ES3048957T3

ES3048957T3 - Cancer biomarkers

Info

Publication number: ES3048957T3
Application number: ES18710027T
Authority: ES
Inventors: Francesco Gatto; Jens Nielsen
Original assignee: Elypta AB
Current assignee: Elypta AB
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2025-12-12
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: EP3593139C0; JP2023133320A; JP7640119B2; EP4614153A2; JP2020511643A; EP3593139B1; JP7377527B2; CN110383070A; EP3593139A1; US20190391151A1; CA3050203A1; EP4614153A3; AU2024219766A1; AU2018231421B2; PL3593139T3; WO2018162596A1; AU2018231421A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método de detección de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de pulmón, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de conducto biliar, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de sangre, cáncer de ovario, cáncer de piel, melanoma y un tumor neuroendocrino en un sujeto, comprendiendo dicho método determinar el nivel y/o la composición química de uno o más de los glicosaminoglicanos (GAG) sulfato de condroitina (CS), sulfato de heparán (HS) y ácido hialurónico (HA) en una muestra de fluido corporal, en donde dicha muestra se ha obtenido de dicho sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Biomarcadores del cáncer

[0005] La presente invención se refiere a biomarcadores del cáncer y a métodos de detección del cáncer. Tales métodos implican determinar el nivel y/o la composición de ciertos biomarcadores que son indicativos de cáncer en un sujeto.

[0006] Se prevé que el número de casos de cáncer aumente considerablemente en un futuro próximo. El aumento de la población con cáncer determina la necesidad urgente de mejorar el panorama actual del diagnóstico del cáncer. En particular, se necesitan herramientas asequibles y prácticas para el diagnóstico del cáncer para ayudar a los profesionales de la salud a detectar precozmente el cáncer de alto riesgo, que de forma típica se correlaciona con resultados clínicos más favorables, o para guiar el tratamiento de los pacientes con cáncer actuales.

[0008] Los biomarcadores circulantes son moléculas que pueden medirse en los fluidos corporales accesibles de los individuos, p. ej., sangre u orina, y cuyos niveles son útiles para ayudar al diagnóstico y/o pronóstico y/o predicción de la respuesta al tratamiento. Un ejemplo de biomarcador ampliamente utilizado es el antígeno específico de la próstata (PSA, por sus siglas en inglés) para el cáncer de próstata, el antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés) para el cáncer colorrectal y el antígeno carbohidrato 125 para el cáncer de ovario. Sin embargo, el valor clínico de estos biomarcadores para el diagnóstico del cáncer es muy debatido. Por ejemplo, una prueba de PSA estándar para detectar el adenocarcinoma de próstata en hombres mayores de 50 años con un riesgo promedio, suponiendo un valor límite igual a 4 ng/ml, tiene valores típicos de sensibilidad y especificidad del 21 % (51 % para las lesiones de grado alto con una puntuación de Gleason mayor o igual que 8) y del 91 %, respectivamente (Wolf y col., 2010).

[0009] lida y col. (British Journal of Urology, 1997, vol. 79, n.° 5, páginas 763 a 769) se refiere al análisis de los glucosaminoglicanos en la próstata humana mediante cromatografía líquida de alta resolución.

[0011] El documento US2014/105824A1 se refiere a la hipoxia y al hialuronano y a marcadores de la misma, así como a la monitorización de enfermedades y afecciones relacionadas.

[0013] Gatto y col. (Frontiers in Oncology, 2016, Vol. 6, Artículo 253) se refiere al valor pronóstico de las puntuaciones de glucosaminoglicanos en plasma y orina en el carcinoma de células renales de células claras.

[0015] Lo que se necesita en la técnica son nuevos métodos de detección del cáncer (p. ej., diagnosticar el cáncer). La identificación de nuevos biomarcadores para el cáncer podría tener implicaciones clínicas para un gran número de pacientes y sería un avance clínico importante. En este caso, los inventores proporcionan pruebas de un marcador de cáncer en sangre y/u orina que puede utilizarse en un ensayo altamente específico y sensible para detectar el cáncer. Por lo tanto, ventajosamente, tales métodos no son invasivos y se realizan en muestras fácilmente obtenibles, además de ser altamente precisos. Los inventores también han observado que los niveles de expresión de ciertos genes son indicativos de cáncer.

[0017] La disponibilidad de tales pruebas también tiene valor para una serie de decisiones médicas, por ejemplo, para determinar el riesgo de progresión de los cánceres recién diagnosticados; para guiar las opciones de tratamiento en pacientes con cáncer con riesgo clínico incierto; para controlar el cáncer antes y después de la cirugía o el tratamiento farmacológico; descartar la recaída de la enfermedad durante un período de tiempo más largo, después del cual de forma típica se declara que el paciente está curado; para evaluar la aparición del cáncer en una población en riesgo, tal como las personas con predisposición genética o las personas que presentan factores de riesgo o las personas que presentan síntomas; para determinar si una metástasis se debe a un cáncer en particular; para predecir la recurrencia o la recaída en pacientes con cáncer en estadio temprano; distinguir las lesiones sospechosas de cáncer de las enfermedades no malignas; o para detectar el cáncer en la población general.

[0019] A este respecto, los presentes inventores han identificado que ciertos glucosaminoglicanos (GAG), es decir, el sulfato de condroitina (CS, en inglés), el sulfato de heparán (HS, en inglés) y el ácido hialurónico (HA, en inglés), y las composiciones químicas de dichos GAG, se encuentran a niveles diferenciales en muestras de fluidos corporales de pacientes con cáncer en comparación con los sujetos de control. Estos niveles diferenciales de los GAG CS o HS o HA, o las composiciones químicas diferenciales de los GAG CS o HS o HA (perfiles de GAG), pueden actuar como biomarcadores del cáncer y, por lo tanto, son útiles en la detección del cáncer en los sujetos. Por lo tanto, los presentes inventores han determinado que los perfiles de GAG de los fluidos accesibles son adecuados para utilizarse como biomarcadores/marcadores de diagnóstico del cáncer.

[0021] Sorprendente y ventajosamente, los presentes inventores han descubierto que se observan cambios en el nivel de los GAG CS, HS y HA en los fluidos corporales accesibles de los pacientes con cáncer y que estos perfiles de GAG son adecuados para utilizarse como biomarcadores del cáncer. Los presentes inventores también han mostrado que, además de los niveles (totales) generales o la concentración de CS y HS y HA, también se observan otros cambios en la composición química, por ejemplo, los patrones específicos de sulfatación de disacáridos de CS y HS entre muestras de cáncer y muestras normales, y pueden utilizarse de forma muy eficaz para diagnosticar cáncer.

[0022] Claramente, el descubrimiento de que el diagnóstico del cáncer se puede realizar en una muestra de fluido corporal accesible, p. ej., sangre u orina, de un sujeto es extremadamente ventajoso. En este caso, los inventores han observado una alteración sistémica de la composición del GAG que era concomitante con el cáncer.

[0023] Ventajosamente, los presentes inventores también han demostrado que los marcadores identificados que son distintivos de la aparición de cáncer y que se calculan basándose en mediciones en fluidos corporales accesibles son predictores precisos y sólidos de la enfermedad.

[0024] Los métodos de la invención se exponen en el conjunto de reivindicaciones anexas.

[0025] Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de pulmón, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de sangre, cáncer de ovario, melanoma y un tumor neuroendocrino en un sujeto, comprendiendo dicho método determinar la composición química del glicosaminoglicano (GAG) sulfato de condroitina (CS) y, opcionalmente, del GAG sulfato de heparán (HS), en una muestra de fluido corporal, en donde dicha muestra se ha obtenido de dicho sujeto,

[0026] en donde dicho método comprende determinar el nivel en la muestra de la propiedad del GAG 6s CS,

[0027] en donde dicho fluido corporal es sangre, y

[0028] en donde un nivel alterado de dicha propiedad del GAG en dicha muestra en comparación con un nivel de control es indicativo de dicho cáncer en dicho sujeto.

[0029] En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende determinar el nivel en la muestra de una o más propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en: una o más de las formas específicas sulfatadas o no sulfatadas de disacáridos de CS o HS, la fracción de disacáridos sulfatados de HS del total de disacáridos de HS presentes (carga HS), la fracción de disacáridos sulfatados de CS del CS total disacáridos presentes (carga CS), la concentración total de CS y la concentración total de HS, y en donde los niveles de uno o más se determinan las formas sulfatadas o no sulfatadas específicas de los disacáridos CS o HS, y en donde los GAG se someten a un paso de procesamiento para obtener las unidades de disacáridos para el análisis.

[0030] En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en: la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/6s CS, 0s CS, Ns2s HS, 4s CS.

[0031] En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG: la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/6s CS y 0s CS. En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG 0s CS, la relación 4s CS/6s CS, carga CS, Ns HS, 4s CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/0s CS, 0s HS, carga H<s>.

[0032] En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG 0s CS, la relación 4s CS/6s CS, carga CS, Ns HS.

[0033] En algunas realizaciones, dicho método comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG carga CS, CS total, 4s CS, 2s HS, 0s HS.

[0034] En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más o todas las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris<c>S, carga CS, CS total, el nivel relativo de 4s C<s>con respecto a 6s C<s>, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, Tris HS, Ns2s HS, 2s6s HS, 6s HS y HS total.

[0035] En algunas realizaciones, dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en carga CS, CS total, 4s CS, 2s HS y 6s HS.

[0036] En algunas realizaciones, dicho método se utiliza para diagnosticar dicho cáncer, para el pronóstico de dicho cáncer, para monitorear a los sujetos en riesgo de aparición de dicho cáncer, para monitorear la progresión de dicho cáncer en un sujeto, para determinar la gravedad clínica de dicho cáncer, para predecir la respuesta de un sujeto a la terapia o cirugía para dicho cáncer, para determinar la eficacia de un régimen terapéutico o quirúrgico que se utiliza para tratar dicho cáncer, para detectar la recurrencia o recaída de dicho cáncer, para la selección del paciente o del tratamiento o para distinguir las pequeñas masas sospechosas de dicho cáncer de otras enfermedades no malignas.

[0037] En algunas realizaciones, dicho nivel o composición química de dicho GAG o propiedad del GAG se determina mediante electroforesis o mediante HPLC y espectrometría de masas. En algunas realizaciones, dicha electroforesis es electroforesis capilar, preferiblemente electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser, y/o en donde la HPLC se combina con espectrometría de masas por ionización por electropulverización.

[0039] Según los métodos de la invención, un nivel alterado de la propiedad del GAG 6s CS en dicha muestra en comparación con un nivel de control es indicativo de un cáncer según la invención (p. ej., cáncer de próstata) en dicho sujeto.

[0040] Como se ha descrito anteriormente, los métodos de la presente invención comprenden determinar la composición química del glicosaminoglicano (GAG) sulfato de condroitina (CS) y, opcionalmente, del sulfato de heparán (HS) del GAG y, opcionalmente, del ácido hialurónico (HA) en una muestra de fluido corporal. Según el método de la invención, se determina la composición química del sulfato de condroitina (CS). En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química del sulfato de heparán (HS). En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química del ácido hialurónico (HA). En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química de dos de dichos GAG. En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química del sulfato de condroitina (CS) y el sulfato de heparán (HS). En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química del sulfato de condroitina (CS) y el ácido hialurónico (HA). En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química del ácido hialurónico (HA) y el sulfato de heparán (HS). En algunas realizaciones, se determina el nivel y/o la composición química de dichos tres GAG, es decir, se determina el nivel y/o la composición química del sulfato de condroitina (CS) y el sulfato de heparán (HS) y el ácido hialurónico (HA).

[0042] Los glicosaminoglicanos (GAG) son moléculas que contienen azúcar que se unen a las proteínas de los residuos de serina, es decir, pueden formar partes de un proteoglicano. Se forman a partir de cadenas lineales o no ramificadas de monosacáridos (es decir, son polisacáridos) que pueden sulfatarse. El sulfato de heparán (HS), el sulfato de condroitina (CS), el sulfato de queratán (KS), el ácido hialurónico (HA) y la heparina son los tipos comunes de GAG, de los cuales el HS y el CS son ejemplos de GAG sulfatados. Los diferentes tipos de GAG se distinguen por diferentes unidades de disacáridos repetidas. Sin embargo, todos los tipos tienen el mismo núcleo de tetrasacárido unido al residuo de serina de la proteína.

[0044] Así, por ejemplo, el CS y el HS son GAG que comparten una ruta biosintética común en el enlace a la proteína central, pero a partir de entonces difieren en su polimerización en que el disacárido repetido en el CS está compuesto por residuos repetidos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) y ácido glucurónico (GlcA), mientras que el disacárido repetido en el HS está compuesto de forma típica por N-acetilglucosamina repetida (GlcNAc) y residuos de ácido glucurónico (GlcA). Cada monosacárido está unido por una enzima específica que permite múltiples niveles de regulación sobre la síntesis de GAG.

[0046] El “ nivel” de HS o CS o HA, como se menciona en la presente memoria, generalmente se refiere al nivel o cantidad total (p. ej., concentración) del HS o CS o HA presente en la muestra. El nivel de CS y/o HS y/o HA en una muestra se puede medir o determinar mediante cualquier método apropiado que sea bien conocido y descrito en la técnica. Un método preferido implica la electroforesis, en particular la electroforesis capilar, p. ej., la electroforesis capilar con detección de fluorescencia, p. ej., la detección de fluorescencia inducida por láser. Otros métodos adecuados son la electroforesis en gel, p. ej., la electroforesis en gel de agarosa (p. ej., FACE, electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos) o la espectrometría de masas o la cromatografía líquida, p. ej., HPLC, opcionalmente en combinación con espectrometría de masas (HPLC-MS). Convenientemente, estos niveles se pueden medir como una concentración, por ejemplo, como un número de microgramos por ml (pg/ml). Sin embargo, nuevamente, se puede utilizar cualquier medida de nivel apropiada.

[0048] En los métodos de la presente invención que determinan los niveles de HS o CS o HA, los niveles de HS o CS o HA se determinan por separado o individualmente. En otras palabras, los métodos no implican la medición de los niveles totales de GAG en una muestra o los niveles totales de todos los GAG presentes en combinación, sino que implican la medición de los niveles de uno o más de los GAG individuales HS, CS o HA.

[0050] En realizaciones particulares, el nivel (p. ej., el nivel total o la concentración) de CS y/o HS y/o HA se puede determinar en muestras de sangre.

[0052] En algunas realizaciones de la invención, un nivel (o concentración) aumentado de la propiedad del GAG 6s CS en una muestra de sangre es indicativo de un cáncer según la presente invención (p. ej., cáncer de próstata) en dicho sujeto y puede utilizarse para cribar, diagnosticar, etc., en sujetos como se describe en otra parte de la presente memoria.

[0054] Las unidades de monosacáridos individuales que componen el CS y el HS pueden tener diferentes patrones de sulfatación en términos de la posición de las moléculas de sulfato y la cantidad/número de moléculas de sulfato. Para el CS, la sulfatación puede ocurrir más comúnmente en una o más de las posiciones 2 del GlcA y en las posiciones 4 y 6 del GalNAc. Para el HS, la sulfatación puede producirse en una o más de las posiciones 2 del GlcA después de la epimerización en IdoA (ácido idurónico), en las posiciones 3 y 6 del GlcNAc y en la N-sulfatación del GlcNAc. Por lo tanto, cada disacárido individual de la cadena de GAG puede tener 0 (es decir, no estar sulfatado), 1, 2, 3 o 4 (solo en HS) formas de sulfatación y esto, a su vez, da lugar a diferentes composiciones químicas generales de las cadenas de GAG en términos de niveles de sulfatación y patrones de sulfatación de disacáridos específicos.

[0056] Como se describe en otra parte de la presente memoria, la invención implica la determinación de la composición química del CS y, opcionalmente, del HS y, opcionalmente, del HA. El término “composición química” , como se utiliza en la presente memoria, puede referirse tanto a los niveles de los GAG como a la composición de sulfatación de disacáridos de los GAG. En particular, este término incluye la determinación de una o más formas particulares, p. ej., formas de sulfatación, de los disacáridos que forman los GAG CS o HS. Dicho de otro modo, el término “composición química” se refiere a la cantidad o nivel de una o más de las diversas formas sulfatadas y/o no sulfatadas de disacáridos de CS o HS, así como, por ejemplo, a algunas otras propiedades de los GAG individuales presentes, tales como los niveles totales de HS o CS o HA GAG, u otras propiedades relacionadas con la sulfatación de GAG, como la carga HS o la carga CS, como se describe más adelante en la presente memoria. Tal composición química que se analiza o determina en la presente invención también puede denominarse en la presente memoria perfil de GAG, formas de GAG, características de GAG o propiedades del GAG. A este respecto, en algunas realizaciones, se pueden medir hasta 22 propiedades del GAG diferentes (incluidas hasta 20 propiedades independientes), como se describe en mayor detalle a continuación, en los métodos de la invención y una colección o grupo (p. ej., dos o más) de estas mediciones tomadas de una muestra particular puede denominarse perfil de GAG. En algunas realizaciones preferidas de la invención, se pueden medir hasta 21 propiedades diferentes del GAG (incluidas hasta 19 propiedades independientes) (como se describe en mayor detalle a continuación).

[0058] Así, por ejemplo, el término “composición química” , como se utiliza en la presente memoria, puede referirse a una determinación o análisis de los patrones de sulfatación (p. ej., una o más de las formas de sulfatación) de los disacáridos que forman el CS y/o el HS.

[0060] Por ejemplo, para el CS, hay 8 formas principales sulfatadas y no sulfatadas (patrones de sulfatación, formas de sulfatación de disacáridos) que son: 0s CS (también denominado unidad CS o CS O sin sulfatar), 2s CS (también denominado condroitina-2-sulfato), 4s CS (también denominado condroitina-4-sulfato o unidad CS A), 6s CS (también denominado condroitin-6-sulfato o unidad CS C), 2s4s CS (también denominado condroitin-2-4-sulfato), 2s6s CS (también denominado condroitin-2-6-sulfato o unidad CS D), 4s6s CS (también denominado condroitin-4-6-sulfato o unidad CS E) y Tris CS (también denominado condroitin-2-4-6-sulfato o CS trisulfatado).

[0062] Cada una de las anteriores es una forma de GAG CS (una forma o propiedad de GAG CS) que puede medirse en los métodos de la presente invención. Según la presente invención, se debe medir la forma GAG CS de 6s CS. También se pueden medir una o más de las otras formas de GAG CS, por ejemplo, se pueden medir hasta 8, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o todas estas 8 formas de sulfatación. En algunas realizaciones, se prefiere la medición de estas 8 formas de sulfatación. Otra propiedad del GAG para la CS que puede medirse en los métodos de la presente invención es la concentración total de CS (también denominada en la presente memoria CS tot o Tot CS o CS total) o el nivel total de CS. Esto se mide de forma típica como una concentración, p. ej., en pp/ml, como se describe en otra parte de la presente memoria. En algunas realizaciones, no se mide la concentración total de CS.

[0064] La “carga CS” es otra forma o propiedad del GAG que puede medirse en la presente invención, p. ej., como parte del perfil del GAG. La “carga CS” se refiere a la fracción total de disacáridos sulfatados del CS, es decir, la fracción de disacáridos sulfatados del CS presentes o medidos en una muestra del total de disacáridos CS presentes o medidos en una muestra (es decir, disacáridos CS sulfatados/disacáridos CS sulfatados no sulfatados).

[0066] Por ejemplo, además de la forma no sulfatada del CS (0s CS), cuando la muestra es una muestra de sangre, el 4s CS también se puede medir como una forma de sulfatación principal (p. ej., en lugar de medir todas las formas sulfatadas del CS) para calcular la carga CS (4s CS/4s CS 0s CS).

[0068] Como la medición de la “carga CS” depende de la medición de otras propiedades, es decir, la medición de los niveles de disacáridos CS sulfatados y no sulfatados, esta propiedad no se denomina la presente memoria propiedad del GAG o propiedad CS independiente. Por lo tanto, se pueden medir hasta 9 propiedades independientes del CS en los métodos de la presente invención, que son las 8 formas sulfatadas y no sulfatadas enumeradas anteriormente, junto con el CS total. En algunas realizaciones, se miden las 9 propiedades independientes del CS.

[0070] En algunas realizaciones, se prefiere medir hasta 8 (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o las 8 formas de sulfatación del CS (es decir, las formas sulfatadas y no sulfatadas), junto con el CS total y el carga CS.

[0072] Por ejemplo, para el HS, hay 8 formas principales sulfatadas y no sulfatadas (patrones de sulfatación, formas de sulfatación de disacáridos) que son: 0s HS (también denominado HS no sulfatado), 2s HS (que está sulfatado en la posición 2 de la GlcA), Ns HS (que está sulfatado en la posición N de la GlcNAc), 6s HS (que está sulfatado en la posición 6 de la GlcNAc), 2s6s HS (que está sulfatado en la posición 2 de la GlcA y la posición 6 de la GlcNAc), Ns6s HS (que está sulfatado en la posición 6 y la posición N de la GlcNAc), Ns2s HS (que está sulfatado en la posición 2 de GlcA y la posición N de la GlcNAc), T ris HS (que está sulfatado en la posición 2 de GlcA y la posición 6 y la posición N de la GlcNAc, también denominado como HS trisulfatado). Tenga en cuenta que la sulfatación en la posición 3 de la GlcNAc también es posible, pero rara vez se observa.

[0073] Cada una de las anteriores es una forma de GAG HS (una forma o propiedad de GAG HS) que puede medirse o determinarse en los métodos de la presente invención. Sin embargo, debido a su rareza, en realizaciones preferidas de la invención, no se mide la forma de sulfatación con la sulfatación en la posición 3 de la GlcNAc. Por lo tanto, en los métodos de la invención, se pueden medir una o más de estas 9 (o preferiblemente 8) formas, por ejemplo, hasta 9 (o preferiblemente hasta 8), p. ej., se pueden medir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o todas estas 9 formas de sulfatación. En algunas realizaciones, se prefiere la medición de estas 8 formas de sulfatación (excluyendo la forma de sulfatación con sulfatación en la posición 3 de la GlcNAc). Otra propiedad del GAG para la HS que puede medirse en los métodos de la presente invención es la concentración total de HS (también denominada en la presente memoria HS tot o Tot HS o HS total) o el nivel total de HS. Esto se mide de forma típica como una concentración, p. ej., en pp/ml, como se describe en otra parte de la presente memoria. En algunas realizaciones, no se mide la concentración total de HS. En los métodos de la invención se prefiere la medición de una o más propiedades del GAG HS.

[0075] La “carga HS” es otra forma o propiedad del GAG que puede medirse en la presente invención, p. ej., como parte del perfil del GAG. La carga HS se refiere a la fracción total de disacáridos sulfatados del HS, es decir, la fracción de disacáridos sulfatados del HS presentes o medida en una muestra del total de disacáridos del HS presentes o medidos en una muestra (es decir, disacáridos del HS sulfatados/disacáridos del HS sulfatados no sulfatados).

[0077] A modo de ejemplo, además de la forma no sulfatada del HS (0s HS), cuando la muestra es una muestra de sangre, el Ns HS y/o el 6s HS también se pueden medir como formas principales de sulfatación (p. ej., en lugar de medir todas las formas sulfatadas del HS) para calcular la carga HS (p. ej., Ns H<s>+ 6s HS /Ns HS 6s HS 0s HS).

[0079] Como la medición de la “carga HS” depende de la medición de otras propiedades, es decir, la medición de los disacáridos HS sulfatados y no sulfatados, esta propiedad no se denomina en la presente memoria propiedad del GAG 0 propiedad HS independiente. Por lo tanto, se pueden medir hasta 10 propiedades independientes del HS en los métodos de la presente invención, que son las 9 formas sulfatadas y no sulfatadas enumeradas anteriormente (excluyendo preferiblemente la forma de sulfatación con sulfatación en la posición 3 de la GlcNAc), junto con el HS total. Por lo tanto, en algunas realizaciones se miden 9 propiedades independientes del HS (las 8 formas principales de HS sulfatadas y no sulfatadas más el HS total).

[0081] En algunas realizaciones, se prefiere medir hasta 8 (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o las 8 formas principales de sulfatación del HS (es decir, las formas sulfatadas y no sulfatadas enumeradas anteriormente, excluyendo la forma de sulfatación con sulfatación en la posición 3 de la GlcNAc), junto con el HS total y el carga HS.

[0083] En algunas realizaciones, se miden 9 propiedades de HS independientes (las 8 formas principales de HS sulfatadas y no sulfatadas más el HS total) y se miden las 9 propiedades de CS independientes, es decir, 18 propiedades del GAG independientes.

[0085] Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, el nivel y/o la composición química del ácido hialurónico (HA) pueden determinarse en una muestra de fluido corporal. El ácido hialurónico (HA) de forma típica no está sulfatado. En consecuencia, cuando el HA se mide según la invención, de forma típica y preferiblemente es el nivel (nivel total o concentración total) de HA que se mide (también denominado en la presente memoria HA tot o Tot HA o HA total). Esto se mide de forma típica como una concentración, p. ej., en pp/ml, como se describe en otra parte de la presente memoria. En algunas realizaciones, la HA no se mide.

[0087] En algunas realizaciones, se miden 9 propiedades de HS independientes (las 8 formas principales de HS sulfatadas y no sulfatadas más el HS total) y se miden las 9 propiedades de CS independientes y se miden el HA total, es decir, 19 propiedades del GAG independientes.

[0089] Estas propiedades del GAG o formas de GAG, p. ej., las formas de sulfatación de disacáridos (con la excepción del CS total o el HS total) pueden medirse como un tamaño de fracción o fracción o proporción o medida relativa, en lugar de como niveles o concentraciones absolutos, por ejemplo, a los que se les da un valor inferior a 1 o se normalizan a 1 según los niveles de todas las formas de sulfatación (o de todas las formas principales de sulfatación) medidos en la muestra. En otras palabras, el nivel de cada una de las formas de sulfatación deseadas se mide de forma independiente y a continuación, se normaliza a 1. En otras palabras, el nivel de cada una de las formas de sulfatación deseadas se mide de forma independiente y, a continuación, se calcula su fracción de masa o fracción de volumen o fracción molar. Estas fracciones también se pueden expresar como porcentaje. En otras palabras, estas fracciones también pueden normalizarse a 100. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tamaño de la fracción de una forma CS sulfatada o forma CS no sulfatada dada puede determinarse midiendo el nivel de la forma CS sulfatada o forma CS no sulfatada dada y dividiéndolo por la suma de los niveles de todas las formas de sulfatación CS (o todas las formas principales de sulfatación) y la forma CS no sulfatada medida (o presente) en la muestra. En algunas realizaciones, el tamaño de la fracción de una forma HS sulfatada o una forma HS no sulfatada dada puede determinarse midiendo el nivel de la forma HS sulfatada o la forma HS no sulfatada dada y dividiéndolo por la suma de los niveles de todas las formas de sulfatación HS (o formas de sulfatación principales) y la forma HS no sulfatada medidas (o presentes) en la muestra. Al calcular tales fracciones, se prefiere medir al menos las principales formas de sulfatación de CS o HS para poder normalizar la fracción de la forma de sulfatación individual particular a 1. En algunas realizaciones, preferiblemente al menos las formas no sulfatadas de HS o CS se miden como la forma de sulfatación principal. Además de la forma no sulfatada del CS, cuando la muestra es una muestra de sangre, el 4s CS también se puede medir como la principal forma de sulfatación. Además de la forma no sulfatada del HS, cuando la muestra es una muestra de sangre, el Ns HS y/o el 6s HS también se pueden medir como las principales formas de sulfatación.

[0090] A modo de ejemplo, los niveles de 0s CS, 4s CS y 6s CS se miden individualmente en una muestra y a continuación, se dividen por la suma de las tres mediciones para obtener la medición de la fracción. Generalmente, se prefieren las mediciones relativas porque son más fáciles de interpretar, por ejemplo, una medición de 0s CS de 0,6 indica que el 60 % de los disacáridos CS no están sulfatados. Sin embargo, también se pueden medir los niveles absolutos.

[0091] En algunas realizaciones preferidas de la invención, se mide o determina la composición de disacáridos (por ejemplo, los patrones de sulfatación específicos (p. ej., las formas de sulfatación)) de uno o más de los disacáridos que forman el CS y, opcionalmente, el HS, siendo esencial según la presente invención que se mida o determine el 6s CS. En realizaciones más preferidas, se miden o determinan una o más propiedades de sulfatación o formas de CS y, opcionalmente, de HS, tales como las descritas anteriormente (p. ej., 0s CS, 2s CS, etc.), siendo esencial según la presente invención que se mida o determine 6s CS. Los métodos apropiados para hacer esto serían bien conocidos por un experto en la técnica y podría utilizarse cualquiera de estos. Sin embargo, un método conveniente para lograr tal cuantificación de la composición de disacáridos o las propiedades o formas apropiadas de CS o HS (y la separación de las formas de disacáridos) es utilizar electroforesis, en particular electroforesis capilar, y preferiblemente electroforesis capilar con detección de fluorescencia, p. ej., electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser (CE-LIF). Un método alternativo es la cromatografía líquida, preferiblemente la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), por ejemplo, la HPLC SAX. Preferiblemente, también se utiliza la espectrometría de masas (p. ej., HPLC-MS), por ejemplo, la espectrometría de masas por ionización por electropulverización (ESI-MS). Alternativamente, la espectrometría de masas se puede utilizar sin cromatografía, p. ej., cromatografía líquida. Los métodos particularmente preferidos se describen en los ejemplos. Un ejemplo de un método particularmente preferido es la electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser. Otro ejemplo de un método particularmente preferido es la HPLC ESI-MS.

[0093] En algunos métodos de la invención en los que se miden los niveles de una o más formas de disacáridos individuales, los GAG se someten a un paso de procesamiento, por ejemplo, un paso de fragmentación o escisión o digestión, p. ej., mediante digestión química o tratamiento enzimático, p. ej., con condroitinasa ABC o condroitinasa B, para obtener las unidades de disacárido que a continuación, se analizan.

[0095] En algunos métodos de la invención, los GAG de la muestra se someten a un paso de extracción (p. ej., utilizando una proteasa tal como la proteinasa K) y/o purificación, p. ej., utilizando una resina de intercambio aniónico.

