ES3049655T3 - Methods of selecting a treatment for breast cancer patients - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a nuevos métodos predictivos y terapias personalizadas para el tratamiento de pacientes con cáncer, como el cáncer de mama. Específicamente, esta divulgación se refiere a métodos para tratar a pacientes con cáncer mediante la administración selectiva de una combinación de inhibidor de CDK 4/6 y letrozol. También se describen formas de transmisión de información, métodos de diagnóstico y kits útiles para predecir la probabilidad de que un paciente con cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, responda al tratamiento con una combinación de un inhibidor de CDK 4/6, por ejemplo, ribociclib, y un inhibidor de la aromatasa, letrozol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCION

[0003] Métodos para seleccionar un tratamiento para pacientes con cáncer de mama

[0005] Campo técnico

[0007] Esta divulgación se refiere a métodos predictivos, terapias personalizadas, kits, formas transmisibles de información y métodos para tratar a pacientes con cáncer.

[0009] Antecedentes de la divulgación

[0011] El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea con un alto grado de diversidad en cuanto a histología, respuesta terapéutica y resultados del tratamiento de las pacientes. Cada año se producen 1,1 millones de nuevos casos de cáncer de mama entre las mujeres de todo el mundo y 400 000 mujeres mueren a causa de esta enfermedad. Aunque se han logrado avances en la prevención de las muertes por cáncer de mama en las mujeres, todavía no comprendemos la biología del cáncer de mama a un nivel que explique por qué algunas pacientes responden bien al tratamiento, mientras que otras desarrollan una enfermedad recurrente con un curso inexorablemente descendente. Se necesitan urgentemente mejores opciones de tratamiento para poner fin a este estancamiento y tratar eficazmente a las pacientes con cáncer de mama.

[0012] W02015/134674 A1 se relaciona con biomarcadores que indican sensibilidad o resistencia al tratamiento con inhibidores de la ciclina D-CDK4/6 en el cáncer.

[0013] Andre Fabrice ET AL, Cancer Res, vol. 77, n.° 13S, 1 de julio de 2017, se relaciona con el estudio MONALEESA-2 de fase III MONALEESA-2 de ribociclib letrozol frente a placebo letrozol para el tratamiento de primera línea del cáncer de mama avanzado HR+, HER2-, evaluado en tumores basales por los niveles de proteína de Rb, pl 6, el marcador de proliferación celular Ki67 y por los niveles de expresión génica de CDKN2A (p16) y CCND1.

[0015] BREVE RESUMEN DE LA DESCRIPCIÓN

[0017] El presente hallazgo se basa en los novedosos métodos predictivos y terapias personalizadas para pacientes con cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, que identifican el pronóstico de los pacientes y permiten su utilización para seleccionar a los pacientes con más probabilidades de beneficiarse del tratamiento con una combinación de un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa. Específicamente, la presente invención se basa en el hallazgo de que, mediante la utilización de los biomarcadores de la invención, es posible predecir qué pacientes con cáncer de mama muestran una mayor probabilidad de supervivencia libre de progresión (PFS) si se tratan con una combinación de ribociclib y letrozol en comparación con los pacientes tratados solo con letrozol. La invención específica se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0019] En una realización, la invención incluye un inhibidor de CDK 4/6 que es ribociclib, o una sal, solvato, hidrato o cocristal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su utilización en un método de tratamiento selectivo de un paciente con cáncer de mama, que comprende: a) analizar una muestra biológica del paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1; y, a continuación, administrar selectivamente una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa seleccionado del grupo que consiste en letrozol, anastrozol y exemestano al paciente si este presenta un nivel aumentado de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A,<c>D<k>N2C, E2F1, E2F3 y RB1, relacionarse con un control. En otro aspecto, la invención incluye un método para predecir la probabilidad de que un paciente con cáncer responda al tratamiento con un inhibidor de CDK 4/6 que es ribociclib, o una sal, solvato, hidrato o cocristal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor de la aromatasa, seleccionado del grupo que consiste en letrozol, anastrozol y exemestano, que incluye el análisis de una muestra biológica del paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKNIA, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RBI, en el que un aumento en el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, C<c>N<e>1 , CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1,<e>2<f>3 y RB1, relacionarse con un control, es indicativo de una mayor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de la aromatasa.

[0021] En otro aspecto más, la invención incluye un inhibidor de CDK 4/6, que es ribociclib o una sal, solvato, hidrato o cocristal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor de la aromatasa seleccionado del grupo que consiste en letrozol, anastrozol y exemestano para su utilización en un método de tratamiento de un paciente con cáncer de mama que incluye:

[0023] a) seleccionar a la paciente para el tratamiento con un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa basándose en que la paciente presenta un aumento en el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 que se relaciona con un control; y

[0024] b) posteriormente, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de c Dk 4/6 y del inhibidor de la aromatasa a la paciente.

[0026] En otro aspecto más, la invención incluye además un paso inicial de análisis de una muestra biológica de la paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de Cc Na 2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKNIA, CDKN2C, E2F1, E2F3 y Rb 1.

[0027] En otro aspecto más, la ausencia de un aumento en el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 es indicativa de una menor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de la aromatasa.

[0029] En un aspecto final, la invención incluye ribociclib en combinación con letrozol para su utilización en un método de tratamiento de una paciente posmenopáusica con cáncer de mama avanzado HR-positivo y HER2-negativo, que no ha recibido previamente ningún tratamiento para el cáncer de mama avanzado, que comprende: analizar una muestra biológica de la paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1; y, a continuación, administrar selectivamente una cantidad terapéuticamente eficaz de ribociclib y letrozol a la paciente si esta presenta un nivel de expresión aumentado de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2,<c>D<k>4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 en relación con un control.

[0031] La muestra biológica utilizada en los métodos anteriores puede ser cualquier muestra tumoral.

[0033] En los métodos anteriores, el paso de desempeñar el análisis del nivel de expresión de uno o más genes puede realizarse detectando la expresión génica, por ejemplo, la expresión del ARNm. Se pueden utilizar técnicas seleccionadas del grupo que consiste en el análisis Northern blot, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) o los ensayos basados en TaqMan.

[0035] Otro aspecto de la presente divulgación que no forma parte de la invención incluye un método para el pronóstico de un paciente con cáncer que incluye: medir en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto el nivel de expresión génica de al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4,<c>D<k>N1A, CDKN2B, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1. b) comparar cada nivel de expresión determinado en el paso a) con un control, en el que la comparación de dicho nivel de expresión con dicho control es predictiva del pronóstico de cáncer en el sujeto. En una realización, si la expresión del gen medida en a) es mayor que el control, se determina que el sujeto tiene un mal pronóstico, por ejemplo, tiene una menor probabilidad de supervivencia libre de progresión (PFS). En otra realización, si la expresión del gen medida en a) es igual o inferior al control, se determina que el sujeto tiene un buen pronóstico, por ejemplo, tiene una mayor probabilidad de supervivencia libre de progresión (PFS).

[0037] En una realización de la invención, según los métodos anteriores, el inhibidor de CDK 4/6, ribociclib, y un inhibidor de aromatasa pueden administrarse como una combinación fija en una forma de unidad de dosificación o como un kit de piezas para la administración combinada, en el que el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de aromatasa pueden administrarse de forma independiente al mismo tiempo o por separado en intervalos de tiempo que permitan que los agentes terapéuticos tengan un efecto terapéutico.

[0039] El término “que comprende” abarca tanto “que incluye” como “que consiste en”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

[0041] El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa /-10 %, a menos que el contexto indique lo contrario.

[0043] Tal y como son utilizados en el presente documento, los términos “sujeto” y “paciente” incluyen cualquier ser humano o animal no humano. El término “animal no humano” incluye todos los vertebrados, que incluyen, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

[0045] El término “ensayo” es utilizado para referirse al acto de identificar, examinar, sondear, probar, medir o determinar, acto que puede ser desempeñado por cualquier medio convencional. Por ejemplo, una muestra puede ser ensayada para detectar la presencia de un marcador genético particular mediante la utilización de un Northern blot. El término “detectar” (y similares) significa el acto de extraer información particular de una fuente dada, que puede ser directa o indirecta. En algunas realizaciones de los métodos predictivos divulgados en el presente documento, se detecta la presencia de un elemento determinado (por ejemplo, el nivel de expresión génica, etc.) en una muestra biológica. Los términos “análisis” y “determinación” contemplan una transformación de la materia, por ejemplo, una transformación de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra tumoral, de un estado a otro mediante la realización de pruebas físicas a dicha muestra.

[0047] El término “obtener” significa adquirir, por ejemplo, tomar posesión de cualquier forma, por ejemplo, mediante intervención física (por ejemplo, biopsia) o intervención no física (por ejemplo, transmisión de información a través de un servidor), etc.

[0048] El término “combinación”, tal y como se utiliza en el presente documento, define una combinación fija en una forma de unidad de dosificación o un kit de piezas para la administración combinada en el que el inhibidor de<c>D<k>4/6 y el inhibidor de la aromatasa pueden administrarse de forma independiente al mismo tiempo o por separado en intervalos de tiempo que permiten que los agentes terapéuticos.

