ES3047833T3 - Rapid cell culture monitoring device including island structure - Google Patents

Rapid cell culture monitoring device including island structure

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ES3047833T3
ES3047833T3 ES20926157T ES20926157T ES3047833T3 ES 3047833 T3 ES3047833 T3 ES 3047833T3 ES 20926157 T ES20926157 T ES 20926157T ES 20926157 T ES20926157 T ES 20926157T ES 3047833 T3 ES3047833 T3 ES 3047833T3
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Jung Soo Kim
Tae Geun Lim
Gi Yoon Lee
Dong Young Kim
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Abstract

Se proporciona un dispositivo de monitorización de cultivo celular que comprende una pluralidad de unidades de pocillos, comprendiendo las unidades de pocillos: una primera unidad de inyección para inyectar un primer fluido; una primera unidad de alojamiento que se comunica con la primera unidad de inyección de modo que el primer fluido inyectado desde la primera unidad de inyección fluye para ser alojado en la misma; una segunda unidad de inyección para inyectar un segundo fluido; y una segunda unidad de alojamiento para alojar el segundo fluido, en donde la segunda unidad de alojamiento incluye una estructura de isla conectada a una estructura de conexión de isla que se extiende desde la pared de la segunda unidad de alojamiento, una tercera unidad de inyección en la que se introduce un agente antibiótico está formada en la parte superior de la estructura de isla, y el agente antibiótico inyectado desde la tercera unidad de inyección está alojado y fijado en el interior y exterior de la estructura de isla. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Dispositivo de monitoreo rápido de cultivo celular, incluida la estructura de isla
[0003] Campo técnico
[0004] La presente descripción se refiere a un dispositivo de prueba de cultivo celular y, más específicamente, a un dispositivo de prueba de cultivo celular que incluye estructuras de isla y está diseñado para que los fluidos dispensados se distribuyan uniformemente en los pocillos de un chip, lo que facilita una observación precisa. Antecedentes de la técnica
[0005] La prescripción oportuna de antibióticos para pacientes humanos infectados con agentes infecciosos afecta en gran medida la supervivencia de los pacientes. Para una correcta prescripción de antibióticos, primero es necesario determinar las concentraciones de antibióticos específicos a las que se inhibe el crecimiento de cepas patógenas de infección. Este proceso de determinación se denomina prueba de susceptibilidad a antibióticos. Según una prueba de susceptibilidad a antibióticos típica, se determina si los patógenos infecciosos se cultivan después del cultivo en micropocillos que contienen varias concentraciones de una mezcla de un medio de cultivo y un antibiótico durante aproximadamente 18 horas a través de mediciones de transmitancia. Actualmente se están desarrollando una serie de productos para minimizar el tiempo requerido para el cultivo de patógenos infecciosos y automatizar el proceso de prueba.
[0006] En primer lugar, la miniaturización de los entornos de cultivo de patógenos infecciosos es un requisito básico para minimizar el tiempo de cultivo de patógenos infecciosos. Para dicha miniaturización y automatización, existe una tendencia en rápido crecimiento a introducir placas de plástico desechables que tienen estructuras a microescala donde se dispensan microfluidos y que pueden ajustarse a las formas y secuencias deseadas. El presente solicitante ha tenido éxito en el desarrollo de un sistema de prueba de susceptibilidad a antibióticos donde se introduce una placa microfluídica de tal manera que el crecimiento de bacterias se determina a través de imágenes microscópicas. El uso de este sistema es ventajoso porque las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos pueden completarse en unas pocas horas, pero tiene limitaciones porque se requiere una forma complicada de canales para la inmovilización celular tridimensional y el medio de cultivo y el suministro de fármacos y un medio de cultivo y un fármaco son difíciles de extender a largas distancias.
[0007] Documentos de la técnica anterior:
[0008] D1: El documento de J. CHOT et al., "A rapid antimicrobial susceptibility test based a single-cell morphological analysis'', Science Translational Medicine, vol. 6, n.° 267, del 17 de diciembre de 2014, páginas 267ral74-267ral74, documento XP055618055, ISSN: 1946-6234, DOI: 10.1126/scitranslmed.3009650
[0009] D2: El documento EP 2987 851 A1 (QUANTA MATRIX CO LTD; UNI. SEOUL NAT R & DB FOUND [KR]) del 24 de febrero de 2016
[0010] D3: El documento EP 3434 370 A1 (QUANTA MATRIX CO LTD [KR]) del 30 de enero de 2019
[0011] D4: El documento WO 2010/018499 A1 (KONINKL PHILIPS ELECTRONICS NV [NL]; CATTANEO STEFANO [NL] et al.) 18 de febrero de 2010
[0012] D5: El documento de SHIN-YI CINDY CHEN et al., BIOMEDICAL MICRODEVICES, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 13, n.° 4, del 10 de mayo de 2011, páginas 753-758, documento XP019921901, ISSN: 1572-8781, DOI: 10.1007/S10544-011-9545-3
[0013] D6: El documento US 2013/21 01 31 A1 (RENKEN CHRISTIAN W [US]), del 15 de agosto de 2013
[0014] El D1 es un NPL (artículo de revista) relacionado con una prueba rápida de susceptibilidad a antibióticos, que es un análisis morfológico unicelular (Single-Cell Morphological Analysis, SCMA) que puede determinar la susceptibilidad antimicrobiana analizando y categorizando automáticamente los cambios morfológicos en células bacterianas individuales en diversas condiciones antimicrobianas.
[0015] El D2 es un documento de patente con respecto a un dispositivo de prueba de cultivo celular basado en múltiples pocillos microfluídicos, que tiene una estructura de matriz de una pluralidad de unidades de pocillos microfluídicos alineados y cada una de las unidades de pocillos microfluídicos comprende una entrada a través de la cual entra un primer fluido, un compartimento de alojamiento adaptado para alojar un segundo fluido en este, un canal microfluídico a través del cual fluye el primer fluido y una salida de aire adaptada para facilitar la entrada del primer fluido.
[0016] El D3 es un documento de patente y describe un dispositivo de prueba de cultivo celular basado en múltiples pocilios que tiene una estructura de matriz de una pluralidad de unidades de pocillos alineadas. Cada una de las unidades de pocillos incluye un primer subpocillo adaptado para alojar un primer fluido, un segundo subpocillo adaptado para alojar un segundo fluido y una barrera ubicada entre el primer subpocillo y el segundo subpocillo para dividir el primer subpocillo y el segundo subpocillo.
[0018] El D4 es un documento de patente que describe un procedimiento y aparato para realizar pruebas de susceptibilidad celular a través de un gradiente de concentración en un dispositivo microfluídico que incluye un canal microfluídico, comprendiendo las etapas de atrapar una o más células individuales que se van a probar en una o más posiciones definidas en una superficie interna del canal; aplicar un gradiente de concentración estable y predecible de una sustancia a través del canal con las células que se van a probar; incubar las células que se van a probar dentro del gradiente de concentración.
[0020] El D5 es un NPL (artículo de revista) que describe una matriz de perfusión microfluídica en un formato de placa de 96 pocillos capaz de un cultivo de matriz extracelular tridimensional (Three Dimensional Extracellular Matrix, 3D ECM) a largo plazo dentro de microcámaras biomiméticas, donde la perfusión se genera usando fuerzas de gravedad y tensión superficial, lo que permite que la matriz funcione sin bombas externas.
[0022] El D6 es un documento de patente y describe un dispositivo de filtro que incluye un pocillo, al menos una abertura de acceso superior al pocillo, y un filtro dispuesto horizontalmente, que incluye una superficie interna que define al menos parcialmente el pocillo, también incluye una primera cámara de pocillos para alojar un fluido y una segunda cámara de pocillos para alojar un fluido, ambas cámaras separadas, y la superficie interna define al menos parcialmente la primera cámara de pocillos y define al menos parcialmente la segunda cámara de pocillos.
[0024] Descripción detallada de la invención
[0026] Problemas que debe resolver la invención
[0028] La presente descripción se ha realizado en un esfuerzo por superar las limitaciones descritas anteriormente y pretende proporcionar un dispositivo de prueba de cultivo celular que incluya estructuras de isla y diseñado de manera que los fluidos dispensados se distribuyan uniformemente en los pocillos de un chip, facilitando la observación precisa según la reivindicación 1.
[0030] Medios para resolver los problemas
[0032] La presente invención proporciona un dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 1 y un procedimiento de análisis celular según la reivindicación 13. En las reivindicaciones secundarias a las reivindicaciones 1 y 13 se exponen realizaciones preferidas de la invención, respectivamente.
[0034] Un aspecto de la presente descripción proporciona un dispositivo de prueba de cultivo celular que incluye una pluralidad de unidades de pocillos, cada una de las cuales incluye una primera parte de entrada a través de la cual se introduce un primer fluido, un primer espacio de alojamiento que se comunica con la primera parte de entrada para alojar un flujo del primer fluido introducido a través de la primera parte de entrada, una segunda parte de entrada a través de la cual se introduce un segundo fluido, un segundo espacio de alojamiento en el cual se aloja el segundo fluido introducido, en donde el segundo espacio de alojamiento se conecta a la superficie interna del primer espacio de alojamiento para formar una interfaz perpendicular a una superficie inferior entre el primer fluido y el segundo fluido,
[0036] y una tercera parte de entrada a través de la cual se había cargado un antibiótico, cuya tercera parte de entrada se ha formado arriba y se ha conectado con una estructura de isla que se extiende desde la superficie de pared del segundo espacio de alojamiento, en donde el antibiótico cargado desde la tercera parte de entrada se aloja de manera fija en las superficies interna y externa de la estructura de isla.
