ES3048694T3 - Oligonucleotide-functionalized hydrophobic polymer nanoparticles - Google Patents
Oligonucleotide-functionalized hydrophobic polymer nanoparticlesInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a una nanopartícula polimérica hidrofóbica funcionalizada con oligonucleótidos y a su método de preparación. Dicha nanopartícula es polimérica cargada con colorante y está funcionalizada mediante: (a) oligonucleótidos específicos de la diana y/o (b) oligonucleótidos no específicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Nanoparticulas de polímero hidrófobo funcionalizadas con oligonucleótidos
[0005] La presente invención se refiere a nanopartículas poliméricas hidrófobas funcionalizadas con oligonucleótidos, su método de producción y su utilización como biosensor.
[0007] La naturaleza ubicua de los ácidos nucleicos los convierte en dianas universales en prácticamente cualquier tipo de investigación biológica. La detección de ácidos nucleicos, especialmente del ARN mensajero (ARNm) y del microARN (miARN) en los fluidos biológicos y en el interior de las células es actualmente la clave en el diagnóstico de enfermedades, tales como el cáncer, las infecciones virales, etc. Por lo tanto, el campo de la detección de ácidos nucleicos ha crecido exponencialmente en los últimos años. Los métodos más sensibles para la detección directa de ácidos nucleicos en soluciones que utilizan colorantes fluorescentes alcanzan límites de detección de alrededor de 5 nM. Incluso los ejemplos recientes más avanzados de sondas moleculares que utilizan nanoestructuras de ADN con mecanismo FRET permiten una LOD de 0,33 nM.1 Sin embargo, con frecuencia esto no es suficiente para detectar concentraciones ultrabajas de ácidos nucleicos en muestras biológicas. Por lo tanto, la detección de ARN y ADN requiere técnicas de multiplicación molecular, en particular la PCR.2 Sin embargo, la PCR es un proceso de múltiples pasos que requiere una mezcla compleja de reactivos costosos, equipos sofisticados y personal bien capacitado. Además, la naturaleza exponencial de la amplificación utilizada en la PCR la hace muy sensible a las contaminaciones y a las pequeñas variaciones en la preparación, que pueden producir resultados falsos positivos y falsos negativos. Los químicos desarrollaron una variedad de sondas fluorescentes que pueden acceder a concentraciones mucho más bajas de ARN, hasta unos pocos pM, pero todas utilizan la multiplicación molecular, basada en las enzimas3 o en reacciones en cadena de hibridación.4
[0009] En trabajos anteriores, se propusieron polímeros conjugados catiónicos5, que se utilizaron como antena captadora de luz que podía amplificar la emisión de moléculas fluorescentes. Como los polímeros conjugados catiónicos podrían unirse fuertemente a las secuencias hibridadas, los límites de detección de la secuencia específica pueden estar por debajo del intervalo de 10 pM. Sin embargo, la limitación de los polímeros conjugados catiónicos es que pueden interactuar de modo no especial mediante fuerzas iónicas con otros ácidos nucleicos y proteínas y su funcionamiento depende en gran medida de la fuerza iónica.6
[0011] Aparecieron nuevas posibilidades con el desarrollo de sondas de nanopartículas.7 Por lo tanto, se desarrollaron nanosensores basados en puntos cuánticos, donde la sensibilidad de detección mejoró (~ 100 veces) en comparación con los sistemas moleculares, al confinar múltiples (~ 50) dianas de ácidos nucleicos alrededor de la partícula que servía como donante de transferencia de energía por resonancia (FRET, por sus siglas en inglés) de Forster.8 Mirkin y col. propusieron utilizar nanopartículas de oro como inactivadores en el enfoque de las nanoflares.9 Muy recientemente, Tinnefeld y col. fueron pioneros en la amplificación plasmónica en la detección de ácidos nucleicos utilizando las NP de oro como nanoantena.10 Este enfoque requiere la colocación precisa de un fluoróforo con respecto a las NP de oro, lo que se logra utilizando un sofisticado enfoque de origami de ADN. La amplificación lograda fue de 7,3 en promedio, aunque se observaron valores más altos para algunas NP.
[0013] Las NP poliméricas cargadas de colorante, que están expandiendo rápidamente la clase de NP orgánicas11, también pueden servir como nanoantena que puede amplificar la emisión de colorante a través del mecanismo FRET. Recientemente, se ha publicado un principio de captación de luz, donde >10.000 colorantes dentro de las NP de poli(ácido metacrilato-co-metacrílico de metilo) (PMMA-MA, por sus siglas en inglés) transfieren de modo eficaz la energía a unos pocos aceptores dentro de las NP. Esto último conduce a una amplificación de la señal (efecto antena) > 1000 veces, lo que de hecho supera los mejores valores de amplificación basados en plasmónica12. Para convertir esta gigantesca nanoantena captadora de luz en una nanosonda de ADN, las NP compuestas por el polímero hidrófobo PMMA-MA deben modificarse con ácidos nucleicos. Sin embargo, la unión covalente de moléculas hidrófilas, tales como un oligonucleótido, a polímeros hidrófobos es aún un desafío debido a la diferente solubilidad de ambos componentes. Por lo tanto, es difícil (si no imposible) hacer una reacción entre estas dos macromoléculas, cuando una de ellas no es soluble. La modificación de la superficie de las nanopartículas permite realizar la reacción en un regulador y crear un material híbrido que consiste en nanopartículas de oligonucleótidos y polímeros. Sin embargo, en este caso, aún existe el desafío que es generar pequeñas nanopartículas poliméricas hidrófobas que expongan los grupos reactivos.
[0015] El grupo Chad Mirkin ha desarrollado recientemente nanopartículas poliméricas de ~65 nm que contienen ácidos nucleicos utilizando el polímero13 especialmente diseñado. En este caso, las NP están formadas por un copolímero que contiene un bloque hidrófobo y un bloque hidrófilo, en donde el bloque hidrófilo contiene múltiples copias de un grupo carboxilo unido a la cadena principal del copolímero mediante una cadena de PEG. Los nucleótidos se acoplan con las NP formando un enlace peptídico con el grupo carboxilo en la superficie de las NP. En otro ejemplo existente relacionado con las NP del polímero PLGA, también se acopla una gran cadena de PEG al polímero con el grupo carboxilo terminal14. Nuevamente, en este caso, el ADN se acopla a la partícula a través de un enlace peptídico a través de un enlazador PEG y el tamaño de partícula era relativamente grande (>100 nm).
[0016] Sin embargo, la presencia de la cadena de PEG en las NP aumenta las distancias entre la nanopartícula y los ácidos nucleicos, lo que puede no ser compatible con un sistema FRET, ya que este requiere una distancia <5 nm entre el donante de energía y el aceptor de energía. En caso de que los grupos PEG sean cortos o estén ausentes, se sabe que es necesario conservar los grupos cargados (p. ej., carboxilo) en la superficie de las NP para evitar la agregación de las nanopartículas.
[0018] El método descrito por el grupo de Chad Mirkin requiere la modificación del monómero para poder introducir en un polímero mediante polimerización un gran número de grupos carboxilo, lo que asegura que queden suficientes grupos carboxilo libres en la superficie de la nanopartícula aunque la conjugación con oligonucleótidos también se realiza en los grupos carboxilo del polímero. Este método no funcionaría en el caso de los polímeros más comunes, tal como el poli(ácido metacrilato-co-metacrílico de metilo) (PMMA-MA), el poli(láctido y coglicólido) (PLGA) y la policaprolactona (PCL), porque cada cadena polimérica de estos polímeros usualmente contiene solo ~ 1 % de monómeros con grupo carboxilo. El bajo contenido de grupos carboxilo en los polímeros hidrófobos clásicos disminuye en gran medida la reactividad de estos polímeros con el ADN/ARN y hace que sea prácticamente imposible funcionalizarlos con oligonucleótidos. Además, el método anterior requiere el denominado “ proceso de envejecimiento por sal” que utiliza una alta concentración de sal (NaCl 300 mM), lo que también puede ser perjudicial para la estabilidad de las nanopartículas, especialmente aquellas que contienen pocos grupos cargados y/o PEG por cadena polimérica. También se observa que, la preparación de NP poliméricas mediante nanoprecipitación requiere grupos cargados, tales como grupos carboxilo, en el polímero, que también aseguran la estabilidad de las nanopartículas15. Sin embargo, la funcionalización de estos polímeros a través de grupos carboxilato con otros grupos reactivos (p. ej., azida para las reacciones de “ clic” de cicloadición) conduciría a polímeros sin grupos cargados, lo que hace imposible la preparación de pequeñas nanopartículas mediante nanoprecipitación15.
[0020] Teniendo en cuenta las deficiencias de los métodos analizados anteriormente para acoplar un ácido nucleico con una nanopartícula polimérica hidrófoba, aún es necesario proporcionar nuevas nanopartículas poliméricas hidrófobas funcionalizadas con oligonucleótidos que, por un lado, tengan un tamaño óptimo para una emisión de fluorescencia FRET eficaz y, por otro lado, que sean estables en solución acuosa y desarrollen un método más fácil y eficaz para acoplar ácidos nucleicos con nanopartículas poliméricas hidrófobas clásicas comercializados.
[0022] Los inventores de la presente invención resuelven el problema mediante un enfoque para injertar un compuesto enlazador que porta un grupo con carga negativa y un grupo reactivo a un polímero hidrófobo. Se requiere que los grupos funcionales estén presentes en la superficie de las nanopartículas para la unión covalente de las moléculas hidrófilas. Contra todo pronóstico, es sorprendente observar que dicho compuesto enlazador no solo se introduce en los grupos con carga negativa de polímeros que favorecerán la formación de pequeñas nanopartículas, sino que también expone los grupos reactivos en la superficie de las nanopartículas para su posterior funcionalización con ácidos nucleicos.
[0024] De hecho, los inventores han desarrollado un compuesto enlazador muy simple que porta al mismo tiempo un grupo amino primario o secundario, un grupo negativo, tal como un grupo carboxilo, y un grupo azida. Por medio de su grupo amino primario, tal compuesto enlazador reacciona con grupos carboxilo transportados por un polímero hidrófobo clásico, tales como poliacrilatos (p. ej., PMMA-MA), poliésteres (p. ej., PLGA o<p>C<l>) y derivados de poliestireno, para introducir en dicho polímero un motivo de fórmula (I), (a continuación) que porta un grupo de carga negativa y un grupo azida:
[0027]
[0030] Fórmula (I)
[0032] en donde:
[0034] - A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH2)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0036] - D representa un grupo elegido entre:
[0037]
[0039] en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (C1-C8),
[0040] - un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
[0041] - E representa
[0044]
[0046] donde Ra es H o un alquilo (C1-C8),
[0047] - X, Y, Z son idénticos o diferentes y cada uno representa independientemente del otro un espaciador elegido entre -(CH2)r-, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NHV, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, en donde r, s, t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0048] - n representa un número entero elegido de 1 a 10, en particular de 1 a 3,
[0049] cuando D representa
[0052]
[0054] E puede estar ausente.
[0055] Sorprende observar que, con la ayuda de un grupo negativo, tal como un grupo carboxilo, presente en dicho motivo, los grupos azida son arrastrados perfectamente fuera de la superficie de las nanopartículas durante la nanoprecipitación, lo que les permite hace posible reaccionar además con ácidos nucleicos que portan una unidad de acetileno.
[0056] Se observa que en el caso de un polímero de control que porta un grupo azida sin un grupo negativo, tal como un grupo carboxilo, se formaron grandes agregados (figura 3). Por el contrario, los polímeros que portan el motivo de la fórmula (I) pueden producir nanopartículas con el tamaño de 30-50 nm. Sorprendentemente, con el aumento del número de grupos carboxilo en la superficie, el tamaño de las nanopartículas disminuye.
[0057] Por lo tanto, uno de los aspectos de la presente invención se refiere a una nanopartícula polimérica basada en un polímero hidrófobo modificado que contiene un motivo de fórmula (I).