[0050] El término “composición farmacéutica” se define en el presente documento para referirse a una mezcla o solución que contiene al menos un agente terapéutico que se administra a un sujeto, por ejemplo, un mamífero o un ser humano, con el fin de prevenir o tratar una enfermedad o afección concreta que afecta al mamífero.

[0051] El término “farmacéuticamente aceptable” se define en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del ámbito del buen juicio médico, son adecuados para el contacto con los tejidos de un sujeto, por ejemplo, un mamífero o un ser humano, sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica y otras complicaciones problemáticas, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable.

[0052] El término “preparación combinada” se define en el presente documento para referirse especialmente a un “kit de piezas” en el sentido de que los agentes terapéuticos (a) y (b), por ejemplo, el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de la aromatasa, pueden dosificarse de forma independiente o mediante la utilización de diferentes combinaciones fijas con cantidades diferenciadas de los agentes terapéuticos (a) y (b), es decir, simultáneamente o en diferentes momentos. Las piezas del kit de piezas pueden entonces, por ejemplo, administrarse simultáneamente o de forma escalonada cronológicamente, es decir, en diferentes momentos y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier pieza del kit de piezas. La proporción de las cantidades totales del agente terapéutico (a) y del agente terapéutico (b) que se administran en la preparación combinada puede variar, por ejemplo, para adaptarse a las necesidades de una subpoblación de pacientes que se va a tratar o a las necesidades de un paciente concreto.

[0054] El término “administración combinada” o “administración de la combinación”, tal y como se utiliza en el presente documento, se define para abarcar la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un solo paciente, y se pretende que incluya regímenes de tratamiento en los que los agentes no se administran necesariamente por la misma vía de administración o al mismo tiempo.

[0056] El término “tratar” o “tratamiento”, tal y como se utiliza en el presente documento, comprende un tratamiento que alivia, reduce o mitiga al menos un síntoma en un sujeto o que retrasa la progresión de un cáncer, por ejemplo, el cáncer de mama. Por ejemplo, el tratamiento puede consistir en la disminución de uno o varios síntomas de un cáncer o en la erradicación completa de un cáncer. En el sentido de la presente invención, el término “tratar” también denota detener, retrasar la aparición (es decir, el período anterior a la manifestación clínica de un cáncer de cabeza y cuello) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar un cáncer de cabeza y cuello. El término “prevención” se utiliza en el presente documento para referirse a prevenir, retrasar o tratar, o todo ello, según corresponda, el desarrollo, la continuación o el agravamiento de un cáncer de cabeza y cuello en un sujeto.

[0058] El término “administrar” en relación con un compuesto, por ejemplo, CDK 4/6 u otro agente, se utiliza para referirse a la administración de ese compuesto a un paciente por cualquier vía.

[0060] Tal y como se utiliza en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de CDK 4/6 solo o en combinación con un inhibidor de la aromatasa que es eficaz, tras la administración de una dosis única o múltiples dosis a un paciente (como un ser humano) para tratar, prevenir, prevenir la aparición, curar, retrasar, reducir la gravedad, aliviar al menos un síntoma de un trastorno o trastorno recurrente, o prolongar la supervivencia del paciente más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan lugar al efecto terapéutico, ya sea que se administren en combinación, en serie o simultáneamente.

[0062] La expresión “recibir datos” se utiliza para ser utilizado en la obtención de información por cualquier medio disponible, por ejemplo, de forma oral, electrónica (por ejemplo, por correo electrónico, codificada en disquete u otros soportes), escrita, etc.

[0064] Tal y como se utiliza en el presente documento, “seleccionar” y “seleccionado” en referencia a un paciente se utiliza para significar que un paciente concreto es elegido específicamente de un grupo más amplio de pacientes sobre la base de (debido a) que dicho paciente cumple unos criterios predeterminados, por ejemplo, que el paciente presenta un aumento en la expresión de uno o más genes concretos. De manera similar, “tratar selectivamente” se refiere a proporcionar tratamiento a un paciente con cáncer, donde ese paciente es elegido específicamente de un grupo más grande de pacientes con cáncer sobre la base de que el paciente en particular cumple con criterios predeterminados, por ejemplo, un aumento en el nivel de expresión de uno o más genes. Similarmente, “administrar selectivamente” se refiere a administrar un fármaco a un paciente que se elige específicamente de un grupo más amplio de pacientes basándose en (debido a) que el paciente en particular cumple unos criterios predeterminados, por ejemplo, un marcador genético u otro marcador biológico concreto. Por seleccionar, tratar selectivamente y administrar selectivamente se entiende que se administra al paciente una terapia personalizada basada en su biología particular, en lugar de un régimen de tratamiento estándar basado únicamente en el hecho de que el paciente padece una enfermedad concreta. La selección, en referencia a un método de tratamiento tal y como se utiliza en el presente documento, no se refiere al tratamiento fortuito de un paciente que presenta un aumento en la expresión de uno o más genes concretos, sino que se refiere a la elección deliberada de administrar un inhibidor de CDK4/6 junto con un inhibidor de la aromatasa a un paciente en función de que este padezca un cáncer, como el cáncer de mama. Así, el tratamiento selectivo difiere del tratamiento estándar, que administra un fármaco concreto a todos los pacientes, independientemente de su estado alélico.

[0066] Tal y como se utiliza en el presente documento, “predecir” indica que los métodos descritos en el presente documento proporcionan información que permite a un profesional sanitario determinar la probabilidad de que una persona que presenta un aumento en la expresión de uno o más genes concretos responda o responda más favorablemente al tratamiento con la combinación de un inhibidor de CDK4/6 y un inhibidor de la aromatasa. No se refiere a la capacidad de predecir la respuesta con una precisión del 100 %. En cambio, el experto en la materia comprenderá que se refiere a una mayor probabilidad.

[0068] Tal y como se utilizan en el presente documento, “probabilidad” y “probable” son medidas de la probabilidad de que se produzca un evento. Pueden ser utilizados indistintamente con “probabilidad”. La probabilidad se refiere a una probabilidad que es más que una especulación, pero menos que una certeza. Así, un evento es probable si una persona razonable que utiliza el sentido común, la formación o la experiencia concluye que, dadas las circunstancias, un evento es probable.

[0069] La expresión “probabilidad aumentada” se refiere a un aumento de la probabilidad de que se produzca un evento. Por ejemplo, algunos métodos en el presente documento permiten predecir si un paciente mostrará una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un inhibidor de CDK4/6 y un inhibidor de la aromatasa o una probabilidad aumentada de responder mejor al tratamiento con un inhibidor de CDK4/6 y un inhibidor de la aromatasa en comparación con un paciente con cáncer que no presenta un aumento en la expresión de uno o más genes.

[0071] El término “sonda” se refiere a cualquier composición de materia que sea útil para detectar específicamente otra sustancia. La sonda puede ser un cebador de PCR, por ejemplo, junto con otro cebador, para amplificar una región de secuencia génica concreta.

[0073] La expresión “hibrida específicamente” se utiliza para referirse a la hibridación en condiciones de hibridación estrictas. Las condiciones estrictas son conocidas por los expertos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6. 3.6. En esa referencia se describen métodos acuosos y no acuosos, y cualquiera de ellos puede ser utilizado. Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45°C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 50°C. Un segundo ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 55°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida de al menos un lavado en SSC 0,2 X, 0,1 % de SDS a 60°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguida de al menos un lavado en 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C. Las condiciones muy estrictas incluyen la hibridación en fosfato sódico 0,5 M, 7 % de SDS a 65°C, seguido de al menos un lavado en 0,2X SSC, 1 % de SDS a 65°C.

[0075] La expresión “una región de un ácido nucleico” se utiliza para indicar una secuencia más pequeña dentro de una secuencia más grande de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un gen es una región de un cromosoma, un exón es una región de un gen, etc.

[0077] El término “capaz” se utiliza para referirse a la capacidad de lograr un resultado determinado, por ejemplo, una sonda que es capaz de detectar la presencia de una sustancia concreta significa que la sonda puede ser utilizada para detectar esa sustancia concreta.

[0079] Un “oligonucleótido” se refiere a una secuencia corta de nucleótidos, por ejemplo, de 2 a 100 bases.

[0081] El término “muestra biológica”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una muestra de un paciente, que puede utilizarse con fines de identificación, diagnóstico, predicción o seguimiento.

[0083] El término “buen pronóstico”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un paciente que presenta al menos uno de los siguientes aspectos: una disminución del riesgo de recurrencia, un aumento de las posibilidades de supervivencia libre de progresión (PFS), un aumento de la probabilidad de supervivencia, un aumento del tiempo de supervivencia o una disminución del riesgo de metástasis.

[0085] El término “mal pronóstico”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un paciente que presenta al menos uno de los siguientes factores: un aumento del riesgo de recurrencia, una disminución de las posibilidades de supervivencia libre de progresión (PFS), una disminución de la probabilidad de supervivencia, una disminución del tiempo de supervivencia o un aumento del riesgo de metástasis.

