ES3052985T3 - Use of bacillus methylotrophicus strain xt1 as a stimulant of plant growth and biological control means, and isolates of said species - Google Patents

Use of bacillus methylotrophicus strain xt1 as a stimulant of plant growth and biological control means, and isolates of said species

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ES3052985T3 ES15826994T ES15826994T ES3052985T3 ES 3052985 T3 ES3052985 T3 ES 3052985T3 ES 15826994 T ES15826994 T ES 15826994T ES 15826994 T ES15826994 T ES 15826994T ES 3052985 T3 ES3052985 T3 ES 3052985T3
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Garcia Cristina Ruiz
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Abstract

Uso de la cepa CECT8662 de Bacillus methylotrophicus como estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico. La presente invención se refiere al uso de microorganismos como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos. Más concretamente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos del género Bacillus, concretamente de la cepa CECT8662 de Bacillus methylotrophicus, a sus cultivos, a composiciones que comprenden estas bacterias, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden, como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos.

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Uso de la cepa XT1 deBacillus methylotrophicuscomo estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico, y aislados de dicha especie
[0003] Campo técnico de la presente invención
[0004] La presente invención tiene como principal aplicación la agricultura. Las bacterias de la presente invención tienen utilidad como estimulantes del crecimiento vegetal.
[0005] Técnica anterior
[0006] 1. Organismos fitopatógenos
[0007] Los organismos fitopatógenos son una causa importante de las enfermedades de las plantas; determinan cambios en su forma, función o integridad y pueden conducir a la muerte de la planta. Entre tales organismos fitopatógenos se incluyen los nematodos, las bacterias, los insectos, los hongos y los virus.
[0008] Uno de los grupos más importantes son los hongos fitopatógenos que incluyen, entre otros, especies de los génerosBotrytis,Pythium,Alternaria,Fusarium,Phytophthora,Rhizoctonia,Colleotrichium,Eutypa,Rhizopus,Penicillium,SclerotiniayVerticillium.Provocan daños locales, tales como machas foliares, hipertrofia de tejidos o tizón, o daños generalizados cuando afectan a la raíz o al sistema vascular, provocando el marchitamiento y la muerte de la planta. Hay más de 8000 especies que atacan a las plantas, siendo algunas muy específicas, y otras tienen una amplia gama de huéspedes. El impacto económico que tienen estos organismos es muy importante. A modo de ejemplo, cuandoBotrytis cinnereaafecta a las viñas, se producen miles de toneladas de pérdidas en la industria vinícola. Las enfermedades de las plantas producidas por bacterias tienen una incidencia menor que las enfermedades de las plantas producidas por hongos o virus (Vidhyasekaran 2002). Las bacterias fitopatógenas incluyen:Erwinia amylovora, responsable de la enfermedad denominada fuego bacteriano, que afecta particularmente a peral, manzano, níspero, membrillero y rosáceas ornamentales;Erwinia carotovora(Pectobacterium carotovorum), productora de podredumbres blandas;Ralstonia solanacearum, que provoca podredumbre y marchitez en las solanáceas cultivadas, pero también en plantas de más de cincuenta familias; los distintos patovares dePseudomonas syringae, que provocan manchas, quemados y ulceraciones;Agrobacterium tumefaciens, una bacteria causante de tumores en cuello, en raíces, y con menor frecuencia en tallo y que tiene una amplia gama de huéspedes, incluyendo más de 700 especies; yXanthomonas campestris, responsable de manchas y quemados en plantas, entre otras.
[0009] Los nematodos tienen también gran importancia en la agricultura. Son gusanos microscópicos que miden entre 0,2-1 mm con un estilete en la parte superior que usan para alimentarse de la planta. Las larvas entran por cualquier parte de la planta en contacto con el suelo húmedo, pero principalmente por la punta de los pelos radiculares absorbentes, ya que su estilete no es muy vigoroso. Una vez que se alojan en los tejidos, no se mueven ni cambian de posición. Los síntomas se manifiestan por la aparición de los típicos nódulos o engrosamientos en las raíces. Estos daños provocan la obstrucción de vasos e impiden la absorción por las raíces, lo que se traduce en un menor desarrollo de las plantas y síntomas de marchitamiento, clorosis y enanismo. Los nematodos fitopatógenos incluyen las especies de los génerosMeloidogyne,Heterodera,RadopholusyPratylenchus.
[0010] Las plagas de insectos también son un importante problema en las plantas. En algunos casos son vectores de infecciones bacterianas y/o virales. En otros casos, pueden debilitar la planta e incluso frenar su crecimiento y desarrollo, y su control o eliminación resulta tremendamente complejo. Este es el caso de los escarabajos barrenadores, que perforan la corteza y se introducen bajo ella para construir sus galerías y donde las hembras depositan los huevos, o los arañuelos del olivo, que succionan la savia de la planta picando en yemas, hojas, flores, frutos y brotes jóvenes a la vez que inyectan toxinas a la planta, deteniendo el crecimiento y deformando los órganos afectados. Otro ejemplo es la mosca blanca, que absorbe la savia hasta que las hojas empiezan a manifestar manchas moteadas de color amarillo y finalmente se secan. Además las secreciones producidas por este insecto favorecen la proliferación de hongos. Pulgones, hormigas podadoras, cochinillas, avispas serradoras, mariposas del geranio, escarabajos de las flores, etc., son otros ejemplos de los principales insectos que provocan daño en las plantas.
[0011] 2. Control de los fitopatógenos
[0012] Para controlar los patógenos de plantas mencionados anteriormente y aumentar los rendimientos de las cosechas, se usan generalmente productos químicos, teniendo estos productos químicos una elevada toxicidad asociada en algunos casos, lo cual afecta negativamente al medioambiente. Tanto el agua como la tierra se están contaminando; se están destruyendo seres vivos fundamentales en la agricultura, tales como los insectos polinizadores, y se está afectando a la salud de animales y humanos. La Directiva 2009/128/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 21 de octubre de 2009, establece el marco de actuación para conseguir el uso sostenible de dichos compuestos y señala ámbitos prioritarios para la puesta en marcha de acciones innovadoras ecológicamente sostenibles que aumenten la productividad agrícola y la eficacia de los recursos.
[0013] Una alternativa al uso indiscriminado de productos químicos en agricultura es el uso de microorganismos beneficiosos, incluyendo tanto hongos como bacterias. Es un método no contaminante y respetuoso con el medio ambiente que reduce notablemente los riesgos de adquisición de resistencia por parte de los patógenos.
