ES3053207T3 - Plasma-treated hydrogel compositions and uses thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende una solución acuosa de polímero, un material biocerámico y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS) y su uso para el tratamiento del cáncer de hueso y/o la regeneración del tejido óseo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones de hidrogeles tratados con plasma y usos de las mismas

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención pertenece al campo de la biotecnología y se refiere a una composición que comprende una solución acuosa polimérica, un material biocerámico y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS,Reactive Oxygen and Nitrogen Species) y su uso para el tratamiento del cáncer óseo o la regeneración del tejido óseo.Antecedentes de la invención

[0005] En los últimos años, se han logrado grandes avances en terapias basadas en plasmas atmosféricos fríos (CAP,Cold Atmospheric Plasmas). Los CAP generan especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS) que pueden ser transferidas a líquidos. Estos líquidos activados con CAP presentan una eficacia biológica similar (es decir, en la eliminación de células cancerosas) a la de los propios CAP, lo que abre la puerta a terapias mínimamente invasivas. Sin embargo, la inyección de un líquido en el cuerpo produce una rápida difusión causada por los fluidos extracelulares y el flujo sanguíneo. Por lo tanto, el desarrollo de vehículos eficientes que permitan el confinamiento local y la administración de RONS a la zona afectada es un requisito fundamental.

[0006] El plasma se define como un gas total o parcialmente ionizado que contiene una gran cantidad de especies reactivas, iones, electrones, partículas metaestables, etc. El desarrollo de fuentes de plasma de pequeñas dimensiones, capaces de operar a presión atmosférica y a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente, ha impulsado el desarrollo de un nuevo campo denominado medicina del plasma. El plasma a presión atmosférica (APP,Atmospheric Pressure Plasma) se ha evaluado como una herramienta eficaz para la esterilización, tratamiento del cáncer o para mejorar la cura de heridas. Los APP formados en el aire generan especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS), que pueden transferirse a líquidos mediante reacciones secundarias. Los líquidos activados por plasma (PAL,Plasma-Activated Liquids) presentan diferentes acciones biológicas que se han atribuido principalmente a la generación de RONS, como peróxidos de hidrógeno (H₂O₂), nitritos (NO₂-), peroxinitritos, etc. Se sabe que estas especies reactivas están involucradas en un amplio espectro de procesos intracelulares e intercelulares. Hasta ahora, en la medicina del plasma, se ha prestado gran atención a la monitorización de las RONS inducidas en los PAL utilizadas en tratamientos indirectos, y algunos trabajos han investigado su almacenamiento mediante la congelación de los PAL, pero esto no siempre es posible. Sin embargo, aún queda por explorar el transporte y la difusión de estas RONS desde biomateriales adecuados para la terapiain situ.

[0007] Labay et al. Scientific Reports 9:16160 (2019) analiza los hidrogeles a base de alginato como vehículos de las RONS generadas por plasmas atmosféricos y estudia si existen modificaciones químicas en la estructura del alginato y su capacidad para formar hidrogeles. También se investiga la biocompatibilidad del polímero tratado con plasma y la citotoxicidad de las RONS generadas.

[0008] El documento WO15123720 A1 se refiere a un método de tratamiento con plasma que comprende: proporcionar una fuente de plasma y una pantalla que comprende un hidrogel y colocar la pantalla entre la fuente de plasma y una superficie de un objetivo a tratar; y/o poner en contacto una superficie de un objetivo a tratar con la composición de gel que comprende un material formador de gel y una fase líquida que comprende líquido activado por plasma. El documento WO10146438 A1 se refiere al uso de soluciones de colágeno o quitosano tratadas con plasma para la cura de heridas.

[0009] El documento US2019274747 se refiere al uso de RONS generadas por plasma atmosférico frío para tratar el cáncer, en particular el cáncer de páncreas y de mama.

[0010] Existe la necesidad de utilizar composiciones mejoradas en el tratamiento del cáncer, que sean biocompatibles y eficaces.

[0011] Labay, Cedric, et al. (en "Producción de especies reactivas en hidrogeles de alginato para terapias basadas en plasma atmosférico frío". Scientific reports 9.1 (2019): 16160) demuestran que las RONS generadas en soluciones de alginato mostraron potencial citotóxico hacia las células de cáncer óseo.

[0012] Descripción detallada de la invención

[0013] La presente invención proporciona composiciones útiles para el tratamiento del cáncer. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que las composiciones que comprenden una solución polimérica, un material biocerámico que comprende calcio y las RONS, en ciertas concentraciones, son útiles en eliminar células cancerosas sin alterar la viabilidad de las células sanas. Estas composiciones pueden inyectarse o implantarse en el cuerpo, donde liberan las RONS al medio circundante y matan específicamente las células cancerosas.

[0014] Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende una solución acuosa polimérica, un material biocerámico que comprende calcio y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS), en donde dichas RONS comprenden entre 0,68 y 200,00 mg/l de H<2>O<2>y/o entre 0,46 y 36,80 mg/l de NO<2>-<.>

[0016] Tal como se utiliza en el presente documento, la solución acuosa polimérica es una solución a base de agua de una sustancia polimérica. Cuando dicha solución polimérica se polimeriza y/o se reticula, se forma un hidrogel. La solución polimérica también puede denominarse hidrosol, antes de la polimerización o reticulación.

[0018] Tal como se utiliza en el presente documento, un material biocerámico es cualquier material cerámico biológicamente compatible.

