ES3053907T3 - Compositions and methods for growth factor modulation - Google Patents

Abstract

Se proporcionan aquí proteínas, anticuerpos, ensayos y métodos útiles para modular los niveles y/o actividades de los factores de crecimiento. En algunas realizaciones, dichos factores de crecimiento pertenecen a la superfamilia de proteínas TGF-β. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones y métodos para la modulación del factor de crecimiento

[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0004] La invención se refiere a métodos para generar anticuerpos que inhiben la liberación de GDF-8 de un complejo factor de crecimiento-prodominio (GPC). La presente divulgación se refiere a proteínas recombinantes así como a anticuerpos dirigidos a tales proteínas. Tales proteínas y anticuerpos pueden estar relacionados con el campo de la biología de los miembros de la familia TGF-β.

[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0006] Las moléculas de señalización celular estimulan una variedad de actividades celulares. Dicha señalización a menudo está estrictamente regulada, a menudo a través de interacciones con otras biomoléculas, la matriz extracelular y/o celular o dentro de un entorno o nicho celular particular. Estas interacciones pueden ser directas o indirectas.

[0007] Las cascadas de señalización celular están implicadas en varias vías biológicas diversas que incluyen, entre otras, la modulación del crecimiento celular, la modulación de la homeostasis tisular, la dinámica de la matriz extracelular (ECM), la modulación de la migración celular, la invasión y la modulación/supresión inmunitaria. En algunos casos, las proteínas involucradas en la señalización celular se sintetizan y/o se secuestran en forma latente, lo que requiere algún tipo de estímulo para participar en los eventos de señalización. Sigue existiendo una necesidad en la técnica de agentes, herramientas y métodos para modular la señalización celular y/o las actividades celulares. US 2011/053221 A1 (Chen et al). describe sistemas de expresión para producir auténticos proteínas recombinantes humanas. Biswas y col. en J Clin Invest, vol.117, n° 5, mayo de 2007 (2007-05), páginas 1305-1313, describen el uso de un anticuerpo pan-TGF-β neutralizante (2G7) que se une al TGF-β maduro libre sólo después de que se libera el complejo latente.

[0008] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0009] La invención proporciona un método para generar un anticuerpo que inhibe la liberación de GDF-8 de un GPC, en el que el anticuerpo se prepara usando un antígeno recombinante que comprende la SEQ ID NO: 5, o un antígeno recombinante que comprende un GPC que comprende la SEQ ID NO: 70.

[0010] La invención también proporciona un método para generar un anticuerpo que inhibe la liberación de GDF-8 de un GPC que comprende:

[0011] (a) seleccionar un anticuerpo de un conjunto de dos o más anticuerpos candidatos sobre la base de la capacidad de asociarse con un antígeno, en el que el antígeno comprende un GPC, que comprende un prodominio de GDF-8 y un factor de crecimiento de GDF-8; y

[0012] (b) seleccionar un anticuerpo del conjunto de dos o más anticuerpos candidatos sobre la base de la capacidad de inhibir los niveles y/o la actividad del factor de crecimiento de GDF-8.

[0013] En la presente se divulgan proporciona proteínas recombinantes que comprenden una o más proteínas relacionadas con TGF-β que comprenden uno o más módulos de proteína seleccionados del grupo que consiste en complejos de prodominio de factor de crecimiento (GPC), péptidos de latencia asociados (LAPs), dominios similares a PAL, regiones de camisa recta, dominios de factores de crecimiento, regiones de sujetadores, regiones de sitios de escisión de furina, regiones de brazos, regiones de dedos, regiones N-terminales para asociaciones extracelulares, bucles de latencia, regiones helicoidales alfa 1, regiones helicoidales alfa 2, regiones de secuencia RGD, regiones de bucle de activación y regiones de pajarita. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender uno o más módulos de proteínas de una especie de vertebrado. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender uno o más módulos de proteínas que comprenden una o más mutaciones. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender una o más mutaciones que comprenden una o más regiones de sitios de escisión de furina. En algunos casos, tales mutaciones pueden prevenir la escisión enzimática de proteínas recombinantes de la presente divulgación. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender una o más mutaciones que comprenden una mutación de la secuencia de aminoácidos RXXR en la secuencia de aminoácidos RXG. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender una o más mutaciones que comprenden una mutación de la secuencia de aminoácidos RXXR en la secuencia de aminoácidos AXXA. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender una o más mutaciones que comprenden regiones N-terminales para asociaciones extracelulares. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender una o más mutaciones que comprenden la sustitución y/o deleción de al menos un residuo de cisteína presente dentro de aproximadamente los primeros 4, 5, 6 o 7 residuos de aminoácidos N-terminales. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender una o más sustituciones de al menos un residuo de cisteína con al menos un residuo de serina.

[0014] Las proteínas recombinantes pueden formar complejos con una proteína seleccionada del grupo que consiste de LTBP1, LTBP1S, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, GARP, LRRC33 y una combinación o fragmento de los mismos. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender uno o más marcadores detectables. Tales etiquetas detectables pueden comprender etiquetas de biotina, etiquetas de polihistidina y/o etiquetas de bandera.

[0016] También se divulgan en la presente proteínas quiméricas que comprenden uno o más módulos de la proteína de al menos dos TGF-β relacionados con las proteínas en donde dichos módulos de la proteína pueden seleccionarse de entre el grupo constituido por complejos de prodominio de factor de crecimiento (GPCs), péptidos asociados con latencia (PAL), dominios similares a Pa L, regiones de camisa recta, dominios de factores de crecimiento, regiones de sujetadores, regiones de sitios de escisión de furina, regiones de brazos, regiones de dedos, regiones N-terminales para asociaciones extracelulares, bucles de latencia, regiones helicoidales alfa 1, regiones de secuencia RGD, regiones de bucle de activación, regiones de pajarita y cualquiera de las enumeradas en las Tablas 2, 3 y 11. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender uno o más módulos de proteínas seleccionados de una o más especies de vertebrados. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender GPC. En algunos casos, tales GPC pueden comprender al menos un dominio PAL o similar a PAL de un miembro de la familia TGF-β y al menos un dominio de factor de crecimiento de un miembro de la familia TGF-β donde el dominio PAL o similar a PAL y el dominio de factor de crecimiento son de diferentes miembros de la familia TGF-β. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender al menos un dominio PAL o similar a PAL y al menos un dominio de factor de crecimiento, cada uno de los cuales se selecciona del grupo que consiste en TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, GDF-8, GDF-11 e inhibina beta A. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender una o más GPC en las que al menos una región N-terminal es de un miembro de la familia TGF-β, al menos una región C-terminal es de un miembro de la familia TGF-β y donde la región N-terminal y la región C-terminal son de diferentes miembros de la familia TGF-β. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender al menos una región N-terminal y al menos una región C-terminal seleccionada de regiones TGF-β1 terminales, regiones TGF-β2 terminales, regiones TGF-β3 terminales, regiones GDF-8 terminales, regiones terminales GDF-11 y la regiones terminales de inhibina beta A. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender una GPC de al menos un miembro de la familia TGF-β que comprende al menos una región del brazo de un miembro diferente de la familia TGF-β. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender una GPC que comprende al menos un miembro de la familia TGF-β que comprende al menos una región de bucle de activación de un miembro diferente de la familia TGF-β. En algunos casos, la proteína quimérica de la presente descripción puede comprender cualquiera de las combinaciones de módulos de proteína enumeradas en la Tabla 12.

[0018] Una proteína quimérica de la presente descripción puede estar complejada con una proteína seleccionada del grupo que consiste en LTBP1, Lt Bp 1S, LTBP2, LTBp 3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, GARP y LRRC33 y una combinación o fragmento de los mismos. En algunos casos, las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender uno o más marcadores detectables. En algunos casos, dichos marcadores detectables pueden comprender al menos un marcador de biotina, un marcador de polihistidina y/o un marcador indicador.

[0020] También se divulga en la presente un anticuerpo dirigido a cualquiera de las proteínas recombinantes y/o proteínas quiméricas divulgadas en la presente. Tales anticuerpos comprenden anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención están sustancialmente aislados. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales de la presente invención son anticuerpos estabilizantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos estabilizantes de la presente invención reducen el nivel de factor de crecimiento libre en relación con el nivel de factor de crecimiento asociado con una o más GPC. En algunas realizaciones, los anticuerpos estabilizantes pueden reducir la señalización celular dependiente del factor de crecimiento. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden comprender anticuerpos liberadores. Dichos anticuerpos pueden aumentar el nivel de factor de crecimiento libre en relación con el nivel de factor de crecimiento asociado con una o más GPC. En algunas realizaciones, la liberación de anticuerpos de la presente invención puede aumentar la señalización celular dependiente del factor de crecimiento.

[0022] En la presente también se divulgan composiciones que comprenden uno o más de cualquiera de las proteínas recombinantes, uno o más de cualquiera de las proteínas quiméricas y/o uno o más de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento en combinación con al menos un excipiente.

[0024] En la presente también se divulgan métodos para modular el nivel de factor de crecimiento libre en un nicho sujeto o célula que comprende el uso de una o más composiciones descritas en este documento. En algunos de estos métodos, se modula el nivel de señalización del factor de crecimiento.

[0026] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para seleccionar un anticuerpo deseado que comprende el uso de uno o más ensayos, en los que tales ensayos comprenden uno o más proteínas recombinantes de la divulgación. Algunos de estos métodos comprenden los pasos de 1) proporcionar un ensayo de unión de anticuerpos, 2) poner en contacto el ensayo de unión con uno o más anticuerpos candidatos, 3) obtener datos de unión relacionados con la afinidad del anticuerpo candidato por una o más proteínas recombinantes y 4) seleccionar un anticuerpo deseado en base a los datos de unión. Los ensayos de unión de acuerdo con tales métodos pueden incluir un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y/o un ensayo basado en clasificación de células asociadas a fluorescencia (FACS). En algunos casos, las proteínas recombinantes de dichos ensayos pueden complejarse con una proteína seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 153-161 y 286-292 o complejarse con una proteína seleccionada del grupo que consiste en LTBP1, LTBP1S, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, GARP, LRRC33, perlecano, decorina, elastina y colágeno. En algunos casos, las proteínas recombinantes pueden comprender una proteína quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 199-236 y 273.

[0027] Otros métodos de selección de un anticuerpo deseado puede comprender las etapas de 1) proporcionar un ensayo de actividad del factor de crecimiento, 2) poner en contacto el ensayo de actividad del factor de crecimiento con uno o más anticuerpos candidatos, 3) obtener datos de actividad del factor de crecimiento y 4) seleccionar un anticuerpo deseado basándose en los datos de actividad del factor de crecimiento. Los ensayos de actividad del factor de crecimiento de acuerdo con tales métodos pueden comprender ensayos basados en células seleccionados del grupo que consiste en ensayos basados en luciferasa y ensayos de proliferación. Dichos ensayos basados en células pueden comprender una o más células de expresión que expresan una o más proteínas recombinantes de la divulgación o un complejo de las mismas. Dichos ensayos pueden comprender además una o más células sensibles que producen datos de expresión génica y/o datos de viabilidad.

[0028] En la presente también se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de cualquiera de las proteínas recombinantes descritas en la presente, una o más de las proteínas quiméricas descritas en la presente y/o uno o más de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente y por lo menos excipiente farmacéuticamente.

[0029] En la presente también se divulgan métodos que comprenden el tratamiento de una indicación relacionada con TGF-β en un sujeto que comprende poner en contacto dicho sujeto con una composición de la invención. Las indicaciones relacionadas con TGF-β pueden incluir indicaciones fibróticas (por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, fibrosis cardiovascular, fibrosis cutánea y fibrosis de la médula ósea), mielofibrosis, cáncer o afecciones relacionadas con el cáncer (por ejemplo, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer, melanoma maligno y glioblastoma) y trastornos y/o lesiones musculares (por ejemplo, caquexia, distrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de la motoneurona, traumatismo, enfermedad neurodegenerativa, infección, artritis reumatoide, inmovilización, sarcopenia, miositis por cuerpos de inclusión y la diabetes.]

[0030] En la presente también se divulga un kit que comprende una composición de la invención e instrucciones para el uso de la misma.

[0031] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0032] Lo anterior y otros objetos, características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción de realizaciones particulares de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos. Los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar los principios de diversas realizaciones de la invención. La Figura 1 es un diagrama del árbol de la superfamilia TGF-beta, donde la divergencia es proporcional a la longitud de la rama.

[0033] La Figura 2 es un esquema de una realización de una representación lineal de un monómero de factor de crecimiento traducido. En tales realizaciones, los factores de crecimiento traducidos pueden comprender péptidos señal de secreción, prodominios y dominios de factores de crecimiento. En realizaciones según la realización representada aquí, los factores de crecimiento traducidos también pueden comprender un sitio de escisión entre las regiones prodominio y factor de crecimiento.

[0034] La Figura 3 es un esquema de una realización de un complejo de factor de crecimiento-prodominio (GPC) así como una realización de un dímero de factor de crecimiento libre y un dímero de péptido asociado a latencia libre (PAL). La flecha indica la capacidad de las proteínas de acuerdo con esta realización para alterar entre formas libres y complejas.

[0035] La Figura 4 es un esquema de una realización de un dímero de PAL libre y un dímero de factor de crecimiento libre con características marcadas y/o módulos de proteína.

[0036] La Figura 5 es un esquema de una realización de una GPC recombinante.

[0037] La Figura 6 es un esquema de realizaciones de GPC recombinantes mutantes.

[0038] La Figura 7 muestra representaciones esquemáticas de cinco proteínas recombinantes solas o en complejo con LTBP o GARP.

[0039] La Figura 8 muestra la alineación basada en la estructura entre las proteínas de miembros de la familia TGF-β [adaptadas de Shi et al (Shi, M. et al., Latent TGF-β structure and activation. Nature.201115 de junio; 474 (7351): 343-9] Los residuos de cisteína necesarios para la interacción con LTBP y/o GARP están encuadrados. Los residuos mutados en el síndrome de Camurati-Engelmann se indican con una estrella. Los sitios de escisión de proteasa son indicados con una flecha hacia arriba. Los módulos de proteínas y los elementos estructurales secundarios se indican con barras sólidas. Los residuos subrayados en el extremo N-terminal de GDF-8 corresponden a sitios de procesamiento de péptidos señal predichos alternativamente. Los "puntos de interrupción del módulo quimérico" indican regiones donde se conservan las características estructurales y proporcionar módulos para la construcción de proteínas quiméricas (intercambio de módulos entre miembros de la familia) en todos los miembros de la familia. Las regiones N-terminales se muestran en (A), las regiones internas se muestran en (B) y Las regiones C-terminales se muestran en (C).

[0040] Las Figuras 9A a C presentan 3 tablas que muestran el porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos encontradas en la familia TGF-β. La Figura 9A demuestra el porcentaje de identidad entre las proproteínas (prodominio y factor de crecimiento). El porcentaje de identidad entre los dominios del factor de crecimiento se presenta en la Figura 9B mientras que el porcentaje de identidad entre los prodominios se presenta en la Figura 9C.

[0041] La Figura 10 presenta una alineación realizada entre GDF-8 (miostatina) GDF-11, Inhibina A y un dímero de GDF-8. Las flechas indican los sitios de escisión. Las regiones involucradas en interacciones internas están encuadradas. Aparecen rectángulos sólidos sobre los residuos que se predice que están involucrados en choques estéricos en construcciones quiméricas. Las estrellas denotan importantes puntos de ruptura en los módulos de proteínas.

[0042] La Figura 11 representa la expresión y purificación de antígenos recombinantes y complejos de antígenos (SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie).

[0043] La Figura 12 presenta resultados de análisis de líneas celulares que expresan de manera estable complejos TGF-β1/GARP. Se marcaron con fluorescencia células 300.19 transfectadas de forma estable con control de vector vacío (A), proTGF-β1-GARP (B) o TGF-β1 PAL-GARP (C) con anticuerpos dirigidos a proteínas expresadas y se examinó la intensidad de fluorescencia mediante citometría de flujo. Los datos del ensayo de luciferasa se presentan en (D) que muestran la actividad de señalización de TGF-β resultante del cocultivo de estas células con células que expresan la integrina α<V>β6.

[0044] La Figura 13 representa proGDF-8 etiquetado con histidina recombinante, separado por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, como se visualiza mediante tinción de Coomassie.

[0046] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0048] Los factores de crecimiento son moléculas de señalización celular que estimulan una variedad de actividades celulares. Debido a su amplia influencia en los sistemas biológicos, la señalización del factor de crecimiento está estrictamente regulada, a menudo a través de interacciones con otras biomoléculas, la matriz extracelular y/o celular o dentro de un entorno o nicho celular particular. Estas interacciones pueden ser directas o indirectas.

[0050] Los factores de crecimiento del factor de crecimiento transformante beta (TGF-Β) de la familia están involucrados en una variedad de procesos celulares. La unión del factor de crecimiento a los receptores de tipo II conduce a la fosforilación y activación del receptor de tipo I (Denicourt, C. et al., Another twist in the transforming growth factor p-induced cell-cycle arrest chronicle. PNAS.2003.100 (26): 15290-1). Los receptores de tipo I activados pueden, a su vez, fosforilar los SMAD asociados al receptor (R-SMAD) que promueven la formación de dímero/trímero de co-SMAD (por ejemplo, SMAD4) y la translocación nuclear. Los complejos SMAD colaboran con cofactores para modular la expresión de genes diana de miembros de la familia TGF-β.

[0052] Las cascadas de señalización de miembros de la familia TGF-β están implicadas en una serie de diversas vías biológicas que incluyen, entre otras, la inhibición del crecimiento celular, la homeostasis tisular, la remodelación de la matriz extracelular (ECM), la transición endotelial a mesenquimal (EMT) en la migración celular e invasión e inmunomodulación/supresión así como en la transición mesenquimatosa a epitelial. La señalización de TGF-β relacionada con la inhibición del crecimiento y la homeostasis tisular puede afectar a las células epiteliales, endoteliales, hematopoyéticas e inmunes a través de la activación de p21 y p15INK para mediar la detención del ciclo celular y reprimir myc. En relación con la remodelación de ECM, la señalización de TGF-β puede aumentar las poblaciones de fibroblastos y la deposición de ECM (por ejemplo, colágeno). La señalización de TGF-β relacionada con la migración e invasión celular puede afectar a las células epiteliales y/o endoteliales, induciendo fenotipos similares a las de las células madre. Este aspecto de la señalización puede desempeñar un papel en la proliferación de células de músculo liso después de cirugía vascular y/o colocación de stents. En el sistema inmunológico, el ligando TGF-β es necesario para la función de las células reguladoras T y el mantenimiento del crecimiento y la homeostasis de las células precursoras inmunes. Casi todas las células inmunes comprenden receptores para TGF-β y TGF-β. Los ratones que mueren postnatalmente debido en parte a patologías inflamatorias. Finalmente, TGF-β suprime la activación inducida por interferón gamma de células asesinas naturales (Wi, J. et al., 2011. Hepatology.53 (4): 1342 51).

[0054] La solución reciente de la estructura cristalina de la forma latente de TGF-beta es una primera para toda la familia del TGF-beta y ofrece una visión profunda de estos complejos (Shi, M. et al., Latent TGF-β structure and activation. Nature.15 de junio de 2011; 474 (7351): 343-9). Casi toda la señalización de la familia TGF-beta pasa por una vía común por la que un ligando dimérico es reconocido por un complejo de receptor heterotetramérico que contiene dos receptores de tipo I y dos de tipo II. Cada receptor tiene un dominio de quinasa de serina-treonina. Los receptores de tipo II fosforilan los receptores de tipo I, que a su vez fosforilan los Smad regulados por el receptor que se traslocan y se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción.

[0056] Hay 33 miembros diferentes de la familia de TGF-beta en los seres humanos (Figura 1). Los miembros incluyen las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), inhibina, activina, factor de crecimiento y diferenciación (GDF), miostatina, hormona nodal, anti-Mulleriana y proteínas lefty. Una revisión de los miembros de la familia TGF-β, moléculas de señalización relacionadas así como sus relaciones se puede encontrar en Massague., 2000. Nature Reviews Molecular Cell Biology.1: 169-78. En algunas realizaciones, los factores de crecimiento maduros se sintetizan junto con sus prodominios como cadenas polipeptídicas únicas (ver Figura 2). En algunas realizaciones, tales cadenas polipeptídicas pueden comprender sitios de escisión para la separación de prodominios de factores de crecimiento maduros. En algunas realizaciones, tales sitios de escisión son sitios de escisión de furina reconocidos y escindidos por convertasas de proproteína.

[0058] En general, la homología entre los dominios del factor de crecimiento del miembro de la familia TGF-β es relativamente alta. Curiosamente, la homología de prodominio es mucho menor. Esta falta de homología puede ser un factor importante en la regulación alterada del factor de crecimiento entre los miembros de la familia. En algunos casos, los prodominios pueden guiar el plegamiento y/o dimerización adecuados de los dominios del factor de crecimiento. En algunos casos, se ha reconocido muy recientemente que los prodominios tienen funciones importantes para dirigir los factores de crecimiento (después de la secreción) a ubicaciones específicas en la matriz extracelular (MEC) y/o matriz celular, hasta que se reciben otras señales que causan la liberación del factor de crecimiento de latencia. La liberación de latencia se puede producir en entornos muy localizados mediante los cuales los factores de crecimiento pueden actuar a través de distancias cortas (por ejemplo de aproximadamente 1 célula de diámetro a aproximadamente unos pocos diámetros de células, de aproximadamente 2 diámetros celulares a alrededor de 100 diámetros celulares y/o de aproximadamente 10 células diámetros hasta unos 10.000 diámetros de células) y se despejan una vez que llegan a la circulación. Algunos complejos de factor de crecimiento-prodominio se secretan como homodímeros. En algunas realizaciones, los complejos prodominio-factor de crecimiento pueden secretarse como heterodímeros.

[0060] Como se usa en este documento, el término "proteína relacionada con TGF-β" se refiere a una isoforma TGF-β, un miembro de la familia TGF-β o de una proteína relacionada con el miembro de la familia TGF-β. Los miembros de la familia TGF-β pueden incluir, pero no se limitan a, cualquiera de los mostrados en la Figura 1 y/o enumerados en la Tabla 1. Estos incluyen, pero no se limitan a, proteínas TGF-β, BMP, miostatina, GDF e inhibinas. En algunos casos, la presente divulgación proporciona herramientas y/o métodos para aislar, caracterizar y o modular proteínas relacionadas con TGF-β. Los aspectos de la presente divulgación proporcionan herramientas y/o métodos para caracterizar y/o modular las actividades celulares relacionadas con la señalización de proteínas relacionadas con TGF-β. En otros casos, las herramientas de la presente divulgación pueden comprender antígenos que comprenden uno o más componentes de una o más proteínas relacionadas con TGF-β. Algunas herramientas pueden comprender anticuerpos dirigidos hacia antígenos de la presente divulgación. En realizaciones adicionales, las herramientas de la presente divulgación pueden comprender ensayos para la detección y/o caracterización de proteínas relacionadas con TGF-β, la detección y/o caracterización de anticuerpos dirigidos hacia proteínas relacionadas con TGF-β y/o la detección y/o o caracterización de actividades celulares y/o su señalización celular relacionada con proteínas relacionadas con TGF-β.

[0062] Proteínas de interés

[0064] Las proteínas relacionadas con TGF-β están implicadas en varios procesos celulares. En la embriogénesis, los 33 miembros de la familia de proteínas TGF-β participan en la regulación de los principales procesos de desarrollo y en los detalles de la formación de muchos órganos. Gran parte de esta regulación ocurre antes del nacimiento; sin embargo, la familia continúa regulando muchos procesos después del nacimiento, que incluyen, entre otros, las respuestas inmunitarias, la cicatrización de heridas, el crecimiento óseo, las funciones endocrinas y la masa muscular. Las proteínas relacionadas con TGF-β se enumeran y describen en las solicitudes de patente provisional de EE.UU.

[0065] 61/722,919, presentada el 6 de noviembre de 2012; 61/722.969, presentada el 6 de noviembre de 2012 y el 61/823.552, presentada el 15 de mayo de 2013.

[0067] Una lista de ejemplo de pro-proteínas de la familia TGF-β, es decir, la proteína después de la eliminación de la secuencia señal de secreción, se muestra en la Tabla 1. La pro-proteína contiene, y es la precursora, del prodominio y del factor de crecimiento. En la Tabla se muestran los nombres del miembro de la familia TGF-β de origen y la secuencia de la proproteína. También se identifican en “negrita” y se subrayan los sitios de escisión de proproteína de convertasa. Tras la escisión, el prodominio resultante retiene este sitio, mientras que el factor de crecimiento maduro comienza después del sitio de escisión. Se observa que Lefty 1 y Lefty 2 no son escindidos por convertasas de proproteína justo antes del inicio del factor de crecimiento maduro.

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[0089] Se hace notar que algunas prodominios pueden ser escindidos por enzimas de convertasa de proproteína. Como se usa en este documento, el término "convertasa de proproteína" se refiere a una enzima que escinde un prodominio de una proteína traducida para facilitar la maduración de la proteína. Algunas convertasas de proproteína de la presente divulgación incluyen las enzimas miembros de la familia de las convertasas de proproteína de tipo subtilisina (SPC). La familia de SPC comprende endoproteasas de serina dependientes de calcio que incluyen, entre otras, furina/PACE, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PACE4 y PC7 (Fuller et al., 2009. Invest Ophthalmol Vis Sci.50 (12): 5759-68). GDF-11 puede, en algunos casos, ser escindido por PC5/6. En algunos casos, las convertasas de proproteínas pueden escindir las proproteínas en sitios adicionales, distintos de los indicados en la Tabla 1. En algunos casos, las proproteínas pueden escindirse en un primer sitio de escisión (el primer sitio es el más cercano al extremo N). En otros casos, las proproteínas se pueden escindir en un sitio de escisión distinto del primer sitio de escisión. En algunos casos, la escisión de convertasa de proproteína puede ocurrir intracelularmente. En algunos casos, la escisión de convertasa de proproteína puede ocurrir extracelularmente.

[0091] Muchas proteínas de miembros de la familia TGF-β se sintetizan en conjunción con prodominios. Algunos prodominios pueden permanecer asociados con factores de crecimiento después de la escisión. Tales asociaciones pueden formar complejos de factor de crecimiento latente-prodominio (GPC) que modulan la disponibilidad de factores de crecimiento para la señalización celular. Los factores de crecimiento pueden liberarse de la latencia en las GPC a través de asociaciones con una o más proteínas extracelulares. En algunos casos, la liberación del factor de crecimiento puede depender de la fuerza aplicada a las GPC a través de interacciones de proteínas extracelulares. Tales fuerzas pueden extraer de las regiones C-terminal y/o N-terminal de las GPC, lo que da como resultado la liberación de factores de crecimiento asociados.

[0093] En algunos miembros de la familia TGF-β, la porción de prodominio de la GPC es responsable de la retención del factor de crecimiento y el bloqueo de la interacción de factores de crecimiento retenidos con sus receptores. Las porciones de prodominio de GPC que funcionan a este respecto se denominan péptidos asociados a latencia (PAL). Se sabe que TGF-β1, 2 y 3 comprenden PAL. Algunos prodominios pueden comprender dominios similares a PAL. Como se usa en este documento, el término "dominio similar a PAL" se refiere a porciones de prodominio de GPC y/o prodominios libres que pueden ser estructuralmente similares o sintetizarse de manera similar a los PAL, pero que pueden no funcionar para prevenir interacciones factor de crecimiento/receptor. Los prodominios GDF-8 y GDF-11 comprenden dominios similares a PAL.