[0014] 2.1. Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)
[0015] Las rizobacterias son microorganismos del suelo que viven en las proximidades de las raíces y también se usan ampliamente en el biocontrol. Dado que, en la mayoría de los casos, estas bacterias se encuentran en la naturaleza en la rizosfera, no suelen dañar a otros organismos beneficiosos y, además, en muchos casos, benefician al ecosistema estimulando el crecimiento vegetal y haciendo más sostenible la producción agrícola. Por otra parte, sus efectos sobre la salud humana son mínimos o nulos. Estos microorganismos, también denominados rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, o PGPR, colonizan las raíces de las plantas, compiten con y controlan los patógenos de plantas, y actúan como fertilizantes.
[0016] Las PGPR se caracterizan por su capacidad para estimular el crecimiento vegetal a través de mecanismos directos o indirectos. La estimulación directa incluye la fijación de nitrógeno (Sessitschet al., 2002); la producción de hormonas, tales como auxinas, giberelinas y citoquininas que aumentan el alargamiento, la división y el tamaño de las raíces (Perrineet al., 2004; García de Salamoneet al.,2001); la solubilización de fosfatos (Rodríguez y Fraga, 1999); y la secreción de sideróforos (Carsonet al., 2000), entre otros. La estimulación indirecta del crecimiento vegetal incluye diversos mecanismos de biocontrol de los organismos fitopatógenos (bacterias, hongos y nematodos, entre otros), que incluyen: la competencia por sustratos o nichos ecológicos; la producción de enzimas hidrolíticas (proteasas, lipasas, quitinasas, colagenasas y glucanasas); la producción de antibióticos (Hassanet al., 1997; Essalmani y Lahlou, 2003); la colonización de las raíces, convirtiéndolas en “envolturas biológicas” que retrasan la invasión por los nematodos (Rodríguez-Kábana, 1997; Loeppler, 1997); la alteración de los exudados de las raíces, haciéndolas menos atractivas a los nematodos (Oostendorp, y Sikora, 1990); la producción de sideróforos y la producción por parte de algunas PGPR de compuestos volátiles, tales como la acetoína y el 2,3-butanodiol, que provocan un aumento de la resistencia de las plantas a las infecciones (también denominada resistencia sistémica inducida o ISR) (Choudhary y Johri, 2009) y la producción de H<2>S que impide el desarrollo de nematodos (Mena, 2004 y 2005).
[0017] A través de todos los mecanismos descritos, a determinadas concentraciones en el suelo (se requieren al menos 10<6>microorganismos/ml), las PGPR actúan no sólo como estimulantes del crecimiento vegetal (fitofortificantes o fitofertilizantes), sino también como agentes de control biológico, impidiendo el desarrollo de bacterias, hongos y nematodos fitopatógenos.
[0018] Entre las bacterias PGPR más ampliamente usadas se encuentran las especies de los génerosArthrobacter,Azospirillum,Bacillus,Pseudomonas,RhizobiumySerratia, entre otras (Kloepperet al., 2004). Otras tales comoTsukamurelia paurometabolatambién se usan, por ejemplo, en el bionematicida HeberNem®, efectivo en el control deMeloidogynespp.,Radopholus similis y Pratylenchusspp. Su modo de acción está relacionado con la liberación de sulfuro de hidrógeno y quitinasas (Mena, 2004 y 2005).
[0019] 2.1.1. Bacterias del géneroBacillus
[0020] Una de las bacterias más ampliamente usadas en la agricultura en el control de patógenos o como PGPR son las bacterias del géneroBacillus.
[0021] Las bacterias de este género tienen muchas de las características mencionadas anteriormente, y por otra parte la formación de esporas permite a este género su viabilidad a largo plazo en las preparaciones comerciales, a diferencia de otras rizobacterias tales comoPseudomonas,RhizobiumoSerratia.
[0022] En el mercado existen diversos productos comerciales del géneroBacillus. Estos incluyen, entre otros:
[0025]
[0026]
[0028] Otras patentes/solicitudes de patente que describen el uso de microorganismos del géneroBacilluspara el control biológico son:
[0029] • Cepa deB. velezensiscomo biofungicida (documento US 2010/0179060 A1).
[0030] • Cepa deB. pumiluscomo nematicida (documento WO 2013/067275).
[0031] • Cepa deB. pumiluscomo insecticida (documento WO2010146204).
[0032] • Cepa deB. thuringiensiscomo nematicida (documento WO 2010/078708 A1, documento US 6077506).
[0033] • Cepa deB. thuringiensis, sus genes y toxinas como nematicida (documento EP 0853671).
[0034] • Tres cepas deBacillus subtilis,Pseudomonas putidaySporobolomyces roseuspara el control de fitopatógenos (documento WO 2004/024865 A2).
[0035] • Varias cepas deBacillusspp.yBrevibacillus parabreviscon efecto fungicida y bactericida (documento WO 2010/142055).
[0036] Se describen otras bacterias usadas como PGPR y en control biológico en las patentes/solicitudes de patente siguientes:
[0037] • Cepa deSerratiapara el control de patógenos (documento CA2822178 A1).
[0038] • Tres cepas deBacillus thuringiensis,Bacillus mojavensisyAzospirillum brasilensecomo estimulantes del crecimiento vegetal y bionematicidas (documento WO2011121408 A1).
[0039] • Una preparación que contiene distintas cepas dePseudomonascomo estimulante del crecimiento vegetal y como agente de control biológico (documento US6048713 A).
[0040] • Un cultivo deDelftia acidovoransque oxida el azufre y estimula el crecimiento vegetal (documento US20080242543 A1).
[0041] • Cepas deRhizobiumpara aumentar el crecimiento vegetal (documento WO2003089640 A2).
[0042] Shanet al.(Crop Protection 44 (2013), 29-37) describen el uso de la cepa BC79 deBacillus methylotrophicusen el biocontrol de la enfermedad del arroz, también conocida como añublo del arroz, provocada por el hongoMagnaporthe oryzae.
[0043] Madhaiyanet al.(lnternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2010), 60, 2490-2495) describenBacillus methylotrophicussp., aislada de la rizosfera del arroz y divulgan su uso para fomentar el crecimiento vegetal.
[0044] Khusroet al.(lndian Journal of Research (2013) vol.2, n.º 11, páginas 243-244) describen la mejora de una nueva cepa deBacillus methylotrophicuspara la producción aumentada de metabolitos antimicrobianos y su uso contra bacterias.
