ES3048791T3

ES3048791T3 - Pharmaceutical compositions comprising hla fusion proteins

Info

Publication number: ES3048791T3
Application number: ES22761216T
Authority: ES
Inventors: Belaunzaran Osiris Marroquin; Anahita Rafiei; Anil Kumar; Christoph Renner
Original assignee: Immunos Therapeutics AG
Current assignee: Immunos Therapeutics AG
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2025-12-11
Anticipated expiration: 2042-08-05
Also published as: AU2022324711A1; EP4380595C0; CA3227299A1; BR112024002198A2; JP2024530199A; EP4380968C0; ES3048639T3; EP4380968A1; WO2023012347A1; MX2024001690A; MX2024001689A; JP2024529079A; AU2022323540A1; CA3227284A1; US20240269232A1; BR112024002196A2; IL310615A; EP4380595B1; EP4380595A1; EP4380968B1

Abstract

La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión HLA para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplásicas. La invención también proporciona medicamentos combinados que comprenden proteínas de fusión HLA e inhibidores de puntos de control para su uso en el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión de HLA

[0005] La presente invención reivindica prioridad de las solicitudes europeas EP21190004.8 y EP21190005.5 presentadas el 5 de agosto de 2021, y EP21207324.1 presentada el 9 de noviembre de 2021.

[0007] La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para su uso como medicamentos antineoplásicos, dichas composiciones comprenden una proteína de fusión HLA asociada con un polipéptido de beta-2-microglobulina, y tienen propiedades inmunomoduladoras y de expresión de proteínas recombinantes deseables.

[0009] Antecedentes de la Invención

[0011] Las moléculas MHC-I clásicas (también conocidas como HLA-I en humanos) son estructuras diméricas o triméricas que comprenden una cadena pesada unida a la membrana caracterizada por un dominio extracelular (que comprende un dominio a l,a2,y a3). La cadena pesada del HLA forma un complejo con la p2-microglobulina (p2m), también conocida como cadena ligera del HLA, y presenta el antígeno en forma de un pequeño epítopo peptídico asociado a la hendidura de unión al péptido de la cadena pesada del HLA en la superficie de la célula. Las moléculas MHC de clase I también pueden disociarse en cadenas pesadas libres carentes de p2m, y/o epítopo peptídico (Arosa et al. Trends in Immunology 2007 Mar; 28(3):115-23). Los inventores han identificado HLA seleccionados, como HLA-B27, o el haplotipo HLA-B57 vinculado a ciertos correlatos inmunitarios en la infección por HIV, como medicamentos inmunomoduladores prometedores cuando se administran como proteína de fusión con un péptido estabilizador como una porción Fc de inmunoglobulina (Ig), en particular cuando el HLA carece de asociación con p2m, o un epítopo peptídico en la hendidura de unión del HLA (véase WO 2017153438 A1, WO2016124661A1, WO2018029284 A1).

[0013] Para obtener HLA aislado no asociado a p2m utilizado en aplicaciones anteriores de esta tecnología, se separa el complejo proteína de fusión de cadena pesada de HLA / p2m, por ejemplo en condiciones ácidas, antes de la purificación, por ejemplo mediante cromatografía basada en el tamaño, antes de volver a plegar las proteínas de fusión de cadena pesada de HLA aisladas. Sin embargo, aunque los compuestos de cadena pesada HLA no asociados ap2m, como la proteína de fusión derivada de la cadena pesada HLA-B57 estudiada aquí, tienen cualidades inmunomoduladoras deseables, la ampliación de la fabricación a cantidades industriales ha revelado desafíos. Hasta la mitad de la proteína de fusión HLA se pierde durante el proceso de separación de la proteína de fusión HLA inmunomoduladora de la p2m.

[0015] Basándose en el estado de la técnica anteriormente mencionado, el objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica mejorada, una proteína de fusión basada en la cadena pesada HLA con propiedades inmunomoduladoras favorables, para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplásicas malignas. Este objetivo se alcanza mediante el objeto de las reivindicaciones independientes de la presente especificación, con otras realizaciones ventajosas descritas en las reivindicaciones dependientes, los ejemplos, las figuras y la descripción general de esta especificación.

[0017] Resumen de la Invención

[0019] Al investigar las cualidades inmunológicas de un complejo intermedio de proteína de fusión de cadena pesada HLA / polipéptido p2m en comparación con una proteína de fusión de cadena pesada HLA que carece de polipéptido p2m, los inventores hicieron la sorprendente observación de que la molécula de complejo de proteína de fusión H<l>A / polipéptido p2m exhibe propiedades inmunomoduladoras deseables, y proporciona un efecto terapéutico beneficioso aumentado en el tratamiento del cáncer, particularmente en un modelo de cáncer de sistema inmunitario humanizado.

[0021] Un primer aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplásicas malignas, dicha composición que comprende una proteína de fusión HLA (que comprende un polipéptido de dominio extracelular de cadena pesada HLA de clase I del MHC, y un polipéptido cristalizable de fragmento de inmunoglobulina (Ig) estabilizante (Fc)), donde la proteína de fusión HLA se asocia adicionalmente con un polipéptido p2m, y donde las composiciones contienen al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA es el dominio extracelular de una cadena pesada HLA natural seleccionada de entre HLA-B57, HLA-C08, HLA-A25, HLA-B58, HLA-B27, HLA-A30, HLA-B53, o HLA-C12. En otras realizaciones particulares, la proteína de fusión HLA comprende un polipéptido de cadena pesada HLA variante, en particular una variante de la cadena pesada HLA-B57, donde la variante tiene al menos un 95% de similitud con una de las cadenas pesadas HLA enumeradas anteriormente, y conserva una función biológica similar.

[0023] Otras realizaciones de la composición farmacéutica para uso según la invención se refieren a la asociación no covalente de la proteína de fusión HLA con el polipéptido p2m, y variantes de polipéptidos de cadena pesada HLA-B57, polipéptidos Ig Fc, enlazadores peptídicos, y señales de secreción de uso particular para su inclusión en tales composiciones farmacéuticas, así como medicamentos de combinación que comprenden además un agente inhibidor del punto de control, en el que dicho agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10-7 mol/L o inferior.

[0024] Otro aspecto de la invención se refiere a agentes inhibidores de puntos de control para su uso en el tratamiento de un paciente con cáncer, especialmente un cáncer de la sangre, o una enfermedad neoplásica maligna, formulados para su administración en combinación con una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA y p2m según el primer aspecto de la invención, en la que dicho agente inhibidor de puntos de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10-7 mol/L o inferior.

[0026] Términos y definiciones

[0028] A efectos de interpretación de la presente especificación, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando proceda, los términos utilizados en singular incluirán también el plural y viceversa. En caso de que cualquier definición establecida a continuación entre en conflicto con cualquier documento al que se haga referencia en este documento, prevalecerá la definición establecida.

[0030] Los términos "que comprende", "que tiene", "que contiene", e "incluyendo", y otras formas similares, y sus equivalentes gramaticales, tal como se utilizan en el presente documento, tienen un significado equivalente y son abiertos en el sentido de que un elemento o elementos que sigan a cualquiera de estas palabras no constituyen una lista exhaustiva de dicho elemento o elementos, ni se limitan únicamente al elemento o elementos enumerados. Por ejemplo, un artículo "que comprende" los componentes A, B, y C puede consistir en (es decir, contener sólo) los componentes A, B, y C, o puede contener no sólo los componentes A, B, y C, sino también otro u otros componentes. Como tal, se pretende y se entiende que "comprende" y formas similares del mismo, y sus equivalentes gramaticales, incluyen la divulgación de realizaciones de "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".

[0032] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado, está comprendido dentro de la divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo declarado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la divulgación.

[0034] La referencia a "sobre" un valor o parámetro incluye (y describe) variaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción referida a "sobre X" incluye la descripción de "X".

[0036] Tal como se utilizan en el presente documento, incluidas las reivindicaciones anexas, las formas singulares "a", "o" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0038] "Y/o", cuando se utiliza en el presente documento, debe entenderse como la mención específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin la otra. Por lo tanto, el término "y/o" utilizado en una frase como "A y/o B" incluye "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, el término "y/o" utilizado en una frase como "A, B, y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

[0040] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Para los métodos moleculares, genéticos y bioquímicos se utilizan técnicas estándar (véase en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (2002) 5th Ed, John Wiley & Sons, Inc.) y métodos químicos.

[0042] El términopolipéptidoen el contexto de la presente especificación se refiere a una molécula que consta de 50 o más aminoácidos que forman una cadena lineal en la que los aminoácidos están conectados por enlaces peptídicos. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido puede representar la secuencia de aminoácidos de una proteína completa (tal y como se encuentra fisiológicamente) o de fragmentos de la misma. Los términos "polipéptidos" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento e incluyen las proteínas y sus fragmentos. Los polipéptidos se describen en el presente documento como secuencias de residuos de aminoácidos.

[0044] Las secuencias de residuos de aminoácidos se indican de amino a carboxilo terminal. Las mayúsculas para las posiciones de secuencia se refieren a los L-aminoácidos en el código de una letra (Stryer, Biochemistry, 3.a ed. p. 21). Las letras minúsculas para las posiciones de la secuencia de aminoácidos se refieren a los correspondientes aminoácidos D o (2R). Las secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección del amino al carboxi terminal. De acuerdo con la nomenclatura estándar, las secuencias de residuos de aminoácidos se denominan mediante un código de tres letras o de una sola letra, como se indica a continuación: Alanina (Ala, A), Arginina (Arg, R), Asparagina (Asn, N), Ácido aspártico (Asp, D), Cisteína (Cys, C), Glutamina (Gln, Q), Ácido glutámico (Glu, E), Glicina (Gly, G), Histidina (His, H), Isoleucina (Ile, I), Leucina (Leu, L), Lisina (Lys, K), Metionina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Prolina (Pro, P), Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Triptófano (Trp, W), Tirosina (Tyr, Y), y Valina (Val, V).

[0046] [0019]Los términosexpresión génicaoexpresión,o alternativamente el términoproducto génico,pueden referirse a cualquiera de los procesos, o a ambos, -y a sus productos- de generación de ácidos nucleicos (ARN) o de generación de un péptido o polipéptido, también denominados transcripción y traducción, respectivamente, o a cualquiera de los procesos intermedios que regulan el procesamiento de la información genética para dar lugar a productos polipeptídicos. El términoexpresión génicatambién puede aplicarse a la transcripción y procesamiento de un producto génico de ARN, por ejemplo un ARN regulador o un ARN estructural (por ejemplo, ribosómico). Si un polinucleótido expresado deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir el empalme del ARNm en una célula eucariota. La expresión puede evaluarse tanto a nivel de transcripción como de traducción, es decir, ARNm y/o producto proteico.

[0048] En el contexto de la presente especificación, los términosidentidad de secuencia, similitud de secuenciayporcentaje de identidad de secuenciase refieren a un único parámetro cuantitativo que representa el resultado de una comparación de secuencias determinada comparando dos secuencias polipeptídicas alineadas posición por posición. Los métodos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación de secuencias para su comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math.