[0095] Dependiendo de una variedad de factores, los factores de crecimiento pueden estar libres o asociados con uno o más dominios de PAL o similares a PAL. La Figura 3 es un esquema que representa una realización en donde un dímero del factor de crecimiento puede asociarse con un dímero PAL. En algunas realizaciones, las GPC comprenden módulos de proteínas necesarios para diferentes aspectos de la señalización, secreción, latencia y/o liberación del factor de crecimiento de las GPC latentes. Como se usa en este documento, el término "módulo de proteína" se refiere a cualquier componente, región y/o característica de una proteína. Los módulos de proteínas pueden variar en longitud, comprendiendo uno o más aminoácidos. Los módulos de proteínas pueden tener desde aproximadamente 2 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de longitud, desde aproximadamente 5 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 75 residuos de aminoácidos de longitud, desde aproximadamente 10 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 100 aminoácidos. residuos de ácido de longitud, desde aproximadamente 25 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 150 residuos de aminoácidos de longitud, desde aproximadamente 125 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 250 residuos de aminoácidos de longitud, desde aproximadamente 175 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de longitud, desde aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de longitud hasta aproximadamente 500 residuos de aminoácidos de longitud y/o al menos 500 residuos de aminoácidos de longitud.

[0096] Los módulos de proteínas comprenden una o más regiones con características conocidas funcionales (por ejemplo, proteína de dominio de unión, dominio de unión a ácido nucleico, bolsillo hidrofóbico, etc).Los módulos de la proteína pueden comprender dominios de proteína funcional necesarios para diferentes aspectos de la señalización, secreción, latencia y/o liberación del factor de crecimiento a partir de conformaciones latentes.

[0097] Los módulos de proteínas se pueden derivar de TGF-β relacionados con las proteínas. Dichos módulos de proteínas pueden incluir, entre otros, péptidos asociados a la latencia (PAL), dominios similares a PAL, dominios de factores de crecimiento, regiones de fijación, sitios de escisión de convertasa de proproteína (por ejemplo, sitios de escisión de furina), sitios de escisión B/TP, regiones de brazos, regiones de dedos, residuos (como residuos de cisteína, por ejemplo) para asociaciones de proteína extracelular [por ejemplo, proteína de unión de TGF-β latente (LTBP), fibrilina y/o proteína de repeticiones predominantes de glicoproteína A (GARP)], bucles de latencia (también denominadas aquí como lazos de latencia,) regiones helicoidales alfa 1, regiones helicoidales alfa 2, secuencias RGD y regiones de pajarita. La Figura 4 es un diagrama esquemático de una realización que representa dímeros de factor de crecimiento y PAL que comprenden módulos de proteínas.

[0098] Los módulos de proteínas se pueden derivar de una o más isoformas de TGF-β (por ejemplo, TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3). Dichos módulos de proteínas pueden comprender los módulos de proteínas y/o secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 2. Algunos módulos de proteínas de la presente invención pueden comprender secuencias de aminoácidos similares a las de la Tabla 2, pero comprenden menos aminoácidos adicionales que los enumerados. Dichas secuencias de aminoácidos pueden comprender aproximadamente 1 más o menos aminoácidos, aproximadamente 2 más o menos aminoácidos, aproximadamente 3 más o menos aminoácidos, aproximadamente 4 más o menos aminoácidos, aproximadamente 5 más o menos aminoácidos, aproximadamente 6 más o menos aminoácidos, aproximadamente 7 más o menos aminoácidos, aproximadamente 8 más o menos aminoácidos, aproximadamente 9 más o menos aminoácidos, aproximadamente 10 más o menos aminoácidos o más de 10 más o menos aminoácidos en los extremos N-terminal y/o C-terminal.

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[0108] Los dominios PAL o similares a PAL comprenden la porción de prodominio de una proteína relacionada con TGF-Β y/o GPC. Algunos dominios de PAL o similares a PAL pueden asociarse con factores de crecimiento en GPC. Algunos PAL pueden prevenir estéricamente la asociación del factor de crecimiento con uno o más receptores celulares. Los dominios de PAL o similares a PAL pueden comprender regiones de brazos y/o regiones de camisa de fuerza. Algunos dominios PAL o similares a PAL pueden comprender regiones C-terminales denominadas en el presente documento "regiones de pajarita". En algunos dímeros de dominio PAL o de tipo PAL, las regiones de pajarita de cada monómero pueden asociarse y/o interactuar. Dichas asociaciones pueden comprender la formación de enlaces disulfuro, como se encuentra entre los monómeros de PAL de isoforma TGF-Β.

[0109] Las regiones de brazo pueden comprender regiones de bucle de gatillo. Los bucles de activación pueden comprender regiones que se asocian con integrinas. Tales regiones pueden comprender secuencias de aminoácidos que comprenden RGD (Arg-Gly-Asp). Las regiones que comprenden secuencias RGD se denominan en el presente documento regiones de secuencia r Gd . En algunos casos, los dominios de PAL o similares a PAL comprenden bucles de latencia (también denominados en el presente documento lazos de latencia). Algunos bucles de latencia pueden mantener asociaciones entre dominios de PAL o similares a PAL y factores de crecimiento presentes dentro de las GPC. Los dominios de PAL o similares a PAL también pueden comprender regiones de fijación. Tales regiones de fijación pueden mantener asociaciones entre dominios de PAL o similares a PAL y factores de crecimiento presentes dentro de las GPC. Algunas regiones de fijación pueden mantener conformaciones de dominios PAL o similares a PAL que promueven la retención del factor de crecimiento.

[0110] En algunos casos, los CPM pueden requerir escisión enzimática para la disociación de los factores de crecimiento ligados. Tal escisión puede ser realizada en algunos casos por miembros de la familia de proteinasas de tipo BMP-1/Tolloide (B/TP) (Muir et al., 2011. J Biol Chem. 286 (49): 41905-11). Estas metaloproteinasas pueden incluir, pero no se limitan a BMP-1, proteína tolloide de mamífero (mTLD,) tipo tolloide de mamífero 1 (m TLLI) y similar a tolloide de mamífero 2 (mTLL2). Ejemplos de GPC que pueden ser escindidos por tales metaloproteinasas pueden incluir, pero no se limitan a GDF-8 y GDF-11. En algunos casos, GDF-8 puede ser escindido por mTLL2. En algunos casos, la escisión de tolloides puede ocurrir intracelularmente. En algunos casos, la escisión de tolloides puede ocurrir extracelularmente.

[0112] Las regiones de camisa recta pueden comprender regiones helicoidales alfa 1. En algunos casos, las regiones helicoidales alfa 1 se pueden colocar entre los monómeros del factor de crecimiento. Algunas regiones helicoidales alfa 1 comprenden regiones N-terminales de dominios de PAL o similares a PAL. Las regiones helicoidales alfa 1 también pueden comprender regiones N-terminales para asociaciones extracelulares. Estas asociaciones extracelulares pueden comprender proteínas de la matriz extracelular y/o proteínas asociadas con la matriz extracelular. Algunas asociaciones extracelulares pueden comprender asociaciones con proteínas que pueden incluir, entre otras, LTBP (por ejemplo, LTBP1, LTBP2, LTBP3 y/o LTBP4), fibrilinas (por ejemplo, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3 y/o fibrilina-4), perlecano, decorina y/o GARP (por ejemplo, GARP y/o LRRC33). Las asociaciones extracelulares N-terminales pueden comprender enlaces disulfuro entre residuos de cisteína. En algunos casos, las proteínas de la matriz extracelular y/o las proteínas asociadas con la matriz extraceullar pueden comprender enlaces con una o más regiones de dominios de tipo PAL/PAL distintos de las regiones N-terminales.

[0114] Los dominios del factor de crecimiento comprenden uno o más monómeros del factor de crecimiento. Algunos dominios de factores de crecimiento comprenden dímeros de factores de crecimiento. Dichos dominios de factores de crecimiento pueden comprender homodímeros o heterodímeros de factores de crecimiento (que comprenden monómeros de factores de crecimiento de diferentes proteínas relacionadas con TGF-β). Algunos dominios de factores de crecimiento pueden comprender regiones de dedos. Tales regiones de dedos pueden comprender láminas plegadas en p. Las regiones de los dedos pueden asociarse con dominios de PAL o similares a PAL. Algunas regiones de los dedos pueden mantener la asociación entre los dominios del factor de crecimiento y los dominios PAL o similares a PAL.

[0116] Las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender módulos de la proteína de proteínas de factor de diferenciación de crecimiento (GDF). Dichos módulos de proteína GDF pueden comprender los módulos de proteína y/o las secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 3. En algunos casos, los módulos de proteína de la presente divulgación pueden comprender secuencias de aminoácidos similares a las de la Tabla 3, pero comprenden menos aminoácidos que los enumerados. Algunas de estas secuencias de aminoácidos pueden comprender aproximadamente 1 más o menos aminoácidos, aproximadamente 2 más o menos aminoácidos, aproximadamente 3 más o menos aminoácidos, aproximadamente 4 más o menos aminoácidos, aproximadamente 5 más o menos aminoácidos, aproximadamente 6 más o menos aminoácidos, aproximadamente 7 más o menos aminoácidos, aproximadamente 8 más o menos aminoácidos, aproximadamente 9 más o menos aminoácidos, aproximadamente 10 más o menos aminoácidos o más de 10 más o menos aminoácidos en los extremos N-terminal y/o C-terminal.

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[0127] Dominios del factor de crecimiento entre miembros de la familia TGF-β son más altamente conservados mientras prodominios comprenden un gran porcentaje de identidad menor entre los miembros de la familia (Figura 9). La Tabla 5 demuestra esta tendencia entre las isoformas de TGF-β.

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[0135] Los prodominios pueden variar en longitud desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 400 o desde aproximadamente 300 hasta aproximadamente 500 residuos de aminoácidos. En algunos casos, los prodominios oscilan entre aproximadamente 169 y aproximadamente 433 residuos. Los prodominios pueden no estar relacionados en secuencia y/o tener baja homología. Algunos prodominios pueden tener pliegues similares y/o estructuras tridimensionales. Los prodominios de miembros de la familia TGF-β pueden comprender bucles de latencia. Dichos bucles pueden ser ricos en prolina. La longitud del bucle de latencia puede determinar la capacidad de tales bucles para rodear las regiones de los dedos del factor de crecimiento.

[0136] Los módulos de proteínas de algunos miembros de la familia TGF-β comprenden una identidad de secuencia baja con módulos de proteínas de otros miembros de la familia TGF-β. Tal baja identidad de secuencia puede indicar roles especializados para tales miembros de la familia con distintos módulos de proteínas.

[0137] La asociación de GPC con proteínas extracelulares puede fortalecer las interacciones prodominio-factor de crecimiento. En algunos casos, tales proteínas extracelulares pueden incluir, pero no se limitan a, LTBP, fibrilinas y/o GARP. En algunos casos, se requieren asociaciones de proteínas extracelulares para mantener latentes los factores de crecimiento en las GPC.

[0138] Se ha demostrado que la expresión de GARP se requiere para la expresión en la superficie de GPC en la superficie de las células de origen hematopoyético (Tran, DQ et al., GARP (LRRC32) es esencial para la expresión superficial de latente TGF-β en plaquetas y células T reguladoras FOXP3 activadas. PNAS.2009, 2 de junio 106 (32): 13445-50). GARP puede actuar como una atadura para mantener las GPC en su lugar en la superficie de estas células, incluidas, entre otras, células T reguladoras y/o plaquetas.

[0139] Proteínas recombinantes

[0140] En algunos casos, la presente divulgación proporciona proteínas recombinantes. Como se usa en este documento, el término "proteína recombinante" se refiere a una proteína producida por un gen y/o proceso artificial (por ejemplo, ingeniería genética). Dichas proteínas recombinantes pueden comprender uno o más módulos de proteínas de una o más proteínas relacionadas con TGF-β. Algunas proteínas recombinantes descritas en el presente documento pueden ser útiles como antígenos recombinantes. Como se usa en este documento, el término "antígeno recombinante" se refiere a una proteína recombinante que puede usarse para inmunizar uno o más huéspedes para la producción de anticuerpos dirigidos hacia uno o más epítopos presentes en tales antígenos recombinantes. Algunos antígenos recombinantes pueden ser antígenos basados en células. Como se usa en este documento, el término "antígeno basado en células" se refiere a antígenos recombinantes que se expresan en células para la presentación de tales antígenos en la superficie celular. Dichas células pueden usarse para inmunizar huéspedes para la producción de anticuerpos dirigidos a tales antígenos basados en células.

[0142] Las proteínas recombinantes descritas en este documento pueden usarse como agentes terapéuticos. Las proteínas recombinantes descritas en el presente documento pueden modular los niveles de factor de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento que comprenden proteínas relacionadas con TGF-β) y/o actividad (por ejemplo, señalización) tras la administración y/o introducción a uno o más sujetos y/o nichos.

[0144] Las proteínas recombinantes descritas en este documento pueden utilizarse para niveles de factor de crecimiento de ensayo (por ejemplo, factores de crecimiento que comprenden TGF-β relacionados con las proteínas) y/o actividad (por ejemplo, señalización). Algunas proteínas recombinantes descritas en el presente documento pueden usarse en el aislamiento de anticuerpos dirigidos a proteínas relacionadas con TGF-β. Las proteínas recombinantes de la presente divulgación también se pueden usar como antígenos recombinantes en el desarrollo de estabilizantes [reduciendo o previniendo la disociación entre dos agentes, (por ejemplo, liberación de factor de crecimiento de GPC, liberación de GPC de una o más interacciones de proteínas)] y/o anticuerpos de liberación [potenciando la disociación entre dos agentes (por ejemplo, liberación de factor de crecimiento de GPC, liberación de GPC de una o más interacciones de proteínas)]. Las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden incluir proteínas de miembros de la familia TGF-β así como componentes y/o módulos de proteínas de las mismas. Algunas proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender prodominios sin factores de crecimiento asociados, mutantes deficientes en la escisión de furina, mutantes deficientes en asociaciones de proteínas extracelulares y/o combinaciones de los mismos.

[0146] Las proteínas recombinantes pueden comprender marcadores detectables. Pueden usarse marcadores detectables para permitir la detección y/o aislamiento de proteínas recombinantes. Algunas etiquetas detectables pueden comprender etiquetas de biotina, etiquetas de polihistidina y/o etiquetas de bandera. Tales etiquetas se pueden usar para aislar proteínas etiquetadas. Las proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C. Dichos sitios permiten la escisión en el sitio de escisión de la proteasa 3C tras el tratamiento con proteasa 3C, que incluye, pero no se limita a, proteasa 3C de rinovirus. Dichos sitios de escisión se introducen para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas recombinantes.

[0147] GPC recombinantes

[0149] La Figura 5 es un esquema que representa una instancia de una GPC recombinante. Las proteínas recombinantes de acuerdo con la Figura 5 que comprenden proteínas miembro de la familia TGF-β pueden comprender características que incluyen, pero no se limitan a, regiones C-terminales del factor de crecimiento maduro, regiones N-terminales del prodominio y/o sitios de escisión de proproteína. El sitio de escisión de proproteína de las GPC de TGF-β recombinantes puede comprender, por ejemplo, la secuencia consenso de furina RXXR en donde R es arginina y X indica residuos de aminoácidos que pueden variar entre los miembros de la familia de TGF-β. Las secuencias del sitio de escisión de furina (aunque no se limitan a escisión por furina sola y pueden incluir escisión por otras enzimas de convertasa de proproteína) para cada miembro de la familia TGF-β se indican en la Tabla 1. Las GPC recombinantes de acuerdo con el caso representado en la Figura 5 también pueden comprender uno o más residuos de cisteína dentro y/o cerca de la región N-terminal del prodominio. Dichos residuos de cisteína pueden ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos, de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos y/o de aproximadamente 7 a aproximadamente 50 aminoácidos del extremo N-terminal del prodominio. Las GPC recombinantes también pueden comprender marcadores detectables. Tales marcadores detectables pueden ser útiles para la detección y/o aislamiento de GPC recombinantes. Los marcadores detectables pueden comprender 2 o más residuos de histidina (His). Dichos marcadores detectables también pueden denominarse en el presente documento marcadores de polihistidina. Las etiquetas de polihistidina pueden incluir etiquetas de hexahistidina o HIS-TAG™ (EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) que comprenden una cadena de seis residuos de histidina. Algunas etiquetas de polihistidina pueden estar presentes en el extremo N de las proteínas recombinantes descritas en el presente documento. Algunas etiquetas de polihistidina pueden estar presentes en el extremo C-terminal de las proteínas recombinantes descritas en el presente documento. Las proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C. Dichos sitios permiten la escisión en el sitio de escisión de la proteasa 3C tras el tratamiento con proteasa 3C, que incluye, pero no se limita a, proteasa 3C de rinovirus. Pueden introducirse algunos sitios de escisión para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas recombinantes.

[0151] En algunas realizaciones de la presente invención, las GPC recombinantes pueden comprender mutaciones en uno o más aminoácidos en comparación con secuencias de tipo salvaje. En algunos casos, una o más regiones de procesamiento proteolítico pueden estar mutadas. Tales regiones pueden comprender sitios de escisión de convertasa de proproteína. Mutaciones en el sitio de escisión de convertasa de proproteína (por ejemplo, la furina) previenen la escisión enzimática en ese sitio y/o previenen la escisión enzimática de los factores de crecimiento de sus prodominios (véase la Figura 6). Algunos sitios de escisión de la convertasa de proproteína que comprenden secuencias de RXXR pueden mutarse a RXG (en donde X indica un sitio donde los residuos de aminoácidos pueden ser variables). Tales mutaciones se abrevian en el presente documento como mutaciones "D2G" y pueden ser resistentes a la escisión enzimática. En algunos casos, los sitios de escisión de furina que comprenden secuencias de RXXR se mutan a AXXA. Tales secuencias AXXA también pueden ser resistentes a la escisión enzimática.

[0153] En algunas realizaciones, las regiones de procesamiento proteolítico por proteínas tolloide y/o similares a tolloide pueden mutarse para impedir tal procesamiento proteolítico. En algunos casos, las regiones de procesamiento tolloide en GDF-8 y/o GDF-11 pueden estar mutadas. En algunos casos, la mutación de residuos de ácido aspártico en residuos de alanina dentro de las regiones de procesamiento de tolloides previene el procesamiento de tolloides. Se ha demostrado que la mutación del residuo de ácido aspártico 76 (D76) de la proproteína de GDF-8 (miostatina) previene la activación proteolítica de GDF-8 latente (Wolfman, NM et al., PNAS.2003, 6 de octubre de 100 (26): 15842 6). En algunos casos, Asp 120 (D120, número de residuo contado de la proteína traducida, D98 de la proproteína de SEQ ID NO: 4) en GDF-11 se puede mutar para prevenir el procesamiento de tolloide (Ge et al., 2005. Cell Mol Biol 25 (14): 5846-58).

[0155] En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos pueden mutarse a fin de formar los CPM recombinantes con reducida latencia. Tales mutaciones se denominan en el presente documento "mutaciones activadoras". Estas mutaciones pueden introducir una o más regiones de choque estérico entre prodominios complejos y dominios de factores de crecimiento. Como se usa en este documento, el término "choque estérico", cuando se refiere a la interacción entre dos proteínas o entre dos dominios y/o epítopos dentro de la misma proteína, se refiere a una interacción repulsiva entre tales proteínas, dominios y/o epítopos debido a la posición de superposición en el espacio tridimensional. El choque estérico dentro de las GPC puede reducir la afinidad entre los prodominios y los dominios del factor de crecimiento, lo que da como resultado proporciones elevadas de factor de crecimiento libre a factor de crecimiento latente. En algunos casos, se pueden mutar uno o más aminoácidos para formar GPC recombinantes con mayor latencia. Tales mutaciones se denominan en el presente documento "mutaciones estabilizadoras”. Estas mutaciones pueden aumentar la afinidad entre los prodominios y los dominios del factor de crecimiento, lo que da como resultado una disminución de las proporciones de factor de crecimiento libre a factor de crecimiento latente.

[0157] La escisión de furina de proteínas recombinantes de la descripción puede, en algunos casos producirse intracelularmente. En algunos casos, la escisión por furina de proteínas recombinantes de la divulgación puede ocurrir extracelularmente.

[0159] En algunas realizaciones, las GPC recombinantes de la presente divulgación pueden comprender mutaciones en una o más regiones N-terminales para asociaciones extracelulares. Como se usa en el presente documento, el término "región N-terminal para asociación extracelular" se refiere a regiones en o cerca de N-terminales de proteína que pueden ser necesarias para asociaciones extracelulares con una o más regiones N-terminales. Tales regiones pueden comprender al menos el primer residuo N-terminal, al menos los primeros 5 residuos N-terminales, al menos los primeros 10 residuos N-terminales, al menos los primeros 20 residuos de aminoácidos y/o al menos los primeros 50 aminoácidos residuos ácidos. Algunas mutaciones pueden comprender desde aproximadamente 1 residuo de aminoácido hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácido, desde aproximadamente 5 residuos de aminoácido hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácido y/o desde aproximadamente 10 residuos de aminoácido hasta aproximadamente 50 residuos de aminoácido en o cerca de la proteína N-terminal. Dichas regiones pueden comprender residuos de asociación de LTBP, fibrilina y/o GARP. En algunos casos, pueden ser necesarios uno o más residuos de cisteína presentes dentro y/o cerca de las regiones N-terminales para asociaciones extracelulares para tales asociaciones. En algunos casos, los residuos de cisteína presentes dentro y/o cerca de las regiones N-terminales para asociaciones extracelulares están presentes dentro de aproximadamente los 2 primeros residuos N-terminales, aproximadamente los 3 primeros residuos N-terminales, aproximadamente los 4 primeros residuos N-terminales, aproximadamente los primeros 5 residuos N-terminales, aproximadamente los primeros 6 residuos N-terminales, aproximadamente los primeros 7 residuos N-terminales y/o al menos los primeros 30 residuos N-terminales. Algunas mutaciones en una o más regiones N-terminales para asociaciones extracelulares comprenden la sustitución y/o supresión de dichos residuos de cisteína. Tales mutaciones pueden modular la asociación de GPC y/o prodominios con una o más proteínas extracelulares, que incluyen, pero no se limitan a, LTBP, fibrilinas y/o GARP. Estas mutaciones también pueden comprender la sustitución de una o más cisteínas por otro aminoácido. Las sustituciones de residuos de cisteína se abrevian en el presente documento como "C#X" en donde # representa el número de residuo [contando desde el extremo N-terminal de la pro-proteína (sin el péptido señal)] del residuo de cisteína original y X representa el código de aminoácido de una letra para el aminoácido que se utiliza para la sustitución. Puede usarse cualquier aminoácido para tales sustituciones. En algunos casos, los residuos de serina (S) se utilizan para sustituir los residuos de cisteína.

[0161] En algunos casos, una o más cisteínas en una o más otras regiones de GPC puede estar sustituida o eliminada. En algunos casos, tales modificaciones de GPC pueden promover la liberación del factor de crecimiento maduro de los prodominios. En algunos casos, tales cisteínas pueden incluir las presentes en uno o más factores de crecimiento maduros, hélices alfa 2, sujetadores, lazos de latencia y/o regiones de pajarita.

[0163] En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender módulos de proteínas derivados de una o más especies, incluyendo mamíferos, incluyendo, pero no limitado a ratones, ratas, conejos, cerdos, monos y/o seres humanos. Las proteínas recombinantes pueden comprender uno o más aminoácidos de una o más secuencias de aminoácidos derivadas de una o más secuencias de proteínas no humanas enumeradas en la Tabla 8. En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender tales secuencias con o sin el péptido señal nativo.

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[0190] En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes se pueden combinar y/o complejos con uno o más adicionales componentes recombinantes. Dichos componentes pueden incluir proteínas extracelulares que se sabe que se asocian con GPC, incluidas, entre otras, LTBP, fibrilinas, perlecano, proteínas GASP1/2, folistatina, gen relacionado con la folistatina (FLRG), decorina y/o GARP (que incluyen, pero no se limitan a formas recombinantes de tales proteínas). Algunas GPC recombinantes de la presente divulgación deben coexpresarse con una o más de dichas proteínas extracelulares para una expresión y/o plegamiento adecuados.

[0192] En algunas realizaciones, LTBPs complejados pueden incluir, pero no se limitan a LTBP1, LTBP2, LTBP3 y/o LTBP4. Las LTBP complejadas pueden comprender fragmentos y/o mutaciones de LTBP. Algunas formas recombinantes de LTBP complejadas con GPC recombinantes pueden comprender variantes de LTBP empalmadas alternativamente. Algunas de estas variantes de LTBP1 se acortan en el extremo N-terminal, denominadas en el presente documento LTBP1 S. Algunas proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender LTBP, fragmentos o mutantes de las mismas que comprenden las secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 9.

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[0207] En algunas ralizaciones, LTBPs pueden comprender marcadores detectables. Pueden usarse marcadores detectables para permitir la detección y/o aislamiento de proteínas recombinantes que comprenden LTBP. Algunas etiquetas detectables pueden comprender etiquetas de biotina, etiquetas de polihistidina y/o etiquetas de bandera. Tales etiquetas se pueden usar para aislar proteínas etiquetadas. Las proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C. Dichos sitios permiten la escisión en el sitio de escisión de la proteasa 3C tras el tratamiento con proteasa 3C, que incluye, pero no se limita a, proteasa 3C de rinovirus. Dichos sitios de escisión pueden introducirse para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas recombinantes.

[0208] Los GARPs, incluyendo, pero no limitado a formas recombinantes de GARP, pueden ser complejados con GPC recombinantes. Algunas GPC recombinantes de la presente divulgación pueden coexpresarse con GARP para asegurar un plegamiento y/o expresión adecuados. En otros casos, el homólogo de GARP, la repetición rica en leucina que contiene 33 (LRRC33) o fragmentos y/o mutantes del mismo pueden sustituirse por GARP [también denominada aquí repetición rica en leucina que contiene 32 (LRRC32)]. Tales fragmentos LRRC33 y/o los mutantes pueden comprender una o más regiones de la secuencia LRRC33 enumerada en la Tabla 10 a continuación. Los GARP recombinantes también pueden comprender mutantes y/o fragmentos de GARP. Algunos GARP recombinantes pueden ser solubles (denominados aquí sGARP).

[0209] En algunas realizaciones, GARPs recombinantes pueden comprender una o más secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 10. Algunos GARPs recombinantes usados en este documento pueden expresarse sin los residuos N-terminales AQ. Los GARP expresados pueden comprender marcadores detectables. Estos marcadores detectables pueden usarse para permitir la detección y/o el aislamiento. Algunas etiquetas detectables pueden comprender etiquetas de biotina, etiquetas de polihistidina y/o etiquetas de bandera. Tales etiquetas se pueden usar para aislar proteínas etiquetadas. Las proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C. Dichos sitios permiten la escisión en el sitio de escisión de la proteasa 3C tras el tratamiento con proteasa 3C, que incluye, pero no se limita a, proteasa 3C de rinovirus. Pueden introducirse sitios de escisión de proteasa 3C para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas recombinantes.