[0020] Tal como se utiliza en el presente documento, el término especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS) se refiere a H₂O₂, OH*, NO₂-, NO₃<->y ONOO-. En la presente invención, las RONS de la composición son generadas mediante el tratamiento de la solución acuosa polimérica o de la solución acuosa polimérica y el material biocerámico que contiene calcio, con plasma atmosférico frío. La persona experta en la materia sabe cómo tratar un líquido con plasma atmosférico frío para obtener las concentraciones deseadas de RONS, y se proporcionan más detalles en los ejemplos. En una realización preferida de la presente invención, las RONS en la composición comprenden entre 12,00 y 150,00 mg/l de H<2>O<2>, preferiblemente entre 13,60 y 150,00 mg/l de H<2>O<2>. En una realización preferida, las RONS en la composición comprenden entre 13,80 y 36,80 mg/l de NO<2>-, más preferiblemente entre 18,40 y 36,80 mg/l de NO<2>-.;[0022] En una realización preferida, las RONS en la composición comprenden entre 5,10 y 200,00 mg/l de H₂O₂ y entre 0,46 y 36,80 mg/l de NO<2>-. En otro método preferido las concentraciones de RONS en la composición oscilan entre 0,68 y 150,00 mg/l de H₂O₂, o entre 1,90 y 200,00 mg/l de H₂O₂, o entre 3,00 y 200,00 mg/l de H₂O₂. En una realización preferida, las concentraciones de RONS en la composición oscilan entre 15,30 y 200,00 mg/l de H₂O₂. En otra realización preferida, las concentraciones de RONS en la composición oscilan entre 51,00 y 200,00 mg/l de H₂O₂.;[0024] La concentración de RONS se cuantifica mediante el método del reactivo AR/HRP o el método del reactivo de Griess para H₂O₂ y NO₂-, respectivamente; o bien utilizando tiras de plástico con papel de prueba, que permiten la cuantificación de H₂O₂ basado en una reacción redox y NO₂-, también utilizando el reactivo de Griess. Estos dos métodos arrojan resultados equivalentes, como se muestra en la sección experimental. Por lo tanto, el experto en la materia sabe qué método utilizar para cada solución polimérica en la composición, ya que las soluciones de proteínas pueden causar interferencias con el método del reactivo AR/HRP o el método del reactivo Griess, que se solucionan al utilizar las tiras.;[0026] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, el polímero se selecciona entre gelatina y sus derivados, tales como gelatina metacrilada, fibrina, fibronectina, colágeno y derivados de colágeno, alginato, agarosa, celulosa, celulosa modificada, tal como hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa, goma xantana, polietilenglicol, ácido hialurónico, quitosano, polilactida-co-glicólido, polihidroxialcanoatos y mezclas de los mismos, preferiblemente se selecciona entre gelatina y sus derivados, alginato, colágeno y mezclas de los mismos.;[0028] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, la composición comprende entre el 0,15 % y el 50,00 % en peso de polímero respecto al peso total de la composición, preferiblemente entre el 0,50 % y el 20,00 % en peso de polímero respecto al peso total de la composición, más preferiblemente entre el 1,00 % y el 10,00 % de polímero respecto al peso total de la composición. En realizaciones particulares, la composición comprende entre el 1,00 % y el 5,00 % en peso de polímero respecto al peso total de la composición.;[0030] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, el material biocerámico que comprende calcio comprende fosfato de calcio. En una realización preferida, el material biocerámico que comprende calcio es distinto del carbonato de calcio. Preferiblemente, el material biocerámico que comprende calcio se selecciona entre fosfato tetracálcico, fosfato dicálcico anhidro, fosfato dicálcico dihidratado, alfa-fosfato tricálcico, beta-fosfato tricálcico, fosfato monocálcico monohidratado, hidroxiapatita, hidroxiapatita deficiente en calcio, fluorapatita, fosfato de calcio amorfo, fosfato de calcio, sodio y potasio, fosfato de calcio y sodio, fosfato de calcio y potasio, pirofosfato de calcio, carbonato de calcio, sulfato de calcio, sulfato de calcio hemihidratado, óxido de calcio e hidróxido de calcio, y mezclas de los mismos.;[0032] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, el material biocerámico es hidroxiapatita, brushita, fosfato tricálcico o mezclas de los mismos.;[0034] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, el material biocerámico se presenta en forma de nanopartículas, microesferas, micropartículas, espumas o andamios, o mezclas de los mismos. Cuando el material biocerámico se presenta en forma de nanopartículas, microesferas o micropartículas, la composición puede inyectarse. En estos casos, las composiciones son adecuadas para la formación de implantes tras su inyección en el cuerpo. Cuando el material biocerámico se presenta en forma de espumas o andamios, la composición es adecuada para su implantación en el cuerpo. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden utilizarse para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, ya sea inyectándolas o implantándolas en el cuerpo del sujeto, de modo que las RONS liberadas de la composición destruyan las células cancerosas sin dañar el tejido sano. En una realización preferida de la composición del primer aspecto, esta comprende entre el 0,5 % y el 99,5 % en peso de materiales biocerámicos con respecto al peso total de la composición. Cuando el material biocerámico se presenta en forma de nanopartículas, microesferas o micropartículas, las composiciones comprenden preferiblemente entre el 0,5 % y el 20,0 % en peso de materiales biocerámicos respecto al peso total de la composición, preferiblemente entre el 0,5 % y el 10,0 % en peso de materiales biocerámicos respecto al peso total de la composición. Cuando el material biocerámico se presenta en forma de espumas o andamios, las composiciones contienen preferiblemente entre el 20,0 % y el 99,5 % en peso, preferiblemente entre el 50,0 % y el 85,0 % en peso de materiales biocerámicos respecto del peso total de la composición.;[0035] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, el pH de la composición está entre 5,0 y 8,0, preferiblemente entre 6,0 y 7,5, medido de acuerdo con la norma ASTM E70.;[0036] En una realización preferida de la composición del primer aspecto, la composición comprende además un principio activo farmacéutico. Preferiblemente, el principio activo farmacéutico es un fármaco quimioterapéutico o un coadyuvante en la terapia contra el cáncer. El fármaco también puede ser un antibiótico para prevenir infecciones. Se pueden incorporar/cargar diferentes tipos de fármacos al componente