ES3053688T3 - Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona promotores aislados, casetes de expresión de transgenes, vectores, kits y métodos para el tratamiento de enfermedades genéticas que afectan a las células cónicas de la retina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Promotores, casetes de expresión, vectores, kits y métodos para el tratamiento de acromatopsia y otras enfermedadesSolicitudes relacionadas

[0003] La presente solicitud reivindica la prioridad respecto de la solicitud provisional de EE. UU. 61/824.071, presentada el 16 de mayo de 2013, cuyos contenidos completos se incorporan por referencia en su totalidad en el presente documento.

[0004] Antecedentes de la invención

[0005] La acromatopsia es una enfermedad retiniana autosómica recesiva caracterizada por una agudeza visual marcadamente reducida, nistagmo, fotofobia grave en condiciones de luz diurna y pérdida reducida o completa de la discriminación del color (Kohl, S.et al.Achromatopsia. En: Pagon RA, Bird TC, Dolan CR, Stephens K, editores Gene Reviews [Internet], Seattle: University of Washington; 2010). Puede ser parcial o completa. Véase Pang, J.-J.et al.(2010). Achromatopsia as a Potential Candidate for Gene Therapy. EnAdvances in Experimental Medicine and Biology,Volumen 664, Parte 6, 639-646 (2010) (en lo sucesivo en el presente documento Panget al). Los síntomas de la acromatopsia incluyen agudeza visual reducida, acromatopsia (falta de percepción del color), hemeralopía (capacidad visual reducida en condiciones de luz brillante acompañada de fotoaversión, que significa aversión o evitación de la luz brillante), nistagmo (movimiento oscilatorio incontrolado de los ojos), anomalías en el funcionamiento del iris y visión estereoscópica deteriorada (incapacidad para percibir los aspectos tridimensionales de una escena). Los electrorretinogramas revelan que en la acromatopsia, la función de los fotorreceptores de bastón de la retina permanece intacta, mientras que los fotorreceptores de cono de la retina no son funcionales. Las mutaciones en el gen de la subunidad beta del canal regulado por nucleótidos cíclicos específico del cono (CNGB3) representan aproximadamente el 50 % de los casos de acromatopsia (Kohl S,et al. Eur J Hum Genet 2005;13:302-8). Los fotorreceptores de bastones y conos cumplen funciones diferentes en la visión. Panget al. (2010). Los fotorreceptores de los conos son los principales responsables de la visión central, resolución fina y visión cromática excelentes en condiciones de luz baja a muy brillante. Se concentran en la mácula central de la retina y comprenden casi el 100 % de la fóvea. Los fotorreceptores de los bastones son responsables de la visión periférica, con baja luminosidad y nocturna; se encuentran principalmente fuera de la mácula en la retina periférica.

[0006] Aproximadamente 1 de cada 30.000 individuos padece acromatopsia completa. En la acromatopsia completa, hay una pérdida total de la visión del color, pérdida de la visión central y agudeza visual de 20/200 o peor. Por lo tanto, la mayoría de las personas con acromatopsia son legalmente ciegas. El tratamiento convencional actual consiste en limitar la exposición de la retina a la luz mediante lentes de contacto tintadas y proporcionar magnificación para mejorar la visión central. Sin embargo, no existe ningún tratamiento disponible que corrija la función de los conos en la acromatopsia. Panget al.

[0007] Existen diversas causas genéticas de acromatopsia congénita. Las mutaciones en el gen del canal iónico activado por nucleótidos cíclicos beta 3 (CNGB3, también conocido como ACHM3), son una causa genética de la acromatopsia. Estudios recientes en perros sugieren cierto potencial para el uso de la terapia génica basada en el virus adenoasociado recombinante (rAAV) para el tratamiento de la acromatopsia provocada por mutaciones en el gen CNGB3. Komaromyet al.,Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia.Human Molecular Genetics,19(13): 2581-2593 (2010) (en lo sucesivo en el presente documento Komaromyet al).En los estudios caninos, los vectores rAAV que se usaron empaquetaron un casete de expresión de CNGB3 humano (hCNGB3) que contenía elementos que incluían un promotor de opsina roja de cono de 2,1 kb (PR2.1) y un ADNc de CNGB3 humano (hCNGB3). Una limitación de los estudios es que el hCNGB3, impulsado por el promotor PR2.1, se expresa únicamente en los conos rojos y verdes, mientras que el hCNGB3 endógeno se expresa en los tres tipos de conos (conos rojos, verdes y azules). Otra limitación es que el tamaño total del casete de expresión usado (5230 pb) estaba muy por encima de la capacidad de empaquetamiento normal (<4,9 kb) de las partículas de AAV; las partículas de rAAV sobrecargadas afectaron drásticamente la eficiencia del empaquetamiento de rAAV, dando como resultado bajos rendimientos, una mayor proporción de partículas vacías a llenas y, probablemente, una menor infectividad del vector. Los casetes de expresión que contienen una versión más corta del promotor de la opsina roja del cono, o un promotor de la arrestina del cono, fueron mucho menos eficaces para restaurar la función visual. La presente invención aborda estas limitaciones.

[0008] La presente invención tiene la ventaja de proporcionar promotores capaces de promover la expresión de hCNGB3 en los tres tipos de conos. Además, los promotores de la invención tienen la ventaja de ser lo suficientemente cortos como para que el casete de expresión hCNGB3 quepa bien dentro de la capacidad de empaquetamiento normal de rAAV. Un promotor que se ajusta a la capacidad de empaquetamiento normal del rAAV proporciona beneficios, tales como rendimientos mejorados, una menor proporción de partículas vacías a llenas y una mayor infectividad del vector. La presente invención también proporciona casetes de expresión, vectores y kits que usan estos promotores mejorados, así como métodos para tratar la acromatopsia mediante la administración de los vectores.

[0009] La presente invención aborda la necesidad de un tratamiento eficaz para la acromatopsia.

[0010] Sumario de la invención

[0011] La presente invención se caracteriza por, en un primer aspecto, un ácido nucleico que comprende una porción del promotor específico de células de los conos PR 2.1.

[0012] En una realización, el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 4. En otra realización, PR2.1 se trunca en el extremo 5' o 3'. En una realización relacionada, el truncamiento es entre aproximadamente 100 pares de bases y 1.500 pares de bases. En una realización relacionada adicional, el truncamiento es de aproximadamente 300 pares de bases en el extremo 5'. En otra realización adicional, el truncamiento es de aproximadamente 500 pares de bases en el extremo 5'. En otra realización, el truncamiento es de aproximadamente 1.1000 pares de bases en el extremo 5'. En otra realización adicional, el truncamiento es de aproximadamente 300 pares de bases en el extremo 3'. En otra realización, el truncamiento es de aproximadamente 500 pares de bases en el extremo 3'. En otra realización adicional, el truncamiento es de aproximadamente 1.1000 pares de bases en el extremo 3'.

[0013] En una realización, el ácido nucleico de los aspectos y las realizaciones anteriores comprende SEQ ID NO:3. En una realización, el ácido nucleico de los aspectos y las realizaciones anteriores comprende SEQ ID NO:2. En una realización, el ácido nucleico de los

[0014] En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2. En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

[0015] En otra realización adicional, la invención presenta un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 85 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1.

[0016] En una realización de los aspectos anteriores, el promotor es capaz de promover la expresión de CNGB3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L. En otra realización de los aspectos anteriores, el promotor es capaz de promover la expresión de CNGA3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L. En aún otra realización de los aspectos anteriores, el promotor es capaz de promover la expresión de GNAT2 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L.

[0017] En otra realización, la invención presenta un vector de expresión adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico diana enlazada operativamente al ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores. En una realización relacionada, el rAAV es del serotipo 1. En realizaciones relacionadas, el rAAV es del serotipo 2. En otra realización relacionada, el rAAV es del serotipo 5. En otra realización relacionada más, el rAAV está comprendido dentro de un virión AAV.

[0018] En una realización, la secuencia de ácido nucleico diana codifica un polipéptido de la subunidad B del canal activado por nucleótidos cíclicos (CNGB3). En una realización relacionada, la CNGB3 es CNGB3 de ratón. En otra realización relacionada, la CNGB3 es CNGB3 de rata. En otra realización relacionada más, la CNGB3 es CNGB3 humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico diana codifica un polipéptido de la subunidad A del canal activado por nucleótidos cíclicos (CNGA3). En una realización relacionada, la CNGA3 es CNGA3 de ratón. En otra realización relacionada, la CNGA3 es CNGA3 de rata. En otra realización relacionada más, la CNGA3 es CNGA3 humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico diana codifica un polipéptido de la subunidad alfa-2 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina G(t) (GNAT-2). En una realización relacionada, la GNAT-2 es GNAT-2 de ratón. En otra realización relacionada, la GNAT-2 es GNAT-2 de rata. En otra realización relacionada más, la GNAT-2 es humana En otra realización, la invención presenta una célula de mamífero que comprende el vector de expresión de uno cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores.

[0019] En aún otra realización, la invención presenta un casete de expresión de transgenes que comprende el ácido nucleico de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores, un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico de CNGB3, un ácido nucleico de CNGA3, un ácido nucleico de GNAT2 y elementos reguladores mínimos. En una realización, la invención presenta un vector de ácido nucleico que comprende el casete de expresión de uno cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores. En una realización relacionada, el vector vírico es un vector vírico adenoasociado (AAV).

[0020] En otra realización, la invención presenta un kit que comprende el vector de expresión de uno cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores e instrucciones para su uso.

[0021] La invención también se refiere a, en otra realización, un método para tratar una enfermedad ocular que comprende administrar a un sujeto que lo necesite el vector de expresión de uno cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores, tratando de esta manera al sujeto.

[0022] La invención también se refiere a, en otra realización, un método para promover la expresión de CNGA3 o CNGB3 en las células de los conos de un sujeto que comprende administrar al sujeto el vector de expresión de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores, promoviendo de esta manera la expresión de CNGA3 o CNGB3.

[0023] En una realización, la enfermedad ocular está asociada a una mutación genética, una sustitución o una eliminación que afecta a las células de los conos de la retina. En otra realización, la enfermedad ocular afecta al epitelio pigmentario de la retina. En otra realización relacionada, la enfermedad ocular es acromatopsia.

[0024] En otra realización, el vector de expresión es capaz de promover la expresión de CNGB3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L. En otra realización adicional, el vector de expresión es capaz de promover la expresión de CNGA3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L. En otra realización adicional más, el vector de expresión es capaz de promover la expresión de GNAT-2 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L.

