ES3047544T3

ES3047544T3 - Anti-human cd45rc binding domains and uses thereof

Info

Publication number: ES3047544T3
Application number: ES22792787T
Authority: ES
Inventors: Carole Guillonneau; Ignacio Anegon; Olivier Favre-Bulle
Original assignee: Aboleris Pharma; Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Aboleris Pharma; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Nantes Université
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2022-09-16
Publication date: 2025-12-03
Anticipated expiration: 2042-09-16
Also published as: US20250281535A1; EP4401842B1; CA3231944A1; FI4401842T3; JP2024535060A; EP4401842A1; PL4401842T3; WO2023041717A1; CN118369344A

Abstract

La presente invención se refiere al dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD45RC, así como a anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos que lo comprenden. También se refiere a su uso en diversos métodos terapéuticos, incluyendo la prevención y/o reducción del rechazo de trasplantes, en particular la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Dominios de unión anti-CD45RC humano y usos de los mismos

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente invención se refiere a un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD45RC, y a anticuerpos y receptores quiméricos de antígeno que comprenden los mismos. Se refiere además a su uso en diversos métodos con fines terapéuticos, entre ellos para prevenir y/o reducir el rechazo de trasplantes, en particular la enfermedad injerto contra hospedador (EICH).

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] CD45 (también conocido como antígeno común leucocitario (LCA), EC3.1.3.48, T200, Ly5 y PTPRC) constituye la primera y prototípica proteína tirosina fosfatasa de tipo receptor (RPTP). Su expresión está restringida a los leucocitos, donde es una de las glicoproteínas de superficie celular más abundantes, constituyendo casi el 10 % de la superficie celular (Trowbridge y Thomas, 1994. Annu Rev Immunol. 12:85-116; Hermistonet al.,2003. Annu Rev Immunol. 21:107-37; Holmes, 2006. Immunology. 117(2):145-55).

[0013] CD45 comprende un dominio extracelular, un único dominio transmembrana y un gran dominio citoplasmático. Los dominios transmembrana y citoplasmático están muy conservados entre las especies. En particular, el dominio citoplasmático de CD45 comprende dos dominios de fosfatasa duplicados en tándem, de los cuales únicamente el dominio proximal a la membrana tiene actividad enzimática (Desaiet al.,1994. EMBO J. 13 (17) :4002-10). La función del segundo dominio fosfatasa más C-terminal en CD45 sigue siendo incierta, aunque se sugiere que puede contribuir a la actividad de CD45 indirectamente mediante la estabilización del primer dominio. A través de este dominio citoplasmático, CD45 funciona como un regulador central de los niveles de fosfotirosina al menos en linfocitos, modulando la actividad de la familia Src de tirosina-proteína cinasas (como Lck en linfocitos T; o Lyn, Fyn y Lck en linfocitos B) (Palacios y Weiss, 2004. Oncogene. 23(48):7990-8000; Lowell, 2004. Mol Immunol. 41 (6-7):631 -43).

[0015] A diferencia de los dominios transmembrana y citoplasmático, el dominio extracelular N-terminal de CD45 muestra un mayor polimorfismo entre los distintos linajes leucocitarios. De hecho, este dominio extracelular está altamente glicosilado y contiene tres exones cortados y empalmados alternativamente (4, 5 y 6, que codifican los determinantes A, B y C, respectivamente) que están tanto glicosilados como sialilados (Hermistonet al.,2003. Annu Rev Immunol. 21:107-37; Holmes, 2006. Immunology. 117(2):145-55). Por tanto, las isoformas de CD45 que difieren en tamaño, forma y carga pueden generarse mediante un corte y empalme alternativo controlado dinámicamente tanto en la diferenciación leucocitaria como en la activación celular, lo que conduce a cambios en el dominio extracelular de la molécula (Hallet al.,1988. J Immunol. 141 (8):2781 -7; Lynch, 2004. Nat Rev Immunol. 4(12):931-40).

[0017] La isoforma de CD45 más grande que contiene los tres exones cortados y empalmados alternativamente, CD45RABC, tiene aproximadamente 235 kDa, mientras que la isoforma más pequeña que carece de los tres exones, CD45RO, tiene aproximadamente 180 kDa. Entre medias, son posibles isoformas que comprenden únicamente dos (p. ej., CD45RAB, CD45RBC) o únicamente uno (p. ej., CD45RB) de los tres exones.

[0019] Aunque la función de las diferentes isoformas de CD45 no está clara, la expresión diferencial de estas isoformas se ha asociado con el nivel de activación de los linfocitos T y permite disociar los linfocitos T vírgenes de los linfocitos T de memoria (Birkelandet al.,1989. Proc Natl Acad Sci USA. 86(17):6734-8). Por ejemplo, CD45RA está presente en linfocitos T CD4+ periféricos vírgenes maduros, mientras que CD45RO se expresa en linfocitos T CD4+ activados y de memoria. CD45RABC se expresa en linfocitos B y sus precursores, en un subgrupo de células dendríticas y en otras células presentadoras de antígenos. Los linfocitos T efectores de memoria de la AR (T<emra>), un subtipo de linfocitos T de memoria diferenciados terminalmente, también reexpresan el marcador de linfocitos T vírgenes CD45RA (Kochet al.,2008. Immun Ageing. 5:6). Es importante destacar que este patrón de expresión de isoformas está muy conservado en todas las especies, lo que subraya su papel funcional y su importancia (Hermistonet al.,2003. Annu Rev Immunol. 21:107-37).

[0021] El patrón de expresión particular de la isoforma CD45RC en linfocitos T CD4+ y CD8+ permite diferenciar entre subconjuntos de linfocitos T alorreactivos funcionalmente distintos que se comportan de forma diferente en términos de proliferación y secreción de citocinas. En roedores, por ejemplo, se ha demostrado que los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ con alta expresión de CD45RC son precursores y/o linfocitos Th1 efectores potentes capaces de promover el rechazo de trasplantes y la inflamación de órganos (Spickettet al.,1983. J Exp Med.

[0022] 158(3):795-810; Xystrakiset al.,2004. Eur J Immunol. 34(2):408-17), mientras que los linfocitos T que expresan niveles indetectables o bajos de CD45RCbajo/- son linfocitos Th2 y linfocitos T reguladores e inhiben el rechazo de aloinjertos, la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) y las enfermedades autoinmunitarias mediadas por células (Xystrakiset al.,2004. Blood. 104(10):3294-30; Guillonneauet al.,2007. J Clin Invest.

[0023] 117(4):1096-106; Powrie y Mason, 1990. J Exp Med. 172(6):1701 -8). En seres humanos, una alta proporción de linfocitos T CD45RC+ CD8+ antes del trasplante se ha correlacionado con una menor supervivencia del injerto en pacientes sometidos a trasplante de riñón (Ordonezetal.,2013. PLoS One. 8(7):e69791).

[0024] La eliminación de la población de linfocitos T CD45RCalto representa, por tanto, una estrategia prometedora para inducir tolerancia inmunitaria en humanos, y así prevenir, reducir y/o tratar el rechazo de trasplantes (en particular la EICH) y las enfermedades autoinmunitarias.

[0025] La EICH (o enfermedad injertocontrahospedador) es una causa importante de morbimortalidad en pacientes con trasplante de células madre. Se trata de un proceso inmunorreactivo mediado por linfocitos T en el que las células del donante reaccionan contra las células del receptor. En la actualidad, la inmunodepresión con fármacos inmunomoduladores como los corticoesteroides es el pilar de la prevención de la EICH. Aunque se han realizado progresos con mejoras en los resultados de supervivencia a lo largo del tiempo, los corticosteroides no previenen la EICH en una elevada proporción de pacientes (menos del 50 % de los pacientes con EICH aguda y del 40-50 % de los pacientes con EICH crónica, dependiendo de la gravedad inicial de la enfermedad; Garnettet al.,2013. Ther Adv Hematol. 4(6):366-378), se asocian a toxicidades significativas, y muchas de las terapias de rescate actualmente disponibles se asocian a un aumento de la inmunodepresión y a complicaciones infecciosas. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad insatisfecha de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento de la EICH para mejorar los resultados a largo plazo tras el trasplante.

[0026] Los Inventores han descrito previamente que el agotamiento de linfocitos T CD45RCalto representa una nueva estrategia terapéutica en la prevención o reducción del rechazo del trasplante mediante la disminución de linfocitos T efectores agresivos, al tiempo que se incrementan los linfocitos T reguladores tolerogénicos. De hecho, el tratamiento transitorio con mAb anti-CD45RC desencadena una rápida apoptosis de los linfocitos T CD45RCalto, al tiempo que preserva la inmunidad de memoria. Además, los Inventores demostraron que el tratamiento a corto plazo con anticuerpos anti-CD45RC da lugar a una supervivencia permanente del aloinjerto sin signos de rechazo crónico (Solicitud de patente internacional WO 2016/016442; Picardaet al.,2017. JCI Insight. 2(3):e90088). También han demostrado sorprendentemente que el tratamiento con un anticuerpo anti-CD45RC que agota específicamente los linfocitos T CD45RCalto mejoraba la fuerza muscular (Ouisseet al.,2019. Front Immunol. 10:2131),y prevenía y trataba enfermedades monogénicas, como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) o la poliendocrinopatía-candidiasis-distrofia autoinmune-ectodérmica (APECED) (Solicitud de patente internacional WO 2019/115791).

[0027] Recientemente, los Inventores han generado anticuerposde novoanti-CD45RC humanos humanizados que mostraron una mayor eficacia en la inducción de la apoptosis del linfocito T objetivo y un efecto terapéutico mejorado,entre otrosen un modelo de ratón NSG inmunohumanizado de EICH xenogénica, en comparación con el anticuerpo anti-CD45RC MT2 disponible comercialmente (Solicitud de patente internacional WO 2020/058495).

[0028] Aquí, los Inventores dieron un paso más y desarrollaron una versión mejorada de estos anticuerpos anti CD45RC humanos ya mejorados del documento WO 2020/058495, con un efecto terapéutico aún mejor.Compendio

[0029] La presente invención se refiere a un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD45RC, en donde dicho dominio de unión a antígeno comprende:.

[0030] (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las tres CDR siguientes:

[0031] (i) V<h>-CDR1 con la secuencia de SEQ ID NO: 10;

[0032] (ii) V<h>-CDR2 con la secuencia de SEQ ID NO: 11; y

[0033] (iii) V<h>-CDR3 con la secuencia de SEQ ID NO: 12; y

[0034] (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende las tres CDR siguientes:

[0035] (i) V<l>-CDR1 con la secuencia de SEQ ID NO: 13;

[0036] (ii) V<l>-CDR2 con la secuencia de SEQ ID NO: 14; y

[0037] (iii) V<l>-CDR3 con la secuencia de SEQ ID NO: 15,

[0038] en donde X en la SEQ ID NO: 13 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G); preferiblemente X en la SEQ ID NO: 13 está ausente.

[0039] En una realización, el dominio de unión a antígeno comprende:

[0040] 1) una HCVR con la secuencia de SEQ ID NO: 24 y una LCVR con la secuencia de SEQ ID NO: 25; o bien 2) una HCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y regiones marco que comparten al menos un 70 % de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 24, y una LCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y regiones marco que comparten al menos un 70 % de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 25, en donde el dominio de unión a antígeno conserva su especificidad de unión a CD45RC;

[0041] en donde X<1>en la SEQ ID NO: 25 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G); preferiblemente X en la SEQ ID NO: 13 está ausente; y

[0042] en donde X<2>en la SEQ ID NO: 25 se selecciona del grupo que consiste en Tyr (Y) y Phe (F), preferiblemente X<2>en la SEQ ID NO: 25 es Tyr (Y).

[0043] En una realización, el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento variable monocatenario (scFv), un di-scFv en tándem, un tri-scFv en tándem, un scFv-Fc, un minicuerpo, un maxicuerpo, un diacuerpo, un tricuerpo, un Fv, un Fab, un Fab', un Fab'-SH, y un F(ab')2.

[0044] La presente invención se refiere además a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD45RC, en donde dicho anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno según la presente invención.

[0045] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además una región constante de cadena pesada (HCCR) y una región constante de cadena ligera (LCCR),

[0046] preferiblemente en donde la HCCR comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 26 a 28, más preferiblemente con la SEQ ID NO: 26 y la LCCR comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; y

[0047] en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo conserva su especificidad de unión a CD45RC.

[0048] La presente invención se refiere además a un receptor quimérico para el antígeno (CAR) que se une específicamente a CD45RC, que comprende:

[0049] i) al menos un dominio extracelular de unión a antígeno según la presente invención;

[0050] ii) opcionalmente, un dominio bisagra extracelular,

[0051] iii) al menos un dominio transmembrana,

[0052] preferiblemente, el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en el dominio transmembrana de CD8 y el dominio transmembrana de CD28,

[0053] más preferiblemente, el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en el dominio transmembrana de CD8 con una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 y el dominio transmembrana de CD28 con una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50;

[0054] iv) al menos un dominio de señalización intracelular que comprende al menos un dominio de señalización primaria y, opcionalmente, uno o más dominios de señalización coestimuladores,

[0055] preferiblemente la al menos una señalización primaria es un dominio de señalización de CD3Z, preferiblemente, la al menos una señalización primaria es un dominio de señalización de CD3Z con una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.

[0056] La presente invención se refiere además a una población de células inmunitarias que expresan el receptor quimérico para el antígeno según la presente invención en su superficie celular.

[0057] En una realización, las células inmunitarias de dicha población se seleccionan del grupo que comprende o consiste en linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T doble positivos, linfocitos T doble negativos, linfocitos T<y>5 , linfocitos NK, linfocitos NKT, linfocitos B, macrófagos o células dendríticas.

[0059] La presente invención se refiere además a un ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno según la presente invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, o el CAR según la presente invención, preferiblemente bajo control de elementos reguladores.

[0061] La presente invención se refiere además al dominio de unión a antígeno según la presente invención, al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, a la población de células inmunitarias según la presente invención, o al ácido nucleico según la presente invención, para su uso como medicamento.

[0063] La presente invención se refiere además al dominio de unión a antígeno según la presente invención, al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, a la población de células inmunitarias según la presente invención, o al ácido nucleico según la presente invención, para su uso en la inducción de tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite.

[0065] La presente invención se refiere además al dominio de unión a antígeno según la presente invención, al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, a la población de células inmunitarias según la presente invención, o al ácido nucleico según la presente invención, para su uso en el agotamiento de células CD45RCalto en un sujeto que lo necesite.

[0067] La presente invención se refiere además al dominio de unión a antígeno según la presente invención, al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, a la población de células inmunitarias según la presente invención, o al ácido nucleico según la presente invención, para su uso en la prevención y/o reducción del rechazo de trasplantes en un sujeto que lo necesite.

[0069] En una realización, prevenir y/o reducir el rechazo del trasplante comprende o consiste en prevenir y/o reducir la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH).

[0071] La presente invención se refiere además al dominio de unión a antígeno según la presente invención, al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la presente invención, a la población de células inmunitarias según la presente invención, o al ácido nucleico según la presente invención, para su uso en la prevención, reducción y/o tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones relacionados con CD45RCaltoen un sujeto que lo necesite, preferiblemente en donde las enfermedades, trastornos o afecciones relacionados con CD45RCaltose seleccionan del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias no deseadas, enfermedades monogénicas, linfoma y cáncer.

[0073] Definiciones

[0075] "Anticuerpo" o "inmunoglobulina"

[0077] Como se emplea en esta memoria, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos ligeras, independientemente de que posea o no cualquier inmunorreactividad específica relevante. "Anticuerpos" se refiere a dichos conjuntos que tienen una actividad inmunorreactiva específica conocida significativa frente a un antígeno de interés (p. ej., CD45RC humano). La expresión "anticuerpos anti-hCD45RC" se emplea en esta memoria para referirse a anticuerpos que presentan especificidad inmunológica por la proteína CD45RC humana. Como se explica en otra parte de la presente memoria, la "especificidad" por CD45RC humano no excluye la reacción cruzada con especies en las que se expresa CD45RC.

[0079] Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre ellas. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien. El término genérico "inmunoglobulina" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que pueden distinguirse bioquímicamente. Aunque el siguiente análisis se referirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina, las cinco clases de anticuerpos están dentro del alcance de la presente invención. En cuanto a las IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas con un peso molecular de aproximadamente 23 kDa, y dos cadenas pesadas idénticas con un peso molecular de aproximadamente 53-70 kDa. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y", en donde las cadenas ligeras enlazan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable. Las cadenas ligeras de un anticuerpo se clasifican en kappa (<k>) o lambda (A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida a una cadena ligera<k>o A. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las regiones de la "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el C-terminal en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma (<y>), mu (p), alfa (a), delta (5) o épsilon (e) con algunas subclases entre ellas (p. ej.,<y>1 -<y>4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas o "isotipos" (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc.) están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto a la vista de la presente divulgación y, por consiguiente, está dentro del alcance de la presente invención. Como se ha indicado anteriormente, la región variable de un anticuerpo permite al anticuerpo reconocer selectivamente y unirse específicamente a epítopos de antígenos. Es decir, el dominio variable de cadena ligera (dominio V<l>) y el dominio variable de cadena pesada (dominio V<h>) de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio tridimensional de unión al antígeno. Esta estructura cuaternaria del anticuerpo forma el sitio de unión al antígeno presente en el extremo de cada brazo de la "Y". Más concretamente, el sitio de unión al antígeno está definido por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en cada una de las cadenas V<h>y V<l>.

[0081] "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC"

[0083] Como se emplea en esta memoria, la expresión"mediada por células dependiente de anticuerpos"o"ADCC"hace referencia a una forma de citotoxicidad en la que la región Fc de los anticuerpos unidos a una célula objetivo portadora de antígeno se une a receptores F<cy>(F<cy>R) del tipo CD16a presentes principalmente en células NK (DiLillo y Ravetch, 2015. Cancer Immunol Res. 3(7):704-13). La unión de determinados isotipos de IgG a otros Fc<y>R, como CD32 o CD64, desencadena la activación de células como monocitos, macrófagos y PMN y la secreción de diversas sustancias como liasa, perforina, granzima, TFN, etc. para mediar en la destrucción de células objetivo inflamatorias. El acoplamiento de CD16a en las células NK también desencadena la producción de citocinas (Anegónet al.,1988. J Exp Med. 167(2):452-72). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCCin vitro,como el descrito en las patentes de EE. UU. 5,500,362 o 5,821,337.

[0085] "Fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCP"

[0087] Como se emplea en esta memoria, la expresión"fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos"o"ADCP"se refiere a una forma de fagocitosis en la que la región Fc de anticuerpos unidos a una célula objetivo portadora de antígeno se une a receptores F<cy>(F<cy>R) presentes en ciertos fagocitos (p. ej., neutrófilos, monocitos, macrófagos y células dendríticas). Esta unión desencadena el inicio de un proceso de fagocitosis para mediar la destrucción de la célula objetivo.

[0089] "Fragmento de unión a antígeno" o "dominio de unión a antígeno"

[0091] Como se emplea en esta memoria, las expresiones "fragmento de unión a antígeno" o "dominio de unión a antígeno" se refieren a una parte o región de un anticuerpo o inmunoglobulina, que comprende menos restos de aminoácido que un anticuerpo completo, pero que es capaz de unirse a un antígeno y/o de competir con un anticuerpo completo por la unión a un antígeno (p. ej., por la unión específica a CD45RC humano). Los fragmentos de unión a antígeno abarcan, sin limitación alguna, los anticuerpos de monocatenarios, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH y F(ab')2.

[0093] "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC"

[0095] La expresión"citotoxicidad dependiente del complemento"o"CDC"se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia del complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento a los anticuerpos que están unidos a su antígeno correspondiente. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC como, p. ej., el descrito en Gazzano-Santoroet al.,1997. J Immunol Methods. 202(2):163-71.

[0097] "CD45"

[0099] Como se emplea en esta memoria, el término "CD45" (también conocido como CD45R o PTPRC) se refiere a una glicoproteína transmembrana que existe en diferentes isoformas. Estas isoformas distintas de CD45 difieren en sus estructuras de dominio extracelular que surgen del corte y empalme alternativo de 3 exones variables (exones 4, 5 y 6) que codifican los determinantes A, B y C, respectivamente, de la región extracelular de CD45. Los anticuerpos reactivos con el epítopo restringido se agrupan como "CD45R". Por lo tanto, los anticuerpos anti-CD45RA, anti-CD45RB y anti-CD45RC reconocen las isoformas de CD45 que incluyen la expresión de los determinantes A, B y C, respectivamente. En ausencia de los tres determinantes A, B y C, la isoforma se denomina CD45RO. Las diversas isoformas de CD45 tienen diferentes dominios extracelulares, pero tienen una secuencia extracelular idéntica proximal a la membrana, así como para el dominio transmembrana y segmentos de una gran cola citoplasmática que contienen dos dominios de fosfatasa en tándem homólogos altamente conservados de aproximadamente 300 restos. CD45 y sus isoformas se asocian de forma no covalente con la fosfoproteína asociada a la fosfatasa linfocitaria (LPAP) en los linfocitos T y B. Se ha observado que CD45 está asociado con otros antígenos de la superficie celular, como CD1, CD2, CD3 y CD4. CD45 participa en la señalización de la activación de los linfocitos. Cuando va precedido de la letra "h" (p. ej., hCD45), se da a entender que CD45 es de origen humano.

[0101] "CD45RC"

[0103] Como se emplea en esta memoria, el término "CD45RC" se refiere a una glicoproteína de membrana de tipo I monocatenaria de 200-220 kDa bien conocida por el experto en la técnica. CD45RC es una isoforma de corte y empalme alternativo de CD45 que comprende el exón 6 que codifica el determinante C (de ahí la terminología CD45RC, es decir, CD45 R restringido al determinante C). En laSEQ ID NO: 1se ofrece una secuencia de aminoácidos de CD45RC humano correspondiente al número de registro de UniProt P08575-10. Esta isoforma de CD45RC se expresa en linfocitos B y NK, y en un subconjunto de linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD4+, pero no en linfocitos T reguladores CD8+ o CD4+, monocitos CD14+ o PMN (Picardaet al.,2017. JCI Insight.