[0049] 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) o mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos, incluidos, entre otros: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Los programas informáticos para realizar análisis BLAST están a disposición del público, por ejemplo, a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0051] Un ejemplo para la comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP que utiliza la configuración por defecto: Esperar umbral: 10; Tamaño de la palabra: 3; Máximo de coincidencias en un intervalo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Gap Costes: Existencia 11, Extensión 1; Ajustes de composición: Ajuste condicional de la matriz de puntuación composicional. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad de secuencias que se proporcionan en este documento se refieren al valor obtenido mediante el conjunto de programas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) utilizando los parámetros por defecto identificados anteriormente para la proteína.

[0053] La referencia a secuencias idénticas sin especificar un valor porcentual implica secuencias idénticas al 100% (es decir, la misma secuencia).

[0055] En el contexto de la presente especificación, el términoconstante de disociación (Kd)se utiliza en su significado conocido en la técnica de la química y la física; se refiere a una constante de equilibrio que mide la propensión de un complejo compuesto de [principalmente dos] componentes diferentes a disociarse reversiblemente en sus componentes constituyentes. El complejo puede ser, por ejemplo, un complejo anticuerpo-antígeno AbAg compuesto por el anticuerpo Ab y el antígeno Ag. La K<d>se expresa en concentración molar [mol/L] y corresponde a la concentración de [Ab] en la que la mitad de los sitios de unión de [Ag] están ocupados, en otras palabras, la concentración de [Ab] no unido es igual a la concentración del complejo [AbAg]. La constante de disociación puede calcularse según la fórmula siguiente:

[0058]

[0060] [Ab]: concentración de anticuerpo; [Ag]: concentración de antígeno; [AbAg]: concentración de complejo anticuerpoantígeno.

[0062] Tal como se utiliza en el presente documento, el términocomposición farmacéuticase refiere a una proteína de fusión HLA asociada a p2m según la invención, junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica según la invención se proporciona en una forma adecuada para la administración tópica, parenteral o inyectable.

[0064] Tal como se utiliza aquí, el términoportador farmacéuticamente aceptableincluye cualquier disolvente, medio de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, y similares, y combinaciones de los mismos, como sería conocido por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Remington: the Science and Practice of Pharmacy, ISBN 0857110624).

[0066] Como se usa aquí, el términotratarotratamientode cualquier enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) se refiere en una realización, a mejorar la enfermedad o trastorno (por ejemplo, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad, o al menos uno de los síntomas clínicos de la misma, por ejemplo, ralentizar o reducir el crecimiento del tumor). En otra realización, "tratar", "en tratamiento" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluidos aquellos que pueden no ser perceptibles por el paciente. En otra realización, "tratar", "en tratamiento" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma perceptible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico), o ambos. Los métodos para evaluar el tratamiento y/o la prevención de enfermedades son generalmente conocidos en la técnica, a menos que se describan específicamente a continuación.

[0068] [0027]En el contexto de la presente especificación, el términoenlazador peptídico,oenlazador aminoácidose refiere a un polipéptido de longitud variable que se utiliza para conectar dos polipéptidos con el fin de generar un polipéptido de cadena simple. Las realizaciones ejemplares de enlazadores útiles para practicar la invención especificada aquí son cadenas de oligopéptidos que constan de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un enlazador de aminoácidos es el polipéptido GGGGSGGGGS (SEQ ID N.° 003) que enlaza un polipéptido de cadena pesada HLA con un péptido estabilizador, por ejemplo, enlazando un polipéptido HLA-B57 con un polipéptido IgG4 Fc en una proteína de fusión HLA.

[0070] El términoantígeno leucocitario humano (HLA) de cadena pesada, cadena pesada HLAen el contexto de la presente especificación se refiere a la proteína codificada por un gen deantígeno de histocompatibilidad MHC de clase I,en particular una cadena pesada clásica, MHC de clase 1a. En humanos, una cadena pesada HLA puede ser un monómero, o formar parte de estructuras diméricas que comprenden una cadena pesada con tres dominios extracelulares ( a l , a2, y a3), unida de forma no covalente a una cadena ligera p2m, u opcionalmente, estructuras triméricas en las que se asocia un pequeño péptido en la hendidura de unión al péptido. Los polipéptidos decadena pesada HLAde longitud completa comprenden un dominio extracelular que comprende un dominio a l , un dominio a2, y un dominio a3, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular.

[0072] Una lista decadenas pesadas HLAde origen natural que se consideran realizaciones del término según este aspecto de la invención se enumeran en la Tabla 1.

[0075] TABLA 1

[0077] L is ia d e a lc lo s de las c a d e n a s p e sa d a s de H LA

[0080]

[0083] El términovarianteen el contexto de la presente especificación se refiere a una secuencia polipeptídica de cadena pesada HLA con al menos un residuo aminoácido que difiere de una secuencia polipeptídica natural. Por ejemplo, una variante del polipéptido de la cadena pesada del HLA en la que se han introducido una o varias sustituciones de aminoácidos, de forma que difiere de la secuencia original de proteína humana natural de la que deriva.

[0085] [0031] El términodominio extracelularaplicado a una cadena pesada HLA, o a una variante de una cadena pesada HLA en el contexto de esta especificación, se refiere a la porción extracelular de un polipéptido de cadena pesada HLA que se extiende desde la superficie celular. La porción extracelular de un polipéptido HLA de clase 1a comprende el dominio alfa (a) 1, el dominio a2, y el dominio a3, que comprenden regiones esenciales para las interacciones del ligando receptor que median los efectos inmunomoduladores de la proteína de fusión HLA en la composición farmacéutica para uso según la invención. El dominioextracelularexcluye el dominio transmembrana, y el dominio intracelular.

[0087] En el contexto de la presente especificación, el términoproteína de fusión HLAse refiere a un polipéptido recombinante que comprende el dominio extracelular de una cadena pesada HLA, unido a una inmunoglobulina (Ig) Fc estabilizadora, opcionalmente mediante un enlazador peptídico. El término engloba dichaproteína de fusión HLAen complejo con un polipéptido de p2-microglobulina tal como se secreta a partir de un cultivo de células de mamífero, así como laproteína de fusión HLApurificada que no está asociada con la p2-microglobulina. El término proteína defusión HLApuede referirse a un monómero que comprende un único polipéptido HLA unido a un único dominio Fc de inmunoglobulina (Ig) estabilizadora, o a un dímero formado por la asociación de un primer monómero de proteína de fusión HLA, y un segundo monómero de proteína de fusión HLA, particularmente unidos a través de sus dominios Fc Ig.

[0089] En el contexto de la presente especificación, el término p2-microglobulina(¡32m, B2m), polipéptido B2m,opolipéptidop2m se refiere a la cadena beta (p), también conocida como cadena ligera HLA de moléculas MHC de clase I. El término p2-microglobulina abarca, en primer lugar, una p2-microglobulina de preprocesamiento que comprende una señal secretora, por ejemplo, la secuencia de Uniprot P61769, o la secuencia SEQ ID N.° 006, y en segundo lugar, la forma postsecreción de la proteína, en la que una porción de señal secretora de la proteína se ha eliminado por escisión durante el proceso de secreción, como se encuentra en un complejo de proteína de fusión HLA: polipéptido p2m comprendido dentro de la composición farmacéutica según la invención.

[0091] En el contexto de la presente especificación, el términoseñal secretora, péptido señal secretor,osecuencia señalse refiere a una secuencia líder N-terminal que inicia el marco de lectura abierto (ORF) de un polipéptido, normalmente de unos 6-30 aminoácidos de longitud. En raras ocasiones, se coloca unaseñal secretoraen el extremo C-terminal de un polipéptido.Las señales secretorasse denominan a veces señales de orientación, señales de localización, péptidos de tránsito, secuencias líderes, o péptidos líderes.Las señales secretorasque permiten la secreción eficiente de un polipéptido a partir de células son bien conocidas, y pueden incluirse en el ORF de una proteína recombinante para facilitar la exportación de un polipéptido al sobrenadante en un sistema de fabricación de polipéptidos basado en células, permitiendo la purificación de un polipéptido a partir del sobrenadante celular. Tras la traducción del ARNm que codifica laseñal secretora,ésta es reconocida por una proteína citosólica que media en la transferencia del complejo ARNmribosoma a una proteína canal del retículo endoplásmico (ER). El polipéptido recién sintetizado que comprende elpéptido señal secretorse transloca al lumen del ER a través de la proteína canal, entrando en la vía de secreción celular.Las secuencias señalde uso particular según la invención son aquellas que se escinden del producto polipeptídico final tras la traducción, por ejemplo, SEQ ID N.° 004.

[0093] En el contexto de la presente especificación, los términosregión de fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Fc),oIg Fcse refieren a una fracción de un anticuerpo, o inmunoglobulina (Ig), compuesta por un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3.Las Ig Fcabarcan tanto un monómero como un dímero que comprende dosIg Fc,unidas covalentemente por enlaces disulfuro. En el contexto de la proteína de fusión HLA según la invención, los enlaces disulfuro pueden unir dos moléculas de proteínas de fusión HLA, cada una de las cuales comprende dominiosFc Ig.La presencia de laIg Fcen la proteína de fusión HLA facilita una mayor solubilidad, estabilidad, avidez, semivida, y desde un punto de vista tecnológico, una producción y purificación rentables en sistemas de mamíferos (purificación de proteínas A o G).

[0095] En el contexto de la presente especificación, el términoagente inhibidor depunto de control abarca anticuerpos capaces de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10'7 mol/L o inferior, capaces de interrumpir una cascada de señalización inhibitoria que limita la activación de células inmunitarias, y en particular la activación de células T, conocida en la técnica como mecanismo de punto de control inmunitario. Entre los ejemplos deagentes inhibidores de puntos de controlse incluyen, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a CTLA-4 (Uniprot P16410), PD-1 (Uniprot Q15116), o PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7).

[0097] Los términos "cáncer" y "enfermedad neoplásica maligna" se utilizan aquí como sinónimos. Alternativas particulares de cualquiera de los aspectos y realizaciones aquí divulgados se dirigen al uso de las combinaciones de la invención en el tratamiento de tumores sólidos. Otras alternativas de cualquiera de los aspectos y realizaciones aquí divulgados se dirigen al uso de las combinaciones de la invención en el tratamiento de cánceres líquidos como la leucemia mielógena o granulocítica, en particular AML, la leucemia linfática, linfocítica, o linfoblástica y el linfoma, la policitemia vera o la eritremia.

[0099] Descripción Detallada de la Invención

[0101] Composición farmacéutica que comprende proteína de fusión HLA para el tratamiento del cáncer

[0103] Un primer aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica maligna, dicha composición comprende una proteína de fusión HLA, asociada con un polipéptido B2m. Dicha proteína de fusión HLA según la invención comprende

[0104] un primer polipéptido que comprende el dominio extracelular de una cadena pesada HLA (en particular, incluyendo los dominios extracelulares a l, a2 y a3), y

[0105] un segundo polipéptido estabilizador, a saber, la porción Ig Fc de una inmunoglobulina.

