ES3049590T3 - Small rna capture, detection and quantification - Google Patents

Small rna capture, detection and quantification

Info

Publication number
ES3049590T3
ES3049590T3 ES19188218T ES19188218T ES3049590T3 ES 3049590 T3 ES3049590 T3 ES 3049590T3 ES 19188218 T ES19188218 T ES 19188218T ES 19188218 T ES19188218 T ES 19188218T ES 3049590 T3 ES3049590 T3 ES 3049590T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ligation
universal
certain embodiments
adapter
approximately
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19188218T
Other languages
English (en)
Inventor
Linda Wong
Caifu Chen
Yalei Wu
Shoulian Dong
Chunmei Liu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Life Technologies Corp
Original Assignee
Life Technologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Life Technologies Corp filed Critical Life Technologies Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES3049590T3 publication Critical patent/ES3049590T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Se proporcionan aquí métodos, composiciones y kits para capturar, detectar y cuantificar ARN pequeños maduros. Las realizaciones de estos métodos comprenden la ligadura de adaptadores de ligadura 5' y 3' a los extremos 5' y 3' de los ARN pequeños maduros, respectivamente, en presencia de férulas de ligadura semidegeneradas 5' y 3' para generar un producto de ligadura. Otras realizaciones comprenden la transcripción inversa de ARN pequeño maduro poliadenilado con un cebador universal de transcripción inversa y la ligadura de un adaptador al extremo 3' del ADNc en presencia de una férula de ligadura semidegenerada para generar un producto de ligadura de ADNc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Captura, detección y cuantificación de ARN pequeño
[0005] Solicitudes relacionadas
[0007] Esta solicitud reivindica el beneficio en virtud del artículo 35 U.S.C. 119(e) de la solicitud de patente provisional US-61/740,242, presentada el 20 de diciembre de 2012, y el beneficio en virtud del artículo 35 U.S.C. 119(e) de la solicitud de patente provisional US-61/721,968, presentada el 2 de noviembre de 2012.
[0009] Campo
[0011] Las presentes enseñanzas están en el campo de la biología molecular y celular, específicamente en el campo de la detección de polinucleótidos diana tales como especies de ARN pequeño.
[0013] Introducción
[0015] Las especies de ARN reguladoras pequeñas, no codificantes, tales como el microARN (miARN), son una clase abundante de elementos reguladores que se ha mostrado que afectan a todos los aspectos de los procesos celulares normales tanto en plantas como en animales, incluyendo la muerte celular, la diferenciación y la proliferación. Los miARN también se han implicado en una serie de enfermedades, que incluyen cáncer, enfermedades cardíacas y enfermedades neurológicas, por lo tanto, los miARN se estudian como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico. Los ARN pequeños, incluyendo los miARN, son generados por complejos enzimáticos específicos a partir de precursores de ARN mucho más grandes. En general, un miARN maduro está compuesto por una secuencia central altamente conservada de 20-30 nucleótidos y típicamente tiene un monofosfato 5'-terminal y un grupo hidroxilo 3'-terminal. Los miARN generalmente inducen el silenciamiento génico mediante la unión a sitios diana dentro de la 3'-UTR de un ARNm al que se dirigen. Esta interacción suprime la síntesis de proteínas y/o inicia la degradación del ARNm.
[0017] Los intentos de detectar, cuantificar y analizar ARN pequeños maduros, tales como los miARN, se han visto obstaculizados por varios factores, que incluyen sus tamaños pequeños y su similitud entre especies relacionadas pero distintas. Los miembros de la familia de miARN estrechamente relacionados pueden diferir en un solo nucleótido, por lo tanto, se necesita una alta especificidad y la capacidad de discriminar entre apareamientos erróneos de un solo nucleótido.
[0019] Las micromatrices de ácido nucleico se han utilizado para cuantificar ARN pequeños maduros, pero este método requiere una alta concentración de diana de entrada para una hibridación eficiente. El pequeño tamaño de los ARN pequeños maduros impide su amplificación por reacción en cadena de la polimerasa(Polymerase Chain Reaction,PCR) con transcriptasa inversa o cuantitativa, aunque los precursores más grandes se pueden amplificar por PCR. Se han desarrollado métodos para facilitar la amplificación por PCR de ARN pequeños maduros. Por ejemplo, los ARN pequeños maduros se han alargado mediante la adición de al menos un adaptador de oligonucleótidos. Alternativamente, las sondas comprendiendo una porción que se hibrida con un ARN pequeño se ligan entre sí y después se utilizan para la amplificación por PCR. Estos métodos están lejos de ser ideales porque la unión de moléculas monocatenarias es ineficiente y/o el ARN pequeño no se detecta directamente. Por lo tanto, todavía se necesita un método de captura, detección y análisis de ARN pequeños que sea mejor con respecto a la técnica anterior con respecto a al menos uno de los siguientes atributos: sensibilidad, velocidad, eficiencia y rentabilidad. El documento WO2008097957 describe métodos, composiciones y kits para detectar moléculas de ARN pequeñas maduras desconocidas. El método fusiona los adaptadores por medio de férulas de ligadura (plantillas de ligadura) a ambos lados del ARN pequeño maduro, requiere una etapa de purificación para separar las férulas y las moléculas de ARN no fusionadas a los adaptadores, seguido de transcripción inversa y amplificación. El documento US-6706476 describe un método en donde se utilizan adaptadores y cebadores especiales para la amplificación de ADNc monocatenario. El método comprende poner en contacto el ARN con un cebador de síntesis de ADNc anclado que se puede reasociar con el ARN que ya está poliadenilado.
[0021] Resumen
[0023] En la presente memoria se proporcionan métodos para la detección de ARN pequeños maduros. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para capturar, detectar y cuantificar un ARN pequeño maduro, tal como un microARN (miARN), de una muestra que utiliza adaptadores de ligadura universales en los extremos tanto 5' como 3' del ARN pequeño maduro utilizando el grupo fosfato 5' terminal y el grupo hidroxilo 3' terminal de un ARN pequeño maduro (véase la Figura 1). La ligadura de doble extremo de un adaptador de ligadura a cada uno de los extremos 5' y 3' de un ARN pequeño maduro es catalizada por una ligasa dependiente de plantilla en presencia de férulas de ligadura semidegeneradas. El producto de ligadura resultante comprende el ARN pequeño maduro, un adaptador de ligadura universal 5' y un adaptador de ligadura universal 3' y se puede extender y amplificar para detectar y cuantificar directamente el ARN pequeño maduro. Después de la ligadura, todos los ARN pequeños maduros presentes en la muestra que se modificaron por la ligadura comprenderán una secuencia universal en los extremos tanto 5' como 3' de las regiones recién ligadas que permiten la transcripción inversa(Reverse Transcription, RT) universal y la preamplificación (preamp) y/o amplificación universal. La digestión posterior a la ligadura de los adaptadores de ligadura y las férulas de ligadura es opcional pero no es obligatoria. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se pueden llevar a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y extensión se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en1 etapa)).
[0025] En ciertas realizaciones, se puede utilizar un agente de bloqueo. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa(Polymerase Chain Reaction,PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional. En ciertas realizaciones, los métodos de amplificación comprenden el uso de activación por reacciones de polifosforólisis(Activation by PolyPhosphorolysis,APP) y agentes de polifosforolización. Los métodos de 1 y 2 etapas que utilizan RT universal y preamp/amplificación que se proporcionan en la presente memoria, ofrecen un flujo de trabajo simplificado que es muy deseable y mejora la detección, la sensibilidad y la reproducibilidad.
[0027] Mediante el uso de adaptadores de ligadura universales 5' y 3', se puede utilizar un solo cebador como cebador de transcripción inversa universal (p. ej., un cebador de RT/inverso universal) para las moléculas de ARN pequeño maduras en la muestra, que se han modificado con adaptadores de ligadura. De manera similar, el par de cebadores universales se puede utilizar para la preamplificación y/o amplificación (p. ej., cebadores universal directo y universal RT/inverso) para las moléculas de<a>R<n>pequeño maduras en la muestra, que se han modificado con adaptadores de ligadura. Al poliadenilar moléculas de AR<n>pequeño maduras, se utiliza un único cebador como cebador de transcripción inversa universal y es compartido por todo el ADNc de los polinucleótidos diana de la muestra. De manera similar, se puede utilizar un par de cebadores universales para la preamplificación y/o amplificación (p. ej., cebadores universal directo y universal inverso) para las moléculas de ADNc del ARN pequeño que se han modificado con un adaptador de ligadura.
[0029] El uso de cebadores universales ofrece una o más de las siguientes ventajas: 1) permite una reacción de un solo plex; 2) reduce los sesgos específicos de la diana; 3) elimina los pools fijos o personalizados; 4) elimina la restricción del número diana; 5) elimina la necesidad de actualizaciones de diseño basadas en especies de ARN pequeñas maduras recién descubiertas; 6) elimina la necesidad de desarrollar y validar pools; y 7) simplifica la fabricación, ya que solo se requieren uno o dos adaptadores de ligadura universales y un conjunto de cebadores universales. Además, este sistema permite una mayor flexibilidad para el diseño del cebador específico del gen y el diseño de la sonda, puesto que el ARN pequeño maduro se puede detectar directamente mediante métodos de ensayo tales como la PCR. Además, los métodos combinados de poliadenilación/RT universal (un método de 2 etapas), ligadura combinada/preamplificador universal (un método de 2 etapas), ligadura combinada/RT universal (un método de 2 etapas), RT universal combinado/preamplificador universal (un método de 2 etapas) o ligadura combinada/RT universal/preamplificador universal (un método de 1 etapa o 3 en 1) proporcionados en la presente memoria proporcionan las siguientes ventajas: 1) elimina la digestión posterior a la ligadura de los adaptadores de ligadura y las férulas de ligadura; 2) simplifica el flujo de trabajo; 3) reduce el tiempo de obtención de resultados; 4) reduce el tiempo de uso práctico; y 5) reduce la variación entre los ensayos.
[0031] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un polinucleótido diana en una muestra, incluyendo el método: ligar un adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 5' que abarca la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 3' que abarca la unión de ligadura 3', con lo que se forma un producto de ligadura; extender o transcribir de forma inversa el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador universal de RT/inverso; amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales directos y RT/inversos para formar un producto de amplificación; y detectar el polinucleótido diana. El polinucleótido diana es un ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, el polinucleótido diana es un miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de transcripción inversa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de amplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana se lleva a cabo esencialmente simultáneamente con la ligadura del adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana se lleva a cabo antes de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana se lleva a cabo después de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0032] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra, incluyendo el método: ligar un adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 5' que abarca la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 3' que abarca la unión de ligadura 3', con lo que se forma un producto de ligadura; extender o transcribir de forma inversa el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador universal de RT/inverso; amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales directos y RT/inversos para formar un producto de amplificación; y detectar el ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro es un miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de transcripción inversa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de amplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se lleva a cabo esencialmente simultáneamente con la ligadura del adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se lleva a cabo antes de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se lleva a cabo después de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0034] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un microARN (miARN) en una muestra, incluyendo el método: ligar un adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 5' que abarca la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 3' que abarca la unión de ligadura 3', con lo que se forma un producto de ligadura; extender o transcribir de forma inversa el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador universal de RT/inverso; amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales para formar un producto de amplificación; y detectar el miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de transcripción inversa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de amplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN se lleva a cabo esencialmente simultáneamente con la ligadura del adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN se lleva a cabo antes de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN se lleva a cabo después de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0036] La presente enseñanza proporciona, pero no reivindica, un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra, el método incluye: ligar un adaptador de ligadura universal de 5' al extremo 5' del A r N pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada de 5' que se extiende por la unión de ligadura en 5', mediante lo cual se forma un producto de ligadura; poliadenilar el extremo 3' del ARN pequeño maduro; extender el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador poli (T) universal, en donde el cebador poli (T) universal comprende una porción poli (T) y una porción de cola, en donde la porción de cola comprende un sitio de unión al cebador RT universal (véase la Figura 6); amplificar el producto de extensión para formar un producto de amplificación; y detectar el ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro es un miARN. En ciertas realizaciones, la etapa de poliadenilación, la etapa de extensión y la etapa de amplificación se llevan a cabo juntas en el mismo recipiente de reacción (un método de 1 etapa). En ciertas realizaciones, las etapas de poliadenilación y extensión se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en1 etapa)). En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0038] La presente enseñanza proporciona, pero no reivindica, un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra, el método incluye: poliadenilar el extremo 3' del ARN pequeño maduro; transcribir de forma inversa el ARN poliadenilado para formar un ADNc utilizando un cebador universal de transcripción inversa(Reverse Transcription,RT) (Figura 2), en donde el cebador RT universal comprende una porción poli (T) y una porción de cola, comprendiendo la porción de cola una porción de cebador universal; ligar un adaptador de ligadura universal al extremo 3' del ADNc en presencia de una férula de ligadura que se extiende por la unión de ligadura, con lo que se forma un producto de ligadura de ADNc; amplificar el producto de ligadura del ADNc utilizando un par de cebadores directos e inversos universales y/o detectar el ARN pequeño maduro mediante PCR. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro es un miARN. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura es una férula de ligadura semidegenerada. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de poliadenilación y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (poliadenilación/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y preamplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura y/o la etapa de preamplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0040] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ y el adaptador de ligadura 3' son oligonucleótidos lineales (véase la Figura 3). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ comprende una región complementaria de la férula de ligadura 5’ en la región terminal 3' que es complementaria de la región 3' de la férula de ligadura 5’, y un sitio de unión del cebador directo universal situado en la región terminal 5'. El sitio de unión del cebador directo universal en el adaptador de ligadura de 5’ es complementario o incluye la secuencia del cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' comprende un grupo de bloqueo en el extremo 3', una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’, y un sitio de unión del cebador de RT/inverso universal situado en la región terminal 3'. El sitio de unión del cebador universal RT/inverso es complementario del cebador universal inverso. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es para ligar al extremo 3' del ADNc y comprende una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’, y un sitio de unión del cebador universal situado en la región terminal 3'. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' para ligar al extremo 3' del ADNc comprende un grupo de bloqueo en el extremo 3', una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’ y un sitio de unión del cebador directo universal situado en la región terminal 3'. El sitio de unión del cebador directo universal es complementario del cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un oligonucleótido de ARN y el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido de ADN.
[0042] En ciertas realizaciones, la férula de ligadura semidegenerada 5' comprende dos regiones distintas (véase la Figura 3): una región terminal 5' que contiene bases de nucleótidos degenerados que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 5' del ARN pequeño maduro y una región 3' que se hibrida con el extremo 3' del adaptador de ligadura de 5’. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura semidegenerada 5' comprende dos regiones distintas: una región terminal 5' que contiene de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se híbrida con el extremo 5' del ARN pequeño maduro y una región 3' que se hibrida con el extremo 3' del adaptador de ligadura de 5’. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene bases de nucleótidos degeneradas que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ADNc del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene bases de nucleótidos degenerados que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ADNc del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'.
[0044] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ y el adaptador de ligadura 3' contienen una estructura de horquilla (en la presente memoria denominados “adaptadores de ligadura de horquilla 5' o 3'” ) (véase la Figura 4), en donde el adaptador de ligadura de horquilla 5' comprende un segmento saliente monocatenario 5', un tallo y un bucle, en donde el extremo 3' de la porción de tallo está ligado al extremo 5' del ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 5' comprende de 3 a 6 bases degeneradas que se hibridan con la porción terminal 5' del ARN pequeño maduro y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende un segmento saliente monocatenario 3', un tallo y un bucle, en donde el extremo 5' de la porción del tallo está ligado al extremo 3' del ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 3' comprende de 3 a 6 bases degeneradas que se hibridan con la región terminal 3' del ARN pequeño maduro y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende un segmento saliente monocatenario 3', un tallo y un bucle, en donde el extremo 5' de la porción de tallo está ligado al extremo 3' del ADNc de un ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 3' comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con la región terminal 3' del ADNc y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el saliente monocatenario 3' de este adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 bases degeneradas que se hibridan con la región terminal 3' del ADNc y que sirve como una férula de ligadura.
[0046] En ciertas realizaciones, los adaptadores de ligadura de horquilla tanto 5' como 3' son oligonucleótidos híbridos de ADN-ARN. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' es un oligonucleótido de ADN. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'.
[0048] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un oligonucleótido lineal y el adaptador de ligadura 3' es un adaptador de ligadura de horquilla (véase la Figura 5). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un adaptador de ligadura de horquilla y el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido lineal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido lineal y se utiliza para la ligadura al ADNc (véase la Figura 2). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es un adaptador de ligadura de horquilla y se utiliza para la ligadura al ADNc.
[0050] La presente enseñanza proporciona pero no reivindica un kit para detectar una molécula de ARN pequeño maduro, comprendiendo el kit: un adaptador de ligadura universal 5' para ligar al extremo 5' del ARN pequeño maduro, un adaptador de ligadura universal 3' para ligar al extremo 3' del ARN pequeño maduro, una férula de ligadura semidegenerada 5' que abarca la unión de ligadura 5', una férula de ligadura semidegenerada 3' que abarca la unión de ligadura 3' e instrucciones para utilizar el kit. En ciertas realizaciones, el kit comprende además una o más de una ligasa, una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa. En ciertas realizaciones, el kit comprende además un cebador universal RT/inverso y un cebador universal directo. En ciertas realizaciones, los adaptadores de ligadura 5' y 3' son lineales. En ciertos casos, los adaptadores de ligadura 5' y 3' son adaptadores de ligadura de horquilla. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender además un oligonucleótido de bloqueo.
[0052] La presente enseñanza proporciona pero no reivindica un kit comprendiendo un cebador de transcripción inversa (RT) universal, un adaptador de ligadura 3' y una férula de ligadura 3’, donde el cebador de transcripción inversa comprende una porción de poli(T) y una porción de cola comprende una porción de cebador universal. En ciertas realizaciones, el kit comprende además una o más de una ligasa, una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa. En ciertas realizaciones, el kit comprende además un cebador inverso universal y un cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es lineal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es un adaptador de ligadura de horquilla. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender además un oligonucleótido de bloqueo. Se proporcionan composiciones, tales como composiciones de reacción, pero actualmente no se reivindican, comprendiendo un adaptador de ligadura universal 5', un adaptador de ligadura universal 3', una férula de ligadura semidegenerada 5' y una férula de ligadura semidegenerada 3'. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo además un oligonucleótido bloqueador y/o un par de cebadores universales directos y RT/inversos. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo un cebador universal de transcripción inversa comprendiendo una porción de poli (T) y una porción de cola comprendiendo una porción de cebador universal, un adaptador de ligadura universal en 3' y una férula de ligadura en 3'. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo además un oligonucleótido bloqueador y/o un par de cebadores directos e inversos universales.
[0053] Se proporcionan composiciones, pero actualmente no se reivindican, comprendiendo un oligonucleótido bloqueador para bloquear la formación y/o amplificación del subproducto autoligado del adaptador de ligadura o del subproducto ligado al cebador-adaptador (véase la Figura 15). En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo es ADN. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo es ARN. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo comprende una porción de poli(A). En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo comprende un agente de bloqueo, que incluye, pero no se limita a, 2'-O-metilo, acridina, un ligando del surco menor(Minor Groove Binder,MGB) y un compuesto colorante intercalante. En ciertas realizaciones, el agente de bloqueo se encuentra en el extremo 3' del oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, el agente de bloqueo se encuentra en el extremo 5' del oligonucleótido de bloqueo.
[0054] También se describe el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades, por ejemplo, cáncer, incluidos, entre otros, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cánceres del tracto reproductivo, cáncer de cerebro, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cánceres de la sangre (por ejemplo, leucemia y linfoma), sarcomas, melanomas y similares; enfermedades cardiovasculares; enfermedades y trastornos autoinmunes; y enfermedades y trastornos metabólicos. Otra descripción proporciona el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria en el diagnóstico o determinación de la sensibilidad a fármacos y al tratamiento médico.
[0055] Otras realizaciones y aspectos ilustrativos, características y ventajas de la presente descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas, se dan solo a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente descripción serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de este descripción detallada.
[0056] Breve descripción de los dibujos
[0057] El experto en la técnica entenderá que los dibujos que se describen a continuación son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
[0058] La Figura 1 representa esquemáticamente el flujo de trabajo para un ensayo de ARN pequeño de ligadura de doble extremo según una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0059] La Figura 2 representa esquemáticamente el flujo de trabajo para un ensayo de extensión de ARN pequeño por dos extremos según una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0060] La Figura 3 representa esquemáticamente adaptadores de ligadura lineales según una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0061] La Figura 4 representa esquemáticamente adaptadores de ligadura de horquilla según una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0062] La Figura 5 representa esquemáticamente una combinación de un adaptador de ligadura lineal y un adaptador de ligadura de horquilla según una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0063] La Figura 6 representa esquemáticamente la cola de poli(A) con un cebador oligo-dT según una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0064] La Figura 7 representa gráficamente la señal de fondo observada cuando la muestra se sustituyó con agua exenta de nucleasas en la reacción de ligadura en métodos según las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0065] La Figura 8 representa gráficamente la sensibilidad y el intervalo dinámico lineal de los métodos según las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0066] La Figura 9 muestra un gráfico de amplificación del nivel de expresión de hsa-let7a en ARN total y una respuesta de valoración de muestra según realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0067] La Figura 10 representa gráficamente la sensibilidad de los presentes métodos en relación con otros métodos. La Figura 11 representa gráficamente el intervalo dinámico lineal y la sensibilidad de un método combinado de ligadura/RT de 2 etapas según realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0068] La Figura 12 representa gráficamente el intervalo dinámico lineal y la sensibilidad de un método combinado de RT/preamplificación de 2 etapas según realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0069] La Figura 13 representa gráficamente una comparación del método combinado 3 en 1 (es decir, ligadura combinada, extensión (RT) y preamplificación/amplificación; cuadrados) y un control en dos etapas (diamantes) según las realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0070] La Figura 14 representa gráficamente la sensibilidad del método combinado 3 en 1 según realizaciones de las presentes enseñanzas que muestran Ct frente a ensayo.
[0071] La Figura 15 representa esquemáticamente cuatro estrategias para bloquear el subproducto de ligadura adaptadoradaptador o adaptador-cebador de fondo utilizando: A) un oligonucleótido bloqueador que tiene una molécula de MGB unida a su extremo 3', b) un oligonucleótido bloqueador URP de amplificación restrictiva dirigida a secuencia(Sequence TargetedAmplification Restrictive,STAR), C) un oligonucleótido bloqueador que tiene un grupo 2'-O-metilo unido a su extremo 5' (en esta realización, el oligonucleótido bloqueador es ARN), o D) un oligonucleótido bloqueador con una estructura de tallo-bucle y una porción saliente monocatenaria que contiene poli(A) en su extremo 3'.
[0072] La Figura 16 representa gráficamente un gráfico de amplificación que muestra el subproducto de adaptador-adaptador de fondo después de la amplificación utilizando PCR cuantitativa (qPCR, curva más a la izquierda) o secuenciación de nueva generación(Next-Generation Sequencing,NGS, curva más a la derecha).
[0073] La Figura 17 representa gráficamente la cuantificación por qPCR del efecto de los oligonucleótidos de bloqueo en el subproducto de adaptador-adaptador de fondo y la amplificación del miARN objetivo.
