ES3053764T3 - Double-haploid method for sunflower plants - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método de doble haploide para plantas de girasol mediante ginogénesis in situ, caracterizado porque no se utiliza polen. La invención se basa únicamente en la castración, que permite obtener un embrión haploide inmaduro en el ovario de la planta, seguido del rescate del embrión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Procedimiento de haplodiploidización de plantas de girasol

[0003] La presente invención se refiere a un procedimiento de haplodiploidización de plantas de girasol.

[0004] La haplodiploidización, o técnica de producción de haploides dobles, es un procedimiento utilizado para fijar genéticamente, es decir, hacer homocigótico, material vegetal para la creación de variedades, más rápidamente que mediante autofecundación sucesiva.

[0005] Esta técnica se basa en la obtención de plantas haploides (n) a partir de los órganos masculinos (polen) o femeninos (óvulos) de la planta y, a continuación, en la duplicación de la reserva cromosómica.

[0006] La haploidía (n) es una condición genética natural y pasajera, ya que sólo los gametos tienen este estado genético y su vida es corta. La duplicación del número de cromosomas en estas células restablece el estado diploide normal (2n). Como las dos copias de cada gen son idénticas, el resultado son plantas diploides homocigóticas para cada locus. Como el estado haploide es inestable, el individuo regenerado es a veces diploide, por duplicación espontánea de la reserva cromosómica. En el trigo, el 20-25% de los haploides se duplican espontáneamente, y el 60-65% en la cebada, por ejemplo.

[0007] A falta de duplicación espontánea, o para garantizar un % más elevado, esta etapa de duplicación del stock cromosómico para permitir el paso al estado diploide se efectúa tradicionalmente mediante un tratamiento químico, frecuentemente la colchicina. El objetivo de este tratamiento con colchicina es duplicar la reserva cromosómica. La colchicina bloquea la división celular, es decir, detiene la mitosis en la fase de metafase bloqueando el huso de microtúbulos. El objetivo es pasar de n a 2n para obtener una planta fértil y viable.

[0008] De este modo se obtienen plantas diploides (2 n), homocigóticas para todos los loci del genoma; el material vegetal queda así "fijado", se denomina línea y puede utilizarse, por ejemplo, en cruces para producir híbridos. Una línea fija, o línea pura, es totalmente homocigótica. Por tanto, transmite exactamente el mismo patrimonio genético al 100% de su descendencia.

[0009] La haplodiploidización es una técnica rápida que permite obtener líneas puras en una sola etapa, en lugar de 7 a 8 generaciones en el caso de la autofecundación. Con este procedimiento, la duración total de un ciclo de selección varietal se acorta entre 3 y 5 años.

[0010] Como ya se ha indicado, las plantas haploides pueden obtenerse por cultivoin vitrode las células destinadas a suministrar las células reproductoras o gametos. En el caso de los gametos masculinos, esto se denomina androgénesis. En el caso de los gametos femeninos, se trata de la ginogénesis.

[0011] Históricamente, la androgénesis fue la primera forma de obtener haploidesin vitro. Las plantas haploides se obtuvieron mediante cultivo de anteras. Más recientemente, se ha desarrollado el cultivo de microsporas, cada vez más popular. La vía androgénica se ha aplicado con éxito a la colza, la cebada, el trigo, los espárragos, los pimientos y las berenjenas, entre otros. En el caso del girasol, también se ha descrito, pero da resultados insatisfactorios (Cf Todorova et al, Biotechnol.. & Biotechnol. Ec.11 (4) : 27-30,1997).

[0012] La haploidía inducida por ginogénesis implica el cultivoin vitrode óvulos u ovarios extraídos de la planta antes de la fecundación. Se han obtenido plantas haploides en cebada, tabaco, trigo, arroz, maíz y remolacha. Alternativamente, la ginogénesis también puede ser inducida por polinización con polen no funcional (desnaturalizado y/o interespecífico) o polen funcional (en el caso particular del maíz) que actúa como inductor del desarrollo haploide en la semilla. Salvo en el caso concreto del maíz, el resultado es un embrión inmaduro, desprovisto de los tejidos nutritivos de la semilla. Los girasoles (Helianthus annuus,L.) pertenecen a la familia de las asteráceas. Es una planta anual. La inflorescencia característica de las asteráceas (compuestas) es un capítulo floral que comprende, insertadas en su receptáculo carnoso, un gran número de pequeñas flores (flósculos) tubulares hermafroditas dispuestas en espiral y una fila periférica de flores liguladas estériles con una lengüeta muy coloreada.

[0013] Cada flósculo tubular y fértil tiene un cáliz modificado (escamas), 5 pétalos fusionados (tubo), un androceo sinantéreo con 5 anteras introrsas fusionadas que forman un estuche, los hilos están separados y se insertan en la base de la corola. El ovario inferior contiene 2 carpelos pero un solo óvulo, y está coronado por el estilo, que atraviesa el estuche formado por las anteras y termina en 2 estigmas.

[0014] La floración es centrípeta, abriéndose al mismo tiempo los flósculos de 3 ó 4 filas sucesivas, floreciendo primero los círculos periféricos. Esto significa que los flósculos de los bordes exteriores florecen primero. Todas las flores del capítulo pueden florecer durante quince días.