[0106] El uso de la proteína de fusión HLA asociada a p2m confiere la ventaja de mayores rendimientos de la proteína de fusión HLA inmunomoduladora, ya que la producción de este producto no incurre en la pérdida de proteína que se produce durante una etapa de disociación de p2m (Fig. 2), y mejora ciertas propiedades inmunológicas como la captación fagocítica de células tumorales, en comparación con una alternativa de proteína de fusión HLA no asociada a p2m (Fig. 4). Es importante destacar que la composición farmacéutica según la invención que comprende una proteína de fusión HLA y p2m se asocia con una mayor supervivencia cuando se utiliza una composición farmacéutica según la invención para tratar el cáncer en ratones humanizados que comprenden células inmunitarias humanas, en comparación con un formato de proteína de fusión HLA que carece del polipéptido p2m (Fig 5).

[0108] En algunas realizaciones de la composición farmacéutica para uso según la invención, el polipéptido p2m está unido por un enlazador peptídico a la proteína de fusión HLA.

[0110] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, el polipéptido p2m se asocia de forma no covalente con dicha proteína de fusión HLA.

[0112] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, la proteína de fusión HLA se asocia con una molécula p2m en una proporción molar de entre 3:5 a 7:5, más particularmente entre 4:5 a 6:5. En otras palabras, la proteína de fusión HLA y el polipéptido p2m están presentes en una proporción de, o cercana a, 1 a 1. Las referencias de HLA a I32M deben entenderse como molares en todo este documento, a menos que se indique explícitamente lo contrario.

[0114] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, dos proteínas de fusión HLA, cada una asociada con un polipéptido p2m pueden asociarse en una forma dimerizada a través de sus porciones Fc.

[0116] Polipéptidos de cadena pesada HLA

[0118] Ciertos dominios de las proteínas de cadena pesada HLA no necesarios para las interacciones de ligando afín, no se incluyen en la porción de polipéptido HLA de la proteína de fusión HLA comprendida en la composición farmacéutica para uso según la invención. El dominio intracelular, y el dominio transmembrana están ausentes del polipéptido de la cadena pesada del HLA.

[0120] En realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión HLA, o la proteína de fusión HLA aislada según la invención, el polipéptido variante HLA-B57 comprendido en la proteína de fusión h La incluye los dominios alfa 1, 2 y 3 de la proteína de cadena pesada HLA natural, regiones de las cuales son esenciales para las interacciones de ligando receptor que median los efectos inmunomoduladores de una proteína de fusión HLA según la invención.

[0122] En realizaciones más particulares del método para producir una proteína de fusión HLA, o la proteína de fusión HLA aislada según la invención, la variante de la proteína polipéptida HLA-B57 son los dominios alfa 1,2, y 3 de la proteína de cadena pesada HLA de origen natural, excepto el dipéptido isoleucina-valina C-terminal, precedido por los residuos treonina-valina-prolina del dominio extracelular, dentro de la región HLA-B57 que precede al dominio transmembrana a veces anotado, o denominado, como el "péptido conector".

[0124] Los datos estructurales sugieren que las cadenas pesadas HLA interactúan con ligandos como los receptores tipo inmunoglobulina asesina (KIR) y los receptores tipo inmunoglobulina leucocitaria (LILR) a través de regiones distantes de la región transmembrana. Los aminoácidos próximos a la membrana no suelen interactuar con los receptores. Además, los inventores suponen que el alto contenido de aminoácidos hidrófobos dentro del motivo de aminoácidos 5 C-terminal del péptido de conexión del dominio extracelular de las secuencias de cadena pesada HLA de origen natural, es probable que introduzca propiedades indeseables en las proteínas recombinantes, como una tendencia a la agregación de proteínas, que luego puede afectar a la producción, purificación, estabilidad y toxicidad en los procesos de producción posteriores.

[0126] En particular de la composición farmacéutica para uso según la invención, el polipéptido de dominio extracelular de cadena pesada HLA del componente de proteína de fusión HLA comprende la estructura central de la porción extracelular de una secuencia de proteína de cadena pesada HLA, que comprende los dominios alfa 1,2, y 3, ya que esta porción confiere a la proteína de fusión HLA la capacidad de interactuar con moléculas de superficie en células diana.

[0128] [0049]En algunas realizaciones de la composición farmacéutica para uso según la invención, la porción de polipéptido de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA tiene la secuencia polipeptídica del dominio extracelular de una cadena pesada HLA de origen natural enumerada en la Tabla. 1. En realizaciones particulares, el dominio extracelular de la cadena pesada HLA es el de una cadena pesada HLA natural con cualidades inmunomoduladoras, como la unión específica a las proteínas reguladoras de la superficie celular KIR3DL1, LILRA, y LILRB1/2 que alteran la función de las células inmunitarias innatas y adaptativas. En algunas de dichas realizaciones, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA se deriva de, o esencialmente es, el dominio extracelular de HLA-B58. En algunas de dichas realizaciones, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA se deriva de, o esencialmente es, el dominio extracelular de HLA-B27. En otras realizaciones, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA se deriva de, o esencialmente es, el dominio extracelular de HLA-B44. En otras realizaciones, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA se deriva de, o esencialmente es, el dominio extracelular de HLA-B81. En otras realizaciones, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA se deriva de, o esencialmente es, el dominio extracelular de HLA-C12. En realizaciones particulares, la porción de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA se deriva de, o esencialmente es, el dominio extracelular de HLA-B57.

[0130] En otra realización de la composición farmacéutica según la invención, la proteína de fusión HLA comprende el dominio extracelular de una cadena pesada HLA-Cw08:02 caracterizada por una E en la posición 46, y una R en la posición 97, ya que los inventores encontraron que este polipéptido tenía cualidades de expresión favorables.

[0132] En otras realizaciones de la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, dicha composición comprende:

[0133] a. una proteína de fusión HLA que comprende:

[0134] i. un dominio extracelular de una cadena pesada HLA-C08 caracterizado por una E en la posición 46, y una R en la posición 97; o una variante del dominio extracelular de una cadena pesada HLA-C08, en la que dicha variante se caracteriza por una similitud de secuencia de al menos (>) 95%, particularmente >98%, y una actividad biológica similar;

[0135] ii. un polipéptido de fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Ig Fc), particularmente un polipéptido IgG Fc, más particularmente un polipéptido IgG4 Fc; y

[0136] b. un polipéptido p2m;

[0137] particularmente donde la proteína de fusión HLA comprende el polipéptido SEQ ID N.° 010, más particularmente en el que la proteína de fusión HLA consiste en la secuencia SEQ ID N.° 010.

[0139] En otra realización de la composición farmacéutica según la invención, la proteína de fusión HLA comprende el dominio extracelular de una cadena pesada HLA-B58:01 caracterizada por una E en la posición 46, y una R en la posición 97, ya que los inventores encontraron que esta cadena pesada tiene cualidades de expresión favorables.

[0141] En otras realizaciones de la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, dicha composición comprende:

[0142] a. una proteína de fusión HLA que comprende:

[0143] i. un dominio extracelular de una cadena pesada HLA-B58 caracterizado por una E en la posición 46, y una R en la posición 97; o una variante del dominio extracelular de una cadena pesada HLA-B58, donde dicha variante se caracteriza por una similitud de secuencia de al menos (>) 95%, particularmente >98%, y una actividad biológica similar;

[0144] ii. un polipéptido de fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Ig Fc), particularmente un polipéptido IgG Fc, más particularmente un polipéptido IgG4 Fc; y

[0145] b. un polipéptido p2m;

[0146] En particular, la proteína de fusión HLA comprende el polipéptido SEQ ID N.° 009, más concretamente, la proteína de fusión HLA consiste en la secuencia SEQ ID N.° 009. En determinadas realizaciones de la composición farmacéutica según la invención, la proteína de fusión HLA comprende un polipéptido de dominio extracelular de cadena pesada HLA variante. Dicho polipéptido de cadena pesada HLA variante se caracteriza por una similitud de secuencia (a nivel proteico) de al menos (>) 95% con el dominio extracelular no variante de una cadena pesada HLA, y por tener una actividad biológica similar en comparación con la secuencia original en el contexto de una proteína de fusión HLA. En realizaciones particulares, la cadena pesada HLA variante es >98% similar al dominio extracelular de la cadena pesada HLA natural de la que se deriva, mientras que tiene una actividad biológica similar en comparación con la secuencia original en el contexto de una proteína de fusión HLA.

[0148] Una "actividad biológica similar" se define como al menos el 65%, o en particular el 85%, o más del 100% de la capacidad de una proteína de fusión HLA polipéptido de cadena pesada HLA variante para unirse a LILRB2, en comparación con la estructura no variante equivalente, medida por un método de ensayo inmunoenzimático (ELISA). La actividad biológica puede evaluarse calculando la EC50, es decir, la concentración de una proteína de fusión que da una respuesta semimáxima, en este caso, la mitad de la unión máxima a una molécula de LILRB2 biotinilada. Por ejemplo, la EC50 de las proteínas de fusión de cadena pesada HLA-B57 y HLA-B57(A46E/V97R equivalentes no asociadas ap2m es de 21nM y 8,3nM respectivamente, lo que demuestra que la función biológica de la variante supera a la de la secuencia de tipo salvaje (Fig. 3A).

[0150] [0055]Para determinar la EC50 según la invención, placas de 96 pocillos de alta capacidad de unión recubiertas con estreptavidina pueden recubrirse con 50 pl de LILRB2 c-terminalmente biotinilado (por ejemplo, obtenido de BPS Bioscience #100335) a una concentración final de 5 pg/ml en tampón PBS. Como controles negativos pueden utilizarse PBS e isotipo IgG. Se aplica una dilución en serie de la proteína de fusión HLA en una serie titulada, (por ejemplo, ocho puntos de concentración: 10, 2,5, 1, 0,25, 0,1, 0,025, 0,01, 0,0025 pg/ml), aplicados preferentemente en duplicados de 50ul. A continuación, puede aplicarse un anticuerpo marcado que pueda detectar la proteína de fusión (por ejemplo, un anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con APC (Jackson Immuno Research #109-135-098, dilución 1:100 en TBS 50 pl) para detectar la unión y el fondo de la proteína de fusión HLA, y medir la excitación y la emisión de fluorescencia a la longitud de onda adecuada (por ejemplo, 650 nm y 660 nm). Un modelo log (agonista) basado en tres parámetros es un medio adecuado para determinar la EC50 de la unión de la proteína de fusión HLA al ELISA LILRB2.

[0152] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para su uso según la invención, la proteína de fusión HLA comprende una variante del polipéptido de dominio extracelular de cadena pesada HLA-B57, que se caracteriza por al menos una, o dos sustituciones de aminoácidos específicas que difieren de la secuencia polipeptídica de un polipéptido de dominio extracelular de cadena pesada HLA natural. La familia de genes de la cadena pesada HLA-B57 abarca actualmente 221 variantes conocidas con secuencias de ácido nucleico únicas, numeradas de HLA-B*57:01 a HLA-B*57:141, que codifican varias docenas de secuencias proteicas únicas. Las secuencias proteínicas correspondientes son conocidas, y pueden recuperarse, por ejemplo, introduciendo el término de búsqueda "B*57" en el formulario MGT/HLA Allele Query Form proporcionado por la European Bioinformatics Institute Immuno Polymorphism Database, Robinson J.et al.2013Nucleic Acids Res.41:D1234, https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html). En formas de realización más particulares, el polipéptido de cadena pesada HLA es una variante del dominio extracelular natural de una secuencia polipeptídica de cadena pesada HLA-B57, en la que se han realizado una o dos sustituciones de aminoácidos de tal manera que el polipéptido de cadena pesada HLA variante se caracteriza por una E en la posición 46, y una R en la posición 97. En otras palabras, un aminoácido distinto de E ha sido sustituido por una E en la posición 46, y/o un aminoácido distinto de R, ha sido sustituido por una R en la posición 97. La numeración de estos aminoácidos se refiere a la asignación de números enteros que comienzan secuencialmente con el motivo G, S, H (o motivo equivalente, por ejemplo, C, S, H en los polipéptidos HLA-C08) que inicia el dominio extracelular de una porción secretada de HLA-B57, que carece de la señal de secreción, con los números 1, 2, y 3. Los inventores encuentran que estas sustituciones de aminoácidos se correlacionan con altos rendimientos de la proteína de fusión HLA resultante basada en la variante en comparación con la secuencia de tipo salvaje (Fig. 1, y Fig. 2), y un perfil de unión LILRB2 favorable.