[0038] En una realización, el centro de la estructura de isla puede coincidir con el centro del primer espacio de alojamiento y la estructura de isla puede estar separada una distancia del primer espacio de alojamiento.
[0039] En una realización, el extremo inferior de la estructura de isla puede estar separado de 0,1 a 1 mm de la superficie inferior del segundo espacio de alojamiento y la estructura de isla puede tener una superficie inferior abierta.
[0040] En una realización, el segundo fluido introducido puede estar en contacto con las superficies interna y externa de la estructura de isla, disolver el antibiótico fijado a las superficies interna y externa de la estructura de isla y difundir el antibiótico disuelto en el primer fluido.
[0042] En una realización, el espesor y el ancho del primer espacio de alojamiento pueden determinarse de manera que el primer espacio de alojamiento se llene con el primer fluido introducido a través de la primera parte de entrada por acción capilar.
[0044] En una realización, el primer espacio de alojamiento puede tener un ancho de 0,3 a 2 mm y un espesor de 100 a 500 pm.
[0046] En una realización, la superficie lateral del segundo espacio de alojamiento puede estar en comunicación con la superficie interna del primer espacio de alojamiento de manera que el primer fluido y el segundo fluido se encuentren entre sí y se produzca la transferencia de masa al primer fluido.
[0048] En una realización, el primer espacio de alojamiento puede ser una estructura microfluídica abierta cuya al menos una superficie está abierta y la superficie abierta del primer espacio de alojamiento puede estar conectada a la superficie lateral del segundo espacio de alojamiento a través de una válvula capilar.
[0050] En una realización, el espesor y el ancho de la estructura de la válvula capilar pueden determinarse de modo que el primer fluido introducido no entre en el segundo espacio de alojamiento durante o después del flujo hacia el primer espacio de alojamiento.
[0052] En una realización, la válvula capilar puede tener un espesor de 100 a 500 pm y un ancho de 100 pm a 2 mm.
[0053] En una realización, el dispositivo de prueba de cultivo celular puede incluir medios de unión dispuestos en la superficie trasera de este para evitar la fuga del primer fluido y el segundo fluido.
[0055] En una realización, el medio de unión puede ser una película ópticamente transparente.
[0057] Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona un procedimiento de análisis celular que usa un dispositivo de prueba de cultivo celular que tiene una estructura de matriz de una pluralidad de unidades de pocillos alineados, cada una de las cuales incluye una primera parte de entrada a través de la cual se introduce una solución de mezcla de un medio líquido que contiene un agente gelificante y un agente biológico como primer fluido, una segunda parte de entrada a través de la cual se introduce un disolvente seleccionado de agua, medios de cultivo celular, dimetilformamida (DMF) y dimetilsulfóxido (DMSO) como segundo fluido. introducido, un primer espacio de alojamiento que se comunica con la primera parte de entrada donde se aloja el primer fluido introducido, un segundo espacio de alojamiento donde se aloja el segundo fluido introducido, una estructura de isla alojada en el segundo espacio de alojamiento y una tercera parte de entrada a través de la cual se carga un antibiótico en la estructura de isla se ha formado por encima de la estructura de isla y se ha conectado con ella a través de una estructura de conexión de isla que se extiende desde la superficie de pared interna del segundo espacio de alojamiento, incluyendo el procedimiento (a) cargar el antibiótico en la tercera parte de entrada formada por encima de la estructura de isla para fijar el antibiótico a las superficies interna y externa de la estructura de isla, (b) introducir el primer fluido en la primera parte de entrada, permitiendo que el primer fluido introducido fluya hacia el primer espacio de alojamiento y gelificar la solución de mezcla para formar una película delgada sólida, (c) introducir el segundo fluido en la segunda parte de entrada, permitiendo que el segundo fluido sea alojado en el segundo espacio de alojamiento y entrar en contacto con la estructura de isla para dispersar o disolver el antibiótico, y permitir que el segundo fluido entre en contacto con la película delgada sólida del primer fluido en una parte de conexión entre el primer espacio de alojamiento y el segundo espacio de alojamiento para difundir el antibiótico en la película delgada sólida en su interfaz formada perpendicular a una superficie inferior entre el primer fluido y el segundo fluido, y (d) observar cambios del agente biológico en una base de célula única en la interfaz entre la película delgada sólida del primer fluido y el segundo fluido y en la película delgada sólida del primer fluido.
[0059] En una realización, el procedimiento puede incluir además (d) observar cambios del agente biológico que responde al antibiótico en una sola célula para determinar la concentración inhibitoria mínima (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) o la concentración mínima de erradicación de biopelícula (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) del antibiótico.
[0061] Efectos de la invención
[0063] El dispositivo de prueba rápida de cultivo celular de la presente descripción incluye estructuras de isla y está diseñado para una distribución uniforme y una difusión rápida de un antibiótico, lo que permite una prueba precisa en comparación con los dispositivos de prueba de antibióticos convencionales. El dispositivo de prueba rápida de cultivo celular de la presente descripción usa células inmovilizadas en películas delgadas sólidas para observar los efectos del antibiótico, lo que permite una prueba rápida de susceptibilidad al antibiótico en comparación con los dispositivos convencionales.
[0065] Además, el dispositivo de prueba rápida de cultivo celular de la presente descripción en general puede observar cambios en el crecimiento de bacterias individuales en varias decenas de minutos (por lo general 30 minutos) y cambios en el crecimiento de colonias individuales de bacterias en 4 a 6 horas. Por consiguiente, el dispositivo de prueba rápida de cultivo celular de la presente descripción puede determinar con mayor precisión y rapidez los efectos de un agente bioactivo sobre un agente biológico que los dispositivos convencionales.
[0066] Además, el dispositivo de prueba rápida de cultivo celular de la presente descripción puede observar cambios de un agente biológico que responde a un agente bioactivo en una base de colonia celular única para determinar la concentración inhibitoria mínima (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) o la concentración mínima de erradicación de biopelícula (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) del agente bioactivo, por lo que es muy útil para la prueba de biopelícula, así como para la prueba de susceptibilidad a antibióticos.
[0067] Breve descripción de los dibujos
[0068] La FIG. 1 ilustra una realización de un dispositivo de prueba de cultivo celular.
[0069] La FIG. 2 ilustra una unidad de pocillos de un dispositivo de prueba de cultivo celular según una realización de la presente descripción.
[0070] La FIG. 3 ilustra una prueba de susceptibilidad a antibióticos que usa un primer fluido y un segundo fluido introducidos en una unidad de pocillos.
[0071] La FIG. 4 ilustra un primer fluido introducido en un canal microfluídico de una unidad de pocillo: (a) vista en planta y (b) vista en sección transversal tomada a lo largo de la línea A-A’ de (a).
[0072] La FIG. 5 ilustra esquemáticamente los comportamientos de un fluido suministrado a través de una segunda parte de entrada y un antibiótico seco unido a una tercera parte de entrada.
[0073] La FIG. 6 ilustra vistas en planta, en perspectiva y en sección transversal de diversas formas de estructuras de isla y estructuras 143 de conexión de isla según realizaciones ejemplares de la presente descripción.
[0074] La FIG. 7 ilustra un molde usado para fabricar un dispositivo de prueba de cultivo celular según una realización de la presente descripción.
[0075] La FIG. 8 ilustra medios de unión traseros y un adhesivo aplicado a los medios de unión traseros según realizaciones ejemplares de la presente descripción.
[0076] La FIG. 9 muestra una imagen de gran aumento de una película delgada sólida según una realización de la presente descripción.
[0077] La FIG. 10 muestra los resultados observados de películas delgadas sólidas cuando se usó colistina a varias concentraciones ((a) 0 mg/ml, (b) 0,12 mg/ml, (c) 0,25 mg/ml, (d) 0,5 mg/ml, (e) 1 mg/ml y (f) 2 mg/ml) según realizaciones ejemplares de la presente descripción.
[0078] La FIG. 11 muestra imágenes que ilustran los comportamientos de un fluido cuando las estructuras de isla se separaron varias distancias según realizaciones ejemplares de la presente descripción.
[0079] Modo de realización de la invención
[0080] A continuación, se describirán en detalle realizaciones de la presente descripción con referencia a los dibujos adjuntos.
[0081] Sin embargo, la presente descripción puede realizarse en muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones aquí establecidas. Más bien, estas realizaciones se proporcionan de manera que la presente descripción sea exhaustiva y completa, y transmitirá completamente el alcance de los presentes conceptos según la invención a los expertos en la técnica. En los dibujos, las dimensiones, tales como anchos y espesores, de los elementos pueden exagerarse por claridad. Los dibujos se explican desde el punto de vista de un observador. Se entenderá que cuando se hace referencia a un elemento como “en” otro elemento, puede estar directamente en el otro elemento, o también pueden estar presentes uno o más elementos intermedios entre ellos. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden realizarse muchas modificaciones sin alejarse del alcance de la descripción. A lo largo de los dibujos adjuntos, se usan los mismos números de referencia para designar sustancialmente los mismos elementos.
[0082] Por otro lado, los términos usados en esta invención deben entenderse como se describe a continuación. Si bien los términos como "primero" y "segundo", etc., pueden usarse para describir varios elementos, dichos elementos no deben limitarse a los términos anteriores. Los términos anteriores se usan únicamente para distinguir un elemento de otro. Por ejemplo, un primer elemento puede referirse como un segundo elemento, y de manera análoga un segundo elemento puede referirse como un primer elemento.
[0083] Como se emplea en esta memoria, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entenderá además que los términos “incluye(n)”, “incluyendo”, “tiene(n)” y/o “teniendo”, cuando se usan en esta especificación, especifican la presencia de características, números enteros, etapas, operaciones, elementos y/o componentes indicados, pero no excluyen la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de estos. Tal como se emplea en esta memoria, el término "y/o" incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados. Las etapas respectivas de los procedimientos descritos en esta invención pueden realizarse en un orden diferente al que se describe explícitamente. En otras palabras, las etapas respectivas pueden realizarse en el mismo orden que se describe, simultáneamente o en orden inverso.