[0015] La apertura de una flor comienza por la mañana, los hilos de los estambres (órganos masculinos) se alargan rápidamente y la columna formada por las anteras sobresale de la corola. A continuación se dehiscencia, dejando el polen (gametos masculinos) en el interior de la columna.

[0016] La elongación del estilo (órgano femenino) en la columna empuja un poco de polen hacia el extremo del tubo formado por las anteras, que puede ser recogido por los recolectores. Al final de la tarde, los 2 estigmas, aún unidos, comienzan a salir del tubo formado por las anteras y, a la mañana siguiente, se separan y se enrollan. La cara interna receptiva de cada estigma, ya madura, está bien expuesta para retener el polen y permitir su germinación. El lado receptor de los estigmas presenta papilas cortas, densas y pegajosas.

[0017] La protandria de la flor (madurez de las partes fértiles masculinas que precede a la madurez de las partes fértiles femeninas) depende de la diferencia de velocidad de crecimiento (controlada por las hormonas vegetales) de los hilos y el estilo.

[0018] Como se ha mencionado anteriormente para la haploidización, la inducción haploide a partir de óvulos también es posible mediante polinización con polen desnaturalizado por irradiación.

[0019] Además, en el caso del girasol, la ginogénesis puede obtenerse por inducción mediante polinización con polen inactivado, por ejemplo irradiado, ya que el simple cultivo, sin inductor, de óvulos u ovarios no fecundados no produce embriones haploides (cf Todorova et al, HELIA, 22, Nr 31, 6649-56, 1999;Todorova et al, Euphytica, 97: 249-254, 1997).

[0020] La irradiación del polen lo vuelve inactivo, pero capaz de iniciar la división celular en el óvulo. Esto produce una plántula sin fecundación y, por tanto, también con el único lote de cromosomas maternos. Esto se conoce como partenogénesis inducida.

[0021] Sin embargo, estas técnicas son muy complejas y requieren mucho tiempo, ya que implican recoger el polen, tratarlo con rayos gamma en instalaciones específicas y, a continuación, polinizar con el polen tratado.

[0022] Alternativamente, la ginogénesis en girasoles también puede lograrse cultivando ovarios extraídos antes de la floración. La inducción de embriones haploides se consigue cultivando ovarios u óvulosin vitroutilizando un medio de cultivo inductor tras la extracción de los mismos (Gelebart et al, Agronomie, EDP Sciences, 7 (2), 81-86, 1987). En este caso, el embrión se forma fuera de la planta.

[0023] Esta técnica es muy tediosa y engorrosa, y muy pocos equipos han conseguido reproducirla de forma fiable y repetida. En cuanto a la producción de haploides de girasol por androgénesis, los rendimientos obtenidos y los defectos inducidos hacen que esta técnica no se utilice, o se utilice muy raramente.

[0024] Así pues, en el caso del girasol, se necesita una técnica de haploidización, incluida la haplodiploidización, que dé buenos resultados en términos de rendimiento y de plantas sin defectos, y que sea fácil de utilizar, evitando manipulaciones complejas.

[0025] Los inventores de la presente invención han descubierto así, sorprendentemente, que en el caso de la planta de girasol, la castración de las flores por eliminación de los órganos masculinos permite obtener en planta embriones haploides inmaduros, independientemente de cualquier polinización, ya sea con polen funcional o no funcional.Sumario de la invención

[0026] Así, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una planta o plántula haploide o doblemente haploide de girasol (Helianthus annuus) que comprende las siguientes etapas:

[0027]  a) Suministro de una planta de girasol diploide en la fase de floración del capítulo,

[0028]  b) Castración antes de la emisión del polen, en particular mediante la abscisión de las anteras de las flores tubulares,

[0029]  c) extracción de un embrión haploide inmaduro formado en el ovario no fecundado de flores tubulares de la planta,  d) Rescate del embrión haploide inmaduroin vitro,

[0030]  e) Obtención de una planta o plántula de girasol haploide o doblemente haploide,

[0031] el procedimiento se caracteriza por la ausencia de cualquier contacto de las flores tubulares con el polen de girasol (Heliantus annuus)..

[0032] Opcionalmente, el procedimiento según la invención puede incluir una etapa de duplicación cromosómica, en particular utilizando un agente de duplicación cromosómica, si es necesario.

[0033] Esta paso de duplicación cromosómica es, de hecho, opcional, ya que la duplicación cromosómica espontánea es posible y, en tal caso, dicha etapa de duplicación cromosómica no es necesario.

[0034] Si no se produce una duplicación cromosómica espontánea en el embrión obtenido y ésta es deseada y deseada, entonces la etapa en cuestión se hace necesaria.

[0035] Alternativamente, esta etapa también es opcional, y por lo tanto no se lleva a cabo, en el caso de que incluso en caso de no duplicación espontánea, ésta no se desee porque el objetivo es obtener una planta haploide.

[0036] Cuando la duplicación cromosómica sea necesaria y deseada y no se produzca espontáneamente, se proporcionará una etapa de duplicación cromosómica, en particular mediante el uso de un agente de duplicación cromosómica. Dicha etapa de duplicación cromosómica puede realizarse en el embrión, después de la etapa d) y antes de la etapa e).