biocerámico de la composición o al componente de hidrogel. Estos pueden incluir fármacos quimioterapéuticos (p. ej., metotrexato, cisplatino, doxorrubicina, ifosfamida, etopósido, bleomicina) u otros agentes terapéuticos, como anticuerpos monoclonales, citocinas e inhibidores específicos de diferentes proteínas relacionadas con la progresión de la enfermedad u otras biomoléculas. En una realización preferida, el fármaco o fármacos están contenidos en el componente biocerámico de la composición. Los fármacos, ya sea en forma libre o encapsulados (liposomas, etc.), pueden permanecer contenidos en el material biocerámico, en el hidrogel o en ambos, y liberarse al medio circundante.;[0037] La composición del primer aspecto de la invención se puede congelar (por ejemplo, utilizando nitrógeno líquido) tras mezclar el hidrogel tratado con plasma y el material biocerámico. Preferiblemente, justo después del tratamiento con plasma del hidrogel, dicho hidrogel se mezcla con el material biocerámico y la composición se congela utilizando nitrógeno líquido.;[0038] Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a la composición del primer aspecto para su uso en el tratamiento del cáncer. Preferiblemente, el cáncer es cáncer óseo, más preferiblemente, osteosarcoma. Tal como se utiliza en el presente documento, el término cáncer óseo se refiere al condrosarcoma, sarcoma de Ewing, osteosarcoma o cáncer óseo metastásico.;[0039] Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a la composición del primer aspecto para su uso en la regeneración de tejido óseo. Los inventores han descubierto que las composiciones de la invención, además de ser útiles para la eliminación selectiva de células cancerosas, también son útiles favoreciendo la regeneración del tejido óseo, por su biocompatibilidad y gracias al componente biocerámico.;[0040] Un cuarto aspecto de la presente invención es un proceso para preparar las composiciones del primer aspecto, que comprende los siguientes pasos: (a) preparar una solución acuosa polimérica, (b) añadir un material biocerámico que comprende calcio, (c) tratar la solución del paso (a) o la solución con el material biocerámico que comprende calcio del paso (b) con plasma atmosférico frío de manera que la solución comprenda entre 0,68 y 102,00 mg/l de H<2>O<2>y/o entre 0,46 y 36,80 mg/l de NO<2>-<.>;[0041] Descripción de las Figuras;[0042] Figura 1: Imagen SEM de la composición del Ejemplo 6 después de la liofilización.;[0043] Figura 2: Imagen SEM de la muestra de composición liofilizada del ejemplo 8 sin RONS (A) y con RONS (B). Figura 3: Ejemplo de reconstrucción del andamio 3D (A), e imagen SEM de la composición liofilizada del Ejemplo 9 (B).;[0044] Figura 4: Imagen SEM que muestra el crecimiento óseo dentro de la composición del Ejemplo 9.;[0045] Figura 5: Imagen SEM de la composición liofilizada del Ejemplo 10.;[0046] Figura 6: Liberación de doxorrubicina (DOX) de la composición del Ejemplo 11 (donde las microesferas de cemento de fosfato de calcio (CPC) se han cargado previamente con doxorrubicina) y un hidrogel sin tratar con microesferas de CPC cargadas con DOX al medio de liberación de agua MilliQ. Se pusieron en contacto 200 µl de la composición con 1 ml de agua MilliQ.;[0047] Ejemplos;[0048] Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor, pero no para limitar, esta invención.;[0049] Materiales;[0050] Gelatina tipo B (Rousselot 250 LBS, Rousselot, Francia), alginato de sodio (PM: 10000-600000 g/mol) (Panreac, EE. UU.), ambos en polvo, y agua MilliQ (MilliPore, Merck) se utilizaron para la preparación de soluciones poliméricas. Se utilizó argón (Ar 5.0, PRAXAIR, España) como gas precursor para la generación de APP en soluciones poliméricas.;[0051] Sulfanilamida (Sigma Aldrich, EE.UU.), N-(1-naftil)etilendiamina dihidrocloruro (Sigma Aldrich, EE. UU.) y ácido ortofosfórico 85 %, puro, grado farmacéutico (USP-NF, BP, Ph. Eur.) (H3PQ4) (85 %) (Panreac, EE. UU.) se utilizaron para la preparación del reactivo de Griess, utilizado para la detección de NO₂. Se utilizó NaNO₂ (nitrito de sodio, Sigma Aldrich, EE. UU.) para las curvas de calibración de nitritos. El reactivo Amplex™ Red (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific) y la peroxidasa de rábano picante ‘Horseradish’(tipo VI) (HRP) (Sigma Aldrich) se utilizaron para la determinación de H₂O₂ en soluciones líquidas. Se utilizó una solución de H₂O₂ al 30 % (p/p) (Sigma Aldrich) para la curva de calibración para la detección de H₂O₂ en agua MilliQ.;[0052] Las células osteogénicas de sarcoma (SaOs-2, ATCC, EE. UU.) se expandieron en medio de cultivo McCoy SA (Sigma Aldrich). El suero fetal bovino (FBS) y la penicilina/estreptomicina (P/S) (50 U/ml y 50 µg/ml, respectivamente) se adquirieron de Invitrogen. Se cultivaron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (hMSC, PCS-500-012, #70014245, ATCC, EE. UU.) en medio Eagle de Dulbecco avanzado (1X) (AdvDMEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific). En todos los experimentos se utilizaron células de entre los pasajes 24 y 32. Para la determinación de la viabilidad celular se utilizó el reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche Diagnostics GmbH, ref. 05015944001) y el reactivo de viabilidad celular PrestoBlue™ (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, ref. A13261).;[0053] Métodos;[0054] Preparación de las soluciones poliméricas.;[0055] Se prepararon diferentes soluciones poliméricas disueltas en agua o soluciones salinas acuosas, a las concentraciones adecuadas, de polímeros como fibrina, fibronectina, colágeno, alginato, gelatina, etc., y sus mezclas. A modo de ejemplo, a continuación se describe detalladamente el procedimiento seguido para la preparación de soluciones de alginato y gelatina:;[0056] Las soluciones de alginato se obtuvieron mezclando el polvo seco de alginato de sodio con agua desionizada en un mezclador SpeedMixer (DAC 150.1 FVZ-k, 3500 rpm) durante 15 min al 0,5 % p/p. Las soluciones también pueden obtenerse agitando con un agitador convencional durante más tiempo.;[0057] Para la preparación de soluciones de gelatina, se mezcló gelatina en polvo con agua MilliQ a 37 ºC con agitación magnética durante 2 horas para obtener una solución de gelatina al 2 % en peso. Las soluciones de gelatina se almacenaron a 4 °C y se utilizaron en un plazo de 2 semanas. Tanto la solución de gelatina como la de alginato se filtraron a 37 °C con un filtro de jeringa de 0,22 µm antes de los experimentos celulares (Millipore, Merck). Para los ensayos celulares, todos los procesos necesarios para la preparación de la solución