[0074] La Figura 18 representa gráficamente el aumento de la sensibilidad de la detección por qPCR del miARN diana utilizando varios oligonucleótidos de bloqueo: Oligonucleótido bloqueante 3'-MGB (línea rombada), oligonucleótido bloqueante 2'-O-metil RNA (línea cuadrada), oligonucleótido bloqueante STAR URP (línea triangular) y oligonucleótido bloqueante STAR URP MGB (línea x -).
[0075] La Figura 19 representa gráficamente la reducción porcentual en el subproducto de adaptador-adaptador de fondo (gráfico izquierdo) y el número de veces de aumento de la sensibilidad (gráfico derecho) utilizando oligonucleótidos de bloqueo en la amplificación por qPCR.
[0076] La Figura 20 representa gráficamente la reducción del subproducto adaptador-adaptador de fondo y el aumento de la sensibilidad de detección de miARN en la secuenciación de próxima generación(Next-Generation Sequencing,NGS) utilizando varios oligonucleótidos de bloqueo: Oligonucleótido bloqueador de 3'-MGB 2 pM (línea de rombos), oligonucleótido bloqueador de 3'-MGB 4 pM (línea de cuadrados) y oligonucleótido bloqueador de 2'-O-metil ARN 4 pM (línea de triángulos).
[0077] La Figura 21 representa gráficamente la reducción porcentual en el subproducto de adaptador-adaptador de fondo utilizando oligonucleótidos de bloqueo en el análisis de NGS de miARN.
[0078] La Figura 22 representa gráficamente el número de veces de aumento de la sensibilidad utilizando oligonucleótidos de bloqueo en el análisis de NGS de miARN.
[0079] La Figura 23 representa gráficamente el intervalo dinámico lineal y la sensibilidad de un método combinado de 2 etapas de poliadenilación/RT seguido de una reacción de ligadura de ADNc, con (línea de cuadrados) o sin (línea de rombos) una etapa de preamplificación según realizaciones de las presentes enseñanzas.
[0080] La Figura 24 representa gráficamente el aumento de la sensibilidad de la detección por qPCR de miARN diana con un oligonucleótido bloqueador (línea de cuadrados) en la reacción de ligadura en comparación con la reacción de ligadura sin el oligonucleótido bloqueador (línea de rombos).
[0081] Descripción de realizaciones ilustrativas
[0082] Se proporcionan en la presente memoria métodos, composiciones y kits para la detección de ARN pequeños maduros. En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para capturar, detectar y cuantificar un ARN pequeño maduro, tal como un microARN (miARN), de una muestra que utiliza adaptadores de ligadura universales en los extremos tanto 5' como 3' del ARN pequeño maduro utilizando el grupo fosfato 5' terminal y el grupo hidroxilo 3' terminal de un ARN pequeño maduro (véase la Figura 1). La ligadura de doble extremo de un adaptador de ligadura a cada uno de los extremos 5' y 3' de un ARN pequeño maduro es catalizada por una ligasa dependiente de plantilla en presencia de férulas de ligadura semidegeneradas 5' y 3'. El producto de ligadura resultante comprende el ARN pequeño maduro, un adaptador de ligadura universal 5' y un adaptador de ligadura universal 3' y se puede extender y amplificar para detectar y cuantificar directamente el ARN pequeño maduro. Después de la ligadura, todos los ARN pequeños maduros presentes en la muestra que se modificaron por la ligadura comprenderán una secuencia universal en los extremos tanto 5' como 3' de las regiones recién ligadas que permiten la transcripción inversa universal (RT) y la preamplificación (preamp) y/o amplificación universal. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. La digestión posterior a la ligadura de los adaptadores de ligadura y las férulas de ligadura es opcional pero no es obligatoria. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se pueden llevar a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y extensión se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en1 etapa)).
[0084] En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en las etapas de ligadura y/o preamplificación. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional. Los métodos de 1 y 2 etapas que utilizan RT universal y preamp/amplificación que se proporcionan en la presente memoria, ofrecen un flujo de trabajo simplificado que es muy deseable y mejora la detección, la sensibilidad y la reproducibilidad.
[0086] Mediante el uso de adaptadores de ligadura universales 5' y 3', se utiliza un solo cebador como cebador universal de transcripción inversa (p. ej., un cebador universal inverso) y es compartido por todas las moléculas de ARN pequeño maduras en la muestra, que se han modificado con adaptadores de ligadura. De manera similar, el par de cebadores universales se puede utilizar para la preamplificación y/o amplificación (p. ej., cebadores universal directo y universal RT/inverso) para las moléculas de a Rn pequeño maduras en la muestra, que se han modificado con adaptadores de ligadura. Al poliadenilar moléculas de ARn pequeño maduras, se utiliza un único cebador comprendiendo una porción de poli(T) como cebador universal de transcripción inversa y es compartido por todo el ADNc de los polinucleótidos diana de la muestra. De manera similar, se puede utilizar un par de cebadores universales para la preamplificación y/o amplificación (p. ej., cebadores universal directo y universal inverso) para las moléculas de ADNc del ARN pequeño que se han modificado con un adaptador de ligadura.
[0088] El uso de cebadores universales ofrece una o más de las siguientes ventajas: 1) permite una reacción de un solo plex; 2) reduce los sesgos específicos de la diana; 3) elimina los pools fijos o personalizados; 4) elimina la restricción del número diana; 5) elimina la necesidad de actualizaciones de diseño basadas en especies de ARN pequeñas maduras recién descubiertas; 6) elimina la necesidad de desarrollar y validar pools; y 7) simplifica la fabricación, ya que solo se requieren uno o dos adaptadores de ligadura y un juego de cebadores universales. Además, este sistema permite una mayor flexibilidad para el diseño del cebador específico del gen y el diseño de la sonda, puesto que el ARn pequeño maduro se puede detectar directamente mediante métodos de ensayo tales como la PCR. Además, los métodos combinados de poliadenilación/RT universal (un método de 2 etapas), ligadura combinada/preamplificador universal (un método de 2 etapas), ligadura combinada/RT universal (un método de 2 etapas), RT universal combinado/preamplificador universal (un método de 2 etapas) o ligadura combinada/RT universal/preamplificador universal (un método de 1 etapa o 3 en 1) proporcionados en la presente memoria proporcionan las siguientes ventajas: 1) elimina la digestión posterior a la ligadura de los adaptadores de ligadura y las férulas de ligadura; 2) simplifica el flujo de trabajo; 3) reduce el tiempo de obtención de resultados; 4) reduce el tiempo de manipulación; y 5) reduce la variación entre los ensayos.
[0090] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un polinucleótido diana en una muestra, incluyendo el método: ligar un adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 5' que abarca la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 3' que abarca la unión de ligadura 3', con lo que se forma un producto de ligadura; extender o transcribir de forma inversa el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador universal de RT/inverso; amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales directos y RT/inversos para formar un producto de amplificación; y detectar el polinucleótido diana. El polinucleótido diana es un ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, el polinucleótido diana es un miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de transcripción inversa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de amplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana se lleva a cabo esencialmente simultáneamente con la ligadura del adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana se lleva a cabo antes de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del polinucleótido diana se lleva a cabo después de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del polinucleótido diana. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0091] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un ARN pequeño maduro de una muestra, incluyendo el método: ligar un adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 5' que abarca la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada 3' que abarca la unión de ligadura 3', con lo que se forma un producto de ligadura; extender o transcribir de forma inversa el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador universal de RT/inverso; amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales directos y RT/inversos para formar un producto de amplificación; y detectar el ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro es un miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de transcripción inversa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de amplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se lleva a cabo esencialmente simultáneamente con la ligadura del adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se lleva a cabo antes de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se lleva a cabo después de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0093] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un microARN (miARN) en una muestra, incluyendo el método: ligar un adaptador de ligadura de 5’ universal al extremo 5' del miARN en presencia de una férula de ligadura 5’ semidegenerada que abarca la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura 3' universal al extremo 3' del miARN en presencia de una férula de ligadura 3’ semidegenerada que abarca la unión de ligadura 3', con lo que se forma un producto de ligadura; extender o transcribir de forma inversa el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador universal de RT/inverso; amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales directos y RT/inversos para formar un producto de amplificación; y detectar el miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura, transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 1 etapa o 3 en 1). En ciertas realizaciones, las etapas de ligadura y transcripción inversa se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (ligadura/RT en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, las etapas de transcripción inversa y preamplificación y/o amplificación se llevan a cabo juntas o esencialmente simultáneamente en un único recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de ligadura. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de transcripción inversa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en la etapa de amplificación. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 1 etapa. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un oligonucleótido de bloqueo en el método de 2 etapas. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN se lleva a cabo esencialmente simultáneamente con la ligadura del adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN se lleva a cabo antes de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN. En ciertas realizaciones, la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del miARN se lleva a cabo después de ligar el adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del miARN. La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0095] En ciertos casos, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra, el método incluye: ligar un adaptador de ligadura universal de 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada de 5' que se extiende por la unión de ligadura en 5', mediante lo cual se forma un producto de ligadura; poliadenilar el extremo 3' del ARN pequeño maduro; extender el producto de ligadura para formar un producto de extensión utilizando un cebador poli (T) universal, en donde el cebador poli (T) universal comprende una parte poli (T) y una parte posterior, en donde la parte posterior comprende un sitio de unión al cebador RT universal (véase la Figura 6); amplificar el producto de extensión para formar un producto de amplificación; y detectar el ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro es un miARN. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro o una síntesis química. En ciertas realizaciones, la etapa de poliadenilación, la etapa de extensión y la etapa de amplificación se llevan a cabo juntas en el mismo recipiente de reacción (un método de 1 etapa). En ciertas realizaciones, la etapa de poliadenilación y la etapa de extensión se llevan a cabo juntas en el mismo recipiente de reacción (un método de 2 etapas). En ciertas realizaciones, la etapa de extensión y la etapa de amplificación se llevan a cabo juntas en el mismo recipiente de reacción (un método de 2 etapas (RT/preamp en 1 etapa)). La detección de los polinucleótidos diana se puede llevar a cabo utilizando métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa(Polymerase Chain Reaction,PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR convencional.
[0097] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ y el adaptador de ligadura 3' son oligonucleótidos lineales (véase la Figura 3). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ comprende una región complementaria de la férula de ligadura 5’ en la región terminal 3' que es complementaria de la región 3' de la férula de ligadura 5’, y un sitio de unión del cebador directo universal situado en la región terminal 5'. El sitio de unión del cebador directo universal en el adaptador de ligadura de 5’ es complementario o incluye la secuencia del cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' comprende un grupo de bloqueo en el extremo 3', una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’, y un sitio de unión del cebador de RT/inverso universal situado en la región terminal 3'. El sitio de unión del cebador universal RT/inverso es complementario del cebador universal inverso. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es para ligar al extremo 3' del ADNc y comprende una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’, y un sitio de unión del cebador universal situado en la región terminal 3'. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es para ligar al extremo 3' del ADNc y comprende un grupo de bloqueo en el extremo 3', una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’ y un sitio de unión del cebador directo universal situado en la región terminal 3'. El sitio de unión del cebador directo universal es complementario del cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un oligonucleótido de ARN y el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido de ADN.
[0099] En ciertas realizaciones, la férula de ligadura semidegenerada 5' comprende dos regiones distintas (véase la Figura 3): una región terminal 5' que contiene bases de nucleótidos degenerados que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 5' del ARN pequeño maduro y una región 3' que se hibrida con el extremo 3' del adaptador de ligadura de 5’. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene bases de nucleótidos degeneradas que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ADNc del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene bases de nucleótidos degenerados que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ADNc del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'.
[0101] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ y el adaptador de ligadura 3' contienen una estructura de horquilla (en la presente memoria denominados “adaptadores de ligadura de horquilla 5' o 3'” ) (véase la Figura 4), en donde el adaptador de ligadura de horquilla 5' comprende un segmento saliente monocatenario 5', un tallo y un bucle, en donde el extremo 3' de la porción de tallo está ligado al extremo 5' del ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 5' comprende de 3 a 6 bases degeneradas que se hibridan con la región terminal 5' del ARN pequeño maduro y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende un segmento saliente monocatenario 3', un tallo y un bucle, en donde el extremo 5' de la porción del tallo está ligado al extremo 3' del ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 3' comprende de 3 a 6 bases degeneradas que se hibridan con la región terminal 3' del ARN pequeño maduro y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende un segmento saliente monocatenario 3', un tallo y un bucle, en donde el extremo 5' de la porción de tallo está ligado al extremo 3' del ADNc de un ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 3' comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con la región terminal 3' del ADNc y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el saliente monocatenario 3' de este adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 bases degeneradas que se hibridan con la región terminal 3' del ADNc y que sirve como una férula de ligadura.
[0103] En ciertas realizaciones, las férulas de ligadura y los adaptadores de ligadura pueden comprender bases de nucleótidos naturales (p. ej., A, C, G, T, U) o bases de nucleótidos degenerados en regiones diseñadas para hibridar con los ARN pequeños maduros o sus ADNc. Las férulas de ligadura semidegeneradas y los adaptadores de ligadura pueden comprender bases de nucleótidos naturales y bases de nucleótidos degenerados en regiones diseñadas para hibridar con los ARN pequeños maduros o sus ADNc. En ciertas realizaciones, las férulas y adaptadores de ligadura comprenden una región terminal que contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 13 bases de nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' o 5' del ARN pequeño maduro o con el extremo 3' del ADNc del ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, dichas regiones terminales de las férulas y adaptadores de ligadura comprenden de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 nucleótidos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 nucleótidos, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el ARN pequeño maduro o su ADNc. En ciertas realizaciones, las férulas y adaptadores de ligadura comprenden una región terminal que contiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 bases de nucleótidos degenerados que se hibridan con el extremo 3' o 5' del ARN pequeño maduro o con el extremo 3' del ADNc del ARN pequeño y maduro. En ciertas realizaciones, las férulas y adaptadores de ligadura comprenden una región terminal que contiene aproximadamente 6 bases de nucleótidos degenerados. En ciertas realizaciones, las férulas y adaptadores de ligadura comprenden una región terminal que contiene aproximadamente 5 bases de nucleótidos degenerados. En ciertas realizaciones, las férulas y adaptadores de ligadura comprenden una región terminal que contiene aproximadamente 4 bases de nucleótidos degenerados. En ciertas realizaciones, las férulas y adaptadores de ligadura comprenden una región terminal que contiene aproximadamente 3 bases de nucleótidos degenerados. En ciertas realizaciones, las bases de nucleótidos degenerados de las férulas y adaptadores de ligadura se seleccionan del grupo que consiste en desoxiinosina, 5-nitroindol y 2-amino purina. En realizaciones particulares, las bases de nucleótidos degenerados de las férulas y adaptadores de ligadura son desoxiinosina.
[0105] En ciertas realizaciones, los adaptadores de ligadura de horquilla tanto 5' como 3' son oligonucleótidos híbridos de ADN-ARN. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' es un oligonucleótido de ADN. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'.
[0107] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un oligonucleótido lineal y el adaptador de ligadura 3' es un adaptador de ligadura de horquilla (véase la Figura 5). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un adaptador de ligadura de horquilla y el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido lineal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido lineal y se utiliza para la ligadura al ADNc (véase la Figura 2). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es un adaptador de ligadura de horquilla y se utiliza para la ligadura al ADNc.
[0109] En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo un oligonucleótido de bloqueo para bloquear el subproducto autoligado del adaptador de ligadura o la formación y/o amplificación del subproducto ligado con cebador-adaptador (ver Figura 15). En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo es ADN. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo es ARN. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo comprende una porción de poli(A). En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo comprende un agente de bloqueo, que incluye, pero no se limita a, 2'-O-metilo, acridina, un ligando del surco menor(Minor Groove Binder,MGB) y un compuesto colorante intercalante.
[0111] Para describir y señalar de manera más clara y concisa el objeto de la presente descripción, se proporcionan las siguientes definiciones para términos específicos, que se utilizan en la siguiente descripción y en las reivindicaciones adjuntas. A lo largo de la memoria descriptiva, la ejemplificación de términos específicos debe considerarse como ejemplos no limitantes.
[0113] Como se utiliza en esta descripción, las palabras “un” o “ una” significan al menos uno, a menos que se indique de otra forma. En esta descripción, el uso del singular incluye al plural a menos que se indique de otra forma. Por ejemplo, pero no como limitación, “ un ácido nucleico diana” significa que puede estar presente más de un ácido nucleico diana; por ejemplo, una o más copias de una especie de ácido nucleico diana particular, así como dos o más especies diferentes de ácido nucleico diana. El término “y/o” significa que los términos antes y después de la barra se pueden considerar juntos o por separado. Con fines ilustrativos, pero no como una limitación, “X y/o Y” puede significar “X” o “Y” o “X” e “Y” .
[0115] Se apreciará que hay un “ aproximadamente” implícito antes de las temperaturas, concentraciones, tiempos, etc., descritos en la presente descripción, de modo que las desviaciones leves e insustanciales están dentro del alcance de las presentes enseñanzas en la presente memoria. También, el uso de “comprenden” , “comprende” , “comprendiendo” , “contienen” , “contiene” , “que contiene” , “ incluyen” , “ incluye” , y “que incluye” no pretenden ser limitantes. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de las enseñanzas.
[0117] A menos que se indique específicamente en la anterior memoria descriptiva, las realizaciones en la anterior memoria descriptiva que enumeran “comprendiendo” diversos componentes también se contemplan como “que consisten en” o “que consisten esencialmente en” los componentes enumerados; realizaciones en la memoria descriptiva que enumeran “que consisten en” diversos componentes también se contemplan como “comprendiendo” o “que consisten esencialmente en” los componentes enumerados; y las realizaciones en la memoria descriptiva que enumeran “que consisten esencialmente en” diversos componentes también se contemplan como “que consisten en” o “comprendiendo” los componentes enumerados (esta intercambiabilidad no se aplica al uso de estos términos en las reivindicaciones).
[0119] La expresión “o combinaciones de estos” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los términos que se citan que preceden al término. Por ejemplo, “A, B, C o combinaciones de los mismos” pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC o CAB. Para continuar con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. El experto en la técnica entenderá que, por lo general, no hay límite en el número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que el contexto lo demuestre de otro modo.
[0120] Los encabezados de sección que se utilizan en la presente memoria son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del objeto que se desea en modo alguno. En el caso de que la bibliografía citada en la especificación, incluidas, entre otras, patentes, solicitudes de patente, artículos, libros y tratados, contradiga cualquier término definido en esta especificación, esta especificación prevalece. Si bien las presentes enseñanzas se describen junto con diversas realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas se limiten a dichas realizaciones. Por el contrario, las presentes enseñanzas abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la técnica.
[0122] El término “ hibridación” , que incluye, sin limitación, variaciones de las palabras raíz “ hibridar” , se utiliza indistintamente y significa la interacción de emparejamiento de bases de nucleótidos complementarias de un ácido nucleico con otro ácido nucleico que da como resultado la formación de un dúplex, triplex u otra estructura de orden superior. La interacción primaria es típicamente específica de bases de nucleótidos, p. ej., A:T, A:U y G:C, mediante enlaces de hidrógeno de tipo Watson-Crick y Hoogsteen. En ciertas realizaciones, el apilamiento de bases y las interacciones hidrófobas también pueden contribuir a la estabilidad del dúplex. Las condiciones en las que los cebadores y las sondas se unen a secuencias complementarias son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe en Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hames y Higgins, eds., IRL Press, Washington, D.C. (1985) y Wetmur y Davidson, Mol. Biol. 31:349 (1968).
[0124] En general, el que esta reasociación tenga lugar depende, entre otras cosas, de la longitud de los polinucleótidos y la complementariedad, el pH, la temperatura, la presencia de cationes mono y divalentes, la proporción de nucleótidos G y C en la región de hibridación, la viscosidad del medio y la presencia de desnaturalizantes. Tales variables influyen en el tiempo que se requiere para la hibridación. Por lo tanto, las condiciones de alineamiento preferentes dependerán de la aplicación particular. Sin embargo, tales condiciones las pueden determinar de forma rutinaria los expertos en la técnica, sin experimentación indebida. Se apreciará que la complementariedad no tiene por qué ser perfecta; Puede haber una pequeña cantidad de desajustes de pares de bases que interferirán mínimamente con la hibridación entre la secuencia objetivo y los ácidos nucleicos monocatenarios de las presentes enseñanzas. Sin embargo, si el número de apareamientos erróneos de pares de bases es tan grande que no puede producirse la hibridación en condiciones mínimamente restrictivas, entonces la secuencia generalmente no es una secuencia diana complementaria. Por lo tanto, “complementariedad” en la presente memoria significa que las sondas o cebadores son suficientemente complementarios con la secuencia diana para hibridar en las condiciones de reacción seleccionadas para lograr los fines de las presentes enseñanzas. Preferiblemente, las condiciones de alineamiento se seleccionan para permitir que los cebadores y/o las sondas se hibriden selectivamente con una secuencia complementaria en la secuencia flanqueante o amplicón objetivo que se corresponde, pero no se hibriden en ningún grado significativo con diferentes ácidos nucleicos objetivo o secuencias no objetivo en la composición de reacción a la segunda temperatura de reacción.
[0126] El término “ ligando del surco menor” o “ MGB” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula pequeña que encaja en el surco menor de ADN bicatenario, a veces de una manera específica de secuencia. En general, los ligandos del surco menor son moléculas largas y planas que pueden adoptar una forma de media luna y, por lo tanto, encajan perfectamente en el surco menor de una doble hélice, a menudo mediante el desplazamiento del agua. Las moléculas de unión al surco menor típicamente comprenden varios anillos aromáticos conectados por enlaces con libertad de torsión, por ejemplo, pero no limitado a anillos de furano, benceno o pirrol.
[0128] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “polinucleótido” , “oligonucleótido” y “ácido nucleico” se utilizan indistintamente y se refieren a polímeros monocatenarios y bicatenarios de monómeros nucleótidos, que incluyen, pero no se limitan a 2'-desoxirribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (ARN) unidos por conexiones de enlace fosfodiéster internucleótidos, o análogos de internucleótidos, y contraiones asociados, p. ej., H+, NH4+, trialquilamonio, Mg2+, Na+ y similares. Un polinucleótido puede estar compuesto enteramente de desoxirribonucleótidos, enteramente de ribonucleótidos, o mezclas quiméricas de los mismos y puede incluir análogos de nucleótidos. Las unidades de monómeros nucleótidos pueden comprender cualquiera de los nucleótidos que se describen en la presente memoria, que incluyen, pero no se limitan a nucleótidos y/o análogos de nucleótidos. Los polinucleótidos varían típicamente en tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, p. ej., 5-40 cuando se denominan a veces en la técnica oligonucleótidos, hasta varios miles de unidades de nucleótidos monoméricos. A menos que se indique de otra forma, siempre que se represente una secuencia de polinucleótidos, se entenderá que los nucleótidos están en el orden 5' a 3' de izquierda a derecha y que “A” indica desoxiadenosina, “ C” indica desoxicitosina, “G” indica desoxiguanosina, “T” indica desoxitimidina y “ U” indica desoxuridina, a menos que se indique de otra forma.
[0130] El término “ nucleótido” se refiere a un éster fosfato de un nucleósido, p. ej., ésteres trifosfato, en donde el sitio más común de esterificación es el grupo hidroxilo unido en la posición C-5 de la pentosa.