[0212]

[0216]

[0217]

[0221]

[0224] GPC unidos a LTBPs pueden adoptar tres conformaciones dimensionales que son distintas de conformaciones encontradas con CPM unidos a GARP o de otras proteínas de la matriz. Esto puede deberse, en algunos casos, a la presencia de cisteínas disponibles en LTBP para la formación de enlaces de disulfuro con GPC que comprenden una distancia diferente entre sí que las cisteínas correspondientes disponibles para la formación de enlaces disulfuro en GARP. Tales diferencias en las conformaciones tridimensionales pueden proporcionar epítopos únicos dependientes de la conformación en las GPC. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se dirigen a tales epítopos dependientes de la conformación. Dichos anticuerpos pueden funcionar selectivamente para activar o inhibir la actividad del factor de crecimiento dependiendo de la identidad de la proteína unida (por ejemplo, LTBP o GARP). En algunos casos, pueden estar presentes diferentes epítopos dependientes de la conformación en las hélices alfa N-terminales de proTGF-β cuando se unen a LTBP o GARP.

[0226] Las proteínas recombinantes pueden coexpresarse con la proteína sérica asociada a GDF (GASP) 1 y/o GASP-2. Dichas proteínas recombinantes pueden incluir, pero no se limitan a, GDF-8 y/o GDF-11. Las GASP son proteínas circulantes que se unen e impiden la actividad de GDF-8 y GDF-11 (Hill, J.J. et al., 2003. Mol Endocrinology.

[0227] 17(6):1144-54 y Hill, J.J. et al., 2002. JBC. 277(43):40735-41). Curiosamente, los factores de crecimiento GDF-8 y GDF-11 no se encuentran libres en el suero. Aproximadamente el 70% se encuentra en las GPC y el 30% restante asociado a las GASP, así como a otras proteínas (por ejemplo, la follistatina, el gen relacionado con la follistatina y la decorina). Los estudios que usan ratones que carecen de expresión de GASP-1 y/o GASP-2 muestran fenotipos indicativos de la hiperactividad de la miostatina y/o la GDF-11 (Lee et al., 2013. PNAS.110(39):E3713-22.) Las GDF 8 y/o GDF-11 unidas a GASP son incapaces de unirse a receptores de tipo II y transmitir señales celulares relacionadas.

[0228] Algunas proteínas recombinantes se pueden coexpresar con perlecano. Dichas proteínas recombinantes pueden incluir, pero no se limitan a, GDF-8. Los estudios de Sengle y col. (Sengle y col., 2011. J Biol Chem.286 (7): 5087-99) encontraron que el prodominio GDF-8 se asocia con el perlecano. Estudios adicionales indican que el knockout de perlecano conduce a hipertrofia muscular, lo que sugiere que la interacción entre GDF-8 y perlecano puede contribuir a la actividad de Gd F-8 (Xu et al.2010. Matrix Biol.29 (6 ): 461-70.)

[0229] En algunos casos, las proteínas recombinantes pueden coexpresarse con folistatina y/o FLRG. Dichas proteínas recombinantes pueden incluir, pero no se limitan a, GDF-8. Se sabe que tanto la folistatina como la FLRG antagonizan algunas proteínas miembros de la familia TGF-β, incluidas, entre otras, GDF-8 (Lee, SJ. Et al., 2010. Mol Endocrinol. 24 (10): 1998-2008, Takehara-Kasamatsu, Y. et al., 2007. J Med Invest. 54 (3-4): 276 88 ). Se ha demostrado que la folistatina bloquea la actividad de GDF-8 al unirse al factor de crecimiento libre y evitar la unión al receptor. Tanto la folistatina como el FLRG están implicados en la modulación de la actividad del factor de crecimiento durante el desarrollo.

[0230] En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes de la divulgación se pueden coexpresar con decorina. Dichas proteínas recombinantes pueden incluir, pero no se limitan a, TGF-β y GDF-8. La decorina es un antagonista conocido de la actividad de TGF-β (Zhu, J. et al., 2007. J Biol Chem.282: 25852-63) y también puede antagonizar a otros miembros de la familia de TGF-β, incluyendo, pero no limitado a GDF-8. Se ha demostrado que la inhibición de la actividad de TGF-β y GDF-8 dependiente de decorina reduce la fibrosis en varios tejidos. También se ha demostrado que la expresión de decorina aumenta la expresión de folistatina, un inhibidor conocido del GDF-8 libre.

[0231] Factores de diferenciación del crecimiento (GDF,) activinas e inhibinas recombinantes

[0232] Los factores de diferenciación del crecimiento (GDF), las activinas y las inhibinas son proteínas miembros de la familia TGF-β implicadas en una serie de actividades celulares y/o de desarrollo. Las proteínas recombinantes divulgadas en la presente pueden comprender uno o más módulos proteicos de uno o más GDF, activinas y/o inhibinas. Los módulos de proteínas de GDF pueden comprender módulos de proteínas de GDF-8 y/o GDF-11.

[0233] El GDF-8 y el GDF-11, que se secretan como complejos latentes (Sengle et al., 2011. J Biol Chem.

[0234] 286(7):5087-99; Ge et al., 2005. Mol Cel Biol.25(14):5846-58,) muestran la conservación de los residuos de elementos de sujeción (Lys 27 y Tyr 75 del TGF-β1; véase la Figura 8.) El GDF-8 (también denominado en la presente miostatina) está implicado en la regulación de la masa muscular, y su deficiencia aumenta la masa muscular en múltiples especies, incluyendo en los humanos (Rodino-Klapac, L.R. et al., 2009. Muscle Nerve. 39(3):283-96). El GDF-8 puede encontrarse en la circulación en forma latente, pero también puede almacenarse en la matriz extracelular, unido a LTBP3 (Anderson et al., 2007. J Biol Chem. 283(11):7027-35) o perlecan (Sengle et al., 2011. J Biol Chem.

[0235] 286(7):5087-99.) Mientras está formando complejo con su prodominio, el GDF-8 es incapaz de participar en la unión de receptor con el receptor de tipo II, ActRIIB (Sengle et al., 2008. J Mol Biol.381(4):1025-39.) Mientras que el GDF-8 se expresa principalmente en el músculo, la expresión del GDF-11 es más sistémica y se piensa que su actividad está implicada en múltiples procesos (Lee et al., 2013. PNAS. 110(39):E3713-22.). Se cree que participa en el desarrollo de múltiples tejidos que incluyen, pero no se limitan a, la retina, el riñón, el páncreas y el sistema olfativo. También se cree que es un factor circulante en la sangre (Sinha, M. et al., 2014. Science Express.

[0236] 10.1126/science.1251152, p2-6 y Katsimpardi, L. et al., 2014. Science Express.10.1126/science.1251141).

[0237] El GDF-8 y el GDF-11 también comparten una homología considerable. Mientras que los prodominios sólo comparten un 48% de homología, los dominios del factor de crecimiento de GDF-8 y GDF-11 comparten un 90% de homología (60% de homología cuando se toman juntos los prodominios y los factores de crecimiento).

[0238] La liberación de GDF-8 y GDF-11 de GPC latentes requiere la escisión de los prodominios en el sitio de escisión BMP/Tolloid(situado entre Arg 75 y Asp 76 en GDF-8 y entre Gly 97 y Asp 98 en GDF-11) por las metaloproteinasas BMP1/Tolloid. Esta escisión se encuentra entre la hélice α2 y el elemento de sujeción. Por tanto, por lo menos dos métodos diferentes de desatar la región de sujeción, la fuerza y la proteólisis, pueden liberar a los miembros de la familia de la latencia.

[0239] En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes usadas en los métodos de la presente invención que comprenden GDF pueden comprender secuencias enumeradas en la Tabla 11 o fragmentos de las mismas.

[0240] Tabla 11. GDF Recombinantes

[0241]

[0242] continuación

[0245]

[0248] Las activinas e inhibinas son proteínas de miembro de la familia TGF-β, la actividad de cada una de las cuales a menudo resulta en funciones opuestas (Bilezikjian et al 2012). Como otros miembros de la familia, estas proteínas se presentan fisiológicamente como dímeros. Las activinas y las inhibinas se construyen en parte a partir de las mismas subunidades p, que pueden incluir inhibina-beta A, inhibina-beta B, inhibina-beta C e inhibina-beta E (denominadas en el presente documento como subunidades p A, B, C y E, respectivamente). La diferencia entre activinas e inhibinas, estructuralmente, es que las activinas son dímeros de subunidades p mientras que las inhibinas son heterodímeros, en donde la segunda subunidad es inhibina-a. Las activinas se nombran por sus pares de subunidades, de modo que la activina A comprende un homodímero de dos subunidades A, la activina AB comprende un dímero de las subunidades A y B, B comprende un dímero de las subunidades B, etc. (Muenster et al 2011). Las activinas están involucradas en una variedad de funciones que pueden incluir, pero no se limitan al crecimiento celular, diferenciación, muerte celular programada, funciones endocrinas, metabolismo celular, crecimiento óseo, etc. Son especialmente reconocidas por su control de los ciclos hormonales reproductivos. La señalización de activina e inhibina a menudo funciona de manera antagónica a este respecto.

[0250] Proteínas quiméricas

[0252] En algunos casos, las proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden comprender proteínas quiméricas. Como se usa en este documento, el término "proteína quimérica" se refiere a una proteína que comprende uno o más módulos de proteína de al menos dos proteínas diferentes [formadas a partir del mismo gen (por ejemplo, variantes que surgen de un corte y empalme alternativo) o de genes diferentes]. Las proteínas quiméricas pueden comprender módulos de proteínas de dos o más proteínas de miembro de la familia TGF-β. Dichas proteínas quiméricas pueden comprender módulos de proteína de TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3. Algunas proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender módulos de proteína que incluyen, pero no se limitan a, los módulos de proteína y/o secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 12 (los números de residuos corresponden a las secuencias de proproteínas enumeradas en la Tabla 1). Algunas proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender módulos de proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos similares a las de la Tabla 12, pero que comprenden menos aminoácidos adicionales o menos que los enumerados. Dichos módulos pueden comprender aproximadamente 1 más o menos aminoácidos, aproximadamente 2 más o menos aminoácidos, aproximadamente 3 más o menos aminoácidos, aproximadamente 4 más o menos aminoácidos, aproximadamente 5 más o menos aminoácidos, aproximadamente 6 más o menos aminoácidos, aproximadamente 7 más o menos aminoácidos, aproximadamente 8 más o menos aminoácidos, aproximadamente 9 más o menos aminoácidos, aproximadamente 10 más o menos aminoácidos o más de 10 más o menos aminoácidos en los extremos N-terminal y/o C-terminal.

[0253]

[0254]

[0255]

[0256]

[0257]

[0258]

[0259]

[0263]

[0265] Las proteínas quiméricas pueden comprender combinaciones de cualquiera de los módulos de proteínas listados en la Tabla 12. Algunas proteínas quiméricas que comprenden los CPM pueden comprender módulos de proteínas que han sido sustituidos con cualquiera de los módulos de proteínas enumerados en la tabla 12.

[0266] Las proteínas quiméricas pueden comprender módulos proteicos de GDF y/o inhibinas. Tales GDF pueden incluir GDF-11 y/o GDF-8. Algunas de dichas proteínas quiméricas pueden comprender un prodominio de GDF-11 y un factor de crecimiento de GDF-8. Las proteínas quiméricas pueden comprender regiones N-terminales sustituidas entre GDF-11 y GDF-8. Las proteínas quiméricas pueden comprender un prodominio de GDF-8 y un factor de crecimiento de GDF-11. Tales proteínas quiméricas pueden comprender residuos de aminoácidos 1-108 de GDF-11 y residuos de aminoácidos 90-el final de la proteína de GDF-8. Algunas proteínas quiméricas pueden comprender una región del brazo de GDF-11.

[0267] Algunos quiméricos pueden comprender GDF-8 que comprende una región del brazo de GDF-11. Tales quiméricos pueden ser inestables debido al choque estérico entre el residuo F95 del brazo de GDF-11 y la hélice α2 de la GPC quimérica. Por lo tanto, en algunos casos, las quimeras GDF8/GDF11/Activina pueden diseñarse de tal manera que la región ARM de tales proteínas quiméricas contenga la hélice α2. Además, F95 puede ser un residuo importante para conferir latencia para GDF11. Este residuo se encuentra en una posición similar a una mutación de Camurati-Engelmann encontrada en el TGF-β1, Y81H (véase la Figura 8), por tanto, la mutación de este residuo por un aminoácido más pequeño, como una alanina, puede llevarse a cabo para promover la disociación del factor de crecimiento GDF11 maduro de la GPC. Tales mutantes pueden ser útiles como moléculas de control positivo en el diseño de ensayos para el cribado de anticuerpos activadores del GDF11.

[0268] Las proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender combinaciones de módulos de proteínas incluyendo, pero no limitado a las combinaciones de módulos de proteínas y/o secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 13. Algunas proteínas quiméricas de la presente divulgación pueden comprender módulos de proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos similares a las de la Tabla 13, pero que comprenden más o menos aminoácidos que los enumerados. Dichas secuencias de aminoácidos pueden comprender aproximadamente 1 más o menos aminoácidos, aproximadamente 2 más o menos aminoácidos, aproximadamente 3 más o menos aminoácidos, aproximadamente 4 más o menos aminoácidos, aproximadamente 5 más o menos aminoácidos, aproximadamente 6 más o menos aminoácidos, aproximadamente 7 más o menos aminoácidos, aproximadamente 8 más o menos aminoácidos, aproximadamente 9 más o menos aminoácidos, aproximadamente 10 más o menos aminoácidos o más de 10 más o menos aminoácidos en extremos N-terminal y/o C-terminal.

[0269]

[0270]

[0271]

[0272]

[0273]

[0274]

[0275]

[0277] Las proteínas quiméricas se pueden usar para caracterizar y/o mapear epítopos asociados con GPC. Como se usa en este documento, los términos "mapa" o "mapeo" se refieren a la identificación, caracterización y/o determinación de una o más regiones funcionales de una o más proteínas. Tales caracterizaciones pueden ser necesarias para determinar interacciones entre uno o más módulos de proteínas y otro agente (por ejemplo, otra proteína y/o módulo de proteína). Se pueden usar algunas proteínas quiméricas para caracterizar funciones asociadas con una o más proteínas y/o módulos de proteínas.

[0278] Las proteínas quiméricas pueden comprender secuencias de bucles de activación que comprenden cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 15.

[0280]

[0284]

[0286] Las proteínas quiméricas pueden comprender marcadores detectables. Los marcadores detectables pueden usarse para permitir la detección y/o aislamiento de proteínas quiméricas. Tales marcadores detectables pueden comprender marcadores de biotina, etiquetas de polihistidina y/o etiquetas de bandera. La etiquetas pueden usarse para identificar y/o aislar proteínas etiquetadas. Las proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C. Dichos sitios permiten la escisión en el sitio de escisión de la proteasa 3C tras el tratamiento con proteasa 3C, que incluye, pero no se limita a, proteasa 3C de rinovirus. Pueden introducirse sitios de escisión de proteasa 3C para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas quiméricas.

[0287] Expresión de proteínas

[0288] La síntesis de proteínas recombinantes de la presente descripción puede ser llevada a cabo de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Algunas síntesis de proteínas se pueden llevar a caboin vitro.Algunas síntesis de proteínas se pueden llevar a cabo utilizando células. Estas células pueden ser bacterianas y/o eucariotas. En algunos casos, se pueden usar células eucariotas para la síntesis de proteínas. Algunas de estas células pueden ser de mamífero. Algunas células de mamífero utilizadas para la expresión de proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, células de ratón, células de conejo, células de rata, células de mono, células de hámster y células humanas. Estas células pueden derivar de una línea celular. En otros casos, pueden usarse células humanas. En otros casos, las líneas celulares pueden incluir, entre otras, células HEK293, células CHO, células HeLa, células Sw-480, células de linfoma T EL4, células TMLC, células 293T/17, células Hs68 , células CCD1112sk, células HFF-1, fibroblastos queloides, células A204, células L17 RIB y células C<2>C<12>.

[0290] Las células 293 se usan para la síntesis de proteínas recombinantes de la presente descripción. Estas células son células humanas que modifican post-traduccionalmente proteínas con estructuras similares a las humanas (por ejemplo, glucanos). Estas células son fácilmente transfectables y escalables y pueden crecer hasta densidades elevadas en cultivo en suspensión. Las células 293 pueden incluir células 293E. Las células 293E son células HEK293 que expresan de forma estable EBNA1 (antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr). En algunos casos, las células 293E pueden cultivarse en medio sin suero para simplificar la purificación posterior. En algunos casos, se pueden utilizar celdas 293-6E (NRC Canadá, Ottawa, CA). Dichas células expresan EBNA1 truncado (EBNA1t) y pueden comprender una producción mejorada de proteínas recombinantes y pueden optimizarse para el crecimiento y/o la expresión de proteínas en medio sin suero para simplificar la purificación en sentido descendente. En algunos casos, se pueden usar células de insectos para expresar proteínas recombinantes de la divulgación. En algunos casos, la expresión de células de insecto puede llevarse a cabo usando células de Spodoptera frugiperda que incluyen, pero no se limitan a, células Sf9 y/o Sf-21. En algunos casos, los cultivos de células de insectos pueden comprender células de Trichoplusia ni, que incluyen, pero no se limitan a, células Tn-368 y/o HIGH-FIVE™ BTI-TN-5B1-4. Se puede encontrar una lista adicional de líneas de células de insectos ejemplares en la Patente de Estados Unidos N° 5.024.947.

[0292] Las proteínas recombinantes de la divulgación pueden comprender un dominio Fc de anticuerpo para crear una proteína de fusión Fc. La formación de una proteína de fusión Fc con cualquiera de las proteínas recombinantes descritas en el presente documento puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, incluido el descrito en Czajkowsky, Dm et al., 2012. EMBO Mol Med.4 (10): 1015-28 y las patentes de Estados Unidos números 5.116.964, 5.541.087 y 8.637.637. Las proteínas de fusión Fc pueden unirse a la región bisagra de un Fc de IgG mediante residuos de cisteína en la región bisagra Fc. Las proteínas de fusión Fc resultantes pueden comprender una estructura similar a un anticuerpo, pero sin dominios Ch1 o cadenas ligeras. En algunos casos, las proteínas de fusión Fc pueden comprender perfiles farmacocinéticos comparables a los de los anticuerpos nativos. En algunos casos, las proteínas de fusión Fc pueden comprender una vida media prolongada en circulación y/o una actividad biológica alterada. En algunos casos, las proteínas de fusión de Fc se pueden preparar usando cualquiera de las proteínas de familia TGF-β o proteínas relacionadas con TGF-β descritas en este documento. En algunos casos, las proteínas de fusión Fc pueden comprender TGF-β, GDF-8 y/o GDF-11.

[0294] Las secuencias que codifican proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden insertarse en cualquier número de vectores de ADN conocidos en la técnica para la expresión. Dichos vectores pueden incluir plásmidos. En algunos casos, las secuencias que codifican proteínas recombinantes de la presente divulgación se clonan en vectores pTT5 (NRC Biotechnology Research Institute, Montreal, Quebec). En otros casos, pTT22, pTT28, pYD5, pYD7, pYD11 (NRC Biotechnology Institute, Montreal, Quebec) y/o pueden usarse vectores pMA (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los vectores pueden comprender secuencias promotoras para modular la expresión de secuencias que codifican proteínas recombinantes de la presente divulgación. Dichos promotores pueden ser constitutivamente activos y/o pueden estar regulados por factores extrínsecos y/o intrínsecos. Pueden usarse algunos factores extrínsecos para potenciar o suprimir la expresión de secuencias que codifican proteínas recombinantes de la presente divulgación. Algunos vectores pueden codificar señales de localización nuclear que pueden incorporarse en proteínas recombinantes de la presente divulgación tras la traducción. Algunos vectores pueden producir transcripciones de ARNm que comprenden señales de exportación nuclear. El ARN transcrito de un vector pTT5 modificado (pTT5-WPRE) contiene un elemento que facilita la exportación nuclear de las transcripciones. Algunos vectores pueden modificarse mediante la inserción de uno o más casetes de clonación independiente de ligación (LIC) para proporcionar una clonación más sencilla.

[0296] Los vectores que codifican proteínas recombinantes de la presente divulgación pueden administrarse a células de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, transfección, electroporación y/o transducción. En algunos casos, los vectores pueden comprender uno o más elementos para mejorar la replicación del vector en las células huésped. En algunos casos, los vectores pueden comprender sitios oriP para la replicación episomal en células que expresan EBNA-1.

[0298] En algunos casos, las células son transfectadas de forma estable para producir proteínas recombinantes de la presente divulgación. Las células transfectadas de manera estable pasan genes transfectados a células hijas durante la división celular, eliminando así la necesidad de transfecciones repetidas. En algunos casos, los genes transfectados se insertan de manera estable en el genoma de las células transfectadas. Los genes transfectados pueden comprender genes para la selección celular, tales como genes que confieren resistencia a uno o más compuestos tóxicos o represivos. Dichos genes pueden usarse para apoyar el crecimiento de solo células con incorporación estable de los genes transfectados cuando se cultivan en presencia de uno o más compuestos tóxicos o represivos (por ejemplo, puromicina, kenomicina, etc.). La selección celular también puede comprender la selección de células en base sobre los niveles generales de expresión de proteínas recombinantes. La determinación de dichos niveles puede realizarse, por ejemplo, mediante transferencia Western y/o ELISA.

[0300] En algunos casos, secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas recombinantes de la presente descripción pueden comprender uno o más elementos reguladores postranscripcionales del virus de la hepatitis de marmota (WPRE). Ácidos nucleicos de ARN que comprenden tales elementos que comprenden la secuencia GCCACGGCGGAACUCAUCGCCGCCUGCCUUGCCCGCUGCUGGACAGGGGCUCGGC UGUUGGGCACUGACAAUUCCGUGGU (SEQ ID NO: 255). El ARN que comprende los WPRE se puede transcribir a partir del ADN que comprende la secuencia AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTT GCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTT CCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG GAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCA ACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTT TCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGA CAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGT CCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTG CTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCT CTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGG CCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO: 256). Los WPRE pueden mejorar la traducción de ácidos nucleicos que comprenden WPRE. Tal traducción mejorada puede deberse a una mayor exportación citoplásmica de ARNm recién transcrito.

[0302] Las proteínas recombinantes pueden comprender una o más secuencias señal de secreción. Como se usa en este documento, el término "secuencia señal de secreción" se refiere a una cadena de aminoácidos (o nucleótidos que los codifican a nivel de ácido nucleico) que, cuando forman parte de una proteína, modulan la secreción de tales proteínas de las células. Algunas secuencias señal de secreción pueden estar ubicadas en los extremos de las proteínas. En otros casos, las secuencias señal de secreción pueden ser secuencias de aminoácidos N-terminales. Otras secuencias señal de secreciones pueden comprender la señal de secreción de las cadenas kappa de Ig. Dichas cadenas kappa de Ig pueden ser cadenas kappa de Ig humanas. En algunos casos, las secuencias señal de secreción pueden comprender la secuencia de aminoácidos MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLG (SEQ ID NO: 257).

[0304] Las proteínas recombinantes usadas en los métodos de la presente invención pueden requerir la coexpresión con una o más otras proteínas para la expresión adecuada, plegado, secreción, actividad y/o función. Algunas GPC recombinantes de la presente divulgación pueden coexpresarse con LTBP, fibrilinas y/o GARP.

[0306] Las proteínas recombinantes usadas en los métodos de la presente invención pueden estar biotiniladas. Como se usa en este documento, el término "biotinilación" se refiere a la unión de uno o más marcadores de biotina. Dichos marcadores de biotina pueden facilitar las interacciones de proteínas recombinantes biotiniladas con superficies y/o proteínas recubiertas de avidina y/o estreptavidina. Como se usa en este documento, un "marcador de biotina" se refiere a un marcador detectable que comprende una o más moléculas de biotina. El término "biotinilado" se refiere a una molécula o proteína que comprende uno o más marcadores de biotina. Las moléculas de biotina se unen con alta afinidad a las moléculas de avidina y estreptavidina. Esta propiedad puede usarse para capturar proteínas biotiniladas usando materiales recubiertos con avidina y/o estretavidina. Algunas GPC recombinantes de la presente divulgación pueden biotinilarse cerca del extremo N-terminal. Tales GPC recombinantes pueden introducirse en superficies de cultivo celular recubiertas de avidina/estreptavidina, permitiendo que las GPC recombinantes biotiniladas se adhieran a la superficie de tal manera que la orientación y unión de dichas GPC unidas imite la orientación y unión de las GPC a LTBP, fibrilinas y/o GARP.

[0308] Las proteínas recombinantes producidas pueden analizarse con fines de control de calidad para evaluar tanto las propiedades biofísicas como las bioactivas. La caracterización biofísica puede incluir la evaluación de los patrones de migración de la proteína después de reducir y/o no reducir la SDS PAGE. La caracterización biofísica también puede comprender filtración en gel, análisis espectrométrico de masas y/o análisis de asociación/disociación entre dominios PAL o similares a PAL y dominios de factor de crecimiento. Las propiedades bioactivas pueden analizarse evaluando la reactividad con anticuerpos y/o la actividad de señalización de factores de crecimiento disociados y/o GPC latentes.

[0310] Algunas proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más marcadores detectables para purificación [por ejemplo, etiqueta de polihistidina, etiqueta FLAG, etc.] En algunos casos, las proteínas son N-terminalmente etiquetado. En algunos casos, las proteínas están marcadas en el extremo C-terminal. En algunos casos, las proteínas están biotiniladas. En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes de la presente divulgación están biotiniladas N-terminalmente.

[0311] Las proteínas producidas pueden comprender aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C. Dichos sitios permiten la escisión entre los residuos Q y G del sitio de escisión de la proteasa 3C tras el tratamiento con proteasa 3C, que incluye, pero no se limita a, proteasa de rinovirus 3C. En algunos casos, dichos sitios de escisión se introducen para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas recombinantes.

[0312] En algunas realizaciones, la modificación de proproteínas de factor de crecimiento expresadas puede llevarse a cabo por escisión enzimática. En algunos casos, se pueden usar convertasas de proproteína. Dichas convertasas de proproteínas pueden incluir, entre otras, furina/PACE3, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PACE4 y PC7. La escisión de la convertasa de proproteína se puede realizar en solución o en cultivo de tejidos. En algunos casos, las convertasas de proproteínas se expresan en células que expresan proproteínas a escindir. En algunos casos, se añaden convertasas de proproteínas a cultivos de tejidos de células que expresan proproteínas a escindir.

[0313] Anticuerpos

[0314] En algunas realizaciones, los compuestos y/o composiciones de la presente invención comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere en el sentido más amplio y cubre específicamente varias realizaciones que incluyen, entre otras, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de anticuerpos tales como diacuerpos siempre que presenten una actividad biológica deseada. Los anticuerpos son principalmente moléculas basadas en aminoácidos pero también pueden comprender una o más modificaciones (que incluyen, pero no se limitan a, la adición de restos de azúcar, restos fluorescentes, etiquetas químicas, etc.)

[0315] Uso de proteínas recombinantes y quiméricas en la generación de anticuerpos

[0316] Las proteínas recombinantes y/o quiméricas descritas en este documento pueden usarse como antígenos (denominadas en el presente documento proteínas antigénicas) para generar anticuerpos. Dichas proteínas antigénicas pueden comprender epítopos que pueden ser menos accesibles para la generación de anticuerpos en proteínas similares de tipo salvaje. Algunos anticuerpos dirigidos a proteínas antigénicas de la presente divulgación pueden modular la liberación de uno o más factores de crecimiento de una o más GPC). Algunos de estos anticuerpos pueden estabilizar [reducir o prevenir la disociación entre dos agentes (por ejemplo, liberación del factor de crecimiento de las GPC, Liberación de GPC a partir de una o más interacciones de proteínas)] y/o liberando [potenciando la disociación entre dos agentes (por ejemplo, liberación de factor de crecimiento de GPC, liberación de GPC de una o más interacciones de proteínas)] anticuerpos. Las proteínas antigénicas de la presente divulgación pueden comprender proteínas relacionadas con TGF-β así como componentes y/o módulos proteicos de los mismos. En algunos casos, las proteínas antigénicas de la presente divulgación pueden comprender prodominios sin factores de crecimiento asociados, mutantes deficientes en escisión de furina, mutantes deficientes en asociaciones de proteínas extracelulares y/o combinaciones de los mismos.