[0104] 2(3):e90088). Aunque algunos anticuerpos monoclonales pueden reconocer un epítopo en la porción de CD45 común a todas las diferentes isoformas (se denominan anticuerpos anti-CD45), otros anticuerpos monoclonales tienen una especificidad restringida a una isoforma determinada, dependiendo del determinante que reconozcan (A, B o C). Cuando va precedido de la letra "h" (p. ej., hCD45RC), se da a entender que CD45RC es de origen humano.

[0106] "CDR" o "región determinante de la complementariedad"

[0108] Como se emplea en esta memoria, el término "CDR" o la expresión "región determinante de la complementariedad" significa los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las CDR se identificaron según las reglas de latabla 1,deducidas de Kabatet al.,1991. Sequences of proteins of immunological interest (5.a ed.). Bethesda, MD: U.S. Dep. of Health and Human Services; y Chothia y Lesk, 1987. J Mol Biol. 196(4) :901 -17:

[0109] TABLA 1

[0111]

[0112]

[0114] * Saul y Poljak,1992.Proteins.14(3):

363-71

[0116] "Genomanipulado/a"

[0118] Como se emplea en esta memoria, el término "manipulado/a" o la expresión "modificado/a por ingeniería genética" se refiere a una célula que se ha transfectado, transformado o transducido.

[0120] "Epítopo"

[0122] Como se emplea en esta memoria, el término "epítopo" se refiere a una disposición específica de aminoácidos localizados en una proteína o proteínas a los que se une un anticuerpo o fragmento de unión del mismo. Los epítopos suelen consistir en una agrupación superficial de moléculas químicamente activas, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser lineales (o secuenciales) o conformacionales,es decir,que implican dos o más secuencias de aminoácidos en varias regiones del antígeno que pueden no ser necesariamente contiguas.

[0124] "Región marco" o "FR" o "regiones no CDR"

[0126] Como se emplea en esta memoria, los términos y expresiones "región marco", "FR" o "regiones no CDR" incluyen los restos de aminoácido que forman parte de la región variable, pero que no forman parte de las CDR (p. ej., utilizando la definición de CDR de Kabat/Chothia). Por lo tanto, un marco de región variable tiene una longitud de aproximadamente 100 a 120 aminoácidos, pero incluye únicamente los aminoácidos situados fuera de las CDR.

[0128] Para el ejemplo específico de una HCVR y para las CDR definidas por Kabat/Chothia:

[0130] - la FR1 puede corresponder al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-25 según la definición de Chothia/AbM, o 5 restos después según la definición de Kabat;

[0132] - la FR2 puede corresponder al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49;

[0134] - la FR3 puede corresponder al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 67-98; y

[0135] - la FR4 puede corresponder al dominio de la región variable desde los aminoácidos 104-110 hasta el final de la región variable.

[0137] Las regiones marco para la cadena ligera están separadas de forma similar por cada una de las CDR de la LCVR. En los anticuerpos naturales, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que se posicionan específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Los restos de los dominios variables pesado y ligero muestran menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones marco. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina p. Por tanto, estas regiones marco actúan para formar un armazón que proporciona el posicionamiento de las seis CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes intercatenarias. El sitio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo del antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria favorece la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo. La posición de las CDR puede identificarse fácilmente por un experto en la técnica.

[0138] "Región de cadena pesada"

[0140] Como se emplea en esta memoria, la expresión "región de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de los dominios constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina. Una proteína que comprende una región de cadena pesada comprende al menos uno de los dominios C<h>1 , un dominio bisagra (p. ej., región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio C<h>2, un dominio C<h>3, o una variante o fragmento de los mismos. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la presente invención puede comprender la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., una porción bisagra, un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3). En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la presente invención carece de al menos una región de un dominio constante (p. ej., la totalidad o parte de un dominio C<h>2). En ciertas realizaciones, al menos uno, y preferiblemente todos, los dominios constantes se derivan de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, en una realización preferida, la región de cadena pesada comprende un dominio bisagra totalmente humano. En otras realizaciones preferidas, la región de cadena pesada comprende una región Fc totalmente humana (p. ej., secuencias de dominio bisagra, C<h>2 y C<h>3 de una inmunoglobulina humana). En ciertas realizaciones, los dominios constantes constituyentes de la región de cadena pesada proceden de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una región de cadena pesada de una proteína puede comprender un dominio C<h>2 derivado de una molécula IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3 o IgG4. En otras realizaciones, los dominios constantes son dominios quiméricos que comprenden regiones de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una bisagra puede comprender una primera región de una molécula IgG1 y una segunda región de una molécula IgG3 o IgG4. Como e ha expuesto anteriormente, cualquier experto en la técnica comprenderá que los dominios constantes de la región de cadena pesada pueden modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina natural (tipo silvestre). Es decir, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la presente invención puede comprender alteraciones o modificaciones de uno o más de los dominios constantes de cadena pesada (C<h>1, bisagra, C<h>2 o C<h>3) y/o del dominio constante de cadena ligera (C<l>). Algunas modificaciones ilustrativas incluyen adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios.

[0142] "Región bisagra" o "dominio bisagra"

[0144] Como se emplea en esta memoria, las expresiones "región bisagra" o "dominio bisagra" se usan indistintamente e incluyen la región de una cadena pesada de inmunoglobulina que une el dominio C<h>1 con el dominio C<h>2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 restos y es flexible, lo que permite que las dos regiones N-terminales de unión al antígeno se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Rouxet al.,1998. J Immunol.

[0145] 161 (8):4083-90). En el contexto de un receptor quimérico para el antígeno (CAR), los términos "región bisagra" o "dominio bisagra" se refieren a la región que conecta el dominio de unión extracelular con el dominio transmembrana.

[0147] "Identidad" o "idéntico/a"

[0149] Como se emplea en esta memoria, el término "identidad" o "idéntico/a", cuando se utiliza en una relación entre las secuencias de dos o más secuencias de aminoácidos, o de dos o más secuencias de ácidos nucleicos, se refiere al grado de parentesco de secuencia entre secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos, determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más restos de aminoácidos o restos de ácidos nucleicos. "Identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hay) abordadas por un modelo matemático o programa informático concreto (es decir, "algoritmos").

[0151] La identidad de secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos relacionadas puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Lesk, 1988. Computational molecular biology: Sources and methods for sequence analysis. Nueva York, NY: Oxford University Press; Smith, 1993. Biocomputing: Informatics and genome projects. San Diego, CA: Academic Press; Griffin y Griffin, 1994. Computer analysis of sequence data, Part 1. Totowa, NJ: Humana Press; von Heijne, 1987. Sequence analysis in molecular biology: treasure trove or trivial pursuit. San Diego, CA: Academic press; Gribskov y Devereux, 1991. Sequence analysis primer. Nueva York, NY: Stockton Press; Carilloet al.,1988. SIAM J Appl Math. 48(5):1073-82.

[0153] Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Algunos métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos de acceso público. Algunos métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, incluido GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI; Devereuxet al.,1984. Nucleic Acids Res. 12(1 Pt 1):387-95), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschulet al.,1990. J Mol Biol. 215(3):403-10). El programa BLASTX está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschulet al.NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894). También puede utilizarse para determinar la identidad el conocido algoritmo de Smith-Waterman.

[0155] "Inmunoespecífico", "específico para" o "se une específicamente"

[0157] Como se emplea en esta memoria, se dice que un anticuerpo o fragmento de unión del mismo es "inmunoespecífico", "específico para" o que "se une específicamente" a un antígeno si reacciona a un nivel detectable con dicho antígeno (p. ej., hCD45RC), preferiblemente con una constante de afinidad (K<a>) mayor o igual a aproximadamente 106 M-1, preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 107 M-1, 108 M-1, 5x108 M-1, 109 M-1, 5x109 M-1 o más.

[0159] La afinidad de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo por su antígeno afín también se expresa comúnmente como una constante de disociación en el equilibrio (K<d>). Se dice que un anticuerpo o fragmento de unión del mismo es "inmunoespecífico", "específico para" o se "une específicamente" a un antígeno si reacciona a un nivel detectable con dicho antígeno (p. ej., hCD45RC), preferiblemente con una K<d>inferior o igual a 10-6 M, preferiblemente inferior o igual a 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M o menos.

[0161] Las afinidades de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos pueden determinarse fácilmente utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard, 1949. Ann NY Acad Sci. 51:660-672. Las propiedades de unión de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo a antígenos, células o tejidos pueden determinarse y evaluarse generalmente usando métodos de inmunodetección que incluyen, por ejemplo, ELISA, ensayos basados en inmunofluorescencia, tales como inmunohistoquímica (IHC) y/o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o por resonancia de plasmón superficial (SPR, p. ej., usando BIAcore®).

[0163] "Anticuerpo monoclonal"

[0165] Como se emplea en esta memoria, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales comprendidos en la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que pueden sintetizarse sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como un requisito para la producción del anticuerpo mediante un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales o fragmento de unión de los mismos según la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma descrita por primera vez por Kohleret al.,1975. Nature. 256(5517):495-7, o puede fabricarse utilizando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales eucariotas o vegetales (Patente de EE. UU. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagotecas de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en Clacksonet al.,1991. Nature. 352(6336):624-8 y Markset al.,1991. J Mol Biol. 222(3):581-97, por ejemplo.

[0167] "Prevenir" o "previniendo" o "prevención"

[0169] Como se emplea en esta memoria, los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" se refieren a medidas profilácticas y preventivas, en donde el objeto es reducir las probabilidades de que un sujeto desarrolle la afección o patología durante un periodo de tiempo determinado. Dicha reducción puede reflejarse, p. ej., en un retraso en la aparición de al menos un síntoma de la afección o patología en el sujeto.

[0171] "Fragmento variable monocatenario"

[0173] Como se emplea en esta memoria, la expresión "fragmento variable monocatenario", también abreviado como"sFv"o"scFv",se refiere a un dominio de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo V<h>y un dominio de anticuerpo V<l>conectados en una única cadena de aminoácidos. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del scFv comprende un enlazador peptídico entre los dominios V<h>y V<l>que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno (Plückthun, 1994. Antibodies from Escherichia coli. En Rosenberg & Moore (Eds.), The pharmacology of monoclonal antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology, 113:269-315. Springer: Berlín, Heidelberg). Los scFv divalentes, trivalentes y superiores, denominados di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, etc., pueden diseñarse uniendo dos, tres o más scFv. Como alternativa, se puede forzar a dos scFv a dimerizarse en un diacuerpo utilizando un péptido enlazador demasiado corto (normalmente de aproximadamente 5 a 10 aminoácidos) entre los dominios V<h>y V<l>. Los diacuerpos se describen con más detalle en la patente europea EP 0 404 097, en la solicitud de patente internacional WO 1993/011161, y en Holligeret al.,1993. Proc Natl Acad Sci USA. 90(14):6444-8. Como alternativa, un péptido enlazador aún más corto (normalmente de aproximadamente 1 a 2 aminoácidos) conduce a la formación de trímeros de scFv, también llamados triacuerpos o tricuerpos.

[0175] "Sujeto"

[0177] Como se emplea en esta memoria, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano. En una realización, un sujeto puede ser un "paciente", es decir, un animal de sangre caliente, más preferiblemente un ser humano, que está a la espera de recibir, o está recibiendo atención médica o ha sido/es/va a ser objeto de un procedimiento médico, o está monitorizado para detectar el desarrollo de una enfermedad. El término "mamífero" se refiere aquí a cualquier mamífero, incluidos los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un primate, más preferiblemente un ser humano.

[0179] "Tratar" o "tratamiento" o "alivio"

[0181] Como se emplea en esta memoria, los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren a tratamiento terapéutico, excluidas medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es ralentizar (disminuir) la afección o patología objetivo. Las personas que necesitan tratamiento son tanto las que ya padecen el trastorno como las que se sospecha que lo padecen. Se "trata" con éxito la patología o trastorno objetivo en un sujeto si, tras recibir una cantidad terapéutica del anticuerpo aislado o fragmento de unión del mismo, ácido nucleico, vector de expresión, composición, composición farmacéutica o medicamento según la presente invención, dicho sujeto muestra una reducción observable y/o medible o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción del número de células CD45RCalto; reducción del porcentaje de células totales que son CD45RCalto; alivio, hasta cierto punto, de uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o afección específica; reducción de la morbimortalidad; y/o mejora en cuestiones de calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar el éxito del tratamiento y la mejoría de la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos rutinarios conocidos por un médico.

[0183] "Región variable" o "dominio variable"

[0185] Como se emplea en esta memoria, el término "variable" se refiere al hecho de que ciertas regiones de los dominios variables V<h>y V<l>difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se emplean en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno objetivo. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "bucles hipervariables" en cada uno de los dominios V<l>y V<h>que forman parte del sitio de unión al antígeno.

[0187] Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio de cadena ligera VA se denominan en el presente documento L1 (A), L2 (A) y L3 (A) y puede definirse que comprenden los restos 24-33 (L1 (A), que consiste en 9, 10 u 11 restos de aminoácido), 49-53 L2 (A), que consiste en 3 restos) y 90-96 (L3(A), que consiste en 6 restos) en el dominio V<l>(Moreaetal.,2000. Methods. 20(3):267-79).

[0189] Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio de cadena ligera V<k>se denominan en el presente documento L1(<k>), L2(x) y L3(x) y pueden definirse como comprendiendo los restos 25-33 (L1(<k>), que consiste en 6, 7, 8, 11, 12 o 13 restos), 49-53 (L2(<k>), que consiste en 3 restos) y 90-97 (L3(<k>), que consiste en 6 restos) en el dominio V<l>(Moreaet a l,2000. Methods. 20(3):267-79).

[0191] Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio V<h>se denominan en el presente documento H1, H2 y H3 y puede definirse que comprenden los restos 25-33 (H1, que consiste en 7, 8 o 9 restos), 52-56 (H2, que consiste en 3 o 4 restos) y 91-105 (H3, de longitud muy variable) en el dominio V<h>(Moreaet a l,2000. Methods. 20(3):267-79).

[0193] A menos que se indique lo contrario, los términos L1, L2 y L3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer bucles hipervariables de un dominio V<l>, y abarcan bucles hipervariables obtenidos de isotipos tanto V<k>como VA. Los términos H1, H2 y H3 se refieren respectivamente a los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio V<h>, y abarcan los bucles hipervariables obtenidos a partir de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos, incluidos gamma (<y>), mu (p), alfa (a), delta (5) o épsilon (s). Cada uno de los bucles hipervariables L1, L2, L3, H1, H2 y H3 puede comprender parte de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR", como se ha definido anteriormente.

[0195] "Vector"

[0197] Como se emplea en esta memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico portadora en la que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico, para su introducción en una célula donde puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es ajena a la célula en la que se está introduciendo el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedadora en la que normalmente no se encuentra la secuencia. Los vectores incluyen vectores de ADN, vectores de ARN, plásmidos, fagémidos, derivados de fagos, virus (p. ej., bacteriófagos, virus animales y virus vegetales), cósmidos y cromosomas artificiales (p. ej., YAC). Un experto en la técnica estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar conocidas en la técnica.

[0199] Descripción detallada

[0201] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un dominio de unión a antígeno, que se une específicamente a CD45RC, y preferiblemente a CD45RC humano (hCD45RC). Por lo tanto, el dominio de unión a antígeno de la invención es un"dominio de unión a CD45RC",y preferiblemente un"dominio de unión a hCD45RC".

[0203] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente a hCD45RC con la SEQ ID NO: 1.

[0206]

[0209] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente al dominio extracelular de hCD45RC. En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente a al menos un epítopo presente en el dominio extracelular de hCD45RC.

[0211] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente al determinante C codificado por el exón 6 de hCD45. En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente a al menos un epítopo del determinante C codificado por el exón 6 de hCD45.

[0213] En una realización, la secuencia de aminoácidos del determinante C codificado por el exón 6 de hCD45 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2.

[0216]

[0219] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente a al menos un epítopo que comprende o consiste en una secuencia que comparte al menos aproximadamente un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma.

[0220] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente a un epítopo que comprende o consiste en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46 o 47 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o de una secuencia que comparte al menos aproximadamente un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 2.

[0222] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une específicamente a al menos un epítopo que comprende o consiste en al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; o de una secuencia que comparta al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 2.

[0224] En una realización, un fragmento del al menos un epítopo que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 comprende o consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 restos de aminoácidos, preferiblemente restos de aminoácidos contiguos.

[0226] En una realización, un fragmento del al menos un epítopo que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 comprende o consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 restos de aminoácido repartidos en un intervalo de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 73, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100 o más restos de aminoácidos contiguos de una secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2.

[0228] En una realización, una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de hCD45RC expuesta en la SEQ ID NO: 1.

[0230] En una realización, una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de hCD45, también conocida como hCD45RABC (es decir, que comprende los determinantes A, B y C), como se expone en la SEQ ID NO: 3, correspondiente al número de registro UniProt P08575-3.

[0233]

[0234]

[0236] En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une al determinante A codificado por el exón 4 de hCD45. En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une al menos a un epítopo del determinante A codificado por el exón 4 de hCD45.

[0237] En una realización, la secuencia de aminoácidos del determinante A codificado por el exón 4 de hCD45 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4.

[0240]

[0241] __________________________________________________________

[0242] En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une al determinante B codificado por el exón 5 de hCD45. En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une al menos a un epítopo del determinante B codificado por el exón 5 de hCD45.

[0243] En una realización, la secuencia de aminoácidos del determinante B codificado por el exón 4 de hCD45 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 5.

[0246]

[0248] En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a hCD45RA. En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a al menos un epítopo de hCD45RA.

[0249] En una realización, la secuencia de aminoácidos de hCD45RA comprende o consiste en la SEQ ID NO: 6, correspondiente al número de registro UniProt P08575-8.

[0250]

[0252] En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a hCD45RB. En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a al menos un epítopo de hCD45RB.

[0253] En una realización, la secuencia de aminoácidos de hCD45RB comprende o consiste en la SEQ ID NO: 7, correspondiente al número de registro UniProt P08575-9.

[0254]

[0256] En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a hCD45RAB. En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a al menos un epítopo de hCD45RAB.

[0257] En una realización, la secuencia de aminoácidos de hCD45RAB comprende o consiste en la SEQ ID NO: 8, correspondiente al número de registro UniProt P08575-5.

[0258]

[0260] En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a hCD45RO. En una realización, el dominio de unión a CD45RC no se une a al menos un epítopo de hCD45RO.

[0261] En una realización, la secuencia de aminoácidos de hCD45RO comprende o consiste en la SEQ ID NO: 9, correspondiente al número de registro UniProt P08575-4.

[0262]

[0265] En una realización, el al menos un epítopo es un epítopo conformacional. En otra realización, el al menos un epítopo es un epítopo secuencial.

[0267] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une a hCD45RC con una constante de disociación en el equilibrio (Kd) de aproximadamente 5x10-7 M o menos, preferiblemente de aproximadamente 2,5x10-7 M o menos, aproximadamente 1 x10'7 M o menos, aproximadamente 7,5x10'8 M o menos, aproximadamente 5x10' 8 M o menos, aproximadamente 2,5x10'8 M o menos, aproximadamente 1x10'8 M o menos, aproximadamente 7,5x10'9 M o menos, aproximadamente 5x10'9 M o menos, aproximadamente 2,5x10'9 M o menos, aproximadamente 1x10'9 M o menos, según se determine, p. ej., por Biacore en hCD45RC inmovilizado.

[0268] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une a hCD45RC con una Kd de menos de 10 nM, tal como 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM o menos, según se determine, p. ej., por Biacore en hCD45RC inmovilizado. En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une a hCD45RC con una Kd de aproximadamente 2,24 nM determinada por Biacore en hCD45RC inmovilizado.

[0270] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une a hCD45RC con una velocidad de asociación (Kon) de aproximadamente 1x104 M 'V 1 o más, preferiblemente de aproximadamente 5x104 M 'V 1 o más, aproximadamente 1x105 M 'V 1 o más, aproximadamente 2,5x105 M 'V 1 o más, aproximadamente 5x105 M 'V 1 o más.

[0272] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une a hCD45RC con una velocidad de disociación (Koff) de aproximadamente 5x10-2 s-1 o menos, preferiblemente de aproximadamente 4x10-2 s-1 o menos, aproximadamente 3x10'2 s-1 o menos, aproximadamente 2x10'2 s-1 o menos, aproximadamente 1,5x10'2 s-1 o menos.

[0274] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se une a hCD45RC con al menos uno de, preferiblemente al menos dos de, más preferiblemente los tres de:.

[0275] - una constante de disociación en el equilibrio (Kd) de aproximadamente 5x10-7 M o menos, preferiblemente de aproximadamente 2,5x10-7 M o menos, de aproximadamente 1x10-7 M o menos, de aproximadamente 7,5x10-8 M o menos, de aproximadamente 5x10-8 M o menos, de aproximadamente 1x10-8 M o menos; - una velocidad de asociación (Kon) de aproximadamente 1x104 M-1s-1 o más, preferiblemente de aproximadamente 5x104 M-1s-1 o más, aproximadamente 1x105 M-1s-1 o más, aproximadamente 2,5x105 M-1s-1 o más, aproximadamente 5x105 M-1s-1 o más; y

[0276] - una velocidad de disociación (Koff) de aproximadamente 5x10-2 s-1 o menos, preferiblemente de aproximadamente 4x10-2 s-1 o menos, aproximadamente 3x10-2 s-1 o menos, aproximadamente 2x10-2 s-1 o menos, aproximadamente 1,5x10-2 s-1 o menos.

[0277] Los métodos para determinar la afinidad (incluidos, por ejemplo, la determinación de la Kd, koff y kon) de un dominio de unión a antígeno o de un anticuerpo por su ligando son conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitación, resonancia de plasmón superficial (SPR), clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), AlphaLISA y KinExA.

[0278] Un método preferido es BIAcore®, que se basa en SPR utilizando CD45RC inmovilizado para determinar la afinidad de un dominio de unión a antígeno o de un anticuerpo.

[0279] En una realización, el dominio de unión a CD45RC es un dominio de unión a CD45RC aislado.