[0058] Dicha nanopartícula comprende:
[0059] - un polímero hidrófobo, portando dichas cadenas al menos un motivo de fórmula (I),
[0062]
[0064] en donde:
[0065] - A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH2)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un
número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0066] - D representa un grupo elegido entre:
[0069]
[0071] en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (CrCs),
[0072] - un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
[0073] - E representa (-Y-NRa), donde Ra es H o un alquilo (C1-Cs),
[0074] - X, Y, Z son idénticos o diferentes y cada uno representa independientemente del otro un espaciador elegido entre -(CH2)r-, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NHV, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, en donde r, s y t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0075] - n representa un número entero elegido de 1 a 10, en particular de 1 a 3,
[0076] cuando D representa
[0079]
[0081] E puede estar ausente,
[0082] estando dicho motivo de fórmula (I) unido a un grupo carboxilo del polímero y situándose sobre la superficie de la nanopartícula y
[0083] opcionalmente, dicha nanopartícula polimérica comprende colorantes luminiscentes.
[0084] Dentro del alcance de la presente invención, dichos colorantes luminiscentes pueden ser colorantes fluorescentes o colorantes fosforescentes. Dicho colorante luminiscente puede ser un colorante donante de energía.
[0085] En una realización particular, los colorantes luminiscentes se encapsulan en las nanopartículas de la invención. Una realización particular se refiere a una nanopartícula polimérica cargada de colorante basándose en un polímero hidrófobo modificado que contiene un motivo de la fórmula (I).
[0086] Dicha nanopartícula comprende:
[0087] - un polímero hidrófobo, portando dichas cadenas al menos un motivo de la fórmula (I),
[0090]
[0092] en donde:
[0093] - A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH2)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un
número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0094] - D representa un grupo elegido entre:
[0097]
[0099] en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (Ci-Cs),
[0100] - un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
[0101] - E representa
[0104]
[0106] donde Ra es H o un alquilo (C1-Cs),
[0107] - X, Y, Z son idénticos o diferentes y cada uno representa independientemente del otro un espaciador elegido entre -(CH2V, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NHV, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, en donde r, s, t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0108] - n representa un número entero elegido de 1 a 10, en particular de 1 a 3,
[0109] cuando D representa
[0112]
[0114] E puede estar ausente;
[0115] estando dicho motivo de fórmula (I) unido a un grupo carboxilo del polímero y situándose sobre la superficie de la nanopartícula y
[0116] - donantes de energía formados por una sal de al menos un colorante donante y un anión fluorado voluminoso, estando dichos donantes de energía encapsulados en el polímero hidrófobo.
[0117] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ alquilo (C1-C8)” se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los ejemplos de “ alquilo (C1-C8)” pueden ser, aunque no de forma limitativa, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo.
[0118] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ halógeno” se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
[0119] El término “ cicloalquilo (C3-C7)” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anillo cíclico saturado a base de carbono compuesto de 3 a 7 átomos de carbono. Los ejemplos de estos cicloalquilos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo. Dicho cicloalquilo (C3-C7) puede comprender un sustituyente.
[0120] La expresión “ grupo heterocíclico no aromático monocíclico” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo saturado monocíclico cuyo anillo está formado por 3 a 10 átomos, en donde al menos un átomo además de los átomos de carbono se elige entre N, S, O. Dicho grupo heterocíclico no aromático monocíclico puede comprender un sustituyente.
[0121] Los ejemplos de grupos heterocíclicos no aromáticos monocíclicos que pueden contemplarse son pirrolidina, piperidina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, tiolano.
[0122] El término “ grupo aromático monocíclico” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo aromático que consiste solo en un anillo plano conjugado. Dicho grupo aromático monocíclico puede ser heterocíclico. Dicho grupo aromático monocíclico puede comprender un sustituyente.
[0123] Los ejemplos de grupos aromáticos monocíclicos que probablemente se utilicen en la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa, fenilo, tolilo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirrolilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, furilo.
[0124] El término “ D representa
[0127]
[0129] como se utiliza en la presente memoria hace referencia a:
[0130] - siendo D un átomo de nitrógeno al que A, Z, y E están unidos directamente, o
[0131] - siendo D un grupo ciclo, tal como un cicloalquilo (C3-C7), un heterocíclico no aromático monocíclico o un grupo aromático monocíclico, que porta un átomo de nitrógeno como sustituyente, estando dicho átomo de nitrógeno unido a E, al menos uno de A o Z unido a dicho grupo ciclo. Como ejemplos están los siguientes grupos
[0134]
[0137] El término “ un colorante luminiscente” se refiere a un grupo de colorantes luminiscentes cuyas estructuras químicas son idénticas y tienen los mismos espectros de excitación y espectros de emisión. El término “ un colorante donante” se refiere a un grupo de colorantes donantes de energía cuyas estructuras químicas son idénticas y tienen los mismos espectros de excitación y espectros de emisión. El término “ un colorante donante” de ningún modo se refiere a una única molécula por nanopartícula.
[0138] Según una realización, las nanopartículas poliméricas hidrófobas cargadas de colorante de la presente invención encapsulan al menos dos colorantes donantes de energía.
[0139] A, X, Y, y Z son respectivamente un espaciador lineal, lo que facilitaría que los ácidos nucleicos que portan una unidad de acetileno se acerquen a los grupos azida.
[0140] En una realización particular, al menos un grupo carboxilo del polímero hidrófobo está unido con un motivo de fórmula (Ia):
[0143]
[0145] en donde A, X, Y, Z, n, R' se definen como antes.
[0146] En una realización más particular, al menos un grupo carboxilo del polímero hidrófobo está unido a un motivo de fórmula (Ib)
[0147]
[0149] en donde A, X, Y, Z, n se definen como antes.
[0150] En otra realización particular, al menos un grupo carboxilo del polímero hidrófobo está unido con un motivo de fórmula (Ic)
[0153]
[0155] En donde A, X, Z se definen como antes.
[0156] En una realización preferida, el espaciador A se elige entre: -NH-CO-, -CH2-CH2-, -CO-NH-, -CH2-O-CH2-, -CO-CH2-CH2-.
[0157] En otra realización preferida, los espaciadores X y Z están compuestos de 1 a 3 puentes de metileno y el espaciador Y está ausente.
[0158] En una realización aún más particular, al menos un grupo carboxilo del polímero hidrófobo está unido con un motivo de fórmula (Ib1)
[0161]
[0163] en donde x, y y z representan cada uno un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3.
[0164] Los ejemplos particulares del motivo de la fórmula (Ib1) que pueden citarse son:
[0165]
[0168] El polímero hidrófobo que probablemente se utilice en la presente invención se elige entre polimetacrilatos (p. ej., PMMA-MA), poliésteres alifáticos (p. ej., PLGA o PCL) y poliestireno y derivados de los mismos. Dicho polímero adecuado debe portar al menos un grupo carboxilo en su cadena.
[0170] El término “ polimetacrilato” , como se utiliza en la presente memoria, significa un polímero de sal o éster de ácido polimetacrílico, cuyo monómero puede representarse mediante la fórmula -[(ROCO)C(Me)CH2]-, en donde R es un hidrógeno, un grupo alquilo (Ci-C8), un grupo catiónico o aniónico. Los ejemplos de polimetacrilatos incluyen, aunque no de forma limitativa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo).
[0172] Según la invención, un derivado de polimetacrilato significa un polimetacrilato que porta una o más sustituciones en su cadena lateral. Dicha sustitución puede ser un grupo alifático, hidrógeno, grupo aromático, un grupo aniónico o catiónico. Ejemplos de derivados del polimetacrilato son el poli(ácido metacrilatoco-metacrílico de metilo) (PMMA-MA) y el poli(ácido metacrilato-co-2-metacrilamidoetanosulfónico de metilo) (PMMA-SO3).
[0174] El término “ poliestireno” , como se utiliza en la presente memoria, significa un polímero aromático sintetizado a partir del monómero que es estireno, o un derivado del estireno.
[0176] Según la invención, un derivado de poliestireno significa un poliestireno que porta una o más sustituciones en su cadena lateral. Tal sustitución puede ser un anión, tal como un sulfonato, fosfato, fosfonato, fosforilo y carboxilo, o un catión, tal como un amonio cuaternario o un amonio terciario. Los ejemplos de derivados del poliestireno pueden ser los sulfonatos de poliestireno, el fosfonato de poliestireno, y el carboxipoliestireno.
[0178] El término “ poliéster alifático” , como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo de polímeros alifáticos que contienen un grupo funcional éster en las unidades repetidas de la cadena principal. Los ejemplos de poliésteres alifáticos pueden citarse como, aunque no de forma limitativa, policaprolactona (PCL, por sus siglas en inglés), poli(ácido láctico) (PLA, por sus siglas en inglés), poli(ácido glicólico) (PGA, por sus siglas en inglés), poli(coglicólido de lactida) (PLGA, por sus siglas en inglés).
[0180] El primer criterio para elegir un polímero adecuado es que la matriz del polímero pueda garantizar una distribución adecuada de los colorantes con un alto brillo y una transferencia de energía de excitación (EET, por sus siglas en inglés) eficaz.
[0182] Por cierto, dicho polímero debería producir nanopartículas bastante pequeñas para asegurar un FRET eficaz, ya que la eficiencia del FRET está determinada por la distancia entre el (los) colorante(s) donante(s) de energía y el colorante aceptor de energía, cuanto mayor sea la distancia, menor será la eficiencia del FRET.
[0184] En tercer lugar, para controlar el número de grupos azida que se introducen en la superficie de la nanopartícula, y además para controlar el número de colorantes aceptores que se acoplan a la superficie de la nanopartícula, el polímero hidrófobo que probablemente se utilizará en la presente invención es un polímero que contiene aproximadamente del 0,1 al 10 por ciento molar, en particular 1-2 por ciento molar, de grupos carboxilo.
[0186] En una realización preferida, dicho polímero es poli(ácido metacrilato-co-metacrílico de metilo) y derivados del mismo.
[0187] Un ejemplo de derivados del PMMA es el poli(ácido metacrilato-co-metacrílico de metilo) (PMMA-MA, ácido metacrílico al 1,6 %, Mn ~15000, Mw ~34000).
[0189] Según una realización de la presente invención, el contenido del donante de energía en una nanopartícula mencionada anteriormente es de 5 a 700 mmol/kg, en particular de 50 a 300mmol/kg, más en particular de 170mmol/kg con respecto a la masa total de las nanopartículas.
[0191] Dichas nanopartículas poliméricas hidrófobas cargadas de colorante pueden obtenerse mediante nanoprecipitación a partir de un disolvente orgánico que contiene:
[0192] - un polímero hidrófobo, portando dichas cadenas al menos un motivo de fórmula (I), y
[0193] - al menos un colorante luminiscente, que puede ser en particular un colorante donante de energía y un anión fluorado voluminoso.
[0194] Dicha solución en disolvente orgánico puede ser una mezcla de un polímero hidrófobo que porta al menos un motivo de fórmula (I) y un polímero hidrófobo sin ningún motivo de fórmula (I).
[0195] Ejemplos de disolventes orgánicos que pueden utilizarse en la nanoprecipitación son acetonitrilo, tetrahidrofurano, dioxano, acetona, dimetilformamida, y dimetilsulfóxido.
[0196] Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos, siendo dicha nanopartícula una nanopartícula polimérica hidrófoba como se ha descrito anteriormente, en donde al menos una parte de los grupos azida se transforma en grupos triazol o un derivado de los mismos y se funcionalizan mediante:
[0197] (a) oligonucleótidos específicos de la diana, y/o
[0198] (b) oligonucleótidos no específicos.
[0199] Otra realización de la invención se refiere a una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos que comprende un colorante donante de energía, siendo dicha nanopartícula una nanopartícula polimérica hidrófoba como se ha descrito anteriormente, en donde al menos una parte de los grupos azida se transforma en grupos triazol o un derivado de los mismos y se funcionalizan mediante:
[0200] (a) oligonucleótidos específicos de la diana, y/o
[0201] (b) oligonucleótidos no específicos.
[0202] Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos que comprende al menos un colorante donante de energía y al menos un colorante aceptor de energía,
[0203] siendo dichas nanopartículas:
[0204] - una nanopartícula polimérica cargada de colorante descrita anteriormente, en donde al menos una parte de los grupos azida se transforman en grupos triazol o un derivado de los mismos y se funcionalizan mediante:
[0205] (a) oligonucleótidos específicos de la diana, y/o
[0206] (b) oligonucleótidos no específicos,
[0207] en donde el colorante aceptor de energía se conjuga con el oligonucleótido específico de la diana que forma una estructura de bucle en forma de horquilla o con un oligonucleótido competitivo con la diana separado que forma un complejo bicatenario con al menos una parte del oligonucleótido específico de la diana, y
[0208] en donde la relación molar entre los oligonucleótidos específicos de la diana y los oligonucleótidos no específicos es de 1:1 a 1:1000, en particular de 1:3 a 1:10, más particularmente 1:6.