[0025] En realizaciones adicionales, el vector se administra por vía subretinal.

[0026] Breve descripción de los dibujos

[0027] Figura 1: Dibujo esquemático del promotor de opsina roja/verde humana truncado.

[0028] Figura 2: Dibujo esquemático del vector rAAV5-PR2.1-hCNGB3.

[0029] Figura 3: Dibujos esquemáticos de cuatro plásmidos províricos que contienen variantes del promotor PR2.1. El promotor PR2.1 (un promotor de opsina roja/verde humana truncado) se truncó en su extremo 5' en 300 pb, 500 pb y 1.100 pb para crear promotores más cortos, designados PR1.7, PR1.5 y PR1.1, respectivamente. Se añadió un potenciador de CMV al extremo 5' del PR 1.1 para crear un promotor híbrido. El promotor central de 500 pb (mostrado en gris) y la región de control del locus (mostrada en rojo) de PR2.1 se dejaron intactos en cada una de estas construcciones. Las repeticiones terminales están indicadas por las flechas, y se muestra la ubicación de las secuencias de señal de corte y empalme de SV40.

[0030] La Figura 4 expone SEQ ID NO: 1-4.

[0031] La Figura 5 muestra los resultados de los experimentos para evaluar la eficacia y especificidad de PR1.1 y PR1.5 para dirigirse a los conos en ratones, usando vectores rAAV que expresan proteína fluorescente verde (GFP). El PNA es un marcador para los fotorreceptores de los conos. DAPI se usa para identificar núcleos.

[0032] La Figura 6 muestra los resultados de los experimentos para evaluar la eficacia y especificidad de PR1.7 y PR2.1 para dirigirse a los conos en ratones, usando vectores rAAV que expresan proteína fluorescente verde (GFP). El PNA es un marcador para los fotorreceptores de los conos. DAPI se usa para identificar núcleos.

[0033] La Figura 7 muestra los resultados de formación de imágenes de autofluorescencia del fondo de ojo (FAF) para detectar la presencia de proteína fluorescente verde (GFP) en los ojos de primates no humanos (NHP) que recibieron por vía subretinal rAAV2tYF-PR2.1-GFP, rAAV2tYF-PR1.7-GFP o AAV2tYF-CSP-GFP.

[0034] La Figura 8 (A-E) muestra la expresión de GFP en retinas de NHP 3 meses después de la inyección de vectores AAV2tYF-GFP. Los paneles muestran secciones representativas de la retina de un ojo de control normal sin tratamiento con AAV (panel A), o de ojos inyectados por vía subretinal con AAV2tYF-CSP-GFP (panel B), AAV2tYF-PR2.1-GFP (panel C), o AAV2tYF-PR1.7-GFP (paneles D y E) teñidos con DAPI para núcleos (azul) y anticuerpos contra GFP (verde), opsina de conos L/M (rojo, paneles A, B, C y D) u opsina de conos S (rojo, panel E).

[0035] La Figura 9 es un gráfico que muestra los niveles de ARN mensajero (ARNm) de GFP en retinas de NHP 3 meses después de la inyección de vectores AAV2tYF-GFP. El ARN mensajero (ARNm) de GFP se determinó mediante qRT-PCR, realizado por triplicado en 3 momentos diferentes y normalizado por la expresión de ARN 18S en las muestras.

[0036] Descripción detallada de la invención

[0037] I. Visión general y definiciones

[0038] A menos que se defina lo contrario, todos los términos y expresiones técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a los expertos una definición general de muchos de los términos y expresiones usados en esta invención: Singletonet al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed.1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5ª Ed., R. Riegeret al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a continuación, salvo que se indique lo contrario.

[0039] En el presente documento, los artículos "un" y "uno/una" se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

[0040] La expresión "que incluye" se usa en el presente documento para significar, y se usa indistintamente con, la expresión "que incluye pero no limitado a".

[0041] El término "o" se usa en el presente documento para significar, y se usa indistintamente con, la expresión "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0042] La expresión "tal como" se usa en el presente documento para significar, y se usa indistintamente, con la expresión "tal como pero no limitado a".

[0043] Un "sujeto" o "paciente" a ser tratado mediante el método de la invención puede referirse tanto a un ser humano como a un animal no humano. Un "animal no humano" incluye cualquier organismo vertebrado o invertebrado.

[0044] La "acromatopsia" es un trastorno de la visión del color. Los síntomas de la acromatopsia incluyen acromatopsia (falta de percepción del color), ambliopía (agudeza visual reducida), hemeralopía (capacidad visual reducida en condiciones de luz brillante acompañada de fotoaversión, que significa aversión o evitación de la luz brillante), nistagmo (movimiento oscilatorio incontrolado de los ojos), anomalías en el funcionamiento del iris y visión estereoscópica deteriorada (incapacidad para percibir los aspectos tridimensionales de una escena). Como se usa en el presente documento, el término "acromatopsia" se refiere a una forma de acromatopsia provocada por mutaciones genéticas, sustituciones o supresiones.

[0045] "Tratar" una enfermedad (tal como, por ejemplo, acromatopsia) significa aliviar, prevenir o retrasar la aparición de al menos un signo o síntoma de la enfermedad.

[0046] Los extremos asimétricos de las cadenas de ADN y ARN se denominan extremos 5' (cinco prima) y 3' (tres prima), teniendo el extremo 5' teniendo un grupo fosfato terminal y el extremo 3' un grupo hidroxilo terminal. El extremo cinco prima (5') tiene el quinto carbono en el anillo de azúcar de la desoxirribosa o ribosa en su extremo. Los ácidos nucleicos se sintetizanin vivoen la dirección de 5' a 3', porque la polimerasa usada para ensamblar nuevas cadenas une cada nuevo nucleótido al grupo 3'-hidroxilo (-OH) a través de un enlace fosfodiéster.

[0047] Un "promotor" es una región del ADN que facilita la transcripción de un gen en particular. Como parte del proceso de transcripción, la enzima que sintetiza el ARN, conocida como ARN polimerasa, se une al ADN cerca de un gen. Los promotores contienen secuencias de ADN específicas y elementos de respuesta que proporcionan un sitio de unión inicial para la ARN polimerasa y para los factores de transcripción que reclutan a la ARN polimerasa.

[0048] La retina contiene tres tipos de fotorreceptores: células de los bastones, células de los conos y células ganglionares fotorreceptoras. Las células de los conos son de tres tipos: células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L. Las células de los conos S responden con mayor intensidad a la luz de longitud de onda corta (pico cerca de 420-440 nm) y también se conocen como conos azules. Las células de los conos S responden con mayor intensidad a la luz de longitud de onda media (pico cerca de 534-545 nm) y también se conocen como conos verdes. Las células de los conos L responden con mayor intensidad a la luz de longitudes de onda largas (pico cerca de 564-580 nm) y también se conocen como conos rojos. La diferencia en las señales recibidas de los tres tipos de conos permite al cerebro percibir todos los colores posibles.

[0049] Un "casete de expresión de transgenes" o "casete de expresión" comprende las secuencias génicas que un vector de ácido nucleico debe suministrar a las células diana. Estas secuencias incluyen el gen de interés (por ejemplo, un ácido nucleico de CNGB3 o CNGA3), uno o más promotores y elementos reguladores mínimos.

[0050] Los "elementos reguladores mínimos" son elementos reguladores necesarios para la expresión eficaz de un gen en una célula diana y, por lo tanto, deben incluirse en un casete de expresión de transgenes. Dichas secuencias podrían incluir, por ejemplo, secuencias promotoras o potenciadoras, una secuencia de polienlazador que facilita la inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector plasmídico, y secuencias responsables del empalme de intrones y la poliadenilación de transcritos de ARNm. En un ejemplo reciente de un tratamiento de terapia génica para la acromatopsia, el casete de expresión incluía los elementos reguladores mínimos de un sitio de poliadenilación, secuencias señal de corte y empalme y repeticiones terminales invertidas de AAV. Véase, por ejemplo, Komaromyet al.

[0051] Un "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" es una molécula compuesta por cadenas de nucleótidos monoméricos, tales como, por ejemplo, moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico). Un ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, un promotor, el gen CNGB3 o CNGA3 o una porción del mismo, o elementos reguladores.

[0052] Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Un "ácido nucleico de CNGB3" se refiere a un ácido nucleico que comprende el gen CNGB3 o una porción del mismo, o una variante funcional del gen CNGB3 o una porción del mismo. De forma similar, un "ácido nucleico de CNGA3" se refiere a un ácido nucleico que comprende el gen CNGA3 o una parte del mismo, o una variante funcional del gen CNGA3 o una parte del mismo, y un "ácido nucleico de GNAT2" se refiere a un ácido nucleico que comprende el gen GNAT2 o una parte del mismo, o una variante funcional del gen GNAT2 o una parte del mismo. Una variante funcional de un gen incluye una variante del gen con variaciones menores tales como, por ejemplo, mutaciones silenciosas, polimorfismos mononucleotídicos, mutaciones de cambio de sentido y otras mutaciones o eliminaciones que no alteran significativamente la función del gen.

[0054] Una molécula de ácido nucleico "aislada" (tal como, por ejemplo, un promotor aislado) es aquella que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el que el ADN genómico está asociado de manera natural. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico "aislada" está libre de secuencias que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico del organismo del que deriva.

[0056] II. Métodos de la invención

[0058] La presente invención proporciona promotores, casetes de expresión, vectores, kits y métodos que pueden usarse en el tratamiento de enfermedades genéticas que afectan a las células de los conos de la retina. Las enfermedades genéticas que afectan a las células de los conos de la retina incluyen acromatopsia; amaurosis congénita de Leber; distrofia de cono-bastón; retinosis pigmentaria, incluyendo retinosis pigmentaria ligada al cromosoma X; maculopatías; y degeneración macular asociada a la edad. En realizaciones preferidas, la enfermedad es acromatopsia.

[0060] La acromatopsia es un trastorno de la visión del color. Las mutaciones autosómicas recesivas u otros tipos de alteraciones de secuencia en tres genes son la causa predominante de la acromatopsia congénita. Véase Pang, J.-J.et al.(2010). Achromatopsia as a Potential Candidate for Gene Therapy. EnAdvances in Experimental Medicine and Biology,Volumen 664, Parte 6, 639-646 (2010). La acromatopsia se ha asociado a mutaciones en las subunidades alfa o beta de los canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos (CNG), que se conocen respectivamente como CNGA3 y CNGB3. Las mutaciones en el gen CNGA3 que se asociaron a acromatopsia se informan en Patel KA,et al.