[0280] Por"aislado",se entiende que el dominio de unión a CD45RC está sustancialmente libre de otros dominios de unión a antígeno que tienen diferentes especificidades antigénicas; en otras palabras, el dominio de unión a CD45RC está sustancialmente libre de dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a antígenos distintos de CD45RC. Sin embargo, un dominio de unión CD45RC aislado puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, particularmente con proteínas CD45RC de otras especies. Además, un dominio de unión a CD45RC aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas, en particular aquellas que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del dominio de unión a CD45RC, incluidos, sin limitación, enzimas, hormonas y otros componentes proteicos o no proteicos.

[0281] Por tanto, en una realización, el dominio de unión a CD45RC aislado se purifica.

[0282] En una realización, el dominio de unión a CD45RC aislado se purifica hasta:

[0283] (1) más del 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % o más en peso del dominio de unión a CD45RC, como puede determinarse por el método de Lowry, y lo más preferiblemente más del 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en peso;

[0284] (2) un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de vaso giratorio; o bien

[0285] (3) la homogeneidad, que puede demostrarse mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras y utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata.

[0286] En una realización, el dominio de unión a antígeno es una molécula seleccionada del grupo que comprende o consiste en un anticuerpo monocatenario, un Fv, un Fab, un Fab', un Fab'-SH, y un F(ab')2.

[0287] En una realización, el dominio de unión a antígeno es un anticuerpo monocatenario. En una realización, el anticuerpo monocatenario se selecciona del grupo que comprende o consiste en un fragmento variable monocatenario (scFv), un di-scFv en tándem, un tri-scFv en tándem, un scFv-Fc, un (scFv-C<h>3)2 (también denominado minicuerpo), un (scFv-C<h>2-C<h>3)2 (también denominado maxicuerpo), un diacuerpo y un triacuerpo. En una realización, el dominio de unión a antígeno es un scFv.

[0288] En una realización, el scFv comprende un enlazador entre los dominios V<h>y V<l>que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. En una realización, el enlazador es un polipéptido corto, preferiblemente con una longitud en el intervalo de 2 a 25 aminoácidos.

[0289] Por ejemplo, los enlazadores de glicina-serina proporcionan enlazadores particularmente adecuados. Algunos ejemplos de enlazadores de glicina-serina incluyen, pero no se limitan a, enlazadores (GS)n, enlazadores (G<2>S)n, enlazadores (G3S)n, enlazadores (G4S)n, etc., siendo n un número entero positivo. En una realización, n es igual a 1,2, 3, 4, 5 o más.

[0290] Algunos ejemplos de enlazadores de glicina-serina incluyen, pero no se limitan a, las SEQ ID NO: 30-39.

[0293]

[0295] En lo sucesivo, y a menos que se mencione explícitamente lo contrario, la numeración y las definiciones de las CDR son según la definición de Kabat/Chothia.

[0296] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente las tres CDR siguientes:

[0297] Vh-CDR1: NYYIG (SEQ ID NO: 10);

[0298] Vh-CDR2: DIFPGGDYANYNEKFQG (SEQ ID NO: 11); y

[0299] Vh-CDR3:RNFDY (SEQ ID NO: 12).

[0300] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una HCVR que comprende las tres CDR siguientes:

[0301] Vh-CDR1: NYYIG (SEQ ID NO: 10);

[0302] Vh-CDR2: DIFPGGDYANYNEKFQG (SEQ ID NO: 11); y

[0303] Vh-CDR3:RNFDY (SEQ ID NO: 12).

[0304] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente las tres CDR siguientes:

[0305] Vl-CDR1: RASSSVS-X-YMH (SEQ ID NO: 13);

[0306] Vl-CDR2:NTANLPS (SEQ ID NO: 14); y

[0307] Vl-CDR3:QQRSSYPLTF (SEQ ID NO: 15).

[0308] estando X ausente o seleccionándose del grupo que comprende o que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G), preferiblemente estando X ausente.

[0309] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una LCVR que comprende las tres CDR siguientes:

[0310] Vl-CDR1: RASSSVS-X-YMH (SEQ ID NO: 13);

[0311] Vl-CDR2:NTANLPS (SEQ ID NO: 14); y

[0312] Vl-CDR3:QQRSSYPLTF (SEQ ID NO: 15).

[0313] estando X ausente o seleccionándose del grupo que comprende o que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G), preferiblemente estando X ausente.

[0314] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende:

[0315] - una HCVR que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente las tres CDR siguientes:

[0316] Vh-CDR1:NYYIG (SEQ ID NO: 10);

[0317] Vh-CDR2: DIFPGGDYANYNEKFQG (SEQ ID NO: 11); y

[0318] Vh-CDR3:RNFDY (SEQ ID NO: 12); y

[0319] - una LCVR que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente las tres CDR siguientes:

[0320] Vl-CDR1:RASSSVS-X-YMH (SEQ ID NO: 13);

[0321] Vl-CDR2:NTANLPS (SEQ ID NO: 14); y

[0322] Vl-CDR3:QQRSSYPLTF (SEQ ID NO: 15).

[0323] estando X ausente o seleccionándose del grupo que comprende o que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G), preferiblemente estando X ausente.

[0324] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende:

[0325] - una HCVR que comprende las tres CDR siguientes:

[0326] Vh-CDR1:NYYIG (SEQ ID NO: 10);

[0327] Vh-CDR2: DIFPGGDYANYNEKFQG (SEQ ID NO: 11); y

[0328] Vh-CDR3:RNFDY (SEQ ID NO: 12); y

[0329] - una LCVR que comprende las tres CDR siguientes:

[0330] Vl-CDR1:RASSSVS-X-YMH (SEQ ID NO: 13);

[0331] Vl-CDR2:NTANLPS (SEQ ID NO: 14); y

[0332] Vl-CDR3:QQRSSYPLTF (SEQ ID NO: 15).

[0333] estando X ausente o seleccionándose del grupo que comprende o que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G), preferiblemente estando X ausente.

[0334] En una realización, cualquiera de la V<h>-CDR1, la V<h>-CDR2, la V<h>-CDR3, la V<l>-CDR1, la V<l>-CDR2 y/o la V<l>-CDR3 como se han definido anteriormente puede caracterizarse por que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la CDR o conjuntos de CDR particulares definidos anteriormente, mientras que el dominio de unión a CD45RC conserva sus propiedades funcionales generales, en particular su especificidad de unión a CD45RC, preferiblemente a hCD45RC.

[0335] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una HCVR que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, incluso más preferiblemente las cuatro regiones marco (FR) siguientes:

[0336] Vh-FR1:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 16);

[0337] Vh-FR2: WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 17);

[0338] Vh-FR3: RVTLTADTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCVR (SEQ ID NO: 18);

[0339] Vh-FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19).

[0340] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una HCVR que comprende las cuatro FR siguientes:

[0341] Vh-FR1: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 16);

[0342] Vh-FR2:WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 17);

[0343] Vh-FR3: RVTLTADTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCVR (SEQ ID NO: 18);

[0344] Vh-FR4:WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19).

[0345] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una LCVR que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, incluso más preferiblemente las cuatro FR siguientes:

[0346] VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 20);

[0347] VL-FR2:WYQQKPGKAPKLWIY (SEQ ID NO: 21);

[0348] VL-FR3: GVPSRFSGSGSGTE-X-TLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 22);

[0349] VL-FR4:GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 23)

[0350] seleccionándose X del grupo que comprende o está formado por Tyr (Y) y Phe (F), preferiblemente siendo X Tyr (Y).

[0351] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una LCVR que comprende las cuatro FR siguientes:

[0352] VL-FR1: DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 20);

[0353] VL-FR2:WYQQKPGKAPKLWIY (SEQ ID NO: 21);

[0354] VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X-TLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 22);

[0355] VL-FR4: GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 23).

[0356] seleccionándose X del grupo que comprende o está formado por Tyr (Y) y Phe (F), preferiblemente siendo X Tyr (Y).

[0357] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una HCVR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0358] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una HCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, y regiones marco que comparten al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las regiones marco de SEQ ID NO: 24.

[0361]

[0363] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una LCVR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.

[0364] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende una LCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, y regiones marco que comparten al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las regiones marco de la<s>E<q>ID N<o>: 25, donde:

[0365] - Xi está ausente o se selecciona del grupo que comprende o que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G), preferiblemente estando X<1>ausente; y

[0366] - X<2>se selecciona del grupo que comprende o consiste en Tyr (Y) y Phe (F), siendo X<2>preferiblemente Tyr (Y).

[0369]

[0371] En una realización, X<1>está ausente y X<2>es Tyr (Y).

[0372] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende:

[0373] - una HCVR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24; y

[0374] - una LCVR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.

[0375] En una realización, el dominio de unión a CD45RC comprende:

[0376] - una HCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, y regiones marco que comparten al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 24; y

[0377] - una LCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, y regiones marco que comparten al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 25.

[0378] En una realización, la HCVR y/o la LCVR tal como se han definido anteriormente puede caracterizarse por tener una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la HCVR y/o la LCVR particular tal como se definieron anteriormente en esta memoria, mientras que el dominio de unión a CD45RC conserva sus propiedades funcionales generales, en particular su especificidad de unión a CD45RC, preferiblemente a hCD45RC.

[0379] En una realización, la secuencia de las regiones marco de la HCVR y/o la LCVR tal como se definen en el presente documento puede caracterizarse por tener una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la secuencia de las regiones marco de la HCVR y/o la LCVR particular tal como se definen en el presente documento, mientras que el dominio de unión a CD45RC conserva sus propiedades funcionales generales, en particular su especificidad de unión a CD45RC, preferiblemente a hCD45RC.

[0380] En una realización, el dominio de unión a CD45RC está conjugado, opcionalmente a través de un enlazador, a una carga útil.

[0381] Algunos ejemplos de cargas útiles adecuadas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, proteínas, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos.

[0382] Además, o como alternativa, algunos ejemplos de cargas útiles adecuadas incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterápicos, agentes de terapia dirigida, agentes citotóxicos (o citotoxinas), agentes sincronizadores del ciclo celular, ligandos para receptor(es) celular(es), agentes inmunomoduladores, agentes proapoptóticos, péptidos líticos, agentes antiangiogénicos, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, oligonucleótidos codificantes o no codificantes, marcadores fotodetectables, agentes de contraste, radiomarcadores y similares.

[0383] Es evidente que algunas cargas útiles pueden pertenecer a más de una categoría.

[0384] En una realización, la carga útil es un agente quimioterápico. Como se emplea en esta memoria, la expresión"agente quimioterápico"se refiere a cualquier molécula que sea eficaz para inhibir el crecimiento tumoral. Algunos ejemplos adecuados de agentes quimioterápicos incluyen los descritos en el subgrupo L01 del sistema de clasificación anatómica, terapéutica y química.

[0385] Algunos ejemplos adecuados de agentes quimioterápicos incluyen, pero no se limitan a:

[0386] - agentes alquilantes, tales como, p. ej.:

[0387] ■ mostazas nitrogenadas, incluidas clormetina, ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida, clorambucilo, melfalán, prednimustina, bendamustina, uramustina, cloronafazina, colofosfamida, estramustina, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, novembicina, fenesterina, mostaza uracilo y similares;

[0388] ■ nitrosoureas, incluidas carmustina, lomustina, semustina, fotemustina, nimustina, ranimustina, estreptozocina, clorozotocina y similares;

[0389] ■ sulfonatos de alquilo, incluidos busulfán, manosulfán, treosulfán y similares;

[0390] ■ aziridinas, incluidas carboquona, tiotepa, triaziquona, trietilenemelamina, benzodopa, meturedopa, uredopa, y similares; hidrazinas, incluidas procarbazina, y similares;

[0391] ■ triazenos, incluidas dacarbazina, temozolomida y similares; etileniminas y metilamelaminas, incluidas altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforarnida, trimetilolomelamina y similares;

[0392] ■ y otros, incluidos mitobronitol, pipobroman, actinomicina, bleomicina, mitomicinas (incluidas mitomicina C, y similares), plicamicina, y similares;

[0393] - acetogeninas, tales como, p. ej., bullatacina, bullatacinona, y similares;

[0394] - benzodiacepinas, tales como, p. ej., 2-oxoquazepam, 3-hidroxifenazepam, bromazepam, camazepam, carburazepam, clordiazepóxido, cinazepam, cinolazepam, clonazepam, cloniprazepam, clorazepato, ciprazepam, delorazepam, demoxepam, desmetilflunitrazepam, devazepida, diazepam, diclazepam, difludiazepam, doxefazepam, elfazepam, carfluzepato de etilo, dirazepato de etilo, loflazepato de etilo, flubromazepam, fletazepam, fludiazepam, flunitrazepam, flurazepam, flutemazepam, flutoprazepam, fosazepam, gidazepam, halazepam, iclazepam, irazepina, kenazepina, ketazolam, lorazepam, lormetazepam, lufuradom, meclonazepam, medazepam, menitrazepam, metaclazepam, motrazepam, N-desalquilflurazepam, nifoxipam, nimetazepam, nitemazepam, nitrazepam, nitrazepato, nordazepam, nortetrazepam, oxazepam, fenazepam, pinazepam, pivoxazepam, prazepam, proflazepam, quazepam, QH-II-66, reclazepam, RO4491533, Ro5-4864, SH-I-048A, sulazepam, temazepam, tetrazepam, tifluadom, tolufazepam, triflunordazepam, tuclazepam, uldazepam, arfendazam, clobazam, CP-1414S, lofendazam, triflubazam, girisopam, GYKI-52466, GYKI-52895, nerisopam, talampanel, tofisopam, adinazolam, alprazolam, bromazolam, clonazolam, estazolam, flualprazolam, flubromazolam, flunitrazolam, nitrazolam, pirazolam, triazolam, bretazenil, climazolam, EVT-201, FG-8205, flumazenil, GL-II-73, imidazenil, 123I-iomazenil, L-655,708, loprazolam, midazolam, PWZ-029, remimazolam, Ro15-4513, Ro48-6791, Ro48-8684, Ro4938581, sarmazenil, SH-053-R-CH3-2'F, cloxazolam, flutazolam, haloxazolam, mexazolam, oxazolam, bentazepam, clotiazepam, brotizolam, ciclotizolam, descloroetizolam, etizolam, fluclotizolam, israpafant, JQ1, metizolam, olanzapina, telenzepina, lopirazepam, zapizolam, razobazam, ripazepam, zolazepam, zomebazam, zometapina, premazepam, clazolam, antramicina, avizafona, rilmazafona, y similares;

[0395] - antimetabolitos, tales como, p. ej.:

[0396] ■ antifolatos, incluidos aminopterina, metotrexato, pemetrexed, pralatrexato, pteropterina, raltitrexed, denopterina, trimetrexato, pemetrexed y similares;

[0397] ■ análogos de la purina, incluidas pentostatina, cladribina, clofarabina, fludarabina, nelarabina, tioguanina, mercaptopurina y similares;

[0398] ■ análogos de la pirimidina, incluidos fluorouracilo, capecitabina, doxifluridina, tegafur, tegafur/gimeracilo/oteracilo, carmofur, floxuridina, citarabina, gemcitabina, azacitidina, decitabina y similares; y

[0399] ■ hidroxicarbamida;

[0400] - andrógenos, tales como, p. ej., calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, y similares;

[0401] - antiadrenales, tales como, p. ej., aminoglutetimida, mitotano, trilostano y similares;

[0402] - reponedores de ácido fólico, tales como, p. ej., ácido frolínico, y similares;

[0403] - maitansinoides, tales como, p. ej., maitansina, ansamitocinas y similares;

[0405] - análogos del platino, tales como, p. ej., platino, carboplatino, cisplatino, dicicloplatino, nedaplatino, oxaliplatino, satraplatino, y similares;

[0407] - agentes antihormonales, tales como, p. ej.:

[0409] ■ antiestrógenos, incluidos tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, toremifeno y similares;

[0411] ■ antiandrógenos, incluidas flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprorelina, goserelina y similares;

[0412] - tricotecenos, tales como, p. ej., toxina T-2, verracurina A, roridinaA, anguidina y similares;

[0414] - toxoides, tales como, p. ej., cabazitaxel, docetaxel, larotaxel, ortataxel, paclitaxel, tesetaxel, y similares;

[0415] - inhibidores de la topoisomerasa I, tales como, p. ej., belotecán, camptotecina, cositecán, etirinotecán pegol, exatecán, gimatecán, irinotecán, lurtotecán, rubitecán, silatecán, topotecán y similares;

[0417] - inhibidores de la topoisomerasa II, tales como, p. ej., etopósido, tenipósido y similares;

[0419] - otros, tales como, p. ej., camptotecina (incluido el análogo sintético topotecán); briostatina; calilistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (incluidas criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos sus análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; aclacinomisinas; autramicina; azaserina; bleomicina; cactinomicina; carabicina; caninomicina; carzinofilina; cromomicinas; dactinomicina; daunorrubicina; detorrubicina; 6-diazo-5-oxo-L-norleucina; doxorrubicina (incluidas morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, desoxidoxorrubicina y similares); epirubicina; esorubicina; idanrbicina; marcelomicina; ácido micofenólico; nogalarnicina; olivomicinas; peplomicina; potfiromicina; puromicina; quelamicina; rodorrubicina; estreptomgrina; estreptozocina; tubercidina; ubenimex; zinostatina; zorubicina; aceglatona; glucósido aldofosfárnico; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; epotelona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogennanio; ácido tenuazónico; 2,2',2"-triclorotritilarnina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobromtol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido; 6-tioguanina; vinblastina; etopósido; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; inhibidor de la topoisomerasa I SN38; difluorometilornitina; ácido retinoico; y similares.

[0421] En una realización, la carga útil es un agente terapéutico dirigido.

[0423] Como se emplea en esta memoria, la expresión"agente terapéutico dirigido"se refiere a cualquier molécula que está dirigida a una o más moléculas diana particulares (tales como, p. ej., proteínas) implicadas en la génesis tumoral, la progresión tumoral, la metástasis tumoral, la proliferación de células tumorales, la reparación celular y similares.

[0425] Algunos ejemplos adecuados de agentes terapéuticos dirigidos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de serina/treonina cinasa, anticuerpos monoclonales y similares.

[0427] Algunos ejemplos adecuados de agentes terapéuticos dirigidos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de HER1/EGFR (tales como, p. ej., brigatinib, erlotinib, gefitinib, olmutinib, osimertinib, rociletinib, vandetanib, y similares); inhibidores de HER2/neu (tales como, p. ej., afatinib, lapatinib, neratinib, y similares); inhibidores de C-kit y PDGFR (tales como, p. ej., axitinib, masitinib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, toceranib, y similares); inhibidores de FLT3 (tales como, p. ej., lestaurtinib, y similares); inhibidores de VEGFR (tales como, p. ej., axitinib, cediranib, lenvatinib, nintedanib, pazopanib, regorafenib, semaxanib, sorafenib, sunitinib, tivozanib, toceranib, vandetanib, y similares); inhibidores de RET (tales como, p. ej., vandetanib, entrectinib, y similares); inhibidores de c-MET (tales como, p. ej., cabozantinib, y similares); inhibidores de bcr-abl (tales como, p. ej., imatinib, dasatinib, nilotinib, ponatinib, radotinib, y similares); inhibidores de Src (tales como, p. ej., bosutinib, dasatinib, y similares); inhibidores de janocinasa (tales como, p. ej., lestaurtinib, momelotinib, ruxolitinib, pacritinib, y similares); inhibidores de MAP2K (tales como, p. ej., cobimetinib, selumetinib, trametinib, binimetinib, y similares); inhibidores de EML4-ALK (tales como, p. ej., alectinib, brigatinib, ceritinib, crizotinib, y similares); inhibidores de Bruton (tales como, p. ej., ibrutinib, y similares); inhibidores de mTOR (tales como, p. ej., everolimus, temsirolimus, y similares); inhibidores de hedgehog (tales como, p. ej., sonidegib, vismodegib, y similares); inhibidores de CDK (tales como, p. ej., palbociclib, ribociclib, y similares); anticuerpos monoclonales anti-HER1/EGFR (tales como, p. ej., cetuximab, necitumumab, panitumumab, y similares); anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu (tales como, p. ej., ado-trastuzumab emtansina, pertuzumab, trastuzumab, trastuzumab-dkst, y similares); anticuerpos monoclonales anti-EpCAM (tales como, p. ej., catumaxomab, edrecolomab, y similares); anticuerpos monoclonales anti-VEGF (tales como, p. ej., bevacizumab, bevacizumab-awwb, y similares); anticuerpos monoclonales anti-CD20 (tales como, p. ej., ibritumomab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, rituximab, tositumomab, y similares); anticuerpos monoclonales anti-CD30 (tales como, p. ej., brentuximab, y similares); anticuerpos monoclonales anti-CD33 (tales como, p. ej., gemtuzumab, y similares); y anticuerpos monoclonales anti-CD52 (tales como,p. ej.,alemtuzumab, y similares).

[0429] En una realización, la carga útil es un agente citotóxico.

[0431] Como se emplea en esta memoria, las expresiones"agente citotóxico"o"citotoxina"se refieren a cualquier molécula que da como resultado la muerte celular mediante cualquier mecanismo.

[0433] Algunos ejemplos adecuados de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, taxanos, antraciclinas, agentes alquilantes, alcaloides de vinca, antimetabolitos, agentes de platino, esteroides, agentes quimioterápicos y auristatinas.

[0435] Algunos ejemplos adecuados de taxanos incluyen, pero no se limitan a, cabazitaxel, docetaxel, larotaxel, ortataxel, paclitaxel y tesetaxel.

[0437] Algunos ejemplos adecuados de antraciclinas incluyen, pero no se limitan a, aclarubicina, amrubicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, pirarubicina, valrubicina y zorubicina.