[0045] El documento CN 103 805 534 A divulga el uso de una cepa deBacillus methylotrophicuspara aumentar la resistencia a la sequía en plantas y para controlar el marchitamiento bacteriano deCapsicumy la antracnosis de cítricos.
[0046] El uso deBacillus methylotrophicuscontra hongos fitopatógenos se ha divulgado previamente, por ejemplo, en Catello Paneet al., (Biocontrol Science and Technology., vol. 22, n.º 12, 1 de diciembre de 2012, páginas 1373-1388); Hongying Shanet al., (Crop Protection, vol. 44, 1 de febrero de 2013, páginas 29-37); Li maet al., (Antonie van Leeuwenhoek, vol 103, n.º 2, 8 de septiembre de 2012, páginas 299-312); documento CN 102 787084 A y documento KR 20130096870 A.
[0047] A pesar de los numerosos intentos de desarrollar estrategias para la estimulación del crecimiento vegetal y/o estrategias para el control biológico de bacterias, hongos y/o nematodos fitopatógenos, existe en la actualidad una imperiosa necesidad de desarrollar estrategias alternativas o estrategias mejores que las actuales, capaces de estimular el crecimiento vegetal y/o controlar biológicamente la presencia de fitopatógenos tales como, por ejemplo, bacterias, hongos y/o nematodos.
[0048] Breve descripción de la invención
[0049] La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones.
[0050] Un objeto de la presente invención se refiere a un microorganismo perteneciente a la cepa XT1 deBacillus methylotrophicus(número de depósito CECT8661) depositada el 23 de abril de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) por la Universidad de Granada.
[0051] Otro objeto de la presente invención es un cultivo de bacterias que comprende un microorganismo perteneciente a la cepa XT1 deBacillus methylotrophicus.
[0052] Un objeto adicional de la presente invención se refiere a una composición que comprende un microorganismo perteneciente a la cepa XT1 deBacillus methylotrophicus.
[0053] Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de las bacterias pertenecientes a la cepa XT1 deBacillus methylotrophicus, de los cultivos o de las composiciones de las mismas que las comprenden, como estimulantes del crecimiento vegetal.
[0054] Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
[0055] a. Obtener las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones tal como se describió anteriormente; y b. Poner en contacto una planta con las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones obtenidos en la etapa a).
[0056] Una realización de la presente invención se refiere a un método para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
[0057] a. Obtener las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones tal como se describió anteriormente; y b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones obtenidos en la etapa a).
[0058] Los métodos de la presente invención pueden comprender además el uso de un sistema para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros autocompensantes para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de sistemas de riego localizado (tales como, por ejemplo, microaspersores con elementos giratorios o difusores) para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de aspersores para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención.
[0059] Breve descripción de los dibujos
[0060] Con el fin de complementar la descripción que está realizándose y ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención según varias realizaciones, en el presente documento se muestran los siguientes dibujos con carácter ilustrativo y no limitativo:
[0061] Figura 1. Zona de inhibición de XT1 y XT2 (cepa de referencia) frente aBotrytisy zona de inhibición de XT1 frente aFusarium.
[0062] Figura 2. Actividad de la cepa XT1 frente aAgrobacterium tumefaciens.
[0063] Figura 3. Factor de multiplicación deM. javanicaen plantas de tomate tratadas con las cepas XT1, XT2 (cepa de referencia) y cepa tipo.
[0064] Figura 4. Número promedio de nematodos encontrados por planta tratada con las cepas XT1, XT2 (cepa de referencia) y cepa tipo.
[0065] Figura 5. Número promedio de nematodos por g de raíz encontrados en plantas tratadas con las cepas XT1, XT2 (cepa de referencia) y cepa tipo.
[0066] Figura 6. Nectarino afectado por una plaga de pulgones antes del tratamiento con la cepa XT1.
[0067] Figura 7. Crecimiento de plantas de calabaza tras 50 días de cultivo en macetas a temperatura ambiente. Las macetas B1 y B2 se inocularon con la cepa XT1 mientras que las macetas B3 y B4 no se inocularon, de modo que pudieron usarse como control.
[0068] Descripción detallada de la invención
[0069] La invención se refiere a bacterias pertenecientes a la cepa con número de depósito CECT8661, depositada el 23 de abril de 2014 por la Universidad de Granada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). A lo largo de la presente memoria descriptiva, puede hacerse referencia a esta cepa usando el término“cepa XT1”.
[0070] En una realización de referencia, en el presente documento se describen bacterias pertenecientes a la cepa con número de depósito CECT8662, depositada el 23 de abril de 2014 por la Universidad de Granada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). A lo largo de la presente memoria descriptiva, puede hacerse referencia a esta cepa usando el término“cepa XT2”.
[0071] Un objeto de la presente invención se refiere al uso de las bacterias pertenecientes a la cepa XT1 en un método para estimular el crecimiento vegetal.
[0072] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 pertenecen a la especieBacillus methylotrophicus.Esta especie fue descrita por Madhaiyanet al.en 2010. Fue aislada de la rizosfera de una planta de arroz (Oryza sativa).La especieBacillus methylotrophicusestá muy relacionada filogenéticamente conBacillus subtilis,B. licheniformis,B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, siendo todos ellos microorganismos con diversas aplicaciones en el campo de la agricultura. El porcentaje de identidad con estas especies oscila entre el 98,2 y el 99,2 %. La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 tienen respectivamente un 99,5 % y un 99,3 % de identidad con la especie tipo deB. methylotrophicus.Esta conclusión se alcanzó tras secuenciar el gen 16S de ARNr completo (1500 pb).
[0073] La clasificación científica de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 de la presente invención es la siguiente: Dominio:Bacterium/ Filo:Firmicutes/ Clase:Bacilli/ Orden:Bacillales/ Familia:Bacillaceae/ Género:Bacillus.Ambas cepas son bacilos Gram positivos esporulados. Su tamaño oscila entre 1,5 y 3,5 μm de longitud por 0,5 μm de anchura. Originan colonias de color marfil de bordes irregulares. Son negativos para oxidasa y positivos para catalasa.
[0074] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 tienen flagelos perítricos que les confieren una gran movilidad. Originan biopelículas o películas que permiten su adherencia a sustratos animados e inanimados y actúan como factor de protección frente a depredadores existentes en el medioambiente. La formación de biopelículas facilita la adherencia del microorganismo; si se administra por riego por goteo, se adherirá a las raíces. Si se administra mediante aplicación foliar, se mantendrá en la filosfera. Además, la formación de biopelícula tanto en las raíces como en las hojas y el tallo protege a la planta frente al ataque de otros seres vivos.