[0061] Transmembrane SI mutations in CNGA3 from achromatopsia 2 patients cause loss of function and impaired cellular trafficking of the cone CNG channel.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.46 (7): 2282-90. (2005)., Johnson S,et al.Achromatopsia caused by novel mutations in both CNGA3 and CNGB3.J. Med. Genet.41 (2): e20. (2004)., Wissinger B,et al.CNGA3 mutations in hereditary cone photoreceptor disorders.Am. J. Hum. Genet.69 (4): 722-37.(2001). y Kohl S,et al.Total colourblindness is caused by mutations in the gene encoding the alpha-subunit of the cone photoreceptor cGMP-gated cation channel.Nat. Genet.19 (3): 257-9. (1998). Las mutaciones en el gen CNGB3 que se asociaron a acromatopsia se informan en Johnson S,et al.Achromatopsia caused by novel mutations in both CNGA3 and CNGB3.J. Med. Genet.41 (2): e20. (2004)., Peng C,et al.Achromatopsia-associated mutation in the human cone photoreceptor cyclic nucleotide-gated channel CNGB3 subunit alters the ligand sensitivity and pore properties of heteromeric channels.J. Biol. Chem.278 (36): 34533-40 (2003)., Bright SR,et al.Disease-associated mutations in CNGB3 produce gain of function alterations in cone cyclic nucleotide-gated channels.Mol. Vis.11:1141-50 (2005)., Kohl S,et al.CNGB3 mutations account for 50 % of all cases with autosomal recessive achromatopsia.Eur. J. Hum. Genet.13 (3): 302-8 (2005)., Rojas CV,et al.A frameshift insertion in the cone cyclic nucleotide gated cation channel causes complete achromatopsia in a consanguineous family from a rural isolate.Eur. J. Hum. Genet.

[0062] 10 (10): 638-42 (2002)., Kohl S,et al.Mutations in the CNGB3 gene encoding the beta-subunit of the cone photoreceptor cGMP-gated channel are responsible for achromatopsia (ACHM3) linked to chromosome 8q21.Hum. Mol. Genet.9 (14): 2107-16 (2000)., Sundin OH,et al.Genetic basis of total colourblindness among the Pingelapese islanders.Nat. Genet.25 (3): 289-93 (2000). Las alteraciones en la secuencia del gen de la transducina de las células de los conos, conocido como GNAT2, también puede provocar acromatopsia. Véase Kohl S,et al., Mutations in the cone photoreceptor G-protein alpha-subunit gene GNAT2 in patients with achromatopsia. Kokl S,et al.Mutations in the cone photoreceptor G-protein alpha-subunit gene GNAT2 in patients with achromatopsia.Am J Hum Genet71 (2): 422-425 (2002) (en lo sucesivo en el presente documento Kohlet al.). La gravedad de las mutaciones en estas proteínas se correlaciona con la gravedad del fenotipo de acromatopsia. http://en.wikipedia.org/wiki/Achromatopsia. Las mutaciones en CNGB3 representan aproximadamente el 50 % de los casos de acromatopsia. Kohlet al. Las mutaciones en CNGA3 representan aproximadamente el 23 % de los casos y las mutaciones en GNAT2 representan aproximadamente el 2 % de los casos.

[0064] El "gen CNGB3" es el gen que codifica el canal beta 3 activado por nucleótidos cíclicos (CNGB3). El "gen CNGA3" es el gen que codifica el canal alfa 3 activado por nucleótidos cíclicos (CNGA3). Los genes CNGB3 y CNGA3 se expresan en las células de los conos de la retina. Los canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos (CNG) de la retina nativa están críticamente implicados en la fototransducción. Los CNG son canales catiónicos que consisten en dos subunidades alfa y dos subunidades beta. En la oscuridad, los conos tienen una concentración relativamente alta de guanosina 3'-5' monofosfato cíclica (GMPc), lo que provoca que se abran los GNC, dando como resultado despolarización y liberación continua de glutamato. La exposición a la luz activa una vía de transducción de señales que descompone el GMPc. La reducción en la concentración de GMPc provoca el cierre de los CNG, impidiendo la entrada de iones positivos, hiperpolarizando la célula y deteniendo la liberación de glutamato. Las mutaciones en los genes CNGB3 o CNGA3 pueden provocar defectos en la función de los fotorreceptores de los conos, dando como resultado acromatopsia. Las mutaciones en el gen CNGB3 se han asociado a otras enfermedades además de la acromatopsia, incluyendo distrofia progresiva de los conos y degeneración macular juvenil.

[0066] El gen GNAT2 codifica la subunidad alfa-2 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina, que también se conoce como la transducina alfa específica de los conos. Las proteínas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) consisten en subunidades alfa, beta y gamma. En los fotorreceptores, las proteínas G son fundamentales en la amplificación y la transducción de señales visuales. Diversos tipos de alteraciones en la secuencia del gen GNAT2 pueden provocar acromatopsia humana: mutaciones interruptoras, pequeñas mutaciones por eliminación y/o inserción, mutaciones por desplazamiento del marco de lectura y grandes eliminaciones intragénicas. Panget al.

[0067] En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz para la acromatopsia. Los estudios en animales sugieren que es posible usar la terapia génica para tratar la acromatopsia y otras enfermedades de la retina. Para defectos genéticos recesivos, el objetivo es suministrar una copia de tipo silvestre de un gen defectuoso al tipo de célula retiniana afectada. Se demostró la capacidad de introducir genes en algunos subconjuntos de células de los conos, por ejemplo, en Mauck, M. C.et al., Longitudinal evaluation of expression of virally delivered transgenes in gerbil cone photoreceptors.Visual Neuroscience25(3): 273-282 (2008). Los autores demostraron que un vector AAV recombinante podría usarse para lograr la expresión a largo plazo de un gen indicador que codifica la proteína fluorescente verde en tipos específicos de células de cono de jerbo. Los autores demostraron además que un gen de opsina humana de longitud de onda larga podía administrarse a conos específicos de jerbos, dando como resultado respuestas de los conos a la luz de longitud de onda larga.

[0069] Otros estudios demostraron que la terapia génica con vectores AAV recombinantes podría usarse para convertir monos dicrómatas en tricrómatas mediante la introducción de un gen de L-opsina humana en la retina del mono ardilla. Mancuso, K.,et al. Gene therapy for red-green colour blindness in adult primates.Nature461: 784-787 (2009). Los electrorretinogramas verificaron que el fotopigmento introducido era funcional, y los monos mostraron una mejor visión del color en una prueba de conducta.

[0071] Existen varios modelos animales de acromatopsia para los que los experimentos de terapia génica han demostrado la capacidad de restaurar la función de los conos. Véase Panget al. En primer lugar, el ratón Gnat2cpfl3presenta una mutación recesiva en el gen de la transducina alfa específica de los conos, dando como resultado una agudeza visual deficiente y una respuesta ERT escasa o nula en los conos. El tratamiento de ratones Gnat2cpfl3homocigotos a los que se les realizó una única inyección subretiniana de un vector AAV serotipo 5 que llevan ADNc de GNAT2 de ratón de tipo silvestre y un promotor de opsina de cono rojo humano recuperaron las respuestas ERG específicas de los conos y la agudeza visual. Alexanderet al.Restoration of cone vision in a mouse model of achromatopsia.Nat Med13:685-687 (2007) (en lo sucesivo en el presente documento Alexanderet al.). En segundo lugar, el ratóncpfl5(Pérdida de función del fotorreceptor de cono 5) tiene una mutación de aminoácido autosómica recesiva en el gen CNGA3 sin respuesta ERG específica de cono. El tratamiento de ratonescpfl5a los que se les inyectó subretinianamente un vector AAV que contenía el gen CNGA3 de ratón de tipo silvestre y un promotor de cono azul humano (HB570) dio como resultado la restauración de las respuestas ERG específicas de los conos. Panget al. En tercer lugar, existe un perro Malamute de Alaska que presenta una mutación natural en el gen CNGB3 que provoca pérdida de la visión diurna y ausencia de la función de los conos de la retina. En este tipo de perro, la inyección subretiniana de un vector AAV5 que contenía ADNc de CNGB3 humano y un promotor de opsina de cono rojo humano restauró las respuestas ERG específicas de los conos. Véase, por ejemplo, Komaromyet al.

[0073] Los métodos anteriores para el tratamiento de la acromatopsia usando terapia génica estaban limitados por el hecho de que los promotores usados provocaban la expresión de transgenes solo en ciertos tipos de fotorreceptores de células de los conos. Los promotores de la presente invención pueden dirigir la expresión génica en los tres tipos de células de los conos presentes en los humanos (células de los conos S, células de los conos M y células de los conos L).

[0075] Otra limitación de los estudios realizados por Komaromyet al.era que el tamaño total del casete de expresión utilizado (5.230 pb) estaba muy por encima de la capacidad de empaquetamiento normal (<4,9 kb) de las partículas de AAV; las partículas de rAAV sobrecargadas afectaron drásticamente la eficiencia del empaquetamiento de rAAV, dando como resultado bajos rendimientos, una mayor proporción de partículas vacías a llenas y, probablemente, una menor infectividad del vector. Los casetes de expresión que contienen una versión más corta del promotor de la opsina roja del cono, o un promotor de la arrestina del cono, fueron mucho menos eficaces para restaurar la función visual. Los promotores de la presente invención tienen la ventaja de que, debido a su menor longitud, hacen que el casete de expresión hCNGB3 se empaquete eficientemente en una partícula AAV. Un promotor que se ajusta a la capacidad de empaquetamiento normal del rAAV proporciona beneficios, tales como rendimientos mejorados, una menor proporción de partículas vacías a llenas, mayor infectividad del vector y, por último, mayor eficacia para el tratamiento de la afección deseada.

[0077] III. Promotores, casetes de expresión, ácidos nucleicos y vectores de la invención

[0078] Los promotores, los ácidos nucleicos de CNGB3, los elementos reguladores, los casetes de expresión y los vectores de la invención pueden producirse usando métodos conocidos en la técnica. Los métodos que se describen a continuación se proporcionan como ejemplos no limitantes de dichos métodos.

[0079] Promotores

[0080] La presente invención proporciona promotores aislados y/o truncados. En algunos aspectos, estos promotores incluyen un segmento del promotor PR 2.1. En una realización, el promotor es un promotor PR2.1 truncado.

