ES3052969T3 - Immunostimulatory compositions - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a composiciones inmunoestimulantes eficaces para inducir respuestas inmunitarias en aves. Más específicamente, estas composiciones inmunoestimulantes comprenden una composición inmunomoduladora y un oligonucleótido inmunoestimulante que, al administrarse, estimula el receptor tipo Toll 21. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones inmunoestimulantes

[0003] Campo de la invención

[0004] Se proporcionan composiciones y usos en métodos para estimular la proteína receptora de tipo Toll 21 (TLR21). Más específicamente, en el presente documento se divulgan oligonucleótidos y composiciones inmunoestimulantes, métodos de fabricación de oligonucleótidos y composiciones inmunoestimulantes, y usos en métodos de estimulación de TLR21. Cualquier referencia a tratamientos o métodos de tratamiento ha de interpretarse como referida a un uso en un método de tratamiento.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Los sistemas inmunitarios de los vertebrados han desarrollado mecanismos moleculares para reconocer patógenos invasores e iniciar vías de señalización celular para resistir activamente la infección. Algunos de los mecanismos moleculares son específicos para un microbio particular e implican biomoléculas tales como anticuerpos que reconocen los antígenos de superficie de una única especie de patógeno. Desafortunadamente, los mecanismos de defensa específicos de los patógenos no son completamente eficaces, ya que algunos animales no desarrollan ninguna resistencia adquirida hasta después de que se haya instalado la infección y, en algunos casos, el patógeno ha desarrollado medios sigilosos para evadir las defensas adquiridas de un vertebrado.

[0007] Los vertebrados también reconocen las infecciones de forma más general, y este reconocimiento conduce a respuestas inmunitarias inespecíficas tales como un aumento de la expresión de citocinas. Esta defensa puede desencadenarse cuando los receptores celulares se unen a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Esta interacción entre el PAMP y el receptor del hospedador para el PAMP puede iniciar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la proteína receptora de tipo Toll 21 (TLR21) es el homólogo funcional en pollos de la TLR9 en mamíferos y es capaz de reconocer motivos CpG no metilados, que tienen un mayor contenido de CpG en los microbios que en los vertebrados. Las metodologías conocidas aprovechan esta vía de respuesta inmunitaria inespecífica administrando plásmidos u oligonucleótidos que tienen motivos CpG no metilados, y se ha demostrado que la activación de TLR21 por ácidos nucleicos que contienen motivos CpG activa señales celulares implicadas en las respuestas inmunitarias a las infecciones microbianas. Sin embargo, los plásmidos u oligonucleótidos inmunoestimulantes administrados por sí solos pueden no desencadenar una respuesta suficiente para combatir la infección. El documento WO 2012/084951 A1 se refiere a un método de activación inmunitaria que es eficaz para desencadenar una respuesta inmunitaria no específica de antígeno en un miembro de la especie bovina. El documento WO 96/02555 A1 se refiere a oligonucleótidos que contienen dinucleótidos CpG no metilados y utilidades terapéuticas basadas en su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto.

[0008] Los productores de animales a gran escala necesitan urgentemente alternativas al tratamiento con antibióticos de las infecciones. Los consumidores presionan a estos productores para que elaboren productos de animales sin antibióticos, y al mismo tiempo, la creciente incidencia de infecciones debidas a patógenos resistentes a antibióticos está poniendo de manifiesto los peligros de administrar antibióticos de forma profiláctica a grandes poblaciones. De manera similar, la resistencia a los antibióticos se está convirtiendo en una emergencia nacional en la sanidad humana. Los hospitales y los consultorios médicos se están convirtiendo en la zona cero de la aparición de bacterias farmacorresistentes, tales como elStaphylococcus aureusde resistencia múltiple (SARM).

[0009] Por lo tanto, se necesitan composiciones inmunoestimulantes y usos en métodos para desencadenar respuestas inmunitarias no específicas contra patógenos. Los usos divulgados en métodos y composiciones se dirigen a estas y otras necesidades importantes.

[0010] Sumario de la invención

[0011] De acuerdo con la invención, en el presente documento se divulgan composiciones inmunoestimulantes que comprenden una composición inmunomoduladora que comprende un plásmido de ácido nucleico inmunogénico y un vehículo de suministro liposomal; y un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante, en donde la secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina comprende una primera pluralidad de nucleótidos de guanina y, opcionalmente, una segunda pluralidad de nucleótidos de guanina en dirección 3' de la primera pluralidad de nucleótidos de guanina.

[0012] En el presente documento también se divulgan métodos de acuerdo con la invención para preparar la composición inmunoestimulante que comprende: combinar una composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante para formar una composición inmunoestimulante; centrifugar la composición inmunoestimulante para generar un sobrenadante y un sedimento; y aislar el sedimento.

[0013] Además se describen usos en métodos de estimulación de TLR21 que comprenden administrar un oligonucleótido inmunoestimulante y una composición inmunomoduladora a un sujeto, en donde el oligonucleótido inmunoestimulante comprende al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en, o cerca de, el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante, y en donde la composición inmunomoduladora comprende un plásmido de ácido nucleico no codificante y un vehículo de suministro de lípidos catiónicos.

[0015] También se divulgan usos en métodos para desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto administrando un oligonucleótido inmunoestimulante y una composición inmunomoduladora, o una composición inmunoestimulante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y una composición inmunomoduladora, a un sujeto, en donde el oligonucleótido inmunoestimulante tiene al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en, o cerca de, el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante, y en donde la composición inmunomoduladora comprende un plásmido de ácido nucleico no codificante y un vehículo de suministro de lípidos catiónicos. La invención reivindica la composición inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación, en donde el plásmido de ácido nucleico es no codificante, para su uso en un método para estimular el receptor de tipo Toll 21 (TLR21) o desencadenar una respuesta inmunitaria en un pollo, comprendiendo dicho método administrar dicha composición inmunoestimulante.

[0017] Breve descripción de los dibujos

[0019] El sumario, así como la siguiente descripción detallada, se entenderán mejor al leerlos junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar las composiciones y métodos divulgados, en los dibujos se muestran realizaciones de ejemplo de las composiciones y métodos; sin embargo, las composiciones y métodos no se limitan a las realizaciones específicas divulgadas. En los dibujos:

[0021] LaFIG.1ilustra la estructura química de un resto colesterilo unido a un enlazador de tetraetilenglicol.

[0022] LasFIG. 2A y 2Bcomparan las inmunogenicidades de ADN plasmídico inmunoestimulante, ADN plasmídico complejado con liposomas catiónicos y oligonucleótidos inmunoestimulantes. LaFIG. 2Acompara las inmunogenicidades de un ADN plasmídico inmunoestimulante ("ADNp") y ADNp complejado con liposomas catiónicos ("ADNp-F"). LaFIG. 2Bcompara las inmunogenicidades de ADNp, ADNp-F y el oligonucleótido inmunoestimulante GCGT3-TG4T que tiene una modificación con 5'-colesterilo ("5Col-GCGT3-TG4T").

[0023] LasFIG. 3A y 3Bcomparan las inmunogenicidades de ADN plasmídico inmunoestimulante, ADN plasmídico inmunoestimulante complejado con liposomas catiónicos, oligonucleótidos inmunoestimulantes y combinaciones de los mismos. LaFIG. 3Acompara las inmunogenicidades de ADNp, ADNp-F, 5Col-GCGT3-TG4T, ADNp combinado con 5'Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-5Col-GCGT3-TG4T") y ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F-5Col-GCGT3-TG4T"), en donde los oligonucleótidos inmunoestimulantes están a concentraciones de nM y el ADNp y el ADNp-F están a concentraciones de µg/ml. LaFIG. 3Brepresenta las diferencias de inmunogenicidad entre ADNp, ADNp-F, 5Col-GCGT3-TG4T, ADNp combinado con 5'Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-5Col-GCGT3-TG4T") y ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F-5Col-GCGT3-TG4T"), en donde los oligonucleótidos inmunoestimulantes están a concentraciones de pM y el ADNp y el ADNp-F están a concentraciones de ng/ml;

[0024] LaFIG.4ilustra la capacidad de las fracciones de ADNp-F para estimular respuestas inmunitarias mediadas por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21. Específicamente, se comparó la inmunogenicidad de ADNp-F almacenado a 4 °C con la de ADNp-F obtenido en el sedimento ("sedimento de ADNp-F") y el sobrenadante ("sobrenadante de ADNp-F") de una muestra centrifugada.

[0025] LasFIG.5A y 5Brepresentan gráficamente la capacidad de generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 de ADNp-F-5Col-GCGT3-TG4T y 5Col-GCGT3-TG4T a concentraciones altas y bajas, respectivamente.

[0026] LasFIG. 6A y 6Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de ADNp-F-5Col-GCGT3-TG4T para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de 5Col-GCGT3-TG4T obtenido en el sedimento ("Sedimento de ADNp-F 5Col") y el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F 5Col") de una muestra de ADNp-F centrifugada.

[0027] LasFIG. 7A y 7Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de 5Col-GCGT3-TG4T para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de 5Col-GCGT3-TG4T obtenido en el sedimento ("Sedimento de 5Col") y el sobrenadante ("Sobrenadante de 5Col") de una muestra de ADNp-F centrifugada.

[0028] LasFIG. 8A y 8Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de 5Col-GCGT3-TG4T ("5Col-GCGT3-TG4T 4 °C") para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T "ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T").

[0029] LasFIG. 9A y 9Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T obtenido en el sedimento ("Sedimento de ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") y el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") de una muestra de ADNp-F centrifugada.

[0030] LasFIG. 10A y 10Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de ADNp-F combinado con 5-Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F-5-Col-GCGT3-TG4T") para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de ADNp-F y el oligonucleótido inmunoestimulante 5-Col-GCGT3-TG4T.

[0031] LasFIG. 11A y 11Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F-5-Col-GCGT3-TG4T") para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de ADNp-F combinado con 5Col-GCGT3-TG4T obtenido en el sedimento ("Sedimento de ADNp-F-5-Col-GCGT3-TG4T") y el sobrenadante ("ADNp-F-5-Col-GCGT3-TG4T") de una muestra de ADNp-F centrifugada.

[0032] LasFIG. 12A y 12Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de ADNp-F, oligonucleótido inmunoestimulante GCGT3-TG4T y ADNp-F complejado con GCGT3-TG4T ("ADNp-F-GCGT3-TG4T") para generar respuestas inmunitarias mediadas por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21.

[0033] LasFIG.13A y 13Bcomparan la capacidad de concentraciones altas y bajas, respectivamente, de ADNp-F junto con el oligonucleótido inmunoestimulante GCGT3-TG4T ("ADNp-F-GCGT3-TG4T") para generar una respuesta inmunitaria mediada por TLR21 en células HEK293-bsd-cTLR21 con la de ADNp-F combinado con el oligonucleótido inmunoestimulante GCGT3-TG4T obtenido en el sedimento ("Sedimento de ADNp-F-GCGT3-TG4T") y el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F-GCGT3-TG4T") de una muestra de ADNp-F centrifugada. LaFIG. 14muestra los resultados de títulos medios de inhibición de la hemoaglutinación (HI, por sus siglas en inglés) (Log2) (con desviación estándar) para ODN1 (GCGT3-TG4T-5Col) los días 14 (panel superior) y 21 (panel inferior) después de la vacunación (pv, por sus siglas en inglés). Los asteriscos indican el nivel de significación (*=significativo a ****=altamente significativo).

[0034] LaFIG.15representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) para ODN1 (GCGT3-TG4T-5Col) durante todo el estudio.

[0035] LaFIG.16representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) para ODN2 (GCGT3-TG4T) los días 14 (panel superior) y 21 (panel inferior) después de la vacunación. Los asteriscos indican el nivel de significación (*=significativo a ****=altamente significativo).

[0036] LaFIG.17representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) para ODN2 (GCGT3-TG4T) durante todo el estudio.

[0037] LaFIG.18representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) para ODN3 (2006-PTO) los días 14 (panel superior) y 21 (panel inferior) después de la vacunación. Los asteriscos indican el nivel de significación (*=significativo a ****=altamente significativo).

[0038] LaFIG.19representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) para ODN3 (2006-PTO) durante todo el estudio.

[0039] LaFIG.20muestra los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) para los Artículos de ensayo de control positivo y negativo los días 14 (panel superior) y 21 (panel inferior) después de la vacunación. Los asteriscos indican el nivel de significación (*=significativo a ****=altamente significativo).

[0040] LaFIG.21representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) de los Artículos de ensayo de control positivo y negativo durante todo el estudio.

[0041] LaFIG. 22representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) a las concentraciones más óptimas de ODN durante todo el estudio en comparación con la vacuna contra NDV sola. LaFIG. 23representa los resultados de títulos medios de HI (Log2) (con desviación estándar) a las concentraciones más óptimas de ODN el día 14 (panel superior) y 21 (panel inferior) pv en comparación con la vacuna contra NDV sola.

[0043] Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

[0045] Las composiciones y métodos divulgados pueden entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con las figuras adjuntas, que forman parte de la presente divulgación. Ha de entenderse que las composiciones y métodos divulgados no se limitan a las composiciones y métodos específicos descritos y/o mostrados en el presente documento, y que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares solamente a modo de ejemplo y no pretende ser limitante de las composiciones y métodos reivindicados. El alcance de protección se define por el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

[0047] A menos que se indique específicamente otra cosa, cualquier descripción de un posible mecanismo o modo de acción o motivo de mejora debe ser solo ilustrativa, y las composiciones y métodos divulgados no han de estar limitados por la corrección o incorrección de ningún mecanismo o modo de acción o motivo de mejora sugerido.