[0132] El término “ nucleósido” se refiere a un compuesto que consiste en una base de nucleósido de purina, desazapurina o pirimidina, p. ej., adenina, guanina, citosina, uracilo, timina, desazaadenina, desazaguanosina y similares, unida a una pentosa en la posición 1', incluyendo las formas 2'-desoxi y 2'-hidroxilo. Cuando la base de nucleósidos es purina o 7-desazapurina, la pentosa se une a la nucleobase en la posición 9 de la purina o desazapurina, y cuando la nucleobase es pirimidina, la pentosa se une a la nucleobase en la posición 1 de la pirimidina.
[0134] El término nucleótido o base de nucleósido “degenerado” se refiere a la capacidad de la base para emparejarse indiscriminadamente con más de una base, por ejemplo, con todas las pirimidinas, con todas las purinas o con cualquier nucleótido natural. Típicamente, una base degenerada tiene la capacidad de reemplazar cualquiera de las cuatro bases naturales sin desestabilizar significativamente la interacción entre pares de bases vecinas o alterar la capacidad funcional esperada del oligonucleótido modificado resultante. Los ejemplos de bases degeneradas incluyen, pero no se limitan a, desoxinosina, iso-desoxiguanosina, 5-nitroindol, 5-metil-isodesoxicitosina y 2-aminopurina.
[0135] El término “ análogo” incluye los análogos sintéticos que tienen restos de base modificados, restos de azúcar modificados y/o restos de éster fosfato modificados. Los análogos de fosfato en general comprenden análogos de fosfato en donde el átomo de fósforo está en el estado de oxidación 5 y uno o más de los átomos de oxígeno se sustituye por un resto sin oxígeno, p. ej., azufre. Análogos de fosfato ilustrativos incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, boronofosfatos, incluidos contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, Na+. Análogos de base ilustrativos incluyen: 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudouridina, C-5-propino, isocitosina, isoguanina, 2-tiopirimidina. Los análogos de azúcar ilustrativos incluyen: Modificaciones 2' o 3' donde la posición 2' o 3' es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, por ejemplo, metoxi, etoxi, aliloxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi y fenoxi, azido, amino o alquilamino, fluoro, cloro y bromo.
[0137] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ polinucleótido diana” se refiere a una secuencia de polinucleótido que se quiere detectar. El polinucleótido diana se puede obtener de cualquier fuente y puede comprender cualquier número de componentes de composición diferentes. Por ejemplo, la diana puede ser un ácido nucleico (p. ej.,<a>D<n>o ARN), ARN de transferencia (ARNt), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN) u otro ARN pequeño maduro, y puede comprender análogos de ácido nucleico u otras moléculas miméticas de ácidos nucleicos. El objetivo puede estar metilado, no metilado o ambos. El objetivo pueden ser citosinas tratadas con bisulfito y no metiladas convertidas en uracilo. Además, se apreciará que “polinucleótido diana” se puede referir al propio polinucleótido diana, así como a sus sustitutos, por ejemplo, productos de amplificación y secuencias naturales. En ciertas realizaciones, el polinucleótido diana es una molécula de miARN. En ciertas realizaciones, el polinucleótido diana carece de una cola de poli-A. En ciertas realizaciones, el polinucleótido diana es una molécula de ARN pequeño maduro. Los polinucleótidos diana de las presentes enseñanzas pueden derivar de cualquiera de una variedad de fuentes, que incluyen, sin limitación virus, arqueas, protistas, procariotas y eucariotas, por ejemplo, pero sin limitarse a, plantas, hongos y animales. Estas fuentes pueden incluir, pero no están limitadas a, sangre completa, una biopsia de tejido, linfa, médula ósea, líquido amniótico, cabello, piel, semen, agentes de guerra biológica, secreciones anales, secreciones vaginales, transpiración, saliva, hisopos bucales, diferentes muestras ambientales (por ejemplo, agrícola, agua y suelo), muestras de investigación en general, muestras purificadas en general, células cultivadas y células lisadas. Se apreciará que los polinucleótidos diana pueden aislarse de las muestras utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, la Applied Biosystems ABI Prism® 6100 Nucleic<Acid PrepStation (Life Technologies, Foster City, CA) y la a>B<i Prism® 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Life>Technologies, Foster City, CA), el kit de aislamiento de ARN Ambion® mirVana™ (Life Technologies, Austin, TX) y similares. Se apreciará que los polinucleótidos diana se pueden partir o cortar antes del análisis, incluyendo el uso de procedimientos tales como fuerza mecánica, ultrasonidos, escisión con endonucleasa de restricción o cualquier método conocido en la técnica. En general, los polinucleótidos diana de las presentes enseñanzas serán monocatenarios, aunque en algunas realizaciones el polinucleótido diana puede ser bicatenario, y puede resultar de la desnaturalización una cadena simple.
[0139] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ARN pequeño maduro” se refiere a una molécula de ARN pequeña que generalmente comprende aproximadamente 20-30 nucleótidos que ha sido procesada a partir de un precursor de ARN más grande. Típicamente, un ARN pequeño maduro tiene un grupo fosfato terminal 5' y un grupo hidroxilo terminal 3'. Se pueden detectar varios tipos diferentes de moléculas de ARN pequeño mediante los métodos proporcionados en la presente memoria. Ejemplos de ARN pequeños maduros que pueden detectarse incluyen, entre otros, microARN (miARN), ARN de interferencia corto (siRNA), ARN de horquilla corto (o pequeño) (shRNA), ARNi asociado a repeticiones (rasiRNA), ARNi transaccional (tasiRNA), ARN que interactúa con Piwi (piRNA) y ARN 21U. El ARN pequeño puede ser codificado en el genoma o se puede originar a partir de una molécula de ARN bicatenario exógeno. La longitud del ARN pequeño maduro que se puede detectar por los métodos descritos en la presente memoria puede variar. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro puede variar de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el ARN pequeño maduro puede variar de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, el ARN pequeño maduro puede tener aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 nucleótidos de longitud.
[0141] La cantidad de ARN maduro pequeño en la muestra añadida a la reacción de ligadura o a la reacción de poliadenilación puede variar dependiendo de la fuente de la muestra que contiene ARN. En general, se puede utilizar cualquier cantidad de ARN maduro pequeño que se pueda ligar a un adaptador de ligadura en una etapa de ligadura y se puede utilizar cualquier cantidad de ARN maduro pequeño que se pueda poliadenilar en la etapa de poliadenilación. Típicamente, la cantidad de ARN maduro pequeño purificado utilizado por volumen de reacción será menor que la cantidad de ARN total utilizado por volumen de reacción. En ciertos casos, la cantidad de ARN total varía de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 20 pg. En ciertos casos, la cantidad de ARN total oscila entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 2,5 ng.
[0143] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ adaptador” y “adaptador de ligadura” son equivalentes y se utilizan indistintamente y se refieren a un oligonucleótido que se une al extremo 5' del ARN pequeño maduro (es decir, un adaptador de ligadura de 5’) o al extremo 3' del ARN pequeño maduro o del ADNc del mismo (es decir, un adaptador de ligadura 3'). Los nucleótidos del adaptador de ligadura de 5’ y del adaptador de ligadura 3' pueden ser estándar o naturales (es decir, adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina), así como nucleótidos no estándar. Ejemplos no limitantes de nucleótidos no convencionales incluyen inosina, xantosina, isoguanosina, isocitidina, diaminopirimidina y desoxiuridina. Los adaptadores de ligadura pueden comprender nucleótidos modificados o derivatizados. Los ejemplos no limitantes de modificaciones en los restos ribosa o base incluyen la adición o eliminación de grupos acetilo, grupos amino, grupos carboxilo, grupos carboximetilo, grupos hidroxilo, grupos metilo, grupos fosforilo y grupos tiol.<En particular, se incluyen 2'-O-metilo y nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (Locked Nucleic Acids, l>NA).<Los>ejemplos adecuados de nucleótidos derivatizados incluyen aquellos con colorantes unidos covalentemente, tales como colorantes fluorescentes o colorantes de atenuación, u otras moléculas tales como biotina, digoxigenina, o partículas magnéticas o microesferas. Los adaptadores de ligadura también pueden comprender análogos de nucleótidos sintéticos tales como morfolinos o ácidos nucleicos peptídicos(Peptide Nucleic Acids,PNA). Los enlaces fosfodiéster o los enlaces fosfotioato pueden unir los nucleótidos o análogos de nucleótidos de los conectores.
[0145] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ y el adaptador de ligadura 3' son oligonucleótidos lineales (véase la Figura 3). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ comprende una región complementaria de férula de ligadura 5’ en la región terminal 3' que es complementaria de la región 3' de la férula de ligadura 5’, y un sitio de unión del cebador directo universal ubicado en la dirección 5' de la región complementaria de la férula de ligadura 5’. El sitio de unión del cebador directo universal en el adaptador de ligadura de 5’ es complementario al cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' comprende un grupo de bloqueo en el extremo 3', una región complementaria de férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’ y un sitio de unión del cebador de RT/inverso universal situado en la dirección 3' de la región complementaria de la férula de ligadura 3’. El sitio de unión del cebador de RT/inverso universal es complementario del cebador de RT/inverso universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ es un oligonucleótido de ARN y el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido de ADN.
[0147] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es para ligar al extremo 3' del ADNc y comprende una región complementaria de la férula de ligadura 3’ en la región terminal 5' que es complementaria de la porción 5' de la férula de ligadura 3’, y un sitio de unión del cebador directo universal situado en la región terminal 3'. El sitio de unión del cebador directo universal es complementario del cebador directo universal. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' comprende además un grupo de bloqueo en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' es un oligonucleótido de ADN.
[0149] La longitud de los adaptadores de ligadura 5' y 3' variará dependiendo, por ejemplo, de la longitud deseada del producto de ligadura y las características deseadas de los conectores. En general, el adaptador de ligadura de 5’ puede variar de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ puede tener aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En general, el adaptador de ligadura 3' puede variar de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura 3' puede tener aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la Tm de los adaptadores de ligadura varía de aproximadamente 30 0C a aproximadamente 60 0C, más preferiblemente de aproximadamente 33 0C a aproximadamente 55 0C.
[0151] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de 5’ y el adaptador de ligadura 3' contienen una estructura de horquilla (en la presente memoria denominados “adaptadores de ligadura de horquilla 5' o 3'” ), en donde el adaptador de ligadura de horquilla 5' comprende un segmento saliente monocatenario 5', un tallo y un bucle, en donde el extremo 3' de la porción de tallo está ligado al extremo 5' del ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 5' comprende de 3 a 6 bases de nucleótidos degenerados que se hibridan con la región terminal 5' del ARN pequeño maduro y que sirve como una férula de ligadura (véase la Figura 4). En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende un segmento saliente monocatenario 3', un tallo y un bucle, en donde el extremo 5' de la porción del tallo está ligado al extremo 3' del ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 3' comprende de 3 a 6 bases de nucleótidos degenerados que se hibridan/se reasocian con la región terminal 3' del ARN pequeño maduro y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, los adaptadores de ligadura de horquilla tanto 5' como 3' son oligonucleótidos híbridos de ADN-ARN. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' es un oligonucleótido de ADN. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador directo universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 5'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador de RT/inverso universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'.
[0153] En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' comprende un segmento saliente monocatenario 3', un tallo y un bucle, en donde el extremo 5' de la porción de tallo está ligado al extremo 3' del ADNc de un ARN pequeño maduro y el segmento saliente monocatenario 3' comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 bases de nucleótidos que se hibridan con la región terminal 3' del ADNc y que sirve como una férula de ligadura. En ciertas realizaciones, el segmento saliente monocatenario 3' comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 bases degeneradas. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' es un oligonucleótido híbrido de ADN-ARN. En ciertas realizaciones, el adaptador de ligadura de horquilla 3' es un oligonucleótido de ADN. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador universal está ubicado en la porción de tallo del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador universal está ubicado en la porción de bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'. En ciertas realizaciones, el sitio de unión del cebador universal está ubicado en las porciones de tallo y bucle del adaptador de ligadura de horquilla 3'.
[0155] Como se utiliza en la presente memoria, el término “tallo” se refiere a la región bicatenaria del adaptador de ligadura de horquilla que se encuentra entre el segmento saliente degenerado 3' (en el caso del adaptador de ligadura de horquilla 3') o el segmento saliente degenerado 5' (en el caso del adaptador de ligadura de horquilla 5') y el bucle. Generalmente, el tallo tiene entre aproximadamente 10 nucleótidos y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, más preferiblemente el tallo tiene entre 12 y aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el tallo tiene aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud. Como cuestión general, en aquellas realizaciones en las que una porción del cebador universal es codificada en el tallo, el tallo puede ser más largo. En aquellas realizaciones en las que una porción del cebador universal no es codificada en el tallo, el tallo puede ser más corto. Los expertos en la técnica apreciarán que los tallos más cortos que aproximadamente 10 nucleótidos y más largos que aproximadamente 20 nucleótidos se pueden identificar en el curso de la metodología de rutina y sin experimentación indebida, de modo que las enseñanzas presentes contemplan tallos más cortos y más largos.
[0156] Como se utiliza en la presente memoria, el término “bucle” se refiere a la región monocatenaria del adaptador de ligadura de horquilla que se encuentra entre las dos cadenas complementarias del tallo y típicamente el bucle comprende nucleótidos monocatenarios, aunque también son posibles otros restos tales como ADN o ARN modificado, espaciadores de carbono tales como C18 y/o polietilenglicol (PEG). Generalmente, el bucle tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, más preferiblemente el bucle tiene entre 17 nucleótidos y 19 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el bucle tiene aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud. Como cuestión general, en aquellas realizaciones en las que un cebador universal es codificado en el bucle, el bucle en general puede ser más largo. En aquellas realizaciones en las que un cebador universal no es codificado en el bucle, el bucle en general puede ser más corto. Los expertos en la técnica apreciarán que los bucles más cortos de aproximadamente 10 nucleótidos y más largos de aproximadamente 20 nucleótidos se pueden identificar en el curso de la metodología de rutina sin experimentación indebida y que las presentes enseñanzas contemplan bucles más cortos y más largos.
[0158] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ producto de ligadura” se refiere a una molécula híbrida comprendiendo al menos un adaptador de ligadura y un ARN pequeño maduro o una molécula híbrida comprendiendo al menos un adaptador de ligadura y un ADNc.
[0160] En ciertas realizaciones, la ligadura del ARN pequeño maduro se realiza en presencia de férulas de ligadura semidegeneradas 5' y 3' (véase la Figura 3). La férula de ligadura 5’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 5' que contiene bases de nucleótidos degeneradas que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 5' del ARN pequeño maduro y una región 3' que se hibrida con el extremo 3' del adaptador de ligadura de 5’. La férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene bases de nucleótidos degeneradas que varían de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos que se hibridan con el extremo 3' del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'. La porción no degenerada de la férula de ligadura 5’ puede ser un complemento exacto o puede ser un complemento casi exacto de la secuencia del adaptador de ligadura de 5’. La porción no degenerada de la férula de ligadura 3’ puede ser un complemento exacto o puede ser un complemento casi exacto de la secuencia del adaptador de ligadura 3'. Dado que las férulas de ligadura hibridan con los adaptadores de ligadura y el ARN pequeño maduro, abarcan las uniones de ligadura de tal modo que para la férula de ligadura 5’, el extremo 3' del adaptador de ligadura de 5’ se lleva cerca del extremo 5' del ARN pequeño maduro y para la férula de ligadura 3’, el extremo 5' del conector de ligadura 3' se lleva cerca del extremo 3' del ARN pequeño maduro.
[0161] En ciertos ejemplos que no se reivindican en esta patente, la ligadura del ADNc de un ARN pequeño maduro se realiza en presencia de una férula de ligadura 3’ (véase la Figura 2). La férula de ligadura 3’ comprende dos regiones distintas: una región terminal 3' que contiene bases de nucleótidos, que varían por ejemplo de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos, que se hibridan con el extremo 3' del ADNc y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligadura 3'. En algunas realizaciones, la férula de ligadura 3’ es semidegenerada y la región terminal 3' contiene bases de nucleótidos degeneradas, que varían, por ejemplo, de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos, que se hibridan con el extremo 3' del ADNc. Dado que la férula de ligadura hibrida con el adaptador de ligadura y el ADNc, abarca la unión de la ligadura de modo que el extremo 5' del conector de ligadura 3' se lleva cerca del extremo 3' del ADNc.
[0163] En general, las férulas de ligadura pueden variar de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 19 nucleótidos de longitud, siendo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 nucleótidos degenerados con el fin de interaccionar con una variedad de moléculas de ARN pequeñas maduras o sus moléculas de ADNc y el resto de los nucleótidos son complementarios de la porción 3' del adaptador de ligadura de 5’ o de la porción 5' del adaptador de ligadura 3'. Un experto en la técnica apreciará que la férula de ligadura puede ser más larga de 20 nucleótidos o más corta de aproximadamente 10 nucleótidos, siempre que hibride con el adaptador de ligadura de 5’ o 3'.
[0165] En ciertas realizaciones, la férula de ligadura puede ser un oligonucleótido de ARN. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura puede ser un oligonucleótido de ADN/ARN quimérico. En ciertas realizaciones, la férula de ligadura puede ser un oligonucleótido de ADN. En una realización preferida, la férula de ligadura 5’ es un oligonucleótido de ADN y la férula de ligadura 3’ es un oligonucleótido de ADN. En otra realización más, la férula de ligadura es un oligonucleótido de ADN comprendiendo al menos un agente de bloqueo de tal modo que la plantilla de ligadura no puede servir como cebador para la amplificación por PCR o como sustrato para la ligadura no específica (o falsa). Los ejemplos no limitantes de grupos de bloqueo incluyen didesoxinucleótidos, grupos amina, grupos metilo, grupos fosfato o espaciadores de carbono. Los grupos de bloqueo preferidos incluyen 2'-O-metilo y fosfotioato. Las férulas de ligadura 5' y 3' pueden comprender nucleótidos o análogos de nucleótidos estándar, no estándar, modificados o derivatizados como se ha descrito antes en la presente memoria. Los enlaces fosfodiéster o los enlaces fosfotioato pueden unir los nucleótidos de las férulas de ligadura.
[0167] Las secuencias del adaptador de ligadura universal facilitan la síntesis de ADNc en la transcripción inversa y/o la preamplificación del ADNc en la PCR utilizando cebadores universales. Para impulsar la ligadura de los adaptadores de ligadura al miARN, se utiliza una cantidad excesiva de adaptadores de ligadura; por lo tanto, la ligadura entre los dos conectores de ligadura se puede producir como un subproducto de fondo no específico en los métodos descritos en la presente memoria. En otras realizaciones, la ligadura entre cebadores de transcripción inversa universales libres (no reasociados) y adaptadores de ligadura 3' se puede producir como un subproducto durante la etapa de ligadura en los métodos proporcionados, dichos subproductos conducen a un fondo no específico durante la detección. Este fondo compromete la detección de transcripciones poco abundantes tanto en qPCR como en el análisis de secuenciación de nueva generación(Next Generation Sequencing,NGS) y detección. Para reducir el fondo, se desarrollaron oligonucleótidos de bloqueo para suprimir selectivamente la amplificación y/o ligadura del subproducto adaptador-adaptador o subproducto adaptador-cebador. Los oligonucleótidos de ADN marcados en el extremo 5' o 3' con grupos de bloqueo, tales como acridina, MGB, 2'-O-metilo, bloqueadores restrictivos de la amplificación dirigida por secuencia (Sequence-Targeted Amplification Restrictive,STAR) y oligonucleótidos de bloqueo comprendiendo una secuencia de poli(A), se pueden utilizar en las etapas de ligadura, extensión y/o amplificación. Se encontró que la adición de dicho oligonucleótido de bloqueo reduce drásticamente la amplificación de fondo y aumenta la sensibilidad de la detección de miARN por qPCR con los ensayos de qPCR de TaqMan® (véase el Ejemplo 4).
[0169] Un oligonucleótido bloqueador STAR comprende una secuencia de marcador STAR en el extremo 5' del oligonucleótido, siendo la secuencia del marcador STAR complementaria a toda o una porción de otra secuencia de cebador que se utiliza en la reacción de amplificación (véase la Figura 15). Cuando se extiende el cebador bloqueador STAR, el producto de extensión comprende tanto la secuencia de marcador STAR en el extremo 5' como el complemento de la secuencia de marcador STAR en la región 3' del producto de extensión. Por lo tanto, el producto de extensión del cebador STAR puede volver a plegarse para autoreasociarse formando de este modo una estructura de horquilla. La estructura de horquilla del cebador STAR extendido excluye la unión del otro cebador utilizado para amplificar la molécula objetivo, inhibiendo de este modo la amplificación del objetivo no deseado (por ejemplo, un producto de ligadura adaptador-adaptador). En ciertas realizaciones, la secuencia del marcador STAR puede comprender una porción de la secuencia interna del amplicón para bloquear la reasociación de otro cebador o la extensión de una ADN polimerasa. Los cebadores STAR se pueden utilizar para la supresión de amplificación selectiva de adaptadores de ligadura ligados en la preamplificación del ARN maduro pequeño o ADNc ligado al adaptador en los métodos proporcionados.
[0171] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo comprende una porción de poli(A) y está presente durante la reacción de ligadura. En los métodos en los que se realiza la transcripción inversa de un ARN pequeño maduro poliadenilado utilizando un cebador universal de transcripción inversa para generar un ADNc y un adaptador de ligadura se liga al extremo 3' del ADNc, la inclusión de un oligonucleótido de bloqueo durante la reacción de ligadura puede suprimir selectivamente la formación del subproducto de adaptador-cebador de RT universal. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido de bloqueo tiene una estructura de horquilla y un poli(A) que contiene una porción de segmento saliente monocatenario en su extremo 3' (véase la Figura 15 D). En otras realizaciones, el oligonucleótido de bloqueo es un oligonucleótido lineal y tiene una porción de poli(A) en su extremo 5' y secuencias complementarias al cebador de transcripción inversa universal en su extremo 3'. En ciertas realizaciones, la porción no poli(A) del oligonucleótido de bloqueo comprende desoxiuridina. La hibridación de dicho oligonucleótido de bloqueo con un cebador de RT universal libre (no reasociado, no extendido) evita que la férula de ligadura hibride con el cebador y facilita la ligadura del adaptador de ligadura, suprimiendo de este modo la formación no deseada del subproducto de adaptador-cebador de RT universal. En ciertas realizaciones, la Tm del cebador de RT y bloqueadores comprendiendo una porción de poli(A) varía de aproximadamente 30 0C a aproximadamente 60 0C, de aproximadamente 35 0C a aproximadamente 50 0C, o de aproximadamente 38 0C a aproximadamente 42 0C.