[0081] En algunas realizaciones de los promotores de la invención, el promotor es capaz de promover la expresión de un transgén en las células de los conos S, de los conos M y de los conos L. Un "transgén" se refiere a un segmento de ADN que contiene una secuencia génica que se ha aislado de un organismo y que se introduce en un organismo diferente. Por ejemplo, para tratar a un individuo que padece acromatopsia provocada por una mutación del gen CNGB3 humano, puede administrarse un gen CNGB3 humano de tipo silvestre (es decir, no mutado o variante funcional) usando un vector apropiado. El gen de tipo silvestre se denomina un "transgén". En realizaciones preferidas, el transgén es una versión de tipo silvestre de un gen que codifica una proteína que normalmente se expresa en las células de los conos de la retina. En una de dichas realizaciones, el transgén deriva de un gen humano. En una primera realización específica, el promotor es capaz de promover la expresión de un ácido nucleico de CNGB3 en las células de los conos S, de los conos M y de los conos L. En una segunda realización específica, el promotor es capaz de promover la expresión de un ácido nucleico de CNGA3 en las células de los conos S, de los conos M y de los conos L. En una tercera realización específica, el promotor es capaz de promover la expresión de un ácido nucleico de GNAT2 en las células de los conos S, de los conos M y de los conos L. En estas tres realizaciones específicas, los CNGB3, CNGA3, o GNAT2 son preferentemente CNGB3, CNGA3 o GNAT2 humanas.

[0082] En otro aspecto, la presente invención proporciona promotores que son versiones acortadas del promotor PR2.1. Dichos promotores tienen la ventaja de que se adaptan mejor a la capacidad de empaquetamiento de las partículas de AAV y, por lo tanto, proporcionan ventajas tales como, por ejemplo, rendimientos mejorados, una menor proporción de partículas vacías a llenas y una mayor infectividad del vector. En algunas realizaciones, estos promotores se crean truncando el extremo 5' de PR2.1 o el extremo 3' de PR 2.1. En algunas de dichas realizaciones, las longitudes de los truncamientos se seleccionan del grupo que consiste en aproximadamente 300 pb, 500 pb y 1.100 pb (véase, por ejemplo, PR1.7, PR1.5 y PR1.1, respectivamente).

[0083] Casetes de expresión

[0084] En otro aspecto, la presente invención proporciona un casete de expresión de transgenes que incluye (a) un promotor de la invención; (b) un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico de CNGB3, un ácido nucleico de CNGA3 y un ácido nucleico de GNAT2; y (c) elementos regulatorios mínimos. Un promotor de la invención incluye los promotores analizados anteriormente.

[0085] Un "ácido nucleico de CNGB3" se refiere a un ácido nucleico que comprende el gen CNGB3 o una porción del mismo, o una variante funcional del gen CNGB3 o una porción del mismo. De forma similar, un "ácido nucleico de CNGA3" se refiere a un ácido nucleico que comprende el gen CNGA3 o una parte del mismo, o una variante funcional del gen CNGA3 o una parte del mismo, y un "ácido nucleico de GNAT2" se refiere a un ácido nucleico que comprende el gen GNAT2 o una parte del mismo, o una variante funcional del gen GNAT2 o una parte del mismo. Una variante funcional de un gen incluye una variante del gen con variaciones menores tales como, por ejemplo, mutaciones silenciosas, polimorfismos mononucleotídicos, mutaciones de cambio de sentido y otras mutaciones o eliminaciones que no alteran significativamente la función del gen.

[0086] En determinadas realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico humano (es decir, un ácido nucleico derivado de un gen de CNGB3, CNGA3 o GNAT2 humano). En otras realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico o humano (es decir, un ácido nucleico derivado de un gen de CNGB3, CNGA3 o GNAT2 no humano).

[0087] Los "elementos reguladores mínimos" son aquellos elementos reguladores necesarios para la expresión eficaz de un gen en una célula diana. Dichos elementos regulatorios podrían incluir, por ejemplo, secuencias promotoras o potenciadoras, una secuencia de polienlazador que facilita la inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector plasmídico, y secuencias responsables del empalme de intrones y la poliadenilación de transcritos de ARNm. En un ejemplo reciente de un tratamiento de terapia génica para la acromatopsia, el casete de expresión incluía los elementos reguladores mínimos de un sitio de poliadenilación, secuencias señal de corte y empalme y repeticiones terminales invertidas de AAV. Véase, por ejemplo, Komaromyet al.Los casetes de expresión de la invención también pueden incluir opcionalmente elementos reguladores adicionales que no son necesarios para la incorporación eficaz de un gen en una célula diana.

[0088] Vectores

[0089] La presente invención también proporciona vectores que incluyen uno cualquiera de los casetes de expresión analizados en la sección anterior. En algunas realizaciones, el vector es un oligonucleótido que comprende las secuencias del casete de expresión. En realizaciones específicas, el suministro del oligonucleótido puede realizarse mediante electroporaciónin vivo(véase, por ejemplo, Chalberg, TW,et al.phiC31 integrase confers genomic integration and long-term transgene expression in rat retina.Investigative Ophthalmology & Visual Science,46, 2140-2146 (2005) (en lo sucesivo en el presente documento Chalberget al.,2005)) o transfección por avalancha de electrones (véase, por ejemplo, Chalberg, TW,et al.Gene transfer to rabbit retina with electron avalanche transfection.Investigative Ophthalmology &Visual Science,47, 4083-4090 (2006) (en lo sucesivo en el presente documento Chalberget al.,2006)). En realizaciones adicionales, el vector es un péptido compactador de ADN (véase, por ejemplo, Farjo, R,et al.Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles.PLoS ONE,1, e38 (2006) (en lo sucesivo en el presente documento Farjoet al.,2006), donde CK30, un péptido que contiene un resto de cisteína unido a polietilenglicol seguido de 30 lisinas, se usó para la transferencia de genes a los fotorreceptores), un péptido con propiedades de penetración celular (véase Johnson, LN,et al.,Cell-penetrating peptide for enhanced delivery of nucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea.Molecular Therapy,16(1), 107-114 (2007) (en lo sucesivo en el presente documento Johnsonet al.,2007), Barnett, EM,et al.Selective cell uptake of modified Tat peptide-fluorophore conjugates in rat retina inex vivoandin vivomodels.Investigative Ophthalmology & Visual Science,47, 2589-2595 (2006) (en lo sucesivo en el presente documento Barnettet al.,2006), Cashman, SM,et al.Evidence of protein transduction but not intercellular transport by proteins fused to HIV tat in retinal cell culture andin vivo.Molecular Therapy,8, 130-142 (2003) (en lo sucesivo en el presente documento Cashmanet al.,2003), Schorderet, DF,et al.D-TAT transporter as an ocular peptide delivery system.Clinical and Experimental Ophthalmology,33, 628-635 (2005) (en lo sucesivo en el presente documento Schorderetet al.,2005), Kretz, A,et al.HSV-1 VP22 augments adenoviral gene transfer to CNS neurons in the retina and striatumin vivo.Molecular Therapy,7, 659-669 (2003) (en lo sucesivo en el presente documento Kretzet al.2003) para ejemplos de suministro de péptidos a células oculares), o un lipoplejo, poliplejo, liposoma o inmunoliposoma encapsulador de ADN (véase, por ejemplo,Zhang, Y,et al.Organ-specific gene expression in the rhesus monkey eye following intravenous nonviral gene transfer.Molecular Vision,9, 465-472 (2003) (en lo sucesivo en el presente documento Zhanget al.2003), Zhu, C,et al.Widespread expression of an exogenous gene in the eye after intravenous administration.Investigative Ophthalmology & Visual Science,43, 3075-3080 (2002) (en lo sucesivo en el presente documento Zhuet al.2002), Zhu, C.,et al.Organ-specific expression of the lacZ gene controlled by the opsin promoter after intravenous gene administration in adult mice.Journal of Gene Medicine,6, 906-912. (2004) (en lo sucesivo en el presente documento Zhuet al.2004)).

[0090] En realizaciones preferidas, el vector es un vector vírico, tal como un vector derivado de un virus adenoasociado, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus, un virus vaccinia/poxvirus o un herpesvirus (por ejemplo, el virus del herpes simple (VHS)). Véase, por ejemplo, Howarth. En las realizaciones más preferidas, el vector vírico es un vector vírico adenoasociado (AAV).

[0092] Múltiples serotipos del virus adenoasociado (AAV), incluyendo 12 serotipos humanos (AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12) y más de 100 serotipos de primates no humanos se han identificado ahora. Howarth JLet al., Using viral vectors as gene transfer tools.Cell Biol Toxicol26:1-10 (2010) (en lo sucesivo en el presente documento Howarth et al.). En realizaciones de la presente invención en donde el vector es un vector AAV, el serotipo de las repeticiones terminales invertidas (ITR) del vector AAV puede seleccionarse de cualquier serotipo de AAV conocido humano o no humano. En realizaciones preferidas, el serotipo de las ITR del vector AAV se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12. Por otro lado, en realizaciones de la presente invención en donde el vector es un vector AAV, el serotipo de la secuencia de la cápside del vector AAV puede seleccionarse de cualquier serotipo de AAV humano o animal conocido. En algunas realizaciones, el serotipo de la secuencia de la cápside del vector AAV se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12. En realizaciones preferidas, el serotipo de la secuencia de la cápside es AAV5. En algunas realizaciones en donde el vector es un vector AAV, se emplea un enfoque de pseudotipado, en donde el genoma de un serotipo de ITR está empaquetado en una cápside de un serotipo diferente. Véase, por ejemplo, Zolutuhkin S.et al. Production and purification of serotype 1,2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.Methods28(2): 158-67 (2002). En realizaciones preferidas, el serotipo de los ITR del vector AAV y el serotipo de la secuencia de la cápside del vector AAV se seleccionan independientemente del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12.

[0094] En algunas realizaciones de la presente invención en donde el vector es un vector rAAV, se emplea una secuencia de cápside mutante. Las secuencias de cápside mutantes, así como otras técnicas tales como mutagénesis racional, ingeniería de péptidos de direccionamiento, generación de partículas quiméricas, enfoques de evolución dirigida y de bibliotecas, y modificaciones de evasión inmunitaria, pueden emplearse en la presente invención para optimizar los vectores AAV, con fines tales como lograr la evasión inmunológica y una mayor eficacia terapéutica. Véase, por ejemplo, Mitchell A.M.et al. AAV’s anatomy: Roadmap for optimizing vectors for translational success.Curr Gene Ther.