[0154] En realizaciones más particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, la porción de polipéptido extracelular de cadena pesada HLA de la proteína de fusión HLA según la invención comprende la secuencia variante HLA-B57 designada SEQ ID N.° 001. En realizaciones aún más particulares, el polipéptido de cadena pesada HLA consiste esencialmente en la secuencia designada SEQ ID N.° 001.

[0156] En otra realización de la composición farmacéutica según la invención, la proteína de fusión HLA comprende la variante de un dominio extracelular de una cadena pesada HLA-A30:01 caracterizada por una E en la posición 46, y una R en la posición 97, ya que los inventores encontraron que esta cadena pesada tiene cualidades de expresión favorables.

[0158] En otras realizaciones de la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, dicha composición comprende:

[0159] a. una proteína de fusión HLA que comprende:

[0160] iii. un dominio extracelular de una cadena pesada HLA-A30 caracterizado por una E en la posición 46, y una R en la posición 97; o una variante del dominio extracelular de una cadena pesada HLA-A30, en la que dicha variante se caracteriza por una similitud de secuencia de al menos (>) 95%, particularmente >98%, y una actividad biológica similar;

[0161] iv. un polipéptido de fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Ig Fc), particularmente un polipéptido IgG Fc, más particularmente un polipéptido IgG4 Fc; y

[0162] b. un polipéptido p2m;

[0163] particularmente donde la proteína de fusión HLA comprende el polipéptido SEQ ID N.° 012, más particularmente donde la proteína de fusión HLA consiste en la secuencia SEQ ID N.° 012.

[0165] En ciertas realizaciones de la composición farmacéutica para uso según la invención, el polipéptido de cadena pesada HLA y el polipéptido Ig Fc están unidos por un enlazador peptídico. En determinadas realizaciones, el enlazador peptídico tiene entre 5 y 20 aminoácidos de longitud. En realizaciones más particulares, este enlazador peptídico de unión tiene la secuencia Se Q ID N.° 003.

[0167] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, la proteína de fusión HLA comprende un polipéptido con la secuencia designada SEQ ID N.° 005, y se asocia con un polipéptido p2m. En otras realizaciones, la proteína de fusión HLA comprende adicionalmente una señal secretora aguas arriba de la secuencia SEQ ID N.° 005. En realizaciones particulares, la señal secretora corriente arriba del polipéptido de proteína de fusión HLA es SEQ ID N.° 004. En otras realizaciones, la proteína de fusión HLA consiste esencialmente en una señal secretora de SEQ ID N.° 004, unida a un polipéptido designado SEQ ID N.° 005. En realizaciones más particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, la proteína de fusión HLA consiste esencialmente en la secuencia designada SEQ ID N.° 005 (que comprende un dominio extracelular variante de HLA-B57 fusionado a una IgG4 Fc), y se asocia con un polipéptido p2m.

[0169] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, el polipéptido p2m asociado con la proteína de fusión HLA tiene la secuencia designada SEQ ID N.° 006.

[0171] [0063]En realizaciones alternativas de la composición farmacéutica para uso según la invención, la proteína de fusión HLA comprende un polipéptido de cadena pesada HLA-B57 idéntico a SEQ ID N.° 001, distinto de un único residuo de aminoácido diferente (donde el único residuo de aminoácido diferente no es la posición 46, o 97). En otras palabras, además de una, o en algunos casos, dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones 46, y/o 97, el polipéptido HLA-B57 recombinante según esta realización incluye al menos otra sustitución de aminoácidos en comparación con la molécula HLA-B57 natural de la que se deriva.

[0173] Péptidos estabilizadores y enlazadores

[0175] La porción de fusión HLA de la composición farmacéutica para uso según la invención, comprende un polipéptido estabilizador que confiere estabilidad durante la expresión y purificación. La presencia de la porción estabilizadora de la proteína de fusión HLA aumenta el rendimiento y la solubilidad al reducir la degradación y la oligomerización de la proteína de fusión HLA, y además se asocia con una viabilidad mejorada de las células que expresan la proteína de fusión.

[0177] El polipéptido estabilizador de la proteína de fusión HLA según la invención es un polipéptido Ig Fc humano. Una porción Ig Fc también puede prolongar la semivida invivode una molécula al unirse a receptores de reciclaje. En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, el polipéptido estabilizador es un isotipo IgG Fc. Un dominio peptídico estabilizador de IgG Fc proporciona una ventaja añadida durante la purificación de la proteína de fusión HLA, al permitir la absorción a una superficie recubierta de proteína A o G.

[0179] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, la proteína de fusión HLA comprende un polipéptido IgG4, que es el isotipo deseable en proteínas de fusión terapéuticas debido a su baja citotoxicidad. En realizaciones aún más particulares de la composición farmacéutica para uso según la invención, la proteína de fusión HLA comprende una molécula IgG4 S228P.dk alterada con la secuencia SEQ ID N.° 002. Se caracteriza por una mutación en la región bisagra de la IgG4, donde la prolina (P) se sustituye por serina (S) en la posición 228 del anticuerpo IgG4 original, y dK indica una supresión del último aminoácido lisina (K) en la secuencia IgG4 original. Estos cambios confieren al formato IgG4 estabilidad y menos heterogenicidad. Ambos cambios están bien establecidos y se utilizan habitualmente en diversas construcciones Fc.

[0181] En ciertas realizaciones de la composición farmacéutica para su uso según la invención, la proteína de fusión HLA comprende un polipéptido HLA unido a un polipéptido IgG como parte de una única cadena polipeptídica por un enlazador peptídico, una secuencia corta de aminoácidos de 5, 10, 15, o 20 residuos de longitud.

[0183] En realizaciones particulares, el enlazador peptídico es una secuencia no inmunogénica, como una secuencia rica en residuos de serina y glicina. En realizaciones más particulares, el enlazador peptídico tiene la secuencia SEQ ID N.° 003.

[0185] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para uso en el tratamiento del cáncer, está en el formato de un dímero. Dicho dímero comprende un primer monómero y un segundo monómero, y cada monómero independientemente del otro monómero comprende una proteína de fusión HLA, un polipéptido de dominio extracelular de cadena pesada HLA fusionado a una porción Ig Fc, pudiendo asociarse esta última mediante enlaces disulfuro. Cada monómero según la invención está asociado adicionalmente a un polipéptido B2m.

[0187] Las moléculas HLA naturales expresadas en el retículo endoplásmico de las células humanas se asocian con epítopos peptídicos antes de ser transportadas y desplegadas en la superficie celular. En realizaciones particulares de la composición farmacéutica según la invención, el polipéptido HLA no está asociado con un epítopo peptídico. En otras palabras, el surco de unión al antígeno, o la hendidura de unión al antígeno formada por los dominios alfa 1 y alfa 2 del polipéptido HLA no está unido a un péptido antigénico pequeño. Se cree que la unión del péptido a las moléculas de clase HLA cambia su conformación, lo que puede afectar a las interacciones con socios de unión como LILRB1 y LILRB2. La afinidad de unión y los efectos inmunomoduladores de un polipéptido HLA-B57 asociado con el polipéptido B2m según la invención, no asociado además con un epítopo peptídico se demuestran en las Figuras 3 a 11 de los Ejemplos.

[0189] Dosificación y administración de composiciones farmacéuticas de proteínas de fusión HLA

[0191] La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la enfermedad neoplásica maligna según la presente invención comprende una proteína de fusión HLA asociada con el polipéptido B2m, y se formula típicamente en formas farmacéuticas de dosificación para proporcionar una dosis fácilmente controlable del fármaco y dar al paciente un producto elegante y fácil de manejar. Dicha composición farmacéutica contiene además un portador farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, la composición comprende al menos dos portadores farmacéuticamente aceptables, como los descritos en el presente documento.

[0193] El régimen de dosificación para la composición farmacéutica de la presente invención variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, edad, sexo, salud, condición médica, y peso del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente, y el efecto deseado. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse en una única dosis diaria, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres, o cuatro veces al día.

[0194] Muchos procedimientos y métodos para preparar composiciones farmacéuticas son conocidos en la técnica, véase por ejemplo L. Lachman et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 4th Ed, 2013 (ISBN 8123922892).

[0196] Medicamentos combinados

[0198] Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica (que comprende una proteína de fusión HLA: B2m según el primer aspecto de la invención), formulado para su administración en combinación con un agente inhibidor del punto de control, en el que dicho agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10-7 mol/L o inferior.

[0200] Otro aspecto de la invención es un agente inhibidor del punto de control para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica maligna, formulado para su administración en combinación con la composición farmacéutica que comprende y la proteína de fusión HLA según el primer aspecto de la invención, en el que dicho agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10-7 mol/L o inferior.

[0202] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica, o del agente inhibidor de puntos de control según la invención, el agente inhibidor de puntos de control es capaz de interrumpir la cascada de señalización inhibitoria que limita la activación de células inmunitarias, y en particular la activación de células T.

[0204] En particular, el agente inhibidor del punto de control es un ligando no agonista de CTLA-4, un ligando no agonista de PD-1, un ligando no agonista de PD-L1, o un ligando no agonista de PD-L2, que no conduce a una actividad atenuada de las células T cuando se une a CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2, respectivamente, en la superficie de una célula T. En ciertas realizaciones, el término "ligando no agonista de CTLA-4" o "ligando no agonista de PD-1" abarca tanto a los antagonistas de CTLA-4 o PD-1 como a los ligandos que son neutrales frente a la señalización de CTLA-4 o PD-1. En algunas realizaciones, los ligandos no agonistas de CTLA-4 utilizados en la presente invención son capaces, cuando se unen a CTLA-4, de bloquear estéricamente la interacción de CTLA-4 con sus compañeros de unión CD80 y/o CD86 y los ligandos no agonistas de PD-1 utilizados en la presente invención son capaces, cuando se unen a PD-1, de bloquear estéricamente la interacción de PD-1 con sus compañeros de unión PD-L1 y/o PD-L2.

[0206] En realizaciones particulares, el agente inhibidor del punto de control interrumpe las cascadas de señalización inhibitorias mediante una capacidad para unirse a CTLA-4 con una constante de disociación de al menos, para marcar la menor afinidad expresada en valor K<d>, 10'7 mol/L, o con una unión más fuerte caracterizada por un valor K<d>de al menos 10'8 mol/L, o incluso 10'9 mol/L, lo que resulta en la inhibición de la actividad biológica de su objetivo respectivo. Un ligando no agonista de PD-1 o un ligando no agonista de PD-L1 (PD-L2) en el sentido de la invención se refiere a una molécula que es capaz de unirse a PD-1 (PD-L1, PD-L2) con una constante de disociación de al menos 10'7 mol/L, particularmente 10'8 mol/L o incluso 10'9 mol/L o inferior, y que inhibe la actividad biológica de su diana respectiva.