[0173] Un “grupo de bloqueo” es un resto químico que se puede añadir a un nucleótido o un ácido nucleico para prevenir o minimizar la adición de nucleótidos por una ADN polimerasa. Al añadir un grupo de bloqueo al 3'-OH terminal, el nucleótido ya no puede participar en la formación de enlaces fosfodiéster catalizados por la ADN polimerasa. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, un grupo alquilo, conectores no nucleótidos, fosforotioato, restos alcano-diol, PNA, LNA, análogos de nucleótidos comprendiendo un grupo 3'-amino en lugar del grupo 3'-OH, análogos de nucleótidos comprendiendo un grupo 5'-OH en lugar del grupo 5'-fosfato, derivados de nucleótidos que carecen de un grupo 3'-OH, biotina, intercaladores de ácido nucleico, acridina y ligandos de surco menor. Un grupo de bloqueo de alquilo es un hidrocarburo saturado que puede ser de cadena lineal, ramificada, cíclica o combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos no limitantes de nucleótidos no extensibles incluyen nucleótidos que tienen un grupo 3'-hidroxilo que se ha modificado, tal como por sustitución con hidrógeno o flúor o por formación de un éster, amida, sulfato o glucósido. Estos nucleótidos en general no son extensibles en cadena. Otros ejemplos de nucleótidos no extensibles que se pueden utilizar incluyen nucleótidos que tienen restos de ribosa modificados. En ciertas realizaciones, los ribonucleótidos pueden servir como nucleótidos no extensibles porque los oligonucleótidos que terminan en ribonucleótidos no pueden ser extendidos por ciertas ADN polimerasas. La ribosa se puede modificar para incluir derivados 3'-desoxi que incluyen aquellos en los que el 3'-hidroxi se reemplaza por un grupo funcional distinto del hidrógeno, por ejemplo, como un grupo azida. En ciertas realizaciones, un nucleótido no extensible comprende un didesoxinucleótido (ddN), por ejemplo, pero no limitado a una didesoxiadenosina (ddA), una didesoxicitosina (ddC), una didesoxiguanosina (ddG), una didesoxitimidina (ddT) o una didesoxuridina (ddU). En una realización preferida, el grupo de bloqueo se selecciona del grupo que consiste en un ligando del surco menor, un grupo 2'-O-metilo, una biotina, una acridina y un grupo fosfotioato.
[0175] La ligadura de los adaptadores de ligadura al ARN pequeño maduro o su ADNc es catalizada por una ligasa, por ejemplo, una ADN ligasa dependiente de plantilla. Las ligasas ilustrativas utilizadas en los métodos, kits y composiciones proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a ADN ligasa T4, ADN ligasa Tfi, ADN ligasa I, ADN ligasa II, ADN ligasa III, ADN ligasa IV y a Dn ligasas de huella pequeña. En una realización preferida, se utiliza ADN ligasa T4.
[0176] Las condiciones de la reacción de ligadura se ajustan típicamente para que la ligasa funcione cerca de su nivel de actividad óptimo. Se puede utilizar un agente de tamponamiento para ajustar y mantener el pH al nivel deseado. Ejemplos representativos de tampones adecuados incluyen, pero no se limitan a tampón de MOPS, HEPES, TAPS, Bicina, Tricina, TES, PIPES, MES, acetato de sodio y Tris.
[0178] La mezcla de ligadura puede comprender además un catión divalente. Los cationes divalentes adecuados incluyen, pero no se limitan a calcio, magnesio y manganeso. La mezcla de reacción puede comprender además un agente reductor. Ejemplos no limitantes incluyen ditiotreitol y p-mercaptoetanol. También se puede añadir un inhibidor de ribonucleasa (RNasa) a la mezcla de ligadura. La mezcla de ligadura puede comprender además ATP.
[0180] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ reacción de extensión” se refiere a una reacción de alargamiento en la que el adaptador de ligadura 3' ligado al extremo 3' del ARN pequeño maduro se extiende para formar un “ producto de reacción de extensión” comprendiendo una cadena complementaria del polinucleótido diana. Tal como se utiliza en la presente memoria, la reacción de extensión también se denomina “transcripción inversa” . En algunos casos, la reacción de alargamiento comprende extender la porción poliadenilada del extremo 3' del ARN pequeño maduro. En algunas realizaciones, el polinucleótido diana es una molécula de miARN y la reacción de extensión es una reacción de transcripción inversa comprendiendo una transcriptasa inversa, mediante la cual se hace una copia de ADN del producto de ligadura. En ciertas realizaciones, la reacción de extensión es una reacción de transcripción inversa comprendiendo una polimerasa, tal como una transcriptasa inversa.
[0182] Las transcriptasas inversas incluyen cualquier enzima que tenga actividad de transcriptasa inversa. Dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a, la transcriptasa inversa retroviral (por ejemplo, las transcriptasas inversas del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV), del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o del virus del sarcoma de Rous (RSV)), Superscript I®, Superscript II® Superscript III®, transcriptasa inversa de retrotransposón, transcriptasa inversa de la hepatitis B, transcriptasa inversa del virus del mosaico de la coliflor, transcriptasa inversa bacteriana, ADN polimerasa Tth, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa Tne, ADN polimerasa Tma y mutantes, variantes o derivados de las mismas.
[0184] En una realización, las transcriptasas inversas incluyen aquellas que tienen actividad de RNasa H reducida, sustancialmente reducida o eliminada. Por enzima con “ actividad de RNasa H sustancialmente reducida” se entiende que la enzima tiene menos de aproximadamente 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 2 % de la actividad de la ARNasa H de la correspondiente RNasa de tipo natural o H+, tales como las transcriptasas inversas del virus de la leucemia murina Moloney de tipo natural (M-MLV), virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o el virus del sarcoma de Rous (RSV). La actividad de RNasa H de cualquier enzima se puede determinar por una variedad de ensayos, tales como los descritos, por ejemplo, en la patente US-5,244,797, en Kotewicz, M.L., y col, Nucl. Acids Res. 16:265(1988) y en Gerard, G. F., y col., FOCUS 14:91 (1992). Polipéptidos adecuados para utilizar en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, transcriptasa inversa H de M-MLV, transcriptasa inversa H de RSV, transcriptasa inversa H de AMV, transcriptasa inversa H de RAV (virus asociado a Rous), transcriptasa inversa H de MAV (virus asociado a mieloblastosis), transcriptasa inversa H de HIV y Superscript III®, y mutantes, variantes o derivados de los mismos. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que cualquier enzima capaz de producir una molécula de ADN a partir de una molécula de ácido ribonucleico (es decir, que tiene actividad de transcriptasa inversa) se puede utilizar de manera equivalente en las composiciones, métodos y kits descritos en la presente memoria.
[0186] Las enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa y/o polimerasa pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo de Life Technologies Corp. (Carlsbad, CA), Perkin-Elmer (Branchburg, NJ), New England BioLabs (Beverly, MA) o Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN). Alternativamente, las polimerasas o las transcriptasas inversas que tienen actividad de polimerasa se pueden aislar de sus fuentes virales o bacterianas naturales según procedimientos convencionales para aislar y purificar proteínas naturales que son bien conocidos por un experto en la técnica (véase, p. ej., Houts, G.E. Y col., J. Virol. 29: 517 (1979)). 29:517 (1979)). Además, dichas polimerasas y/o transcriptasas inversas se pueden preparar mediante técnicas de ADN recombinante rutinarias bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Kotewicz, M.L., y col., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Patente US-<5,244,797; Publicación de solicitud de patente>US-W<o 98/47912; Soltis, D. A., y Skalka, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci.>USA 85:3372-3376 (1988)).
[0188] En algunas realizaciones, los dúplex de ácido nucleico recién formados no se desnaturalizan inicialmente, sino que se utilizan en su forma bicatenaria en una o más etapas posteriores. Una reacción de extensión es una técnica de amplificación comprendiendo alargar un producto de ligadura que se reasocia con una plantilla en la dirección de 5' a 3' utilizando un medio de amplificación tal como una polimerasa y/o transcriptasa inversa (y un cebador de RT/inverso universal). Según algunas realizaciones, con tampones, sales, pH, temperatura y trifosfatos de nucleótidos adecuados, incluyendo análogos de los mismos, es decir, en condiciones adecuadas, una polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a la cadena plantilla que comienza en el extremo 3' de un producto de ligadura reasociado, para generar una cadena complementaria. En algunas realizaciones, la polimerasa utilizada para la extensión carece o carece sustancialmente de actividad de exonucleasa 5'. En algunas realizaciones de las presentes enseñanzas, se pueden introducir bases de nucleótidos no convencionales en los productos de reacción de amplificación y los productos tratados por enzimas (p. ej., glicosilasas) y/o medios fisicoquímicos con el fin de hacer que el producto sea incapaz de actuar como plantilla para amplificaciones posteriores. En algunas realizaciones, se puede incluir uracilo como una nucleobase en la mezcla de reacción, lo que permite reacciones posteriores para descontaminar el arrastre de productos previos que contienen uracilo mediante el uso de uracil-N-glicosilasa (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud PCT N° WO 92/01814A2). En algunas realizaciones de las presentes enseñanzas, se puede emplear cualquiera de una variedad de técnicas antes de la amplificación para facilitar el éxito de la amplificación, como se describe, por ejemplo, en Radstrom y col., Mol Biotechnol. 26:133-46 (2004). En algunas realizaciones, la amplificación se puede lograr en un enfoque integrado independiente comprendiendo la preparación y detección de muestras, como se describe, por ejemplo, en las patentes US-6,153,425 y US-6,649,378. Las enzimas modificadas de forma reversible, por ejemplo, pero sin limitarse a las descritas en la patente US-5,773,258, también están dentro del alcance de las enseñanzas descritas. Las presentes enseñanzas también contemplan diferentes estrategias de descontaminación basadas en uracilo, en donde, por ejemplo, el uracilo se puede incorporar en una reacción de amplificación, y los productos de arrastre subsiguientes se pueden eliminar con diversos tratamientos con glicosilasa (véase, por ejemplo, la patente US-5,536,649). Los expertos en la técnica entenderán que se puede utilizar cualquier proteína con la actividad enzimática deseada en los métodos y kits descritos.
[0190] En ciertas realizaciones, el polinucleótido diana es un miARN u otra molécula de ARN pequeño maduro y, como tal, se apreciará que el uso de polimerasas que también comprenden propiedades de transcripción inversa puede permitir que algunas realizaciones de las presentes enseñanzas comprendan una primera reacción de transcripción inversa seguida a continuación de una reacción de amplificación, permitiendo de este modo la consolidación de dos reacciones en esencialmente una reacción única. En ciertas realizaciones, está contemplada además por las presentes enseñanzas la consolidación de la reacción de extensión y la posterior reacción de amplificación.
[0192] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “porción de cebador universal” se refiere a una región de un adaptador de ligadura o un cebador de transcripción inversa (RT) universal que puede servir directamente, o en virtud de su complemento, como la plantilla sobre la cual un cebador universal puede hibridar para cualquiera de una variedad de reacciones de extensión de nucleótidos cebadores conocidas en la técnica (por ejemplo, PCR o RT-PCR). Los expertos en la técnica apreciarán que cuando dos porciones de cebador están presentes en un único polinucleótido, la orientación de las dos porciones de cebador en general es diferente. Por ejemplo, un cebador de PCR puede hibridar directamente con una primera porción de cebador, mientras que el otro cebador de PCR puede hibridar con el complemento de la segunda porción de cebador. Además, los cebadores “ universales” y las porciones de cebador como se utilizan en la presente memoria generalmente se eligen para que sean lo más únicos posibles dados los ensayos particulares y los genomas del hospedante para asegurar la especificidad del ensayo.
[0194] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cebador universal” se refiere a un cebador que se puede utilizar en una pluralidad de reacciones diferentes que consultan diferentes polinucleótidos diana e hibrida con la porción de cebador universal del adaptador de ligadura o cebador de RT universal. En general, la región del cebador universal que se hibrida con el adaptador de ligadura o cebador de RT tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la región que se hibrida con el adaptador de ligadura o cebador de RT tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica apreciarán que las longitudes de la porción del adaptador de ligadura o del cebador de RT del cebador universal pueden ser más cortas que aproximadamente 15 nucleótidos y más largas que aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y se pueden identificar en el curso de la metodología rutinaria y sin experimentación excesiva y que dichas porciones más largas o más cortas del adaptador de ligadura o cebador de RT del cebador universal están contempladas en las presentes enseñanzas. El cebador universal puede comprender nucleótidos estándar, no estándar, derivatizados y modificados como se describe en la presente memoria.
[0196] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cebador de transcripción inversa (RT) universal” se refiere a un cebador que se puede utilizar en una pluralidad de reacciones diferentes que consultan polinucleótidos diana diferentes. El cebador de RT universal comprende una porción de poli(T) y una porción de cola, en donde la porción de cola comprende una porción de cebador universal. Típicamente, la porción de poli(T) está en el extremo 3' del<cebador de>R<t universal. En ciertas realizaciones, la secuencia de poli(T) en el extremo 3' del cebador es seguida por>una base de nucleótidos adicional que no es una T. En general, el cebador de RT universal tiene entre 15 y 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el cebador de RT universal tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. El cebador de RT universal puede comprender nucleótidos estándar, no estándar, derivatizados y modificados como se ha descrito antes en la presente memoria.
[0198] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cebador directo universal” se refiere a un cebador que se puede utilizar en una pluralidad de reacciones diferentes que consultan polinucleótidos diana diferentes. Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cebador de RT/inverso universal” se refiere a un cebador que se puede utilizar en una pluralidad de reacciones diferentes que consultan polinucleótidos diana diferentes. Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cebador inverso universal” se refiere a un cebador que se puede utilizar en una pluralidad de reacciones diferentes que consultan polinucleótidos diana diferentes. En una amplificación por PCR típica, los cebadores directo e inverso se utilizan para dirigir y amplificar preferiblemente una secuencia de ADN de interés. Como se utiliza en los métodos proporcionados, un solo par de cebadores directo e inverso universales permite la amplificación de diferentes polinucleótidos diana, ya que los polinucleótidos diana se modifican para incluir porciones de cebador universal que sirven directamente, o en virtud de su complemento, como una plantilla sobre la cual puede hibridar un cebador directo o inverso universal.
[0200] En ciertas realizaciones, el cebador directo universal hibrida con la porción de cebador universal del adaptador de ligadura de 5’. En general, la región del cebador directo universal que se hibrida con el adaptador de ligadura de 5’ tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la región que se hibrida con el adaptador de ligadura de 5’ tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica apreciarán que las longitudes de la porción del adaptador de ligadura de 5’ del cebador directo universal pueden ser más cortas que aproximadamente 15 nucleótidos y más largas que aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y se pueden identificar en el curso de la metodología rutinaria y sin experimentación excesiva y que dichas porciones del adaptador de ligadura de 5’ más largas o más cortas o porciones de cebador directo universal están contempladas en las presentes enseñanzas. El cebador directo universal puede comprender nucleótidos estándar, no estándar, derivatizados y modificados como se ha descrito antes en la presente memoria.
[0202] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cebador de RT/inverso universal” se refiere a un cebador que se puede utilizar en una pluralidad de reacciones diferentes que consultan polinucleótidos diana diferentes. En algunas realizaciones, un cebador de RT/inverso universal hibrida con una porción del adaptador de ligadura 3' comprendiendo la porción de cebador universal del adaptador de ligadura 3'. Después de la reacción de extensión, el cebador directo universal se puede extender para formar un segundo producto de cadena. El cebador universal de RT/inverso puede hibridar con esta segunda cadena y se puede extender para continuar la reacción de amplificación. En general, el cebador de RT/inverso universal tiene entre aproximadamente 15 y 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el cebador de RT/inverso universal tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. El cebador de RT/inverso universal puede comprender nucleótidos estándar, no estándar, derivatizados y modificados como se ha descrito antes en la presente memoria.
[0204] La expresión “ secuencia arriba” como se utiliza en la presente memoria adquiere su significado habitual en biología molecular, y se refiere a la ubicación de una región de un polinucleótido que está en el lado 5' de una región “secuencia abajo” . De forma correspondiente, la expresión “ secuencia abajo” se refiere a la ubicación de un polinucleótido que está en el lado 3' de una región “ secuencia arriba” .
[0206] En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen además ensayar el producto de ligadura comprendiendo el ARN pequeño maduro y los adaptadores de ligadura 5' y 3', de modo que se detecta el ARN pequeño maduro. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen además ensayar el producto de ligadura comprendiendo el ADNc del ARN pequeño maduro y el adaptador de ligadura 3', de modo que se detecta el ARN pequeño maduro. Los ensayos pueden ser cuantitativos, de modo que se pueda determinar la cantidad o copias del ARN pequeño maduro en una muestra. Alternativamente, los ensayos pueden ser cualitativos, de modo que se puede determinar en la muestra la presencia de un ARN pequeño maduro, pero su nivel no se puede medir. Además, los ensayos pueden ser tales que el ARN pequeño maduro o su ADNc se pueden aislar de la muestra para su posterior estudio.
[0208] En ciertas realizaciones, se puede utilizar un método de amplificación para ensayar el producto de ligadura. Ejemplos no limitantes de métodos de amplificación adecuados incluyen PCR cuantitativa en tiempo real, PCR cuantitativa de punto final y PCR estándar. En ciertas realizaciones, el ARN maduro pequeño se poliadenila y se realiza la transcripción inversa a una copia de ADN utilizando una transcriptasa inversa y un cebador de RT universal comprendiendo una porción de poli(T). Después de la transcripción inversa, se liga un adaptador de ligadura comprendiendo una porción de cebador universal al extremo 3' del ADNc, de modo que el producto de ligadura de ADNc se puede preamplificar y/o amplificar por métodos adecuados. La preamplificación del ADNc se puede lograr utilizando cebadores directos e inversos universales. Para ensayar el producto de ligadura de ADNc en ciertas realizaciones, el método de amplificación puede utilizar un cebador directo específico de ARN pequeño y un cebador inverso universal, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda universal (véase, por ejemplo, la Figura 2 en (A)). En ciertas realizaciones, el método de amplificación del ensayo puede utilizar cebadores directos e inversos universales, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda específica de ARN pequeño (véase, por ejemplo, la Figura 2 en (B). Los cebadores directos e inversos universales y los cebadores directos e inversos específicos de ARN pequeño pueden comprender nucleótidos estándar, no estándar, derivatizados y modificados como se ha detallado antes. Los cebadores directo e inverso pueden variar cada uno de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y en ciertas realizaciones, de aproximadamente 18 nucleótidos a aproximadamente 22 nucleótidos de longitud.
[0210] En otras realizaciones, para amplificar el producto de ligadura comprendiendo un ARN maduro pequeño, el producto de ligadura en general se convierte en una copia de ADN. En ciertas realizaciones, se puede sintetizar una copia de ADN del producto de ligadura durante la PCR utilizando un cebador de RT/inverso universal que se hibrida con el extremo 3' del producto de ligadura, de modo que una ADN polimerasa termoestable extiende el cebador utilizando el producto de ligadura como plantilla. El cebador de RT/inverso universal es complementario de la porción de cebador de RT/inverso universal del adaptador de ligadura 3'. El cebador de RT/inverso universal utilizado para generar una copia de ADN del producto de ligadura generalmente también se utilizará para amplificar el producto, junto con un cebador directo universal. En general, el cebador directo universal corresponde a una secuencia del adaptador de ligadura de 5’. Los cebadores tanto directos como inversos universales pueden comprender nucleótidos estándar, no estándar, derivatizados y modificados como se ha detallado antes. Los cebadores directos e inversos universales pueden variar cada uno de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 18 nucleótidos a aproximadamente 22 nucleótidos de longitud.
[0212] En ciertas realizaciones, se puede utilizar la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para ensayar el producto de ligadura. En este método, la cantidad de producto de PCR se sigue ciclo por ciclo en tiempo real. Para medir la cantidad de producto de PCR, la reacción se puede llevar a cabo en presencia de un colorante fluorescente cuya fluorescencia aumenta considerablemente cuando se une al ADN bicatenario. Ejemplos no limitativos de colorantes fluorescentes adecuados incluyen SYBR® Green I, PicoGreen® I, EvaGreen™, bromuro de etidio y naranja de acridina. La reacción también se puede llevar a cabo con una sonda indicadora fluorogénica que es específica para el ADN que se está amplificando. Ejemplos no limitantes de sondas indicadoras incluyen sondas TaqMan®, balizas moleculares y cebadores Scorpion®. Las sondas mencionadas antes dependen de la transferencia de energía de resonancia Forster(Forster Resonance Energy Transfer,FRET) para atenuar la señal de fluorescencia a través del acoplamiento de una molécula de colorante fluorogénico y un resto atenuador en el mismo o diferentes sustratos de oligonucleótidos. La señal de fluorescencia se genera cuando la molécula de colorante fluorogénico y el atenuador se desacoplan por medios enzimáticos o físicos. Los valores de fluorescencia generalmente se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El ciclo durante el cual la fluorescencia supera un valor umbral definido se define como el ciclo umbral (Ct). En general, la cantidad de materia de partida se puede calcular determinando el valor del Ct de la muestra y comparándolo con el valor del Ct de las muestras de control.
[0214] En ciertas realizaciones, también se puede utilizar la PCR cuantitativa de punto final para analizar el producto de ligadura. Este método es similar a la qPCR en cuando que la reacción en general se lleva a cabo en presencia de un colorante fluorescente o una sonda y/o cebador fluorogénico, pero la cantidad de producto de la PCR no se sigue ciclo por ciclo. En cambio, el producto de la PCR se analiza al final de la reacción resolviendo el producto amplificado por electroforesis en un chip de ADN, un gel de agarosa o un capilar, y después midiendo la fluorescencia del producto. La reacción típicamente incluye un control interno coamplificado o un ácido nucleico sintético coamplificado para la normalización de la muestra.
[0216] En ciertas realizaciones, también se puede utilizar un método de PCR estándar para ensayar el producto de ligadura. Los procedimientos de PCR estándar son bien conocidos en la técnica y la información sobre estos se puede encontrar en Ausubel y col. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, 1998; Ausubel y col, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY, 1990 o Sambrook y col. Molecular Protocols: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, NY, 2001.
[0218] Los términos “amplicón” y “producto de amplificación” como se utilizan en la presente memoria generalmente se refieren al producto de una reacción de amplificación. Un amplicón puede ser bicatenario o monocatenario, y puede incluir las cadenas componentes separadas obtenidas por desnaturalización de un producto de amplificación bicatenario. En ciertas realizaciones, el amplicón de un ciclo de amplificación puede servir como una plantilla en un ciclo de amplificación posterior.
[0220] Como se utiliza en la presente memoria, el término “amplificar” se refiere a cualquier medio por el cual se reproduce al menos una parte de un polinucleótido diana, sustituto de polinucleotídico diana o combinaciones de los mismos, típicamente de una manera dependiente de plantilla, que incluye, sin limitación, una amplia variedad de técnicas para amplificar secuencias de ácido nucleico, ya sea lineal o exponencialmente. Se puede utilizar cualquiera de varios métodos para amplificar el polinucleótido diana. Se puede utilizar cualquier medio in vitro para multiplicar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico. Estos incluyen lineal, logarítmico y/o cualquier otro método de amplificación. Métodos ilustrativos adicionales incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véanse, p. ej., las Patentes US-4,683,202; US-4,683,195; US-4,965,188; y/o US-5,035,996), procedimientos isotérmicos utilizando una o más ARN polimerasas (véase, p. ej., publicación PCT n.° WO 2006/081222), desplazamiento de cadena (véase, p. ej., Patente US-RE39007E), destrucción parcial de moléculas de cebador (véase, p. ej., publicación PCT n.° WO 2006/087574), reacción en cadena de la ligasa(Ligase Chain Reaction,LCR) [véase, p. ej., Wu, y col. Genomics 4:560-569 (1990) y Barany, y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991)], sistemas de replicasa de ARN Qp<(véase, p. ej., Publicación>PC<t N° WO 1994/016108), sistemas basados en transcripción de ARN (p. ej., TAS, 3SR),>amplificación por círculo rodante(Rolling Circle Amplification,RCA) [véase, p. ej., la Patente US-5,854,033; Publicación de Solicitud de Patente US-2004/265897; Lizardi y col. Nat. Genet. 19:225-232 (1998); y Banér, y col. Nucleic Acid Res. 26: 5073-5078 (1998)] y amplificación por desplazamiento de cadena(Strand Displacement Amplification,SDA) [Little, y col. Clin. Chem. 45:777-784 (1999)], entre otros. Muchos sistemas son adecuados para utilizar en la amplificación de ácidos nucleicos diana y están contemplados en la presente memoria como entendería un experto en la técnica.