[0095] 10(5): 319-340.

[0097] Fabricación de los ácidos nucleicos de la invención

[0099] Una molécula de ácido nucleico (incluyendo, por ejemplo, un promotor, ácido nucleico de CNGB3, ácido nucleico de CNGA3, ácido nucleico de GNAT2, o un elemento regulador) de la presente invención puede aislarse usando técnicas convencionales de biología molecular. Usando la totalidad o una parte de una secuencia de ácido nucleico de interés como una sonda de hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden aislarse usando técnicas convencionales de hibridación y clonación (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

[0100] Una molécula de ácido nucleico para su uso en los métodos de la invención también puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados en base a la secuencia de una molécula de ácido nucleico de interés. Una molécula de ácido nucleico usada en los métodos de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genómico como plantilla y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación por PCR convencional.

[0101] Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a secuencias de nucleótidos de interés también pueden sintetizarse químicamente usando técnicas convencionales. Se conocen numerosos métodos para la síntesis química de polidesoxinucleótidos, incluyendo síntesis en fase sólida que se ha automatizado en sintetizadores de ADN disponibles en el mercado (Véase, por ejemplo, Itakuraet al. Patente de EE. UU. N.º 4.598.049; Carutherset al. Patente de EE. UU. N.º 4.458.066; y las Patentes de EE. UU. N.º 4.401.796 y 4.373.071 de Itakura, incorporadas como referencia en el presente documento). Existen métodos automatizados para el diseño de oligonucleótidos sintéticos. Véase, por ejemplo, Hoover, D.M. y Lubowski, J.Nucleic Acids Research,30(10): e43 (2002).

[0102] Muchas realizaciones de la invención implican un ácido nucleico de CNGB3, un ácido nucleico de CNGA3 o un ácido nucleico de GNAT2. Algunos aspectos y realizaciones de la invención implican otros ácidos nucleicos, tales como promotores aislados o elementos reguladores. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc o un ácido nucleico sintetizado químicamente. Un ADNc puede obtenerse, por ejemplo, mediante amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante el cribado de una biblioteca de ADNc apropiada. Como alternativa, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente.

[0103] IV. Métodos y kits de la invención

[0104] Métodos de tratamiento

[0105] La invención proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada a una mutación genética, una sustitución o una eliminación que afecta a las células de los conos de la retina, en donde los métodos comprenden administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento un vector que incluye uno de los promotores de la invención, tratando de esta manera al sujeto. En una realización preferida, la enfermedad es acromatopsia. Otras enfermedades asociadas a una mutación genética, una sustitución o una supresión que afectan a las células de los conos de la retina incluyen acromatopsia, amaurosis congénita de Leber, distrofia de conos y bastones, maculopatías, degeneración macular asociada a la edad y retinosis pigmentaria, incluyendo retinitis pigmentosa ligada al cromosoma X.

[0106] La invención proporciona además métodos para tratar la acromatopsia que comprenden la administración de cualquiera de los vectores de la invención a un sujeto que necesite dicho tratamiento, tratando de esta manera al sujeto.

[0107] Un "sujeto" a ser tratado mediante los métodos de la invención puede referirse tanto a un ser humano como a un animal no humano. Un "animal no humano" incluye cualquier organismo vertebrado o invertebrado. En algunas realizaciones, el animal no humano es un modelo animal de enfermedad retiniana, o de acromatopsia en particular. Véanse, por ejemplo,Pang et al., Alexanderet al., Komaromyet al. Diversos modelos animales están disponibles para el estudio de terapias basadas en genes mediadas por AAV en la retina. Stieger K.et al. AAV-mediated gene therapy for retinal disorders inlarge animal models. ILAR J.50(2): 206-224 (2009). Los promotores de la invención se describen anteriormente."Tratar" una enfermedad (tal como, por ejemplo, acromatopsia) significa aliviar, prevenir o retrasar la aparición de al menos un signo o síntoma de la enfermedad. Un "signo" de una enfermedad es una manifestación de la misma que puede ser observada por otros o medida mediante métodos objetivos, tales como, por ejemplo, electrorretinografía o pruebas de comportamiento. Un "síntoma" de una enfermedad es una característica de la misma que es percibida subjetivamente por el sujeto.

[0108] En cualquiera de estos dos métodos de tratamiento, el vector puede ser cualquier tipo de vector conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el vector es un vector no vírico, tal como un plásmido de ADN desnudo, un oligonucleótido (tal como, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, una molécula pequeña de ARN (ARNip), un oligodesoxinucleótido bicatenario o un oligonucleótido de ADN monocatenario). En realizaciones específicas que implican vectores de oligonucleótidos, el suministro puede realizarse mediante electroporaciónin vivo(véase, por ejemplo, Chalberget al., 2005) o transfección por avalancha de electrones (véase, por ejemplo, Chalberget al.2006). En realizaciones adicionales, el vector es un complejo dendrímero/ADN que opcionalmente puede encapsularse en un polímero soluble en agua, un péptido compactador de ADN (véase, por ejemplo, Farjoet al.2006, donde CK30, un péptido que contiene un resto de cisteína unido a polietilenglicol seguido de 30 lisinas, se usó para la transferencia de genes a los fotorreceptores), un péptido con propiedades de penetración celular (véanse, Johnsonet al.2007; Barnettet al.,2006; Cashmanet al.,2003; Schorderet al.,2005; Kretzet al.2003 para ejemplos de administración de péptidos a células oculares), o un lipoplejo, poliplejo, liposoma o inmunoliposoma encapsulador de ADN (véanse, por ejemplo, Zhanget al.2003; Zhuet al.2002; Zhuet al.2004). En muchas realizaciones adicionales, el vector es un vector vírico, tal como un vector derivado de un virus adenoasociado, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus, un virus vaccinia/poxvirus o un herpesvirus (por ejemplo, el virus del herpes simple (VHS)). Véanse, por ejemplo,Howarth. En realizaciones preferidas, el vector vírico es un vector vírico adenoasociado (AAV).

[0109] En los métodos de tratamiento de la presente invención, la administración de un vector puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica. En realizaciones preferidas, la administración se realiza mediante inyección subretinal. En determinadas realizaciones, la inyección subretinal se suministra preferentemente en una o más regiones donde la densidad de conos es particularmente alta (tal como, por ejemplo, la zona tapetal superior al disco óptico). En otras realizaciones, la administración se realiza mediante inyección intraocular, inyección intravítrea o inyección intravenosa. La administración de un vector a la retina puede ser unilateral o bilateral y puede realizarse con o sin el uso de anestesia general.

[0110] En los métodos de tratamiento de la presente invención, el volumen de vector suministrado puede determinarse basándose en las características del sujeto que recibe el tratamiento, tal como la edad del sujeto y el volumen del área a la que se va a suministrar el vector. Se sabe que el tamaño del ojo y el volumen del espacio subretiniano difieren entre individuos y pueden cambiar con la edad del sujeto. En las realizaciones en donde el vector se administra por vía subretinal, los volúmenes vectoriales pueden elegirse con el objetivo de cubrir todo el espacio subretinal o un determinado porcentaje del mismo, o para que se suministre un número específico de genomas vectoriales.

[0111] En los métodos de tratamiento de la presente invención, la concentración del vector que se administra puede diferir dependiendo del método de producción y puede elegirse u optimizarse en función de las concentraciones que se hayan determinado como terapéuticamente eficaces para la vía de administración particular. En algunas realizaciones, la concentración de genomas vectoriales por mililitro (vg/ml) se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 10<8>vg/ml, aproximadamente 10<9>vg/ml, aproximadamente 10<10>vg/ml, aproximadamente 10<11>vg/ml, aproximadamente 10<12>vg/ml, aproximadamente 10<13>vg/ml y aproximadamente 10<14>vg/ml. En realizaciones preferidas, la concentración está en el intervalo de 10<10>vg/ml - 10<13>vg/ml, suministrada mediante inyección subretinal o inyección intravítrea en un volumen de aproximadamente 0,1 ml, aproximadamente 0,2 ml, aproximadamente 0,4 ml, aproximadamente 0,6 ml, aproximadamente 0,8 ml y aproximadamente 1,0 ml

[0112] Kits

[0113] La presente invención también proporciona kits. En un aspecto, un kit de la invención comprende un vector que comprende (a) uno cualquiera de los promotores de la invención y (b) instrucciones para el uso del mismo. En otro aspecto, un kit de la invención comprende (a) uno cualquiera de los vectores de la invención y (b) instrucciones para el uso del mismo. Los promotores y vectores de la invención se describen anteriormente.En algunas realizaciones, un vector de la invención puede ser cualquier tipo de vector conocido en la técnica, incluyendo un vector no vírico o vírico, como se ha descrito anteriormente.En realizaciones preferidas, el vector es un vector vírico, tal como un vector derivado de un virus adenoasociado, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus, un virus vaccinia/poxvirus o un herpesvirus (por ejemplo, el virus del herpes simple (VHS)). En las realizaciones más preferidas, el vector vírico es un vector vírico adenoasociado (AAV).

[0114] Las instrucciones que se incluyen con el kit pueden describir cómo puede incorporarse el promotor a un vector o cómo puede administrarse el vector con fines terapéuticos, por ejemplo, para tratar una enfermedad asociada a una mutación genética, una sustitución o una eliminación que afecta a las células de los conos de la retina. En algunas realizaciones en donde el kit se usa con fines terapéuticos, las instrucciones incluyen detalles sobre las dosis recomendadas y las vías de administración.

[0115] Métodos para la elaboración de vectores víricos adenoasociados recombinantes (vectores AAV)

[0116] La presente invención también proporciona métodos para elaborar un vector vírico adenoasociado recombinante (rAAV) que comprenden la inserción en un vector vírico adenoasociado de cualquiera de los promotores de la invención (descritos anteriormente) y un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico de CNGB3, un ácido nucleico de CNGA3 y un ácido nucleico de GNAT2 (también descritos anteriormente). En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico humano, es decir, un ácido nucleico derivado de un gen de CNGB3, CNGA o GNAT humano, o una variante funcional del mismo. En realizaciones alternativas, el ácido nucleico es un ácido nucleico derivado de un gen no humano.