[0209] En el sentido de la presente invención, el término “ nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos” , el término “ nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos” y el término “ nanosonda” son intercambiables.
[0210] El diámetro de las nanopartículas de la presente invención es variado de 10 nm a 300 nm, preferiblemente en el intervalo de 20 nm a 100 nm, más preferiblemente en el intervalo de 25 a 70 nm, aún más preferiblemente en el intervalo de 30 a 50 nm. El diámetro de la nanopartícula puede medirse según un método convencional mediante microscopía electrónica.
[0211] Las nanopartículas de la presente invención tienen un tamaño bastante pequeño en comparación con las nanopartículas descritas anteriormente por Chad Mirkin y Omid C. Grupos Farokhzad que contienen la cadena PEG como enlazador entre el grupo carboxilo y la cadena polimérica principal.
[0212] Ya se sabe que la distancia entre los colorantes donantes y los colorantes aceptores es extremadamente importante para la eficiencia de la transferencia de energía (que depende de la distancia a la potencia 10 de -6). El pequeño tamaño de las nanopartículas y de los enlazadores (entre el polímero y el oligonucleótido) de la presente invención
asegura que los colorantes es se localicen cerca de la superficie de las nanopartículas para permitir una transferencia de energía de resonancia Forester (FRET) eficaz entre los colorantes donantes y los colorantes aceptores.
[0214] En la nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos de la presente invención, la relación molar entre el aceptor de energía y el donante de energía es de 1:10 a 1:1000, en particular 1:100.
[0216] Dicha nanopartícula contiene respectivamente:
[0218] -de 5 a 700 mmol/kg, en particular de 50 a 300 mmol/kg, más en particular 170 mmol/kg de colorantes donantes con respecto a la masa total de las nanopartículas, y
[0220] -de 1 a 500, en particular de 1 a 100, más particularmente aproximadamente 20 colorantes aceptores en la superficie de las nanopartículas.
[0222] Debido al tamaño de partícula pequeño y a la presencia de un gran número de colorantes donantes dentro de una partícula, la nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos de la presente invención puede funcionar como nanoantena para amplificar la fluorescencia. El término “ nanoantena” se refiere en este caso a una nanopartícula que puede recolectar energía luminosa con un gran número de donantes de energía y transferir de modo eficaz esta energía a unos pocos aceptores de energía dentro de la nanopartícula y, por lo tanto, puede amplificar la emisión de fluorescencia del aceptor. La nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos de la presente invención puede amplificar >50 veces la fluorescencia que podría producirse directamente entre un colorante donante y un colorante aceptor, un valor que no se ha alcanzado hasta la fecha con ninguna sonda óptica para la detección de biomoléculas, siendo comparable o mejor que las sondas equivalentes basándose en la fluorescencia mejorada con plasmones.
[0223] Por “ oligonucleótido” se entiende un ADN o ARN monocatenario corto. Un oligonucleótido comprendido en nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención puede ser un oligonucleótido sintético, cuya secuencia puede diseñarse con la ayuda de un software de diseño de secuencias convencional. En el sentido de la presente invención, dicho oligonucleótido está constituido por 5 a 50 nucleótidos.
[0225] Los oligonucleótidos se acoplan a una nanopartícula polimérica cargada de colorante como se ha descrito anteriormente para dos propósitos: el primero es estabilizar además una nanopartícula polimérica hidrófoba en solución acuosa, el segundo es proporcionar una estructura de soporte para un colorante aceptor.
[0227] Por “ oligonucleótido no específico” “ se entiende un oligonucleótido cuya secuencia no es complementaria a la de una biomolécula diana de tipo ácido nucleico ni es reconocida por una biomolécula tal como una proteína o una toxina. La función esencial del oligonucleótido no específico es proporcionar una mayor estabilidad a las nanopartículas en solución. Se observa que las nanopartículas que contienen oligonucleótidos no específicos en la superficie pueden ser estables en solución a 4 °C durante al menos 2 meses después de la preparación.
[0229] Según una realización particular, los oligonucleótidos no específicos son oligonucleótidos no codificantes.
[0231] Según otra realización particular, los oligonucleótidos no específicos son poli(dA) o poli(dT) de 10 a 50 nucleótidos.
[0232] Por “ oligonucleótido específico de la diana” se entiende un oligonucleótido cuya secuencia es complementaria a la de una biomolécula diana de tipo ácido nucleico o es reconocida por una biomolécula, tal como una proteína o una toxina. El oligonucleótido específico de la diana confiere la especificidad diana a cada nanopartícula funcionalizada con el oligonucleótido, ya que es el oligonucleótido específico de la diana el que es reconocido por una biomolécula diana y forma con esta última un complejo estable. La secuencia nucleica de un oligonucleótido específico de la diana depende de la biomolécula diana que va a detectarse. Un oligonucleótido específico de la diana forma un oligonucleótido bicatenario con dicha biomolécula diana o forma un complejo aptámero/diana.
[0234] En el sentido de la presente invención, que un primer oligonucleótido sea complementario a un segundo oligonucleótido significa que un primer oligonucleótido tiene al menos 5 coincidencias de secuencia consecutivas con un segundo oligonucleótido y tiene menos de 3 desajustes de secuencia.
[0236] Según una realización particular, el oligonucleótido específico de la diana está constituido por 10 a 40 nucleótidos. Según una realización, un oligonucleótido específico de la diana puede unirse a un colorante aceptor. Este último puede estar situado en un extremo del oligonucleótido que es opuesto al extremo por el que está unido al polímero.
[0237] En este caso, la secuencia nucleica de dicho oligonucleótido específico de la diana está diseñada para formar una estructura de bucle en forma de horquilla para acercar el colorante aceptor a la superficie de la nanopartícula.
[0239] La secuencia específica de la diana puede estar situada en la parte de la secuencia de bucle de una estructura de bucles en horquilla.
[0240] La secuencia específica de la diana también puede estar situada en una parte de la secuencia madre. En este caso, dicho oligonucleótido específico de la diana contiene también una secuencia competitiva diana en otra parte de la secuencia madre. En otra palabra, el oligonucleótido competitivo con la diana y el oligonucleótido específico de la diana pueden ser dos partes situadas en el mismo oligonucleótido.
[0242] Según otra realización, un colorante aceptor se acopla a un oligonucleótido competitivo con la diana separado. Dicho oligonucleótido competitivo con la diana acerca el colorante aceptor a la superficie de la nanopartícula al alinear con el oligonucleótido específico de la diana.
[0244] Por “ oligonucleótido competitivo con la diana” se entiende un oligonucleótido cuya secuencia es complementaria a la del oligonucleótido específico de la diana contenido en la misma nanopartícula. Cuando la biomolécula diana es un ácido nucleico, la secuencia del oligonucleótido competitivo con la diana es idéntica a al menos una parte de la de la biomolécula.
[0246] Según una realización particular, para garantizar que el oligonucleótido específico de la diana forma un complejo más estable con la biomolécula diana que con el oligonucleótido competitivo con la diana, el oligonucleótido competitivo con la diana es más corto que el oligonucleótido específico de la diana y está constituido por 5 a 20 nucleótidos.
[0247] Gracias al alto brillo producido por un efecto de antena sin precedentes, las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención permiten disminuir el límite de detección de un ácido nucleico al menos hasta 5 pM, que es aproximadamente 1000 veces mayor que el logrado utilizando sondas moleculares. Este es uno de los límites más bajos de detección que ha alcanzado una sonda óptica de ADN sin explotar la multiplicación molecular. Esta alta sensibilidad hace que estas nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos sean útiles como un biosensor para detectar directamente una biomolécula presente en una muestra.
[0249] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a las nanopartículas poliméricas hidrófobas funcionalizadas con oligonucleótidos tal como se ha descrito anteriormente para su utilización como biosensor para una biomolécula diana.
[0251] En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un biosensor que comprende o consiste en una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos de la presente invención.
[0253] El biosensor de la presente invención indica la presencia de una biomolécula diana mediante la señalización de la fluorescencia FRET, es decir, una disminución o incluso la desaparición de la fluorescencia FRET. De hecho, cuando una biomolécula diana está en contacto con dicha nanopartícula que porta un oligonucleótido específico de la diana, este último se deshibrida con el oligonucleótido competitivo con la diana y forma un complejo más estable con la biomolécula diana. Por lo tanto, los oligonucleótidos competitivos con la diana separados que comprenden un colorante aceptor se liberan de la superficie de las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos y el colorante aceptor se aleja del colorante donante. Esta mayor distancia conduce a la disminución hasta la desaparición de la fluorescencia FRET. Se logra un efecto muy similar cuando el colorante aceptor se acopla al oligonucleótido específico de la diana que forma una estructura de bucle en forma de horquilla. En este caso, la hibridación con la diana abre la horquilla, aumentando de este modo la distancia entre el colorante aceptor y la partícula donante.
[0255] Según la presente invención, dichas biomoléculas diana pueden ser ADN monocatenario, ARN, ARNm, microARN, ARNsi, ARN satélite, oligonucleótidos sintéticos de tipo ADN o ARN, ADNc, productos amplificados por PCR, fragmentos de ADN genómico, una proteína o una toxina.
[0257] Dentro del significado de la presente invención, el término “ “ biomolécula diana” y el término “ biomolécula de interés” son intercambiables.
[0259] Cuando la biomolécula de interés es una biomolécula de tipo ácido nucleico, el complejo formado por dicha biomolécula y el oligonucleótido específico de la diana es un complejo bicatenario. En otra palabra, el oligonucleótido específico de la diana tiene una secuencia complementaria a al menos una parte de la de dicha biomolécula.
[0261] Cuando la biomolécula de interés es una proteína o una toxina, el complejo formado por dicha biomolécula y el oligonucleótido específico de la diana es un complejo aptámero-proteína/toxina. El oligonucleótido específico de la diana se pliega en un aptámero capaz de unirse de forma no covalente con alta afinidad y especificidad a una proteína diana o una toxina. La secuencia de dicho oligonucleótido puede determinarse mediante el conocimiento general de un experto en la técnica, por ejemplo mediante la técnica SELEX (evaluación sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial).
[0263] En una realización particular, la biomolécula diana es un ácido nucleico diana de >10 nucleótidos elegidos entre un microARN, un ARNm, un ARNsi, un ADNmc, o un ADNc.
[0265] La presente invención se refiere a otro aspecto que es proporcionar un método para detectarin vitrouna biomolécula de interés en una muestra.
[0266] Dicho método comprende el paso de:
[0267] - poner en contacto una muestra que contiene una biomolécula de interés con la nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos anteriormente mencionada,
[0268] - formar una composición en donde la biomolécula diana se une a la nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos,
[0269] - medir los cambios de fluorescencia producidos por los cambios en la transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET) entre los colorantes donantes de las nanopartículas y los colorantes aceptores.
[0270] La nanosonda puede detectar la biomolécula diana en solución o directamente en una muestra biológica (células en cultivo, tejidos biológicos). Para la detección, la nanosonda puede suspenderse en solución o inmovilizarse en las superficies de microplacas.
[0271] Dicha muestra puede ser una muestra obtenida de un fluido biológico, de un cultivo celularin vitroo de un tejido, de plantas, de microorganismos, una solución que contiene moléculas biológicas, una muestra medioambiental, una muestra de alimento, una muestra farmacéutica.
[0272] Por “ fluido biológico” se refiere a un líquido contenido, excretado o secretado por un animal o planta vivos, por ejemplo: sangre, diferentes fracciones de sangre, linfa, bilis, saliva, exudados. En una realización preferida de la presente invención, el fluido biológico es un fluido de origen humano o animal elegido entre suero, suero inactivado, plasma o sangre.
[0273] Por “tejido” se entiende un tejido humano, animal o vegetal. En una realización particular de la invención, la muestra de un tejido es una muestra obtenida por biopsia o durante una operación quirúrgica. En una realización más particular, el tejido es un tejido tumoral obtenido mediante biopsia o durante una operación quirúrgica de un paciente que padece un cáncer o se sospecha que está desarrollando un cáncer.
[0274] Muchas proteínas, anticuerpos, microARN y ARN si ya se sabe que son biomarcadores de afecciones patológicas. Debido a su límite de detección muy bajo, las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención son particularmente adecuadas para utilizarse como biosensores para estos biomarcadores en los métodos de diagnósticoin vitrode enfermedades.