[0085] Según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un dispositivo de prueba de cultivo celular que incluye una pluralidad de unidades de pocillos tal como se define en la reivindicación 1. La FIG. 1 ilustra una realización del dispositivo de prueba de cultivo celular. En la FIG. 1, (a) se ilustra la constitución del dispositivo de prueba de cultivo celular, (b) se ilustra una vista parcialmente ampliada del dispositivo de prueba de cultivo celular, y (c) se ilustra una vista en sección transversal de una de las unidades de pocillos. Con referencia a la FIG. 1, la pluralidad de unidades 110 de pocillos están alineadas en el dispositivo de prueba de cultivo celular. La pluralidad de las unidades 110 de pocillos alineadas puede tener dimensiones generales similares a los pocillos de una placa comercial de múltiples pocillos. Los centros de las unidades 110 de pocillos pueden coincidir con los centros de los pocillos de una placa comercial de múltiples pocillos. Cada una de las unidades 110 de pocillos incluye una primera parte 132 de entrada a través de la cual se introduce un primer fluido, una segunda parte 134 de entrada a través de la cual se introduce un segundo fluido, un primer espacio 150 de alojamiento que se comunica con la primera parte de entrada para alojar un flujo del primer fluido introducido a través de la primera parte 132 de entrada, y un segundo espacio 120 de alojamiento en el cual se aloja el segundo fluido.
[0087] Las placas de múltiples pocillos son herramientas estándar para procesar y analizar una gran cantidad de muestras en pruebas químicas, bioquímicas y/o biológicas. Las placas de múltiples pocillos pueden adoptar varias formas, tamaños y formas. En general, las placas de múltiples pocillos están diseñadas para tener tamaños y formas estándar y tienen disposiciones estándar de pocillos. Para la compatibilidad con dichas placas de múltiples pocillos, la pluralidad de unidades de pocillos puede tener disposiciones estándar de pocillos, incluidas las que se encuentran en placas de 96 pocillos (matriz de 12 x 8 pocillos), placas de 384 pocillos (matriz de 24 x 16 pocillos) y placas de 1536 pocillos (matriz de 48 x 32 pocillos). Las disposiciones de la pluralidad de unidades de pocillos pueden ser idénticas o similares a las de varias placas de múltiples pocillos disponibles comercialmente. El dispositivo 100 de prueba de cultivo celular es fácilmente compatible con diversas técnicas de análisis biológico convencionales porque sus dimensiones son similares a las de una placa comercial de múltiples pocillos. Por consiguiente, las unidades de pocillos pueden disponerse en una matriz de 1 x 1, 1 x 2, 1 x 4, 2 x 4, 4 x 6, 12 x 8, 24 x 16 o 48 x 32.
[0089] La FIG. 2 ilustra (a) una unidad de pocillos de un chip para la prueba de antibióticos y (b) una vista en sección transversal tomada a lo largo de la línea A-A’ de (a).
[0091] [Ubicaciones de las primeras partes de entrada y las segundas partes de entrada]
[0093] La primera parte 132 de entrada y la segunda parte 134 de entrada en general están ubicadas en la parte superior de cada una de las unidades 110 de pocillos. Cada una de la primera parte 132 de entrada y la segunda parte 134 de entrada puede tener una forma total o parcialmente abierta. Pueden formarse una o más aberturas en cada una de la primera parte 132 de entrada y la segunda parte 134 de entrada. El primer fluido y el segundo fluido pueden introducirse en la unidad 110 de pocillos a través de la primera parte 132 de entrada y la segunda parte 134 de entrada, respectivamente, a través de pipeteo o inyección.
[0095] [Características de las primeras partes de entrada]
[0097] El primer fluido se introduce a través de la primera parte 132 de entrada. El extremo inferior de la primera parte 132 de entrada se comunica con el primer espacio 150 de alojamiento de modo que el primer fluido introducido puede suministrarse al primer espacio 150 de alojamiento. Dado que la primera parte 132 de entrada se usa simplemente para el suministro del primer fluido, la primera parte 132 de entrada se diseña preferentemente en una forma cilíndrica, una forma cónica con un extremo superior abierto o una forma cónica para un flujo suave del primer fluido suministrado. Particularmente, cuando se diseña en una forma cónica, la primera parte 132 de entrada es fácil de liberar de un molde después del moldeo por inyección. Además, la entrada con un diámetro ampliado garantiza una fácil introducción del primer fluido. Además, el primer fluido introducido se recoge en el punto donde la primera parte 132 de entrada y el primer espacio 150 de alojamiento se encuentran entre sí y se suministra al primer espacio 150 de alojamiento. Cuando se garantiza un flujo suave del primer fluido hacia el primer espacio de alojamiento, la primera parte de entrada puede estar en comunicación con la segunda parte de entrada o puede alojarse en la segunda parte de entrada.
[0098] [Características de las segundas partes de entrada]
[0100] El segundo fluido se introduce en el segundo espacio 120 de alojamiento a través de la segunda parte 134 de entrada. La segunda parte 134 de entrada puede estar ubicada en la parte superior del segundo espacio 120 de alojamiento. La segunda parte 134 de entrada proporciona un espacio para la introducción del segundo fluido y el segundo espacio 120 de alojamiento aloja una tercera parte 140 de entrada y una estructura 142 de isla conectadas entre sí a través de una estructura 143 de conexión de isla. Por lo tanto, es preferible que la segunda parte 134 de entrada tenga un diámetro mayor que la primera parte 132 de entrada. Cuando el segundo fluido se controla para que no entre en la primera parte de entrada, la segunda parte de entrada también puede alojar la primera parte de entrada. La segunda parte 134 de entrada puede tener la misma forma de sección transversal que el segundo espacio 120 de alojamiento. Alternativamente, la forma de la segunda parte 134 de entrada puede deformarse parcialmente para especificar la ubicación de introducción y mejorar la conveniencia de la introducción. La parte deformada puede ayudar a guiar la entrada suave del medio de inyección (por ejemplo, una pipeta) para la introducción del segundo fluido. Por lo tanto, puede introducirse una cantidad precisa del segundo fluido en una ubicación precisa.
[0102] [Características del primer fluido y del segundo fluido]
[0104] Cada uno del primer y segundo fluidos incluye típicamente del 70 % al 99 % en peso, preferentemente del 85 % al 99 % en peso, lo más preferentemente del 93 % al 99 % en peso de agua como medio de dispersión o disolvente. Por ejemplo, el primer fluido puede ser una solución de mezcla de un medio líquido que contiene un agente gelificante y un agente biológico. Cuando el contenido de agua en el primer fluido está dentro del intervalo definido anteriormente, el agua puede exhibir un rendimiento óptimo como medio de dispersión.
[0105] [Características del medio líquido en el primer fluido]
[0107] El medio líquido puede incluir al menos aproximadamente el 95 % de agua y puede gelificarse en presencia de un agente gelificante. Por ejemplo, el agente gelificante puede ser agar, agarosa, gelatina, alginato, colágeno o fibrina. Se prefiere el uso de agar o agarosa. Por ejemplo, el agar puede usarse en una cantidad del 0,3 al 4 % en peso en el medio líquido. El medio líquido en general no requiere nutrientes. En algunos ejemplos, sin embargo, el medio líquido puede incluir nutrientes. El medio líquido puede ser una solución que incluye un medio que estimula la división de células particulares. Si el contenido de agar es inferior al 0,3 % en peso, es posible que el medio líquido no se gelifique. Mientras tanto, si el contenido de agar supera el 4 % en peso, el medio líquido puede estar excesivamente gelificado, lo que dificulta la difusión del agente biológico.
[0109] [Características del agente biológico en el primer fluido]
[0111] Los ejemplos de agentes biológicos adecuados incluyen virus, bacterias, hongos, algas, protozoos, patógenos parásitos, células humanas y de mamíferos y biopelículas. El agente biológico puede ser una mezcla de un agente biológico infeccioso (por ejemplo, una cepa bacteriana, viral o fúngica) y células sanguíneas. Por ejemplo, el agente biológico puede ser sangre extraída de un ser humano infectado con bacterias. En este caso, puede usarse un medio que estimule la división de solo las células bacterianas para distinguir las células bacterianas de las células sanguíneas según sus diferentes tamaños. El agente biológico puede crecer en un medio líquido o sólido y el crecimiento del agente biológico puede verse afectado por el tipo y la concentración de un agente bioactivo extraño. La densidad del agente biológico en la solución de mezcla es de 102 a 1010 células/ml, preferentemente de 104 a 1010 células/ml, más preferentemente de 105 a 109 células/ml. Si la densidad del agente biológico está por debajo del límite inferior, puede ser difícil percibir la ubicación del agente biológico. Mientras tanto, si la densidad del agente biológico excede el límite superior, puede ser difícil percibir el estado individual del agente biológico.