[0208] En otras realizaciones particulares, el agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo inhibidor del punto de control seleccionado entre los anticuerpos clínicamente disponibles ipilimumab (Bristol-Myers Squibb; CAS N.° 477202 00-9), tremelimumab (CAS 745013-59-6), nivolumab (Bristol-Myers Squibb; CAS N.° 946414-94-4), pidilizumab (CAS N.° 1036730-42-3), atezolizumab (Roche AG; N.° CAS 1380723-44-3), avelumab (Merck KGaA; N.° CAS 1537032-82-8), durvalumab (Astra Zeneca, N.° CAS 1428935-60-7), y cemiplimab (Sanofi Aventis; N.° CAS 1801342-60-8). En realizaciones aún más particulares, el agente inhibidor de puntos de control es pembrolizumab (Merck Inc.; CAS N.° 1374853-91-4).

[0210] En ciertas realizaciones, la terapia combinada comprende dos formas de dosificación distintas, por ejemplo, en las que dicha composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA se proporciona como una forma de dosificación para administración intratumoral, o administración local en las proximidades del tumor, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, o inyección intratumoral en un tumor sólido, y dicho agente inhibidor de puntos de control se proporciona como una forma de dosificación para administración sistémica, en particular mediante inyección intravenosa. Sin embargo, dicho agente inhibidor de puntos de control y dicha composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA también pueden administrarse en dos formas de dosificación similares.

[0212] La administración en combinación, abarca tanto la administración simultánea del agente inhibidor de puntos de control y la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA, o en formulaciones separadas, o la administración de una sustancia inmediatamente antes de, por ejemplo, en la semana anterior a, o como máximo en el mes anterior a, o inmediatamente después de, por ejemplo, en la semana, o como máximo en el mes posterior a, la administración de una segunda sustancia.

[0214] Tratamiento médico, Formas de dosificación, Método de fabricación

[0216] [0082]La composición farmacéutica para su uso según la invención se proporciona para su uso en el tratamiento de diversas formas de cáncer. Los estudios preclínicos sobre otras formas de terapia antineoplásica dirigida a LILBR2 (uno de los varios mecanismos a través de los cuales se prevé que actúe la composición farmacéutica según la invención) han demostrado eficacia en el cáncer renal, y el cáncer de ovario. Actualmente se está investigando la seguridad y tolerabilidad del anticuerpo MK-4830 dirigido contra LILRB2 en un ensayo clínico dirigido contra una amplia gama de cánceres de órganos sólidos (mesotelioma, cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer gástrico), en combinación con quimioterapia (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03564691), todos los cuales los inventores consideran que pueden tratarse eficazmente con una composición farmacéutica según la invención.

[0218] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA, se proporciona para su uso en el tratamiento de un tipo de cáncer líquido o sanguíneo. Los inventores consideran que el agotamiento característico de las células T, y la accesibilidad de las células cancerosas sanguíneas circulantes a las células T, y la activación de macrófagos inducida por las composiciones farmacéuticas según la invención significan que es probable que el tratamiento sea eficaz. En tales realizaciones particulares, la composición farmacéutica se proporciona para su uso en un paciente diagnosticado con leucemia de células T. En otras realizaciones particulares, la composición farmacéutica se proporciona para su uso en un paciente diagnosticado con linfoma, incluyendo, pero no limitado a, linfoma de Burkitt como modelado por células Daudi en los ejemplos. En otras realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona para su uso en un paciente diagnosticado de mieloma múltiple, según el modelo de la línea celular RPMI-8226 (Fig. 4).

[0220] En otras realizaciones particulares, la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA se proporciona para su uso en un paciente diagnosticado con un cáncer sólido, o una metástasis de un cáncer sólido. En algunas realizaciones particulares, la composición farmacéutica es para uso en un paciente diagnosticado con cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, el cáncer de pulmón es una forma de cáncer de pulmón de células no pequeñas. En otras realizaciones particulares, el cáncer de pulmón es una forma de cáncer de pulmón de células pequeñas, o carcinoma. En otras realizaciones particulares, la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA es para su uso en un paciente diagnosticado con una forma de cáncer de mama. En realizaciones más particulares, el cáncer es receptor de estrógenos positivo. En otras realizaciones particulares, el cáncer es receptor de progesterona positivo. En otras realizaciones particulares, el cáncer es positivo para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano.

[0222] En algunas realizaciones particulares, la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión HLA, o el inhibidor del punto de control inmunitario, es para uso en un paciente diagnosticado con cáncer de colon. En realizaciones particulares, el cáncer de colon metastásico.

[0224] En algunas realizaciones de aspectos de la invención relativos a la administración de una composición farmacéutica según la invención en combinación con un agente inhibidor de puntos de control, se proporciona para su uso en una forma de enfermedad maligna, o cáncer, en la que la terapia de inhibición de puntos de control está aprobada para monoterapia, o terapia de combinación. En determinadas realizaciones, el tratamiento combinado se utiliza en un paciente con cáncer de colon, en particular cáncer de colon metastásico. En otras realizaciones particulares, el cáncer es un melanoma. En otras realizaciones particulares, el cáncer es de páncreas. En otras realizaciones particulares, el cáncer es de mama.

[0226] Las formas de dosificación pueden ser para administración parenteral, como formas de inyección subcutánea, intravenosa, intrahepática o intramuscular. Opcionalmente, puede estar presente un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0228] Dondequiera que las alternativas para las características separables solas se presenten aquí como "realizaciones", debe entenderse que tales alternativas se pueden combinar libremente para formar realizaciones discretas de la invención divulgada aquí.

[0230] Descripción de las Figuras

[0232]

[0233] La Fig. 1 muestra propiedades de expresión superiores de la proteína de fusión HLA-B57(A46E/V97R) IgG4. Perfiles de ARN de las proteínas de fusión (A) HLA-B57 IgG4 y (B) p2m indicadas expresadas a partir de vectores dentro de clones de células CHO. Expresión de la proteína de fusión a partir de clones transfectados con HLA B57.p2m (DGC8-T39, DGC8-T64 y DGC8-73) y HLA-B57<A46E/V97R>.p2m (DGC8-T54, DGC8-T75 y DGC8-91) sobre la base de la viabilidad celular (C) y los títulos de proteína expresada (D). En la tabla se resume el rendimiento en las diferentes proporciones de transfección probadas.

[0234] La Fig. 2 muestra los perfiles de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de las construcciones (A) HLA-B57 y (B) HLA-B57(A46E/V97R) purificadas en tres etapas. A partir del sobrenadante A de CHO la purificación por afinidad B dos métodos divergen. La purificación se realiza con una etapa adicional para la eliminación de B2m, seguido de SEC C, y la purificación de HLA-B57 asociado a B2m se realiza mediante SEC D directo. La tabla resumida insertada (abajo) demuestra el rendimiento de los compuestos purificados a partir de ambas construcciones. HLA-B57.p2m tiene una cantidad elevada de especies de alto peso molecular (HMW) y también de especies de bajo peso molecular (LMW), con un contenido reducido de monómeros, mientras que HLA-B57(A46E/V97R).p2m tiene una cantidad significativamente reducida de HMW, LWM y un contenido elevado de monómeros. (C) muestra los rendimientos de proteína recombinante a partir de fusiones IgG Fc de las estructuras de tipo salvaje y variante HLA-A30, B57, B58 y C08 indicadas con las sustituciones de aminoácidos indicadas en las posiciones 46 y 97. Se transfectaron transitoriamente células CHO con 2 construcciones vectoriales de: a) moléculas HLA de fusión Fc y b) p2m humana, en una proporción 1:1. Los títulos de proteínas expresadas se cuantificaron mediante el sistema Octet Red96 (Sartorius) utilizando biosensores de proteína A.

[0235] La Fig. 3 (A) muestra la estimación cuantitativa de las afinidades de unión de LILRB2 con HLA-B57 no asociado a p2m, HLA-B57(A46E/V97R) no asociado a p2m y HLA-B57(A46E/V97R>.p2m medida mediante ELISA. El HLA-B57 no asociado ap2m tiene una EC50 de 21 nM, la Ec 50 del HLA-B57(A46E/V97R) no asociado ap2m de 8,3 nM, y la EC50 del HLA-B57(A46E/V97R).p2m es de 5,72 nM, lo que demuestra que las sustituciones de aminoácidos no reducen la unión de la cadena pesada del HLA-B57 a LILRB2. (B) Estimación cuantitativa de las afinidades de unión de LILRB2 con HLA-B57<A46E/V97R) no asociado a p2m (Kd=20,3 nM) y HLA-B57<A46E/V97R>.p2m (Kd=2,3 nM) medidas por interferometría de biocapa (BLI), confirmando una mejor unión del B57(A46E/V97R).p2m asociado a p2m.

[0236] La Fig. 4 muestra la fagocitosis inducida por HLA-B57(A46E, V97R) con o sin p2m de células cancerosas líquidas y sólidas por macrófagos primarios humanos. Las líneas celulares cancerosas derivadas de los tumores líquidos y sólidos indicados se co-cultivaron con macrófagos primarios humanos, y la fagocitosis de células tumorales se midió durante 36 horas utilizando el sistema de imagen de células vivas IncuCyte. Los experimentos se repitieron utilizando al menos 2 muestras biológicamente independientes. Barras de error, SEM de n = 2 réplicas biológicas con 2 réplicas técnicas cada una. El análisis estadístico se realizó mediante la comparación múltiple ANOVA de 2 vías, seguida del análisis post-hoc de Dunnett **p< 0,01, ***p< 0,001, ****p< 0,0001.

[0237] La Fig. 5 muestra que la monoterapia con HLA-B57(A46E, V97R) con y sinB2m (etiquetados como B57 y B57.B2m respectivamente) reduce el crecimiento tumoral, y el HLA-B57(A46E V97R).B2m aumenta la supervivencia en ratones BRGSF-HIS humanizados PDX de cáncer de pulmón. A. Crecimiento tumoral relativo (tiempo de duplicación del tumor) y (B) supervivencia tras monoterapia HLA-B57(A46E, V97R) con y sin p2m. Se realizaron inyecciones I.p cada 5 días hasta el final del estudio; concentración de los compuestos inyectados: isotipo IgG4 (10 mg/kg), HLA-B57(A46E, V97R) no asociado a p2m (10 mg/kg), y HLA-B57(A46E, V97R).p2m (10mg/kg); n = 6. Los datos de A se representan como cajas y bigotes que muestran todos los puntos del mínimo al máximo. El análisis estadístico para A se realizó mediante comparación múltiple ANOVA de 2 vías (modelo de efectos mixtos), seguido del análisis post-hoc de Tukey donde *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, ****p< 0,0001; El análisis estadístico para la supervivencia B se realizó mediante una prueba Log-rank (Mantel-Cox).