[0439] Algunos ejemplos adecuados de agente alquilante incluyen, pero no se limitan a, mostazas nitrogenadas (tales como, p. ej., clormetina, ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida, clorambucilo, melfalán, prednimustina, bendamustina, uramustina, y similares), nitrosoureas (tales como, p. ej., carmustina, lomustina, semustina, fotemustina, nimustina, ranimustina, estreptozocina, y similares), sulfonatos de alquilo (tales como, p. ej., busulfán, manosulfán, treosulfán, y simlares), aziridinas (tales como, p. ej., carboquona, tiotepa, triaziquona, trietilenmelamina, benzodopa, meturedopa, uredopa, y similares), hidrazinas (tales como, p. ej., procarbazina, y similares), triazenos (tales como, p. ej., dacarbazina, temozolomida, y similares), altretamina, mitobronitol, pipobromano, actinomicina, bleomicina, mitomicinas y plicamicina.

[0441] Algunos ejemplos adecuados de alcaloides de la vinca incluyen, pero no se limitan a, vinblastina, vincristina, vinflunina, vindesina y vinorelbina.

[0443] Algunos ejemplos adecuados de antimetabolitos incluyen, pero no se limitan a, antifolatos (tales como aminopterina, metotrexato, pemetrexed, pralatrexato, raltitrexed, pemetrexed, y similares), análogos de la purina (tales como, p. ej., pentostatina, cladribina, clofarabina, fludarabina, nelarabina, tioguanina, mercaptopurina y similares), análogos de pirimidina (tales como, p. ej., fluorouracilo, capecitabina, doxifluridina, tegafur, tegafur/gimeracilo/oteracilo, carmofur, floxuridina, citarabina, gemcitabina, azacitidina, decitabina, y similares), e hidroxicarbamida.

[0445] Algunos ejemplos adecuados de agentes de platino incluyen, pero no se limitan a, carboplatino, cisplatino, dicicloplatino, nedaplatino, oxaliplatino y satraplatino.

[0447] Algunos ejemplos adecuados de esteroides incluyen, pero no se limitan a, moduladores de los receptores de estrógenos, moduladores de los receptores de andrógenos y moduladores de los receptores de progesterona.

[0448] Algunos ejemplos adecuados de agentes quimioterápicos se han descrito anteriormente.

[0450] Algunos ejemplos adecuados de auristatinas incluyen, pero no se limitan a,auristatina E, auristatina F, monometil auristatina E y monometil auristatina F.

[0452] En una realización, la carga útil es un agente sincronizador del ciclo celular.

[0454] Como se emplea en esta memoria, la expresión"agente sincronizador del ciclo celular"se refiere a cualquier molécula capaz de unificar el ciclo celular de una población de células a la misma fase tras su administración.

[0455] Algunos ejemplos de agentes sincronizadores del ciclo celular incluyen, pero no se limitan a, afidicolina,butirolactona I,colicina,cicloheximida,demecolcina,dimetilsulfóxido,5-fluorodesoxiuridina,Hoechst 33342, mimosina,nocodazol,roscovitina ytimidina.

[0457] En una realización, la carga útil es un ligando para un receptor celular.

[0459] Como se emplea en esta memoria, la expresión"ligando para un receptor celular"se refiere a cualquier molécula de unión a un receptor celular (tal como un receptor de la superficie celular, un receptor intracelular o un correceptor, incluidos factores de transcripción y similares), incluidos agonistas y antagonistas, así como agonistas parciales, agonistas inversos y moduladores alostéricos.

[0461] Algunos ejemplos adecuados de ligandos para receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, ligandos que se unen a los receptores de AATYK, los receptores de acetilcolina, los receptores de ADGRG, los receptores de adiponectina, los receptores a1 adrenérgicos, los receptores a2 adrenérgicos, los receptores p1 adrenérgicos, los receptores p2 adrenérgicos, los receptores p3 adrenérgicos, el receptor de adrenomedulina, los receptores de AMPA, los receptores de anafilatoxina, los receptores de angiopoyetina, los receptores de angiotensina, el receptor de hormona antimülleriana, los receptores de apelina, los receptores de asialoglicoproteína, los receptores AXL, el receptor de benzodiazepina, el receptor de ácido biliar, los receptores de bombesina, los receptores de proteína morfogenética ósea, los receptores de bradiquinina, los inhibidores de la angiogénesis específicos del cerebro, los receptores de cadherina, el receptor de calcitonina, el receptor similar al receptor de calcitonina, el receptor sensor de calcio, los receptores cannabinoides, el receptor CD97, los receptores de quimioquinas, los receptores de colecistoquinina, los receptores del complemento, los receptores de la hormona liberadora de corticotropina, los receptores CysLT, los receptores de citocinas, los receptores DDR, los receptores de dopamina, el receptor EBI2, el receptor de ectodisplasina A, los receptores de hormonas similares a la mucina que contienen módulos EGF, los receptores EGF, los receptores de endotelina, los receptores EPH, el receptor de estrógenos, los receptores FGF, los receptores de ácidos grasos libres, los receptores frizzled, el receptor FSH, los receptores GABAB, los receptores de galanina, el receptor GHB, el receptor de ghrelina, los receptores de glucagón, los receptores de péptidos similares al glucagón, los receptores de glutamato, los receptores de glicina, los receptores de gonadotropina, los receptores de la hormona liberadora de gonadotropina, el receptor GPRC6A, los receptores del factor de crecimiento, los receptores de la hormona de crecimiento, el receptor de la hormona liberadora de hormona de crecimiento, los receptores acoplados a la guanilato ciclasa, los receptores HGF, los receptores de histamina, los receptores de ácidos hidroxicarboxílicos, los receptores de inmunoglobulina, los receptores de insulina, los receptores de kainato, el receptor del péptido derivado de KiSSl, los receptores de latrofilina, el receptor de leptina, los receptores de leucotrieno B4, los receptores de proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas, los receptores LTK, el receptor de la hormona luteinizante/coriogonadotropina, los receptores del ácido lisofosfatídico, los receptores de lisofosfolípidos, el receptor de manosa, los receptores MAS, los receptores de la hormona concentradora de melanina, los receptores de melanocortina, los receptores de melatonina, los receptores de proteínas similares a la metuselina, el receptor de motilina, los receptores MuSK, el receptor de N-acetilglucosamina, los receptores de neuromedina, los receptores de neuropéptidos B/W, los receptores de neuropéptidos FF, los receptores de neuropéptidos S, los receptores de neuropéptidos Y, los receptores de neuropilinas, los receptores de neurotensina, el receptor del péptido N-formil, los receptores nicotínicos de acetilcolina, los receptores NMDA, los receptores nucleares, el receptor olfativo, los receptores opioides, los receptores de opsina, los receptores de orexina, el receptor de oxoeicosanoides, el receptor de oxoglutarato, el receptor de oxitocina, los receptores de la hormona paratiroidea, los receptores PDGF, el receptor del polipéptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria de tipo I, el receptor del factor activador de plaquetas, los receptores de progestina y adipoQ, los receptores de procinticina, el receptor de prolactina, el receptor del péptido liberador de prolactina, el receptor de prostaciclina, los receptores de prostaglandina, el receptor activado por proteasa, los receptores PTK7, los receptores purinérgicos de adenosina, los receptores purinérgicos P2X, los receptores purinérgicos P2Y, los receptores de relaxina, los receptores RET, los receptores huérfanos inducibles por ácido retinoico acoplados a proteínas G, los receptores ROR, los receptores ROS, los receptores RYK, los receptores carroñeros, el receptor de secretina, los receptores de serina/treonina-proteína cinasa específicos, los receptores de serotonina, el receptor de lisado, los receptores de somatostatina, los receptores de esfingosina-1-fosfato, los receptores SREB, el receptor estimulador de genes de interferón (STING), el receptor de succinato, los receptores de taquiquinina, el receptor de tromboxano, el receptor de tirotropina, el receptor de la hormona liberadora de tirotropina, los receptores toll-like, los receptores asociados a trazas de aminas, el receptor de transferrina, los receptores Trk, los receptores del factor de necrosis tumoral, los receptores de la tirosina fosfatasa, el receptor de la urotensina-II, los receptores del péptido intestinal vasoactivo, los receptores del péptido intestinal vasoactivo, los receptores de la vasopresina, los receptores del VEGF, el receptor vomeronasal y el receptor del canal iónico activado por zinc.

[0463] En una realización, la carga útil es un agente inmunomodulador.

[0465] Algunos ejemplos adecuados de agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunoestimuladores y agentes inmunodepresores.

[0467] Algunos ejemplos de agentes inmunoestimuladores incluyen los descritos en el subgrupo L03 del sistema de clasificación anatómica, terapéutica y química.

[0469] Algunos ejemplos adecuados de agentes inmunoestimuladores incluyen, pero no se limitan a, citocinas (tales como, p. ej., filgrastim, pegfilgrastim, lenograstim, molgramostim, sargramostim, ancestim, albinterferón, interferón a natural, interferón a 2a, peginterferón a 2a, interferón a 2b, peginterferón a -2b, interferón a nl, interferón alfacon-1, interferón a-n3, interferón p natural, interferón p la, interferón p 1b, interferón y, aldesleucina, oprelvecina, y similares); inhibidores del punto de control inmunitario (tales como, p. ej., inhibidores de CTLA4, PD-1, PD-L1, LAG-3, B7-H3,<b>7-H4, TIM3, A2AR, y/o IDO, incluidos nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, AMP-224, MPDL3280A, MDX-1105, MEDI-4736, arelumab, ipilimumab, tremelimumab, pidilizumab, IMP321, MGA271, BMS-986016, lirilumab, urelumab, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870.893, mogamulizumab, varlilumab, avelumab, galiximab, AMP-514, AUNP 12, indoximod, NLG-919, INCB024360, y similares); agonistas de los receptores tipo Toll (tales como, p. ej., buprenorfina, carbamazepina, etanol, fentanilo, GS-9620, imiqimod, lefitolimod, levorfanol, metadona, morfina, (+)-morfina, morfina-3-glucurónido, ocarbazepina, oxicodona, petidina, resiquimod, SD-101, tapentadol, tilsotolimod, VTX-2337, glucuronoxilomanano deCryptococcus,MALP-2 deMycoplasma,MALP-404 deMycoplasma,OspA deBorrelia,porina deNeisseriaoHaemophilus,hsp60, hemaglutinina, LcrV deYersinia,flagelina bacteriana, lipopolisacárido, ácido lipoteicoico, lipomanano deMycobacterium,glucosilfosfatidilinositol, lisofosfatidilserina, lipofosfoglicano deLeishmania,zimosano deSaccharomyces,Pam2CGDPKHPKSF, Pam3CSK4, oligodeoxinucleótidos CpG, secuencias de ácido nucleico poli(I:C) secuencias de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico poli(A:U), ARN vírico bicatenario, y similares); agonistas del receptor STING (tales como, p. ej., los descritos en el documento WO2017100305, vadimezán, CL656, ADU-S100, 3'3'-cGAMP, 2'3'-<c>G<a>M<p>,<m>L RR-S2 CDG, ML RR-S2 cGAMP, di-GMP cíclico, DMXAA, DiABZI, y similares); ligandos de CD1; hormona de crecimiento; inmunocianina; pegademasa; prolactina; tasonermina; esteroides sexuales femeninos; dihidrocloruro de histamina; poli ICLC; vitamina D; lentinan; plerixafor; roquinimex; mifamurtida; acetato de glatiramer; timopentina; timosina a1; timulina; polinosínico:ácido policitidílico; pidotimod; Bacillus Calmette-Guérin; vacuna contra el melanoma; sipuleucel-T; y similares.

[0471] Algunos ejemplos de agentes inmunodepresores adecuados incluyen los descritos en el subgrupo L04 del sistema de clasificación anatómica, terapéutica y química.

[0473] Algunos ejemplos adecuados de agentes inmunodepresores incluyen, pero no se limitan a:.

[0475] - antimetabolitos, tales como, p. ej.:

[0477] ■ antifolatos, incluidos aminopterina, metotrexato, pemetrexed, pralatrexato, pteropterina, raltitrexed, denopterina, trimetrexato, pemetrexed y similares;

[0479] ■ análogos de la purina, incluidas pentostatina, cladribina, clofarabina, fludarabina, nelarabina, tioguanina, mercaptopurina y similares;

[0481] ■ análogos de la pirimidina, incluidos fluorouracilo, capecitabina, doxifluridina, tegafur, tegafur/gimeracilo/oteracilo, carmofur, floxuridina, citarabina, gemcitabina, azacitidina, decitabina y similares; y

[0483] ■ hidroxicarbamida;

[0485] - macrólidos, tales como, p. ej., tacrolimus, ciclosporina, pimecrolimus, abetimus, gusperimus, y similares;

[0486] - fármacos inmunomoduladores de imida, tales como, p. ej., lenalidomida, pomalidomida, talidomida, apremilast y similares;

[0488] - antagonistas de los receptores de la IL-1, tales como, p. ej., anakinra y similares;

[0490] - inhibidores de mTOR, tales como, p. ej., sirolimus, everolimus, ridaforolimus, temsirolimus, umirolimus, zotarolimus, y similares;

[0492] - anticuerpos dirigidos al suero, tales como, p. ej., eculizumab, adalimumab, afelimomab, certolizumab pegol, golimumab, infliximab, nerelimomab, mepolizumab, omalizumab, faralimomab, elsilimomab, lebrikizumab, ustekinumab, secukinumab, y similares;

[0494] - anticuerpos de direccionamiento celular, tales como, p. ej., muromonab-CD3, otelixizumab, teplizumab, visilizumab, clenoliximab, keliximab, zanolimumab, efalizumab, erlizumab, obinutuzumab, rituximab, ocrelizumab, pascolizumab, gomiliximab, lumiliximab, teneliximab, toralizumab, aselizumab, galiximab, gavilimomab, ruplizumab, belimumab, blisibimod, ipilimumab, tremelimumab, bertilimumab, lerdelimumab, metelimumab, natalizumab, tocilizumab, odulimomab, basiliximab, daclizumab, inolimomab, zolimomab aritox, atorolimumab, cedelizumab, fontolizumab, maslimomab, morolimumab, pexelizumab, reslizumab, rovelizumab, siplizumab, talizumab, telimomab aritox, vapaliximab, vepalimomab, y similares;

[0496] - anticuerpos de fusión, tales como, p. ej., abatacept, belatacept, etanercept, pegsunercept, aflibercept, alefacept, rilonacept y similares.

[0498] En una realización, la carga útil es un agente proapoptótico.

[0499] Como se emplea en esta memoria, la expresión"agente proapoptótico"se refiere a cualquier molécula capaz de inducir la apoptosis o muerte celular programada en una célula tras la administración.

[0501] Algunos ejemplos de agentes proapoptóticos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la histona deacetilasa (tales como, p. ej., butirato sódico, depsipéptido y similares), bortezomib, deguelina, favopiridol, fenretinida, fludarabina, kaempferol, miltefosina, narciclasina, obatoclax, oblimersen y oncrasina.

[0503] En una realización, la carga útil es un péptido lítico.

[0505] Como se emplea en esta memoria, la expresión"péptido lítico"se refiere a un péptido que tiene la capacidad de lisar o perforar membranas.

[0507] Algunos ejemplos de péptidos líticos incluyen, sin limitación, LL-37, a-defensinas, p-defensinas, 0-defensinas, dermcidina, histatina, perforina, cecropinas, dermaseptina, magainón, melitina, nisina, neumolisina y toxinas..

[0509] Algunos ejemplos de toxinas incluyen, sin limitación, toxinas bacterianas (tales como, p. ej., toxina tetánica deClostidium tetani,tetanolisina deClostidium tetani,toxina alfa deClostidium perfringens,enterotoxina deClostidium perfringens,toxina A deClostidium difficile,toxina B deClostidium difficile,toxina deClostidium botulinum,exoenzima C3 deClostridium botulinum,toxina del ántrax, listeriolisina O, toxina alfa deStaphylococcus aureus,toxina beta deStaphylococcus aureus,toxina delta deStaphylococcus aureus,factor de aglutinación A deStaphylococcus aureus,proteína de unión a fibronectina AStaphylococcus aureus,exfoliatina, toxina del síndrome de shock tóxico, enterotoxina tipo B, factor del cordón umbilical, toxina diftérica, estreptolisina, leucocidina, toxina shiga, toxina similar a la shiga, enterotoxina termoestable, toxina del cólera, toxina pertussis, exotoxina dePseudomonas,adenilato ciclasa extracelular, endotoxina delta deBacillus thuringiensis),micotoxinas (tales como, p. ej., aflatoxina, alfa-amanitina, beta-amanitina, gamma-amanitina, épsilon-amanitina, ácido p-nitropropiónico, citrinina, citocalasina, ergotamina, fumonisina B1, fumonisina B2, fumonisina B3, fumonisina B4, gliotoxina, ácido iboténico, lolitrem B, muscimol, ocratoxina, patulina, faloidina, esterigmatocistina, tricoteceno, vomitoxina, zeranol, zearalenona), toxinas vegetales (como, por ejemplo.g., amigdalina, anisatina, antiarina, brucina, chaconina, cicutoxina, dafnina, delfinina, divicina, ácido djenkólico, falcarinol, gosipol, helenalina, ledol, linamarina, lotaustralina, mimosina, enantotoxina, oleandrina, persina, protoanemonina, pseudaconitina, retronecina, resiniferatoxina; escopolamina, solamargina, solanidina, solanina, solasodamina, solasodina, solasonina, solauricidina, solauricina, estricnina, swainsonina, tagetitoxina, tinyatoxina, tomatina, abrina, ricina, tutina), toxinas de invertebrados (tales como, p. ej., toxina de insectoAndroctonus australis hector,caribdotoxina, maurotoxina, agitoxina, margatoxina, eslotoxina, escilatoxina, hefutoxina, HgeTx1, HsTx1, Lq2, birtoxina, bestoxina, BmKAEP, faiodotoxina, imperatoxina, Pi3, latrotoxina, CSTX, cupiennins, PhTx3, stromatoxina, vanillotoxina, huwentoxina, conotoxina, eledoisina, onchidal, saxitoxina, tetrodotoxina), y toxinas de vertebrados (tales como, p. ej., ciguatera, tetrodotoxina, (+)-allopumiliotoxina 267A, batracotoxina, arenobufagina, bufotalina, bufotenina, cinobufagina, marinobufagina, epibatidina, histrionicotoxina, pumiliotoxina 251D, samandarina, samandaridina, taricatoxina, zetekitoxina AB, alfa-bungarotoxina, beta-bungarotoxina, calciseptina, taicatoxina, calcicludina, cardiotoxina III).

[0511] En una realización, la carga útil es un agente antiangiogénico.

[0513] Como se emplea en esta memoria, la expresión"agente antiangiogénico"se refiere a una molécula que reduce o previene la angiogénesis, que es responsable del crecimiento y desarrollo de vasos sanguíneos.

[0514] Algunos ejemplos adecuados de agentes antiangiogénicos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de cualquiera de los factores de crecimiento endotelial vascular VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, o VEGF-D, que son inductores principales de la angiogénesis en condiciones normales y patológicas, y son esenciales en la vasculogénesis embrionaria.

[0516] Además o como alternativa, un agente antiangiogénico también puede inhibir otros factores angiogénicos, tales como, sin limitación, un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), tal como FGF-1 (ácido), FGF-2 (básico), FGF-4 o FGF-5; o angiopoyetina-1, un factor que señala a través del receptor tirosina cinasa Tie2 específico de células endoteliales; o el receptor de cualquiera de estos factores angiogénicos.

[0517] En una realización, la carga útil es una citocina.

[0519] Algunos ejemplos adecuados de citocinas incluyen, pero no se limitan a, quimiocinas, factores de necrosis tumoral, interleucinas y factores estimulantes de colonias.

[0521] Algunos ejemplos adecuados de quimiocinas incluyen, pero no se limitan a, ligando de quimiocina con motivo C-C (CCL) 1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, ligando con motivo C-X-C de quimioquinas (CXCL) 1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, fractalcina, ligando con motivo C de quimiocinas (XCL) 1 y XCL2.

[0523] Algunos ejemplos adecuados de factores de necrosis tumoral incluyen, pero no se limitan a, factor de necrosis tumoral (TNF) a, linfotoxina, OX40L, CD40LG, ligando Fas, CD70, CD153, ligando 4-1BB, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), ligando activador del receptor del factor nuclear<k>-B (RANKL), ligando inductor de proliferación (APRIL), factor activador de linfocitos B (BAFF) y ectodisplasina A (EDA).

[0525] Algunos ejemplos adecuados de interleucinas incluyen, pero no se limitan a, interleucina (IL) 1a, IL-1 p, IL-1 Ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36a, IL-36p, IL-36<y>, IL-36Ra, IL-37, IL-38, interferón (IFN) a, IFNp, IFN<k>e IFNw.

[0527] Algunos ejemplos adecuados de factores estimulantes de colonias incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (incluidos el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)), hematopoyetina y trombopoyetina.

[0529] En una realización, la carga útil es un factor de crecimiento.

[0531] Algunos ejemplos adecuados de factores de crecimiento incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, factor de crecimiento transformante (TGF) a, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar al EGF ligado a la heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante (TGF) p, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) 1, IGF2, factor de crecimiento derivado de plaquetas (P<d>G<f>) subunidad A (PDGFA), subunidad B de PDGF (<p>D<g>FB), subunidad C de PDGF (PDGFC), subunidad D de PDGF (PDGFD), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A, VEGF-B, VEGF-C, v Eg F-D, factor de crecimiento placentario (PGF), factor de crecimiento nervioso (NGF) y factor de crecimiento hepatocitario (HGF).

[0533] En una realización, la carga útil es una hormona.

[0535] Algunos ejemplos de hormonas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, GnRH, TRH, dopamina, CRH, GHRH, somatostatina, MCH, oxitocina, vasopresina, FSH,<l>H, TSH, prolactina, POMC, CLIP, ACTH, MSH, endorfinas, lipotropina, GH, aldosterona, cortisol, cortisona, DHEA, DHEA-S, androstenediona, epinefrina, norepinefrina, hormona tiroidea T3, hormona tiroidea T4, calcitonina, PTH, testosterona, AMH, inhibina, estradiol, progesterona, activina, relaxina, GnSAF, hCG, HPL, estrógeno, glucagón, insulina, amilina, polipéptido pancreático, melatonina, N,N-dimetiltriptamina, 5-metoxi-N,N-dimetiltriptamina, timosina a1, timosinas beta, timopoyetina, timulina, gastrina, grelina, CCK, GIP, GLP-1, secretina, motilina, VIP, enteroglucagón, péptido YY, IGF-1, IGF-2, leptina, adiponectina, resistina, osteocalcina, renina, EPO, calcitriol, prostaglandina, ANP y BNP.

