ES3049846T3 - Antimicrobial agent - Google Patents

Abstract

Un compuesto según la fórmula (I) o la fórmula (Ia), y una composición que comprende el compuesto para su uso como antimicrobiano: en donde, X1, X2, X3 y X4 se seleccionan cada uno independientemente de: N, O, S; Y1 e Y2 se seleccionan cada uno independientemente de: N, O, S, C(Ra); M1 y M2 son cada uno un centro metálico; R1, R2, R3, R4 y Ra se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, haloalquilo, haloalquenilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o una combinación de los mismos; A1, A2, A3 y A4 son cada uno ligandos bidentados; y los anillos D1 y D2 comprenden cada uno independientemente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S, C(Ra); en donde dicho compuesto es para su uso como antimicrobiano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Agente antimicrobiano

[0005] Campo de la invención

[0007] La invención se refiere a compuestos para su uso en el tratamiento de infecciones microbianas, específicamente infecciones bacterianas. También se describen nuevos compuestos, métodos para fabricar dichos compuestos y métodos para tratar enfermedades y trastornos causados por infecciones antimicrobianas.

[0009] Antecedentes

[0011] Aunque los complejos de polipiridilo y Ru(II) han sido muy estudiados como sondas de imágenes y candidatos terapéuticos contra el cáncer, los estudios biológicos iniciales se centraron en su potencial como antimicrobianos. En un trabajo que en muchos aspectos fue adelantado a su tiempo, el grupo Dwyer demostró que los derivados lipófilos de [Ru(phen)<3>]<2+>(phen = 1,10-fenantrolina) que contienen ligandos de fenilo metilados son activos contra una variedad de bacterias, en particular las especies Gram positivas, que no pueden desarrollar resistencia a estas estructuras. Dado que se descubrió que las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de estos complejos eran relativamente altas en comparación con las de los antibacterianos comerciales contemporáneos, este trabajo no se desarrolló más. Sin embargo, en el contexto moderno de una crisis de salud mundial que está surgiendo rápidamente debido al aumento de la resistencia a los antimicrobianos (AMR), se está revisando la actividad de dichas estructuras.

[0013] Recientemente se descubrió que la unión de unidades de [Ru(phen)<3>]<2+>entre sí usando conectores flexibles basados en metileno de diferentes longitudes produce complejos con actividad considerablemente mayor (MIC más bajas). El mecanismo de actividad de estos compuestos todavía se está explorando. Se ha planteado la hipótesis de que se acumulan en los ribosomas, produciendo la condensación de los polisomas, pero también se ha sugerido que la absorción celular y la actividad antibacteriana de esta clase de compuestos se deben a su capacidad de atravesar la membrana. Sin embargo, excepto por un ejemplo notable que implica un complejo mononuclear, estos sistemas presentan una actividad menor contra especies Gram negativas tales como Escherichia coli. De hecho, las especies Gram negativas patógenas son un problema de AMR particularmente pernicioso. Por ejemplo, en su informe reciente, la Organización Mundial de la Salud declaró que una era posterior a los antibióticos es "una posibilidad muy real para el siglo XXI" e identificó a las Gram negativas Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y miembros de las enterobacterias que constituyen la mayoría del grupo ESKAPE de infecciones graves nosocomiales como sus tres patógenos de prioridad 1 (críticos) en su "Lista de patógenos prioritarios para I+D". La urgencia de la situación se ve agravada por la falta de nuevos candidatos terapéuticos: hace más de 50 años que no se ha aprobado ninguna nueva clase de antibióticos para patógenos Gram negativos y, desde 2010, solo un compuesto nuevo ha entrado en la fase de desarrollo de antibióticos a través de ensayos de fase 1. Esta situación ha provocado llamamientos para aumentar la diversidad química en la búsqueda de candidatos químicos. También se ha sugerido que la falta de "candidatos de puntos de partida" moleculares completamente nuevos es el mayor obstáculo para el descubrimiento de antibióticos.

[0015] Se han realizado algunas investigaciones sobre los complejos de rutenio como agentes de formación de imágenes para especies bacterianas, en particular para su uso en microscopía confocal (véase, por ejemplo, la publicación internacional WO2009/050509). Sin embargo, hasta la fecha, no se han descubierto complejos de rutenio sustancialmente eficaces que puedan formar la base de una nueva clase de antibióticos y/o antimicrobianos.

[0017] La invención pretende resolver, o al menos mejorar, este problema.

[0019] Compendio de la invención

[0021] Se proporciona, en un primer aspecto de la invención, como se define en la reivindicación 1, un compuesto para usar como antimicrobiano según la fórmula (I) o fórmula (Ia):

[0022]

[0024] fórmula (la)

[0025] en donde,

[0026] X<i>, X<2>, X<3>y X<4>son cada uno N;

[0027] Y<i>e Y<2>se seleccionan cada uno independientemente de: N o C(R<a>);

[0028] M<1>y M<2>son cada uno un centro metálico, en donde M<1>y M<2>son cada uno rutenio;

[0029] R<1>, R<2>, R<3>, R<4>y R<a>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, haloalquilo, haloalquenilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o combinaciones de los mismos; y

[0030] A<1>, A<2>, A<3>y A<4>son cada uno ligandos bidentados;

[0031] en donde los anillos D<1>y D<2>comprenden cada uno independientemente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S, C(R<a>);

[0032] en donde el ligando bidentado es un compuesto según la fórmula (III)

[0035]

[0036] en donde,

[0038] Z<i>y Z<2>son cada uno N; y

[0040] R<5>, R<6>y R<7>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, haloalquilo, haloalquenilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o combinación de los mismos.

[0042] Los autores de la invención han descubierto que los complejos funcionalizados bidentados según la fórmula (I) o fórmula (Ia) no solo pueden funcionar como agentes de formación de imágenes eficaces, sino que también proporcionan propiedades antimicrobianas notables. Sin pretender estar ligados por la teoría, se plantea la hipótesis de que estos compuestos inicialmente dañan las membranas celulares, atacando tanto las membranas externas como internas (desgarrándose y "formando vesículas", respectivamente). Además, se cree que los compuestos de fórmula (I) interaccionan con las cardiolipinas, un lípido con doble carga negativa en la solapa s de la membrana interna.

[0044] Con respecto a los compuestos de fórmula (Ia), de nuevo sin estar ligados por la teoría, se cree que estos compuestos se dirigen al ADN.

[0046] Típicamente ocurre que dichos compuestos del primer aspecto de la invención son para usar como antibióticos. Aunque estos compuestos pueden usarse para tratar una amplia variedad de microbios, se ha descubierto que los compuestos según el primer aspecto de la invención son sorprendentemente eficaces contra bacterias. Esto es especialmente cierto con respecto a las bacterias Gram negativas, contra las que los compuestos del primer aspecto de la invención son particularmente eficaces. Sin embargo, también se prevé que los compuestos reivindicados puedan ser útiles contra bacterias Gram positivas.

[0048] No hay restricción particular en cuanto a las bacterias contra las que pueden desplegarse los compuestos de la invención. Sin embargo, típicamente ocurre que los compuestos del primer aspecto de la invención se usan para tratar una o más especies bacterianas seleccionadas de:E. coli, A. baumannii, B. cenocepacia, P. aureginosa, S. aureus, E. faecalisystreptocccus.

[0050] Para evitar dudas, el término "alquilo" pretende tener su significado habitual y abarca hidrocarburos saturados lineales, ramificados y cíclicos que tienen una longitud de carbonos en el intervalo de C<1>a C<30>. A menudo, el grupo alquilo será lineal o ramificado, típicamente lineal. Aunque la longitud exacta del grupo alquilo puede variar, típicamente ocurre que el grupo alquilo tiene una longitud de carbonos en el intervalo de C<1>a C<20>, más típicamente de C<1>a C<12>, más típicamente de C<1>a C<8>, y lo más típicamente de C<1>a C<6>. Los grupos alquilo típicos se seleccionan de, pero no se limitan a: metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo o butilo terciario. De manera similar, se pretende que el término "alcoxi" lleve su significado habitual, es decir, este término es idéntico al "alquilo" descrito anteriormente, con la excepción de que dicho grupo alquilo está unido covalentemente por un átomo de oxígeno (como sería familiar para un experto en la técnica).

[0052] Para evitar dudas, el término "alquenilo" pretende tener su significado habitual y abarca hidrocarburos parcialmente saturados lineales, ramificados y cíclicos que tienen una longitud de carbonos en el intervalo de C<2>a C<30>. La expresión "parcialmente saturado" se refiere a la presencia de al menos un enlace C=C dentro de la estructura. A menudo, el grupo alquenilo será lineal o ramificado, típicamente lineal. Aunque la longitud exacta del grupo alquenilo puede variar, típicamente ocurre que el grupo alquenilo tiene una longitud de carbonos en el intervalo de C<2>a C<20>, más típicamente de C<2>a C<12>, más típicamente de C<2>a C<8>, y lo más típicamente de C<2>a C<6>. Los grupos alquenilo típicos se seleccionan de, pero no se limitan a: vinilo, propenilo, isopropenilo o butenilo.

[0054] Para evitar dudas, cada uno de los grupos "alquilo" y "alquenilo" mencionados anteriormente puede estar opcionalmente sustituido. Pueden estar presentes uno o más sustituyentes opcionales y los sustituyentes opcionales típicos se seleccionan de: halógenos, hidroxi, ácidos carboxílicos, aminas, amidas, nitro o combinaciones de los mismos. Lo más típicamente, los sustituyentes opcionales son halógenos o grupos hidroxi. En algunas realizaciones, uno o más átomos de hidrógeno pueden sustituirse por un halógeno.

[0056] Para evitar dudas, el término "arilo" pretende tener su significado habitual y abarca grupos de una o más especies de anillos aromáticos. Dichos anillos aromáticos pueden incluir anillos de ocho miembros, anillos de siete miembros, anillos de seis miembros y anillos de cinco miembros. Más típicamente, los anillos son anillos de seis miembros o anillos de cinco miembros, y lo más típicamente los anillos son anillos de seis miembros. Además, pueden estar incluidos uno o más heteroátomos dentro de dichos anillos para formar especies de heteroarilo. Los heteroátomos típicos incluyen N, O y S, más típicamente N y O, y lo más típicamente N. Cuando se usa un grupo heteroarilo, típicamente ocurre que solo está presente un heteroátomo. A menudo ocurre que el grupo arilo se selecciona de: fenilo, ciclopentadienilo, piridilo y furilo.

[0058] Para evitar dudas, el grupo "arilo" mencionado anteriormente puede estar opcionalmente sustituido. Pueden estar presentes uno o más sustituyentes opcionales y los sustituyentes opcionales típicos se seleccionan de: alquilo, alcoxi, alquenilo, halógenos, hidroxi, ácidos carboxílicos, aminas, amidas, nitro o combinaciones de los mismos. Más típicamente, los sustituyentes opcionales son grupos alquilo, alcoxi, halógenos o hidroxi, e incluso más típicamente los sustituyentes opcionales son alquilo o alcoxi (normalmente alquilo). En algunas realizaciones, uno o más átomos de hidrógeno arbitrarios pueden sustituirse por un halógeno.

[0060] Para evitar dudas, el término "halógeno" pretende tener su significado habitual y, a menudo, abarca flúor, cloro, bromo y yodo. Más típicamente, el halógeno será flúor, cloro o bromo; incluso más típicamente flúor o cloro; y lo más típicamente flúor.

[0062] Además, la expresión "centro metálico" pretende referirse a un átomo de metal (típicamente un ion metálico) alrededor del cual se puede formar un complejo en combinación con ligandos adecuados. Como se describe en el presente documento, el centro metálico típicamente es capaz de formar complejos con una geometría hexagonal, es decir, es capaz de formar 6 enlaces. Típicamente, el(los) centro(s) metálico(s) son metales de transición.