[0049] A lo largo de este texto, las descripciones se refieren a composiciones y métodos de uso de dichas composiciones. Cuando la divulgación describe o reivindica una característica o realización asociada a una composición, una característica o realización de este tipo es igualmente aplicable a los métodos de uso de dicha composición. Análogamente, cuando la divulgación describe o reivindica una característica o realización asociada a un método de uso de una composición, una característica o realización de este tipo es igualmente aplicable a la composición.

[0050] Cuando se expresa un intervalo de valores, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. Además, la referencia a los valores citados en los intervalos incluye todos y cada uno de los valores dentro de ese intervalo. Todos los intervalos son inclusivos y combinables. Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular constituye otra realización. La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

[0051] Ha de apreciarse que determinadas características de las composiciones y métodos divulgados, que por motivos de claridad se describen en el presente documento en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, las diversas características de las composiciones y métodos divulgados, que por motivos de brevedad se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación.

[0052] Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen el plural.

[0053] "Coadministrado", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de la composición inmunomoduladora en combinación con el oligonucleótido inmunoestimulante para conseguir el efecto inmunoestimulante deseado. La composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante pueden coadministrarse como composiciones separadas o juntos como una única composición. Si la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante son composiciones separadas, pueden coadministrarse simultánea o secuencialmente en cualquier orden. Para la coadministración secuencial, puede haber un retraso de un minuto, una hora, o incluso uno o más días entre la administración de la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante.

[0054] Como se usa en el presente documento, "fusión" se refiere a la creación de un enlace químico entre dos especies químicamente reactivas. En el contexto de la presente divulgación, la fusión con mayor frecuencia se refiere a la incorporación de elementos específicos en un oligonucleótido. Por ejemplo, puede fusionarse una serie de nucleótidos de timina en el extremo 3' de un oligonucleótido.

[0055] Como se usa en el presente documento, "secuencia de cuarteto G" se refiere a un tramo de restos guanina consecutivos cerca del extremo 5' de un oligonucleótido que permite al oligonucleótido interactuar con otras secuencias de cuarteto G para formar un cuarteto G. El cuarteto G refuerza las propiedades inmunoestimulantes del ácido nucleico. Por ejemplo, los oligonucleótidos que comprenden secuencias de cuarteto G pueden interactuar, dando como resultado cuartetos G. Las secuencias de cuarteto G que se encuentran en la región promotora de un gen pueden formar estructuras cuaternarias implicadas en la regulación de la expresión del gen. Aunque una secuencia de cuarteto G no se limita a cualquier secuencia particular, un ejemplo de una secuencia de cuarteto G es TGGGGT. Como se usa en el presente documento, "Secuencia de cable G", "Secuencia cable G", "Secuencia de cable-G", y términos relacionados, se refieren a una pluralidad, con la mayor frecuencia dos, de al menos cuatro nucleótidos de guanina consecutivos. Las pluralidades de nucleótidos de guanina, ubicados en o cerca del extremo 5' de un oligonucleótido, están separadas por dos o más nucleótidos no guanina (es decir, timina). Las secuencias de cable G son capaces de interactuar con otras secuencias de cable G para formar una estructura de cable G. Una estructura de cable G puede potenciar las propiedades inmunoestimulantes de un ácido nucleico. Una secuencia de cable G de ejemplo es GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) o GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO: 258).

[0056] Como se usan en el presente documento, las expresiones "secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina", "secuencia enriquecida en guanina", y similares, se refieren a secuencias que comprenden una serie de nucleótidos de guanina consecutivos, por lo general entre cuatro y seis nucleótidos de guanina, o una región de un ácido nucleico, normalmente en o cerca del extremo 5' de un oligonucleótido que tiene más nucleótidos de guanina que nucleótidos de adenina, citosina o timina. Una secuencia enriquecida en guanina como se ha descrito en el presente documento puede potenciar las propiedades inmunoestimulantes de un oligonucleótido. Las secuencias de cuarteto G y de cable G son ambas tipos de secuencias enriquecidas en nucleótidos de guanina.

[0057] La expresión "composición inmunomoduladora", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que comprende al menos un plásmido de ácido nucleico inmunogénico y un vehículo de suministro liposomal. En algunos aspectos de las composiciones y métodos divulgados en el presente, el plásmido de ácido nucleico puede no codificar un inmunógeno particular y puede ser inmunogénico basándose en las propiedades inherentes del plásmido de ácido nucleico. En algunos aspectos, el vehículo de suministro liposomal es catiónico.

[0058] Un "plásmido de ácido nucleico inmunogénico" es un plásmido de ácido nucleico que, cuando es detectado por el sistema inmunitario de un vertebrado, desencadena una respuesta inmunitaria. Algunos plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos comprenden un porcentaje aumentado de motivos de dinucleótidos CpG en comparación con las secuencias de plásmido de ácido nucleico que se encuentran de forma natural en algunos organismos vertebrados. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que hay presentes motivos de dinucleótidos CpG aumentados en el ácido nucleico derivado de bacterias, y por lo tanto, dicho ácido nucleico enriquecido en CpG parece extraño a las defensas inmunitarias del hospedador. Los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos pueden comprender nucleótidos de origen no natural y derivados de nucleótidos.

[0059] "Composición inmunoestimulante", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que comprende una composición inmunomoduladora y un oligonucleótido inmunoestimulante. En algunos aspectos, el oligonucleótido inmunoestimulante y la composición inmunomoduladora comprenden una única formulación que es la composición inmunoestimulante. En algunos aspectos, el oligonucleótido inmunoestimulante puede estar físicamente asociado al vehículo de suministro liposomal de la composición inmunomoduladora.

[0061] Como se usa en el presente documento, "insertar" se refiere a añadir uno o más nucleótidos específicos en posiciones específicas durante la síntesis de un oligonucleótido.

[0063] Como se usa en el presente documento, "orientación paralela" se refiere a la interacción direccional entre diferentes oligonucleótidos. Por ejemplo, los oligonucleótidos individuales orientados en la misma dirección de 5' a 3' están en una orientación paralela.

[0065] Como se usa en el presente documento, "porcentaje de identidad" y términos similares se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos, polinucleótidos, proteínas o polipéptidos, y se entienden en el contexto de y junto con las expresiones que incluyen: (a) secuencia de referencia, (b) ventana de comparación, (c) identidad de secuencia y (d) porcentaje de identidad de secuencia.

[0067] (a) Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de un ADNc o una secuencia génica de longitud completa, o el ADNc o la secuencia génica completos.

[0068] (b) Una "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotídica, en donde la secuencia polinucleotídica puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. Los expertos en la materia entienden que para evitar una similitud engañosamente alta con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia polinucleotídica se introduce normalmente una penalización por hueco y se resta del número de coincidencias.

[0069] (c) Se conocen bien en la materia métodos de alineación de secuencias para comparación. Puede realizarse una alineación óptima de secuencias para su comparación mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman,Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981; mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch,J. Mol. Biol., 48: 443, 1970; mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988; mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif., GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete del programa informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 7 Science Dr., Madison, Wisconsin, EE. UU.; el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp,Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet,et al.,Nucleic Acids Research, 16: 881-90, 1988; Huang,et al.,Computer Applications in the Biosciences, 8: 1-6, 1992; y Pearson,et al.,Methods in Molecular Biology, 24: 7-331, 1994. La familia BLAST de programas que pueden usarse para búsquedas de similitud en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos. Véase,Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel,et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1995. No cabe duda de que en el futuro se dispondrá de nuevas versiones de los programas mencionados o de programas totalmente nuevos, que podrán usarse con la presente divulgación.

[0070] (d) "Porcentaje de identidad" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen las bases de ácido nucleico idénticas en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

[0071] "Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una composición inmunomoduladora y/o un oligonucleótido inmunoestimulante o de una composición inmunoestimulante que trata al sujeto.

[0073] "Cantidad sinérgicamente eficaz" se refiere a una cantidad de una composición inmunomoduladora y un oligonucleótido inmunoestimulante que proporciona un efecto sinérgico, o más que aditivo, en el tratamiento del sujeto. El término "sujeto", como se usa en el presente documento, pretende significar cualquier animal, pero en particular, especies aviares. "Especies aviares" incluye, pero sin limitación, pollos, pavos domésticos, aves acuáticas y cualquier otra ave fuente de alimento.

[0075] Como se usa en el presente documento, "tratar" y similares se refieren a reducir la gravedad y/o frecuencia de los síntomas de una infección, eliminar los síntomas y/o la causa subyacente de dichos síntomas, reducir la frecuencia o la probabilidad de los síntomas y/o su causa subyacente, y/o mejorar o remediar el daño provocado, directa o indirectamente, por un agente infeccioso.

[0076] A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se usan diversos términos relacionados con aspectos de la descripción. A dichos términos se les debe proporcionar su significado habitual en la técnica, a menos que se indique otra cosa. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de un modo coherente con las definiciones proporcionadas en el presente documento.

[0078] En el presente documento se describen composiciones inmunoestimulantes que comprenden una composición inmunomoduladora que comprende un plásmido de ácido nucleico y un vehículo de suministro liposomal y un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en, o cerca de, el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante. Las composiciones inmunoestimulantes de acuerdo con la invención comprenden una composición inmunomoduladora que comprende un plásmido de ácido nucleico inmunogénico y un vehículo de suministro liposomal; y un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante, en donde la secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina comprende una primera pluralidad de nucleótidos de guanina y, opcionalmente, una segunda pluralidad de nucleótidos de guanina en dirección 3' de la primera pluralidad de nucleótidos de guanina.

[0080] Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, como se describen en el presente documento, pueden interactuar con TLR21 para desencadenar una respuesta inmunitaria. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes comprenden al menos un motivo CpG dinucleotídico no metilado, que interactúa con los receptores de reconocimiento de patógenos expresados en el organismo hospedador. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes también tienen una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina. Estas secuencias pueden facilitar el plegamiento de una cadena de ADN en una estructura cuaternaria o promover la agregación de uno o más oligonucleótidos inmunoestimulantes que tienen una secuencia de guanina potenciada. No es necesario que la secuencia enriquecida en guanina esté comprendida únicamente por nucleótidos de guanina, pero debe estar enriquecida. Una secuencia enriquecida en guanina, como se ha descrito anteriormente y se ejemplifica a lo largo de estas divulgaciones, normalmente se ubica en o cerca (a cuatro nucleótidos) del extremo del oligonucleótido. La manipulación adicional de la secuencia y la estructura del oligonucleótido puede potenciar adicionalmente la capacidad del oligonucleótido inmunoestimulante para estimular TLR21. Por lo tanto, una realización de la presente divulgación comprende una composición inmunoestimulante que comprende al menos un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en guanina que comienza en, o a cuatro nucleótidos, del extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante.

[0081] En algunos aspectos de la presente divulgación, la adición de series de nucleótidos de guanina al extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante que contiene CpG puede mejorar significativamente la inmunogenicidad del oligonucleótido inmunoestimulante. No sólo la posición de la secuencia rica en guanina en el oligonucleótido inmunoestimulante afecta a la potenciación de la activación de TLR21, sino que el contenido de la secuencia también tiene un efecto. Por este motivo, en algunos aspectos de la presente divulgación, las secuencias enriquecidas en guanina comprenden una pluralidad de nucleótidos de guanina consecutivos.

[0083] En algunas realizaciones, la secuencia enriquecida en guanina comprende una primera pluralidad de nucleótidos de guanina consecutivos. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende de dos a ocho nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende dos nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende tres nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende cuatro nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende cinco nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende seis nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende siete nucleótidos de guanina. En algunos aspectos, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende ocho nucleótidos de guanina. En otros aspectos más, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende más de ocho nucleótidos de guanina.

[0085] En algunas realizaciones de la presente invención, el oligonucleótido comprende la SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 92, 93, 96, 97, 100, 102, 104, 106, 108 o 143. En otras realizaciones, la secuencia enriquecida en guanina comprende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO: 261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO: 262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO: 263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 269), GGAGG, TGGAGGC o TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO: 264). En aún otras realizaciones, el oligonucleótido comprende la SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 136, 137 o 138.

[0086] Una única serie de nucleótidos de guanina no es la única modificación en 5' que puede potenciar la estimulación de TLR21. Por ejemplo, también pueden añadirse secuencias enriquecidas en adenina, citosina y timina al extremo 5' de un oligonucleótido que tiene un motivo CpG y dar como resultado una estimulación de TLR21 potenciada, aunque menor que la desencadenada por las secuencias enriquecidas en guanina en el extremo 5' del oligonucleótido. Aunque una única pluralidad de restos guanina en el extremo 5' del oligonucleótido puede desencadenar la estimulación de TLR21, pluralidades adicionales de nucleótidos de guanina en la secuencia enriquecida en guanina pueden potenciar adicionalmente las propiedades estimulantes del oligonucleótido. Por lo tanto, en algunos aspectos, el oligonucleótido de la presente divulgación comprende una segunda pluralidad de nucleótidos de guanina entre la primera pluralidad de nucleótidos de guanina y el al menos un motivo CpG.

[0088] En algunos aspectos, una pluralidad de nucleótidos de guanina comprende una secuencia de cuarteto G. En algunas realizaciones, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina, la segunda pluralidad de nucleótidos de guanina o ambas comprenden una secuencia de cuarteto G. Las secuencias de cuarteto G, como se han definido anteriormente, también permiten la interacción entre oligonucleótidos. Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, la interacción en el extremo 5' de los oligonucleótidos permite la concentración de motivos de dinucleótidos CpG y una oportunidad potenciada correspondiente de reconocimiento por TRL21. En algunas realizaciones, la composición inmunoestimulante comprende además al menos un oligonucleótido adicional que tiene una secuencia de cuarteto G, en donde el oligonucleótido y el al menos un oligonucleótido adicional tienen una orientación paralela en una estructura cuaternaria. En algunos aspectos, la secuencia de cuarteto G comprende TGGGGT.