[0221] En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados se pueden utilizar para detectar un ARN pequeño maduro raro en una muestra y/o distinguir un ARN pequeño de otros ARN pequeños similares o muy homólogos en la muestra. En ciertas realizaciones, los métodos para amplificar los ácidos nucleicos diana utilizan la activación por reacciones de polifosforolisis(Activation by PolyPhosphorolysis,APP) para proporcionar una amplificación muy específica del ARN maduro pequeño diana o su ADNc. La polifosforolisis se refiere a la eliminación de un nucleótido no extensible de un ácido nucleico (p. ej., un oligonucleótido) en presencia de uno o más agentes de polifosforilación y una enzima que presenta actividad de polifosforolización. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido activable por polifosforolisis (oligonucleótido APP) es un oligonucleótido específico diana con un didesoxinucleótido en el extremo 3'. El didesoxinucleótido terminal 3' inhibe la extensión directa por la polimerasa, pero se puede eliminar por polifosforolisis en presencia de un agente de polifosforilación y la cadena complementaria de la diana. En general, el didesoxinucleótido no se elimina si hay un apareamiento erróneo entre el oligonucleótido APP y su pareja de hibridación. Típicamente, el oligonucleótido APP está diseñado para tener un nucleótido que distingue una diana de otra, por ejemplo, un miARN de otro miARN, cerca del extremo 3'. La APP se puede utilizar para polimerizar y/o amplificar moléculas de ácido nucleico, que incluyen pero no se limitan a ácido ribonucleico (p. ej., ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (p. ej., ADN), o híbridos de los mismos. Reacciones de APP y sus usos se describen en la Pub. de Patente US-2012/0196329.
[0223] En algunas realizaciones que utilizan APP, el uno o más agentes de polifosforilación pueden estar representados por la Fórmula I:
[0226]
[0227] 0 )
[0229] en donde n es, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o más. En algunas realizaciones, el uno o más agentes de polifosforilación pueden estar representados por la Fórmula II:
[0232]
[0235] En algunas realizaciones que representan compuestos de Fórmula II, n y/o m pueden ser iguales o diferentes. Y n y/o m pueden ser, por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 con la condición de que n o m, pero no ambos, puedan ser 0. Por lo tanto, si n es 0, entonces m puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Si m es 0, entonces n puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, n y m son mayores o iguales que 1. En algunas realizaciones, n y m son ambos 1. En algunas realizaciones, la suma de n+m es mayor que o igual a 2 (p. ej., n > 1 y m >1, n > 2 y m > 0, n > 0 y m > 2). En algunas realizaciones, como donde (pero no limitado a) la suma de n+m es mayor o igual a 2, X puede ser, por ejemplo,
[0238]
[0241] En algunas realizaciones en donde el uno o más agentes de polifosforilación están representados por la Fórmula II, tal como donde (pero no limitado a) n o m = 0, X puede ser, por ejemplo,
[0244]
[0245] por ejemplo:
[0247]
[0249] En algunas realizaciones, el uno o más agentes de polifosforilación pueden ser:
[0251]
[0252]
[0255] y/o
[0258]
[0261] Cualquiera de los agentes de polifosforilación descritos en la presente memoria puede combinarse con cualquier otro agente de polifosforilación. En algunas realizaciones, el uno o más agentes de polifosforilación pueden ser pirofosfato(PyroPhosphate,PP<i>) en combinación con al menos uno o más de otros agentes de polifosforilación. Cualquiera de los uno o más agentes de polifosforilación se puede utilizar en forma de sal (p. ej., sodio). Típicamente, las reacciones de APP descritas en la presente memoria incluyen además uno o más biocatalizadores (p. ej., enzima(s)) que tienen actividad de polifosforolisis para generar uno o más trifosfatos de nucleósidos. Como se ha mostrado anteriormente, por ejemplo, el imidodifosfato(ImidoDiPPhosphate,IDP) une las fracciones de fosfato utilizando nitrógeno; compuestos de difosfato similares pueden sustituir el nitrógeno por azufre. En algunas realizaciones, un polifosfato puede ser cualquier éster fosfato que tenga dos o más restos fosfato. En algunas realizaciones, un polifosfato puede ser cualquier éster fosfato que tenga tres o más restos fosfato.
[0263] Un ejemplo de uno o más biocatalizadores que se pueden utilizar en APP es una ADN polimerasa que cataliza la polimerización de trifosfatos de nucleósidos y la polifosforolisis de dúplex de ADN en presencia de uno o más agentes de polifosforilación como se describe en la presente memoria. Las ADN polimerasas ilustrativas que tienen actividad de polifosforólisis incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasas termoestables Tfl, Taq y/o modificadas genéticamente (por ejemplo, AMPLITAQFS, THERMOSEQUENASE), aquellas que tienen la mutación del sitio activo F667Y o el equivalente de F667Y (por ejemplo, en Tth) que muestra una afinidad mejorada por el didesoxinucleótido como nucleótido entrante (por ejemplo, K<m>más pequeño para el ddNTP), RQ1 tal como se describe en la patente US-7,422,872 y sus mutantes (p. ej., RQY, donde 669 se sustituye por tirosina, que puede proporcionar la transcripción inversa y/o la secuenciación directa del ARN), THERMINATOR I (NEB), THERMINATOR II, THERMINATOR III y/o THERMINATOR GAMMA (todos disponibles en NEB), entre otros. Estas y otras ADN polimerasas potencialmente adecuadas pueden estar descritas, por ejemplo, en la Pub de EE. UU. 2008/0254525A1, Pub. de EE. UU.
[0264] 2007/0020622A1, Pub. de EE. UU. 2007/0009924A1, Pat. US-4,889,818, Pat. US-4,965,188, Pat. US-5,047,342, Pat. US-5,079,352, Pat. US-5,270,179, Pat. US-5,374,553, Pat. US-5,436,149, Pat. US-5,512,462, Pat. US-5,614,365, y/o Pat. US-6,228,628B1. Se ha encontrado que el uso de tales ADN polimerasas genéticamente modificadas puede mejorar la eficiencia de la APP.
[0266] La APP proporciona la extensión de oligonucleótidos mediante conversión de un oligonucleótido no extensible en un oligonucleótido extensible, extensión del oligonucleótido para producir una cadena de ácido nucleico deseada (p. ej., una copia complementaria de un ácido nucleico diana), y opcionalmente amplificación y detección de la cadena de nucleico deseado. Un nucleótido no extensible se refiere a un nucleótido, que tras la incorporación en un ácido nucleico evita una mayor extensión del ácido nucleico, p. ej., al menos por un biocatalizador (p. ej., enzima). Un nucleótido puede ser extensible mediante una enzima, pero no extensible mediante otra enzima. Un nucleótido no extensible para una enzima podría hacerse extensible o parcialmente extensible en diferentes condiciones. Un nucleótido extensible se puede referir a un nucleótido al que se puede añadir o unir covalentemente al menos otro nucleótido en una posición 3' del resto de azúcar del nucleótido extensible por un biocatalizador (p. ej., enzima) presente en la reacción. La extensión también puede comenzar desde 2'-OH de un nucleótido que puede tener o no un 3'-OH extensible. Extender un ácido nucleico se refiere a la adición o incorporación de uno o más nucleótidos a o en un ácido nucleico dado. Un oligonucleótido extendido es típicamente un oligonucleótido (p. ej., un ácido nucleico cebador) al que se han añadido o incorporado de otro modo uno o más nucleótidos adicionales (p. ej., unidos covalentemente). La APP se lleva a cabo normalmente mediante las etapas de: (a) hibridar con un ácido nucleico un primer oligonucleótido que tiene un extremo 3' no extensible (“ P*” ) que se puede eliminar mediante polifosforólisis(es decir,se puede activar); (b) eliminar ese extremo no extensible en 3' utilizando un agente polifosforolizante y un biocatalizador(es decir,una ADN polimerasa) que tiene actividad de polifosforólisis para producir un oligonucleótido desbloqueado; y (c) extender el oligonucleótido desbloqueado para producir una cadena de ácido nucleico deseada. También se pueden incluir etapas adicionales para detectar la cadena de ácido nucleico deseada como se describe a continuación.
[0268] El uno o más agentes de polifosforilación se pueden incluir en la mezcla de reacción a cualquier concentración adecuada. Por ejemplo, una concentración adecuada puede ser de aproximadamente 1-500 pM. Otros intervalos adecuados de concentraciones de agentes de polifosforilación pueden incluir, pero no se limitan a aproximadamente 1-10 pM, 10-20 pM, 20-30 pM, 30-40 pM, 40-50 pM, hasta 50 pM, 50-60 pM 60-70 pM, 70-80 pM, 90-100 pM, hasta 100 pM, 100-150 pM, 150-200 pM, hasta 200 pM, 200-250 pM, 250-300 pM, hasta 300 pM, 300-350 pM, 350-400 pM, hasta 400 pM, 400-450 pM, 450-500 pM. Adicionalmente, las concentraciones adecuadas de agente de polifosforilación incluyen, pero no se limitan a, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM, 35 pM, 40 pM, 45 pM, 50 pM, 55 pM, 60 pM, 65 pM, 70 pM, 75 pM, 80 pM, 85 pM, 90 pM, 95 pM, 100 pM, 125 pM, 150 pM, 175 pM, 200 pM, 225 pM, 250 pM, 275 pM, 300 pM, 325 pM, 350 pM, 375 pM, 400 pM, 425 pM, 450 pM, 475 pM y 500 pM. Las concentraciones particularmente adecuadas de agente(s) de polifosforilación pueden incluir, pero no se limitan a aproximadamente 25 pM, 40 pM, 50 pM y 100 pM, 150 pM, 200 pM y 250 pM. Otras concentraciones adecuadas de agente de polifosforilación también pueden ser adecuadas, como entendería un experto en la técnica, y también están contempladas como parte de esta descripción.
[0270] Los métodos que utilizan APP descritos en la presente memoria se pueden llevar a cabo en cualquiera de varias formas diferentes. En algunas realizaciones, el método comprende las siguientes etapas llevadas a cabo en serie:
[0271] (a) Reasociación de la cadena plantilla con un oligonucleótido activable complementario “ P*” . Este oligonucleótido activable tiene un nucleótido no extensible en su extremo 3'. No tiene nucleótidos en o cerca de su extremo 3' que se emparejen mal con los nucleótidos correspondientes en la cadena plantilla. Por lo tanto, el nucleótido terminal hibrida con la cadena plantilla cuando el oligonucleótido P* se reasocia.
[0273] (b) Polifosforilación del oligonucleótido activable reasociado P* con al menos un agente de polifosforilación descrito en la presente memoria y una enzima que tiene actividad de polifosforolisis. Esto activa el oligonucleótido P* por eliminación del nucleótido terminal hibridado.
[0275] (c) Polimerización extendiendo el oligonucleótido P* activado en la cadena plantilla en presencia de cuatro trifosfatos de nucleósidos y una polimerasa de ácido nucleico para sintetizar la cadena de ácido nucleico deseada.
[0277] El método APP también se puede utilizar para amplificar una cadena de ácido nucleico deseada, por ejemplo, añadiendo las siguientes etapas adicionales: (d) separar la cadena de ácido nucleico deseada de la etapa (c) de la cadena plantilla, y (e) repetir las etapas (a) - (d) hasta lograr un nivel deseado de amplificación de la cadena de ácido nucleico deseada. Las etapas (a) a (c) de la APP se pueden realizar secuencialmente como etapas de dos o más temperatura en un termociclador, o se pueden realizar como una etapa de una temperatura en un termociclador.
[0278] Como se ha descrito antes, la APP se puede utilizar para amplificar moléculas de ácido nucleico, que incluyen pero no se limitan a ácido ribonucleico (p. ej., ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (p. ej., ADN). Cuando se utiliza para amplificar el ADN, el oligonucleótido P* activable no extensible es típicamente un 2'-desoxioligonucleótido, el desoxinucleótido terminal puede ser un 2',3'-didesoxinucleótido, los cuatro trifosfatos de nucleósidos son trifosfatos de 2'-desoxinucleósidos y la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa. La ADN polimerasa utilizada en la etapa (c) también puede ser la enzima que tiene actividad de polifosforolisis utilizada en la etapa (b). La amplificación por APP puede ser lineal o exponencial. La amplificación lineal se obtiene cuando el oligonucleótido activable P* es el único oligonucleótido complementario utilizado. La amplificación exponencial se obtiene cuando está presente un segundo oligonucleótido que es complementario de la cadena de ácido nucleico deseada (p. ej., como en la PCR). El segundo oligonucleótido puede ser un oligonucleótido extensible o no extensible activable. El oligonucleótido activable P* y el segundo oligonucleótido flanquean la región que es el objetivo de la amplificación. En la etapa (a), el segundo oligonucleótido se reasocia con el producto de cadena de ácido nucleico deseado separado de la etapa (d). En la etapa (c), la polimerización extiende el segundo oligonucleótido en la cadena de ácido nucleico deseada para sintetizar una copia de la cadena plantilla de ácido nucleico. En la etapa (d), la cadena plantilla de ácido nucleico sintetizada se separa de la cadena de ácido nucleico deseada. Las etapas (a) a (d) se pueden repetir hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación exponencial.
[0280] En ciertas realizaciones, el método de APP se utiliza para la amplificación específica de miARN. La cadena plantilla de ácido nucleico es típicamente una cadena de ADNc homosentido o antisentido de una especie de miARN y está presente en mezcla con la cadena de ADNc correspondiente (homosentido o antisentido) de otras especies de miARN. El oligonucleótido P* activable (p. ej., no extensible) no tiene apareamientos erróneos cerca del extremo 3' de la secuencia de ADNc del miARN diana y tiene al menos un nucleótido en o cerca de su extremo 3' que no se empareja con el nucleótido correspondiente de especies de ADNc de miARN no diana. Debido al apareamiento erróneo, en la etapa (a) del método de APP, el nucleótido terminal no extensible del oligonucleótido P* no hibrida con el ADNc del miARN no diana. En la etapa (b), la polifosforolisis no elimina sustancialmente el nucleótido terminal o casi terminal no hibridado del oligonucleótido activable P* reasociado con el miARN no diana. Por lo tanto, en la etapa (c), el oligonucleótido P* no se extiende sustancialmente por polimerización en el ADNc de miARN no diana. Como resultado, la cadena de ácido nucleico deseada de ADNc del miARN diana sintetizada en la cadena plantilla se amplifica con preferencia frente a cualquier cadena de ácido nucleico sintetizada en el ADNc del miARN no diana. En una realización, el método de APP se utiliza para la amplificación exponencial de una especie de miARN específica (diana) en una mezcla que contiene una o más de otras especies de miARN (no diana). Después de la generación de un producto de ligadura de ADNc a partir de un miARN poliadenilado como se describe en la presente memoria o la generación de un producto de ligadura de miARN y posterior transcripción inversa para crear un ADNc, las cadenas de los ADNc se pueden separar para proporcionar ADN monocatenario, seguido de la serie etapas (a) - (e):
[0282] (a) Reasociación con las cadenas homosentido o antisentido del ADNc diana y no diana de un 2'-desoxioligonucleótido P* activable complementario que tiene un 2',3'-didesoxinucleótido no extensible en su extremo 3'. P* no tiene nucleótidos en o cerca de su extremo 3' que tengan apareamiento erróneo con los 2'-desoxinucleótidos correspondientes en el ADNc diana, pero tiene al menos un nucleótido en o cerca de su extremo 3' que tiene apareamiento erróneo con el 2'-desoxinucleótido correspondiente en el ADNc que no es diana. Por consiguiente, el 2',3'-didesoxinucleótido terminal hibrida con la cadena diana pero no con la cadena que no es diana cuando el oligonucleótido P* se reasocia. Simultáneamente, un segundo 2'-desoxioligonucleótido que es complementario de las cadenas antiparalelas de cada ADNc se reasocia con las cadenas antiparalelas. El 2'-desoxioligonucleótido P* activable y el segundo 2'-desoxioligonucleótido flanquean la región del ADNc que se va a amplificar.
[0284] (b) Polifosforilación de P* activable que está reasociado con una cadena de ADNc diana con al menos un agente de polifosforilación y una enzima que tiene actividad de polifosforolisis. Esto activa el P* que se reasocia con la cadena diana mediante la eliminación del 2',3'-didesoxinucleótido terminal hibridado. No activa sustancialmente el P* que está reasociado con la cadena de ADNc que no es diana porque la polifosporólisis no elimina sustancialmente el 2',3'-didesoxinucleótido terminal no hibridado.
[0286] (c) Polimerización extendiendo el oligonucleótido P* activado en la cadena diana en presencia de cuatro trifosfatos de nucleósidos y una ADN polimerasa y extendiendo simultáneamente el segundo 2'-desoxioligonucleótido en cadenas antiparalelas de ADNc tanto diana como que no son diana.
[0288] (d) Separación de los productos de extensión de la etapa (c);
[0290] (e) Repetición de las etapas (a) - (d) hasta que se haya alcanzado el nivel deseado de amplificación exponencial del ADNc diana.
[0292] En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados para detectar y/o cuantificar el miARN comprenden la etapa de amplificación del ácido nucleico diana utilizando la activación por polifosforolisis(polyphosphorolysis,APP) en presencia de al menos un agente de fosforilación. En ciertas realizaciones, el al menos un agente de polifosforilación es un difosfato, un trifosfato, un tetrafosfato, un pentafosfato o un hexafosfato. En ciertas realizaciones de los métodos proporcionados, el agente de polifosforilación es trifosfato. En ciertas realizaciones de los métodos proporcionados, el agente de polifosforilación es hexafosfato.
[0294] En ciertas realizaciones, los métodos para amplificar ácidos nucleicos diana utilizan la activación por reacciones de polimerización activada por pirofosforolisis(Pyrophosphorolysis-Activated Polymerization,PAP). La PAP se puede utilizar para polimerizar y/o amplificar moléculas de ácido nucleico, que incluyen pero no se limitan a ácido ribonucleico (p. ej., ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (p. ej., ADN), o híbridos de los mismos. Las reacciones de PAP y sus usos en reacciones de polimerización y amplificación se describen, por ejemplo, en la patente US- 7,033,763. En la PAP, el oligonucleótido activable P* reasociado se pirofosforila con pirofosfato y una enzima que presenta actividad de polifosforilación. Esto activa el oligonucleótido P* mediante la eliminación del extremo 3' no extensible hibridado. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la amplificación del ADNc del miARN diana utiliza PAP y pirofosfato como agente de pirofosforilación.
[0296] En ciertas realizaciones, para reacciones de amplificación de ácido nucleico diana que utilizan APP o PAP, un cebador directo o un cebador inverso comprende un nucleótido no extensible en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, para reacciones de amplificación de ácido nucleico diana que utilizan APP o PAP, tanto un cebador directo como un cebador inverso comprenden un nucleótido no extensible en el extremo 3'.
[0298] En una realización, la reacción de amplificación es un ensayo de 5'-nucleasa (también conocido comercialmente como ensayos TaqMan®) realizado utilizando una polimerasa de ácido nucleico, tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa y transcriptasa inversa, al menos un cebador oligonucleótido capaz de hibridar específicamente con un polinucleótido diana (a partir del cual se amplifica el ácido nucleico diana amplificado), al menos una sonda detectable que se hibrida con el ácido nucleico diana amplificado, y que se puede incorporar en el al menos un cebador), y al menos un agente de unión de ácido nucleico detectable (p. ej., un colorante intercalante o no intercalante) que se puede introducir antes, durante o después de la amplificación. La sonda típicamente contiene un marcador detectable que emite una señal que puede ser vigilar para determinar si el ácido nucleico diana ha sido amplificado. En algunas realizaciones, la sonda es un oligonucleótido que se hibrida con el ácido nucleico diana 3' con respecto a el al menos un cebador. En algunas realizaciones, la polimerasa tiene actividad de nucleasa (es decir, actividad de nucleasa 5' a 3') para liberar la sonda del ácido nucleico amplificado. En algunas realizaciones, la liberación del ácido nucleico amplificado hace que la sonda sea detectable. En algunas realizaciones, la sonda comprende un marcador detectable y una molécula atenuadora que atenúa el marcador detectable cuando está libre pero no atenúa cuando la sonda hibrida con el ácido nucleico amplificado. En algunas realizaciones, se pueden utilizar dos o más sondas donde al menos una sonda tiene un marcador detectable y al menos otra sonda tiene una molécula atenuadora. Cuando están lo suficientemente cerca uno de otro, la molécula atenuadora normalmente suprime la señal del marcador detectable en la otra sonda. En algunas realizaciones, se pueden utilizar dos o más sondas, cada una con un marcador detectable diferente, sin moléculas atenuadoras. En dichas realizaciones, las sondas se vuelven detectables, ya sea de forma nueva o presentando una señal diferente de cualquiera de las sondas solas, cuando están suficientemente cerca una de la otra. Típicamente, el marcador detectable y la molécula atenuadora forman parte de una única sonda. A medida que avanza la amplificación, la polimerasa digiere la sonda para separar el marcador detectable de la molécula atenuadora. El marcador detectable (p. ej., fluorescencia) se puede vigilar durante la reacción, donde la detección del marcador corresponde a la aparición de la amplificación de ácido nucleico (p. ej., cuanto mayor es la señal, mayor es la cantidad de amplificación). Se conocen en la técnica variaciones de los ensayos TaqMan®, como el ensayo TaqMan® con LNA™, y serían adecuadas para su uso en los métodos descritos en la presente memoria.
[0300] Se puede utilizar cualquiera de varios métodos para detectar ácidos nucleicos diana amplificados utilizando cebadores o sondas. Se pueden utilizar muchos reactivos, sistemas o marcadores detectables diferentes en los métodos descritos en la presente memoria. Estos incluyen, por ejemplo, sistemas TaqMan®, sistemas de marcador-atenuador detectable (p. ej., FRET, sistemas de ligandos de salicilato/DTPA (véase, por ejemplo, Oser, y col. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
[0301] 29:1167-1169 (1990), hibridación por desplazamiento, sondas homólogas, ensayos descritos en EP 070685), balizas moleculares (p. ej., NASBA®), bases de ácido nucleico bloqueado(Locked Nucleic Acid,LNA) (Singh, y col. Chem. Commun. 4:455-456 (1998)), sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) (Pellestor, y col. Eur. J. Hum. Gen. 12:694-700 (2004)), sondas Eclipse (Afonina, y col. Biotechniques 32:940-949 (2002)), sondas luminosas (Svanvik, y col. Anal. Biochem. 281:26-35 (2000)), balizas moleculares (Tyagi, y col. Nat. Biotechnol. 14:303-308 (1996)), balizas moleculares tripartitas (Nutiu, y col. Nucleic Acids Res. 30:E94 (2002)), QuantiProbes (www.qiagen.com), HyBeacons (French, y col. Mol. Cell. Probes 15:363-374 (2001)), sondas de desplazamiento (Li, y col. Nucleic Acids Res. 30:E5 (2002)), HybProbes (Cardullo, y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8790-8794 (1988)], M<g>B Alert (www.nanogen.com), Q-PNA [Fiandaca, y col. Genome Res. 11:609-613 (2001)), Plexor (www.Promega.com), LUX™ cebadores (Nazarenko, y col. Nucleic Acids Res. 30:E37 (2002)), cebadores Scorpion® (Whitcombe, y col. Nat. Biotechnol.