[0275] Las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención también pueden utilizarse como biosensores para detectar la presencia de un compuesto tóxico o un microorganismo patógeno en una muestra ambiental, una muestra de alimento o una muestra farmacéutica.
[0276] Por “ muestra medioambiental” se entiende una muestra recolectada de un entorno, tal como tierra, barro o aguas residuales.
[0277] Según otro aspecto, la invención se refiere a nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente para su utilización como un agente de contraste, un agente de diagnóstico o como agente de obtención de imágenes médicas.
[0278] La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende nanopartículas polimérica hidrófobo funcionalizadas con oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente para utilizar como un agente de contraste, un agente de diagnóstico o un agente de obtención de imágenes médicas.
[0279] Dicha composición se puede usar como agente de diagnósticoin vivo.
[0280] Dichas nanopartículas pueden formularse en una composición farmacéutica, según los métodos de formulación de fármacos convencionales. Los vehículos farmacéuticos adecuados pueden estar comprendidos en dichas composiciones.
[0281] Por ejemplo, dicha composición farmacéutica puede ser una composición farmacéutica inyectable.
[0282] Uno de los aspectos de la presente invención es también proporcionar un método para conjugar un oligonucleótido con una nanopartícula polimérica hidrófoba, comprendiendo dicho método:
[0283] (i) hacer reaccionar un polímero hidrófobo que porta al menos un grupo carboxilo con un compuesto de fórmula (II),
[0284]
[0286] en donde
[0287] - A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH2)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
[0288] - D representa un grupo elegido entre:
[0291]
[0293] en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (CrCe),
[0294] - un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
[0295] - E representa
[0298]
[0300] donde Ra es H o un alquilo (Ci-Cs),
[0301] - X, Y, Z idénticos o diferentes y cada uno representa un espaciador elegido entre -(CH2V, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NH)r-, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, r, s y t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3;
[0302] - n representa un número entero elegido de 1 a 10, en - particular de 1 a 3,
[0303] cuando D representa
[0306]
[0308] E puede estar ausente,
[0309] para obtener un polímero modificado, portando dichas cadenas al menos un motivo de fórmula (I)
[0310]
[0312] en donde A, D, X, Z, E y n son como se han definido anteriormente,
[0313] (ii) precipitar el polímero modificado obtenido en el paso (i) a partir de un disolvente orgánico en una solución acuosa para producir las nanopartículas;
[0314] (iii) realizar una cicloadición entre las nanopartículas obtenidas en el paso anterior con:
[0315] (a) un oligonucleótido no específico que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo azida del motivo (I) mediante una cicloadición y/o
[0316] (b) un oligonucleótido específico de la diana que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo azida del motivo (I) mediante una cicloadición.
[0317] Gracias al desarrollo del compuesto de fórmula (II) como enlazador, el grupo azida como grupos funcionales y el grupo carboxilo se introducen al mismo tiempo directamente en los polímeros hidrófobos clásicos comercializados.
[0318] Al contrario del método descrito por el grupo Chad Mirkin, el paso (i) del método descrito anteriormente no necesita una alta concentración de sal.
[0319] El paso de precipitación puede realizarse mediante un método convencional para la precipitación de nanopartículas. El polímero modificado obtenido en el paso (i) puede coprecipitarse con colorantes luminiscentes, por ejemplo, una sal de al menos un colorante donante y un anión fluorado voluminoso, para encapsular los colorantes luminiscentes en las nanopartículas.
[0320] Los oligonucleótidos específicos de la diana y los oligonucleótidos no específicos se unen a una nanopartícula hidrófoba cargada de colorante obtenida en el paso (ii) mediante un grupo triazol o un derivado del mismo que se forma mediante una cicloadición entre:
[0321] - el grupo azida de una nanopartícula polimérica cargada de colorante obtenida en el paso (ii), y
[0322] - un grupo funcional capaz de reaccionar con azida mediante una cicloadición comprendido en un oligonucleótido específico de la diana y en un oligonucleótido no específico.
[0323] Dicho grupo funcional puede ser cualquier grupo funcional conocido en el estado de la técnica capaz de reaccionar con azida mediante una cicloadición.
[0324] En particular, dicho grupo funcional se elige entre:
[0325] - grupo cicloalquinilo (C7-C10)
[0326] - grupo alquinilo heterocíclico, y
[0327] - grupo alquinilo (C2-C10)
[0328] El término “ grupo cicloalquinilo (C7-C10)” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anillo cíclico a base de carbono insaturado compuesto de 7 a 10 átomos de carbono y que contiene al menos un triple enlace entre dos átomos de carbono. Los ejemplos del grupo cicloalquinilo (C-Cl0) son cicloheptinilo, ciclooctinilo, ciclononinilo, ciclodecinilo.
[0329] En particular, tal grupo cicloalquinilo puede ser un grupo ciclooctinilo o derivados del mismo, entre los que podemos citar la biarilazaciclooctinona (BARAC, por sus siglas en inglés), el dibenzociclooctinilo (DBCO, por sus siglas en
inglés), el ciclooctinilo monofluorado (MOFO, por sus siglas en inglés), el ciclooctinilo difluorado (DIFO, por sus siglas en inglés), el ALO (octinilo sin arilo), el dimetilo oxiazaciclooctinilo (DIMAC, por sus siglas en inglés) y difluorobenzociclooctinilo (DIFBO, por sus siglas en inglés).
[0330] El término “ grupo alquinilo heterocíclico” se refiere a un grupo monocíclico insaturado cuyo anillo está formado por 3 a 10 átomos y contiene al menos un triple enlace carbono-carbono, en donde al menos un átomo además de los átomos de carbono se elige entre N, S, O.
[0331] El término “ grupo alquinilo (C2-C10)” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo hidrocarbonado ramificado o no ramificado que tiene de 2 a 10 átomos de carbono que comprenden al menos un triple enlace entre dos átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo, propinilo, butinilo, octinilo, noninilo, decinilo, etc. Dicho grupo alquinilo puede comprender particularmente un triple enlace terminal.
[0332] Por “ cicloadición” se entiende cualquier tipo de cicloadición conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, cicloadición de Diels-Alder, cicloadición catalizada para embutición o sin embutición, etc.
[0333] Se prefiere que la cicloadición entre una sonda específica de la diana/sonda no específica y una nanopartícula hidrófoba cargada de colorante sea una cicloadición sin embutición, debido a su fiabilidad, biocompatibilidad y daño potencial mínimo para los oligonucleótidos y la nanopartícula.
[0334] Para la reacción eficaz entre un oligonucleótido y las nanopartículas cargadas de colorante, el disolvente orgánico puede evaporarse después de la nanoprecipitación de las nanopartículas y antes del paso (iii), lo que podría ser útil para lograr concentraciones micromolares de grupos funcionales.
[0335] En una realización particular, dicho compuesto es de fórmula (IIa)
[0338]
[0340] en donde A, X, Y, Z, Y, n, R' se definen como los de la fórmula (II).
[0341] En otra realización particular, dicho compuesto es de fórmula (IIb)
[0344]
[0346] en donde A, X, Y, Z, Y, n, se definen como los de la fórmula (II).
[0347] En otra realización particular, dicho compuesto es de fórmula (IIc)
[0348]
[0350] En donde A, X, Z se definen como la forma de la fórmula (II).
[0351] En una realización preferida, dicho compuesto enlazador está representado por la fórmula (IIb1):
[0354]
[0356] en donde x, y y z representan cada uno un número entero elegido de 0 a 5, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3.
[0357] En una realización más preferida, dicho compuesto puede ser por ejemplo uno de los siguientes compuestos.
[0360]
[0362] En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona un kit para producir un biosensor tal como se ha definido anteriormente. Dicho kit comprende:
[0363] - una nanopartícula polimérica cargada de colorante como se ha descrito anteriormente,
[0364] - un oligonucleótido no específico que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo azida mediante una cicloadición
[0365] Dicho kit proporciona a los usuarios finales una plataforma desde la que es fácil personalizar sus nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos según sus biomoléculas diana.
[0366] El usuario final solo necesita diseñar:
[0367] - un oligonucleótido específico de la diana de 10 a 40 nucleótidos que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con azida mediante una cicloadición, y
[0368] - un oligonucleótido competitivo con la diana de 5 a 20 nucleótidos que porta un colorante aceptor.
[0369] El usuario final también puede diseñar un oligonucleótido específico de la diana que porte:
[0370] - un grupo funcional capaz de reaccionar con la azida mediante una cicloadición en un extremo del oligonucleótido, y - un colorante aceptor en el otro extremo del oligonucleótido,
[0371] en donde el oligonucleótido específico de la diana puede formar una estructura de bucle en forma de horquilla. • Donante de energía
[0372] En las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención, el donante de energía está formado por una sal de un colorante donante y un anión fluorado voluminoso y está encapsulado en la matriz del polímero.
[0373] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ encapsulado” pretende incluir un donante de energía dentro de la matriz del polímero.
[0374] Por “ colorante donante” se entiende un material luminiscente que, en su estado excitado electrónico, puede transferir energía a un aceptor de energía.
[0375] El colorante donante se elige entre un derivado de rodamina o un derivado de cianina.
[0376] Según la presente invención, el colorante donante puede ser una rodamina de fórmula (A):
[0379]
[0381] En la fórmula anterior (A):
[0382] - Ri, R2, R3 y R4 son idénticos o diferentes y cada uno representa un hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C8), - R5 es un alquilo (C1-C24).
[0383] La expresión “ grupo alquilo (C1-C8)” , como se utiliza en la presente memoria, significa una cadena hidrocarbonada saturada recta o ramificada que contiene de 1 a 8 carbonos. Los ejemplos representativos de alquilo (C1-C8) incluyen, aunque no de forma limitativa, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, ferc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo.
[0384] La expresión “ grupo alquilo (C1-C24)” se refiere a una cadena de hidrocarburo saturada lineal o ramificada que contiene de 1 a 24 carbonos. Los ejemplos de grupos alquilo (C1-C24) pueden ser, aunque no de forma limitativa, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, n-undecilo, n-docenilo, ntridecilo, n-tetradecilo, n-pentadecilo, n-hexadecilo, n-heptadecilo, n-octadecilo, n-nonadecilo, n-icosilo, n-henicosilo, n-docosilo, n-tricosilo, n-tetracosilo.
[0385] Preferiblemente, la rodamina utilizada en la presente invención puede ser éster octadecilico de rodamina B de fórmula (A1) a continuación en la presente memoria.
[0386]
[0388] El colorante donante también puede ser un derivado de cianina de las fórmulas (B1) y (B2).
[0391]
[0393] en donde:
[0394] - n es un número entero elegido entre 0, 1,2 o 3;
[0395] - G es un carbono sustituido, preferiblemente -C(CH3)2 o un heteroátomo O, S, N.
[0396] - Ri' y R3' son idénticos o diferentes y representan cada uno un grupo alquilo (C1-C24).
[0397] - R2' y R4' son idénticos o diferentes y representan cada uno un hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C24).
[0398] Un compuesto de fórmula (B1), en donde n = 1, corresponde a un colorante Cy3. Un ejemplo de colorante Cy3 es 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (Dil).
[0399] Un compuesto de fórmula (B1), en donde n = 2, corresponde a un colorante Cy5. Un ejemplo de colorante Cy5 es 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina (DiD).
[0400] Un compuesto de fórmula (B1), en donde n = 3, corresponde a un colorante Cy7. Un ejemplo de colorante Cy7 es 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (DiR).
[0401] Un compuesto de fórmula (B2), en donde n = 1, corresponde a un colorante Cy3,5. Un ejemplo de colorante Cy3,5 es 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilbencindocarbocianina.
[0402] Un compuesto de fórmula (B2), en donde n = 2, corresponde a un colorante Cy5,5. 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilbenzindodicarbocianina es un ejemplo de Cy5,5.
[0404] Un compuesto de fórmula (B2), en donde n = 3, corresponde a un colorante Cy7,5. 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilbencindotricarbocianina es un ejemplo de Cy7,5.
[0406] El término “ aniones fluorados voluminosos” , como se utiliza en la presente memoria un anión orgánico grande que porta residuos fluorados aromáticos y/o alifáticos. Dichos aniones fluorados voluminosos funcionan no solo como contraiones en el donante de energía, sino también como un espaciador entre los colorantes donantes que, por un lado, evita su agregación y autoinactivación y, por otro lado, acerca mucho los colorantes donantes de energía para permitir una difusión ultrarrápida de la energía de excitación con una pérdida mínima.