[0090] Otra secuencia enriquecida en guanina que puede añadirse en o cerca del extremo 5' de un oligonucleótido que tiene motivos CpG es una secuencia de cable G. En algunos aspectos de la presente divulgación, las pluralidades primera y segunda de nucleótidos de guanina comprenden una secuencia de cable G. En algunos aspectos, la secuencia de cable G comprende la SEQ ID NO: 257 o 258. En otros aspectos más, la secuencia de cable G comprende la SEQ ID NO: 141, 142, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203 o GCGT-cableG3. Las dos pluralidades de nucleótidos de guanina pueden estar separadas por nucleótidos no de guanina, análogos de nucleótidos o cualquier otro espaciador o enlazador. Por ejemplo, en algunos aspectos de la presente divulgación, la primera pluralidad de nucleótidos de guanina y la segunda pluralidad de nucleótidos de guanina están separadas por al menos un nucleótido. Como se usa en el presente documento, el término "espaciador" se refiere a una unión química entre motivos de nucleótidos similares, es decir, entre dos motivos CpG o entre dos motivos de secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina, mientras que el término "enlazador" se refiere a una unión química entre diferentes motivos de nucleótidos, es decir, entre una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina y otro motivo de nucleótidos, por ejemplo, un motivo CpG. Los términos "espaciador" y "enlazador" se usan con fines de claridad para describir qué aspecto de un oligonucleótido se está analizando. Sin embargo, los expertos en la materia entenderán que las estructuras divulgadas en el presente documento para los espaciadores pueden ser intercambiables con las estructuras divulgadas en el presente documento para los enlazadores, y viceversa.

[0092] Sin desear quedar ligados a ninguna teoría particular, es posible que la secuencia de cable G permita a un oligonucleótido interactuar y agregarse con otros oligonucleótidos que tengan secuencias de cable G. La conformación asumida por la agregación de oligonucleótidos que tienen secuencias de cable G se denomina conformación de cable G, y esta acumulación de oligonucleótidos y sus motivos CpG puede conducir a una estimulación potenciada de TLR21.

[0094] Las secuencias enriquecidas en guanina pueden estar separadas de los motivos de nucleótidos CpG por nucleótidos, análogos de nucleótidos u otros enlazadores. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente divulgación, el oligonucleótido comprende además un enlazador entre la secuencia enriquecida en guanina y el al menos un motivo CpG en dirección 3'. Como se usa en el presente documento, "en dirección 3'" significa en la dirección 5' • 3'; es decir, un nucleótido o motivo "en dirección 3'" es un nucleótido o motivo que está en posición 3' de un elemento de secuencia de comparación. "En dirección 5'" significa en la dirección 3' • 5'; es decir, un nucleótido o motivo "en dirección 5'" es un nucleótido o motivo que está en posición 5' de un elemento de secuencia de comparación. No es necesario que el enlazador esté directamente adyacente a la secuencia enriquecida en guanina o al motivo CpG; más bien, el enlazador debe residir entre los dos motivos de secuencia independientemente de las secuencias intermedias entre la secuencia enriquecida en guanina y el enlazador, así como entre el motivo CpG y el enlazador. En algunas realizaciones de las presentes divulgaciones, el enlazador comprende al menos tres nucleótidos. El enlazador también puede no comprender bases nitrogenadas. Por ejemplo, en algunos aspectos, el enlazador es un hexaetilenglicol, un propanodiol, un trietilenglicol o derivados de los mismos. En otros ejemplos, el oligonucleótido que tiene un enlazador comprende 2006-PDE5dG4-X1 o 2006-PDE5dG4-X3.

[0096] Se cree que los motivos CpG dinucleotídicos presentes en los oligonucleótidos de la presente divulgación son PAMP reconocidos por TLR21 en pollos. Mientras que incluso un único motivo CpG puede estimular TLR21, la presencia de múltiples CpG en un oligonucleótido puede aumentar la intensidad de señal de TLR21 estimulada. Por este motivo, en algunos aspectos de la presente invención, el al menos un motivo CpG comprende dos, tres, cuatro o cinco motivos CpG. En algunos aspectos, el al menos un motivo CpG comprende seis o más motivos CpG. En algunos aspectos, el al menos un motivo CpG comprende dos motivos CpG. En algunos aspectos, el al menos un motivo CpG comprende tres motivos CpG. En algunos aspectos, el al menos un motivo CpG comprende cuatro motivos CpG. En algunas realizaciones, el al menos un motivo CpG comprende cuatro motivos CpG.

[0098] En algunas realizaciones de los oligonucleótidos divulgados en el presente documento, cada motivo CpG puede estar separado de los otros motivos CpG por al menos un nucleótido o análogo de nucleótido. En algunos aspectos, el al menos un nucleótido es de dos o tres nucleótidos de timina. En otros aspectos, el al menos un nucleótido está entre uno y cuatro nucleótidos, aunque el número de nucleótidos intermedios puede diferir dependiendo de la secuencia de los nucleótidos intermedios. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende la SEQ ID NO: 217, 218, 219 o 220. Los nucleótidos adyacentes a un CpG, junto con el propio motivo CpG, constituyen un elemento de secuencia de CpG (es decir, XCGX, donde X = cualquier nucleótido). Los oligonucleótidos de la presente divulgación, en algunos aspectos comprenden elementos de secuencia de CpG que son GCGA, GCGG, ACGC, CCGC, GCGT, TCGC o cualquier combinación de los mismos.

[0099] En algunas realizaciones de las presentes divulgaciones, el motivo CpG comprende un elemento de secuencia de CpG que tiene cuatro nucleótidos. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos dos elementos de secuencia de CpG. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos tres elementos de secuencia de CpG. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos cuatro elementos de secuencia de CpG. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos cinco elementos de secuencia de CpG. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos seis elementos de secuencia de CpG. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende más de ocho, diez, quince o incluso veinte elementos de secuencia de CpG.

[0100] En otras realizaciones de los oligonucleótidos divulgados en el presente documento, cada uno de los motivos CpG está separado de cualquier otro motivo CpG por un espaciador o una combinación de espaciador y al menos un nucleótido. En algunos aspectos, al menos un motivo CpG está separado del otro motivo CpG más cercano por un espaciador o una combinación de un espaciador y al menos un nucleótido, mientras que al menos otros dos motivos CpG son adyacentes entre sí. Aunque los motivos CpG separados pueden potenciar las capacidades inmunoestimulantes de los oligonucleótidos diseñados, se reconoce que los motivos CpG adyacentes entre sí aún pueden estimular TLR21.

[0101] El espaciador empleado para separar linealmente los motivos CpG puede ser cualquier unión que puentee al menos una porción del oligonucleótido entre los motivos CpG. El espaciador puede estar comprendido por, pero sin limitación necesariamente a, un puente de desoxirribosafosfato, una cadena de múltiples carbonos o una unidad química repetida. Una propiedad esencial de un espaciador es la capacidad de formar un enlace químico con la cadena principal nucleotídica del oligonucleótido. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el espaciador es un puente de desoxirribosafosfato. El puente de desoxirribosafosfato puede comprender bases nitrogenadas en algunos aspectos, mientras que en otros, el puente de desoxirribosafosfato es abásico. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende la SEQ ID NO: 221, que comprende un puente abásico de desoxirribosafosfato.

[0102] En otras realizaciones de la presente divulgación, el espaciador comprende una cadena de carbono. La cadena de carbono puede comprender de dos a doce átomos de carbono. Pueden usarse dioles que comprenden una cadena de carbono ya que los grupos alcohol terminales pueden reaccionar con grupos fosfato y/o alcohol terminales de un oligonucleótido. En algunas realizaciones, la cadena de carbono comprende dos átomos de carbono y, en algunos aspectos, la cadena de carbono deriva de etanodiol. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende ODN-X2, en donde X2 es etanodiol.

[0103] Otras realizaciones de la presente divulgación proporcionan la cadena de carbono que comprende tres átomos de carbono. En algunos aspectos de estas realizaciones, la cadena de carbono deriva de 1,3-propanodiol. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende CG-Gw2X2, CG-Gw2X2-2 u ODN-X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG-Gw2X2-4, CG-Gw2X2-5, CG-G4T16X2-1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2-3, CG-G4T16X2-4 o CG-G4T16X2-5, en donde X2 es una cadena de tres carbonos; 2006-PDE5dG4-X2 en donde X2 es una cadena de tres carbonos derivada de propanodiol; o la SEQ ID NO: 250, en donde X4 es una cadena de tres carbonos derivada de propanodiol.

[0104] En otras realizaciones de la presente divulgación, el oligonucleótido comprende un espaciador de cadena de carbono, en donde la cadena de carbono comprende cuatro átomos de carbono. En algunos aspectos de estas realizaciones, la cadena de carbono deriva de 1,4-butanodiol. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende ODN-X4, en donde X4 es una cadena de cuatro carbonos derivada de 1,4-butanodiol.

[0105] En aún otras realizaciones diferentes de las presentes divulgaciones, el oligonucleótido comprende un espaciador que tiene una unidad química repetida. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la unidad química repetida es un etilenglicol. La unidad química repetida puede repetirse de dos a doce veces. En algunas realizaciones, etilenglicol se repite seis veces. Por lo tanto, en algunos aspectos, el oligonucleótido comprende CCGC-Gw2X1, en donde X1 es un espaciador derivado de hexaetilenglicol.

[0106] Aunque las series de nucleótidos de guanina en el extremo 3' de un oligonucleótido dan como resultado poca estimulación de TLR21, si la hay, otras series de nucleótidos pueden transmitir una inmunogenicidad potenciada al oligonucleótido. Específicamente, en algunos aspectos de las presentes divulgaciones, el oligonucleótido puede comprender además un extremo terminal 3' de nucleótido de tri-timina. En algunos aspectos, el oligonucleótido comprende la SEQ ID NO: 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 o 215.

[0107] Para cada oligonucleótido divulgado en el presente documento, un experto en la materia sabría que un nucleótido puede sustituirse por un análogo de nucleótido. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una cadena principal de fosfodiéster, aunque otras realizaciones de los oligonucleótidos divulgados en el presente documento comprenden una cadena principal de fosforotioato. Las cadenas principales de fosforotioato, en algunas circunstancias, pueden ser más fáciles y rentables de fabricar.

[0108] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el oligonucleótido puede comprender un resto lipídico, lo que puede conducir a un aumento de la inmunogenicidad del oligonucleótido. Una posible explicación de la inmunogenicidad aumentada es que el resto lipídico puede actuar para potenciar la biodisponibilidad del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el resto lipídico está en o cerca del extremo 5' del oligonucleótido. Esta "caperuza" lipídica puede impedir la degradación, aumentar la solubilidad, mejorar la estabilidad del oligonucleótido en una composición farmacéutica o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, el resto lipídico es un colesterilo.

[0109] La potencia del oligonucleótido inmunoestimulante y la composición inmunoestimulante puede caracterizarse por su concentración eficaz semimáxima (CE<50>), que es una medición de la concentración necesaria para inducir una respuesta que es la mitad de la respuesta máxima que puede alcanzarse administrando la composición. Cuanto menor sea la concentración, más potente será el oligonucleótido. En algunos aspectos de las presentes divulgaciones, la composición inmunoestimulante puede tener una CE<50>en el intervalo de pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 0,1 y 100 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 100 y 200 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 200 y 300 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 300 y 400 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 400 y 500 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 500 y 600 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 600 y 700 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 700 y 800 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 800 y 900 pM. En algunos aspectos, la CE<50>es de entre aproximadamente 900 y 1 nM. En otros aspectos más, la CE<50>es inferior a aproximadamente 100 pM.

[0110] En cuanto a la concentración del oligonucleótido en la composición inmunoestimulante, en algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 0,1 y 10 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 10 y 20 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 20 y 30 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 30 y 40 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 40 y 50 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 50 y 60 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 60 y 70 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 70 y 80 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 80 y 90 nM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido es de entre aproximadamente 90 y 100 nM. En otros aspectos más, la concentración del oligonucleótido es inferior a aproximadamente 20 nM.

[0111] La composición inmunoestimulante puede comprender además al menos un oligonucleótido adicional que tiene una secuencia de cable G en algunas realizaciones de la presente divulgación. Debido a que la secuencia de cable G facilita la agregación de otros oligonucleótidos que tienen la misma, o similar, secuencia de cable G, un aspecto de la composición inmunoestimulante comprende además al menos un oligonucleótido adicional que tiene una secuencia de cable G. En algunos aspectos en los que la composición inmunoestimulante comprende múltiples oligonucleótidos que tienen secuencias de cable G, el oligonucleótido y el al menos un oligonucleótido adicional tienen una conformación de cable G.

[0112] La capacidad de un oligonucleótido para estimular TLR21 puede potenciarse adicionalmente de acuerdo con algún aspecto de la invención insertando motivos CpG adicionales. En algunos aspectos, el al menos un motivo CpG es una pluralidad de motivos CpG, y la pluralidad de motivos CpG comprende dos, tres, cuatro o cinco motivos CpG. La distancia entre los motivos CpG puede influir en las propiedades estimulantes de TLR21 del oligonucleótido. Por este motivo, algunos aspectos de los oligonucleótidos divulgados proporcionan la inserción de al menos un nucleótido o análogo de nucleótido entre los motivos CpG. El al menos un nucleótido puede ser dos o tres nucleótidos de timina. Otras realizaciones proporcionan la inclusión de un espaciador entre cada uno de los motivos CpG. El espaciador debe poder unirse al extremo 3' de una cadena de nucleótidos adyacente y al extremo 5' de la otra cadena de nucleótidos. En algunos aspectos, el espaciador es un puente de desoxirribosafosfato, que puede ser abásico en algunos aspectos.