[0238] La Fig. 6 muestra el análisis de las citocinas indicadas en la sangre de los ratones BRGSF-HIS tratados con cáncer de pulmón PDX humanizado de la Fig. 5, medidas mediante el inmunoensayo de citocinas multiplexado V-Plex. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional ordinario seguido de análisis post-hoc de Fischer *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, ****p< 0,0001.

[0239] La Fig. 7muestra que la monoterapia y la terapia combinada con inhibidores del punto de control anti-PD-1 y (A) HLA no asociado a p2m (HLA-B57(A46E/V97R)) y (<b>) HLA asociado a p2m (HLA-B57(A46E/V97R).p2m) reduce el tamaño de los tumores en el modelo murino C38 de carcinoma de colon singénico. Media (superior) del volumen tumoral en mm3 de los grupos tratados indicados e (inferior) gráfico de araña que muestra los animales individuales y la respuesta al tratamiento de cada grupo. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizaron mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. La Fig. 8 muestra HLA-B57(A46E, V97R).p2m (marcado iosH2) se une a LILRB1 y LILRB2, y bloquea las interacciones con ligandos naturales. (A) iosH2 se une a LILRB1 humano y bloquea competitivamente la interacción con HLA-G. (B) iosH2 se une a LILRB2 humano y bloquea competitivamente la interacción con HLA-G (de producción propia), ANGPTL2 (R&D systems, 9795-AN) y ANGPTL7 (R&D systems, 914-AN).

[0240] La Fig. 9 muestra HLA-B57(A46E, V97R).p2m (marcado con iosH2) potencia la fagocitosis mediada por macrófagos primarios de líneas celulares derivadas de tumores sólidos y líquidos. Las líneas celulares cancerosas derivadas de diversas indicaciones (pulmón-H69, leucemia-Jurkat, páncreas-MIA PaCa2, pulmón-H460, mieloma-RPMI8226, linfoma-Daudi) se co-cultivaron con macrófagos primarios humanos y la fagocitosis se midió mediante el sistema de imagen de células vivas IncuCyte. La fagocitosis se comparó con (A) LILRB1 (Biolegend; Cat.#333722), LILRB2 (MK4830, US2018/0298096A1, ClinicalTrials.gov identificador NCT03564691), anticuerpos monoclonales y (B) contra proteínas de fusión Fc Trillium SIRPa (TTI 621 (Lin G. PLos One 2017 12(10):e0187626) y TTI 622 (ClinicalTrials.gov identificador NCT03530683)).

[0241] La Fig. 10 muestra HLA-B57(A46E, V97R).p2m (marcado con iosH2) aumenta la actividad de destrucción de células T humanas primarias, como monoterapia y terapia combinada con PD-1. Se incubaron células T primarias humanas con (A,B) células cancerosas de AML (THP1) y (C,D) células cancerosas de colon (HCT116), en forma de contacto celular a 2 E:T diferentes (Células efectoras: Células diana) en proporciones de 1:1 y 5:1, tratadas con compuestos y el porcentaje de destrucción de células cancerosas se midió mediante el sistema IncuCyte live.

[0242] La Fig. 11 muestra HLA-B57(A46E, V97R). p2m (iosH2 marcado) aumenta el potencial de destrucción de las células NK. (A) Se incubaron células NK primarias humanas aisladas con diferentes líneas celulares cancerosas, se trataron con compuestos y se midió el porcentaje de destrucción de células cancerosas mediante el sistema IncuCyte live. (B) Se seleccionaron células NK primarias humanas en busca de la población KIR3DL1-positiva y se repitieron los mismos experimentos que en (A).

[0244] Ejemplos

[0246] Ejemplo 1. Generación de grupos de clones

[0248] [0090]Una primera proteína de fusión HLA para uso médico en humanos fue desarrollada por los inventores uniendo el dominio extracelular de cadena pesada del polipéptido HLA-B57:01:01 a un polipéptido IgG4 Fc (SEQ ID N.° 002) para proporcionar una proteína de fusión HLA de SEQ ID N.° 008. Para aumentar el rendimiento de esta proteína de fusión HLA, los aminoácidos inhibidores identificados en la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular natural HLA-B57 se alteraron mediante la sustitución de un residuo de alanina (A) en la posición 46 por glutamina (E), y de una valina (V) en la posición 97 por una arginina (R), proporcionando una variante del polipéptido HLA-B57 (SEQ iD N.° 001). Ésta se fusionó con el polipéptido IgG4 (SEQ iD N.° 002) a través de un péptido de enlace (SEQ ID N.° 003), para proporcionar una variante de la proteína de fusión HLA-B57 (SEQ ID N.° 005). El ADNc que codifica la proteína de fusión HLA-B57(A46E/V97R) recombinante y el control de la proteína de fusión natural derivada de HLA-B57, carente de las dos mutaciones, se clonaron en vectores de expresión comerciales (Probiogen) corriente abajo de una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de secreción (SEQ ID N.° 004). Las construcciones vectoriales que expresan HLA-B57-Fc y HLA-B57(A46E/V97R)- Fc se co-transfectaron en células de ovario de hámster chino (CHO) junto con un plásmido que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína p2m (SEQ N.° 006) mediante microporación (MP) utilizando el kit de transfección NEON (Life Technologies #MPK10096). Las células madre CHO-DG44 se transfectaron en diferentes proporciones de proteína de fusión HLA y plásmido p2m (4:1, 2:1, 1:1, 1:2). Los grupos de clones seleccionados se cultivaron en matraces agitadores estandarizados y con una densidad de siembra celular definida de 4E5 vc/mL en 125 mL de medio suplementado con PBG-CD-C4 que incluía puromicina y metotrexato. Tras una presión de selección ajustada con antibióticos, se seleccionaron grupos de clones individuales para su análisis. La medición de la viabilidad y de la densidad de células viables se realizó mediante el sistema Vi-CELL XR, y el método de exclusión celular con azul Trypan. Las cuantificaciones de títulos se midieron en diferentes puntos temporales (días) utilizando una máquina Octet RED (ForteBio, una división de Pall) con biosensores de proteína A.

[0250] Ejemplo 2. Purificación de HLA-B57(A46BV97R)fi2m y procedimiento de eliminación p2m

[0252] Se confirmaron niveles equimolares de ARN de las proteínas de fusión HLA-B57 natural o HLA-B57(A46E/V97R) alterada en relación con p2m en clones celulares seleccionados (Fig. 1A). El análisis de los clones que expresan la proteína de fusión HLA-B57 o la variante demostró que la viabilidad celular y los títulos de HLA-B57.p2m son significativamente inferiores a los de HLA-B57(A46E/V97R).p2m (Fig 1B y C). El análisis por HPLC de las proteínas recogidas de los sobrenadantes de cada una de ellas demuestra que HLA-B57.p2m tiene una gran cantidad de especies de alto peso molecular (HMW) y también de bajo peso molecular (LMW), con un contenido reducido de monómeros, mientras que HLA-B57(A46E/V97R).p2m tiene un contenido significativamente reducido de HMW, LMW y monómeros altos (Fig 2A y B), lo que demuestra la mayor estabilidad de la cadena pesada HLA variante.

[0254] A continuación, el complejo HLA-B57(A46E/V97R).p2m se aisló de sobrenadantes de células CHO filtrados mediante purificación en columna de afinidad. La purificación de las proteínas y la eliminación de p2m en condiciones ácidas se realizó como un protocolo de purificación en dos etapas. Como primera etapa, se utilizaron microesferas de sefarosa de proteína G [(4 Fast Flow) Sigma, #GE-17-0618-01)] para capturar HLA-B57(A46E/V97R) asociado a p2m a partir de sobrenadantes. Tras una incubación de una noche a 4 grados sobre un balancín, las microesferas recuperadas se lavaron en PBS y, posteriormente, las proteínas de fusión HLA-B57(A46E/V97R ) se eluyeron utilizando tampón de elución de IgG estándar (pH 2,8) (Pierce™ IgG Elution Buffer, Thermo Fischer #21004). Se realizó una segunda etapa de purificación basada en cromatografía de exclusión por tamaño para separar HLA-B57(A46E/V97R) de p2m en condiciones ácidas, con el fin de obtener una proteína de fusión HLA no asociada a p2m. Para la separación se utilizó una columna de filtración en gel Superdex 10/300, preequilibrada en citrato de sodio (100 mM, pH 3,0). Se aplicó una inyección de 0,5 ml de la proteína a una concentración de 2,0 mg/ml, y el pico deseado de proteína HLA-B57(A46E/V97R). no asociada a p2m eluyó a 12,7 ml y el pico para p2m eluyó a 22,0 ml. La Fig. 2 muestra los rendimientos de varias etapas del proceso descrito anteriormente, indicando que la separación de p2m para producir una proteína de fusión HLA no asociada a p2m da lugar a una pérdida de aproximadamente el 50% de la proteína de fusión inmunomoduladora HLA-B57(A46E/V97R).

[0256] Para confirmar la importancia de los residuos 46E y 97R para la expresión recombinante óptima de varias cadenas pesadas HLA de clase I asociadas con diferentes fenotipos inmunitarios en la población humana, los inventores midieron el impacto de estas sustituciones de aminoácidos en construcciones adicionales de proteína de fusión IgG Fc que comprendían otras secuencias representativas de polipéptidos de cadenas pesadas HLA de clase I asociadas con efectos inmunogénicos en la población humana, HLA-A30, HLA-B58, y HLA-C08 (Fig. 2C). Utilizando el mismo proceso que para las proteínas de fusión HLA-B57 IgG4, se crearon vectores de expresión de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión HLA clase I de cadenas pesadas IgG4 inmunogénicas alternativas: HLA-A30, A*30:01:01:01 (SEQ ID N.° 007), HLA-B57 B*57:01:01:01 (SEQ ID N.° 008), HLA-B58, B*58:01:01:01 (SEQ ID N.° 009), y HLA-C08, C*08:02:01:01 (SEQ ID N.° 010). A continuación, se crearon construcciones modificadas introduciendo para medir el impacto las sustituciones de aminoácidos añadiendo, o eliminando un residuo de aminoácido E46, o un residuo R97 en la porción del dominio extracelular de la cadena pesada HLA de cada proteína de fusión HLA-Fc como sigue: HLA-A30E46A (SEQ ID N.° 011), HLA-A30I97R (SEQ ID N.° 012), HLA- A30E46A/I97R (SEQ ID N.° 013), HLA-B57A46E (SEQ ID N.° 014), HLA-B57V97R (SEQ ID N.° 015), HLA-B57A46E/V97R (SEQ ID N.° 005), HLA-B58E46A (SEQ ID N.° 016), HLA-B58R97V (SEQ ID N.° 017), HLA-B58E46A/R97V (SEQ ID N.° 018), HLA-C08E46A (SEQ ID N.° 019), HLA-C08R97V (SEQ ID N.° 020), HLA-C08E46A/R97V (SEQ ID N.° 021). El rendimiento de producción de constructos HLA asociados a p2m expresados recombinantemente por células CHO transfectadas transitoriamente con vectores de expresión de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión IgG4 de cadenas pesadas HLA de tipo salvaje y variante y p2m, se evaluó en el sobrenadante de células CHO utilizando biosensores de proteína A (sistema Octet Red96, Sartorius).