[0408] Según una realización particular de la presente invención, el anión fluorado voluminoso se elige entre tetraquis(pentafluorofenil)borato (F5-TPB), tetrakis[3,5-bis-(trifluorometil)fenilo]borato (F6-TPB), tetrakis[3,5-bis-(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metoxi-2-propil)fenilo]borato (F12-TPB) y tetrakis[perfluoro-terc-butoxi]aluminato (F9-Al).
[0409] • Aceptor de energía
[0411] El aceptor de energía se acopla a una nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos de la presente invención mediante un oligonucleótido específico de la diana o mediante un oligonucleótido competitivo con la diana.
[0413] Por “ colorante aceptor” se entiende un material, que puede excitarse físicamente mediante la energía transferida desde un colorante donante. Los espectros de emisión de un colorante aceptor deben estar al menos 20 nm desplazados a la longitud de onda más larga.
[0415] El colorante aceptor transportado por una nanopartícula de la presente invención puede ser un fluoróforo orgánico, tal como colorantes a base de fluoresceína, rodamina o cianina (p. ej., Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Cy7, Cy7,5), o un inactivador oscuro no fluorescente o una combinación de los mismos.
[0417] Como colorante aceptor fluorescente pueden utilizarse derivados comerciales: Alexa Fluor® (absorción máxima: 433 -790 nm), p. ej., Alexa Fluor® 647; Atto® (absorción máxima: 425 - 740 nm), p. ej., Atto® 655; Abberior® (absorción máxima: 432 - 638 nm), p. ej., Abberior® STAR RED; Dy® (absorción máxima: 430 - 831 nm), p. ej., Dy® 654; Eterneon™ (absorción máxima: 480 - 680 nm), p. ej., Eterneon™ Red 645; Chromeo™ (absorción máxima: 488 -642 nm), p. ej., Chromeo™ 642; Oyster® (absorción máxima: 488 - 680 nm), p. ej., Oyster® 650.
[0419] Un “ inactivador oscuro no fluorescente” se refiere a un material que no emite fluorescencia en estado excitado. Los ejemplos de inactivadores oscuros no fluorescentes que pueden citarse son dabsil (ácido dimetilaminoazobenzosulfónico), dabcil (ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo)benzoico), Black Hole Quencher®-1, Black Hole Quencher®-2, Black Hole Quencher®-3, Atto®Q (p. ej., Atto® MB2), Dy®Q (p. ej., Dy®Q 660).
[0421] En una realización de la presente invención, cuando el colorante donante de energía es un derivado de cianina de fórmula (B1 y B2), el colorante aceptor de energía se selecciona según la siguiente regla. El espectro de absorción del aceptor debe superponerse con el espectro de emisión de los colorantes donantes. Como un ejemplo, el colorante donante puede ser el colorante ocdadecil-rodamina B con un contraión F5-TPB, mientras que el aceptor de energía es el colorante Cy5 (2-((1E,3E,5Z)-5-(1-(3-hidroxipropil)-3,3-dimetilindolin-2-iliden)penta-1,3-dien-1-il)-3,3-dimetil-1-(3-(fosfonooxina)propil)-3H-indol-1-ium).
[0423] A continuación se proporciona un ejemplo de un colorante aceptor unido a un oligonucleótido.
[0426]
[0427] La conjugación entre un colorante aceptor y un oligonucleótido también puede realizarse en cualquier posición adecuada, que incluye el anillo aromático del colorante aceptor.
[0428] • Detección de múltiples dianas
[0429] Según una realización, las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención comprenden más de un oligonucleótido específico de la diana, que son reconocidos por más de una biomolécula diana diferentes entre sí.
[0430] Por “ un oligonucleótido específico de la diana” se entiende un grupo de oligonucleótidos específicos de la diana que tienen la misma secuencia de ácidos nucleicos y que son reconocidos por una misma biomolécula diana.
[0431] Dichas nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos pueden utilizarse como un biosensor para detecciones de múltiples dianas.
[0432] Para indicar al mismo tiempo la presencia de más de una biomolécula diana, las nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención comprenden también más de un colorante aceptor, cuyo número es idéntico al número de oligonucleótidos específicos de la diana.
[0433] Por “ un colorante aceptor” se entiende un grupo de colorantes aceptores de energía cuyas estructuras químicas son idénticas y tienen los mismos espectros de excitación y espectros de emisión. El término “ un colorante aceptor” de ningún modo se refiere a una única molécula por cada nanopartícula.
[0434] Cuando una nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos comprende más de un colorante aceptor, el criterio para elegir los colorantes aceptores adecuados es que sus espectros de emisión no estén superpuestos.
[0435] Según una realización de nanopartícula funcionalizada con oligonucleótidos para su utilización en múltiples detecciones diana, dicha nanopartícula comprende un colorante donante y más de un colorante aceptor. El espectro de emisión de dicho colorante donante cubre los espectros de absorción de esos colorantes aceptores.
[0436] La presente invención se ilustra en mayor detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos.
[0437] Figuras
[0438] Figura 1: Concepto de nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos para la detección amplificada de ácidos nucleicos.
[0439] Figura 2: Esquema de síntesis de nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos de la presente invención. Incluye (i) conjugación de grupos carboxilo y grupos azida que portan polímeros; (ii) nanoprecipitación del polímero, (iii) unión del ADN a la superficie de las<n>P cargadas de colorante, hibridación con una sonda aceptora, detección diana.
[0440] Figura 3: Tamaño de las NP mediante dispersión de luz dinámica. Polímeros utilizados para la nanoprecipitación: PMMMA-MA modificado con 3-aminopropilazida (diseñado como control); PMMA-MA comercial; AspN3, Asp2N3 y Asp3N3: PMMA-MA que porta el motivo AspN3, Asp2N3 o Asp3N3 (diseñado como AspN3, Asp2N3, Asp3N3). Figuras 4a y 4b: La figura 4a muestra el diámetro hidrodinámico de las NP (mediante DLS) preparadas a concentraciones bajas y altas. La figura 4b muestra los espectros de absorción de las NP que muestran que el nuevo protocolo puede aumentar la colección de concentración de muestras.
[0441] Figura 5: Espectros de fluorescencia de NP en condiciones frías (línea representada por -), temperatura ambiente (línea representada por - -), o 40 °C (línea representada p o r.....) de conjugación con ácidos nucleicos. A Np-Asp-N3 se le añadieron 10 pM de SurC y después de 16 h de reacción se hibridó con 10 pM de la sonda aceptora Cy5-Flare. La purificación se realizó utilizando un regulador de fosfato 20 mM.
[0442] Las figuras 6a-6g muestran la caracterización de nanopartículas funcionalizadas con oligonucleótidos.
[0443] Figura 6a: Tamaño por DLS de las NP no modificadas (NP), las NP que solo portan grupos azida (NP-N3), las NP que portan el motivo Asp-N3 (NP-Asp-N3), las NP que portan Asp-N3 preparadas a alta concentración (NP-Asp-N3-Conc), las NP que portan el motivo Asp-N3 y el oligonucleótido específico de la diana (NP-SurC), las NP que portan el motivo Asp-N3, el oligonucleótido específico de la diana y el oligonucleótido no específico (NP-SurC-T20), este último después de 2 meses de almacenamiento (NP-SurC-T20, 2 meses).
[0444] Figura 6b: Absorción de las NP no modificadas (NP), de NP que portan el motivo Asp-N3, oligonucleótido específico de la diana y sonda aceptora Cy5-Flare (NP-SurC/Cy5), de las NP que portan el motivo Asp-N3, oligonucleótido específico de la diana, oligonucleótido no específico y sonda aceptora Cy5-Flare (NP-SurC-T20/Cy5).
[0445] Figura 6c: espectros de fluorescencia de las NP que portan el motivo Asp-N3, oligonucleótido específico de la diana y oligonucleótido no específico (NP-SurC-T20), y de las NP que portan el motivo Asp-N3, oligonucleótido específico de la diana, oligonucleótido no específico y sonda aceptora Cy5-Flare (NP-Succ-T20/Cy5).
[0446] Figuras 6d y 6e: Imágenes TEM de NP no modificadas y las correspondientes estadísticas de distribución de tamaños. Figuras 6f y 6g: Imágenes TEM de NP funcionalizadas con oligonucleótidos y estadísticas de distribución de tamaños correspondientes.
[0447] Figura 7: Espectros de emisión de fluorescencia de las NP funcionalizadas con oligonucleótidos inmediatamente después de la preparación y después de 2 meses de almacenamiento en la oscuridad a 4 °C. Los espectros se normalizan en la banda de longitud de onda corta.
[0448] Las figuras 8a-8d muestran la respuesta de las NP funcionalizadas con oligonucleótidos al diana.
[0449] Figura 8a: Espectros de fluorescencia de NP funcionalizadas con oligonucleótidos con concentración de Cy5-Flare de 20 |<j>M después de mantenerlas durante la noche a 4 °C sin diana (control) y con diana (100<j>M).
[0450] Figura 8b: Espectros de fluorescencia de las NP funcionalizadas con oligonucleótidos después de la incubación con diana a diferentes concentraciones: 0 (Control), 20, 50, 100 y 200 pM.
[0451] Figura 8c: Valores de la relación A/D de las NP funcionalizadas con oligonucleótidos después de la incubación con diana a diferentes concentraciones: 0 (Control), 20, 50, 100 y 200 pM.
[0452] Figura 8d: Relación A/D de la respuesta de la sonda (Cy5-Flare de 100<j>M) a la diana (500<j>M) en diferentes medios biológicos
[0453] Figuras 9a-9f: Obtención de imágenes de partículas únicas de NP funcionalizadas con oligonucleótidos inmovilizados. Figura 9a: Se muestran las NP funcionalizadas con oligonucleótidos en una superficie de BSA-biotina-neutravidinabiotina-A20. La hibridación con la superficie se produce debido a la formación de la doble hebra de A20-biotina y T20-NP.
[0454] Figura 9b: Distribución de intensidad total de una partícula única del donante en NP-T20.
[0455] Figura 9c: Suma del donante de FRET y el aceptor de FRET en NP (nanosondas) funcionalizadas con oligonucleótidos. Figura 9d: Imágenes de microscopía de campo silvestre de las nanosondas en los canales aceptor, donante y fusionado (ambos canales están representados en la misma escala de intensidad). La excitación fue a 550 nm con una potencia de excitación de 0,2 mW a nivel de muestra. El tiempo de integración fue de 200 ms.
[0456] Figura 9e: Excitación directa del aceptor (650 nm con potencia láser de 10 mW y tiempo de integración de 200 ms). Figura 9f: La amplificación de la señal (efecto antena) de las NP funcionalizadas con oligonucleótidos al nivel de una partícula única se presenta como un histograma de distribución. Se analizaron al menos 1500 NP.
[0457] Figuras 10: Respuesta a la diana a nivel de una partícula única. (a) Imágenes de microscopía de campo silvestre utilizando la configuración GEMINI de las NP funcionalizadas con oligonucleótidos (primera fila), después de la adición diana y 30 minutos de incubación a temperatura ambiente (segunda fila) y el NP-T20 de control (tercera fila). Todos los canales están representados en la misma escala de intensidad. La excitación fue a 550 nm (la potencia de excitación fue de 0,20 mW, el tiempo de integración fue de 200 ms). (b) Histogramas de distribución correspondientes de la FRET relativa para la nanosonda, la nanosonda con diana (1 nM) y el NP-T20 de control.
[0458] Ejemplos
[0459] 1. Materiales y métodos
[0460] Materiales
[0461] Compuestos químicos: Poli(ácido metacrilato-co-metacrílico de metilo) (PMMA-MA, ácido metacrílico al 1,6%, Mn ~15000, Mw ~34000), clorhidrato de 3-cloropropanamina (98%), perclorato de éster octadecilico de rodamina B (>98,0%), tetraquis (pentafluorofenil)borato de litio eterato de etilo, N,N-dimetilformamida (anhidro, 98%), N,N-diisopropiletilamina (>99%), acetonitrilo (anhidro, 99,8%), diclorometano (anhidro, >99,8%), 1-hidroxibenzotriazol (>97%), BSA-biotina y filtros centrífugos Amicon (0,5 ml, 100 K) se compraron de Sigma-Aldrich. El ácido cítrico monohidratado (> 99,5 %), la azida sódica (99 %), el yoduro sódico (> 99,5 %) y el ácido trifluoroacético (99 %) se
adquirieron en Alfa Aesar. Fmoc-Asp(OtBu)-OH se adquirió de Activotec. El HBTU se adquirió en ChemPep Inc. Las cámaras Neutravidin y LabTek (vidrio con cubierta de borosilicato, ocho pocillos) se adquirieron en Thermo Scientific. Las secuencias de<a>D<n>monocatenario liofilizadas se adquirieron de IBA, se disolvieron en agua Milli-Q, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20 °C para experimentos adicionales.