[0537] En una realización, la carga útil es un oligonucleótido codificante o no codificante.

[0539] Algunos ejemplos adecuados de oligonucleótidos codificantes o no codificantes incluyen, pero no se limitan a, ARN mensajero (ARNm), ARN antisentido (ARNas), ARN pequeño de interferencia (ARNpi), microARN (miARN), ARN largo no codificante (ARNlnc) (tales como, p. ej., ARN de transferencia [ARNt], ARN ribosómico [ARNr], y similares), ARN temporal pequeño (ARNt), ARNip trans-activo, ARN en horquilla corta (ARNhc), transcritos cis-naturales antisentido (NAT), ARN CRISPR, ARN no codificante largo, ARN que interactúa con piwi (ARNip), ARNip asociado a repeticiones (ARNpiar), aptámeros de ARN, ribozimas y similares.

[0541] Otros ejemplos adecuados de oligonucleótidos codificantes o no codificantes incluyen, pero no se limitan a, recapuldencel-T, TriMix, BI-1361849, nusinersen, volanesorsen sodio, eteplirsen, ATL1105, ASM-8, inclisiran, patisiran, RXI-109, fitusiran, cemdisiran, QPI-1002, BMS-986263, PF-655, pegaptanib, avacincaptad pegol sódico, olaptesed pegol, emapticap pegol, SPC3649, bevasiranib, AGN-745, QPI-1007, TD101, SYL040012, SYL1001, Excellair, ALN-RSV01, CEQ508, siG12D LODER, TKM-ApoB, TKM-PLK1, ALN-VSP02, ALN-TTR01, Bcr-Abl ARNpi, Atu027, 15NP,<c>A<l>AA-01, vacuna FANG, iPsiRNA, ARNhc Tat/Rev, ARC1779, ARC19499, AS1411 (AGRO001), Fovista, NOX-A12, NOX-E36, NOX-H94, NU172, RB006 más RB007, ARC1905, así como los descritos en las tablas 1 y 2 de Crookeet al.,2018 (Cell Metab. 27(4):714-739), que se incorpora en la presente memoria por referencia.

[0543] En una realización, la carga útil es un marcador fotodetectable.

[0545] Como se emplea en esta memoria, la expresión"marcador fotodetectable"o el término"fluoróforo"se refieren a un resto que puede reemitir luz tras la excitación con luz.

[0547] Algunos ejemplos de marcadores fotodetectables incluyen, pero no se limitan a, colorantes Alexa Fluor®, colorantes BODIPY®, fluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-(4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceína, 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), QFITC, Oregon Green™ 488, Oregon Green® 514, rodamina y derivados de los mismos (tales como, p. ej., verde rodamina, verde rodamina-X, rojo rodamina-X, X-rodamina, 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), lisamina rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101 (Texas Red), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC)), eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina, eritrosina B, isotiocianato de eritrosina, Texas Red®, Texas Red®-X, naftofluoresceína, verde malaquita, isotiocianato de verde malaquita, derivados de cumarina, Pacific Orange, azul cascada, amarillo cascada, cloruro de dansilo, colorante dapoxilo, 1-dimetilamina-W(2-azidoetil)naftaleno-5-sulfonamida, 6-(6-amino-2-(2-azidoetil)-1,3-dioxo-1 H-benzo(cfe)-2(3H)isoquinolina, 6-(6-amino-2-(2-propinil)-1,3-dioxo-1 H-benzo(ate)-2(3H)isoquinolina, 8-(4-azidoetiloxifenil)-2,6-dietil-1,3,5,7-tetrametil-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno, 8-(4-propiniloxifenil)-2,6-dietil-1,3,5,7-tetrametil-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno, 1 -(3-azido-propoxi)-7-metilamino-fenoxazin-3-ona, 1 -(2-propinil)-7-metilaminofenoxazm-3-ona, cloruro de W-(5-(3-azidopropilamino)-9H-benzo(a)-fenoxa-2-in-9-iliden)-W-metil-metanaminio, cloruro de W-(5-(3-propinil-amino)-9H-benzo(a)-fenoxazin-9-ilen)-W-metil-metanaminio, perclorato de (9-(3-azido-propoxi)-7-piperidin-l-il-fenoxazin-3-ilideno)-dimetilamonio, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'-disulfónico, acridina, isotiocianato de acridina, ácido 5-(2'-aminoetil)amino-naftaleno-1-sulfónico, 4-amino-W-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato, W-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, amarillo brillante, cumarina, derivados de cumarina, 7-amino-4-metilcumarina, 7-amino-trifluorometilcumarina, cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenilindol, 5',5"-dibromopirogalol-sulfoneftaleína, ácido 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina-4,4'-isotiocianato-dihidroestilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, etidio, IR144, IR1446, 4-metilumbeliferona, o-cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, Rojo Fenol, B-ficoeritrina, o-ftaldialdehído, pireno, butirato de pireno, succinimidil butirato de 1-pireno, rojo reactivo 4, riboflavina, ácido rosólico, quelatos de lantánidos, puntos cuánticos, cianinas, colorantes de pirelio y escuarinas.

[0549] En una realización, la carga útil es un agente de contraste.

[0551] Como se emplea en esta memoria, la expresión"agente de contraste"se refiere a cualquier molécula utilizada para aumentar el contraste de las estructuras o fluidos dentro del cuerpo en los procedimientos médicos de diagnóstico por la imagen. Los agentes de contraste absorben o alteran el electromagnetismo externo o los ultrasonidos (a diferencia de los radiomarcadores, que emiten radiación por sí mismos).

[0553] Algunos ejemplos de radiomarcadores son los descritos en el subgrupo V08 del sistema de clasificación anatómica, terapéutica y química.

[0555] Algunos ejemplos adecuados de agentes de contraste incluyen, pero no se limitan a, ácido diatrizoico, ácido metrizoico, yodamida, ácido iotalámico, ácido ioxitalámico, ácido ioglícico, ácido acetrizoico, ácido iocármico, metiodal, diodona, metrizamida, iohexol, ácido ioxagílico, iopamidol, iopromida, iotrolan, ioversol, iopentol, iodixanol, iomeprol, iobitridol, ioxilan, ácido iodoxámico, ácido iotróxico, ácido ioglicámico, adipiodona, ácido iobenzámico, ácido iopanoico, ácido iocetámico, iopodato sódico, ácido tiropanoico, iopodato cálcico, iopiodol, propiliodona, iofendilato, lipiodol, sulfato de bario, ácido gadobénico, gadobutrol, gadodiamida, gadofosveset, gadolinio, ácido gadopentético, ácido gadoterico, gadoteridol, gadoversetamida, ácido gadoxético, citrato de amonio férrico, mangafodipir, ferumoxsil, ferristeno, perflubron, microesferas de albúmina humana, micropartículas de galactosa, perflenapent, microesferas de fosfolípidos, hexafluoruro de azufre, y similares.

[0556] En una realización, la carga útil es un radiomarcador.

[0558] Como se emplea en esta memoria, el término"radiomarcador", "radiofarmacéutico"o"radioisótopo"se refieren a cualquier molécula que emita radiación. Los radiomarcadores pueden utilizarse con fines terapéuticos o de diagnóstico.

[0560] Algunos ejemplos de radiomarcadores son los descritos en los subgrupos V09 y V10 del sistema de clasificación anatómica, terapéutica y química.

[0562] Algunos ejemplos adecuados de radiomarcadores incluyen, pero no se limitan a, compuestos de 99mTc (tales como, p. ej., exametazima, ácido medrónico, albúmina macroagregada, sestamibi, tetrofosmina, exametazima, sulesomab, tilmanocept, arcitumomab, votumumab, hynicoctreotide, y similares); compuestos de 123I, 125I o 131I (tales como, p. ej., yoflupano, yofetamina, yomazenil, yodohippurato sódico, yobenguano, yodocolesterol, minretumomab, tositumomab y similares); compuestos de 18F (tales como, p. ej., florbetapir, flutemetamol, fluciclovina, fludeoxiglucosa, fluoroetiltirosina, fluoruro sódico, y similares); compuestos de 64Cu (tales como, p. ej., Cu-ETS2, y similares); compuestos de 75Se (tales como, p. ej., SeHCAT); compuestos de 111In (tales como, p. ej., imciromab, capromab pendetida, satumomab pendetida, y similares); compuestos de 82Rb (tales como, p. ej., cloruro de rubidio); compuestos de 153Sm (tales como, p. ej., lexidronam, y similares); compuestos de 89Sr (tales como, p. ej., cloruro de estroncio-89, y similares); compuestos de 90Y (tales como, p. ej., ibritumomab tiuxetan, y similares); compuestos de 223Ra (tales como, p. ej., cloruro de radio-223, y similares); compuestos de 177Lu (tales como, p. ej., oxodotreótida, y similares); y cualquier compuesto que comprenda al menos un átomo de 2H, 3H, 11C, 13N, 14C, 15O, 18F, 22Na, 24Na, 2P, 33P, 40K, 47Ca, 51Cr, 55Eu, 57Co, 58Co, 60Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 75Se, 81mKr, 82Rb, 89Sr, 90Sr, 90Y, 97Tc, 99mTc, 103Pd, 106Ru, 107Pd, 111In, 113Cd, 121Sn, 123I, 124I, 125I, 126Sn, 129I, 131I, 133Xe, 135Cs, 137Cs, 153Sm, 165Dy, 169Er, 177Lu, 186Re, 192Ir, 198Au, 201Tl, 213Bi, 223Ra, y/o 225Ra.

[0563] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con auristatina o un análogo, derivado o profármaco de la misma. Se ha demostrado que las auristatinas interfieren en la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis del GTP y la división nuclear y celular (Woykeet al.,2001. Antimicrob Agents Chemother.

[0564] 46(12):3802-8) y tienen actividad anticancerígena (Patente de EE. UU. 5,663,149) y antifúngica (Pettitet al.,1998. Antimicrob Agents Chemother. 42(11 ):2961 -5). Por ejemplo, la auristatina E puede hacerse reaccionar con ácido paraacetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados típicos de la auristatina son la auristatina F, la MMAF (monometil auristatina F) y la MMAE (monometil auristatina E). Se describen auristatinas y análogos, derivados y profármacos de la auristatina adecuados, así como enlazadores adecuados para la conjugación de auristatinas con anticuerpos, en, p. ej., las patentes de EE. UU. 5,635,483, 5,780,588 y 6,214,345 y en las publicaciones de patente internacionales WO 2002/088172, WO 2004/010957, WO 2005/081711, WO 2005/084390, WO 2006/132670, WO 2003/026577, WO 2007/00860, WO 2007/011968 y WO 2005/082023.

[0566] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con una pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepina (PDB) (tales como, p. ej., antramicina) o un análogo, derivado o profármaco de la misma. En la técnica se describen PDB y derivados de PDB adecuados, así como las técnicas relacionadas.

[0568] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con un resto citotóxico seleccionado entre antraciclina, maitansina, caliqueamicina, duocarmicina, raquelmicina (CC-1065), dolastatina 10, dolastatina 15, irinotecán, monometil auristatina E, monometil auristatina F, un PDB, o un análogo, derivado o profármaco de cualquiera los mismos.

[0570] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con una antraciclina o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0572] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con maitansina o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0574] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con caliqueamicina o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0576] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con duocarmicina o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0578] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con raquelmicina (CC-1065) o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0580] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga con dolastatina o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0582] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con monometil auristatina E o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0584] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con monometil auristatina F o un análogo, derivado o profármaco de la misma.

[0586] En una realización, el dominio de unión a CD45RC se conjuga con irinotecán o un análogo, derivado o profármaco del mismo.

[0588] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD45RC, y preferiblemente a hCD45RC. Por lo tanto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención es un"anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo",y preferiblemente un"anticuerpo anti-hCD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo".

[0590] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos un dominio de unión a CD45RC, como se ha definido anteriormente.

[0592] Todas las características y realizaciones descritas anteriormente para los dominios de unión a CD45RC se aplican, cambiando lo que sea necesario, al anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo. A continuación se definen características adicionales.

[0593] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo policlonal. Preferiblemente, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal.

[0595] Los métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales, así como sus fragmentos, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).

[0597] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un isotipo seleccionado del grupo que comprende o consiste en IgG (incluidas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA (incluidas IgA1 e IgA2), IgD e IgE.

[0599] La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de éste para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad dependiente de células y la fagocitosis. Por lo tanto, como se analiza en el presente documento, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse sobre la base de si es deseable que el anticuerpo medie en la citotoxicidad/fagocitosis. La determinación o selección del isotipo de un anticuerpo puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica.

[0601] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena pesada (abreviada como HCCR o C<h>) y/o región constante de cadena ligera (abreviada como LCCR o C<l>).

[0603] En una realización, la HCCR y/o la región constante de cadena ligera LCCR son HCCR y/o LCCR murinas.

[0604] En una realización, la HCCR y/o la región constante de cadena ligera LCCR, preferiblemente ambas, son humanas o humanizadas.

[0606] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCCR humana o humanizada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; o una HCCR humana o humanizada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %,<8 5>%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.

[0609]

[0612] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCCR humana o humanizado que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27; o una HCCR humana o humanizada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.

[0613]

[0615] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCCR humana o humanizado que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28; o una HCCR humana o humanizada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %,<8 5>%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.

[0618]

[0619] _________________________________________________________________

[0620] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una LCCR humana o humanizado que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; o una LCCR humana o humanizada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.

[0623]

[0625] Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:

[0626] - una HCVR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24;

[0627] - una LCVR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25;

[0628] - una HCCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 26, 27 o 28, preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; y

[0629] - una LCCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.

[0630] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: - una HCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, y regiones marco que comparten al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 24;

[0631] - una LCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, y regiones marco que comparten al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 25;

[0632] - una HCCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 26, 27 o 28, preferiblemente con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID<n>O: 26; y

[0633] - una LCCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29;

[0635] mientras que el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo conserva sus propiedades funcionales generales, en particular su especificidad de unión a CD45RC, preferiblemente a hCD45RC.

[0636] Se apreciará que el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo puede modificarse usando métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, o mejorar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Estas modificaciones son conocidas en la técnica.

[0638] Por ejemplo, para ralentizar el aclaramientoin vivoy obtener un perfil farmacocinético más deseable, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo puede modificarse con polietilenglicol (PEG). Se describen métodos para realizar una conjugación con PEG de sitio específico en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en, p. ej., Leonget al.,2001. Cytokine. 16(3):106-19 o Delgadoet al.,1996. Br J Cancer. 73(2):175-82.

[0640] Otro ejemplo no limitante de modificación consiste en la modificación de la región Fc humana del anticuerpo para aumentar su afinidad por un receptor Fcy. Algunos métodos para potenciar la unión al receptor Fcy incluyen modificaciones de la secuencia primaria de aminoácidos del fragmento Fc, particularmente de la HCCR, y modificaciones de las estructuras y contenido de carbohidratos del fragmento Fc.

[0642] Por consiguiente, se sabe que los anticuerpos que comprenden un contenido reducido de fucosa mejoran la respuesta de ADCC y/o ADCP. De hecho, se ha demostrado que la eliminación del resto central de a-1,6-fucosa de los oligosacáridos del fragmento Fc mejora la actividad de ADCC y/o ADCP a través de una mejor unión al receptor FcyRIII (véase, p. ej., Carter, 2001. Nat Rev Cancer. 1 (2):118-29; Kandaet al.,2007. Glycobiology. 17(1 ):104-18; Shieldset al.,2002. J Biol Chem. 277(30):26733-40; Shinkawaet al.,2003. J Biol Chem. 278(5):3466-73; Niwaet al.,2004. Cancer Res. 64(6):2127-33; la publicación de patente internacional WO 2014/140322).

[0644] Por tanto, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un contenido reducido de fucosa.

[0646] La expresión "contenido de fucosa", como se emplea en esta memoria, se refiere al porcentaje de formas fucosiladas dentro de los N-glicanos unidos al resto N297 del fragmento Fc de cada cadena pesada de cada anticuerpo (correspondiente a N180 de la SEQ ID NO: 26 o 27).

[0648] La expresión"contenido de fucosa reducido",como se emplea en esta memoria, se refiere a un contenido de fucosa inferior o igual al 85 %. Ventajosamente, el contenido de fucosa se encuentra en el intervalo de aproximadamente el 65 % a aproximadamente el 85 %. Como alternativa, el contenido de fucosa puede ser inferior o igual al 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, o incluso inferior, tal como del 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % o 20 %. Sin embargo, no es necesario que el contenido de fucosa sea cero, y puede ser, por ejemplo, mayor o igual al 5 %, 10 %, 15 % o 20 %.

[0650] También se ha sugerido que el nivel de otra glicoforma, el carbohidrato bisecado ligado a N, aumenta la ADCC y/o la ADCP (véase, p. ej., Umañaet al.,1999. Nat Biotechnol. 17(2):176-80; Hodoniczkyet al.,2005. Biotechnol Prog. 21 (6):1644-52).

[0652] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además diferentes tipos de glicosilación (N-glicanos del tipo oligomanosa o complejo biantenario, con una proporción variable de restos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisecantes o restos de galactosa en el caso de N-glicanos de tipo complejo biantenario), siempre que tengan un contenido reducido de fucosa como se definió anteriormente (Publicación de patente internacional WO 2007/048077). Por ejemplo, los anticuerpos que tienen un contenido reducido de fucosa pueden obtenerse mediante métodos descritos, p. ej., en la publicación de patente europea EP 1 176 195 o en las publicaciones de patente internacional WO 2001/077181 o WO 2012/041768.

[0654] Los N-glicanos del tipo oligomanosa tienen una semividain vivoreducida en comparación con los N-glicanos del tipo complejo biantenario. Por consiguiente, ventajosamente, el anticuerpo anti-CD45RC o el fragmento de unión a antígeno del mismo tienen en sus sitios de N-glicosilación del fragmento Fc estructuras de glicanos del tipo complejo biantenario, con un contenido reducido de fucosa, como se definió anteriormente.

[0656] Se han descrito y son conocidas en la técnica diversas variantes de fragmentos Fc con afinidad de unión optimizada para los receptores Fcy y/o ADCC y/o ADCP mejoradas.

[0657] En una realización, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga, opcionalmente a través de un enlazador, con una carga útil. Algunos ejemplos adecuados de cargas útiles se han descrito anteriormente en el contexto de los dominios de unión a CD45RC, que se aplican aquí cambiando lo que sea necesario.

[0658] En una realización, la carga útil es un fármaco. Los conjugados entre un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y un fármaco son conocidos en la técnica como"conjugados anticuerpo-fármaco"o"ADC".

[0659] En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un receptor quimérico para el antígeno (CAR) que se une específicamente a CD45RC, y preferiblemente a hCD45RC. Por lo tanto, el CAR de la invención es un"CAR anti-CD45RC",y preferiblemente un"CAR anti-hCD45RC".

[0660] En una realización, el CAR anti-CD45RC comprende:

[0661] (i) al menos un dominio extracelular de unión a CD45RC, preferiblemente al menos un dominio extracelular de unión a hCD45RC, como se ha descrito anteriormente;

[0662] (ii) opcionalmente, un dominio bisagra extracelular;

[0663] (iii) al menos un dominio transmembrana; y

[0664] (iv) al menos un dominio de señalización intracelular que comprende al menos un dominio de señalización primaria y, opcionalmente, uno o más dominios de señalización coestimuladores.

[0665] En una realización, el CAR comprende al menos un dominio extracelular de unión a CD45RC, como se ha descrito anteriormente.

[0666] En una realización, el dominio extracelular de unión a CD45RC es un scFv de unión a CD45RC.

[0667] En una realización, el CAR comprende dos o más dominios extracelulares de unión a antígeno, al menos uno de los cuales es un dominio de unión a CD45RC, como se ha descrito anteriormente, y al menos uno de los cuales se une específicamente a un antígeno distinto de CD45RC. Por lo tanto, un CAR de este tipo es capaz de unirse al menos a dos antígenos diferentes, uno de los cuales es CD45RC.

[0668] En una realización, el dominio extracelular de unión a antígeno, en particular el dominio extracelular de unión a CD45RC, está conectado a un dominio transmembrana a través de un dominio bisagra.

[0669] En una realización, el dominio bisagra es un enlazador polipeptídico corto, que preferiblemente tiene una longitud en el intervalo de 2 a 25 aminoácidos. En una realización, el dominio bisagra es un enlazador similar al enlazador entre los dominios V<h>y V<l>en un scFv, como se ha descrito anteriormente.

[0670] En una realización, el dominio bisagra es un enlazador de glicina-serina como se ha descrito anteriormente, tal como, p. ej.. un enlazador (GS)n, un enlazador (G<2>S)n, un enlazador (G3S)n, un enlazador (G4S)n, etc., siendo n un número entero positivo. En una realización, n es igual a 1,2, 3, 4, 5 o más. En una realización, el dominio bisagra puede ser un enlazador de glicina-serina con una cualquiera de las SEQ ID NO: 30-39.

[0671] Otro ejemplo de dominio bisagra adecuado se describe en la publicación de patente internacional WO 2012/138475, que se incorpora en la presente memoria por referencia.

[0672] En una realización, el dominio bisagra puede ser cualquiera de las SEQ ID NO: 40-44.

[0675]

[0676] En una realización, el dominio bisagra comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una bisagra de CD8 con la SEQ ID NO: 45 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 45.

[0679]

[0682] En otra realización, el dominio bisagra comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una bisagra de IgG4 con la SEQ ID NO: 46 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 46.

[0685]

[0688] En otra realización, el dominio bisagra comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una bisagra de IgD con la SEQ ID NO: 47 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 47.

[0691]

[0692] ______________________________________________________

[0694] En otra realización, el dominio bisagra comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una bisagra de CD28 con la SEQ ID NO: 48 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 48.