[0087] En la siguiente descripción y en las reivindicaciones adjuntas se proporcionan métodos, utilización y kits adicionales. Las características, ventajas y aspectos adicionales de la presente divulgación resultarán aparentemente evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

[0089] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0091] La figura 1A-1Q muestra las curvas de Kaplan Meier para la supervivencia libre de progresión (PFS) para diversos genes por grupo de tratamiento y subgrupo definido por los niveles de expresión génica.

[0093] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN

[0094] Cada vez hay más pruebas que sugieren que el perfil genético de un paciente puede ser determinante para su respuesta a un tratamiento terapéutico. Dadas las numerosas terapias disponibles para tratar el cáncer, la determinación de los factores genéticos que influyen, por ejemplo, en el pronóstico o en la respuesta a un fármaco concreto, podría utilizarse para proporcionar al paciente un régimen de tratamiento personalizado. Estos regímenes de tratamiento personalizados ofrecen la posibilidad de maximizar los beneficios terapéuticos para el paciente, al tiempo que se minimizan los efectos secundarios relacionados que pueden relacionarse con otros regímenes de tratamiento. Así, es necesario identificar los factores que pueden ser utilizados para predecir el pronóstico de un paciente y si es probable que este responda a una terapia concreta.

[0096] Los biomarcadores de la invención incluyen uno o más genes enumerados en la tabla 1. El nivel de expresión de uno o más genes que se muestran en la tabla 1 puede incluir la detección de productos de ácido nucleico (por ejemplo, ARN, ARNm, etc.) y/o productos polipeptídicos (por ejemplo, proteínas expresadas) obtenidos a partir de una muestra biológica.

[0097] En otro aspecto, la invención incluye el gen E2F3 enumerado en la tabla 2. El nivel de expresión de uno o más genes mostrados en la tabla 2 puede incluir la detección de productos de ácido nucleico (por ejemplo, ARN, ARNm, etc.) y/o productos polipeptídicos (por ejemplo, proteínas expresadas) obtenidos a partir de una muestra biológica.

[0099] Mediante el análisis del nivel de expresión de uno o más biomarcadores identificados en la tabla 1 o los biomarcadores de la tabla 2, es posible predecir el pronóstico de pacientes con cáncer, por ejemplo, pacientes con cáncer de mama, y así seleccionar a los pacientes con más probabilidades de responder al tratamiento con uno o varios fármacos concretos. Una realización que no forma parte de la invención puede ser utilizada para identificar a pacientes con cáncer de mama que tienen un mal pronóstico y, así, se beneficiarían del tratamiento con una combinación de un inhibidor de la aromatasa, por ejemplo, letrozol, y un inhibidor de CDK 4/6, ribociclib.

[0101] Inhibidores de CDK 4/6

[0103] El inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina 4/6 (CDK 4/6) puede ser cualquier inhibidor de CDK 4/6 conocido o una sal, solvato, hidrato, cocristal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. Se han identificado varios inhibidores de CDK 4/6, que incluyen pirido[2,3-d]pirimidinas específicamente, 2-anilinopirimidinas, diarilureas, benzoil-2,4-diaminotiazoles, indolo[6,7-a]pirrolo[3,4c]carbazoles y oxindoles (véase P. S. Sharma, R. Sharma, R. Tyagi, Curr. Cancer Drug Targets 8 (2008) 53-75).

[0105] En una realización que no forma parte de la invención, el inhibidor de CDK 4/6 es palbociclib (nombre comercial Ibrance@ de Pfizer, 1.° aprobado)

[0107] (1) Palbociclib

[0109] La forma comercial es una base libre, en cápsulas para administración oral. El compuesto está divulgado en la Patente Estadounidense 6.936.612. La dosis recomendada de IBRANCE es una cápsula de 125 mg tomada por vía oral una vez al día durante 21 días consecutivos, seguida de 7 días sin tratamiento, para completar un ciclo completo de 28 días. IBRANCE está indicado para el tratamiento del cáncer de mama avanzado o metastásico HR-positivo y HER2 negativo en combinación con

[0110] --un inhibidor de la aromatasa como terapia endocrina inicial en mujeres posmenopáusicas; o

[0111] --fulvestrant en mujeres con progresión de la enfermedad tras la terapia endocrina.

[0113] En otra realización, el CDK 4/6 es ribociclib (nombre comercial Kisqali@ de Novartis, segundo aprobado).

[0115] (2) Ribociclib (KISQALI)

[0117] KISQALI® está indicado en combinación con un inhibidor de la aromatasa como terapia endocrina inicial para el tratamiento de mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama avanzado o metastásico con receptores hormonales (HR) positivos y receptores del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) negativos. La dosis recomendada de KISQALI es de 600 mg (tres comprimidos recubiertos con película de 200 mg) por vía oral, una vez al día durante 21 días consecutivos, seguidos de 7 días sin tratamiento, lo que da como resultado un ciclo completo de 28 días. KISQALI se administra conjuntamente con 2,5 mg de letrozol una vez al día durante todo el ciclo de 28 días.

[0118] KISQALI se comercializa en forma de comprimidos para administración oral. La forma salina comercial es el succinato de ribociclib.

[0119] El ribociclib está divulgado como ejemplo 74 de la Patente Estadounidense 8.415.355. La forma salina del succinato de ribociclib se describe en la Patente Estadounidense 9.193.732.

[0120] En otra realización más que no forma parte de la invención, el inhibidor de CDK 4/6 es abemacicilib (de Lilly, que pronto se aprobará como el tercer producto en entrar en el mercado).

[0121] (3) Abemaciclib (LY2835219 de Eli Lilly)

[0124]

[0126] Inhibidores de la aromatasa:

[0127] En una realización, el inhibidor de la aromatasa es letrozol (que es un inhibidor no esteroideo). En otra realización, el inhibidor de la aromatasa puede ser anastrazol (también un inhibidor no esteroideo) o exemestano (inhibidor esteroideo irreversible).

[0128] Cáncer:

[0129] La presente divulgación puede ser utilizada con fines pronósticos y/o para seleccionar pacientes con cáncer que se beneficiarían de tratamientos específicos. Se puede detectar cualquier tipo de cáncer según los métodos en el presente documento, que incluyen, entre otros, el cáncer de colon, el cáncer de pulmón, el cáncer de páncreas, el cáncer de estómago, el cáncer de próstata y el carcinoma hepatocelular, el carcinoma basocelular, el cáncer de mama, el sarcoma óseo, el sarcoma de tejidos blandos, la leucemia mieloide crónica, la leucemia mieloide aguda, el cáncer hematológico, el meduloblastoma, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, cáncer de páncreas, carcinoma de mama, meningioma, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de vías biliares, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de células gliales, mieloma múltiple, cáncer de colon, tumor neuroectodérmico, tumor neuroendocrino, mastocitoma y síndrome de Gorlin. En una realización particular, el cáncer es cáncer de mama. En un ejemplo, el cáncer es cáncer de mama metastásico. En otro ejemplo, el cáncer de mama es de mama primario. En otro ejemplo, el cáncer de mama es de una paciente con HR positivo, HER2 negativo, o de una paciente con HR positivo, HER2 negativo, posmenopáusica, o de una paciente con HR positivo, HER2 negativo. En una realización, la paciente con cáncer de mama es HR positiva, HER2 negativa. En otra realización, la paciente con cáncer de mama es HR-positiva, HER2-negativa y posmenopáusica. En otra realización más, la paciente con cáncer de mama es HR-positiva, HER2-negativa y premenopáusica.

[0130] Preparación de muestras

[0131] Cualquier muestra de células adecuada tomada de una persona con una enfermedad proliferativa puede ser utilizada. Por lo general, la muestra de células o tejido se obtendrá del sujeto con cáncer mediante biopsia o resección quirúrgica. Se puede extraer una muestra de células, tejido o líquido mediante una biopsia por aspiración con aguja. Para ello, se inserta una aguja fina unida a una jeringa a través de la piel y en el tejido de interés. Normalmente, la aguja se guía hasta la región de interés mediante ecografía o tomografía computarizada (TC). Una vez insertada la aguja en el tejido, se crea un vacío con la jeringa para que las células o el líquido puedan aspirarse a través de la aguja y recogerse en la jeringa. También se puede extraer una muestra de células o tejido mediante biopsia incisional o por punción. Para ello, se extrae un cono, un cilindro o una pequeña porción de tejido de la región de interés. Para guiar este tipo de biopsia, se suele utilizar una tomografía computarizada, una ecografía o un endoscopio. Más concretamente, toda la lesión cancerosa puede extirparse mediante una biopsia por escisión o una resección quirúrgica. En la presente invención, la muestra de prueba suele ser una muestra de células extraídas como parte de una resección quirúrgica.

[0132] La muestra de prueba, por ejemplo de tejido, también puede almacenarse, por ejemplo, en RNA later (Ambion; Austin, Texas) o congelarse rápidamente y almacenarse a -80 °C para su utilización posterior. La muestra de tejido biopsiado también puede fijarse con un fijador, como formaldehído, paraformaldehído o ácido acético/etanol. La muestra de tejido fijada puede incluirse en cera (parafina) o resina plástica. La muestra de tejido embebida (o la muestra de tejido congelada) puede cortarse en secciones finas. El ARN o la proteína también pueden extraerse de una muestra de tejido fijada o embebida en cera o de una muestra de tejido congelada. Una vez que se extrae una muestra de células o de tejido del sujeto con cáncer, puede procesarse para aislar el ARN o la proteína utilizando técnicas bien conocidas en la técnica y tal como se describe a continuación.