[0113] [Características de los primeros espacios de alojamiento]
[0115] El primer espacio 150 de alojamiento se comunica con la primera parte 132 de entrada de modo que el primer fluido introducido desde la primera parte 132 de entrada puede llenar el primer espacio 150 de alojamiento. Por norma general, el primer espacio 150 de alojamiento puede tener una estructura de canal microfluídico abierto. Por ejemplo, el primer espacio 150 de alojamiento puede estar en el nivel de cientos de gm a varios mm de ancho y cientos de gm de profundidad (o espesor). Estas dimensiones facilitan la formación de imágenes posterior y permiten el llenado del primer fluido en el primer espacio 150 de alojamiento por acción capilar. El primer fluido puede ser un medio líquido que contiene un agente gelificante. En este caso, el primer fluido se gelifica después del transcurso de un tiempo predeterminado, lo que resulta en la formación de una película delgada sólida que llena el canal microfluídico. El primer espacio de alojamiento puede tener la forma de una rosquilla que rodea el segundo espacio de alojamiento. El primer fluido introducido en el primer espacio de alojamiento entra en contacto con el segundo fluido simultáneamente con la gelificación para formar una película delgada sólida. El primer espacio de alojamiento puede tener la forma de una rosquilla que rodea la superficie exterior del segundo espacio de alojamiento para maximizar el área de contacto entre la película delgada sólida y el segundo fluido. Alternativamente, cuando el segundo espacio de alojamiento tiene una forma poligonal tal como una forma cuadrangular o triangular, el primer espacio de alojamiento se adapta preferentemente a la forma del segundo espacio de alojamiento de tal manera que su parte de contacto con el segundo fluido ubicado a lo largo de la circunferencia interna del primer espacio de alojamiento se maximiza.
[0116] El primer fluido introducido puede gelificarse para formar una película delgada sólida en el primer espacio 150 de alojamiento. El primer fluido introducido a través de la primera parte de entrada experimenta gelificación. El espesor de la película delgada sólida puede determinarse dependiendo de la profundidad del primer espacio 150 de alojamiento. El espesor del primer espacio de alojamiento puede estar en el intervalo de 1 pm a 500 pm, de 1 pm a 100 pm o de 100 pm a 500 pm. La profundidad del primer espacio de alojamiento es preferentemente de 500 pm o menos, más preferentemente de 100 pm a 500 pm. Si el espesor del primer espacio de alojamiento de fluidos excede el límite superior definido anteriormente, el espesor de la película delgada se vuelve grande, lo que aumenta la cantidad requerida de una muestra o dificulta la observación precisa. Mientras tanto, si el espesor del primer espacio de alojamiento de fluidos es menor que el límite inferior definido anteriormente, la cantidad de agente biológico observable por la misma área es demasiado pequeña, hace que la observación y la determinación sean difíciles.
[0118] Teniendo en cuenta el tamaño de un área de imagen, el ancho del primer espacio de alojamiento puede ser de 100 pm a 5 mm, de 300 pm a 5 mm, de 500 pm a 3 mm o de 1 mm a 3 mm. El ancho del canal microfluídico es preferentemente de 0,3 mm a 2 mm. Si el ancho del primer espacio de alojamiento de fluidos es menor que el límite inferior definido anteriormente, se asegura un campo de visión observable estrecho, lo que dificulta la observación precisa. Mientras tanto, si el ancho del primer espacio de alojamiento de fluidos excede el límite superior definido anteriormente, la cantidad requerida de una muestra aumenta, lo que es ineficiente.
[0120] [Dimensiones de la película delgada sólida en el primer espacio de alojamiento]
[0122] El espesor y el ancho de la película delgada sólida se determinan según la profundidad y el ancho del canal microfluídico. Como se emplea en esta memoria, el término "película delgada" se refiere a una capa delgada que tiene un espesor suficiente para inmovilizar el agente biológico y para observar células individuales. El espesor de la película delgada está típicamente en el intervalo de 1 pm a 5 mm, 1 pm a 3 mm, 1 pm a 2 mm, 1 pm a 1,5 mm, 1 pm a 1 mm, 1 pm a 800 pm, 1 pm a 500 pm, 1 pm a 100 pm, 10 pm a 3 mm, 100 pm a 500 pm, 10 pm a 1 mm, 100 pm a 1 mm, 200 pm a 1 mm o 500 pm a 1 mm, pero no se limita particularmente a este intervalo. El espesor de la película delgada sólida puede corresponder al tamaño de un lado de la película delgada sólida en una dirección perpendicular a un lado de la película delgada sólida que se observará. Dentro del intervalo de espesor de la película delgada sólida definida anteriormente, el agente biológico inmovilizado en la película delgada sólida puede observarse en una sola célula.
[0124] [Propiedades interfaciales de la película delgada sólida en el primer espacio de alojamiento]
[0126] El primer espacio 150 de alojamiento se comunica con la superficie lateral del segundo espacio 120 de alojamiento de tal manera que el primer fluido y el segundo fluido entran en contacto entre sí para formar una interfaz perpendicular a la superficie inferior. En un dispositivo de prueba de cultivo celular de la técnica anterior, el primer fluido y el segundo fluido forman una interfaz paralela a la superficie inferior. En este caso, sin embargo, los cambios causados por un antibiótico solo pueden observarse a una altura específica. En particular, cuando un agente biológico apropiado (por ejemplo, una especie bacteriana o fúngica) no se encuentra a la altura específica para observar, no pueden observarse cambios o la confiabilidad de la prueba puede deteriorarse. Además, una variación de altura de la interfaz horizontal puede ser causada por una variación de volumen del primer fluido y puede ocurrir un gradiente de concentración del antibiótico. En este caso, el efecto dependiente de la concentración del antibiótico puede deteriorar aún más la fiabilidad de los resultados de la prueba. Por el contrario, según la presente descripción, la conexión del segundo espacio de alojamiento a la superficie interior del primer espacio de alojamiento conduce a la formación de una interfaz perpendicular a la superficie inferior. La ubicación de la interfaz puede encontrarse con precisión al observarla. En particular, observar la interfaz y sus alrededores facilita observar los cambios del agente biológico presente en una cantidad menor en el primer fluido.
[0128] Cuando la superficie interior del primer espacio de alojamiento está conectada al segundo espacio de alojamiento de manera que el centro del segundo espacio de alojamiento coincide con el centro del primer espacio de alojamiento, el centro de la estructura de isla también coincide con los centros del primer y segundo espacio de alojamiento, y como resultado, la interfaz entre el primer fluido y el segundo fluido se forma a la misma distancia del centro de la estructura de isla. En particular, cuando un antibiótico introducido en la tercera parte de entrada o unido a la estructura de isla se difunde en el segundo fluido y se transfiere a la interfaz, la concentración del antibiótico puede hacerse uniforme porque la interfaz está a la misma distancia de la posición inicial del antibiótico. Con este fin, la superficie circunferencial interna del primer espacio de alojamiento puede diseñarse para formar la superficie lateral del segundo espacio 120 de alojamiento. Es decir, toda la superficie circunferencial interna del primer espacio de alojamiento está preferentemente en comunicación con la superficie lateral inferior del segundo espacio de alojamiento. El primer espacio de alojamiento se conecta preferentemente a la superficie lateral inferior del segundo espacio de alojamiento a través de una válvula capilar para evitar que el primer fluido introducido a través de la superficie circunferencial exterior del primer espacio de alojamiento pase a través de la superficie circunferencial interior del primer espacio de alojamiento en comunicación con la superficie lateral inferior del segundo espacio de alojamiento.
[0130] [Características de los segundos espacios de alojamiento]
[0132] El segundo fluido introducido a través de la segunda parte 134 de entrada se aloja en el segundo espacio 120 de alojamiento. El segundo espacio 120 de alojamiento aloja la estructura 142 de isla y la tercera parte 140 de entrada conectadas entre sí a través de la estructura 143 de conexión de isla. El segundo espacio 120 de alojamiento puede tener forma de pocillos que tiene un espacio suficiente para alojar el segundo fluido. El volumen del segundo espacio de alojamiento no está particularmente limitado y puede ser lo suficientemente grande como para observar respuestas durante mucho tiempo después de la introducción del segundo fluido. El volumen del segundo espacio de alojamiento es preferentemente de 100 pl a 2000 pl. Si el volumen del segundo espacio de alojamiento es inferior a 100 pl, el tamaño reducido del pocillo no es adecuado para observar. Mientras tanto, si el volumen del segundo espacio de alojamiento supera los 2000 pl, se requieren grandes cantidades de una muestra y reactivos, lo que resulta en una reducción de la eficiencia.
[0134] [Características de las estructuras de conexión de isla]
[0136] La tercera parte 140 de entrada y la estructura 142 de isla se colocan en el segundo espacio 120 de alojamiento a través de la estructura 143 de conexión de isla. El segundo fluido se introduce preferentemente en un espacio entre la estructura 143 de conexión de isla y la pared interna del segundo espacio 120 de alojamiento. Para este fin, la estructura 143 de conexión de isla se extiende hacia adentro desde la superficie de pared del segundo espacio 120 de alojamiento. La tercera parte 140 de entrada y la estructura 142 de isla pueden estar ubicadas en la parte central de la estructura 143 de conexión de isla. La estructura de isla debe colocarse a una distancia por debajo de un nivel predeterminado del segundo espacio de alojamiento. Por lo tanto, la estructura 143 de conexión de isla se extiende preferentemente desde la superficie de pared interna del segundo espacio 120 de alojamiento hacia el centro del extremo inferior del segundo espacio 120 de alojamiento.
[0138] La tercera parte 140 de entrada y la estructura 142 de isla pueden alojarse en el segundo espacio 120 de alojamiento a través de una estructura 143 de conexión de isla. Como alternativa, la estructura 143 de conexión de isla puede proporcionarse en pluralidad. La tercera parte 140 de entrada y la estructura 142 de isla están preferentemente conectadas entre sí a través de dos o más estructuras 143 de conexión de isla, más preferentemente de dos a cuatro estructuras 143 de conexión de isla. Para facilitar la introducción del segundo fluido, se prefieren dos estructuras de conexión de isla que se extienden.