[0463] Se utilizaron fosfato de sodio monobásico (>99,0 %, Sigma-Aldrich) y fosfato de sodio dibásico dihidratado (>99,0 %, Sigma-Aldrich) para preparar reguladores de fosfato de 20 mM a pH 7,4. Para el regulador salino, se añadieron cloruro de sodio (>99 %, Sigma Aldrich) 30 mM y cloruro de magnesio (>98 %, Sigma Aldrich) 12 mM a 20 mM de regulador de fosfato y el pH se ajustó con una solución de hidróxido de sodio 1N. Se utilizó agua Milli-Q (Millipore) en todos los experimentos. Para el protocolo de inmovilización, el DPBS (sin Ca2+ y Mg2+) se adquirió en Lonza.
[0465] Síntesis del enlazador
[0467] Fmoc-Asp-Cl propanoato 3-[(3-cloropropil)carbamoil]-3-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino] de terc-butilo - Fmoc-Asp (OtBu)-OH (1 eq 6 mmol 2,47 g),<h>B<t>U (1,2 eq 7,2 mmol 2,73 g) y HOBt (1,3 eq 7,8 mmol 1,05 g) se disolvieron en 30 ml de N,N-dimetilformamida anhidro. Después de la disolución completa, se añadió la N,N-diisopropiletilamina (3 eq 18 mmol, 2,97 ml) a la mezcla en agitación bajo argón a temperatura ambiente y, en 15 minutos, se añadió clorhidrato de 3-cloropropanamina (1 eq 6 mmol, 0,78 g). La reacción se agitó durante 24 h y se comprobó la finalización de la reacción mediante TLC (DCM/MeOH 98/2). El disolvente se evaporó a presión reducida, el residuo se diluyó con agua y el precipitado se recolectó. El producto bruto se lavó con una solución de ácido cítrico, seguido de una solución de bicarbonato de sodio. Después de purificar el producto bruto mediante cromatografía en columna (DCM/MeOH 98/2), se obtuvo el producto como un sólido de color amarillo pálido (2,3 g, rendimiento del 80 %). 1H Mhz (400 MHz, CDCl3) 8 ppm 1,46 (s, 9H), 1,98 (quin, J= 6,30 Hz, 2H), 2,60 (dd,J= 16,75, 6,24 Hz, 1 H), 2,95 (br d,J= 15,16 Hz, 1H), 3,45 (m, 2H), 3,56 (br t,J= 6,24 Hz, 2 H), 4,23 (m, 1H), 4,36 -4,60 (m, 3H), 5,93 (br s, 1 H), 6,59 (br s, 1H), 7,27 - 7,36 (m, 2H), 7,42 (t,J= 7,50 Hz, 2H), 7,60 (d,J= 7,34 Hz, 2H), 7,78 (d,J= 7,58 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCla) 8, ppm: 28,00, 31,99, 37,09, 37,43, 42,23, 47,20, 51,19, 67,14, 81,95, 120,06, 120,08, 121,01, 124.98, 125,00, 127,09, 127,12, 127,81, 141,35, 141,38, 143.65, 143,70, 156,10, 170,71, 171,27. HR/LC/MS para C26H3-iClN2O5 m/z (M+) calc. 487,19, encontrado 487,19706.
[0469] Asp-N 3 - Fmoc-Asp-Cl (1 eq 3 mmol 1,5 g), azida sódica (5 eq 15,4 mmol 1 g) y yoduro sódico (1 eq 3 mmol 0,47 g) se disolvieron en N,N-dimetilformamida anhidra (20 ml) y se agitaron bajo Ar durante la noche a 60 °C. Después de que el disolvente se evaporó, el residuo se extrajo con agua/DCM y se lavó dos veces con salmuera. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (DCM/MeOH 94/6). Mediante LCMS y NMR se observó que Fmoc desprotegía el Asp-N3 como un aceite de color amarillo pálido (460 mg, 55 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 1,46 (s, 9 H), 1,65 (m, 2 H), 1,81 (quin, J=6,72 Hz, 2 H) 2,57 (dd, J=16,63, 8,07 Hz, 1 H) 2,8 -2,85 (m, 1 H) 3,29 - 3,44 (m, 4 H) 3,63 (dd, J=8,07, 3,67 Hz, 1 H), 7,57 (br s, 1 H). 13C NMR (101 MHz, CDCh) 8 ppm 28,08, 28,89, 36,65, 40,52, 49,20, 52,02, 81,15, 171,24, 173,71. HR/LC/MS para C11H21N5O3 m/z (M+) calc 272,17, encontrado 272,17153.
[0471] Polímero
[0473] PM-Asp-N3-Boc. El PMMA-MA (1 eq de grupos COOH, 0,06 mmol, 400 mg) se disolvió en N,N-dimetilformamida anhidra (5 ml). A esta solución se le añadieron HBTU (3 eq, 0,183 mmol, 70 mg), HOBt (4 eq, 0,24 mmol, 33 mg) y N,N-diisopropiletilamina (10 eq 0,61 mmol, 0,1 ml). La mezcla se agitó durante 15 minutos y después se añadió Asp-N3-Boc (3 eq 0,183 mmol, 50 mg). La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en un mínimo de acetonitrilo y se precipitó con metanol. El precipitado se lavó con metanol, se disolvió nuevamente en acetonitrilo y se volvió a precipitar dos veces en metanol. Después de secar al vacío, se obtuvo el producto en forma de un sólido blanco: 220 mg, rendimiento del 55 %. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 8, ppm: 0,85 (br s, 2 H), 1,02 (br s, 1 H), 1,18 - 1,29 (m, 1 H), 1,46 (br s, 1 H), 1,65 (br s, 1H), 1,74 - 2,11 (m, 2 H), 3,60 (br s, 3 H). (Grado de modificación del 82 % calculado a partir de la señal BOC en los espectros de NMR).
[0475] PM-Asp-N3 - PM-Asp-N3-Boc (200 mg) se disolvió en diclorometano anhidro (5 ml) y se añadió 2 ml de ácido trifluoroacético. La mezcla se agitó vigorosamente durante 3 horas. A continuación los disolventes se evaporaron a presión reducida. Al residuo se añadió acetonitrilo y la evaporación se repitió varias veces hasta la ausencia del ácido trifluoroacético. Después, el producto se precipitó en metanol y se filtró. Después de secar al vacío, se obtuvo el producto en forma de un sólido blanco: 160 mg, rendimiento del 80 %. 1H NMR (400 MHz, CDCh) 8 , ppm: 0,78 -1,11 (m, 2H), 0,94 -1.11 (m, 1H), 1,24 (br s, 1H), 1,45 (br s, 1H), 1,72 -2,15 (m, 2H), 3,61 (br s, 3H).
[0477] El éster octadecilo traquis(penta-fluorofenil)borato (R18/F5) de rodamina B se sintetizó mediante intercambio iónico y se purificó mediante cromatografía en columna como se ha descrito anteriormente. (Reisch, A. y col. Nat. Commun.
[0478] 5, 4089 (2014))
[0480] Preparación de nanopartículas. La solución madre de los polímeros en acetonitrilo se preparó a una concentración de 1 o 2 mg ml'1 que contenía R18/F5-TPB (30 % en peso con respecto al polímero). A continuación, se añadieron rápidamente 50 pL de las soluciones de polímero utilizando una micropipeta y bajo agitación (comodidad del
termomezclador, Eppendorf, 1100 rpm) a 450 mL del regulador de fosfato de 20 mM. La solución de partículas se diluyó después rápidamente 5 veces con el mismo regulador. Para la preparación de las NP funcionalizadas con ADN el protocolo fue ligeramente diferente (véase más adelante).
[0482] Síntesis de sonda NP. A continuación, 100<m>L de la solución de polímeros en acetonitrilo (2 mg ml-1 con un 30 % en peso de R18/F5-TPB con respecto al polímero) se añadieron rápidamente utilizando una micropipeta y bajo agitación (comodidad del termomezclador, Eppendorf, 1,100 rpm) a 900 mL del regulador de fosfato 20 mM, pH 7,4 a 21 °C. Después se evaporaron los residuos de acetonitrilo. Se añadieron alícuotas de ADN a 300<m>L de nanopartículas. La reacción se mezcló y se mantuvo durante la noche a 40 °C en un termomezclador sin agitación y protegido de la luz. Después la reacción se enfrió a temperatura ambiente. Para la hibridación con Flare-Cy5, se añadió la alícuota de Flare-Cy5 en una relación 1:1 con SurC y la mezcla se calentó a 70 °C en un baño de agua durante 3 minutos. Para completar la hibridación la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se mantuvo en la oscuridad durante 2 horas. Después, la mezcla se diluyó con un regulador de fosfato 20 mM que contenía MgCl2 de 12 mM y NaCl de 30 mM a 4 ml y se purificó mediante centrifugación utilizando filtros centrífugos (Amicon, 0,5 ml, 100 k) en 1000 g a 20 °C durante 2 min. El procedimiento de centrifugación se repitió 5 veces para eliminar los oligonucleótidos que no habían reaccionado. Las sondas NP obtenidas en un volumen de 1 ml se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C.
[0484] Caracterización de nanopartículas. Las mediciones para la determinación del tamaño de las nanopartículas se realizaron en un Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments S.A.) El valor medio del diámetro de la distribución de tamaños por volumen se utilizó para el análisis. Los espectros de absorción se registraron en un espectrofotómetro UV-visible de barrido Cary 4000 (Varian), los espectros de excitación y emisión se registraron en un espectrofluorómetro FluoroMax-4 (Horiba Jobin Yvon). Para el registro estándar de los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de excitación se estableció en 530 nm. Los espectros de fluorescencia se corrigieron para la respuesta del detector y las fluctuaciones de la lámpara. Para calcular la eficiencia de FRET basándose en los
[0485] espectros de fluorescencia, se utilizó una ecuación clásica:
, donde lD es la intensidad integral del donante e I<d>-<a>es la intensidad integral del donante en presencia del aceptor. El factor de amplificación de la emisión del aceptor (efecto antena, AE) se expresó como la relación entre la intensidad de excitación máxima del donante y la del aceptor con la corrección de la emisión de los colorantes del donante a 690 nm :14
[0488]
[0491] j
[0492] Donde<J>^
y son las intensidades de excitación máximas del donante y el aceptor en la sonda NP,
[0493] <respectivamente;><son las intensidades de excitación en las longitudes de onda de excitación máxima del>
[0494] donante y el aceptor en NP-SurC-T20;
son la intensidad máxima de emisión del donante para la sonda NP y NP-SurC-T20, respectivamente.
[0496] Los rendimientos cuánticos del donante en las NP se calcularon utilizando rodamina 101 en metanol como referencia (QY = 1,0) con una absorbancia de 0,01 a 530 nm. (Karstens, T. & Kobs, K. J.Phys. Chem. 84, 1871-1872 (1980)). Los QY de un aceptor se midieron utilizando DiD en metanol (QY = 0,33) como referencia. (Texier, I. y col. J. Biomd. Opt. 14, 054005 (2009)).
[0498] Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
[0500] Las rejillas de microscopía electrónica de cobre-rodio recubiertas de carbono con una malla 300 (Euromedex, Francia) se trataron en superficie con una descarga luminiscente en una atmósfera de amilamina (0,45 mbar, 4 - 4,5 mA, 22 s) en un sistema de descarga luminiscente Elmo (Cordouan Technologies, Francia). Después, se depositaron 5 pl de la solución de NP a 0,04 g/L en las rejillas y se dejaron durante 2 min. Después, las rejillas se trataron durante 1 minuto con una solución de acetato de uranilo al 2 % para teñirlas. Se observaron con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM120 equipado con un filamento LaB6 y que funcionaba a 100 kV. Las áreas cubiertas con nanopartículas de interés se registraron con diferentes aumentos en una cámara CCD refrigerada Peltier (modelo 794, Gatan, Pleasanton, CA). El análisis de imágenes se realizó utilizando el software Fiji.