[0133] Un ejemplo de extracción de ARN de una biopsia tomada de un paciente con cáncer puede incluir, por ejemplo, la lisis con tiocianato de guanidio seguida de centrifugación con CsC1 (Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979). El ARN de células individuales puede obtenerse tal y como se describe en los métodos para preparar bibliotecas de ADNc a partir de células individuales (véase, por ejemplo, Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36045, 1998; Jena, et al., J. Immunol. Methods 190: 199, 1996). En una realización, la población de ARN puede enriquecerse con secuencias de interés, como se detalla en las tablas 1 y 2. El enriquecimiento puede lograrse, por ejemplo, mediante hexámeros aleatorios y síntesis de ADNc específica de cebador, o múltiples rondas de amplificación lineal basadas en la síntesis de ADNc y la transcripción in vitro dirigida por molde (véase, por ejemplo, Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9717, 1989; Dulac, et al., supra; Jena, et al., supra).

[0135] El perfil de expresión puede desempeñar en una biopsia tomada de un sujeto, como tejido fresco, tejido congelado, tejido procesado en formalina (FFPE) u otros fijadores.

[0137] El sujeto con un tumor o cáncer será generalmente un sujeto mamífero, como un primate. En una realización ejemplar, el sujeto es un ser humano.

[0139] Detección de la expresión del biomarcador

[0141] En un ejemplo, el método que incluye determinar el nivel de expresión de uno o más de los genes CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 o productos génicos. Las secuencias génicas de interés pueden detectarse utilizando agentes que pueden ser utilizados para detectar específicamente el nivel de expresión del gen, por ejemplo, ARN transcrito a partir del gen o polipéptidos codificados por el gen.

[0143] El análisis de la secuencia del ARNm transcrito a partir de un gen determinado puede desempeñar utilizando cualquier método conocido en la técnica, que incluye, entre otros, el análisis Northern blot, los ensayos de protección con nucleasas (NPA), la hibridación in situ, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), RT-PCR ELISA, RT-PCR cuantitativa basada en TaqMan (RT-PCR cuantitativa basada en sondas), utilizando Nanostring y RT-PCR cuantitativa basada en SYBR green. En un ejemplo, la detección de los niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con un oligonucleótido que puede hibridarse con el ARNm codificado por un marcador de respuesta Al. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa o una parte del mismo, como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50 o 100 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones estrictas con el ARNm. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el marcador en cuestión se está expresando. En un formato, el ARN se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, haciendo pasar el ARN aislado por un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, como nitrocelulosa. Los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden hibridarse con las regiones 5' o 3' de un gen (cadenas positiva y negativa, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entre ellas. En general, los cebadores de amplificación tienen una longitud de entre 10 y 30 nucleótidos y flanquean una región de entre 50 y 200 nucleótidos de longitud. En condiciones adecuadas y con los reactivos apropiados, estos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores. Los productos de la PCR pueden detectarse mediante cualquier método adecuado, que incluye, entre otros, la electroforesis en gel y la tinción con un colorante específico para ADN o la hibridación con una sonda marcada.

[0145] En una realización, el método incluye: proporcionar una sonda de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, al menos 10, 15, 25 o 40 nucleótidos, y hasta toda o casi toda la secuencia codificante que es complementaria a una parte de la secuencia codificante de una secuencia de ácido nucleico de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1; obtener una muestra de tejido de un mamífero que tenga una célula cancerosa; poner en contacto la sonda de ácido nucleico en condiciones estrictas con ARN obtenido de una biopsia tomada de un paciente con cáncer (por ejemplo, en un Northern blot, un ensayo de hibridación in situ, PCR, etc.); y determinar la cantidad de hibridación de la sonda con el ARN. Los ácidos nucleicos pueden marcarse durante o después del enriquecimiento y/o la amplificación de los ARN.

[0147] Los biomarcadores CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RBI también incluyen secuencias naturales, que incluyen variantes alélicas y otros miembros de la familia. Los biomarcadores de la invención también incluyen secuencias que son complementarias a las secuencias enumeradas resultantes de la degeneración del código, así como secuencias que son suficientemente homólogas y secuencias que se hibridan en condiciones estrictas con los genes de la invención.

[0149] Las condiciones para la hibridación son conocidas por los expertos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y (1989), 6.3. 1-6.3.6. Un ejemplo preferido, no limitativo, de condiciones de hibridación altamente estrictas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 grados centígrados, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 50-65 grados centígrados. Por “suficientemente homólogo” se entiende una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de un biomarcador que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, de modo que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos comparten dominios o motivos estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos un 50 % de homología, al menos un 60 % de homología, al menos un 70 %, al menos un 80 % y al menos un 90-95 % de homología en las secuencias de aminoácidos de los dominios se definen en el presente documento como suficientemente homólogos. Por otra parte, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos con al menos un 50 % de homología, al menos un 60-70 % de homología, al menos un 70-80 %, al menos un 80-90 % y al menos un 90-95 % y que comparten una actividad funcional común se definen en el presente documento como suficientemente homólogas.

[0151] La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias pueden realizarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Dicho algoritmo se incorpora a los programas NBLAST y XBlAs T (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:40310. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden desempeñar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico TRL de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden desempeñar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las secuencias de proteínas codificadas por los genes enumerados en la tabla 1 o la tabla 2. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST, tal y como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 250. Al ser utilizado los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ALIGN de Myers y Miller, CABIOS (1989). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos ponderados PAMI 20, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

[0153] La presente invención que incluye la medición de la expresión de uno o más biomarcadores CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 en una biopsia tumoral tomada de un sujeto que padece cáncer. Los niveles de expresión pueden analizarse y ser utilizados para generar una puntuación que puede ser utilizada para diferenciar a los pacientes con un tumor que se beneficiarán del tratamiento con la combinación de un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa, en comparación con los pacientes que se beneficiarían de otros tratamientos, como el tratamiento con un inhibidor de la aromatasa solo.

[0155] En una realización, el método de la invención que incluye la medición de cualquiera de los genes CCNA2, CCNEI, CDK2, CDK4, CDKNIA, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RBI enumerados en la tabla 1. En otra realización, el método de la invención que incluye la medición de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete o al menos ocho genes, o al menos nueve biomarcadores.

[0157] En un ejemplo, se mide el nivel de expresión de un gen, por ejemplo, CCNA2, de la tabla 1, mediante la utilización de los métodos reivindicados. En otro ejemplo, utilizando los métodos reivindicados, se mide el nivel de expresión de CCNEI. En otro ejemplo más, utilizando los métodos reivindicados, se mide el nivel de expresión de CDK2, etc.

[0159] En otro ejemplo, se mide el nivel de expresión de dos genes, por ejemplo, CCNA2 y CCNEI de la tabla 1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de tres genes, CCNA2, CCNE1 y CDK2 de la tabla 1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de cuatro genes, CCNA2, CCNE1, CDK2 y CDK4 de la tabla 1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de cinco genes, CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4 y CDKN1A, de la tabla 1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de cinco genes, CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4 y CDKN1A, de la tabla 1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de seis genes CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A y CDKN2C de la tabla 1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de siete genes CCNA2, CCNE1, CDK2, c Dk4, CDKN1A, CDKN2C y E2F1. En otro ejemplo más, se mide el nivel de expresión de ocho genes: CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1 y E2F3. En otra realización más, se mide la expresión de al menos nueve genes: CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1. Se puede medir cualquier combinación de dichos genes de la tabla 1, y un aumento de la expresión que se relaciona con un control indica que ese paciente debe ser seleccionado para recibir terapia con la combinación del inhibidor de CDK 4/6 ribociclib y un inhibidor de la aromatasa, como el letrozol.

[0160] Tabla 1

[0163]

[0164] Los biomarcadores de la invención también incluyen cualquier combinación de genes identificados en la Tabla 1 cuyo nivel de expresión o producto génico sirva como marcador predictivo o biomarcador.

[0166] En el método de la invención, se mide y analiza el nivel de expresión de uno o más genes, tal y como se ha descrito anteriormente, y se utiliza (es decir, se hace “ser utilizado”) para generar una puntuación que puede emplearse para seleccionar a aquellos sujetos con buen pronóstico o con mal pronóstico y/o seleccionar a los pacientes que tienen más probabilidades de beneficiarse del tratamiento con la combinación de un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa.

[0168] Alternativamente, los biomarcadores enumerados en la tabla 2 pueden ser utilizados para seleccionar a los pacientes que más probablemente se beneficiarían del tratamiento con un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa.

[0169] Tabla 2

[0172]

[0175] En los métodos de la invención, se mide la expresión de cada biomarcador y, por lo general, se convierte en un valor de expresión tras la normalización por el nivel de expresión del gen de control único. Estos valores de expresión se utilizarán para generar una puntuación que se comparará con un umbral para seleccionar a los sujetos con buen pronóstico o con mal pronóstico y/o seleccionar a los pacientes que tienen más probabilidades de beneficiarse del tratamiento con la combinación de un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa.