[0140] La estructura 143 de conexión de isla puede variar en forma. La FIG. 6 ilustra vistas en planta, en perspectiva y en sección transversal de varias formas de estructuras de isla y estructuras 143 de conexión de isla. Como se ilustra en la FIG. 6, la estructura de isla puede tener un canal abierto (2, 3, 4 o 5 en la fila superior de la FIG.
[0141] 6) o forma de cesta cerrada (1 en la fila superior de la FIG. 6). La capacidad de la estructura de isla para atrapar el antibiótico es más importante que la forma de la estructura de isla. La forma de canal abierto es más ventajosa para la difusión de antibióticos durante la introducción del segundo fluido que la forma de cesta cerrada. Sin embargo, se requiere un diseño optimizado para evitar que el antibiótico se filtre al espacio abierto desde el momento en que se introduce el antibiótico hasta que se seca.
[0143] La estructura 143 de conexión de isla conecta la estructura de isla con el segundo espacio de alojamiento. Puede usarse una estructura 143 de conexión de isla para fijar la estructura de isla. Se recomiendan dos o más estructuras 143 de conexión de isla simétricas o anchas para su liberación estable de un molde después del moldeo por inyección. Dos o más estructuras 143 de conexión de isla simétricas o roscadas individualmente son preferibles para evitar la interferencia con la dispensación del segundo fluido. En el caso donde se proporciona una pluralidad de estructuras 143 de conexión de isla, el número, la forma y el tamaño de las estructuras 143 de conexión de isla deben optimizarse para garantizar la liberación estable de un molde después del moldeo por inyección y asegurar un espacio para la dispensación suave del segundo fluido. Las estructuras 143 de conexión de isla roscada aseguran la mayor estabilidad durante la liberación debido a su gran área de contacto. Sin embargo, las estructuras 143 de conexión de isla roscada son difíciles de usar porque el segundo fluido se introduce solo en una dirección. Es preferible usar dos estructuras 143 de conexión de isla que tengan el mismo espesor que el diámetro de la estructura de isla y estén conectadas simétricamente al segundo espacio de alojamiento.
[0145] [Características de las terceras partes de entrada]
[0147] El antibiótico se carga a través de la tercera parte 140 de entrada. La tercera parte 140 de entrada puede estar conectada a la parte superior de la estructura de isla y alojada en el segundo espacio 120 de alojamiento. La tercera parte 140 de entrada está en comunicación con la estructura de isla subyacente donde puede alojarse el antibiótico cargado (véase la FIG. 5). Dado que la tercera parte 140 de entrada se usa simplemente para el suministro del antibiótico, la tercera parte 140 de entrada se diseña preferentemente en una forma cilíndrica, una forma cónica con un extremo superior abierto o una forma cónica para un flujo suave del antibiótico suministrado en la estructura de isla.
[0149] [Características de las estructuras de isla]
[0151] La estructura 142 de isla está fijada dentro del segundo espacio de alojamiento por la estructura 143 de conexión de isla. El antibiótico cargado a través de la tercera parte de entrada se aloja en la estructura 142 de isla o el antibiótico seco (en forma sólida) se une a la estructura 142 de isla. El antibiótico líquido cargado puede alojarse en la estructura 142 de isla. Alternativamente, el antibiótico líquido cargado puede escapar a través de una abertura inferior de la estructura de isla y puede alojarse en un espacio entre la estructura de isla y la parte inferior del segundo espacio 120 de alojamiento. Siempre que el antibiótico líquido no se escape de la estructura 142 de isla debido a la tensión superficial, el antibiótico cargado en la estructura 142 de isla puede colocarse lejos de la parte inferior del segundo espacio 120 de alojamiento. El antibiótico puede secarse y unirse a la estructura 142 de isla o entre la estructura 142 de isla con una parte inferior abierta y la superficie inferior del segundo espacio 120 de alojamiento. El antibiótico puede dispersarse o disolverse en el segundo fluido introducido. En el caso donde el antibiótico se carga en la estructura de isla con una parte inferior abierta y se coloca lejos de la parte inferior del segundo espacio de alojamiento, se aloja un volumen mayor del antibiótico y la trayectoria de difusión del antibiótico seco se acorta después de la introducción del segundo fluido, lo que es ventajoso para la difusión suave del antibiótico. La forma del antibiótico debe mantenerse por tensión superficial en el espacio entre la estructura de isla y el segundo espacio de alojamiento para confinar el antibiótico líquido cargado al espacio entre la estructura de isla y el segundo espacio de alojamiento y evitar que el antibiótico líquido cargado se extienda fuera de la estructura de isla. En este momento, la estructura de isla está preferentemente separada de 0,1 a 1 mm del segundo espacio de alojamiento para mantener la tensión superficial del antibiótico. Si la distancia es inferior a 0,1 mm, se reduce el espacio requerido para la difusión y, como resultado, se tarda mucho tiempo en probar la susceptibilidad al antibiótico. Mientras tanto, si la distancia supera 1 mm, la forma del antibiótico no puede mantenerse debido a la tensión superficial, causando fugas del antibiótico fuera de la estructura de isla.
[0153] [Características del antibiótico en las estructuras de isla]
[0155] La tercera parte 140 de entrada puede incluir el antibiótico en forma sólida. En este caso, el antibiótico puede estar en un estado seco (véase (b) de la FIG. 5). El antibiótico seco puede disolverse en un disolvente seleccionado de agua, medios de cultivo celular, dimetilformamida (DMF) y dimetilsulfóxido (DMSO). El disolvente puede introducirse a través de pipeteo de modo que el antibiótico en forma sólida se disuelva completamente y la solución resultante tenga una concentración uniforme ((d) de la FIG. 5). Cualquier proceso de secado que no deteriore la eficacia del antibiótico puede usarse sin limitación para secar el antibiótico. El antibiótico se seca preferentemente a través de secado a temperatura ambiente, secado por calor, liofilización o secado al vacío, lo más preferentemente secado por calor. El antibiótico así secado se introduce en la tercera parte de entrada. Alternativamente, la solución de antibiótico puede introducirse en la tercera parte de entrada y secarse a través del proceso de secado mencionado anteriormente.
[0157] Puede introducirse directamente un fluido que contiene antibiótico en la tercera parte 140 de entrada. En este caso, el fluido que contiene antibiótico puede ser una solución del antibiótico en un disolvente. El disolvente puede ser el mismo que el segundo fluido. Alternativamente, el antibiótico puede disolverse en un disolvente diferente del segundo fluido para facilitar el almacenamiento y la manipulación. En este caso, el disolvente se selecciona preferentemente de disolventes que se mezclan o difunden fácilmente con el segundo fluido. Es preferible que el antibiótico tenga una tensión superficial constante de modo que se seque mientras mantiene su forma en el espacio entre la estructura de isla y el segundo espacio de alojamiento. Aquí, la distancia entre la estructura de isla y el segundo espacio de alojamiento se determina según el agua cuya viscosidad es similar a la de la mayoría de los antibióticos.
[0159] [Características de las válvulas capilares]
[0161] La superficie interna del segundo espacio de alojamiento está conectada a la superficie interna del primer espacio de alojamiento a través de la válvula 152 capilar. La válvula 152 capilar evita que el primer fluido entre en el segundo espacio 120 de alojamiento durante o después del flujo hacia el primer espacio 120 de alojamiento. El espesor y el ángulo de la válvula 152 capilar pueden determinarse de modo que se controle el flujo del primer fluido. El primer fluido que entra en la primera parte de alojamiento que tiene un ancho pequeño tiene una alta tensión superficial debido a su interfaz con el aire. La interfaz del primer fluido en el primer espacio de alojamiento forma un ángulo de contacto y una tensión superficial en una dirección que soporta la dirección de flujo. Por el contrario, la interfaz del primer fluido forma un ángulo de contacto y una tensión superficial en una dirección que resiste su entrada en el segundo espacio de alojamiento debido al ángulo de borde variable en el límite entre el segundo espacio de alojamiento y el primer espacio de alojamiento. La válvula capilar puede usarse para liberar aire del canal y eliminar una diferencia de presión entre la primera parte de entrada y el primer espacio de alojamiento cuando el primer fluido se suministra al primer espacio de alojamiento, permitiendo el llenado uniforme del primer espacio 150 de alojamiento con el primer fluido. Para una fácil difusión masiva del segundo fluido, el espesor y el ancho de la válvula capilar se determinan preferentemente de modo que no se perturbe la vía de difusión. El espesor y el ancho de la válvula capilar son típicamente de 100 a 500 gm y de 100 gm a 2 mm, respectivamente. Sin embargo, el ancho de la válvula capilar puede seleccionarse libremente cuando el espesor de la válvula capilar es el mismo que el del primer espacio de alojamiento. Dentro de los intervalos de espesor y ancho definidos anteriormente, el aire puede liberarse fácilmente del primer espacio 150 de alojamiento y el segundo fluido puede difundirse fácilmente sin fugas del primer fluido. Si el espesor y el ancho de la válvula capilar son menores que los intervalos respectivos, el aire no se libera fácilmente y no se logra una fácil difusión masiva del segundo fluido. Mientras tanto, si el espesor y el ancho de la válvula capilar exceden los intervalos respectivos, el primer fluido se fuga al segundo espacio de alojamiento, lo que aumenta la cantidad requerida de una muestra o dificulta la detección precisa de los resultados de la prueba.