[0037] Esta etapa de duplicación cromosómica también puede llevarse a cabo en la plántula, es decir, después de la etapa f).

[0038] Cuando se realiza en la plántula, la fase de duplicación cromosómica se lleva a cabo en las raíces o en el meristemo apical.

[0039] Ventajosamente, la plántula de girasol doble haploide es homocigota.

[0040] El procedimiento aquí descrito puede incluir una etapa adicional de autofecundación de las plantas haploides dobles resultantes para producir semillas de girasol homocigóticas. Las semillas así producidas por autofecundación permiten también obtener descendencia a partir de plantas obtenidas por el procedimiento de la invención. Estas semillas permiten propagar la planta de girasol simplemente sembrándola y cultivándola, y utilizarla cuando sea necesario para programas de cruces y selección.

[0041] Alternativamente, el procedimiento aquí descrito también puede incluir una etapa adicional de fertilización controlada y dirigida de las plantas haploides dobles obtenidas, utilizando polen de otra planta de girasol para crear progenie que pueda utilizarse directamente en un programa de selección varietal.

[0042] Definiciones

[0043] En el contexto del procedimiento según la invención, el término girasol se refiere a la plantaHélianthus annuusL. Una planta haploide o plántula tiene un solo juego de cromosomas y el número reducido de cromosomas (n) en la planta haploide es igual al del gameto.

[0044] Una planta diploide tiene dos juegos de cromosomas y el número de cromosomas (2n) es igual al del cigoto.

[0045] Una planta haploide duplicada, plántula haploide duplicada o célula haploide duplicada es aquella que se ha desarrollado duplicando un conjunto haploide de cromosomas.

[0046] Una planta o semilla obtenida de una planta doblemente haploide que sea autosostenible, independientemente del número de generaciones, puede seguir identificándose como planta doblemente haploide.

[0047] Una planta doblemente haploide se considera una planta homocigótica. Una planta se considera doble haploide si es fértil, aunque toda la parte vegetativa de la planta no incluya células con el juego doble de cromosomas. Por ejemplo, una planta se considerará doble haploide si contiene gametos viables, aunque sea quimérica.

[0048] Un "embrión doble haploide" es un embrión con una o más células que contienen 2 juegos de cromosomas homocigóticos.

[0049] Las expresiones "contacto", "entra en contacto con" o "puesto en contacto con" pueden significar "contacto directo" o "contacto indirecto".

[0050] Por ejemplo, el medio que contiene un agente de duplicación cromosómica puede estar en contacto directo con la célula haploide o el medio que contiene el agente de duplicación puede estar separado de la célula haploide por papel de filtro, tejido vegetal u otras células, de modo que el agente de duplicación se transfiera a través del papel de filtro o las células a la célula haploide.

[0051] El término "medio" incluye compuestos en estado líquido, gaseoso o sólido.

[0052] Tal y como se utiliza aquí, el término "planta" incluye plantas y plántulas, así como su descendencia. El término puede utilizarse indiferentemente en singular o en plural.

[0053] Una plántula es una planta joven con pocas hojas. Nacido del embrión de una semilla, su desarrollo comienza con la germinación de ésta.

[0054] "Célula vegetal", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, sin limitación, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas.

[0055] La expresión "fase de floración del capítulo" en el sentido de la presente invención significa que al menos algunos de los flósculos (es decir, al menos un flósculo) contenidos en el capítulo están abiertos, es decir, se encuentran en la fase de floración y tienen partes fértiles.

[0056] La expresión "embrión inmaduro" en el sentido de la presente invención significa que una estructura embrionaria, haploide o diploide, se ha desarrollado en el ovario del flósculo y se encuentra en una fase de desarrollo más temprana que el embrión maduro de la semilla, lo que hace necesaria su extracción para el cultivo en un medio nutritivoin vitro.

[0057] Descripción detallada

[0058] La etapa a) del procedimiento según la invención comprende, por lo tanto, proporcionar una planta de girasol diploide en la fase de floración del capítulo. Dicha planta puede obtenerse sembrando semillas de girasol, ya sean semillas homocigóticas, es decir, líneas, o semillas heterocigóticas, es decir, híbridos, por ejemplo híbridos F1.

[0059] Según una realización de la invención, la plántula en la etapa a) es homocigótica o heterocigótica.

[0060] La siembra se realiza mediante técnicas convencionales conocidas por un experto en la materia, sembrando en tazas y trasplantando después en macetas que contengan un sustrato adecuado, como un compost de siembra comercial para las tazas y un compost de crecimiento comercial para las macetas, por ejemplo.

[0061] Ventajosamente, las plántulas se siembran y se cultivan en invernadero, en particular a una temperatura de entre 18 y 20 °C y con un fotoperíodo de entre 12 y 20 horas, en particular de 16 horas, para que los capítulos florales estén bien desarrollados.

[0062] Normalmente, habrá un retraso de unas semanas, por ejemplo de 8 a 10 semanas, entre la siembra y la floración de las plantas, es decir, cuando las plantas hayan alcanzado la fase de capítulo floral.