[0177] Los biomarcadores de la invención pueden medirse utilizando cualquier método conocido en la técnica, como la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). El método incluye el aislamiento del ARNm utilizando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, utilizando un kit de purificación, un conjunto de tampones y una proteasa de fabricantes comerciales, como Qiagen. La etapa de transcripción inversa se inicia típicamente utilizando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo del perfil de expresión, y el ADNc derivado puede utilizarse entonces como molde en la reacción de PCR posterior. A continuación, se puede realizar la RT-PCR TaqMan(R) utilizando, por ejemplo, equipos disponibles en el mercado.

[0179] Una variante más reciente de la técnica RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación del producto de la PCR mediante una sonda fluorogénica con doble marcaje (por ejemplo, utilizando la sonda TaqMan(R)). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, en la que se utiliza un competidor interno para cada secuencia objetivo para la normalización, como con la PCR comparativa cuantitativa que utiliza un gen de normalización contenido en la muestra o un gen de mantenimiento para la RT-PCR. Para más detalles, véase, por ejemplo, Held et al, Genome Research 6:986-994 (1996).

[0181] En otro ejemplo, se utilizan microarrays que incluyen una o más sondas correspondientes a uno o más de los genes CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2B, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1. El método descrito anteriormente da como resultado la producción de patrones de hibridación de ácidos nucleicos diana marcados en la superficie del microarray. Los patrones de hibridación resultantes de los ácidos nucleicos marcados pueden visualizarse o detectarse de diversas maneras, seleccionándose la forma concreta de detección en función de la marca concreta del ácido nucleico diana. Entre los medios de detección representativos se incluyen el recuento por centelleo, la autorradiografía, la medición de fluorescencia, la medición calorimétrica, la medición de emisión de luz, la dispersión de luz y similares.

[0183] En otro ejemplo, se puede utilizar una tarjeta TaqMan® Low Density Array ( TLDA) que puede incluir una o más sondas correspondientes a uno o más de los genes CCNA2, CCNE1, CDK2, C<d>K4, CDKN1A, CDKN2B, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1. Este método utiliza una tarjeta microfluídica que realiza reacciones de PCR simultáneas en tiempo real.

[0185] En un ejemplo, el método de detección utiliza un escáner de matriz disponible en el mercado (Affymetrix, Santa Clara, California), por ejemplo, el 417. TM. Arrayer, el 418. TM. Array Scanner o el Agilent GeneArray.TM. Scanner. Este escáner se controla desde un ordenador del sistema con una interfaz y herramientas de software fáciles de usar. La salida puede importarse directamente o leerse directamente en una variedad de aplicaciones de software. Los dispositivos de escaneo se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses No. 5.143.854 y 5.424.186.

[0187] Tal y como se utiliza en el presente documento, el control para la comparación puede ser determinado por un experto en la materia. En un aspecto, el control se determina eligiendo un valor que sirva como valor de corte. Por ejemplo, el valor puede ser un valor que diferencie, por ejemplo, entre aquellas muestras de prueba que presentan un aumento en la expresión de un biomarcador de la invención y aquellas que no muestran un aumento en la expresión. En otro ejemplo, el perfil de expresión génica de un biomarcador de la invención se compara con un control (presencia de expresión del biomarcador en una muestra tomada de una persona sana).

[0189] Detección de la expresión del producto génico del biomarcador

[0190] La detección de la presencia de un producto proteico codificado por uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 puede realizarse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un agente de interés que puede utilizarse para detectar una proteína de interés concreta, por ejemplo, utilizando un anticuerpo. El método para producir anticuerpos policlonales y/o monoclonales que se unen específicamente a polipéptidos útiles en la presente invención es conocido por los expertos en la materia y puede encontrarse, por ejemplo, en Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267:4815, 1992); Boersma y Van Leeuwen, (J. Neuroscl. Methods 51:317, 1994); Green, et al., (Cell 28:477, 1982); y Arnheiter, et al., (Nature 294078, 1981). En una realización, se puede utilizar un inmunoensayo para cuantificar los niveles de proteínas en muestras celulares. La invención no se limita a un procedimiento de ensayo concreto y, por lo tanto, pretende incluir tanto procedimientos homogéneos como heterogéneos.

[0192] Entre los inmunoensayos ejemplares que pueden realizarse según la invención se incluyen el inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA)5, el inmunoensayo de fluorescencia (FIA), el inmunoensayo enzimático (EIA), el inmunoensayo de inhibición nefelométrica (NIA), el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Se puede unir un grupo indicador, o grupo marcador, a los anticuerpos en cuestión, y se selecciona de manera que satisfaga las necesidades de los diversos usos del método, que a menudo vienen dictados por la disponibilidad de equipos de ensayo y procedimientos de inmunoensayo compatibles. Las técnicas generales que se utilizan para realizar los diversos inmunoensayos mencionados anteriormente son conocidas por los expertos en la materia.

[0194] Alternativamente, se pueden utilizar otros métodos, como el análisis Western blot, que incluye la separación electroforética de proteínas en un gel de poliacrilamida y, tras teñir las proteínas separadas, se puede cuantificar la cantidad relativa de cada proteína evaluando su densidad óptica.

[0196] Alternativamente, se pueden utilizar otros métodos, como los ensayos dot-blot, FACS o inmunohistoquímica.

[0198] Normalmente, los anticuerpos generados contra los biomarcadores de la invención pueden utilizarse para visualizar la presencia de una proteína de interés que puede marcarse, por ejemplo, utilizando una molécula informadora como fluoróforos, enzimas, biotina, moléculas quimioluminiscentes, moléculas bioluminiscentes, digoxigenina, avidina, estreptavidina o radioisótopos.

[0200] En otra realización más, la invención contempla el uso de un panel de anticuerpos que se generan contra los polipéptidos marcadores de esta invención.

[0202] Análisis de datos

[0204] Para facilitar la operación de análisis de muestras, los datos obtenidos por el lector del dispositivo pueden analizarse utilizando un ordenador digital. Normalmente, el ordenador estará programado adecuadamente para recibir y almacenar los datos del dispositivo, así como para analizar y comunicar los datos recopilados, por ejemplo, restando el fondo, verificando que los controles se han realizado correctamente, normalizando las señales, interpretando los datos de fluorescencia para determinar la cantidad de objetivo hibridado, normalizando el fondo y similares.

[0206] Específicamente, el resultado puede presentarse en una forma de información transmisible que puede comunicarse o transmitirse a otros investigadores, médicos, asesores genéticos o pacientes. Dicha forma puede variar y puede ser tangible o intangible. El resultado en el individuo sometido a la prueba puede plasmarse en declaraciones descriptivas, diagramas, fotografías, gráficos, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden utilizar imágenes de electroforesis en gel de productos de PCR para explicar los resultados. Las declaraciones relativas a los niveles de expresión génica y los niveles de proteína también son útiles para indicar los resultados de las pruebas. Estas declaraciones y formas visuales pueden registrarse en un medio tangible, como papel, en un medio legible por ordenador, como disquetes, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o sitio web en Internet o intranet. En adición, el resultado también puede registrarse en forma de sonido y transmitirse a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., a través del teléfono, el fax, el teléfono móvil inalámbrico, el teléfono por Internet y similares. Todas estas formas (tangibles e intangibles) constituirían una “forma de información transmisible”. Por lo tanto, la información y los datos sobre el resultado de una prueba pueden producirse en cualquier parte del mundo y transmitirse a una ubicación diferente. Por ejemplo, al detectar el nivel de ARNm en un ensayo realizado en el extranjero, la información y los datos sobre el resultado de la prueba pueden generarse y transmitirse en una forma transmisible como se ha descrito anteriormente. El resultado de la prueba en un formato transmisible puede importarse a los Estados Unidos. En consecuencia, la presente divulgación también abarca un método para producir un formato transmisible de información que contenga los niveles de expresión de biomarcadores y/o los niveles de proteína/actividad de biomarcadores en un paciente con cáncer. Este formato de información es útil para predecir la respuesta de un paciente con cáncer, para seleccionar un curso de tratamiento basado en esa información y para tratar selectivamente a un paciente basándose en esa información.

[0208] Kits

[0210] Aunque no forma parte de la invención, la presente especificación proporciona kits para determinar el nivel de expresión de los biomarcadores descritos en el presente documento. Los kits pueden ser útiles para determinar quién se beneficiará del tratamiento con un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa. Un kit puede comprender sondas de genes identificados en la Tabla 1 que pueden utilizarse para medir la expresión génica de una muestra de prueba. En una realización, el kit comprende un medio legible por ordenador que incluye un software de análisis de perfiles de expresión capaz de cargarse en la memoria de un sistema informático y que puede convertir los valores de expresión medidos en una puntuación de riesgo. Un kit puede comprender además controles de ácido nucleico, tampones e instrucciones de uso.

[0212] Administración

[0214] El CDK 4/6 puede administrarse en cantidades terapéuticamente eficaces a través de cualquiera de los modos habituales y aceptables conocidos en la técnica, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, como un inhibidor de la aromatasa, por ejemplo, letrozol. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar ampliamente dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y la salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto utilizado y otros factores.