polimérica o hidrogel se llevaron a cabo en condiciones estériles.;[0058] Tratamientos con plasma.;[0059] En los ejemplos presentados, se utilizaron dos tipos de chorros de plasma atmosférico: un chorro de plasma atmosférico frío klNPen IND (NEOPLAS Tools, Alemania), comercializado, que opera con argón, y un chorro de plasma a presión atmosférica (APPJ) que utiliza He como gas de plasma en un diseño de chorro basado en un solo electrodo. El flujo de gas se reguló entre 1 y 2,5 l/min para klNPen y entre 1 y 5 l/min para APPJ, utilizando Ar y He, respectivamente. Se utilizaron controladores de flujo Bronkhorst Mass View (BRONKHORST, Países Bajos). Todos los tratamientos con plasma de soluciones poliméricas para la cuantificación de RONS se realizaron con 200 µl de la solución polimérica en placas de 96 pocillos, con una distancia entre la fuente de plasma y la superficie de la muestra de entre 10 y 20 mm. Estos tratamientos con plasma se realizaron con muestras sin toma a tierra. Tanto las muestras con o sin toma a tierra pueden utilizarse para obtener las composiciones de la presente invención, ya que el experto en la materia puede fijar las condiciones de tratamiento del plasma para obtener las concentraciones de RONS deseadas.;[0060] Preparación de las composiciones;[0061] Para preparar las composiciones de la presente invención, las soluciones poliméricas tratadas con plasma se mezclaron con el biomaterial que contiene calcio. El método de mezcla y preparación de las composiciones puede variar según la morfología o forma del material que contiene calcio. En el caso de las nanopartículas de fosfato de calcio, la mezcla con la solución polimérica puede realizarse manualmente, en un sistema de doble jeringa, utilizando un SpeedMixer o cualquier otro método que garantice una dispersión homogénea. En este caso, la mezcla puede realizarse con una solución polimérica que contenga RONS o, alternativamente, tratar la composición con plasma para transferir las RONS a la composición tras mezclar la solución polimérica y la fase de fosfato de calcio. Si el tratamiento con plasma se aplica a la composición que comprende la solución polimérica y el material que contiene calcio, este debe aplicarse antes de la polimerización o la reticulación (gelificación) del polímero.;[0063] En el caso de biocerámicos en forma de andamios, la mezcla debe realizarse con las soluciones poliméricas con RONS, pudiendo considerarse diferentes métodos: por inmersión, empleando dos jeringas, adición gota a gota, etc.;[0065] Detección de RONS en las soluciones poliméricas.;[0067] Se realizó la determinación de la concentración de NO<2>-;en soluciones poliméricas tratadas con plasma utilizando reactivo de Griess. El reactivo de Griess utilizado se obtuvo disolviendo 1 % p/v de sulfanilamida, 0,1 % p/v de N-(1-naftil)etilendiamina dihidrocloruro y 5 % p/v de ácido fosfórico en agua desionizada. Se añadieron 200 µl de reactivo de Griess en 200 µl de muestra en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. La absorbancia se midió a λ<abs>= 540 nm con un lector de placas híbrido multimodo Synergy HTX (BioTek Instruments, Inc., EE. UU.). La [NO₂-] en cada muestra se determinó a partir de los valores de absorbancia mediante el uso de una curva de calibración realizada a partir de diluciones de NaNO<2>en las correspondientes soluciones poliméricas.;[0069] La concentración de peróxido de hidrógeno se determinó mediante la reacción de H₂O₂ con Amplex Red en presencia de la enzima HRP, lo que produce resorufina, un producto fluorescente. El reactivo Amplex Red/HRP consiste en 100 µM de Amplex Red y 0,25 U/ml de HRP en agua desionizada. Dado que la concentración máxima de H₂O₂ que puede ser procesada adecuadamente por este reactivo es de alrededor de 10 µM de H₂O₂, las soluciones poliméricas tratadas con plasma se diluyeron 200 veces antes de la adición del reactivo. En este caso, para la detección de peróxido de hidrógeno, se añadieron 50 µl del reactivo Amplex Red/HRP a 200 µl de la muestra de solución polimérica diluida 200 veces en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Las mediciones de fluorescencia posteriores se realizaron con el Lector de placas Synergy HTX Hybrid Multimodal (BioTek Instruments, Inc., EE. UU.), con filtros de fluorescencia centrados en λ<ex>= 560/20 nm y λ<em>= 590/20 nm como longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. Las concentraciones de H₂O₂ en la solución polimérica generada por tratamiento con plasma se obtuvieron a partir de los valores de fluorescencia utilizando una curva de calibración elaborada con una solución de peróxido de hidrógeno al 30 % en las soluciones poliméricas correspondientes.;[0070] Además, se empleó la sonda química cumarina (Sigma Aldrich, EE. UU.) para detectar radicales hidroxilo (-OH). Se prepararon diferentes soluciones poliméricas en 1 mM de cumarina y se evaluaron diferentes tiempos de tratamiento con plasma. En solución, los radicales OH reaccionan con la cumarina, dando lugar a un producto fluorescente: 7-hidroxicumarina (7-hC). La intensidad de fluorescencia de 500 µl de soluciones tratadas con plasma se midió con el Lector de placas Synergy HTX Hybrid Multimodal (λ<ex>/<em>= 360/460). Para calcular la tasa de producción de este producto fluorescente, se prepararon curvas de calibración con 7-hC (Sigma Aldrich, EE. UU.).;[0072] En ciertas soluciones poliméricas, pueden encontrarse interferencias entre la solución y los reactivos, lo que invalida la medición. En estos casos, se utilizó otro método para determinar la concentración de H₂O₂, NO₃<->y NO₂<->en las soluciones poliméricas tras el tratamiento con plasma: tiras reactivas QUANTOFIX®, analizadas mediante un fotómetro de reflexión (QUANTOFIX® Relax, de Macherey Nagel). Las tiras reactivas consisten en tiras de plástico selladas con papel de prueba. Las tiras de nitrito también contienen reactivo de Griess. Las tiras de peróxido también utilizan una reacción redox. El rango de detección de las tiras reactivas utilizadas para H₂O₂, NO₃<->y NO₂<->fue de 1-100 mg/l, 10-500 mg/l y 1-80 mg/l, respectivamente. Las soluciones poliméricas tratadas con plasma se diluyeron, si era necesario, para estar dentro del rango de medición.;[0074] Para comprobar si los valores de las concentraciones de RONS obtenidos con los dos métodos descritos anteriormente eran equivalentes, se probaron diferentes soluciones con ambos métodos.;[0076] Se prepararon soluciones de concentraciones conocidas (100, 50, 25 y 12,5 mg/l para peróxido de hidrógeno y 8,28, 4,14, 2,07, 1,035 mg/l para nitritos), y la concentración de peróxido