[0317] Las proteínas antigénicas pueden comprender proteínas relacionadas con TGF-β y/o módulos de las mismas. Dichas proteínas antigénicas pueden comprender epítopos de regiones en las que los factores de crecimiento se asocian o comprenden proximidad estereológica con regiones prodominio. Los anticuerpos de la presente invención dirigidos a tales epítopos pueden unirse a regiones superpuestas entre factores de crecimiento y prodominios. Dichos anticuerpos pueden inhibir estereológicamente la disociación de factores de crecimiento de las GPC.

[0318] Las proteínas antigénicas comprenden solo el prodominio o solo el factor de crecimiento de una GPC particular. Los epítopos presentes en tales proteínas antigénicas pueden estar protegidos o no expuestos en GPC intactas. Algunos anticuerpos de la presente invención pueden dirigirse a tales epítopos. Dichos anticuerpos pueden estar liberando anticuerpos, promoviendo la disociación del factor de crecimiento de las GPC. Otros anticuerpos pueden competir con el factor de crecimiento libre por la unión del prodominio, promoviendo así la disociación del factor de crecimiento de las GPC.

[0319] Las proteínas antigénicas pueden comprender mutaciones de sitios de escisión de convertasa de proproteína (por ejemplo furina). Tales mutaciones pueden prevenir la escisión enzimática de los factores de crecimiento de sus prodominios. Algunos anticuerpos de la presente invención pueden dirigirse a epítopos presentes en tales proteínas mutantes. Dichos anticuerpos pueden estabilizar la asociación entre prodominios y factores de crecimiento. En algunos casos, los mutantes del sitio de escisión de furina comprenden mutantes D2G como se describe en el presente documento.

[0320] Las proteínas antigénicas pueden comprender uno o más recombinante LTBP. Tales LTBP recombinantes pueden comprender LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, variantes empalmadas alternativamente y/o fragmentos de las mismas. Las LTBP recombinantes también se pueden modificar para que comprendan uno o más marcadores detectables. Dichos marcadores detectables pueden incluir, entre otros, marcadores de biotina, marcadores de polihistidina, marcadores myc, marcadores HA y/o marcadores fluorescentes.

[0321] En algunas realizaciones, las proteínas antigénicas pueden comprender una o más proteínas recombinantes y/o proteínas quiméricas complejadas con una o más LTBP recombinantes. Algunas proteínas antigénicas pueden comprender mutantes del sitio de escisión de la convertasa de proproteína (por ejemplo, mutantes D2G, mutantes AXXA) complejados con una o más LTBP recombinantes. Algunas de tales LTBp recombinantes pueden comprender LTBP1S. Algunas LTBP recombinantes pueden comprender uno o más marcadores detectables, incluidos, entre otros, marcadores de biotina, marcadores de polihistidina y/o marcadores de bandera.

[0322] Las proteínas antigénicas divulgadas en la presente pueden comprender uno o más módulos proteicos de GDF (por ejemplo, GDF-11 y/o GDF-8). Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención se dirigen hacia proteínas antigénicas que comprenden módulos proteicos de GDF-8. Tales anticuerpos pueden modular los niveles y/o la actividad de GDF-8 en uno o más nichos. Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención pueden impedir la liberación de factores de crecimiento GDF-8 de las GPC. Tales anticuerpos pueden usarse para reparar y/o mejorar los tejidos musculares.

[0323] Las proteínas recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a proteínas quiméricas) descritas en este documento pueden usarse en estudios para identificar y mapear epítopos que pueden ser dianas importantes para el desarrollo de anticuerpos. Tales estudios pueden usarse para identificar epítopos que pueden promover la liberación del factor de crecimiento o la estabilización de las GPC tras la unión del anticuerpo.

[0324] Anticuerpos liberadores

[0325] Como se usa en este documento, el término "anticuerpo liberador" se refiere a un anticuerpo que aumenta la proporción de factor de crecimiento activo y/o libre con respecto al factor de crecimiento asociado al prodominio inactivo y/o tras la introducción del anticuerpo a un GPC, célula, nicho, depósito natural o cualquier otro sitio de secuestro del factor de crecimiento. En este contexto, los anticuerpos liberadores se pueden caracterizar como agonistas. Como se usa en este documento, el término "depósito natural" se refiere a una ubicación dentro de una célula, tejido u órgano donde se almacenan niveles aumentados de una biomolécula o ión. Por ejemplo, la matriz extracelular puede actuar como un depósito natural para uno o más factores de crecimiento.

[0326] El contacto necesario para la liberación del factor de crecimiento puede ser definido como el contacto directo o indirecto del anticuerpo con una GPC o un componente del mismo o con una estructura celular tal como una proteína extracelular y/o celular matriz y/o proteína asociada a la matriz extracelular y/o celular [por ejemplo, LTBP (por ejemplo, LTBP1, LTBP2, LTBP3 y/o LTb P4), fibrilinas (por ejemplo, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3 y/o fibrilina-4,) perlecano, decorina, elastina, colágeno y/o GARP (por ejemplo, GARP y/o LRRC33)] para la liberación del factor de crecimiento. La liberación de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90% o más de factor de crecimiento es suficiente para caracterizar los anticuerpos de la presente invención como anticuerpos liberadores. Se entiende que la liberación del factor de crecimiento después de la administración de anticuerpos puede ser local y puede ocurrir durante un período de tiempo sostenido y puede incluir picos o picos de liberación. Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar para liberar uno o más factores de crecimiento durante minutos, horas, días o más.

[0327] Los perfiles de liberación pueden tener un pico inicial o estallar dentro de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 7 días de poner en contacto en períodos más cortos in vivo o in vitro. Por ejemplo, el pico o ráfaga inicial puede ocurrir desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 5 horas, o desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 6 horas, o desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 7 horas, o desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 8 horas, o desde de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 9 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 10 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 11 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 12 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas, o desde de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 36 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 7 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 2 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 3 días, o desde de aproximadamente 1 día a aproximadamente 4 días, o de aproximadamente 4 días a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 4 días a aproximadamente 6 días, o de aproximadamente 4 días a aproximadamente 7 días. Los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden estimular la liberación de 5 a 100% del factor de crecimiento presente. Por ejemplo, el porcentaje de liberación de factor de crecimiento puede ser de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, o desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 30%, o desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 40%, o desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 50%, o desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 60%, o desde aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 70%, o desde aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 80%, o desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 90%, o desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 100%.

[0328] Los anticuerpos liberadores generados de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento se pueden generar para liberar factores de crecimiento de las GPC que comprenden cualquiera de las proproteínas enumeradas en la Tabla 1. En algunos casos, los anticuerpos liberadores se dirigen a las GPC que comprenden isoformas de TGF-β y/o uno o más módulos de tales isoformas. En algunos casos, los anticuerpos liberadores se dirigen a GPC que comprenden GDF y/o uno o más módulos de GDF.

[0330] Anticuerpos estabilizantes

[0332] Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo estabilizante" se refiere a un anticuerpo que disminuye la relación de activo y/o el factor de crecimiento libre con respecto al factor de crecimiento inactivo y/o prodominio asociada después de la introducción del anticuerpo a uno o más GPC, célula, nicho, depósito natural y/o cualquier otro sitio de secuestro del factor de crecimiento. En este contexto, los anticuerpos pueden caracterizarse como antagonistas. Como se usa en el presente documento, un "antagonista" es uno que interfiere con o inhibe la acción fisiológica de otro. La acción antagonista puede incluso dar como resultado la estimulación o activación de la señalización corriente abajo y, por lo tanto, puede actuar de forma agonista con respecto a otra vía, separada de la que está siendo antagonizada. Las vías están interrelacionadas, por lo que, en un ejemplo no limitante, un antagonista de TGF-β podría actuar como agonista de BMP y viceversa. En el contexto de eventos celulares, como se usa en este documento, el término "corriente abajo" se refiere a cualquier evento celular o de señalización que ocurre después de la acción, unión o dirección de compuestos y/o composiciones de la presente invención.

[0334] El contacto necesario para la inhibición o estabilización puede ser el contacto directo o indirecto entre el anticuerpo y GPC o componentes del mismo o con estructuras celulares tales como una proteína de matriz extracelular y/o celular y/o proteína asociada con la matriz extracelular y/o celular [p. ej. LTBP (p. ej. LTBP1, LTBP2, LTBP3 y/o LTBP4), fibrilinas (p. ej. fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3 y/o fibrilina-4,) perlecano, decorina, elastina, colágeno y/o GARP (p. ej. GARP y/o LRRC33)] mediante el cual se inhibe la liberación del factor de crecimiento. La inhibición de la liberación de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de factores de crecimiento puede ser suficiente, en algunos casos, para caracterizar anticuerpos de la presente invención como inhibidores o estabilizadores. Los anticuerpos inhibidores pueden estabilizar las GPC y atraparlas como heterodímeros.

[0336] Se entiende que la inhibición de la liberación de factor de crecimiento después del contacto con uno o más anticuerpos de la presente invención puede ser local y puede ocurrir durante un período sostenido de tiempo y puede incluir picos, depresiones o picos. Los anticuerpos inhibidores que también pueden funcionar para estabilizar las GPC pueden definirse por su cinética de liberación. La liberación del factor de crecimiento y la correspondiente cinética de liberación, incluso localmente, pueden medirse o inferirse directamente mediante eventos de señalización corriente abajo. En algunas realizaciones, los cambios en las concentraciones de proteínas o ácidos nucleicos o las respuestas fenotípicas pueden ser indicativos de los efectos de los compuestos y/o composiciones de la presente invención.

[0338] Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención pueden actuar a la liberación de inhibición de un factor de crecimiento durante minutos, horas o días. Los perfiles de inhibición y/o estabilización pueden tener un mínimo inicial dentro de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 7 días de la introducción in vivo o períodos más cortos in vitro. Por ejemplo, el mínimo inicial de inhibición o estabilización puede ocurrir desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 5 horas, o desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 6 horas, o desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 7 horas, o desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 8 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 9 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 10 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 11 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 12 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 36 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 7 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 2 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 3 días, o de aproximadamente 1 día a aproximadamente 4 días, o de aproximadamente 4 días a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 4 días a aproximadamente 6 días, o de aproximadamente 4 días a aproximadamente 7 días. La introducción de compuestos y/o composiciones de la presente invención puede conducir a la inhibición y/o estabilización del 5% al 100% del factor de crecimiento presente. Por ejemplo, el porcentaje de inhibición o estabilización del factor de crecimiento puede ser de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente 80%, desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 90% o desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 100%.

[0340] Los anticuerpos estabilizantes generados de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento se pueden generar para bloquear la liberación de factores de crecimiento de las GPC que comprenden cualquiera de las pro-proteínas enumeradas en la Tabla 1. Dichos anticuerpos pueden interactuar físicamente con los sitios de escisión de la proteasa GPC y/o bloquear la interacción de enzimas proteolíticas que pueden dirigirse a dichos sitios de escisión. En algunos casos, los anticuerpos estabilizantes se dirigen a GPC que comprenden isoformas de TGF-β y/o uno o más módulos de tales isoformas. En algunos casos, los anticuerpos estabilizantes se dirigen a GPC que comprenden GDF y/o uno o más módulos de GDF.

[0341] Los anticuerpos estabilizantes dirigidos a las GPC que comprenden GDF-8 pueden bloquear la escisión por metaloproteinasa de tales complejos. Dichos agentes pueden unirse a GPC que comprenden GDF-8 de tal manera que eviten físicamente interacciones entre tales GPC y metaloproteinasas dirigidas a tales GPC. Los agentes que en realidad se dirigen a las metaloproteinasas de sí mismos se han descrito anteriormente (véase la Patente de Estados Unidos N° US 7572599).

[0342] Selección de anticuerpos

[0343] Un anticuerpo deseado se puede seleccionar de un grupo más grande de dos o más anticuerpos candidatos en base a la capacidad del anticuerpo deseada para asociarse antígenos y/o epítopos. Dichos antígenos y/o epítopos pueden incluir, entre otros, cualquiera de los descritos en este documento, que incluyen, entre otros, proteínas recombinantes, proteínas quiméricas, GPC, prodominios (p. ej., dominios de PAL o similares a PAL), factores de crecimiento, módulos de proteínas., LTBPs, fibrilinas, GARP, proteínas relacionadas con TGF-β y/o mutantes y/o variantes y/o complejos y/o combinaciones de los mismos. La selección de los anticuerpos deseados se puede llevar a cabo usando un ensayo de unión de anticuerpos, tal como un ensayo basado en resonancia de plasmón de superficie, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o un ensayo basado en clasificación celular asociada a fluorescencia (FACS). Dichos ensayos pueden utilizar un antígeno deseado para unirse a un anticuerpo deseado y luego usar uno o más métodos de detección para detectar la unión.

[0344] Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención pueden seleccionarse de un grupo más grande de dos o más anticuerpos candidatos en base a su capacidad para asociarse con antígenos y/o epítopos deseados de múltiples especies (referidos aquí como "selección positiva").

[0345] En algunas realizaciones, tales especies pueden comprender especies de vertebrados. En algunas realizaciones, tales especies pueden comprender especies de mamíferos. En algunas realizaciones, tales especies pueden incluir, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, caballos, vacas y/o seres humanos.

[0346] En algunas realizaciones, la selección negativa se utiliza para eliminar los anticuerpos a partir de un grupo más grande de dos o más anticuerpos candidatos. Como se usa en el presente documento, el término "selección negativa" se refiere a la eliminación de uno o más factores de un grupo en base a su capacidad para unirse a uno o más antígenos y/o epítopos no deseados. En algunas realizaciones, los antígenos y/o epítopos no deseados pueden incluir, pero no se limitan a, cualquiera de los descritos en este documento, que incluyen, entre otros, proteínas recombinantes, proteínas quiméricas, GPC, prodominios (por ejemplo, dominios de PAL o similares a PAL), factores de crecimiento, módulos proteicos, LTBP, fibrilinas, GARP, proteínas relacionadas con TGF-β y/o mutantes y/o variantes y/o combinaciones y/o complejos de los mismos.

[0347] Los anticuerpos divulgados en la presente se pueden dirigir a prodominios (por ejemplo, la porción de prodominio de una GPC y/o dominio PAL libre o similar a PAL) que disminuyen la señalización y/o niveles del factor de crecimiento (por ejemplo, señalización y/o niveles de factor de crecimiento TGF-β1) en un nicho determinado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden dirigirse a dominios de PAL o similares a PAL que aumentan la señalización y/o los niveles del factor de crecimiento en un nicho dado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden estar dirigidos a prodominios (por ejemplo, dominios de PAL o similares a PAL) y/o GPC solo cuando forman complejos con LTBP, fibrilinas y/o GARp .

[0348] Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención se pueden seleccionar de un grupo más grande de dos o más anticuerpos candidatos basándose en su capacidad para modular los niveles y/o la actividad del factor de crecimiento. En algunos casos, se pueden usar ensayos de actividad del factor de crecimiento para probar la capacidad de los anticuerpos candidatos para modular la actividad del factor de crecimiento. Los ensayos de actividad del factor de crecimiento pueden incluir ensayos basados en células como se describe a continuación. Los ensayos adicionales que pueden usarse para determinar el efecto de los anticuerpos candidatos sobre la actividad del factor de crecimiento pueden incluir, entre otros, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), la transferencia Western, los ensayos de indicador (por ejemplo, los ensayos de indicador basados en luciferasa u otro indicador basado en ensayos de enzimas), análisis de PCR, análisis de RT-PCR y/u otros métodos conocidos en la técnica, incluido cualquiera de los métodos descritos en las solicitudes de patente provisional de EE. UU.61/722,919, presentada el 6 de noviembre de 2012 y 61/722,969, presentada el 6 de noviembre de 2012.

[0349] Una o más proteínas recombinantes o anticuerpos descritos en este documento pueden usarse en ensayos para probar, desarrollar y/o seleccionar anticuerpos. Las GPC recombinantes pueden expresarse para probar las capacidades de liberación y/o estabilización de uno o más anticuerpos que se están ensayando. En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes pueden expresarse como componentes de control positivos o negativos de los ensayos. En algunas realizaciones, pueden expresarse múltiples proteínas recombinantes a la vez para modular la liberación y/o la actividad del factor de crecimiento, en las que dichas proteínas recombinantes pueden actuar de forma sinérgica o antagonista en dicha modulación.

[0350] Desarrollo de anticuerpos

[0351] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente que comprenden anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, sus variantes o derivados, como se describe anteriormente son específicamente inmunorreactivos con proteínas antigénicas como se describe en el presente documento.

[0352] Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención se pueden caracterizar por su molécula(s) diana, por los antígenos utilizados para generarlos, por su función (ya sea como agonistas, antagonistas del factor de crecimiento de liberación, GPC estabilizantes, activadores y/o inhibidores) y/o por el nicho celular en donde funcionan.

[0353] Tal como se utiliza aquí, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier porción de un anticuerpo intacto. En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpos comprenden regiones de unión a antígenos de anticuerpos intactos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno. También se produce un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno. Los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden comprender uno o más de estos fragmentos. Para los propósitos de la presente, un "anticuerpo" puede comprender un dominio variable pesado y ligero así como una región Fc.

[0354] Como se usa en este documento, el término "anticuerpo nativo" se refiere a una glicoproteína generalmente heterotetramérica de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.

[0355] Como se usa en este documento, el término "dominio variable" se refiere a dominios de anticuerpos específicos que difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la especificidad de unión y de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Como se usa en este documento, el término "Fv" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden sitios completos de reconocimiento y unión de antígenos. Estas regiones constan de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente.

[0356] Como se usa en este documento, el término "cadena ligera" se refiere a un componente de un anticuerpo de cualquier especie vertebrada asignada a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda basados en secuencias de aminoácidos de los dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Como se usa en el presente documento, el término "Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a una proteína de fusión de dominios de anticuerpos Vh y Vl, en donde estos dominios están unidos entre sí en una única cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el conector de polipéptido Fv permite que scFv forme la estructura deseada para la unión de antígenos.

[0357] Tal como se utiliza aquí, el término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a dos antígenos diferentes. Dichos anticuerpos comprenden típicamente regiones de al menos dos anticuerpos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden incluir cualquiera de los descritos en Riethmuller, G. 2012. Cancer Immunity.

[0358] 12: 12-18, Marvin, JS y col., 2005. Acta Pharmacologica Sinica.26 (6 ): 649-58 y Schaefer, W. et al., 2011. PNAS.108 (27): 11187-92.

[0359] Como se usa en este documento, el término "diacuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo pequeño con dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos comprenden un dominio variable Vh de cadena pesada conectado a un dominio variable Vl de cadena ligera en la misma cadena polipeptídica. Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, EP 404,097; W o 93/11161; y Hollinger et al. (Hollinger, P. et al., "Diabodies": pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes y biespecíficos. PNAS.1993.90: 6444-8).

[0360] Tal como se utiliza aquí, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de células sustancialmente homogéneas (o clones), es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto para posibles variantes que puedan surgir durante la producción de los anticuerpos monoclonales, estas variantes generalmente están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno.

[0361] El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos.

[0362] Como se usa en este documento, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una porción mínima de una o más fuentes de anticuerpos no humanas (por ejemplo, murinas) con el resto derivado de una o más fuentes de inmunoglobulina humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable de un anticuerpo del receptor se reemplazan por residuos de la región hipervariable de un anticuerpo de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas.

[0363] Como se usa en este documento, el término "región hipervariable" se refiere a regiones dentro del dominio de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende residuos de aminoácidos responsables de la unión al antígeno. Los aminoácidos presentes dentro de las regiones hipervariables determinan la estructura de la región determinante de complementariedad (CDR). Como se usa en este documento, el término "CDR" se refiere a regiones de anticuerpos que comprenden una estructura que es complementaria a su antígeno o epítopo diana.

[0364] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden ser miméticos de anticuerpos. Como se usa en este documento, el término "mimético de anticuerpo" se refiere a cualquier molécula que imita la función o efecto de un anticuerpo y que se une específicamente y con alta afinidad a sus dianas moleculares. En algunos casos, los miméticos de anticuerpos pueden ser monocuerpos, diseñados para incorporar el dominio de fibronectina tipo III (Fn3) como un armazón proteico (US 6.673.901; US 6.348.584). En algunos casos, los miméticos de anticuerpos pueden ser los conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, moléculas affibody, filinas, afitinas, anticalinas, avímeros, centirinas, DARPINS™, finómeros y Kunitz y péptidos de dominio. En otros casos, los miméticos de anticuerpos pueden incluir una o más regiones no peptídicas.

[0365] Como se usa en este documento, el término "variante de anticuerpo" se refiere a una biomolécula que se asemeja a un anticuerpo en su estructura y/o función que comprende algunas diferencias en su secuencia de aminoácido, la composición o estructura en comparación con un anticuerpo nativo.

[0366] La preparación de anticuerpos, ya sean monoclonales o policlonales, es conocida en la técnica. Las técnicas para la producción de anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow y Lane " Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 e "Therapeutic Antibody Engineering: Current and Future Advances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry" Woodhead Publishing, 2012.Generación de anticuerpos monoclonales estándar

[0367] En algunas realizaciones, los anticuerpos se generan en ratones knockout, que carecen del gen que codifica los antígenos diana deseados. Dichos ratones pueden no ser tolerizados para los antígenos diana y, por lo tanto, pueden ser más adecuados para generar anticuerpos contra dichos antígenos que pueden reaccionar de forma cruzada con formas humanas y de ratón del antígeno. Para la producción de anticuerpos monoclonales, los ratones hospedadores se pueden inmunizar con proteínas recombinantes para provocar linfocitos que se unan específicamente a dichas proteínas. Los linfocitos resultantes se pueden recolectar y fusionar con líneas celulares inmortalizadas. Las células de hibridoma resultantes pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado con agentes de selección para apoyar el crecimiento de sólo células fusionadas.

[0368] Las líneas de células de hibridoma deseadas pueden ser identificadas a través de análisis de la especificidad de unión de anticuerpos secretados para péptidos diana y clones de tales células pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos estándar. Los anticuerpos producidos por células de hibridoma subclonadas pueden aislarse y purificarse a partir de medio de cultivo por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales

[0369] Anticuerpos recombinantes

[0370] Los anticuerpos recombinantes pueden generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en las solicitudes de patente provisional US 61/722.919, presentada 6 de noviembre de 2012 y 61/722,969, presentada el 6 de noviembre de 2012. En algunas realizaciones, se pueden producir anticuerpos recombinantes utilizando células de hibridoma producidas según los métodos descritos en el presente documento. Las secuencias de ADNc de la región variable de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos pueden determinarse usando técnicas bioquímicas estándar. El ARN total puede extraerse de células de hibridoma productoras de anticuerpos y convertirse en ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT) (PCR). La amplificación por PCR se puede llevar a cabo en el ADNc resultante para amplificar los genes de la región variable. Tal amplificación puede comprender el uso de cebadores específicos para la amplificación de secuencias de cadenas pesadas y ligeras. Los productos de la PCR resultantes pueden subclonarse luego en plásmidos para el análisis de secuencia. Una vez secuenciadas, las secuencias codificantes de anticuerpos pueden colocarse en vectores de expresión. Para la humanización, se pueden usar secuencias codificantes de dominios constantes de cadena ligera y pesada humana para sustituir secuencias murinas homólogas. Las construcciones resultantes se pueden transfectar luego en células de mamífero para su traducción a gran escala.

[0371] Desarrollo de anticuerpos citotóxicos

[0372] Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser capaces de inducir anticuerpos dependientes de la citotoxicidad mediada por células (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). La ADCC es un mecanismo inmunológico mediante el cual las células se lisan como resultado del ataque de las células inmunitarias. Tales células inmunes pueden incluir células CD56+, células asesinas naturales CD3 (NK), monocitos y neutrófilos (Strohl, WR Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Filadelfia PA.2012. Cap.8, p186).

[0373] En algunos casos, anticuerpos de la presente invención pueden diseñarse para comprender un isotipo dado dependiendo de si se desea o no ADCC o ADCP tras la unión del anticuerpo. Dichos anticuerpos, por ejemplo, pueden diseñarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos por Alderson, KL et al., J Biomed Biotechnol.2011.2011: 379123.). En el caso de los anticuerpos de ratón, diferentes isotipos de anticuerpos son más eficaces para promover la ADCC. IgG2a, por ejemplo, es más eficaz para inducir ADCc que IgG2b. Algunos anticuerpos de la presente invención, que comprenden anticuerpos IgG2b de ratón, pueden modificarse para comprender anticuerpos IgG2a. Dichos anticuerpos modificados pueden ser más eficaces para inducir ADCC al unirse a antígenos asociados a células.

[0374] Los genes que codifican las regiones variables de los anticuerpos desarrollados de acuerdo a los métodos de la presente invención pueden clonarse en vectores de expresión de mamífero que codifican las regiones Fc humanas. Tales regiones Fc pueden comprender regiones Fc de IgGlK humana. Las regiones Fc de IgGlK pueden comprender mutaciones de aminoácidos que se sabe que mejoran la unión al receptor F y la citotoxicidad ADCC mediada por células dependiente de anticuerpos.

[0375] En algunos casos, los anticuerpos pueden modificarse para reducir ADCC. Los anticuerpos que no activan la ADCC o que están asociados con niveles reducidos de ADCC pueden ser deseables para las realizaciones de anticuerpos de la presente invención, en algunos casos debido a la ausencia o la eliminación limitada mediada por el sistema inmunitario, lo que permite vidas medias más largas en la circulación.

[0376] Técnicas de cribado de biblioteca de presentación de fragmentos de anticuerpos

[0377] En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden ser producidos y/o optimizados utilizando métodos de descubrimiento de alto rendimiento. Dichos métodos pueden incluir cualquiera de las técnicas de visualización (por ejemplo, técnicas de selección de bibliotecas de visualización) descritas en las solicitudes de patente provisional de US 61/722,919, presentada el 6 de noviembre de 2012 y 61/722,969, presentada el 6 de noviembre de 2012. En algunas realizaciones, los anticuerpos sintéticos pueden ser diseñados, seleccionados u optimizados mediante el cribado de antígenos diana usando tecnologías de presentación (por ejemplo, tecnologías de presentación de fagos). Las bibliotecas de presentación de fagos pueden comprender de millones a miles de millones de partículas de fagos, cada una de las cuales expresa fragmentos de anticuerpos únicos en sus cubiertas virales. En algunos casos, el ADNc que codifica cada fragmento puede contener la misma secuencia con la excepción de secuencias únicas que codifican bucles variables de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las cadenas Vh de las CDR pueden expresarse como una proteína de fusión, unida a las proteínas de la cubierta viral (p. ej., el extremo N de la proteína de la cubierta viral pIII). Las cadenas Vl pueden expresarse por separado para el ensamblaje con las cadenas Vh en el periplasma antes de incorporación compleja en capas virales.