[0097] En algunos métodos de la invención, los GAG de la muestra (p. ej., varias formas diferentes de GAG en la muestra) se someten a un paso de separación y/o cuantificación, como se describe en otra parte de la presente memoria.

[0098] Otros métodos que podrían utilizarse son conocidos en la técnica. Sin embargo, algunos ejemplos son las técnicas analíticas que implican la utilización de anticuerpos contra diversas formas de GAG, p. ej., técnicas tales como transferencia Western, ELISA o FACS, o métodos que implican electroforesis en gel de agarosa (p. ej., electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos [FACE]) o electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

[0100] En algunas realizaciones, se seleccionan hasta 22 propiedades del GAG del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 6s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, CS total, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s H<s>, Tris HS, HS sulfatado en la posición 3 de la GlcNAc, HS total, carga HS y HA total se pueden medir o determinar en los métodos de la invención, siendo esencial que se mida o determine la propiedad del GAG 6s CS. Como se describe en otra parte de la presente memoria, preferiblemente no se mide ni se determina el HS sulfatado en la posición 3 de la GlcNAc. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se seleccionan hasta 21 propiedades del GAG del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 6s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, CS total, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s H<s>, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, T ris HS El H<s>total, el carga<h>S y el HA total se pueden medir o determinar en los métodos de la invención, siendo esencial que se mida o determine la propiedad del GAG 6s CS. En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar una o más de las siguientes propiedades del GAG: el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) o el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS). Por lo tanto, en algunas realizaciones, se pueden medir o determinar hasta 25 propiedades del GAG o hasta 24 propiedades del GAG.

[0102] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: 0s CS, 6s CS, la relación 4s CS/6s CS, carga C<s>, Ns HS, 4s CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/0s CS, 0s HS y carga H<s>.

[0103] En algunas realizaciones, para las muestras de sangre, se pueden medir o determinar las siguientes propiedades del GAG: 0s CS, 6s CS, la relación 4s CS/6s CS, carga CS y Ns HS.

[0104] En algunas realizaciones, para las muestras de sangre, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: 6s CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/6s CS y 0s CS.

[0105] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar una o más (o todas) de las siguientes formas de GAG: carga CS, CS total o HS total.

[0106] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes formas de GAG: 0s CS, 4s CS y 6s CS. En algunas realizaciones, una alteración en el nivel de todos los siguientes: 0s CS, el 4s CS y el 6s CS, en comparación con un nivel de control, son indicativos de un cáncer según la invención en dicho sujeto. En algunas realizaciones, un aumento en el nivel de 6s CS (o tanto 6s CS como 4s CS), en comparación con un nivel de control, es indicativo de un cáncer según la invención en dicho sujeto.

[0107] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: carga CS, CS total, 6 CS, 4 CS, 2 HS y 0 Hs.

[0108] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar las siguientes propiedades del GAG: la relación 6s CS/4s CS+6s CS (o la relación inversa 4s CS+6s CS/6s CS) o el nivel relativo de 2s HS con respecto a 0s HS (p. ej., la relación 2s HS/0s HS o la relación inversa 0s HS/2s HS).

[0109] En algunas realizaciones, se puede medir o determinar la siguiente propiedad del GAG: el nivel relativo de 2s HS con respecto a 0s HS (p. ej., la relación 2s HS/0s HS o la relación inversa 0s HS/2s HS).

[0110] En algunas realizaciones, se puede medir o determinar el 2s HS.

[0111] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: CS total, 6s CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS) y el nivel relativo de 2s HS con respecto a 0s HS (p. ej., la relación 2s HS/0s HS o la relación inversa 0s HS/2s HS). En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: CS total, 6s CS, carga CS y el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS).

[0112] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: carga CS, CS total, HS total, 0s CS, 2s C<s>, 6s CS, 4s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) y el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS).

[0113] En algunas realizaciones, una alteración en el nivel de todos los siguientes: carga CS, CS total, HS total, 0s CS, 2s CS, 6s CS, 4s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS S/6s CS) y el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), en comparación con un nivel de control, es indicativo de un cáncer según la invención en dicho tema. En algunas realizaciones, un aumento en el nivel de todos los siguientes: carga CS, CS total, HS total, 6s CS, 4s CS, la relación 6s CS/0s CS y la relación 4s CS/0s CS, en comparación con un nivel de control, es indicativo de un cáncer según la invención en dicho tema.

[0114] En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) y el HS total. En algunas realizaciones, se pueden medir o determinar todas las siguientes propiedades del GAG: 6s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) y el HS total. En algunas realizaciones, una alteración en el nivel de todos los siguientes: 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) o el HS total, por ejemplo, en comparación con un nivel de control, son indicativos de un cáncer según la invención en dicho sujeto.

[0115] En algunas realizaciones, una alteración en el nivel de todos los siguientes: 6s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) y el HS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de un cáncer según la invención en dicho tema.

[0116] En algunas realizaciones, CS Tot, 0s CS y/o 4s CS no está determinado.

[0117] En algunas realizaciones, CS Tot, 0s CS, 4s CS y/o HS Tot no están determinados. En algunas realizaciones, CS Tot, 0s CS, 4s CS, HS Tot y/o HA Tot no están determinados. En algunas realizaciones, si el cáncer que se está analizando es cáncer de sangre, cáncer de cerebro, cáncer de útero, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón o cáncer de próstata, no se determina el CS Tot, 0s CS, 4s CS y/o HS Tot. En algunas realizaciones, si el cáncer que se está analizando es cáncer de sangre, cáncer de cerebro, cáncer de útero, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón o cáncer de próstata, no se determina CS Tot, 0s CS, 4s CS, HS Tot y/o HA Tot.

[0118] En algunas realizaciones, 0s CS, 4s CS, CS Tot y/o HA Tot no están determinados. En algunas realizaciones, si el cáncer que se está examinando es cáncer de colon o cáncer de recto, no se determina 0s CS, 4s CS, CS Tot y/o HA Tot.

[0119] En algunas realizaciones, no se determina el CS Tot y/o el HA Tot. En algunas realizaciones, si el cáncer que se está analizando es cáncer de mama, no se determina el CS Tot y/o el HA Tot.

[0120] En algunas realizaciones, no se determina el CS Tot y/o el HS Tot. En algunas realizaciones, si el cáncer que se está examinando es cáncer de colon o cáncer de recto, no se determina el CS Tot y/o el HS Tot.

[0121] En algunas realizaciones, no se determina HS Tot, CS Tot y/o HA Tot. En algunas realizaciones, si el cáncer que se está analizando es cáncer de sangre, cáncer de ovario, cáncer de mama o cáncer de colon, no se determina el HS Tot, el CS Tot y/o el HA Tot.

[0122] En algunas realizaciones, CS Tot, 4s CS, HS Tot y/o HA Tot no están determinados. En algunas realizaciones, si el cáncer es cáncer de próstata, no se determina CS Tot, 4s CS, HS Tot y/o HA Tot.

[0123] En algunas realizaciones, CS Tot, 0s CS, 4s CS, HS Tot y/o HA Tot no están determinados.

[0124] En algunas realizaciones, se determina 0s CS.

[0125] Como se ha indicado anteriormente, un cáncer particularmente preferido según la presente invención es el cáncer de próstata.

[0126] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de próstata, no se determina el Ns HS y/o el 0s HS. En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de próstata, no se determina el 0s Hs.

[0127] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de próstata, no se determina el 2s6s HS.

[0128] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de próstata, un nivel elevado en dicha muestra de 6s CS, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de próstata en dicho sujeto.

[0129] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de próstata, un nivel aumentado en dicha muestra de todos los siguientes: 2s CS, 6s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, T ris CS,<h>A total, T ris HS, Ns2s HS, 6s HS, carga HS y HS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de próstata en dicho sujeto.

[0130] Las formas de GAG particularmente preferidas que se van a medir o determinar en los métodos de detección del cáncer de próstata de la invención son una o más (o todas) de: 4 CS, 0 CS, HA total y Ns2s HS.

[0131] Otras formas de GAG preferidas que se miden en los métodos de la invención (p. ej., los métodos de detección del cáncer de próstata) son una o más (o todas) de: el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) o el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS).

[0132] Otras formas de GAG preferidas que se van a medir o determinar en los métodos de la invención (p. ej., los métodos de detección del cáncer de próstata) son una o más (o todas) de: 0s CS, 4s CS, Ns2s HS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS). Otras formas de GAG preferidas que se van a medir en los métodos de la invención (p. ej., métodos de detección del cáncer de próstata) son todas ellas: 2s6s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, HA tot, CS tot, 2s CS, 6s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), Tris HS, Ns6s HS, 0s HS, carga HS y HS tot.

[0133] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de próstata, un aumento en el nivel de todos los siguientes: 2s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/0s CS, carga CS, HA total, T ris HS, Ns2s HS, 6s HS, 2s HS, carga HS y HS total, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de próstata en dicho tema.

[0135] En realizaciones preferidas de la invención, los métodos de detección del cáncer de próstata implican la determinación de todos los siguientes: 0s CS, 2s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, T ris CS, carga CS, CS total, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) y el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS).

[0137] En algunas realizaciones de los métodos de detección del cáncer de próstata, un aumento en todas las formas sulfatadas del CS es indicativo de cáncer de próstata. En particular, un aumento en todos los siguientes aspectos: 2s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS) y el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), es indicativa de cáncer de próstata en dicho sujeto.

[0139] Por lo tanto, estos marcadores se pueden utilizar en los métodos de la invención (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata) de forma individual, aunque también se pueden utilizar en combinación, p. ej., en forma de un ensayo de marcadores múltiples. Las proporciones son marcadores particularmente preferidos (p. ej., las proporciones 4s CS/6s CS o 6s CS/4s CS). En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., las proporciones 4s CS/0s CS o 0s CS/4s CS) es un marcador preferido.

[0141] En realizaciones preferidas de los métodos de detección del cáncer de próstata de la invención, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: Tris HS, Ns2s HS, 2s6s HS, 6s HS o HS total. En algunas realizaciones de la invención (p. ej., de los métodos de detección del cáncer de próstata), los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: Tris HS, Ns2s HS y HS total. Estos marcadores se pueden utilizar en los métodos de la invención (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata) individualmente, aunque también se pueden utilizar en combinación, p. ej., en forma de un ensayo de marcadores múltiples.

[0143] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata) se puede medir el HA tot (HA total).

[0145] En algunas realizaciones, se determina el nivel de una única forma de GAG (propiedad del GAG). En realizaciones en los que se determina el nivel de una única forma de GAG (propiedad del GAG), dicha forma de GAG única es 6s CS. Por ejemplo, en una realización de los métodos de detección del cáncer de próstata, el método comprende determinar el nivel en una muestra de una o más características del GAG (propiedades del GAG) que se identifican en la tabla B de la presente memoria como alteradas significativamente entre el cáncer de próstata y las muestras sanas, es decir, aquellas características con un “% en ROPE” (región de equivalencia práctica) inferior a 5,00, siendo esencial que se determine el nivel de 6s CS.

[0147] En otras realizaciones de la presente invención, se determina el nivel de más de una de las formas de GAG (propiedades del GAG) (p. ej., se determina el nivel de dos o más formas de GAG, o tres o más formas de GAG, o cuatro o más formas de GAG, o cinco o más formas de GAG). Por “ más de uno” se entiende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc. 21,22, 24 o 25 (incluidos todos los números enteros entre 2 y 21 o 2 y 22 o 2 y 24 o 2 y 25). En cualquier lista de marcadores o propiedades del GAG proporcionada en la presente memoria, es una realización preferida que se midan todos.

[0149] Por lo tanto, en algunas realizaciones se realizan métodos de marcadores múltiples. Determinar el nivel de múltiples formas de GAG (multiplexación de biomarcadores) puede mejorar la precisión de la detección (p. ej., el diagnóstico).

[0150] En una realización preferida, se determina el nivel de dos de las formas de GAG indicadas. En otra realización preferida, se determina el nivel de tres de las formas de GAG indicadas. En otra realización preferida, se determina el nivel de cuatro o cinco de las formas de GAG indicadas.

[0152] En el caso de la sangre, los marcadores particularmente preferidos que deben determinarse para la detección del cáncer de próstata son uno o ambos (preferiblemente ambos) de: 4s CS y 0s CS. Por lo tanto, una o ambas de estas formas de GAG pueden medirse en los métodos de la invención.

[0154] En el caso de la sangre, la mayor precisión para el cáncer de próstata se alcanzó al determinar el nivel de las siguientes formas (propiedades) de GAG, clasificadas según su precisión: la relación 4s CS a 0s CS (p. ej., 4s CS/0s CS), 0s CS, 4s CS, carga CS,<h>S tot, 6s CS, la relación 6s CS a 0s CS (p. ej., 6s CS/0s CS), 4s6s CS. Por lo tanto, una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más o preferiblemente todas estas formas de GAG pueden medirse en los métodos de la invención, siendo esencial que se determine el nivel de 6s CS.

[0155] Otras formas de GAG preferidas en la sangre para la detección del cáncer de próstata pueden identificarse por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla B, p. ej., inferior a 4,00, 3,00, 2,00 o 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0156] En algunas realizaciones de la invención, los métodos de detección del cáncer de próstata implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0s CS, Tris CS, Tot CS, Tris HS, 2s6s HS o 6s HS en muestras de sangre.

[0158] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más (o todas) de las propiedades del GAG se seleccionan del grupo que consiste en 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris H<s>, la carga HS y HA total pueden medirse o determinarse en los métodos de la invención. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS y carga HS pueden medirse o determinarse en los métodos de la invención.

[0160] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS, carga HS y HA total se puede medir o determinar en los métodos de la invención. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 2s CS, 2s4s C<s>, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s C<s>, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS y carga HS se pueden medir o determinar en los métodos de la invención.

[0161] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS y carga HS, pueden medirse o determinarse en los métodos de la invención.

[0163] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), se seleccionan una o más (o todas) de las propiedades del GAG del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, HS y carga HS pueden medirse o determinarse en los métodos de la invención.

[0165] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), todas las propiedades del GAG en el grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 6s CS, 2s4s CS, 2s6s C<s>, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS y carga HS, se miden o determinan en los métodos de la invención.

[0167] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), todas las propiedades del GAG en el grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 6s CS, 2s4s CS, 2s6s C<s>, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS, carga HS y HA Tot se miden o determinan en los métodos de la invención.

[0169] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), se seleccionan una o más (o todas) de las propiedades del GAG del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, HS y carga HS pueden medirse o determinarse en los métodos de la invención.

[0171] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, o el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, Tris HS y carga HS se pueden medir o determinar en los métodos de la invención.

[0173] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), se seleccionan una o más (o todas) de las propiedades del GAG del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS,<c>S tot, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s<h>S, Ns2s HS, T ris HS, el carga HS y HS tot pueden medirse o determinarse en los métodos de la invención.

[0175] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, CS tot, HS tot, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS La CS con respecto a 0s CS, o el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, 0s HS, 2s HS, Ns HS, 6s HS, 2s6s HS, Ns6s HS, Ns2s HS, T ris HS y carga HS se pueden medir o determinar en los métodos de la invención.

[0177] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 2s6s CS, 2s4s CS, T ris CS, carga HS, 2s HS, Ns2s HS, Ns6s HS, T ris HS y HA tot.

[0179] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más de: 2s6s CS, 2s4s CS, Tris CS, carga HS, 2s HS, Ns2s HS, Ns6s HS y Tris HS.

[0181] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 2s6s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS cargan HS, 2s HS, Ns2s HS, Ns6s HS, Tris HS y HA tot.

[0183] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 2s6s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS carga HS, 2s HS, Ns2s HS, Ns6s HS y Tris HS.

[0185] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga HS, 2s HS, Ns2s HS, Ns6s h S y Tris HS.

[0186] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga HS, 2s HS, Ns2s HS, Ns6s HS, Tris HS y HA tot.

[0188] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, no se determinan los niveles relativos de CS y HS (p. ej., no se determinan la proporción de CS/HS o la relación inversa de HS/CS).

[0190] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), se miden o determinan una o más formas de GAG con múltiples sitios de sulfatación (p. ej., 2 o 3). Por lo tanto, en algunas realizaciones, se miden o determinan una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris HS, Ns6s HS, Ns2s Hs y 2s6s HS. En algunas realizaciones, se miden o determinan una o más formas de CS con múltiples sitios de sulfatación (p. ej., 2 o 3).

[0192] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 2s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, Tris HS, Ns2s HS, 2s6s HS o 6s HS.

[0194] En algunas realizaciones de métodos de detección del cáncer de próstata, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de los siguientes: 2s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la inversa relación 0s CS/6s CS) o el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), Tris HS, Ns2s HS, 2s6s HS o 6s HS.

[0196] Opcionalmente, en algunas realizaciones (p. ej., los métodos de detección del cáncer de próstata), los métodos pueden comprender además medir (o determinar) una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 4s CS, CS Tot, HS Tot y HA Tot (p. ej., además de una o más de las otras propiedades del GAG o grupos de propiedades del GAG descritas o enumeradas en otra parte de la presente memoria).

[0198] En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), no se miden ni determinan una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 4s CS, CS Tot y HS Tot. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), no se miden ni determinan una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 4s CS, CS Tot, HS Tot y HA Tot. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), no se miden ni determinan una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en CS Tot, HS Tot y HA Tot. Por lo tanto, en algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), no se mide ni se determina la 0s CS. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), el 4s CS no se mide ni se determina. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), el CS tot no se mide ni se determina. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), el HS tot no se mide ni se determina. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), el HA tot no se mide ni se determina. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), no se miden ni determinan una o ambas propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS y 4s CS. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata) el CS de 0 s no se mide ni se determina. En algunas realizaciones (p. ej., en los métodos de detección del cáncer de próstata), no se miden ni determinan una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 4s CS, Tot CS, Tot HS y Tot HA.

[0200] En algunas realizaciones, no se mide ni determina una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en CS Tot, el nivel relativo de 4s CS a 6s CS, Ns HS, Ns6s HS, carga HS y 4s CS. En algunas realizaciones, una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en CS Tot, el nivel relativo de 4s CS a 6s CS y Ns HS no se mide ni determina. En algunas realizaciones, no se miden ni determinan una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en Ns6s HS, carga HS y 4s CS.

[0202] En algunas realizaciones, una o más (o todas) de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 2s CS, 4s CS, 2s4s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., la relación 4s CS/6s CS o la relación inversa 6s CS/4s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a No se miden 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS, 0s HS, Ns HS, Ns2s HS, el HS total, la carga HS, el HA total no se miden o determinado en muestras de plasma.

[0204] Basándose en las alteraciones observadas en los niveles de diversas formas de GAG en pacientes con cáncer (p. ej., pacientes con cáncer de próstata) frente a pacientes sanos, si se desea, se pueden diseñar métodos de puntuación, sistemas de puntuación, marcadores o fórmulas que usen tales niveles de diversas formas de GAG para llegar a una indicación, p. ej., en forma de un valor o puntuación, que a continuación, se puede utilizar para el diagnóstico. Los sistemas de puntuación y parámetros apropiados (p. ej., las formas de GAG) que se van a medir pueden diseñarse fácilmente basándose, por ejemplo, en los datos descritos en la presente memoria, por ejemplo, en la tabla B, por ejemplo, basándose en una o más de las características o propiedades individuales de GAG que muestran diferencias significativas en muestras particulares (sangre u orina) como se indica en la tabla B. En particular, las propiedades del GAG en la tabla B que son las más diferentes entre las muestras de cáncer de próstata y las muestras sanas (p. ej., una o más o todas las propiedades que tienen un valor de % en ROPE de 0,00 o cercano a 0,00, p. ej., se pueden seleccionar una o más o todas las propiedades que tengan un % en el valor ROPE igual o inferior a 5,00 o 4,00 o 3,00 o 2,00 o 1,00).

[0206] Con referencia a la tabla B, dos ejemplos de propiedades del GAG en sangre que son más diferenciales en el cáncer de próstata en comparación con los sujetos sanos en las muestras de sangre son 4s CS y 0s CS. Una fórmula simple puede basarse en la relación de estas dos propiedades:

[0208] [45CS]

[0209] Puntuación sanguínea =

[0210] [OsCS]

[0212] Un experto en la técnica puede diseñar los valores umbral o límite apropiados (utilizados para declarar una muestra positiva o negativa) para su utilización con esta fórmula. Por ejemplo, el inventor usó un valor límite de 0,2511, donde las puntuaciones por encima de este límite clasifican la muestra como cáncer de próstata con una precisión del 98 % y un AUC de 0,997.

[0214] En la sección de ejemplos de la presente memoria, se han diseñado sistemas de puntuación (fórmulas) utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer de próstata), pero igualmente un experto podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se analizarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a analizar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla B.

[0216] En la presente memoria se proporcionan algunos sistemas o métodos de puntuación preferidos y ejemplares (fórmulas).

[0218] En los sistemas de puntuación anteriores, los términos entre paréntesis representan la fracción de la forma de GAG particular en cuestión (como se describe en otra parte de la presente memoria).

[0220] Como se describe en el ejemplo 2 de la presente memoria, también se han diseñado puntuaciones que pueden diferenciar entre sujetos con cáncer y sujetos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección del cáncer (p. ej., el diagnóstico del cáncer, etc.). Estas puntuaciones de GAG son:

[0221]

[0223] ^ [gfcsl IOsCS]

[0225] [Ns2s HS]

[0226] Puntuación urinaria= 2 —?--------—

[0227] [4sCS]

[0229] P„untuaci.ó,n comb i i -na ida — (-P-u--n-t-u-a--c-ió--n--s-a-n-g--u-í-n-e-a--+---P-u--n-t-u-a-c--ió--n--u-r-i-n--a-r-i-a-)-

[0231] En los sistemas de puntuación anteriores, los términos entre paréntesis representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (como se describe en otra parte de la presente memoria). En algunas realizaciones, se prefieren las puntuaciones sanguíneas y combinadas anteriores (fórmulas) del ejemplo 2. En otras realizaciones, estas fórmulas específicas no se utilizan.

[0233] Un experto en la técnica puede diseñar valores umbral o límite apropiados (utilizados para declarar una muestra positiva o negativa) para su utilización con estas fórmulas.

[0235] En una realización, se utiliza la puntuación sanguínea anterior (o fórmula, la puntuación sanguínea del ejemplo 2) y la puntuación límite es de 0,961, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más superior a 0,961 es indicativa de cáncer. En algunas realizaciones, una puntuación que sea al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,961 es indicativa de que no hay cáncer (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0237] En una realización, se utiliza la puntuación combinada anterior (o fórmula, la puntuación combinada del ejemplo 2) y la puntuación límite es de 0,998, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más superior a 0,998 es indicativa de cáncer. En algunas realizaciones, una puntuación que sea al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,998 es indicativa de que no hay cáncer (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0239] Como se describe en el ejemplo 2, se calcularon las tres puntuaciones para cada muestra y se observó que las muestras de cáncer (casos) tenían puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras de control. La diferencia en las puntuaciones de GAG entre el cáncer (caso) y los controles examinados permitió discriminar a los sujetos con una precisión muy alta, ya que las curvas ROC generadas para cada puntuación de GAG tenían un AUC igual a 0,961 para la sangre, 0,942 para la orina y 0,998 para la combinación.

[0241] En general, estos resultados indican que se pueden diseñar puntuaciones a partir de mediciones en sangre u orina de propiedades específicas de los GAG para detectar el cáncer independientemente del tipo de cáncer.

[0243] Como se describe en el ejemplo 15 de la presente memoria, también se ha diseñado una puntuación alternativa (fórmula) que puede diferenciar entre sujetos con cáncer y sujetos sanos en muestras de sangre y, por lo tanto, puede utilizarse para la detección del cáncer (p. ej., el diagnóstico del cáncer, etc.) Esta puntuación de GAG, también denominada la presente memoria puntuación de GAG del cáncer n.° 2 (o puntuación del cáncer en sangre n.° 2), es:

[0245] [6s CS] [2s HS]Carga CS CS total+ L og 2 ( 1

[0246] [4s CS] [6s CS] [Os HS]

[0247] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS y elCS totales la concentración total de Cs (en pg/ml). En algunas realizaciones, se prefiere la puntuación n.° 2 del GAG del cáncer. Como se describe en el ejemplo 15, el rendimiento de esta puntuación de GAG se evaluó utilizando las curvas de características operativas del receptor (ROC, por sus siglas en inglés), y se encontró que el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) era de 0,986. Identificamos un límite óptimo igual a 1,39 para esta puntuación. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es 1,39, donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más superior a 1,39 es indicativa de cáncer. En algunas realizaciones, una puntuación que sea al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 1,39 es indicativa de que no hay cáncer (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0248] En los sistemas de puntuación anteriores, los términos entre paréntesis representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (como se describe en otra parte de la presente memoria). En otras realizaciones, estas fórmulas específicas no se utilizan.

[0250] Debe tenerse en cuenta que estos sistemas de puntuación preferidos se dan como ejemplos preferidos, en donde una puntuación alta da lugar a una detección positiva, un diagnóstico, etc., de la presencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Sin embargo, está claro que se podrían realizar cambios menores en esta fórmula y/o en los parámetros (propiedades del GAG, formas de GAG) medidos en una muestra en particular sin tener un impacto significativo en la puntuación o el resultado del diagnóstico.

[0252] Cuando el objetivo es proporcionar un sistema de puntuación en el que una puntuación alta es indicativa de la presencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata), a continuación convenientemente dicho sistema de puntuación puede diseñarse como una razón o fracción, en donde el numerador es la suma de los valores asociados con una o más propiedades del GAG (formas de GAG) asociadas con el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) y el denominador es la suma de los valores asociados con una o más propiedades del GAG (formas de GAG) asociadas con el estado sano.

[0253] Por supuesto, como se ha explicado anteriormente, también se podrían diseñar sistemas de puntuación alternativos (fórmulas) en los que, por ejemplo, el numerador sea la suma de los valores asociados con una o más propiedades del GAG (formas de GAG) asociadas con el estado sano y el denominador sea la suma de los valores asociados con una o más propiedades del GAG (formas de GAG) asociadas con el cáncer (p. ej., cáncer de próstata), y una puntuación baja sea indicativa de la presencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0255] p. ej., se pueden utilizar métodos de puntuación, sistemas de puntuación, marcadores o fórmulas alternativos que comprendan cualquier combinación apropiada de las propiedades del GAG para llegar a una indicación, p. ej., en forma de un valor o puntuación, que a continuación, se puede utilizar para el diagnóstico del cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Por ejemplo, dichos métodos, etc., pueden ser un algoritmo que comprenda cualquier combinación apropiada de las propiedades del GAG como entrada, para, p. ej., realizar el reconocimiento del patrón de las muestras, para llegar a una indicación, p. ej., en forma de un valor o puntuación, que a continuación, se puede utilizar para el diagnóstico del cáncer (p. ej., el cáncer de próstata). Los ejemplos no limitativos de tales algoritmos incluyen algoritmos de aprendizaje automático que implementan la clasificación (clasificadores algorítmicos), tales como los clasificadores lineales (p. ej., el discriminante lineal de Fisher, la regresión logística, el clasificador bayesiano no ajustado, el perceptrón); máquinas vectoriales de soporte (p. ej., máquinas vectoriales de soporte de mínimos cuadrados); clasificadores cuadráticos; estimación del núcleo (p. ej., k-vecino más cercano); impulsar; árboles de decisión (p. ej., bosques aleatorios); redes neuronales; cuantificación vectorial de aprendizaje.

[0257] La utilización de tales clasificadores, p. ej., clasificadores de aprendizaje automático, p. ej., clasificadores forestales aleatorios, estaría dentro de las habilidades de un experto en la técnica. Por ejemplo, tales clasificadores pueden entrenarse convenientemente sobre las propiedades del GAG a partir de un conjunto de muestras de entrenamiento y a continuación, probarse en términos de precisión en un conjunto de muestras de prueba. El clasificador genera un modelo de caja negra que se entrena en las propiedades más importantes de los GAG y, por lo tanto, se puede utilizar para identificar las propiedades más importantes de los GAG que se pueden utilizar para llegar a un diagnóstico preciso del cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0259] Al utilizar un clasificador forestal aleatorio, las cinco propiedades de los GAG más importantes para un diagnóstico preciso del cáncer de próstata en sangre fueron (en orden): la relación entre 4s CS y 0s CS, 0s CS, 4s CS, carga CS y HS total. Las siguientes nueve propiedades más importantes de los GAG en la sangre fueron (en orden): 6s CS, la relación de 6s CS a 0s CS, 4s6s CS, la relación de 4s CS a 6s CS, 2s CS, 2s6s CS, Tris HS, Ns HS y 2s4s CS (ver Figura 8). Por lo tanto, una o más, dos o más, tres o más, etc., o las 5 o las 14 de estas formas de GAG pueden medirse en los métodos de la invención, siendo esencial que se mida 6s CS.

[0261] El rendimiento de las tres puntuaciones específicas del cáncer de próstata indicadas anteriormente (sangre, orina y puntuaciones combinadas) se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (es decir, un clasificador perfecto) en el caso de la puntuación combinada, 0,997 para la puntuación sanguínea y 0,994 para la puntuación en orina. Esto se muestra en la Figura 5 y en la tabla C. En conjunto, estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química del GAG en sangre y orina que se producen en el cáncer de próstata pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con cáncer de próstata de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc.

[0263] El rendimiento de las tres puntuaciones de cáncer específicas (puntuaciones de cáncer del ejemplo 2) indicadas anteriormente (puntuaciones de sangre, orina y puntuaciones combinadas) se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,961 para la sangre, 0,942 para la orina y 0,998 para la combinación. Esto se muestra en la Figura 15. En conjunto, estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG en sangre y orina que se producen en el cáncer pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con cáncer de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc.