[0697]

[0700] Algunos ejemplos de dominios transmembrana que pueden usarse en el CAR según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, dominios transmembrana de una cadena a, p o Z de un receptor de linfocitos T, o de CD28, CD3<y>, CD35, CD3s, CD3Z, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, subunidad a de LFA-1 (CD11a), subunidad p de LFA-1 (CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2Rp, IL2R<y>, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly-9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (Ly-108), SLAMF1 (CD150), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D y NKG2C.

[0702] En una realización, el dominio transmembrana puede comprender todo el dominio transmembrana de la molécula de la que se deriva, o puede comprender únicamente un fragmento funcional y/o estructural o una variante del mismo.

[0703] En una realización, el dominio transmembrana comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de un dominio transmembrana de CD8 con la SEQ ID NO: 49, o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 49.

[0706]

[0708] En otra realización, el dominio transmembrana comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de un dominio transmembrana de CD28 con la SEQ ID NO: 50, o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 50.

[0711]

[0713] Como se emplea en esta memoria, la expresión"dominio de señalización intracelular"se refiere a una porción intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular genera una señal que promueve una función efectora inmunitaria de la célula inmunitaria que contiene el CAR. Algunos ejemplos de funciones efectoras inmunitarias en una célula inmunitaria con CAR incluyen, sin limitación, actividad citolítica, actividad supresora, actividad reguladora y actividad ayudante, incluida la secreción de citocinas.

[0714] En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende al menos un dominio de señalización primario, y opcionalmente, uno o más dominios de señalización coestimuladores.

[0715] El dominio de señalización primario, también denominado endodominio, es citoplasmático, y permite transducir la señal de función efectora y dirigir a la célula inmunitaria que contiene el CAR para que realice su función especializada tras la unión del dominio de unión extracelular a su antígeno.

[0716] Algunos ejemplos de dominio de señalización primario incluyen, pero no se limitan a, la cadena Z del receptor de linfocitos T o cualquiera de sus homólogos (tales como, p. ej., cadena n, cadenas FcsRI<y>y P, cadena MB1 (Iga), cadena B29 (Igp), etc.), polipéptidos de CD3 (tales como, p. ej., A, 5 y s), tirosina cinasas de la familia syk (tales como, p. ej., Syk, ZAP 70, etc.), tirosina cinasas de la familia src (tales como, p. ej., Lck, Fyn, Lyn, etc.) y otras moléculas implicadas en la transducción de linfocitos T, tales como, p. ej., CD2, CD5 y CD28. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede ser la cadena CD3Z humana, FcyRIlI, FcsRI, colas citoplasmáticas de receptores Fc, motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores (ITAM) portador de receptores citoplasmáticos o combinaciones de los mismos. Otros dominios de señalización intracelular serán evidentes para los expertos en la técnica y pueden utilizarse en relación con realizaciones alternativas de la invención.

[0717] En una realización, el al menos un dominio de señalización intracelular puede comprender toda la porción intracelular, o todo el dominio de señalización intracelular nativo, de la molécula de la que se deriva, o un fragmento funcional o derivado de la misma.

[0718] En una realización, el al menos un dominio de señalización primario intracelular comprende o consiste en un dominio de señalización primario de linfocitos T (o una secuencia derivada del mismo).

[0719] En una realización, el dominio de señalización primario de linfocitos T comprende o consiste en un dominio de señalización de una proteína seleccionada del grupo de CD3Z, CD3y, CD35, CD3s, FcRy común (FCER1G), FcRs (Fc Epsilon Rib), CD79a, CD79b, FcyRIIa, dAp 10, DAP12, y secuencias derivadas de los mismos. En una realización, el dominio de señalización primario de linfocitos T comprende o consiste en un dominio de señalización funcional de CD3Z.

[0720] En una realización, el dominio de señalización primario de linfocitos T comprende o consiste en un dominio de señalización funcional de CD3Z con la SEQ ID NO: 51; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 51.

[0721]

[0724] Los dominios de señalización primarios de linfocitos T que actúan de forma estimuladora pueden comprender adicionalmente o como alternativa motivos de señalización conocidos como motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora (ITAMS).

[0726] Algunos ejemplos de dominios de señalización intracelular primaria de linfocitos T que contienen ITAM incluyen, pero no se limitan a, los de (o derivados de) CD3Z, FcRy común (FCER1G), FcYRIIa, FcRp (FcsR1b), c D3y, CD35, CD3s, CD5, CD22, CD66b, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12.

[0728] En una realización, el dominio de señalización primario de linfocitos T comprende un dominio ITAM modificado (p. ej., un dominio ITAM mutado que tiene actividad alterada p. ej., aumentado o disminuido la actividad en comparación con el dominio ITAM nativo). En una realización, un dominio de señalización primario comprende un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM modificado, p. ej., un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una realización, un dominio de señalización primario comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.

[0730] En una realización, el CAR comprende más de un dominio de señalización primario intracelular, tal como 2, 3, 4, 5, o más, dominios de señalización primarios intracelulares.

[0732] En una realización, estos dos o más dominios de señalización primarios intracelulares pueden estar unidos entre sí en tándem, de forma aleatoria o en un orden especificado. Opcionalmente, un enlazador, como un enlazador peptídico flexible como se ha descrito anteriormente, puede formar el enlace entre dos dominios de señalización primarios intracelulares distintos. Además de los enlazadores de glicina-serina descritos anteriormente, un solo aminoácido (tal como, p. ej., una alanina o un resto de glicina) también puede ser un enlazador adecuado.

[0734] En una realización, el CAR de la invención puede comprender opcionalmente uno o varios dominios de señalización coestimuladores.

[0736] Como se emplea en esta memoria, la expresión"dominio de señalización coestimulador"se refiere a la porción intracelular de una molécula coestimuladora, es decir, una pareja de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de este modo una respuesta coestimuladora por el linfocito T, tal como, pero sin limitación, proliferación celular mejorada, supervivencia celular mejorada y desarrollo de linfocitos de memoria.

[0738] Los uno o varios dominios de señalización coestimuladores pueden ser, individualmente, la totalidad o una porción del dominio intracelular de una molécula coestimuladora que incluye, pero no se limita a, 4-1BB (CD137), ICOS (CD278), CD27, CD28, CTLA-4 (CD152), PD-1, una molécula MHC de clase I, BTLA, un receptor de ligando Toll, OX40, CD30, CD40, antígeno-1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LI<g>H<t>, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83, CDS, ICAM-1, GITR, A<r>HR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8a, CD8p, IL2Ra, IL6Ra, IL2Rp, IL2R<y>, IL7Ra, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-33R, IL-10Ra, IL-10Rp, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), IL-21R, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a/CD18, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, CD95, TGFbR1/2/3, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, cadena gamma común, un ligando que se une específicamente con CD83, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, y cualquier combinación de los mismos.

[0740] En una realización, el CAR comprende al menos un dominio de señalización coestimulador que comprende la totalidad o una parte del dominio intracelular de 4-1BB, ICOS, OX40, CD28, CTLA4 o PD-1.

[0742] En una realización, el dominio de señalización coestimulador intracelular comprende o consiste en la totalidad o una parte del dominio intracelular de 4-1 BB.

[0744] En una realización, el dominio de señalización coestimulador intracelular comprende o consiste en el dominio intracelular de 4-1 BB con la SEQ ID NO: 52; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 52; o un fragmento funcionalmente activo del mismo.

[0747]

[0749] En una realización, el dominio de señalización coestimulador intracelular comprende o consiste en la totalidad o parte del dominio intracelular de ICOS.

[0750] En una realización, el dominio de señalización coestimulador intracelular comprende o consiste en el dominio intracelular de ICOS con la SEQ ID NO: 53; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 53; o un fragmento funcionalmente activo del mismo.

[0753]

[0755] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en la totalidad o parte del dominio intracelular de OX40.

[0756] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en el dominio intracelular de OX40 con la SEQ ID NO: 54; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 54; o un fragmento funcionalmente activo del mismo.

[0759]

[0761] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en la totalidad o parte del dominio intracelular de CD28.

[0762] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en el dominio intracelular de CD28 con la SEQ ID NO: 55; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 55; o un fragmento funcionalmente activo del mismo.

[0765]

[0767] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en la totalidad o parte del dominio intracelular de CTLA4.

[0768] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en el dominio intracelular de CTLA4 con la SEQ ID NO: 56; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 56; o un fragmento funcionalmente activo del mismo.

[0771]

[0773] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en la totalidad o parte del dominio intracelular de PD-1.

[0774] En una realización, el dominio intracelular de señalización coestimulador comprende o consiste en el dominio intracelular de PD-1 con la SEQ ID NO: 57; o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 57; o un fragmento funcionalmente activo del mismo.

[0777]

[0778] En una realización, el CAR comprende más de un dominio de señalización coestimulador intracelular, tal como 2, 3, 4, 5 o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares.

[0779] En una realización, estos dos o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares pueden estar unidos entre sí en tándem, de forma aleatoria o en un orden especificado. Opcionalmente, un enlazador, como un enlazador peptídico flexible como se ha descrito anteriormente, puede formar el enlace entre dos dominios de señalización coestimuladores intracelulares distintos. Además de los enlazadores de glicina-serina como se ha descrito anteriormente, un solo aminoácido (tal como, p. ej., una alanina o un resto de glicina) también puede ser un enlazador adecuado.

[0780] En una realización, el al menos un dominio de señalización primario intracelular y el al menos un dominio de señalización coestimulador intracelular pueden estar unidos entre sí en tándem, de forma aleatoria o en un orden especificado. Opcionalmente, un enlazador, como un enlazador peptídico flexible como se ha descrito anteriormente, puede formar el enlace entre un dominio de señalización primario intracelular y un dominio de señalización coestimulador intracelular. Además de los enlazadores de glicina-serina descritos anteriormente, un solo aminoácido (tal como, p. ej., una alanina o un resto de glicina) también puede ser un enlazador adecuado.

[0781] El CAR según la presente invención puede ser un CAR de primera, segunda o tercera generación.

[0782] La primera generación de CAR se desarrolló hace más de 30 años (Kuwanaet al.,1987. Biochem Biophys Res Commun. 149(3):960-968; Grosset al.,1989. Transplant Proc. 21(1 Pt 1):127-130; Grosset al.,1989. Proc Natl Acad Sci USA. 86(24):10024-10028).

[0783] En una realización, el CAR de la invención es un CAR de primera generación y comprende:.

[0784] (i) al menos un dominio extracelular de unión a CD45RC, preferiblemente al menos un dominio extracelular de unión a hCD45RC, como se ha descrito anteriormente,

[0785] (ii) opcionalmente, un dominio bisagra extracelular,

[0786] (iii) al menos un dominio transmembrana, y

[0787] (iv) uno o más dominios de señalización primarios intracelulares.

[0788] Un CAR de primera generación puede ser, por ejemplo, un CAR en el que la señalización se proporciona por CD3Z, es decir, el dominio de señalización primario intracelular es CD3Z.

[0789] Los CAR de segunda generación añaden un dominio de señalización coestimulador intracelular, tal como, p. ej., CD28 o 4-1BB. La implicación de estos dominios de señalización intracelular mejora la proliferación de linfocitos T, la secreción de citocinas, la resistencia a la apoptosis y la persistenciain vivo.

[0790] En una realización, el CAR de la invención es un CAR de segunda generación y comprende:

[0791] (i) al menos un dominio extracelular de unión a CD45RC, preferiblemente al menos un dominio extracelular de unión a hCD45RC, como se ha descrito anteriormente,

[0792] (ii) opcionalmente, un dominio bisagra extracelular,

[0793] (iii) al menos un dominio transmembrana,

[0794] (iv) un dominio de señalización coestimulador, y

[0795] (v) uno o más dominios de señalización primarios intracelulares.

[0796] Los CAR de tercera generación combinan múltiples dominios coestimuladores, tales como, p. ej., CD28-4-1BB o CD28-OX40, para aumentar la actividad de los linfocitos T.

[0797] En una realización, el CAR de la invención es un CAR de tercera generación y comprende:

[0798] (i) al menos un dominio extracelular de unión a CD45RC, preferiblemente al menos un dominio extracelular de unión a hCD45RC, como se ha descrito anteriormente,

[0799] (ii) opcionalmente, un dominio bisagra extracelular,

[0800] (iii) al menos un dominio transmembrana,

[0801] (iv) al menos dos dominios de señalización coestimuladores, y

[0803] (v) uno o más dominios de señalización primarios intracelulares.

[0805] En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el dominio de unión a CD45RC, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el CAR anti-CD45RC, como se ha descrito anteriormente.

[0807] También se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el dominio de unión a CD45RC, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el CAR anti-CD45RC, descritos anteriormente.

[0809] En una realización, el vector es un vector de expresión y comprende además elementos reguladores que permiten la expresión del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o del fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, en una célula.

[0811] Por"vector de expresión",se entiende cualquier tipo de construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia que puede transcribirse. Los vectores de expresión pueden contener diversos elementos reguladores, que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante vinculada operablemente en una célula hospedadora particular. Algunos ejemplos de dichos elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, promotores, potenciadores, sitios de entrada internos al ribosoma (IRES), sitios de corte y empalme, señales de terminación y similares.

[0813] Algunos ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de ADN, vectores de ARN, plásmidos, fagémidos, derivados de fagos, virus y cósmidos.

[0815] En una realización, el vector de expresión es un plásmido.

[0817] En una realización, el vector de expresión es un vector vírico. Algunos ejemplos de vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores retrovirales (como lentivirus), vectores del virus de la variolovacuna, vectores del virus sindbis, vectores del citomegalovirus, vectores del virus del herpes simple y similares.

[0819] En una realización, el vector de expresión puede ser monocistrónico. Por"monocistrónico",se entiende que un único ácido nucleico que codifica una única proteína se expresa en un único vector de expresión.

[0821] En una realización, el vector de expresión comprende una secuencia que codifica la HCVR del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o el fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, preferiblemente unido de forma operable a elementos reguladores. En una realización, el vector de expresión comprende una secuencia que codifica la cadena pesada, que incluye la HCVR y la HCCR, del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o el fragmento de unión a antígeno del mismo, preferiblemente unido de forma operable a elementos reguladores. En una realización, las secuencias de la HCVR y la HCCR se encuentran en el mismo marco de lectura abierto y, por tanto, pueden expresarse como una única cadena polipeptídica.

[0823] En una realización, el vector de expresión comprende una secuencia que codifica la LCVR del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o del fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, preferiblemente unido de forma operable a elementos reguladores. En una realización, el vector de expresión comprende una secuencia que codifica la cadena ligera, que incluye la LCVR y la LCCR, del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o el fragmento de unión a antígeno del mismo, preferiblemente unido de forma operable a elementos reguladores. En una realización, las secuencias de la LCVR y la LCCR se encuentran en el mismo marco de lectura abierto y, por tanto, pueden expresarse como una única cadena polipeptídica.

[0825] Por lo tanto, la invención también se refiere a un sistema de vector de expresión que comprende o consiste en al menos dos vectores de expresión, uno que comprende una secuencia que codifica la HCVR del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o el fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, preferiblemente unido operablemente a elementos reguladores; y una que comprende una secuencia que codifica la LCVR del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o del fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, preferiblemente unida operablemente a elementos reguladores.

[0826] En una realización, el vector de expresión comprende una secuencia que codifica el dominio extracelular de unión a CD45RC, opcionalmente, el dominio bisagra extracelular, al menos un dominio transmembrana, y al menos un dominio intracelular de señalización que comprende al menos un dominio primario de señalización y opcionalmente, uno o más dominios coestimuladores de señalización, preferiblemente enlazados operablemente a elementos reguladores. En una realización, estas secuencias se encuentran en el mismo marco abierto de lectura y, por lo tanto, pueden expresarse como una única cadena polipeptídica.

[0827] En una realización, el vector de expresión puede ser policistrónico. Por"policistrónico",se entiende que al menos dos o más ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica una única proteína, se expresan en un único vector de expresión.

[0828] En una realización, el vector de expresión comprende:

[0829] - una secuencia que codifica la HCVR del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o del fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, preferiblemente unido de forma operable a elementos reguladores; y

[0830] - una secuencia que codifica la LCVR del dominio de unión a CD45RC, del anticuerpo anti-CD45RC o del fragmento de unión a antígeno del mismo, o del CAR anti-CD45RC, preferiblemente unido de forma operable a elementos reguladores.

[0831] Se entenderá fácilmente que el experto en la técnica puede diseñar secuencias de ácido nucleico que codifican las HCVR, LCVR, HCCR y/o LCCR descritas en el presente documento. Se entiende además que el experto en la técnica está familiarizado con los métodos de biología molecular destinados a modificar una secuencia de ácido nucleico con el fin de mejorar, p. ej., las tasas de producción recombinante, como por ejemplo mediante la optimización de codones. En última instancia, la presente solicitud abarca así cualquier ácido nucleico que codifique cualquier HCVR, LCVR, HCCR y/o LCCR descrita en el presente documento.

[0832] En una realización, el ácido nucleico o vector es un ácido nucleico o vector aislado.

[0833] Por"aislado",se entiende que el ácido nucleico o vector está sustancialmente libre de secuencias de ADN genómico, así como de proteínas o complejos, tales como ribosomas y polimerasas, que acompañan de manera natural a una secuencia nativa. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha extraído de su entorno natural, e incluye aislados de ADN recombinantes o clonados y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos.

[0834] En una realización, el ácido nucleico o vector aislado se purifica.

[0835] En una realización, el ácido nucleico aislado o el vector se purifica hasta:

[0836] (1) más del 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % o más en peso de ácido nucleico determinado por métodos de absorbancia o métodos de fluorescencia (tales como, p. ej., midiendo la relación de absorbancia a 260 y 280 nm (A<260>/<280>)), y lo más preferiblemente más del 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en peso; o bien

[0837] (2) la homogeneidad demostrada mediante electroforesis en gel de agarosa y utilizando un agente intercalante como bromuro de etidio, SYBR Green, GelGreen o similares.

[0838] En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir y purificar el dominio de unión a CD45RC, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente. En una realización, el método comprende:

[0839] - cultivar células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico, preferiblemente el vector de expresión descrito anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del dominio de unión a CD45RC, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, y

[0840] - recuperar el dominio de unión a CD45RC expresado, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0841] Este proceso recombinante puede utilizarse para la producción a gran escala de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluidos anticuerpos monoclonales destinados a usos terapéuticos y/o diagnósticosin vitro, ex vivoy/oin vivo.

[0842] El ácido nucleico o vector de expresión puede propagarse y expresarse según cualquiera de diversos procedimientos practicados rutinariamente para la escisión, ligación, transformación y transfección de ácidos nucleicos. En ciertas realizaciones, la expresión puede llevarse a cabo en una célula hospedadora procariota (es decir,la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico o vector de expresión es una célula hospedadora procariota), tal comoEscherichia coli.En otras realizaciones, la expresión puede llevarse a cabo en una célula hospedadora eucariota (es decir,la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico o el vector de expresión es una célula hospedadora eucariota), incluidas células animales (tales como células de mamífero), levaduras (p. ej.,Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,oPichia pastoris);y células vegetales.

[0844] Empleando métodos conocidos por los expertos en la técnica y basándose en la presente divulgación, puede diseñarse un vector de ácido nucleico o de expresión para expresar secuencias extrañas en un sistema hospedador particular, y a continuación pueden insertarse secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido celular. Los elementos reguladores variarán según sea necesario para el hospedador concreto.

[0845] Todos estos procesos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Subramanian (Ed.), 2004. Antibodies (1.a ed., Vol. 1: Production and Purification). Nueva York, NY: Springer EE. UU.).

[0847] En una realización, el dominio de unión a CD45RC expresado, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, se purifica adicionalmente.

[0849] Los métodos para purificar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Subramanian (Ed.), 2004. Antibodies (1.a ed., Vol. 1: Production and Purification). Nueva York, NY: Springer EE. UU.).

[0851] En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC descrito en la presente memoria, y a una población de dichas células inmunitarias.

[0853] Como se emplea en esta memoria, la expresión"célula inmunitaria"se refiere a glóbulos blancos (o leucocitos) que se derivan de células madre hematopoyéticas (HSC) producidas en la médula ósea.

[0855] En una realización, la célula inmunitaria comprende el ácido nucleico o vector, preferiblemente vector de expresión, que codifica el CAR anti-CD45RC descrito anteriormente, generando así una célula inmunitaria genomanipulada que expresa el CAR anti-CD45RC en su superficie celular.

[0857] En una realización, la célula inmunitaria es una célula inmunitaria de mamífero, p. ej., una célula inmunitaria humana, una célula inmunitaria de un animal de granja (p. ej., una vaca, cerdo o caballo), o una célula inmunitaria de un animal de compañía (p. ej., un gato o un perro).

[0859] En una realización, las células inmunitarias son células autólogas, células heterólogas o células alogénicas.

[0860] En una realización, la célula inmunitaria se selecciona del grupo que comprende o consiste en linfocitos, células derivadas de mieloides, y cualquier combinación de los mismos.

[0862] En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito, p. ej., una célula seleccionada del grupo que comprende o consiste en linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos naturales (NKT) y cualquier combinación de los mismos.

[0864] En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T, que puede seleccionarse del grupo que comprende o consiste en linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T<y>S, linfocitos T doble negativos (DN), y cualquier combinación de los mismos.

[0866] En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T CD4+, tal como, p. ej., un linfocito T colaborador, un linfocito T regulador, un linfocito T efector, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T CD8+, tal como, p. ej., un linfocito T citotóxico CD8+ o un linfocito T regulador CD8+. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T yS. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T diseñado para expresar un<y>STCR definido (linfocitos TEG). En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T DN. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito NK. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito NKT.

[0868] En una realización, la célula inmunitaria es una célula inmunitaria reguladora, tal como, por ejemplo, cualquier célula inmunitaria reguladora adecuada para su uso en terapia celular. En una realización, la célula inmunitaria reguladora se selecciona del grupo que consiste en un linfocito T regulador, un linfocito T CD4+ regulador, un linfocito T CD8+ regulador, un linfocito T<y>S regulador, un linfocito T DN regulador, un linfocito B regulador, un linfocito NK regulador, un linfocito NKT regulador, un macrófago regulador, una célula dendrítica reguladora, y cualquier combinación de los mismos.