[0378] Para la selección, antígenos diana pueden incubarse, in vitro, con las partículas de la biblioteca de presentación en fagos para la precipitación de parejas de unión positivas. Este proceso se denomina en el presente documento "enriquecimiento en fagos". En algunos casos, el enriquecimiento en fagos comprende el enriquecimiento en fagos en fase sólida. De acuerdo con dicho enriquecimiento, los antígenos diana se unen a un sustrato (por ejemplo, mediante adsorción pasiva) y se ponen en contacto con una o más soluciones que comprenden partículas de fagos. Las partículas de fagos con afinidad por tales antígenos diana se precipitan de la solución. En algunos casos, el enriquecimiento de fagos comprende el enriquecimiento de fagos en fase de solución donde los antígenos diana están presentes en una solución que se combina con soluciones de fagos. Según tales métodos, los antígenos diana pueden comprender marcadores detectables (por ejemplo, marcadores de biotina) para facilitar la recuperación de la solución y la recuperación del fago unido.

[0379] Después de la selección, CDR que codifican ADNc de miembros de la biblioteca precipitados se pueden secuenciar a partir de la cota de fagos. Dichas secuencias pueden incorporarse directamente en secuencias de anticuerpos para la producción de anticuerpos recombinantes, o mutarse y utilizarse para una optimización adicional a través de la maduración por afinidad in vitro.

[0380] En algunos casos el cribado de visualización de fagos puede usarse para generar ampliamente diversos paneles de anticuerpos. Tal diversidad puede medirse mediante la diversidad de secuencias de anticuerpos y/o la diversidad de epítopos diana.

[0381] Técnicas d emaduración por afinidad

[0382] Técnicas de maduración de la afinidad pueden comprender cualquiera de los descritos en solicitudes de patentes provisionales de EE.UU.61/722.919, presentada el 6 de noviembre de 2012 y 61/722.969, presentada el 6 de noviembre de 2012. Después de identificarse fragmentos de anticuerpos capaces de unir los antígenos diana (por ejemplo, mediante el uso de bibliotecas de presentación de fagos como se describe anteriormente), se pueden derivar mutantes de alta afinidad a partir de estos mediante el proceso de maduración por afinidad. La tecnología de maduración por afinidad se utiliza para identificar secuencias que codifican CDR que tienen la mayor afinidad por los antígenos diana. Usando tales tecnologías, las secuencias de CDR seleccionadas (por ejemplo, las que se han aislado o producido de acuerdo con los procesos descritos en este documento) se pueden mutar aleatoriamente como un todo o en residuos específicos para crear de millones a miles de millones de variantes. Tales variantes pueden someterse a rondas repetidas de cribado de afinidad (por ejemplo, cribado de biblioteca de presentación) para determinar su capacidad para unirse a antígenos diana. Estas rondas repetidas de selección, mutación y expresión pueden llevarse a cabo para identificar secuencias de fragmentos de anticuerpos con la mayor afinidad por los antígenos diana. Dichas secuencias pueden incorporarse directamente en secuencias de anticuerpos para la producción de anticuerpos recombinantes.

[0383] Caracterización de anticuerpos

[0384] Los compuestos y/o composiciones de la presente invención que comprenden anticuerpos pueden actuar para disminuir la concentración local de uno o más GPC a través de la eliminación por fagocitosis, pinocitosis, o la inhibición de montaje en la matriz extracelular y/o la matriz celular. La introducción de compuestos y/o composiciones de la presente invención puede conducir a la eliminación del 5% al 100% del factor de crecimiento presente en un área determinada. Por ejemplo, el porcentaje de eliminación del factor de crecimiento puede ser de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 10% % a aproximadamente 30%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 90% o desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 100%.

[0385] Las medidas de liberación, inhibición o eliminación de uno o más factores de crecimiento se pueden realizar en relación con un estándar o con la liberación o actividad natural del factor de crecimiento en condiciones fisiológicas normales,in v itrooin vivo.También se pueden realizar mediciones relativas a la presencia o ausencia de anticuerpos. Dichos métodos para medir los niveles, liberación, inhibición o eliminación del factor de crecimiento incluyen la medición estándar en tejidos y/o fluidos (por ejemplo, suero o sangre) como transferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos de actividad, ensayos informadores, ensayos de luciferasa, matrices de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), matrices de genes, PCR de transcriptasa inversa (RT) en tiempo real y similares.

[0386] Los anticuerpos descritos en la presente pueden unirse o interactuar con cualquier número de epítopos en o a lo largo de GPC o sus estructuras asociadas para mejorar o inhibir la señalización del factor de crecimiento. Dichos epítopos pueden incluir todos y cada uno de los sitios posibles para alterar, mejorar o inhibir la función de GPC. En algunas realizaciones, tales epítopos incluyen, pero no se limitan a, epítopos en o dentro de factores de crecimiento, elementos reguladores, GPC, factores moduladores de GPC, células receptoras de factor de crecimiento o receptores, dominios de PAL o similares a PAL, regiones de fijación, sitios de escisión de furina, regiones del brazo, regiones de los dedos, dominios de unión de LTBP, dominios de unión de fibrilina, dominios de unión de repeticiones predominantes de glucoproteína A (GARP), lazos de latencia, regiones alfa 1, secuencias de RGD, regiones de pajarita, matriz extracelular y/o componentes de la matriz celular y/o epítopos formados combinando regiones o porciones de cualquiera de los anteriores.

[0387] Los compuestos y/o composiciones de la presente invención ejercen sus efectos a través de la unión (reversible o irreversiblemente) a uno o más epítopos y/o regiones de reconocimiento de anticuerpos. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, tales sitios de unión para anticuerpos están formados con mayor frecuencia por proteínas, dominios o regiones de proteínas. Los sitios de unión pueden; sin embargo, incluir biomoléculas como azúcares, lípidos, moléculas de ácido nucleico o cualquier otra forma de epítopo de unión.

[0388] Alternativamente o adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar como miméticos de ligandos que inducen la internalización de los CPM. Dichos anticuerpos pueden actuar como portadores de carga útil no tradicionales, actuando para entregar y/o transportar cargas útiles de fármacos unidas o conjugadas a sitios específicos de GPC y/o relacionadas con GPC.

[0389] Los cambios provocados por anticuerpos de la presente invención pueden resultar en cambios neomórficos en la célula. Como se usa en este documento, el término "cambio neomórfico" se refiere a un cambio o alteración que es nuevo o diferente. Por ejemplo, un anticuerpo que provoca la liberación o estabilización de uno o más factores de crecimiento no asociados típicamente con una GPC particular dirigida por el anticuerpo, sería un anticuerpo neomórfico y la liberación sería un cambio neomórfico.

[0390] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden actuar para alterar y/o controlar eventos proteolíticos. En algunas realizaciones, tales eventos proteolíticos pueden ser intracelulares o extracelulares. En algunas realizaciones, tales eventos proteolíticos pueden incluir la alteración de la escisión de furina y/u otros eventos de procesamiento proteolítico. En algunas realizaciones, tales eventos proteolíticos pueden comprender el procesamiento proteolítico de moléculas de señalización del factor de crecimiento o cascadas corriente abajo iniciadas por moléculas de señalización del factor de crecimiento.

[0391] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden inducir o inhibir la dimerización o multimerización de factores de crecimiento (ligandos) o sus receptores. En algunas realizaciones, tales acciones pueden ser mediante la estabilización de formas monoméricas, diméricas o multiméricas o mediante la rotura de complejos diméricos o multiméricos.

[0392] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden actuar sobre homo y/o heterodímeros de las unidades monoméricas que comprenden grupos receptores o GPC u otros pares de moléculas de señalización.

[0393] Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser internalizados en las células anteriores a antígenos diana de unión. Tras la internalización, tales anticuerpos pueden actuar para aumentar o disminuir uno o más eventos de señalización, liberar o estabilizar una o más GPC, bloquear o facilitar la liberación del factor de crecimiento y/o alterar uno o más nichos celulares.

[0394] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente también pueden alterar el tiempo de residencia de uno o más factores de crecimiento en una o más GPC y/o alterar el tiempo de residencia de una o más GPC en la matriz extracelular y/o matriz celular. Tales alteraciones pueden resultar en una localización irreversible y/o una localización transitoria.

[0395] Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser diseñados, fabricados y/o seleccionados utilizando cualquiera de los métodos conocidos para un experto en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos y/o las células productoras de anticuerpos de la presente invención se producen de acuerdo con cualquiera de los métodos enumerados en las solicitudes de patente provisional de EE.UU.61/722,919, presentada el 6 de noviembre de 2012 y 61/722,969, presentada el 6 de noviembre de 2012.

[0396] Generación de anticuerpos en ratones knockout

[0397] En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden generarse en ratones knockout que carecen de un gen que codifica uno o más antígenos deseados. Dichos ratones no serían tolerados a tales antígenos y, por lo tanto, podrían generar anticuerpos contra ellos que podrían reaccionar de forma cruzada con formas humanas y de ratón del antígeno. Para la producción de anticuerpos monoclonales, los ratones hospedadores se inmunizan con el péptido diana para provocar linfocitos que se unen específicamente a ese péptido. Los linfocitos se recogen y fusionan con una línea celular inmortalizada. Las células de hibridoma resultantes se cultivan en un medio de cultivo adecuado con un agente de selección para favorecer el crecimiento únicamente de las células fusionadas.

[0398] En algunas realizaciones, la desactivación de uno o más genes del factor de crecimiento puede ser letal y/o producir un feto o un recién nacido que no es viable. En algunas realizaciones, los animales recién nacidos solo pueden sobrevivir durante unas semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 semanas). En tales realizaciones, las inmunizaciones se pueden llevar a cabo en animales recién nacidos poco después del nacimiento. Oida et al (Oida, T. et al., TGF-β induces surface LAP expression on Murine CD4 T cells independent of FoxP3 induction. PLOS One. 2010. 5(11): e15523) demuestran la inmunización de ratones knockout TGF-β neonatales mediante el uso de inyecciones de galectina-1 para prolongar la supervivencia (típicamente 3-4 semanas después del nacimiento en estos ratones). Los ratones fueron inmunizados con células que expresan TGF-β murino cada dos días durante 10 días comenzando el 8° día después del nacimiento y las células del bazo se recogieron en el día 22 después del nacimiento. Las células del bazo recolectadas se fusionaron con células de mieloma y se encontró que muchas de las células de hibridoma resultantes producían con éxito anticuerpos anti-PAL.

[0399] Anticuerpos activadore s e inhibidores

[0400] Los anticuerpos descritos en la presente pueden comprender anticuerpos activadores o inhibidores. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo activador" se refiere a un anticuerpo que promueve la actividad del factor de crecimiento. Los anticuerpos activadores incluyen anticuerpos dirigidos a cualquier epítopo que promueva la actividad del factor de crecimiento. Dichos epítopos pueden encontrarse en prodominios (por ejemplo, PAL y dominios similares a PAL) factores de crecimiento u otros epítopos que, cuando se unen al anticuerpo, conducen a la actividad del factor de crecimiento.

[0401] Como se usa en este documento, el término "inhibición de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que reduce la actividad de factor de crecimiento. Los anticuerpos inhibidores incluyen anticuerpos dirigidos a cualquier epítopo que reduce la actividad del factor de crecimiento cuando se asocia con tales anticuerpos. Dichos epítopos pueden encontrarse en prodominios (por ejemplo, PAL y dominios similares a PAL) factores de crecimiento u otros epítopos que conducen a una actividad reducida del factor de crecimiento cuando se unen a un anticuerpo.

[0402] En la presente se describen métodos para usar anticuerpos activadores y/o inhibidores en solución, en cultivo celular y/o en sujetos para modificar la señalización del factor de crecimiento.

[0403] Variaciones

[0404] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden existir como un polipéptido completo, una pluralidad de polipéptidos o fragmentos de polipéptidos, que independientemente pueden estar codificados por uno o más ácidos nucleicos, una pluralidad de ácidos nucleicos, fragmentos de nucleicos ácidos o variantes de cualquiera de los antes mencionados. Como se usa en este documento, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de residuos de aminoácidos (naturales o no naturales) unidos entre sí con mayor frecuencia mediante enlaces peptídicos. El término, como se usa en este documento, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. En algunos casos, el polipéptido codificado es más pequeño que aproximadamente 50 aminoácidos y el polipéptido se denomina péptido. Si el polipéptido es un péptido, tendrá una longitud de al menos aproximadamente 2, 3, 4 o al menos 5 residuos de aminoácidos. Por tanto, los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser una sola molécula o puede ser un complejo multimolecular tal como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden comprender polipéptidos de cadena única o de cadenas múltiples y pueden estar asociados o enlazados. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente.

[0405] Como se usa en este documento, el término "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa o de referencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes poseerán al menos aproximadamente un 50% de identidad (homología) con una secuencia nativa o de referencia y, preferiblemente, serán al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% idénticas (homólogas) a una secuencia nativa o de referencia.

[0406] En algunas realizaciones se proporcionan "mímicos variantes". Como se usa en este documento, el término "mímico variante" se refiere a una variante que contiene uno o más aminoácidos que imitarían una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como un imitador de fosfotreonina y/o fosfoserina. Alternativamente, los miméticos variantes pueden resultar en la desactivación o en un producto inactivado que contiene el mimético, por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución inactivante de la tirosina; o la alanina puede actuar como una sustitución inactivante de la serina. Las secuencias de aminoácidos de los compuestos y/o composiciones de la invención pueden comprender aminoácidos de origen natural y, como tales, pueden considerarse proteínas, péptidos, polipéptidos o fragmentos de los mismos. Alternativamente, los compuestos y/o composiciones pueden comprender aminoácidos tanto naturales como no naturales.

[0407] Como se usa en este documento, el término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia nativa o de partida. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos. Como se usa en el presente documento, los términos "nativo" o "inicial" cuando se refieren a secuencias son términos relativos que se refieren a una molécula original con la que se puede hacer una comparación. Las secuencias nativas o iniciales no deben confundirse con las secuencias de tipo salvaje. Las secuencias o moléculas nativas pueden representar el tipo salvaje (la secuencia que se encuentra en la naturaleza) pero no tienen que ser idénticas a la secuencia del tipo salvaje.

[0408] Normalmente, las variantes poseerán al menos aproximadamente un 70% de homología con una secuencia nativa y, preferiblemente, serán al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de homología con una secuencia nativa.

[0409] Tal como se utiliza aquí, el término "homología" como se aplica a secuencias de aminoácidos se define como el porcentaje de residuos en el candidato de secuencia de aminoácidos que son idénticos con los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia después de alinear las secuencias e introduciendo huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología. Los métodos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidas en el cálculo.

[0410] Como se usa en este documento, por el término "homólogo" como se aplica a secuencias de aminoácidos se entiende la secuencia correspondiente de otras especies que tienen una identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.

[0411] Tal como se utiliza aquí, el término "análogo" se entiende que incluye variantes de polipéptidos que difieren en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos de aminoácidos que aún mantienen las propiedades del polipéptido parental.

[0412] Tal como se utiliza aquí, el término "derivado" se usa como sinónimo del término "variante" y se refiere a una molécula que ha sido modificada o cambiada de cualquier manera con respecto a una molécula de referencia o molécula de partida.

[0413] La divulgación contempla varios tipos de compuestos y/o composiciones que se basan en aminoácidos incluyendo variantes y derivados. Estos incluyen variantes y derivados sustitutivos, insercionales, delecionales y covalentes. Como tales, se incluyen dentro del alcance de esta invención compuestos y/o composiciones que comprenden sustituciones, inserciones, adiciones, deleciones y/o modificaciones covalentes. Por ejemplo, se pueden añadir etiquetas de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, a las secuencias de péptidos de la invención (por ejemplo, en los extremos N-terminal o C-terminal). Las etiquetas de secuencia se pueden usar para la purificación o localización de péptidos. Las lisinas se pueden usar para aumentar la solubilidad de los péptidos o para permitir la biotinilación. Alternativamente, los residuos de aminoácidos ubicados en las regiones carboxi y amino terminales de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína se pueden eliminar opcionalmente proporcionando secuencias truncadas. Ciertos aminoácidos (p. ej., residuos C-terminales o N-terminales) pueden eliminarse alternativamente dependiendo del uso de la secuencia, como por ejemplo, la expresión de la secuencia como parte de una secuencia más grande que es soluble o está unida a un soporte sólido.

[0414] Las "variantes de sustitución" cuando se refieren a proteínas son aquellas que tienen al menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa o inicial eliminada y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser simples, donde solo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, donde se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.

[0415] Como se usa en este documento, el término "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de tamaño similar, carga, o polaridad. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) como isoleucina, valina y leucina por otro residuo no polar. Asimismo, los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. Además, la sustitución de un residuo básico como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Los ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo) como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina por un residuo polar (hidrófilo) como cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina y/o un residuo polar para un residuo no polar.

[0416] Como se usa en este documento, el término "variantes de inserción" cuando se refiere a las proteínas son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa o de partida. Como se usa en este documento, el término "inmediatamente adyacente" se refiere a un aminoácido adyacente que está conectado al grupo funcional alfa-carboxi o alfa-amino de un aminoácido inicial o de referencia.

[0417] Como se usa en este documento, el término "variantes de eliminación" cuando se refiere a las proteínas, son aquellas en las que se ha eliminado uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida. Normalmente, las variantes delecionales tendrán uno o más aminoácidos delecionados en una región particular de la molécula.

[0418] Como se usa en el presente documento, el término "derivados", que se refiere el presente documento incluye variantes de una proteína nativa o de partida que comprende una o más modificaciones con agentes de derivación orgánicos proteináceos o no proteináceos, y modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar los residuos de aminoácidos dirigidos de la proteína con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales, o aprovechando los mecanismos de modificaciones postraduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos o para la preparación de anticuerpos anti-proteína para la purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Tales modificaciones están dentro del conocimiento ordinario de la técnica y se realizan sin experimentación indebida.

[0419] Ciertas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de las células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan con frecuencia después de la traducción a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos puede estar presente en las proteínas utilizadas de acuerdo con la presente invención.

[0420] Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos de hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, págs.79 - 86 (1983)).

[0421] Los derivados covalentes incluyen específicamente moléculas de fusión en donde las proteínas de la invención están covalentemente unidas a un polímero no proteínico. El polímero no proteínico es normalmente un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero que no se encuentra de otra manera en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante métodos recombinantes o in vitro son útiles, al igual que los polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrófilos se encuentran dentro del alcance de esta invención, por ejemplo, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los éteres de polivinilalquileno tales como polietilenglicol, polipropilenglicol. Las proteínas se pueden unir a varios polímeros no proteicos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera que se expone en la patente de EE.UU. N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

[0422] Tal como se utiliza aquí, el término "características", cuando se hace referencia a las proteínas, se define como componentes distintos basados en la secuencia de aminoácidos de una molécula. Las características de las proteínas de la presente invención incluyen manifestaciones superficiales, forma conformacional local, pliegues, bucles, semicírculos, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.

[0423] Como se usa en este documento, el término "manifestación superficial" cuando se hace referencia a las proteínas se refiere a un componente basado en polipéptidos de una proteína que aparece en la superficie más exterior.

[0424] Como se usa en este documento, el término "forma conformacional local" cuando se hace referencia a las proteínas se refiere a una manifestación estructural basada en polipéptidos de una proteína que se encuentra dentro de un espacio definible de la proteína.

[0425] Como se usa en este documento, el término "pliegue", cuando se refiere a las proteínas, se refiere a la conformación resultante de una secuencia de aminoácidos después de la minimización de energía. Puede producirse un pliegue en el nivel secundario o terciario del proceso de plegado. Ejemplos de pliegues de nivel secundario incluyen hojas beta y hélices alfa. Los ejemplos de pliegues terciarios incluyen dominios y regiones formados debido a la agregación o separación de fuerzas energéticas. Las regiones formadas de esta manera incluyen bolsas hidrófobas e hidrófilas y similares.

[0426] Tal como se utiliza aquí, el término "giro" que se refiere a la conformación de proteínas, se refiere a una curva que altera la dirección de la cadena principal de un péptido o polipéptido y puede implicar uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos.

[0427] Como se usa en este documento, el término "bucle", cuando se refiere a las proteínas, se refiere a una característica estructural de un péptido o polipéptido que invierte la dirección de la cadena principal de un péptido o polipéptido y comprende cuatro o más residuos de aminoácidos. Oliva y col. han identificado al menos 5 clases de bucles de proteínas (Oliva, B. et al., An automated classification of the structure of protein loops. J Mol Biol.1997.266 (4): 814-30).

[0428] Como se usa en este documento, el término "medio bucle", cuando se refiere a proteínas, se refiere a una parte de un bucle identificado que tiene al menos la mitad del número de aminoácidos que reside como el bucle del que se deriva. Se entiende que los bucles no siempre pueden contener un número par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en aquellos casos en los que un bucle contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un medio bucle del bucle impar comprenderá la parte de número entero o la siguiente parte de número entero del bucle (número de aminoácidos del bucle/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un bucle identificado como un bucle de 7 aminoácidos podría producir medios bucles de 3 aminoácidos o 4 aminoácidos (7/2 = 3,5 /- 0,5 siendo 3 o 4).

[0429] Como se usa en este documento, el término "dominio", cuando se refiere a las proteínas, se refiere a un motivo de un polipéptido que tiene una o más características o propiedades identificables estructurales o funcionales (por ejemplo, capacidad de unión, que sirve como un sitio para las interacciones proteína-proteína).

[0430] Tal como se utiliza aquí, el término "medio-dominio," cuando se refiere a las proteínas, se refiere a una porción de un dominio identificado que tiene al menos la mitad del número de residuos de aminoácidos como el dominio desde el que se deriva. Se entiende que los dominios no siempre pueden contener un número par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en aquellos casos en los que un dominio contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un medio dominio del dominio de número impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del dominio (número de aminoácidos del dominio/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un dominio identificado como un dominio de 7 aminoácidos podría producir semidominios de 3 aminoácidos o 4 aminoácidos (7/2 = 3,5 /- 0,5 siendo 3 o 4). También se entiende que los subdominios pueden identificarse dentro de los dominios o semidominios, poseyendo estos subdominios menos que todas las propiedades estructurales o funcionales identificadas en los dominios o semidominios de los que se derivaron. También se entiende que los aminoácidos que comprenden cualquiera de los tipos de dominios en este documento no necesitan ser contiguos a lo largo de la estructura del polipéptido (es decir, los aminoácidos no adyacentes pueden plegarse estructuralmente para producir un dominio, medio dominio o subdominio).

[0431] Como se usa en este documento, los términos "sitio", en lo que se refiere a realizaciones basadas en aminoácidos, se usa como sinónimo de "residuo de aminoácido" y "amino de la cadena lateral de ácido". Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que se puede modificar, manipular, alterar, derivatizar o variar dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente invención.

[0432] Como se usa en este documento, los términos "terminales" o "terminal," cuando se hacen referencia a las proteínas, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Tal extremidad no se limita solo al primer o último sitio del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptidos de la presente invención pueden caracterizarse por tener un extremo N-terminal (terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) y un extremo C-terminal (terminado por un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). Las proteínas de la invención en algunos casos están formadas por múltiples cadenas polipeptídicas unidas por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estos tipos de proteínas tendrán múltiples extremos N y C terminales. Alternativamente, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.

[0433] Una vez que cualquiera de las características se han identificado o definido como un componente de una molécula de la invención, cualesquiera de varias manipulaciones y/o modificaciones de estas características pueden realizarse moviendo, intercambiando, invirtiendo, suprimiendo, aleatorizando o duplicando. Además, se entiende que la manipulación de características puede dar como resultado el mismo resultado que una modificación de las moléculas de la invención. Por ejemplo, una manipulación que implique la eliminación de un dominio daría como resultado la alteración de la longitud de una molécula tal como lo haría la modificación de un ácido nucleico para codificar menos que una molécula de longitud completa.

[0434] Las modificaciones y manipulaciones se pueden lograr por métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio. Las moléculas modificadas resultantes pueden ensayarse luego para determinar su actividad usando ensayos in vitro o in vivo tales como los descritos en este documento o cualquier otro ensayo de cribado adecuado conocido en la técnica.

[0435] En algunas realizaciones, los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden comprender uno o más átomos que son isótopos. Como se usa en este documento, el término "isótopo" se refiere a un elemento químico que tiene uno o más neutrones adicionales. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención pueden deuterarse. Como se usa en este documento, el término "deuterato" se refiere al proceso de reemplazar uno o más átomos de hidrógeno en una sustancia con isótopos de deuterio. Los isótopos de deuterio son isótopos de hidrógeno. El núcleo de hidrógeno contiene un protón, mientras que los núcleos de deuterio contienen tanto un protón como un neutrón. Los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden deuterarse para cambiar una o más propiedades físicas, como la estabilidad, o para permitir que los compuestos y/o composiciones se utilicen en aplicaciones de diagnóstico y/o experimentales.

[0436] Conjugados y combinaciones

[0437] Se contempla que los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden formar complejos, conjugados o combinarse con una o más moléculas homólogas o heterólogas. Como se usa en este documento, el término "molécula homóloga" se refiere a una molécula que es similar en al menos una estructura o función con respecto a una molécula de partida, mientras que una "molécula heteróloga" es una que difiere en al menos una estructura o función con respecto a una molécula de partida. Los homólogos estructurales son, por tanto, moléculas que pueden ser sustancialmente similares estructuralmente. En algunas realizaciones, dichos homólogos pueden ser idénticos. Los homólogos funcionales son moléculas que pueden ser sustancialmente similares funcionalmente. En algunas realizaciones, dichos homólogos pueden ser idénticos.

[0438] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden comprender conjugados. Dichos conjugados de la invención pueden incluir sustancias o ligandos de origen natural, tales como proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o lípidos. Los conjugados también pueden ser moléculas recombinantes o sintéticas, tales como polímeros sintéticos, por ejemplo, poliaminoácidos sintéticos, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Los ejemplos de poliaminoácidos pueden incluir polilisina (PLL), poli L-ácido aspártico, poli L-ácido glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicólico), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli(2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Entre los ejemplos de poliaminas se incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido helicoidal alfa.

[0439] Los conjugados también pueden incluir grupos diana. Como se usa en el presente documento, el término "grupo diana" se refiere a un grupo funcional o resto unido a un agente que facilita la localización del agente en una región, tejido, célula y/o proteína deseados. Dichos grupos de direccionamiento pueden incluir, entre otros, agentes o grupos de direccionamiento de células o tejidos (por ejemplo, lectinas, glicoproteínas, lípidos, proteínas, un anticuerpo que se une a un tipo de célula específico como una célula de riñón u otro tipo de célula). En algunas realizaciones, los grupos dirigidos pueden comprender tirotropinas, melanotropinas, lectinas, glicoproteínas, tensioactivo proteína A, carbohidratos de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, lípidos, colesterol, esteroides, ácidos biliares, folatos, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un mimético de péptido RGD o un aptámero.

[0440] Los grupos dirigidos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los grupos dirigidos también pueden comprender hormonas y/o receptores hormonales.

[0441] Los grupos de orientación pueden ser cualquier ligando capaz de dirigirse a receptores específicos. Los ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, aptámeros, ligandos del receptor de integrina, ligandos del receptor de quimiocina, transferrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, ligandos PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, LDL y HDL. En algunas realizaciones, los grupos diana son aptámeros. Dichos aptámeros pueden estar sin modificar o comprender cualquier combinación de modificaciones descritas en este documento.