[0117] En los métodos de fabricación de un vector rAAV que se proporciona mediante la invención, el serotipo de la secuencia de la cápside y el serotipo de las ITR de dicho vector AAV se seleccionan independientemente del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12. Por lo tanto, la invención comprende vectores que usan un enfoque de pseudotipado, en donde el genoma de un serotipo de ITR está empaquetado en una cápside de un serotipo diferente. Véase, por ejemplo, Daya S. y Berns, K.I., Gene therapy using adeno-associated virus vectors.Clinical Microbiology Reviews,21(4): 583-593 (2008) (en lo sucesivo en el presente documento Dayaet al.). Adicionalmente, en algunas realizaciones, la secuencia de la cápside es una secuencia de la cápside mutante.

[0118] Vectores AAV

[0120] Los vectores AAV derivan del virus adenoasociado, que recibe su nombre porque originalmente se describió como un contaminante de las preparaciones de adenovirus. Los vectores AAV ofrecen numerosas ventajas bien conocidas sobre otros tipos de vectores: las cepas de tipo silvestre infectan a humanos y primates no humanos sin evidencia de enfermedad o efectos adversos; la cápside del AAV presenta una inmunogenicidad muy baja combinada con una alta estabilidad química y física, lo que permite métodos rigurosos de purificación y concentración del virus; la transducción con vectores AAV conduce a una expresión sostenida del transgén en células postmitóticas no divisoras y proporciona una ganancia de función a largo plazo; y la diversidad de subtipos y variantes de AAV ofrece la posibilidad de dirigir el tratamiento a tejidos y tipos celulares específicos. Heilbronn R y Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics, en M. Schäfer-Korting (ed.),Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010) (en lo sucesivo en el presente documento Heilbronn). Una limitación importante de los vectores AAV es que el AAV ofrece solo una capacidad de transgenes limitada (<4,9 kb) para un vector convencional que contiene ADN monocatenario.

[0122] El AAV es un virus no envuelto, pequeño, que contiene ADN monocatenario encapsulado por una cápside icosaédrica de 20 nm de diámetro. En la mayoría de los estudios iniciales sobre AAV se usó el serotipo humano AAV2. Heilbronn. Contiene un genoma de ADN monocatenario lineal de 4,7 kb con dos marcos de lectura abiertos rep y cap ("rep" para replicación y "cap" para cápside). Códigos de Rep para cuatro proteínas no estructurales superpuestas: Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. Las proteínas Rep78 y Rep69 son necesarias para la mayoría de las etapas del ciclo de vida del AAV, incluyendo la iniciación de la replicación del ADN del AAV en las repeticiones terminales invertidas (ITR) con estructura de horquilla, que es una etapa esencial para la producción de vectores AAV. El gen cap codifica tres proteínas de la cápside, VP1, VP2 y VP3. Rep y cap están flanqueados por ITR de 145 pb. Las ITR contienen los orígenes de la replicación del ADN y las señales de empaquetamiento, y sirven para mediar la integración cromosómica. Las ITR son generalmente los únicos elementos del AAV mantenidos en la construcción del vector AAV.

[0124] Para lograr la replicación, los AAV deben coinfectar la célula diana con un virus auxiliar. Grieger JC y Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production, and clinical applications.Adv Biochem Engin/Biotechnol99:119-145 (2005). Normalmente, los virus auxiliares son el adenovirus (Ad) o el virus del herpes simple (VHS). En ausencia de un virus auxiliar, el AAV puede establecer una infección latente integrándose en un sitio del cromosoma 19 humano. La infección por Ad o VHS de células infectadas latentemente con AAV rescatará el genoma integrado e iniciará una infección productiva. Las cuatro proteínas del Ad necesarias para la función auxiliar son E1A, E1B, E4 y E2A. Además, se requiere la síntesis de ARN asociados al virus Ad (VA). Los herpesvirus también pueden servir como virus auxiliares para la replicación productiva del AAV. Los genes que codifican el complejo helicasa-primasa (UL5, UL8 y UL52) y la proteína de unión al ADN (UL29) se han encontrado ser suficientes para mediar el efecto auxiliar del VHS. En algunas realizaciones de la presente invención que emplean vectores rAAV, el virus auxiliar es un adenovirus. En otras realizaciones que emplean vectores rAAV, el virus auxiliar es el VHS.

[0126] Creación de vectores AAV recombinantes (rAAV)

[0128] La producción, la purificación y la caracterización de los vectores rAAV de la presente invención pueden llevarse a cabo usando cualquiera de los muchos métodos conocidos en la técnica. Para revisiones de métodos de producción a escala de laboratorio, véase, por ejemplo, Clark RK, Recent advances in recombinant adeno-associated virus vector production.Kidney Int.61 s:9-15 (2002); Choi VWet al., Production of recombinant adeno-associated viral vectors forin vitroandin vivouse.Current Protocols in Molecular Biology16.25.1-16.25.24 (2007) (en lo sucesivo en el presente documento Choiet al.); Grieger JC y Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production, and clinical applications.Adv Biochem Engin/Biotechnol99:119-145 (2005) (en lo sucesivo en el presente documento Grieger y Samulski); Heilbronn R y Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics, en M. Schafer-Korting (ed.),Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010) (en lo sucesivo en el presente documento Heilbronn); Howarth JLet al., Using viral vectors as gene transfer tools.Cell Biol Toxicol26:1-10 (2010) (en lo sucesivo en el presente documento Howarth). Los métodos de producción descritos a continuación están previstos como ejemplos no limitantes.

[0130] La producción de vectores AAV puede lograrse mediante la cotransfección de plásmidos de empaquetamiento. Heilbronn. La línea celular proporciona los genes rep y cap de AAV eliminados y las funciones de virus auxiliares necesarias. Los genes auxiliares del adenovirus, VA-ARN, E2A y E4 se transfectan junto con los genes rep y cap del AAV, ya sea en dos plásmidos separados o en una única construcción auxiliar. Un plásmido vector AAV recombinante en donde los genes de la cápside del AAV se reemplazan por un casete de expresión de transgén (que comprende el gen de interés, por ejemplo, un ácido nucleico de CNGB3; un promotor; y elementos regulatorios mínimos) delimitados por ITR, también se transfecta. Estos plásmidos de empaquetamiento se transfectan normalmente en células 293, una línea celular humana que expresa constitutivamente los genes auxiliares Ad restantes necesarios, E1A y E1B. Esto conduce a la amplificación y el empaquetamiento del vector AAV que porta el gen de interés.

[0132] Múltiples serotipos de AAV, incluyendo 12 serotipos humanos y más de 100 serotipos de primates no humanos se han identificado hasta la fecha. Howarthet al. Los vectores AAV de la presente invención pueden comprender secuencias de cápside derivadas de AAV de cualquier serotipo conocido. Como se usa en el presente documento, un "serotipo conocido" engloba mutantes de la cápside que pueden producirse usando métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos, incluyen, por ejemplo, manipulación genética de la secuencia de la cápside vírica, intercambio de dominios de las superficies expuestas de las regiones de la cápside de diferentes serotipos y generación de quimeras de AAV usando técnicas tales como el rescate de marcadores. Véase Bowleset al. Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimeric AAV production. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003), así como las referencias citadas en el mismo. Por otro lado, los vectores AAV de la presente invención pueden comprender ITR derivadas de AAV de cualquier serotipo conocido. De forma preferencial, las ITR derivan de uno de los serotipos humanos AAV1-AAV12. En algunas realizaciones de la presente invención, se emplea un enfoque de pseudotipado, en donde el genoma de un serotipo de ITR está empaquetado en una cápside de un serotipo diferente.

[0134] De forma preferencial, las secuencias de la cápside empleadas en la presente invención derivan de uno de los serotipos humanos AAV1-AAV12. Se ha demostrado que los vectores AAV recombinantes que contienen una secuencia de cápside del serotipo AAV5 se dirigen a las células de la retinain vivo. Véase, por ejemplo, Komaromyet al. Por lo tanto, en realizaciones preferidas de la presente invención, el serotipo de la secuencia de la cápside del vector AAV es AAV5. En otras realizaciones, el serotipo de la secuencia de la cápside del vector AAV es AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV12. Incluso cuando el serotipo de la secuencia de la cápside no se dirige de forma natural a las células de la retina, también pueden emplearse otros métodos de direccionamiento específicos del tejido. Véase Howarthet al. Por ejemplo, los vectores AAV recombinantes pueden modificarse directamente mediante manipulación genética de la secuencia de la cápside vírica, particularmente en la región en bucle de la estructura tridimensional del AAV, o mediante el intercambio de dominios de las superficies expuestas de las regiones de la cápside de diferentes serotipos, o mediante la generación de quimeras de AAV usando técnicas tales como el rescate de marcadores. Véase Bowleset al. Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimeric AAV production. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003), así como las referencias citadas en el mismo.

[0136] Un posible protocolo para la producción, la purificación y la caracterización de vectores AAV recombinantes (rAAV) se describe enChoi et al. En general, están implicadas las siguientes etapas: diseñar un casete de expresión de transgenes, diseñar una secuencia de cápside para dirigirla a un receptor específico, generar vectores rAAV libres de adenovirus, purificar y titular. Estas etapas se resumen a continuación y se describen en detalle en Choiet al.

[0138] El casete de expresión del transgén puede ser un vector AAV de cadena sencilla (ssAAV) o un vector AAV "dimérico" o autocomplementario (scAAV) que se empaqueta como un transgén pseudo-bicatenario. Choi et al.; Heilbronn; Howarth. El uso de un vector ssAAV tradicional generalmente da como resultado un inicio lento de la expresión géntica (de días a semanas hasta que se alcanza una meseta de expresión del transgén) debido a la conversión requerida del ADN de AAV monocatenario en ADN bicatenario. Por el contrario, los vectores scAAV muestran un inicio de expresión génica en cuestión de horas que se estabiliza en cuestión de días después de la transducción de células quiescentes. Heilbronn. Sin embargo, la capacidad de empaquetamiento de los vectores scAAV es aproximadamente la mitad que la de los vectores ssAAV tradicionales. Choiet al. Como alternativa, el casete de expresión del transgén puede dividirse entre dos vectores AAV, lo cual permite el suministro de una estructura más larga. Véase, por ejemplo, Dayaet al. Un vector ssAAV puede construirse mediante la digestión de un plásmido apropiado (tal como, por ejemplo, un plásmido que contiene el gen hCNGB3) con endonucleasas de restricción para eliminar los fragmentos rep y cap, y purificar en gel la cadena principal del plásmido que contiene las ITR de AAVts. Choiet al. Posteriormente, el casete de expresión del transgén deseado puede insertarse entre los sitios de restricción apropiados para construir el plásmido vector rAAV monocatenario. Puede construirse un vector scAAV como se describe en Choiet al.