[0064] La identidad de X<i>, X<2>, X<3>y X<4>(es decir, si se emplean N, O o S) está determinada en gran medida por la elección del centro metálico que se usa en el compuesto de fórmula (I) o fórmula (la), es decir, "M<i>y M<2>" y "M<i>", respectivamente. Como se apreciará, diferentes metales tienen diferentes afinidades por diferentes átomos donadores. Como se describe en el presente documento, a menudo ocurre que X<i>, X<2>, X<3>y X<4>son cada uno independientemente N u O. Normalmente, al menos uno de X<i>, X<2>, X<3>y X<4>es N, más típicamente al menos dos de X<i>, X<2>, X<3>y X<4>son N, e incluso más típicamente al menos tres de X<i>, X<2>, X<3>y X<4>son N. Según la reivindicación i , X<i>, X<2>, X<3>y X<4>son N.

[0066] Como se describe en el presente documento, aunque no existe una limitación real sobre la identidad de Y<i>e Y<2>, es decir, si se usan N, O, S, C(R<a>), a menudo ocurre que Y<i>e Y<2>se seleccionan cada uno independientemente de N, O, C(R<a>). Según la reivindicación i , Y<i>e Y<2>se seleccionan cada uno independientemente de N o C(R<a>). Normalmente, al menos uno de Y<i>e Y<2>es N. Sin embargo, lo más frecuente es que tanto Y<i>como Y<2>son N.

[0068] Con respecto a los compuestos según la fórmula (la), cada uno de los anillos D<i>y D<2>puede incluir cada uno independientemente uno o más heteroátomos que típicamente se definen como para el X<3>y X<4>anteriores. Como se describe en el presente documento, X<3>y/o X<4>pueden seleccionarse de C, N y O, más típicamente C y N, y lo más típicamente N. Puede darse el caso de que estén presentes dos o más heteroátomos dentro de los anillos D<i>y/o D<2>. Típicamente, el compuesto tiene una estructura según la fórmula (Ib):

[0071]

[0073] fórmula (Ib)

[0075] en donde,

[0077] A<i>, A<2>, M<i>, R<i>a R<4>, Y<i>, Y<2>, y X<i>a X<4>son como se definen antes.

[0079] Como se describe en el presente documento, los centros metálicos usados en el compuesto de fórmula (I) y fórmula (la), M<i>y M<2>, no están particularmente limitados con la condición de que sean capaces de formar un complejo estable con los ligandos de fórmula (I) y fórmula (la). Ejemplos típicos del centro metálico incluyen, pero no se limitan a: rutenio, iridio, osmio, hierro, platino, rodio o combinaciones de los mismos. A menudo, M<i>y M<2>se seleccionan de: rutenio, iridio y osmio. Típicamente, al menos uno de M<i>y M<2>es rutenio o iridio; más típicamente rutenio. Según la reivindicación i , tanto M<i>como M<2>son rutenio. Como se describe en el presente documento, uno o ambos centros metálicos, M<i>y M<2>, pueden ser iridio.

[0081] Típicamente, cada uno de R<i>, R<2>, R<3>y R<4>se selecciona independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o un combinación de los mismos. Cada

[0082] uno de R<1>, R<2>, R<3>y R<4>representa entre uno y tres grupos unidos al anillo aromático asociado, como sería

[0083] familiar para el experto en la técnica, es decir, como se muestra en la fórmula (II) o fórmula (IIa):

[0086]

[0088] fórmula (IIa)

[0090] Típicamente ocurre que R<1>, R<2>, R<3>y R<4>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, hidroxi, alcoxi o combinaciones de los mismos. Más típicamente, R<1>, R<2>, R<3>y R<4>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo o combinaciones de los

[0091] mismos. Lo más típicamente, R<1>, R<2>, R<3>y R<4>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno,

[0092] alquilo, arilo o combinaciones de los mismos. Normalmente, al menos uno de R<1>, R<2>, R<3>y R<4>es hidrógeno;

[0093] más a menudo, al menos dos de R<1>, R<2>, R<3>y R<4>son hidrógeno; más típicamente todavía, al menos tres de R<1>,

[0094] R<2>, R<3>y R<4>son hidrógeno; y lo más típicamente cada uno de R<1>, R<2>, R<3>y R<4>es hidrógeno.

[0096] Además, R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>se seleccionan cada uno independie alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, hidroxi, alcoxi o combinaciones de los mismos. Más típicamente, R<14>, R<15>,

[0097] R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo

[0098] o combinaciones de los mismos. Lo más típicamente, R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>se seleccionan cada

[0099] uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, arilo o combinaciones de los mismos. Normalmente, al menos

[0100] uno de R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>es hidrógeno; más a menudo, al menos dos de R<14>, R<1>R<18>, R<19>, R<20>y R<21>son hidrógeno; más típicamente todavía, al menos tres de R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y

[0101] R<21>son hidrógeno; incluso más típicamente todavía, al menos cuatro de R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>

[0102] son hidrógeno; y lo más típicamente al menos cinco de R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>son hidrógeno.

[0103] Normalmente, R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>y R<21>son cada uno hidrógeno. Como se apreciará, cuando X<3>o

[0104] X<4>son heteroátomos (tales como nitrógeno u oxígeno), puede darse el caso de que se excluyan R<17>y R<18>, respectivamente.

[0106] Como apreciará el experto en la técnica, los tres sustituyentes asociados con cada uno de R<1>, R<2>, R<3>y R<4>(por

[0107] ejemplo; R<4>', R<4>" y R /' con respecto a R<4>) no necesitan ser idénticos.

[0108] Típicamente, R<a>se selecciona de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o un combinación de los mismos. A menudo, R<a>se selecciona de: hidrógeno, alquilo, arilo, halógeno, hidroxi o alcoxi; más típicamente, hidrógeno, alquilo o alcoxi; más típicamente todavía, hidrógeno o alquilo; y lo más típicamente R<a>es hidrógeno.

[0110] Los autores de la invención han descubierto que los compuestos de fórmula (I) y fórmula (Ia) que usan ligandos bidentados (A<1>a A<4>) demuestran una eficacia sorprendente contra una variedad de microbios. En particular, aunque no hay restricción particular en la elección del ligando bidentado, se ha descubierto que los compuestos según la fórmula (III) son particularmente eficaces. Dichos ligandos bidentados se muestran a continuación:

[0113]

[0115] fórmula (III)

[0117] en donde,

[0119] Z<1>y Z<2>se seleccionan cada uno independientemente de: N, O, S; y

[0121] R<5>, R<6>y R<7>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, haloalquilo, haloalquenilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o combinación de los mismos.

[0123] Sin estar ligados a ninguna teoría, se cree que el uso de compuestos de fórmula de estructura general (III), que comprenden dos átomos donadores en las posiciones 4 y 5, da como resultado compuestos con una sorprendente eficacia antimicrobiana. Como se describe en el presente documento, aunque cada átomo donador, Z<1>y Z<2>, puede ser diferente, a menudo ocurre que Z<1>y Z<2>son iguales. Además, cada uno de Z<1>y Z<2>se puede seleccionar independientemente de N u O. Lo más típicamente, al menos uno de Z<1>y Z<2>es nitrógeno. Según la reivindicación 1, cada uno de Z<1>y Z<2>es nitrógeno. Así pues, típicamente ocurre que A<1>, A<2>, A<3>y A<4>son cada uno independientemente fenantrolina o derivados de la misma.

[0125] Cada uno de los sustituyentes R<5>, R<6>y R<7>representa los grupos unidos a los anillos que forman la estructura general de la fórmula (III). R<5>y R<7>se refieren a hasta tres sustituyentes y R<6>se refiere a hasta dos sustituyentes como se indica en la fórmula (IIIa):

[0128]

[0131] fórmula (IIIa)

[0133] Cada uno de R<5>, R<6>y R<7>puede ser igual o diferente; y cada sustituyente de los mismos puede ser igual o diferente. Por ejemplo, cuando R<5>es un grupo alquilo; uno, dos o tres de R<5>', R<5>" y R<5>" pueden ser un grupo alquilo. A menudo ocurre que R<5>, R<6>y R<7>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alcoxi, arilo o combinaciones de los mismos. A menudo ocurre que al menos uno de R<5>, R<6>y R<7>es hidrógeno; a menudo, que al menos dos de R<5>, R<6>y R<7>son hidrógeno; y en algunos casos, cada uno de R<5>, R<6>y R<7>es hidrógeno.

[0135] En una realización alternativa, a menudo ocurre que al menos uno de R<5>, R<6>y R<7>es alquilo; a menudo, que al menos dos de R<5>, R<6>y R<7>son alquilo; y en algunos casos, cada uno de R<5>, R<6>y R<7>es alquilo. En algunos casos, dos de R<5>, R<6>y R<7>son alquilo. Típicamente, cuando dos de R<5>, R<6>y R<7>son alquilo, R<5>y R<7>son alquilo. Los grupos alquilo típicos son como se definen anteriormente. Sin embargo, a menudo ocurre que, cuando R<5>, R<6>o R<7>es un grupo alquilo, dicho grupo alquilo se selecciona de: metilo, etilo o propilo. Típicamente, dicho grupo alquilo es metilo o etilo y, más típicamente, dicho grupo alquilo es metilo.

[0137] En una realización alternativa adicional, a menudo ocurre que al menos uno de R<5>, R<6>y R<7>es arilo; a menudo, que al menos dos de R<5>, R<6>y R<7>son arilo; y en algunos casos, cada uno de R<5>, R<6>y R<7>es arilo. En algunos casos, dos de R<5>, R<6>y R<7>son arilo. Típicamente, cuando dos de R<5>, R<6>y R<7>son arilo, R<5>y R<7>son arilo. Los grupos arilo típicos son como se definen anteriormente. Sin embargo, a menudo ocurre que, cuando R<5>, R<6>o R<7>es un grupo arilo, dicho grupo arilo se selecciona de: fenilo, piridilo o furilo. Típicamente, dicho grupo arilo es fenilo o piridilo y, más típicamente, dicho grupo arilo es fenilo.

[0139] Puede darse el caso de que R<5>y R<7>son iguales. Además, a menudo ocurre que el ligando bidentado es simétrico, es decir, el patrón de sustitución alrededor de la estructura de la fórmula (IIIa) es simétrico, p. ej., en donde R<5>' y R<7>' son grupos metilo y todos los demás sustituyentes son hidrógeno.

[0141] Los ligandos bidentados típicos son los compuestos(1)a(7)que se muestran a continuación:

[0144]

[0147] A menudo ocurre que al menos dos de A<1>, A<2>, A<3>y A<4>son iguales. A menudo, al menos tres de A<1>, A<2>, A<3>y A<4>son iguales; y puede ocurrir que los cuatro de A<1>, A<2>, A<3>y A<4>sean iguales. En algunas realizaciones, cada uno de A<1>, A<2>, A<3>y A<4>es diferente. Cada uno de A<1>, A<2>, A<3>y A<4>se puede seleccionar independientemente de los compuestos(1)a(7). A menudo, A<1>, A<2>, A<3>y A<4>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(1),(2),(3),(5),(6)y(7);más típicamente A<1>, A<2>, A<3>y A<4>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(1), (2)y(3);más típicamente todavía A<1>, A<2>, A<3>y A<4>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(2)y(3);lo más típicamente A<1>, A<2>, A<3>y A<4>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(1)y(2).Puede ocurrir que A<1>, A<2>, A<3>y A<4>estén todos representados por el compuesto(3).