[0265] En los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Tales puntuaciones o valores límite pueden utilizarse para declarar una muestra positiva o negativa. Por lo tanto, por ejemplo, en el ejemplo 1 de la presente memoria, para los tres sistemas de marcadores de cáncer de próstata específicos explicados anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer de próstata en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la probabilidad máxima de no ser cáncer de próstata o, dicho de otro modo, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor umbral (límite). el valor off tiene la probabilidad máxima de ser cáncer de próstata. Estas puntuaciones límite fueron de 0,63 (para la puntuación de los marcadores sanguíneos), 0,19 (para la puntuación de los marcadores de orina) y 0,47 (para la puntuación de los marcadores combinados), véase la figura 5. Esta forma de determinar los valores umbral podría utilizarse para cualquiera de los marcadores descritos en la presente memoria. Tales puntuaciones de umbral (límite) se pueden utilizar a continuación, convenientemente para evaluar las muestras apropiadas en los sujetos y llegar a un diagnóstico. Usando los puntos límite descritos anteriormente, los sujetos con cáncer de próstata podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 97,4 % utilizando la puntuación en sangre u orina, y con una precisión del 100 % utilizando la puntuación combinada. Al utilizar un valor límite o umbral adecuado (utilizado para declarar una muestra positiva o negativa), las puntuaciones explicadas anteriormente muestran excelentes resultados (AUC de 1 para la puntuación combinada, AUC de 0,997 para la puntuación sanguínea y AUC de 0,994 para la puntuación de orina), con una sensibilidad del 100 % para las tres puntuaciones de los tres marcadores y especificidades del 100 % (para la puntuación del marcador combinado), el 96 % (para la puntuación del marcador sanguíneo) y el 96 % (para la puntuación de marcadores de orina), véase la tabla C. Por lo tanto, estos resultados muestran que la invención anterior proporciona una prueba sencilla y accesible para permitir un diagnóstico preciso de la presencia de cáncer de próstata en un individuo.

[0267] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el melanoma (p. ej., el melanoma cutáneo o el melanoma uveal).

[0269] Según la presente invención, en los métodos de detección del melanoma, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de melanoma en dicho sujeto.

[0271] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del melanoma, las formas de GAG particularmente preferidas para medir o determinar en muestras de sangre son todas ellas: 4s6s CS, 6s CS, 4s CS, CS total, HA total, 0s HS, Ns HS y 2s HS. En tales realizaciones, las formas de GAG particularmente preferidas que se van a medir o determinar son todas: 6s CS, 4s CS y CS total.

[0273] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del melanoma, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 6s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), CS total, 2s HS, 0s HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de melanoma.

[0275] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del melanoma, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 6s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS) y C<s>total.

[0277] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del melanoma, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: 2s HS, 0s HS y HS total.

[0279] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del melanoma, hay un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS) y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de melanoma en dicho sujeto.

[0281] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en la detección del melanoma en muestras de sangre son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla M, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0283] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de melanoma en muestras de sangre, los métodos implican la determinación de uno (o ambos) de: CS total y 2s HS.

[0284] En el ejemplo 3 de la presente memoria, los sistemas de puntuación (fórmulas) se diseñaron utilizando mediciones de múltiples formas de Ga G de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de melanoma), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se van a explicar en tal sistema de puntuación también se pueden elegir en basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla M. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., de diagnóstico) del melanoma.

[0286] Para el melanoma, un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0288] Fórmula de puntuación para el melanoma n.° 1

[0291]

[0293] [Os HS] 1 , r

[0294] ~ [Os HS] + [A/s HS] ~ 1000 ([2SH S]+ [° SWS])

[0296] Para el melanoma, otro sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0298] Fórmula de puntuación para el melanoma n.° 2

[0300] P runtuaci .ó.nr GAíG r dj eu M.2 -- 4-[-6--s-- C--S--]- +- J 5q[qT-o--t- C---S-]- 5 ( [4s CS [6]s + C [S6]s CS]

[0302] En los sistemas de puntuación anteriores, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria) y [7ot CS] es la concentración total de CS (en pg/ml) y [7otHA]es la concentración total de HA (en pg/ml).

[0304] El rendimiento de la fórmula de puntuación n.° 1 del melanoma indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,973. Esto se describe en el ejemplo 3.

[0306] El rendimiento de la fórmula de puntuación n.° 2 del melanoma indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,933. Esto se describe en el ejemplo 3.

[0308] Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el melanoma pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con melanoma de los individuos sanos y, por lo tanto, se pueden utilizar para la detección, el diagnóstico, etc. La explicación en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se criba el melanoma (p. ej., se diagnostica).

[0310] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para los sistemas de marcadores (puntuación) de melanoma descritos anteriormente, se determinaron/seleccionaron las puntuaciones de umbral (límite) óptimas que maximizarían la precisión en la clasificación de los sujetos con melanoma en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser melanoma o, dicho de otra forma, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de no ser melanoma.

[0312] La puntuación límite óptima fue de 0,92 para la fórmula de puntuación n.° 1 para el melanoma. Por lo tanto, en una realización, se utiliza la fórmula de puntuación del melanoma n.° 1 y la puntuación límite es de 0,92, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de melanoma y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser melanoma (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,92 es indicativa de melanoma. En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,92 es indicativa de que no hay melanoma (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0314] La puntuación límite óptima fue de 1,19 para la fórmula de puntuación n.° 2 para el melanoma. Por lo tanto, en una realización, se utiliza la fórmula de puntuación del melanoma n.° 2 y la puntuación límite es 1,19, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de melanoma y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser melanoma (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más superior a 1,19 es indicativa de melanoma. En algunas realizaciones, una puntuación que sea al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 1,19 es indicativa de que no hay melanoma (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0316] Como se ha indicado anteriormente, los cánceres preferidos según la invención incluyen el cáncer de colon y el cáncer de recto. Estos cánceres también pueden denominarse colectivamente cáncer colorrectal.

[0318] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de colon y el cáncer de recto, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de colon o cáncer de recto en dicho sujeto.

[0320] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer colorrectal (o el cáncer de colon o el cáncer de recto), las formas de GAG particularmente preferidas para medir o determinar en muestras de sangre son todas las siguientes: 6s CS, 4sCS, 2s6s CS, 2sCS, 6sHS, 2s HS y HS total.

[0322] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer colorrectal, los métodos implican la determinación de todos los siguientes: 2s CS, 6s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o relación inversa 0s CS/6s CS), CS total, Ns6s HS, Ns2s HS, 2s6s HS, 6s HS, 2s HS, 0s HS, carga HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer colorrectal.

[0324] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer colorrectal, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: 2s CS, 6s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, T ris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o relación inversa 0s CS/6s CS) y CS total.

[0326] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer colorrectal, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns6s HS, Ns2s HS, 2s6s HS, 6s HS, 2s HS, 0s HS, carga HS y HS total.

[0328] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer colorrectal, se produce un aumento (p. ej., en las muestras de sangre) en todos los casos: 2s CS, 6s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS) y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer colorrectal en dicho sujeto.

[0330] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que se pueden utilizar en la detección del cáncer colorrectal (p. ej., en muestras de sangre) son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla O, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0332] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer colorrectal en muestras de sangre, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: Tris CS, CS total, Ns6s HS, 2s6s HS, 6s HS y 2s HS.

[0334] En el ejemplo 4 de la presente memoria, se ha diseñado un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer colorrectal), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se van a explicar en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla O. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., de diagnóstico) del cáncer colorrectal.

[0336] Para el cáncer colorrectal, un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0337]

[0340] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma particular de GAG en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria) yTot HSes la concentración total de HS (en pg/ml).

[0342] El rendimiento de la puntuación de la enfermedad del cáncer colorrectal indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,998. Esto se describe en el ejemplo 4. Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el cáncer colorrectal pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con cáncer colorrectal de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. La explicación en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se criba el cáncer colorrectal (p. ej., se diagnostica).

[0344] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para el sistema de marcadores (puntuación) del cáncer colorrectal explicado anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer colorrectal en contraposición a la de los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer colorrectal o, dicho de otra forma, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer colorrectal de ser cáncer colorrectal. Esta puntuación límite óptima fue de 0,74. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es de 0,74, donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer colorrectal y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer colorrectal (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,74 es indicativa de cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,74 es indicativa de que no hay cáncer colorrectal (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0345] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es un tumor neuroendocrino (p. ej., un tumor neuroendocrino gastrointestinal, GNET).

[0347] Según la presente invención, en los métodos de detección de un tumor neuroendocrino, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de un tumor neuroendocrino en dicho sujeto.

[0349] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de tumores neuroendocrinos (preferiblemente el GNET), las formas de GAG particularmente preferidas que se miden o determinan en muestras de sangre en los métodos de la invención son una o más (o todas) de: 2s6s CS, Tris CS, carga CS, 2s HS y 0s HS.

[0351] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de un tumor neuroendocrino (preferiblemente el GNET), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación de 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS) S CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, Ns6s HS, Ns HS, 6s HS, 2s HS, 0s HS, carga HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de un tumor neuroendocrino (preferiblemente GNET).

[0353] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de tumores neuroendocrinos (preferiblemente el GNET), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación de 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS) y la carga CS.

[0355] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de tumores neuroendocrinos (preferiblemente GNET), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns6s HS, Ns HS, 6s HS, 2s HS, sangre 0s HS, carga HS y HS total.

[0356] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de tumores neuroendocrinos (preferiblemente el GNET), se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS) y carga CS, en comparación con un nivel de control, es indicativo de tumor neuroendocrino (preferiblemente GNET) en dicho sujeto.

[0358] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en el cribado de tumores neuroendocrinos (preferiblemente GNET) en muestras de sangre son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla Q, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0360] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de tumores neuroendocrinos (preferiblemente GNET) en muestras de sangre, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0s CS, Tris CS, Ns6s HS, 6s HS y 2s HS.

[0362] En el ejemplo 5 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de g Ag de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de un tumor neuroendocrino, particularmente GNET), pero igualmente un experto podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se explicarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla Q. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) de un tumor neuroendocrino (preferiblemente GNET).

[0363] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de sangre (p. ej., leucemia linfoide crónica, CLL).

[0365] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de sangre, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de sangre en dicho sujeto.

[0367] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), las formas de GAG particularmente preferidas para medir o determinar en muestras de sangre son todas las siguientes: 6s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, carga CS, 6s HS y 0s HS. En algunas realizaciones, las formas de GAG particularmente preferidas que se van a medir o determinar son todas: 6s CS, 2s6s CS, 4s6s CS, 4s CS y 6s CS (y opcionalmente el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS)).

[0369] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, Ns6s HS, Ns HS, 2s6s HS, 6s HS, 2s HS, 0s HS, carga HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente CLL).

[0371] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todo: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0373] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns6s HS, Ns HS, 2s6s HS, 6s HS, 2s HS, 0s HS, de carga y HS total.

[0375] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), la carga CS y el CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer (preferiblemente CLL) en dicho sujeto.

[0376] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en la detección del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL) en muestras de sangre son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla S, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0378] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), los métodos implican la determinación de uno (o ambos) de: 0s CS, CS Total, Ns6s HS, 2s6s HS, 6s HS y 2s HS.

[0380] En el ejemplo 6 de la presente memoria, los sistemas de puntuación (fórmulas) se diseñaron utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer de sangre, particularmente CLL), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se explicarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla S. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del cáncer de sangre (preferiblemente la CLL).

[0382] Para el cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0384] Fórmula de untuación CLL n.° 1

[0387]

[0390] Para el cáncer de sangre (preferiblemente la CLL), otro sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0393]

[0396] En los sistemas de puntuación anteriores, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria) y [7otHS]es la concentración total de HS (en pg/ml) ycarga CSes la carga ponderada de CS.

[0397] El rendimiento de la fórmula de puntuación de la CLL n.° 1 indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,974. Esto se describe en el ejemplo 6.

[0399] El rendimiento de la fórmula de puntuación de la CLL n.° 2 indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,974. Esto se describe en el ejemplo 6.

[0401] Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el cáncer de sangre (preferiblemente la CLL) pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con cáncer de sangre (particularmente con CLL) de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. La explicación en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se examina (p. ej., se diagnostica) el cáncer de sangre (preferiblemente la CLL).

[0403] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para los sistemas de marcadores (puntuación) de la CLL explicados anteriormente, se determinaron/seleccionaron puntuaciones umbrales óptimas (límite) que maximizarían la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer de sangre (particularmente la CLL) en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer de sangre (particularmente la CLL) o, dicho de otro modo, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor umbral (punto límite). El valor t-off tiene la probabilidad máxima de ser cáncer de sangre (particularmente CLL).

[0405] La puntuación límite óptima fue de 0,25 para la fórmula de puntuación n.° 1 de la CLL. Por lo tanto, en una realización, se utiliza la fórmula n.° 1 de puntuación de la CLL y la puntuación límite es de 0,25, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente CLL) y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer de sangre (preferiblemente CLL) (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,25 es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente CLL). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,25 es indicativa de que no hay cáncer de sangre (preferiblemente CLL) (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0407] La puntuación límite óptima fue de 0,23 para la fórmula de puntuación n.° 2 de la CLL. Por lo tanto, en una realización, se utiliza la fórmula n.° 2 de puntuación de la CLL y la puntuación límite es la CLL, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente CLL) y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer de sangre (preferiblemente CLL) (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,23 es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente CLL). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,23 es indicativa de que no hay cáncer de sangre (preferiblemente CLL) (p. ej., indicativo de un sujeto normal o sano).

[0409] Como se ha indicado anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de mama (BC).

[0411] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de mama, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de mama en dicho sujeto.

[0413] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del BC, las formas de GAG particularmente preferidas para medir o determinar en muestras de sangre en los métodos de la invención son todas ellas: 6 CS, 0 CS, carga CS y CS total. En algunas de tales realizaciones, se mide o determina el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS).

[0415] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, Ns2s HS, Ns h S, 6s HS, 0s HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de mama.

[0417] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0419] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del BC, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns2s HS, Ns HS, 6s HS, 0s HS y HS total.

[0421] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del BC, se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), la carga CS y el CS total, en comparación con un nivel de control, son indicativos de BC en dicho sujeto.

[0423] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que se pueden utilizar en la detección del BC (p. ej., en muestras de sangre) son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla V, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0425] En algunas realizaciones, en los métodos de detección de BC en muestras de sangre, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0s CS, total CS y 6s HS.

[0427] En el ejemplo 8 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de g Ag de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de BC), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se explicarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla V. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) de la BC.

[0429] Para la BC, un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0432]

[0435] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria), lacarga CSes la carga ponderada de CS yTotCs es la concentración total de CS (en pg/ml).

[0436] El rendimiento de la puntuación de la enfermedad de BC indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Esto se describe en el ejemplo 8. Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el b C pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con BC de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. El análisis en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se explica el BC (p. ej., se diagnostica).

[0438] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para el sistema de marcadores (puntuación) de BC explicado anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con BC en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador esté por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser BC o, dicho de otro modo, una muestra cuya puntuación de marcador esté por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de no ser BC. Esta puntuación límite óptima fue de 0,94. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es de 0,94, en donde una puntuación por encima de esta puntuación de límite es indicativa de b C y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de que no es BC (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más superior a 0,94 es indicativa de BC. En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,94 es indicativa de que no hay BC (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0439] Como se ha indicado anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de ovario (OV).

[0441] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de ovario, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de ovario en dicho sujeto.

[0443] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, las formas de GAG particularmente preferidas que se miden o determinan en muestras de sangre en los métodos de la invención son una o más (o todas) de: carga CS, CS total, HS total y HA total.

[0445] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, HS total y HA total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de ovario.

[0447] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0448] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre del HS total.

[0449] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre del HA total.

[0450] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), carga CS y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de OV en dicho tema.

[0451] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en el cribado de OV en muestras de sangre son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla X, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0452] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el OV, los métodos implican la determinación de uno (o ambos) de: 0s CS y CS total.

[0453] En el ejemplo 9 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de g Ag de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de OV), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se explicarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla X. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del OV.

[0454] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de útero (p. ej., cáncer de endometrio, EC).

[0455] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de útero, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de útero en dicho sujeto.

[0456] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente la EC), las formas de GAG particularmente preferidas que se miden o determinan en muestras de sangre en los métodos de la invención son todas las siguientes: carga CS, 6s CS, 2s4s CS, CS total y HS total.

[0457] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente la EC), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS, el CS total, el HS total y el HA total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de útero (preferiblemente EC). En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente la EC), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0458] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente la EC), los métodos implican la determinación en muestras de sangre del HS total.

[0459] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente la EC), los métodos implican la determinación en muestras de sangre del HA total.

[0460] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente la EC), se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), carga CS y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de útero (preferiblemente EC) en dicho tema.

[0461] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en el cribado del cáncer de útero (preferiblemente EC) en muestras de sangre son aquellas formas de GAG identificadas por tener un % en el valor ROPE inferior a 5,00 en la tabla Z, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0463] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el cáncer de útero (preferiblemente la EC), los métodos implican la determinación de uno (o ambos) de: 0s CS y CS total.

[0465] En el ejemplo 10 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer de útero, preferiblemente EC), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se van a explicar en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a explicar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla Z. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del cáncer de útero (preferiblemente EC).

[0467] Para el cáncer de útero (preferiblemente EC), un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0469]

[0471] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria), lacarga CSes la carga ponderada de CS,TotCS es la concentración total de CS (en pp/ml) yTot HSes la concentración total de HS (en pp/ml).

[0473] El rendimiento de la puntuación de la enfermedad de EC indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Esto se describe en el ejemplo 10. Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el cáncer de útero (especialmente en el EC) pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a las personas con cáncer de útero (particularmente con EC) de las personas sanas y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. El análisis en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se examina (p. ej., se diagnostica) el cáncer de útero (preferiblemente la EC).

[0475] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para el sistema de marcadores (puntuación) de EC explicado anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer de útero (particularmente EC) en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer de útero (particularmente EC) o, dicho de otra forma, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de ser cáncer de útero (especialmente EC). Esta puntuación límite óptima fue de 0,97. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es de 0,97, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer de útero (preferiblemente EC) y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer de útero (preferiblemente EC) (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,97 es indicativa de cáncer de útero (preferiblemente EC). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,97 es indicativa de que no hay cáncer de útero (preferiblemente EC) (p. ej., indicativo de un sujeto normal o sano).

[0477] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de útero (p. ej., el cáncer de cuello uterino, también denominado en la presente memoria CST).

[0479] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de útero, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de útero en dicho sujeto.

[0481] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente el CST), las formas de GAG particularmente preferidas para medir o determinar en muestras de sangre son todas ellas: carga CS, 6s CS, CS total, Ns2s HS y HS total.

[0482] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente el CST), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS, el CS total, el Ns2s HS, el 6s HS, el HS total y el HA total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de útero (preferiblemente CST).

[0484] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente el CST), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0486] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente el CST), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns2s HS, 6s HS y HS total.

[0488] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente el CST), los métodos implican la determinación en muestras de sangre del HA total.

[0490] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero (preferiblemente el CST), se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), carga CS y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de útero (preferiblemente CST) en dicho tema.

[0492] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que se pueden utilizar en la detección del cáncer de útero (preferiblemente CST) (p. ej., en muestras de sangre) son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla AB, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0494] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el cáncer de útero (preferiblemente el CST), los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0s CS, total CS y 6s HS.

[0495] En el ejemplo 11 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer de útero, particularmente CST), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se analizarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a analizar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla AB. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del cáncer de útero (preferiblemente el CST).

[0497] Para el cáncer de útero (preferiblemente CST), un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0500]

[0503] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria), lacarga CSes la carga ponderada de CS,TotCS es la concentración total de CS (en pp/ml) yTot HSes la concentración total de HS (en pp/ml).

[0505] El rendimiento de la puntuación de la enfermedad del CST indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 1 (clasificador perfecto). Esto se describe en el ejemplo 11. Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el cáncer de útero (especialmente en el CST) pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a las personas con cáncer de útero (particularmente con CST) de las personas sanas y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. El análisis en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se examina (p. ej., se diagnostica) el cáncer de útero (preferiblemente el CST).

[0507] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para el sistema de marcadores (puntuación) de CST explicado anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer de útero (particularmente CST) en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer de útero (particularmente CST) o, dicho de otra forma, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de ser cáncer de útero (especialmente CST). Esta puntuación límite óptima fue de 0,71. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es de 0,71, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer de útero (preferiblemente CST) y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer de útero (preferiblemente CST) (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,71 es indicativa de cáncer de útero (preferiblemente CST). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,71 es indicativa de que no hay cáncer de útero (preferiblemente CST) (p. ej., indicativo de un sujeto normal o sano).

[0509] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de sangre (p. ej., linfoma no hodgkiniano, NHL).

[0511] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de sangre, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de sangre en dicho sujeto.

[0513] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente el NHL), las formas de GAG particularmente preferidas que se miden o determinan en muestras de sangre en los métodos de la invención son todas: carga CS, 6s CS, Tris CS, carga HS y HS total.

[0515] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente NHL), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, Tris HS, Ns2s HS, Ns HS, 6s HS, 0s HS, carga HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente NHL).

[0517] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente NHL), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0519] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente NHL), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: T ris HS, Ns2s HS, Ns HS, 6s HS, 0s HS, carga HS y HS total.

[0521] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre (preferiblemente el linfoma no hodgkiniano), se produce un aumento (p. ej., en las muestras de sangre) en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), carga CS y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de sangre (preferiblemente NHL) en dicho sujeto.

[0523] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en la detección del cáncer de sangre (preferiblemente del NHL) (p. ej., en muestras de sangre) son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla AD, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0525] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el cáncer de sangre (preferiblemente NHL), los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0 CS, Tris CS, CS total, Tris HS y 6s HS.

[0526] En el ejemplo 12 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer de sangre, particularmente NHL), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se analizarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a analizar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla AD. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis puede aplicarse,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del cáncer de sangre (preferiblemente el NHL).

[0528] Para el cáncer de sangre (preferiblemente NHL), un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0531]

[0534] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria), lacarga CSes la carga ponderada de CS, lacarga HSes la carga ponderada de HS yTot HSes la concentración total de HS (en pg/ml).

[0536] El rendimiento de la puntuación de la enfermedad de NHL indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Esto se describe en el ejemplo 12. Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el cáncer de sangre (especialmente en el linfoma no hodgkiniano) pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con cáncer de sangre (particularmente con NHL) de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. La explicación en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se examina (p. ej., se diagnostica) el cáncer de sangre (preferiblemente el NHL).

[0538] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para el sistema de marcadores (puntuación) de NHL explicado anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer de sangre (particularmente NHL) en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer de sangre (particularmente NHL) o, dicho de otra forma, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor umbral (límite). El valor t-off tiene la probabilidad máxima de ser cáncer de sangre (particularmente NHL). Esta puntuación límite óptima fue de 0,97. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es de 0,97, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente NHL) y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer de sangre (preferiblemente NHL) (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,97 es indicativa de cáncer de sangre (preferiblemente NHL). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,97 es indicativa de que no hay cáncer de sangre (preferiblemente NHL) (p. ej., indicativo de un sujeto normal o sano).

[0540] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de cerebro (p. ej., el glioma difuso, DG, por sus siglas en inglés).

[0542] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de cerebro, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de cerebro en dicho sujeto.

[0544] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de cerebro (preferiblemente el DG), las formas de GAG particularmente preferidas que se miden o determinan en muestras de sangre son todas las siguientes: carga CS, 6 segundos CS, total CS, total HA y 0s HS.

[0546] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de cerebro (preferiblemente el DG), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, Ns HS, 6s HS, 0s HS, carga HS, HS total y HA total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de cerebro (preferiblemente DG).

[0548] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de cerebro (preferiblemente el DG), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0550] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de cerebro (preferiblemente el DG), los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: NS HS, 6 HS, 0 HS, carga HS y HS total.

[0551] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de cerebro (preferiblemente DG), los métodos implican la determinación en muestras de sangre del HA total.

[0553] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de cerebro (preferiblemente el DG), se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), carga C<s>y CS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de cerebro (preferiblemente DG) en dicho tema.

[0555] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en la detección del cáncer de cerebro (preferiblemente<d>G) (p. ej., en muestras de sangre) son aquellas formas de GAG identificadas por tener un % en el valor ROPE inferior a 5,00 en la tabla AF, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0557] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el cáncer de cerebro (preferiblemente el DG), los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0 CS, Tris CS, CS total y 6s HS.

[0559] En el ejemplo 13 de la presente memoria, se diseñó un sistema de puntuación (fórmula) utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de cáncer de cerebro, particularmente DG), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se analizarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a analizar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla AF. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis puede aplicarse,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del cáncer de cerebro (preferiblemente DG).

[0561] Para el cáncer de cerebro (preferiblemente DG), un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0564]

[0567] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria), lacarga CSes la carga ponderada de CS, elCS totales la concentración total de CS (en |jp/ml) y el HA total es la concentraciónHA total(en |jp/ml).

[0569] El rendimiento de la puntuación de la enfermedad de DG indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Esto se describe en el ejemplo 13. Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el cáncer de cerebro (especialmente en el DG) pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con cáncer de cerebro (particularmente con DG) de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. El análisis en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se criba (p. ej., se diagnostica) el cáncer de cerebro (preferiblemente el DG).

[0571] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para el sistema de marcadores (puntuación) de DG explicado anteriormente, se determinó/seleccionó una puntuación umbral (límite) óptima que maximizaría la precisión en la clasificación de los sujetos con cáncer de cerebro (particularmente DG) en comparación con los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser cáncer de cerebro (particularmente DG) o, dicho de otra forma, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor umbral (punto límite) El valor t-off tiene la máxima probabilidad de ser cáncer de cerebro (especialmente DG). Esta puntuación límite óptima fue de 0,95. Por lo tanto, en una realización, la puntuación límite es de 0,95, donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de cáncer de cerebro (preferiblemente DG) y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser cáncer de cerebro (preferiblemente DG) (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más de 0,95 es indicativa de cáncer de cerebro (preferiblemente DG). En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,95 es indicativa de que no hay cáncer de cerebro (preferiblemente DG) (p. ej., indicativo de un sujeto normal o sano).

[0573] Como se ha indicado anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de pulmón (LC).

[0575] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de pulmón, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de pulmón en dicho sujeto.

[0577] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del LC, las formas de GAG particularmente preferidas para medir o determinar en muestras de sangre son todas ellas: CS total, 4s CS, 6s CS, 0s HS y carga CS (y opcionalmente se mide o determina el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS (p. ej., 4s CS/6s CS)).

[0579] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 2s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, Ns6s HS, Ns2s Hs , 6s HS, 0s HS, carga HS y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de todas dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de pulmón.

[0581] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del OV, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 2s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS y el CS total.

[0583] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del LC, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns6s HS, Ns2s HS, 6s HS, 0s HS, carga HS y HS total.

[0585] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del LC, se produce un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 2s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, Tris CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS), carga CS y CS total, por ejemplo, en comparación con un nivel de control, es indicativo de LC en dicho sujeto.

[0587] Las formas (o propiedades) de GAG preferidas que pueden utilizarse en el cribado de LC (p. ej., en muestras de sangre) son aquellas formas de GAG identificadas por tener un valor de % en ROPE inferior a 5,00 en la tabla AH, p. ej., inferior a 4,00. 3,00, 2,00, 1,00 o incluso un valor de 0,00.

[0589] En algunas realizaciones, en los métodos de cribado en muestras de sangre para detectar el LC, los métodos implican la determinación de uno o más (o todos) de: 0s CS, Tris CS, carga CS, CS total, Ns6s HS y 6s HS.

[0591] En el ejemplo 14 de la presente memoria, los sistemas de puntuación (fórmulas) se diseñaron utilizando mediciones de múltiples formas de GAG de tal modo que una puntuación alta (o una puntuación elevada) dé como resultado un diagnóstico positivo (es decir, el hallazgo de la presencia de LC), pero igualmente un experto en la técnica podría diseñar y elegir fácilmente el método de puntuación y los parámetros utilizados en tal método de puntuación de tal modo que una puntuación baja (o disminuida) dé lugar a un diagnóstico positivo. Las características relevantes que se analizarán en tal sistema de puntuación también se pueden elegir basándose en el tipo de muestra que se va a analizar, de nuevo, por ejemplo, utilizando los datos que se presentan en la tabla AH. Los sistemas de puntuación se explican en otra parte de la presente memoria y ese análisis se puede aplicar,mutatis mutandis,a los métodos de detección (p. ej., diagnóstico) del LC.

[0593] Para el LC, un sistema de puntuación preferido que da lugar a una puntuación cuando se analiza una muestra de sangre de un sujeto es:

[0594] Fórmula de puntuación LC 1

[0597]

[0599] En el sistema de puntuación anterior, los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) de la forma de GAG particular en cuestión (disacárido para el GAG correspondiente) (como se describe en otra parte de la presente memoria). El CS total es la concentraciónCS total(en pg/ml).

[0600] El rendimiento de la fórmula de puntuación LC n.° 1 indicada anteriormente se evaluó utilizando las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,986. Esto se describe en el ejemplo 14.

[0601] Estos hallazgos demuestran que las alteraciones en la composición química de los GAG (p. ej., en muestras de sangre) que se producen en el LC pueden resumirse en puntuaciones. A su vez, estas puntuaciones distinguen con precisión a los individuos con LC de los individuos sanos y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección, el diagnóstico, etc. El análisis en otra parte de la presente memoria en relación con los sistemas de puntuación puede aplicarse,mutatis mutandis,a las realizaciones de la invención en las que se explica el LC (p. ej., se diagnostica).

[0602] Como se describe en otra parte de la presente memoria, en los métodos de la invención, las puntuaciones o valores de umbral o límite apropiados pueden calcularse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la curva ROC, para su utilización en los métodos de la invención. Para los sistemas de marcadores (puntuación) de LC explicados anteriormente, se determinaron/seleccionaron puntuaciones de umbral (límite) óptimas que maximizarían la precisión en la clasificación de los sujetos con LC en contraposición a las de los sujetos sanos, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador esté por debajo de este valor umbral (límite) tiene la máxima probabilidad de no ser LC o, dicho de otro modo, una muestra cuya puntuación de marcador esté por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de ser LC.

[0603] La puntuación límite óptima fue de 0,83 para la fórmula de puntuación n.° 1 del LC. Por lo tanto, en una realización, se utiliza la fórmula de puntuación LC n.° 1 y la puntuación límite es de 0,83, en donde una puntuación por encima de esta puntuación límite es indicativa de LC y una puntuación por debajo de esta puntuación límite es indicativa de no ser LC (p. ej., indicativa de una muestra normal o sana). En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más superior a 0,83 es indicativa de LC. En algunas realizaciones, una puntuación que sea de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o más inferior a 0,83 es indicativa de que no hay LC (p. ej., indicativa de un sujeto normal o sano).