[0442] En otras realizaciones más, los compuestos y/o composiciones de la presente invención se pueden conjugar covalentemente con polipéptidos que penetran en las células. En algunas realizaciones, los péptidos de penetración celular también pueden incluir secuencias de señal. En algunas realizaciones, los conjugados de la invención pueden ser diseñados para tener una mayor estabilidad, aumento de la transfección de células y/o biodistribución alterada (por ejemplo, dirigida a tejidos específicos o tipos de células).

[0443] Los restos de conjugación se pueden añadir a los compuestos y/o composiciones de la presente invención de manera que permitan la unión de marcadores detectables a objetivos para su eliminación. Dichos marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a marcadores de biotina, ubiquitinas, moléculas fluorescentes, hemaglutinina (HA) de influenza humana, c-myc, histidina (His), bandera, glutatión S-transferasa (GST), V5 (un paramixovirus de epítopo de virus simio 5), biotina, avidina, estreptavidina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y digoxigenina.

[0444] Los compuestos descritos en la presente pueden conjugarse con un dominio Fc de anticuerpo para crear una proteína de fusión Fc. La formación de una proteína de fusión Fc con cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, incluido el descrito en las patentes estadounidenses números 5.116.964, 5.541.087 y 8.637.637. Las proteínas de fusión Fc de la invención pueden comprender un compuesto de la invención unido a la región bisagra de un Fc de IgG mediante residuos de cisteína en la región bisagra Fc. Las proteínas de fusión Fc resultantes pueden comprender una estructura similar a un anticuerpo, pero sin dominios Ch1 o cadenas ligeras. En algunos casos, las proteínas de fusión Fc pueden comprender perfiles farmacocinéticos comparables a los de los anticuerpos nativos. En algunos casos, las proteínas de fusión Fc de la invención pueden comprender una vida media prolongada en circulación y/o una actividad biológica alterada.

[0445] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden combinarse uno con otra u otras moléculas en el tratamiento de enfermedades y/o condiciones.

[0446] Ácidos nucleicos

[0447] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden ser codificados por moléculas de ácido nucleico. Dichas moléculas de ácido nucleico incluyen, sin limitación, moléculas de ADN, moléculas de ARN, polinucleótidos, oligonucleótidos, moléculas de ARNm, vectores, plásmidos y similares. En algunas realizaciones, la presente invención puede comprender células programadas o generadas para expresar moléculas de ácido nucleico que codifican compuestos y/o composiciones de la presente invención.

[0448] Métodos de uso

[0449] Los métodos descritos la presente incluyen métodos de modificación de la actividad del factor de crecimiento en uno o más sistemas biológicos. Dichos métodos pueden incluir poner en contacto uno o más sistemas biológicos con un compuesto y/o composición de la invención. En algunos casos, estos métodos incluyen modificar el nivel de factor de crecimiento libre en un sistema biológico (por ejemplo, en un nicho celular o sujeto). Los compuestos y/o composiciones de acuerdo con dichos métodos pueden incluir, pero no se limitan a biomoléculas, incluyendo, pero sin limitarse a proteínas recombinantes, complejos de proteínas y/o anticuerpos descritos en este documento.

[0450] Los métodos descritos la presente se pueden utilizar para iniciar o aumentar la actividad de factor de crecimiento, denominada "métodos de activación" en el presente documento. Algunos de tales métodos pueden comprender la liberación del factor de crecimiento de una GPC y/o la inhibición de la reasociación del factor de crecimiento en una GPC latente. En algunos casos, los métodos de activación pueden comprender el uso de un anticuerpo, una proteína recombinante y/o un complejo proteico. Según algunos métodos de activación, se proporcionan uno o más anticuerpos de activación. En tales métodos, se puede liberar uno o más factores de crecimiento o evitar que se devuelvan a un GPC. En un ejemplo no limitante, se puede proporcionar un anticuerpo anti-PAL que potencia la disociación entre un factor de crecimiento y una GPC y/o previene la reformación de una GPC.

[0451] En la presente se describen métodos de uso de anticuerpos de dominio anti-PAL y/o similares a anti-PAL para modificar la actividad del factor de crecimiento. En algunos casos, tales métodos pueden incluir el uso de anticuerpos anti-TGF-β-PAL como anticuerpos activadores de TGF-β. En algunos casos, los métodos para usar y/o probar dichos anticuerpos pueden incluir cualquiera de los métodos enseñados en Tsang, M. et al. 1995. Cytokine 7(5):389-97.

[0452] Los métodos descritos la presente se pueden usar para reducir o eliminar la actividad de factor de crecimiento, denominada "métodos de inhibición" en el presente documento. Algunos de estos métodos pueden comprender la retención del factor de crecimiento en una g Pc y/o la promoción de la reasociación del factor de crecimiento en una GPC latente. En algunos casos, los métodos de inhibición pueden comprender el uso de un anticuerpo.

[0453] Agentes terapéuticos

[0454] Las composiciones y los métodos descritos en la presente pueden usarse para tratar una amplia variedad de enfermedades, trastornos y/o condiciones. En algunos casos, tales enfermedades, trastornos y/o afecciones pueden ser indicaciones relacionadas con TGF-β. Como se usa en este documento, el término "indicación relacionada con TGF-β" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno y/o condición relacionada con la expresión, actividad y/o metabolismo de una proteína de miembro de la familia TGF-β o cualquier enfermedad, trastorno y/o condición que pueden beneficiarse de la modulación de la actividad y/o niveles de una o más proteínas de miembro de la familia TGF-β. Las indicaciones relacionadas con TGF-β pueden incluir, pero no se limitan a, fibrosis, anemia del envejecimiento, cáncer (que incluye, pero no se limita a, colon, riñón, mama, melanoma maligno y glioblastoma), facilitación de la hematopoyesis rápida después de la quimioterapia, curación, síndromes de proliferación endotelial, asma y alergia, trastornos gastrointestinales, aneurisma aórtico, indicaciones huérfanas (como el síndrome de Marfan y la enfermedad de Camurati-Engelmann), obesidad, diabetes, artritis, esclerosis múltiple, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson, la osteoporosis, la osteoartritis, la osteopenia, síndromes metabólicos, trastornos nutricionales, atrofia de órganos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y anorexia. Las indicaciones adicionales pueden incluir cualquiera de las divulgadas en la Pub. de EE.UU. N° 2013/0122007, patente de EE.UU. N° 8,415,459 o Pub. Internacional. N° WO 2011/151432.

[0456] La eficacia del tratamiento o la mejora de la enfermedad se puede evaluar, por ejemplo, midiendo la progresión de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la gravedad de los síntomas, la reducción del dolor, la calidad de vida, la dosis de un medicamento necesaria para mantener el efecto del tratamiento, el nivel de una enfermedad. marcador o cualquier otro parámetro medible apropiado para una enfermedad determinada que se está tratando o se dirige para la prevención. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica controlar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo cualquiera de dichos parámetros, o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de composiciones de la presente invención, "eficaz contra", por ejemplo, un cáncer, indica que la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, como una mejora de los síntomas, una cura, una reducción en la carga de enfermedad, reducción en la masa tumoral o en el número de células, extensión de la vida, mejora en la calidad de vida u otro efecto generalmente reconocido como positivo por los médicos familiarizados con el tratamiento del tipo particular de cáncer.

[0458] Un tratamiento o efecto preventivo es evidente cuando hay una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado de la enfermedad, o por una falla para empeorar o desarrollar síntomas donde de otro modo se anticiparían. Como ejemplo, un cambio favorable de al menos el 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferiblemente al menos el 20%, 30%, 40%, 50% o más puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia para una composición o formulación dada de la presente invención también se puede juzgar usando un modelo animal experimental para la enfermedad dada como se conoce en la técnica. Cuando se utiliza un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se evidencia cuando se observa un cambio estadísticamente significativo.

[0460] Agentes terapéuticos relacionados con trastornos y/o lesiones musculares

[0462] En algunas realizaciones, los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención pueden usarse para tratar uno o más trastornos y/o lesiones musculares. El músculo comprende aproximadamente entre un 40 y un 50% del peso corporal total, lo que lo convierte en el órgano más grande del cuerpo. Los trastornos musculares pueden incluir la caquexia (por ejemplo, el desgaste muscular.) El desgaste muscular puede estar asociado a una variedad de enfermedades y trastornos catabólicos (por ejemplo. VIH/SIDA, cáncer, caquexia por cáncer, insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca congestiva, distrofia muscular, atrofia por desuso, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de la neurona motora, traumatismo, enfermedad neurodegenerativa, infección, artritis reumatoide, inmovilización, diabetes, etc.) En tales trastornos, la actividad de señalización de GDF-8 y/o activina puede contribuir al catabolismo muscular (Han et al., 2013. Int J Biochem Cell Biol.45(10):2333-47; Lee., 2010. Immunol Endocr Metab Agents Med Chem. 10:183-94). Otros trastornos musculares pueden englobar la sarcopenia. La sarcopenia es la pérdida progresiva de músculo y función asociada al envejecimiento. En las personas mayores, la sarcopenia puede provocar fragilidad, debilidad, fatiga y pérdida de movilidad (Morely. 2012. Family Practice. 29:144-148.) Con el aumento de la población de edad avanzada, la sarcopenia se está convirtiendo progresivamente en un problema de salud pública más grave. Un estudio de Hamrick et al. (Hamrick et al., 2010.

[0463] 69(3):579-83) demostró que la inhibición de GDF-8 podía reparar el músculo en un modelo de ratón de osteotomía de peroné que incluía lesiones musculares del compartimento lateral. La administración de los propéptidos GDF-8 fue suficiente para aumentar la masa muscular en casi un 20%, así como para mejorar la curación de la fractura. Algunos compuestos y/o composiciones generados mediante métodos de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades, trastornos y/o lesiones musculares modulando la actividad de GDF-8. Los compuestos pueden ser antagonistas de la señalización de GDF-8, impidiendo o reduciendo la actividad de señalización de GDF-8.

[0465] La miositis por cuerpos de inclusión (MCI) es una enfermedad caracterizada por la pérdida progresiva de masa muscular, que se produce típicamente a mediados o finales de la vida. Se cree que la enfermedad se produce debido a una respuesta autoinmune a los autoantígenos del músculo que provoca la invasión de la fibra muscular por las células T y da como resultado la destrucción de las miofibras (Greenberg 2012. Curr Opin Neurol.25(5):630-9.) Se están investigando compuestos terapéuticos, entre los que se incluye el Bimagrumab (BYM338; Novartis, Basilea, Suiza,) un anticuerpo que se dirige a los receptores de activina de tipo II, impidiendo la transducción de señales de GDF-8 y/o activina, estimulando de este modo la producción y el fortalecimiento muscular [véase el ensayo clínico número NCT01925209 tituladoEficacia y seguridad de Bimagrumab/BYM338 a las 52 semanas sobre la función física, la fuerza muscular y la movilidad en pacientes con sIBM(RESILIENT.)]. Algunos compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención pueden usarse para tratar a sujetos con IBM. Tales compuestos y/o composiciones pueden bloquear la actividad de GDF-8 (por ejemplo, mediante la estabilización de las GPC de GDF-8.) Además de la IBM, el BYM338 se está investigando para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC.) En algunos casos, los compuestos y/o composiciones utilizados para el tratamiento de la IBM, pueden usarse también para tratar la EPOC. En algunos casos, los compuestos y/o composiciones pueden administrarse en combinación y/o coordinación con BYM338.

[0466] Agentes terapéuticos para la diabetes

[0467] El músculo esquelético usa y almacena glucosa como combustible. Debido a ello, el músculo esquelético es un importante regulador de los niveles circulantes de glucosa. La captación de glucosa por el músculo puede estimularse tanto por la contracción como por la estimulación de la insulina (McPherron et al., 2013. Adipocyte.2(2):92-8). Un estudio reciente de Guo et al. (Guo, et al., 2012. Diabetes 61(10):2414-23) descubrió que cuando los ratones deficientes en el receptor GDF-8 se cruzaban con ratones A-ZIP/F1 (una cepa de ratones lipodistróficos, usada como modelo diabético), la descendencia híbrida mostraba niveles reducidos de glucosa en sangre y una mayor sensibilidad a la insulina. También se redujo en estos ratones la hiperfagia (comer en exceso). Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención pueden usarse para tratar la diabetes y/o la hiperfagia. Algunos de estos tratamientos pueden usarse para reducir la glucosa en sangre y/o mejorar la sensibilidad a la insulina. Tales tratamientos pueden comprender antagonistas de la señalización de GDF-8, como uno o más anticuerpos que impidan la disociación de GDF-8 de su prodominio.

[0468] Aplicaciones veterinarias

[0469] Se contempla que las composiciones u métodos descritos en la presente encuentren utilidad en el área de la atención veterinaria, incluido el cuidado y tratamiento de vertebrados no humanos. Como se describe en el presente documento, el término "vertebrado" incluye todos los vertebrados, incluidos, entre otros, peces, anfibios, aves, reptiles y mamíferos (incluidos, entre otros, alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, ciervo, perro, burro, gayal, cabra, conejillo de indias, caballo, llama, ratones, monos, mula, cerdo, conejo, ratas, renos, búfalos de agua de oveja, yak y humanos). Como se usa en este documento, el término "vertebrado no humano" se refiere a cualquier vertebrado con la excepción de los humanos (es decir, Homo sapiens). Los ejemplos de vertebrados no humanos incluyen especies salvajes y domesticadas tales como animales de compañía y ganado. El ganado incluye animales domesticados criados en un entorno agrícola para producir materiales como alimentos, mano de obra y productos derivados como fibras y productos químicos. Generalmente, el ganado incluye todos los mamíferos, aves y peces que tienen un significado agrícola potencial. En particular, los animales de matanza de cuatro patas incluyen novillos, novillas, vacas, terneros, toros, bovinos, cerdos y ovejas.

[0470] Bioprocesamiento

[0471] En la presente se describen métodos para producir uno o más productos biológicos en las células huésped poniendo en contacto dichas células con compuestos y/o composiciones de la presente invención capaces de modular la expresión de genes diana o alterar el nivel de moléculas de señalización del factor de crecimiento en las que tal modulación o alteración potencia la producción de productos biológicos. Según la presente invención, los métodos de bioprocesamiento pueden mejorarse usando uno o más compuestos y/o composiciones de la presente invención. También pueden mejorarse complementando, reemplazando o añadiendo uno o más compuestos y/o composiciones.Composiciones farmacéuticas

[0472] Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden caracterizarse por una o más de biodisponibilidad, ventana terapéutica y/o volumen de distribución.

[0473] Biodisponibilidad

[0474] Las composiciones farmacéuticas pueden comprender complejos de compuestos y/o composiciones de la presente descripción con GPC. En tales realizaciones, los complejos pueden implantarse en sitios terapéuticos deseados donde puede producirse una disociación constante de los factores de crecimiento de los complejos durante un período de tiempo deseado. En algunas realizaciones, los complejos de implantación se pueden llevar a cabo en asociación con matrices esponjosas y/o similares a huesos. Tales implantaciones pueden incluir, pero no se limitan a, sitios de implantes dentales y/o sitios de reparación ósea.

[0475] Los compuestos y/o composiciones descritos en la presente pueden prepararse en células deficientes en furina. Las GPC producidas en tales células pueden ser útiles para el tratamiento en áreas donde la liberación se ralentiza debido al hecho de que la escisión de la furina in vivo limita la velocidad durante el procesamiento de GPC. En algunos casos, uno o más sitios tolloides y/o furina en las GPC están mutados, lo que ralentiza la acción de las proteasas tolloide y/o furina endógenas. En tales casos, la liberación del factor de crecimiento puede ser más lenta (por ejemplo, en los sitios de implantación).

[0476] Los anticuerpos generados usando los métodos de la presente invención, cuando se formulan en composiciones con entrega/formulación de agentes o vehículos tal como se describe en el presente documento, pueden presentar una mayor biodisponibilidad en comparación con composiciones carecen de agentes de administración como se describe en este documento. Como se usa en este documento, el término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica de una cantidad dada de un agente particular administrado a un sujeto. La biodisponibilidad se puede evaluar midiendo el área bajo la curva (AUC) o la concentración máxima en suero o plasma (Cmax) de la forma inalterada de un compuesto después de la administración del compuesto a un mamífero. El AUC es una determinación del área bajo la curva que representa la concentración en suero o plasma de un compuesto a lo largo de la ordenada (eje Y) frente al tiempo a lo largo de la abscisa (eje X). Generalmente, el AUC para un compuesto particular puede calcularse usando métodos conocidos por los expertos en la técnica y como se describe en GS Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v.72, Marcel Dekker, Nueva York, Inc., 1996.

[0478] Los valores de Cmax son concentraciones máximas de los compuestos obtenidos en el suero o plasma de un sujeto después de la administración de compuestos para el sujeto. Los valores de Cmax de compuestos particulares se pueden medir usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Como se usa en el presente documento, las frases "aumentar la biodisponibilidad" o "mejorar la farmacocinética" se refieren a acciones que pueden aumentar la disponibilidad sistémica de los compuestos y/o composiciones de la presente invención (medido por AUC, Cmax o Cmin). en un tema. En algunas realizaciones, tales acciones pueden comprender la coadministración con uno o más agentes de administración como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la biodisponibilidad de compuestos y/o composiciones puede aumentar en al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, en al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente el 100%.

[0480] Ventana terapéutica

[0482] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención, cuando se formula con uno o más agentes de administración como se describe en el presente documento, pueden presentar aumentos en la ventana terapéutica de la administración del compuesto y/o composición en comparación con la ventana terapéutica de los compuestos y/o composiciones administradas sin uno o más agentes de administración como se describe en este documento. Como se usa en este documento, el término "ventana terapéutica" se refiere al rango de concentraciones plasmáticas, o al rango de niveles de sustancia terapéuticamente activa en el sitio de acción, con una alta probabilidad de provocar un efecto terapéutico. En algunas realizaciones, las ventanas terapéuticas de compuestos y/o composiciones cuando se coadministran con uno o más agentes de administración como se describe en el presente documento pueden aumentar en al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente 100%.

[0484] Volumen de distribución

[0486] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención, cuando se formulan con uno o más agentes de administración como se describe en este documento, pueden exhibir un volumen de distribución mejorado (Vdist), por ejemplo, reducido o dirigido, en relación con las formulaciones que carecen uno o más agentes de administración como se describe en este documento. Vdist relaciona la cantidad de un agente en el cuerpo con la concentración del mismo agente en la sangre o el plasma. Como se usa en este documento, el término "volumen de distribución" se refiere al volumen de fluido que se requeriría para contener la cantidad total de un agente en el cuerpo a la misma concentración que en la sangre o el plasma: Vdist es igual a la cantidad de un agente en el cuerpo/concentración del agente en sangre o plasma. Por ejemplo, para una dosis de 10 mg de un agente dado y una concentración plasmática de 10 mg/L, el volumen de distribución sería de 1 litro. El volumen de distribución refleja la medida en que un agente está presente en el tejido extravascular. Los grandes volúmenes de distribución reflejan la tendencia de los agentes a unirse a los componentes tisulares en comparación con las proteínas plasmáticas. En entornos clínicos, Vdist se puede utilizar para determinar las dosis de carga para lograr concentraciones en estado estacionario. En algunas realizaciones, los volúmenes de distribución de compuestos y/o composiciones de la presente invención cuando se coadministran con uno o más agentes de administración como se describe en este documento pueden disminuir al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%.

[0487] Formulación, administración, suministro y dosificación

[0488] En algunos casos, los compuestos y/o composiciones descritos en la presente invención son composiciones farmacéuticas. Como se usa en este documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a un compuesto y/o composición de la presente invención que se ha formulado con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Se pueden encontrar consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (incorporado aquí como referencia).

[0489] Las composiciones pueden administrarse a seres humanos, pacientes humanos o sujetos. Para los propósitos de la presente divulgación, la frase "ingrediente activo" generalmente se refiere a compuestos y/o composiciones de la presente invención que se administrarán como se describe en el presente documento.

[0490] Aunque las descripciones de composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento están dirigidas principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, se entenderá por el experto en la técnica que tales composiciones son en general adecuadas para la administración a otros sujetos, por ejemplo, a animales no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos. Se comprende bien la modificación de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a varios animales, y el farmacólogo veterinario habitualmente experto puede diseñar y/o realizar tal modificación con experimentación meramente ordinaria, si la hay. Los sujetos a los que se contempla la administración de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos, incluidos mamíferos comercialmente relevantes como ganado, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluidas aves comercialmente relevantes como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos.

[0491] En algunas realizaciones, las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar por cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos preparatorios incluyen el paso de asociar los ingredientes activos con excipientes y/o uno o más de otros ingredientes accesorios, y luego, si es necesario y/o deseable, dividir, dar forma y/o envasar los productos en los productos deseados individuales o unidades multidosis.

[0492] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como dosis unitarias individuales, y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en este documento, el término "dosis unitaria" se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada de ingrediente activo. Las cantidades de ingrediente activo son generalmente iguales a la dosis de ingredientes activos que se administrarían a los sujetos y/o fracciones convenientes de tales dosis tales como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tales dosis.

[0493] En algunas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes activos, excipientes farmacéuticamente aceptables, y/o cualquiera de los ingredientes adicionales en las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede variar, dependiendo de la identidad, tamaño, y/o condición de los sujetos a tratar y además dependiendo de las rutas por las que se vayan a administrar las composiciones. A modo de ejemplo, las composiciones pueden comprender entre aproximadamente 0,1% y 100%, por ejemplo, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% o al menos 80% (p/p) de ingrediente activo. En algunas realizaciones, los ingredientes activos son anticuerpos dirigidos hacia elementos reguladores y/o GPC.

[0494] Formulaciones

[0495] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención pueden formularse utilizando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la permeabilidad celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, de compuestos y/o factores de crecimiento de tales formulaciones); y/o (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, compuestos diana a tejidos o tipos de células específicos). Además de los excipientes tradicionales tales como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes, vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión, adyuvantes de suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes, agentes emulsionantes y conservantes, las formulaciones de la presente invención pueden comprender, sin limitación, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas núcleo-capa, péptidos, proteínas, células transfectadas con los compuestos y/o composiciones de la presente invención (por ejemplo, para trasplante en sujetos) y combinaciones de los mismos.

[0496] Excipientes

[0497] Varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para la preparación de la composición son conocidos en la técnica (véase Remington: The Science y Practice of Pharmacy, 21a edición, AR Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; incorporado aquí como referencia).

[0498] En algunas realizaciones, el uso de medios de excipiente convencionales se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación, excepto en la medida en que cualquier medio de excipiente convencional pueden ser incompatibles con las sustancias y/o sus derivados, tales como mediante la producción de cualquier efecto biológico indeseable o interactuando de otra manera de manera perjudicial con cualquier otro componente de las composiciones farmacéuticas.

[0499] Las formulaciones de composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos preparatorios incluyen etapas de asociar ingredientes activos con excipientes y/u otros ingredientes accesorios.

[0500] Las composiciones farmacéuticas, de conformidad con la presente descripción, pueden prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como dosis unitarias individuales, y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales.

[0501] Las cantidades relativas de ingredientes activos, excipientes farmacéuticamente aceptables, y/o ingredientes adicionales en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño, y/o condición de los sujetos que están siendo tratados y dependiendo además de rutas por las cuales se pueden administrar composiciones farmacéuticas.

[0502] En algunas realizaciones, excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% pura. En algunas realizaciones, los excipientes están aprobados para uso en humanos y/o para uso veterinario. En algunas realizaciones, los excipientes están aprobados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos. En algunas realizaciones, los excipientes son de calidad farmacéutica. En algunas realizaciones, los excipientes cumplen los estándares de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.

[0503] En algunas realizaciones, los excipientes farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden incluir, pero están no limitados a, diluyentes inertes, dispersantes y/o granulación de agentes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes de tampón, agentes lubricantes y/o aceites. Estos excipientes se pueden incluir opcionalmente en composiciones farmacéuticas.

[0504] Los diluyentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, carbonato sódico, fosfato cálcico, fosfato dicálcico, sulfato cálcico, hidrogenofosfato cálcico, lactosa de fosfato sódico, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo,etc.,y/o combinaciones de los mismos.

[0505] Los ejemplos de agentes de granulación y/o dispersión incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón sódico, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) (crospovidona) reticulada, almidón de carboximetilo sódico (glicolato de almidón sódico), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa cálcica, silicato de magnesio y aluminio (VEEGUM®), sulfato de laurilo sódico, compuestos de amonio cuaternario,etc.,y/o combinaciones de los mismos.

[0506] Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, condrux, colesterol, xantano, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, grasa de lana, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [silicato de aluminio y magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de alto peso molecular (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxipolimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenina, derivados celulósicos (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (p. ej., monolaurato de polioxietilensorbitán [TWEEN®20], polioxietilensorbitán [TWEENn®60], monooleato de sorbitán de polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [Span®60], triestearato de sorbitán [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOl®), ésteres de ácidos grasos de sacarosa, ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno, (por ejemplo, polioxietilen lauril éter [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, sulfato de laurilo sódico, PLUORINC® F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, etc. y/o combinaciones de los mismos.

[0508] Los agentes aglutinantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidón (p. ej., almidón de maíz y pasta de almidón); gelatina; azúcares (p. ej., sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol); gomas naturales y sintéticas (p. ej.,goma arábiga, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de celulosa microcristalina (vinilpirrolidona), silicato de magnesio y aluminio (Veegum®) y arabogalactano de alerce); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales de calcio inorgánicas; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol;etc.;y combinaciones de los mismos.

[0510] Los conservantes ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. Los agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Los conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, parabeno butílico, parabeno metílico, parabeno etílico, parabeno propílico, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los conservantes de alcohol ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero no se limitan a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, sulfato de laurilo sódico (SLS), sulfato de sodio de laurilo éter (SLES), bisulfito, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ y/o EUXYL®.

[0512] Los agentes tamponantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a soluciones de tampón de citrato, soluciones de tampón de acetato, soluciones de tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido de fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua libre de pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico,etc.,y/o combinaciones de los mismos.

[0514] Los agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, betanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, sulfato de lauril de magnesio, sulfato de laurilo sódico,etc.,y combinaciones de los mismos.

[0516] Los ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de corriente negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, macademias, malva, semilla de mango, semilla de prado, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, maní, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, ajedrea, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol del té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y aceites de germen de trigo. Los ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.

[0518] Excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.

[0519] Vehículos de formulación: liposomas, lipoplexos, y nanopartículas de lípidos

[0520] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención pueden formularse utilizando uno o más liposomas, lipoplexos y/o nanopartículas lipídicas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden liposomas. Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y pueden usarse como vehículos de suministro para la administración de nutrientes y formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños como, entre otros, vesículas multilaminares (MLV) que pueden tener cientos de nanómetros de diámetro y pueden contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos, pequeñas vesículas unicelulares (SUV) que pueden ser menor de 50 nm de diámetro y vesícula unilaminar grande (LUV) que puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. Los componentes de los liposomas pueden incluir, pero no se limitan a, opsoninas o ligandos con el fin de mejorar la unión de los liposomas a los tejidos no saludables o para activar eventos tales como, pero no se limitan a, endocitosis. Los liposomas pueden comprender un pH alto o bajo. En algunas realizaciones, el pH de los liposomas se puede variar para mejorar la administración de formulaciones farmacéuticas.

[0521] En algunas realizaciones, la formación de liposomas puede depender de características físico-químicas tales como, pero no limitado a, la formulación farmacéutica atrapada, ingredientes liposomales, la naturaleza del medio en donde los lípidos se dispersan vesículas, la concentración efectiva de sustancias atrapadas, potencial toxicidad de sustancias atrapadas, procesos adicionales involucrados durante la aplicación y/o entrega de vesículas, tamaño de optimización, polidispersidad, vida útil de vesículas para la aplicación prevista, reproducibilidad de lote a lote y posibilidad de producción a gran escala de productos liposomales seguros y eficientes.