[0870] En una realización, la célula inmunitaria reguladora es un linfocito T regulador (Treg), en particular, un Treg derivado del timo o un Treg adaptativo o inducido. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito Treg CD4+. En una realización, el Treg es un Treg derivado del timo o un Treg adaptativo o inducido. En una realización, el Treg es un Treg CD4+FoxP3+ o un Treg CD4+FoxP3- (linfocito Tr1). En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T regulador CD4+FoxP3+. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T reg CD8+. Algunos ejemplos de Treg CD8+ incluyen, pero no se limitan a, un Treg CD8+CD28-, un Treg CD8+CD103+, un Treg CD8+FoxP3+, un T reg CD8+CD122+, y cualquier combinación de los mismos.

[0872] En una realización, la célula inmunitaria reguladora es un linfocito TySregulador. En una realización, la célula inmunitaria reguladora es un linfocito T DN regulador. En una realización, la célula inmunitaria reguladora es un linfocito NK regulador. En una realización, la célula inmunitaria reguladora es un linfocito NKT regulador.

[0873] En una realización, la célula inmunitaria es una célula inmunitaria efectora, tal como, p. ej., cualquier célula inmunitaria efectora adecuada para su uso en terapia celular. En una realización, la célula inmunitaria efectora se selecciona del grupo que comprende o consiste en un linfocito T efector, un linfocito T CD4+ efector, un linfocito T CD8+ efector, un linfocito TySefector, un linfocito T DN efector, un linfocito NK efector, un linfocito NKT efector, y cualquier combinación de los mismos.

[0875] En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T efector (Teff). En una realización, la célula inmunitaria efectora es una Teff CD4+. Algunos ejemplos de Teff CD4+ incluyen, pero no se limitan a, linfocitos Th1, linfocitos Th2, linfocitos Th9, linfocitos Th17, linfocitos Th22, linfocitos T colaboradores foliculares (Tfh) CD4+, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, la célula inmunitaria efectora es una Teff CD8+. Algunos ejemplos de linfocitos T efectores CD8+ incluyen, pero no se limitan a, un Teff CD8+CD45RO+CCR7-CD62L-, un Teff CD8+CD45RA+CCR7'CD62L', y cualquier combinación de los mismos.

[0877] En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito TySefector. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito T DN efector. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito NK efector. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito NKT efector.

[0879] La invención también se refiere a una población aislada y/o sustancialmente purificada de células inmunitarias como se ha descrito anteriormente.

[0881] Como se emplea en esta memoria, una"población aislada"se refiere a una población celular que se retira de su entorno natural (como la sangre periférica) y que se aísla, purifica o separa y que está al menos un 75 % libre, 80 % libre, 85 % libre, y en ciertas realizaciones aproximadamente un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % libre, de otras células con las que está presente de manera natural, pero que carecen de los marcadores de la superficie celular basándose en qué células se aislaron.

[0883] La invención también se refiere a una población enriquecida de células inmunitarias como se ha descrito anteriormente. En una realización, la población enriquecida comprende al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o más de células inmunitarias de interés.

[0885] En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende el dominio de unión a CD45RC, o el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el CAR anti-CD45RC, como se ha descrito anteriormente; o un ácido nucleico o vector, preferiblemente vector de expresión, que codifica el mismo, como se ha descrito anteriormente; o una célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC, como se ha descrito anteriormente.

[0887] En una realización, la composición es una composición farmacéutica y comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0889] La expresión"excipiente farmacéuticamente aceptable"incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. Dicho excipiente no produce reacciones adversas, alérgicas o de otro tipo cuando se administra a un animal, preferiblemente a un ser humano. Para su administración en humanos, los preparados deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales exigidas por las agencias sanitarias, como, por ejemplo, la FDA o la EMA.

[0891] Algunos excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, como la albúmina sérica humana, sustancias tampón como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica), polietilenglicol, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.

[0893] En una realización, la composición farmacéutica comprende vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que pueda inyectarse a un sujeto. Puede tratarse particularmente de soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro sódico, potásico, cálcico o magnésico y similares, o mezclas de dichas sales), o de composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, según los casos, de agua esterilizada o de solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.

[0894] En una realización, la composición es un medicamento.

[0896] En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a usos del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, y la composición descrita anteriormente, en diversos métodos con fines terapéuticos, como se ha descrito anteriormente.

[0898] En una realización, la invención se refiere a métodos para inducir tolerancia inmunitaria en un sujeto que la necesita, administrando al sujeto cualquiera de los dominios de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente. También se refiere al dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, para su uso en la inducción de tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite. También se refiere al uso del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, en la preparación de un medicamento para inducir tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite.

[0900] La expresión"tolerancia inmunitaria",como se emplea en esta memoria, se refiere a un estado de falta de respuesta del sistema inmunitario a sustancias o tejidos específicos que tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria, mientras que se conserva la respuesta inmunitaria contra otras sustancias o tejidos.

[0901] La expresión"respuesta inmunitaria",como se emplea en esta memoria, incluye respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T y/o linfocitos B. Las respuestas inmunitarias ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, respuestas de linfocitos T (p. ej., producción de citocinas y citotoxicidad celular), pero también respuestas inmunitarias que se ven afectadas indirectamente por la activación de linfocitos T (p. ej., macrófagos). Las células inmunitarias implicadas en la respuesta inmunitaria incluyen linfocitos (como linfocitos B y linfocitos T, incluidos linfocitos Th1 y Th2 CD4+, CD8+), células presentadoras de antígeno (p. ej., células presentadoras de antígenos profesionales como las células dendríticas), linfocitos citolíticos naturales, células mieloides (como macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos).

[0903] En una realización, la invención se refiere a métodos de agotamiento de células CD45RCalto en un sujeto que lo necesite, mediante la administración al sujeto del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente. También se refiere al dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, para su uso en el agotamiento de células CD45RCalto en un sujeto que lo necesite. También se refiere al uso del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, en la preparación de un medicamento para agotar células CD45RCalto en un sujeto que lo necesite.

[0905] El nivel relativo de expresión de CD45RC puede medirse mediante citometría de flujo. Se distinguen tres tipos de células: células que presentan un nivel de expresión CD45RC alto, intermedio o negativo.

[0907] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente agota las células CD45RCalto.

[0909] Las "células CD45RCalto" son células (tales como, p. ej., linfocitos T, linfocitos NK, linfocitos NKT, linfocitos B, etc.) que expresan el marcador CD45RC a altas concentraciones, como se ha definido anteriormente.

[0911] Como se emplea en esta memoria, los términos"agotar" o "depleción", con respecto a las células que expresan CD45RC, se refieren a una disminución medible del número de células en el sujeto. La reducción puede ser de al menos de aproximadamente el 10 %, p. ej., al menos de aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %,<98>%, 99 % o más. En una realización, los términos se refieren a una disminución del número de células CD45RCalto en un sujeto o en una muestra hasta una cantidad inferior a los límites detectables.

[0913] En particular, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente agotan las células CD45RCalto uniéndose a CD45RC y transducen señales proapoptóticas y/o activan la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0915] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente media la citotoxicidad dependiente del complemento.

[0917] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el CAR anti-CD45RC descrito anteriormente pueden conjugarse con un agente citotóxico o un agente inhibidor del crecimiento.

[0919] En una realización, la invención se refiere a métodos de expansión y/o potenciación de linfocitos T reguladores en un sujeto que los necesita, mediante la administración al sujeto del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente. También se refiere al dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, para su uso en la expansión y/o potenciación de linfocitos T reguladores en un sujeto que lo necesite. También se refiere al uso del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, en la preparación de un medicamento para expandir y/o potenciar los linfocitos T reguladores en un sujeto que lo necesite.

[0921] Como se emplea en esta memoria, el término"expandir"se refiere al proceso de convertir y/o amplificar una población dada de células (p. ej., células inmunitarias como los Treg). La expansión de una población de células puede producirsein vivo, in vitrooex vivo.

[0923] Como se emplea en esta memoria, el término "potenciar" se refiere al proceso de aumentar la función de una población determinada de células (p. ej., aumentar la capacidad supresora de los Treg). La potenciación de una población de células puede producirsein vivo, in vitrooex vivo.

[0925] Los "Linfocitos T reguladores"o"Tregs"son linfocitos T que suprimen una respuesta inmunitaria anormal o excesiva y desempeñan un papel en la tolerancia inmunitaria. Los Tregs suelen ser "linfocitos T reguladores positivos para caja de forkhead P3 (Foxp3+)" y/o "linfocitos CD45RCbajo/-".

[0927] Como se emplean en esta memoria, las expresiones"linfocitos T reguladores positivos para caja P3 de forkhead (Foxp3+)"y "células CD45RCbajo/-"se refieren a un 0,1-10 % de linfocitos T CD4+ y/o CD8+ en seres humanos y roedores cuyo marcador característico es el factor de transcripción Foxp3.

[0929] En una realización, los métodos y usos son para expandir y/o potenciar T reg Foxp3+ y/o CD45RCbajo/-.

[0931] En una realización, los Treg CD45RCbajo/- se expanden mediante estimulación. En una realización, los Treg CD45RCbajo/- se expanden mediante estimulación en presencia de IL-2 y/o IL-15. En una realización, los Treg CD45RCbajo/- se expanden mediante estimulación con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 y/o células presentadoras de antígenos (APC) alogénicas y/o antígenos específicos.

[0933] Además o como alternativa, la invención se refiere a métodosin vitrooex vivode purificación de Treg CD45RCbajo/-.

[0935] En una realización, los T reg CD45RCbajo/- son linfocitos T CD8+/CD4+. En una realización, los T reg CD45RCbajo/-son linfocitos T CD8+/CD4-. En una realización, los Treg CD45RCbajo/- son linfocitos T CD8-/CD4+.

[0937] En una realización, los Treg CD45RCbajo/- purificados pueden expandirse adicionalmente y/o potenciarse antes de, simultáneamente con o después de la administración a un sujeto que lo necesite.

[0939] En una realización, la invención se refiere a métodos para prevenir y/o reducir el rechazo del trasplante en un sujeto que lo necesite, administrando al sujeto el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente. También se refiere al dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, para su uso en la prevención y/o reducción del rechazo de trasplante en un sujeto que lo necesite. También se refiere al uso del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, en la preparación de un medicamento para prevenir y/o reducir el rechazo de trasplante en un sujeto que lo necesite.

[0941] Las expresiones"prevenir el rechazo del trasplante"y"reducir el rechazo del trasplante"pretenden abarcar la prevención o inhibición del rechazo inmunitario del trasplante, así como retrasar la aparición o la progresión del rechazo inmunitario del trasplante. Las expresiones también abarcan la prolongación de la supervivencia de un trasplante en un sujeto o la reversión del fracaso de un trasplante en un sujeto. Además, las expresiones pretenden abarcar la mejora de un síntoma de rechazo inmunitario de un trasplante, lo que incluye, por ejemplo, la mejora de una complicación inmunológica asociada con el rechazo inmunitario, tal como, p. ej., fibrosis intersticial, arteriesclerosis crónica del injerto o vasculitis.

[0943] El término"trasplante"y las variaciones del mismo, se refieren a la inserción de un trasplante (también denominado injerto) en un receptor, independientemente de que el trasplante sea singénico (donde el donante y el receptor son genéticamente idénticos), alogénico (donde el donante y el receptor tienen un origen genético diferente pero son de la misma especie) o xenogénico (donde el donante y el receptor son de especies diferentes). Por tanto, en un escenario típico, el hospedador es un ser humano y el injerto es un isoinjerto, derivado de un humano del mismo o diferente origen genético. En otro caso, el injerto procede de una especie distinta de aquella a la que se trasplanta, incluidos animales de especies filogenéticamente muy separadas, por ejemplo, un corazón de babuino trasplantado a un hospedador humano.

[0945] La expresión"rechazo de trasplante",como se emplea en esta memoria, abarca el rechazo de trasplantes tanto agudo como crónico.

[0947] El"rechazo agudo"es el rechazo por parte del sistema inmunitario de un trasplantado de tejido cuando el tejido trasplantado es inmunológicamente extraño. El rechazo agudo se caracteriza por la infiltración del tejido del trasplante por células inmunitarias del receptor, que ejercen su función efectora y destruyen el tejido del trasplante. La aparición del rechazo agudo es rápida y, por lo general, se produce en el ser humano pocas semanas después de la intervención quirúrgica del trasplante. Generalmente, el rechazo agudo puede inhibirse o suprimirse con fármacos inmunodepresores como rapamicina, ciclosporina, anticuerpo monoclonal anti-CD40L y similares.

[0949] El"rechazo crónico"suele producirse en seres humanos de varios meses a años después del injerto, incluso en presencia de una inmunodepresión satisfactoria del rechazo agudo. La fibrosis es un factor común en el rechazo crónico de todo tipo de trasplantes de órganos.

[0951] En una realización, el rechazo de trasplante es un rechazo de trasplante alogénico. Por consiguiente, en una realización, el donante del trasplante es un ser humano. El donante del trasplante puede ser un donante vivo o un donante fallecido, es decir, un donante cadáver.

[0953] En una realización, el trasplante es un órgano, un tejido o células.

[0955] Como se emplea en esta memoria, el término"órgano"se refiere a un órgano sólido vascularizado que realiza una función específica o un grupo de funciones dentro de un organismo. El término órgano incluye, pero no se limita a, corazón, pulmón, riñón, hígado, páncreas, piel, útero, hueso, cartílago, intestino delgado o grueso, vejiga, cerebro, mama, vasos sanguíneos, esófago, trompa de Falopio, vesícula biliar, ovarios, páncreas, próstata, placenta, médula espinal, extremidades, incluidas las superiores e inferiores, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, tráquea, uréter, uretra, útero.

[0957] Como se emplea en esta memoria, el término"tejido"se refiere a cualquier tipo de tejido en seres humanos o animales e incluye, pero sin limitación, tejido vascular, tejido cutáneo, tejido hepático, tejido pancreático, tejido nervioso, tejido urogenital, tejido gastrointestinal, tejido esquelético, incluidos los huesos y cartílagos, tejido adiposo, tejido conjuntivo, incluidos tendones y ligamentos, tejido amniótico, tejido coriónico, dura, pericardio, tejido muscular, tejido granular, tejido facial, tejido oftálmico.

[0959] El término "células" se refiere aquí a una composición enriquecida para células de interés, preferiblemente una composición que comprende al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos un 65 % de dichas células. En una realización, las células se seleccionan del grupo que comprende o consiste en células madre hematopoyéticas multipotentes derivadas de médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón umbilical; o células madre pluripotentes (es decir, células madre embrionarias [ES] o células madre pluripotentes inducidas [iPS]) o células diferenciadas derivadas de células madre multipotentes de diferentes linajes celulares, que incluyen, pero no se limitan a, cardiomiocitos, células ppancreáticas, hepatocitos, neuronas y similares.

[0961] En una realización en la que el trasplante es un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT), las células se seleccionan del grupo que comprende o consiste en células madre hematopoyéticas multipotentes, normalmente derivadas de médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón umbilical.

[0962] "TCMH"o"trasplante de células madre hematopoyéticas"es una terapia de trasplante que puede ser curativa para pacientes afectados de leucemia y linfomas (incluidos, sin limitación, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndrome de mielodisplasia (SMD), síndrome mieloproliferativo, linfomas hodgkinianos, linfomas no hodgkinianos, leucemia linfática crónica (LLC) y mieloma múltiple). Sin embargo, una limitación importante del TCMH alogénico es el desarrollo de la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), que se presenta de forma grave en aproximadamente un 30 50 % de los seres humanos que reciben esta terapia.

[0964] Por lo tanto, en una realización, los métodos y usos son para prevenir y/o reducir la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH).

[0966] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente pueden utilizarse en combinación con células madre hematopoyéticas multipotentes para prevenir y/o tratar enfermedades malignas, tales como leucemia y/o linfomas (incluidos, sin limitación, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndrome mielodisplásico (SMD), síndrome mieloproliferativo, linfomas hodgkinianos, linfomas no hodgkinianos, leucemia linfática crónica (LLC), neuroblastoma, sarcoma de Ewing, síndromes mielodisplásicos, glioma y mieloma múltiple), o enfermedades no malignas, como adrenoleucodistrofia, talasemia, anemia drepanocítica, anemia aplásica, anemia de células falciformes, anemia de Fanconi, síndromes de insuficiencia de la médula ósea, hemoglobinopatías, osteopetrosis infantil maligna, mucopolisacaridosis, deficiencia de piruvato cinasa, síndromes de inmunodeficiencia, linfohistiocitosis hemagofagocítica, errores innatos del metabolismo, mieloma osteosclerótico (también conocido como síndrome de POEMS) y amiloidosis primaria.

[0968] Además o como alternativa, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente pueden utilizarse para ingeniería de injertos.

[0970] En una realización, el trasplante que se va a injertar se trata con el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente antes del trasplante, para agotar las células CD45RCalto.

[0972] En una realización, el trasplante es de médula ósea, y se trata con el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente antes del trasplante para agotar los linfocitos T CD45RCalto. En una realización, la médula ósea comprende células CD34+ que contienen linfocitos T CD45RCalto y linfocitos T CD45RCbajo/-.

[0974] En una realización, la invención se refiere a métodos de prevención, reducción y/o tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCaltoen un sujeto que lo necesite, administrando al sujeto cualquiera de los dominios de unión a CD45RC el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente. También se refiere al dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, para su uso en la prevención, reducción y/o tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCalto en un sujeto que lo necesite. También se refiere al uso del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente, en la preparación de un medicamento para prevenir, reducir y/o tratar enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCalto en un sujeto que lo necesite.

[0976] Como se emplea en esta memoria, la expresión "enfermedades, trastornos o afecciones relacionados con CD45RCalto"se refiere a enfermedades, trastornos o afecciones causados o potenciados o caracterizados por una proporción aumentada de células que expresan CD45RC en un sujeto y/o por un nivel aumentado de expresión de CD45RC en células del sujeto.

[0978] Por"aumento de la proporción de células que expresan CD45RC"se entiende un aumento de aproximadamente el 5 %, preferiblemente de aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más del número de células que expresan CD45RC (es decir, CD45RCalto) en un sujeto dado en comparación con una referencia, tal como, p. ej., el número de células CD45RCalto en un sujeto sustancialmente sano (es decir, un sujeto que no padece una enfermedad, trastorno o afección en cuestión relacionada con CD45RCalto).

[0980] Por"nivel aumentado de expresión de CD45RC",se entiende un aumento de al menos aproximadamente el 5 %, preferiblemente aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más del nivel de expresión de CD45RC, ya sea a nivel de ARNm o a nivel de proteína, en células de un sujeto concreto en comparación con una referencia, tal como, p. ej., el nivel de expresión de CD45RC en células de un sujeto sustancialmente sano (es decir,un sujeto que no padece una enfermedad, trastorno o afección en cuestión relacionada con CD45RCalto).

[0982] En una realización, las enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCalto se seleccionan del grupo que comprende o consiste en enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias no deseadas, enfermedades monogénicas y linfoma o cáncer.

[0984] En una realización, las enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCalto se seleccionan del grupo que comprende o consiste en enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias no deseadas y enfermedades monogénicas.

[0986] Como se emplea en esta memoria, la expresión"enfermedad autoinmunitaria"se refiere a una enfermedad en la que el sistema inmunitario produce una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de linfocitos B o de linfocitos T) contra un antígeno que forma parte del hospedador normal (es decir, un autoantígeno), con la consiguiente lesión de los tejidos. En una enfermedad autoinmunitaria, el sistema inmunitario del hospedador no reconoce un antígeno concreto como "propio" y se produce una reacción inmunitaria contra los tejidos del hospedador que expresan el antígeno.

[0988] Algunas enfermedades autoinmunitarias ilustrativas contempladas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, oligoartritis juvenil, artritis inducida por colágeno, artritis inducida por adyuvante, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, enfermedad inflamatoria intestinal (incluidas la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), atrofia gástrica autoinmunitaria, pénfigo vulgar, psoriasis, vitíligo, alopecia areata, diabetes de tipo 1, diabetes no obesogénica, miastenia grave, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, colangitis esclerosante, sialoadenitis esclerosante, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica autoinmune, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, esclerosis sistémica, polimiositis, dermatomiositis, hemofilia adquirida, púrpura trombótica trombocitopénica, uveítis, enfermedades autoinmunitarias asociadas a IgG4 (tales como, p. ej., las enfermedades enumeradas en la tabla 1 de Klegeret al.,2015. Dtsch Arztebl Int. 112(8): 128-135, incorporándose dicha tabla por referencia) y similares.

[0990] En una realización, la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico.

[0992] En una realización, la enfermedad autoinmunitaria es enteropatía inflamatoria, incluidas enfermedad de Crohn, colitis y colitis ulcerosa. En una realización, la enfermedad autoinmunitaria es enfermedad de Crohn. En una realización, la enfermedad autoinmunitaria es colitis ulcerosa.

[0994] Como se emplea en esta memoria, la expresión"respuesta inmunitaria no deseada"se refiere a cualquier reacción inmunitaria no deseada, preferiblemente cualquier reacción inmunitaria no deseada dirigida a (i) proteínas expresadas en el curso de la terapia génica, (ii) vectores (tales como, p. ej., vectores víricos) utilizados en el curso de la terapia génica y/o (iii) proteínas terapéuticas. Dichas proteínas incluyen, p. ej., factor VIII (hemofilia A) y otros factores de coagulación, terapias de sustitución enzimática, anticuerpos monoclonales (por ejemplo, natalizumab, rituximab, infliximab), anticuerpos policlonales, enzimas y citocinas (por ejemplo, IFNp). La expresión"respuesta inmunitaria no deseada"también se refiere a alergias y reacciones alérgicas.