[0063] Esta fase produce plantas de girasol al inicio de la floración, es decir, con la apertura de las primeras flores tubulares. Es la etapa b) del procedimiento según la invención la que adquiere importancia porque, como se ha indicado anteriormente, los inventores han observado que la castración de los órganos masculinos de las flores permite inducir el desarrollo de embriones haploides en los óvulos no fecundados de algunas de estas flores.

[0064] Esta etapa de castración b) comprende las siguientes subetapas y procede como sigue.

[0065] La castración tiene lugar a lo largo de varios días y puede comenzar el primer día, cuando los capítulos están completamente abiertos, con la abscisión de las flores liguladas de la periferia del capítulo. Esta etapa es opcional. Por lo tanto, la castración puede incluir una primera etapa en la que se eliminan las flores tubulares ya abiertas alrededor del capítulo.

[0066] Esta eliminación se hace manualmente, por ejemplo utilizando pinzas o una herramienta similar.

[0067] Hay que tener cuidado de retirar el ovario de la parte inferior del flósculos.

[0068] Luego, cada día, se procede a la abscisión de las anteras de las flores tubulares que salieron esa mañana.

[0069] Hay que tener cuidado de quitar sólo las anteras y no dañar ni quitar el pistilo.

[0070] Esta etapa de abscisión de las anteras puede llevarse a cabo utilizando pinzas, por ejemplo, o cualquier otra herramienta adecuada bien conocida por los expertos en la materia.

[0071] Antes de la abscisión de las anteras, los flósculos pueden lavarse para eliminar el polen que pueda haber caído de las anteras proximales.

[0072] Ventajosamente, esta etapa de castración mediante la abscisión de las anteras puede repetirse diariamente durante varios días a medida que las flores tubulares se desarrollan y abren en la fase masculina.

[0073] Normalmente, estas etapas de castración se repiten diariamente durante 2 a 7 días, particularmente de 3 a 4 días. Se eliminan las flores tubulares que no hayan abierto al final de la castración del capítulo, por ejemplo después de 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días o incluso 2 días a partir del primer día de castración por abscisión de las anteras. También puede hacerse con pinzas o herramientas similares.

[0074] Durante estas fases de castración, los capítulos pueden cubrirse con una bolsa sujeta con una corbata para evitar cualquier riesgo de polinización parasitaria.

[0075] Ventajosamente, la(s) etapa(s) de castración se lleva(n) a cabo bajo vidrio.

[0076] En general, se pueden tomar todas las precauciones para evitar la polinización y/o la contaminación por polen. En particular, las plantas en flor deben mantenerse alejadas de las plantas castradas.

[0077] Las herramientas utilizadas para la castración, como las pinzas utilizadas para la abscisión de las anteras, deben enjuagarse regularmente con agua durante la castración y lavarse con agua jabonosa después de las etapas de castración diarias y antes de las etapas de castración del día siguiente.

[0078] Tras las etapas de castración y de eliminación de las flores tubulares sin abrir, el capítulo del girasol sólo contiene flores sin órganos masculinos ni polen.

[0079] Por lo tanto, las plantas que tienen estos capítulos se dejan en macetas, en un invernadero, en condiciones de cultivo convencionales de temperatura y fotoperíodo, como se ha descrito anteriormente.

[0080] Después de 3 a 25 días, o incluso de 7 a 20 días, en particular entre 10 y 18 días, y más concretamente entre 11 y 15 días de cultivo de estas plantas, se cosechan los ovarios.

[0081] La etapa c) de extracción del embrión inmaduro contenido y formado en la semilla inmadura,in planta,puede realizarse bajo lupa binocular.

[0082] Es importante señalar que en el procedimiento según la presente invención, el embrión haploide inmaduro se forma en el ovario no fecundado, en la planta, es decir,in planta..

[0083] De hecho, según otras técnicas, se extrae el ovario o el óvulo, se cultiva en un medio estimulante e inductor y se forma el embriónin vitro. Esto es lo que se describe enGelebartet al, sin embargo no es el caso de la presente invención ya que el embrión se forma en el ovario no fecundado de las flores tubulares, y en la propia planta.

[0084] Esta etapa de extracción se lleva a cabo mediante técnicas conocidas por el experto.

[0085] En este caso, se extraen los ovarios de los capítulos antes de colocarlos en un recipiente individual, como un matraz Erlenmeyer o Becher.

[0086] Por lo general, los ovarios se lavan y desinfectan con soluciones adecuadas, como hipoclorito de calcio diluido. A continuación, los ovarios desinfectados pueden enjuagarse a fondo con agua destilada estéril.

[0087] El embrión haploide inmaduro puede extraerse del ovario por incisión en condiciones estériles y colocarse en un medio de cultivoin vitro.

[0088] Sorprendentemente, durante las fases exploratorias de la inducción de la ginogénesis clásica mediante polen irradiado, los inventores descubrieron que las semillas de los capítulos de girasol castradas podían contener embriones haploides inmaduros -pero viables-, a pesar de la ausencia de polinización o de inducción mediante polen irradiado. El procedimiento según la invención evita así la tediosa operación de recoger el polen y procesarlo.