[0075] Por consiguiente, tanto la presencia de flagelos como la formación de biopelícula suponen una ventaja que poseen estas bacterias (XT1 y la cepa de referencia XT2) para la colonización del hábitat.
[0076] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 originan esporas elipsoidales no deformantes. En el medio 2xSG, estas bacterias producen más de 5 x 10<8>esporas/ml entre tres y cinco días. Son halotolerantes y crecen óptimamente en una amplia gama de concentraciones de sal [entre el 0 y el 12 % (p/v)]. Crecen óptimamente entre 20-45 ºC y a un pH de 5-10. Sus requisitos nutricionales son escasos: pueden crecer con una gran variedad de compuestos orgánicos como única fuente de carbono, tales como citrato o sacarosa. Son capaces de crecer con nitrato de amonio como única fuente de nitrógeno, sin necesidad de la presencia de extracto de levadura o de una fuente de nitrógeno compleja.
[0077] La formación de esporas, que permite a la bacteria su mantenimiento en el hábitat en condiciones adversas, y los escasos requisitos nutricionales que permiten la elaboración de medios de cultivo de bajo coste, hacen a la cepa XT1 y a la cepa de referencia XT2 muy atractivas desde el punto de vista industrial.
[0078] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 son anaerobias facultativas. Respiran aerobiamente en presencia de oxígeno, y en ausencia de éste, por ejemplo, en las raíces y en sus proximidades, realizan fermentación butanodiólica, produciendo 2,3-butanodiol y acetoína. Usan numerosos azúcares como fuente de carbono y energía, produciendo ácidos a partir de dichos azúcares. Entre los azúcares que usan estas cepas se encuentran el glicerol, la glucosa, la fructosa, el manitol, el sorbitol, la celobiosa, la lactosa y la sacarosa. También pueden realizar la fijación de nitrógeno, es decir, en ausencia de una fuente nitrogenada captan el nitrógeno gaseoso y lo transforman en amonio, que es la fuente de nitrógeno que pueden usar las plantas. Producen dihidroxiacetona y H<2>S.
[0079] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 son capaces de sintetizar compuestos quelantes, tales como compuestos sideróforos, que captan el Fe<3+>y lo transforman en Fe<2+>. El ion de hierro Fe<3+>tiene muy poca solubilidad a pH neutro y, por tanto, no puede usarse por los organismos. Los sideróforos disuelven estos iones para dar complejos de Fe<2+>, que pueden ser asimilados por mecanismos de transporte activo.
[0080] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 son capaces de producir numerosos enzimas extracelulares con una alta capacidad hidrolítica, lo cual facilita la disponibilidad de sustratos para las plantas. Entre otros efectos, la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 son capaces de producir amilasas que hidrolizan el almidón, ureasa que hidroliza la urea originando amonio, proteasas que hidrolizan la gelatina y la caseína, lipasas que hidrolizan el Tween 80 y la lecitina, ADNasas que hidrolizan el ADN, fosfatasas que hidrolizan el fosfato orgánico y el fosfato inorgánico y ACC desaminasa.
[0081] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 producen en medio CAS, usado para la detección de sideróforos, una mayor zona de aclaramiento (7 y 5 mm, respectivamente) que la cepa deBacillus velezensisde Botrybel usada como control y que produce 3 mm. Ambas cepas crecen mejor que la cepa de control (se observa una mayor cantidad de masa bacteriana en la superficie del medio sólido) en medios sólidos libres de nitrógeno, indicando una mayor actividad fijadora de nitrógeno. Por tanto, su actividad como fertilizante microbiano es mayor.
[0082] La cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 son capaces de formar biopelícula. Esta actividad no ha sido determinada en la preparación comercial anterior. Esta capacidad permite a las bacterias adherirse más fácilmente a las raíces o a las hojas de las plantas para ejercer su acción fitoprotectora o estimulante del crecimiento vegetal.
[0083] Más específicamente, se ha hallado que la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 tienen una actividad enzimática superior a la cepa de la preparación Botrybel, producen mayores halos de hidrólisis de almidón (actividad amilasa, véase la figura 3), gelatina y caseína (actividad proteasa), Tween 80 y lecitina (actividad lipasa), y mayor actividad ACC desaminasa y fosfatasa, determinada usando fosfato de fenolftaleína y fosfato de calcio. Los halos de hidrólisis se observan como la aparición de una zona transparente en el caso de la hidrólisis de almidón, caseína y lecitina; para la gelatina, se observa la licuación de la misma, es decir, el paso de estado sólido a líquido; en el caso de Tween 80, aparece una zona de precipitación más opaca; para la actividad ACC desaminasa, se estudia el crecimiento en medios con ácido aminociclopropanocarboxílico como única fuente de nitrógeno; y finalmente, la actividad fosfatasa se observa junto con la aparición de un color rosa al adicionar amoniaco en la placa con fosfato de fenolftaleína, y la solubilización de fosfato de calcio se analiza observando la zona transparente que se origina alrededor de la masa bacteriana que ha crecido en un medio con este compuesto. Las actividades se han analizado usando como control la cepa deBacillus velezensisde la preparación Botrybel.
[0084] En cuanto a sus actividades como agentes de control biológico frente a hongos, se han determinado los valores de inhibición de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deB. methylothrophicusfrente aAlternaria alternata,Aspergillus niger,Botrytis cynerea,Fusarium oxysporum,Phytophthora cactorum,Phytophthora cinnamomi,Rhizopus oryzae,Sclerotinia sclerotiorum,Thanatephorus cucumerisyVerticillium dahliae.Los valores de inhibición de crecimiento son muy significativos en el caso deBotrytis cinnerea.La actividad fue inferior frente aFusarium oxysporum.En general, la cepa deBacillusde Botrybel presenta una actividad inferior (y en algunos casos similar) a la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (véase la tabla 1 en el ejemplo 2, más adelante). La cepa XT1 y la cepa tipo deB. methylothrophicus(cepa de referencia) también muestran actividad frente a bacterias fitopatógenas tales comoAgrobacterium tumefaciens,Pectobacterium atrosepticum,Ralstonia solanacearumyXanthomonas campestris, mientras que la cepa de referencia XT2 muestra actividad frente aP. atrosepticumyX. campestris(véase tabla 2 en el ejemplo 3, más adelante).
[0085] La cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deB. methylothrophicus(cepa de referencia) muestran actividad frente aRhopalosiphum padi(véase tabla 3) y la cepa XT1 frente a la mosca blanca (véase el ejemplo 6, b1, más adelante).