[0302] 17:804-807 (1999)), AmpliFluor® (Sunrise) cebadores (Nazarenko, y col. Nucleic Acids Res. 25:2516-2521 (1997)), cebadores DzyNA (Todd, y col. Clin. Chem. 46:625-630 (2000)), y similares. En cada uno de estos ensayos, se puede vigilar la generación de productos de amplificación mientras la reacción avanza. Se puede utilizar un aparato para detectar la señal generada por el marcador detectable para detectar, medir y cuantificar la señal antes, durante o después de la amplificación. El tipo particular de señal puede dictar la elección del método de detección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los colorantes fluorescentes se utilizan para marcar sondas o productos amplificados. Las sondas se unen a productos amplificados monocatenarios o bicatenarios, o los colorantes se intercalan en los productos amplificados bicatenarios y, en consecuencia, la fluorescencia resultante aumenta a medida que aumenta la cantidad de producto amplificado. El uso de otros métodos o reactivos también está contemplado en la presente memoria como entendería un experto en la técnica.
[0304] Otro sistema ilustrativo utiliza sondas de doble cadena en métodos de hibridación por desplazamiento (véase, por ejemplo, Morrison, y col. Anal. Biochem. 183:231-244 (1989); y Li, y col. (supra)). En tales métodos, la sonda típicamente incluye dos oligonucleótidos complementarios de diferentes longitudes, donde uno incluye un marcador detectable y el otro incluye una molécula atenuadora. Cuando no se une a un ácido nucleico objetivo, el atenuador suprime la señal del marcador detectable. La sonda se vuelve detectable tras la hibridación de desplazamiento con un ácido nucleico objetivo. Se pueden utilizar múltiples sondas, cada una de las cuales contiene diferentes marcadores detectables, de tal modo que se pueden consultar múltiples ácidos nucleicos diana en una sola reacción.
[0306] Métodos ilustrativos adicionales para amplificar y detectar ácidos nucleicos implican “balizas moleculares” , que son sondas de oligonucleótidos en forma de horquilla monocatenarias. En presencia de la secuencia diana, la sonda se despliega, se une y emite una señal (p. ej., fluorescencia). Una baliza molecular incluye de forma típica al menos cuatro componentes: 1) el “ bucle” , una región de 18-30 nucleótidos que es complementaria de la secuencia diana; 2) dos “tallos” de 5-7 nucleótidos que se encuentran en cualquier extremo del bucle y que son complementarios entre sí; 3) en el extremo 5', un marcador detectable; y 4) en el extremo 3', una molécula extintora que impide que la etiqueta detectable emita una sola señal cuando la sonda está en forma de bucle cerrado (es decir, no está unida a un ácido nucleico diana). Por lo tanto, en presencia de un objetivo complementario, la porción de “tallo” del modelo se separa, lo que resulta en que la sonda hibrida con el objetivo. También se conocen otros tipos de balizas moleculares y pueden ser adecuadas para utilizar en los métodos descritos en la presente memoria. Las balizas moleculares se pueden utilizar en una variedad de sistemas de ensayo. Uno de estos sistemas es la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,NASBA®), un proceso isotérmico de una sola etapa para amplificar ARN a ADN bicatenario sin ciclos de temperatura. Una reacción NASBA® generalmente requiere el virus de la mieloblastosis aviar (AMV), transcriptasa inversa(Reverse Transcriptase,RT), ARN polimerasa T7, ARNasa H y dos cebadores de oligonucleótidos. Después de la amplificación, el ácido nucleico diana amplificado se puede detectar utilizando una baliza molecular. Otros usos para los modelos moleculares se conocen en la técnica y son adecuados para utilizar en los métodos que se describen en la presente memoria.
[0308] El sistema Scorpions™ es otro formato de ensayo ilustrativo que puede utilizarse en los métodos que se describen en la presente memoria. Los cebadores Scorpion® son moléculas bifuncionales en las que un cebador está unido covalentemente a la sonda, junto con un marcador detectable (p. ej., un fluoróforo) y un atenuador. En presencia de un ácido nucleico objetivo, el marcador detectable y el atenuador se separan, lo que conduce a un aumento de la señal que emite el marcador detectable. Normalmente, un cebador utilizado en la reacción de amplificación incluye un elemento de sonda en el extremo 5' junto con un elemento “bloqueador de PCR” (tal como un monómero de h EG) al inicio del bucle de horquilla. La sonda típicamente incluye una secuencia de tallo autocomplementaria con un marcador detectable en un extremo y un atenuador en el otro. En los ciclos de amplificación iniciales, el cebador hibrida con la diana y la extensión se produce debido a la acción de la polimerasa. El sistema Scorpion® se puede utilizar para examinar e identificar mutaciones puntuales utilizando múltiples sondas con diferentes marcadores para distinguir entre las sondas. utilizando la PCR como ejemplo, después de completar un ciclo de extensión, la región diana recién sintetizada se une a la misma cadena que la sonda. Después del segundo ciclo de desnaturalización y alineamiento, la sonda y el objetivo se hibridan. La secuencia de horquilla después se hibrida con una parte del producto de la PCR recién producida. Esto resulta en la separación del marcador detectable del atenuador y produce la emisión de la señal. Otros usos para cebadores Scorpion® son conocidos en la técnica y serían adecuados para uso en los métodos descritos en la presente memoria.
[0310] Normalmente uno o más marcadores detectables o agentes de atenuación están unidos a un cebador o sonda. El marcador detectable puede emitir una señal cuando está libre o cuando se une a uno de los ácidos nucleicos diana. El marcador detectable también puede emitir una señal cuando está cerca de otro marcador detectable. Los marcadores detectables también pueden utilizarse con moléculas atenuadoras, de modo que la señal solo sea detectable cuando no esté lo suficientemente cerca de la molécula atenuadora. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema de ensayo puede hacer que el marcador detectable se libere de la molécula atenuadora. Se puede utilizar cualquiera de varios marcadores detectables para marcar los cebadores y las sondas que se utilizan en los métodos que se describen en la presente memoria. Como se ha mencionado antes, en algunas realizaciones, el marcador detectable se puede unir a una sonda, que se puede incorporar a un cebador, o se puede unir de otro modo al ácido nucleico diana amplificado (por ejemplo, un agente de unión a ácido nucleico detectable, tal como un colorante intercalante o no intercalante). Cuando se utiliza más de un marcador detectable, cada marcador debe diferir en sus propiedades espectrales de modo que los marcadores puedan distinguirse entre sí, o de tal modo que los marcadores detectables juntos emitan una señal que no es emitida por ningún marcador detectable solo. Los marcadores detectables ilustrativos incluyen, pero no se limitan a un colorante fluorescente o fluoróforo (es decir, un grupo químico que puede ser excitado por luz para emitir fluorescencia o fosforescencia), “colorantes aceptores” capaces de atenuar una señal fluorescente de un colorante donador fluorescente, y similares.
[0312] Marcadores detectables adecuados pueden incluir, p. ej., fluoresceínas (p. ej., 5-carboxi-2,7-diclorofluoresceína; 5-carboxifluoresceína (5-FAM); 5-HAT (hidroxi triptamina); 6-HAT; 6-JOE; 6-carboxifluoresceína (6-FAM); FITC); fluors Alexa (por ejemplo, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); Fluoróforos BODIPY® (p. ej., 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, FI-Ceramida, R6G SE, TMR, conjugado TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), cumarinas (p. ej., 7-amino-4-metilcumarina, AMC, a Mc A, AMCA-S, AMCA-X, Ab Q, metilcumarina CPM, faloidina cumarina, hidroxicumarina, CMFDA, metoxicumarina), calceína, calceína AM, azul de calceína, colorantes de calcio (p. ej., carmesí de calcio, verde de calcio, naranja de calcio, blanco de calcofluor), azul cascada, amarillo cascada; Colorantes CyTM (p. ej., 3, 3,18, 3,5, 5, 5,18, 5,5, 7), GFP cian, fluorosensor de AMP cíclico (FiCRhR), proteínas fluorescentes (p. ej., proteína fluorescente verde (p. ej., GFP. EGFP), proteína fluorescente azul (p. ej., BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal), proteína fluorescente cian (p. ej., ECFP, Cerulean, CyPet), proteína fluorescente amarilla (p. ej., YFP, Citrine, Venus, YPet), pares donantes/aceptores FRET (p. ej., fluoresceína/tetrametilrodamina, IAEDANS/fluoresceína, EDANS/dabcyl, fluoresceína/fluoresceína, BODIPY® FL/BODIPY® FL, Fluoresceína/QSY7 y QSY9), LysoTracker® y LysoSensor™ (p. ej., LysoTracker® Blue DND-22, LysoTracker® Blue-White DPX, LysoTracker® Yellow HCK-123, LysoTracker® Green DND-26, LysoTracker® Rojo<DND-99, LysoSensor™ Azul d>N<d>-167,<LysoSensor™ Verde>D<n>D-189,<LysoSensor™ Verde>D<n>D-153,<LysoSensor™>Amarillo/Azul DND-160, LysoSensor Amarillo/Azul 10000 MW dextrano), Verde Oregón (p. ej., 488, 488-X, 500, 514);<rodaminas (p. ej., 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-carboxitetrametilrodamina>(5-T<a>M<r>A),<5 g>L<d>,<6->carboxirrodamina 6G, lisamina, lisamina rodamina B, falicidina, faloidina, rojo, Rhod-2, 5-ROX (carboxi-X-rodamina), sulforodamina B puede C, sulforodamina G extra, tetrametilrodamina (TRITC), WT), Texas Red, Texas Red-X, VIC y otras etiquetas descritas, p. ej., en la publicación de EE. UU. N° 2009/0197254). entre otros, como conocerían los expertos en la técnica. También se pueden utilizar otros marcadores detectables (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente US-2009/0197254), como conocerán los expertos en la técnica.
[0314] Como se utiliza en la presente memoria, “ polimerasa” se refiere a cualquier enzima que tiene una actividad de polimerización de nucleótidos. Las polimerasas (incluyendo las ADN polimerasas y las ARN polimerasas) útiles según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasas dirigidas por ADN naturales o disponibles en el mercado, ARN polimerasas dirigidas por ADN, ADN polimerasas dirigidas por ARN y ARN polimerasas dirigidas por ARN. Las polimerasas utilizadas según la invención pueden ser cualquier enzima que pueda sintetizar una molécula de ácido nucleico a partir de una plantilla de ácido nucleico, típicamente en la dirección 5' a 3'.
[0316] Las ADN polimerasas ilustrativas que se pueden utilizar en los métodos, kits y composiciones proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a: ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de<Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne), a>D<n polimerasa de Thermotoga>maritima (Tma), ADN polimerasa de Thermococcus litoralis (Tli o VENT™), ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu), ADN polimerasa de DEEPVENT™, ADN polimerasa de Pyrococcus woosii (Pwo), ADN polimerasa de Bacillus sterothermophilus (Bst), ADN polimerasa de Bacillus caldophilus (Bca), ADN polimerasa de Sulfolobus acidocaldarius (Sac), ADN polimerasa de Thermoplasma acidophilum (Tac), ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl/Tub), ADN polimerasa de Thermus ruber (Tru), ADN polimerasa de Thermus brockianus (DYNAZYME™), ADN polimerasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) ADN polimerasa, ADN polimerasa de micobacterias (Mtb, Mlep) y mutantes, variantes y derivados de las mismas. Las ARN polimerasas tales como T3, T5 y SP6 y los mutantes, variantes y derivados de estas también se pueden utilizar según las presentes enseñanzas. En general, se puede utilizar cualquier ADN polimerasa de tipo I según las presentes enseñanzas, aunque se pueden utilizar otras ADN polimerasas que incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasas de tipo III o de la familia A, B, C, etc.
[0318] Las polimerasas de ácido nucleico utilizadas en los métodos, kits y composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden ser mesófilas o termófilas. Las ADN polimerasas mesófilas ilustrativas incluyen la ADN polimerasa T7, la ADN polimerasa T5, la ADN polimerasa del fragmento Klenow, la ADN polimerasa III y similares. Las ADN polimerasas termoestables ilustrativas incluyen Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, fragmento Stoffel, ADN polimerasas VENT™ y DEEPVENT™, y mutantes, variantes y derivados de las mismas (Patentes US-5,436,149; US-4,889,818; US-4,965,188; US-5,079,352; US-5,614,365; US-5,374,553; US-5,270,179; US-5,047,342; y US-<5,512,462; Publicaciones de solicitud PCT números WO 92/06188,>W<o 92/06200 y WO 96/10640; Barnes, Gene>112:29-35 (1992); Lawyer, y col., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, y col., Nucl. Acids Res. 22:3259-3260 (1994)). Los ejemplos de ADN polimerasas que carecen sustancialmente de actividad de exonucleasa 3' incluyen, pero no se limitan a ADN polimerasas Taq, Tne (exo-), Tma (exo-), Pfu (exo-), Pwo (exo-) y Tth, y mutantes, variantes y derivados de los mismos.
[0320] Las ADN polimerasas para su uso en las presentes enseñanzas pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, de Life Technologies Corp. (Carlsbad, CA), Pharmacia (Piscataway, N.J.), Sigma (St. Louis, Missouri) y Boehringer Mannheim. Las ADN polimerasas ilustrativas disponibles en el mercado para utilizar en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasa Tsp de Life Technologies Corp.
[0322] También se puede utilizar un método de hibridación para ensayar el producto de ligadura. Ejemplos no limitativos de métodos de hibridación adecuados incluyen micromatriz de ácido nucleico. Los análisis de micromatrices se pueden llevar a cabo utilizando equipos disponibles en el mercado y siguiendo los protocolos del fabricante. Típicamente, los ácidos nucleicos monocatenarios están unidos (en matrices) a una superficie de microchip. Las secuencias en matrices después se hibridan (sonda) con ácidos nucleicos, que se pueden marcar con fluorescencia. Después de un lavado riguroso para eliminar los ácidos nucleicos no unidos específicamente, en general se hace un barrido de la superficie del chip por microscopía láser confocal o por otro método de detección, tal como una cámara CCD. Los métodos de análisis de los datos originales de fluorescencia son conocidos en la técnica. Se puede utilizar una variedad de combinaciones de ácido nucleico y sonda en matrices para detectar el producto de ligadura de las presentes enseñanzas.
[0324] Los adaptadores de ligadura 5' y 3' pueden estar libres en disolución, de modo que el ARN pequeño maduro se detecte en disolución. Alternativamente, el adaptador de ligadura de 5’ o el adaptador de ligadura 3' se pueden unir a un soporte sólido, de modo que el extremo terminal 3' del adaptador de ligadura de 5’ o el extremo terminal 5' del adaptador de ligadura 3’ está libre. Por lo tanto, en esta realización, el ARN pequeño maduro o su ADNc está unido al adaptador de ligadura que está unido al soporte sólido. El ARN pequeño maduro o su ADNc se puede hibridar con el adaptador de ligadura inmovilizado y se puede ligar cuando se une indirectamente al soporte sólido. En otras realizaciones, el cebador de RT universal comprendiendo una porción de poli(T) puede estar unido a un soporte sólido, de modo que el extremo 3'-terminal del cebador de RT universal está libre. Por lo tanto, en esta realización, el ADNc del ARN pequeño extendido a partir del cebador universal está unido al soporte sólido. Los ejemplos no limitantes de un soporte sólido adecuado incluyen una superficie de vidrio, una superficie de sílice, una superficie de plástico, una superficie de polímero, una superficie de copolímero o una superficie de metal.
[0326] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “secuenciación de nueva generación” o “ NGS” en general se refiere a tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de firma masiva paralela, secuenciación de alto rendimiento, secuenciación por ligadura (p. ej., secuenciación SOLiD), secuenciación por iones semiconductores - protones, secuenciación por nanobolas de ADN, secuenciación de una sola molécula y secuenciación por nanoporos.
[0328] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ recipiente de reacción” generalmente se refiere a cualquier recipiente en el que puede ocurrir una reacción según las presentes enseñanzas. En algunas realizaciones, un recipiente de reacción puede ser un tubo de microcentrífuga y otros recipientes del tipo de la práctica común en los laboratorios modernos de biología molecular. En algunas realizaciones, un recipiente de reacción puede ser un pocillo en una placa de microvaloración, una mancha en un portaobjetos de vidrio o una mancha en una Array Card TaqMan® de Applied Biosystems (Life Technologies, Foster City, CA). Por ejemplo, una pluralidad de recipientes de reacción pueden residir en el mismo soporte. En algunas realizaciones, los dispositivos tipo laboratorio en un chip, disponibles por ejemplo de Caliper y Fluidigm, pueden proporcionar recipientes de reacción. En algunas realizaciones, se pueden emplear diversos enfoques microfluídicos. Se reconocerá que una variedad de recipientes de reacción están disponibles en la técnica y caen dentro del alcance de las presentes enseñanzas.
[0330] Las realizaciones que se refieren a la composición y los kits que figuran a continuación se describen pero no se reivindican en la actualidad. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo un adaptador de ligadura universal 5', un adaptador de ligadura universal 3', una férula de ligadura semidegenerada 5' y una férula de ligadura semidegenerada 3'. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo además un par de cebadores directo y RT/inverso universales. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo además un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, dichas composiciones son composiciones de reacción.
[0332] En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo un cebador de RT universal comprendiendo una porción de poli(T), un adaptador de ligadura 3' universal y una férula de ligadura semi-degenerada 3'. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo además un par de cebadores directo e inverso universales. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo un adaptador de ligadura 3 'universal, una férula de ligadura 3’ y un par de cebadores directo e inverso universales. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones comprendiendo además un oligonucleótido de bloqueo. En ciertas realizaciones, dichas composiciones son composiciones de reacción.
[0334] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas también proporcionan kits diseñados para acelerar la realización de ciertos métodos. En algunas realizaciones, los kits sirven para acelerar la realización de los métodos de interés al ensamblar dos o más componentes utilizados para llevar a cabo los métodos. En algunas realizaciones, los kits pueden contener componentes en cantidades unitarias previamente medidas para minimizar la necesidad de mediciones por porción de los usuarios finales. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir instrucciones para realizar uno o más métodos de las presentes enseñanzas. En ciertas realizaciones, los componentes del kit están optimizados para funcionar conjuntamente entre sí.
[0336] En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un kit comprendiendo un adaptador de ligadura de 5’, un adaptador de ligadura 3', una férula de ligadura 5’ y una férula de ligadura 3’. En ciertas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un kit comprendiendo un cebador RT universal comprendiendo una porción de poli(T), un adaptador de ligadura 3' y una férula de ligadura 3’. En ciertas realizaciones, los kits pueden comprender además una o más de una ligasa, una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa. En algunas realizaciones, los kits pueden comprender un par de cebadores universales. En algunas realizaciones, los kits pueden comprender además pares de cebadores específicos para uno o más ARN pequeños maduros. En algunas realizaciones, los kits pueden comprender una pluralidad de pares de cebadores, en donde cada par de cebadores está en un recipiente de reacción de una pluralidad de recipientes de reacción. En algunas realizaciones, los kits pueden comprender una sonda detectora. En algunas realizaciones, la sonda detectora comprende un nucleótido del conector 5' o el conector 3' en el producto de amplificación o un nucleótido del complemento del conector 5' o 3' en el producto de amplificación y la sonda detectora además comprende un nucleótido de la región del extremo 3' del ARN pequeño maduro o un nucleótido de la región del extremo 5' del ARN pequeño maduro en el producto de amplificación o un nucleótido de la región del extremo 3' del ARN pequeño maduro o un nucleótido de la región del extremo 5' del complemento de ARN pequeño maduro en el producto de amplificación. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender además un oligonucleótido de bloqueo.
[0337] Los métodos proporcionados en la presente memoria son útiles para detectar o cuantificar ARN pequeño maduro en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados se pueden utilizar para detectar y/o distinguir una especie específica de ARN pequeño maduro de entre otras especies de ARN pequeños en la muestra. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados se pueden utilizar para distinguir varios miARN entre sí en una muestra esencialmente de forma simultánea en un único ensayo. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar cantidades muy bajas de ARN maduro pequeño en una muestra. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 1500 copias de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 1000 copias, menos de aproximadamente 800 copias, menos de aproximadamente 600 copias, menos de aproximadamente 400 copias, menos de aproximadamente 300 copias, menos de aproximadamente 200 copias, menos de aproximadamente 100 copias, menos de aproximadamente 60 copias, menos de aproximadamente 30 copias de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar tan poco como aproximadamente 20 copias hasta aproximadamente 1500 copias de un miARN en una muestra. Los intervalos de sensibilidad adicionales de ciertas realizaciones de los métodos proporcionados incluyen, pero no se limitan a, detección de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 1000 copias, de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 600 copias, de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 300 copias, de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 100 copias, y de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 60 copias de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar tan poco como: de aproximadamente 1000 copias a aproximadamente 1500 copias, de aproximadamente 500 copias a aproximadamente 1000 copias, de aproximadamente 50 copias a aproximadamente 500 copias, de aproximadamente 50 copias a aproximadamente 200 copias, o de aproximadamente 50 copias a aproximadamente 100 copias de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar tan poco como aproximadamente 600 copias de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar tan poco como aproximadamente 60 copias de un miARN en una muestra.
[0339] En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 0,01 pM de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 0,001 pM de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 0,0001 pM de un miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar en el intervalo de aproximadamente 0,0001 pM a aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar en el intervalo de aproximadamente 0,0001 pM a aproximadamente 0,001 pM de miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar en el intervalo de aproximadamente 0,001 pM a aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar aproximadamente 0,001 pM de miARN en una muestra. En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar aproximadamente 0,0001 pM de miARN en una muestra. Según otra realización de las presentes enseñanzas, los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar en métodos de diagnóstico y/o pronóstico para identificar enfermedades y/o determinar la respuesta del paciente al tratamiento con ciertos fármacos, medicamentos o métodos de terapia. Una afección ilustrativa que se puede asociar con ARN pequeños maduros como el miARN es el cáncer. Por lo tanto, las presentes enseñanzas proporcionan un método para diagnosticar la susceptibilidad a un cáncer, el pronóstico del resultado para el tratamiento del cáncer o la etapa y/o identidad del cáncer basado en el perfil de miARN de la muestra.
[0341] Los métodos de pronóstico de las presentes enseñanzas son útiles para determinar si un paciente está en riesgo de recaída. La recaída del cáncer es una preocupación relacionada con una variedad de tipos de cáncer. Por ejemplo, de los pacientes sometidos a extirpación quirúrgica completa de cáncer de colon, 25-40 % de los pacientes con carcinoma de colon en estadio II y aproximadamente 50 % de los pacientes con carcinoma de colon en estadio III experimentan recaída del cáncer. Una explicación para la recaída del cáncer es que los pacientes con enfermedad en estadio relativamente temprano, por ejemplo, etapa II o etapa III, ya tienen pequeñas cantidades de cáncer diseminadas fuera del órgano afectado que no fueron extirpadas mediante cirugía. Estas células cancerosas, denominadas micrometástasis, generalmente no se pueden detectar con las pruebas disponibles actualmente.