[0089] El procedimiento según la invención se caracteriza así por la ausencia de contacto de las flores tubuladas con polen de girasol (Helianthus annuus); y si se trata de polen de girasol (Helianthus annuus) funcional o no funcional, por ejemplo irradiado.

[0090] En experimentos comparativos que incluían una etapa de contacto de los flósculos castrados con polen funcional o no funcional, en particular polen irradiado, los inventores descubrieron que la tasa de producción de embriones no cambiaba significativamente y que dicho contacto, presentado en la técnica anterior como una condición esencial para la inducción y producción del embrión, era de hecho innecesario.

[0091] Los embriones haploides inmaduros extraídos de semillas de flores tubulares castradas se someten a una fase de rescate embrionario. Esta etapa es necesaria porque, en ausencia de fecundación, no hay desarrollo de los tejidos nutritivos de la semilla y, por tanto, no hay supervivencia fuerain vitro.

[0092] Por ejemplo, pueden colocarse o ponerse en contacto con un medio de cultivo sólido para llevar a cabo la etapa d) rescate de embriones.

[0093] En la etapa d), el procedimiento según la invención prevé el rescate de embriones inmaduros utilizando una técnica conocida de rescate de embriones. El rescate embrionario se consigue, por ejemplo, poniendo un embrión en contacto con un medio que contenga nutrientes. Las fitohormonas pueden incluirse o no en el medio de rescate embrionario. Normalmente, los embriones inmaduros se colocan en un medio adecuado para el rescate embrionario. Estas técnicas son conocidas por los expertos en la materia. Un ejemplo es un medio de Murashige y Skoog (MS, 1962) con 2% de sacarosa y 0,8% de agar a pH 5,6-5,7 (cf Jambhulkar, S. J., 1995.. Rapid cycling through immature embryo culture in sunflower (Helianthus annuusL). Helia, 18(22): 45-50.).

[0094] Las placas de Petri pueden sellarse, por ejemplo con Parafilm<®>, para evitar la pérdida de humedad y colocarse en la oscuridad inicialmente durante unos 5 a 10 días, en particular unos 7 días, y luego en luz alterna día/noche (alternando 4pm/8am día/noche por ejemplo) a unos 25°C hasta que se produzcan las plántulas.

[0095] Al cabo de 1 a 2 semanas de cultivo en un medio de rescate de embriones adecuado, los embriones en desarrollo dan lugar a plántulas con raíces (de 2 a 6 cm aproximadamente y ramificadas) y un tallo (de 3 a 5 cm aproximadamente) con algunas hojas (de 1 a 5 cm aproximadamente).

[0096] Tras esta fase de rescate embrionario, se utiliza el análisis de ploidía para comprobar si las células vegetales son haploides o diploides.

[0097] Las células haploides (de embriones, semillas, plantas, etc.) pueden identificarse mediante varios procedimientos, como el recuento de cromosomas, la medición de la longitud de las células protectoras (en las hojas de las plantas) o el uso de un citómetro de flujo.

[0098] En los embriones o plántulas doblemente haploides puede realizarse una etapa de marcado molecular para comprobar que la diploidía se debe efectivamente a la duplicación cromosómica y, por tanto, que se trata de una plántula o embrión homocigótico, y no corresponde a un escape, es decir, que se debe a una autofecundación que da lugar a un individuo heterocigótico.

[0099] Según una realización de la invención, se obtiene una planta haploide duplicada (haplodiploide) (o plántula dependiendo del tamaño) poniendo en contacto un embrión haploide con un agente duplicador y se obtiene un embrión o planta haploide duplicada.

[0100] Esto se debe a que los cromosomas pueden duplicarse espontáneamente, por lo que es posible obtener plantas, embriones o plántulas con células diploides sin necesidad de tratamientos químicos de duplicación cromosómica. Así, las células haploides, los embriones haploides, las semillas haploides, las plántulas haploides o las plantas haploides pueden tratarse con un agente de duplicación cromosómica, en caso necesario, si la duplicación cromosómica no es espontánea. Así, las plantas homocigóticas pueden regenerarse a partir de células haploides poniendo en contacto células haploides, como células embrionarias haploides, o embriones haploides enteros, o plantas haploides enteras, con agentes de duplicación cromosómica.

[0101] El procedimiento según la invención se caracteriza porque comprende una etapa de tratamiento de duplicación cromosómica.

[0102] Según una realización, el procedimiento se caracteriza porque el tratamiento de duplicación cromosómica comprende la aplicación de un agente de duplicación cromosómica al embrión obtenido en la etapa d).

[0103] Según una realización, el procedimiento se caracteriza porque el tratamiento de duplicación cromosómica comprende la aplicación de un agente de duplicación cromosómica al meristemo apical de la plántula obtenida en la etapa e). Según otra realización, el procedimiento se caracteriza porque el tratamiento de duplicación cromosómica comprende la aplicación de un agente de duplicación cromosómica a las raíces de la plántula obtenida en la etapa e).

[0104] La presente descripción también da a conocer una planta o plántula de girasol haploide duplicada obtenida por un procedimiento según la invención que comprende una etapa de tratamiento de duplicación cromosómica.