de hidrógeno se midió tanto con el método AR/HRP como con el método de tiras, mientras que la concentración de NO₂<->se midió tanto con el método del reactivo de Griess como con el método de tiras.;[0078] Las cuatro diluciones diferentes de H₂O₂ al 30 % se prepararon en agua o en una solución acuosa de alginato al 0,5 % en peso, y la concentración de H₂O₂ se analizó con ambos métodos. Se analizaron tres réplicas para cada punto. Como se muestra en la siguiente tabla, ambos métodos arrojan resultados equivalentes:;[0079] ;[0081] Las cuatro diluciones de NaNO₃ se prepararon en agua o en una solución acuosa de alginato al 0,5 % en peso, y la concentración de NO₃ se analizó con ambos métodos. Se analizaron tres réplicas para cada punto. Como se muestra en la siguiente tabla, ambos métodos arrojan resultados equivalentes:;[0084] ;[0086] Por lo tanto, para la presente invención, la concentración de RONS se determina utilizando el método del reactivo AR/HRP y el método del reactivo Griess, o el método de tiras.;[0087] Control del pH.;[0088] La solución polimérica se colocó en placas de 24 pocillos y se trató utilizando klNPen o APPJ (10 mm, 1 l/min). El pH se midió utilizando un instrumento multiparamétrico PC80 (XS Instruments, Italia) con un electrodo Crison 5014 (Crison, España).;[0089] Microscopio electrónico de barrido (SEM).;[0090] Las composiciones se liofilizaron y se recubrieron con carbono utilizando un EMITECH K950X Turbo Evaporador (Quorum Technologies Ltd., Reino Unido). Las imágenes de todas las muestras se obtuvieron con un microscopio electrónico de barrido (SEM) Phenom XL (Phenom-World BV, Países Bajos) en condiciones de alto vacío a 5 kV y una distancia de trabajo de 5 mm.;[0091] Liberación de RONS.;[0092] Se trataron 200 µl de la solución polimérica en una placa de 96 pocillos con klNPen durante 90 s, a 10 mm y 1 l/min, y con APPJ durante 15 min, a 10 mm y 1 l/min.;[0093] Después del tratamiento con plasma, la solución polimérica se transfirió a un inserto para cultivo celular con membrana de poliéster CORNING Transwell (Sigma-Aldrich), con un diámetro de 6,5 mm y un tamaño de poro de 0,4 µm, y se colocó en suspensión en 1 ml de medio de cultivo celular en placas de 24 pocillos. Para el control de la cinética de liberación de RONS desde los hidrogeles, se retiraron, en momentos determinados, 100 µl del medio de cultivo celular utilizado como medio de liberación, para la posterior cuantificación de NO₂⁻ y H₂O₂. Después de cada toma de muestra, se añadieron 100 µl de medio fresco. Los volúmenes finales del medio de liberación se midieron al final del experimento de liberación para considerar la corrección de volumen en los cálculos de concentración de NO₂⁻ y H₂O₂. La cuantificación de NO₂⁻ y H₂O₂ se realizó como se describe en la sección anterior.;[0094] Experimentos celulares in vitro.;[0095] Cultivo celular.;[0096] Se utilizó sarcoma osteogénico (SaOS-2) para estudiar la citotoxicidad de los hidrogeles y las composiciones. El medio de cultivo celular consistió en McCoy SA con 10 % de FBS y 1 % P/S. Las células se cultivaron en matraces de cultivo celular de 75 cm² a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO₂ y, al alcanzar una confluencia del 80 %, se separaron las células SaOS-2 del matraz con tripsina (Invitrogen, Thermofisher) y se sembraron 10000 células/pocillo en placas de 24 pocillos con 1 ml de volumen del medio de cultivo. Tras 6 h de adhesión, se introdujeron soluciones poliméricas estériles tratadas con plasma, previamente preparadas en condiciones estériles, en un inserto de cultivo celular con membrana de poliéster CORNING Transwell y se suspendieron en el pocillo para evaluar el efecto del tratamiento con plasma klNPen y APPJ de la solución polimérica en la viabilidad de las células SaOs-2. Como control positivo, se colocó el mismo número de células sin añadir solución ni composición polimérica. Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO₂ durante 72 h adicionales.;[0097] Se utilizaron células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (hMSC) para evaluar la selectividad de la citotoxicidad de los hidrogeles tratados con plasma entre líneas celulares cancerosas y sanas. El medio de cultivo celular de hMSC consistió en AdvDMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de P/S. La siembra, la densidad celular y el diseño experimental de hMSC se reprodujeron en las mismas condiciones que las presentadas anteriormente con SaOS-2. La viabilidad celular de hMSC se evaluó a las 72 horas para células en presencia de solución polimérica sin tratar (UT) y solución polimérica tratada con plasma en diferentes tiempos de tratamiento. La viabilidad celular a las 24 y 72 horas se evaluó con el reactivo WST-1, siguiendo el protocolo del proveedor. La absorbancia se midió a una λ<abs>de 440 nm utilizando un lector de placas híbrido multimodo Synergy HTX (BioTek Instruments, Inc., EE. UU.). La normalización de los valores de absorbancia se realizó únicamente con respecto a las células para determinar los efectos de la solución polimérica Gel/Alg sin tratar y tratada con plasma sobre la viabilidad celular de SaOS-2.;[0098] Viabilidad celular.;[0099] La influencia de las soluciones poliméricas tratadas con plasma en la viabilidad celular de SaOs-2 o hMSCs se evaluó para klNPen y APPJ (10 mm, 1 l/min) con tratamientos de plasma de 90 y 180 s. También se estudiaron las soluciones poliméricas tratadas con plasma tras 180 s de tratamiento con APPJ y klNPen. La viabilidad celular se evaluó a las 0, 24 y 72 horas. El medio de cultivo celular se reemplazó por una preparación que contenía 250 µl del reactivo de proliferación celular WST-1 en medio de cultivo McCoy's SA (1:10) y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente, se transfirieron 100 µl del sobrenadante a otro pocillo para la medición de absorbancia a 440 nm. Para evaluar los efectos de las soluciones poliméricas, tanto no tratadas como tratadas con plasma, en la viabilidad celular de SaOs-2, los valores se normalizaron con respecto al pocillo que contenía únicamente células.;[0100] Rango de concentraciones de especies reactivas generadas en la solución polimérica;[0101] A continuación, se muestran las concentraciones de especies reactivas generadas por el tratamiento con plasma a presión atmosférica en 200 µl de solución polimérica (gelatina/alginato como en el Ejemplo 1) y en 1 ml de solución polimérica, en diferentes tiempos de tratamiento.;[0104] ;[0105] continuación;[0106] ;[0107] ;[0108] ;[0109] ;[0110] Ejemplo 0;[0111] La gelatina en polvo se mezcló con agua MilliQ a 37 °C usando agitación