[0215] Los métodos de la invención pueden utilizarse para seleccionar a aquellos pacientes con cáncer, pacientes con cáncer de mama, que se beneficiarían más del tratamiento con una combinación de un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa, por ejemplo, letrozol. Los agentes terapéuticos del inhibidor de CDK 4/6 y del inhibidor de la aromatasa pueden ser una combinación fija en una forma de unidad de dosificación o un kit de componentes para la administración combinada, en el que el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de la aromatasa pueden administrarse de forma independiente al mismo tiempo o por separado en intervalos de tiempo.

[0217] Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, que podrían utilizarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos.

[0219] EJEMPLOS

[0221] Ejemplo 1: MONALEESA-2, un estudio aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo de LEE011 en combinación con letrozol para el tratamiento de mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama avanzado, receptor hormonal positivo y HER2 negativo, que no habían recibido tratamiento previo para la enfermedad avanzada.

[0223] Métodos

[0226]

[0228] Figura: diseño del estudio - estudio CLEE011A2301

[0230] Participantes en el estudio

[0232] La población de pacientes estaba formada por mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama avanzado HR-positivo y HER2-negativo, que no habían recibido previamente ningún tratamiento para su cáncer de mama avanzado.

[0234] Los principales criterios de inclusión fueron los siguientes:

[0236] • Mujeres adultas posmenopáusicas (>18 años) en el momento del consentimiento informado.

[0237] • Mujeres con cáncer de mama avanzado (recidiva locorregional o metastásico) no susceptible de tratamiento curativo.

[0238] • El estado posmenopáusico se definió por:

[0239] <o>Ooforectomía bilateral previa

[0240] <o>Edad >60

[0241] <o>Edad < 60 y amenorrea durante 12 o más meses (en ausencia de quimioterapia, tamoxifeno, toremifeno o supresión ovárica) y hormona folículoestimulante (FSH) y estradiol en el rango posmenopáusico según el rango normal local.

[0242] • Confirmación histológica y/o citológica de cáncer de mama positivo para receptores de estrógeno (ER) y/o positivo para receptores de progesterona por un laboratorio local.

[0243] • Pacientes diagnosticadas con cáncer de mama HER2 negativo, definido como una prueba de hibridación in situ negativa o un estado de inmunohistoquímica (IHC) de 0, 1+ o 2+. Si la IHC era 2+, se requería una prueba de hibridación in situ negativa (hibridación in situ fluorescente [FISH], hibridación cromosómica in situ [CISH] o hibridación in situ mejorada con plata [SISH]) realizada por un laboratorio local.

[0245] La paciente presentaba:

[0247] • Enfermedad medible, es decir, al menos una lesión medible según los criterios RECIST 1.1

[0248] • Al menos una lesión ósea predominantemente lítica (las pacientes con una sola lesión ósea predominantemente lítica que hubiera sido irradiada previamente eran elegibles si había evidencia documentada de progresión de la enfermedad de la lesión ósea después de la irradiación).

[0249] • Estado funcional ECOG 0 o 1.

[0251] Los principales criterios de exclusión fueron:

[0253] • Pacientes que hubieran recibido previamente cualquier inhibidor de CDK4/6.

[0254] • Pacientes con cáncer de mama inflamatorio.

[0255] • Pacientes que habían recibido previamente cualquier terapia anticancerígena sistémica (incluida la terapia hormonal y la quimioterapia) para el cáncer de mama avanzado

[0256] • Los pacientes que recibieron terapia (neo)adyuvante para el cáncer de mama eran elegibles. Si la terapia neo (adyuvante) previa incluía letrozol o anastrozol, el intervalo libre de enfermedad debía ser superior a 12 meses desde la finalización del tratamiento hasta la aleatorización. Se admitieron pacientes que habían recibido menos de <14 días de letrozol o anastrozol para la enfermedad avanzada antes de la aleatorización.

[0257] • Cualquier terapia anticancerígena (neo)adyuvante previa debía interrumpirse al menos 5 vidas medias o 7 días, lo que fuera más largo, antes de la aleatorización.

[0258] • Pacientes que actualmente recibían otra terapia anticancerígena.

[0259] • Pacientes con metástasis en el sistema nervioso central (SNC).

[0260] • Pacientes que tenían una enfermedad cardíaca activa o antecedentes de disfunción cardíaca, incluyendo cualquiera de los siguientes:

[0261] <o>Antecedentes de angina de pecho, pericarditis sintomática o infarto de miocardio en los 12 meses anteriores al inicio del estudio.

[0262] <o>Antecedentes documentados de insuficiencia cardíaca congestiva (clasificación funcional III-IV de la New York Heart Association).

[0263] <o>Miocardiopatía documentada

[0264] <o>Fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) <50 % según lo determinado por una gammagrafía de captación múltiple (MUGA) o un ecocardiograma (ECHO)

[0265] <o>Antecedentes de cualquier arritmia cardíaca, por ejemplo, arritmias ventriculares, supraventriculares, nodales o anomalías de la conducción en los 12 meses anteriores.<o>En la selección, cualquiera de los siguientes parámetros cardíacos: bradicardia (frecuencia cardíaca en reposo), taquicardia (frecuencia cardíaca >90 en reposo), intervalo del pulso >220 ms, intervalo QRS >109 ms o QTcF >450 ms.

[0266] <o>Presión arterial sistólica >160 o <90 mmHg.

[0267] • Pacientes que actualmente recibían alguno de los siguientes medicamentos y no podían suspenderlo siete días antes del inicio del tratamiento:

[0268] <o>Inductores o inhibidores potentes conocidos del CYP3A4/5.

[0269] <o>Aquellos con un riesgo conocido de prolongar el intervalo QT o inducir torsades de pointes.<o>Aquellos con un margen terapéutico estrecho y que se metabolizan predominantemente a través del CYP3A4/5.

[0270] <o>Preparados/medicamentos a base de hierbas.

[0271] <o>Suplementos dietéticos (excepto vitaminas).

[0273] • Pacientes que estaban recibiendo o habían recibido corticosteroides sistémicos dos semanas antes de iniciar el fármaco del estudio, o que no se habían recuperado completamente de los efectos secundarios de dicho tratamiento.

[0275] Nota: Se permitió el uso de los siguientes corticosteroides: dosis únicas de aplicaciones tópicas (por ejemplo, para erupciones cutáneas), aerosoles inhalados (por ejemplo, para enfermedades obstructivas de las vías respiratorias) y gotas oftálmicas o inyecciones locales (por ejemplo, intraarticulares).

[0277] Tratamientos

[0279] Grupo A : Ribociclib (600 mg una vez al día, días 1-21 de un ciclo de 28 días) letrozol (2,5 mg una vez al día, días 1-28 de un ciclo de 28 días).

[0280] Grupo B: placebo (una vez al día, días 1 -21 de un ciclo de 28 días) letrozol (2,5 mg una vez al día, días 1 -28 de un ciclo de 28 días de forma continua).

[0281] La dosis de ribociclib/placebo podía reducirse a 400 mg (primera reducción) y 200 mg (segunda reducción), mientras que no se preveía ninguna modificación de la dosis de letrozol en el estudio.

[0282] Las pacientes recibieron el tratamiento del estudio hasta la progresión de la enfermedad, la aparición de toxicidad inaceptable, el fallecimiento o la interrupción del tratamiento del estudio por cualquier otro motivo.

[0284] Objetivos

[0286] Objetivo principal

[0288] El objetivo principal era comparar la supervivencia libre de progresión (PFS) en pacientes tratadas con ribociclib y letrozol con la de pacientes tratadas con placebo y letrozol, según la revisión de los investigadores.

[0290] Objetivos secundarios

[0292] El objetivo secundario clave del estudio era comparar los dos grupos de tratamiento con respecto a la supervivencia global (OS).

[0294] Otros objetivos secundarios fueron:

[0296] - Evaluar los dos grupos de tratamiento con respecto a la tasa de respuesta global (TRG) y la tasa de beneficio clínico (TBC).

[0297] - Evaluar los dos grupos de tratamiento con respecto al tiempo hasta el deterioro del estado funcional según la escala del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG).

[0298] - Evaluar la seguridad y la tolerabilidad de ribociclib en combinación con letrozol.

[0299] - Evaluar los resultados comunicados por los pacientes (PRO) en relación con la calidad de vida relacionada con la salud (QoL) en los dos grupos de tratamiento.

[0301] Objetivos exploratorios

[0303] Tiempo hasta la respuesta, duración de la respuesta, exposición al ribociclib y al letrozol, efectos sobre la supresión del estradiol para la combinación frente a la monoterapia, relación exposición-respuesta, utilización de recursos hospitalarios, alteraciones de las vías de señalización, ADN circulante, mecanismos de resistencia.

[0305] Resultados/criterios de valoración

[0307] La SLP se determinó mediante la revisión por parte de los investigadores de los datos radiológicos utilizando los criterios RECIST versión 1.1. Las evaluaciones tumorales (TC con contraste intravenoso o sin contraste intravenoso combinada con evaluación visual por RM, fotografía) se realizaron cada 8 semanas durante los primeros 18 meses y, a partir de entonces, cada 12 semanas hasta la progresión de la enfermedad y al final del tratamiento.