[0113] El espaciador, en algunos aspectos, puede comprender una cadena de carbono. En algunas realizaciones, la cadena de carbono comprende dos átomos de carbono. En algunos aspectos, la cadena de carbono deriva de etanodiol. Otras realizaciones proporcionan una cadena de carbono que comprende tres átomos de carbono. En algunos aspectos, la cadena de carbono deriva de 1,3-propanodiol. En algunas realizaciones, la cadena de carbono comprende cuatro átomos de carbono y, en algunos aspectos, la cadena de carbono deriva de 1,4-butanodiol. En aún otras realizaciones, el espaciador comprende una unidad química repetida. En algunos aspectos, la unidad química repetida es un etilenglicol, y en algunos aspectos, el espaciador deriva de hexaetilenglicol.

[0114] En la Tabla 1 se identifican oligonucleótidos representativos de la presente divulgación.

[0115] Tabla 1: Secuencias de oli onucleótidos minúsculas: enlaces PTO ma úsculas: enlaces PDE

[0116]

[0117] (continuación)

[0118]

[0119] (continuación)

[0120]

[0121] (continuación)

[0122]

[0123] (continuación)

[0124]

[0125] (continuación)

[0126]

[0127] (continuación)

[0128]

[0129] (continuación)

[0130]

[0131] (continuación)

[0132]

[0133] (continuación)

[0134]

[0135] (continuación)

[0137]

[0140] Los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos descritos en el presente documento están enriquecidos en motivos CpG. En algunos aspectos, los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos contienen más del 20 % de motivos CpG en comparación con la frecuencia de motivos CpG que se encuentran en las secuencias de ácido nucleico de vertebrados.

[0142] En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos que no comprenden un gen de resistencia a antibióticos. En algunos aspectos, los plásmidos no comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifique un marcador seleccionable o cribable de longitud completa o funcional. Por ejemplo, el plásmido pGCMB75.6 descrito en el presente documento no comprende ningún gen marcador seleccionable o cribable de longitud completa o funcional. La secuencia de pGCMB75.6 se proporciona en la SEQ ID NO: 265 (Tabla 1A). En algunos aspectos, los plásmidos descritos en el presente documento no codifican un inmunógeno.

[0144] En algunos aspectos, los plásmidos inmunogénicos pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen marcador seleccionable o cribable que no es un gen de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, el plásmido pLacZMB75.6 descrito en el presente documento comprende un gen LacZ como marcador cribable. La secuencia de pLacZNM75.6 se proporciona en la SEQ ID NO: 268. En otros aspectos más, el plásmido contendrá un gen de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, pMB75.6 comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una resistencia al antibiótico kanamicina. La secuencia de pMB75.6 se proporciona en la SEQ ID NO: 266.

[0146] Se apreciará que la secuencia de nucleótidos del plásmido pMB75.6, pGCMB75.6 o pLacZMB75.6 puede variarse hasta cierto punto sin afectar significativamente a sus propiedades inmunoestimulantes. En algunos aspectos se describe un plásmido de ácido nucleico inmunogénico que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 89 % de identidad de secuencia con la secuencia de pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 265). En algunos aspectos, el plásmido inmunogénico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 265). En algunos aspectos, el plásmido de ácido nucleico inmunogénico comprende la secuencia de pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 265).

[0148] En algunos aspectos se describen plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 84 % de identidad de secuencia con la secuencia depLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 268). En algunos aspectos, el plásmido inmunogénico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 268). En algunos aspectos, el ácido nucleico inmunogénico comprende un plásmido que tiene la secuencia pLacZNM75.6 (SEQ ID NO: 268).

[0149] En algunos aspectos se describen plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 266. En algunos aspectos, el plásmido inmunogénico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 266. En algunos aspectos, el plásmido de ácido nucleico inmunogénico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 266.

[0150] En algunos aspectos se describe un plásmido de ácido nucleico inmunogénico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de pMB75.6_AscI (SEQ ID NO: 267). En algunos aspectos, el plásmido inmunogénico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 267. En algunos aspectos, el plásmido de ácido nucleico inmunogénico comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 267.

[0151] Tabla 1A: Secuencias del lásmido

[0153]

[0154] (continuación)

[0155]

[0156] (continuación)

[0157]

[0158] (continuación)

[0159]

[0160] (continuación)

[0161]

[0162] (continuación)

[0163]

[0164] (continuación)

[0165]

[0166] (continuación)

[0167]

[0168] (continuación)

[0170]

[0173] En el presente documento se describen además ácidos nucleicos inmunogénicos o plásmidos inmunogénicos capaces de estimular una respuesta inmunitaria que incluye secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones de alta rigurosidad con la SEQ ID NO: 265, la SEQ ID NO: 266, la SEQ ID NO: 267 o la SEQ ID NO: 268. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas incluyen aquellas que son homólogas, sustancialmente similares o idénticas a los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, las secuencias de ácido nucleico homólogas tendrán un porcentaje de identidad de al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 265 o la secuencia complementaria respectiva. En otros aspectos, las secuencias de ácido nucleico homólogas tendrán una similitud de secuencia de al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 268 o la secuencia complementaria respectiva. En otros aspectos, las secuencias de ácido nucleico homólogas tendrán una similitud de secuencia de al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 266 o la secuencia complementaria respectiva. En otros aspectos, las secuencias de ácido nucleico homólogas tendrán una similitud de secuencia de al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO: 267 o la secuencia complementaria respectiva. La similitud de secuencias puede calcularse usando una serie de algoritmos conocidos en la técnica, tales como BLAST, descrito en Altschul, S. F.,et al.,J. Mol. Biol.215: 403-10, 1990. Los ácidos nucleicos pueden diferir en secuencia de los ácidos nucleicos descritos anteriormente debido a la degeneración del código genético. En general, una secuencia de referencia será de 18 nucleótidos, más habitualmente 30 o más nucleótidos, y puede comprender toda la secuencia de ácido nucleico de la composición con fines de comparación.

[0175] En el presente documento se contemplan ácidos nucleicos que pueden hibridarse con la SEQ ID NO: 265, la SEQ ID NO: 266, la SEQ ID NO: 267 o la SEQ ID NO: 268. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen condiciones tales como hibridación a 50 °C o más y SSC 0,1X (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM). Otro ejemplo es la incubación durante la noche a 42 °C en una solución de formamida al 50 %, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10 % y ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado 20 µg/ml, seguido de un lavado en SSC 0,1X a aproximadamente 65 °C. Las condiciones de hibridación rigurosas de ejemplo son condiciones de hibridación que son al menos de aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % tan rigurosas como las condiciones específicas anteriores. En la técnica se conocen otras condiciones de hibridación rigurosas y también pueden emplearse para identificar homólogos de los ácidos nucleicos de la presente divulgación (Current Protocols in Molecular Biology, Unidad 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y.1989).

[0177] Se apreciará que las secuencias de nucleótidos de los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos pueden variarse hasta cierto punto sin afectar negativamente de forma significativa a sus propiedades inmunogénicas. La secuencia de ácido nucleico de una molécula de plásmido de ácido nucleico variante de este tipo diferirá normalmente en uno o más nucleótidos. Los cambios de la secuencia pueden ser sustituciones, inserciones, supresiones o una combinación de las mismas. En la técnica se conocen técnicas de mutagénesis de genes clonados. Pueden encontrarse métodos de mutagénesis específica de sitio en Gustinet al.,Biotechniques14: 22, 1993; Barany,Gene37: 111-23, 1985; Colicelliet al.,Mol. Gen. Genet.199: 537-9, 1985; y Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, págs. 15.3-15.108. En resumen, la invención se refiere a la materia objeto reivindicada, es decir, la composición inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación 1 y el método de preparación de dicha composición inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación 13 que contiene moléculas de plásmido de ácido nucleico, y variantes o mutantes de las mismas, capaces de estimular una respuesta inmunitaria innata en un sujeto. Además, en el presente documento se describen los ARN intermedios codificados por los ácidos nucleicos descritos, así como cualquier secuencia de aminoácidos resultante codificada por los plásmidos de ácido nucleico descritos en el presente documento.

[0179] En algunos aspectos, cuando la secuencia de nucleótidos del plásmido de ácido nucleico inmunogénico varía con respecto a la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 265, 266, 267 o 268, los dinucleótidos CpG en el plásmido de ácido nucleico inmunogénico se dejan preferentemente intactos. Como alternativa, si la secuencia de nucleótidos del plásmido inmunogénico se altera de manera que se elimina un dinucleótido CpG, la secuencia del plásmido de ácido nucleico inmunogénico puede alterarse en otra ubicación de manera que el número total de dinucleótidos CpG en el plásmido de ácido nucleico siga siendo el mismo. También pueden introducirse dinucleótidos CpG adicionales a los ya presentes en el plásmido de ácido nucleico inmunogénico. Por lo tanto, por ejemplo, los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos descritos en el presente documento comprenden al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 220, al menos aproximadamente 240, al menos aproximadamente 260, al menos aproximadamente 270, al menos aproximadamente 275, al menos aproximadamente 280, al menos aproximadamente 283, al menos aproximadamente 285 o al menos aproximadamente 288 dinucleótidos CpG. En algunas realizaciones, el plásmido de ácido nucleico inmunogénico puede comprender 283 dinucleótidos CpG. En algunas realizaciones, en el plásmido se introducen dinucleótidos CpG además de los ya presentes en las secuencias de nucleótidos de pGCMB75.6 o pLacZMB75.6.

[0181] En algunos aspectos, cuando la secuencia de nucleótidos del plásmido de ácido nucleico inmunogénico varía de las secuencias descritas en el presente documento, los tipos de motivos CpG en el ácido nucleico inmunogénico se varían para modular la activación resultante de una molécula citosólica de vigilancia de ácido nucleico, es decir, TLR21 y/o TLR9. Por ejemplo, el número de motivos CpG inmunoestimulantes puede aumentarse para potenciar la activación de al menos una molécula citosólica de vigilancia de ácido nucleico que responda a un plásmido de ácido nucleico inmunogénico. Como alternativa, el número de motivos CpG no inmunoestimulantes puede aumentarse para reducir la activación de al menos una molécula citosólica de vigilancia de ácido nucleico. En algunos aspectos, el número de motivos CpG estimulantes y no estimulantes puede modificarse para potenciar la activación de al menos una molécula citosólica de vigilancia de ácido nucleico y reducir la activación de al menos una molécula citosólica de vigilancia de ácido nucleico.

[0183] Una molécula de plásmido de ácido nucleico inmunogénico adecuada incluye cualquiera de los ácidos nucleicos inmunogénicos codificantes y no codificantes descritos en el presente documento. Las secuencias codificantes de ácido nucleico codifican al menos una porción de una proteína o péptido, mientras que la secuencia no codificante no codifica ninguna porción de una proteína o péptido. De acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos "no codificantes" pueden incluir regiones reguladoras de una unidad de transcripción, tales como una región promotora. La expresión "vector vacío" puede usarse indistintamente con la expresión "no codificante", y en particular se refiere a una secuencia de ácido nucleico en ausencia de una porción codificante de proteínas, tal como un vector plasmídico sin inserción génica. La expresión de una proteína codificada por los plásmidos de ácido nucleico descritos en el presente documento no es necesaria para inducir una respuesta inmunitaria; por lo tanto, no es necesario que los plásmidos contengan secuencias codificantes unidas operativamente a una secuencia de control de la transcripción. Sin embargo, pueden obtenerse ventajas adicionales (es decir, inmunidad específica de antígeno y potenciada) incluyendo en la composición inmunomoduladora al menos una secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) que codifique un inmunógeno y/o una citocina. Una secuencia de ácido nucleico de este tipo que codifica un inmunógeno y/o una citocina puede incluirse en los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos descritos en el presente documento, o puede incluirse en un ácido nucleico separado (por ejemplo, un plásmido separado) en la composición.

[0184] En algunas realizaciones de las composiciones inmunomoduladoras descritas en el presente documento, la composición inmunomoduladora comprende un vehículo de suministro liposomal y al menos uno de los plásmidos de ácido nucleico inmunogénicos descritos en el presente documento. Se describen composiciones inmunomoduladoras adecuadas en las Publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. N.º 2012/0064151 A1 y 2013/0295167 A1.

[0185] Un vehículo de suministro liposomal adecuado comprende una composición lipídica que es capaz de suministrar moléculas de ácido nucleico a los tejidos de un sujeto tratado. En algunas realizaciones, un vehículo de suministro liposomal puede ser capaz de permanecer estable en un sujeto durante una cantidad de tiempo suficiente para suministrar una molécula de ácido nucleico y/o un agente biológico. Por ejemplo, el vehículo de suministro liposomal es estable en el sujeto receptor durante al menos aproximadamente cinco minutos, durante al menos aproximadamente 1 hora, o durante al menos aproximadamente 24 horas.

[0187] Un vehículo de suministro liposomal, como se describe en el presente documento, comprende una composición lipídica capaz de fusionarse con la membrana plasmática de una célula para suministrar una molécula de ácido nucleico a una célula. Cuando la molécula de ácido nucleico codifica uno o más proteínas, el complejo ácido nucleico:liposoma tiene, en algunos aspectos, una eficiencia de transfección de al menos aproximadamente 1 picogramo (pg) de proteína expresada por miligramo (mg) de proteína tisular total por microgramo (µg) de ácido nucleico suministrado. Por ejemplo, la eficiencia de transfección de un complejo ácido nucleico: liposoma puede ser de al menos aproximadamente 10 pg de proteína expresada por mg de proteína tisular total por µg de ácido nucleico suministrado; o al menos aproximadamente 50 pg de proteína expresada por mg de proteína tisular total por µg de ácido nucleico administrado. La eficiencia de transfección del complejo puede ser tan baja como 1 femtogramo (fg) de proteína expresada por mg de proteína tisular total por µg de ácido nucleico suministrado, siendo más preferidas las cantidades anteriores.