[0258] [0094]Estos resultados confirmaron que en todas las moléculas probadas, las cadenas pesadas HLA caracterizadas tanto por residuos de aminoácidos 46E como 97R se asociaron con rendimientos óptimos de proteínas recombinantes, y que la introducción tanto de una sustitución A46E como V97R en la secuencia de la cadena pesada HLA-B57 logró el rendimiento más alto entre todas las construcciones. Por el contrario, la introducción tanto de 46A como de 97V presentes en HLA-B57 de tipo salvaje en HLA-A30, HLA-B58, o HLA-C08 redujo significativamente los rendimientos de productividad, confirmando que los aminoácidos 46E y 97R son clave para la estabilización y producción de títulos óptimos de cadenas pesadas HLA, incluyendo una variedad de moléculas HLA-Fc asociadas con p2m.

[0260] Ejemplo 3. Cuantificación de la interacción de LILRB2 con HLA-857(A46E/V97R) y HLA-B57(A46E/V97R) con o sin p2m.

[0262] Teniendo en cuenta la gran pérdida de rendimiento que acompaña a la purificación del HLA en relación con su HLA parental todavía asociado con el polipéptido p2m, los inventores pasaron a diseccionar las propiedades inmunológicas más relevantes para la inmunidad tumoral asociadas con cada formato HLA-B57(A46E/V97R). Como primera etapa, se examinó el impacto de la eliminación de p2m on de una proteína de fusión HLA-B57 IgG4 sobre la unión al receptor inmunitario innato LILRB2.

[0264] La cuantificación de la afinidad de interacción de LILRB2 con HLA-B57 no asociado a p2m y HLA-B57(A46E/V97R), y HLA-B57(A46E/V97R).p2m se midió utilizando el método de ensayo inmunoenzimático (ELISA). Se recubrieron placas de fondo plano Pierce™ Streptavidin coated high binding capacity de 96 pocillos (Pierce #15500) con 50 pl de moléculas de antígeno c-terminalmente biotiniladas (LILRB2, BPS Bioscience #100335) inmovilizadas a una concentración final de 5 pg/ml en tampón PBS. Como controles negativos se utilizaron PBS e IgG isotipo. Una dilución en serie de HLA-B57 no asociado ap2m y HLA-B57(A46E/V97R), y HLA-B57(A46E/V97R).p2m (ocho puntos de concentración: 10, 2,5, 1, 0,25, 0,1, 0,025, 0,01, 0,0025 pg/ml) se aplicó (50 pl) por duplicado. Para la detección se utilizó un anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado con APC (Jackson Immuno Research #109-135-098) con dilución 1:100 en TBS (50 pl). Por último, se añadieron 50 pl de TBS en cada pocillo y se realizó un barrido de fluorescencia con longitudes de onda de excitación y emisión APC de 650 nm y 660 nm, respectivamente. Se utilizó Graphpad Prism v9.1.2 y el modelo log (agonista) vs. respuesta basado en tres parámetros para determinar la EC50 de la interacción con LILRB2 (Fig. 3A).

[0266] La unión de HLA-B57(A46E/V97R) no asociado a p2m, y HLA-B57(A46E/V97R).p2 también se evaluó mediante interferometría de biocapa (BLI). Se utilizó la tecnología de interferometría de biocapa (BLI) basada en Octet Red 96e (Sartorius) para la cuantificación de las afinidades de unión de las proteínas de fusión HLA con LILRB2 y para los experimentos de bloqueo utilizando HLA-G y ANGPTL2/7. La proteína LILRB2 biotinilada (BPS Bioscience) se inmovilizó en biosensores de estreptavidina (SAXS). Los biosensores se incubaron con concentraciones crecientes (500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,6 y 7,8nM) del HLA-B57<A46E/V97R> no asociado a p2m y (105, 52,5, 26,3, 13,2 y 6,6nM) de HLA-B57(A46E/V97R):p2m y se registraron los sensogramas de interacción y referencia (Fig. 3B). Para los experimentos de bloqueo se incubaron sensores LILRB2 biotinilados con concentraciones de 1 o 4 pM de HLA-B57(A46E/V97R):p2m, seguidos de concentraciones crecientes de HLA-G (3750 a 12,5 nM), o ANGTPL2 y ANGPTL7 (100 a 1,56 nM) (Fig. 8). El análisis de datos, la sustracción de doble referencia y la cuantificación de las afinidades de unión y los parámetros cinéticos se determinaron utilizando el paquete de software Data Analysis HT 12.0.2.59 y los datos se ajustaron localmente utilizando un modelo de analito bivalente (modelo 2:1) para la reacción ligando-analito.

[0268] En conjunto, los ensayos de unión demostraron una mejor unión de las proteínas de fusión HLA variantes a LILRB2, como HLA que carece de asociación con p2m, y particularmente cuando se asocia con p2m, lo que sugiere que la cadena pesada HLA variante HLA-B57(A46E/V97R) tiene un alto potencial inmunomodulador (Fig. 3 y Fig. 8).

[0270] Ejemplo 4. Mayor destrucción de células tumorales in vitro

[0272] A continuación, se evaluó la capacidad del polipéptido p2m para influir en la inducción por la proteína de fusión HLA-B57(A46E, V97R) IgG4 de la fagocitosis de células tumorales por macrófagos primarios humanos hacia células cancerosas líquidas (linfoma, leucemia y mieloma) y sólidas (cáncer de mama y pulmón). Las líneas celulares cancerosas derivadas de los tumores líquidos y sólidos indicados se co-cultivaron con macrófagos primarios humanos, y la fagocitosis de las células tumorales se monitorizó según las instrucciones del fabricante durante 36 horas utilizando el sistema de imagen de células vivas IncuCyte. Se aislaron monocitos humanos primarios derivados de donantes a partir de PBMC de donantes sanos y se diferenciaron en macrófagos mediante 5-7 días de cultivo en un medio de cultivo específico para macrófagos. El día 1 después de la siembra, se añadieron compuestos a los pocillos a 10ug/ml (controles de isotipo) o 20ug/ml (proteína de fusión HLA). El día 5-7 después de la siembra, se añadieron de nuevo los compuestos a los macrófagos y se realizaron dos experimentos posteriores para determinar el potencial de fagocitosis de los macrófagos mediante imágenes de células vivas.

[0274] [0101]Las células cancerosas se tiñeron con CellTrace™ CFSE (ThermoFisher) siguiendo las instrucciones del fabricante y posteriormente se sembraron 1000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano (Greiner) junto con 1000 5000 células T primarias. Los medios contenían 250nM de Cytotox Red (Sartorius). Las imágenes de células vivas se realizaron utilizando el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 (Sartorius). Se analizaron 4 imágenes no adyacentes por pocillo con el software Incucyte v2020C. La señal CFSe se segmentó en objetos verdes, y cada objeto se contó como célula cancerosa. Las células muertas se identificaron con la señal Cytotox segmentada en objetos rojos. La muerte de las células cancerosas se detectó mediante la colocalización de objetos verdes y rojos. Los resultados demuestran que el HLA-B57(A46E, V97R).B2m aumenta la actividad de fagocitosis de los macrófagos contra las células cancerosas, mientras que el HLA-B57(A46E’ V97R) carente de p2m muestra una actividad ligeramente reducida (Fig 4).

[0275] Ejemplo 5 inmunomodulación del crecimiento tumoral in vivo

[0277] Los HLA-B57(A46E, V97R) y HLA-B57(A46E, V97R).B2m no asociados ap2m se evaluaron a continuación para determinar su impacto en el crecimiento tumoralin vivoen ratones BRGSF-HIS (Rag2'/‘, IL-2Ry_/', Flk2-/-, portadores de una mutación SIRPa específica de NOD que inhibe los macrófagos endógenos murinos). Estos receptores fueron humanizados con la inyección intrahepática de células CD34+ purificadas derivadas de sangre de cordón umbilical humano, e implantadas con células de cáncer de pulmón xenoinjertadas derivadas de pacientes (PDX). Estos ratones comprenden todos los principales subconjuntos de células inmunitarias humanas, incluidas las células T y B, las células NK, y las células mieloides. Los tumores de cáncer de pulmón de células no pequeñas utilizados para el xenoinjerto se evaluaron para determinar la expresión de la proteína de fusión HLA diana LILRB2 tras el trasplante en el pulmón utilizando un anticuerpo inmunohistoquímico disponible en el mercado, y se confirmó la expresión positiva tras el injerto, lo que demuestra que se trata de un modelo eficaz para evaluar los efectos inmunomoduladores mediados por LILRB2 humano.

[0279] Los fragmentos tumorales de NSCLC LU6425 Lung PDX se obtuvieron congelados de la colección HuPrime® PDX de CrownBio. El tumor LU6425 procede de una mujer occidental de 69 años. Diagnóstico patológico: adenocarcinoma de pulmón. Se obtuvieron 18 ratones humanizados BRGSF-HIS para los estudios de eficacia, la humanización se realizó con 6 donantes CD34+ de HSC diferentes, con un engraftment de corte de >30% de células CD45+ humanas (Genoway). Los tumores LU6425 PDX se expandieron en ratones BRGSF, los fragmentos PDX se almacenan congelados en RPMI1640:FBS:DMSO (6:3:1) en nitrógeno líquido hasta su uso. Los fragmentos se descongelaron a 37°C durante 5 min, se enjuagaron dos veces en medio de cultivo RPMI 1640 (ref. L0500-500, Dutscher o equivalente). A diez (10) ratones BRGSF hembra se les implantaron fragmentos tumorales LU6425 por vía subcutánea en el flanco izquierdo. Cuando los volúmenes tumorales de los ratones de la fase de amplificación in vivo alcanzaron los 500-1000 mm3 se extirparon quirúrgicamente y se implantaron por vía subcutánea fragmentos tumorales (2-3mm3) en el flanco izquierdo de dieciocho (18) ratones BRGSF-HIS hembra. El día de la implantación del tumor se considera el día 0 (D0). Una vez establecidos los tumores, los ratones recibieron 4 inyecciones intraperitoneales de ligando Flt3 (10 |jg por inyección) durante 7 días. En este protocolo, el ligando Flt3 expande la población de células mieloides. Las inyecciones de Flt3 se iniciaron 1 día antes del comienzo del tratamiento, cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de ~30- 250mm3. Se asignaron 6 ratones a cada uno de los grupos de tratamiento IgG4 isotipo control, HLA-B57(A46E, V97R) no asociado a p2m o HLA-B57(A46E, V97R).p2m con un volumen tumoral medio uniforme entre los grupos. El tratamiento se administró mediante inyección en la cavidad peritoneal (IP). El volumen de administración fue de 10 mL/kg ajustado al peso corporal individual más reciente. Los ratones fueron eutanasiados a un volumen tumoral de corte. El bienestar de los animales para este estudio se ajusta a la Ley de Procedimientos Científicos con Animales del Reino Unido de 1986 (ASPA), en consonancia con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Todos los procedimientos experimentales de gestión de datos y elaboración de informes se ajustaron estrictamente a las directrices y procedimientos normalizados de trabajo de Crown Bioscience UK.