[0148] En el caso de compuestos de fórmula (Ila), cada uno de Ai y A<2>se puede seleccionar independientemente de los compuestos(1)a(7). A menudo, Ai y A<2>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(1),(2),(3),(5),(6)y(7); más típicamente, Ai y A<2>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(i), (2)y(3); más típicamente todavía, Ai y A<2>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(2)y(3); lo más típicamente, Ai y A<2>se seleccionan cada uno independientemente de los compuestos(1)y(2). Puede ocurrir que Ai y A<2>estén ambos representados por el compuesto(3).

[0149] Típicamente ocurre que los compuestos del primer aspecto de la invención tienen una carga positiva, normalmente una carga 4+ para los compuestos de fórmula (I) y una carga 2+ para los compuestos de fórmula (la). Se pueden proporcionar varios contraiones para equilibrar esta carga. Si bien no hay restricciones particulares en la elección del contraión, éste típicamente se puede seleccionar de: cloruro, fluoruro, bromuro, hidróxido, nitrato, hexafluorofosfato o una combinación de los mismos. Típicamente el contraión es cloruro o nitrato, normalmente cloruro. Para evitar dudas, la referencia a los compuestos del presente documento también pretende abarcar referencias a sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

[0150] También se proporciona, en un segundo aspecto de la invención, una composición para usar como un antimicrobiano que comprende el compuesto según el primer aspecto de la invención. No hay restricción particular sobre el contenido de la composición. La composición puede incluir uno o más excipientes para modificar las propiedades físicas o químicas de la composición, como sería familiar para un experto en la técnica. La composición puede formularse como un comprimido para administración oral, como una formulación tópica aplicable al cuerpo o como una composición adaptada para administración intravenosa o subdérmica, como sería familiar para un experto en la técnica.

[0151] La composición puede incluir uno o más ingredientes farmacéuticos activos adicionales que incluyen uno o más antimicrobianos adicionales, típicamente uno o más antibióticos adicionales. La composición también se puede preparar con un intervalo de dosis del compuesto del primer aspecto de la invención.

[0152] El compuesto según el primer aspecto de la invención y la composición según el segundo aspecto de la invención pueden ser para el tratamiento de una o más enfermedades o trastornos causados por microbios. Más típicamente, el compuesto según el primer aspecto de la invención y la composición según el segundo aspecto de la invención se usan para el tratamiento de una o más enfermedades o trastornos causados por bacterias, en particular bacterias Gram negativas. Enfermedades típicas incluyen, pero no se limitan a: neumonía, tuberculosis, cólera, sífilis, tifoidea, tétanos, infecciones nosocomiales (adquiridas en el hospital), infecciones del tracto urinario, infecciones del torrente sanguíneo o combinaciones de las mismas.

[0153] También se describe en el presente documento un método para tratar una enfermedad o trastorno microbiano, que comprende las etapas de administrar el compuesto del primer aspecto de la invención o la composición del segundo aspecto de la invención a un paciente. Típicamente, la enfermedad o trastorno microbiano es una enfermedad o trastorno bacteriano, normalmente causado por bacterias Gram negativas. Ejemplos típicos incluyen, pero no se limitan a: neumonía, tuberculosis, cólera, sífilis, tifoidea, tétanos, infecciones nosocomiales (adquiridas en el hospital), infecciones del tracto urinario, infecciones del torrente sanguíneo o combinaciones de las mismas.

[0154] Se proporciona en un cuarto aspecto de la invención, según la reivindicación 8, un compuesto según la fórmula (IV) o (IVa):

[0155]

[0157] fórmula (IVa)

[0158] en donde

[0159] R<8>, R<e>', R<8>", R<8>", R<9>, R<9>', R<9>", R<9>", R<10>, R<10>', R<10>", R<io>m, R<11>, R<11>', R<11>", R<11>'", R<12>, R<12>', R<12>", R<i 3>m se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alcoxi, alquenilo y arilo;

[0160] con la condición de que al menos uno de R<8>, R<8>', R<8>", R<8>", R<9>, R<9>', R<9>", R<9>", R<10>, R<10>', R<10>", R<10'>", P<11>, R<11>', R<11>",

[0161] R<11'>", R<12>, P<12>', R<12>", R<12>", R<13>, R<13>', R<13>" y R<13>" se selecciona de: alquilo, alcoxi, alquenilo y arilo (en donde cada

[0162] uno de los grupos alquilo, alcoxi, alquenilo y arilo son como se describen anteriormente); y en donde R<14>a R<16>

[0163] y R ^ a R<21>son como se describen anteriormente.

[0164] A menudo ocurre que dos, tres o los cuatro de R<8>, R<8>', R<8>" y R<8>" son iguales. También ocurre a menudo que

[0165] dos, tres o los cuatro de R<9>, R<9>', R<9>" y R<9>" son iguales. En algunos casos, dos, tres o los cuatro de R<10>, R<10>',

[0166] R<10>" y R<10'>" pueden ser iguales y, típicamente dos, tres o los cuatro de R<11>, R<11>', R<11>" y R<11>'" también son iguales.

[0167] Además, dos, tres o los cuatro de R<12>, R<12>', R<12>" y R<12>" típicamente son iguales y, a menudo, ocurre que dos,

[0168] tres o los cuatro de R<13>, R<13>', R<13>" y R<13>" son iguales. Como se apreciará, a menudo es más fácil fabricar complejos usando los mismos ligandos bidentados, e idealmente los cuatro ligandos bidentados idénticos, en lugar de usar una combinación de diferentes ligandos bidentados, ya que puede ser difícil controlar con precisión el patrón de sustitución alrededor del centro metálico del rutenio de una manera fiable. A menudo se requieren técnicas de separación para lograr complejos de ligandos "mixtos" consistentes.

[0170] Del mismo modo, en relación con la fórmula (IVa), a menudo ocurre que R<8>y R<8>' son iguales. Además, a menudo ocurre que R<9>y R<9>' son iguales. En algunas realizaciones, R<10>y R<10>' pueden ser iguales y, típicamente R<11>y R<11>' también son iguales. Además, R<12>y R<12>' son típicamente iguales y, a menudo ocurre que R<13>y R<13>' son iguales.

[0172] En una realización de la invención, al menos uno de R<8>a R<13>es alquilo; más típicamente, al menos dos de R<8>a R<13>son alquilo; incluso más típicamente, al menos tres de R<8>a R<13>son alquilo; más típicamente todavía, al menos cuatro de R<8>a R<13>son alquilo; incluso más típicamente todavía, al menos cinco de R<8>a R<13>son alquilo; y lo más típicamente cada uno de R<8>a R<13>son alquilo. Dicho grupo alquilo se selecciona típicamente de metilo, etilo y propilo, lo más típicamente será metilo o etilo, normalmente metilo. Los sustituyentes R<8>a R<13>que no son alquilo, típicamente serán hidrógeno. A menudo ocurre que el patrón de sustitución alrededor de los ligandos bidentados es simétrico (p. ej., en donde R<8>, R<9>y R<10>son iguales a R<13>, R<12>y R<11>, respectivamente). A menudo, dos de R<8>a R<13>son alquilo, más típicamente cuatro de R<8>a R<13>son alquilo, y en algunos casos los seis de R<8>a R<13>son alquilo.

[0174] A menudo, ocurrirá que R<8>a R<13>son alquilo (normalmente metilo); y típicamente, en dichas situaciones, R<9>a R<12>serán hidrógeno. Alternativamente, puede ocurrir que R<9>a R<12>son alquilo (normalmente metilo); y típicamente, en dichas situaciones, R<8>y R<13>son hidrógeno. Además, puede ocurrir que R<9>y R<12>son alquilo (normalmente metilo); y típicamente, en dichas situaciones, R<8>, R<10>, R<11>y R<13>son hidrógeno. Alternativamente, puede ocurrir que R<10>y R<11>son alquilo (normalmente metilo); y típicamente, en dichas situaciones, R<8>, R<9>, R<12>y R<13>son hidrógeno.

[0176] En otra realización de la invención, al menos uno de R<8>a R<13>es arilo; y más típicamente, al menos dos de R<8>a R<13>son arilo. Dicho grupo arilo se selecciona típicamente de fenilo, piridilo y furilo; lo más típicamente fenilo. Los sustituyentes R<8>a R<13>que no son arilo, típicamente serán hidrógeno. A menudo ocurre que el patrón de sustitución alrededor de los ligandos bidentados es simétrico (p. ej., en donde R<8>, R<9>y R<10>son iguales a R<13>, R<12>y R<11>, respectivamente). A menudo, dos de R<8>a R<13>son arilo y, en algunos casos, cuatro de R<8>a R<13>son arilo.

[0178] A menudo, ocurrirá que R<10>y R<11>sean arilo (normalmente fenilo); y típicamente, en dichas situaciones, R<8>, R<9>, R<12>y R<13>son hidrógeno. Alternativamente, puede ocurrir que R<9>y R<12>sean arilo (normalmente fenilo); y típicamente, en dichas situaciones, R<8>, R<10>, R<11>y R<13>son hidrógeno.

[0180] Puede ocurrir que el compuesto esté representado por la fórmula (Va) o fórmula (Va):

[0183]

[0185] fórmula (V)

[0186]

[0188] fórmula (Va)

[0190] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. No hay restricción particular en cuanto a la elección del contraión que se puede usar y se han descrito ejemplos de contraiones anteriormente.

[0192] También se describe en el presente documento, en un quinto aspecto, una composición que comprende el compuesto según el cuarto aspecto de la invención. No hay restricción particular sobre el contenido de la composición. La composición puede incluir uno o más excipientes para modificar las propiedades físicas o químicas de la composición, como sería familiar para un experto en la técnica. La composición puede formularse como un comprimido para administración oral, como una formulación tópica aplicable al cuerpo o como una composición adaptada para administración intravenosa o subdérmica, como sería familiar para un experto en la técnica.

[0194] La composición puede incluir uno o más ingredientes farmacéuticos activos adicionales que incluyen uno o más antimicrobianos, típicamente uno o más antibióticos. La composición también se puede preparar con un intervalo de dosis del compuesto del primer aspecto de la invención.

[0196] El compuesto según el cuarto aspecto de la invención y la composición según el quinto aspecto como se describe en el presente documento pueden ser para el tratamiento de una o más enfermedades o trastornos causados por microbios. Más típicamente, el compuesto según el cuarto aspecto de la invención y la composición según el quinto aspecto se pueden usar para el tratamiento de una o más enfermedades o trastornos causados por bacterias, en particular bacterias Gram negativas. Enfermedades típicas incluyen, pero no se limitan a: neumonía, tuberculosis, cólera, sífilis, tifoidea, tétanos, infecciones nosocomiales (adquiridas en el hospital), infecciones del tracto urinario, infecciones del torrente sanguíneo o combinaciones de las mismas.

[0198] También se describe en el presente documento, en un sexto aspecto, un método para tratar una enfermedad o trastorno microbiano, que comprende las etapas de administrar el compuesto del cuarto aspecto o la composición del quinto aspecto a un paciente. Típicamente, la enfermedad o trastorno microbiano es una enfermedad o trastorno bacteriano, normalmente causado por bacterias Gram negativas. Ejemplos típicos incluyen, pero no se limitan a: neumonía, tuberculosis, cólera, sífilis, tifoidea, tétanos, infecciones nosocomiales (adquiridas en el hospital), infecciones del tracto urinario, infecciones del torrente sanguíneo o combinaciones de las mismas.

[0200] La invención se describirá ahora con respecto a las figuras adjuntas, únicamente para facilitar la comprensión.