[0189] En algunas realizaciones, el vehículo de suministro liposomal de la presente invención está entre aproximadamente 100 y 500 nanómetros (nm) de diámetro. Por ejemplo, el vehículo de suministro liposomal puede tener un diámetro de aproximadamente 150 a 450 nm o de aproximadamente 200 a 400 nm.

[0191] Los liposomas adecuados incluyen cualquier liposoma, tal como los que se usan habitualmente en, por ejemplo, métodos de suministro de genes conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, los vehículos de suministro liposomales comprenden lípidos de vesículas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés), lípidos extruidos o ambos. En algunos aspectos, el vehículo de suministro liposomal es catiónico. Se conocen bien en la técnica métodos para la preparación de MLV. En algunos aspectos, los vehículos de suministro liposomales comprenden liposomas que tienen una composición lipídica policatiónica (es decir, liposomas catiónicos) y/o liposomas que tienen una cadena principal de colesterol conjugada con polietilenglicol. Las composiciones liposomales catiónicas de ejemplo incluyen, pero sin limitación, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) y colesterol, cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio (DOTIM) y colesterol, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y colesterol, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el vehículo de suministro liposomal comprende pares de lípidos seleccionados del grupo que consiste en cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y colesterol; cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) y colesterol; cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio (DOTIM) y colesterol; y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y colesterol. En algunos aspectos, la composición liposomal para su uso como vehículo de suministro incluye DOTIM y colesterol.

[0193] La complejación de un liposoma con un plásmido de ácido nucleico inmunogénico descrito en el presente documento puede conseguirse usando métodos convencionales en la técnica o como se describe en la Patente de los EE. UU. N.º 6.693.086. Una concentración adecuada de plásmido de ácido nucleico para añadir a un liposoma incluye una concentración eficaz para suministrar una cantidad suficiente del plásmido de ácido nucleico inmunogénico a un sujeto de manera que se desencadene una respuesta inmunitaria sistémica. Por ejemplo, de aproximadamente 0,1 µg a aproximadamente 10 µg de plásmido de ácido nucleico inmunogénico pueden combinarse con aproximadamente 8 nmol de liposomas, de aproximadamente 0,5 µg a aproximadamente 5 µg de plásmido de ácido nucleico inmunogénico pueden combinarse con aproximadamente 8 nmol de liposomas, o aproximadamente 1,0 µg de plásmido de ácido nucleico inmunogénico puede combinarse con aproximadamente 8 nmol de liposomas. La relación entre el plásmido de ácido nucleico inmunogénico y el lípido (µg de plásmido de ácido nucleico inmunogénico:nmol de lípido) en una composición puede ser de al menos aproximadamente 1:1 de plásmido de ácido nucleico inmunogénico:lípido en peso (por ejemplo, 1 µg de plásmido de ácido nucleico inmunógeno: 1 nmol de lípido). Por ejemplo, la relación entre el plásmido de ácido nucleico inmunogénico y los lípidos puede ser de al menos aproximadamente 1:5, al menos aproximadamente 1:10 o al menos aproximadamente 1:20. Las relaciones expresadas en el presente documento se basan en la cantidad de lípido de la composición, y no en la cantidad total de lípido de la composición. La relación entre el plásmido de ácido nucleico inmunogénico y los lípidos en una composición de la invención es convenientemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:80 de plásmido de ácido nucleico inmunogénico: lípido en peso; de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:40 de plásmido de ácido nucleico inmunogénico:lípido en peso; de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:30 de ácido nucleico inmunogénico: lípido en peso; o de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 1:15 de plásmido de ácido nucleico inmunogénico:lípido en peso.

[0195] La concentración de la composición inmunomoduladora, si se eleva por encima de un umbral, puede ser citotóxica. Por este motivo, la concentración de la composición inmunomoduladora contemplada en la presente divulgación no es citotóxica, es decir, a un nivel inferior a este umbral. "Citotoxicidad", como se usa en el presente documento, se refiere a un estado celular anormal tal como el retraso del crecimiento, el crecimiento retardado, el aspecto microscópico irregular y/o la disminución de la inmunorreactividad. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 250 ng/ml. En algunos aspectos, la concentración está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 200 ng/ml. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 150 ng/ml. En otros aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 ng/ml. En otros aspectos más, la concentración del complejo inmunomodulador está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 ng/ml. En otros aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 250 ng/ml. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 10 y aproximadamente 250 ng/ml. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 250 ng/ml. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 250 ng/ml. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 150 y aproximadamente 250 ng/ml. En otros aspectos más, la concentración de la composición inmunomoduladora está entre aproximadamente 200 y aproximadamente 250 ng/ml. En algunas realizaciones, la concentración de la composición inmunomoduladora es de aproximadamente 120 ng/ml o menos. En algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora no es citotóxica.

[0197] En el presente documento se describen además composiciones farmacéuticas que comprenden una composición inmunoestimulante como se ha descrito anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición inmunomoduladora puede administrarse antes, simultáneamente o después del oligonucleótido inmunoestimulante. Los portadores farmacéuticos para la composición inmunomoduladora individual y el oligonucleótido inmunoestimulante pueden ser el mismo portador, pero no necesariamente. El portador farmacéuticamente aceptable adapta la composición para su administración por una vía seleccionada de intravenosa, intramuscular, intramamaria, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, por pulverización, por aerosol,in ovo, mucosa, transdérmica, por inmersión, oral, intraocular, intratraqueal, intranasal, pulmonar, rectal u otros medios conocidos por los expertos en la materia. El portador o portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la composición inmunoestimulante, o se administran la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante. Dichos vehículos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, puede usarse solución salina al 0,4 % y glicina al 0,3 %. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de materia particulada. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de las moléculas de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5 %, por lo general a al menos aproximadamente el 1 % a tanto como el 15 o 20 % en peso, y se seleccionará principalmente basándose en la dosis requerida, los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Se describen vehículos y formulaciones adecuados, incluyendo de otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, por ejemplo, en, por ejemplo,Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.ª Edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA 2006, Parte 5,Pharmaceutical Manufacturingpágs.691-1092, (véanse especialmente las págs.958-989).

[0199] En el presente documento también se proporcionan métodos de acuerdo con la invención para preparar la composición inmunoestimulante de acuerdo con la invención, como se ha descrito anteriormente, que comprende combinar la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante, para formar la composición inmunoestimulante; centrifugar la composición inmunoestimulante para generar un sobrenadante y un sedimento; y aislar el sedimento.

[0201] La centrifugación de la composición inmunoestimulante provocará la sedimentación de la composición inmunoestimulante. El aislamiento del sedimento puede lograrse retirando mediante vertido el sobrenadante, retirando por pipeteo el sobrenadante o retirando el sobrenadante por otros medios mientras quede una porción del sedimento. Ha de esperarse que se pierda algo de sedimento durante la retirada del sobrenadante. Además, parte de la composición inmunoestimulante puede permanecer en el sobrenadante incluso después de la centrifugación. En dicho escenario, el sobrenadante puede conservar propiedades inmunoestimulantes. Si la actividad inmunoestimulante debida a la presencia de la composición inmunoestimulante permanece en el sobrenadante pero se desea tener casi toda la composición inmunoestimulante en el sedimento, deben usarse velocidades de centrifugación más elevadas. Por ejemplo, si el sobrenadante contiene composición inmunoestimulante después de la centrifugación a 8.000 rpm, aumentar la centrifugación a 14.000 rpm puede precipitar la composición inmunoestimulante restante.

[0203] En el presente documento también se describen usos en métodos para estimular el receptor de tipo Toll 21 (TLR21) que comprenden administrar un oligonucleótido inmunoestimulante y una composición inmunomoduladora, en donde el oligonucleótido inmunoestimulante comprende al menos un motivo CpG, y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en, o cerca de, el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante, y en donde la composición inmunomoduladora comprende un plásmido de ácido nucleico no codificante y un vehículo de suministro de lípidos catiónicos. La invención reivindica la composición inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación, en donde el plásmido de ácido nucleico es no codificante, para su uso en un método para estimular el receptor de tipo Toll 21 (TLR21) o desencadenar una respuesta inmunitaria en un pollo, comprendiendo dicho método administrar dicha composición inmunoestimulante.

[0204] El oligonucleótido inmunoestimulante y la composición inmunomoduladora pueden administrarse por una vía seleccionada de intravenosa, intramuscular, intramamaria, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, por pulverización, por aerosol,in ovo, mucosa, transdérmica, por inmersión, oral, intraocular, intratraqueal, intranasal, pulmonar, rectal u otros medios conocidos por los expertos en la materia. En algunos aspectos, la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante están presentes en cantidades sinérgicamente eficaces. La administración de la composición inmunoestimulante y de la composición inmunomoduladora puede ser secuencial o simultánea.

[0205] La concentración de la composición inmunomoduladora puede ser citotóxica cuando es superior a 250 µg/ml, y esta citotoxicidad puede contrarrestar con creces cualquier efecto inmunoestimulante del inmunomodulador. En algunos aspectos de las presentes divulgaciones, la concentración del inmunomodulador es de aproximadamente 200 µg/ml. Con la administración del oligonucleótido inmunoestimulante, no se observan niveles citotóxicos en el intervalo de 10 µM o inferior. Incluso concentraciones más altas del oligonucleótido inmunoestimulante pueden ser toleradas por el receptor. En algunos aspectos de la presente divulgación, la concentración del oligonucleótido inmunoestimulante está entre aproximadamente 10 µM y 0,5 µM. En algunos aspectos, la concentración del oligonucleótido inmunoestimulante es de aproximadamente 2 µM y, en algunos aspectos, la concentración de la composición inmunomoduladora es superior a la concentración del oligonucleótido inmunoestimulante. Debido a que la citotoxicidad es un factor limitante con la administración de la composición inmunomoduladora, en algunos aspectos, la composición inmunomoduladora está presente en cantidades no citotóxicas.

[0206] En cada aspecto de los métodos/usos en métodos presentados en el presente documento, la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante pueden ser cualquier realización o aspecto como se ha descrito anteriormente, en donde el alcance de la protección de los métodos/usos en métodos está definido por el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

[0207] También se describen usos en métodos para desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar cualquier realización de la composición inmunoestimulante descrita en el presente documento. Otras realizaciones incluidas en la presente divulgación incluyen métodos para desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar el oligonucleótido inmunoestimulante y la composición inmunomoduladora descritos en el presente documento. La invención reivindica la composición inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación, en donde el plásmido de ácido nucleico es no codificante, para su uso en un método para estimular el receptor de tipo Toll 21 (TLR21) o desencadenar una respuesta inmunitaria en un pollo, comprendiendo dicho método administrar dicha composición inmunoestimulante.

[0208] Ejemplos

[0209] Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir adicionalmente algunas de las realizaciones divulgadas en el presente documento. Los ejemplos tienen por objeto ilustrar, no limitar, las realizaciones divulgadas.

[0210] La composición inmunomoduladora utilizada en los siguientes ejemplos fue una composición que comprendía un lípido catiónico (DOTIM y colesterol) y ADN no codificante (pMB75.6) (SEQ ID NO: 266). Los componentes lipídicos catiónicos fueron cloruro de [1-[2-[9-(Z)-octadeceno-iloxi]]-2-[8](Z)-heptadecenil]-3-[hidroxietil]imidazolinio (DOTIM) y un lípido neutro sintético colesterol, formulado para producir liposomas de aproximadamente 200 nm de diámetro (véase, la Pat. de los EE. UU. N.º 6.693.086). El componente de ADN no codificante fue un plásmido de ADN no codificante de 4292 pares de bases (pMB75.6) (SEQ ID NO: 266) producido enE. coli, que, estando cargado negativamente, se asocia a los liposomas cargados positivamente (catiónicos) (véase, la Pat. de los EE. UU. N.º 6.693.086). En los ejemplos, la expresión "plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante" se refiere a pMB75.6.

[0211] Ejemplo 1: Combinación de oligodesoxinucleótidos activos en TLR21 con una composición inmunomoduladora

[0212] Se exploró la actividad de la composición inmunomoduladora sobre TLR21. Específicamente, se sembraron células HEK293-NF•B-bsd-cTLR21 en placas de 384 pocillos a razón de 10.000 células/pocillo en 45 µl de medio de crecimiento. Estas células se expusieron al oligonucleótido disuelto en medio de crecimiento y se incubaron a 37° durante 3-4 días. Se transfirieron 10 µl de sobrenadante de cultivo por pocillo a una placa de 384 pocillos y se añadieron 90 µl de NaHCO<3>50 mM/Na<2>CO<3>, MgCl<2>2 mM,para-nitrofenilfosfato 5 mM (pNP) pH 9,6 y las velocidades de reacción se determinaron mediante la medición cinética de los cambios temporales de la densidad óptica a 405 nM (mDO405nm/min).

[0213] El plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante solo demostró ser inactivo en el intervalo de concentración considerado (2 µg/ml e inferior), mientras que el plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante formulado liposómicamente (ADNp-F) mostró una señal débil pero clara con una curva en forma de campana, indicando su interacción con TLR21 (FIG. 2A). La actividad estimulante de TLR21 fue, sin embargo, varios órdenes de magnitud inferior en comparación con 5-Col-GCGT3-TG4T (SEQ ID NO: 1) (FIG. 2A y 2B), un ligando oligonucleotídico optimizado para interactuar con este receptor.

[0214] Tabla 2:Secuencias de ODN

[0217]

[0219] La actividad de la composición inmunomoduladora ADNp-F sobre TLR21 sugiere que este receptor puede ser efectivamente un componente de la acciónin vivode la composición inmunomoduladora, pero debido a que la composición inmunomoduladora es un ligando bastante débil para TLR21, este receptor puede no ser el receptor afín único y dominante.