[0502] Microscopía de fluorescencia.
[0504] La inmovilización de nanopartículas en la cámara LabTek se realizó según el Protocolo (Jurgen J Schmied y col., Nature Protocols, Vol.9, No. 6, 2014): La cámara LabTek se lavó 3 veces con DPBS y a continuación se incubó con 200 mI de BSA-biotina (0,5 mg ml-1 en DBPS) durante 5 min. A continuación se retiró la solución de biotina y BSA y la cámara se lavó 3 veces con 500<m>I de DPBS. Después, la cámara se incubó con 200<m>I de solución de neutravidina (0,5 mg ml-1 en DBPS) durante 5 minutos y se lavó 3 veces con 500 mI de DPBS. A continuación la cámara se incubó
con 200 pL de una solución de 1 pM de biotina A20 en DPBS durante 5 minutos y se lavó 3 veces con un regulador de fosfato de 20 mM que contenía MgCh de 12 mM y NaCl de 30 mM. Después la solución de la sonda NP se depositó con la concentración adecuada para lograr la densidad deseada y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Antes de las mediciones la cámara se lavó 2 veces con un regulador de fosfato de 20 mM que contenía MgCl2 de 12 mM y NaCl de 30 mM y se cubrió con 200 pl del mismo regulador.
[0506] Las mediciones de partículas únicas se realizaron en el modo de epifluorescencia utilizando un microscopio invertido Nikon Ti-E con un objetivo (Apo TIRF 100X, óleo, NA 1,49, Nikon). Se utilizaron diodos emisores de luz de 550 nm y 650 nm para excitar las muestras. La potencia luminosa de 550 nm se estableció en 0,2 mW. Para la excitación directa del aceptor Cy5, se utilizó la luz de 650 nm con una potencia de 10 mW. La señal de fluorescencia se registró con una cámara Hamamatsu Orca Flash 4. El tiempo de exposición se estableció en 200 ms por cuadro de imagen. Para permitir dos imágenes en color, se utilizó la óptica de división de imágenes W-VIEW GEMINI con el siguiente conjunto de filtros: 640 nm dicroicos (Semrock FF640-FDi01-25x36), para obtener imágenes de R18/F5-TPB y Cy5, respectivamente. El análisis de partículas únicas se realizó utilizando el software Fiji: las ubicaciones de las partículas se detectaron a través de una rutina de Fiji aplicada a una proyección (intensidad máxima) de 3 marcos. Después de la sustracción automática del fondo, se midieron las intensidades medias de las regiones circulares de interés con un diámetro de 8 píxeles alrededor de las ubicaciones de las partículas encontradas. Se analizaron al menos tres secuencias de imágenes (245 píxeles x 245 píxeles) por condición con, en promedio, 500-700 partículas por muestra.
[0507] El factor de amplificación de la emisión del aceptor a un nivel de partícula única se determinó utilizando:
[0510]
[0513] Donde
son intensidades medias de los aceptores bajo excitación a 550 y 650 nm, respectivamente, y P650 nm y P550 nm son potencias de láser correspondientes a la longitud de onda.
[0515] 2. Resultados experimentales
[0517] 2.1 Síntesis de NP y modificación del ADN
[0519] Las nanopartículas se obtuvieron mediante nanoprecipitación. En el caso de un polímero de control que porta un grupo azida sin grupo carboxilo, se formaron grandes agregados (figura 3). Por el contrario, los polímeros que portan el motivo AspN3 pueden producir las partículas con un tamaño de 32-36 nm. Sorprendentemente, con el aumento del número de grupos carboxilo en la superficie el tamaño de las NP estaba disminuyendo.
[0521] Para que la reacción entre el ADN y las NP cargadas de colorante sea eficaz, es necesario alcanzar concentraciones micromolares de los grupos funcionales de las NP. El aumento de la concentración de azida puede calcularse mediante el aumento del donante de colorante encapsulado en las NP, ya que el contenido del donante de colorante es de aproximadamente el 30%en peso del polímero. El protocolo común de nanoprecipitación usualmente incluye una dilución de 50 veces a partir de la solución madre inicial de polímero (1 g/L) con el colorante en CH3CN. Este procedimiento permite obtener NP de 30-40 nm con una concentración total de grupos azida reactivos de 0,6-1,3 pM. Para aumentar la concentración de grupos funcionales, se modifica el protocolo de nanoprecipitación. En primer lugar, la concentración del polímero en acetonitrilo se aumenta a (2 mg/ml), mientras se mantiene el contenido de colorante en un 30% en peso con respecto al polímero. A continuación, se añadieron 100 pl de esta solución madre de acetonitrilo al regulador de fosfato (900 pl), seguido de la evaporación del acetonitrilo de la mezcla. Los datos del DLS sugieren que el tamaño de las NP solo aumentó ligeramente para las NP obtenidas con el nuevo método y que la evaporación del acetonitrilo no influyó significativamente en el tamaño de las partículas. Además, según la espectroscopia de absorción, el nuevo protocolo permitió aumentar la concentración de NP cargadas de colorante alrededor de 9 veces (figura 4).
[0523] Para el acoplamiento del ADN a las NP, se realiza una reacción de clic sin embutición entre el ADN modificado con DBCO y las NP que contienen grupos azida en la superficie. Como secuencia de ADN, se utilizan 20 meros que codifican la survivina (SurC), que es un marcador importante del cáncer. La reacción de las NP concentradas y el Sur-C se realizó a 4, 20 y 40 °C durante 18 h. Para controlar la reacción, la mezcla de reacción se hibridó con Flare-Cy5 complementario, que es una cadena más corta (12NA) marcada con Cy5 (aceptor FRET). Las NP se cargaron con RhC18-F5 (donante FRET). El exceso de ADN se retiró al repetir (5 veces) la filtración a través de filtros de 100 kDa. La eficacia de la purificación se monitorizó mediante absorbancia. Los espectros de fluorescencia revelaron que a 4 y 20 °C no se produjo la reacción, mientras que a 40 °C se observó una señal FRET clara de la partícula al ADN hibridado, indicando una reacción de conjugación exitosa (figura 5). La evidencia del injerto también fue proporcionada mediante la espectroscopía de absorción: la absorción del destello aceptor se observó claramente en las muestras purificadas, a diferencia del control negativo, donde las NP sin grupo azida se mezclaron con el ADN Sur. Sin embargo, en el regulador PBS que contenía iones Mg 2+ de 12 mM (necesarios para la formación de dúplex estables), los
conjugados de NP-ADN mostraron un tamaño relativamente grande (figura 6a), probablemente debido a la agregación parcial de las NP obtenidas en condiciones de alto contenido de sal.
[0525] 2.2 Optimización del sensor y caracterización de las NP con ADN
[0527] Para lograr la amplificación óptica más alta a través de un mecanismo de captación de luz, es necesario garantizar una alta relación donante/aceptor en la nanosonda de la invención. Esto significa que la cantidad mínima de ADN/aceptor-flare debe injertarse en la superficie de la partícula, pero el número de aceptores injertados debe ser lo suficientemente grande como para garantizar una FRET eficaz. Por otro lado, un gran número de ácidos nucleicos debería mejorar la estabilidad coloidal de las NP en medios biológicos, lo que está soportado por un informe reciente sobre las NP construidas a partir de copolímeros de bloques de metátesis con apertura de anillos.13 Por lo tanto, para asegurar una pequeña cantidad controlada de ácidos nucleicos codificantes y la estabilidad de las partículas, se realizó la reacción de las NP con una mezcla de ADN codificante (SurC) y no codificante (T20). La adición de T20 (20<j>M) al SurC (3<j>M) no inhibió el injerto del SurC en la superficie de NP, como lo demuestra la espectroscopía de absorción (figura 6b). De hecho, en comparación con las NP que reaccionaron con SurC (3<j>M) sin T20, solo se observó una ligera disminución en la absorbancia del aceptor-flare. Los espectros de fluorescencia mostraron una fuerte emisión del aceptor FRET hibridado en SurC para ambos tipos de muestras (véase la figura 6 para las NP modificadas con SurC y T20), lo que confirmó el éxito del injerto de SurC en NP en ambos casos. Sorprendentemente, las partículas que contenían T20 permanecieron pequeñas en un regulador con alto contenido de sal (PBS) con iones Mg2+ y su tamaño no cambió incluso después de 2 meses de incubación en este medio (figura 6a). Además, el espectro de emisión de este conjugado de NP-ADN, que muestra las bandas donantes y aceptoras de FRET, permaneció prácticamente invariante durante este período de 2 meses (figura 7). Estos resultados sugieren que el exceso de ADN no codificante es esencial para proporcionar estabilidad a las NP del polímero. La microscopía electrónica también confirmó que la conjugación con ácidos nucleicos preservaba la forma esférica y la monodispersidad de las NP, mientras que su tamaño aumentaba solo en unos 5 nm.
[0529] Los estudios posteriores se centraron en las NP de SurC/T20, que presentaban las propiedades más prometedoras. La síntesis de estas NP se repitió cuatro veces mostrando una buena reproducibilidad de su tamaño y propiedades espectroscópicas (tabla 1). Basándose en los datos de absorción y el tamaño de partícula del TEM, pudimos estimar que se injertaron 23 ± 3 (s.e.m. n = 4) unidades de aceptor-flare por cada partícula que contenía 3200 ± 400 colorantes donantes. Sorprendentemente, la eficiencia del FRET en este sistema fue del 60 ± 6 %, lo que indica que 138 ± 20 colorantes donantes dentro de las nanopartículas transfieren el 60 % de su energía a un aceptor único ubicado en la superficie de las NP. Se trata de un fenómeno de captación de luz altamente eficaz, que debería resultar en la amplificación de la emisión del aceptor (efecto antena). El efecto antena puede medirse directamente como una relación entre la intensidad de excitación del donante y del aceptor obtenida a partir de los espectros de excitación registrados en la longitud de onda de emisión del aceptor.15 El efecto antena obtenido fue de 58 ± 1, con una reproducibilidad notablemente alta en las cuatro preparaciones (tabla 1), demostrando que la excitación mediante un donante de NP (nanoantena) amplifica 58 veces la emisión del aceptor. Este gran fenómeno de amplificación de señales debería ser de importancia clave para el siguiente paso en la detección de los ácidos nucleicos diana.
[0531] Tabla 1. Tamaño, composición y propiedades de captación de luz del conjugado NPS-ADN preparado cuatro veces.a
[0533]
[0535] a En los datos del DLS se utilizaron estadísticas por volumen; La relación D/A es la relación donante-aceptor; A por cada NP es el número de aceptores por partícula; AE es el efecto antena. b Los valores promedio se muestran junto con el error estándar de la media. cA pesar de las variaciones en los datos del DLS, el tamaño promedio por TEM se mantuvo relativamente estable (40 ± 10 nm), donde el error es el ancho total a la mitad como máximo de la distribución de tamaños (el número de partículas analizadas es >500).
[0537] 2.3 Detección de ácidos nucleicos diana
[0539] Como diana, se utilizó una secuencia de ADN (20 NA) correspondiente a una parte del gen de la survivina. En primer lugar, la diana a una concentración de 100 j M se mezcló con una nanosonda que porta un flare de 20 j M (Cy5) (corresponde a una concentración de nanosonda de 0,87 j M) y se incubó a 4 °C durante 24 h. Se descubrió que en presencia del exceso del ADN diana, la nanosonda perdía totalmente la señal FRET, en contraste con la muestra de
control sin la diana (figura 8a). Este resultado muestra que, como se esperaba, la secuencia diana reemplazó a flare-Cy5 en la superficie de las NP, deteniendo de este modo la FRET. Para hacer una estimación del límite de detección, las NP se diluyeron aún más hasta una concentración de erupción de 10 pM y se añadieron concentraciones crecientes de la diana. Sorprendentemente, la intensidad relativa del aceptor disminuyó gradualmente (figura 8b, c), indicando que la nanosonda funciona bien en el intervalo de concentración estudiado (0-200 pM). Basándose en la dependencia de la concentración obtenida la LOD estimada fue de 5 pM. Este LOD notablemente bajo se logró para un fluorómetro estándar y puede ser mucho menor cuando se utiliza una configuración de detección dedicada. A continuación, se verificó si la nanosonda estaba operativa en diferentes medios biológicos. En todos los medios estudiados, especialmente la solución salina regulada con fosfato (PBS), PBS con albúmina sérica bovina, Opti-MEM (medio de cultivo celular sin suero) y DMEM con suero (medio celular completo), la sonda mostró una fuerte respuesta de medición de intervalos a la diana: disminución de la señal FRET en presencia de la diana. Este es un resultado muy importante, porque muestra que la sonda es compatible con medios altamente complejos que contienen una variedad de biomoléculas, que incluyen las proteínas. Además, la nanosonda de la invención detectó exitosamente la diana también en el extracto de ARN de las células, mostrando que es altamente específica para una secuencia de ácido nucleico única en presencia de una gran variedad de otras secuencias.