[0086] La cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deB. methylothrophicus(cepa de referencia) disminuyen considerablemente el factor de multiplicación deMeloidogyne javanicay el número de nematodos por planta de tomate y el número de nematodos por g de raíz (véanse las figuras 3, 4 y 5); asimismo, el tratamiento con la cepa XT1 recuperó plantas de pepino holandés cultivadas en invernadero y altamente infectadas por nematodos (véase el ejemplo 4b, más adelante).
[0087] Otra ventaja de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 es su elevada sensibilidad a los agentes antimicrobianos generalmente usados en terapia. Son sensibles a ácido nalidíxico (30 μg), amoxicilina (2 μg), amoxicilina-ácido clavulánico (30 μg), cefalotina (30 μg), colistina (10 μg), doxiciclina (30 μg), eritromicina (15 μg), kanamicina (30 μg), nitrofurantoína (300 μg), norfloxacina (5 μg), novobiocina (30 μg), rifampicina (30 μg), trimetoprim sulfametoxazol (1,25 μg-23,75 μg) y vancomicina (30 μg) siguiendo la técnica de difusión en medio sólido (Bauer y Kirby, 1966). Por tanto, no pueden transferir genes de resistencia a otras poblaciones microbianas de la rizosfera.
[0088] La cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deB. methylotrophicus(cepa de referencia) presentan una ventaja adicional frente a los hongos usados para el control biológico y como estimulantes del crecimiento vegetal, que es su fácil cultivo y, por tanto, su fácil obtención a nivel industrial. La ventaja frente a otras cepas bacterianas de otros géneros descritas con el mismo propósito es la presencia de esporas por parte de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2, lo que supone una total estabilidad del producto durante el almacenamiento y en el medioambiente cuando las condiciones no son adecuadas para la manipulación de dichos microorganismos.
[0089] La cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deB. methylotrophicus(cepa de referencia) producen compuestos que disminuyen el pH, tales como 2,3-butanodiol y acetoína, cuando fermentan azúcares en condiciones anaerobias. Además, son capaces de fijar nitrógeno, producir sideróforos y enzimas hidrolíticas. Todas estas características son mecanismos de estimulación directa del crecimiento vegetal (Sessitschet al., 2002; Perrineet al., 2004; Rodríguez y Fraga, 1999; Carsonet al., 2000; Essalmani y Lahlou, 2003; Choudhary y Johri, 2009). La cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) producen distintos lipopéptidos tensioactivos. Entre estos lipopéptidos tensioactivos se encuentran la surfactina, que es similar a la producida porBacillus subtilis.Más específicamente, la surfactina producida por la cepa XT1 no presenta ácidos grasos de 12 carbonos (12C) en su cadena lipídica.
[0090] Tras la extracción de los lipopéptidos siguiendo el método de Cooperet al., 1981, para la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 se obtuvo un rendimiento de 0,12 g/l y 0,10 g/l de cultivo, respectivamente. La cepa tipo (cepa de referencia) produjo 0,6 g/l. En el caso de la cepa deBacillusde la preparación comercial Botrybel no se ha descrito la producción de lipopéptidos. En particular, además de la surfactina, la cepa XT1 objeto de la presente invención produce otros lipopéptidos tensioactivos tales como fengicina y liquenisina.
[0091] El peso seco celular (PSC) de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) es de 2,7 g/l, 2,5 g/l y 2,9 g/l, respectivamente. En el caso de la cepa XT1, la concentración micelar crítica (CMC) es del 0,0025 % (0,025 mg/ml); con este valor se obtuvo una tensión superficial de 29,7 mN/m. En el caso de la surfactina producida porB. subtilisy comercializada por Sigma<®>, se obtuvieron valores de 26,7 mN/m a la misma CMC. Dicho de otro modo, la cepa XT1 produce lipopéptidos tensioactivos muy activos que muestran una actividad análoga a la surfactina disponible comercialmente.
[0092] Muchos lipopéptidos producidos por especies deBacillusmuestran actividad antibiótica, actuando a nivel de las membranas celulares en hongos y bacterias Gram negativas, tales como, por ejemplo, fengicinas, micobacilinas, iturinas, bacilomicinas, surfactinas, micosubtilinas, fungistatinas (Volponet al., 2000; Yilmazet al., 2006).
[0093] Más específicamente, los lipopéptidos producidos por la cepa XT1 son una mezcla de ácidos grasos de 13, 14 y 15 átomos de carbono, que se unen a un péptido cíclico por leucina o isoleucina. La proporción relativa de estos ácidos grasos es de 1, 6,5 y 5,7, respectivamente.
[0094] La producción de enzimas (glucanasas, proteasas, lipasas, fosfatasas y ureasa) junto con los distintos lipopéptidos, y la liberación de H<2>S, son, según la bibliografía (véase la técnica anterior), responsables de la acción de dichas cepas en el control biológico de hongos, bacterias, insectos y nematodos.
[0095] Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para estimular el crecimiento vegetal en plantas (preferiblemente no afectadas por organismos fitopatógenos) que comprende las etapas de:
[0096] a. Obtener las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones según la presente invención; y
[0097] b. Poner en contacto una planta preferiblemente no afectada por un fitopatógeno con las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones obtenidos en la etapa a).
[0098] Una realización de la presente invención se refiere a un método para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
[0099] a. Obtener las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones según la presente invención; y
[0100] b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones obtenidos en la etapa a).
[0101] En los métodos de la presente invención, las bacterias, los cultivos y/o la composición de la presente invención pueden ponerse en contacto con la planta (afectada) mediante aplicación foliar, tal como, por ejemplo, por medio de pulverización y/o goteo, o por riego tradicional, o riego por inundación.
[0102] Los métodos de la presente invención pueden comprender además el uso de un sistema de distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros autocompensantes para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de sistemas de riego localizado (tales como, por ejemplo, microaspersores, opcionalmente con elementos giratorios o difusores) para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de aspersores para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención.
[0103] Los sistemas de riego localizado pueden definirse como métodos de distribución de fluidos (agua, fertilizantes, o, en este caso, las bacterias, los cultivos o las composiciones según la presente invención), que, para mantener un nivel adecuado y constante del fluido distribuido en el suelo, aplica dicho fluido gota a gota, de manera lenta, localizada y uniforme en la masa radicular de la planta.
[0104] Los sistemas de riego localizado pueden comprender sistemas de goteo, exudación y/o microaspersión.
[0105] El experto en la técnica conoce cómo funcionan los sistemas de riego localizado y cómo hacer uso de ellos.