[0220] Ejemplo 2: Combinación de 5-Col-GCGT3-TG4T con el plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante y la composición inmunomoduladora

[0221] Se prepararon soluciones 200 µg/ml del plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante solo y de la composición inmunomoduladora y soluciones 2 µM de 5-Col-GCGT3-TG4T y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Posteriormente, a partir de esta solución, se prepararon diluciones en serie 1:2 y se administraron a células HEK293-bsd-cTLR21 empezando con una concentración de plásmido 20 nM (y una concentración de plásmido 2 µg/ml) de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1 y se compararon con una muestra que sólo contenía 5-Col-GCGT3-TG4T. Todas las muestras mostraron una fuerte actividad estimulante de TLR21, mostrando la única muestra valores máximos ligeramente superiores y una CE<50>de 2,44 pM (FIG.3A, Tabla 3). Excepto por mostrar una V<máx>ligeramente inferior, la combinación de 5-Col-GCGT3-TG4T con el plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante, que por sí sola era totalmente inactiva, condujo a pocos cambios en la CE<50>, en comparación con 5-Col-GCGT3-TG4T solo (2,11 pM) (FIG.3A, Tabla 3). En cambio, la muestra que contenía liposomas (oligonucleótido inmunoestimulante 5-Col-GCGT3-TG4T y la composición inmunomoduladora) mostró un máximo de actividad y una fuerte disminución de la señal a concentraciones más altas, (FIG. 3A). Sin embargo, una inspección más detallada de las concentraciones bajas (pM) reveló una meseta de actividad definida con una CE<50>calculada de 1,04 pM (FIG. 3B, Tabla 3). En este intervalo de concentración, la composición inmunomoduladora es también totalmente inactiva (FIG. 3B) y, por sí misma, no es responsable de la CE<50>inferior.

[0222] Tabla 3:Concentración eficaz semimáxima CE<50>velocidad máxima de la señal V<máx>

[0224]

[0226] Los resultados sugieren que la combinación del ODN 5-Col-GCGT3-TG4T estimulante de TLR21 y concentraciones no citotóxicas del plásmido de ácido nucleico inmunoestimulante o de la composición inmunomoduladora conduce a mezclas activas. Además, la combinación del ODN 5-Col-GCGT3-TG4T estimulante de TLR21 y la composición inmunomoduladora es sinérgica con respecto a la CE<50>de activación de TLR21.

[0227] Ejemplo 3: Centrifugación de la composición inmunomoduladora y de la actividad de TLR21

[0228] Una solución de composición inmunomoduladora de concentración de plásmido 200 µg/ml se centrifugó durante 2 horas a 4 °C en una centrifugadora de mesa Eppendorf a 14.000 rpm a 4 °C. Para la comparación, una alícuota no centrifugada se almacenó a 4 °C durante 2 horas. El sobrenadante se retiró y se almacenó, mientras que el sedimento se resuspendió en un volumen equivalente. Se prepararon titulaciones empezando con un contenido de plásmido de 2 mg/ml para su uso en el ensayo de TLR21 como se describe en el Ejemplo 1, ya que se había establecido anteriormente que la composición inmunomoduladora posee cierta actividad estimulante de TLR21 débil (véase el Ejemplo 1).

[0229] La centrifugación de la composición inmunomoduladora dio como resultado un sedimento que fue difícil de resuspender con una pipeta. Toda la actividad estimulante de TLR21 de la composición inmunomoduladora se encontró en el sedimento después de la centrifugación, y el sobrenadante estaba desprovisto de actividad TLR21 (FIG.4). Los liposomas resuspendidos presentaron una CE<50>superior para la estimulación de TLR21 en comparación con los liposomas almacenados a 4 °C. Este efecto puede deberse a cambios en los liposomas después de la centrifugación (por ejemplo, resuspensión/dispersión incompleta).

[0230] Ejemplo 4: Combinación de 5-Col-GCGT3-TG4T con composición inmunomoduladora

[0231] Se preparó una solución de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T que tenía una concentración de plásmido 200 µg/ml y 5-Col-GCGT3-TG4T 2 µM. También se preparó una solución 2 µM de 5-Col-GCGT3-TG4T. Ambas muestras se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Se centrifugaron alícuotas de 100 µl de estas soluciones en una centrifugadora de mesa Eppendorf a 14.000 rpm a 4 °C durante 2 horas para su uso en el Ejemplo 5, mientras que el resto de las incubaciones se almacenaron a 4 °C para su análisis de acuerdo con este Ejemplo 4. Ambas muestras mostraron una potente actividad estimulante de TLR21, pero la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T mostró señales fuertemente decrecientes a concentraciones superiores (FIG.

[0232] 5A), probablemente una consecuencia de la citotoxicidad de la composición inmunomoduladora. Los valores de V<máx>respectivos fueron similares cuando se consideró el componente de composición inmunomoduladora de la muestra a concentraciones de toxicidad baja (FIG. 5B, Tabla 4). Sin embargo, la CE<50>calculada de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T fue 4 veces menor que la de 5-Col-GCGT3-TG4T solo (FIG.5B, Tabla 4).

[0233] Tabla 4:Concentración eficaz semimáxima CE<50>velocidad máxima de la señal V<máx>

[0235]

[0237] Ejemplo 5: Centrifugación de la composición inmunomoduladora /5-Col-GCGT3-TG4T y 5-Col-GCGT3-TG4TSe preparó una solución de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T que tenía una concentración de plásmido 200 µg/ml y 5-Col-GCGT3-TG4T 2 µM. También se preparó una solución 2 µM de 5-Col-GCGT3-TG4T. Ambas muestras se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Se centrifugaron alícuotas de 100 µl de estas soluciones en una centrifugadora de mesa Eppendorf a 14.000 rpm a 4 °C durante 2 horas. Los sobrenadantes se retiraron y se almacenaron, mientras que los sedimentos se resuspendieron en 100 µl. Posteriormente, a partir de estas soluciones, se prepararon diluciones en serie 1:2 y se administraron a células HEK293-bsd-cTLR21 empezando con una concentración de plásmido 20 nM (y una concentración de plásmido 2 µg/ml) y se compararon con una muestra que sólo contenía 5-Col-GCGT3-TG4T.

[0238] La centrifugación de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T condujo a un sedimento claramente visible, mientras que en el caso de 5-Col-GCGT3-TG4T no se observó ningún sedimento visible. El sedimento de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T ("Sedimento de ADNp-F 5Col") fue difícil de resuspender, pero en el ensayo de TLR21 como se describe en el Ejemplo 1, contenía prácticamente toda la actividad estimulante (FIG.6A y 6B), detectándose sólo trazas en el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F 5Col") (FIG. 6B, Tabla 4), aunque con CE<50>superior a la de la muestra original ("ADNp-f F-Col-GCGT3-TG4T") (Tabla 4). Este resultado sugiere que después de la mezcla con la composición inmunomoduladora, 5-Col-GCGT3-TG4T está cuantitativamente asociado físicamente a la fracción liposomal.5-Col-GCGT3-TG4T solo, que, cuando se centrifuga, permanece casi exclusivamente (una estimación del 99 %, Tabla 4) en el sobrenadante, como se espera de un compuesto soluble (FIG.7A y 7B).

[0239] Ejemplo 6: Combinación de 5-Col-GCGT3-TG4T y composición inmunomoduladora

[0240] Se preparó una composición inmunoestimulante con una concentración de plásmido 200 µg/ml y 5-Col-GCGT3-TG4T 2 µM. También se preparó una solución 2 µM de 5-Col-GCGT3-TG4T. Ambas muestras se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Se centrifugaron alícuotas de 100 µl de estas soluciones en una centrifugadora de mesa Eppendorf a 14.000 rpm a 4 °C durante 2 horas para su uso en el Ejemplo 7, mientras que el resto de las incubaciones se almacenaron a 4 °C para su análisis de acuerdo con este Ejemplo 6. Los sobrenadantes se retiraron y se almacenaron, mientras que los sedimentos se resuspendieron en 200 µl. Posteriormente, a partir de estas soluciones, se realizaron diluciones 1:2 en serie y se administraron a células HEK293-bsd-cTLR21 para el análisis de TLR21 de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1. La concentración inicial de plásmido fue de 20 nM (y concentración de plásmido 2 µg/ml) y se comparó con una muestra que sólo contenía 5-Col-GCGT3-TG4T.

[0241] Ambas muestras ("5-Col-GCGT3-TG4T" y "ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") mostraron una actividad estimulante de TLR21 potente, pero la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") mostró señales fuertemente decrecientes a concentraciones superiores (FIG.8A), probablemente una consecuencia de la citotoxicidad de la composición inmunomoduladora. Los valores de V<máx>respectivos fueron muy similares cuando se consideró la actividad estimulante de la muestra que contenía composición inmunomoduladora a concentraciones de toxicidad baja (FIG. 8B, Tabla 5). Sin embargo, la CE<50>calculada de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T fue 2 veces menor que la de 5-Col-GCGT3-TG4T ("5-Col-GCGT3-TG4T") solo (FIG.8B, Tabla 5).

[0242] Tabla 5:Concentración eficaz semimáxima CE<50>velocidad máxima de la señal V<máx>

[0244]

[0246] Ejemplo 7: Centrifugación de la composición inmunomoduladora /5-Col-GCGT3-TG4T y 5-Col-GCGT3-TG4TLa centrifugación de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T condujo a un sedimento claramente visible, mientras que en el caso de 5-Col-GCGT3-TG4T no se observó ningún sedimento visible. El sedimento de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T fue difícil de resuspender, pero en un ensayo de TLR21 como se describe en el Ejemplo 1, éste ("Sedimento de ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") contenía prácticamente toda la actividad estimulante (FIG. 9B), aunque con una CE<50>superior a la de la muestra original (Tabla 5)), detectándose únicamente trazas en el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") (FIG.9B, Tabla 5). Este resultado sugiere que después de la mezcla con la composición inmunomoduladora, el 5-Col-GCGT3-TG4T está físicamente asociado a la fracción liposomal. Ambas fracciones se compararon con la composición inmunomoduladora no centrifugada/5-Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T")Ejemplo 8: Combinación de 5-Col-GCGT3-TG4T con composición inmunomoduladora

[0247] Se preparó una solución de composición inmunomoduladora de concentración de plásmido 200 µg/ml y 5-Col-GCGT3-TG4T 2 µM. También se preparó una muestra de 5-Col-GCGT3-TG4T 2 µM. Ambas muestras se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Se centrifugaron alícuotas de 100 µl de estas soluciones en una centrifugadora de mesa Eppendorf a 14.000 rpm a 4 °C durante 2 horas para su uso en el Ejemplo 9, mientras que el resto de las incubaciones se almacenaron a 4 °C para su análisis de acuerdo con este Ejemplo 8. Los sobrenadantes se retiraron y se almacenaron, mientras que los sedimentos se resuspendieron en 100 µl. Posteriormente, a partir de estas soluciones, se prepararon diluciones en serie 1:2 y se administraron a células HEK293-bsd-cTLR21 de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1, empezando con una concentración de plásmido de 20 nM (y una concentración de plásmido 2 µg/ml) y se compararon con una muestra que sólo contenía 5-Col-GCGT3-TG4T.

[0248] Ambas muestras mostraron una potente actividad estimulante de TLR21, pero la combinación de 5-Col-GCGT3-TG4T/composición inmunomoduladora ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") mostró señales fuertemente decrecientes a concentraciones superiores (FIG.10A), similares a las del inmunomodulador por sí solo ("ADNp-F") y probablemente consecuencia de la citotoxicidad de la composición inmunomoduladora. El oligonucleótido inmunoestimulante ("5-Col-GCGT3-TG4T") presentó una mayor actividad estimulante a concentraciones superiores a las de cualquiera de las muestras que contenían la composición inmunomoduladora. Los valores de V<máx>respectivos fueron muy similares cuando se consideró la actividad estimulante del componente de composición inmunomoduladora de la muestra a concentraciones de toxicidad baja (FIG. 10B, Tabla 6). Sin embargo, la CE<50>calculada de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") fue 4 veces menor que la de 5-Col-GCGT3-TG4T solo ("5-Col-GCGT3-TG4T") (FIG.10B, Tabla 6). La composición inmunomoduladora sola ("Bay 98-F") sólo mostró una actividad mínima cuyo efecto aditivo no pudo explicar la actividad aumentada de la composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T frente a 5-Col-GCGT3-TG4T solo.

[0249] Tabla 6:Concentración eficaz semimáxima CE<50>velocidad máxima de la señal V<máx>:

[0252]

[0254] Ejemplo 9: Centrifugación de la composición inmunomoduladora

[0255] La centrifugación de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T condujo a un sedimento claramente visible, mientras que para 5-Col-GCGT3-TG4T, no se observó ningún sedimento visible. El sedimento de la combinación de composición inmunomoduladora/5-Col-GCGT3-TG4T ("Sedimento de ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") fue difícil de resuspender, pero en un ensayo de TLR21 como se describe en el Ejemplo 1, contenía > 95 % de la actividad estimulante (FIG.11B), aunque con una CE<50>superior a la de la muestra original, detectándose sólo una pequeña fracción (< 5 %) en el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") (FIG.11B, Tabla 6) y sólo ligeramente inferior a la de la muestra no centrifugada a concentraciones bajas de composición inmunomoduladora ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T"). Este resultado sugiere que después de la mezcla con la composición inmunomoduladora, 5-Col-GCGT3-TG4T está cuantitativamente asociado físicamente a la fracción liposomal.