[0105] Los procedimientos típicos consisten en poner en contacto las células con agentes duplicadores como la colchicina, agentes antimicrotúbulos o herbicidas antimicrotúbulos, pronamida, óxido nitroso o cualquier otro inhibidor mitótico, por ejemplo, con el fin de crear células haploides homocigóticas duplicadas.

[0106] La cantidad de colchicina utilizada en el medio es generalmente de 0,01% a 0,2% o aproximadamente 0,05%. Pueden utilizarse otros agentes con inhibidores mitóticos para mejorar la eficacia de la duplicación cromosómica.

[0107] El agente duplicador puede entrar en contacto con el embrión o la planta en distintos momentos. Si se aísla el embrión, el agente duplicador puede entrar en contacto inmediatamente después del aislamiento y antes de la germinación. Si el embrión está contenido en la semilla, puede entrar en contacto con el agente duplicador en cualquier momento. Si se va a tratar la planta, el contacto se realiza con toda o parte de la plántula haploide.

[0108] El tiempo de contacto entre el agente de duplicación cromosómica y el cromosoma puede variar. El contacto puede durar desde menos de 24 horas, por ejemplo de 4 a 12 horas, hasta alrededor de una semana. El tiempo de contacto suele ser de 24 horas a 2 días.

[0109] Las células haploides pueden entrar en contacto con el agente duplicador en la fase de embrión, en la fase de semilla madura, en la fase de plántula o, preferiblemente, en la fase de plántula.

[0110] En este último caso, el tratamiento puede dirigirse a las raíces o al meristemo apical.

[0111] En el caso del tratamiento de las raíces de las plántulas, puede preverse un tratamiento de 1 a 10 horas, en particular de 2 a 5 horas, con una solución de colchicina de 200 a 300 mg/L, en particular de 300 a 500 mg/L.

[0112] En el caso del tratamiento del meristemo apical, puede preverse un tratamiento de 3 a 8 horas, en particular alrededor de 5 horas, con una solución de colchicina de 1000 a 2000 mg/L, en particular 1500 mg/L. Normalmente, el tratamiento puede consistir en aplicar una gota de agente de duplicación cromosómica, en particular colchicina, en el meristemo apical.

[0113] Tras la duplicación cromosómica, el embrión o planta haploide duplicado contendrá 2 copias de cromosomas de origen materno. La eficacia del procedimiento de obtención de plantas doblemente haploides a partir de embriones haploides puede ser superior al 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%.

[0114] Los procedimientos de duplicación cromosómica se describen en la bibliografía, por ejemplo en Kasha (2005) Haploids in crop improvement II. Biotechnologie in Agriculture and forestry, Vol.56. Chap 1.7 pág.123-152..

[0115] Las plantas de girasol haploides o doblemente haploides obtenidas de este modo pueden someterse a una fase adicional de aclimatación.

[0116] Esta etapa permite que la plántulain vitrose establezca gradualmente en un nuevo entorno de crecimiento, diferente del cultivoin vitroen cuanto a clima, temperatura, humedad y recursos.

[0117] Para la planta joven, esto implica pasar de un medio de cultivo sólidoin vitroa un medio de cultivo como el compost para macetas y la tierra en un invernadero, que es lo más parecido posible a las condiciones reales de crecimiento de un girasol.

[0118] Esta fase de aclimatación puede consistir en transferir las plántulas a macetas con tierra para macetas, dispuestas en un mini invernadero, y expuestas a la alternancia del día y la noche a una temperatura de unos 18 a 20°C, por ejemplo. Una vez que las plántulas se hayan recuperado bien, pueden trasplantarse a macetas más grandes con tierra para macetas y colocarse en un invernadero.

[0119] Una vez que las plantas de girasol han florecido, hay que tener cuidado para evitar la polinización cruzada y se puede fomentar la autopolinización, por ejemplo colocando bolsitas en los capítulos.

[0120] Dicha etapa de autofecundación puede incluirse en el procedimiento según la invención y tener lugar después de que se hayan obtenido las plantas o plántulas haploides dobladas, con o sin una etapa de aclimatación.

[0121] La presente descripción también divulga un procedimiento como el descrito anteriormente, que comprende una etapa adicional, después de la etapa e), de autofecundación de las plantas de girasol doblemente haploides obtenidas con el fin de obtener semillas homocigóticas.

[0122] Alternativamente, también puede incluirse en el procedimiento descrito anteriormente una etapa de fertilización, en particular una fertilización dirigida, con polen de otra planta de girasol, que tendrá lugar después de que se hayan obtenido las plantas o plántulas haploides dobladas, con o sin una etapa de aclimatación.

[0123] Por lo tanto, la presente descripción también divulga un procedimiento según una de las realizaciones descritas anteriormente, que comprende una etapa adicional, después de la etapa e), de polinizar las plantas o plántulas haploides dobladas con polen de otra planta de girasol, con el fin de obtener semillas heterocigóticas.

[0124] Por último, la presente descripción también abarca el uso de semillas de girasol homocigóticas o semillas de girasol heterocigóticas obtenidas por un procedimiento según la presente invención, en un programa de creación y selección de nuevas plantas de girasol. Dicho programa de cría y selección puede incluir cruces de plantas homocigóticas o heterocigóticas de estas semillas de girasol homocigóticas o semillas de girasol heterocigóticas con otras plantas de girasol homocigóticas o heterocigóticas.