[0140] A continuación, una preparación de plásmido a gran escala (al menos 1 mg) del vector rAAV y el plásmido auxiliar AAV adecuado y el plásmido auxiliar pXX6 Ad puede purificarse mediante fraccionamiento por doble gradiente de CsCl. Choiet al. Puede seleccionarse un plásmido auxiliar AAV adecuado de la serie pXR, pXR1-pXR5, que respectivamente permiten el empaquetamiento cruzado de genomas ITR de AAV2 en cápsides de serotipos AAV 1 a 5. La cápside apropiada puede elegirse en función de la eficiencia con la que la cápside se dirige a las células de interés. Por ejemplo, en una realización preferida de la presente invención, el serotipo de la secuencia de la cápside del vector rAAV es AAV5, porque se sabe que este tipo de cápside ataca eficazmente las células de la retina. Pueden emplearse métodos conocidos de variación de la longitud del genoma (es decir, del casete de expresión del transgén) y de las cápsides de AAV para mejorar la expresión y/o la transferencia de genes a tipos celulares específicos (por ejemplo, células de los conos de la retina). Véase, por ejemplo, Yang GS, Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: Effects of viral capsid and genome size. Journal of Virology, 76(15): 7651-7660.

[0142] Seguidamente, se transfectan células 293 con el plásmido auxiliar pXX6, el plásmido vector rAAV y el plásmido auxiliar AAV. Choiet al. Posteriormente, los lisados celulares fraccionados se someten a un proceso de purificación de rAAV en varias etapas, seguido de purificación mediante gradiente de CsCl o purificación mediante columna de heparina sefarosa. La producción y cuantificación de viriones rAAV puede determinarse mediante un ensayo de transferencia por puntos. La transducción de rAAVin vitroen cultivos celulares puede usarse para verificar la infectividad del virus y la funcionalidad del casete de expresión.

[0144] Además de los métodos descritos en Choiet al, en el contexto de la presente invención pueden usarse diversos métodos distintos de transfección para la producción de AAV. Por ejemplo, hay disponibles métodos de transfección transitoria, incluyendo métodos que se basan en un protocolo de precipitación de fosfato de calcio.

[0145] Además de los métodos a escala de laboratorio para producir vectores rAAV, la presente invención puede utilizar técnicas conocidas en la técnica para la fabricación a escala de biorreactor de vectores AAV, incluyendo, por ejemplo, Heilbronn; Clement, N. et al. Large-scale adeno-associated viral vector production using a herpesvirus-based system enables manufacturing for clinical studies. Human Gene Therapy, 20: 796-606.

[0146] La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben considerarse limitantes adicionales. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de la presente solicitud, así como las Figuras, se incorporan expresamente como referencia en el presente documento en su totalidad.

[0147] Ejemplos

[0148] EJEMPLO 1: Creación y prueba de versiones más cortas del promotor PR2.1

[0149] Materiales y métodos

[0150] La Figura 2 muestra un dibujo esquemático del plásmido provírico que contiene repeticiones terminales (TR) del AAV, el promotor PR2.1 y el transgén hCMGB3. El promotor PR2.1 se acortó realizando truncamientos a partir del extremo 5' de PR2.1. El promotor central de 500 pb y la región de control del locus (LCR) de 600 pb de PR2.1 se dejaron intactos. Se crearon tres versiones acortadas del promotor PR2.1: PR1.7, PR1.5 y PR1.1. PR1.7, PR1.5 y PR1.1 se crearon truncando PR2.1 en el extremo 5' en aproximadamente 300 pb, 500 pb y 1.100 pb, respectivamente.

[0151] SEQ ID NO: 1 corresponde al promotor PR1.1

[0152] SEQ ID NO: 2 corresponde al promotor PR1.5

[0153] SEQ ID NO: 3 corresponde al promotor PR1.7

[0154] SEQ ID NO: 4 corresponde al promotor PR2.1

[0155] Se añadió un potenciador de CMV al extremo 5' del PR1.1 para crear un promotor híbrido. Se crearon plásmidos províricos que contenían cada uno de estos promotores, como se muestra en la Figura 3. Estos plásmidos províricos (p) contenían repeticiones terminales de AAV (TR), un promotor sintetizado (PR2.1-syn) o truncamientos del mismo, con o sin un potenciador de CMV (CMVenh) y un transgén de proteína fluorescente verde (GFP). Se construyeron y se secuenciaron los siguientes cuatro plásmidos províricos:

[0156] (1) pTR-PR2.1syn-GFP

[0157] (2) pTR-PR1.8-GFP

[0158] (3) pTR-PR1.6-GFP

[0159] (4) pTR-CMVenh-PRl.1-GFP.

[0160] Para construir pTR-PR2.1syn-GFP, primero se construyó un plásmido parental pTR-CMVenh-hGFP a partir de pTR-CBA-hRS1 reemplazando las secuencias CBA y hRS1 por secuencias hGFP. La secuencia de ADN de GFP humana (hGFP) se amplificó mediante PCR a partir de la fuente con cebadores de oligonucleótidos con sitios de restricción de endonucleasa en ambos extremos (Not I y BspHI), se digirió con Not I /BspHI y se unió al plásmido pTR-CBA-hRSl que había sido digerido con NotI/NcoI para eliminar todas las secuencias de ADN innecesarias incluyendo el promotor de beta actina de pollo y el hRS1 (pero no el potenciador de CMV). El plásmido resultante pTR-CMVenh-hGFP contiene el potenciador de CMV, el marco de lectura abierto (ORF) de hGFP y la secuencia poli (A) de SV40 flanqueada por ITR de AAV2. La secuencia de ADN PR2.1 se sintetizó de acuerdo con la secuencia de ADN 5' de la opsina del cono rojo humano (Wang Y.et al., A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes, Neuron, vol 9, pp429-440, 1992). El PR2.1 sintetizado estaba compuesto por bases que abarcaban desde -4564 hasta -3009 unidas a bases desde -496 hasta 0 y contenía un FCR esencial para la expresión de los genes de opsina L y M en seres humanos (Komaromy AMet al., Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters in recombinant AAV, Gene Therapy, vol 15, ppl049-1055, 2008). Además, se unió un donante/aceptor de corte y empalme SV40 (SD/SA) de 97 pares de bases al extremo del promotor PR2.1. PR2.1 sintetizado incluyendo la secuencia SD/SA se insertó en el vector de clonación pJ206 para generar pJ206-PR2.1syn. La secuencia de ADN PR2.1syn, incluyendo la secuencia SV40 SD/SA, se liberó de pJ206-PR2.1syn por digestión con HindIII/Acc65I y se insertó en pTR-CMVenh-hGFP que había sido digerido con HindIII/Acc65I para eliminar la secuencia potenciadora de CMV innecesaria para generar el plásmido pTR-PR2.1syn-hGFP.

[0161] Para construir plásmidos con versiones más cortas del promotor PR2.1, la secuencia PR2.1 con truncamiento de 300 pb, 500 pb o 1100 pb del extremo 5' de PR2.1 se amplificaron por PCR a partir de pJ206-PR2.1syn. Se diseñaron cuatro cebadores de oligonucleótidos:

[0162] 1) PR right-Hind: 2) PR1.1 Left-Hind:

[0163] 3) PR1.5 Left-Acc65I: y

[0164] 4) PR1.7 left-Acc65I: . El cebador PR right-Hind se combinó con los otros tres cebadores para amplificar por PCR PR1.1, PR1.5 y PR1.7, respectivamente. Se usó la mezcla de polimerasa Pfu Ultra HS con un ciclo térmico de 95 °C durante 5 min, y a continuación 35 ciclos de 94 °C durante 1 min, 58 °C durante 45 s y 72 °C durante 2 min.

[0165] PR1.1 se amplificó a partir de pJ206-PR2.1 syn usando el conjunto de cebadores PR right-Hind y PR1.1-left-Hind. El ADN amplificado se digirió con HindIII y se insertó en pTR-CMVenh-hGFP que había sido digerido con HindIII para generar el plásmido pTR-CMVenh-PR1.1-hGFP.

[0166] PR1.5 se amplificó a partir de pJ206-PR2. lsyn usando el conjunto de cebadores PR right-Hind y PR1.5-left-Acc65I. El ADN amplificado se digirió con HindIII/Acc65I y se insertó en pTR-CMVenh-hGFP, que se había digerido con HindIII/Acc65I, para generar el plásmido pTR-PR1.5-hGFP

[0167] PR1.7 se amplificó a partir de pJ206-PR2.1syn usando el conjunto de cebadores PR right-Hind y PR1.7-left-Acc65I. El ADN amplificado se digirió con Hindlll/Acc65I y se insertó en pTR-CMVenh-hGFP que se había digerido con Hindlll/Acc65I para generar el plásmido pTR-PR1.7-hGFP.

[0168] La secuencia de ADN del casete de expresión, incluyendo el promotor y hGFP, se confirmaron mediante secuenciación de ADN, y la ubicación de los TR se confirmó mediante mapeo de restricción SmaI.

[0169] Para examinar si el promotor PR2.1 es funcional para la transcripción de ARN y la consiguiente expresión de proteínas, una línea celular de epitelio pigmentario de la retina humana (RPE), APRE-19 y células renales embrionarias humanas HEK293 se sembraron en placas de 6 pocillos (5 x 10<5>células/pocillo) y a continuación se transfectaron con 1 µg de ADN de cada uno de los seis plásmidos: pTR-CMVenh-PR1.1-GFP, pTR-PR1.5-GFP, pTR-PRl.7-GFP, pTR-PR2.1syn-GFP, pTR-PR2.1-GFP (Control) o pTR-smCBA-GFP (control positivo). Se incubaron células transfectadas a 37 °C, incubadora con CO<2>al 5 % durante 4 días. Durante el período de incubación, las células transfectadas se examinaron mediante microscopía de fluorescencia para la expresión de GFP.

[0170] Resultados

[0171] La secuenciación de ADN y el mapeo de restricción de los cuatro plásmidos confirmaron que la secuencia y las TR de estos plásmidos províricos son correctas.