[0522] En algunas realizaciones, las formulaciones se pueden ensamblar o las composiciones se pueden alterar de manera que se dirijan pasiva o activamente a diferentes tipos de célulasin vivo.

[0523] En algunas realizaciones, las formulaciones pueden ser dirigidas selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en la formulación de las superficies como se ejemplifica por, pero no limitado por, ácido fólico, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc), y enfoques dirigidos a anticuerpos.

[0524] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular con liposomas, lipoplexos y/o nanopartículas de lípidos para mejorar la eficacia de la función. Tales formulaciones pueden aumentar la transfección celular mediante composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, se pueden usar liposomas, lipoplejos o nanopartículas de lípidos para aumentar la estabilidad de la composición farmacéutica.

[0525] En algunas realizaciones, los liposomas se formulan específicamente para composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos. Dichos liposomas se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas por Eppstein et al. (Eppstein, DA y col., Biological activity of liposome-encapsulated murine interferon gamma is mediated by a cell membrane receptor. Proc Natl Acad Sci EE.UU.. 1985 Jun; 82 (11): 3688-92); Hwang y col. (Hwang, KJ y col., Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin/cholesterol liposomes: a kinetic study. Proc Natl Acad Sci EE.UU.1980 julio; 77 (7): 4030-4); US 4.485.045 y US 4.544.545. La producción de liposomas con un tiempo de circulación sostenido también se describe en el documento US 5.013.556.

[0526] En algunas formas de realización, los liposomas de la presente invención comprenden anticuerpos pueden generarse utilizando la evaporación de fase inversa utilizando lípidos tales como fosfatidilcolina, colesterol, así como fosfatidiletanolamina que han sido derivatizados de polietilenoglicol. Se utilizan filtros con un tamaño de poro definido para extruir liposomas del diámetro deseado. En otra realización, los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden conjugarse con superficies externas de liposomas mediante reacciones de intercambio de disulfuro como describen Martin et al. (Martin, FJ et al., Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles. An improved method for liposome targeting. J Biol Chem.10 de enero de 1982; 257 (1): 286-8).

[0527] Vehículos de formulación: polímeros y nanopartículas

[0528] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención se pueden formular utilizando polímeros naturales y/o sintéticos. Los ejemplos no limitantes de polímeros que se pueden usar para la administración incluyen, pero no se limitan a polímeros DMRI/DOPE, poloxámero, quitosano, ciclodextrina y ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser biodegradables.

[0529] En algunas realizaciones, la formulación de polímero puede permitir la liberación sostenida y/o retardada de compuestos y/o composiciones (p. ej., después de una inyección intramuscular y/o subcutánea). El perfil de liberación alterado para compuestos y/o composiciones de la presente invención puede dar como resultado, por ejemplo, la liberación de compuestos durante un período de tiempo prolongado. También se pueden usar formulaciones poliméricas para aumentar la estabilidad de compuestos y/o composiciones de la presente invención.

[0530] En algunas realizaciones, las formulaciones poliméricas pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos como se ejemplifica, pero no se limita a, folato, transferrina y N-acetilgalactosamina (GalNAc) (Benoit, DS et al., Synthesis of folate-functionalized RAFT polymers for targeted siRNA delivery. Biomacromolecules. 201112: 2708-14; Rozema, DB et al., Dynamic polyconjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proc Natl Acad Sci EE.UU.2007104: 12982-12887; Davis, ME et al., The first targeted delivery of siRNA in humans via a self-assembling, cyclodextrin polymer-based nanoparticle: from concept to clinic. Mol Pharm.

[0531] 20096: 659-668; Davis, ME et al., Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature 2010.464: 1067-1070).

[0532] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención se pueden formular como nanopartículas utilizando combinaciones de polímeros, lípidos, y/o otros agentes biodegradables, tales como, pero no limitado a, fosfatos de calcio. En algunas realizaciones, los componentes pueden combinarse en arquitecturas de capas de núcleo, híbridos y/o capa por capa, para permitir el ajuste fino de la estructura de nanopartículas, por lo que la entrega puede mejorarse. Para los anticuerpos de la presente invención, se pueden utilizar los sistemas basados en poli(2-(metacriloiloxi)etilfosforilcolina)-bloque-(2-(diisopropilamino)metacrilato de etilo), (PMPC-PDPA), un copolímero dibloque sensible al pH que se autoensambla para formar vesículas de tamaño nanométrico, también conocidas como polimerosomas, a pH fisiológico. Se ha demostrado que estos polimerosomas entregan con éxito cargas útiles de anticuerpos relativamente altas dentro de las células vivas. (Massignani, M. et al., Cellular delivery of antibodies: effective targeted subcellular imaging and new therapeutic tool. Nature Proceedings.

[0533] 2010. p1-17).

[0534] En algunas realizaciones, los polímeros de conversión de carga de PEG (Pitella, F.et al., Enhanced endosomal escape of siRNA-incorporating hybrid nanoparticles from calcium phosphate and PEG-block chargeconversional polymer for efficient gene knockdown with negligible cytotoxicity. Biomaterials. 2011 32: 3106-14) se pueden usar para formar nanopartículas para la administración de compuestos y/o composiciones de la presente invención. En algunas realizaciones, los polímeros de conversión de carga de PEG pueden mejorar los copolímeros de bloque de polianiones de PEG al escindirse en policationes a pH ácido, mejorando así el escape endosómico.

[0535] En algunas realizaciones, la complejación, liberación y/o internalización de nanopartículas poliméricas se pueden controlar con precisión mediante la alteración de las composiciones químicas en los componentes de nanopartículas de núcleo y capa (Siegwart, DJ et al., Combinatorial synthesis of chemically diverse core-shell nanoparticles for intracellular delivery. Proc Natl Acad Sci EE.UU.2011108: 12996-3001).

[0536] En algunas realizaciones, las matrices de poli(acetato de etileno-co-vinilo), se utilizan para entregar compuestos y/o composiciones de la invención. Dichas matrices han sido descritas por otros (Sherwood, JK et al., Controlled antibody delivery systems. Nature Biotechnology.1992.10: 1446-9).

[0537] Formulaciones de anticuerpos

[0538] Los anticuerpos pueden formularse para administración intravenosa o extravascular (Daugherty, et al., Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev.7 de agosto de 2006; 58 (5-6): 686-706 y publicación de solicitud de patente estadounidense número US2011/0135570). Las vías de administración extravascular pueden incluir, pero no se limitan a, administración subcutánea, administración intraperitoneal, administración intracerebral, administración intraocular, administración intralesional, administración tópica y administración intramuscular.

[0539] En algunas realizaciones, las estructuras de anticuerpos pueden modificarse para mejorar la eficacia como terapéutica. Las mejoras pueden incluir, pero no se limitan a, estabilidad termodinámica mejorada, propiedades reducidas de unión al receptor de Fc y/o eficiencia de plegado mejorada. Las modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, sustituciones de aminoácidos, glicosilación, palmitoilación y/o conjugación de proteínas.

[0540] En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden formular con antioxidantes para reducir la oxidación de anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden formular con aditivos para reducir la agregación de proteínas. Dichos aditivos pueden incluir, entre otros, albúmina, aminoácidos, azúcares, urea, cloruro de guanidinio, polialcoholes, polímeros (como polietilenglicol y dextranos), tensioactivos (incluidos, entre otros, polisorbato 20 y polisorbato 80) o incluso otros anticuerpos.

[0541] En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden formular para reducir el impacto del agua sobre la estructura y la función del anticuerpo. Las preparaciones de anticuerpos en tales formulaciones pueden liofilizarse. Las formulaciones sujetas a liofilización pueden incluir carbohidratos o compuestos de poliol para proteger y/o estabilizar la estructura del anticuerpo. Dichos compuestos pueden incluir, entre otros, sacarosa, trehalosa y manitol.

[0542] En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden formular con polímeros. En algunas realizaciones, las formulaciones de polímeros pueden comprender polímeros hidrófobos. Dichos polímeros pueden ser microesferas formuladas con polilactida-co-glicólido mediante métodos de encapsulación de sólido en aceite en agua. En algunas realizaciones, las microesferas que comprenden copolímero de etilenvinilacetato también pueden usarse para la administración de anticuerpos y/o para extender el transcurso de tiempo de la liberación de anticuerpos en los sitios de administración. En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser geles acuosos. Dichos geles pueden comprender, por ejemplo, carboximetilcelulosa. En algunas realizaciones, los geles acuosos también pueden comprender hidrogeles de ácido hialurónico. En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden unir covalentemente a dichos geles a través de enlaces de hidrazona que permiten el suministro sostenido en tejidos, incluidos, entre otros, tejidos del sistema nervioso central.

[0543] Vehículos de formulación: péptidos y proteínas

[0544] Los compuestos y/o composiciones generados usando los métodos de la presente invención pueden formularse con péptidos y/o proteínas. En algunas realizaciones, se pueden usar péptidos tales como, pero sin limitarse a, péptidos que penetran en las células y/o proteínas/péptidos que permiten la administración intracelular para administrar formulaciones farmacéuticas. Los ejemplos no limitantes de péptidos que penetran en las células que se pueden usar con las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen secuencias de péptidos que penetran en las células unidas a policationes que facilitan el suministro al espacio intracelular, por ejemplo, péptido TAT derivado del VIH, penetratinas, transportadores o Péptidos penetrantes de células derivados de hCT (véase, por ejemplo, Caron, NJ et al., Intracellular delivery of a Tat-eGFP fusion protein into muscle cells. Mol Ther.2001.3 (3): 310-8; Langel, U., Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications, CRC Press, Boca Raton FL, 2002; El-Andaloussi, S. et al., Cell-Peptides Peptides: Mechanisms and Applications. Curr Pharm Des. 2003. 11 (28): 3597-611; y Deshayes, S. et al., Cellpenetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci.

[0545] 2005.62 (16): 1839-49). Los compuestos y/o composiciones de la presente invención también pueden ser formulados para incluir agentes penetrantes de células, por ejemplo, liposomas, que mejoran la entrega de las composiciones a espacios intracelulares. Los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden formar complejos con péptidos y/o proteínas tales como, pero sin limitarse a, péptidos y/o proteínas de Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) y Permeon Biologics (Cambridge, MA) para permitir el suministro intracelular (Cronican, JJ et al., Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem Biol.2010.5: 747-52; McNaughton, BR et al., Mammalian cell penetration, siRNA transfection, and DNA transfection by supercharged proteins. Proc Natl Acad Sci, EE.UU. 2009. 106: 6111-6; Verdine, GL et al., Stapled peptides for intracellular drug targets. Methods Enzymol.2012.503: 3-33).

[0546] En algunas realizaciones, los polipéptidos que penetran en las células pueden comprender dominios primero y segundo. Los primeros dominios pueden comprender polipéptidos supercargados. Los segundos dominios pueden comprender un compañero de unión a proteínas. Como se usa en este documento, los pares de unión a proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de armazón y/o péptidos. Los polipéptidos que penetran en las células pueden comprender además pares de unión intracelular para pares de unión a proteínas. En algunas realizaciones, los polipéptidos que penetran en las células pueden ser capaces de secretarse a partir de células donde se pueden introducir compuestos y/o composiciones de la presente invención.

[0547] Las composiciones d que comprenden péptidos y/o proteínas pueden usarse para aumentar la transfección celular y/o alterar la biodistribución del compuesto/composición (p. ej., dirigiéndose a tejidos o tipos celulares específicos).

[0548] Vehículos d eformulación: células

[0549] Las formulaciones basadas en células de compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden usarse para asegurar la transfección celular (p. ej., en vehículos celulares) o para alterar la biodistribución (p. ej., dirigiendo los vehículos celulares a tejidos específicos o tipos de células).

[0550] Métodos de transferencia de células

[0551] Una variedad de métodos se conocen en la técnica y son adecuados para la introducción de ácidos nucleicos o proteínas en las células, incluyendo técnicas mediadas virales y no virales. Ejemplos de técnicas típicas no mediadas por virus incluyen, pero no se limitan a, electroporación, transferencia mediada por fosfato de calcio, nucleofección, sonoporación, choque térmico, magnetofección, transferencia mediada por liposomas, microinyección, transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), transferencia mediada por polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (PEG) y similares) o fusión celular.

[0552] La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso de sonido (p. ej., frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de las membranas plasmáticas de las células. Los métodos de sonoporación son conocidos por los expertos en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicosin v ivo(Yoon, CS et al., Ultrasoundmediated gene delivery. Expert Opin Drug Deliv.20107: 321-30; Postema, M. et al., Ultrasound-directed drug delivery. Curr Pharm Biotechnol. 20078: 355-61; Newman, CM et al., Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 2007. 14 (6): 465-75). Los métodos de sonoporación son conocidos en la técnica y también se enseñan, por ejemplo, en lo que respecta a bacterias en la publicación de solicitud de patente estadounidense US2010/0196983 y en lo que se refiere a otros tipos de células en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense US2010/0009424.

[0553] Las técnicas de electroporación también son bien conocidas en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicosin v ivoy clínicamente (Andre, FM et al., Nucleic acids electrotransfer in vivo: mechanisms and practical aspects. Curr Gene Ther. 2010 10: 267-80; Chiarella, P. et al., Application of electroporation in DNA vaccination protocols. Curr Gene Ther. 2010. 10: 281-6; Hojman, P., Basic principles and clinical advancements of muscle electrotransfer. Curr Gene Ther. 2010 10: 128-38). En algunos casos, los compuestos y/o composiciones de la presente divulgación pueden administrarse mediante electroporación.

[0554] Ensayos

[0555] Las proteínas recombinantes (incluyendo, pero no limitado a proteínas quiméricas) divulgadas en la presente y/o anticuerpos dirigidos a tales proteínas se pueden desarrollar usando ensayos descritos en este documento. En algunos casos, las proteínas recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, proteínas quiméricas) descritas en el presente documento y/o anticuerpos dirigidos a tales proteínas pueden usarse en ensayos para desarrollar otras proteínas recombinantes y/o anticuerpos de la presente divulgación.

[0556] Ensayos de unión

[0557] En algunos casos, la divulgación proporciona ensayos de unión. Como se usa en el presente documento, el término "ensayo de unión" se refiere a un ensayo usado para evaluar la capacidad de dos o más factores para asociarse. Dichos ensayos pueden evaluar la capacidad de un antígeno deseado para unirse a un anticuerpo deseado y luego usar uno o más métodos de detección para detectar la unión. Los ensayos de unión de la invención pueden incluir, pero no se limitan a, ensayos basados en resonancia de plasmon superficial, ensayos ELISA y basados en FACS. Los ensayos de unión de la invención pueden comprender el uso de una o más proteínas recombinantes descritas en este documento, incluyendo, pero sin limitarse a, cualesquiera proteínas de miembro de la familia TGF-β, cualquier proteína quimérica, cualquier cofactor y cualquier módulo, combinación o fragmento de los mismos.Ensayos basados en células

[0558] En algunos casos, la presente divulgación proporciona ensayos basados en células. Como se usa en este documento, el término "ensayo basado en células" se refiere a un ensayo que comprende al menos un aspecto que implica el uso de una célula viva o cultivo celular. En algunas realizaciones, estos pueden ser útiles para evaluar la modulación de la liberación del factor de crecimiento de las GPC, denominadas en el presente documento "ensayos de liberación del factor de crecimiento". En algunas realizaciones, los ensayos basados en células pueden ser útiles para evaluar la modulación de la actividad del factor de crecimiento, denominados en el presente documento "ensayos de actividad del factor de crecimiento". Los ensayos basados en células de la presente invención pueden comprender células de expresión y/o células sensibles. Las células de expresión, como se hace referencia en este documento, son células que expresan uno o más factores que se analizan en un ensayo particular. Tal expresión puede ser natural o puede ser el resultado de la transfección y/o transducción de un gen extraño. En algunas realizaciones, la expresión de uno o más factores por células de expresión puede potenciarse o suprimirse mediante la adición de uno o más factores exógenos. En algunas realizaciones, las células de expresión pueden comprender líneas celulares (p. ej., células HEK293, células CHO, células TMLC, células 293T/17, células Hs68, células CCD1112sk, células HFF-1, fibroblastos queloides o células Sw-480). En algunas realizaciones, las líneas celulares que comprenden células de expresión pueden expresar una o más proteínas recombinantes de la presente divulgación (p. ej., de forma natural y/o mediante transfección, transfección estable y/o transducción).

[0559] En algunas realizaciones, los ensayos de actividad/liberación de factor de crecimiento pueden comprender células de expresión que expresan GPC. En tales realizaciones, se pueden coexpresar factores adicionales y/o combinar con células de expresión para determinar su efecto sobre la liberación del factor de crecimiento de tales GPC. En algunas realizaciones, las integrinas (que incluyen, entre otras, la integrina avp6, la integrina avp8 y/o la integrina agPi) se coexpresan y/o se introducen de otro modo en células de expresión que expresan GPC. En algunas realizaciones, dicha expresión de integrina adicional puede facilitar la liberación del factor de crecimiento. En algunas realizaciones, las LTBP, fibrilinas y/o GARP y/o variantes de las mismas se coexpresan y/o se introducen de otro modo en células de expresión.

[0560] En algunas realizaciones, uno o más genes se pueden inactivar, reducir y/o modular de otro modo en las células de expresión dependiendo del enfoque de un ensayo particular. En algunas realizaciones, uno o más productos génicos se pueden modular a nivel de ARN y/o proteína. En algunas realizaciones, los productos génicos pueden reducirse mediante la introducción de moléculas de ARNip en células de expresión. En algunas realizaciones, los productos génicos de LTBP, fibrilina y/o genes GARP pueden reducirse y/o eliminarse de las células de expresión de la presente invención.

[0561] Ensayos a base celular de la presente invención, incluyendo, pero no limitado a ensayos de liberación/actividad de factores de crecimiento, puede comprender células que responden. Como se usa en este documento, el término "célula sensible" se refiere a una célula que experimenta una respuesta a uno o más factores introducidos en un ensayo. En algunas realizaciones, tales respuestas pueden incluir un cambio en la expresión génica, en donde dichas células modulan la transcripción de uno o más genes al entrar en contacto con uno o más factores introducidos. En algunas realizaciones, las células sensibles pueden sufrir un cambio de fenotipo, comportamiento y/o viabilidad.

[0563] En algunas realizaciones, las células que responden comprenden uno o más genes indicadores. Como se usa en el presente documento, el término "gen indicador" se refiere a un gen sintético que comprende típicamente un promotor y una región codificante de proteína que codifica uno o más productos génicos detectables. Los genes indicadores se diseñan típicamente de tal manera que su expresión se pueda modular en respuesta a uno o más factores que se analizan mediante un ensayo particular. Esto puede llevarse a cabo manipulando el promotor de genes indicadores. Como se usa en este documento, el término promotor se refiere a parte de un gen que inicia la transcripción de ese gen. Los promotores típicamente comprenden nucleótidos en el extremo 3' de la hebra antisentido de un gen dado y no se transcriben durante la expresión del gen. Los promotores funcionan típicamente a través de la interacción con uno o más factores de transcripción, así como con las enzimas ARN polimerasa para iniciar la transcripción de la porción del gen que codifica la proteína. Los segmentos del promotor que interactúan físicamente con uno o más factores de transcripción y/o enzimas polimerasas se denominan en el presente documento elementos de respuesta. En algunas realizaciones, los genes informadores se diseñan para comprender promotores y/o elementos de respuesta que se sabe que responden a uno o más factores (incluidos, entre otros, factores de crecimiento) que se analizan en un ensayo dado. Los cambios en la expresión de genes de células sensibles se pueden medir de acuerdo con cualquier método disponible en la técnica para producir datos de expresión de genes. Tales datos de expresión génica se pueden obtener en forma de datos de actividad de luciferasa [a menudo se mide en términos de unidades relativas de luz (RLU)].

[0565] En algunos casos, las células que responden experimentan un cambio en la viabilidad en respuesta a uno o más factores introducido en un ensayo. Dichas células sensibles se pueden usar en ensayos de proliferación como se describe en este documento. Los cambios en la viabilidad celular sensible se pueden detectar mediante recuento celular y/u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica para producir datos de viabilidad celular sensible.

[0567] Las regiones que codifican proteínas de los genes indicadores codifican típicamente una o más proteínas detectables. Las proteínas detectables se refieren a cualquier proteína capaz de detectarse mediante uno o más métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos de detección pueden incluir, entre otros, transferencia Western, ELISA, análisis de la actividad enzimática de proteínas detectables (p. ej., actividad catalasa, actividad |3-galactosidasa y/o actividad luciferasa), detección inmunocitoquímica, cribado y/o detección por resonancia de plasmón superficial. de proteínas detectables fluorescentes. Cuando se usa un gen indicador en un ensayo, la expresión de proteínas detectables se correlaciona con la capacidad de los factores que se están ensayando para activar el promotor presente en el gen indicador. En realizaciones que comprenden ensayos de actividad/liberación del factor de crecimiento, los promotores del gen indicador responden típicamente a la señalización del factor de crecimiento. En tales realizaciones, el nivel de proteína detectable producida se correlaciona con el nivel de señalización del factor de crecimiento, lo que indica la liberación y/o actividad de un factor de crecimiento dado.

[0569] En algunas realizaciones, los genes indicadores codifican enzimas luciferasas. Las reacciones químicas entre las enzimas luciferasas y las moléculas de sustrato son reacciones emisoras de luz. Debido a tales reacciones de emisión de luz, los niveles de la enzima luciferasa pueden cuantificarse mediante la adición de moléculas de sustrato y la posterior fotodetección de la luz emitida. En algunas realizaciones, los genes indicadores de la presente invención codifican luciferasa de luciérnaga, cuya secuencia se clonó a partir deP h o tin u s pyra lis .En algunas realizaciones, las células sensibles de la presente invención comprenden genes indicadores que expresan luciferasa con promotores que responden a factores de crecimiento. En tales realizaciones, la actividad de la luciferasa puede correlacionarse con los niveles de actividad del factor de crecimiento, lo que permite determinar la actividad del factor de crecimiento y/o la liberación de las GPC.

[0571] En algunas realizaciones, los genes indicadores se insertan en plásmidos bacterianos para permitir la replicación y/o facilitar la introducción en células. En algunas realizaciones, tales plásmidos se diseñan para comprender secuencias que codifican productos génicos detectables y pueden manipularse para insertar secuencias promotoras que pueden responder a uno o más factores de interés. Estos plásmidos se denominan en el presente documento plásmidos informadores. En algunas realizaciones de la presente invención, los promotores que pueden responder a uno o más factores de interés pueden insertarse en plásmidos informadores, corriente arriba de secuencias que codifican productos génicos detectables para formar genes informadores funcionales dentro de dichos plásmidos informadores. Los plásmidos informadores que comprenden al menos un gen informador funcional se denominan en el presente documento construcciones informadoras. En algunas realizaciones, las construcciones informadoras de la presente invención pueden comprender plásmidos informadores pGL2 (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI), plásmidos informadores pGL3 (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI), plásmidos informadores pGL4 (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI) o variantes de los mismos. Tales construcciones informadoras expresan luciferasa de luciérnaga en respuesta a la activación del promotor.

[0572] En algunas realizaciones, las construcciones informadoras pueden introducirse directamente en células de expresión o pueden introducirse en una o más células sensibles. Las células sensibles de la presente invención que comprenden uno o más genes informadores se denominan en el presente documento células informadoras. En algunas realizaciones, las células indicadoras pueden transfectarse transitoriamente con construcciones informadoras o pueden comprender una expresión estable de dichas construcciones (p. ej., las construcciones indicadoras se replican con éxito junto con el ADN genómico durante cada ronda de división celular). Las líneas celulares que comprenden de manera estable construcciones informadoras se denominan en el presente documento líneas celulares indicadoras. En algunas realizaciones, las células indicadoras son de mamífero. En algunas realizaciones, las células indicadoras pueden comprender células de ratón, células de conejo, células de rata, células de mono, células de hámster y células humanas. En algunas realizaciones, las líneas celulares útiles para la expresión transitoria y/o estable de genes indicadores pueden incluir, pero no se limitan a, células HEK293, células HeLa, células Sw-480, células TMLC [como describen Abe et al (Abe, M. et al., An assay for transforming growth factor-p using cells transfected with a plasminogen activator inhibitor-1 promoter-luciferase construct. Analytical Biochemistry.1994.216: 276-84,)] células 293T/17, células Hs68 , células CCD1112sk, células HFF-1, fibroblastos queloides, células A204, células L17 RIB [como describen Cash y col. (Cash, JN y col., The structure of myostatin:follistatin 288: insights into receptor utilization and heparin binding. The EMBO Journal.2009.28: 2662-76,)] células C2C12 y células de linfoma T EL4.

[0573] En formas de realización donde se utilizan una o más células indicadoras y/o líneas de células informadoras, tales células pueden ser cultivadas con células de expresión como parte de un sistema de co-cultivo. En algunas realizaciones, las células indicadoras/líneas de células indicadoras pueden cultivarse por separado de las células de expresión. En tales realizaciones, los lisados y/o los medios de las células de expresión pueden combinarse con cultivos de células indicadoras/líneas de células indicadoras para evaluar los factores expresados (incluidos, entre otros, factores de crecimiento).

[0574] En algunas realizaciones, los ensayos basados en células de la presente invención pueden comprender sólo células de expresión y no las células de respuesta. En tales realizaciones, las proteínas expresadas, que incluyen pero no se limitan a GPC y/o factores de crecimiento, pueden detectarse mediante uno o más métodos que no se basan en células. Tales métodos pueden incluir, pero no se limitan a, transferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunocitoquímica, resonancia de plasmón superficial y otros métodos conocidos en la técnica para la detección de proteínas. En algunas realizaciones, la liberación de TGF-β en cultivos de células de expresión y/o medio de cultivo puede detectarse mediante ELISA. En algunas realizaciones, tales ensayos pueden utilizar anticuerpo anti-TGF-β, anticuerpo clon 1D11 (R&D Systems, Minneapolis, MN) como un anticuerpo de captura, capaz de reconocer las isoformas 1, 2 y 3 de TGF-β en múltiples especies, incluyendo, pero no se limita a vacas, pollos, ratones y humanos. En algunas realizaciones, puede usarse IgY de pollo anti-TGF-β1 biotinilada (BAF240; R&D Systems, Minneapolis, MN) como anticuerpo de detección. En algunas realizaciones, la liberación de GDF-8/miostatina en cultivos de células de expresión y/o medio de cultivo puede detectarse mediante ELISA. En algunas realizaciones, se puede usar el kit ELISA de cuantica de GDF-8/miostatina (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los ejemplos de anticuerpos anti-GDF-8/miostatina que pueden usarse para la detección incluyen AF1539, MAB788 y AF788 (R & D Systems, Minneapolis, MN).