[0309] La SLP se definió como el tiempo transcurrido desde la fecha de aleatorización hasta la fecha de la primera progresión documentada de la enfermedad o la muerte por cualquier causa. La interrupción por progresión no RECIST no se contabilizó como un evento de SLP. Si un paciente iniciaba otra terapia antineoplásica o faltaban dos o más evaluaciones tumorales, la SLP se censuraba en la última evaluación tumoral adecuada, independientemente de los eventos posteriores.

[0311] Se utilizó un comité de revisión independiente ciego (BIRC) para revisar los datos radiológicos (y fotográficos). Al inicio del estudio, el BIRC estaba formado por un único lector de radiología y un oncólogo que revisaba todos los datos de determinados pacientes en los que no se podía confirmar completamente la progresión radiológica. La decisión sobre el tratamiento del paciente seguía correspondiendo al investigador.

[0313] La supervivencia global (SG) fue un criterio de valoración secundario clave. La supervivencia global (SG) se definió como el tiempo transcurrido desde la fecha de aleatorización hasta la fecha de muerte por cualquier causa.

[0315] Otras variables secundarias de eficacia fueron la ORR, la CBR y el estado funcional ECOG. La ORR se definió como la proporción de pacientes con la mejor respuesta global de RC o RP confirmada según los criterios RECIST 1.1, y la CBR se definió como la proporción de pacientes con la mejor respuesta global de RC o RP confirmada o enfermedad estable (EE) que duró 24 semanas o más, según los criterios RECIST 1. 1.

[0317] Los resultados comunicados por los pacientes (PRO) se evaluaron utilizando el cuestionario QLQ-C30 (versión 3.0) de la Organización Europea para la Investigación y el T ratamiento del Cáncer (EORTC), junto con el módulo específico para el cáncer de mama (EORTC QLQ-BR23, versión 1.0) y el instrumento EuroQoL de 5 niveles (EQ-5D-5L, versión 4.0) para explorar los impactos en la calidad de vida relacionada con la salud, el funcionamiento, los síntomas de la enfermedad y los efectos secundarios relacionados con el tratamiento.

[0319] Tamaño de la muestra

[0320] Inicialmente se planeó aleatorizar a 500 pacientes. En una enmienda al protocolo del estudio (enmienda 2, 25 de noviembre de 2014), el tamaño de la muestra del estudio se aumentó a 650 para caracterizar mejor el efecto de ribociclib y letrozol sobre la supervivencia global.

[0322] Se estimó que la media de la duración de la SLP en el grupo de control (placebo más letrozol) sería de 9,0 meses, y que el tratamiento con el grupo de tratamiento de prueba (ribociclib más letrozol) daría lugar a una reducción del 33 % en la tasa de riesgo (lo que corresponde a un aumento de la mediana de la SLP a 13,43 meses).

[0324] Si la tasa de riesgo real era de 0,67 (bajo la hipótesis alternativa), se requerían un total de 302 eventos de SLP para tener una potencia del 93,5 % con un nivel de significación global unilateral del 2,5 % para rechazar la hipótesis nula (HR = 1) utilizando una prueba de log-rank y un diseño secuencial de grupos de 2-100k con Haybittle-Peto para determinar el límite de eficacia para el análisis provisional. Teniendo en cuenta un período de reclutamiento de aproximadamente 16 meses a una tasa uniforme de 37 pacientes/mes, era necesario aleatorizar a 592 pacientes a los dos grupos de tratamiento en una proporción de 1:1. Suponiendo que se perdería aproximadamente el 10 % de los pacientes durante el seguimiento de la SLP, era necesario aleatorizar a un total de 650 pacientes. Teniendo en cuenta las hipótesis anteriores, se estimó que el evento SLP número 302 se observaría aproximadamente a los 20 meses desde la fecha de aleatorización del primer paciente en el estudio.

[0326] Se esperaba que la media de la SG en el grupo de letrozol solo fuera de unos 34 meses. Se planteó la hipótesis de que el grupo de tratamiento de prueba (ribociclib más letrozol) daría lugar a una reducción del 28 % en la tasa de riesgo para la supervivencia global (lo que correspondería a un aumento de la mediana de supervivencia a 47,2 meses).

[0327] Si la tasa de riesgo real era de 0,72 (bajo la hipótesis alternativa), era necesario observar un total de 400 muertes para tener una potencia del 90 % con un nivel de significación unilateral del 2,5 % para rechazar la hipótesis nula (HR = 1) utilizando una prueba de log-rank y un diseño secuencial de 4 grupos.

[0329] Aleatorización

[0331] Los pacientes elegibles fueron aleatorizados utilizando el sistema IRT en una proporción de 1:1.

[0332] La aleatorización se estratificó según la presencia de metástasis hepáticas y/o pulmonares (sí frente a no).

[0334] Cegamiento (enmascaramiento)

[0336] Estudio doble ciego.

[0338] Métodos estadísticos

[0340] Se trataba de un ensayo de superioridad, con la potencia estadística necesaria para detectar una diferencia (como mínimo) correspondiente a una mediana de la SLP de 13,43 meses (grupo experimental) frente a 9 meses (grupo control), con una probabilidad del 93,5 % (HR 0,67, nivel de significación global unilateral del 2,5 %, prueba de log-rank). También se utilizó un diseño secuencial de dos grupos con un análisis intermedio de superioridad. Se planeó realizar el análisis intermedio después de aproximadamente 211 eventos, lo que requería un valor p < 0,0000129 para concluir la superioridad, mientras que el análisis final se planeó después de 302 eventos, lo que requería un valor p de 0,02499 para la significación estadística.

[0342] Suponiendo una media de SG de 47,2 meses para el grupo experimental frente a 34 para el grupo control (HR de 0,72), se necesitarían 400 eventos para obtener una potencia del 90 % para detectar una diferencia (nivel de significación global unilateral del 2,5 %, prueba de log-rank, diseño secuencial de 4 grupos). Se planificó realizar los cuatro análisis de SG después de 76 (análisis provisional de SLP), 120 (análisis final de SLP), 300 y 400 muertes.

[0344] Los investigadores y los pacientes permanecerán cegados al tratamiento del estudio y se seguirá realizando un seguimiento de la SG de todos los pacientes hasta el análisis final de SG (o antes, si la SG alcanza significación estadística en cualquiera de los análisis provisionales).

[0346] Se utilizó una estrategia de pruebas jerárquicas, en la que la SG solo se evaluaba estadísticamente si el criterio de valoración principal de eficacia, la SLP, era estadísticamente significativo, para controlar la tasa global de error de tipo I.

[0347] Todos los análisis de eficacia se realizaron utilizando el conjunto de análisis completo (FAS), que incluía a todos los pacientes aleatorizados. De acuerdo con el principio de intención de tratar, los datos de los pacientes se analizaron según el tratamiento y el estrato al que habían sido asignados en la aleatorización. Los análisis de eficacia incluyeron todos los datos observados en los pacientes del FAS, independientemente de si se observaron durante el tratamiento o después de la interrupción del tratamiento del estudio hasta la fecha de corte del análisis.

[0349] Como análisis de apoyo, el análisis primario de la SLP se repitió utilizando los datos de las evaluaciones del BIRC con el FAS y las mismas convenciones que en el análisis primario.

[0351] Se planificaron varios análisis de sensibilidad para evaluar la solidez general de los resultados primarios de eficacia. Estos análisis incluyeron la repetición del análisis primario de eficacia utilizando el conjunto por protocolo, una prueba de logrank no estratificada y diferentes reglas de censura.

[0353] Resultados

[0354] Flujo de participantes

[0357]

[0360] Ejemplo 2: Recogida y registro de muestras

[0361] El análisis de biomarcadores se realizó en muestras de tejido tumoral fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) proporcionadas por centros de estudios clínicos.

[0362] Resumen de los métodos analíticos: expresión génica mediante la tecnología NanoString

[0363] Utilizando los ensayos de expresión génica Counter ofrecidos por NanoString® Technologies, Inc., diseñados para proporcionar un método ultrasensible, reproducible y altamente multiplexado para el perfilado de la expresión génica en todos los niveles de expresión biológica. La metodología permite la detección directa de ARNm con códigos de barras moleculares denominados sondas nCounter Reporter, sin necesidad de utilizar transcripción inversa o amplificación. El kit de referencia nCounter GX Human Cancer (NanoString, número de catálogo 50091) es un conjunto completo de 230 genes relacionados con el cáncer humano y seis genes de referencia internos. Estos genes representan una amplia gama de procesos relevantes relacionados con el cáncer.

[0365] Extracción de ARN

[0367] Se cortaron de cuatro a ocho secciones de FFPE de 5 ± 1 gm para cada muestra que contenía un contenido tumoral superior o igual al 10 %, según lo determinado por la revisión del patólogo de la sección de tejido adyacente teñida con hematoxilina y eosina (H&E). Las secciones se desparafinaron utilizando el tiñedor automático Tissue-Tek Prisma y se macrodissecaron según la región tumoral especificada durante la revisión por parte del patólogo de la sección de tejido teñida con H&E. El ARN se extrajo de los raspados de tejido utilizando el procedimiento manual basado en centrifugación del kit Qiagen RNEasy FFPE, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la extracción, el ARN se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 8000.