[0604] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de sangre (p. ej., CLL o NHL). Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de sangre, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de sangre en dicho sujeto.

[0605] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), carga CS, CS total, Ns HS, 6s HS, 0s HS, carga<h>S y HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de sangre.

[0606] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de sangre, un aumento en las muestras de sangre en todos los casos: 6s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/0s CS, carga CS, CS total, Ns HS, 6s HS, carga HS y HS total, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de sangre en dicho sujeto.

[0607] En algunas de tales realizaciones, en los métodos de detección de la NHL, los métodos comprenden además la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Tris CS, Tris HS y Ns2s HS.

[0608] En algunas de tales realizaciones, en los métodos de detección de la CLL, los métodos comprenden además la determinación en muestras de sangre de uno o más (o todos) de: Ns6s HS, 2s6s HS y 2s HS.

[0609] Como se indicó anteriormente, un cáncer preferido según la invención es el cáncer de útero (p. ej., EC o CST).

[0610] Según la presente invención, en los métodos de detección del cáncer de útero, se determina el nivel de la propiedad del GAG 6s CS y un nivel alterado de 6s CS en comparación con un nivel de control es indicativo de cáncer de útero en dicho sujeto.

[0612] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero, los métodos implican la determinación en muestras de sangre de todos los siguientes: 0s CS, 6s CS, 4s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 4s CS (p. ej., la relación 6s CS/4s CS o la relación inversa 4s CS/6s CS), el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 6s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/6s CS), el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS (p. ej., la relación 4s CS/0s CS o la relación inversa 0s CS/4s CS), la carga CS, el CS total, el HA total y el HS total. En algunas de tales realizaciones, una alteración en el nivel de dichas formas de GAG, en comparación con un nivel de control, es indicativa de cáncer de útero.

[0614] En algunas realizaciones, en los métodos de detección del cáncer de útero, un aumento en las muestras de sangre en todos los 6s CS, 4s<c>S, 2s4s CS, 4s6s CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/0s CS, carga CS, CS total, HA total y HS total, en comparación con un nivel de control, es indicativo de cáncer de útero en dicho sujeto.

[0616] Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, las puntuaciones de GAG (o fórmulas o fórmulas de puntuación) pueden utilizarse, p. ej., en combinación con las puntuaciones límite descritas, para discriminar entre un cáncer según la invención y muestras sanas (y por lo tanto entre sujetos con cáncer y sujetos sanos). En algunas otras realizaciones, estas puntuaciones de GAG exactas no se utilizan, pero se utilizan otras realizaciones de la invención, que por ejemplo, pueden emplear puntuaciones de GAG alternativas o, de hecho, que no emplean puntuaciones de GAG (fórmulas) en absoluto. En algunas de tales otras realizaciones se proporciona un método de detección (p. ej., diagnóstico de) un cáncer según la invención que es indicativo de cáncer si se hubiera hecho una indicación de cáncer si se hubiera utilizado la puntuación de GAG específica relevante (y opcionalmente la puntuación límite asociada) (es decir, si se hubiera utilizado en su lugar).

[0618] Como se explica en la presente memoria, los métodos de la presente invención pueden comprender determinar o medir una o más formas de GAG específicas (o grupos de formas de GAG) “ seleccionadas del grupo que consiste en” ciertas formas de GAG específicas (o grupos de formas de GAG) expuestas en la presente memoria. Para evitar dudas, en algunas realizaciones en los que se miden o determinan una o más de las formas de GAG específicas (o grupos de formas de GAG) explicadas en la presente memoria, se pueden medir o determinar adicionalmente una o más formas de GAG diferentes (o distintas) y/o uno o más de otros biomarcadores y, según la invención, es esencial que se mida o determine el 6s CS. Por lo tanto, “seleccionado del grupo que consiste en” puede ser un término “ abierto” . En algunas realizaciones, solo se mide o determina una o más de las formas de GAG específicas (o grupos de formas de GAG) explicadas en la presente memoria (p. ej., no se miden ni determinan otras formas de GAG u otros biomarcadores), con la condición de que en todos los casos es esencial que se mida o determine la forma 6s CS de GAG.

[0620] Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona un método de detección del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Según la presente invención, el “cáncer” es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de pulmón, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de sangre, cáncer de ovario, melanoma y un tumor neuroendocrino. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para diagnosticar el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Como alternativa, la presente invención proporciona un método para el pronóstico del cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) en un sujeto (el pronóstico de la gravedad, el curso y/o el resultado futuros del cáncer, p. ej., el cáncer de próstata). Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para monitorizar la aparición del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto en riesgo. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para monitorizar la progresión del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Como alternativa, la presente invención proporciona un método para determinar la gravedad clínica del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para determinar el riesgo de progresión del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para guiar el tratamiento basándose en la evaluación del riesgo de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para predecir la respuesta de un sujeto a la terapia para el cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para determinar la eficacia de un régimen terapéutico o quirúrgico para el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para detectar la recurrencia o recaída del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) (p. ej., en pacientes con cáncer en estadio temprano, p. ej., cáncer de próstata). Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método de selección de pacientes o selección de tratamientos, por ejemplo, ya que proporciona un medio para distinguir a los pacientes con pequeñas masas cancerosas (p. ej., masas prostáticas) que no son cancerosas (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., son masas no malignas, benignas o indolentes (pero que pueden mostrar algunos síntomas problemáticos, p. ej., síntomas prostáticos, y se puede sospechar que son cáncer, p. ej., cáncer de próstata) de los pacientes con cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Por lo tanto, vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para distinguir el cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) de las enfermedades no malignas. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para determinar si una metástasis se debe al cáncer de próstata. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para predecir si se espera la metástasis de un cáncer dado (p. ej., cáncer de próstata). Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método de detección del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en la población general. Vista de forma alternativa, la presente invención proporciona un método para detectar el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en una población con riesgo de tener o desarrollar cáncer (p. ej., cáncer de próstata) (p. ej., individuos con predisposición genética o individuos que presentan factores de riesgo o individuos que presentan síntomas).

[0622] Por lo tanto, el método de detección del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) según la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, para diagnosticar el cáncer (p. ej., cáncer de próstata), para el pronóstico del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), para controlar la aparición del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto en riesgo, para controlar la progresión del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), para determinar la gravedad clínica del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), para predecir la respuesta de un sujeto a tratamiento para el cáncer (p. ej., cáncer de próstata), para determinar la eficacia de un régimen terapéutico o quirúrgico que se utiliza para tratar el cáncer (p. ej., el cáncer de próstata), para detectar la recurrencia o la recaída del cáncer (p. ej., el cáncer de próstata), para la selección de pacientes o la selección del tratamiento, para distinguir pequeñas masas cancerosas (p. ej., masas prostáticas) sospechosas de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) de otras enfermedades no malignas, para determinar si una metástasis se debe a un cáncer determinado (p. ej., cáncer de próstata), para detectar el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en general población o para la detección del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un población en riesgo de tener o desarrollar cáncer de próstata (p. ej., personas con predisposición genética o personas que presentan factores de riesgo o personas que presentan síntomas).

[0624] Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. En algunas realizaciones, se realiza un diagnóstico positivo (es decir, la presencia de cáncer, p. ej., cáncer de próstata) si el nivel de una o más de las formas de GAG según la presente invención en la muestra se altera (aumenta o disminuye, según sea el caso) en comparación con un nivel de control. Las formas de GAG para las que un nivel elevado es indicativo de (p. ej., diagnóstico de) cáncer (p. ej., cáncer de próstata) se describen en otra parte de la presente memoria. Las formas de GAG para las que un nivel reducido es indicativo de (p. ej., diagnóstico de) cáncer (p. ej., cáncer de próstata) se describen en otra parte de la presente memoria. Alternativamente, se analizan varias formas o propiedades diferentes de los GAG según la invención como se describe en otra parte de la presente memoria para llegar a un diagnóstico, p. ej., utilizando un sistema o método de puntuación. Los métodos de la invención también pueden utilizarse para determinar si una metástasis se debe a un tipo determinado de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0626] En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el pronóstico del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. En tales métodos, el nivel de una o más de las formas de GAG según la invención en la muestra es indicativo de la gravedad, el curso y/o el resultado futuros del cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Por ejemplo, una alteración (aumento o disminución, según sea el caso) en el nivel de una o más de las formas de GAG según la invención en la muestra en comparación con un nivel de control puede indicar un mal pronóstico. Un nivel (o puntuación) muy alterado, p. ej., en comparación con los niveles (o puntuaciones) de control, puede indicar un pronóstico particularmente malo.

[0628] Por lo tanto, en algunas realizaciones, un nivel elevado de una o más de las formas de GAG según la invención para las que un nivel elevado es indicativo de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) sugiere (es decir, indica) un mal pronóstico. En algunas realizaciones, una disminución del nivel de una o más de las formas de GAG según la presente invención para las que un nivel reducido es indicativo de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) sugiere (es decir, indica) un mal pronóstico. Por el contrario, si una o más formas de GAG tienen un nivel inalterado (o un nivel esencialmente inalterado), eso puede ser indicativo de un buen pronóstico.

[0630] La medición en serie (periódica) del nivel de una o más de las formas de GAG (biomarcadores) según la presente invención también se puede utilizar con fines pronósticos buscando niveles (o puntuaciones) crecientes o decrecientes a lo largo del tiempo. En algunas realizaciones, la alteración del nivel (aumento o disminución, según corresponda) de una o más de las formas de GAG según la presente invención a lo largo del tiempo (en comparación con un nivel de control, p. ej., un nivel que se aleja más del nivel de control) puede indicar un empeoramiento del pronóstico. En algunas realizaciones, la alteración del nivel (aumento o disminución, según corresponda) de una o más de las formas de GAG según la presente invención a lo largo del tiempo (en comparación con un nivel de control, p. ej., un nivel que se acerca al nivel de control) puede indicar una mejora del pronóstico.

[0632] En un aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorizar la aparición de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto con riesgo de desarrollar cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Tales métodos y las formas de GAG que se miden son similares a los métodos de diagnóstico descritos en la presente memoria, pero se realizan en sujetos que corren un riesgo particular de desarrollar cáncer (p. ej., cáncer de próstata) y, por lo tanto, pueden beneficiarse de una monitorización más estrecha. Tales sujetos “en riesgo” serían identificados fácilmente por un experto en la técnica, pero incluirían, por ejemplo, sujetos con antecedentes familiares de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) o una predisposición genética al cáncer (p. ej., cáncer de próstata), o sujetos en remisión por cáncer (p. ej., cáncer de próstata), o sujetos con factores de riesgo de cáncer reconocidos (p. ej., cáncer de próstata). Por ejemplo, un factor de riesgo reconocido para el cáncer de próstata es la edad, por ejemplo, los varones mayores de 40 años, o más de 50 años, o más de 55 años, o preferiblemente mayores de 65 años, p. ej., 40-65, o 50-65, o 55-65, o 60-65, o 70-75, o 40-75, o 50-75, o 55-75, o 60-75, o 65-75 (p. ej., 66-71), o 70-75, o 40-85, o 50-85, o 55-85, o 60-85, o 65 85, o 70-85.

[0634] De esta forma, se puede observar que, en algunas realizaciones de la invención, los métodos pueden realizarse en pacientes (sujetos) “sanos” o al menos en pacientes (sujetos) que no manifiestan ningún síntoma clínico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata), por ejemplo, pacientes con cáncer en estadio muy temprano o preclínico (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., pacientes en los que el tumor primario es tan pequeño que no puede evaluarse o detectarse o en pacientes en los que las células están siendo sometidas a un tratamiento previo cambios cancerosos asociados con el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) pero que aún no se han convertido maligno.

[0636] Por lo tanto, los métodos de la presente invención también se pueden utilizar para monitorizar la progresión de la enfermedad. Tal monitorización puede tener lugar antes, durante o después del tratamiento del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) mediante cirugía o terapia, p. ej., terapia farmacéutica. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorizar la progresión del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto.

[0638] Los métodos de la presente invención pueden utilizarse en la monitorización activa de pacientes que no han sido sometidos a cirugía o terapia, p. ej., para controlar el progreso del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en pacientes no tratados. Una vez más, las mediciones en serie pueden permitir evaluar si el cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) está empeorando o no, o en qué medida, lo que permite por ejemplo, tomar una decisión más razonada sobre si es necesaria o aconsejable una intervención terapéutica o quirúrgica.

[0640] Como se ha descrito anteriormente, la monitorización también se puede realizar, p. ej., en un individuo, p. ej., un individuo sano, que se cree que corre el riesgo de desarrollar cáncer (p. ej., cáncer de próstata), para obtener una indicación temprana e idealmente preclínica de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0642] En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la gravedad clínica del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. En tales métodos, el nivel de una o más de las formas de GAG según la invención en la muestra, muestra una asociación con la gravedad del cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Por lo tanto, el nivel de una o más de las formas de GAG según la invención es indicativo de la gravedad del cáncer (p. ej., cáncer de próstata). En algunas realizaciones, cuanto más alterado (más aumentado o más disminuido, según sea el caso) el nivel (o puntuación) de una o más de las formas de GAG según la invención en comparación con un nivel de control, mayor será la probabilidad de una forma más grave de cáncer (p. ej., cáncer de próstata). En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden utilizarse, por lo tanto, en la selección de pacientes para la terapia.

[0644] La medición en serie (periódica) del nivel (o puntuación) de una o más de las formas de GAG (biomarcadores) según la invención también se puede utilizar para monitorizar la gravedad del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) buscando niveles crecientes o decrecientes a lo largo del tiempo. La observación de los niveles alterados (aumento o disminución, según sea el caso) también se puede utilizar para guiar y controlar el tratamiento, tanto en el caso de una enfermedad subclínica, es decir, en una situación de “espera vigilante” antes del tratamiento o la cirugía, p. ej., antes de iniciar el tratamiento farmacológico o la cirugía, como durante o después del tratamiento para evaluar el efecto del tratamiento y detectar signos de fracaso terapéutico.

[0646] Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia o cirugía. Por ejemplo, un sujeto con una forma menos grave o un estadio temprano de cáncer (p. ej., cáncer de próstata), determinado por el nivel de una o más de las formas de GAG según la presente invención en una muestra según la presente invención, es generalmente más probable que responda a la terapia o la cirugía, en particular a la cirugía. En tales métodos, la elección de la terapia o la cirugía puede guiarse por el conocimiento del nivel de una o más de las formas de GAG en la muestra. En algunos ejemplos de métodos para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia o cirugía, el nivel de HA no se mide ni se determina.

[0648] La presente invención también proporciona un método de selección de pacientes o selección de tratamientos, ya que proporciona un medio para distinguir a los pacientes con cáncer de alto riesgo (p. ej., cáncer de próstata) de los pacientes con cáncer de bajo riesgo (p. ej., cáncer de próstata). Por lo tanto, vistos de forma alternativa, los métodos de la presente invención proporcionan un método para distinguir el cáncer de alto y bajo riesgo (p. ej., el cáncer de próstata) y pueden guiar el tratamiento apropiado.

[0650] En algunas realizaciones, la invención proporciona un método de distinguir entre cáncer de riesgo alto (o mayor) (p. ej., cáncer de próstata, p. ej., con una puntuación de Gleason de 8 o más) y cáncer de riesgo bajo (o menor) (p. ej., cáncer de próstata, p. ej., con una puntuación de Gleason de 6 o menos) en sujetos que han sido diagnosticados (p. ej., diagnosticados recientemente, p. ej., < 1 mes o < 6 meses o < 1 año desde el diagnóstico) con cáncer (p. ej., cáncer de próstata). El alto riesgo y el bajo riesgo se explican en otra parte de la presente memoria. Un riesgo alto (o mayor) puede significar que un sujeto tiene un pronóstico malo (o peor) y un riesgo bajo (o menor) puede significar que un sujeto tiene un pronóstico bueno (o mejor). También se pueden identificar sujetos de riesgo intermedio (p. ej., sujetos con cáncer de próstata con una puntuación de Gleason de 7). En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para clasificar a los sujetos con cáncer de próstata de riesgo intermedio (p. ej., con una puntuación de Gleason de 7) como cáncer de próstata de alto (o mayor) riesgo. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para clasificar a los sujetos con cáncer de próstata de riesgo intermedio (p. ej., con una puntuación de Gleason de 7) como cáncer de próstata de bajo (o menor) riesgo. Los métodos de la invención pueden utilizarse para evaluar la gravedad, la agresividad, el potencial metastásico o el nivel de riesgo en un sujeto diagnosticado (p. ej., diagnosticado recientemente) con cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0652] En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para monitorizar (p. ej., monitorizar continuamente o realizar una vigilancia activa de) un sujeto que tiene cáncer (p. ej., cáncer de próstata) (p. ej., un sujeto en tratamiento contra el cáncer, p. ej., cáncer de próstata). Tal monitorización puede guiar qué tratamiento utilizar o si no se debe administrar ningún tratamiento.

[0654] En algunas realizaciones, cuanto más alterado (más aumentado o disminuido, según sea el caso) el nivel (o puntuación) de una o más de las formas de GAG según la invención en comparación con un nivel (o puntuación) de control, mayor será la probabilidad de cáncer de alto riesgo (p. ej., cáncer de próstata) (o menor será la probabilidad de cáncer de bajo riesgo, p. ej., cáncer de próstata). Por el contrario, en algunas realizaciones, cuanto menos alterado (menos aumentado o disminuido, según sea el caso) el nivel (o puntuación) de una o más de las formas de GAG según la invención en comparación con un nivel (o puntuación) de control, menor será la probabilidad de cáncer de alto riesgo (p. ej., cáncer de próstata) (o mayor será la probabilidad de cáncer de bajo riesgo, p. ej., cáncer de próstata).

[0655] En algunas realizaciones, los pacientes de bajo (o menor) riesgo pueden ser sometidos a una espera vigilante o a una vigilancia activa y es posible que no reciban tratamiento (p. ej., terapia farmacéutica o cirugía). En algunas realizaciones, los pacientes de alto (o mayor) riesgo pueden recibir tratamiento, p. ej., resección (p. ej., prostatectomía), radioterapia, terapia hormonal u otro tratamiento (p. ej., como se detalla en otra parte de la presente memoria).

[0656] La presente invención también proporciona un método para determinar (o monitorizar) la eficacia de un régimen terapéutico que se utiliza para tratar el cáncer (p. ej., el cáncer de próstata), en otras palabras, seguir o monitorizar una respuesta al tratamiento. En tales métodos, una alteración (aumento o disminución, según sea el caso) en el nivel (o puntuaciones) de una o más de las formas de GAG según la presente invención indica la eficacia del régimen terapéutico que se está utilizando. Por ejemplo, si el nivel de una o más de las formas de GAG según la presente invención para las que un nivel (o puntuación) aumentado es indicativo de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) se reduce durante (o después) de la terapia, esto es indicativo de un régimen terapéutico eficaz. Por el contrario, por ejemplo, si el nivel de una o más de las formas de GAG según la presente invención para las que un nivel (o puntuación) disminuido es indicativo de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) aumenta durante (o después) de la terapia, esto es indicativo de un régimen terapéutico eficaz. En tales métodos, la medición en serie (periódica) del nivel de una o más de las formas de GAG (biomarcadores) según la presente invención a lo largo del tiempo también se puede utilizar para determinar la eficacia de un régimen terapéutico que se esté utilizando. Se pueden utilizar métodos similares para proporcionar un método para determinar (o monitorizar) la eficacia de un régimen quirúrgico que se utiliza para tratar el cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0658] La presente invención también proporciona un método para detectar la recurrencia (recaída) del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), por ejemplo, en un sujeto que ha tenido cáncer anteriormente (p. ej., cáncer de próstata) pero que ha sido tratado con éxito, p. ej., mediante cirugía o terapia (p. ej., terapia farmacéutica) de tal modo que se considere que está en remisión o curado, o por ejemplo, para predecir una recaída metastásica en los pacientes durante el seguimiento. Tales sujetos forman una categoría de “ riesgo” y pueden beneficiarse de una monitorización regular del cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Tales métodos para detectar la recurrencia (o recaída) del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) utilizan los métodos de diagnóstico descritos en la presente memoria para detectar la presencia o ausencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0660] La presente invención también proporciona un método de selección de pacientes o selección de tratamientos, ya que proporciona un medio para distinguir a los pacientes con cáncer (p. ej., cáncer de próstata) de los pacientes con enfermedades no malignas, p. ej., enfermedades de la próstata no malignas. Por lo tanto, vistos de forma alternativa, los métodos de la presente invención proporcionan un método para distinguir el cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) de las enfermedades no malignas.

[0662] Tales métodos de selección de pacientes o selección del tratamiento o métodos para distinguir el cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) de las enfermedades no malignas utilizan los métodos de diagnóstico descritos en la presente memoria para detectar la presencia o ausencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0664] Las características y el análisis de la presente memoria en relación con el método de detección del cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) (p. ej., en relación con las formas de GAG preferidas o combinaciones de las mismas para la medición) se aplican,mutatis mutandis,a los otros métodos relacionados de la presente invención (p. ej., a un método de diagnóstico del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), etc.).

[0666] En una realización, la invención proporciona la utilización de los métodos de la invención (p. ej., métodos de detección, diagnóstico o pronóstico, etc., como se describe en la presente memoria) junto con otros métodos conocidos de detección, diagnóstico o pronóstico del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), tales como imágenes radiológicas (p. ej., tomografía computarizada, tomografía computarizada, escaneo) o imágenes por resonancia magnética (escaneo de IRM), o evaluación histológica, p. ej., utilizando una biopsia tumoral o la prueba de PSA (antígeno específico de próstata) o la prueba DRE (examen rectal digital) o la prueba Prostate Core Mitomic Test™ (prueba mitómica del núcleo prostático). Por lo tanto, p. ej., los métodos de la invención pueden utilizarse para confirmar un diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención se utilizan solos.

[0668] El nivel de la forma GAG en cuestión puede determinarse o medirse analizando la muestra que se ha obtenido o extraído del sujeto por un medio apropiado. La determinación se realiza de forma típicain vitro.

[0670] Los niveles de una o más de las formas de GAG en la muestra pueden medirse (determinarse) mediante cualquier ensayo apropiado, varios de los cuales son bien conocidos y están documentados en la técnica. Como se describe en otra parte de la presente memoria, la electroforesis, p. ej., la electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis capilar (en particular la electroforesis capilar con detección de fluorescencia, tal como CE-LIF) o la cromatografía líquida, en particular la HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) en combinación con la espectrometría de masas (MS), son técnicas preferidas para medir (determinar) los niveles de una o más de las formas de GAG según la presente invención.

[0672] La electroforesis adecuada, p. ej., la electroforesis capilar y la cromatografía líquida, p. ej., las técnicas de HPLC para el análisis de formas de GAG, junto con los métodos de espectrometría de masas apropiados (y las técnicas de procesamiento de datos asociadas) son bien conocidas y están documentadas en la técnica.

[0674] Un método particularmente preferido para determinar el nivel de una o más de las formas de GAG en la muestra se describe en la presente memoria en los Ejemplos. Un método preferido utilizado en la invención es la electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser, CE-LIF (p. ej., como se describe en Galeotti y col., 2014, Electrophoresis 35: 811-818; y Kottler y col, 2013, Electroforesis 34: 2323-2336). También se puede utilizar la HPLC combinada con la derivatización posterior a la columna y la detección fluorimétrica, p. ej., como se describe en Volpi 2006, Curr Pharm Des 12:639-658, al igual que la HPLC combinada con ESI-MS (espectrometría de masas por ionización por electronebulización), p. ej., como se describe en Volpi y Linhardt, 2010, Nature protocols 5:993-1004, también con detección fluorimétrica, p. ej., como se describe en Volpi y Volpi, 2011, Anal Chem 83:6770-6777, o Volpi y otros, 2014, Nature Protocols 9:541-558. También se puede utilizar la electroforesis en gel de agarosa, p. ej., FACE (electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos) como se describe en Volpi and Maccari, 2006, Analyt Technol Biomed Life Sci, 834:1-13; y Volpi and Maccari, 2002, Electrophoresis 23:4060-4066.

[0676] También se conocen y describen en la técnica métodos apropiados de preparación de muestras, p. ej., la extracción y purificación de GAG, por ejemplo, Volpi and Maccari, 2005, Biomacromolecules 6:3174-3180 y Clin Chim Acta 356:125-133, Coppa y col., 2011 Glycobiology 21:295-303.

[0678] En algunas realizaciones, la HPLC y la espectrometría de masas (y las técnicas de procesamiento de datos asociadas) se utilizan para obtener una fracción del nivel de una o más formas de GAG particulares (p. ej., las formas de disacáridos sulfatados o no sulfatados) en la muestra en comparación con la cantidad total. Por ejemplo, después de la preparación de la muestra, los GAG pueden digerirse utilizando enzimas, separarse en una columna de HPLC y caracterizarse utilizando MS. Como se describe en otra parte de la presente memoria, las cantidades de una o más formas de GAG individuales (p. ej., una forma particular de disacárido sulfatado o no sulfatado) se normalizan convenientemente (es decir, se dividen) por la suma de todas las cantidades de formas de GAG individuales medidas, para producir fracciones.

[0680] Según la presente invención, se puede realizar una evaluación (determinación) cuantitativa, semicuantitativa o cualitativa del nivel de una o más de las formas de GAG.

[0682] Los métodos apropiados para hacer esto serían bien conocidos por un experto en la técnica y podría utilizarse cualquiera de estos. Sin embargo, un método conveniente para lograr tal cuantificación de la composición de disacáridos o las propiedades o formas apropiadas del CS o el HS (y la separación de las formas de disacáridos) es utilizar la electroforesis, en particular la electroforesis capilar, y preferiblemente la electroforesis capilar con detección de fluorescencia, p. ej., la electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser (CE-LIF) (p. ej., como se describe en Galeotti 2014, supra, o Kottler 2013, supra). Un método alternativo es utilizar cromatografía líquida, preferiblemente HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), por ejemplo, SAX HPLC o, por ejemplo, como se describe en Volpi 2006, supra, Galeotti y Volpi 2011, supra, Volpi y col., 2014, supra o Volpi and Linhardt, 2010, supra. Preferiblemente, también se utiliza la espectrometría de masas (HPLC-MS), por ejemplo, la espectrometría de masas por ionización por electropulverización (ESI-MS), p. ej., la HPLC ESI-MS. Los métodos particularmente preferidos se describen en los ejemplos. Por lo tanto, un ejemplo de un método particularmente preferido es la electroforesis capilar (p. ej., la electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser). Otro ejemplo sería la HPLC seguida de la MS (HPLC-MS), p. ej., la HPLC ESI-MS. Alternativamente, la espectrometría de masas se puede utilizar sin cromatografía, p. ej., cromatografía líquida.

[0683] Generalmente, la determinación de las propiedades o formas del GAG según la presente invención no implica la medición de las moléculas de GAG exactamente en la misma forma que la que se encuentra en el fluido corporal de un sujeto (p. ej., no implica la medición de una forma natural del GAG). Por ejemplo, tales moléculas de GAG nativas o de origen natural se encuentran a menudo en forma de largas cadenas de azúcar unidas a proteínas, mientras que para determinar los niveles según la presente invención, generalmente tales moléculas de GAG deben al menos separarse o extraerse de las proteínas a las que están unidas y, a menudo, procesarse adicionalmente. Por lo tanto, generalmente los métodos de la invención se realizan en muestras que se han procesado de alguna forma (p. ej., son muestras artificiales en lugar de muestras nativas).

[0685] Por lo tanto, en algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden incluir un paso de procesamiento de una muestra. En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden realizarse, por lo tanto, en tales muestras procesadas o en materiales derivados de tales muestras procesadas. Los pasos de procesamiento incluyen, aunque no de forma limitativa, la extracción o purificación de los GAG de la muestra, los pasos de fragmentación o escisión o digestión de las proteínas presentes en la muestra, p. ej., como un medio para separar o extraer o eliminar los GAG de la proteína a la que están unidos, p. ej., mediante la utilización de una proteasa tal como la proteinasa K, la purificación de los GAG, p. ej., utilizando una resina de intercambio aniónico. Por lo tanto, dichos pasos de procesamiento también incluyen pasos realizados en una muestra de fluido corporal para prepararla para el análisis, p. ej., en el caso de una muestra de sangre, tales pasos pueden incluir los pasos para preparar un componente sanguíneo apropiado para el análisis, p. ej., plasma o suero. Un paso de procesamiento puede implicar una o más de las siguientes: digestión, extracción, purificación, ebullición, filtración, liofilización, fraccionamiento, centrifugación, concentración, dilución, inactivación de los componentes que interfieren, adición de reactivos, derivatización, formación de complejos y similares. Los pasos de procesamiento ejemplares se describen en los ejemplos.

[0687] En algunos métodos de la invención en los que se miden los niveles de ciertas formas de disacáridos individuales, los GAG, p. ej., las moléculas de GAG de longitud completa o las moléculas de GAG unidas a proteínas en residuos de serina, o las cadenas de unidades de disacáridos repetidas de los GAG, se someten a un paso de procesamiento, por ejemplo, un paso de fragmentación, escisión o digestión, p. ej., mediante digestión química o enzima tratamiento, p. ej., con condroitinasa ABC o condroitinasa B, para obtener las unidades de disacáridos que a continuación, se analizan.

[0689] En la técnica se conocen otros métodos para determinar los niveles o composiciones de los GAG que podrían utilizarse. Sin embargo, algunos ejemplos son las técnicas analíticas que implican la utilización de anticuerpos contra diversas formas de GAG, p. ej., técnicas tales como transferencia Western, ELISA o FACS, o métodos que implican electroforesis en gel de agarosa (p. ej., electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos [FACE]) o electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

[0691] Por lo tanto, en algunas realizaciones, el nivel de una o más formas de GAG (p. ej., formas específicas sulfatadas o no sulfatadas de disacáridos CS o HS, que se han derivado, por ejemplo, de la molécula de GAG de longitud completa o de una cadena de unidades de disacárido repetidas de una molécula de GAG por fragmentación, escisión o digestión) en asociación con (p. ej., asociación física con, en complejo o derivatizado con) un reactivo que es se determina que se utiliza para detectar la forma GAG. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se determina el nivel de un complejo de una forma de GAG y el reactivo utilizado para detectar la forma de GAG. Los reactivos adecuados para detectar formas particulares de GAG se explican en otra parte de la presente memoria, pero incluyen anticuerpos o algún tipo de fluoróforo (u otro marcador o colorante detectable) unido a (o utilizado para derivatizar) la forma de GAG en cuestión, por ejemplo, para hacerla detectable mediante un fluorímetro (u otro dispositivo de detección). Así, a modo de ejemplo, en algunas realizaciones puede determinarse el nivel de una forma de GAG en asociación con (p. ej., en complejo con o derivatizada con) un anticuerpo o fluoróforo o similares.