[0172] El análisisin vitrousando células ARPE-19 y HEK293 reveló que ninguna de estas líneas celulares soportaba la funcionalidad del promotor PR2.1. A las 24 h después de la transfección, se observó una fuerte expresión de GFP en células transfectadas con ADN de pTR-smCBA-GFP (control positivo). A las 48 h después de la transfección, se observó una expresión débil de GFP en células transfectadas con ADN de pTR-CMVenh-PR1.1-GFP. No se observaron células que expresaran GFP en ningún otro pocillo, es decir, aquellos transfectados con ADN de pTR-PR1.5-GFP, pTR-PR1.7-GFP, pTR-PR2.1syn-GFP o pTR-PR2.1-GFP. El plásmido pTR-PR2.1-GFP contiene el promotor PR2.1 de longitud completa, que se sabe que es funcional para la transcripción de ARN y la posterior expresión de GFPin vivo.(Komaromy AMet al., Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters in recombinant AAV, Gene Therapy, vol 15, ppl049-1055, 2008). Por lo tanto, estos resultados indican que la línea celular ARPE-19 no admite el promotor PR2.1, ni ninguna otra versión más corta del promotor PR2.1. Expresión débil de GFP a partir de pTR-CMVenh-PRl. Lo más probable es que la transfección de 1-GFP en las células se deba al potenciador CMV, lo cual aumenta considerablemente la fuerza del promotor PR1.1.

[0173] Se realizaron estudios adicionales para evaluar la eficacia y la especificidad de PR1.1, PR1.5, PR1.7 y PR2.1 para marcar como diana los conos en ratones, usando vectores rAAV que expresan proteína fluorescente verde (GFP). Las construcciones se empaquetan en una cápside de rAAV y se pruebanin vivoen un modelo de ratón. Como se muestra en las Figuras 5 y 6, cuatro vectores rAAV, es decir, rAAV5-CMVenh-PR1.1-GFP, rAAV5-PR1.5-GFP, rAAV5-PR1.7-GFP y rAAV5-PR2.1-GFP, se producen mediante un método convencional de transfección de plásmidos. Los vectores rAAV que se han empaquetado en células transfectadas se recogen mediante lisis celular y a continuación se purifican mediante gradiente de iodixanol (IDX) seguido de cromatografía en columna Q Sepharose HP, y se formulan en solución Alcon BSS. A continuación se inyecta a ratones normales mediante inyección subretiniana (1 µl) en ambos ojos (5 ratones por vector). Seis semanas después de la inyección, se sacrifica a los ratones, los ojos son enucleados y las secciones de retina se preparan. Las preparaciones se tiñen con DAPI para identificar los núcleos y se someten a inmunotinción para GFP y para PNA (un marcador para los fotorreceptores de cono). Los resultados se muestran en las Figuras 5 y 6. Se detectó la expresión de la proteína GFP en los fotorreceptores (conos y bastones) de los ojos que recibieron vectores rAAV5-GFP que contenían uno de los cuatro promotores, es decir, PR1.1, PR1.5, PR1.7 o PR2.1. En que, PR1.5 es un promotor relativamente más débil, y PR1.1 es un promotor fuerte pero tiene una expresión de GFP inespecífica en las células RPE. Globalmente, el promotor PR1.7 es comparable al promotor PR2.1 en términos de fuerza (ambos obtienen una puntuación ++ en el nivel de expresión de GFP en los conos) y especificidad del tipo celular (diana a los conos y también los bastones, pero no las células RPE).

[0174] EJEMPLO 2: Evaluación en primates no humanos

[0175] Se realizaron estudios adicionales para evaluar tres promotores específicos de conos y tres serotipos de cápside de AAV comparando su eficiencia y especificidad para dirigirse a los conos L, M y S en primates no humanos (NHP), usando vectores rAAV que expresan proteína fluorescente verde (GFP). En el primer estudio, seis macacos cangrejeros recibieron inyecciones subretinales bilaterales de AAV2tYF-GFP que contenía un promotor PR1.7, CSP o PR2.1. Cada ojo recibió dos inyecciones de 0,1 ml de vector AAV a una concentración de 5 x 10<11>vg/ml (dos ampollas de 0,05 ml/ojo, 1 x 10<11>vg/ojo). Doce semanas después del tratamiento, se obtuvo tejido retinal para PCR cuantitativa con retrotranscriptasa (qRT-PCR) e inmunohistoquímica. Se descubrió que el vector con el promotor PR1.7 produce una orientación robusta y específica de la expresión del gen indicador GFP (Grado 3) en los tres tipos de conos en las áreas de ampollas subretinales en todos los ojos de NHP. La Figura 7 muestra los resultados de la obtención de imágenes de autofluorescencia del fondo de ojo (FAF) en tiempo real para detectar la presencia de fluoróforos (GFP) en el ojo. Se observó tinción variable de GFP (Grados 0, 1 o 2) en las áreas de ampolla subretiniana en el grupo promotor PR2.1 y no se observó marcaje de GFP en ninguno de los ojos que recibieron el grupo promotor CSP (grado 0) (Figura 8, Tabla 1, a continuación). La Tabla 1 es un resumen de la clasificación inmunohistoquímica descrita en el presente estudio de selección de promotores. En la Tabla 1, la expresión de GFP se clasificó como 0 (sin tinción), 1 (tinción leve), 2 (tinción moderada) y 3 (tinción intensa).

[0176] Tabla 1

[0177] Ojo Promotor R G1 B1 R G2 B2 Media Media del grupo GFP+RG GFP+B 100253 OS Ninguno nd nd 0 0 0 0 nd nd IM080058 OS Ninguno nd nd 0 0 0 nd nd

[0178] IM083748 OS Ninguno nd nd 0 0 0 nd nd

[0179] 108050 OS AAV2tYF-CSP-GFP 0 0 0 0 0 0 no no 108051 OD AAV2tYF-CSP-GFP 0 0 0 0 0 no no I08053 OD AAV2tYF-CSP-GFP 0 0 0 0 0 no no I08054 OS AAV2tYF-CSP-GFP 0 0 0 0 0 no no I08053 OS AAV2tYF-PR2.1-GFP 1 1 0 0 0,5 1,4 sí no

[0180] I08050 OD AAV2tYF-PR2.1-GFP 1 2 1 1 1,25 sí sí

[0181] I08052 OD AAV2tYF-PR2.1-GFP 2 2 1 1 1,5 sí no

[0182] I08049 OS AAV2tYF-PR2.1-GFP 3 2 2 2 2,25 sí sí

[0183] I08049 OD AAV2tYF-PR1.7-GFP 3 3 3 3 3 3 sí sí

[0184] 108051 OS AAV2tYF-PR1.7-GFP 3 3 3 3 3 sí sí

[0185] I08052 OS AAV2tYF-PR1.7-GFP 3 3 3 3 3 sí sí

[0186] I08054 OD AAV2tYF-PR1.7-GFP 3 3 3 3 3 sí sí

[0187] Tomados en conjunto, los resultados de estos experimentos muestran que la fuerza y la especificidad de PR1.7 acortado son comparables a las de PR2.1 en ratones. Se descubrió que el promotor PR1.7 dirigía el nivel más alto de expresión de los conos verdes y azules reg/. Se ha identificado que el promotor nativo CNGB3 es un promotor fuerte y específico de RPE en ratones.

[0188] Equivalentes

[0189] Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar usando nada más que la experimentación habitual, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico que comprende un promotor específico de células de los conos que consiste en SEQ ID NO: 3.

2. Un ácido nucleico que comprende un promotor específico de células de los conos que consiste en SEQ ID NO: 2.

3. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el promotor es capaz de promover la expresión de CNGB3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L, o en donde el promotor es capaz de promover la expresión de CNGA3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L, o en donde el promotor es capaz de promover la expresión de GNAT2 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L.

4. Un vector de expresión adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico diana unida operativamente al ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde

(i) la secuencia de ácido nucleico diana codifica un polipéptido de la subunidad B del canal activado por nucleótidos cíclicos (CNGB3); o

(ii) en donde la secuencia de ácido nucleico diana codifica un polipéptido de la subunidad A del canal activado por nucleótidos cíclicos (CNGA3); o

(iii) en donde la secuencia de ácido nucleico diana codifica un polipéptido de la subunidad alfa-2 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina G(t) (GNAT-2).

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en donde rAAV es de serotipo 1, o en donde rAAV es de serotipo 2, o en donde rAAV es de serotipo 5, o en donde rAAV está comprendido dentro de un virión AAV.

6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en donde CNGB3 es CNGB3 de ratón; o en donde la CNGB3 es CNGB3 de rata; o en donde la CNGB3 es CNGB3 humana; o en donde la CNGA3 es CNGA3 de ratón o en donde la CNGA3 es CNGA3 de rata; o en donde la CNGA3 es CNGA3 humana; o en donde la GNAT-2 es GNAT-2 de ratón; o en donde la GNAT-2 es GNAT-2 de rata; o en donde la GNAT-2 es GNAT-2 humana.

7. Una célula de mamífero aislada que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Un casete de expresión de transgenes que comprende:

(a) un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(b) un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica CNGB3, una secuencia de ácido nucleico que codifica CNGA3 y un ácido nucleico que codifica GNAT2; y

(c) elementos reguladores mínimos seleccionados de uno o más del grupo que consiste en: una secuencia potenciadora, una secuencia de polienlazador, un sitio de poliadenilación, una o más secuencias señal de corte y empalme y repeticiones terminales invertidas de AAV.

9. Un vector de ácido nucleico que comprende el casete de expresión de la reivindicación 8.

10. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde el vector vírico es un vector vírico adenoasociado (AAV).

11. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular, en donde la enfermedad ocular está asociada a una mutación genética, una sustitución o una eliminación que afecta a las células de los conos de la retina, en donde la enfermedad ocular afecta al epitelio pigmentario de la retina; o en donde la enfermedad ocular es acromatopsia.

12. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular, en donde el vector de expresión promueve la expresión de CNGA3 o CNGB3 en las células de los conos de un sujeto.

13. El ácido nucleico para su uso o el vector de expresión para el uso de la reivindicación 11 o 12, en donde el vector de expresión es capaz de promover la expresión de CNGB3 en las células de los conos S, las células de los conos M y las células de los conos L.

14. El ácido nucleico para su uso o el vector de expresión para el uso de la reivindicación 13, en donde el vector de expresión es capaz de promover la expresión de CNGA3 en las células de los conos S, células de los conos M y células de los conos L; o en donde el vector de expresión es capaz de promover la expresión de GNAT-2 en las células de los conos S, células de los conos M y células de los conos L; o en donde el vector se administra por vía subretinal.