[0541] 2.4 Evaluación de la nanosonda a nivel de una partícula única
[0543] La prueba definitiva para el rendimiento de la nanosonda es verificar si puede funcionar al nivel de una partícula única. Con este fin, la superficie del vidrio se modificó con la secuencia a 20, que es complementaria a la secuencia no codificante de la nanosonda de la presente invención. A continuación, la adición de la nanosonda a 100 pM de concentración de Cy5-flare dio como resultado una cobertura suficientemente buena de la superficie. Debe observarse una notable homogeneidad de la intensidad de fluorescencia total de las nanosondas de la invención en la superficie del vidrio, sugiriendo que la deposición se realizó con éxito sin ninguna agregación de sondas (figura 9c). Para evaluar la señal FRET a nivel de una partícula única, las imágenes de las NP se grabaron simultáneamente en los canales verde (donante) y aceptor (rojo). Puede verse en la superposición que la sonda NP mostró intensidades similares en los canales donante y aceptor, ya que la mayoría de las Np aparecen en amarillo. Por el contrario, las NP de control que portaban solo<t>20 (NP-T20) mostraron señal solo en el canal donante. Estos resultados proporcionan una clara evidencia de que, después de la inmovilización de la superficie, la sonda NP de la invención conservó una FRET fuerte, tal como se observó en las mediciones de espectroscopía. A continuación, para evaluar el efecto antena a nivel de una partícula única, se comparó la emisión del aceptor excitado con la nanosonda (a 550 nm) con su excitación directa a 640 nm. Sorprendentemente, se requirió una densidad de potencia de excitación 50 veces mayor a 640 nm para lograr una intensidad de emisión comparable a la excitada a 550 nm. El análisis cuantitativo de imágenes reveló que la amplificación de la emisión del aceptor a través de la sonda NP de la invención es de 75 ± 25. Este resultado está en línea con el efecto antena medido utilizando los espectros de excitación en la cubeta. Cabe señalar que este es el primer informe, donde se informa de esta alta amplificación a nivel de una partícula única o de un biosensor. Un informe anterior que utilizaba QD como donante de FRET no explotaba el efecto antena porque un gran número de aceptores (~ 50) deberían absorber la luz al menos tan bien como un QD único. El único informe sobre la amplificación al nivel de una partícula única se informó muy recientemente para un biosensor plasmónico utilizando origami de ADN, donde la amplificación promedio fue de 7,3.10
[0545] Finalmente, se probó la respuesta de la nanosonda de la invención a la diana a nivel de una partícula única (figura 10). Las NP inmovilizadas se incubaron con un exceso de la diana (1 nM) durante 30 minutos, seguido de su detección bicolor. Está claro que después de la incubación con la diana la emisión en el canal rojo disminuye considerablemente, como se observó previamente mediante espectroscopía de fluorescencia en la cubeta. La eficiencia relativa de FRET, expresada como A/(A+D), disminuyó de 0,4 a 0,1 (figura 10), alcanzando valores cercanos a los de las NP de control sin aceptor de FRET (NP-T20). Estos resultados constituyen una clara demostración de que la nanosonda de la invención puede informar sobre la presencia de ácidos nucleicos diana a nivel de una partícula única. Esto implica que ~23 eventos de hibridación en la superficie de la nanosonda (correspondientes al número de flares por NP) dieron como resultado el cambio de color de un nanoemisor que exhibía el brillo >3000 colorantes de rodamina. Este fenómeno único tiene dos consecuencias importantes. En primer lugar, este cambio de casi 6 veces en la relación de intensidad en los dos canales de emisión para aproximadamente 23 eventos de hibridación implica que, a nivel de una partícula única, la nanosonda podría detectar fácilmente solo unas pocas copias del ácido nucleico diana. Además, debido a la amplificación de la señal producida por la captación de luz de más de 3000 colorantes fluorescentes, los ácidos nucleicos diana podían detectarse con una potencia de iluminación muy baja (~1 W/cm2) del LED en un modo de epifluorescencia, que es ~ 100 veces menor que la requerida en las mediciones de detección de una única molécula. La utilización de baja potencia reduce significativamente el ruido de fondo y hace posible la detección de algunas copias de ADN utilizando fuentes de luz relativamente débiles y económicas y una configuración para la obtención de imágenes relativamente simple.
[0547] Referencias:
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Claims (1)
1. REIVINDICACIONES
Una nanopartícula polimérica que comprende:
-un polímero hidrófobo, portando dichas cadenas al menos un motivo de la fórmula (I),
Fórmula (I)
en donde:
-A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
-D representa un grupo elegido entre:
en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (CrCs),
-un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
-E representa (-Y-NRa), donde Ra es H o un alquilo (C1-C8),
-X, Y, Z son idénticos o diferentes y cada uno representa independientemente del otro un espaciador elegido entre -(CH2V, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NHV, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, en donde r, s y t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
-n representa un número entero elegido de 1 a 10, en particular de 1 a 3 cuando D representa
E puede estar ausente;
estando dicho motivo de fórmula (I) unido a un grupo carboxilo del polímero y situándose sobre la superficie de la nanopartícula,
opcionalmente, dicha nanopartícula polimérica comprende colorantes luminiscentes.
Una nanopartícula polimérica cargada de colorante según la reivindicación 1, que comprende:
-un polímero hidrófobo, portando dichas cadenas al menos un motivo de la fórmula (I),
en donde:
-A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH2)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
-D representa un grupo elegido entre:
en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (CrCe),
-un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
-E representa
donde Ra es H o un alquilo (Ci-Ce),
-X, Y, Z son idénticos o diferentes y cada uno representa independientemente del otro un espaciador elegido entre -(CH2V, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NHV, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, en donde r, s y t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
-n representa un número entero elegido de 1 a 10, en particular de 1 a 3
cuando D representa
E puede estar ausente;
estando dicho motivo de fórmula (I) unido a un grupo carboxilo del polímero y situándose sobre la superficie de la nanopartícula y
-donantes de energía formados por una sal de al menos un colorante donante y un anión fluorado voluminoso, estando dichos donantes de energía encapsulados en el polímero hidrófobo.
La nanopartícula polimérica cargada de colorante según la reivindicación 2, en donde las cadenas del polímero hidrófobo llevan al menos un motivo de la fórmula (Ia):
en donde x, y y z representan cada uno un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3.
4. La nanopartícula polimérica cargada de colorante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho polímero hidrófobo se elige entre polimetacrilatos, poliésteres y poliestirenos alifáticos, y derivados de los mismos.
5. La nanopartícula polimérica cargada de colorante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el colorante donante se elige entre un derivado de rodamina o un derivado de cianina.
6. Una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos, siendo dicha nanopartícula una nanopartícula polimérica hidrófoba según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos una parte de los grupos azida se transforman en grupos triazol o un derivado de los mismos y siendo funcionalizados mediante:
(a) oligonucleótidos específicos de la diana, y/o
(b) oligonucleótidos no específicos.
7. Una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos que comprende al menos un colorante donante de energía y al menos un colorante aceptor de energía,
siendo dicha nanopartícula:
-una nanopartícula polimérica cargada de colorante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde al menos una parte de los grupos azida se transforman en grupos triazol o un derivado de los mismos y siendo funcionalizados mediante:
(a) oligonucleótidos específicos de la diana, y
(b) oligonucleótidos no específicos,
y en donde el colorante aceptor de energía se conjuga con el oligonucleótido específico de la diana que forma una estructura de bucle en forma de horquilla o con un oligonucleótido competitivo con la diana separado que forma un complejo bicatenario con al menos una parte del oligonucleótido específico de la diana,
en donde la relación molar entre los oligonucleótidos específicos de la diana y los oligonucleótidos no específicos es de 1:1 a 1:1000, en particular de 1:3 a 1:10, más en particular 1:6.
8. La nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos según la reivindicación 6 o 7, en donde la nanopartícula tiene un diámetro de 10 nm a 300 nm, preferiblemente de 25-100 nm, más preferiblemente de 25 a 70 nm, aún más preferiblemente de 30 a 50 nm.
9. La nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde la relación entre el aceptor de energía y el donante de energía es de 1:10 a 1:1000, en particular 1:100.
10. La nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para utilizar como biosensor para detectar biomoléculas diana.
11. La nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos según la reivindicación 10, en donde las biomoléculas diana se eligen entre los ADN monocatenarios, los ARNm, los microARN, los ARNsi, los ARN satélite, productos amplificados por PCR, fragmentos de ADN genómico, una proteína o una toxina.
Un biosensor que comprende una nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11.
Un método para conjugar un oligonucleótido con una nanopartícula polimérica hidrófoba, comprendiendo dicho método:
(i)hacer reaccionar un polímero hidrófobo que porta al menos un grupo carboxilo con un compuesto de fórmula (II),
en donde
-A representa un espaciador elegido entre: -(CH2)m-, -(CH2)pNH-CO(CH2)q-, -(CH2)pCO-NH(CH2)q-, -(CH2)pO(CH2)q-, -(CH2)pNH(CH2)qO-, -(CH2)mCO-, -CO(CH2)m-, cada uno de m, p y q representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3,
-D representa un grupo elegido entre:
en donde R' representa un hidrógeno, un halógeno, un alquilo (C rC s), -un cicloalquilo (C3-C7) eventualmente monosustituido, un grupo heterocíclico no aromático monocíclico eventualmente monosustituido, o un grupo aromático monocíclico eventualmente monosustituido,
-E representa
donde Ra es H o un alquilo (Ci-Cs),
-X, Y, Z son idénticos o diferentes y cada uno representa un espaciador elegido entre -(CH2)r-, -(CH2-CH2-OV, -(CH2-CH2-NHV, -(CH2)sNH-CO(CH2)t-, -(CH2)sCO-NH(CH2)t-, r, s y t representan independientemente entre sí un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3;
-n representa un número entero elegido de 1 a 10, en particular de 1 a 3 cuando D representa
E puede estar ausente;
para obtener un polímero modificado, portando dichas cadenas al menos un motivo de fórmula (I),
en donde A, D, X, Y, Z y n son como se han definido anteriormente,
(ii) precipitar el polímero modificado obtenido en el paso (i) a partir de un disolvente orgánico en una solución acuosa para producir las nanopartículas;
(iii) realizar una cicloadición entre las nanopartículas obtenidas en el paso anterior con:
-un oligonucleótido no específico que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo azida del motivo (I) mediante una cicloadición, y/o
-un oligonucleótido específico de la diana que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo azida del motivo (I) mediante una cicloadición.
14. El método según la reivindicación 13, donde el grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo azida del motivo (I) comprendido en el oligonucleótido modificado se elige entre:
-grupo cicloalquinilo (C7-C10)
-grupo alquinilo heterocíclico, y
-grupo alquinilo (C2-C10)
15. Método según la reivindicación 13 o 14, en donde en el paso (i) el polímero hidrófobo se hace reaccionar con un compuesto de fórmula (IIb1):
en donde x, y y z representan cada uno un número entero elegido de 0 a 8, preferiblemente un número entero elegido de 0 a 5, más preferiblemente un número entero elegido de 0 a 3.
16. Método de detección de una biomolécula de interés que comprende el paso de:
-poner en contacto una muestra que contiene biomoléculas de interés con una nanopartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12,
-formar una composición en donde la biomolécula de interés se une a la nanopartícula,
- medir los cambios de fluorescencia producidos por los cambios en la transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET, por sus siglas en inglés) entre los colorantes donantes y los colorantes aceptores.
17. Un kit para detectar biomoléculas diana que comprende:
-una nanopartícula polimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, -un oligonucleótido no específico que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo azida mediante una cicloadición.
18. La nanopartícula polimérica hidrófoba funcionalizada con oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para utilizar como un agente de contraste, agente de diagnóstico o como agente de obtención de imágenes médicas.
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