[0693] Un nivel alterado (o composición) de una o más de las formas de GAG (propiedades del GAG) según la presente invención, como se describe en la presente memoria, incluye cualquier alteración o cambio medible de la forma de GAG (biomarcador) en cuestión cuando la forma de GAG en cuestión se compara con un nivel de control. Un nivel alterado incluye un nivel aumentado o disminuido. Preferiblemente, el nivel se altera significativamente, en comparación con el nivel encontrado en una muestra o sujeto de control apropiado. Más preferiblemente, los niveles significativamente alterados son estadísticamente significativos, preferiblemente con un valor p de <0,05 o un valor % en ROPE de <5,00.

[0695] En algunas realizaciones, una alteración en el nivel de > 2 %, > 3 %, > 5 %, > 10 %, > 25 %, > 50 %, > 75 %, > 100 %, > 200 %, > 300 %, > 400 %, > 500 %, > 600 %, > 700 %, > 800 %, > 900 %, > 1000 %, > 2000 %, > 5000 % o > 10,000 % en comparación con el nivel encontrado en una muestra o sujeto de control apropiado o la población (es decir, cuando se compara con un nivel de control) puede ser indicativa de la presencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0697] El “ aumento” en el nivel o el nivel “aumentado” de una o más de las formas de GAG (propiedades del GAG) según la invención, como se describe en la presente memoria, incluye cualquier aumento o elevación medible de la forma de GAG (biomarcador) en cuestión cuando la forma de GAG en cuestión se compara con un nivel de control. Preferiblemente, el nivel aumenta significativamente, en comparación con el nivel encontrado en una muestra o sujeto de control apropiado. Más preferiblemente, los niveles significativamente aumentados son estadísticamente significativos, preferiblemente con un valor p de <0,05 o un valor % en ROPE de <5,00.

[0699] En algunas realizaciones, un aumento en el nivel de > 2 %, > 3 %, > 5 %, > 10 %, > 25 %, > 50 %, > 75 %, > 100 %, > 200 %, > 300 %, > 400 %, > 500 %, > 600 %, > 700 %, > 800 %, > 900 %, > 1000 %, > 2000 %, > 5000 % o > 10,000 % en comparación con el nivel encontrado en una muestra o sujeto de control apropiado o la población (es decir, cuando se compara con un nivel de control) puede ser indicativa de la presencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0700] La “disminución” en el nivel o el nivel “disminuido” de una o más de las formas de GAG (propiedades del GAG) según la invención, como se describe en la presente memoria, incluye cualquier disminución o reducción medible de la forma de GAG (biomarcador) en cuestión cuando la forma de GAG en cuestión se compara con un nivel de control. Preferiblemente, el nivel se reduce significativamente, en comparación con el nivel encontrado en una muestra o sujeto de control apropiado. Más preferiblemente, los niveles significativamente disminuidos son estadísticamente significativos, preferiblemente con un valor p de <0,05 o un valor % en ROPE de <5,00.

[0702] En algunas realizaciones, una disminución del nivel de > 2 %, > 3 %, > 5 %, > 10 %, > 25 %, > 50 %, > 75 %, > 100 %, > 200 %, > 300 %, > 400 %, > 500 %, > 600 %, > 700 %, > 800 %, > 900 %, > 1000 %, > 2000 %, > 5000 % o > 10,000 % en comparación con el nivel encontrado en una muestra o sujeto de control apropiado o la población (es decir, cuando se compara con un nivel de control) es indicativa de la presencia de cáncer (p. ej., cáncer de próstata).

[0703] Un “ nivel de control” es el nivel de una forma de GAG (propiedad del GAG) en un sujeto o población de control (p. ej., en una muestra que se ha obtenido de un sujeto o población de control). Un experto en la técnica identificaría fácilmente los sujetos o muestras de control apropiados para su utilización en los métodos de la invención; por ejemplo, un grupo de control apropiado es como se describe en los ejemplos. Tales sujetos también pueden denominarse sujetos “ normales” o población de referencia. Los ejemplos de poblaciones apropiadas de sujetos de control incluirían sujetos sanos, por ejemplo, individuos que no tienen antecedentes de ninguna forma de enfermedad de la próstata (p. ej., cáncer de próstata) y ninguna otra enfermedad concurrente, o sujetos que no padecen, y preferiblemente no tienen antecedentes de padecer, ninguna forma de enfermedad de la próstata, en particular individuos que no padecen, y preferiblemente no tienen antecedentes de padecer, cáncer de próstata. Otros sujetos de control preferidos incluirían individuos que no padecen, y preferiblemente no tienen antecedentes de cáncer (p. ej., no padecen, y preferiblemente no tienen antecedentes de, ninguno de los tipos de cáncer a los que se hace referencia en la presente memoria). Otros ejemplos de poblaciones apropiadas de sujetos de control incluirían sujetos sanos, por ejemplo, individuos que no tienen antecedentes de ninguna forma de enfermedad renal (p. ej., RCC) y ninguna otra enfermedad concurrente, o sujetos que no padecen, y preferiblemente no tienen antecedentes de padecer, ninguna forma de enfermedad renal, en particular individuos que no padecen, y preferiblemente no tienen antecedentes de padecer, cáncer renal o RCC. Preferiblemente, tales sujetos de control tampoco padecen, y más preferiblemente no tienen antecedentes de padecer, cánceres de hígado. Preferiblemente, tales sujetos de control tampoco padecen patologías inflamatorias. Preferiblemente, los sujetos de control no son usuarios habituales de ningún medicamento. En una realización preferida, los sujetos de control son sujetos sanos.

[0705] El nivel de control puede corresponder al nivel de la forma GAG equivalente en los sujetos o muestras de control apropiados, p. ej., puede corresponder a un nivel o rango límite encontrado en una población de control o de referencia. Alternativamente, dicho nivel de control puede corresponder al nivel del marcador (forma GAG) en cuestión en el mismo sujeto individual, o a una muestra de dicho sujeto, medida en un punto temporal anterior (p. ej., comparación con un nivel “ basal” en ese sujeto). Este tipo de nivel de control (es decir, un nivel de control de un sujeto individual) es particularmente útil para las realizaciones de la invención en las que se realizan mediciones en serie o periódicas de las formas de GAG en individuos, sanos o enfermos, para detectar cambios en los niveles de la(s) forma(s) de GAG. En este sentido, un nivel de control apropiado será el valor basal, estable, nulo, previo o seco del individuo (según corresponda), en contraposición a un nivel de control o límite que se encuentre en la población de control general. Los niveles de control también pueden denominarse niveles “ normales” o niveles “de referencia” . El nivel de control puede ser una cifra discreta o un rango.

[0707] Aunque el nivel de control para la comparación podría derivarse ensayando un conjunto apropiado de sujetos de control, los métodos de la invención no implicarían necesariamente la realización de ensayos activos en sujetos de control como parte de los métodos de la presente invención, sino que implicarían generalmente una comparación con un nivel de control que se hubiera determinado previamente a partir de los sujetos de control y que fuera conocido por la persona que realiza los métodos de la invención.

[0709] Los métodos de detección, diagnóstico, etc., de la presente invención son para el cáncer. Los cánceres a los que se refiere la presente invención se describen en otra parte de la presente memoria. En realizaciones preferidas, el subtipo de cáncer de próstata es el adenocarcinoma de próstata (también denominado en la presente memoria PRAD, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de colon es el adenocarcinoma de colon. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de recto es el adenocarcinoma de recto. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el cáncer es un adenocarcinoma colorrectal. El cáncer de colon y el cáncer de recto pueden denominarse colectivamente cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer colorrectal es de estadio TNM I, II, III o IV. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de pulmón es el carcinoma de células escamosas de pulmón o el adenocarcinoma pulmonar o el cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón es del estadio TNM I, II, III o IV. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de útero es el carcinoma de endometrio del cuerpo uterino o el cáncer de cuello uterino o el cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de útero es cáncer de cuello uterino o cáncer de endometrio. En algunas realizaciones, el cáncer de útero (p. ej., cáncer de cuello uterino o cáncer de endometrio) se encuentra en los estadios I, II, III o IV de la FIGO. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de mama es el carcinoma invasivo de mama. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de cerebro es el glioblastoma multiforme o el glioma difuso (p. ej., astrocitoma, glioblastoma multiforme u oligoastrocitoma). En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de sangre es el linfoma periférico de células T o el linfoma no hodgkiniano o la leucemia linfoide crónica. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de sangre es el linfoma no hodgkiniano o la leucemia linfoide crónica. En algunas realizaciones, la leucemia linfoide crónica se encuentra en los estadios A, B o C de Binet. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de sangre del linfoma no hodgkiniano es el linfoma difuso de células B grandes. En algunas realizaciones, el linfoma no hodgkiniano se encuentra en los estadios I, II, III o IV de Ann Arbor. En algunas realizaciones, el subtipo de cáncer de ovario es el adenocarcinoma ovárico seroso. En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es de estadio FIGO I, II, III o IV. En algunas realizaciones, el melanoma es un melanoma cutáneo o un melanoma uveal (p. ej., un melanoma cutáneo maligno o un melanoma uveal). En algunas realizaciones, el tumor neuroendocrino es un tumor neuroendocrino gastrointestinal. En algunas realizaciones, el tumor neuroendocrino (p. ej., un tumor neuroendocrino gastrointestinal) es de grado G1 o G2 según la ENETS. Los métodos de la presente invención se pueden realizar en cualquier estadio del cáncer (p. ej., cáncer de próstata), por ejemplo, se pueden utilizar para los estadios tempranos o iniciales del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) o de la enfermedad del cáncer en estadio avanzado o tardío (p. ej., cáncer de próstata).

[0711] La clasificación del cáncer (p. ej., cáncer de próstata) en un estadio determinado se puede realizar mediante cualquier definición reconocida y aceptada en la técnica.

[0713] La clasificación del cáncer (p. ej., el cáncer de próstata) con un riesgo determinado se puede realizar mediante cualquier definición reconocida y aceptada en la técnica. Por ejemplo, en el caso del cáncer de próstata, el riesgo puede evaluarse mediante un examen rectal digital o evaluando el nivel de PSA en sangre en el momento del diagnóstico o determinando la puntuación de Gleason en el diagnóstico clínico o determinando la puntuación de Gleason en el momento del diagnóstico patológico o evaluando los resultados de una biopsia de próstata (p. ej., evaluando el tamaño del tumor y/o el grado del tumor y/o el volumen del tumor) o determinando el estadio según el sistema TNM o evaluando los resultados de otras pruebas (radiografías, tomografías computarizadas y/o resonancias magnéticas). o cualquier combinación de las anteriores. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente el riesgo basándose en una o más de las evaluaciones anteriores, por ejemplo, determinando el riesgo bajo si la puntuación de Gleason es 6 o menos, el riesgo intermedio si la puntuación de Gleason es 7 y el riesgo alto si la puntuación de Gleason es 8 o más.

[0715] En algunas realizaciones, el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) puede ser una forma no metastásica de cáncer (p. ej., cáncer de próstata). En algunas realizaciones, el cáncer (p. ej., cáncer de próstata) puede ser una forma metastásica de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) (a diferencia del cáncer localizado o confinado, p. ej., cáncer de próstata).

[0716] En algunas realizaciones, el cáncer puede ser una enfermedad (cáncer) en estadio o grado bajo. Una enfermedad (cáncer) de estadio/grado bajo puede definirse como estadio TNM I a III para CRC y LC, estadio FIGO I para CST, estadio FIGO I a II para EC y<o>V, glioma distinto del grado IV para DG, grado G1 de ENETS para GNET, estadio A o B de Binet para LL, estadio I a II de Ann Arbor para NHL y grado de Gleason < 7 para PCa.

[0718] Los métodos de la presente invención se realizan en muestras de sangre. La muestra se ha obtenido de (extraído de) un sujeto (p. ej., como se describe en otra parte de la presente memoria, preferiblemente un sujeto humano (de forma típica un sujeto masculino humano en el caso de la detección del cáncer de próstata).

[0720] Según la presente invención, un “fluido corporal” es sangre (que incluye todos los componentes derivados de la sangre, por ejemplo, plasma, suero, etc.). Según la presente invención, la muestra es una muestra de sangre (p. ej., una muestra de plasma o suero). En algunas realizaciones preferidas, la muestra es una muestra de plasma. En algunas realizaciones preferidas, una muestra de plasma es una muestra de plasma pobre en plaquetas. En algunas realizaciones preferidas, la muestra es una muestra de suero. El fluido corporal o la muestra pueden estar en forma de una biopsia líquida.

[0722] El término “ muestra” también abarca cualquier material derivado del procesamiento de una muestra de fluido corporal (p. ej., derivado del procesamiento de una muestra de sangre). El procesamiento de muestras biológicas para obtener una muestra de ensayo puede implicar una o más de: digestión, ebullición, filtración, destilación, centrifugación, liofilización, fraccionamiento, extracción, concentración, dilución, purificación, inactivación de los componentes interferentes, adición de reactivos, derivatización, formación de complejos y similares, p. ej., como se describe en otra parte de la presente memoria.

[0724] Se puede emplear cualquier método adecuado para aislar muestras de sangre (p. ej., suero o plasma).

[0725] Según la presente invención, la muestra es sangre o plasma. Una muestra de sangre (p. ej., plasma o suero) puede comprender ADN y/o ARN de células tumorales circulantes y/o proteínas que se han difundido desde un tumor (p. ej., un tumor de próstata).

[0727] El término “ muestra” también abarca cualquier material derivado del procesamiento (p. ej., como se ha descrito anteriormente) de una muestra biológica.

[0729] En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden incluir un paso de procesamiento de una muestra. En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden realizarse, por lo tanto, en tales muestras procesadas o en materiales derivados de tales muestras procesadas. Un paso de procesamiento puede implicar una o más de las siguientes: filtración, destilación, centrifugación, extracción, concentración, dilución, purificación, inactivación de los componentes que interfieren, adición de reactivos, derivatización, amplificación, ligación por adaptador y similares.

[0730] Las muestras se pueden utilizar inmediatamente o se pueden almacenar para su utilización posterior (p. ej., a -80 0C).

[0731] Los métodos de la invención como se describen en la presente memoria pueden realizarse en cualquier tipo de sujeto que sea capaz de padecer cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Los métodos se realizan generalmente en mamíferos (de forma típica mamíferos machos en el caso de la detección del cáncer de próstata), por ejemplo, seres humanos, primates (p. ej., monos), mamíferos de laboratorio (p. ej., ratones, ratas, conejos, cobayas), mamíferos ganaderos (p. ej., caballos, vacas, ovejas, cerdos) o mascotas domésticas (p. ej., gatos, perros). Preferiblemente, el sujeto es un ser humano (de forma típica un ser humano masculino en el caso de la detección del cáncer de próstata).

[0733] En una realización, el sujeto (p. ej., un ser humano) es un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer (p. ej., cáncer de próstata) o en riesgo de aparición de cáncer (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., un sujeto sano o un sujeto que no presenta ningún síntoma de enfermedad (p. ej., enfermedad de la próstata) o cualquier otro sujeto “en riesgo” apropiado como se describe en otra parte de la presente memoria. En otra realización, el sujeto es un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene (o desarrolla), o que potencialmente tiene (o desarrolla) cáncer (p. ej., cáncer de próstata). En algunas realizaciones, particularmente para la detección del cáncer de próstata, el sujeto “en riesgo” puede ser un varón humano mayor de 40 años, o mayor de 50 años, o mayor de 55 años, o mayor de 60 años, o preferiblemente mayor de 65 años. En algunas realizaciones, el sujeto “en riesgo” puede ser un varón humano con un nivel de PSA (antígeno específico de la próstata) (p. ej., en la sangre) que es >4 ng/ml, o >5 ng/ml, >6 ng/ml, >7 ng/ml, >8 ng/ml, >9 ng/ml (p. ej., 9-19 ng/ml), >10 ng/ml o >11 ng/ml, >12 ng/ml, >13 ng/ml, >14 ng/ml, 15 ng/ml, >16 ng/ml, >17 ng/ml, >18 ng/ml, >19 ng/ml o >20 ng/ml o >25 ng/ml, o >50 ng/ml (p. ej., 4-20 o 4-50 ng/ml).

[0735] En algunos aspectos, un método de la invención puede comprender además un paso inicial de selección de un sujeto (p. ej., un sujeto humano) con riesgo de desarrollar cáncer (p. ej., cáncer de próstata) o en riesgo de aparición de cáncer (p. ej., cáncer de próstata), o que tiene o se sospecha que tiene (o desarrolla) cáncer (p. ej., cáncer de próstata), o que potencialmente tiene (o desarrolla) cáncer (p. ej., cáncer de próstata). Los pasos del método a continuación se pueden realizar en una muestra de tal sujeto seleccionado.

[0737] Si el resultado de un método de la invención es indicativo de cáncer de bajo riesgo (p. ej., cáncer de próstata) en el sujeto (p. ej., se hace un diagnóstico positivo de cáncer de bajo riesgo, p. ej., cáncer de próstata), a continuación, se puede realizar un paso adicional de espera vigilante o vigilancia activa.

[0739] En algunas realizaciones, si un sujeto ya está recibiendo una terapia farmacéutica (p. ej., una terapia quimioterapéutica u otra terapia como se ha descrito anteriormente) y el nivel de una o más propiedades del GAG según la invención en una muestra, o una puntuación basada en estos niveles, se altera (o incluso no se altera) en un grado particular en comparación con un nivel de control (p. ej., en comparación con un nivel o puntuación registrado anteriormente para el mismo sujeto), a continuación, esto puede ser indicativo de que el tratamiento actual el agente no está siendo eficaz y que un agente terapéutico distinto de se debe utilizar el agente terapéutico anterior.

[0741] La invención se describirá adicionalmente con referencia al siguiente ejemplo no limitativo con referencia a los siguientes dibujos, en los que:

[0743] Figura 1.Análisis de los componentes principales de los perfiles de GAG en la sangre de sujetos sanos (gris claro), con PRAD (gris oscuro) o con células claras (negro). Los sujetos que pertenecen a un grupo determinado se representan como puntos conectados al centro geométrico de los puntos suspensivos que representan ese grupo. PRAD: Cáncer de próstata. RCC: Carcinoma de células renales.

[0745] Figura 2.Análisis de los componentes principales de los perfiles de GAG en la orina de sujetos sanos (gris claro), con PRAD (gris oscuro) o con células claras (negro). Los sujetos que pertenecen a un grupo determinado se representan como puntos conectados al centro geométrico de los puntos suspensivos que representan ese grupo. PRAD: Cáncer de próstata. RCC: Carcinoma de células renales.

[0747] Figura 3.Análisis de los componentes principales de los perfiles de GAG en la sangre y la orina combinados de sujetos sanos (gris claro), PRAD (gris oscuro) o con células claras (negro). Los sujetos que pertenecen a un grupo determinado se representan como puntos conectados al centro geométrico de los puntos suspensivos que representan ese grupo. PRAD: Cáncer de próstata. RCC: Carcinoma de células renales.

[0749] Figura 4.Gráficos de cajas de sangre, orina y puntuaciones combinadas en sujetos sanos vs. sujetos con PRAD. Las puntuaciones de las asignaturas individuales se representan con puntos. Las líneas horizontales identifican la puntuación límite óptima para la que se logró la mayor precisión al distinguir el PRAD de los individuos sanos para cada tipo de puntuación. PRAD: Cáncer de próstata.

[0751] Figura 5.Curvas ROC para la clasificación de los sujetos entre PRAD y sanos basándose en la puntuación en sangre (arriba), orina (en la mitad) o combinada (en la parte inferior). Los puntos superpuestos en cada curva representan la puntuación límite óptima en la que la clasificación de los sujetos entre PRAD y sanos basándose en las diferentes puntuaciones es más precisa (las coordenadas bidimensionales de ese punto son la especificidad y la sensibilidad). PRAD: Cáncer de próstata.

[0753] Figura 6.Gráficos de cajas de puntuaciones combinadas del PRAD en sujetos sanos con RCC vs. sujetos con PRAD vs. sujetos con RCC de células claras. Las líneas horizontales identifican la puntuación límite óptima previamente detectada para maximizar la precisión a la hora de distinguir el PRAD de las personas sanas. PRAD: Cáncer de próstata. RCC: Carcinoma de células renales.

[0755] Figura 7.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de RCC en sujetos sanos vs. sujetos con PRAD vs. sujetos con RCC de células claras. Las líneas horizontales identifican la puntuación límite óptima previamente detectada para maximizar la precisión a la hora de distinguir el RCC de las personas sanas. PRAD: Cáncer de próstata. RCC: Carcinoma de células renales.

[0757] Figura 8.Clasificación de las propiedades del GAG en términos de la disminución de la precisión de un clasificador forestal aleatorio cuando se omite la propiedad (la disminución de la precisión se mide como la disminución media del coeficiente de Gini). El clasificador fue entrenado sobre las propiedades del GAG de muestras de sangre y orina coincidentes. Solo se muestran las 30 mejores propiedades.

[0759] Figura 9. (A/B/C)Propiedades de los GAG en la sangre que se alteraron significativamente en el cáncer en comparación con las de los voluntarios sanos, pero no debido a los efectos específicos del tipo de cáncer. Las muestras triangulares y circulares del gráfico de cajas que representan la población con cáncer definen dos tipos diferentes de cáncer. (A:NsHS;B:6s CS y carga<c>S;C:0s<c>S y 4s/6s CS).

[0761] Figura 10. (A/B/C)Propiedades de los GAG en la orina que se alteraron significativamente en el cáncer en comparación con las de los voluntarios sanos, pero no debido a los efectos específicos del tipo de cáncer. Las muestras triangulares y circulares del gráfico de cajas que representan la población con cáncer definen dos tipos diferentes de cáncer. (A:0s HS y carga HS;B:4s CS y 6s/0s CS;C:4s/0s CS).

[0763] Figura 11.Curva de las características operativas del receptor (ROC) para la clasificación de las muestras en “casos” (sujetos con un diagnóstico actual de cáncer) vs. “controles” (sujetos sanos o con un diagnóstico anterior de cáncer y actualmente sin evidencia de enfermedad) utilizando un clasificador de perceptrones multicapa que se basa en el 66 % de los perfiles de GAG de las muestras (izquierda) y se analizó en el 33 % restante de las muestras los perfiles de GAG (derecha) medidos en la sangre (arriba), orina (medio), o sangre y orina (abajo).

[0765] Figura 12.Puntuaciones de GAG basadas en las mediciones de las propiedades del GAG en sangre en “casos” (sujetos con un diagnóstico actual de cáncer) vs. “controles” (sujetos sanos o con un diagnóstico anterior de cáncer y actualmente sin evidencia de enfermedad). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima para la que se logró la mayor precisión al distinguir los casos de los controles. Se omitió un punto de datos del “caso” porque las puntuaciones del GAG eran superiores a 3. Clave: cuadrados: carcinoma de células renales; triángulos: cáncer de próstata; círculos - sujetos sanos. Tenga en cuenta que un “control” puede representarse con un símbolo de cáncer si el estado actual en el momento del muestreo no era evidencia de enfermedad.

[0767] Figura 13.Las puntuaciones de GAG se basan en las mediciones de las propiedades del GAG en la orina en “casos” (sujetos con un diagnóstico actual de cáncer) vs. “controles” (sujetos sanos o con un diagnóstico anterior de cáncer y actualmente sin evidencia de enfermedad). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima para la que se logró la mayor precisión al distinguir los casos de los controles. Clave: cuadrados: carcinoma de células renales; triángulos: cáncer de próstata; círculos - sujetos sanos. Tenga en cuenta que un “control” puede representarse con un símbolo de cáncer si el estado actual en el momento del muestreo no era evidencia de enfermedad.

[0769] Figura 14.Puntuaciones de GAG basadas en mediciones de las propiedades del GAG en sangre y orina en “casos” (sujetos con un diagnóstico actual de cáncer) vs. “controles” (sujetos sanos o con un diagnóstico anterior de cáncer y actualmente sin evidencia de enfermedad). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima para la que se logró la mayor precisión al distinguir los casos de los controles. Clave: cuadrados: carcinoma de células renales; triángulos: cáncer de próstata; círculos - sujetos sanos. Tenga en cuenta que un “control” puede representarse con un símbolo de cáncer si el estado actual en el momento del muestreo no era evidencia de enfermedad.

[0770] Figura 15.Curvas ROC para la clasificación de los sujetos como casos frente a controles basándose en la puntuación en sangre (arriba), orina (en la mitad) o combinada (en la parte inferior). Los puntos superpuestos en cada curva representan la puntuación límite óptima en la que la clasificación de los sujetos como casos y controles basándose en las diferentes puntuaciones es más precisa (las coordenadas bidimensionales de ese punto son la especificidad y la sensibilidad). También se indica el área bajo la curva (AUC) de cada curva ROC.

[0772] Figura 16.Regulación del metabolismo de los glucosaminoglicanos en 22 subtipos de cáncer vs. tejido normal de origen compatible. Mapa térmico de la dirección de regulación de cada gen asociado con el metabolismo de los glicosaminoglicanos (filas) en cada subtipo de cáncer (columnas) en comparación con el tejido normal de origen correspondiente. Las entradas grises indican una regulación negativa del nivel de expresión génica, las entradas negras indican una regulación positiva del nivel de expresión génica, mientras que las entradas blancas indican que no hay una diferencia significativa en el nivel de expresión génica con muestras normales o que no hay datos disponibles. Leyenda: MM - Melanoma maligno; PRAD - Adenocarcinoma de próstata; THCA - Carcinoma de tiroides; PAAD - Adenocarcinoma pancreático; COAD- Adenocarcinoma de colon; READ - Adenocarcinoma rectal; UCEC-Carcinoma endometrial del cuerpo uterino; BRCA - Carcinoma de mama; LUAD - Adenocarcinoma pulmonar; BLAD -Carcinoma de vejiga urotelial; LUSC - Carcinoma de células escamosas de pulmón; LIHC - Carcinoma hepatocelular hepático; CHOL - Colangiocarcinoma; GBM - Glioblastoma multiforme; STAD - Adenocarcinoma de estómago; HNSC - Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; ESCA - Carcinoma de esófago; OVSA - Adenocarcinoma ovárico seroso; PTCL - Linfoma periférico de células T; KIRC - Carcinoma de células renales de células claras; KICH - Carcinoma cromófobo de células renales; KIRP - Carcinoma papilar de células renales.

[0774] Figura 17.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de M GAG en personas sanas vs. melanomas. La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el melanoma de las personas sanas para esta puntuación.

[0776] Figura 18.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas del grupo M GAG calculadas mediante una fórmula alternativa entre pacientes sanos y melanomas. La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el melanoma de las personas sanas para esta puntuación alternativa.

[0778] Figura 19.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG del CRC en pacientes sanos vs. cánceres colorrectales (CRC). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el CRC de las personas sanas para esta puntuación.

[0780] Figura 20.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG de GNET en sanos vs. tumores neuroendocrinos gastrointestinales (GNET). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el GNET de las personas sanas para esta puntuación.

[0782] Figura 21.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG de la CLL en la leucemia linfoide sana vs. la leucemia linfoide crónica (CLL). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir la CLL de las personas sanas para esta puntuación.

[0784] Figura 22.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG de la CLL calculadas mediante una fórmula alternativa entre la leucemia linfoide sana y la leucemia linfoide crónica (CLL). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir la CLL de las personas sanas para esta puntuación alternativa.

[0786] Figura 23.Gráficos de cajas de las puntuaciones de GAG en orina de BCa en personas sanas vs. las del cáncer de vejiga (BCa). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir la BCa de las personas sanas para esta puntuación.

[0788] Figura 24.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de BC GAG en pacientes sanos vs. cáncer de mama (BC). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el BC de las personas sanas para esta puntuación.

[0790] Figura 25.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG de OV en pacientes sanos vs. cáncer de ovario (OV). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el OV de las personas sanas para esta puntuación.

[0792] Figura 26.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG en sangre de la EC en pacientes sanos vs. cánceres de endometrio (EC). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir la EC de las personas sanas para esta puntuación.

[0794] Figura 27.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG en el CST en pacientes sanos vs. cánceres de cuello uterino (CST). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el CST de las personas sanas para esta puntuación.

[0795] Figura 28.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG del NHL en sanos vs. linfomas no hodgkinianos (NHL). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir NHL de las personas sanas para esta puntuación.

[0797] Figura 29.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas del DG GAG en gliomas sanos y difusos (DG), agrupados por subtipo. La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el DG de las personas sanas para esta puntuación.

[0799] Figura 30.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG de LC en personas sanas vs. personas con cáncer de pulmón (LC). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el LC de las personas sanas para esta puntuación.

[0801] Figura 31.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG de LC calculadas mediante una fórmula alternativa en sanos y el cáncer de pulmón (LC). La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el LC de las personas sanas para esta puntuación alternativa.

[0803] Figura 32.Gráficos de cajas de la carga CS y la concentración total de CS y HA en cada tipo de cáncer en comparación con sujetos sanos. Clave: cáncer de mama (BC), cáncer colorrectal (CRC), cáncer de cuello uterino (CST), glioma difuso (DG), cáncer de endometrio (EC), tumores neuroendocrinos gastrointestinales (GNET), sano (H), leucemia linfoide (LL), linfoma no hodgkiniano (NHL), cáncer de pulmón (NSCLC), cáncer de ovario (OV), cáncer de próstata (PCa).

[0805] Figura 33.Gráficos de cajas de la carga HS y la HS total en cada tipo de cáncer en comparación con sujetos sanos. Clave como en la figura 32.

[0807] Figura 34.Los valores medios de cada propiedad en la composición del CS en cada grupo de tipos de cáncer y en el grupo de sujetos sanos. Los valores medios de cada propiedad de composición de CS que pertenecen al mismo grupo están conectados por una línea distinta. Clave como en la figura 32.