[0281] Ambos compuestos de proteína de fusión HLA se inyectaron por vía intraperitoneal cada cinco días durante la duración del experimento. El crecimiento tumoral relativo (tiempo de duplicación) se redujo significativamente tanto con HLA-B57(A46E, V97R) no asociado a p2m como con HLA-B57(A46E, V97R) p2m en monoterapia (Fig. 5A). Sin embargo, la monoterapia con HLA-B57(A46E, V97R).p2m también prolongó significativamente la supervivencia de los ratones tratados frente a los controles en este modelo de cáncer altamente relevante para la inmunoterapia humana (Fig. 5B). La concentración de citoquinas en el plasma de ratones BRGSF-HIS humanizados con cáncer de pulmón PDX tratados se recogió en la fase terminal y, a continuación, se evaluó mediante un V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human MSD (MSD). HLA-B57(A46E, V97R). p2m moduló significativamente varias citocinas sanguíneas tras la terapia en ratones, mientras que la monoterapia con HLA-B57(A46E, V97R) no asociada a p2m alteró únicamente los niveles de IL-10 en comparación con el grupo tratado con IgG4 de control, lo que confirma que una proteína de fusión HLA asociada a p2m fue un inmunomodulador más potente en este modelo de cáncer (Fig. 6).

[0283] Ejemplo 6 Combinación con inhibidores de puntos de control

[0285] Ambos compuestos de proteína de fusión HLA con o sin p2m asociado se probaron a continuación para determinar su capacidad de complementar la terapia inhibidora del punto de control con un anticuerpo neutralizante PD-1. Se inyectaron fragmentos tumorales C38 por vía subcutánea en los flancos derechos de ratones C57BL/6 hembra singénicos. Una vez que el tumor alcanzó ±50 mm3, los animales se distribuyeron equitativamente entre grupos con un tamaño medio del volumen tumoral equivalente. Los diámetros tumorales se midieron con un calibrador a lo largo del estudio, y el volumen se calculó según la fórmula D/2^d2, donde D y d corresponden al diámetro más largo y más corto del tumor en mm, respectivamente. El diseño experimental de los puntos temporales de inyección de células e inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo IgG4 (10mg/Kg) quincenal x 3; HLA-B57(A46E/V97R) no asociado a p2m (5 mg/Kg) quincenal x 3; HLA-B57(A46E/V97R).p2m (5 mg/kg) quincenal x 2. Algunos grupos recibieron tratamiento combinado simultáneo con inyecciones de 10mg/kg de anti-PD-1 (RMP1-14). En este modelo murino, ambos compuestos proporcionaron alguna ventaja para contrarrestar el crecimiento tumoral, sin embargo las composiciones farmacéuticas que comprenden proteína de fusión HLA asociada a p2m controlaron más eficazmente el crecimiento tumoral en combinación con un anticuerpo antiPD-1 en todos los animales del grupo, mientras que se observó un único caso de escape y crecimiento tumoral en el grupo equivalente de proteína de fusión HLA no asociada a p2m (Fig. 7).

[0286] Ejemplo 7 Mecanismos de la actividad antitumoral de HLA-B57(A46BV97R).p2m

[0288] HLA-B57 tiene la capacidad de unirse a múltiples moléculas inmunes inhibidoras, incluyendo LILRB1, LILRB2 y KIR3DL1. LILRB1/2 y KIR3DL1 se expresan en diversos conjuntos de células inmunitarias, incluyendo la expresión de LILRB1 en células mieloides (p. ej. macrófagos), células T, células NK, células B, y tumores, la expresión de LILRB2 en células mieloides (por ejemplo, macrófagos), células T y tumores, y la expresión de KIR3DL1 en células NK, donde se cree que la unión con ligandos celulares como HLA-G o moléculas de la familia MHC expresadas por células tumorales, o factores inhibidores solubles como proteínas similares a la angiopoyetina (ANGPTL) inhibe la función citolítica. Se cree que la ligadura de LILRB1/2 expresada por los macrófagos impulsa la diferenciación de subconjuntos de células mieloides supresoras, como los macrófagos M2 y las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), ambas asociadas a un crecimiento permisivo de las células tumorales.

[0290] Los inventores investigaron si HLA-B57(A46E/V97R).p2m actúa por inhibición multimodal de los receptores LILRB1, LILRB2 y KIR3DL1. La unión de HLA-B57(A46E/V97R>.p2m (losH2) a LILRB1, LILRB2 y KIR3DL1 se confirmó mediante interferometría de bicapa. La reducción de la fosforilación de SHP1 y SHP2 tras la exposición de macrófagos humanos primarios a HLA-B57(A46E/V97R).p2m sugiere que actúa como antagonista de la regulación negativa de la respuesta inmunitaria a través de estas moléculas. A continuación, se evaluó la capacidad de HLA-B57(A46E/V97R).p2m para bloquear la unión de LILRB1/2 con varios ligandos naturales. De hecho, HLA-B57(A46E/V97R).p2m (iosH2) bloqueó competitivamente la interacción de LILRB1 con HLA-G, así como la de LILRB2 con HLA-G, ANGPTL2, y ANGPTL7 (Fig. 8).

[0292] A continuación, los investigadores evaluaron si HLA-B57(A46E/V97R).p2m podía aumentar la capacidad de los macrófagos humanos primarios para fagocitar células tumorales. HLA-B57(A46E/V97R).p2m indujo una fagocitosis superior del cáncer de pulmón, el cáncer de sangre (mieloma o leucemia) y el cáncer de páncreas en comparación con las moléculas existentes dirigidas al punto de control de macrófagos, como los anticuerpos monoclonales dirigidos a LILRB1 o 2 (Fig. 9A), o las construcciones de proteína de fusión IgFc de proteína reguladora de señal alfa (SIRPa) (Fig. 9B). Además, HLA-B57(A46E/V97R).p2m aumentó la actividad de eliminación de células tumorales de células T humanas primarias, como agente único o como terapia combinada con la inhibición del punto de control anti-PD-1 (Figura 10), induciendo una mejor eliminación de tumores incluso en proporciones muy bajas de células efectoras frente a células diana en comparación con el anticuerpo monoclonal anti-LILRB2. Por último, se evaluó la capacidad del constructo para influir en las células NK. Se demostró que HLA-B57(A46E/V97R).p2m aumentaba el potencial letal de las células NK en mayor medida que los anticuerpos monoclonales específicos para LILRB1 o 2 (Fig. 11A). El efecto fue mayor en un cultivo de células NK KIR3DL1+ seleccionadas en comparación con el total de células NK, lo que sugiere que la unión de HLA-B57(A46E/V97R).p2m a KIR3DL1 desempeñó un papel en esta mayor destrucción tumoral (Fig. 11B).

[0294] Resumen

[0296] Inesperadamente, los datos demostraron que una proteína de fusión HLA-B57(A46/V97) IgG4 era eficaz para impedir el crecimiento tumoral in vivo con o sin la presencia de p2m. Según el conocimiento del inventor, esta es la primera vez que se ha examinado la utilidad de la asociación de p2m con proteínas de fusión HLA humanas en modelos exhaustivos que examinan las células linfoides y mieloides humanas que son un objetivo importante para la función de la proteína de fusión HLA tantoin vitrocomoin vivo.Como las proteínas de fusión de cadena pesada HLA tienen rendimientos considerablemente más altos debido al proceso de producción más corto (Fig. 2), estos hallazgos sugieren que puede ser deseable utilizar la composición farmacéutica que comprende una molécula HLA y una molécula p2m según la invención en entornos terapéuticos antineoplásicos incluyendo, pero sin limitarse a cánceres epiteliales como cáncer de pulmón, cáncer de colon, y cáncer de mama, y neoplasias malignas de células sanguíneas como mieloma, linfoma, y leucemia. Las investigaciones mecanísticas sugieren que la capacidad de HLA-B57(A46E/V97R).p2m para antagonizar múltiples vías inhibidoras en macrófagos, células T y células NK subyace a su profunda actividad antitumoral en comparación con los agentes existentes que se dirigen a vías inmunitarias inhibidoras únicas.

[0298] Citaciones:

[0300]

[0301] Arosa et al. Trends in Immunology 2007 Mar; 28(3):115-23

[0302] WO 2017153438 A1; WO2016124661A1; WO2018029284 A1.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, dicha composición que comprende:

a. una proteína de fusión HLA que comprende:

i. un polipéptido de cadena pesada de antígeno leucocitario humano (HLA) seleccionado entre:

un dominio extracelular de una cadena pesada HLA, en particular una cadena pesada HLA seleccionada entre HLA-B57, HLA-C08, HLA-A25, HLA-B58, HLA-B27, HLA-A30, HLA-B53 o HLA-C12; o

una variante de dicho dominio extracelular de una cadena pesada HLA, en la que dicha variante se caracteriza por una similitud de secuencia de al menos (>) 95%, y una actividad biológica similar, en comparación con el respectivo dominio extracelular de la cadena pesada HLA;

ii. un polipéptido de fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Ig Fc); y

b. un polipéptido de microglobulina beta 2 (B2m).

2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión HLA está asociada de forma no covalente con el polipéptido B2m.

3. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína de fusión HLA está asociada de forma no covalente con el polipéptido B2m en una proporción de entre 3:5 y 7:5.

4. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido de cadena pesada HLA es una variante del dominio extracelular de HLA-B57, y en la que el polipéptido de cadena pesada HLA se caracteriza por una E en la posición 46, y una R en la posición 97.

5. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido de cadena pesada HLA comprende, o consiste esencialmente en, la secuencia SEQ ID N.° 001.

6. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína de fusión HLA comprende:

a. el polipéptido de cadena pesada del HLA especificado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y b. un polipéptido IgG Fc; y opcionalmente

c. un enlazador peptídico que conecta el polipéptido de cadena pesada HLA al polipéptido IgG Fc;

y en el que opcionalmente, la proteína de fusión HLA comprende además:

d. una señal secretora.

7. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido de cadena pesada HLA se sitúa N-terminal con respecto al polipéptido Fc IgG.

8. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la proteína de fusión HLA comprende, o consiste esencialmente, en la secuencia designada SEQ ID N.° 005.

9. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la proteína de fusión HLA está en forma de dímero, dicho dímero comprende, o consiste esencialmente en un primer monómero HLA y un segundo monómero HLA;

- donde el primer monómero HLA consiste esencialmente en una primera proteína de fusión HLA como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un primer polipéptido B2m; y

- donde el segundo monómero HLA consiste esencialmente en una segunda proteína de fusión HLA como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un segundo polipéptido B2m.

10. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la proteína de fusión HLA no está asociada a un epítopo peptídico.

11. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la composición farmacéutica se administra antes, en combinación con o después de un agente inhibidor del punto de control, y donde dicho agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10'7 mol/L o inferior.

12. Un agente inhibidor del punto de control para su uso en el tratamiento del cáncer, donde el agente inhibidor del punto de control se administra antes, en combinación con o después de la composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y donde dicho agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1, o PD-L2 con una constante de disociación de 10'7 mol/L o inferior.

13. La composición farmacéutica para uso según cualquier reivindicación 11, o el agente inhibidor de puntos de control para uso según la reivindicación 12, donde dicho agente inhibidor de puntos de control se proporciona en una forma de dosificación adecuada para la administración sistémica.

14.Una composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o 13, donde el cáncer es

a. un cáncer derivado de células sanguíneas, o

b. un tumor sólido.

15.El agente inhibidor del punto de control para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, donde la enfermedad neoplásica maligna se selecciona entre cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de páncreas, o melanoma.