[0369] Configuración de la reacción NanoString

[0371] Las reacciones de hibridación se prepararon de acuerdo con el protocolo NanoString para la expresión génica utilizando reactivos heredados con una entrada mínima de ARN de 50 ng en un volumen máximo de 10 gL. La hibridación se llevó a cabo durante 20 ± 4 horas a 65 ° C, tras lo cual las muestras se purificaron y analizaron utilizando la estación de preparación NanoString nCounter® GEN2 y el analizador digital.

[0373] Análisis de datos NanoString

[0374] Para cada muestra, se obtuvieron archivos RCC (.rcc) que contenían datos de recuento sin procesar del analizador digital NanoString nCounter® GEN2 y se cargaron en NanoString nSolver™ V1.1 para su procesamiento.

[0376] Se realizó la normalización de los datos de control positivo ERCC en todas las muestras que superaron los criterios de control de calidad utilizando la función de normalización de control positivo de nSolver™ V1. 1. Los valores normalizados del control positivo ERCC resultantes según las especificaciones del proveedor se transfirieron a la base de datos clínica para su posterior análisis.

[0378] El conjunto de análisis incluye 410 pacientes del ITT (intención de tratar) con evaluaciones NanoString en el estudio CLEE011A2301/MONALEESA-2. Se realizaron análisis de subgrupos para identificar si las expresiones génicas de ARN basales del gen único estaban asociadas con la eficacia del tratamiento con ribociclib.

[0380] Los pacientes se clasificaron en subgrupos de biomarcadores altos (> media) y bajos (<= media) según los niveles de expresión medianos de cada gen individual. Se estimaron los valores de Kaplan-Meier de la mediana del tiempo de supervivencia libre de progresión (PFS) para ambos grupos de tratamiento dentro de cada subgrupo. Se utilizaron modelos de riesgos proporcionales de Cox estratificados por metástasis hepáticas y/o pulmonares según IRT (Interactive Response Technologies) para calcular las razones de riesgo, así como los intervalos de confianza del 95 % para ribociclib 600 mg letrozol 2,5 mg frente a placebo letrozol 2,5 mg en cada subgrupo. Se utilizaron pruebas de log-rank para comprobar la diferencia en las distribuciones de supervivencia entre los subgrupos de tratamiento y expresión génica.

[0382] Se evaluó la correlación entre la eficacia (PFS) y la expresión génica de los siguientes genes que intervienen directamente en la progresión del ciclo celular. Estos genes son: CDKN1A, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CCND1, CCND2, CCND3, CCNA2, E2F1, E2F3, TFDP1 y RB1. Como se muestra a continuación, estos análisis exploratorios con los biomarcadores relacionados con la vía CDK4/6 mencionados anteriormente indicaron que todas las pacientes se beneficiaron del tratamiento combinado de ribociclib y letrozol. La SLP del grupo tratado solo con letrozol varió con varios de estos biomarcadores; sin embargo, la combinación de ribociclib y letrozol mejoró de forma consistente la SLP.

[0384] Tabla 3: Análisis de subgrupos de la asociación de la SLP con los niveles de expresión del ARNm de genes individuales específicos medidos mediante la tecnología NanoString. Los niveles bajos y altos de expresión del ARNm se definieron mediante el valor de corte mediano para cada gen.

[0385]

[0388] Los resultados del estudio muestran que determinados pacientes que presentan una firma biomarcadora concreta (es decir, que presentan un aumento en uno o más de los biomarcadores que se muestran en la tabla 1) tienen más probabilidades de sobrevivir sin progresión de la enfermedad cuando se tratan con la combinación de ribociclib y letrozol que cuando se tratan solo con letrozol.

[0390] Ejemplo 3: Descripción del método para la generación de la firma genética

[0392] Se ajustó un modelo de riesgos proporcionales de Cox con el tratamiento, la metástasis hepática/pulmonar, que es el factor de estratificación del estudio, los efectos de los 16 genes, incluidos CCNA2, CCND1, CCND2, CCND3, CCNEI, CDK2, CDK4, CDK6, CDKN1A, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, E2F1, E2F3, RB1 y TFDP1, y las interacciones entre los genes y el tratamiento. Se realizó una selección de modelos hacia atrás para seleccionar las variables ajustadas que están significativamente asociadas con la supervivencia libre de progresión (PFS). Se identificó un conjunto de genes (CDKN2A y E2F3) con interacciones significativas entre los genes y el tratamiento en el modelo mediante la selección de modelos hacia atrás. Las puntuaciones de la firma de todas las muestras se calcularon como la suma ponderada de los valores de expresión génica, donde las ponderaciones eran los coeficientes de regresión de las respectivas interacciones entre genes y tratamientos en el modelo de riesgos proporcionales de Cox. Los pacientes se clasificaron en subgrupos altos y bajos utilizando la puntuación mediana de la firma como valor de corte. Se calcularon la mediana de la PFS y la razón de riesgos, junto con los intervalos de confianza del 95 %, para cada subgrupo de pacientes.

[0394] Resultado: Mediante la selección de modelos hacia atrás, se obtuvo una firma de dos genes (CDKN2A y E2F3). La figura 1Q y la tabla 4 son los resultados del análisis de subgrupos, los grupos de expresión de la firma génica alta y baja se definen por la puntuación mediana de la firma como valor de corte.

[0395]

[0397] Ribociclib = LEE Tabla 4

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de CDK 4/6 que es ribociclib, o una sal, solvato, hidrato o cocristal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su utilización en un método de tratamiento selectivo de un paciente con cáncer de mama, que comprende:

a) analizar una muestra biológica del paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1; y a continuación, administrar selectivamente una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa seleccionado del grupo que consiste en letrozol, anastrozol y exemestano al paciente si este presenta un nivel aumentado de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 en relación con un control.

2. Método para predecir la probabilidad de que un paciente con cáncer de mama responda al tratamiento con un inhibidor de CDK 4/6 que es ribociclib, o una sal, solvato, hidrato o cocristal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor de la aromatasa seleccionado del grupo que consiste en letrozol, anastrozol y exemestano, que comprende: el análisis de una muestra biológica del paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1, en el que un aumento en el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKNIA, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1, cuando se relacionan con un control, es indicativo de una mayor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de la aromatasa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la ausencia de un aumento en el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 es indicativo de una menor probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el inhibidor de CDK 4/6 y el inhibidor de la aromatasa.

4. Un inhibidor de CDK 4/6 que es ribociclib, o una sal, solvato, hidrato o cocristal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor de la aromatasa seleccionado del grupo que consiste en letrozol, anastrozol y exemestano, para utilizar en un método de tratamiento de un paciente con cáncer de mama, que comprende:

a) seleccionar al paciente para el tratamiento con un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa basándose en que el paciente presenta un aumento en el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 que se relaciona con un control; y b) posteriormente, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de CDK 4/6 y del inhibidor de la aromatasa a la paciente.

5. Un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa para utilizar según la reivindicación 4, en el que el método comprende un paso inicial de análisis de una muestra biológica del paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKNIA, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1.

6. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de la aromatasa para utilizar según la reivindicación 4 o 5, o un método según la reivindicación 2, 3 o 5, en el que la muestra biológica es una muestra tumoral.

7. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de aromatasa para utilizar según las reivindicaciones 4-6, o un método según las reivindicaciones 2, 3 o 6, en el que el paso de análisis comprende una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y ensayos basados en TaqMan.

8. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de aromatasa para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, o un método según la reivindicación 2, 3, 6 o 7, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos dos genes.

9. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de aromatasa para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, o un método según la reivindicación 2, 3 o 6-8 que comprende determinar el nivel de expresión de al menos cinco genes.

10. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de aromatasa para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, o un método según la reivindicación 2, 3 o 6 a 9, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos ocho genes.

11. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de aromatasa para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, o un método según la reivindicación 2, 3, 6-10, en el que el cáncer de mama es HR-positivo, HER2-negativo; HR positivo, HER2 negativo, posmenopáusico; o HR positivo, HER2 negativo, premenopáusico.

12. Un inhibidor de CDK 4/6 para utilizar según la reivindicación 1, o un inhibidor de CDK 4/6 y un inhibidor de aromatasa para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 4-11, o un método según las reivindicaciones 2, 3, 6-11,

en el que el inhibidor de aromatasa es letrozol.

13. Ribociclib en combinación con letrozol para su utilización en un método de tratamiento de una paciente posmenopáusica con cáncer de mama avanzado HR positivo, HER2 negativo, que no ha recibido previamente ningún tratamiento para el cáncer de mama avanzado, que comprende:

analizar una muestra biológica de la paciente para determinar el nivel de expresión de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, C<d>K<n>2C, E2F1, E2F3 y RB1; y, a continuación, administrar selectivamente una cantidad terapéuticamente eficaz de ribociclib y letrozol a la paciente si esta presenta un nivel de expresión aumentado de uno o más de CCNA2, CCNE1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN2C, E2F1, E2F3 y RB1 en relación con un control.