[0106] Un gotero al que se hace referencia en el presente documento se define como un punto de emisión de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención en la proximidad de las plantas que van a tratarse. El experto en la técnica conoce cómo funciona un gotero y cómo hacer uso de él.
[0107] Los sistemas de distribución para la distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención pueden comprender sistemas de riego localizado, goteros, goteros autocompensantes, microaspersores y/o aspersores.
[0108] Además, en el método de la presente invención, las bacterias, los cultivos y/o las composiciones de la presente invención pueden ponerse en contacto con la planta afectada al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más.
[0109] Además, el intervalo de tiempo entre una aplicación de las bacterias, el cultivo y/o la composición de la presente invención y la siguiente (si se ponen en contacto o se aplican más de una vez) es de 2 días, o 3 días, o 5 días, o 10 días, o 15 días, o 20 días, o 30 días.
[0110] Preferiblemente, las bacterias, el cultivo y/o la composición de la presente invención se ponen en contacto con la planta afectada dos veces, una vez a tiempo (t) = 0 y otra vez después de 30 días.
[0111] Preferiblemente, las bacterias, el cultivo y/o la composición de la presente invención se ponen en contacto con la planta afectada una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez al día durante 8-12 días.
[0112] Además, en el método de la presente invención, el cultivo y/o la composición de la presente invención que tienen una concentración de microorganismos de al menos 10<8>unidades formadoras de colonias (UFC) por ml se usan, por ejemplo, a una dilución de entre el 0,5-5 % (v/v), tal como el 0,5 %, el 1 %, el 1,5 %, el 2 %, el 3 % y/o el 5 % (v/v). Preferiblemente, en el método de la presente invención, el cultivo y/o la composición de la presente invención tienen una concentración de microorganismos del 1,5 % (v/v) de una preparación que contiene 5 x 10<8>UFC/ml.
[0113] Por tanto, una realización de la presente invención se refiere a un método para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
[0114] a. Obtener las bacterias, los cultivos de bacterias o las composiciones según la presente invención; y
[0115] b. Poner en contacto una planta (que puede estar afectada o no por un fitopatógeno) con las bacterias, los cultivos o las composiciones obtenidos en la etapa a) por medio de sistemas de distribución, por ejemplo, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, usando para ello un sistema de distribución de las bacterias, los cultivos o las composiciones de la presente invención, donde los cultivos o las composiciones tienen una concentración de microorganismos de al menos 10<8>unidades formadoras de colonias (UFC) por ml, usados a una dilución de entre el 0,5-5 % (v/v), tal como, por ejemplo, el 0,5 %, el 1 %, el 1,5 %, el 2 %, el 3 % y/o el 5 % (v/v), por ejemplo, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, una vez al día durante 8-12 días, o dos veces en un periodo de 30 días (una vez a tiempo 0 días y otra vez a tiempo 30 días). A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra“comprender”y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas.
[0116] Ejemplos
[0117] Ejemplo 1. Aislamiento de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2
[0118] La cepa XT1 (número de depósito CECT8661), objeto de la invención, fue aislada en 1999 a partir de una muestra de la rizosfera de un suelo cercano a la laguna de Capacete, situada en Fuente de Piedra, Málaga (España). La cepa de referencia XT2 (número de depósito CECT8662) fue aislada en 2010 en un suelo cercano a la desembocadura del río Vélez (Málaga, España). El medio usado fue el medio MY (Moraine y Rogovin, 1966) al que se le añadió un 7,5 % de sales marinas en el caso de la cepa XT1 y el medio MY con un 3 % de sales marinas en el caso de la cepa de referencia XT2. Se seleccionaron ambas cepas por sus características de aproximadamente 5000 colonias (buscando aquellas con mayor actividad tensioactiva mediante el método de Jainet al., 1991).
[0119] Ejemplo 2. Uso de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) como agentes antifúngicos
[0120] La actividad frente a los hongos (tabla 1) fue realizada sembrando la cepa XT1, la cepa de referencia XT2, la cepa tipo (cepa de referencia) y la cepa de Botrybel (cepa de referencia) en una pequeña extensión en medio PDA (agar de dextrosa de patata). A continuación se colocó en el extremo opuesto un trozo de agar de aproximadamente 1 cm<2>con micelio del hongo que va a someterse a prueba, y a los 20 días y tras la incubación a 25 ºC se procedió a medir el radio máximo y mínimo del micelio del hongo para calcular el porcentaje de reducción de crecimiento del hongo.
[0122]
[0124] Tabla 1.- Valores de inhibición máximos y mínimos frente a distintos hongos expresados en mm, entre paréntesis el porcentaje de reducción del micelio. ND: No determinado.
[0125] Entre los hongos sometidos a prueba, la mayor inhibición se logró frente aBotrytis(cepa XT1 y cepa de referencia XT2) y la menor inhibición se logró frente aFusarium(figura 1).
[0126] También se determinó la actividad antimicrobiana de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) frente aSaccharomyces cerevisiae(levadura beneficiosa con grandes aplicaciones industriales) y se observó la ausencia de la misma, es decir, la zona de inhibición fue de cero mm.
[0127] Ejemplo 3. Uso de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) como agentes antibacterianos
[0128] La actividad antibacteriana se determinó incorporando, en una placa de Petri con agar con triptona y soja (TSA), una sobrecapa con 6 ml de TSA estéril a 45 ºC y 1 ml de un cultivo de la cepa fitopatógena que va a analizarse en fase de crecimiento exponencial a una concentración equivalente a 1 en la escala de Mac Farland. A continuación, una vez solidificado el medio, se inocularon en un pocillo 100 μl de sobrenadante de los cultivos. Tras 24 horas de incubación, se midió la zona de inhibición (tabla 2, figura 2).
[0131]
[0133] Tabla 2.- Actividad antibacteriana. Resultados expresados en mm de inhibición de crecimiento. R: Resistente.
[0134] Ejemplo 4. Uso de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) como agentes para el control biológico de nematodos
[0135] a) Pruebas en plantas de tomate inoculadas conMeloidogyne javanica(figuras 3, 4 y 5)
[0136] Se usaron 5 lotes de 10 plantas de tomate cada uno (Solanum lycopersicum).Tres lotes se inocularon con las cepas seleccionadas (2 x 10<8>UFC) y posteriormente conM. javanicaJ2 (1500). Finalmente, como control se usaron dos lotes, con y sin nematodos. A los 50 días se determinó el número de nematodos en el suelo de cada planta y en las raíces, y se calculó el factor de multiplicación (Talaveraet al., 2012). Los resultados obtenidos pueden observarse en las figuras 3, 4 y 5.