magnética durante 2 horas para obtener un gel de gelatina al 2 % en peso.200 µl de esta solución de gelatina se trataron con dos tipos de chorro de plasma a presión atmosférica: i) klNPen IND® (Neoplas, Alemania) operando con argón, con un flujo de gas de 1 l/min y una distancia de 10 mm, y ii) APPJ (un chorro de plasma a presión atmosférica de fabricación casera) operando con helio, con un flujo de gas de 1 l/min y una distancia de 10 mm. Se cuantificaron las especies reactivas generadas tras diferentes tiempos de tratamiento con plasma. Dicha solución de gelatina tratada con plasma se utilizó en ensayos de viabilidad celular en una línea celular de osteosarcoma (SaOS-2).;[0114] ;[0116] Las concentraciones de especies reactivas generadas en las soluciones de gelatina tras el tratamiento con plasma son superiores a las divulgadas hasta ahora, y los hidrogeles de gelatina que contienen dichas concentraciones de RONS muestran una citotoxicidad mejorada sobre la línea celular de osteosarcoma SaOS-2.;[0119] ;[0121] Ejemplo 1;[0122] Se preparó una mezcla 50/50 de soluciones de 0,5 % en peso de alginato y 2 % en peso de gelatina (concentración final de 0,25 % en peso de alginato y 1 % en peso de gelatina).;[0123] La mezcla de alginato/gelatina se preparó mediante agitación en vórtex en una proporción 1:1, con un 2 % en peso de gelatina y un 0,5 % en peso de alginato, durante 2 minutos. La gelatina en polvo se mezcló con agua Milli-Q a 37 °C mediante agitación magnética durante 2 horas para obtener un gel de gelatina al 2 % en peso. El alginato al 0,5 % se preparó mezclando polvo de alginato con agua Milli-Q utilizando un SpeedMixer™ DAC 150,1 FVZ-K (SpeedMixer™, Alemania) a 3500 r.p.m. durante 15 minutos.;[0124] La mezcla acuosa de 0,25 % en peso de alginato y 1 % en peso de gelatina fue tratada con un chorro de plasma a presión atmosférica klNPen IND® (Neoplas, Alemania) operando con argón para generar plasma. Condiciones del tratamiento: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm y tratamiento durante 180 segundos. El tratamiento se realizó en 200 µl de la mezcla en una placa de 96 pocillos.;[0125] Dicha mezcla tratada con plasma produjo las siguientes concentraciones de especies reactivas en el material:;[0126] ;[0128] Todos los valores tienen una variabilidad de ± 20 % debido al método de medición.;[0129] Como se muestra en la tabla, los valores de especies reactivas obtenidos en la composición del ejemplo 1 son varias veces superiores a los generados en agua.;[0130] Dicha mezcla tratada con plasma se utilizó en ensayos de viabilidad celular tanto en una línea celular de osteosarcoma (SaOS-2) como en células sanas (células madre mesenquimales de médula ósea humana o hBM-MSC):;[0133] ;[0135] La composición del ejemplo 1 muestra selectividad de la solución polimérica tratada con plasma en la línea de células cancerosas, permitiendo la supervivencia de células sanas (hBM-MSC) después de 72 horas.;[0136] Ejemplo 2;[0137] Una mezcla acuosa compuesta por 0,25 % en peso de alginato y 1 % en peso de gelatina se trató con un chorro de plasma a presión atmosférica klNPen IND® (Neoplas, Alemania) que operaba con argón para generar plasma. Condiciones de tratamiento: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm y 300 segundos de tratamiento. El tratamiento se realizó con 200 µl de mezcla en una placa de 96 pocillos. La mezcla tratada con plasma produjo las siguientes concentraciones de especies reactivas en el material, que son mucho más altas que en el agua:;[0140] ;[0142] Todos los valores presentan una variabilidad de ±20 % debido al método de medición.;[0143] Dicha mezcla tratada con plasma se utilizó en ensayos de viabilidad celular tanto en una línea celular de osteosarcoma (SaOS-2) como en células control (células madre mesenquimales de médula ósea humana, hBM-MSC):;[0146] ;[0148] La composición del ejemplo 2 también muestra selectividad de la solución polimérica tratada con plasma en la línea de células cancerosas, permitiendo la supervivencia de células sanas (hBM-MSC) después de 72 horas.;[0149] Ejemplo 3;[0150] Una mezcla acuosa compuesta por 0,25 % en peso de alginato y 1 % en peso de gelatina se trató con un chorro de plasma a presión atmosférica operando con helio para generar plasma. Condiciones de tratamiento: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm y 180 segundos de tratamiento. El tratamiento se realizó con 200 µl de mezcla en una placa de 96 pocillos.;[0151] Dicha mezcla tratada con plasma produjo las siguientes concentraciones de especies reactivas en el material, que son mucho más altas que las producidas en el agua:;[0152] ;[0154] Todos los valores tienen una variabilidad de ± 20 % debido al método de medición.;[0155] Dicha mezcla tratada con plasma se utilizó en ensayos de viabilidad celular tanto en una línea celular de osteosarcoma (SaOS-2) como en células de control (células madre mesenquimales de médula ósea humana o hBM-MSC):;[0158] ;[0160] La composición del Ejemplo 3 también muestra selectividad de la solución polimérica tratada con plasma en la línea de células cancerosas, lo que permite la supervivencia de células sanas (hBM-MSC) después de 72 horas.;[0161] Ejemplo 4;[0162] Se trató una mezcla acuosa que comprendía 0,25 % en peso de alginato y 1 % en peso de gelatina con un chorro de plasma a presión atmosférica que funcionan con helio para generar plasma. Condiciones de tratamiento: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm y 300 segundos de tratamiento. El tratamiento se realizó con 200 µl de mezcla en una placa de 96 pocillos.;[0163] Dicha mezcla tratada con plasma produjo las siguientes concentraciones de especies reactivas en el material, que son mucho más altas ue las roducidas en el a ua:;[0166] ;[0168] Todos los valores tienen una variabilidad de ± 20 % debido al método de medición.;[0169] Dicha mezcla tratada con plasma se utilizó en ensayos de viabilidad celular tanto en una línea celular de osteosarcoma (SaOS-2) como en células de control (células madre mesenquimales de médula ósea humana o hBM MSC):;[0172] ;[0174] Ejemplo 5;[0175] Las composiciones de los Ejemplos 1 a 4 se prepararon con un 5 % en peso de microesferas (MS) de hidroxiapatita deficientes en calcio, que se añadieron y se mezclaron en vórtex durante 2 min. El diámetro de las microesferas fue de 100 µm < Ø < 150 µm. Las composiciones se liofilizaron para realizar la microscopía electrónica de barrido. El Ejemplo 5 corresponde a la composición del Ejemplo 1 (tratamiento de 5 min con klNPen de la mezcla de alginato/gelatina) 5 % en peso de microesferas de hidroxiapatita