[0125] Como se ha indicado, un procedimiento puede incluir la etapa adicional de autofecundación de las plantas de girasol doblemente haploides para obtener semillas homocigóticas.

[0126] Tras la floración, generalmente se tarda de 4 a 6 semanas en cosechar las semillas, que serán homocigóticas y permitirán reproducir y fijar este genotipo homocigótico, que puede utilizarse en la selección varietal.

[0127] Realizaciones de la invención

[0128] Según una primera realización, la invención se refiere a un procedimiento para producir una planta o plántula haploide o doblemente haploide de girasol (Helianthus annuus) que comprende las siguientes etapas:

[0129]  a) Suministro de una plántula de girasol diploide en la fase de floración del capítulo,

[0130]  b) Castración antes de la emisión del polen, en particular mediante la abscisión de las anteras de las flores tubulares,

[0131]  c) extracción de un embrión haploide inmaduro formado en el ovario no fecundado de flores tubulares de la planta,  d) Rescate del embrión haploide inmaduroin vitro,

[0132]  e) Obtención de una planta o plántula de girasol haploide o doblemente haploide; el procedimiento se caracteriza por la ausencia de contacto de las flores tubuladas con el polen de girasol (Helianthus annuus).

[0133] Según otra realización, la invención se refiere a un procedimiento según la primera realización, caracterizado porque la plántula de la etapa a) es homocigótica o heterocigótica.

[0134] Según una tercera realización, la invención se refiere a un procedimiento según una de las modalidades precedentes, caracterizado porque la etapa de castración se repite diariamente durante varios días a medida que se desarrollan las flores tubulares,

[0135] Según una cuarta realización, la invención se refiere a un procedimiento según la tercera realización, caracterizado porque la castración se repite diariamente durante 2 a 7 días.

[0136] En una quinta realización, la invención se refiere a un procedimiento según una de las realizaciones precedentes, caracterizado porque el embrión haploide inmaduro se forma en el ovario no fecundado de la planta.

[0137] En una sexta realización, la invención se refiere a un procedimiento según una de las realizaciones precedentes, caracterizado porque las flores tubulares no abiertas después de la etapa de castración se eliminan antes de la etapa de extracción del embrión inmaduro.

[0138] En una séptima realización, la invención se refiere a un procedimiento según una de las realizaciones precedentes, caracterizado porque comprende una etapa de tratamiento de duplicación cromosómica.

[0139] Según una realización de la invención, el tratamiento de duplicación cromosómica puede comprender la aplicación de un agente de duplicación cromosómica al embrión obtenido en la etapa d).

[0140] Según una realización de la invención, el tratamiento de duplicación cromosómica puede comprender la aplicación de un agente de duplicación cromosómica al meristemo apical de la plántula obtenida en la etapa e).

[0141] Según una realización de la invención, el tratamiento de duplicación cromosómica también puede comprender la aplicación de un agente de duplicación cromosómica a las raíces de la plántula obtenida en la etapa e).

[0142] Ejemplos

[0143] Preparación de los pies

[0144] Las semillas de plantas de girasol híbridas o lineales se siembran en macetas con abono de siembra. Las plantas jóvenes se trasplantan a macetas de 7,5 litros con compost.

[0145] Las plantas se colocan en un invernadero con un fotoperiodo de 16 horas a una temperatura de unos 18°C. Las luces se apagan cuando los capítulos están completamente desarrollados y abiertos, es decir, cuando las flores liguladas son visibles.

[0146] Castración

[0147] El primer día de la castración:

[0148]  Retirar manualmente todas las flores liguladas del capítulo.

[0149]  Con unas pinzas, retirar los flósculos del borde del capítulo que ya se hayan abierto. Ten cuidado de extirpar también el ovario

[0150] Todos los días de castración:

[0151]  Las anteras extraídas esa mañana se retiran con pinzas. Ten cuidado de pellizcar sólo la punta de la antera para no arrancar el pistilo. Se pueden castrar varios flósculos al mismo tiempo.

[0152]  Se eliminan todos los flósculos aún cerrados del centro del capítulo (retirar con cuidado el ovario).

[0153] Rescate de embriones

[0154]  Coseche los capítulos entre 11 y 15 días después de la castración;

[0155]  Siembre los capítulos en el laboratorio y coloque los ovarios en matraces Erlenmeyer distintos para cada capítulo;  Desinfectar los ovarios con hipoclorito de calcio al 5% durante 15 minutos;

[0156]  Enjuagar los ovarios 3 veces durante 5 minutos con agua destilada estéril;

[0157]  Abrir los ovarios con una lupa binocular y extraer el embrión si está presente;

[0158]  Colocar el embrión en el medio sólido descrito por Todorova et al.1997.

[0159] Citometría

[0160] Compruebe el nivel de ploidía de las plántulas listas para la aclimatación mediante citometría de flujo. Las plántulas deben tener raíces, un tallo y alrededor de 1 ó 2 fases foliares. Las plántulas se sacaron delin vitrocon suficiente antelación para evitar la necrosis.