[0202] Descripción de las figuras

[0204] La figura 1A muestra los efectos de absorción y muerte celular de44+. El complejo44+ induce la destrucción dependiente de la dosis de cultivos planctónicos deE. coliMG1655 (arriba) y EC958 (abajo) in vitro. El complejo se añadió en diversas concentraciones por debajo y por encima de la MIC, 1,2 pM (A) o 1,6 pM (B), de44+ en GDMM. La destrucción se determinó vigilando el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml a intervalos de tiempo de hasta 6 h después del tratamiento. Las barras de error representan tres repeticiones biológicas independientes ± desviación estándar (SD).

[0206] La figura 1B muestra los efectos en la muerte celular de la absorción de44+. Datos de ICP-AES para la absorción de rutenio porE. coliEC958 en ausencia (izquierda) y presencia (derecha) de glucosa tras la exposición a44+. Los niveles de Ru (línea superior) y Fe (línea inferior) por célula se expresan como metal (g) por célula. Los niveles de Fe se calcularon como control. Condiciones: concentración de44+

= 0,8 pM. Las células se lavaron con ácido nítrico al 0,5% (v/v) para eliminar el complejo no unido. Las barras de error representan tres repeticiones biológicas independientes ± SD.

[0208] La figura 2 muestra la localización de44+

en células de E.coliEC958 visualizadas mediante microscopía confocal de barrido láser (LSCM) y nanoscopia de depleción de emisión estimulada (STED) a los 5, 20, 60 y 120 minutos. Fila superior: imágenes de células obtenidas usando la emisión de44+

en excitación a 470 nm con un láser de luz blanca y un filtro eliminador de banda de 470 nm. Fila central: imágenes de células obtenidas con los mismos ajustes de excitación y emisión; el efecto STED se obtuvo empleando un láser de depleción de 775 nm y una placa de fase de vórtice de 780 nm. Tanto las imágenes deconvolucionadas limitadas por difracción (d-LSCM) como las imágenes de superresolución (d-STED) se procesaron utilizando el software comercial Huygens (SVI). Las puntas de flecha destacan las regiones donde se acumula preferentemente44+

. Fila inferior: perfil de intensidad de emisión normalizada a lo largo de las líneas blancas continuas dibujadas en la parte superior de la región seleccionada de células que se muestra en la fila central; las líneas negras continuas representan el d-LSCM, las líneas rojas continuas representan el d-STEM. Condiciones: después del tratamiento con44+

0,8 pM, las células se lavaron con ácido nítrico antes de fijarlas con paraformaldehído (16%).

[0210] La figura 3 presenta imágenes representativas que muestran planos de secciones de células, limitadas por difracción deconvolucionadas de volumen completo e imágenes de superresolución (d-LSCM y d-3D STED). Se representa gráficamente el perfil de intensidad de emisión normalizada de las líneas blancas continuas dibujadas en la parte superior de la región seleccionada de células. Las líneas negras continuas representan el d-LSCM, las líneas rojas continuas representan el d-3D STED. Las áreas ampliadas del cuadrado blanco discontinuo dibujado para cada punto temporal se muestran junto a las imágenes, así como la representación ortogonal de cada eje (XY, XZ e YZ), donde el aumento de la resolución y la mejor localización de44+

se muestran en verde. Los puntos temporales de 10 y 20 minutos muestran la acumulación en ubicaciones específicas dentro de la membrana celular; en el punto temporal de 60 minutos, el compuesto se localiza en secciones de los polos celulares, como puede verse en las regiones ampliadas (a, b, c, d). Las condiciones utilizadas son idénticas a las empleadas en la figura 2.

[0212] La figura 4A muestra evidencia de daño a la membrana enE. coliEC958. La localización conjunta de44+

y el éster de NHS 405 se visualizó mediante SIM a los 5 minutos (izquierda) y 60 minutos (derecha). (i) Células tratadas con44+

0,8 pM y fijadas con paraformaldehído (16%). Tras la fijación, las células se trataron con éster de NHS 4052,5 pg/ml. Panel superior: emisión de44+

(filtro A568) Panel central: emisión de éster de NHS 405 a 405 nm (filtro DAPI Panel inferior: imágenes fusionadas. (ii). Tinción con éster de NHS en ausencia de44+

.

[0213] La figura 4B muestra la liberación de ATP inducida por44+

de células EC958, [ATP] (nM) extracelular cuantificado con luciferasa recombinante y D-luciferina con ATP liberado medido en un luminómetro para muestras expuestas a44+

0 (control), 0,8 y 1,6 pM (MIC) durante un período de dos horas. Se observa una diferencia significativa de tres asteriscos entre 0 y 1 MIC, valor P = 0,0006. Las barras de error representan tres repeticiones biológicas ± SD. Control positivo de ATP - polimixina 4 pg/ml (recuadro). Comparación de IC<50>/MIC para células HEK293 y tres cepas de bacterias.

[0215] La figura 4C muestra la comparación de IC<50>/MIC para células HEK293 y tres cepas de bacterias.

[0217] La figura 4D muestra curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de cribado de toxicidad deGallería melonella,células tratadas con compuesto44+

0-80 mg/kg, incubadas a 37,5°C durante 120 horas, control de agua (negro), compuesto44+

(rojo).

[0219] La figura 5A muestra el espectro de absorción UV-Vis que muestra el cambio en el coeficiente de extinción molar al aumentar la concentración de [{Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)2}2(tpphz)] en MeCN (realizado en un espectrofotómetro UV/Vis Cary 300 a 27,5°C).

[0221] La figura 5B muestra el espectro de absorción UV-Vis que muestra el cambio en el coeficiente de extinción molar al aumentar la concentración de [{Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)2}2(tpphz)] en agua (realizado en un espectrofotómetro UV/Vis Cary 300 a 27,5°C).

[0223] La figura 6A muestra los espectros de emisión a una concentración creciente de [{Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)<2>}<2>(tpphz)] entre 550-800 nm en MeCN. Realizado en un fluorímetro Fluoromax 3 a 27,5°C.

[0224] La figura 6B muestra los espectros de emisión a una concentración creciente de [{Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)<2>}<2>(tpphz)] entre 550-800 nm en agua. Realizado en un fluorímetro Fluoromax 3 a 27,5°C.

[0226] La figura 7 muestra una comparación de los valores de LogP determinados y la actividad (MIC) de cada complejo contra la cepa patógena deE. coliEC958, para mostrar el aumento de la actividad con el aumento relativo de la lipofilia. Los datos de LogP se recopilaron usando el procedimiento del matraz agitado. "Phen" es fenantrolina, "DMP" es dimetilfenantrolina, "TMP" es tetrametilfenantrolina y "DIP" es difenilfenantrolina.

[0227] La figura 8 muestra los recuentos de UFC/ml para el experimento de acumulación de44+ por EC958, para garantizar que el número de bacterias en la solución se mantuviera constante entre cada punto temporal.

[0228] La figura 9 muestra la diferencia en el contenido de Ru por célula (g) en cada punto temporal (+) con glucosa y (-) sin glucosa para44+. Se muestran diferencias significativas en la acumulación de rutenio en la muestra (+) con glucosa a los 10 y 20 minutos. Contenido de rutenio por célula determinado por ICP-AES.

[0230] La figura 10A muestra la valoración de la unión al ADN utilizando concentraciones crecientes de CT-ADN y44+ en tampón Tris a 27°C, realizada en un Fluoromax 3.

[0232] La figura 10B muestra un gráfico de Scatchard y un ajuste de McGhee Von Hippel, para encontrar la constante de unión de44+.

[0234] Las figuras 11A y 11B muestran la detección del potencial de membrana en células deE. coliEC958. Se indica el porcentaje de población de células (%) que contienen fluorescencia roja/roja+verde/verde. Las células se incubaron con Di-OC2(3) 30 pM durante 30 minutos en presencia o ausencia de44+ 1,6 pM.

[0236] Las figuras 12A y 12B muestran el análisis de los datos de citometría de flujo usando parámetros de fluorescencia roja y verde. Los gráficos de puntos de fluorescencia roja frente a verde se recogieron con amplificación logarítmica.

[0238] La figura 13 muestraAcetinobacter baumannii(AB184) teñida con44+ a una concentración de MIC a los 10 minutos (izquierda) y 60 minutos (derecha), que corresponde a la obtención de imágenes de la membrana externa (10 minutos) y la membrana interna (60 minutos). Las células se fijaron con PFA (4%) y se lavaron con PBS. Se obtuvieron imágenes de las células en un microscopio de iluminación estructurada utilizando el láser de 488 nm y un filtro A568.

[0240] La figura 14 muestra el contenido de rutenio en la hemolinfa (pg/ml) paraGallería melonellaa la que se inyectaron 20 mg/kg (azul) y 80 mg/kg (rojo). Se inyectaron en Galleria 10 pl de44+/agua en su falsa pata izquierda y se incubaron a 37,5°C durante 120 horas. En cada intervalo de tiempo, los Galleria fueron puntuados: vivo/muerto, actividad y melanización. El contenido de Ru se determinó por ICP-AES.

[0242] La figura 15 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de cribado de toxicidad deGalleria melonella(UFC 105 - izquierda y 106 - derecha), células tratadas con44+ 0-80 mg/kg, incubadas a 37,5°C durante 120 horas - control de agua (naranja), bacterias (verde) y44+ (púrpura). A las larvas coinyectadas se les inyectaron bacterias en la falsa pata derecha y luego44+ 30 minutos después, en la falsa pata izquierda.

[0244] La figura 16A muestra los recuentos de UFC de bacterias de la hemolinfa de larvas extraída(Galleria melonella),observados durante 120 horas en presencia de44+ 40 mg/kg y 80 mg/kg, con extracciones realizadas a las 24 y 120 horas. Recuento bacteriano inicial 105 (izquierda) y 106 (derecha). Las larvas se incubaron a 37,5°C.

[0246] La figura 16B muestra fotografías de las placas de agar utilizadas para determinar los gráficos de la figura 16A y muestran una dosificación de 0 mg/kg, 40 mg/kg y 80 mg/kg de44+ después de 24 horas. El aclaramiento completo se observó en 96 horas con dosis de 40 y 80 mg/kg, con una sola dosis. Las marcas negras no son colonias de bacterias, sino hemolinfa melanizada.

[0248] La figura 17 muestra la localización de44+ en células deA. baumanniiAB184 dentro de la hemolinfa de las larvas usando microscopía confocal. Fila superior: imágenes de células usando la emisión de44+ con excitación a 450 nm usando un filtro A568. Fila central: contraste de fase. Fila inferior: imagen combinada. Las células de la hemolinfa extraída se lavaron con ácido nítrico antes de fijarlas con paraformaldehído (16%).

[0250] Las figuras 18 A - C son imágenes de larvas deGalleria mellonelladepuradas. Se determinó la luminiscencia del complejo44+ enA. baumanniiAB184 teñidas (cabeza A, cola B). Las regiones I y II que contienen hemocitos de las células bacterianas están destacadas.A. baumanniise tiñeron con44+ 1,2 pM durante 30 minutos y luego se fijaron con PFA (4%). A las larvas se les inyectaron células y se incubaron durante 30 minutos, las larvas anestesiadas con éter dietílico se incubaron en PFA (4%) durante 30 minutos, antes de depuración con el protocolo CUBIC. Las imágenes se tomaron en un microscopio confocal Nikon utilizando el láser de 488 nm y el filtro de emisión roja. Las imágenes se procesaron usando la imagen J.

[0252] La figura 19 proporciona una serie de imágenes de larvas deGalleria mellonelladepuradas infectadas conA. baumannii,AB184, teñidas con éster de NHS 488 - 0,5 mg/ml (A) o complejo44+ - 1,2 pM (B). Las secciones de las células se identifican (i) y se expanden (AII, AIII, BII) para mostrarA. baumanniidentro de las células hemocitos. Se proporcionan gráficos de superficie 3D (AIV, BIII) para mostrar la intensidad de emisión máxima. Las condiciones son las mismas que las de la figura 18. Las imágenes se tomaron en un microscopio estereoscópico de fluorescencia: 490 nm ex/ 520 nm em (éster de NHS 488), 565 nm ex/640 nm. Las imágenes se procesaron usando la imagen J.