[0809] Figura 35.Los valores medios de cada propiedad en la composición del HS en cada grupo de tipos de cáncer y en el grupo de sujetos sanos. Los valores medios de cada propiedad de composición de HS que pertenecen al mismo grupo están conectados por una línea distinta. Clave como en la figura 32.

[0811] Figura 36.Gráficos de cajas de las puntuaciones sanguíneas de GAG para el cáncer calculadas mediante una fórmula alternativa para determinar si están sanos vs. los que tienen cáncer, agrupados por tipo. Clave como la figura 32. La línea horizontal identifica la puntuación límite óptima que maximiza la precisión a la hora de distinguir el cáncer de las personas sanas para esta puntuación alternativa. A la derecha, el ROC correspondiente a la clasificación entre cáncer y sano utilizando esta puntuación sanguínea alternativa de GAG para el cáncer.

[0813] Ejemplo 1

[0815] introducción

[0817] Se prevé que el número de casos de cáncer de próstata aumente considerablemente en un futuro próximo. El aumento de la población con cáncer de próstata determina la necesidad urgente de mejorar el panorama actual del diagnóstico del cáncer de próstata. En particular, se necesitan herramientas prácticas y asequibles para el diagnóstico del cáncer de próstata para ayudar a los profesionales de la salud a detectar temprano el cáncer de próstata, que de forma típica se correlaciona con resultados clínicos más favorables, o para guiar el tratamiento de los pacientes actuales con cáncer de próstata. Los biomarcadores circulantes son moléculas que pueden medirse en los fluidos corporales accesibles de los individuos, p. ej., sangre u orina, y cuyos niveles son útiles para ayudar al diagnóstico y/o pronóstico y/o predicción de la respuesta al tratamiento. Un ejemplo de un biomarcador ampliamente utilizado es el antígeno específico de la próstata (PSA) para el cáncer de próstata, pero el valor clínico de este biomarcador para el diagnóstico del cáncer de próstata es muy debatido.

[0819] Los biomarcadores emergentes del cáncer son ácidos nucleicos circulantes derivados directamente de las células cancerosas. Estos ácidos nucleicos se pueden encontrar, por ejemplo, en el ADN libre circulante, en el ARN pequeño circulante, en las células tumorales circulantes o en las microvesículas extracelulares (incluidos los exosomas) que contienen ARN pequeño, ARNm y ADN. La tecnología mínimamente invasiva para la detección de tales biomarcadores moleculares sin la necesidad de procedimientos costosos o invasivos se define como biopsia líquida. Recientemente, la definición de biopsia líquida se amplió para abarcar otras clases macromoleculares de biomarcadores del cáncer, por ejemplo, las proteínas transportadas dentro de los exosomas circulantes. Se ha demostrado anteriormente que incluso los metabolitos circulantes podrían servir como biomarcadores moleculares precisos para el carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés), la forma más común de cáncer de riñón (Gatto y col., 2016). En particular, el perfil cuantitativo de los glucosaminoglicanos (GAG) en la sangre u orina de un sujeto podría puntuarse computacionalmente para obtener puntuaciones de GAG con un valor diagnóstico demostrado para el RCC (Gatto y col., 2016).

[0821] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer de próstata.

[0823] Material y métodos

[0825] Recolección de muestras de sangre y orina

[0827] Se recolectaron 28 muestras de orina y sangre coincidentes de 14 pacientes con PRAD.

[0829] Los tubos de sangre entera se centrifugaron (2,500 g durante 15 minutos a 4 0C) y el suero se extrajo y se recolectó en un tubo separado. Las mediciones de GAG en sangre en pacientes con PRAD se realizaron en muestras de suero. Las muestras de orina se recolectaron en tubos de polipropileno. Las muestras se almacenaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco. Las muestras de orina y las muestras de sangre (plasma) de sujetos sanos y sujetos con RCC son las de Gattoy col.,2016.

[0831] Los GAG séricos y plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Por lo tanto, para los fines de este estudio, el suero y el plasma se denominan colectivamente sangre.

[0833] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[0835] La preparación de las muestras, incluidas los pasos de extracción y purificación, se realizó como lo describieron anteriormente Volpi y Maccari (20051 y 2) y Coppa y col. (2011), mientras que la separación y cuantificación de los GAG de las muestras se realizaron como se describe en Volpi y col. (2014); Volpi y Linhardt (2010).

[0837] En resumen, para extraer los GAG, se liofilizaron 500 pl de muestra, se reconstituyeron con 1 ml de un tampón TRIS-Cl 20 mM a pH 7,4 y se trataron con proteasa (Proteinasa K de Tritirachium album [E.C. 3,4.21,64], >500 unidades ml_1 de Sigma-Aldrich) a 60 0C durante 12 h. Después de hervir durante 10 minutos, centrifugar y filtrar en filtros de 0,45 pm, el filtrado se liofilizó. El polvo se disolvió en 1 ml de agua destilada mediante mezcla prolongada. Después de la centrifugación a 5000 g durante 15 minutos, se añadieron 0,2 ml de ácido tricloro-acético al 20 % al sobrenadante. Después de 2 h a 4 0C, la mezcla se centrifugó a 5000 g durante 15 min, y el sobrenadante se recuperó y se liofilizó. Después de la solubilización en 0,4 ml de agua bidestilada y la centrifugación a 10 000 g durante 10 minutos, se recolectó el sobrenadante y se analizó adicionalmente. Para purificar los GAG, después de la reconstitución con 500 pl de NaCl 10 mM, los GAG de muestra se purificaron adicionalmente en resina de intercambio aniónico (QAE Sephadex A-25). Después de la centrifugación a 10,000 x g durante 5 min, el sobrenadante se aplicó a una columna (1 cm x 4 cm) empaquetada con aproximadamente 3 ml de resina previamente equilibrada con NaCl 10 mM. Después de lavar la resina con 20 ml de NaCl 10 mM, se añadieron 10 ml de NaCl 2,5 M. Se añadieron cincuenta mililitros de etanol al eluato (10 ml) y se almacenó a -20 0C durante 24 h. Después de la centrifugación a 5000 x g durante 15 min, el sedimento se secó a 60 0C durante 12 h. Después de la reconstitución con 80 pl de acetato de amonio 50 mM, pH 8,0, el material se trató con 20 pl de condroitinasa ABC a 37 0C durante 12 h. Para separar y cuantificar los GAG, después de hervir durante 5 minutos, las muestras se inyectaron en HPLC con derivatización posterior a la columna y detección fluorimétrica y espectrometría de masas por ionización por electropulverización en línea (ESI-MS).

[0839] Se midieron diecinueve propiedades independientes del GAG en cada muestra (sangre u orina): Concentración de CS (en pg/ml), concentración de HS (en pg/ml), concentración de HA (en pg/ml) y fracciones másicas de la composición de disacáridos tanto para CS como para HS. Además, se calcularon cinco propiedades dependientes del GAG a partir de estas mediciones: la carga CS y HS; y la siguiente relación CS de fracciones de masa: 4s/6s, 6s/0s, y 4s/0s. Las 24 propiedades del GAG pueden denominarse colectivamente perfil de GAG.

[0841] La similitud general en el perfil de GAG entre los sujetos pertenecientes a los tres grupos (cáncer de próstata vs. carcinoma de células renales vs. sanos) se examinó más a fondo mediante el análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) comparando las propiedades de los GAG medidas únicamente en la sangre o en la orina o en ambos líquidos. El análisis de los componentes principales se implementó utilizando el paquete R ade4 (el centrado se realizó por la media) (Dray y Dufour, 2007).

[0843] Diseño de biomarcadores

[0845] La significación estadística de los cambios en cada propiedad del GAG entre los dos grupos (cáncer de próstata vs. pacientes sanos) se evaluó calculando el intervalo de densidad (HDI, por sus siglas en inglés) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana bajo los siguientes supuestos: Los valores de las propiedades del GAG se muestrean a partir de una distribucióntde normalidad desconocida y por estimar (es decir, grados de libertad); alta incertidumbre sobre las distribuciones anteriores; la distribución marginal se aproxima bien mediante un muestreo de Montecarlo en cadena de Markov sin adelgazamiento y con una longitud de cadena igual a 100 000. La estimación se realizó utilizando el paquete RBEST(las suposiciones anteriores se reflejan en los parámetros predeterminados). Se prefirió la estimación bayesiana a la prueba t, ampliamente utilizada, ya que proporciona una estimación sólida y confiable de la diferencia de medias incluso bajo la incertidumbre de la distribución de la puntuación subyacente para los dos grupos (este es el caso cuando el número de muestras es limitado).

[0847] Para verificar si los cambios en el perfil de GAG en los pacientes con PRAD podían condensarse en puntuaciones de GAG, que pudieran utilizarse para diferenciar a los pacientes con PRAD de los sujetos sanos y, por lo tanto, serían adecuadas como diagnóstico del cáncer, utilizamos la regresión logística penalizada por Lasso (Tibshirani, 1996) con una validación cruzada sin dejar de lado para seleccionar las propiedades sólidas del GAG que fueran más predictivas del resultado clínico (es decir, el PRAD en comparación con un sujeto sano). La puntuación se diseñó posteriormente como una razón, donde el numerador es la suma de las propiedades asociadas con el PRAD y el denominador es la suma de las propiedades asociadas con el estado sano. Cada término se normalizó utilizando los coeficientes de regresión.

[0849] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era de suero o plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[0851] Métricas de precisión

[0853] Para cada marcador (sangre, orina o combinado), evaluamos su desempeño en la clasificación binaria de una muestra como cancerosa de próstata o sana con diferentes puntuaciones de umbral mediante la derivación de las curvas de características operativas del receptor (ROC). Medimos la precisión de cada marcador como el área bajo la curva (AUC) de su curva ROC (el AUC es 1 para un clasificador perfecto y 0,5 para un clasificador aleatorio). Seleccionamos como valor límite potencial para un marcador dado la puntuación para la que la precisión era máxima, es decir, una muestra cuya puntuación de marcador está por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de ser cáncer de próstata y por debajo de este valor límite tiene la máxima probabilidad de estar sana. Las curvas ROC se calcularon con el paquete R pROC, mientras que el punto límite óptimo se calculó con el paquete R OptimalCutpoints.

[0855] Resultados

[0857] Analizamos los perfiles de GAG en el adenocarcinoma de próstata (PRAD). Recolectamos un total de 28 muestras de orina y sangre coincidentes de 14 pacientes con PRAD. Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla A. Cuantificamos el perfil de los GAG en las muestras anteriores, que comprende el nivel y la composición química de disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG para muestras de sangre y/u orina (enumeradas en la tabla B). También comparamos el valor de cada propiedad del perfil GAG del grupo PRAD con los valores previamente medidos en el perfil GAG de un grupo de 50 muestras de orina y sangre coincidentes de 25 personas sanas. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana bajo los siguientes supuestos: Los valores de las propiedades del GAG se muestrean a partir de una distribucióntde normalidad desconocida y por estimar (es decir, grados de libertad); alta incertidumbre sobre las distribuciones anteriores; la distribución marginal se aproxima bien mediante un muestreo de Montecarlo en cadena de Markov sin adelgazamiento y con una longitud de cadena igual a 100000. La estimación se realizó utilizando el paquete RBEST(las suposiciones anteriores se reflejan en los parámetros predeterminados). Se prefirió la estimación bayesiana a la prueba t, ampliamente utilizada, ya que proporciona una estimación sólida y confiable de la diferencia de medias incluso bajo la incertidumbre de la distribución de la puntuación subyacente para los dos grupos (este es el caso cuando el número de muestras es limitado). Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades del GAG entre el PRAD, en comparación con los sujetos sanos (tabla B). Además, examinamos la similitud general en el perfil de GAG entre los sujetos que pertenecían a los dos grupos mediante el análisis de componentes principales (PCA) comparando las propiedades de los GAG medidas únicamente en la sangre (figura 1) o en la orina (figura 2) o en ambos líquidos (figura 3). El análisis de los componentes principales se implementó utilizando el paquete R ade4 (el centrado se realizó por la media) (Dray y Dufour, 2007). Este análisis demostró que los sujetos pertenecientes a los dos grupos se agruparon por separado en cada fluido, lo que sugiere que existen diferencias marcadas en el perfil de los GAG para los dos grupos. Para comparar qué tan similar era el perfil de GAG del PRAD al del RCC, incluimos en cada PCA los perfiles de GAG del grupo de RCC, analizados en nuestro estudio anterior (Gatto y col., 2016), y los perfiles de GAG en sangre recopilados de una cohorte adicional de 40 sujetos con RCC de células claras. El grupo de RCC de nuestro estudio previo incluyó específicamente a pacientes con RCC de células claras, que comprende 52 sujetos con muestras de sangre, 20 sujetos con muestras de orina y 19 sujetos con ambas. Sorprendentemente, se observó una separación entre los sujetos con PRAD y con RCC, y también entre los sujetos sanos, lo que indica que se producen cambios únicos en el perfil de GAG en la sangre y la orina de los sujetos con PRAD.

[0859] Para verificar si los cambios en el perfil de GAG en los pacientes con PRAD podían condensarse en puntuaciones de GAG, que pudieran utilizarse para diferenciar a los pacientes con PRAD de los sujetos sanos y, por lo tanto, serían adecuadas como diagnóstico del cáncer de próstata, utilizamos la regresión logística penalizada por Lasso (Tibshirani, 1996) con una validación cruzada sin dejar de lado para seleccionar las propiedades sólidas del GAG que fueran más predictivas del resultado clínico (es decir, el PRAD en comparación con un sujeto sano). La puntuación se diseñó posteriormente como una razón, donde el numerador es la suma de las propiedades asociadas con el PRAD y el denominador es la suma de las propiedades asociadas con el estado sano. Cada término se normalizó utilizando los coeficientes de regresión. Obtuvimos tres puntuaciones de biomarcadores del PRAD, basadas en mediciones de sangre u orina o combinadas:

[0862] [45CS]

[0863] Puntuación sanguínea= —r----------¿[O sC S ]

[0865] 3[HÁ\ +^ [Ns2s HS]

[0866] Puntuación urinaria =..............-----------------

[0867] | [45CS]

[0869] „ ., , . ,(Puntuación sanguínea Puntuación urinaria) Puntuación combinada= ------------------2------------------------------- -

[0871] donde los términos entre paréntesis representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, y [HA] es la concentración total de HA (en pg/ml). Posteriormente, calculamos las tres puntuaciones para cada muestra y observamos que las muestras de PRAD tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras sanas (Figura. 4). Calculamos las diferencias medias significativas no nulas en las tres puntuaciones entre los dos grupos utilizando una estimación bayesiana sólida. La diferencia media fue igual a 0,43 para la puntuación combinada (HDI del 95 %: 0,35 a 0,52), 0,54 para la puntuación sanguínea (HDI del 95 %: 0,39 a 0,69) y 0,29 para la puntuación en orina (HDI del 95 %: 0,21 a 0,37). El rendimiento de las tres puntuaciones se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto) en el caso de la puntuación combinada, 0,997 para la puntuación sanguínea y 0,994 para la puntuación urinaria (figura). 5). Identificamos un punto límite óptimo para cada puntuación a fin de maximizar la precisión en la clasificación de los sujetos con PRAD en comparación con los de los individuos sanos que utilizaron los datos del perfil de GAG en sangre u orina. Estas puntuaciones límite fueron de 0,63, 0,19, 0,47 para la sangre, la orina y la puntuación combinada, respectivamente. Con estos puntos límite, los sujetos con PRAD pudieron distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 97,4 % utilizando la puntuación de sangre u orina, y una precisión del 100 % utilizando la puntuación combinada. Otras métricas de precisión se informaron en la tabla C. En conjunto, estos resultados demuestran que la elaboración de perfiles de GAG en biofluidos accesibles es adecuada para diagnosticar el cáncer de próstata.

[0873] También investigamos si las puntuaciones diseñadas para detectar el PRAD no son específicas del RCC (carcinoma de células renales) y viceversa. Sorprendentemente, la puntuación combinada diseñada para detectar el PRAD se correlacionó específicamente con los 14 sujetos con PRAD, frente a 19 sujetos con RCC y 25 sujetos sanos (figura 6). Al optimizar el punto límite para maximizar la precisión en la detección del PRAD, con una puntuación límite igual a 0,52, el PRAD se puede distinguir de los sujetos sanos o de los sujetos con RCC con una precisión del 98,3 %, lo que confiere a la puntuación combinada una sensibilidad y una especificidad generales para el PRAD iguales al 100 % y al 97,7 %, respectivamente. A modo de comparación, una prueba de PSA estándar para detectar el PRAD en hombres mayores de 50 años con un riesgo promedio, suponiendo un valor límite igual a 4 ng/ml, tiene valores típicos de sensibilidad y especificidad del 21 % (51 % para las lesiones de grado alto con una puntuación de Gleason mayor o igual que 8) y del 91 %, respectivamente (Wolf y col., 2010).

[0875] Por el contrario, la puntuación sanguínea diseñada para detectar el RCC identificó específicamente a los sujetos con RCC, a diferencia de los sujetos con PRAD y los sujetos sanos (Figura 7). Al optimizar el límite para maximizar la precisión en la detección del RCC en comparación con los sujetos sanos o con PRAD, con una puntuación límite igual a 0,23 para la puntuación sanguínea previamente obtenida para el RCC (Gatto y col., 2016), la precisión general también para la detección de sujetos con RCC fue del 89,3 %, logrando una sensibilidad y una especificidad del 97,8 % y el 69,2 %, respectivamente, y un AUC = 0,941. Estos resultados demuestran que se pueden diseñar diferentes puntuaciones de GAG (o perfiles de GAG) para detectar específicamente la próstata o el RCC, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[0877] Conclusiones

[0879] Las biopsias líquidas prometen revolucionar el diagnóstico del cáncer de próstata al proporcionar una alternativa precisa, simple, mínimamente invasiva, rápida y/o económica a las biopsias de tejido y las imágenes médicas, que actualmente son el estándar de referencia para el diagnóstico del cáncer de próstata. En este estudio, hemos demostrado que una plataforma emergente de biopsias líquidas podría aprovechar las mediciones de los perfiles de GAG basadas en sangre u orina. Hemos demostrado que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer de próstata y los sujetos sanos. Los perfiles de GAG se pueden condensar aún más en puntuaciones de GAG que son muy prometedoras en términos de precisión para la detección o el diagnóstico del cáncer de próstata. Además, se demostró que las puntuaciones de g Ag del cáncer de próstata eran específicas del cáncer de próstata en comparación con el RCC (carcinoma de células renales). Las propiedades o puntuaciones diagnósticas del GAG divulgadas en la presente memoria también podrían aplicarse para cambiar una serie de prácticas clínicas. Por ejemplo, para controlar el cáncer de próstata antes y después de la cirugía o el tratamiento farmacológico; descartar la recaída de la enfermedad durante un período de tiempo más largo, después del cual de forma típica se declara que el paciente está curado; para evaluar la aparición del cáncer de próstata en una población en riesgo, tal como las personas con predisposición genética o las personas que presentan factores de riesgo o las personas que presentan síntomas; para determinar si una metástasis se debe a un cáncer de próstata; para predecir la recurrencia o recaída en pacientes con cáncer de próstata en estadio temprano; distinguir las lesiones sospechosas de cáncer de próstata de las enfermedades no malignas; y para detectar el cáncer de próstata en la población general. Por lo tanto, esta biopsia líquida tiene el potencial de convertirse en una herramienta crucial para permitir la prevención secundaria del cáncer de próstata y reducir la carga que cautiliza esta enfermedad en la población general.

[0880] Referencias

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[0889] Tabla A Datos clínicos de las cohortes analizadas en este estudio. Todos los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o en porcentaje. Se omitieron los valores faltantes.

[0891]

[0892] Tabla B: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el PRAD y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla B muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en el PRAD vs. la sangre o la orina de sujetos sanos y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla B también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[0894]

[0895]

[0898] Tabla C: Métricas de precisión con un punto límite óptimo para la sangre, la orina y la puntuación combinada para distinguir 14 sujetos con PRAD de 25 sujetos sanos.

[0900]

[0903] Ejemplo 2

[0905] Introducción

[0907] Se prevé que el número de casos de cáncer aumente considerablemente en un futuro próximo. Solo en los EE. UU., se espera que el número de nuevos pacientes con cáncer aumente de 1,36 millones en el 2000 a casi 3,0 millones en el 2050. El aumento de la población con cáncer determina la necesidad urgente de mejorar el panorama actual del diagnóstico del cáncer. En particular, se necesitan herramientas asequibles y prácticas para el diagnóstico del cáncer para ayudar a los profesionales de la salud a detectar el cáncer de forma temprana, lo que de forma típica se correlaciona con resultados clínicos más favorables, o para guiar el tratamiento de los pacientes con cáncer actuales. Los biomarcadores circulantes son moléculas que pueden medirse en los fluidos corporales accesibles de los individuos, p. ej., sangre u orina, y cuyos niveles son útiles para ayudar al diagnóstico y/o pronóstico y/o predicción de la respuesta al tratamiento. Desafortunadamente, los biomarcadores circulantes clínicamente probados están o estarán disponibles solo para una minoría de tipos de cáncer, incluso en casos de metástasis avanzadas. Ejemplos de biomarcadores ampliamente utilizados son el antígeno específico de la próstata (PSA) para el cáncer de próstata, el antígeno de carbohidratos 125 (CA125) para el cáncer de ovario o el antígeno carcinoembrionario (CEA) para el cáncer colorrectal. Incluso en estos casos, el valor clínico de estos biomarcadores para el diagnóstico del cáncer es muy debatido.

[0909] Los biomarcadores emergentes del cáncer son ácidos nucleicos circulantes derivados directamente de las células cancerosas. Estos ácidos nucleicos se pueden encontrar, por ejemplo, en el ADN libre circulante, en el ARN pequeño circulante, en las células tumorales circulantes o en las microvesículas extracelulares (incluidos los exosomas) que contienen ARN pequeño, ARNm y ADN. La tecnología mínimamente invasiva para la detección de tales biomarcadores moleculares sin la necesidad de procedimientos costosos o invasivos se define como biopsia líquida. Recientemente, la definición de biopsia líquida se amplió para abarcar otras clases macromoleculares de biomarcadores del cáncer, por ejemplo, las proteínas transportadas dentro de los exosomas circulantes. Se ha demostrado anteriormente que incluso los metabolitos circulantes podrían servir como biomarcadores moleculares precisos para el carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés), la forma más común de cáncer de riñón (Gatto y col., 2016). En particular, el perfil cuantitativo de los glucosaminoglicanos (GAG) en la sangre u orina de un sujeto podría puntuarse computacionalmente para obtener puntajes de GAG con un valor diagnóstico demostrado para el RCC (Gatto y col., 2016).

[0911] En este estudio, analizamos los datos sobre los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban dos tipos diferentes de cáncer, así como en voluntarios sanos. El objetivo era identificar si las alteraciones producidas por voluntarios sanos en el nivel o la composición química de GAG específicos eran atribuibles al cáncer en general y no se veían afectadas de forma significativa específicamente en un tipo de cáncer determinado, es decir, si existen patrones comunes de alteraciones en el perfil de GAG en diferentes tipos de cáncer. Además, buscamos analizar la regulación transcripcional del metabolismo de los GAG, que abarca los genes asociados con la biosíntesis y la degradación de los GAG, en un amplio espectro de tipos de cáncer según la histología. El objetivo era identificar si un patrón común de regulación transcripcional en muchos tipos diferentes de cáncer puede ser la base de posibles patrones comunes de alteraciones en el perfil de GAG en diferentes tipos de cáncer.

[0913] Materiales y métodos

[0914] A menos que se indique lo contrario, los materiales y métodos utilizados en este ejemplo corresponden a los materiales y métodos utilizados en el ejemplo 1.

[0916] Resultados

[0918] Analizamos los perfiles de GAG en muestras de sangre y orina de 114 sujetos, incluidos 25 voluntarios sanos, 100 pacientes con diagnóstico de carcinoma de células renales y 14 pacientes con diagnóstico de adenocarcinoma de próstata. Adoptamos un método de mínimos cuadrados (OLS, por sus siglas en inglés) ordinario para estimar los cambios en cada parte de una propiedad individual de los perfiles de GAG que eran atribuibles al cáncer, en contraposición a los cambios atribuibles específicamente a un tipo particular de cáncer (p. ej., el adenocarcinoma de próstata frente al carcinoma de células renales). Por lo tanto, el modelo lineal resultante fue:

[0920] Propiedad del GA Gu = /¿ ai[Cáncef\¡ + $•[.Adenocarcinoma de próstata]j

[0922] dondeiindexa una propiedad del GAG determinada en el perfil GAG de un determinado líquido (sangre u orina) yjindexa un sujeto determinado, es la intersección (p. ej., el valor esperado en un sujeto sano),aes el cambio atribuible al hecho de que el sujeto tiene cáncer y £ es el cambio atribuible al hecho de que el sujeto tiene un tipo específico de cáncer, el adenocarcinoma de próstata, mientras que e es el error que explica la discrepancia entre el valor realmente observado para la propiedad del GAG y el valor predicho por el modelo lineal, que se minimiza en OLS. Se realizó una prueba estadística en cada estimación de los coeficientes del modelo lineal (/,ay £) calculando sus estadísticas t y calculando la probabilidadpde observar al menos un valorttan extremo bajo la hipótesis nula de que el coeficiente verdadero es cero. La hipótesis nula se rechazó sipera inferior a 0,01, después de ajustar las pruebas múltiples mediante la corrección de Holm (tasa de falsos descubrimientos, FDR). Este análisis se realizó utilizando paquetes base en R, versión 3.3.1.

[0924] La tabla D y la tabla E enumeran las estimaciones para / (es decir, “ media en personas sanas” ),a(es decir, “desviación con respecto a la media en el cáncer” ) y £ (es decir, “desviación de la media debido a efectos específicos del tipo de cáncer” ) y sus respectivos FDR para cada propiedad del GAG en la sangre o la orina, respectivamente. Nos centramos en aquellas propiedades del GAG que mostraron en un fluido particular cambios significativos atribuibles al cáncer (FDR < 0,01), pero no a un efecto específico de un tipo particular de cáncer (FDR > 0,01).

[0926] En la sangre, las siguientes propiedades de los GAG se alteraron significativamente en el cáncer, independientemente del tipo de cáncer: 0s CS (fracción de peso másico, en%); 6s CS (fracción de peso másico, en%); 4s/6s CS (relación de fracciones de peso másico); carga CS; Ns HS (fracción de masa en peso, en%). Observamos un aumento de 6s CS y carga CS en la sangre de sujetos con cáncer en comparación con sujetos sanos, y una disminución de 0s CS, la relación 4s/6s CS y Ns HS (figura 9A/B/C).

[0928] En la orina, las siguientes propiedades de los GAG se alteraron significativamente en el cáncer, independientemente del tipo de cáncer: 4s CS (fracción de peso másico, en%).; 6s/0s CS (relación de fracciones de peso másico); 4s/0s (relación de fracciones de peso másico); 0s HS (fracción de peso másico, en%); carga HS. Observamos un aumento de la carga HS en la orina de los sujetos con cáncer en comparación con los sujetos sanos, y una disminución de 4s CS; 6s/0s CS; 4s/0s CS; 0s HS (Figura 10A/B/C).

[0930] Estos resultados indican que es de esperar que en voluntarios sanos se alteren propiedades específicas del perfil de GAG con respecto a los valores normales en la orina y la sangre de los pacientes con cáncer, independientemente del tipo de cáncer.

[0932] Intentamos diseñar un clasificador de aprendizaje automático para discriminar a los sujetos con cáncer vs. los sujetos de control mediante mediciones del perfil de GAG en sangre u orina. Las muestras se clasificaron como “ casos” si se tomaron de sujetos con un diagnóstico actual de cáncer o como “controles” si se tomaron de sujetos sanos o sujetos con un diagnóstico anterior de cáncer, pero sin evidencia de enfermedad. Por lo tanto, se añadieron 8 sujetos a la cohorte con un diagnóstico de carcinoma de células renales, pero sin evidencia de enfermedad en el momento del muestreo.

[0934] Entrenamos un perceptrón multicapa utilizando el software de código abierto weka 3.8.0 (suministrado por la Universidad de Waikato, Hamilton, Nueva Zelanda) y parámetros predeterminados en el 66 % de las muestras de la cohorte y probamos la precisión del modelo en el 33 % restante de las muestras. Los resultados sobre la capacidad del clasificador para distinguir los casos de los controles en el conjunto de entrenamiento y el conjunto de prueba para cada fluido se muestran en la tabla F. Observamos que el clasificador tenía una especificidad consistentemente alta en la detección de “ casos” , que oscilaban entre el 97,5 % y el 100 % en el conjunto de entrenamiento, según el fluido utilizado, y esta especificidad se mantuvo en el conjunto de prueba con valores que oscilaban entre el 81,1 % y el 95,4 %. Es importante destacar que el clasificador demostró ser robusto ante las elecciones arbitrarias del umbral de clasificación, como lo demuestra el hecho de que el clasificador era prácticamente perfecto en el conjunto de entrenamiento según el área bajo la curva de características operativas (AUC) del receptor, con valores que oscilaban entre 0,975 y 1, donde el AUC es una métrica que abarca un intervalo de 0 a 1, donde 0,5 es un clasificador aleatorio y 1 es un clasificador perfecto (figura 11). Este elevado poder discriminatorio también se observó en el conjunto de prueba, con valores de AUC que oscilaban entre 0,922 y 0,992. Estos resultados descartan la posibilidad de que el perceptrón multicapa se hubiera sobreajustado a los datos de entrenamiento y sugieren que su capacidad para detectar “ casos” podría generalizarse a cualquier muestra recolectada de forma independiente.