[0161] Duplicación cromosómica

[0162] Las plantas analizadas como haploides por citometría de flujo pueden tratarse con colchicina para duplicar su reserva cromosómica.

[0163] Se pueden tratar dos zonas de la planta: las raíces o el meristemo apical.

[0164] Dependiendo del procedimiento de ensayo, las raíces se trataron durante entre 2 y 5 horas con dosis de colchicina que oscilaban entre 300 y 500 mg/L.

[0165] El meristemo apical se trata durante 5 horas con una gota de colchicina a 1500 mg/L.

[0166] Aclimatación

[0167] Aclimatar las plántulas en tazas en compost de siembra en mini-invernaderos en una cámara de crecimiento a 18°C de noche y 20°C de día. Cuando aparezcan las raíces bajo la maceta, trasládelas primero al invernadero bajo un velo y, a continuación, trasplántelas con sustrato de cultivo. Pasados unos días, retira el velo de las plantas. Durante la floración, coloque bolsitas sobre las plantas para evitar la contaminación por polen y favorecer la autofecundación. Cosecha de semillas

[0168] Tras la floración, hay que esperar 5 semanas antes de cosechar las semillas. Coloca las semillas en bolsas pequeñas. Identifique cada bolsa con el número de la planta de la que proceden las semillas y la fecha de cosecha. Las semillas pueden almacenarse y luego sembrarse y utilizarse en un programa de cruces y selección.

[0169] El tiempo transcurrido entre la siembra de las plantas y la obtención de semillas homocigóticas, mediante castración, rescate embrionario y duplicación cromosómica, es de unos 5 meses. Esto contrasta con una serie de al menos 6 a 8 autofecundaciones necesarias para obtener un nivel similar de homocigosis, lo que puede llevar al menos 2 años. En la tabla 1 se resumen los resultados obtenidos con plantas diploides de girasol de arranque, en cuanto a la obtención de plantas haploides dobles mediante el procedimiento aquí descrito.

[0170] [Tabla 1]

[0173]

[0174]

[0176] Comprobamos que es posible obtener entre un 5 y un 40% de plantas haploides duplicadas con tasas de duplicación espontánea de entre un 6 y un 20%.

[0177] Estos resultados demuestran que el procedimiento según la invención permite obtener plantas dobles haploides de girasol de forma sencilla y rápida y sin necesidad de inducción de polen.

[0178] Pruebas con polen irradiado

[0179] Se realizó un experimento utilizando polen irradiado para comparar la eficacia de la presente invención y validar su concepto.

[0180] La tabla 2 siguiente muestra los resultados en % de semillas que presentan un embrión haploide inmaduro en un caso sin polinización (es decir, según la invención y como se presenta en el ejemplo anterior) y tres casos con lotes de granos de polen irradiados según técnicas conocidas en el estado de la técnica (cf Todorova et al, HELIA, 22, Nr 31, 6649-56, 1999 ; Todorova et al, Euphytica 97: 249-254, 1997).

[0181] [Tabla 2]

[0184]

[0186] Estos resultados demuestran que, contrariamente a los prejuicios de la técnica anterior, la inducción por contacto con polen inactivo (irradiado) no es un requisito previo y no modifica la inducción de semillas que contienen un embrión haploide inmaduro.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de producción de plantas o plántulas haploides o doblemente haploides de girasol (Helianthus annuus) que comprende las siguientes etapas:

a) Suministro de una plántula de girasol diploide en la fase de floración del capítulo,

b) Castración antes de la emisión del polen, en particular mediante la abscisión de las anteras de las flores tubulares,

c) extracción de un embrión haploide inmaduro formado en el ovario no fecundado de flores tubulares de la planta,

d) Rescate del embrión haploide inmaduroin vitro,

e) Obtención de una planta o plántula de girasol haploide o doblemente haploide,

estando el procedimientocaracterizado porla ausencia de contacto de las flores tubuladas con el polen de girasol (Heliantus annuus).

2. Procedimiento según la reivindicación 1,caracterizado porquela plántula de la etapa a) es homocigótica o heterocigótica.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores,caracterizado porquela etapa de castración se repite diariamente durante varios días, y ello a medida que se desarrollan las flores tubulares.

4. Procedimiento según la reivindicación 3,caracterizado porquela castración se repite diariamente durante 2 a 7 días.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porquelas flores tubulares no abiertas después de la etapa de castración, se eliminan antes de la etapa de extracción de embriones inmaduros.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porquecomprende una etapa de tratamiento de duplicación cromosómica.

7. Procedimiento según la reivindicación 6,caracterizado porqueel tratamiento de duplicación cromosómica comprende aplicar un agente de duplicación cromosómica al embrión obtenido en la etapa d).

8. Procedimiento según la reivindicación 6,caracterizado porqueel tratamiento de duplicación cromosómica comprende aplicar un agente de duplicación cromosómica al meristemo apical de la plántula obtenida en la etapa e).

9. Procedimiento según la reivindicación 6,caracterizado porqueel tratamiento de duplicación cromosómica comprende aplicar un agente de duplicación cromosómica a las raíces de la plántula obtenida en la etapa e).