[0253] La figura 20 muestra la formación de biopelículas deE. coliST131, EC958, cuando se somete a diferentes concentraciones de 44+. N >3±SEM. La biopelícula se formó durante 19 horas de incubación a 37°C en placas de 24 pocillos. ST131 muestra la formación de biopelículas sin rutenio y 0,156 pM (10% de la MIC),

[0254] La figura 21 muestra las UFC/ml de biopelícula producida porE. co liST131 cuando las biopelículas existentes se sometieron a 44+ 15,6 pM, 78 pM y 156 pM. N >3±SEM. La biopelícula cultivada durante cuatro días sobre una membrana de filtro a 37°C con MHA cambió diariamente. El compuesto se pipeteó directamente sobre la biopelícula el día cuatro, se incubó durante 24 horas. Las UFC/ml se calcularon usando el método de Miles y Mirsa. ANOVA de una vía realizado con las pruebas de comparación múltiple de Turkey.

[0255] Las figuras 22A y 22B muestran 42+ en EC958 que muestran la unión al ADN helicoidal y mono-TMP en SH1000 que muestra nuevamente la unión al ADN.

[0256] La figura 23 muestra los efectos en la muerte celular de la absorción de 42+. Datos de ICP-AES para la absorción de rutenio porE. coliEC958 en ausencia (a) y presencia (b) de glucosa tras la exposición a 42+. Los niveles de Ru (línea superior) y Fe (línea inferior) por célula se expresan como metal (g) por célula. Los niveles de Fe se calcularon como control. Condiciones: concentración de 42+ = 0,8 pM. Las células se lavaron con ácido nítrico al 0,5% (v/v) para eliminar el complejo no unido. Las barras de error representan tres repeticiones biológicas independientes ± SD.

[0257] La figura 24 muestra la diferencia en el contenido de Ru por célula (g) en cada punto temporal (+) con glucosa y (-) sin glucosa para 42+. Se muestran diferencias significativas en la acumulación de rutenio en la muestra (+) con glucosa a los 10 minutos. Contenido de rutenio por célula determinado por ICP-AES.

[0258] La figura 25 muestra las tasas relativas de absorción de Ru para 42+ y 44+ basándose en los resultados de las figuras 1B y 23.

[0259] Las figuras 26 A-C muestran la localización de 42+ en células deE. coliEC958 visualizadas mediante microscopía confocal de barrido láser (LSCM) y nanoscopia de depleción de emisión estimulada (STED) a los 60 minutos, 120 minutos y 24 horas. Se obtuvieron imágenes de las células usando la emisión de 42+ con excitación a 470 nm con un láser de luz blanca y un filtro de muesca de 470 nm, las imágenes deconvolucionadas limitadas por difracción (d-LSCM) y las imágenes de superresolución (d-STED) se procesaron utilizando el software comercial Huygens (SVI). Condiciones: después del tratamiento con 42+ 0,8 pM, las células se lavaron con ácido nítrico antes de fijarlas con paraformaldehído (16%).

[0260] La figura 27 muestra los resultados de un experimento de tinción conjunta de ADN. S.aureusteñida con 42+ (parte superior y CI), S.aureusteñida con la tinción de ADN DAPI (CII), imagen superpuesta (CIII), gráfico de superficie 3D superpuesto (CIV). La imagen muestra una superposición directa de DAPI y mono-TMP para calcular una constante de colocalización de Pearson de >0,9.

[0261] La figura 28 muestra los resultados de un ensayo mutagénico de Ames paraE. colien presencia de 42+. El porcentaje de mutagénesis se midió tratando células deE. coli(25% de cultivo nocturno, 75% de medios) con 42+ con 0 (control de mutagénesis natural), 0,5, 1,0 y 2,0 veces. Se añadió el indicador violeta de bromocresol y se midió el porcentaje de cambio de color de púrpura a amarillo después de la incubación durante 48 horas. Se añadió un control positivo con células irradiadas con luz UV para la comparación.

[0262] La figura 29 muestra imágenes TEM deE. colien presencia de 42+.

[0263] La figura 30 muestra la liberación de ATP inducida por 42+ de células deE. coliEC958, [ATP] extracelular (nM) cuantificado con polimixina medida en un luminómetro para muestras expuestas a 0 (control), 0,5 MIC y 1,0 MIC de 42+ durante un período de cuatro horas. Las barras de error representan tres repeticiones biológicas ± SD. Polimixina 4 pg/ml.

[0264] La figura 31 muestra curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de cribado de toxicidad deGallería melonella,células tratadas con 42+ 0-80 mg/kg, incubadas a 37,5°C durante 120 horas - control de agua (negro), compuesto (rojo).

[0265] La figura 32 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de cribado de toxicidad deA. baumanniiAB184 (recuento bacteriano inicial 104 - izquierda y 105 - derecha), células tratadas con 42+ 40 u 80 mg/kg, incubadas a 37,5°C durante 120 horas - control de agua (rojo), compuesto (verde).

[0266] La figura 33A muestra los recuentos de UFC de bacterias de la hemolinfa de larvas extraída (A.baumanniiAB184), observados durante 120 horas en presencia de 42+ 40 mg/kg y 80 mg/kg. Recuento bacteriano inicial 104 (izquierda) y 105 (derecha).

[0267] La figura 33B muestra fotografías de las placas de agar utilizadas para determinar los gráficos de la figura 33A con respecto a la dosificación de 80 mg/kg de42+. Las marcas negras no son colonias de bacterias, sino hemolinfa melanizada.

[0269] La invención se describirá ahora con respecto a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes y se proporcionan para mejorar la comprensión de la invención.

[0271] Ejemplos

[0273] Síntesis de complejos dinucleares

[0275] Los complejos14+ y24+ (véase el esquema 1) se sintetizaron usando los procedimientos descritos a continuación.

[0278]

[0281] 1,10-fenantrolina-5,6-diona (compuesto14+)

[0283] La 1,10-fenantrolina (18,02 g, 100 mmol) se disolvió en H<2>SO<4>al 60% (125 ml). Con agitación constante, se añadió lentamente bromato de potasio (66,81 g, 400,1 mmol) para evitar que la reacción se volviera demasiado vigorosa. La reacción liberó vapores marrones de bromo gaseoso. Una vez añadido todo el bromato de potasio, la mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió más añadiendo hielo picado (100 g) y poniéndola en un baño de hielo. La solución se neutralizó a pH 5-6 por adición gota a gota de NaOH (20 M), durante la neutralización la mezcla se calienta, esto debe realizarse en un baño de hielo para mantenerla fría. El precipitado amarillo se filtró en filtro sinterizado y se lavó con agua (1 l) y éter dietílico (100 ml). El producto se secó al vacío. El producto bruto se purificó por recristalización en agua/metanol (1:50) y los cristales de color amarillo brillante se recogieron por filtración al vacío. Masa = 16,04 g (76,31 mmol, 76,3%) de sólido amarillo. RMN 1H (CDCh) 5 (integración de desdoblamiento); 7,61 (dd, 2H), 8,52 (dd, 2H), 9,13 (dd, 2<h>). MS; m/z: 210,1 (100) [M+].

[0285] Tetrapirido[3,2-a:2',3'-c:3'-c:3",2"-h:2m,3m-j]fenazina (TPPHZ)

[0287] Acetato de amonio (15 g, 194,6 mmol), dip (2,90 g, 13,8 mmol) y ditionito de sodio (300 mg, 1,72 mmol) se hirvieron a reflujo durante 2 horas a 180°C en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó de vez en cuando. Una vez que se completó la reacción, la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y después se añadió agua destilada (20 ml). El precipitado amarillo formado se recogió, se filtró al vacío y se lavó con agua, metanol y acetona (3 x 20 ml). El producto bruto resultante se trituró en etanol a reflujo (100 ml) para eliminar las impurezas, se filtró mientras estaba caliente y se secó al vacío. Masa = (0,92 g, 2,39 mmol, 34,6%) sólido amarillo. El producto era escasamente soluble en la mayoría de los disolventes. RMN 1H (CDCh) 5 (integración de desdoblamiento) 7,94 (dd, 4H), 9,41 (dd, 4H), 9,83 (dd, 4H). RMN 1H (d-TFA) 5 (integración de desdoblamiento) 8,62 (dd, 4H), 9,56 (dd, 4H), 10,52 (dd, 4H). MS; m/z (42,6 %): 385,1 (100) [M+].

[0288] [Ru(N-N)<2>Cl<2>]

[0290] Se sintetizaron cuatro compuestos mediante el siguiente método, donde N-N representa el ligando auxiliar de fenantrolina sustituida. Se calentaron RuCl<3>.3H<2>O, N-N y LiCl en DMF durante 8 horas a reflujo. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió acetona. Esta se almacenó a 4°C durante 16 horas. El precipitado de color púrpura oscuro se lavó con agua y etanol y se secó al vacío.

[0292] [Ru(1,10-fenantrolina)<2>Cl<2>]

[0294] RuCl<3>.3H<2>O (1,56 g, 6 mmol), LiCl (1,55 g, 36,9 mmol), phen (2,5 g, 13,9 mmol), DMF (20 ml) y acetona (100 ml). Masa = 2,41 g (4,59 mmol, rendimiento de 66,1%). E<s>-MS m/z (%): 497 (70) [M-Cl]<+>, 525 (100) [M-Cl]<+>+CO.

[0296] [{Ru(N-N)<2>}<2>(tpphz)][PF<8>]<4>

[0298] Los cuatro compuestos se sintetizaron mediante el siguiente procedimiento general. Se añadieron [Ru(N-N)<2>Cl<2>] y (tpphz) a una solución 1:1 de etanol y agua. La solución se calentó a reflujo durante 12 horas en atmósfera de nitrógeno. Una vez completada, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se almacenó a 4°C durante 16 horas. La solución roja se filtró y el etanol se separó por evaporación rotatoria. Se añadió una cantidad saturante de NH<4>PF<6>; esto produjo la formación de un precipitado rojo oscuro. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se recristalizó en acetonitrilo por adición de éter dietílico. El producto se secó al vacío y se purificó en una columna de alúmina, usando el siguiente sistema de disolventes: era 95% de MeCN, 3% de dH<2>O y 2% de KNO<3>.

[0300] [{Ru(1,10-fenantrolina)<2>}<2>(tpphz)][PF<6>]<4>

[0302] Tpphz (0,263 g, 0,68 mmol), [Ru(phen)<2>Cl<2>] (1 g, 1,89 mmol) y etanol/agua (50 ml). Masa = 1,1 g (0,58 mmol, rendimiento de 85,6%).<r>M<n 1>H (MeCN-d<6>) 5 (integración de desdoblamiento): 7,71 (m, 8H), 7,94 (dd, 4H), 8,09 (d, 4H), 8,29 (dd, 8H), 8,33 (s, 8H), 8,69 (dd, 8H), 10,01 (dd, 4H). ES-MS; m/z (%): 799 (10) [M-2PF<8>]<2+>, 484 (15) [M-3PF<6>]<3+>, 321 (50) [M-4P<f>6]4+, Análisis de masas preciso: C<72>H<2>8

N<14>[<102>Ru]<24+>Calculado 321,1110. Encontrado 321,1112.