[0137] Se observa que todas las cepas disminuyen el factor de multiplicación de nematodos, el número de nematodos por planta y el número de nematodos por g de raíz, siendo las disminuciones más pronunciadas en el caso de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2.
[0138] b) Prueba en invernadero con la cepa XT1 en un cultivo de pepino holandés con problemas recurrentes cada año por exceso de humedad en suelo, dificultad para el enraizamiento y alta incidencia de podredumbre en la raíz, así como infección por nematodos.
[0139] Se usó un sector de 2000 m<2>para inyectar en el riego por goteo y se usó otro sector similar como control. Se aplicaron 7,5 l de cultivo en 6 aplicaciones separadas por un periodo de 10 días (1, 250 l de un cultivo con al menos 10<8>UFC/ml en cada aplicación). Tanto en el sector de control como en el sector de tratamiento se mantuvieron los tratamientos fertilizantes y fitosanitarios habituales. El número de plantas perdidas durante este tratamiento en el sector control fue de 36, mientras que el de las tratadas con la cepa XT1 fue de 6. Las diferencias en la producción también fueron significativas, obteniéndose un 30 % más de producción en el sector tratado.
[0140] Ejemplo 5. Uso de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) como agentes para el control biológico de insectos
[0141] a) Se realizaron experimentos en el laboratorio con el pulgón de la cebada (Rhopalosiphum padi) yAnthocoris nemoraliscon el fin de determinar el porcentaje de mortalidad, que originan los cultivos de bacterias de las tres cepas deB. methylotrophicusy sus tensioactivos, sobre estos insectos. Dado que el primero es un insecto succionador, las pruebas se realizan únicamente por vía tópica, mientras que en el segundo caso se realizan tanto por vía tópica como por ingestión.
[0142] Se analizó la actividad de los cultivos de bacterias de la cepa XT1 y la cepa de referencia XT2 con 5 x 10<8>UFC/ml, así como de sus tensioactivos a una concentración de 1/1000 en agua destilada, en ambos tipos de insectos, por uso tópico. Para cada tratamiento se usaron diez individuos. En el caso deAnthocoris, se aplicaron 5 μI con una pipeta sobre el cuerpo de los mismos y en los pulgones se impregnó la misma cantidad con un cepillo. Como control se usó el medio de cultivo de bacterias SG. Los resultados obtenidos expresados en porcentaje de mortalidad tras 48 h son los siguientes:
[0145]
[0147] Tabla 3. Mortalidad por uso tópico en el pulgón de la cebadaRhopalosiphum padiyAnthocoris nemoralis. Resultados expresados en porcentaje de individuos.
[0148] Asimismo se analizó la actividad de los cultivos de bacterias de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deB. methylotrophicus(cepa de referencia) con 5 x 10<8>UFC/ml, así como de los tres tensioactivos correspondientes, a una concentración de 1/1000 en agua destilada por ingestión sobreAnthocoris nemoralis.Como control se usó agua y Tween 80 (dilución 1/1000). Los distintos productos se aplicaron sobre una esponja humedecida con agua (1 ml) y por pulverización (0,25 ml) sobre la comida (huevos deEphestia kuheniella) procurando que estuviera bien cubierta. Para cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones de cinco individuos observándose diariamente durante 6 días. Los resultados obtenidos, expresados en porcentaje de mortalidad, se indican en la siguiente tabla:
[0150]
[0152] Tabla 4. Mortalidad por ingestión enAnthocoris nemoralis. Resultados expresados en porcentaje de individuos.
[0153] b) Además, se trató un nectarinoPrunus persicavar.nectarinaaltamente afectado por una plaga de pulgones verdes y negros (véase la figura 6) con un cultivo de XT1 con 5 x 10<8>UFC/ml. Específicamente, se administraron mediante aplicación foliar 50 ml de una dilución al 5 % de dicho cultivo cada 10 días. Tras la segunda aplicación, la población desapareció prácticamente, aunque quedaron pequeñas zonas con pulgones en el extremo de algunas hojas que permanecían enrolladas y se eliminaron manualmente. Trascurrido un mes, la plaga quedó controlada. c) Asimismo se observó la desaparición de mosca blanca en cultivo de tomate en invernadero tratado con la cepa XT1 (véase ejemplo 6, b1).
[0154] Ejemplo 6. Uso de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia) como agentes fitofortificantes
[0155] a) Prueba en maceta con plantas de pimiento (géneroCapsicum) y plantas de calabaza (géneroCucurbita) con la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia).
[0156] Se usaron dieciséis plántulas de 5 cm de altura de cada una de las plantas anteriores que se trasplantaron a macetas de 10 cm de diámetro y 15 cm de altura y se dejaron al aire libre a temperatura ambiente (intervalo de temperatura de 20-38 ºC) durante 35 días. Las macetas se regaron cada 48 h con la misma cantidad de agua (aproximadamente 50 ml). Se hicieron 4 lotes de 4 macetas de cada tipo de planta. Cada siete días se añadieron 5 ml de una dilución 1/100 de un cultivo de la cepa XT1, la cepa de referencia XT2 y la cepa tipo deBacilluscon 5 x 10<8>UFC/ml a tres lotes de cada tipo de planta, después del riego. Un lote de cuatro macetas de cada tipo se usó como control y, por tanto, no se inoculó con cultivos de bacterias. A los 35 días se cortó la parte aérea y se secó. Los resultados obtenidos se observan en la tabla adjunta.
[0158]
[0160] Tabla 5. Efecto fitofortificante de las cepas XT1, XT2 y la cepa tipo (cepa de referencia).
[0161] Nota: En el cultivo del pepino hubo una pérdida, debido a las condiciones climatológicas y plagas, del 50 % de plantas en caso del control y en las plantas regadas con la cepa tipo, y del 25 % en las plantas regadas con la cepa de referencia XT2; sin embargo, todas las plantas regadas con XT1 se mantuvieron en condiciones óptimas. b) Además, con la cepa XT1 se realizó lo siguiente:
[0162] b.1. Prueba en cultivos de tomate pera en invernadero.
[0163] Se realizaron tratamientos mediante aplicación foliar a tres dosis distintas del caldo de cultivo que contenía al menos 10<8>UFC/ml (0,5, 1 y 1,5 % v/v) por medio de pulverización y con dos repeticiones (a tiempo cero y a los 30 días). En cada tratamiento se plantaron 6 plantas. Se usó un control sin tratar. Durante el periodo del estudio, en el invernadero, y por tanto en el control, hubo varias plagas: mosca blanca, pulgón, oidio yBotrytis.El número de plantas que se perdieron en las zonas tratadas con el cultivo de la cepa XT1 fue inferior al número perdido en la zona de control, siendo la dosis más adecuada la del 1,5 % (v/v). Además, el peso de los tomates recolectados de las plantas tratadas fue superior al peso de la planta de control (véase la tabla 6).