[0256] Ejemplo 10: Combinación de GCGT3-TG4T con composición inmunomoduladora

[0257] Se preparó una solución de composición inmunomoduladora de concentración de plásmido 200 µg/ml y GCGT3-TG4T 2 µM (SEQ ID NO: 252; la misma secuencia oligonucleotídica que 5-Col-GCGT3-TG4T (SEQ ID NO: 1) pero sin la modificación con colesterilo). Además, se preparó una muestra de GCGT3-TG4T 2 µM, y ambas muestras se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Se centrifugaron alícuotas de 100 µl de estas soluciones en una centrifugadora de mesa Eppendorf a 14.000 rpm a 4 °C durante 2 horas para su uso en el Ejemplo 11, mientras que el resto de las incubaciones se almacenaron a 4 °C para su análisis de acuerdo con este Ejemplo 10. Los sobrenadantes se retiraron y se almacenaron, mientras que los sedimentos se resuspendieron en 100 µl. Posteriormente, a partir de estas soluciones, se prepararon diluciones en serie 1:2 y se administraron a células HEK293-bsd-cTLR21 de acuerdo con el protocolo en el Ejemplo 1, empezando con una concentración de plásmido de 20 nM (y una concentración de plásmido 2 µg/ml) y se compararon con una muestra que sólo contenía GCGT3-TG4T.

[0258] Ambas muestras mostraron una potente actividad estimulante de TLR21, pero la combinación de GCGT3-TG4T/composición inmunomoduladora ("ADNp-F/5-Col-GCGT3-TG4T") mostró señales fuertemente decrecientes a concentraciones superiores (FIG. 12A), probablemente una consecuencia de la citotoxicidad de la composición inmunomoduladora. Los valores de V<máx>respectivos fueron muy similares, cuando se consideró la actividad estimulante del componente de composición inmunomoduladora de la muestra a concentraciones de toxicidad baja (FIG. 12B, Tabla 7). Sin embargo, la CE<50>calculada de la combinación de composición inmunomoduladora/GCGT3-TG4T fue más de 4 veces inferior a la de GCGT3-TG4T solo (Tabla 7). La composición inmunomoduladora sola ("ADNp-F") sólo mostró una actividad mínima cuyo efecto aditivo no pudo explicar la actividad aumentada de la composición inmunomoduladora/GCGT3-TG4T frente a GCGT3-TG4T solo.

[0259] Tabla 7:Concentración eficaz semimáxima CE<50>velocidad máxima de la señal V<máx>

[0260]

[0261] continuación

[0263]

[0265] Ejemplo 11: Centrifugación de la composición inmunomoduladora/GCGT3-TG4T

[0266] La centrifugación de la combinación de composición inmunomoduladora/GCGT3-TG4T condujo a un sedimento claramente visible. El sedimento de la combinación de composición inmunomoduladora/GCGT3-TG4T fue difícil de resuspender, pero en un ensayo de TLR21 como se describió en el Ejemplo 1 contenía ("Sedimento de ADNp-F/GCGT3-TG4T") > 3 x más actividad estimulante (FIG.13B), aunque con una CE<50>superior a la de la muestra original ("ADNp-F/GCGT3-TG4T") que el sobrenadante ("Sobrenadante de ADNp-F/GCGT3-TG4T") (FIG.13B, Tabla 7). Este resultado sugiere que después de la mezcla con la composición inmunomoduladora, el GCGT3-TG4T está cuantitativamente asociado físicamente a la fracción liposomal, aunque quizás no tan eficientemente como el 5-Col-GCGT3-TG4T derivatizado con colesterilo.

[0267] Ejemplo 12: Estudio in vivo de la eficacia de inmunoestimulantes en un modelo de vacunación contra la enfermedad de Newcastle en pollos

[0268] Para determinar la idoneidad y eficacia de ODN1, ODN2 y ODN3 como inmunoestimulantes, cada uno se sometió a ensayo en tres concentraciones diferentes.

[0269] Se investigaron los siguientes inmunoestimulantes:

[0270] ODN1: [ColTEG]- TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT ("5Col-GCGT3-TG4T") (SEQ ID NO: 1) ([ColTEG] = modificación con colesterilo ligada a 5'-trietilenglicol),

[0271] ODN2: TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT ("GCGT3-TG4T") (SEQ ID NO: 252), ODN3: tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt ("2006-PTO") (SEQ ID NO: 3).

[0272] Cada inmunoestimulante se añadió a una emulsión de aceite que contenía una concentración subóptima de un virus inactivado de la enfermedad de Newcastle (NDV) de acuerdo con laTabla9. Para la preparación de la vacuna contra NDV subóptima, el lote de antígeno de NDV se diluyó 50 veces en líquido alantoico (FA) negativo para el NDV. La eficacia de ODN1, ODN2 y ODN3 en combinación con una dosis subóptima de una vacuna contra la enfermedad de Newcastle se sometieron a ensayo en gallinas ponedoras SPF (Leghorn). Se midió la respuesta serológica y se comparó con la vacuna contra el NDV subóptima similar sin el inmunoestimulante. El título de anticuerpos se determinó en diferentes puntos temporales después de la vacunación para investigar si la adición de los inmunoestimulantes conduce a una respuesta inmunitaria más temprana. Para determinar la dosis más óptima de los tres ODN, cada uno se suplementó en tres dosis diferentes de 100 ng, 1000 ng y 5000 ng a la vacuna contra NDV subóptima, dando como resultado nueve grupos de inmunoestimulantes. Además de estos nueve grupos de inmunoestimulantes, en este estudio se incorporaron cinco grupos de control, que consistían en una vacuna contra NDV subóptima sin grupo inmunoestimulante, el grupo de la vacuna contra NDV no diluida, un grupo de control negativo (inmunoestimulantes en combinación con adyuvante) y dos grupos de control positivo con ácido polinosínico:policidílico (poli I:C) a dos concentraciones diferentes(Tabla 8).

[0273] Se sometieron a ensayo los siguientes parámetros: salud de los pollos (datos no mostrados) y serología mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI).

[0274] Tabla 8:Diseño del estudio

[0276]

[0277] continuación

[0279]

[0282] Los pollos inscritos en los grupos de tratamiento T01-T14 recibieron el artículo de ensayo o el artículo de control de acuerdo con el diseño del estudio. En los grupos T13 y T14, se vacunaron nueve en lugar de diez pollos por grupo debido a la pérdida de dos animales antes del inicio del estudio.

[0284] Los pollos asignados a los grupos de tratamiento T01, T02, T03, T04, T05, T06, T07, T08 y T09 fueron vacunados con una suspensión de NDV subóptima que contenía 1 de 3 inmunoestimulantes diferentes (ODN), cada una en 3 concentraciones diferentes (100, 1000, 5000 ng/dosis). Para la preparación de emulsiones de agua en aceite, la suspensión de antígeno de NDV y el inmunoestimulante (fase acuosa) se formularon junto con el adyuvante Stimune (fase oleosa) en una relación 4:5(Tabla9).

[0286] Tabla 9:Pre aración de artículos de ensa o artículos de control

[0288]

[0289] continuación

[0291]

[0293] Los pollos asignados al grupo de control de T10 fueron vacunados con una suspensión subóptima de virus de la enfermedad de Newcastle sin inmunoestimulante en adyuvante (Stimune) en una relación de 4:5.

[0294] Los pollos asignados al grupo de control de T11 fueron vacunados con una suspensión no diluida de virus de la enfermedad de Newcastle sin inmunoestimulante en adyuvante (Stimune) en una relación de 4:5.

[0295] Los pollos asignados al grupo T12 fueron vacunados con el inmunoestimulante 1 (3 pollos), el inmunoestimulante 2 (3 pollos) y el inmunoestimulante 3 (3 pollos) en adyuvante (Stimune) en una relación de 4:5. Un pollo fue vacunado con tampón de dilución (patentado) en adyuvante (Stimune).

[0296] Los pollos asignados a los grupos de control de T13 (n=9) y T14 (n=9) fueron vacunados con una suspensión de NDV subóptima de NDV en combinación con Poli I:C en dos concentraciones (10.000 ng y 100 µg) en adyuvante (Stimune) en una relación de 4:5.

[0297] Administración del artículo de ensayo o el artículo de control

[0298] La suspensión de la cepa Ulster de NDV inactivada almacenada a -70 °C se descongeló y diluyó 50 veces en líquido alantoico negativo para crear la dosis de vacuna subóptima. Se añadieron inmunoestimulantes de acuerdo con el diseño del estudio. Las fases acuosas resultantes se mezclaron con Stimune en una relación de 4:5 de acuerdo con el esquema de preparación de la vacunación que se muestra en laTabla 9.Durante la preparación, todos los ingredientes de vacuna, a excepción del adyuvante Stimune, se colocaron en hielo fundido. Las vacunas formuladas se inyectaron (0,5 ml, intramuscular) directamente después de la preparación.

[0299] La salud general se controló diariamente por un biotécnico experimentado desde el día de llegada hasta el final del estudio.

[0300] Muestreo de suero sanguíneo

[0301] Se recogieron muestras de sangre para serología de todos los pollos en los días 0 del estudio (antes de la vacunación), 7, 14 y 21. Las muestras de sangre se etiquetaron con el número del estudio, una identificación única de la muestra y la fecha de recogida. Dependiendo del volumen de sangre extraída, los sueros se dividieron en dos alícuotas de aproximadamente 0,5 ml y se almacenaron a -20 ±5 °C.

[0302] Ensayo de inhibición de la hemoaglutinación (HI)

[0303] En resumen, se incubaron series de diluciones de sueros con 8 HAU (unidades hemoaglutinantes) de la cepa Ulster del NDV a temperatura ambiente durante 60 minutos. Las HAU se titularon antes de cada ensayo. Posteriormente, se añadieron eritrocitos de pollo y se puntuó la aglutinación después de incubar a 4 °C durante 45 minutos. Un suero de control negativo y tres sueros de control positivo, con títulos de anticuerpos bajos, intermedios y altos, se incluyeron en cada ensayo.

[0304] Los resultados del título de HI se expresaron como la recíproca de la dilución de suero más alta que inhibe totalmente la aglutinación, que se transformaron logarítmicamente en los títulos Log2 finales.

[0305] Estadísticas

[0306] Los resultados de HI transformados logarítmicamente se resumieron por animal (véanse lasTablas 62-65). Por grupo de tratamiento, se calcularon la media y la desviación típica de los títulos de anticuerpos. El análisis estadístico se realizó con la prueba t no paramétrica de Mann-Whitney.

[0307] Resultados

[0308] No se observaron síntomas clínicos ni acontecimientos adversos relacionados con la vacunación en todos los grupos, todos los pollos parecían sanos durante todo el período de estudio.

[0309] Dos pollos, sin embargo, se calificaron con heridas leves debido al comportamiento de picoteo, que comenzó 6 días antes del inicio del estudio. El día de la vacunación, estos pollos fueron asignados a los grupos Poli I:C T13 (N.º 11658) y T14 (N.º 11676). La recuperación se produjo en la semana siguiente a la vacunación.

[0310] ODN1, GCGT3-TG4T-5Col

[0311] Los resultados de HI individuales expresados como títulos Log2 de los grupos de dosis deODN1de 100 ng, 1000 ng y 5000 ng se indican en laTabla 10.Los títulos medios de HI y la desviación estándar de estos grupos se indican en laFIG. 14(días 14 y 21 después de la vacunación (pv)) y laFIG. 15(todos los datos) comparados con los títulos medios del grupo de vacuna contra NDV diluida.

[0312] Los grupos GCGT3-TG4T-5Col mostraron títulos de HI significativamente superiores en comparación con la vacuna contra NDV diluida (título medio de HI: 4,8 Log2/DE 1,0). El día 14 pv este fue el caso para las tres dosis; 100 ng: título medio de HI 6,2 Log2/DE 1,4 (p=0,0214), 1000 ng: título medio de HI 6,9 Log2/DE 1,1 (p=0,0003) y 5000 ng: HI media 5,9 Log2/DE 0,7 (p=0,0243).

[0313] El día 21 pv, sin embargo, no se observaron diferencias significativas para todas las concentraciones; 100 ng: título medio de HI 6,9 Log2 /DE 0,8 (p=0,1995); 1000 ng: título medio de HI 7,3 Log2/DE 0,9 (p=0,0527); y 5000 ng: HI media 6,7 Log2/DE 0,9 (p=0,4523) en comparación con la vacuna contra NDV; título de HI 6,2 Log2/ DE1,0.(FIG.14),aunque la concentración de 1000 ng está muy cerca de la significación.

[0314]

[0315] ODN2, GCGT3-TG4T

[0316] Los resultados de HI individuales expresados como títulos Log2 de los grupos de dosis deODN1de 100 ng, 1000 ng y 5000 ng se indican en laTabla 11.Los títulos medios de HI y la desviación estándar de estos grupos se indican en laFIG. 16(días 14 y 21 pv) y laFIG. 17(todos los datos) comparados con los títulos medios del grupo de vacuna contra NDV diluida.

[0317] Los grupos ODN2, GCGT3-TG4T mostraron títulos de HI significativamente superiores en comparación con la vacuna contra NDV diluida (título medio de HI: 4,8 Log<2>/DE 1,0). Este fue el caso el día 14 después de la vacunación para las tres dosis; 100 ng: título medio de HI 7,1 Log<2>/DE 1,2 (p=0,0003), 1000 ng: título medio de HI 6,4 Log<2>/DE 0,7 (p=0,0027) y 5000 ng: título medio de HI 6,1 Log<2>/DE 1,1 (p=0,0236). El día 21 sólo se observaron diferencias significativas a la dosis de 100 ng con un título medio de HI de 7,6 Log<2>/DE 0,8 (p=0,0083) en comparación con la vacuna contra NDV (título HI 6,2 Log<2>/DE 1,0). Los títulos medios de HI para 1000 ng y 5000 ng fueron 7,1 Log<2>/0,6 (p=0,0696) y 7,2 Log<2>/DE 1,0 (p=0,0956) respectivamente(FIG.16).