[0304] Los complejos34+ y44+ se sintetizaron usando métodos similares, empleando los ligandos bidentados metilados relevantes. Tanto34+ como44+ presentan la emisión intensa de 3MLCT basada en Ru'^tpphz en MeCN esperada centrada en 670 nm y 700 nm respectivamente (figuras 5 y 6). Las propiedades biológicas de cada uno de estos cuatro complejos se estudiaron utilizando sus sales de cloruro, que se obtuvieron por metátesis de aniones.

[0306] Propiedades de los complejos dinucleares

[0308] Se cree que el equilibrio de lipofilia e hidrofilia es importante para la absorción de sustratos bioactivos por las células vivas. El Log P de los cuatro complejos se determinó mediante reparto en octanol-agua utilizando el procedimiento de matraz agitado. Los resultados fueron los siguientes:14+ = 1,77,24+ = 1,03,34+ = 1,38 y44+ = 1,13. Estos datos ponen de manifiesto que24+ es el complejo más lipófilo. Además, la lipofilia relativa parece aumentar con el número de grupos metilo unidos a los ligandos auxiliares de estos complejos.

[0310] La bioactividad de estos compuestos se investigó con respecto a las cepas MG1655 derivada de K12 de tipo natural, y EC958 ST131 uropatogénica multirresistentes deE. coli.También se analizaron otras bacterias Gram positivas, la bacteria ESKAPE, la cepa gastrointestinal patógena deEnterococcus faecalis, V583(ATCC700802), que es uno de los principales patógenos oportunistas (y una de las principales causas de infecciones del tracto urinario) con respecto a los compuestos. La concentración inhibidora mínima, MIC, de los cuatro complejos se obtuvo tanto en el medio mínimo definido por glucosa (GDMM) como en el Mueller-Hinton-II (MH-II) rico en nutrientes (Figura 7). Como demuestran los datos de la Tabla 1, los cuatro complejos muestran mayor actividad en el GDMM.

[0312] Tabla 1. Resultados de MIC (pM) y MBC (pM) para cepas deE. colide tipo natural (MG1655) y patógenas (EC958) y cepa deE. faecalispatógena (V583) en GDMM y MH-II.

[0314] Complejo MG1655 EC958 V583 MG1655 EC958 V583 Valores de MIC en GDMM Valores de MIC en MH-II

[0316] 1<4+>2,3 2,8 21,3 12,9 14,7 64

[0317] <24+>7,8 10,4 64 139,9 145,1 64

[0318] <34+>2,5 2,5 8 6,8 6,8 42,7

[0319] <44+>1,2 1,6 0,5 5,6 5,6 3,3

[0320] ampicilina 3,3 - 1 5,7 - 0,5 Valores de MBC en GDMM Valores de MBC en MH-II

[0321] 1<4+>11 4,3 53,3

11 4,6 53,3 Complejo MG1655 EC958 V583 MG1655 EC958 V583 Valores de MIC en GDMM Valores de MIC en MH-II

[0323] <24+>15,5 25,9 85,3 15,5 25,9 85,3

[0324] <34+>20,3 5,1 53,3 20,3 5,1 53,3

[0325] <44+>2,4 2,4 4

2,4 2,4 4

[0326] ampicilina 11,4 - 6,3 11,4 - 6,3 Aunque el compuesto más lipófilo, el24+, muestra la menor actividad, muy probablemente debido a su menor solubilidad en medios acuosos, la serie lipófila muestra un aumento de la lipofilia y un aumento concomitante de la actividad, teniendo44+ la mayor actividad contra las tres cepas de bacterias. En particular,14+,34+ y44+ mostraron actividad apreciable contra la cepa deE. coliresistente a los p-lactámicos y la cepa deE. faecalisresistente a la vancomicina; el complejo44+ presenta incluso mayor actividad que la ampicilina contra la cepa de tipo natural deE. coli.También se obtuvieron estimaciones de la concentración bactericida mínima (MBC) para14+ -44+, que se resumen en la Tabla 1. Estos datos muestran que, como para los datos de MIC, se observa un aumento en los valores de MBC entre GDMM y MH-II. De nuevo, el44+ es el más activo, y en GDMM sus valores de MBC eran inferiores a los de la ampicilina, lo que indica que, para todas las cepas de bacterias, es más activo que el antibiótico convencional. Además, puesto que los valores de MBC contra las tres cepas superan los de MIC en al menos 4 veces, todos los compuestos funcionan como agentes antimicrobianos bacteriostáticos.

[0328] Habiendo establecido que el complejo44+ tenía las propiedades bactericidas más prometedoras, se llevaron a cabo ensayos de cinética de tiempo-muerte para ambas cepas deE. colidurante 6 horas de exposición a concentraciones crecientes del complejo en un medio mínimo a 37°C (véanse las figuras 1A y 8). A concentraciones inferiores a la MIC, había un aumento gradual de las unidades formadoras de colonias (UFC), a medida que las bacterias continuaban creciendo. En ambas cepas, es evidente que, a concentraciones de MIC y superiores, el compuesto detiene la proliferación bacteriana y reduce el número de células bacterianas viables. Para EC958 a la exposición más alta a44+ no se formaron colonias, lo que muestra que todas las bacterias del sistema murieron. Las discrepancias entre los valores de MBC y los ensayos de tiempo-muerte pueden deberse a diferentes condiciones experimentales, el ensayo de MBC implica incubación estacionaria durante 16-18 horas, y el ensayo de tiempo-muerte se lleva a cabo con 90% de aireación y rotación durante 6 horas.

[0330] Para investigar la absorción de44+ por las células deE. coli,se realizaron estudios de ICP-AES. Los estudios de absorción con44+ se llevaron a cabo en presencia y ausencia de glucosa (véanse las figuras 1B y 9). Se llevaron a cabo experimentos para investigar la acumulación de rutenio en laE. coliEC958 a lo largo de una hora, ya que, a altas concentraciones, los ensayos de tiempo-muerte mostraron que el 99,9% de las bacterias murieron en la primera hora de exposición a44+. En estos experimentos, la concentración de hierro (un oligoelemento en todas las células) también se cuantificó como control. Se descubrió que, en el tratamiento con44+, el contenido de hierro permanecía constante; además, también había un cambio insignificante en las UFC/ml, lo que demuestra que las células no se lisaron durante el experimento de acumulación.

[0332] En condiciones exentas de glucosa, la acumulación muestra dos fases: tras un aumento inicial de la exposición, se mantienen niveles bajos de rutenio durante aproximadamente 20 minutos, tras lo cual la absorción se duplica gradualmente hasta una cifra final de 1,1 x 10-16 g por célula. Suponiendo un volumen celular promedio de 1 pm3, esto equivale a una concentración intracelular de >1 mM. Por el contrario, en presencia de glucosa, aunque la cantidad de rutenio que finalmente se acumula es idéntica dentro del error experimental, la absorción del complejo es rápida, alcanzándose la concentración intracelular máxima de rutenio en 20 minutos. Las diferencias significativas entre las condiciones con glucosa y exentas de glucosa se observan a los 10 y 20 minutos.

[0334] La absorción de44+ y la respuesta celular a la exposición a44+ también se analizaron con superresolución utilizando un complejo metálico. Aunque se utilizó microscopía de iluminación estructurada para obtener imágenes de la internalización de44+ con resoluciones mejoradas (~ 100 nm), también se empleó nanoscopia de depleción de emisión estimulada (STED) para proporcionar las resoluciones limitadas de subdifracción más altas. En la Figura 2 se muestran ejemplos de imágenes STED tomadas a lo largo de un período de tiempo (5­ 120 minutos).

[0336] Para investigar si se producen cambios en la morfología celular dentro de los primeros 5-20 minutos de exposición, se tomaron imágenes en los mismos puntos temporales y en condiciones idénticas utilizadas en los experimentos de acumulación. Estas imágenes confirmaron que44+ es absorbido fácil y rápidamente por la cepa patógena deE. coli.Es interesante que, hasta 20 minutos, el complejo se acumula en gran medida en las membranas celulares y generalmente se distribuye dentro del compartimento celular. Sin embargo, después de este período, se localiza cada vez más preferentemente en los polos celulares.

[0338] La microscopía STED también se empleó para experimentos de seccionamiento 3D detallados (3D STED). Al emplear un haz STED dual dividido en el plano XY y el eje Z, se facilitaron las resoluciones 3D más altas posibles en cada imagen de plano obtenida; un factor crítico dadas las dimensiones celulares de las bacterias. Usando este procedimiento, se obtuvieron resoluciones STED 3D de 50 nm en cada plano y aproximadamente 120 nm en el eje Z. La figura 3 muestra imágenes tomadas en puntos temporales específicos después de la exposición a44+.Durante los primeros 10 min, la sonda se acumula dentro de la membrana celular formando un patrón de distribución distintivo. Después de 20 minutos comienza la redistribución del colorante y la acumulación en los polos se hace cada vez más evidente.

[0340] Considerados junto con los datos de ICP-AES, los estudios de imágenes indican un cambio en la calidad de la absorción y la distribución intracelular del complejo después de aproximadamente 20 minutos. Además, dado que el peso molecular de44+

es considerablemente mayor que el límite superior para la absorción mediada por porinas (~600 Da), este mecanismo puede descartarse. Para investigar la posibilidad de daño a la membrana, se llevó a cabo un segundo experimento de tinción conjunta con la sonda de éster de NHS Alexa Fluor 405 (véase la figura 4A).

[0342] Dado que el éster de NHS Alexa Fluor 405 es impermeable a las membranas bacterianas no comprometidas, localiza y genera imágenes de las membranas celulares. Tras 5 minutos de exposición a44+

, la localización del éster de NHS 405 se limita a la membrana celular de las bacterias. Sin embargo, después de 60 minutos de exposición al complejo, se encuentra que ambos colorantes son internalizados dentro deE. coli.Por el contrario, incluso después de 60 minutos, las células teñidas únicamente con el éster de NHS 405 siguen mostrando exclusivamente tinción en la membrana. El hecho de que la tinción de la membrana sea internalizada solo después del tratamiento con44+

ofrece más pruebas de que el complejo está alterando la estructura de las membranas bacterianas. Para investigar este fenómeno de forma más cuantitativa, se realizaron ensayos de fuga celular de ATP dependientes de la concentración. Tras el tratamiento con concentraciones específicas de44+

, la presencia de ATP extracelular, liberado por el daño a las membranas celulares bacterianas, se detectó utilizando la luminiscencia generada por la reacción dependiente de ATP entre la luciferasa recombinante de luciérnaga y la D-luciferina.

[0344] Los datos obtenidos de la determinación del [ATP] basada en la luminiscencia, resumidos en la figura 4B, confirman que las membranas bacterianas están comprometidas de una manera dependiente de la concentración tras la exposición a44+

. Dado este efecto, parece probable que la absorción del complejo en condiciones exentas de glucosa sea bifásica, ya que el daño a la membrana debe producirse inicialmente antes de que el nivel de44+

internalizado pueda alcanzar una concentración alta. Es posible que este daño a la membrana sea el único mecanismo de acción terapéutica del complejo; aunque, una vez internalizado, el complejo se localiza y se une a regiones específicas de la célula sugiriendo una segunda diana celular. Dado que las cepas patógenas, terapéuticamente resistentes, deE. colisiguen siendo sensibles al complejo, parece probable que el efecto de alteración de la membrana de44+

solo sea una faceta de un conjunto más complejo de interacciones y respuestas celulares.

[0346] Tabla 2. Datos de espectroscopía UV-Vis que muestran el coeficiente de extinción molar y los máximos de absorción de los cuatro [{Ru(N-N)<2>}<2>(tpphz)] en agua y MeCN. Realizado en un espectrofotómetro UV/Vis Cary 300 a 27,5°C.