[0164] Tratamiento
1,5 % CONTROL 1,5 % CONTROL Exp
ri n i (1) (1) (2) (2) Plantas perdidas 1 4 0 3 Peso de los tomates
[0165] <(kg totales)>3,6 3,1 3,8 3,1 Tabla 6. Plantas de tomates perdidas y peso de los tomates recolectados en dos zonas de cultivo de tomate pera en invernadero tras el tratamiento con XT1.
[0166] Estos resultados mostraron una tendencia clara entre la aplicación del producto y el aumento en la producción de las plantas con respecto a los controles atribuible al efecto estimulante sobre el metabolismo de la planta. Además, las plantas tratadas mostraron una disminución significativa de la plaga por mosca blanca y pulgón y se recuperaron de la infección porBotrytisy oidio.
[0167] b.2. Prueba en maceta a mayor plazo de tiempo con la cepa XT1 con cultivos de planta de tomate (Solanum lycopersicum), planta de pimiento (géneroCapsicum), planta de calabaza (géneroCucurbita) y planta de pepino (Cucumis sativus) sanas y ya desarrolladas.
[0169] Se usaron cuatro plántulas de 10 cm de altura de cada una de las especies anteriores (tomates (Solanum lycopersicum), pimientos (géneroCapsicum), calabaza (géneroCucurbita) y pepino (Cucumis sativus)).Se trasplantaron a macetas de 10 cm de diámetro y 15 cm de altura y se dejaron al aire libre a temperatura ambiente (intervalo de temperatura de 15-32 ºC). Las macetas se regaron cada 48 h con la misma cantidad de agua (aproximadamente 100 ml). Cada siete días se añadieron 5 ml de una dilución 1/100 de un cultivo de la cepa XT1 deBacilluscon 5 x 10<8>UFC/ml a la mitad de las macetas, después del riego. La otra mitad se usó como control y, por tanto, no se inoculó. A los 50 días se cortó la parte aérea y se secó. Asimismo se anotó el número de hojas, flores y frutos, así como la altura de las mismas. Los resultados obtenidos (valores medios) se observan en la tabla adjunta. Se obtiene un aumento del peso de la vegetación aérea del 86 %, un aumento del número de hojas del 57,6 % y un aumento del número de frutos y flores del 112,5 y 137,5 %, respectivamente (véase la tabla 7). Además, el tamaño de la planta tratada aumentó en un 38,3 %. En la figura 7 pueden observarse los resultados en el cultivo de calabaza.
[0172]
[0175] Tabla 7. Efecto del riego con XT1 en plantas de pimiento, pepino, tomate y calabaza. Se indica la media.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. Microorganismo perteneciente a la especieBacillus methylotrophicus, cepa XT1 (número de depósito CECT8661) depositada el 23 de abril de 2014 por la Universidad de Granada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
2. Cultivo de microorganismos que comprende un microorganismo según la reivindicación 1.
3. Composición que comprende un microorganismo según la reivindicación 1.
4. Uso del microorganismo según la reivindicación 1, y/o del cultivo según la reivindicación 2, y/o de la composición según la reivindicación 3, en un método para estimular el crecimiento vegetal.
5. Método para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
a. Obtener un microorganismo según la reivindicación 1 y/o un cultivo de bacterias según la reivindicación 2 y/o una composición según la reivindicación 3; y
b. Poner en contacto una planta con el microorganismo y/o el cultivo de bacterias y/o la composición obtenidos en la etapa a).
6. Uso según la reivindicación 4 o método según la reivindicación 5, en donde dicho método para estimular el crecimiento vegetal está caracterizado porque el microorganismo según la reivindicación 1, el cultivo según la reivindicación 2 y/o la composición según la reivindicación 3 se ponen en contacto con la planta mediante aplicación foliar.
7. Uso según la reivindicación 4 o método según la reivindicación 5, en donde dicho método para estimular el crecimiento vegetal está caracterizado porque el microorganismo según la reivindicación 1, el cultivo según la reivindicación 2 o la composición según la reivindicación 3 se distribuyen por medio de un sistema de distribución.
8. Uso o método según la reivindicación 7, en donde dicho método para estimular el crecimiento vegetal está caracterizado porque el microorganismo según la reivindicación 1, el cultivo según la reivindicación 2 o la composición según la reivindicación 3 se distribuyen por medio de sistemas de riego localizado.
9. Uso o método según la reivindicación anterior, caracterizado porque el sistema de riego localizado es un microaspersor.
10. Uso o método según la reivindicación 7, en donde dicho método para estimular el crecimiento vegetal está caracterizado porque el microorganismo según la reivindicación 1, el cultivo según la reivindicación 2 o la composición según la reivindicación 3 se distribuyen por medio del uso de aspersores o goteros.
11. Uso según la reivindicación 4 o método según la reivindicación 5, en donde dicho método para estimular el crecimiento vegetal está caracterizado porque el cultivo según la reivindicación 2 o la composición según la reivindicación 3 tiene una concentración de microorganismos de al menos 10<8>unidades formadoras de colonias (UFC) por ml y se usa a una dilución de entre el 0,5-5 % (v/v).
12. Uso o método según la reivindicación anterior, en donde dicho cultivo o dicha composición se usa a una dilución del 1,5 % (v/v).
13. Uso según la reivindicación 4 o método según la reivindicación 5, en donde dicho método para estimular el crecimiento vegetal comprende las etapas de:
a. Obtener el microorganismo según la reivindicación 1, el cultivo según la reivindicación 2 o la composición según la reivindicación 3; y
b. Poner en contacto una planta con el microorganismo, el cultivo o la composición obtenidos en la etapa a) por medio de un sistema de distribución que distribuye las bacterias, el cultivo o la composición;
al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más;
en donde los cultivos o las composiciones tienen una concentración de microorganismos de al menos 10<8>unidades formadoras de colonias (UFC) por ml, usados a una dilución de entre el 0,5-5 % (v/v).
14. Uso o método según la reivindicación 13, en donde dicha planta se pone en contacto con el microorganismo, el cultivo o la composición una vez cada 10 días, durante 60 días, una vez al día durante 8-12 días, o dos veces en un periodo de 30 días.
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