[0995] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente pueden administrarse a un sujeto para suprimir una respuesta inmunitaria, especialmente para prevenir reacciones inmunitarias a proteínas específicas cuando su expresión se restaura mediante terapia génica en aquellos sujetos con las deficiencias genéticas correspondientes. Por tanto, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente pueden utilizarse para prevenir la reactividad inmunitaria frente a proteínas normalmente ausentes en el sujeto debido a mutaciones, mientras que su reconstitución se consigue mediante terapia génica. Por otra parte, la proteinoterapia es un ámbito de innovación médica cada vez más extendido, que implica la aplicación de proteínas, tales como enzimas, anticuerpos o citocinas, directamente a los sujetos como productos terapéuticos. Uno de los principales obstáculos para la administración de estos medicamentos son las respuestas inmunitarias dirigidas contra las propias proteínas terapéuticas. La administración de terapias basadas en proteínas suele ir acompañada de la administración de inmunodepresores, que se utilizan para facilitar una vida útil más larga de la proteína y, por tanto, una mayor absorción de la proteína en las células y tejidos del organismo. Sin embargo, los inmunodepresores generales pueden ser desventajosos debido a la naturaleza inespecífica de la inmunodepresión que se lleva a cabo, lo que provoca efectos secundarios no deseados en el paciente. Por lo tanto, esta estrategia puede aplicarse para suprimir una respuesta inmunitaria contra proteínas y péptidos terapéuticos, como anticuerpos terapéuticos, citocinas, enzimas o cualquier otra proteína administrada a un paciente.

[0997] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente puede administrarse a un sujeto para suprimir una respuesta inmunitaria, particularmente para prevenir reacciones inmunitarias a vectores usados en terapia génica, en particular vectores víricos usados en terapia génica. Dichos vectores víricos incluyen, p. ej., vectores de virus adenoasociados (AAV), vectores adenovirales (Ad), vectores lentivirales y similares. Para una revisión, véase Nayak y Herzog, 2010. Gene Ther. 17(3):295-304.

[0999] Como se emplea en esta memoria, el término"alergia"o"alergias"se refiere a una reacción inadecuada del sistema inmunitario. Las reacciones alérgicas se producen ante sustancias ambientales normalmente inocuas conocidas como alérgenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rápidas. En sentido estricto, la alergia es una de las cuatro formas de hipersensibilidad y se denomina hipersensibilidad de tipo I (o inmediata). Se caracteriza por una activación excesiva de ciertos glóbulos blancos llamados mastocitos y basófilos por un tipo de anticuerpo conocido como IgE, lo que provoca una respuesta inflamatoria extrema. Entre las reacciones alérgicas más comunes se encuentran el eccema, la urticaria, la fiebre del heno, el asma, las alergias alimentarias, las enfermedades celíacas y las reacciones al veneno de insectos urticantes como las avispas y las abejas.

[1001] La expresión"enfermedades monogénicas",como se emplea en esta memoria, se refiere a enfermedades resultantes de una mutación en un solo gen seleccionado entre los siguientes genes:

[1003] (i) genes que no están asociados a la función inmunitaria, pero cuya deficiencia está asociada a la inflamación y/o a reacciones autoinmunitarias, como los genes deficientes en las siguientes enfermedades distrofia muscular de Duchenne (DMD), fibrosis quística, enfermedades lisosomales y deficiencia de a1-antitripsina; y

[1005] (ii) genes implicados en el sistema inmunitario y cuya deficiencia genera inflamación y/o reacciones autoinmunitarias, como los genes deficientes en las siguientes enfermedades: inmunodeficiencia primaria de linfocitos T, tales como IPEX (síndrome de polendocrinopatía enteropatía inmunodisregulada ligada al cromosoma X), síndrome poliendocrino autoinmunitario de tipo 1 (APS-1) (también conocido como polendocrinopatía autoinmunitaria-candidiasis-distrofia ectodérmica o APECED), síndrome poliendocrino autoinmunitario de tipo 2 (APS-2) (también conocido como síndrome de Schmidt), síndrome polendocrino autoinmunitario de tipo 3 (APS-3) (también conocido como polendocrinopatía autoinmunitaria), inmunodeficiencias primarias de linfocitos B, síndrome de Muckle-Wells, síndrome autoinflamatorio y autoinmunitario mixto, síndrome de fiebre periódica hereditaria asociada a NLRP12 y síndrome periódico asociado al receptor 1 del factor de necrosis tumoral.

[1007] Otras enfermedades autoinmunitarias de origen genético (es decir, enfermedad monogénica como se define en la presente memoria) como son conocidas en la técnica y englobadas en la presente memoria bajo la expresión "enfermedades monogénicas", como se describe, p. ej., en la tabla 1 de Ramoset al.,2015 (J Hum Genet. 60(11):657-64), incorporándose dicha tabla en la presente memoria por referencia. En particular, las enfermedades autoinmunitarias de origen genético englobadas en la presente memoria son las asociadas a mutaciones en cualquiera de los siguientes genes: alelos HLA-DR, STAT4, PTPN22, IFIH1, TRAF3IP2, TRAF1-C5, PADI4, TNF, IL-1, IL-6, IL-4, IL-5, OPN, IL12A e IL12RB2.

[1009] En una realización, la enfermedad monogénica es APECED (polendocrinopatía autoinmunitaria-candidiasisdistrofia ectodérmica).

[1010] En una realización, la enfermedad monogénica es la distrofia muscular de Duchenne (DMD).

[1012] La expresión"linfoma o cáncer",como se emplea en esta memoria, abarca linfoma o cáncer que están asociados con células CD45RCalto. Los linfomas o cánceres ilustrativos asociados con células CD45RCalto incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndrome de mielodisplasia (SMD)/síndrome mieloproliferativo, linfomas (tales como, p. ej., linfomas hodgkinianos y no hodgkinianos), leucemia linfática crónica (LLC) y mieloma múltiple.

[1014] En una realización, la enfermedad, trastorno o afección relacionada con CD45RCalto es lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal (incluidas enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), APECED (polendocrinopatía autoinmunitaria-candidiasis-distrofia ectodérmica), o distrofia muscular de Duchenne (DMD).

[1015] En una realización, la enfermedad, trastorno o afección relacionada con CD45RCalto es lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal (incluidas enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) o APECED (poliendocrinopatía autoinmunitaria-candidiasis-distrofia ectodérmica).

[1017] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente se formularán para su administración al sujeto.

[1019] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente se administrará sistémica o localmente.

[1021] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente se va a administrar por inyección, por vía oral, tópica, nasal, bucal, rectal, vaginal, intratraqueal, por endoscopia, transmucosa o por administración percutánea.

[1023] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente se inyecta, preferiblemente de forma sistémica.

[1025] Algunos ejemplos de formulaciones adaptadas para inyección incluyen, pero no se limitan a, soluciones, tales como, por ejemplo, soluciones acuosas estériles, geles, dispersiones, emulsiones, suspensiones, formas sólidas adecuadas para preparar soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de su uso, tales como, por ejemplo, polvo, formas liposomales y similares.

[1027] Algunos ejemplos de inyecciones sistémicas incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa (i.v.), subcutánea, intramuscular (i.m.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) y perfusión.

[1029] Se entenderá que en la presente invención también se contemplan otras vías de administración adecuadas, y el modo de administración lo decidirá en última instancia el médico que atienda al paciente dentro del alcance del buen juicio médico. Además de la administración por inyección (i.v., i.p., i.m. y similares), existen otras vías, como la nebulización (Respaudetal.,2014. MAbs. 6(5):1347-55; Guilleminaultetal.,2014. J Control Release.

[1030] 196:344-54; Respaudet al.,2015. Expert Opin Drug Deliv. 12(6):1027-39) o administración subcutánea (Jackischet al.,2014. Geburtshilfe Frauenheilkd. 74(4):343-349; Solal-Celigny, 2015. Expert Rev Hematol.

[1031] 8(2):147-53).

[1033] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente se administra al sujeto que lo necesita en una cantidad terapéuticamente eficaz.

[1035] La expresión"cantidad terapéuticamente eficaz",como se emplea en esta memoria, se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado preventivo y/o terapéutico deseado.

[1037] Sin embargo, se entenderá que el uso diario total del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o el vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente será decidida por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente concreto dependerá de diversos factores, entre los que se incluyen la enfermedad tratada y la gravedad de la enfermedad; la actividad del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición empleada; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del dominio específico de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o el vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición empleada; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el dominio específico de unión a CD45RC, anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, CAR anti-CD45RC, ácido nucleico o vector que lo codifica, célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o población de dichas células inmunitarias, o composición empleada; y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Por ejemplo, se encuentra dentro de la capacidad de la técnica iniciar dosis del compuesto a concentraciones inferiores a las necesarias para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logra el efecto deseado. La dosis total necesaria para cada tratamiento puede administrarse en dosis múltiples o en una sola dosis.

[1039] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC o del anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo oscila de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 0,4 mg/kg a aproximadamente 2,5 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg.

[1041] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC o del anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo oscila de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 400 pg/kg, de aproximadamente 20 pg/kg a aproximadamente 300 pg/kg, de aproximadamente 30 pg/kg a aproximadamente 250 pg/kg, de aproximadamente 35 pg/kg a aproximadamente 200 pg/kg, de aproximadamente 40 pg/kg a aproximadamente 160 pg/kg.

[1043] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias oscila de aproximadamente 1 x 102 a aproximadamente 1 x 109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 108 células por kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de dichos intervalos.

[1045] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias es al menos 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 o 1 x 109 células por kg de peso corporal.

[1047] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se administrará una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o más.

[1049] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se administrará cada día, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días.

[1051] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se administrará cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas.

[1053] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se administrará cada mes, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada cinco meses, cada seis meses.

[1055] En una realización preferida, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición debe administrarse cada 12 horas, cada 24 horas, cada 36 horas, cada 48 horas, cada 60 horas, cada 72 horas, cada 96 horas.

[1056] En una realización preferida, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se administrará cada 60 horas.

[1058] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición es para administración aguda. En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición es para administración crónica.

[1060] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se va a administrar durante aproximadamente 5 días, 7 días, 10 días, 14 días, 21 días, 28 días, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año o más.

[1062] En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se va a administrar durante un periodo de tiempo que va de aproximadamente una semana a aproximadamente ocho semanas, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente siete semanas, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente seis semanas, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente cinco semanas.

[1064] En una realización preferida, una cantidad terapéuticamente eficaz del dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición se administrará durante un periodo de tiempo que oscila de aproximadamente 10 días a aproximadamente 40 días, de aproximadamente 15 días a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 20 días a aproximadamente 30 días.

[1066] En una realización, el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente se administrará antes, concomitantemente o después de un fármaco terapéutico.

[1068] Algunos ejemplos de fármacos terapéuticos adecuados se han descrito anteriormente como cargas útiles adecuadas para ser conjugadas con el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, e incluyen agentes quimioterápicos, agentes terapéuticos dirigidos, agentes citotóxicos (o citotoxinas), agentes sincronizadores del ciclo celular, ligandos para receptor(es) celular(es), agentes inmunomoduladores, agentes proapoptóticos, péptidos líticos, agentes antiangiogénicos, citocinas, factores de crecimiento y hormonas.

[1070] Se entiende fácilmente que estos fármacos terapéuticos pueden por tanto administrarse en forma conjugada, pero también en forma no conjugada (o libre) junto con el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente.

[1072] T ambién se entenderá por el experto en la técnica que el fármaco terapéutico particular para la coadministración dependerá de la enfermedad o afección a prevenir y/o tratar.

[1074] En una realización ilustrativa, cuando el dominio de unión a CD45RC, el anticuerpo anti-CD45RC o fragmento de unión a antígeno del mismo, el CAR anti-CD45RC, el ácido nucleico o vector que lo codifica, la célula inmunitaria que expresa el CAR anti-CD45RC o la población de dichas células inmunitarias, o la composición descrita anteriormente es para inducir tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesita, o prevenir y/o reducir el rechazo de trasplante, puede ser deseable que se coadministre un agente inmunodepresor.

[1076] Breve descripción de los dibujos

[1078] Las Figuras 1A-Cson un conjunto de tres gráficos que muestran el efecto de tres anticuerpos anti-hCD45RC (ABO-21001, ABO-21007 y ABO-21009) para tratar la EICH en ratones NSG inmunodeficientes.Figura 1A:curvas de supervivencia.Figura 1B:pérdida de peso.Figura 1C:puntuación clínica.

[1079] Ejemplos

[1080] La presente invención se ilustra además mediante los ejemplos siguientes. A lo largo de los ejemplos, se aplica la siguiente nomenclatura:

[1081] "ABIS-45RC":un anticuerpo murino anti-hCD45RC correspondiente al anticuerpo n.° 1 descrito en la tabla 2 del documento WO2020/058495.

[1082] "ABO-21001":una de las mejores variantes humanizadas de ABIS-45RC del documento WO2020/058495, correspondiente al anticuerpo n.° 92 descrito en la tabla 2 del documento WO2020/058495.

[1083] "ABO-21009":una de las mejores variantes humanizadas de ABIS-45RC del documento WO2020/058495, correspondiente al anticuerpo n.° 103 descrito en la tabla 2 del documento WO2020/058495.

[1084] "ABO-21007":una variante humanizada de ABIS-45RC, objeto de la presente invención, que comprende: - una región variable de cadena pesada (HCVR) con la SEQ ID NO: 24;

[1085] - una región variable de cadena ligera (LCVR) con la SEQ ID NO: 25, en donde X<1>está ausente, y X<2>es Tyr (Y); - una región constante de cadena pesada (HCCR) con la SEQ ID NO: 26; y

[1086] - una región constante de cadena ligera (LCCR) con la SEQ ID NO: 29.

[1087] Ejemplo 1: tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) con ABO-21007 Materiales y métodos

[1088] Aislamiento de PBMC

[1089] Se extrajo sangre en el Établissement Frangais du Sang (Nantes, Francia) de individuos sanos. Se proporcionó el consentimiento informado por escrito según las directrices del centro. Las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (Eurobio, Courtaboeuf, Francia). Los hematíes y plaquetas restantes se eliminaron con una solución hipotónica y centrifugación.

[1090] Animales

[1091] Se criaron ratones NOD/SCID/IL2R<y>-/- (NSG) de 8 a 12 semanas de edad en las instalaciones para animales de los presentes inventores en condiciones SPF (número de acreditación C44-278).

[1092] Modelo de EICH

[1093] Se irradió subletalmente a ratones adultos inmunodeficientes NSG en todo el cuerpo (dosis de irradiación de 2 Gy en el día -1) para inducir lesiones en los tejidos que favorecieran el desarrollo de la EICH. Al día siguiente (día 0), se inyectaron por vía intravenosa en estos ratones 1,5 x 107 PBMC (incluidos linfocitos T CD45RCalto y CD45RCbajo/- ) procedentes de voluntarios sanos. Las PBMC humanas, y particularmente los linfocitos T, reaccionan contra los tejidos de ratón y los atacan induciendo lesiones. Estos linfocitos T y las lesiones observadas en hígado, intestino, pulmones y piel imitan la EICH observada tras el trasplante de médula ósea en seres humanos u otros sistemas experimentales de EICH que utilizan roedores como donantes y receptores. En particular, estas lesiones tisulares suelen inducir una pérdida de peso corporal que comienza, dependiendo del número de PBMC inyectadas y en nuestro sistema experimental, aproximadamente el día 13 tras la inyección de las PBMC. La pérdida de peso corporal se controla diariamente y los animales se sacrifican cuando desciende al 20 % del peso corporal original para evitarles sufrimientos innecesarios.

[1094] Tratamiento

[1095] Se trató a los ratones NSG por vía intraperitoneal con los anticuerpos purificados anti-CD45RC ABO-21001, ABO-21007 y ABO-21009, o con PBS a 0,8 mg/kg desde el día 0 y cada 2,5 días durante 20 días.

[1096] Puntuación clínica global

[1097] Se determinó una puntuación clínica global de la EICH (de 0 a 12) mediante la compilación de seis puntuaciones individuales, a saber:

[1098] - puntuación de la pérdida de peso corporal (de 0 a 2);

[1099] - puntuación de la postura (de 0 a 2);

[1100] - puntuación de la integridad de la piel (de 0 a 2);

[1101] - puntuación de la actividad (de 0 a 2);

[1102] - puntuación de la textura de la piel (de 0 a 2); y

[1103] - puntuación de palidez (de 0 a 2).

[1104] Resultados

[1105] El tratamiento únicamente con PBMC (PBS) indujo la muerte de los ratones, que se inició aproximadamente el día 11 y, como se muestra en laFigura 1A,la muerte de todos los ratones antes del día 15. El tratamiento con ABO-21001 y ABO-21009 aumentó la supervivencia de los ratones en comparación con los tratados con PBS. A los 35 días, una media del 40 % de los ratones tratados siguen vivos(Figura 1A).Sorprendentemente, sin embargo, el tratamiento con ABO-21007 aumentó significativamente la supervivencia de los ratones, con una media del 70 % de ratones que seguían vivos a los 35 días(Figura 1A).

[1106] Del mismo modo, tras el tratamiento con ABO-21001 o ABO-21009, los ratones NSG perdieron peso aunque significativamente menos que los ratones NSG tratados con PBS(Figura 1B).Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con ABO-21007 no produjo ninguna pérdida de peso.

[1107] Por último, la puntuación clínica de la EICH también fue la más baja en los ratones tratados con ABO-21007(Figura 1C).

[1108] En conjunto, estos resultados demuestran las características mejoradas de ABO-21007, en comparación con los anticuerpos anti CD45RC humanos ya mejorados del documento WO 2020/058495.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD45RC, en donde dicho dominio de unión a antígeno comprende:

(a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las tres CDR siguientes:

(i) V<h>-CDR1 con la secuencia de SEQ ID NO: 10;

(ii) V<h>-CDR2 con la secuencia de SEQ ID NO: 11; y

(iii) V<h>-CDR3 con la secuencia de SEQ ID NO: 12; y

(b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende las tres CDR siguientes:

(i) V<l>-CDR1 con la secuencia de SEQ ID NO: 13;

(ii) V<l>-CDR2 con la secuencia de SEQ ID NO: 14; y

(iii) V<l>-CDR3 con la secuencia de SEQ ID NO: 15,

en donde X en la SEQ ID NO: 13 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G); preferiblemente X en la SEQ ID NO: 13 está ausente.

2. El dominio de unión a antígeno según la reivindicación 1, en donde dicho dominio de unión a antígeno comprende:

1) una HCVR con la secuencia de SEQ ID NO: 24 y una LCVR con la secuencia de SEQ ID NO: 25; o bien 2) una HCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y regiones marco que comparten al menos un 70 % de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 24, y una LCVR que comprende las tres CDR con las SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y regiones marco que comparten al menos un 70 % de identidad de secuencia con las regiones marco de la SEQ ID NO: 25, en donde el dominio de unión a antígeno conserva su especificidad de unión a CD45RC;

en donde X<1>en la SEQ ID NO: 25 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en Asn (N), Ser (S) y Gly (G); preferiblemente X en la SEQ ID NO: 13 está ausente; y

en donde X<2>en la SEQ ID NO: 25 se selecciona del grupo que consiste en Tyr (Y) y Phe (F), preferiblemente X<2>en la SEQ ID NO: 25 es Tyr (Y).

3. El dominio de unión a antígeno según la reivindicación1o2,en donde dicho dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento variable monocatenario (scFv), un di-scFv en tándem, un tri-scFv en tándem, un scFv-Fc, un minicuerpo, un maxicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un Fv, un Fab, un Fab', un Fab'-SH, y un F(ab')2.

4. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD45RC, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4,que comprende además una región constante de cadena pesada (HCCR) y una región constante de cadena ligera (LCCR), preferiblemente en donde la HCCR comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 26 a 28, más preferiblemente con la SEQ ID NO: 26 y la LCCR comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; y

en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo conserva su especificidad de unión a CD45RC.

6. Un receptor quimérico para el antígeno (CAR) que se une específicamente a CD45RC, que comprende: i) al menos un dominio extracelular de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3;ii) opcionalmente, un dominio bisagra extracelular,

iii) al menos un dominio transmembrana,

preferiblemente el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en el dominio transmembrana CD8 y el dominio transmembrana CD28, más preferiblemente el dominio transmembrana se selecciona del grupo que consiste en el dominio transmembrana CD8 con una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 y el dominio transmembrana CD28 con una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50;

iv) al menos un dominio de señalización intracelular que comprende al menos un dominio de señalización primaria y, opcionalmente, uno o más dominios de señalización coestimuladores,

preferiblemente la al menos una señalización primaria es un dominio de señalización de CD3Z, preferiblemente la al menos una señalización primaria es un dominio de señalización de CD3Z con una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.

7. Una población de células inmunitarias que expresa el receptor quimérico para el antígeno según la reivindicación6en su superficie celular.

8. La población de células inmunitarias según la reivindicación7,en donde las células inmunitarias de dicha población se seleccionan del grupo que comprende linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T doble positivos, linfocitos T doble negativos, linfocitos T yS, linfocitos NK, linfocitos NKT, linfocitos B, macrófagos o células dendríticas.

9. Un ácido nucleico que codifica: el dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,o el CAR según la reivindicación 6, preferiblemente bajo el control de elementos reguladores.

10. El dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,la población de células inmunitarias según la reivindicación7u8,o el ácido nucleico según la reivindicación9,para su uso como medicamento.

11. El dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,la población de células inmunitarias según la reivindicación7u8,o el ácido nucleico según la reivindicación9,para su uso en la inducción de tolerancia inmunitaria en un sujeto que lo necesite.

12. El dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,la población de células inmunitarias según la reivindicación7u8,o el ácido nucleico según la reivindicación9,para su uso en el agotamiento de células CD45RCalto en un sujeto que lo necesite.

13. El dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,la población de células inmunitarias según la reivindicación7u8,o el ácido nucleico según la reivindicación9,para su uso en la prevención y/o reducción del rechazo del trasplante en un sujeto que lo necesite.

14. El dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,la población de células inmunitarias según la reivindicación7u8,o el ácido nucleico según la reivindicación9,para su uso en la prevención y/o reducción de la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) en un sujeto que la necesite.

15. El dominio de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones1a3,el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación4o5,la población de células inmunitarias según la reivindicación7u8,o el ácido nucleico según la reivindicación9,para su uso en la prevención, reducción y/o tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCalto en un sujeto que lo necesite

preferiblemente en donde las enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con CD45RCalto se seleccionan del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias no deseadas, enfermedades monogénicas, linfoma y cáncer.