[0318] Tabla 11:

[0320]

[0321] ODN3, 2006-PTO

[0322] Los resultados de HI individuales expresados como títulos Log2 de los grupos de dosis de ODN1 de 100 ng, 1000 ng y 5000 ng medidos se indican en laTabla 12.Durante la realización del ensayo de HI por triplicado se observó un resultado atípico en el animal 11570 el día 21, lo más probable es que se debiera a un error de pipeteo (no se añadió suficiente AF) y, por lo tanto, este resultado se omitió del análisis final (resaltado en laTabla 12).Por lo tanto, para este animal y esta fecha, el título medio de HI se basó en la medición por duplicado.

[0323] Los títulos medios de HI y la desviación estándar de estos grupos se indican en laFIG.18(días 14 y 21 pv) y laFIG.

[0324] 19(todos los datos) comparados con los títulos medios del grupo de vacuna contra NDV diluida.

[0325] Los grupos ODN3, 2006-PTO mostraron títulos de HI significativamente superiores en comparación con la vacuna contra NDV diluida (título medio de HI: 4,8 Log2/DE 1,0). Este fue el caso el día 14 después de la vacunación para dos dosis; 1000 ng: título medio de HI: 6,3 Log2/DE 1,2 (p=0,0081) y 5000 ng: título medio de HI: 6,2 Log2/DE 0.8 (p=0,0059). El título medio de HI de la dosis de 100 ng fue de 5,3 Log2/DE 0,5 (p=0,2090). El día 21 pv sólo se midieron diferencias significativas en 5000 ng: título medio de HI 7,3 Log2/DE 0,6 (p=0,0296). No se observaron diferencias significativas en las dosis de 100 ng y 1000 ng, con unos títulos medios de HI de 6,6 Log2/DE 0,5 (p=0,7183) y 6,8 Log2/DE 1,1 (p=0,1685) respectivamente, en comparación con la vacuna contra NDV; título de HI 6,2 Log2/DE 1,0(FIG.18).

[0326] Tabla 12:

[0329]

[0331] Grupos de control

[0332] Los resultados de HI individuales expresados como títulos Log2 de los grupos de dosis de 10 µg y 100 µg de Poli I:C, las vacunas contra NDV diluidas y no diluidas y los grupos de control negativo se indican en laTabla 13.Los títulos medios de HI y la desviación estándar de estos grupos se indican en laFIG.20(días 14 y 21 pv) y laFIG.21(todos los datos) comparados con los títulos medios del grupo de vacuna contra NDV diluida.

[0333] Para Poli I:C, los grupos de control positivos, sólo se observaron títulos de HI significativamente más altos con la dosis de 100 µg: Título de HI 7,5 Log2/DE 0,4 el día 21 (p=0,0053) en comparación con la vacuna contra NDV (6,2 Log2/DE 1,0). Los títulos medios de HI el día 14 pv de los grupos de dosis de 10 µg y 100 µg fueron de 5,8 Log2/DE 1,3 (p=0,1859) y 5,5 Log2/DE 0,8 (p=0,1609) respectivamente. El título medio de HI del grupo de dosis de 10 µg en el día 21 pv fue de 6,4 Log2/DE 1,3 (p=0,7273). Se observaron diferencias significativas (p< 0,0001) entre la vacuna contra NDV no diluida (8,3/DE 0,5 y 8,5 Log2/DE 0,7) y el grupo de control negativo en comparación con el grupo de NDV diluida los días 14 y 21 después de la vacunación (4,8/DE 1,0 y 6,2 Log2/ DE 1,0, respectivamente)(FIG.20).

[0335] Tabla 13:

[0337]

[0338] continuación

[0340]

[0342] Conclusiones

[0343] El objetivo era estudiar la actividad adyuvante de tres inmunoestimulantes diferentes. Esto se sometió a ensayo midiendo la respuesta serológica después de la vacunación con vacunas en emulsión oleosa que contenían una concentración subóptima de virus de NDV inactivado y distintas concentraciones de uno de tres inmunoestimulantes diferentes.

[0344] Se investigaron los siguientes inmunoestimulantes:

[0345] ODN1: [ChoITEG]-TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT ("GCGT3-TG4T-5Col") (SEQIDNO: 1) ([ColTEG] = modificación con colesterilo ligada a 5'-trietilenglicol),

[0346] ODN2: TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT ("GCGT3-TG4T") (SEQIDNO: 252), ODN3: tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt ("2006-PTO") (SEQ ID NO: 3).

[0347] Las cadenas principales de ODN1 y ODN2 inmunitarios estaban unidas a fosfodiésteres, mientras que la cadena principal del ODN3 estaba unida a fosforotioato. La eficacia de cada ODN se determinó a tres dosis diferentes; 100 ng, 1000 ng y 5000 ng, suplementada con la vacuna contra NDV subóptima.

[0348] La respuesta serológica se determinó 0 (antes de la vacunación), 7, 14 y 21 días después de la vacunación para investigar si la adición de estos inmunoestimulantes puede conducir también a una respuesta inmunitaria más temprana. Los días 0 y 7 después de la vacunación (pv) no se detectaron niveles de anticuerpos contra el NDV, con excepción de un animal (N.º 11618) en el grupo de vacuna contra NDV no diluida el día 7.

[0349] La respuesta serológica expresada como títulos de Log2 HI mostró diferencias significativas (p<0,0001) entre las vacunas contra el NDV no diluidas y las subóptimas los días 14 y 21 pv, lo que indica que el factor de dilución de 50 veces fue suficiente para crear la dosis de vacuna subóptima.

[0350] El grupo de control negativo permaneció negativo durante todo el estudio, lo que indica que los inmunoestimulantes sin vacuna contra NDV no dieron como resultado una respuesta inmunitaria inespecífica.

[0351] El grupo de dosis de Poli I:C 100 µg de control positivo mostró títulos de HI significativamente superiores en comparación con la vacuna contra NDV sin exposición previa el día 21 (p=0,0053), lo que indica que este grupo de dosis sirvió como grupo de control positivo válido.

[0352] El grupo GCGT3-TG4T-5Col (ODN1) mostró títulos de HI significativamente superiores en comparación con la vacuna diluida contra NDV el día 14 pv para las tres dosis; 100 ng (p=0,0214), 1000 ng (p=0,0003) y 5000 ng (p=0,0243). El día 21 pv, sin embargo, no se observaron diferencias significativas.

[0353] El grupo GCGT3-TG4T (ODN2) mostró títulos de HI significativamente superiores en comparación con la vacuna diluida contra NDV el día 14 pv para las tres dosis; 100 ng (p=0,0003), 1000 ng (p=0,0027) y 5000 ng (p=0,0236). El día 21 sólo se midieron diferencias significativas (p=0,0083) en el grupo de dosis de 100 ng.

[0354] El grupo 2006-PTO (ODN3) mostró títulos de HI significativamente más altos en comparación con la vacuna contra NDV diluida el día 14 pv para dos dosis; 1000 ng (p=0,0081) y 5000 ng (p=0,0059). El día 21 pv sólo se midieron diferencias significativas (p=0,0296) en el grupo de dosis de 5000 ng.

[0355] En conclusión, los títulos medios de HI más elevados se observaron con el grupo de dosis de 100 ng de GCGT3-TG4T (ODN2), 7,1 Log2 (14 días pv) y 7,6 Log2 (21 días pv), lo que indica un aumento de los títulos en comparación con la vacuna contra NDV sin exposición previa de 2,3 Log2 y 1,4 Log2 los días 14 y 21 pv, respectivamente.

[0356] Los títulos del grupo de dosis de 1000 ng de GCGT3-TG4T-5Col (ODN1), 6,9 Log2 y 7,3 Log2, el día 14 y 21 pv respectivamente fueron casi similares a los del grupo ODN2. El día 14 pv no se observaron diferencias significativas (p=0,7513) entre los grupos ODN1 y ODN2.

[0357] Los títulos del grupo de dosis de 5000 ng de 2006-PTO (ODN3) fueron de 6,2 Log2 y 7,3 Log2 los días 14 y 21 pv, respectivamente. El día 14 pv, el grupo ODN3 difería significativamente (p=0,0300) de los grupos ODN1 y ODN2 (FIG.

[0358] 22 y FIG.23).

[0359] El día 21 pv no se mostraron diferencias significativas entre todos los grupos ODN.

[0360] Estos resultados indican, por lo tanto, que todos los ODN fueron capaces de aumentar significativamente la respuesta serológica, especialmente el día 14 después de la vacunación, indicando también un inicio más temprano de la inmunidad.

[0361] Al introducir elementos de la presente divulgación, los artículos "un", "una", "el/la" y "dicho/a" pretenden significar que hay uno o más de los elementos. Las expresiones "que comprende/n", "que incluye/n" y "que tiene/n" pretenden ser incluyentes y hacen referencia a que puede haber elementos adicionales además de los elementos enumerados.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunoestimulante que comprende:

a) una composición inmunomoduladora que comprende un plásmido de ácido nucleico inmunogénico y un vehículo de suministro liposomal; y

b) un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un motivo CpG y una secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina en el extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante, en donde la secuencia enriquecida en nucleótidos de guanina comprende una primera pluralidad de nucleótidos de guanina y, opcionalmente, una segunda pluralidad de nucleótidos de guanina en dirección 3' de la primera pluralidad de nucleótidos de guanina.

2. La composición inmunoestimulante de la reivindicación 1, en donde

(1) la concentración del plásmido de ácido nucleico de la composición inmunomoduladora es superior a la concentración del oligonucleótido inmunoestimulante; y/o

(2) la composición inmunoestimulante comprende además un portador farmacéutico; y/o

(3) el vehículo de suministro liposomal comprende lípidos de vesículas multilamelares, lípidos extruidos o ambos.

3. La composición inmunoestimulante de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el vehículo de suministro liposomal es catiónico, en donde el vehículo de suministro liposomal catiónico comprende preferentemente pares de lípidos seleccionados del grupo que consiste en cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y colesterol; cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) y colesterol; cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM) y colesterol; y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y colesterol.

4. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde

(1) el plásmido de ácido nucleico es no codificante; y/o

(2) tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 265 o la SEQ ID NO: 266 o la SEQ ID NO: 268.

5. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde

(1) la primera pluralidad de nucleótidos de guanina comprende de tres a ocho nucleótidos de guanina; y/o (2) la primera pluralidad de nucleótidos de guanina y la segunda pluralidad de nucleótidos de guanina están separadas por al menos dos nucleótidos; y/o

(3) la primera pluralidad de nucleótidos de guanina y el al menos un motivo CpG están separados por al menos 3 nucleótidos; y/o

(4) la primera pluralidad de nucleótidos de guanina y el al menos un motivo CpG están separados por un hexaetilenglicol, tetraetilenglicol, propanodiol o derivados de los mismos, en donde la estructura del hexaetilenglicol es opcionalmente:

.

6. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el oligonucleótido inmunoestimulante comprende además una pluralidad de motivos CpG, estando cada motivo CpG de la pluralidad de motivos CpG separado de los otros de la pluralidad de motivos CpG por un espaciador.

7. La composición inmunoestimulante de la reivindicación 6, en donde

(1) el espaciador comprende al menos un nucleótido o análogo de nucleótido, en donde el espaciador comprende opcionalmente un puente de desoxirribosafosfato, siendo el puente de desoxirribosafosfato opcionalmente abásico; y/o

(2) el espaciador comprende una cadena de carbono, en donde la cadena de carbono deriva opcionalmente de 1,3-propanodiol; y/o

(3) el espaciador comprende una unidad química repetida, en donde la unidad química repetida es opcionalmente un etilenglicol.

8. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde

(1) el oligonucleótido inmunoestimulante comprende además una cadena principal de fosforotioato; y/o

(2) el oligonucleótido inmunoestimulante comprende un resto lipídico, en donde el resto lipídico es preferentemente colesterilo y/o el resto lipídico está preferentemente en o cerca del extremo 5' del oligonucleótido inmunoestimulante.

9. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende un elemento de secuencia de CpG en un extremo 5', un extremo 3', o ambos, en donde el elemento de secuencia de CpG comprende preferentemente al menos dos elementos de secuencia de CpG y/o los elementos de secuencia de CpG son GCGA, GCGG, ACGC, CCGC, GCGT o TCGC.

10. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulante comprende la SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 92, 93, 96, 97, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 143, 1, 141, 142, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204-215, 217-221, 223, 225-235, 239, 242-250, 251-253, 255 o GCGT-Gwire3 (SEQ ID NO: 224).

11. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:

a. un plásmido de ácido nucleico y un vehículo de suministro liposomal; y

b. un oligonucleótido inmunoestimulante que comprende la SEQ ID NO: 1.

12. La composición inmunoestimulante de la reivindicación 11, en donde

(1) el plásmido de ácido nucleico tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 265, la SEQ ID NO: 266, la SEQ ID NO: 268; y/o (2) el oligonucleótido inmunoestimulante comprende además una modificación con 5' colesterilo, la modificación con 5' colesterilo comprende opcionalmente un enlazador de trietilenglicol.

13. Un método de preparación de la composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende: combinar la composición inmunomoduladora y el oligonucleótido inmunoestimulante para formar una composición inmunoestimulante; centrifugar la composición inmunoestimulante para generar un sobrenadante y un sedimento; y aislar el sedimento.

14. La composición inmunoestimulante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el plásmido de ácido nucleico es no codificante, para su uso en un método para estimular el receptor de tipo Toll 21 (TLR21) o desencadenar una respuesta inmunitaria en un pollo, comprendiendo dicho método administrar dicha composición inmunoestimulante.