[0347] Complejomáx/nrn s/M-1cm-1Transición14+en a 450 34000 MLCT

[0348] 24+en a soluble - -34+en a 454 25300 MLCT

[0349] 44+en a 430 22833 MLCT

[0350] 14+en M 450 27000 MLCT

[0351] 24+en M 450 41000 -34+en M 449 22700 MLCT

[0352] 44+en M

432 19498 MLCT

[0353] Tabla 3. Datos de emisión luminiscente que muestran el coeficiente de extinción molar y los máximos de absorción de los cuatro {Ru(N-N)<2>}<2>(tpphz)] en agua) y MeCN. Realizado en un fluorímetro Fluoromax 3 a

[0354] 27,5°C.

[0356] Complej /nm (MeCN) Amáx/nm (agua)

[0357] 14+710 -

[0358] 24+660 insoluble

[0360] 34+670 600

[0362] 44+

670 650

[0364] Puesto que44+

muestra alta actividad antimicrobiana y se dirige a la membrana, se determinó la potencia del compuesto en las células eucariotas no cancerosas para explorar más su potencial como candidato teranóstico antimicrobiano. Los ensayos de MTT en la línea renal embrionaria humana, HEK293, pusieron de manifiesto un valor promedio de IC<50>de 135 pM, indicando una diferencia de magnitud de al menos 80 veces en la concentración inhibidora contra las bacterias y las células HEK293 (véase la figura 4C).

[0365] Dada la prometedora comparación entre los valores de IC<50>y MIC, se llevó a cabo un cribado en un modelo animal. Puesto que muchos aspectos de la fisiología de las larvas deGallería mellonella,en particular su sistema inmunitario, son muy similares a los de los mamíferos, se emplean mucho como modeloín vivo, incluso como cribado de toxicidad, dando resultados comparables a los de los modelos de mamíferos utilizados habitualmente. Se realizó un cribado de toxicidad con44+ y se representaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (véase la figura 4D). Todas las concentraciones utilizadas estaban por encima de la MIC para44+ contra EC958 y dentro del intervalo de dosis diario utilizado en clínica para los antimicrobianos. A partir de los ensayos de rango logarítmico, se determinó que no había diferencias significativas entre el porcentaje de supervivencia con Galleria tratada con44+ y el control en todas las concentraciones del compuesto. Además, las puntuaciones de actividad y melanización mostraron que no había efectos negativos significativos enGalleríaexpuesta a44+, confirmando que este compuesto no es tóxico en concentraciones muy por encima de la MIC.

[0366] Tabla 4 Constantes de unión al ADN y tamaños de sitio de cuatro compuestos descritos en el presente documento (Figura 10)

[0368] Complej Ib/If Kb n

[0369] 14+ 60 1,1 x 107 2,924+

17 5,6 x 106 1,26 ± 0,0234+ 27 6,7 x 106 1,45 ± 0,02

[0370] 44+

10 2,4 x 106 0,92 ± 0,02

[0372] Tabla 5 Ensayos de rango logarítmico (Mantel-Cox) en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para determinar si se observa una diferencia significativa entre los porcentajes de supervivencia de Galleria a la que se inyecta control (agua) y compuesto. Se inyectaron en Galleria 10 gl de compuesto (0-80 mg/kg) y se almacenaron a 37,5°C durante 120 horas.

[0373]

cia sig. diferentes

[0375] Se determinaron los potenciales de membrana y el comportamiento de citometría de flujo de44+, como se muestra en las figuras 11 y 12. Además, se ha mostrado que44+ a una concentración de MlC puede penetrar enAcetinobacter baumannii(AB184) (figura 13). A los 10 minutos, se pueden obtener imágenes de la membrana externa, a los 60, de la membrana interna. La localización de44+ en las células AB184 de A.baumanniidentro de la hemolinfa de las larvas se muestra en la figura 17.

[0377] Se determinó el contenido de rutenio (gg/ml) en la hemolinfa enGalleria mellonellaa la que se inyectó44+ (figura 14). Como era de esperar, a dosis más altas, el contenido de rutenio es mayor en la hemolinfa, aunque permanece en gran medida constante durante todo el experimento. Los modelos de infección de Kaplan Meier (figura 15) muestran una buena supervivencia a ambas concentraciones de44+ (40 mg/kg y 80 mg/kg) respecto al control (agua). Además, las figuras 16A y 16B muestran los recuentos de UFC de bacterias de la hemolinfa de larva extraída (bacterias enGalleria).A partir de estas gráficas está claro que después de 48 horas con ambas concentraciones de tratamiento (40 u 80 mg/kg de44+) las colonias eran depuradas. Esta depuración se logró a partir de una sola dosis de compuesto. En comparación, se observó un aumento exponencial en el crecimiento bacteriano en ausencia de44+.

[0379] Las larvas deGalleria mellonellase seleccionaron para su posterior estudio, utilizando el protocolo de depuración CUBIC. La figura 18 muestra imágenes tomadas a través de larvas de polilla de la ceraGalleriadepuradas. La luminiscencia de44+ tiñó las células deA. baumanniien la cabeza (A) y la cola (B) deGalleria Mellonella.Las regiones de células deA. baumnniiestán resaltadas (I, II). Se observa el inicio de una respuesta inmunitaria en las células de la hemolinfa deGalleria(C). Las imágenes muestran que lasA. baumanniiteñidas con44+ son absorbidas por las células hemocitos de las larvas y fagocitadas. Esto indica que no solo44+ mata las bacterias, sino que también regula por aumento la respuesta inmunitaria de las larvas, permitiendo que la infección sea depurada. La figura 19 también muestra imágenes de larvas depuradas infectadas conA. baumannii,AB184, teñidas con éster de NHS 488 (A) o44+ (B). Secciones de las células se identifican (i) y se expanden (AII, AIII, BII) para mostrarA. baumanniidentro de las células hemocitos. Se proporcionan gráficos de superficie 3D (AIV, BIII) para mostrar la intensidad de emisión máxima.

[0381] En la figura 20, se presenta un estudio de formación de biopelículas deE. coliST131, EC958, cuando se somete al complejo44+. ST131 formaba biopelículas en ausencia de44+, y con 10% de la MIC. El ensayo T de Welch no mostró diferencias significativas entre estos grupos (P = 0,687). Las concentraciones de 0,390 y 0,781 no mostraron formación de biopelículas con valores negativos menores de 0,003 y 0,005, respectivamente. Así pues,44+ evita que se formen biopelículas en concentraciones tan bajas como 0,390 pM. La figura 21 muestra un estudio con biopelículas preformadas. Las biopelículas se sometieron a44+ 15,6 pM, 78 pM y 156 pM. Se observó una diferencia significativa de un asterisco entre las muestras de control (0 pM) y 156 pM (valor p = 0,0015), y se observó una diferencia significativa de dos asteriscos entre las muestras de control (0 pM) y 15,6 pM (valor p = 0,0086). Por lo tanto,44+ tiene la capacidad de prevenir la formación de biopelículas y de penetrar las biopelículas existentes.

[0383] Síntesis de complejos mononucleares

[0385] Los complejos12+ y22+ (véase el esquema 2) se sintetizaron usando los procedimientos descritos a continuación.

[0388]

[0391] Esquema 2. Compuestos14+ a44+

[0392] [Ru(N-N)<2>Cl<2>]

[0394] Se sintetizaron cuatro compuestos mediante el siguiente método, donde N-N representa el ligando auxiliar de fenantrolina sustituida. Se calentaron RuCl3.3H2Ü, N-N y LiCl en DMF durante 8 horas a reflujo. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió acetona. Esta se almacenó a 4°C durante 16 horas. El precipitado de color púrpura oscuro se lavó con agua y etanol y se secó al vacío.

[0396] [Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)<2>Cl<2>]

[0398] RuCl<3>.3H<2>Ü (1,14 g, 5,50 mmol), TMP (2,4 g, 10,16 mmol), LiCl (1,47 g, 34,68 mmol), DMF (19 ml) y acetona (100 ml). Masa = 2,07 g (3,21 mmol, 63,2%) sólido púrpura. MS m/z (%): 609,1 (62) [M-Cl]<+>, 637,1 (100) [M]<+>667,1. (44) [M+Na]<+>. El monóxido de carbono desplazó a uno de los cloros.

[0400] [Ru(N-N)<2>(DPQ)][PF<8>]<2>

[0402] Se sintetizaron cuatro compuestos por el siguiente procedimiento general. [Ru(N-N)<2>Cl<2>] y DPQ se suspendieron en una solución 1:1 de EtOH:H<2>O. La suspensión se calentó a reflujo durante 12 horas en atmósfera de argón, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. Se añadió NH<4>PF<6>para formar una sal de hexafluorofosfato marrón.

[0404] [Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)(DPQ)][PF<6>]<2>

[0406] [Ru(TMP)<2>Cl<2>] (1,01 g, 1,57 mmol), DPQ (0,495 g, 2,36 mmol) y EtOH:H<2>O (50 ml). Masa = 0,861 g (0,801 mmol, 51%). MS(TOF MS LD+) m/z (%): 784 (51) [M-2PF<8>]<2+>, 929 (100) [M-PF<8>]<+>. RMN 1H (DMSO-d<6>) 5 (integración de desdoblamiento): 2,23 (6H, s), 2,39 (6H, s), 2,79 (6H, s), 2,85 (6H, s), 7,46 (2H, dd), 7,85 (2H, d), 7,65 (2H, s), 7,95 (2H, s), 8,41 (4H, d), 8,48 (2H, d).

[0408] [Ru(N-N)<2>(tpphz)][PF<8>]<2>

[0410] Se sintetizaron cuatro compuestos por el siguiente procedimiento general. La 5,6-diamino-1,10-fenantrolina se disolvió en metanol caliente, esta se añadió a una solución en ebullición de [[Ru(N-N)<2>DPQ][PF<6>]<2>en acetonitrilo. La mezcla de reacción se calentó a reflujo a 80°C durante 6 horas. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. Se añadió NH<4>PF<6>para formar una sal de hexafluorofosfato roja. El producto bruto se lavó con agua, etanol y éter dietílico. Después se purificó en una columna de alúmina de grado I con acetonitrilo/agua/KNO<3>. La banda roja se recogió, el disolvente se separó a presión reducida y el sólido rojo se secó al vacío.

[0412] [Ru(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)(tpphz)][PF<6>]<2>

[0414] 5,6-diamino-1,10-fenantrolina (88,2 mg, 0,42 mmol), metanol caliente (17 ml), [Ru(TMP)<2>DPQ][PF<6>]<2>(606 mg, 0,56 mmol), acetonitrilo (30 ml). Masa = 0,272 g (0,389 mmol, 45%), RMN<1>H (CD<3>CN-d<6>) 5 (integración de desdoblamiento): 2,29 (6H, s), 2,32 (6H, s), 2,80 (6H, s), 2,86 (6H, s), 7,71 - 7,78 (4H, m), 7,84 (4H, s,), 8,15 (4H, d), 9,30 (4H, d), 9,59 (4H, d). MS; m/z (%): 479 [M-2(PF<6>)]<2+>. Análisis de masa preciso: C<56>H<44>N<i 0>[<102>Ru]<2+>Calculado 479,1391. Encontrado 479,1405.

[0416] Propiedades de los complejos mononucleares

[0418] Los mismos parámetros y condiciones utilizados anteriormente para determinar los valores de MIC y MBC con respecto a los compuestos14+

a44+

se emplearon con el fin de ensayar los valores de MIC y MBC de los complejos12+

a42+

.