[0936] Intentamos aprovechar las alteraciones comunes independientes del tipo de cáncer en el perfil de GAG de los casos, en lugar de las muestras de control para diseñar puntuaciones de GAG en sangre, orina o combinadas con el objetivo de discriminar a los sujetos del “ caso” vs. los “de control” . Para ello, se utilizaron todas las muestras disponibles en nuestra cohorte como se describe en la tabla F. Adoptamos la regresión logística penalizada por Lasso (Tibshirani, 1996,supra)con una validación cruzada sin dejar de lado para seleccionar las propiedades sólidas de los GAG que fueran más predictivas del resultado clínico (es decir, el caso en comparación con el control). A continuación, filtramos de esta selección las propiedades del GAG para las que observamos que la diferencia de media entre el caso y el control tenía un intervalo de densidad (HDI) más alto estimado que incluía el valor 0. El HDI de cada propiedad del GAG se calculó utilizando una estimación bayesiana bajo los siguientes supuestos: para cada propiedad, se supuso que los valores de las propiedades del GAG se muestrearon a partir de una distribución t de normalidad desconocida y estimada (es decir, grados de libertad); alta incertidumbre sobre las distribuciones anteriores; la distribución marginal se aproximó bien mediante un muestreo de Montecarlo en cadena de Markov, sin adelgazamiento y con una longitud de cadena igual a 100 000. La estimación se realizó utilizando el paquete R BEST (las suposiciones anteriores se reflejaron en los parámetros predeterminados). A continuación, cada puntuación de GAG se diseñó como una relación, donde el numerador era la suma de las propiedades filtradas asociadas al caso y el denominador era la suma de las propiedades filtradas asociadas al control. Cada término se normalizó utilizando los coeficientes de regresión de la regresión logística. Se diseñaron las siguientes puntuaciones de GAG:

[0938] 10[6s CS] 20 [IpCsl

[0939] Puntuación sanguínea =—- —

-<------------------------>

[0940] 100 [6s

[0942] ,

[0943] Puntuación urinaria — [Ns2s HS]

[0945] <2 —=>--------

[0946] [45 CSl-—

[0948] {Puntuación sanguínea

[0949] Puntuación combinada =+Puntuación urinaria)

[0950] -------------------------------------------------------------------

[0952] donde los términos entre paréntesis representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente. Posteriormente calculamos las tres puntuaciones para cada muestra y observamos que las muestras de casos tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras de control (figuras 12, 13 y 14). La diferencia en las puntuaciones de GAG entre los casos y los controles demostró ser capaz de discriminar a los sujetos con una precisión muy alta, ya que las curvas ROC generadas para cada puntuación de GAG tenían un AUC igual a 0,961 para la sangre, 0,942 para la orina y 0,998 para las combinadas (figura 15). En general, estos resultados indican que se pueden diseñar puntuaciones a partir de mediciones en sangre u orina de propiedades específicas de los GAG para detectar el cáncer independientemente del tipo de cáncer.

[0954] También recuperamos datos de expresión génica para 19 subtipos de cáncer que abarcan 17 tipos de cáncer por histología: cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de sangre, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de tiroides y cáncer de útero. Los datos de expresión génica en forma de tablas de recuento de lecturas generadas por RNAseq para 16 de estos subtipos se recuperaron del proyecto The Cancer Genome Atlas (TCGA) (ttps: //gdc-portal.nci.nih.gov/). Los datos de expresión génica en forma de tablas de intensidad de señal generadas por micromatrices se recuperaron para los 3 subtipos restantes de tres conjuntos de datos públicos depositados en el Gene Expression Omnibus (GEO) (Raskin y col., 2013, Mok y col., 2009, Iqbal y col., 2010). También recuperamos datos de TCGA para el carcinoma de células renales (RCC) y tres subtipos de RCC: el RCC cromófobo, el RCC de células claras y el RCC papilar. Se recuperaron tanto muestras de tejido tumoral primario como muestras de tejidos normales compatibles para cada subtipo de cáncer. En la tabla G se presenta un resumen de los datos recuperados para este análisis.

[0956] Los datos de expresión génica se preprocesaron como se ha descrito anteriormente (Ritchie y col., 2015) utilizando el paquete R limma (Smyth, 2004). El análisis diferencial de la expresión génica para evaluar los cambios en la regulación transcripcional entre las muestras tumorales y normales se realizó por separado para cada subtipo de cáncer utilizando el paquete R limma en el caso de los datos de micromatrices y utilizando el paquete R voom (Law y col., 2014) en el caso de los datos de RNA-Seq, como se ha descrito anteriormente (Ritchie y col., 2015). Para un gen dado, los cambios en la regulación transcripcional en cualquiera de las direcciones, p. ej., regulación al alza o regulación a la baja, a partir de tejidos normales se consideraron estadísticamente significativos si observamos una tasa de error de descubrimiento falso q < 0,001 y un cambio mínimo absoluto en el nivel de expresión > 50 %.

[0957] A continuación, nos centramos en 60 genes asociados con el metabolismo de los GAG. En la tabla H. Se muestra una lista completa de genes. Observamos un perfil de regulación transcripcional diferencial específico para un subtipo de cáncer en comparación con los tejidos normales (Figura 16 y tabla K). En promedio, 30 de los 60 (50 %) genes GAG estaban regulados diferencialmente en cada tipo de cáncer (12 regulados negativamente y 18 regulados positivamente). Al menos 2 genes GAG se regularon diferencialmente en todos los subtipos de cáncer analizados. El número máximo de genes GAG regulados diferencialmente fue de 39, lo que se observó en el colangiocarcinoma. Ninguno de los subtipos de cáncer analizados mostró un perfil de regulación transcripcional de los genes GAG idéntico al de ninguno de los otros subtipos. Estos resultados sugieren que cada subtipo de cáncer puede afectar el nivel y la composición química de los GAG de una forma específica para cada subtipo de cáncer, lo que puede reflejar los efectos específicos del tipo de cáncer observados en las alteraciones del perfil de los GAG mencionadas anteriormente. Sorprendentemente, observamos genes GAG que mostraban el mismo patrón de regulación transcripcional prácticamente en todos los tipos de cáncer examinados: El CHPF2 se reguló al alza en 17 de los 22 tipos de cáncer, el CHPF y el B4GALT7 en 16 de los 22 tipos y el B3GAT3 en 15 de los 22 tipos. Se encontró que ninguno de estos estaba significativamente regulado a la baja en los tipos restantes. El EXTL1 y el HPSE2 se regularon significativamente a la baja en 11 y 12 de los 22 tipos, respectivamente. Se encontró que ninguno de estos estaba significativamente regulado al alza en los tipos restantes. Estos patrones son la base de los programas reguladores que se conservan en gran medida en diferentes tipos de cáncer.

[0959] El B4GALT7 y el B3GAT3 codifican las enzimas necesarias para sintetizar la región de enlace de cualquier GAG, mientras que el CHPF y el CHPF2 codifican las enzimas principales responsables de la polimerización del CS mediante la adición de monómeros de CS no sulfatados a la cadena en crecimiento. Se puede esperar que su regulación positiva en la mayoría de los cánceres altere el nivel y la composición de los GAG emergentes al aumentar el grado de CS no sulfatado, lo que resulta en los patrones comunes aquí observados en la orina de dos tipos de cáncer diferentes, donde la fracción sulfatada se redujo significativamente en comparación con la fracción no sulfatada (figura 10B/C). El patrón opuesto en la sangre puede atribuirse a la consecuencia fisiológica de la filtración de GAG del torrente sanguíneo operado por los riñones, lo que resulta en un enriquecimiento de las especies de CS sulfatadas en la sangre (Figura 9B/C). Por el contrario, la represión del EXTL1, que participa en la polimerización del HS añadiendo monómeros de HS no sulfatados a la región de unión, puede disminuir el grado de HS no sulfatado, dando como resultado el patrón común aquí observado en la orina de dos tipos de cáncer diferentes, donde la fracción sulfatada aumentó significativamente en comparación con la fracción no sulfatada (Figura 10A). Una vez más, la filtración fisiológica de GAG realizada por los riñones dará como resultado el patrón opuesto en la sangre, donde una forma sulfatada de HS disminuyó significativamente (Figura 9A). La represión de la HPSE2, que se sabe que inhibe la HPSE, puede provocar la actividad heparanasa de la HPSE, que tiene como objetivo degradar los polímeros de HS maduros, exacerbando así la reducción del HS no sulfatado que normalmente se observa en individuos sanos.

[0961] Estas observaciones sugieren que los patrones comunes en la regulación del metabolismo de los GAG en todos los cánceres están relacionados con las alteraciones comunes observadas en el perfil de GAG en la orina y la sangre en diferentes tipos de cáncer. Esto refuerza las conclusiones de que se espera que las propiedades específicas de los GAG se alteren en los fluidos corporales en comparación con las condiciones saludables como consecuencia del cáncer, independientemente del tipo de cáncer.

[0963] Tabla D - Estimaciones de los valores medios de cada propiedad del GAG en la sangre de voluntarios sanos y su cambio en presencia de cáncer y de los efectos específicos del tipo de cáncer. Se informan las FDR para cada estimación, considerándose estadísticamente significativas las FDR < 0,01 (negrita subrayada). Las propiedades de los GAG en la sangre que mostraron cambios significativos atribuibles al cáncer, pero no a efectos específicos de un tipo de cáncer en particular, se destacan en subrayado.

[0965]

[0966] Propiedad GAG Media en Desviación de Desviación de la de Desviación de la sanos la media en elMedia de la Desviación

[0967] cáncer m uned eia debido a s FaDnRos en l FD espefceícfitcoo del ra FDR con

[0968] meesdpieact eon a el la a laR m coedni respecto un efectoa debido a tipo de cáncer cáncer e dsep ceácnífciceor del tipo 4s/0s_CS_blood0,22 0,17 0,041.69E-031,32E-01 1,00E+00Charae CS blood0,18 0,10 0,042.84E-11 5.81 E-031,00E+00Tot_HA_blood0,12 -0,04 0,065.78E-108,45E-01 3,52E-01Tot_CS_blood5,37 -0,18 -1,201.21E-131,00E+00 1,00E+00Tris_HS_blood1,18 1,00 -1,03 3,82E-01 1,00E+00 1,00E+00Ns6s_HS_blood1,69 0,79 -1,281.11E-041,00E+00 3,52E-01Ns2s_HS_blood1,69 0,98 -0,121.69E-039,02E-01 1,00E+00Ns HS blood16,44 -10,18 5,147.87E-25 6.72E-101,62E-012s6s_HS_blood1,99 0,28 -1,519.40E-051,00E+00 3,31 E-016s_HS_blood6,87 -0,24 9,101.68E-051,00E+009.76E-05 2s_HS_blood5,35 -1,21 6,301.71E-051,00E+009.87E/-04 0s_HS_blood64,79 8,55 -16,631.98E-453,31 E-014.15E-03 Chame HS blood0,43 -0,04 0,121.70E-171,00E+00 1,00E+00Tot_HS_blood0,05 0,08 0,06 3,17E-01 2,09E-02 9,02E-01

[0969] Tabla E - Estimaciones de los valores medios de cada propiedad del GAG en la orina de voluntarios sanos y su cambio en presencia de cáncer y de los efectos específicos del tipo de cáncer. Se informan las FDR para cada estimación, considerándose estadísticamente significativas las FDR < 0,01 (negrita subrayada). Las propiedades de los GAG en la orina que mostraron cambios significativos atribuibles al cáncer, pero no a efectos específicos de un tipo de cáncer en particular, se destacan en subrayado.

[0971]

[0974] Tabla F - Métricas de precisión para un clasificador de perceptrones multicapa entrenado en el 66 % de las muestras y probado en el 33 % restante de las muestras. Se entrenaron tres clasificadores basándose únicamente en el perfil de GAG en sangre, solo en el perfil de GAG en orina, o en los perfiles de GAG en sangre y orina. Las muestras se clasificaron como “casos” , si se tomaron de sujetos con un diagnóstico actual de cáncer, o “controles” , si se tomaron de sujetos sanos o sujetos con un diagnóstico anterior de cáncer, pero sin evidencia de enfermedad.

[0975]

[0977] Tabla G: Número de muestras analizadas para cada subtipo de cáncer y su origen.

[0979]

[0981] Tabla H: Lista de genes asociados al metabolismo de los GAG.

[0983]

[0984]

[0985]

[0986] Tabla K:Regulación de los genes GAG en diferentes tipos de cáncer en comparación con el tejido normal de origen compatible. Las entradas con “1” indican que se encontró que el gen de esa fila estaba regulado al alza en el tipo de cáncer de esa columna; “-1” indica que se encontró que el gen de esa fila estaba regulado a la baja en el tipo de cáncer de esa columna; “0” indica que no se encontró que el gen de esa fila estuviera regulado en el tipo de cáncer de esa columna; NA indica información no disponible. Los genes se identifican por su símbolo genético oficial o, si no está disponible, por su Ident. genético Entrez. Clave como en la Tabla G.

[0988]

[0989]

[0990] Referencias

[0992] 1. F. Gatto y col., Glycosaminoglycan Profiling in Patients' Plasma and Urine Predicts the Occurrence of Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell Rep 15, 1822-1836 (2016).

[0994] 2. L. Raskin y col., Transcriptome profiling identifies HMGA2 as a biomarker of melanoma progression and prognosis. J Invest Dermatol 133, 2585-2592 (2013).

[0996] 3. S. C. Mok y col., A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell 16, 521-532 (2009).

[0998] 4. J. lqbal y col., Molecular signatures to improve diagnosis in peripheral T-cell lymphoma and prognostication in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Blood 115, 1026-1036 (2010).

[1000] 5. M. E. Ritchie y col., limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res 43, e47 (2015).

[1002] 6. G. K. Smyth, Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol 3, Artículo 3 (2004).

[1004] 7. C. W. Law, Y. Chen, W. Shi, G. K. Smyth, Voom: precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts. Genome Biol 15, R29 (2014).

[1006] Ejemplo 3

[1008] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban melanoma (M).

[1010] Material y métodos

[1012] Recolección de muestras de plasma

[1014] Se obtuvieron muestras de sangre de 14 voluntarios sanos (H) y 16 pacientes con melanoma uveal (N = 12) o cutáneo (N = 4). Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad en el momento de la toma de muestras.

[1016] La sangre entera se recolectó en tubos de EDTA y se centrifugó primero a 1000 g durante 10 minutos a 4 0C dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección y a continuación, el sobrenadante se centrifugó nuevamente a 10,000 g durante 10 minutos a 4 0C. El sobrenadante es un plasma pobre en plaquetas que se congeló a -80 0C hasta que se envió para el análisis en hielo seco.

[1018] Los GAG plasmáticos pobres en plaquetas corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este estudio, el plasma pobre en plaquetas también se denomina indistintamente sangre.

[1020] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1022] La preparación de la muestra, incluidas los pasos de extracción y purificación, se realizó como lo describieron anteriormente Volpi y Maccari (20051 y 2) y Coppa y col. (2011), mientras que la separación y cuantificación de los GAG de las muestras se realizaron como se describe en Volpi y col. (2014); Volpi y Linhardt (2010).

[1024] En resumen, para extraer los GAG, se liofilizaron 500 gl de muestra, se reconstituyeron con 1 ml de un tampón TRIS-CI 20 mM a pH 7,4 y se trataron con proteasa (Proteinasa K de Tritirachium album [E.C. 3,4.21,64], >500 unidades ml_1 de Sigma-Aldrich) a 60 0C durante 12 h. Después de hervir durante 10 minutos, centrifugar y filtrar en filtros de 0,45 gm, el filtrado se liofilizó. El polvo se disolvió en 1 ml de agua destilada mediante mezcla prolongada. Después de la centrifugación a 5000 g durante 15 minutos, se añadieron 0,2 ml de ácido tricloro-acético al 20 % al sobrenadante. Después de 2 h a 4 0C, la mezcla se centrifugó a 5000 g durante 15 min, y el sobrenadante se recuperó y se liofilizó. Después de la solubilización en 0,4 ml de agua bidestilada y la centrifugación a 10 000 g durante 10 minutos, se recolectó el sobrenadante y se analizó adicionalmente. Para purificar los GAG, después de la reconstitución con 500 gl de NaCl 10 mM, los GAG de muestra se purificaron adicionalmente en resina de intercambio aniónico (QAE Sephadex A-25). Después de la centrifugación a 10,000 x g durante 5 min, el sobrenadante se aplicó a una columna (1 cm x 4 cm) empaquetada con aproximadamente 3 ml de resina previamente equilibrada con NaCl 10 mM. Después de lavar la resina con 20 ml de NaCl 10 mM, se añadieron 10 ml de NaCl 2,5 M. Se añadieron cincuenta mililitros de etanol al eluato (10 ml) y se almacenó a -20 0C durante 24 h. Después la centrifugación a 5000 x g durante 15 min, el sedimento se secó a 60 0C durante 12 h. Después de la reconstitución con 80 gl de acetato de amonio 50 mM, pH 8,0, el material se trató con 20 gl de condroitinasa ABC a 37 0C durante 12 h. Para separar y cuantificar los GAG, después de hervir durante 5 minutos, las muestras se inyectaron en un instrumento de electroforesis capilar equipado con un detector de fluorescencia inducido por láser (CE-LIF).

[1025] Se midieron diecinueve propiedades independientes del GAG en cada muestra (sangre): Concentración de CS (en pg/ml), concentración de HS (en pg/ml), concentración de HA (en pg/ml) y fracciones másicas de la composición de disacáridos tanto para CS como para HS. Además, se calcularon cinco propiedades dependientes del GAG a partir de estas mediciones: la carga CS y HS; y la siguiente relación CS de fracciones de masa: 4s/6s, 6s/0s, y 4s/0s. Las 24 propiedades del GAG pueden denominarse colectivamente perfil de GAG.

[1027] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1029] La significación estadística de los cambios en cada propiedad del GAG entre los dos grupos (melanoma vs. pacientes sanos) se evaluó calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana bajo los siguientes supuestos: Los valores de las propiedades del GAG se muestrean a partir de una distribución t de normalidad desconocida y por estimar (es decir, grados de libertad); alta incertidumbre sobre las distribuciones anteriores; la distribución marginal se aproxima bien mediante un muestreo de Montecarlo en cadena de Markov sin adelgazamiento y con una longitud de cadena igual a 100 000. La estimación se realizó utilizando el paquete RBEST(las suposiciones anteriores se reflejan en los parámetros predeterminados). Se prefirió la estimación bayesiana a la prueba t, ampliamente utilizada, ya que proporciona una estimación sólida y confiable de la diferencia de medias incluso bajo la incertidumbre de la distribución de la puntuación subyacente para los dos grupos (este es el caso cuando el número de muestras es limitado).

[1031] Para verificar si los cambios en el perfil de GAG en los pacientes con melanoma podían condensarse en puntuaciones de GAG, que pudieran utilizarse para diferenciar a los pacientes con melanoma de los sujetos sanos y, por lo tanto, serían adecuadas como diagnóstico del cáncer, utilizamos la regresión logística penalizada por Lasso (Tibshirani, 1996) con una validación cruzada sin dejar de lado para seleccionar las propiedades sólidas del GAG que mejor predicen el resultado clínico (es decir, el melanoma en comparación con un sujeto sano). La puntuación se diseñó posteriormente como una relación, donde el numerador es la suma de las propiedades asociadas con el melanoma y el denominador es la suma de las propiedades asociadas con el estado sano. Cada término se normalizó utilizando los coeficientes de regresión.

[1033] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma pobre en plaquetas, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1035] Métricas de precisión

[1037] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG en la clasificación binaria de una muestra como melanoma o sana con diferentes puntuaciones de umbral mediante la derivación de las curvas de características operativas del receptor (ROC). Medimos la precisión de la puntuación de GAG como el área bajo la curva (AUC) de su curva ROC (el AUC es 1 para un clasificador perfecto y 0,5 para un clasificador aleatorio). Seleccionamos como valor límite potencial para la puntuación de GAG la puntuación para la que la precisión fue máxima, es decir, una muestra cuya puntuación de g Ag esté por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de ser melanoma y por debajo de este valor límite tiene la máxima probabilidad de estar sana. Las curvas ROC se calcularon con el paquete R pROC, mientras que el punto límite óptimo se calculó con el paquete R OptimalCutpoints.

[1039] Resultados

[1041] Analizamos un total de 16 muestras de sangre de pacientes con M, de las cuales 12 tenían melanoma uveal y 4 tenían melanoma (M) de piel (cutáneo). Además, analizamos 14 muestras de sangre de voluntarios sanos (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla L. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 30 muestras, que comprende el nivel y la composición química de disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla M). Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil GAG en el grupo M frente al H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos M y H (tabla M).

[1042] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las puntuaciones de GAG de las asignaturas M vs. H. Obtuvimos una puntuación GAG de M (fórmula de puntuación de melanoma n.° 1), basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1043]

[1046] [05HS]7

[1047] ([25HS]+ [05HS])

[1048] [05HS] [Ns HS]1000

[1050] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, y[T o tCS] es la concentración total de CS (en pg/ml) y [TotHA]es la concentración total de HA (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras M tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 17). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,973. Identificamos un límite óptimo igual a 0,92 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos M podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 93,3 %, una sensibilidad del 87,3 % y una especificidad del 100 %.

[1052] También investigamos si las variaciones de la puntuación de GAG anterior también serían eficaces para distinguir los sujetos M de los H. Con este fin, obtuvimos una puntuación GAG de M alternativa (fórmula de puntuación del melanoma n.° 2) basada únicamente en las mediciones de CS:

[1054] Puntuación GAG de M 2=4[6s CS] 5 [Tot CS]

[1055] 100 ■f 5 [6s CS]

[1056] [4s CS] [6s CS]

[1058] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, y [Tot CS] es la concentración total de CS (en pg/ml). Usando este sistema de puntuación alternativo, las muestras M tuvieron puntuaciones recurrentemente más altas que las muestras H (Figura 18). Se encontró que el AUC era de 0,933. Identificamos un límite óptimo igual a 1,19 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos M podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 93,3 %, una sensibilidad del 81,2 % y una especificidad del 100 %.

[1060] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el melanoma y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección del melanoma (p. ej., en el diagnóstico).

[1062] Estos resultados demuestran además que se pueden diseñar diferentes puntuaciones de GAG para discriminar entre el melanoma y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1064] Referencias

[1066] Coppa GV, Gabrielli O, Buzzega D, Zampini L, Galeazzi T, Maccari F, Bertino E, Volpi N (2011). Composition and structure elucidation of human milk glycosaminoglycans. Glycobiology 21,295-303.

[1068] Gatto, F., Volpi, N., Nilsson, H., Nookaew, I., Maruzzo, M., Roma, A., Johansson, M.E., Stierner, U., Lundstam, S., Basso, U., y col. (2016). Glycosaminoglycan Profiling in Patients' Plasma and Urine Predicts the Occurrence of Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell Rep 15, 1822-1836.

[1070] Tibshirani, R. (1996). Regression shrinkage and selection via the Lasso. Journal of the Royal Statistical Society Series B-Methodological 58, 267-288.

[1072] Volpi N y Maccari F. (20051). Glycosaminoglycans composition of the largefreshwater mollusc bivalve Anodonta anodonta. Biomacromolecules 6, 3174-3180.

[1074] Volpi N y Maccari F (20052). Microdetermination of chondroitin sulfate in normal human plasma by fluorophore-assisted carbohydrate electrophore-sis (FACE). Clin Chim Acta 356, 125-133.

[1076] Volpi, N., Galeotti, F., Yang, B., y Linhardt, R.J. (2014). Analysis of glycosaminoglycan-derived, precolumn, 2-aminoacridone-labeled disaccharides with LC-fluorescence and<l>C-MS detection. Nature protocols 9, 541-558.

[1077] Volpi, N., y Linhardt, R.J. (2010). High-performance liquid chromatography-mass spectrometry for mapping and sequencing glycosaminoglycan-derived oligosaccharides. Nature protocols 5, 993-1004.

[1079] Tabla L: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1080]

[1083] Tabla M: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre las muestras M y sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla M muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos M vs. los H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla M también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS.

[1084] 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1086]

[1087] Ejemplo 4

[1088] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer colorrectal (CRC). Material y métodos

[1089] Recolección de muestras de plasma

[1090] Se obtuvieron muestras de sangre de 10 pacientes con cánceres colorrectales. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1091] La sangre entera se recolectó en tubos de EDTA y se centrifugó para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 °C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco. Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1092] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1093] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1094] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1095] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1096] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer colorrectal frente a los grupos sanos (en lugar de melanoma frente a los sanos).

[1097] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1098] Métricas de precisión

[1099] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG CRC como en el ejemplo 3, pero clasificamos una muestra como de cáncer colorrectal o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1100] Resultados

[1101] Analizamos un total de 10 muestras de sangre de pacientes con CRC. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 10 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla O). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla N. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo CRC con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con CRC y H (tabla O).

[1102] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del CRC vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG del CRC, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1105]

[1107] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, y[Tot HS]es la concentración total de HS (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de CRC tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 19). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,998. Identificamos un límite óptimo igual a 0,74 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con CRC podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 98,5 %, una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 98,2 %.

[1109] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer colorrectal y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer colorrectal (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer colorrectal y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1111] Tabla N: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1113]

[1116] Tabla O: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el CRC y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla O muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos con CRC vs. la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla O también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1118]

[1119]

[1121] Ejemplo 5

[1122] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban tumores neuroendocrinos gastrointestinales (GNET).

[1123] Material y métodos

[1124] Recolección de muestras de plasma

[1125] Se obtuvieron muestras de sangre de 10 pacientes con un tumor neuroendocrino gastrointestinal. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras. La sangre entera se recolectó en tubos de EDTA y se centrifugó para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco. Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1126] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1127] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1128] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1129] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1130] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería a grupos de tumores neuroendocrinos gastrointestinales frente a grupos sanos (en lugar de melanomas frente a grupos sanos).

[1131] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1133] Métricas de precisión

[1135] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG del GNET como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como GNET o sano (en lugar de melanoma o sana).

[1137] Resultados

[1139] Analizamos un total de 10 muestras de sangre de pacientes con GNET. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 10 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla Q). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla P. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo GNET con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades del GAG entre los sujetos GNET y H (tabla Q).

[1141] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del GNET vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG del GNET, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1143] 3 3

[1144] Puntuación GAG de GNET= - [2s6s CS] - — [T r is CS]2 Carga

[1146] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, y lacarga CSes la carga ponderada de CS. Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de GNET tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 20). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,90 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con GNET podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100%de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1148] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre los tumores neuroendocrinos gastrointestinales y los de los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección de tumores neuroendocrinos gastrointestinales (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre tumores neuroendocrinos gastrointestinales y sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1150] Tabla P: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1152]

[1155] Tabla Q: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el GNET y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla Q muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos GNET vs. los H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla Q también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1157]

[1159] Ejemplo 6

[1160] En este estudio medimos los niveles de GAG circulantes en sujetos que presentaban un cáncer de sangre, más específicamente con leucemia linfoide crónica (CLL).

[1161] Material y métodos

[1162] Recolección de muestras de plasma

[1163] Se obtuvieron muestras de sangre de 10 pacientes con leucemia linfoide crónica. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1164] La sangre entera se recolectó en tubos de EDTA y se centrifugó para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1165] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1166] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1167] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1168] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1169] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1170] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería a grupos de CLL frente a grupos sanos (en lugar de melanoma frente a grupos sanos).

[1171] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1172] Métricas de precisión

[1173] Evaluamos el rendimiento de las puntuaciones de GAG de CLL como en el ejemplo 3, pero clasificamos una muestra como de CLL o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1174] Resultados

[1175] Analizamos un total de 10 muestras de sangre de pacientes con CLL. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 10 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla S). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla R. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo CLL con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con CLL y H (tabla S).

[1176] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas de la CLL vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG de CLL (puntuación de GAG de CLL n.° 1), basándonos en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1178]

[1180] 1 r n 2

[1181] - 25 0 [° S Í ÍS ]+ Í 5 7b' ®

[1182] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, yTot HS es la concentración total de HS(en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de CLL tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 21). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,974. Identificamos un límite óptimo igual a 0,25 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con CLL podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 95,6 %, una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 94,8 %.

[1183] También investigamos si las variaciones de la puntuación de GAG anterior también serían eficaces para distinguir la CLL de los sujetos H. Con este fin, obtuvimos una puntuación de GAG de CLL alternativa (puntuación de GAG de CLL n.° 2) utilizando solo propiedades de CS:

[1186]

[1187] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente. Usando este sistema de puntuación alternativo, las muestras de CLL tuvieron puntuaciones recurrentemente más altas que las muestras H (Figura 22). Se encontró que el AUC era de 0,974. Identificamos un límite óptimo igual a 0,23 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con CLL podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 95,6 %, una sensibilidad del 70 % y una especificidad del 100 %.

[1189] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre la CLL y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades de los GAG pueden ser útiles en la detección de la CLL (p. ej., en el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre la leucemia linfoide crónica y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1191] Tabla R: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1193]

[1196] Tabla S: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el CLL y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla S muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos con CLL vs. la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla S también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1198]

[1199]

[1201] Ejemplo 7

[1202] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer de vejiga (BCa).

[1203] Material y métodos

[1204] Recolección de muestras de orina

[1205] Se obtuvieron muestras de orina de 6 pacientes con cáncer de vejiga. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1206] La orina se recolectó en tubos de polipropileno y se congeló a -80 0C hasta que se envió para el análisis en hielo seco. Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1207] La preparación de la muestra y la medición de las propiedades de los GAG (determinación del perfil de GAG) se realizaron comoperel Ejemplo 3, pero en muestras de orina en lugar de muestras de sangre.

[1208] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1209] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de orina de 25 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a dos cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1210] El diseño de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer de vejiga frente a los grupos sanos (en lugar de al melanoma frente a los sanos).

[1211] Métricas de precisión

[1212] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG del BCa (cáncer de vejiga) como en el ejemplo 3, pero clasificamos una muestra como cancerosa de vejiga o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1213] Resultados

[1214] Analizamos un total de 6 muestras de orina de pacientes con BCa. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 6 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla T). Además, incluimos como controles un grupo de 25 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de orina de personas sanas (H). Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil GAG en el grupo BCa con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con BCa y H (tabla T).

[1215] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas de BCa vs. las de H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG de BCa, basándonos en la siguiente fórmula utilizando mediciones de orina:

[1216] 3 1 1 1 3

[1217] Puntuación GAG de BCa = -4 Carga CS - 3 [Tris HS]- —

50[NsHS]<+>—

25—0[2sHS] -4 Tot HS

[1218] donde los términos entre paréntesis representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacargaCS es la carga ponderada de CS yTot HSes la concentración total de HS (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de BCa tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 23). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 1,0. Identificamos un límite óptimo igual a 0,92 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con BCa podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1220] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG y/o la composición química entre el cáncer de vejiga y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer de vejiga (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer de vejiga y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1222] Tabla T: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre las muestras de BCa y sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla T muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos BCa vs. los H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla T también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1224]

[1225]

[1227] Ejemplo 8

[1228] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer de mama (BC).