[0342] Los métodos de pronóstico descritos en la presente memoria se pueden utilizar para identificar pacientes tratados quirúrgicamente que tienen probabilidad de experimentar recaída del cáncer, de modo que se les pueden ofrecer opciones terapéuticas adicionales, incluyendo complementos preoperatorios o posoperatorios tales como quimioterapia, radiación, modificadores biológicos y otras terapias adecuadas. Los métodos son especialmente efectivos para determinar el riesgo de metástasis en pacientes que no demuestran metástasis medibles en el momento del examen o la cirugía.
[0344] Los métodos de pronóstico según ciertas realizaciones también son útiles para determinar un curso de tratamiento adecuado para un paciente que tiene cáncer. Un curso de tratamiento se refiere a las medidas terapéuticas tomadas para un paciente después del diagnóstico o después del tratamiento para el cáncer. Por ejemplo, una determinación de la probabilidad de recaída del cáncer, diseminación o supervivencia del paciente puede ayudar a determinar si se debe adoptar un enfoque más conservador o más radical de la terapia, o si se deben combinar las modalidades de tratamiento. Por ejemplo, cuando es probable la recaída del cáncer, puede ser ventajoso preceder o seguir el tratamiento quirúrgico con quimioterapia, radiación, inmunoterapia, terapia con modificadores de la respuesta biológica, terapia génica, vacunas y similares, o ajustar el período de tiempo durante el cual el paciente es tratado.
[0345] Los cánceres ilustrativos que se pueden evaluar utilizando un método como se describe en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, neoplasias hematopoyéticas, leucemia/linfoma de células T del adulto, neoplasias linfoides, linfoma anaplásico de células grandes, neoplasias mieloides, histiocitosis, enfermedades de Hodgkin (HD), leucemia/linfoma linfoblástico B (ALL) de precursores, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia/linfoma linfoblástico T (ALL) de precursores, síndromes mielodisplásicos, trastornos mieloproliferativos crónicos, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma linfoplasmacítico, policitemia vera, linfoma de células del manto, trombocitosis esencial, linfoma folicular, mielofibrosis con metaplasia mieloide, linfoma de la zona marginal, leucemia de células pilosas, hemangioma, plasmacitoma/mieloma de células plasmáticas, linfangioma, glomangioma, linfoma difuso de células B grandes, sarcoma de Kaposi, hemanioendotelioma, linfoma de Burkitt, angiosarcoma, leucemia linfocítica crónica de células T, hemangiopericitoma, leucemia de linfocitos grandes granulares, cánceres de cabeza y cuello, carcinoma de células basales, micosis fungoides y síndrome de sezary, carcinoma de células escamosas, ceruminoma, linfoma de células T periféricas, osteoma, paraganglioma no cromafínico, linfoma angioinmunoblástico de células T, neurinoma acústico, carcinoma cístico adenoide, linfoma angiocéntrico, carcinoma mucoepidermoide, linfoma de células NK/T, tumores mixtos malignos, linfoma intestinal de células T, adenocarcinoma, mesotelioma maligno, fibrosarcoma, cáncer de pulmón tipo sarcomotoide, osteosarcoma, cáncer de pulmón tipo epitelial, condrosarcoma, melanoma, cáncer del tracto gastrointestinal, neuroblastoma olfatorio, carcinoma de células escamosas, plasmocitoma aislado, adenocarcinoma, papilomas invertidos, carcinoide, carcinoma indiferenciado, melanoma maligno, carcinoma mucoepidermoide, adenocarcinoma, carcinoma de células acinares, carcinoma gástrico, tumor mixto maligno, linfoma gástrico, tumores gástricos de células estromales, amenoblastoma, linfoma, odontoma, tumores intestinales de células estromales, cánceres de timo, timoma maligno, carcinoides, tipo I (timoma invasivo), mesotelioma maligno, tipo II (carcinoma tímico), adenocarcinoma no productor de mucina, carcinoma de células escamosas, epitelioma linfático, cánceres de hígado y vías biliares, carcinoma de células escamosas, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma, colangiocarcinoma, hepatoblastoma, cáncer papilar, angiosarcoma, cáncer bronquioalveolar sólido, carcinoma fibrolamelar, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de células intermedias, carcinoma de células grandes, carcinoma de células escamosas, cáncer indiferenciado, cáncer de páncreas, cáncer del tracto genital femenino, carcinoma de células escamosas, cistadenocarcinoma, carcinoma de células basales, insulinoma, melanoma, gastrinoma, fibrosarcoma, glucagonoma, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma embrionario, cáncer de riñón, rabdomiosarcoma, carcinoma de células renales, carcinoma de células grandes, nefroblastoma (tumor de Wilm), carcinoma neuroendocrino o de células de avena, cáncer del tracto urinario inferior, carcinoma adenoescamoso, tumores uroteliales, carcinoma indiferenciado, carcinoma de células escamosas, carcinoma del tracto genital femenino, carcinoma mixto, adenoacantoma, sarcoma, carcinoma de células pequeñas, carcinosarcoma, leiomiosarcoma, sarcoma del estroma endometrial, cáncer del tracto genial masculino, cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, sarcinoma, tumores endometrioides, sarcinoma espermatocítico, carcinoma embrionario, celioblastoma, coriocarcinoma, teratoma, carcinoma de células claras, tumor de células de Leydig, carcinoma no clasificado, tumor de células de Sertoli, tumores de teca-granulosa, tumor de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, carcinoma prostático indiferenciado, teratoma, carcinoma ductal transitorio, cáncer de mama, tumor filodes, cáncer de huesos, articulaciones y tejidos blandos, enfermedad de Paget, mieloma múltiple, carcinoma in situ, linfoma maligno, carcinoma invasivo, condrosarcoma, condrosarcoma mesenquimal, cáncer del sistema endocrino, osteosarcoma, adenoma, tumor de Ewing, carcinoma endocrino, tumor de células gigantes malignas, meningioma, adamantinoma, craneofaringioma, histiocitoma fibroso maligno, carcinoma papilar, histiocitoma, carcinoma folicular, fibroma dermoplásico, carcinoma medular, fibrosarcoma, carcinoma anoplásico, cordoma, adenoma, hemangiotelioma, memangispericitoma, feocromocitoma, liposarcoma, neuroblastoma, paraganglioma, histiocitoma, cáncer pineal, rabdomiosarcoma, pineoblastoma, leiomiosarcoma, pineocitoma, angiosarcoma, cáncer de piel, cáncer del sistema nervioso, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de estómago, melanoma, schwannoma, carcinoma de células escamosas, neurofibroma, carcinoma de células basales, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, carcinoma de células de Merkel, tumor de la vaina, enfermedad de Paget extramamaria, astrocitoma, enfermedad de Paget del pezón, astrocitoma fibrilar, glioblastoma multiforme, glioma del tallo cerebral, linfoma cutáneo de células T, astrocitoma pilocítico, xantoastrocitoma, histiocitosis, oligodendroglioma, ependimoma, gangliocitoma, neuroblastoma cerebral, neurocitoma central, tumor neuroepitelial disembrioplásico, meduloblastoma, meningioma maligno, linfoma cerebral primario, tumor de células germinales cerebrales primarias, cánceres del ojo, carcinoma de células escamosas, carcinoma mucoepidermoide, melanoma, retinoblastoma, glioma, meningioma, cáncer del corazón, mixoma, fibroma, lipoma, fibroelastoma papilar, rasoioma o angiosarcoma, entre otros.
[0347] Ejemplos
[0349] Ejemplo 1: análisis de miARN utilizando RT-qPCR basado en ligadura de doble extremo (método de 3 etapas)
[0350] Los ARN totales del cerebro humano se obtuvieron de Ambion® (Carlsbad, CA). El adaptador de ligadura, cebador y oligonucleótidos sintéticos se adquirieron en Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Los ensayos TagMan® se obtuvieron del laboratorio de expresión génica personalizada de Applied Biosystems ®.
[0351] Reacción de ligadura
[0352] La reacción de ligadura se llevó a cabo para ligar los adaptadores de ligadura 5' y 3' al miARN en presencia de las férulas de ligadura 5' y 3' con segmentos salientes semidegenerados. La reacción de ligadura se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:
[0355]
[0357] La mezcla de reacción de ligadura se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un termociclador a 37 0C durante 30 min.
[0358] Reacción de transcripción inversa
[0359] La etapa de transcripción inversa (RT) permite la síntesis de la primera cadena del ADNc a partir del producto de ligadura como plantilla. La reacción de RT se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:
[0362]
[0364] La reacción de RT se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un termociclador a 50 0C durante 50 min, 85 0C durante 5 min, mantenimiento a 40C.
[0365] Reacción de preamplificación
[0366] La preamplificación (preamp) es una etapa opcional para aumentar la sensibilidad para la detección. La reacción de preamp se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:
[0369]
[0371] La reacción de preamp se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un termociclador a 95 0C durante 10 min, seguido de 12 ciclos de (95 0C durante 15 s, 60 0C durante 2 min), seguido de 99 0C durante 10 min y mantenimiento a 40C.
[0372] Reacción en cadena de polimerasa (PCR)
[0373] Se llevó a cabo la PCR en tiempo real para la detección del miARN objetivo. Las reacciones de RT o preamp se diluyeron a 1:10, 1:50 o 1:100 en agua exenta de nucleasas. La reacción de PCR se preparó combinando los siguientes componentes:
[0374]
[0376] La reacción de PCR se mezcló y se centrifugó brevemente. Las reacciones se ejecutaron con un sistema de PCR en tiempo real, como el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7900HT o el sistema de PCR en tiempo real ViiA™7. Los datos se analizaron según las especificaciones y directrices del instrumento.
[0377] Como se puede ver en la Figura 7, no se detectó o se detectó señal de fondo mínima cuando la muestra de miARN se sustituyó por agua exenta de nucleasas en la reacción de ligadura.
[0378] Como se puede ver en la Figura8, la valoración de pool de plantillas sintéticas que varía de 6X107a 60 copias en la reacción de ligadura mostró al menos un intervalo dinámico lineal de6log y un límite de detección de 60 copias que es distinguible de la reacción que no es con plantilla.
[0379] Como se puede ver en la Figura 9, el gráfico de amplificación muestra el nivel de expresión de hsa-let-7a en el ARN total del cerebro humano, y una respuesta de valoración de la muestra que varía de 20 ng a 2 pg de ARN total en la reacción de ligadura.
[0380] La especificidad de la reacción se evaluó con experimentos de reactividad cruzada en los que se ensayó un ensayo con el miARN deseado, así como con el homólogo de miARN no deseado con solo un único apareamiento erróneo. Los datos mostraron una reactividad cruzada mínima para el ensayo hsa-let-7b TaqMan® con la plantilla hsa-let-7c y el ensayo hsa-let-7c TagMan® con la plantilla hsa-let-7b. La alineación de la secuencia se muestra en la Tabla 1 a continuación para hsa-let-7b y hsa-let-7c (los nucleótidos variables se muestran en negrita):
[0381] Tabla 1
[0384]
[0386] Como se puede ver en la Figura 10, los datos de detección de miARN utilizando los ensayos y métodos descritos en la presente memoria se compararon con los métodos de detección de miARN de una fuente interna (Proveedor 2) y dos fuentes externas (Proveedores 1 y 3). Cada método se llevó a cabo según las especificaciones y directrices del producto. La mayor sensibilidad se obtuvo utilizando los métodos según las presentes enseñanzas en relación con los otros métodos observados con 2,5 ng de ARN total (gráfico derecho), con la menor cantidad de variación (gráfico izquierdo).
[0387] Ejemplo 2: análisis de miARN utilizando RT-qPCR basado en ligadura de doble extremo (método de 2 etapas) Los métodos de dos etapas se llevaron a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que se combinaron las etapas de ligadura y RT o las etapas de RT y preamplificación.
[0388] El método combinado de ligadura/RT “2 en 1” se realizó combinando el miARN con los siguientes componentes: Adaptador de ligadura de 5’, férula de ligadura 5’, adaptador de ligadura 3’, férula de ligadura 3’, cebador RT/inverso universal, ligasa T4, tampón de reacción, SuperScript® III y agua libre de nucleasas. La preamplificación y la PCR se llevaron a cabo como en el Ejemplo 1 con el producto de ligadura-RT. Como se puede ver en la Figura 11 en el método combinado de ligadura/RT de 2 etapas, la valoración de la plantilla sintética mostró al menos un intervalo dinámico lineal de 4 a 5 log utilizando un ensayo de hsa-let-7a con oligonucleótido de bloqueo (rombos negros) o sin oligonucleótidos de bloqueo (cuadrados negros).
[0389] El método combinado de RT/preamp “2 en 1 ” se llevó a cabo combinando el producto de ligadura (reacción de ligadura como en el Ejemplo 1) con los siguientes componentes: cebador directo universal, cebador RT/inverso universal, SuperScript®III, mezcla maestra de reacción y agua exenta de nucleasas. La PCR se llevó a cabo como en el Ejemplo 1 con el producto RT/preamp. Como se puede ver en la Figura 12 en el método combinado de RT/preamplificación de2etapas, la valoración de la plantilla sintética mostró al menos un rango dinámico lineal de6log utilizando un ensayo de hsa-let-7a.
[0391] Ejemplo 3: análisis de miARN utilizando RT-qPCR basado en ligadura de doble extremo (método de 1 etapa)
[0392] Se realizó un método “3 en 1” combinando el miRNA con los siguientes componentes: un adaptador de ligadura de 5’, una férula de ligadura 5’, un adaptador de ligadura 3', una férula de ligadura 3’, cebador directo universal, cebador RT/reverso universal, ligasa (ligasa T4), transcriptasa inversa (SuperScript® III) y ADN polimerasa AmpliTaq®Gold. La reacción se detuvo después de la RT calentando la mezcla a 99 0C durante 10 minutos. Para la comparación, se usó un protocolo separado de ligadura y transcripción inversa (según los métodos convencionales) como control (Figura 13, rombos) para comparar el rendimiento del método 3 en 1 (Figura 13, cuadrados) utilizando 45 plantillas de miARN. Como se puede ver en la Figura 13, ambos métodos son comparables.
[0394] Se utilizaron diluciones seriadas de 48 plantillas miARN para ensayar el método 3 en 1 en cuanto a la sensibilidad y el intervalo dinámico (véase la Figura 14). La preamp n° 1,2 y 3 indicada a lo largo del eje x indica la cantidad diferente de cebadores de RT/inversos universales incluidos en la reacción 3 en 1. Una concentración de 0,5 pM de cebador de RT/inverso es la que mejor funciona. El intervalo dinámico lineal del método 3 en 1 tiene un intervalo dinámico lineal de6a 7 log.
[0396] Ejemplo 4: Bloqueo selectivo de la amplificación de fondo mediante oligonucleótidos bloqueadores
[0398] Las secuencias del adaptador de ligadura universal facilitan la síntesis de ADNc en la RT y la preamplificación del ADNc en la PCR utilizando cebadores universales. Para impulsar la ligadura de los adaptadores de ligadura al miARN, se utiliza una cantidad excesiva de adaptadores de ligadura; por lo tanto, la ligadura entre los dos conectores de ligadura se puede producir como un subproducto de fondo no específico en los métodos descritos en la presente memoria. Este fondo compromete la detección de transcripciones poco abundantes tanto en la qPCR como en el análisis de NGS y detección. Para reducir el fondo, se desarrollaron oligonucleótidos de bloqueo para suprimir selectivamente la amplificación del subproducto adaptador-adaptador en la etapa de preamplificación. Se utilizaron oligonucleótidos de ADN marcados en el extremo 5' o 3' con MGB, 2'-O-metil ARN y bloqueadores restrictivos de la amplificación dirigida a la secuencia (STAR) en las reacciones de preamplificación (véase la Figura 15). Se descubrió que la adición de dichos oligonucleótidos bloqueadores reducía drásticamente la amplificación de fondo y aumentaba la sensibilidad de la detección de miRNA mediante qPCR con ensayos qPCR TaqMan®. Se espera que la aplicación de oligonucleótidos de bloqueo en la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) para el análisis de ARN pequeños reduzca en gran medida el fondo y aumente la proporción de análisis de secuencia de miARN y los números efectivos de cobertura para secuencias de miARN.
[0400] El análisis de ARNm de ligadura de doble extremo se llevó a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Como se puede ver en la Figura 16, se generó una cantidad en exceso de subproducto de adaptador-adaptador de fondo en la qPCR (curva más a la izquierda) y secuenciación de nueva generación (curva más a la derecha). El ACt del miARN diana y el subproducto de fondo era de aproximadamente 18, lo que se traduce en que se introdujo más de100.000veces más fondo en el proceso.
[0402] Como se puede ver en la Figura 17, un fondo artificial (53) o C. Lin 4 se mezcló con adaptadores de ligadura de 5' y 3' en una proporción de 10.000:1. Se añadieron oligonucleótidos de bloqueo durante la etapa de preamplificación. Se comparó el ACt de muestras con o sin bloqueadores. La línea superior (rombos sólidos) representa el desplazamiento del Ct de fondo: cuanto mayor sea el desplazamiento, mejor será la reducción del fondo. La línea inferior (cuadrados sólidos) muestra el cambio de Ct con oligonucleótidos de bloqueo: cuanto menor es el cambio, es mejor para mejorar la sensibilidad.
[0404] Las Figuras 17-18 muestran que los oligonucleótidos de bloqueo aumentan la sensibilidad de la detección de la qPCR a través de la reducción del fondo en muestras biológicas. Se usó el ARN total del cerebro humano en el ensayo de ligadura de doble extremo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron tres bloqueadores diferentes (oligonucleótido de bloqueo 3'-MGB, oligonucleótido de bloqueo 2'-O-metil ARN y oligonucleótido de bloqueo STAR) durante la preamplificación. qPCR se realizó utilizando 45 ensayos TaqMan® contra 45 miARN. La Figura 18 muestra el aumento de la sensibilidad de cada ensayo de miARN con cada oligonucleótido de bloqueo. La Figura 19, el panel izquierdo muestra el porcentaje de reducción de la amplificación del subproducto de fondo utilizando los oligonucleótidos de bloqueo. La Figura 19, el panel derecho muestra el aumento promedio de la sensibilidad de detección en los 45 ensayos de miARN.
[0406] Las Figuras 20-22 muestran que los oligonucleótidos de bloqueo aumentan la sensibilidad de la secuenciación de nueva generación a través de la reducción en la formación de subproductos de fondo en muestras biológicas. El ARN total de cerebro humano se utilizó en el flujo de trabajo de NGS de RNASeq según las instrucciones del fabricante. Se añadieron dos oligonucleótidos de bloqueo diferentes (oligonucleótido de bloqueo 3'-MGB y oligonucleótido de bloqueo de 2-O-metil ARN) a 2 pM o 4 pM durante la preamplificación de la biblioteca de ADNc. qPCR se realizó utilizando 48 ensayos TaqMan® contra 48 miARN. La Figura 20 muestra el aumento de la sensibilidad de cada miARN con los diversos oligonucleótidos de bloqueo. La Figura 21 muestra el porcentaje de reducción en la formación de subproductos de fondo con cada oligonucleótido de bloqueo. La Figura 22 muestra el aumento promedio de la sensibilidad de detección en los 48 ensayos de miARN.
[0408] Tanto el análisis de miARN de ligadura de doble extremo utilizando qPCR como el análisis de secuenciación de nueva generación de miARN utilizaron oligonucleótidos de bloqueo para reducir la formación de subproducto de adaptadoradaptador ligado. Para el análisis de qPCR, tanto el oligonucleótido de bloqueo MGB como el oligonucleótido de bloqueo STAR mostraron mayor reducción de fondo (> 90 %), pero el oligonucleótido de bloqueo de 2'-O-metil ARN mostró un aumento de sensibilidad mayor (media = 2,7 veces). Sin embargo, para el análisis de secuenciación de nueva generación, el oligonucleótido de bloqueo de 2'-O-metil ARN mostró la mayor reducción del fondo, mientras que el oligonucleótido de bloqueo de MGB (4 pM) mostró el mayor aumento en la sensibilidad (media = 9 veces) para la detección del miARN diana.
[0410] Ejemplo 5: análisis de miARN utilizando un ensayo basado en extensión de dos extremos
[0412] Se adquirieron adaptadores, cebadores y oligonucleótidos de miARN sintéticos de Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Los ensayos TagMan® se obtuvieron del laboratorio de expresión génica personalizada de Applied Biosystems ®.
[0414] Reacciones de transcripción inversa y colas poliA
[0416] La primera cadena del ADNc se generó mediante una reacción de transcripción inversa (RT) y cola de poli A de un solo etapa. La reacción de poliadenilación y RT se realizó combinando 2 pl de 5x tampón de RT, 1 pl de SuperScript™ III 200 U/pl, 3 pl de agua exenta de nucleasas y 4 pl de plantillas de miARN sintético en el intervalo de 60 a 60 millones de copias en un volumen de reacción total de 10 pl. La mezcla de reacción se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un termociclador a 37 0C durante 60 minutos, 95 0C durante 5 min, mantenimiento a 40C.
[0418] Reacción de ligadura
[0420] La reacción de ligadura se llevó a cabo para ligar el ADNc al adaptador de ligadura en presencia de férula de ligadura oligo con segmento saliente semidegenerado. La reacción de ligadura se llevó a cabo combinando los siguientes componentes: 1,5 pl de mezcla adaptadora 10x, 1,5 pl de tampón de ligadura 10x, 1,5 pl de enzima de ligadura 10x, 0,5 pl de agua libre de nucleasas y 10 pl de ADNc de la reacción RT de cola de poli A para un volumen total de reacción de ligadura de 15 pl. La reacción de ligadura se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un termociclador a 25 0C durante 60 minutos, 65 0C durante 10 min, mantenimiento de 40C.
[0422] Reacción de preamplificación
[0424] La preamplificación (preamp) es una etapa opcional para aumentar la sensibilidad para la detección. La reacción de preamp se llevó a cabo combinando los siguientes componentes: 25 pl de 2x TagMan® PreAmp Master Mix, 2,5 pl de 20x PreAmp Universal Primers, 7,5 pl de agua libre de nucleasas y 15 pl de ADNc ligado de la reacción de ligadura para una reacción de preamplificación total de 50 pl. La reacción de preamplificación se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 95 0C durante 10 min, seguido de 12 ciclos de (95 0C durante 15 s, 60 0C durante 2 min), seguido de 99 0C durante 10 min y una retención a 40C.
[0426] PCR
[0428] Se llevó a cabo la PCR en tiempo real (qPCR) para la detección de los miARN. Las reacciones de ligadura o reacciones de preamp se diluyeron a 1:4, 1:10, 1:50 o 1:100 en agua exenta de nucleasas. La reacción de PCR se preparó combinando los siguientes componentes: 10 pl 2x TagMan ® Universal Master Mix II, 1 pl 20x TagMan ® Assay, 4 pl de agua exenta de nucleasas y 5 pl de reacción de ligadura o preamplificación diluida para un volumen total de 20 pl de PCR. La reacción de PCR se mezcló y se centrifugó brevemente. Las reacciones se ejecutaron con un sistema de PCR en tiempo real, como el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7900HT o el sistema de PCR en tiempo real ViiA™ 7. Los datos se analizaron según las especificaciones y directrices del instrumento.