deficientes en calcio. La cantidad de especies reactivas en la composición es proporcional al porcentaje de solución polimérica de los ejemplos 1 a 4. La cantidad de RONS no se vio afectada por la adición del material biocerámico.;[0176] La concentración de especies reactivas generadas por el plasma en la solución polimérica y en la composición después de agregar el material biocerámico es equivalente, como se puede ver a continuación:;[0177] ;[0179] Las especies generadas en la composición del Ejemplo 5 pueden liberarse a un medio circundante y conservarse al menos durante 24 horas:;[0182] ;[0186] ;[0188] Dicho Ejemplo 5 se utilizó en ensayos de viabilidad celular en la línea celular de osteosarcoma (SaOS-2):;[0191] ;[0193] Ejemplo 6;[0194] El Ejemplo 6 corresponde a la composición del Ejemplo 2 (tratamiento con klNPen de 5 min de la mezcla de alginato/gelatina) 5 % en peso de microesferas de hidroxiapatita deficientes en calcio. La composición se liofilizó y se fotografió en SEM (Figura 1). La cantidad de especies reactivas en la composición fue proporcional al porcentaje de solución polimérica de los ejemplos 1 a 4. La cantidad de RONS no se vio afectada por la adición del material biocerámico.;[0195] La concentración de especies reactivas generadas por el plasma en la solución polimérica y en la composición después de agregar el material biocerámico es equivalente, como se puede ver a continuación:;[0198] ;[0200] Dicho Ejemplo 6 se utilizó en ensayos de viabilidad celular en la línea celular de osteosarcoma (SaOS-2):;[0203] ;[0205] Ejemplo 7;[0206] Las composiciones de los Ejemplos 1 a 4 se prepararon con un 5 % en peso de nanopartículas de hidroxiapatita. Se evaluó su inyectabilidad y se observó que todas eran completamente inyectables;[0207] Ejemplo 8;[0208] Se preparó una composición que comprende una solución acuosa polimérica que contiene gelatina al 6,5 % en peso, fibrinógeno a 10 mg/ml, aprotinina a 1 µg/ml y nanopartículas de hidroxiapatita al 0,5 % en peso. Condiciones del tratamiento con plasma: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm y tratamiento durante 5 minutos, realizado sobre 1000 µl de la composición (Figura 2). La inyectabilidad siempre fue buena, con valores ligeramente más altos para las composiciones que incluyen RONS, pero manteniendo una inyectabilidad adecuada para su uso.;[0209] Ejemplo 9;[0210] Se trató una composición que comprende una solución acuosa polimérica que contiene 0,25 % en peso de alginato y 1 % en peso de gelatina con un chorro de plasma a presión atmosférica klNPen IND operando con argón para generar plasma. Condiciones del tratamiento: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm y tratamiento durante 180 segundos. El tratamiento se realizó en 200 µl de la mezcla en una placa de 96 pocillos, y luego de añadió un andamio de fosfato de calcio, obteniendo una composición con un 55 % en peso final de hidroxiapatita deficiente en calcio, respecto al peso total de la composición. En este ejemplo, la solución polimérica está incrustada dentro del andamio impreso en 3D (Figura 3). Esta composición se implantó en un defecto de cóndilo de 5 mm en conejos sanos de Nueva Zelanda. Los animales fueron sacrificados dos meses después del procedimiento quirúrgico y la regeneración ósea fue evaluada mediante micro-tomografía computarizada y SEM. La composición del Ejemplo 9 (Andamio hidrogel que contiene RONS generados por plasma) demostró seguridad in vivo, permitiendo una regeneración ósea equivalente a la misma composición sin RONS (Andamio hidrogel sin tratamiento con plasma) (Figura 4). La cantidad de hueso regenerado en los andamios se cuantificó a partir de las imágenes de microtomografía computarizada. Considerando que la degradación del andamio puede ser despreciable, el volumen de macroporos corresponde a la suma de hueso recién formado y píxeles de vacío. Por lo tanto, la regeneración ósea promedio se calculó como BV/MV, siendo BV el volumen de hueso recién formado y MV el volumen de los macroporos. La regeneración ósea promedio se calculó y se expresó como media ± desviación estándar (DE).;[0213] ;[0215] El porcentaje de regeneración ósea equivalente en ambas muestras confirma la seguridad de la composición tratada con plasma. La composición del Ejemplo 9 no impide la proliferación de células óseas sanas del conejo y permite un crecimiento óseo similar al de los injertos óseos basados en biocerámicos. Por lo tanto, la composición del Ejemplo 9 puede ser utilizada para tratar el cáncer óseo, ya que no daña las células sanas y permite la regeneración ósea.;[0216] Ejemplo 10;[0217] Se preparó una composición que comprende una solución acuosa de colágeno tipo I a 4 mg/ml y un 58 % en peso seco de nanopartículas de hidroxiapatita. La composición se liofilizó para su análisis por SEM (Figura 5).;[0218] Ejemplo 11;[0219] Se preparó una composición como la del Ejemplo 5, en la que las microesferas de fosfato de calcio (CPC) habían sido previamente cargadas con doxorrubicina. Como control, se ensayaron microesferas de CPC cargadas con DOX en hidrogel no tratado para la liberación de RONS. Se pusieron en contacto 200 µl de la composición con 1 ml de agua Milli-Q. La Figura 6 muestra que la carga de especies reactivas dentro del hidrogel no afecta la liberación del principio activo (doxorrubicina) del biomaterial.;[0220] Ejemplo 12;[0221] Se preparó una composición que comprende una solución de gelatina metacrilatada (GelMA) al 2 % en peso, la cual fue tratada con plasma. Se observó que se obtuvieron mayores cantidades de RONS en dicha composición que en un tampón salino fosfato (PBS) utilizando el mismo tratamiento.;[0224] ;[0226] Ejemplo 13;[0227] Se preparó una composición que comprende una solución polimérica que contiene metilcelulosa al 1 % en peso solubilizada en una solución de fosfato que contiene 200 mM de Na<2>HPO<4>, la cual fue tratada con un chorro de plasma a presión atmosférica klNPen IND® (Neoplas, Alemania) operando con argón para generar plasma.;[0228] Condiciones del tratamiento: flujo de gas de 1 l/min, distancia a la boquilla de 10 mm. El tratamiento se realizó en 1000 µl de solución en una placa de 24 pocillos. Dicha solución tratada con plasma produjo las siguientes concentraciones de RONS en el material:;[0231] ;[0233] Además, se estimó la tasa de producción de radicales hidroxilo (OH*) durante el tratamiento con plasma utilizando la sonda química cumarina. Dicha solución tratada con plasma produjo las siguientes concentraciones de 7-hidroxicumarina (7-hC) en el material, lo que da como resultado una tasa de formación de 0,0002 µM/s:

[0236]

[0238] Ejemplo 14

[0239] Se preparó una composición que comprende una mezcla de alginato/gelatina, como la descrita en el Ejemplo 2, tratada durante 5 minutos con el tratamiento de klNPen, la cual se mezcló con un 1 % en peso de microesferas de hidroxiapatita deficiente en calcio, que habían sido cargadas con doxorrubicina (1 %). La cantidad de especies reactivas en la composición es la misma que la de los Ejemplos 2 y 6, ya que la cantidad de RONS no se vio afectada por la adición del material biocerámico. Las microesferas tenían un tamaño de entre 100 y 150 micrones de diámetro (de 0 % a 5 % de carga del fármaco). El tratamiento con plasma se realizó en 1 ml en placas de 24 pocillos con klNPen; Argón; 10 mm; 1 l/min; 5 min. Se puede observar un efecto sinérgico en la citotoxicidad de las células cancerosas con la combinación de doxorrubicina contenida en las microesferas y RONS provenientes del hidrogel de alginato/gelatina. En este sentido, la cantidad de doxorrubicina se puede reducir hasta 4 veces cuando las RONS se proporcionan simultáneamente a través del hidrogel. La siguiente tabla muestra la viabilidad de las células MG63 en presencia de las microesferas (MS) de hidroxiapatita cargadas con 1, 2, 3, 4 o 5 % de doxorrubicina y en presencia de las microesferas de hidroxiapatita cargadas con 1 % de doxorrubicina en combinación con hidrogeles de alginato/gelatina (HG) no tratados (UT) o tratados con plasma (PT):

[0242]

[0244] Se sembraron 20.000 células MG63 por pocillo en medio de cultivo celular DMEM en placas de 24 pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas. Antes de añadir el material, se cambió el medio de cultivo celular (DMEM-Pyr). Dos horas después, se añadieron 200 µl de material. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C; 95 % humedad.; 5 % CO<2>.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una solución acuosa polimérica, un material biocerámico que comprende calcio y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS), donde dichas RONS comprenden entre 0,68 y 200,00 mg/l de H<2>O<2>y/o entre 0,46 y 36,80 mg/l de NO<2>-.

2. La composición según la reivindicación anterior, en donde dichas RONS comprenden entre 12,00 y 150,00 mg/l de H<2>O<2>, preferiblemente entre 13,60 y 150,00 mg/l de H<2>O<2>.

3. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas RONS comprenden entre 13,80 y 36,80 mg/l de NO<2>-, preferiblemente entre 18,40 y 36,80 mg/l de NO<2>-<.>

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polímero se selecciona entre gelatina, gelatina metacrilada, fibrina, fibronectina, colágeno, alginato, agarosa, celulosa, celulosa modificada, como hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa, goma xantana, polietilenglicol, ácido hialurónico, quitosano, poli(ácido láctico-co-glicólico), polihidroxialcanoatos y sus mezclas; preferiblemente, se selecciona entre gelatina, alginato, colágeno y sus mezclas.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición comprende entre 0,15 y 50,00 % en peso de polímero respecto al peso total de la composición, preferiblemente entre 0,50 y 20,00 % en peso de polímero respecto al peso total de la composición.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material biocerámico que comprende calcio, preferiblemente comprende fosfato de calcio y se selecciona entre fosfato tetracálcico, fosfato dicálcico anhidro, fosfato dicálcico dihidratado, alfa-fosfato tricálcico, beta-fosfato tricálcico, fosfato monocálcico monohidratado, hidroxiapatita, hidroxiapatita deficiente en calcio, fluorapatita, fosfato de calcio amorfo, fosfato de calcio, sodio y potasio, fosfato de calcio y sodio, fosfato de calcio y potasio, pirofosfato de calcio, carbonato de calcio, sulfato de calcio, sulfato de calcio hemihidratado, óxido de calcio e hidróxido de calcio, y sus mezclas.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material biocerámico es hidroxiapatita, brushita, fosfato tricálcico o mezclas de los mismos.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material biocerámico está en forma de nanopartículas, microesferas, micropartículas, espumas o andamios, o mezclas de los mismos.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición comprende entre 0,5 y 99,5 % en peso de materiales biocerámicos respecto al peso total de la composición.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el pH de la composición es entre 5,0 y 8,0, preferiblemente entre 6,0 y 7,5, medido de acuerdo con la norma ASTM E70.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un ingrediente farmacéutico activo.

12. La composición según la reivindicación anterior, en donde el ingrediente farmacéutico activo es un fármaco quimioterapéutico o un coadyuvante en la terapia contra el cáncer.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento del cáncer óseo.

14. La composición para su uso según la reivindicación 13, en el tratamiento del osteosarcoma.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la regeneración del tejido óseo.