[0163] [Características relacionadas con la fabricación de chips]
[0165] Un chip de plástico desechable convencional (o una placa de múltiples pocillos) se fabrica típicamente a través de moldeo por inyección e incluye pocillos diseñados para tener una forma donde el extremo superior es más ancho que el extremo inferior. Debido a esta forma cónica hacia abajo, el chip es fácil de retirar de un molde después del moldeo por inyección y sufre daños mínimos durante la extracción del molde. Sin embargo, en el caso donde el producto ahusado hacia abajo incluye estructuras de isla alojadas en segundas partes de alojamiento y primeros espacios de alojamiento cuyo diámetro es mayor que el de los segundos espacios de alojamiento en la parte inferior de este, como en la presente descripción, se requiere un molde que tenga una forma rebajada debido a las características del producto. Debido a la forma del molde, el producto no puede moldearse por inyección de una sola vez. Por el contrario, el dispositivo de prueba de cultivo celular puede fabricarse usando un molde que consiste en una parte de molde superior y una parte de molde inferior. Cuando la parte de molde superior está diseñada para tener una forma ahusada hacia abajo, la parte de molde inferior está diseñada para tener una forma ahusada hacia arriba, y las estructuras 142 de isla y las estructuras 143 de conexión de isla están ubicadas entre la parte de molde superior y la parte de molde inferior, una placa de múltiples pocillos que tiene una forma compleja puede fabricarse por moldeo, como en la presente descripción (véase la FIG. 7). Por consiguiente, el dispositivo de prueba de cultivo celular puede fabricarse a través de moldeo por inyección de una resina polimérica. Para observar ópticamente, el dispositivo de prueba de cultivo celular puede estar hecho de una resina polimérica ópticamente transparente tal como poliestireno, polietileno, polipropileno, polimetacrilato o policarbonato.
[0167] [Características de los medios de unión y el material de unión]
[0169] Dado que los extremos inferiores del primer espacio 150 de alojamiento y el segundo espacio 120 de alojamiento están expuestos al exterior, el primer fluido y el segundo fluido no pueden alojarse en el primer espacio 150 de alojamiento y el segundo espacio 120 de alojamiento. Por lo tanto, el medio 160 de unión está unido a la superficie trasera del dispositivo de prueba de cultivo celular para evitar la fuga del primer fluido y el segundo fluido y alojar el primer fluido y el segundo fluido en el primer espacio 150 de alojamiento y el segundo espacio 120 de alojamiento. Aquí, los medios 160 de unión pueden diseñarse en forma de una película delgada que tiene el mismo tamaño que la superficie trasera del dispositivo de prueba de cultivo celular. Un medio de unión puede estar unido a las superficies posteriores de las unidades de pocillos. Alternativamente, pueden unirse por separado diferentes medios de unión a las superficies posteriores de las unidades de pocillos. En este caso, cada uno de los medios 160 de unión puede adaptarse al tamaño de la unidad de pocillos correspondiente. Es preferible usar una película ópticamente transparente como medio de unión porque el objetivo presente en el primer fluido se observa a través de la superficie inferior del primer espacio de alojamiento. El medio de unión puede ser una película ópticamente transparente tal como una película de polietileno, cloruro de polivinilo o poliestireno. El material de unión se imprime preferentemente solo en el dispositivo de cultivo celular o los medios de unión, excepto las áreas donde se colocan las superficies inferiores del primer y el segundo espacio de alojamiento, para mantener la transparencia óptica de los medios de unión y evitar los efectos causados por el contacto con el primer fluido y el segundo fluido (véase la FIG. 8). Además, el material de unión no debe deformarse después de la impresión y antes y después de la unión de los medios de unión a las unidades de pocillos. Se recomienda un adhesivo no reactivo como material de unión para evitar efectos sobre el agente biológico. Se prefiere un adhesivo sensible a la presión (Pressure Sensitive Adhesive, PSA) usado principalmente en cintas adhesivas como material de unión. Pueden usarse adhesivos sensibles a la presión reforzados con un adhesivo a base de éster a base de caucho natural, caucho sintético, caucho de silicona o acrilato para el material de unión. Se prefiere un material que tenga una alta transmitancia para evitar una reducción en la cantidad de luz tras la observación óptica.
[0171] El dispositivo de prueba rápida de cultivo celular de la presente descripción puede diseñarse para poder abrirse y cerrarse a través de una estructura de sujeción o puede estar provisto de una película de cubierta hecha de silicona, tereftalato de polietileno (PET), polietileno ( PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), policarbonato (PC), teflón o cloruro de polivinilo (PVC). Puede formarse un corte cruciforme o en forma de X en una posición de la película de cubierta correspondiente a la primera parte de entrada subyacente. El corte puede servir como una parte de entrada a través de la cual se introduce fácilmente una pequeña cantidad del primer fluido. Los cortes cruciformes o en forma de X también pueden formarse en las posiciones de la película de cubierta correspondientes a la segunda parte de entrada subyacente y la tercera parte de entrada. Los cortes pueden servir como partes de entrada a través de las cuales los fluidos se introducen fácilmente. En términos de conveniencia de uso, es preferible que las partes de entrada a través de las cuales se introducen los fluidos correspondientes tengan diferentes formas.
[0173] Pueden proporcionarse marcas de enfoque en la parte inferior de los segundos espacios de alojamiento para proporcionar información sobre las posiciones del objetivo. Las marcas de enfoque pueden marcarse en las superficies inferiores de los primeros subpocillos de modo que las áreas objetivo del dispositivo de prueba de cultivo celular puedan rastrearse automáticamente. Las marcas de enfoque se proporcionan en forma de microcanales a través de moldeo por inyección. Dado que el agente biológico está inmovilizado en las películas delgadas sólidas, el uso de las marcas de enfoque permite obtener imágenes de las mismas áreas cada vez que se toman fotografías. Las marcas de enfoque sirven para corregir las posiciones del objetivo en las tres direcciones axiales, es decir, las direcciones de los ejes x, y y z, en el seguimiento automático de las áreas objetivo.
[0175] La presente descripción se describirá en detalle con referencia al siguiente procedimiento de prueba como se define en la reivindicación 13. La FIG. 3 ilustra una prueba de susceptibilidad a antibióticos usando un primer fluido y un segundo fluido introducidos en una unidad de pocillos y la FIG. 4 ilustra un primer espacio de alojamiento al que se suministra un primer fluido.
[0177] Según un aspecto adicional de la presente descripción, se proporciona un procedimiento de análisis celular que usa un dispositivo de prueba de cultivo celular que tiene una estructura de matriz de una pluralidad de unidades de pocillos alineados, cada una de las cuales incluye una primera parte de entrada a través de la cual se introduce una solución de mezcla de un medio líquido que contiene un agente gelificante y un agente biológico como primer fluido, una segunda parte de entrada a través de la cual un disolvente seleccionado de agua, medios de cultivo celular, dimetilformamida (DMF) y dimetilsulfóxido (DMSO) como se introduce un segundo fluido, un primer espacio de alojamiento donde se aloja el primer fluido, un segundo espacio de alojamiento donde se aloja el segundo fluido, una estructura de isla alojada en el segundo espacio de alojamiento y una tercera parte de entrada a través de la cual se carga un antibiótico en la estructura de isla, el procedimiento incluye (a) cargar el antibiótico en la tercera parte de entrada formada por encima de la estructura de isla para fijar el antibiótico a las superficies interna y externa de la estructura de isla, (b) introducir el primer fluido en la primera parte de entrada, permitiendo que el primer fluido introducido fluya hacia el primer espacio de alojamiento, y gelificando la solución de mezcla para formar una película delgada sólida, (c) introducir el segundo fluido en la segunda parte de entrada, permitiendo que el segundo fluido se aloje en el segundo espacio de alojamiento y entre en contacto con la estructura de isla para dispersar o disolver el antibiótico, y permitiendo que el segundo fluido entre en contacto con la película delgada sólida del primer fluido en una parte de conexión entre el primer espacio de alojamiento y el segundo espacio de alojamiento para difundir el antibiótico en la película delgada sólida, y (d) observar cambios del agente biológico sobre una base de una sola célula en la interfaz entre la película delgada sólida del primer fluido y el segundo fluido y en la película delgada sólida del primer fluido.
[0179] Un medio líquido que contiene un agente gelificante se mezcla con un agente biológico para preparar una solución de mezcla como primer fluido. El primer fluido se prepara en un volumen mayor que el del primer espacio de alojamiento y se introduce en la primera parte de entrada. El primer fluido introducido en la primera parte 132 de entrada fluye hacia el primer espacio de alojamiento con un ángulo de contacto dinámico apropiado bajo la influencia de la gravedad y la tensión superficial (acción capilar). En general, un flujo en un espacio de flujo cerrado por paredes se contrarresta por una presión inducida por el aire atrapado en el espacio. Por el contrario, dado que el primer espacio de alojamiento es un canal microfluídico abierto conectado al segundo espacio de alojamiento, el aire no queda atrapado en el primer espacio de alojamiento y fluye libremente sin una diferencia de presión en el primer espacio de alojamiento. Por otro lado, un flujo radial del primer fluido llega a la válvula capilar conectada al segundo espacio de alojamiento. En este momento, el ángulo de la pared de la válvula capilar se cambia rápidamente de modo que se impide que la interfaz del primer fluido avance siempre que no forme un ángulo de contacto dinámico apropiado con la pared después del cambio de ángulo. A partir de entonces, el primer fluido se gelifica y se fija solo en el primer espacio de alojamiento sin entrar en el segundo espacio de alojamiento. Como resultado de la gelificación, el agente biológico (por ejemplo, una cepa bacteriana) se inmoviliza en la matriz de gel y el primer fluido forma una película delgada sólida que entra en contacto con un segundo fluido, que se describirá más adelante.
[0181] A continuación, se introduce un segundo fluido en el segundo espacio 120 de alojamiento a través de la segunda parte 134 de entrada para el suministro de antibióticos.