[1229] Material y métodos

[1230] Recolección de muestras de plasma

[1231] Se obtuvieron muestras de sangre de 10 pacientes con cáncer de mama. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1232] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1233] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1234] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1235] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1236] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1237] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1238] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer de mama frente a los grupos sanos (en lugar de al melanoma frente a los sanos).

[1239] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1240] Métricas de precisión

[1241] Evaluamos el rendimiento de la puntuación BC GAG como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como de cáncer de mama o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1242] Resultados

[1243] Analizamos un total de 10 muestras de sangre de pacientes con BC. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 10 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla V). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla U. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo BC con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos BC y H (tabla V). Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del BC vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG del BC, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1244]

[1247] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS y elTotCS es la concentración total de Cs (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras BC tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 24). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,94 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con BC podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1249] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer de mama y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer de mama (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer de mama y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1251] Tabla U: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1253]

[1256] Tabla V: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el BC y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla V muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos BC vs. H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla V también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1258]

[1259]

[1261] Ejemplo 9

[1262] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer de ovario (OV).

[1263] Material y métodos

[1264] Recolección de muestras de plasma

[1265] Se obtuvieron muestras de sangre de 9 pacientes con cáncer de ovario. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1266] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1267] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1268] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1269] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1270] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1271] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1272] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer de ovario frente a los grupos sanos (en lugar de al melanoma frente a los sanos).

[1273] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1274] Métricas de precisión

[1275] Evaluamos el rendimiento de la puntuación OV GAG como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como de cáncer de ovario o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1276] Resultados

[1277] Analizamos un total de 9 muestras de sangre de pacientes con OV. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 9 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla X). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla W. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo OV con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos OV y H (tabla X).

[1278] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del OV vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG del OV, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1280] 1 x 1

[1281] Puntuación GAG de OV = 2 Carga CS—{Tot CS - TotHS) —Tot HA

[1283] dondecargaCS es la carga ponderada de CS,TotCS es la concentración total de CS (en pg/ml),Tot HSes la concentración total de HS (en pg/ml),Tot HAes la concentración total de HA (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras OV tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 25). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,99 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con OV podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1284] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer de ovario y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades de los GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer de ovario (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer de ovario y las de sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1286] Tabla W: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1288]

[1291] Tabla X: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el OV y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla X muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos OV vs. los H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla X también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1293]

[1294]

[1296] Ejemplo 10

[1297] En este estudio medimos los niveles de GAG circulantes en sujetos que presentaban un cáncer de útero, más específicamente cáncer de endometrio (EC).

[1298] Material y métodos

[1299] Recolección de muestras de plasma

[1300] Se obtuvieron muestras de sangre de 9 pacientes con cáncer de endometrio. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1301] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1302] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1303] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1304] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1305] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1306] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1307] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer de endometrio frente a los grupos sanos (en lugar de al melanoma frente a los sanos).

[1308] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los

[1309] GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1311] Métricas de precisión

[1313] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG EC como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como de cáncer de endometrio o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1315] Resultados

[1317] Analizamos un total de 9 muestras de sangre de pacientes con EC. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 9 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla Z). Además, incluimos como controles un grupo de

[1318] 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla Y. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo EC con el grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana.

[1319] Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos EC y H (tabla Z).

[1321] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas de la EC vs. las de la H en puntajes de GAG.

[1322] Obtuvimos una puntuación de GAG de EC, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1324] H

[1326] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS,TotCs es la concentración total de CS (en pg/ml) yTot

[1327] HSes la concentración total de HS (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras EC tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H

[1328] (Figura 26). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,97 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con EC podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1330] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer de endometrio y en los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades de los GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer de endometrio (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer de endometrio y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1332] Tabla Y: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°,

[1333] 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1335]

[1338] Tabla Z: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de

[1339] CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el EC y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla Z muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medido en la sangre de los sujetos EC vs. los H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla Z también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1341]

[1343] Ejemplo 11

[1344] En este estudio medimos los niveles de GAG circulantes en sujetos que presentaban un cáncer de útero, más específicamente cáncer de cuello uterino (CST).

[1345] Material y métodos

[1346] Recolección de muestras de plasma

[1347] Se obtuvieron muestras de sangre de 9 pacientes con cáncer de cuello uterino. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1348] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1349] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1350] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1351] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1352] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1353] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1354] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer de cuello uterino frente a los grupos sanos (en lugar de al melanoma frente a los sanos).

[1355] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1356] Métricas de precisión

[1357] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG del CST como en el ejemplo 3, pero clasificamos una muestra como de cáncer de cuello uterino o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1358] Resultados

[1359] Analizamos un total de 9 muestras de sangre de pacientes con CST. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 9 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla AB). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla AA. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo del CST con el del grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con CST y H (tabla AB).

[1360] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del CST vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG del CST, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1363]

[1365] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS,TotCs es la concentración total de CS (en pg/ml) yTot HSes la concentración total de HS (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de CST tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 27). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,71 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con CST podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1366] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer de cuello uterino y los de sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer de cuello uterino (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer de cuello uterino y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1367] Tabla AA: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1369]

[1370]

[1373] Tabla AB: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el CST y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla AB muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos con CST vs. H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla AB también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1375]

[1378] Ejemplo 12

[1380] En este estudio medimos los niveles de GAG circulantes en sujetos que presentaban un cáncer de sangre, más específicamente un linfoma no hodgkiniano (NHL).

[1381] Material y métodos

[1382] Recolección de muestras de plasma

[1383] Se obtuvieron muestras de sangre de 10 pacientes con linfoma no hodgkiniano, específicamente linfoma difuso de células B grandes. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1384] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 °C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1385] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1386] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1387] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1388] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1389] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1390] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería a grupos de NHL frente a grupos sanos (en lugar de melanoma frente a grupos sanos).

[1391] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1392] Métricas de precisión

[1393] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG del NHL como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como GNET o sano (en lugar de melanoma o sana).

[1394] Resultados

[1395] Analizamos un total de 10 muestras de sangre de pacientes con NHL. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 10 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla AD). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla AC. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo de NHL con el del grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con NHL y H (tabla AD).

[1396] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas de NHL vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG de NHL, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1399]

[1401] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS, lacarga HSes la carga ponderada de HS yTot HSes la concentración total de HS (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de NHL tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 28). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,97 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con NHL podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1403] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre la NHL y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades de los GAG pueden ser útiles en la detección de la NHL (p. ej., en el diagnóstico). Estos resultados demuestran que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el linfoma no hodgkiniano y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1405] Tabla AC: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1407]

[1410] Tabla AD: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el NHL y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla AD muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos con NHL vs. H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla AD también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1412]

[1413]

[1415] Ejemplo 13

[1416] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer de cerebro, más específicamente un glioma difuso (DG).

[1417] Material y métodos

[1418] Recolección de muestras de plasma

[1419] Se obtuvieron muestras de sangre de 11 pacientes con glioma difuso, específicamente 7 pacientes con astrocitoma, 3 con glioblastoma multiforme y 1 con oligoastrocitoma. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1420] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1421] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1422] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1423] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1424] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1425] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1426] El diseño de la puntuación de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería a grupos de glioma difuso frente a grupos sanos (en lugar de melanoma frente a grupos sanos).

[1427] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1428] Métricas de precisión

[1429] Evaluamos el rendimiento de la puntuación de GAG del DG como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como GNET o sano (en lugar de melanoma o sana).

[1430] Resultados

[1431] Analizamos un total de 11 muestras de sangre de pacientes con DG. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 11 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla AF). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla AE. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo del DG con el del grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con DG y H (tabla AF).

[1433] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del DG vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG de DG, basada en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1436]

[1439] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS, el CS total es la concentraciónTotalde CS (en pg/ml) y el HA total es la concentraciónHA total(en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras DG tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 29). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era 1 (clasificador perfecto). Identificamos un límite óptimo igual a 0,95 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con DG podrían distinguirse de los individuos sanos con un 100 % de precisión, un 100 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad.

[1441] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el DG y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades de los GAG pueden ser útiles en la detección del DG (p. ej., en el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG (o perfiles de GAG) pueden diseñarse para discriminar entre el glioma difuso y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1443] Tabla AE: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1445]

[1448] Tabla AF: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el DG y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla AF muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos con DG vs. H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla AF también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1450]

[1451]

[1453] Ejemplo 14

[1454] En este estudio medimos los niveles circulantes de GAG en sujetos que presentaban cáncer de pulmón (LC).

[1455] Material y métodos

[1456] Recolección de muestras de plasma

[1457] Se obtuvieron muestras de sangre de 10 pacientes con cáncer de pulmón, específicamente cáncer de pulmón de células no pequeñas. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras.

[1458] Los tubos de sangre entera se recolectaron en tubos de EDTA y se centrifugaron para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco.

[1459] Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1460] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1461] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1462] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1463] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1464] El diseño de los biomarcadores fue como se describe en el ejemplo 3, pero se refería al cáncer de pulmón frente a los grupos sanos (en lugar de al melanoma frente a los sanos).

[1465] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1466] Métricas de precisión

[1467] Evaluamos el rendimiento de la puntuación GAG de LC como en el ejemplo 3, pero clasificando una muestra como de cáncer de pulmón o sana (en lugar de melanoma o sana).

[1468] Resultados

[1469] Analizamos un total de 10 muestras de sangre de pacientes con LC. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 10 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla AH). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla AG. Comparamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en el grupo del LC con el del grupo H. Evaluamos la significación estadística de los cambios para cada propiedad del GAG entre los dos grupos calculando el intervalo de densidad (HDI) más alto para la diferencia de medias mediante una estimación bayesiana. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con LC y H (tabla AH).

[1470] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en las asignaturas del LC vs. las de la H en puntajes de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG de LC (puntuación de GAG de LC n.°1), basándonos en la siguiente fórmula mediante mediciones de sangre:

[1471] [45 CS] 1 r 1

[1473] l6 7 csj 25 [0SÍÍS]

[1474] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, y el CS total es la concentraciónTotalde CS (en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras LC tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 30). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,986. Identificamos un límite óptimo igual a 0,83 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con LC podrían distinguirse de los individuos sanos con un 97 % de precisión, un 90 % de sensibilidad y un 98 % de especificidad.

[1475] También investigamos si las variaciones de la puntuación de GAG anterior también serían eficaces para distinguir los sujetos LC de los H. Con este fin, obtuvimos una puntuación de GAG de LC alternativa (puntuación de GAG de LC n.° 2) utilizando solo propiedades de CS:

[1478]

[1480] donde elCS totales la concentración total de CS (en pg/ml) y lacarga CSes la carga ponderada de CS. Usando este sistema de puntuación alternativo, las muestras LC tuvieron puntuaciones recurrentemente más altas que las muestras H (Figura 31). Se encontró que el AUC era de 0,997. Identificamos un límite óptimo igual a 0,88 para esta puntuación. Con este límite, los pacientes con LC podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 98,5 %, una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 100 %.

[1481] Estos resultados indican que existen diferencias mensurables en los niveles de GAG circulantes y/o en la composición química entre el cáncer de pulmón y los sujetos sanos y, por lo tanto, que las propiedades del GAG pueden ser útiles en la detección del cáncer de pulmón (p. ej., el diagnóstico). Estos resultados demuestran además que las puntuaciones de GAG pueden diseñarse para discriminar entre el cáncer de pulmón y los sujetos sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1482] Tabla AG: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes.

[1484]

[1485]

[1487] Tabla AH: Se calculó una métrica de confianza estadística de que cualquier propiedad individual del GAG (niveles de CS, HS o HA, composiciones de disacáridos individuales y carga HS o carga CS) muestra una alteración significativa y prácticamente apreciable entre el LC y las muestras sanas. Una alteración se definió como significativa y prácticamente apreciable si la diferencia de medias entre el caso y el control se encuentra dentro de la denominada región de equivalencia práctica en menos del 5 % de todas las distribuciones estadísticas posibles que pueden ajustar los datos relativos a una medición. La tabla AH muestra un resumen de los resultados y muestra el valor medio de las propiedades del GAG medidas en la sangre de los sujetos con LC vs. H y la estimación bayesiana de la significación estadística de la diferencia media (% en ROPE, región de equivalencia práctica, donde un % en ROPE > 5 indica que las distribuciones aleatorias de los valores de los dos grupos tienen una media prácticamente equivalente en más del 5 % de los casos y, por lo tanto, no es significativa). La tabla AH también muestra los resultados en los que se han calculado ciertas proporciones de tipos individuales de composición de disacáridos. 4s/6s CS es la relación entre 4s CS y 6s CS. 6s/0s CS es la relación entre 6s CS y 0s CS (CS no sulfatado). 4s/0s CS es la relación entre 4s CS y 0s CS (CS no sulfatado).

[1489]

[1491] Ejemplo 15

[1492] En este estudio medimos los niveles de GAG circulantes en sujetos que presentaban diferentes tipos de cáncer y los comparamos con los niveles de GAG en sujetos sanos.

[1493] Material y métodos

[1494] Recolección de muestras de plasma

[1495] Se obtuvieron muestras de sangre de 105 pacientes con diferentes tipos de cáncer. Todos los pacientes presentaban signos de enfermedad y no habían recibido tratamiento previo en el momento de la toma de muestras. Se examinaron los siguientes tipos de cáncer: cáncer de mama (BC), cáncer colorrectal (CRC), cáncer de cuello uterino (CST), glioma difuso (DG), cáncer de endometrio (EC), tumores neuroendocrinos gastrointestinales (GNET), leucemia linfoide (LL), linfoma no hodgkiniano (NHL), cáncer de pulmón (LC), cáncer de ovario (OV), cáncer de próstata (PCa).

[1496] La sangre entera se recolectó en tubos de EDTA y se centrifugó para separar el plasma. El plasma se dividió en alícuotas en viales de 220 ul y los viales se congelaron a -80 0C hasta que se enviaron para el análisis en hielo seco. Los GAG plasmáticos corresponden a los GAG sanguíneos. Para los fines de este ejemplo, el plasma también se denomina indistintamente sangre.

[1497] Determinación del perfil de glicosaminoglicanos

[1498] La preparación de muestras y la medición de propiedades del GAG (determinación del perfil de GAG) se realizóperel ejemplo 3.

[1499] Diseño de puntuación de biomarcadores

[1500] Se formó un grupo de control utilizando perfiles históricos de GAG obtenidos de muestras de sangre de 58 individuos sanos. Estas muestras pertenecían a cuatro cohortes históricas distintas. El perfil de GAG se midió como se describe en la sección anterior.

[1501] La diferencia para cada propiedad del GAG entre cada tipo de cáncer y el grupo de control se ha descrito en términos de media y desviación estándar. La significación estadística en el cambio de cada propiedad del GAG entre grupos se informó en los ejemplos anteriores.

[1502] Para verificar si los cambios en el perfil de GAG en los pacientes con cáncer podían condensarse en puntuaciones de GAG, que pudieran utilizarse para diferenciar a los pacientes con cáncer de los sujetos sanos y, por lo tanto, serían adecuadas como diagnóstico del cáncer, utilizamos la regresión logística penalizada por Lasso (Tibshirani, 1996,supra)con una validación cruzada sin dejar de lado para seleccionar propiedades sólidas del GAG que fueran más predictivas del resultado clínico (es decir, el cáncer en comparación con las de un sujeto sano). La puntuación se diseñó posteriormente como una relación, donde el numerador es la suma de las propiedades asociadas con el cáncer y el denominador es la suma de las propiedades asociadas con el estado sano. Cada término se normalizó utilizando los coeficientes de regresión.

[1503] Para los fines de este estudio y por las razones expuestas en otra parte, las puntuaciones calculadas a partir de los GAG en sangre, independientemente de si la muestra procesada era plasma, se denominan puntuaciones de GAG en sangre.

[1504] Métricas de precisión

[1505] Evaluamos el desempeño de la puntuación de GAG en la clasificación binaria de una muestra como cancerosa o sana con diferentes puntuaciones de umbral mediante la derivación de las curvas de características operativas del receptor (ROC). Medimos la precisión de la puntuación de GAG como el área bajo la curva (AUC) de su curva ROC (el AUC es 1 para un clasificador perfecto y 0,5 para un clasificador aleatorio). Seleccionamos como valor límite potencial para la puntuación de GAG la puntuación cuya precisión fue máxima, es decir, una muestra cuya puntuación de GAG esté por encima de este valor límite tiene la máxima probabilidad de ser cancerosa y por debajo de este valor límite tiene la máxima probabilidad de estar sana. Las curvas ROC se calcularon con el paquete R pROC, mientras que el punto límite óptimo se calculó con el paquete R OptimalCutpoints.

[1506] Resultados

[1507] Analizamos un total de 105 muestras de sangre de pacientes con cáncer. Cuantificamos el perfil de los GAG en las 105 muestras, que comprende el nivel y la composición química de los disacáridos de (i) sulfato de condroitina (CS), (ii) sulfato de heparán (HS) y (iii) ácido hialurónico (HA), como se ha descrito anteriormente (Gatto y col., 2016 y anteriores). En total, se midieron 24 propiedades diferentes (incluidas 19 propiedades independientes) como parte del perfil de GAG de las muestras de sangre (enumeradas en la tabla AJ). Además, incluimos como controles un grupo de 58 perfiles históricos de GAG medidos en muestras de sangre de personas sanas (H). Los datos clínicos de esta cohorte se presentan en la tabla AI. En la tabla AJ presentamos el valor de cada propiedad en el perfil de GAG en cada grupo de tipo de cáncer en comparación con el grupo H. Los resultados mostraron marcadas diferencias en varias propiedades de los GAG entre los sujetos con cáncer y H, como se muestra en la figura 32-35. La significación estadística de cada diferencia con el grupo sano se evaluó por separado para cada tipo de cáncer en los ejemplos anteriores.

[1509] Condensamos los cambios en el perfil de GAG en sujetos con cáncer en comparación con sujetos con H en puntuaciones de GAG. Obtuvimos una puntuación de GAG del cáncer alternativa (puntuación de G<a>G del cáncer n.° 2 /puntuación de sangre del cáncer n.° 2) a la puntuación sanguínea diseñada en el ejemplo 2, basándonos en la siguiente fórmula utilizando mediciones de sangre:

[1511] 10 t / [6s CS] Puntuación GAG de cáncer = - Carga CS CS total ( [4s cs] [6s CS

[1513] donde los términos entre corchetes representan la fracción (fracción de masa) del disacárido para el GAG correspondiente, lacarga CSes la carga ponderada de CS y el CS total es la concentraciónCS total(en pg/ml). Posteriormente calculamos la puntuación en cada muestra y observamos que las muestras de cáncer tienen puntuaciones elevadas de forma recurrente con respecto a las muestras H (Figura 36). El rendimiento de la puntuación de GAG se evaluó mediante las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se encontró que el área bajo la curva (AUC) era de 0,986. Identificamos un límite óptimo igual a 1,39 para esta puntuación. Con este límite, los sujetos con cáncer podrían distinguirse de los individuos sanos con una precisión del 95,1 %, una sensibilidad del 97,1 % y una especificidad del 91,4 %.

[1515] Estos resultados demuestran que las puntuaciones de GAG (o perfiles de GAG) pueden diseñarse para discriminar entre sujetos con cáncer y sanos, y que su AUC significativo permite ajustar con precisión las puntuaciones límite óptimas, para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad, según el uso diagnóstico previsto.

[1517] Tabla AI: Datos clínicos de la cohorte analizada en este estudio. Los resultados se presentan como medianas (25.°, 75.° percentil) o porcentajes o recuentos. Se omitieron los valores faltantes. *La enfermedad de estadio/grado bajo se define como estadio TNM I a III para CRC y LC, estadio FIGO I para CST, estadio FIGO I a II para EC y OV, glioma distinto del grado IV para DG, grado G1 de ENETS para GNET, estadio A o B de Binet para LL, estadio I a II de Ann Arbor para NHL y grado de Gleason < 7 para PCa (N.A. si no está disponible).

[1519]

[1522] Tabla AJ: Valor medio (+/- desviación estándar) para cada propiedad del GAG en el grupo sano y en cada grupo de tipo de cáncer. Las propiedades del GAG que se refieren a la composición se expresan como fracciones de masa (peso/% en peso).

[1523] C CR C CS T DG EC GN ET LL NH L LC OV PCa,37 0,29 0,43 0,46 0,46 0,35 0,32 0,40 0,36 0,47 0,28 0,07 -0,14 -0,12 -0,10 -0,13 -0,09 -0,11 -0,10 -0,16 -0,15 -0,04 7,0,2 9,50 13,38 10,86 14,00 6,19 7,73 9,01 17,26 20,32 7,67 6,38 -6,65 -2,42 -2,70 -6,71 -2,67 -2,50 -3,29 -6,07 -11,30 -3,00 ,13 0,14 0,27 0,34 0,34 0,15 0,14 0,37 0,16 0,29 0,16 0,04 -0,07 -0,15 -0,20 -0,26 -0,07 -0,05 -0,45 -0,06 -0,10 -0,08 ,64 0,67 0,48 0,74 0,45 0,75 0,73 0,66 0,84 0,42 0,73 0,27 -0,22 -0,27 -0,29 -0,25 -0,16 -0,14 -0,12 -0,08 -0,17 -0,20 ,97 1,57 1,04 1,60 0,87 1,58 1,41 1,24 2,85 0,77 1,37 1,71 -1,11 -0,75 -1,03 -0,53 -0,89 -0,60 -0,54 -2,13 -0,49 -0,53 3,05 72,30+ 57,05+ 56,17+ 55,06+ 66,26+ 68,90+ 60,40 64,39+ 53,19+ 72,56+ 6,55 -13,3,3 -12,0,7 -8,66 -13,0,9 -9,15 -10,1,3 -9,85 -15,5,6 -15,2,4 -3,39 ,07 0,08 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 0,04 0,07 -0,05 -0,03 -0,02 -0,02 -0,02 -0,02 -0,02 -0,03 -0,02 -0,02 ,39 4,96 5,53 5,58 6,18 3,64 4,27 5,43 3,88 7,03 2,76 0,81 -7,07 -2,63 -1,89 -3,29 -1,77 -2,96 -2,89 -4,38 -4,57 -1,37 3,13+ 21,75+ 37,01 36,74+ 38,18+ 29,11 25,83 33,43 ( 31,32+ 39,28+ 23,93 6,25 -6,10 -9,75 -6,87 -10,0, 8 --8,52 -7,59 7,04) -11,49 -11,00 -2,03 ,07 0,69 0,11 0,29 0,15 0,57 0,67 0,22 0,11 0,14 0,45 0,09 -1,11 -0,08 -0,34 -0,11 -0,31 -0,66 -0,20 -0,11 -0,11 -0,25 ,10 0,08 0,09 0,60 0,08 0,09 0,07 0,14 0,07 0,14 0,05 0,15 -0,05 -0,07 -1,55 -0,06 -0,05 -0,02 -0,10 -0,05 -0,14 -0,02 ,14 0,10 0,12 0,33 0,17 0,23 0,21 0,24 0,13 0,15 0,19 0,10 -0,04 -0,05 -0,45 -0,11 -0,16 -0,15 -0,21 -0,10 -0,08 -0,10 ,05 0,03 0,05 0,24 0,13 0,06 0,01 0,09 0,06 0,04 0,03 0,08 -0,03 -0,04 -0,28 -0,21 -0,09 -0,01 -0,08 -0,09 -0,04 -0,02 0,1,5 9,34 7,38 7,13 6,95 9,70 8,11 6,82 10,8,7 6,86 10,3,3 2,72 -5,56 -2,05 -2,43 -1,98 -5,42 -3,71 -1,78 -3,82 -2,35 -4,47 ,05 0,10 0,12 0,10 0,14 0,06 0,07 0,10 0,10 0,17 0,04 0,02 -0,19 -0,10 -0,04 -0,13 -0,03 -0,05 -0,09 -0,20 -0,16 -0,02 ,54 0,34 0,74 0,69 0,80 0,46 0,40 0,59 0,62 0,88 0,33 0,14 -0,21 -0,51 -0,28 -0,54 -0,20 -0,18 -0,27 -0,65 -0,55 -0,04 ,37 0,29 0,43 0,46 0,46 0,35 0,32 0,40 0,36 0,47 0,28 0,07 -0,14 -0,12 -0,10 -0,13 -0,09 -0,11 -0,10 -0,16 -0,15 -0,04 ,47 0,26 0,54 0,43 0,54 0,43 0,32 0,79 0,31 0,87 0,38 0,41 -0,28 -0,37 -0,24 -0,49 -0,36 -0,21 -0,51 -0,27 -0,81 -0,22 ,72 0,40 0,85 3,61 0,66 0,47 0,47 0,90 0,47 2,10 0,92 0,64 -0,32 -0,51 -8,35 -0,32 -0,36 -0,34 -0,57 -0,45 -2,79 -0,71 ,72 0,55 2,04 1,95 0,82 0,59 0,61 1,69 0,46 2,23 0,69 0,77 -0,59 -1,32 -3,63 -0,41 -0,36 -0,39 -1,18 -0,32 -2,74 -0,38 8,2,5 16,87 17,86 31,50 19,54 27,84 31,15 31,57 26,48 12,56 22,97 15,96 -10,61 -16,66 -16,47 -16,00 -12,35 -11,45 -8,71 -22,16 -12,77 -15,65 ,79 0,25 0,42 0,76 0,89 0,25 0,21 1,54 0,39 1,70 0,99 0,79 -0,20 -0,33 -1,34 -0,89 -0,14 -0,15 -3,68 -0,25 -2,37 -2,12 5,64 30,86 18,24 22,27 14,98 33,31 29,41 19,22 49,81 9,48 30,67 16,22 -21,82 -16,19 -18,51 -13,66 -16,49 -20,90 -12,72 -30,15 -8,57 -24,46 ,29 16,56 3,72 6,47 3,65 10,03 8,77 4,31 4,19 5,52 12,96 3,55 -11,65 -3,27 -9,07 -2,28 -6,16 -6,07 -3,19 -3,91 -4,70 -6,62 9,16 34,26 56,36 33,00 58,93 27,11 29,10 40,02 17,79 65,57 30,46 28,64 -22,11 -28,65 -26,25 -24,52 -16,26 -15,07 -11,18 -8,86 -15,90 -21,78 ,64 0,67 0,48 0,74 0,45 0,75 0,73 0,66 0,84 0,42 0,73

[1524] 0,27 -0,22 -0,27 -0,29 -0,25 -0,16 -0,14 -0,12 -0,08 -0,17 -0,20

Claims

1. REIVINDICACIONES

i.Un método para detectar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de pulmón, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de sangre, cáncer de ovario, melanoma y un tumor neuroendocrino en un sujeto, comprendiendo dicho método determinar la composición química del glucosaminoglucano (GAG) sulfato de condroitina (CS) y, opcionalmente, del GAG sulfato de heparán (HS), en una muestra de fluido corporal, en donde dicha muestra se ha obtenido de dicho sujeto,

en donde dicho método comprende determinar el nivel en la muestra de la propiedad del GAG 6s CS,

en donde dicho fluido corporal es sangre, y

en donde un nivel alterado de dicha propiedad del GAG en dicha muestra en comparación con un nivel de control es indicativo de dicho cáncer en dicho sujeto.

2.El método de la reivindicación 1, en donde dicha determinación de la composición química comprende determinar el nivel en la muestra de una o más propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en: una o más de las formas específicas sulfatadas o no sulfatadas de los disacáridos de CS o HS, la fracción de disacáridos sulfatados de HS del total de disacáridos de HS presentes (carga HS), la fracción de disacáridos sulfatados de CS de los disacáridos de CS totales presentes (carga CS), la concentración total de CS y la concentración total de HS, y

en donde se determinan los niveles de una o más de las formas específicas sulfatadas o no sulfatadas de los disacáridos CS o HS y en donde los GAG se someten a un paso de procesamiento para obtener las unidades de disacáridos para el análisis.

3.El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en: la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/6s CS, 0s CS, Ns2s HS, 4s CS.

4.El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/6s CS y 0s CS.

5.El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG 0s Cs , la relación 4s CS/6s CS, la carga CS, Ns HS, 4s CS, la relación 6s CS/0s CS, la relación 4s CS/0s CS, 0s HS, la carga HS.

6.El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG 0s Cs , la relación 4s CS/6s CS, carga CS, Ns HS.

7.El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde dicho método comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG, carga CS, concentración total de CS, 4s CS, 2s HS, 0s HS.

8.El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más o todas las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en 0s CS, 2s CS, 4s CS, 2s6s CS, 2s4s CS, 4s6s CS, Tris CS, carga CS, CS total, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 6s CS, el nivel relativo de 6s CS con respecto a 0s CS, el nivel relativo de 4s CS con respecto a 0s CS, Tris HS, Ns2s HS, 2s6s HS, 6s HS y HS total.

9.El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha determinación de la composición química comprende además determinar el nivel en la muestra de una o más de las propiedades del GAG seleccionadas del grupo que consiste en carga CS, CS total, 4s CS, 2s HS y 6s HS.

10.El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho método se utiliza para diagnosticar dicho cáncer, para el pronóstico de dicho cáncer, para la monitorización de sujetos en riesgo de aparición de dicho cáncer, para la monitorización de la progresión de dicho cáncer en un sujeto, para determinar la gravedad clínica de dicho cáncer, para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia o cirugía para dicho cáncer, para determinar la eficacia de un régimen terapéutico o quirúrgico que se esté utilizando para tratar dicho cáncer, para detectar la recurrencia o recaída de dicho cáncer, para la selección de pacientes o la selección de tratamientos o para distinguir pequeñas masas sospechosas de dicho cáncer de otras enfermedades no malignas.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho nivel o composición química de dicho GAG o propiedad del GAG se determina mediante electroforesis o mediante HPL<c>y espectrometría de masas.

El método de la reivindicación 11, en donde dicha electroforesis es electroforesis capilar, preferiblemente electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser y/o en donde la HPLC se combina con espectrometría de masas con ionización por electrorrociado.