[0420] Tabla 6. Resultados de MIC para complejos mononucleares

[0421] Complejo G1655 EC958 V583 SH1000 PA2017 AB184 Valores en medio definido

[0423] 12+ 17,5 34,9 69,8 69,8 34,9 17,5

[0424] 22+

33,9 33,9 135,6 33,9 16,9 16,4

[0425] 32+

8,2 16,5 35,8 32,9 16,4 8,5

[0426] 42+

3,9 3,9 31,1 7,8 7,8 3,6

[0427] ampicilina

5 - 7,5 5 - -

[0428] Tabla 7. Resultados de MBC para complejos mononucleares

[0429] Complejo G1655 EC958 V583 SH1000 PA2017 AB184 Valores en medio definido

[0431] 12+34,9 17,5 279,5 69,8 34,9 34,9

[0432] 22+33,9 17 271,2 33,9 16,9 16,9

[0433] 32+8,2 16,5 131,7 32,9 32,9 8,2

[0434] 42+3,9 3,9 31,1 7,8 7,8 3,6

[0435] ampicilina

10 - 7,5 10 - -

[0436] Como puede verse en las Tablas 6 y 7, se determinó la actividad antimicrobiana de cada uno de los compuestos12+ a42+. Además, se encontró que el compuesto42+ muestra una eficacia sorprendente como antibiótico, con mejores propiedades que los antibióticos existentes tales como la ampicilina. Para evitar dudas; SH1000 es Staphylococcus aureus; AB184 es acetinobacter baumanii; y PA2017 es pseudomonas aeruginosa.

[0438] Habiendo establecido que el complejo42+ tenía las propiedades bactericidas más prometedoras, se llevaron a cabo ensayos cinéticos de unión de ADN (figura 22) y tiempo-muerte paraE. colidurante la exposición a concentraciones crecientes del complejo en medio mínimo a 37°C (véase la figura 23). En presencia de glucosa, se observa el mecanismo de eflujo, que indica claramente que el complejo puede ser transportado activamente dentro y fuera de la célula. La figura 24 muestra la diferencia en el contenido de Ru por célula (g) en los intervalos de tiempo de la figura 23. El contenido de Ru es generalmente mayor en presencia de glucosa a los 5, 10 y 20 minutos, observándose diferencias significativas después de 10 minutos.

[0440] Las células deE. colitratadas con42+ a la concentración MIC a las 1,2 y 24 horas han mostrado el inicio de la filamentación celular multinucleada cuando está presente42+ (figuras 26 A-C y figura 27). Esto indica que la muerte celular es causada por el daño al ADN en presencia de este complejo. En la figura 27, una superposición directa de DAPI y42+ da una constante de colocalización de Pearson de >0,9. Esta constante indica una fuerte colocalización que confirma que42+ se dirige al ADN de S.aureus.Para corroborar las observaciones de las figuras 26 y 27, las propiedades mutagénicas de42+ enE. colise determinaron usando un ensayo mutagénico de Ames (Figura 28), en comparación con la mutagénesis natural y la irradiación UV. A los niveles de y por encima de los niveles de MIC de42+ se observa una mutagénesis significativa del ADN, con el doble de la MIC, esto se acerca a los niveles observados para la irradiación UV, lo que indica que42+ produce daño al ADN de las células bacterianas, como se observa en la filamentación que se muestra en la figura 26. La figura 29 muestra imágenes TEM deE. Colidespués de tratamiento con42+, la membrana celular permanece intacta, lo que proporciona más pruebas de que la muerte celular se produce por daño de la membrana y no por lisis de la membrana. Sin embargo, hay indicios de plasmólisis en las células muertas (por ejemplo, la fuga celular interna observada en III), lo que indica que42+ también puede causar daño osmótico a las células. El modelo de daño al ADN se corrobora adicionalmente mediante el ensayo de daño a la membrana de la figura 30. Este ensayo cuantifica el ATP extracelular después del tratamiento con diferentes concentraciones de42+, con respecto al control de polimixina, las células tratadas con42+ retienen el ATP. Se cree que esto se debe a la necesidad de niveles adicionales de ATP dentro de las células para reparar el ADN dañado.

[0442] El cribado de toxicidad, para42+ (Figura 31), se completó como se describe anteriormente para44+ (figura 4D).

[0443] 42+ no es tóxico paraGallería mellonellahasta 80 mg/kg (la dosis clínica diaria máxima de un antibiótico). Al igual que con44+, los ensayos de rango logarítmico de Mantel-cox mostraron que no había diferencia estadística, a ninguna concentración, entre el porcentaje de supervivencia de los controles y las larvas tratadas con el compuesto. La figura 32 proporciona más datos de cribado de toxicidad, esta vez conA. baumanniiAB184, en estos ensayos está claro que la presencia de42+ depura las colonias, ya que todas las larvas tratadas sobreviven durante las 120 horas de duración del experimento, mientras que las larvas no tratadas con42+ no sobreviven. Los estudios de rango logarítmico de Mantel-cox mostraron una diferencia significativa de un asterisco en el porcentaje de supervivencia entre las larvas infectadas no tratadas y tratadas. Además, las figuras 33A y 33B muestran los recuentos de UFC de bacterias de la hemolinfa de larva extraída (bacteriaA. baumanniiAB184). A partir de estas gráficas está claro que después de 48 horas con ambas concentraciones de tratamiento (40 u 80 mg/kg de42+) se depuraron las colonias. Esta depuración se logró a partir de una sola dosis de compuesto. En comparación, se observó un aumento exponencial en el crecimiento bacteriano en ausencia de42+.

[0444] Comparación de las propiedades de los complejos mono y dinucleares

[0445] Para considerar más la actividad antimicrobiana de los compuestos14+ a44+ se seleccionaron los compuestos12+ a42+, los compuestos44+ y42+ para estudiar con una amplia variedad de microbios, los resultados se muestran en la Tabla 8 a continuación. Los valores de MIC y MBC se determinaron como antes.

[0446] Tabla 8. Resultados de MIC y MBC para complejos dinucleares y mononucleares

[0449]

[0450]

[0453] Como puede verse, los complejos reivindicados presentan actividad contra una amplia biblioteca de cepas bacterianas. En particular, ambos complejos muestran una alta actividad en todas las bacterias, incluidas las cepas resistentes al carbapenem identificadas por la OMS como de prioridad 1: crítica.

[0455] Las tablas 9 a 11 comparan además la actividad de los complejos44+ y42+ con las referencias clínicas de gentamicina y cisplatino.

[0457] Tabla 9. Resultados del perfil de actividad de biopelículas para los complejos dinucleares y mononucleares contra biopelículas Gram negativas

[0460]

[0463] Como puede verse, ambos compuestos son activos en las biopelículas Gram negativas analizadas, lo que indica que penetran y alteran las biopelículas. El complejo dinuclear,44+, presenta una mayor actividad que el42+ o el antibiótico de referencia clínico gentamicina.

[0465] Tabla 10. Resultados del ensayo de mutación para complejos dinucleares y mononucleares

[0468]

[0471] La tabla 10 muestra que en concentraciones superiores a las MIC de los compuestos, se encontró que los complejos presentaban frecuencias mutagénicas en el intervalo del control no tratado (mutagénesis natural). La frecuencia mutagénica era inferior a la observada con el cisplatino. Por lo tanto, se confirma que los compuestos no son mutagénicos para el ADN de los mamíferos.

[0472] Tabla 11. Resultados de toxicidad en células de mamíferos para complejos dinucleares y mononucleares

[0474]

[0477] Los datos de toxicidad en células de mamífero de la Tabla 11 muestran que ambos compuestos son menos tóxicos que el cisplatino, siendo el44+ dinuclear más de 10 veces menos tóxico para las células eucariotas sanas que este conocido fármaco. Además, se observa un índice terapéutico promedio de >60 para44+ y de ~6 para42+. En comparación, el cisplatino tiene un índice terapéutico de 2.

[0479] Las tasas relativas de absorción de los complejos42+ y44+. Se muestran en la figura 25, se observó un aumento en la velocidad inicial de absorción respecto al complejo44+, lo que se cree que se debe al menor peso molecular del complejo mononuclear.

[0481] La tabla 12 ilustra la solubilidad cinética de los complejos42+ y44+ que se ensayaron y se compararon con un fármaco de control positivo soluble (nicardipina). Ambos compuestos pasaron el análisis de DMPK con una solubilidad y estabilidad cinética óptimas.

[0483] Tabla 12: Solubilidad turbidimétrica cinética de DMPK

[0485]

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

1. Un compuesto para usar como antimicrobiano según la fórmula (I) o fórmula (la):

en donde,

X<1>, X<2>, X<3>y X<4>son cada uno N;

Y<1>e Y<2>se seleccionan cada uno independientemente de: N o C(R<a>);

M<1>y M<2>son cada uno un centro metálico, en donde M<1>y M<2>son cada uno rutenio;

R<1>, R<2>, R<3>, R<4>y R<a>se selecciona cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, haloalquilo, haloalquenilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o combinaciones de los mismos;

A<1>, A<2>, A<3>y A<4>son cada uno ligandos bidentados; y

los anillos D<1>y D<2>comprenden cada uno independientemente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S, C(R<a>);

en donde el ligando bidentado es un compuesto según la fórmula (III):

en donde,

Zi y Z<2>son cada uno N; y

R<5>, R6 y R<7>se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, halógeno, haloalquilo, haloalquenilo, haloarilo, hidroxi, alcoxi, ácido carboxílico, amino, amido, nitro o combinaciones de los mismos.

2. Un compuesto para usar según la reivindicación 1, en donde el compuesto es para usar como un antibiótico.

3. Un compuesto para usar según la reivindicación 2, en donde el compuesto es para usar contra bacterias Gram negativas.

4. Un compuesto para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde Y<1>e Y<2>son cada uno N.

5. Un compuesto para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde R<1>, R<2>, R<3>, R<4>y Ra se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo y arilo.

6. Un compuesto para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde R<5>, R6 y R<7>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo y arilo.

7. Un compuesto para usar según cualquier reivindicación precedente, en donde A<1>, A<2>, A<3>y A<4>son cada uno ligandos bidentados seleccionados independientemente de(1)a(7):

o una combinación de los mismos.

8. Un compuesto para usar según cualquier reivindicación precedente, que tiene una estructura según la fórmula (IV) o (IVa):

en donde

R<8>, R<8>', R<8>", R<8>''', R<9>, R<9>', R<9>", R<9>''', R<10>, R<10>', R<10>", R<10>''', R<11>, R<11>', R<11>", R<11>''', R<12>R<13>''' se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo, alcoxi, alquenilo y arilo; con la

condición de que al menos uno de R<8>, R<8>', R<8>", R<8>''', R<9>, R<g>', R<g>", R<g>''', R<10>, R<10>', R<10>", R<10>''', R<11>, R<11>', R<11>", R<11>''',

R<12>, R<12'>, R<12>", R<12>''', R<13>, R<13>', R<13>" y R<13>''' se selecciona de: alquilo, alcoxi, alquenilo y arilo; y

en donde R<14>, R<15>, R<16>, R<19>, R<20>y R<21>se seleccionan cada uno independientemente de: hidrógeno, alquilo,

alquenilo, arilo, halógeno, hidroxi, alcoxi o combinaciones de los mismos.

9. Un compuesto para usar según la reivindicación 8, en donde R<8>, R<8>', R<8>" y R<8>''' son iguales; R<9>, R<9>', R<9>" y R<9>'''

son iguales; R<10>, R<10>', R<10>" y R<10>" son iguales; R<11>, R<11>', R<11>" y R<11>''' son iguales; R<12>, R<12'>, R<12>" y R<12>''' son iguales;

R<13>, R<13>', R<13>" y R<13>''' son iguales.

10. Un compuesto para usar según la reivindicación 8 o 9, que tiene una estructura según la fórmula (V) o

fórmula (Va):

2s

fórmula (Va)

o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. Una composición para usar como un antimicrobiano que comprende el compuesto según cualquier reivindicación precedente.