[0430] Como se puede ver en la Figura 23, la valoración de plantilla de miARN sintético que varía de 6x107a 60 copias en la reacción de poliadenilación/RT mostró al menos un intervalo dinámico lineal de6log con sensibilidad de detección de 60 copias. La señal de fondo no era un problema, como se muestra en las reacciones sin plantilla. La inclusión de una etapa de preamplificación mejoró la sensibilidad de detección (véase la Figura 23, cuadrados cerrados).
[0432] Este método de análisis de miARN también se realizó con un bloqueador oligonucleótido presente en la reacción de ligadura. El bloqueador oligonucleotídico tiene una estructura de horquilla y una porción sobresaliente monocatenaria que contiene poli (A) en su extremo 3', como se representa en la Figura 15 D. El bloqueador puede hibridarse con cualquier cebador RT universal que no esté reasociado o no extendido. En consecuencia, el bloqueador oligonucleótido suprimiría la ligadura del adaptador de ligadura para liberar el cebador de RT universal.
[0433] Como se puede ver en la Figura 24, el uso de un bloqueador oligonucleótido en la reacción de ligadura aumentó la eficiencia de la amplificación para un número de copias bajo al reducir el subproducto de ligadura no específico.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
i .Un método para detectar un ARN pequeño maduro, comprendiendo el método:
a. proporcionar una muestra comprendiendo un ARN pequeño maduro;
b. ligar un adaptador de ligadura universal de 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada de 5' que se extiende por la unión de ligadura 5', y ligar un adaptador de ligadura universal de 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro en presencia de una férula de ligadura semidegenerada de 3' que abarca la unión de ligadura 3', mediante la cual un producto de ligadura se forma;
c. transcribir de forma inversa el producto de ligadura utilizando un cebador universal de RT/inversa, mediante lo cual se forma un producto de extensión, en donde la etapa de ligadura y la etapa de transcripción inversa se realizan esencialmente de forma simultánea en el mismo recipiente de reacción;
d. amplificar el producto de extensión utilizando un par de cebadores universales directo y RT/inverso, con lo que se forma un producto de amplificación; y
e. detectar el producto de amplificación.
2. El método de la reivindicación1, en donde la etapa de ligadura, la etapa de transcripción inversa y la etapa de amplificación se realizan esencialmente de forma simultánea en el mismo recipiente de reacción.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la ligadura del adaptador de ligadura universal 5' al extremo 5' del ARN pequeño maduro se realiza esencialmente de manera concurrente con o antes o después de la ligadura de un adaptador de ligadura universal 3' al extremo 3' del ARN pequeño maduro.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el adaptador de ligadura universal en 3' comprende además una estructura de horquilla con un saliente monocatenario en 3' comprendiendo de aproximadamente 3 a aproximadamente6bases nucleotídicas degeneradas que se hibridan con la región 3' del ARN pequeño maduro y sirve como férula de ligadura semidegenerada en 3'.
5. El método de la reivindicación 1 a 4, en donde el adaptador de ligadura universal 5' comprende además una estructura de horquilla, con un saliente monocatenario de 5' comprendiendo de aproximadamente 3 a aproximadamente6bases nucleotídicas degeneradas que se hibridan con la región 5' del ARN pequeño maduro y sirve como férula de ligadura semidegenerada 5'.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la férula de ligadura semidegenerada 3' comprende una región 3' terminal comprendiendo de aproximadamente 3 a aproximadamente6bases nucleotídicas degeneradas que se hibrida con el extremo 3' del ARN pequeño maduro y una región 5' que se hibrida con el extremo 5' del adaptador de ligamiento universal 3'.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a6, en donde la férula de ligadura semidegenerada 5' comprende una región terminal 5' comprendiendo de aproximadamente 3 a aproximadamente6bases nucleotídicas degeneradas que se hibrida con el extremo 5' del ARN pequeño maduro y una región 3' que se hibrida con el extremo 3' del adaptador de ligadura universal 5'.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el adaptador de ligadura universal 3' se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido de ADN y un oligonucleótido de ADN comprendiendo al menos un agente de bloqueo.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a8, en donde al menos una de las férulas de ligadura semidegeneradas en 5' y/o las férulas de ligadura semidegeneradas en 3' se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido de ADN-ARN quimérico, un oligonucleótido de ADN y un oligonucleótido de ADN comprendiendo al menos un agente bloqueante.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones8o 9, en donde el agente bloqueante se selecciona del grupo que consiste en un didesoxinucleótido, un grupo amina, un grupo metilo, un aglutinante del surco principal, biotina, un grupo fosfato y un espaciador de carbono.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además añadir un oligonucleótido bloqueador a la etapa de ligadura, transcripción inversa, extensión y/o amplificación.
12. El método de la reivindicación 11, en donde el oligonucleótido bloqueante se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido bloqueante del 3'-MGB, un oligonucleótido bloqueante del 5'-MGB, un oligonucleótido bloquente del 2'-O-metilo, un oligonucleótido bloquente de la 3'-acridina, un oligonucleótido bloquente de la 5'-acridina, un oligonucleótido bloqueante STAR y un oligonucleótido bloqueante
comprendiendo un poli (A) o en donde el oligonucleótido bloqueante se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido de ADN y un oligonucleótido de ARN.
ES19188218T 2012-11-02 2013-11-04 Small rna capture, detection and quantification Active ES3049590T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261721968P 2012-11-02 2012-11-02
US201261740242P 2012-12-20 2012-12-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3049590T3 true ES3049590T3 (en) 2025-12-17

Family

ID=49585636

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13795633T Active ES2749463T3 (es) 2012-11-02 2013-11-04 Captura, detección y cuantificación de ARN pequeño
ES17186097T Active ES2800075T3 (es) 2012-11-02 2013-11-04 Nuevas composiciones y métodos para mejorar la especificidad de la PCR
ES19188218T Active ES3049590T3 (en) 2012-11-02 2013-11-04 Small rna capture, detection and quantification

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13795633T Active ES2749463T3 (es) 2012-11-02 2013-11-04 Captura, detección y cuantificación de ARN pequeño
ES17186097T Active ES2800075T3 (es) 2012-11-02 2013-11-04 Nuevas composiciones y métodos para mejorar la especificidad de la PCR

Country Status (7)

Country Link
US (7) US9416405B2 (es)
EP (5) EP3628746B1 (es)
CN (2) CN111793621B (es)
DK (2) DK2914743T3 (es)
ES (3) ES2749463T3 (es)
PL (2) PL2914743T3 (es)
WO (2) WO2014071315A1 (es)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG185544A1 (en) * 2010-05-14 2012-12-28 Fluidigm Corp Nucleic acid isolation methods
US9528107B2 (en) * 2012-01-31 2016-12-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for selection of nucleic acids
WO2014071315A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Life Technologies Corporation Novel compositions, methods and kits for enhancing pcr specificity
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP4279610A3 (en) 2013-03-15 2024-01-03 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
SG10201708498VA (en) 2013-04-17 2017-11-29 Agency Science Tech & Res Method for generating extended sequence reads
JP7058502B2 (ja) * 2014-04-11 2022-04-22 レッドボールト バイオサイエンシズ エルピー ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法
CN114250278B (zh) * 2015-03-13 2024-08-06 生命技术公司 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒
WO2016164866A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Hudsonalpha Institute For Biotechnology METHOD FOR BLOCKING miRNA
US10844427B2 (en) 2015-04-30 2020-11-24 Thomas Jefferson University Four-leaf clover qRT-PCR: an efficient and convenient method for selective quantification of mature tRNA
WO2017035090A1 (en) * 2015-08-21 2017-03-02 Thomas Jefferson University Dumbbell-pcr: a method to quantify specific small rna variants with a single nucleotide resolution at terminal sequences
US10287625B2 (en) * 2016-03-18 2019-05-14 Norgen Biotek Corp. Methods and kits for separating nucleic acids by size
US10961573B2 (en) 2016-03-28 2021-03-30 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex target capture
US12385034B2 (en) 2016-06-24 2025-08-12 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for filtration
CN110139931B (zh) * 2016-08-30 2024-06-11 元素生物科学公司 用于定相测序的方法和组合物
CN107151695B (zh) * 2016-12-08 2021-11-09 青岛大学 用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合及其检测方法和应用
JP7048609B2 (ja) 2016-12-09 2022-04-05 ボリアル ジェノミクス， インコーポレイテッド 連結型ライゲーション
WO2019236726A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
US12098419B2 (en) 2018-08-23 2024-09-24 Ncan Genomics, Inc. Linked target capture and ligation
EP4538389A3 (en) 2019-01-03 2025-07-30 Ncan Genomics, Inc. Linked target capture
US11390915B2 (en) * 2019-04-26 2022-07-19 New England Biolabs, Inc. Polynucleotide adapter design for reduced bias
GB201911421D0 (en) * 2019-08-09 2019-09-25 Dnae Diagnostics Ltd Methods of multiplexed isothermal amplification of nucleic acid sequences
US11515117B2 (en) 2020-08-28 2022-11-29 GE Precision Healthcare LLC Biased cathode assembly of an X-ray tube with improved thermal management and a method of manufacturing same
US20240344056A1 (en) * 2021-06-04 2024-10-17 Somagenics, Inc. Improved method of sequencing library preparation for short dna
US12601008B2 (en) 2021-11-04 2026-04-14 Florida State University Research Foundation, Inc. Using hairpin formation to identify DNA and RNA sequences having a target nucleic acid sequence
CN114295594B (zh) * 2021-12-06 2023-09-19 贵州理工学院 一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器
CN114252602B (zh) * 2021-12-22 2023-09-12 清华大学深圳国际研究生院 微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法
EP4457356A4 (en) * 2021-12-24 2025-10-29 Pacbridge Partners Ii Invest Co Ltd COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING GENE FUSIONS
US20250092448A1 (en) * 2022-01-12 2025-03-20 Shoulian Dong Methods and compositions for nucleic acid amplifications
EP4549583A4 (en) * 2022-06-29 2026-06-17 Xenohelix Co Ltd METHOD FOR DETECTING TARGET RNA, COMPRISING TREATMENT WITH A BLOCKING NUCLEIC ACID

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4257774A (en) 1979-07-16 1981-03-24 Meloy Laboratories, Inc. Intercalation inhibition assay for compounds that interact with DNA or RNA
CA1190838A (en) 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5618711A (en) 1986-08-22 1997-04-08 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase
US6127155A (en) 1986-08-22 2000-10-03 Roche Molecular Systems, Inc. Stabilized thermostable nucleic acid polymerase compositions containing non-ionic polymeric detergents
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5244797B1 (en) 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
US5035996A (en) 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5270179A (en) 1989-08-10 1993-12-14 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity
US5047342A (en) 1989-08-10 1991-09-10 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase
EP0540693B1 (en) 1990-07-24 1999-01-20 F. Hoffmann-La Roche Ag THE REDUCTION OF NON-SPECIFIC AMPLIFICATION DURING $i(IN VITRO) NUCLEIC ACID AMPLIFICATION USING MODIFIED NUCLEIC ACID BASES
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
JP2709311B2 (ja) 1990-09-28 1998-02-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト 熱安定性ｄｎａポリメラーゼの５→３′のエキソヌクレアーゼ突然変異
WO1992006188A2 (en) 1990-10-05 1992-04-16 Barnes Wayne M Thermostable dna polymerase
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
DE69430665T2 (de) 1993-01-15 2002-11-21 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Empfindlicher nukleinsäure-sandwichhybridisierungs-assay und kits
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US5767259A (en) 1994-12-27 1998-06-16 Naxcor Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains
CA2122203C (en) 1993-05-11 2001-12-18 Melinda S. Fraiser Decontamination of nucleic acid amplification reactions
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6821727B1 (en) 1993-11-15 2004-11-23 Applera Corporation Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
CA2185239C (en) 1994-03-16 2002-12-17 Nanibhushan Dattagupta Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5912155A (en) 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
US5614365A (en) 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US6153425A (en) 1995-07-13 2000-11-28 Xtrana, Inc. Self-contained device integrating nucleic acid extraction, amplification and detection
US5773258A (en) 1995-08-25 1998-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme
US5770365A (en) * 1995-08-25 1998-06-23 Tm Technologies, Inc. Nucleic acid capture moieties
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
AU713667B2 (en) 1996-04-12 1999-12-09 Phri Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
AU730633B2 (en) 1996-05-29 2001-03-08 Phillip Belgrader Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
EP0977779A1 (en) 1997-04-21 2000-02-09 Schering Corporation Mammalian cytokines; related reagents and methods
CA2287542A1 (en) 1997-04-22 1998-10-29 Invitrogen Corporation Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
US6228628B1 (en) 1997-07-09 2001-05-08 Roche Molecular Systems Mutant chimeric DNA polymerase
AU1366299A (en) 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
US6238927B1 (en) 1998-10-05 2001-05-29 Mosaic Technologies, Incorporated Reverse displacement assay for detection of nucleic acid sequences
US6383752B1 (en) 1999-03-31 2002-05-07 Hybridon, Inc. Pseudo-cyclic oligonucleobases
US20070059752A1 (en) * 1999-06-09 2007-03-15 Biosearch Technologies, Inc. Fluorescence energy transfer probes with stabilized conformations
US6528254B1 (en) 1999-10-29 2003-03-04 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid sequence
US7033763B2 (en) 2000-02-23 2006-04-25 City Of Hope Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP)
US6605451B1 (en) 2000-06-06 2003-08-12 Xtrana, Inc. Methods and devices for multiplexing amplification reactions
US6596490B2 (en) 2000-07-14 2003-07-22 Applied Gene Technologies, Inc. Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
US6706476B1 (en) * 2000-08-22 2004-03-16 Azign Bioscience A/S Process for amplifying and labeling single stranded cDNA by 5′ ligated adaptor mediated amplification
US6569927B1 (en) 2000-10-06 2003-05-27 Uniroyal Chemical Company, Inc. Thermoplastic resins stabilized by blends of sterically hindered phenols, secondary amines, and lactones
US6350580B1 (en) 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
WO2003025132A2 (en) 2001-09-14 2003-03-27 Invitrogen Corporation Dna polymerases and mutants thereof
US6593091B2 (en) 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer
US6589250B2 (en) 2001-11-20 2003-07-08 Stephen A. Schendel Maxillary distraction device
WO2003048309A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Applera Corporation Thermus thermophilus nucleic acid polymerases
US20040022764A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Hanan Polansky Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease
GB0218215D0 (en) * 2002-08-06 2002-09-11 Tepnel Medical Ltd Amplification of nucleic acids
EP1426448A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-09 bioMérieux BV Method for lowering the effects of sequence variations in a diagnostic hybridization assay, probe for use in the assay and assay
JP2006508662A (ja) 2002-12-04 2006-03-16 アプレラ コーポレイション ポリヌクレオチドの多重増幅
US7282333B2 (en) * 2003-10-20 2007-10-16 Promega Corporation Methods and compositions for nucleic acid analysis
US8192937B2 (en) * 2004-04-07 2012-06-05 Exiqon A/S Methods for quantification of microRNAs and small interfering RNAs
DK1735459T3 (da) 2004-04-07 2012-05-29 Exiqon As Fremgangsmåder til kvantificering af microRNA'er og små interfererende RNA'er
US7387887B2 (en) 2004-04-20 2008-06-17 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US7361465B2 (en) 2004-09-07 2008-04-22 Applera Corporation Methods and compositions for tailing and amplifying RNA
US7579153B2 (en) 2005-01-25 2009-08-25 Population Genetics Technologies, Ltd. Isothermal DNA amplification
US20070009924A1 (en) 2005-01-28 2007-01-11 Lee Jun E Thermococcus zilligii DNA polymerases and variants thereof
WO2006084201A2 (en) 2005-02-04 2006-08-10 Genosensor Corporation Method of isolating, labeling and profiling small rna and whole-genome transcripts
US7824890B2 (en) 2005-02-19 2010-11-02 Avacta Group Plc Isothermal amplification of nucleic acids
US20060223066A1 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Applera Corporation Methods for normalizing and for identifying small nucleic acids
US7456281B2 (en) * 2005-04-20 2008-11-25 Idaho Technology, Inc. Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US20070054287A1 (en) * 2005-05-31 2007-03-08 Applera Corporation Method for identifying medically important cell populations using micro rna as tissue specific biomarkers
DK1907571T3 (en) * 2005-06-15 2017-08-21 Complete Genomics Inc NUCLEIC ACID ANALYSIS USING INCIDENTAL MIXTURES OF NON-OVERLAPPING FRAGMENTS
US20060292578A1 (en) 2005-06-28 2006-12-28 Weidong Zheng DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases
AU2006265896B2 (en) * 2005-06-30 2012-05-31 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of fully 2'-modified nucleic acid transcripts
DK1924704T3 (da) 2005-08-02 2011-09-05 Rubicon Genomics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion
WO2007025281A2 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 Applera Corporation A method to quantify sirnas, mirnas and polymorphic mirnas
EP2021506B1 (en) * 2006-04-28 2016-03-16 Igor Kutyavin Use of products of pcr amplification carrying elements of secondary structure to improve pcr-based nucleic acid detection
WO2008029295A2 (en) 2006-06-30 2008-03-13 Rosetta Genomics Ltd A method for detecting nucleic acids
DE102006038113A1 (de) 2006-08-14 2008-02-21 Qiagen Gmbh Verfahren zur Synthese einer cDNA in einer Probe in einer enzymatischen Reaktion und gleichzeitigen Bereitstellung eines ersten Enzyms mit Polyadenylierungsaktivität und eines zweiten Enzyms mit reverser Transkriptaseaktivität
US20080248469A1 (en) * 2006-08-16 2008-10-09 Applera Corporation Methods for Identifying Nucleotides of Interest in Target Polynucleotides
EP2079754B1 (en) * 2006-10-04 2017-03-15 Third Wave Technologies, Inc. Snap-back primers and detectable hairpin structures
US8383370B2 (en) 2007-01-30 2013-02-26 The Rockefeller University Modified RNA ligase for efficient 3′ modification of RNA
EP2121983A2 (en) * 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20080194416A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sigma Aldrich Detection of mature small rna molecules
GB0703996D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Nucleic acid detection
EP1978111B1 (en) * 2007-04-02 2013-03-27 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Pseudomonas aeruginosa
US20090061424A1 (en) 2007-08-30 2009-03-05 Sigma-Aldrich Company Universal ligation array for analyzing gene expression or genomic variations
US20090215057A1 (en) * 2007-11-19 2009-08-27 Reimo Tetzner Analysis molecule and method for the analysis of a nucleotide position in a nucleic acid
US20090197254A1 (en) 2007-12-14 2009-08-06 Ming-Chou Lee Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection
JP5685085B2 (ja) * 2008-01-14 2015-03-18 アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー リボ核酸を検出するための組成物、方法およびキット
US8399221B2 (en) 2008-11-04 2013-03-19 Sabiosciences Corporation Methods for detection and quantitation of small RNAs
SG172965A1 (en) 2009-01-13 2011-08-29 Fluidigm Corp Single-cell nucleic acid analysis
WO2010085966A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Exiqon A/S Method for quantification of small rna species
EP2534263B1 (en) * 2010-02-09 2020-08-05 Unitaq Bio Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
US20130045885A1 (en) * 2010-02-18 2013-02-21 Univeristy Of South Florida Materials and methods for profiling micrornas
US9255291B2 (en) * 2010-05-06 2016-02-09 Bioo Scientific Corporation Oligonucleotide ligation methods for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing
WO2011146942A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 The Translational Genomics Research Institute Methods and kits to analyze microrna by nucleic acid sequencing
US8883421B2 (en) 2010-09-10 2014-11-11 New England Biolabs, Inc. Method for reducing adapter-dimer formation
US8575071B2 (en) 2010-11-03 2013-11-05 Illumina, Inc. Reducing adapter dimer formation
CN103492587B (zh) 2010-12-13 2015-02-18 生命技术公司 利用通过多磷酸分解作用(app)反应的活化聚合核酸
CN103261416B (zh) 2010-12-16 2016-08-10 安捷伦科技有限公司 利用真核tRNA连接酶的连接方法
US9677130B2 (en) 2011-02-15 2017-06-13 Institute For Systems Biology Methods to detect and quantify RNA
CN102676637B (zh) 2011-03-08 2016-02-03 生元科技有限公司 一种高专一性的测定小rna的方法
EP3301188B1 (en) * 2012-04-16 2020-10-07 Life Technologies Corporation Methods for the preparation of rna libraries
WO2014071315A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Life Technologies Corporation Novel compositions, methods and kits for enhancing pcr specificity
CN114250278B (zh) 2015-03-13 2024-08-06 生命技术公司 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
US20180171400A1 (en) 2018-06-21
EP2914743B1 (en) 2019-08-07
EP3260558A1 (en) 2017-12-27
EP3748016A1 (en) 2020-12-09
ES2749463T3 (es) 2020-03-20
US20140134614A1 (en) 2014-05-15
EP2914741B1 (en) 2017-08-16
US9416405B2 (en) 2016-08-16
EP3260558B1 (en) 2020-05-13
US20230052754A1 (en) 2023-02-16
US20170130264A1 (en) 2017-05-11
CN104955959B (zh) 2020-04-17
EP3628746B1 (en) 2025-08-27
CN111793621A (zh) 2020-10-20
DK2914741T3 (da) 2017-11-20
CN111793621B (zh) 2024-12-10
EP2914743A1 (en) 2015-09-09
PL3260558T3 (pl) 2020-08-10
US20210002717A1 (en) 2021-01-07
EP3628746A1 (en) 2020-04-01
US11208688B2 (en) 2021-12-28
WO2014071315A1 (en) 2014-05-08
WO2014071322A1 (en) 2014-05-08
PL2914743T3 (pl) 2020-05-18
EP2914741A1 (en) 2015-09-09
US20150105275A1 (en) 2015-04-16
DK2914743T3 (da) 2019-10-14
US9920360B2 (en) 2018-03-20
CN104955959A (zh) 2015-09-30
US10954553B2 (en) 2021-03-23
ES2800075T3 (es) 2020-12-23
US11473132B2 (en) 2022-10-18
US20220119875A1 (en) 2022-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2749463T3 (es) Captura, detección y cuantificación de ARN pequeño
ES2890776T3 (es) Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño
ES2893411T3 (es) Procedimientos para realizar PCR multiplexada
ES2774447T3 (es) Métodos de uso de cebador de horquilla de extremos cohesivos
ES2874753T3 (es) Método mejorado de detección de secuencia de polinucleótidos
EP2753712B1 (en) Closed nucleic acid structures
ES2961374T3 (es) Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada
EP2971095B1 (en) Universal reporter-based genotyping methods, reaction mixture and kit
ES2700606T3 (es) Uso de trifosfatos de desoxinucleósidos modificados en sus bases para mejorar la detección de ácidos nucleicos
JP2008543288A (ja) プライマーに基づく改善された増幅法
ES2770638T3 (es) Nuevas composiciones, métodos y kits para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
JP2004532615A (ja) 核酸の検出および識別のためのプライマーおよび方法
JP2023175685A (ja) 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット
KR20140123858A (ko) 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
ES2966013T3 (es) Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado
WO2011034895A1 (en) Compositions, methods and uses for nucleotide analogues
HK1197593A (zh) 多核苷酸引物和探針