[0183] Más específicamente, el segundo fluido se introduce directamente en la parte inferior del segundo espacio 120 de alojamiento a través de un espacio vacío rodeado por la pared exterior de la estructura de isla, la estructura 143 de conexión de isla y la pared interior del segundo espacio de alojamiento. El segundo fluido se introduce en una cantidad suficiente para sumergir la estructura de isla, de modo que un antibiótico pueda disolverse y difundirse en el segundo fluido. Cuando el antibiótico disuelto se carga directamente a través de la tercera parte 130 de entrada, el antibiótico y el disolvente pueden difundirse mientras se mezclan con el segundo fluido. Alternativamente, el antibiótico puede secarse y unirse a la estructura de isla. En este caso, el antibiótico se disuelve y se difunde en el segundo fluido. Dado que la estructura de isla unida a antibiótico está ubicada en la parte central del primer espacio de alojamiento, el antibiótico se extiende uniformemente en el primer espacio de alojamiento y, como resultado, el gradiente de concentración de antibiótico puede minimizarse (véase la FIG. 5).
[0184] El segundo fluido suministrado al segundo espacio de alojamiento alcanza la válvula 152 capilar ubicada en la superficie lateral inferior del segundo espacio de alojamiento y entra en contacto con el primer fluido. Dado que el primer fluido es igual o similar al segundo fluido, el antibiótico se difunde en la matriz de gel y pueden observarse cambios en el crecimiento de bacterias inmovilizadas en la matriz de gel con un microscopio para determinar la susceptibilidad de las bacterias al antibiótico.
[0186] A continuación, se observan respuestas del agente biológico al antibiótico. El agente biológico inmovilizado en la película delgada sólida se distribuye bidimensionalmente, con el resultado de que el agente biológico puede observarse en una sola célula. Según el procedimiento de análisis celular de la presente descripción, los cambios en el crecimiento de las células individuales pueden observarse típicamente en varias decenas de minutos (normalmente 30 minutos). Por consiguiente, el procedimiento de análisis celular de la presente descripción permite la determinación de la influencia del antibiótico en el agente biológico de una manera más precisa y rápida que los procedimientos convencionales. Por ejemplo, la bioactividad del antibiótico para las células bacterianas puede analizarse en 3-4 horas. Este procedimiento de prueba de bioactividad rápida se denomina en la presente análisis morfológico unicelular (Single-Cell Morphological Analysis, SCMA). El uso del dispositivo de prueba de cultivo celular permite observar los cambios en la morfología de una sola célula a través de imágenes de lapso en diferentes condiciones de antibióticos.
[0188] Puede usarse un sistema de medición óptica para observar. El sistema de medición óptica puede incluir un sistema de formación de imágenes, tal como una cámara CCD o CMOS. El sistema de medición óptica puede incluir unidades ópticas o dispositivos necesarios para el enfoque y la formación de imágenes de luz, tales como una lente, un iluminador y una guía de luz. El sistema de medición óptica puede incluir un sistema de procesamiento de imágenes para procesar y analizar los datos de imagen observados por la cámara. El sistema de medición óptica registra y analiza rápidamente los cambios en el crecimiento del agente biológico observados durante las pruebas para obtener los resultados de las pruebas. Se forma una imagen del área alrededor de la interfaz entre la película delgada sólida del primer fluido y el segundo fluido. El área de formación de imágenes puede tener un tamaño de aproximadamente 300 gm x 300 gm a 4000 gm x 4000 gm. Es preferible que el área de sección transversal del primer subpocillo sea al menos de mayor ancho que el área de formación de imágenes.
[0190] En consecuencia, el uso del procedimiento de prueba basado en la inmovilización del agente biológico y la difusión del antibiótico puede reducir en gran medida la cantidad del fármaco y las células necesarias para la prueba del fármaco y permite un rápido seguimiento de los cambios en el crecimiento de células individuales para obtener resultados de prueba en el fármaco tan rápidamente como 2 horas (normalmente dentro de 3-4 horas), en comparación con la técnica anterior. Esta es la velocidad de prueba más rápida conocida hasta ahora.
[0192] En una realización, el procedimiento puede incluir además (d) observar cambios del agente biológico que responde al antibiótico en una sola célula para determinar la concentración inhibitoria mínima (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) o la concentración mínima de erradicación de biopelícula (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) del antibiótico.
[0194] Las biopelículas se encuentran en áreas infectadas con microbios o a las que se unen microbios. Las biopelículas se refieren a películas que constituyen complejos microbianos mucilaginosos, que están formados por microbios rodeados por matrices poliméricas. La formación de biopelículas puede afectar en gran medida a la salud humana. Las biopelículas causan infecciones pulmonares, otitis media, periodontitis y otras enfermedades infecciosas. La resistencia de las bacterias presentes en las biopelículas a los antibióticos es al menos 1000 veces mayor que la de las bacterias en suspensión. Se han usado sistemas de células de flujo y sistemas basados en pocillos para investigar biopelículas. Sin embargo, estos sistemas de prueba requieren un largo tiempo de varios días para la formación de biopelículas. Otras dificultades asociadas con el uso de los sistemas de prueba son que las biopelículas deben teñirse y deben usarse microscopios confocales para observar. Se necesitan más experimentos para la medición de la concentración inhibitoria mínima (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) o la concentración mínima de erradicación de biopelícula (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC). Dichos sistemas son de tamaño muy grande y no muestran claramente las etapas de formación de biopelículas ni representan la formación de biopelículas in vivo.
[0196] Por lo tanto, existe una necesidad de sistemas eficientes que sean adecuados para investigar la formación de biopelículas y la reactividad de biopelículas con antibióticos. En consideración de esta necesidad, el dispositivo de prueba de cultivo celular de la presente descripción demuestra ser una excelente alternativa a los dispositivos de prueba convencionales.
[0197] Se describirán en detalle realizaciones preferidas de la invención de la presente descripción con referencia a los dibujos adjuntos de modo que los expertos en la técnica puedan practicar fácilmente la descripción. En la descripción de la presente descripción, se omiten las explicaciones detalladas de una función o construcción conocida relacionada cuando se considera que pueden oscurecer innecesariamente la esencia de la descripción. Ciertas características mostradas en los dibujos se amplían, reducen o simplifican para facilitar la ilustración y los dibujos y los elementos de estos no están necesariamente en la proporción adecuada. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán fácilmente dichos detalles.
[0198] Ejemplo 1
[0199] Se moldeó por inyección una resina termoplástica (poliestireno) en el dispositivo de prueba de cultivo celular ilustrado en las FIGS. 1 y 2, que tenían una matriz de 8 x 12 unidades de pocillos alineadas.
[0200] Se cargó colistina como antibiótico en la estructura de isla a través de la tercera parte de entrada de cada una de las unidades de pocillos. El antibiótico se cargó en una cantidad de 10 pl, se secó y se fijó en la forma ilustrada en (b) de la FIG. 5.
[0201] A continuación, se dispensaron 10 pl de una mezcla de agarosa y una solución bacteriana (P. aeruginosa ATCC 27853) como primer fluido en el primer espacio de alojamiento a través de la primera parte de entrada. Después de que se completó la introducción del primer fluido en el primer espacio de alojamiento, se introdujeron 100 pl de un medio de cultivo como segundo fluido en el segundo espacio de alojamiento a través de la segunda parte de entrada.
[0202] El primer espacio de alojamiento fue diseñado para tener un espesor de 300 pm y un ancho de 1 mm. La estructura de válvula capilar que tiene el mismo espesor (300 pm) que la del primer espacio de alojamiento se formó en una parte de contacto entre el primer espacio de alojamiento y el segundo espacio de alojamiento. La estructura de isla estaba separada 300 pm de la parte inferior del segundo espacio de alojamiento y se diseñó de manera que su centro coincidiera con el centro del segundo espacio de alojamiento. Se usó una película de PMMA de 100 pm de espesor como medio de unión.
[0203] Ejemplo 2
[0204] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor del primer espacio de alojamiento se cambió a 500 pm y la altura de la estructura de isla desde la parte inferior del segundo espacio de alojamiento se cambió a 500 pm.
[0205] Ejemplo 3
[0206] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que se usó una película de PET como medio de unión. Ejemplo 4
[0207] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor del primer espacio de alojamiento se cambió a 500 pm, la altura de la estructura de isla desde la parte inferior del segundo espacio de alojamiento se cambió a 500 pm y se usó una película de PET como medio de unión.
[0208] Ejemplo 5
[0209] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor y el ancho de la estructura de la válvula capilar se cambiaron a 100 pm y 100 pm, respectivamente.
[0210] Ejemplo 6
[0211] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor del primer espacio de alojamiento se cambió a 500 pm, la altura de la estructura de isla desde la parte inferior del segundo espacio de alojamiento se cambió a 500 pm, y el espesor y el ancho de la estructura de válvula capilar se cambiaron a 100 pm y 100 pm, respectivamente.
[0212] Ejemplo 7
[0213] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que la parte inferior de la estructura de isla estaba cerrada. Ejemplo 8
[0214] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor del primer espacio de alojamiento se cambió a 500 pm, la altura de la estructura de isla desde la parte inferior del segundo espacio de alojamiento se cambió a 500 pm y la parte inferior de la estructura de isla se cerró.
[0215] Ejemplo 1 comparativo
[0216] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el ancho del primer espacio de alojamiento se cambió a 0,5 mm.
[0217] Ejemplo 2 comparativo
[0218] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor del primer espacio de alojamiento se cambió a 500 pm, la altura de la estructura de isla desde la parte inferior del segundo espacio de alojamiento se cambió a 500 pm y el ancho del primer espacio de alojamiento se cambió a 0,5 mm.
[0219] Ejemplo 3 comparativo
[0220] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el ancho del primer espacio de alojamiento se cambió a 0,1 mm.
[0221] Ejemplo 4 comparativo
[0222] Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que el espesor del primer espacio de alojamiento se cambió a 500 pm, la altura de la estructura de isla desde la parte inferior del segundo espacio de alojamiento se cambió a 500 pm y el ancho del primer espacio de alojamiento se cambió a 0,1 mm.
[0223] Ejemplo de prueba
[0224] En cada uno de los Ejemplos 1-8 y Ejemplos 1-4 comparativos, se fabricaron 10 dispositivos de prueba de cultivo celular que tienen la misma estructura. Se hizo una determinación en cuanto a si las películas delgadas sólidas del primer fluido eran defectuosas. Se evaluaron las susceptibilidades al antibiótico en cuatro puntos seleccionados de cada primer espacio de alojamiento. Los cuatro puntos (a, b, c y d) estaban en ángulo recto con la primera parte de entrada. 6 h después de la introducción del segundo fluido, se observó P. aeruginosa ATCC 27853 en cada punto para evaluar si la MIC estaba dentro del intervalo de control de calidad para la colistina aprobada por CLSI. Se observó visualmente la película delgada sólida en el primer espacio de alojamiento para determinar si la película delgada sólida era defectuosa.
[0225] La FIG. 9 muestra una imagen de gran aumento de la película delgada sólida después de 4 h sin usar el antibiótico colistina en el Ejemplo 1 y la FIG. 10 muestra los resultados observados después de 6 h a varias concentraciones de colistina: (a) 0, (b) 0,12, (c) 0,25, (d) 0,5, (e) 1 y (f) 2 mg/ml. Se observaron respuestas claras a las concentraciones. En particular, el efecto del antibiótico fue pronunciado a > 1 mg/ml.
[0226] [Tabla 1]
[0228]
[0230] Como puede observarse a partir de los resultados en la Tabla 1, ninguna o solo algunas de las películas delgadas sólidas en los dispositivos de prueba de los Ejemplos 1-8 eran defectuosas. Además, se lograron altas confiabilidades de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos en los pocillos sin defectos. Por el contrario, se observaron muchos defectos en los dispositivos de prueba de los Ejemplos 1 -4 comparativos donde el primer fluido no fluyó suavemente hacia los primeros espacios de alojamiento estrechados, no llenando completamente los primeros espacios de alojamiento, o se infiltró en los segundos espacios de alojamiento.
[0231] Los números de defectos en los dispositivos de prueba de los Ejemplos 2, 4, 6 y 8 donde los primeros espacios de alojamiento eran relativamente espesos fueron ligeramente mayores que los de los Ejemplos 1,3, 5 y 7. En muchos de los dispositivos de prueba, el primer fluido penetró en los segundos espacios de alojamiento. En los dispositivos de prueba de los Ejemplos 3 y 4, cada uno de los cuales usó una película de PET más hidrófila, el primer fluido fluyó suavemente hacia los primeros espacios de alojamiento, logrando bajas tasas de defectos.
[0232] En los dispositivos de prueba de los Ejemplos 5 y 6 donde se dispusieron válvulas capilares estrechas, el primer fluido fluyó fácilmente hacia los primeros espacios de alojamiento, logrando bajas tasas de defectos. Sin embargo, era difícil que el antibiótico difundido entrara en las películas delgadas sólidas. Como resultado, un número reducido de dispositivos de prueba superó el intervalo de QC.
[0233] Como se muestra en la FIG. 11, cuando se dispensó un fluido en los pocillos del Ejemplo 1 (el 1°, 2°, 5° y 6° desde la izquierda) y los pocillos del Ejemplo 2 (3°, 4°, 7° y 8° desde la izquierda), sus comportamientos variaron dependiendo de la altura de la estructura de isla.
[0234] Aunque los detalles de la presente descripción se han descrito en detalle, será obvio para un experto en la técnica que tales detalles son meramente realizaciones preferidas y no limitantes.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo de prueba de cultivo celular comprendiendo una pluralidad de unidades (110) de pocilios, cada una de las cuales comprende una primera parte (132) de entrada a través de la cual se introduce un primer fluido,
un primer espacio (150) de alojamiento que se comunica con la primera parte (132) de entrada para alojar un flujo del primer fluido introducido a través de la primera parte (132) de entrada,
una segunda parte (134) de entrada a través de la cual se introduce un segundo fluido,
un segundo espacio (120) de alojamiento donde se aloja el segundo fluido introducido,
en donde el segundo espacio (120) de alojamiento se conecta a la superficie interna del primer espacio (150) de alojamiento para formar una interfaz perpendicular a una superficie inferior entre el primer fluido y el segundo fluido,
y una tercera parte (140) de entrada a través de la cual se ha cargado un antibiótico, cuya tercera parte de entrada se ha formado arriba y se ha conectado con una estructura (142) de isla a través de una estructura (143) de conexión de isla que se extiende desde la superficie de pared interior del segundo espacio (120) de alojamiento, en donde el antibiótico cargado desde la tercera parte (140) de entrada se aloja de manera fija en las superficies interior y exterior de la estructura (142) de isla.
2. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 1, en donde el centro de la estructura (142) de isla coincide con el centro del primer espacio (150) de alojamiento y la estructura (142) de isla está separada una distancia del primer espacio (150) de alojamiento.
3. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 2, en donde el extremo inferior de la estructura (142) de isla está separado de 0,1 a 1 mm de la superficie inferior del segundo espacio (120) de alojamiento y la estructura (142) de isla tiene una superficie inferior abierta.
4. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 1, en donde el segundo fluido introducido está en contacto con las superficies interna y externa de la estructura (142) de isla, disuelve el antibiótico fijado a las superficies interna y externa de la estructura (142) de isla y difunde el antibiótico disuelto en el primer fluido.
5. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 1, en donde el espesor y el ancho del primer espacio (150) de alojamiento se determinan de tal manera que el primer espacio (150) de alojamiento se llene con el primer fluido introducido a través de la primera parte (132) de entrada por acción capilar.
6. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 5, en donde el primer espacio (150) de alojamiento tiene un ancho de 0,3 a 2 mm y un espesor de 100 a 500 pm.
7. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 1, en donde la superficie lateral del segundo espacio (120) de alojamiento está en comunicación con la superficie interna del primer espacio (150) de alojamiento de tal manera que el primer fluido y el segundo fluido se encuentran entre sí y se produce la transferencia de masa al primer fluido.
8. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 7, en donde el primer espacio (150) de alojamiento es una estructura microfluídica abierta cuya al menos una superficie está abierta y la superficie abierta del primer espacio (150) de alojamiento está conectada a la superficie lateral del segundo espacio (120) de alojamiento a través de una válvula (152) capilar.
9. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 8, en donde el espesor y el ancho de la estructura (152) de válvula capilar se determinan de manera que el primer fluido introducido no entre en el segundo espacio (120) de alojamiento durante o después del flujo al primer espacio (150) de alojamiento.
10. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 9, en donde la válvula (152) capilar tiene un espesor de 100 a 500 pm y un ancho de 100 pm a 2 mm.
11. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 1, comprendiendo además medios (160) de unión dispuestos en la superficie trasera del mismo para evitar fugas del primer fluido y el segundo fluido.
12. El dispositivo de prueba de cultivo celular según la reivindicación 11, en donde el medio (160) de unión es una película ópticamente transparente.
13. Un procedimiento de análisis celular que usa un dispositivo de prueba de cultivo celular que tiene una estructura de matriz de una pluralidad de unidades (110) de pocillos alineadas,
cada una de las cuales comprende una primera parte (132) de entrada a través de la cual se introduce una solución de mezcla de un medio líquido que contiene un agente gelificante y un agente biológico como primer fluido,
una segunda parte (134) de entrada a través de la cual se introduce un disolvente seleccionado de agua, medios de cultivo celular, dimetilformamida (DMF) y dimetilsulfóxido (DMSO) como segundo fluido, un primer espacio (150) de alojamiento que se comunica con la primera parte (132) de entrada donde se aloja el primer fluido introducido,
un segundo espacio (120) de alojamiento donde se aloja el segundo fluido introducido,
una estructura (142) de isla alojada en el segundo espacio (120) de alojamiento, y una tercera parte (140) de entrada a través de la cual se carga un antibiótico en la estructura (142) de isla y se ha formado encima de la estructura (142) de isla y se ha conectado con ella a través de una estructura (143) de conexión de isla que se extiende desde la superficie de pared interior del segundo espacio (120) de alojamiento, el procedimiento comprendiendo (a) cargar el antibiótico en la tercera parte (140) de entrada formada por encima de la estructura (142) de isla para fijar el antibiótico a las superficies interna y externa de la estructura (142) de isla, (b) introducir el primer fluido en la primera parte (132) de entrada, permitir que el primer fluido introducido fluya hacia el primer espacio (150) de alojamiento, y gelificar la solución de mezcla para formar una película delgada sólida, (c) introducir el segundo fluido en la segunda parte (134) de entrada, permitir que el segundo fluido se aloje en el segundo espacio (120) de alojamiento y entre en contacto con la estructura (142) de isla para dispersar o disolver el antibiótico, y permitir que el segundo fluido entre en contacto con la película delgada sólida del primer fluido en una parte de conexión entre el primer espacio (150) de alojamiento y el segundo espacio (120) de alojamiento para difundir el antibiótico en la película delgada sólida en su interfaz formada perpendicular a una superficie inferior entre el primer fluido y el segundo fluido, y (d) observar cambios del agente biológico sobre una base de una sola célula en la interfaz entre la película delgada sólida del primer fluido y el segundo fluido y en la película delgada sólida del primer fluido.
14. El procedimiento de análisis celular según la reivindicación 13, comprendiendo además (d) observar los cambios del agente biológico que responde al antibiótico sobre una base de una sola célula para determinar la concentración inhibitoria mínima (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) o la concentración mínima de erradicación de biopelícula (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) del antibiótico.
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