[0575] En algunas realizaciones, los genes informadores de la presente invención comprenden promotores sensibles al factor del crecimiento. Como se usa en este documento, el término "promotor que responde al factor de crecimiento" se refiere a un promotor génico que facilita la transcripción de un gen corriente abajo en respuesta a la señalización celular del factor de crecimiento inducida por uno o más factores de crecimiento. En algunas realizaciones, los promotores que responden al factor de crecimiento responden a la señalización del factor de crecimiento del miembro de la familia TGF-β. En algunas realizaciones, los promotores sensibles al factor de crecimiento de la presente invención comprenden una o más secuencias enumeradas en la Tabla 16 o fragmentos o variantes de las mismas. Estos incluyen dos versiones del promotor del inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI- 1) [VI como se describe por Abe et al. (Abe, M. et al., An assay for transforming growth factor-p using cells transfected with a plasminogen activator inhibitor-1 promoter-luciferase construct. Analytical Biochemistry.1994.216: 276-84) y V2 como se describe en el documento W o 2011/034935], un colágeno, tipo 1, promotor alfa 1, un colágeno, tipo 1, promotor alfa 2, un promotor FoxP3, un promotor CAGA12 [que responde a la señalización dependiente de Smad como informador de Thies et al. (Thies, r S et al., GDF-8 propeptide binds to GDF-8 and antagonizes biological activity by inhibiting GDF-8 receptor binding. Growth Factors.2001, 18: 251-9) y un promotor tardío principal de adenovirus.

[0576]

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[0580]

[0582] Pueden usarse líneas de células indicadoras de PAI/epiteliales de pulmón de visón. Las células epiteliales de pulmón de visón no producen TGF-β, pero expresan niveles elevados de receptores de TGF-β (Munger et al). Las líneas de células indicadoras de PAI/epiteliales de pulmón de visón comprenden construcciones indicadoras que comprenden elementos promotores de los genes PAI y/o COL1A que responden a TGF-β que modulan la expresión de la porción codificante de proteína del gen de luciferasa. En algunas realizaciones, pueden usarse otras construcciones informadoras con células epiteliales de pulmón de visón. En algunas realizaciones, se pueden usar construcciones informadoras que responden a SMAD3.

[0583] Ensayos de proliferación

[0584] En algunas realizaciones, los ensayos basados en células de la presente invención pueden comprender ensayos de proliferación. Como se usa en este documento, el término "ensayo de proliferación" se refiere a un ensayo que determina el efecto sobre uno o más agentes sobre la proliferación celular.

[0585] En algunos casos, los ensayos de proliferación pueden comprender ensayos de proliferación de HT2. Dichos ensayos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, según los métodos descritos en Tsang, M. et al., 1995. Cytokine 7 (5): 389-97. Las células HT2 (ATCC CRL-1841) se cultivan en presencia de IL-2, en donde son insensibles al TGF-β1 en los medios de cultivo. Cuando las células HT2 se cambian a medios que contienen IL-4, continuarán proliferando, pero responderán al TGF-β1 en el medio de cultivo por inducción de apoptosis. En los medios que contienen IL-4, la muerte celular debida al TGF-β1 en los medios de cultivo se produce de una manera dependiente de la dosis, que puede ser bloqueada por numerosos reactivos que interfieren con la vía de señalización del TGF-β. Esto permite el uso de este ensayo para seleccionar reactivos para modular la activación de TGF-β1.

[0586] La detección de cambios en el número de células se puede llevar a cabo, en algunas realizaciones, mediante la detección y/o cuantificación de los niveles de ATP en las células. Los niveles de ATP normalmente se correlacionan con el número de células presentes en una muestra de prueba, pocillo, placa o plato dado. En algunas realizaciones, los niveles de ATP pueden determinarse usando un ensayo de viabilidad de células luminiscentes CELLTITER-GLO® (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI).

[0587] Kits y dispositivos

[0588] Cualquiera de los compuestos y/o composiciones de la presente invención puede estar incluido en un kit. En un ejemplo no limitante, los reactivos para generar compuestos y/o composiciones, incluidas moléculas de antígeno, se incluyen en uno o más kits. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir además reactivos y/o instrucciones para crear y/o sintetizar compuestos y/o composiciones de la presente invención. En algunas realizaciones, los kits también pueden incluir uno o más tampones. En algunas realizaciones, los kits de la invención pueden incluir componentes para preparar matrices o bibliotecas de proteínas o ácidos nucleicos y, por tanto, pueden incluir, por ejemplo, soportes sólidos.

[0589] En algunas realizaciones, los componentes del kit se pueden envasar o bien en medios acuosos o en forma liofilizada. Los medios de recipiente de los kits incluirán generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio de recipiente, en donde se puede colocar un componente y, preferiblemente, alícuotas de manera adecuada. Cuando hay más de un componente del kit (el reactivo de etiquetado y la etiqueta se pueden empaquetar juntos), los kits también pueden contener generalmente un segundo, tercer u otros recipientes adicionales en los que se pueden colocar componentes adicionales por separado. En algunas realizaciones, los kits también pueden comprender un segundo medio de recipiente para contener tampones estériles, farmacéuticamente aceptables y/u otros diluyentes. En algunas realizaciones, pueden estar comprendidas varias combinaciones de componentes en uno o más viales. Los kits de la presente invención también pueden incluir típicamente medios para contener compuestos y/o composiciones de la presente invención, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos y cualquier otro recipiente de reactivo en confinamiento cerrado para la venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que se retienen los viales deseados.

[0590] En algunas realizaciones, los componentes del kit se proporcionan en una y/o más soluciones líquidas. En algunas realizaciones, soluciones líquidas son soluciones acuosas, siendo particularmente preferidas las soluciones acuosas estériles. En algunas realizaciones, los componentes del kit se pueden proporcionar como polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos y/o componentes se proporcionan como polvos secos, dichos polvos pueden reconstituirse mediante la adición de volúmenes adecuados de disolvente. En algunas realizaciones, se prevé que los disolventes también se puedan proporcionar en otros medios de recipiente. En algunas realizaciones, los tintes de etiquetado se proporcionan como polvos secos. En algunas realizaciones, se contempla que 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 microgramos o al menos o como máximo esas cantidades de tinte seco se proporcionan en los kits de la invención. En tales realizaciones, el tinte se puede resuspender luego en cualquier disolvente adecuado, tal como DMSO.

[0591] En algunas realizaciones, los kits pueden incluir instrucciones para el empleo de los componentes del kit, así el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden implementarse.

[0592] En algunas realizaciones, los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden combinarse con, recubiertas sobre o incrustadas en un dispositivo. Los dispositivos pueden incluir, entre otros, implantes dentales, stents, reemplazos de huesos, articulaciones artificiales, válvulas, marcapasos y/u otros dispositivos terapéuticos implantables.

[0593] Definiciones

[0594] En varios lugares de la presente memoria descriptiva, los sustituyentes de los compuestos de la presente descripción se dan a conocer en grupos o en gamas. Se pretende específicamente que la presente divulgación incluya todas y cada una de las subcombinaciones individuales de los miembros de dichos grupos y rangos. La siguiente es una lista no limitante de definiciones de términos.

[0595] Actividad:como se usa en este documento, el término "actividad" se refiere a la condición en donde las cosas están sucediendo o se están haciendo. Las composiciones de la invención pueden tener actividad y esta actividad puede implicar uno o más eventos biológicos. En algunas realizaciones, tal evento biológico puede implicar factores de crecimiento y/o señalización de factores de crecimiento. En algunas realizaciones, los eventos biológicos pueden incluir eventos de señalización celular asociados con las interacciones del receptor y el factor de crecimiento. En algunas realizaciones, los eventos biológicos pueden incluir eventos de señalización celular asociados con interacciones de proteínas relacionadas con TGF-β o TGF-β con uno o más receptores correspondientes.

[0596] Administrado en combinación:como se usa en este documento, el término "administrado en combinación" o "administración combinada" se refiere a la exposición simultánea de uno o más sujetos a dos o más agentes administrados al mismo tiempo o dentro de un intervalo tal que el sujeto está en algún momento punto en el tiempo expuesto simultáneamente a ambos y/o tal que pueda haber una superposición en el efecto de cada agente en el paciente. En algunas realizaciones, al menos una dosis de uno o más agentes se administra dentro de aproximadamente 24 horas, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1 hora, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos o 1 minuto de al menos una dosis de uno o más de otros agentes. En algunas realizaciones, la administración se produce en regímenes de dosificación superpuestos. Como se usa en este documento, el término "régimen de dosificación" se refiere a una pluralidad de dosis espaciadas en el tiempo. Tales dosis pueden ocurrir a intervalos regulares o pueden incluir una o más pausas en la administración. En algunas realizaciones, la administración de dosis individuales de uno o más compuestos y/o composiciones de la presente invención, como se describe en el presente documento, se espacian lo suficientemente cerca como para que se logre un efecto combinatorio (p. ej., sinérgico).

[0597] Animal:como se usa en este documento, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a seres humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos en cualquier etapa de desarrollo. En determinadas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunas realizaciones, el animal es un animal transgénico, un animal manipulado genéticamente o un clon.

[0598] Antígenos de interésoantígenos deseados:como se usa en este documento, los términos "antígenos de interés" o "antígenos deseados" se refieren a aquellas proteínas y/u otras biomoléculas proporcionadas en este documento que están unidas inmunoespecíficamente o interactúan con anticuerpos de la presente invención y/o fragmentos., mutantes, variantes y/o alteraciones de los mismos descritos en este documento. En algunas realizaciones, los antígenos de interés pueden comprender proteínas relacionadas con TGF-β, factores de crecimiento, prodominios, GPC, módulos de proteínas o regiones de superposición entre ellos.

[0599] Aproximadamente:como se usa en este documento, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente” o “alrededor de" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).

[0600] Asociado con:Como se usa en este documento, los términos "asociado con", "conjugado", "ligado", "unido" y "anclado", cuando se usan con respecto a dos o más restos, significan que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, directamente o mediante uno o más restos adicionales que sirven como agentes de enlace, para formar una estructura que sea suficientemente estable de modo que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no necesita ser estrictamente a través de enlaces químicos covalentes directos. También puede sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable como para que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.

[0601] Biomolécula:como se usa en el presente documento, el término "biomolécula" es cualquier molécula natural basada en aminoácidos, basada en ácidos nucleicos, basada en carbohidratos o basada en lípidos, y similares.

[0602] Biológicamente activo:como se usa en este documento, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema biológico y/u organismo. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activa. En realizaciones particulares, los compuestos y/o composiciones de la presente invención pueden considerarse biológicamente activos si incluso una porción de es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.

[0603] Sistema biológico:como se usa en este documento, el término "sistema biológico" se refiere a un grupo de órganos, tejidos, células, componentes intracelulares, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas (incluidas, entre otras, biomoléculas) que funcionan juntas para realizar una determinada actividad biológica dentro de las membranas celulares, compartimentos celulares, células, tejidos, órganos, sistemas de órganos, organismos multicelulares o cualquier entidad biológica. En algunas realizaciones, los sistemas biológicos son rutas de señalización celular que comprenden biomoléculas de señalización celular intracelulares y/o extracelulares. En algunas realizaciones, los sistemas biológicos comprenden eventos de señalización del factor de crecimiento dentro de la matriz extracelular, matriz celular y/o nichos celulares.

[0604] Anticuerpo candidato:como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo candidato" se refiere a un anticuerpo de un grupo de uno o más anticuerpos del que se pueden seleccionar uno o más anticuerpos deseados.

[0605] Matriz celular:como se usa en este documento, el término "matriz celular" se refiere al entorno bioquímico y estructural asociado con la parte exterior de la membrana celular. Tales membranas celulares también pueden incluir membranas plaquetarias. Los componentes de la matriz celular pueden incluir, pero no se limitan a, proteoglicanos, moléculas de carbohidratos, proteínas integrales de membrana, glicolípidos y similares. En algunos casos, los componentes de la matriz celular pueden incluir factores de crecimiento y/o moduladores de la actividad del factor de crecimiento. Algunas proteínas de la matriz celular incluyen integrinas, GARP y LRRC33.

[0606] Compuesto:Como se usa en este documento, el término "compuesto" se refiere a una entidad química distinta. El término se puede usar en este documento para referirse a péptidos, proteínas, complejos de proteínas o anticuerpos de la invención. En algunas realizaciones, un compuesto particular puede existir en una o más formas isoméricas o isotópicas (que incluyen, pero no se limitan a, estereoisómeros, isómeros geométricos e isótopos). En algunas realizaciones, se proporciona o utiliza un compuesto en una única forma de este tipo. En algunas realizaciones, se proporciona o utiliza un compuesto como una mezcla de dos o más de tales formas (que incluyen, pero no se limitan a, una mezcla racémica de estereoisómeros). Los expertos en la técnica apreciarán que algunos compuestos existen en diferentes formas, muestran diferentes propiedades y/o actividades (que incluyen, pero no se limitan a, actividades biológicas). En tales casos, está dentro del conocimiento ordinario de los expertos en la técnica seleccionar o evitar formas particulares del compuesto para usar de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los compuestos que contienen átomos de carbono asimétricamente sustituidos pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Se conocen en la técnica métodos sobre cómo preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos, tales como por resolución de mezclas racémicas o por síntesis estereoselectiva.

[0607] Conservado:como se usa en este documento, el término "conservado" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos de secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente, que son aquellos que aparecen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre más secuencias relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.

[0608] En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" si son 100% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos un 70% idénticas, al menos un 80% idénticas, al menos un 90% idénticas o al menos un 95% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente un 70% idénticas, aproximadamente un 80% idénticas, aproximadamente un 90% idénticas, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos 30% idénticas, al menos 40% idénticas, al menos 50% idénticas, al menos 60% idénticas, al menos 70% idénticas, al menos 80% idénticos, al menos 90% idénticos o al menos 95% idénticos entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente un 30% idénticas, aproximadamente un 40% idénticas, aproximadamente un 50% idénticas, aproximadamente un 60% idénticas, aproximadamente un 70% idénticas, aproximadamente un 80% idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95% idénticas, aproximadamente un 98% idénticas o aproximadamente un 99% idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un oligonucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo.

[0609] En una realización, las secuencias conservadas no son contiguas. Los expertos en la técnica son capaces de apreciar cómo lograr el alineamiento cuando existen espacios en el alineamiento contiguo entre secuencias, y alinear los residuos correspondientes a pesar de las inserciones o deleciones presentes.

[0610] Entrega:como se usa en el presente documento, "entrega" se refiere al acto o la manera de entregar un compuesto, sustancia, entidad, resto, carga o carga útil.

[0611] Agente de entrega:Como se usa en la presente memoria, "agente de entrega" se refiere a cualquier agente que facilite, al menos en parte, la entregain v ivode una o más sustancias (incluyendo, pero no limitado a compuestos y/o composiciones de la presente invención) a una célula, sujeto u otras células del sistema biológico.

[0612] Anticuerpo deseado:como se usa en este documento, el término "anticuerpo deseado" se refiere a un anticuerpo que se busca, en algunos casos de un grupo de anticuerpos candidatos.

[0613] Desestabilizado:como se usa en este documento, el término "desechable", "desestabilizar" o "región desestabilizadora" significa una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de referencia, de tipo salvaje o nativa de la misma región o molécula.

[0614] Marcador detectable:como se usa en este documento, "marcador detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad, cuyos marcadores, señales o restos se detectan fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica, incluida la radiografía., fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbancia, detección inmunológica y similares. Las etiquetas detectables pueden incluir radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos, biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos, etiquetas de polihistidina, etiquetas myc, etiquetas de bandera, etiquetas de hemaglutinina (HA) de influenza humana y similares. Las etiquetas detectables pueden ubicarse en cualquier posición de la entidad a la que están unidas, incorporadas o asociadas. Por ejemplo, cuando se unen, incorporan o se asocian con un péptido o proteína, pueden estar dentro de los aminoácidos, péptidos o proteínas, o localizados en los extremos N o C terminales.

[0615] Distal:Como se usa en este documento, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.

[0616] Modificado:como se usa en este documento, las realizaciones de la invención se "diseñan" cuando se diseñan para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía desde un punto de partida, tipo salvaje o molécula nativa. Por tanto, los agentes o entidades diseñados son aquellos cuyo diseño y/o producción incluyen un acto de la mano del hombre.

[0617] Epítopo:como se usa en este documento, un "epítopo" se refiere a una superficie o región en una molécula que es capaz de interactuar con componentes del sistema inmunológico, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos. En algunas realizaciones, cuando se hace referencia a una proteína o módulo de proteína, un epítopo puede comprender un tramo lineal de aminoácidos o una estructura tridimensional formada por cadenas de aminoácidos plegadas.

[0618] Expresión:Como se usa en este documento, "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p. ej., por transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (p. ej.,mediante empalme, edición, formación de la tapa 5' y/o procesamiento del extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; (4) plegamiento de un polipéptido o proteína; y (5) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

[0619] Matriz extracelular:como se usa en este documento, el término "matriz extracelular" o "ECM" se refiere al área que rodea las células y/o el área entre las células que típicamente comprende proteínas estructurales así como moléculas de señalización celular. Los componentes de la matriz extracelular pueden incluir, pero no se limitan a proteínas, ácidos nucleicos, membranas, lípidos y azúcares que pueden estar asociados directa o indirectamente con componentes estructurales de los entornos extracelulares. Los componentes estructurales de la matriz extracelular pueden incluir, pero no se limitan a proteínas, polisacáridos (p. ej., ácido hialurónico), glicosaminoglicanos y proteoglicanos (p. ej., sulfato de heparina, sulfato de condroitina y sulfato de queratina). Dichos componentes estructurales pueden incluir, entre otros, componentes fibrosos (p. ej., colágenos y elastinas), fibrilinas, fibronectina, lamininas, agrina, perlecano, decorina y similares. Otras proteínas que pueden ser componentes de la matriz extracelular incluyen y LTBP. Los componentes de la matriz extracelular también pueden incluir factores de crecimiento y/o moduladores de la actividad del factor de crecimiento.

[0620] Característica:como se usa en este documento, una "característica" se refiere a una característica, una propiedad o un elemento distintivo.

[0621] Formulación:Como se usa en este documento, una "formulación" incluye al menos un compuesto y/o composición de la presente invención y un agente de administración.

[0622] Fragmento:un "fragmento", como se usa en este documento, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos por digestión de proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas. En algunas realizaciones, un fragmento de una proteína incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, los fragmentos de un anticuerpo incluyen porciones de un anticuerpo sometidas a digestión enzimática o sintetizadas como tales.

[0623] Funcional:como se usa en este documento, una molécula biológica "funcional" es una entidad biológica con una estructura y en una forma en donde exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.

[0624] Homología:Como se usa en este documento, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas,p. ej.,entre moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). De acuerdo con la invención, se considera que dos secuencias de polinucleótidos son homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% durante al menos un tramo. de al menos aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina típicamente por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. De acuerdo con la invención, se considera que dos secuencias de proteínas son homólogas si las proteínas son al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% idénticas para al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos. En muchas realizaciones, la proteína homóloga puede mostrar un alto grado general de homología y un alto grado de homología en al menos un tramo corto de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13., 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos. En muchas realizaciones, las proteínas homólogas comparten uno o más elementos de secuencia característicos. Como se usa en este documento, el término "elemento de secuencia característico" se refiere a un motivo presente en proteínas relacionadas. En algunas realizaciones, la presencia de tales motivos se correlaciona con una actividad particular (tal como actividad biológica).

[0626] Identidad:como se usa en este documento, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas,p. ej.,entre moléculas de oligonucleótidos (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos, p. ej., se puede realizar alineando las dos secuencias con fines de comparación óptimos (p. ej.,se pueden introducir espacios en una o ambas de las secuencias primera y segunda de ácido nucleico para una alineación óptima y las secuencias no idénticas pueden descartarse para fines de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con fines de comparación es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos al menos el 95% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. P. ej., el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando métodos tales como los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM y Griffin, HG, eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; cada uno de los cuales está incorporado aquí como referencia. P. ej., el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar, p. ej., utilizando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede, alternativamente, determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz NWSgapdna. CMP. Los métodos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Carillo, H. y Lipman, D., S iA m J Applied Math., 48: 1073 (1988); incorporado aquí como referencia. Las técnicas para determinar la identidad están codificadas en programas informáticos disponibles al público. Los programas informáticos ejemplares para determinar la homología entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA Altschul, SF y col., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).

[0628] Inhibir la expresión de un gen:como se usa en el presente documento, la frase "inhibir la expresión de un gen" significa provocar una reducción en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser ARN transcrito del gen (p. ej., ARNm) o un polipéptido traducido del ARNm transcrito del gen. Normalmente, una reducción en el nivel de ARNm da como resultado una reducción en el nivel de un polipéptido traducido del mismo. El nivel de expresión se puede determinar usando técnicas estándar para medir ARNm o proteína.

[0630] In vitro:como se usa en este documento, el término"in v itro " serefiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial,p. ej.,en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, en una placa de Petri,etc.,en lugar de dentro de un organismo. (p. ej., animal, vegetal o microbio).

[0632] In vivo:como se usa en este documento, el término"in v iv o "s erefiere a eventos que ocurren dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).

[0634] Aislado:como se usa en este documento, el término "aislado" es sinónimo de "separado", pero lleva consigo la inferencia de que la separación se llevó a cabo por la mano del hombre. En una realización, una sustancia o entidad aislada es aquella que se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada previamente (ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental). Las sustancias aisladas pueden tener distintos niveles de pureza en relación con las sustancias con las que se han asociado. Las sustancias y/o entidades aisladas se pueden separar de al menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o más de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% puro. Como se usa en este documento, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes.

[0636] Sustancialmente aislado:por "sustancialmente aislado" se entiende que el compuesto está sustancialmente separado del entorno en donde se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, p. ej., una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. Separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente el 99% en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo. Los métodos para aislar compuestos y sus sales son habituales en la técnica. En algunas realizaciones, el aislamiento de una sustancia o entidad incluye la ruptura de asociaciones y/o enlaces químicos. En algunas realizaciones, el aislamiento incluye solo la separación de los componentes con los que la sustancia o entidad aislada se combinó previamente y no incluye tal alteración.

[0638] Enlazador:como se usa en el presente documento, un enlazador se refiere a un resto que conecta dos o más dominios, restos o entidades. En una realización, un enlazador puede comprender 10 o más átomos. En una realización adicional, un enlazador puede comprender un grupo de átomos, p. ej., 10-1.000 átomos, y puede estar compuesto por átomos o grupos tales como, pero no limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. En algunas realizaciones, un enlazador puede comprender uno o más ácidos nucleicos que comprenden uno o más nucleótidos. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un aminoácido, péptido, polipéptido o proteína. En algunas realizaciones, un resto unido por un enlazador puede incluir, pero no se limita a, un átomo, un grupo químico, un nucleósido, un nucleótido, una nucleobase, un azúcar, un ácido nucleico, un aminoácido, un péptido, un polipéptido., una proteína, un complejo de proteínas, una carga útil (p. ej., un agente terapéutico). o un marcador (que incluye, pero no se limita a, un marcador químico, fluorescente, radiactivo o bioluminiscente). El enlazador puede usarse para cualquier propósito útil, tal como para formar multímeros o conjugados, así como para administrar una carga útil, como se describe en este documento. Los ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido, como se describe en este documento. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (p. ej., unidades monoméricas de etileno o propilenglicol, p. ej., dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y dextrano. polímeros. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos escindibles dentro del enlazador, tales como, p. ej., un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N=N-), que se puede escindir usando un agente reductor o fotólisis. Los ejemplos no limitantes de enlaces selectivamente escindibles incluyen un enlace amido que se puede escindir, p. ej., mediante el uso de tris (2-carboxietilo) fosfina (TCEP) u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster. que se puede escindir, p. ej., mediante hidrólisis ácida o básica.

[0640] Modificado:como se usa en este documento, el término "modificado" se refiere a un estado o estructura cambiados de una molécula o entidad en comparación con una molécula o entidad parental o de referencia. Las moléculas se pueden modificar de muchas formas, incluidas química, estructural y funcionalmente. En algunas realizaciones, los compuestos y/o composiciones de la presente invención se modifican mediante la introducción de aminoácidos no naturales.

[0642] Mutación:como se usa en este documento, el término "mutación" se refiere a un cambio y/o alteración. En algunas realizaciones, las mutaciones pueden ser cambios y/o alteraciones de proteínas (incluidos péptidos y polipéptidos) y/o ácidos nucleicos (incluidos ácidos polinucleicos). En algunas realizaciones, las mutaciones comprenden cambios y/o alteraciones en una secuencia de proteína y/o ácido nucleico. Dichos cambios y/o alteraciones pueden comprender la adición, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos (en el caso de proteínas y/o péptidos) y/o nucleótidos (en el caso de ácidos nucleicos y/o ácidos polinucleicos). En realizaciones en las que las mutaciones comprenden la adición y/o sustitución de aminoácidos y/o nucleótidos, dichas adiciones y/o sustituciones pueden comprender 1 o más residuos de aminoácidos y/o nucleótidos y pueden incluir aminoácidos y/o nucleótidos modificados.

[0644] De origen natural:como se usa en este documento, "de origen natural" significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial o la participación de la mano del hombre.

[0646] Nicho:como se usa en este documento, el término "nicho" se refiere a un lugar, zona y/o habitat. En algunas realizaciones, los nichos comprenden nichos celulares. Como se usa en este documento, el término "nicho celular" se refiere a un conjunto único de condiciones fisiológicas en un sistema celular dentro de un tejido, órgano u sistema de órganos dentro o derivado de un organismo mamífero. Un nicho celular puede ocurririn vivo, in vitro, e x v ivooin situ .Dada la naturaleza compleja y los procesos dinámicos implicados en la señalización del factor de crecimiento, un nicho celular puede caracterizarse funcional, espacial o temporalmente o puede usarse para hacer referencia a cualquier entorno que abarque una o más células. Como tal, en algunas realizaciones un nicho de celda incluye el entorno de cualquier celda adyacente a otra celda que proporciona soporte, como por ejemplo una celda de enfermera.

[0647] En algunas realizaciones, los nichos pueden incluir los descritos en las solicitudes de patente provisional de EE.UU.

[0648] 61/722,919, presentadas el 6 de noviembre de 2012 y 61/722,969, presentadas el 6 de noviembre de 2012.

[0649] Vertebrado no humano:como se usa en este documento, un "vertebrado no humano" incluye todos los vertebrados excepto elH o m o sap iens,incluidas las especies silvestres y domesticadas. Ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, como alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, venado, perro, burro, gayal, cabra, conejillo de indias, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, búfalo de agua de oveja y yak.

[0650] Fuera de diana:como se usa en el presente documento, "fuera de diana" se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una o más dianas, genes y/o transcripciones celulares.

[0651] Unido operativamente:como se usa en el presente documento, la frase "operativamente ligado" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcripciones, entidades, restos o similares.

[0652] Paratope:como se usa en este documento, un "paratope" se refiere al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo.

[0653] Adsorción pasiva:como se usa en este documento, "adsorción pasiva" se refiere a un método de inmovilización de reactivos en fase sólida en una o más superficies (p. ej., membranas, placas, placas de cultivo, placas de ensayo, etc.). La inmovilización se produce típicamente debido a la afinidad entre tales reactivos y componentes superficiales.

[0654] Paciente:como se usa en este documento, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado (p. ej., con licencia). para una enfermedad o afección en particular.

[0655] Péptido:como se usa en este documento, el término "péptido" se refiere a una cadena de aminoácidos que es menor o igual a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, p. ej., aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de largo.

[0656] Farmacéuticamente aceptable:La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en este documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico sólido, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

[0657] Excipientes farmacéuticamente aceptables:como se usa en este documento, el término "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a cualquier ingrediente que no sean agentes activos (p. ej., como se describe en este documento) presente en composiciones farmacéuticas y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxicos y no inflamatorios en sujetos. En algunas realizaciones, los excipientes farmacéuticamente aceptables son vehículos capaces de suspender y/o disolver agentes activos. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, coadyuvantes de compresión, desintegrantes, tintes (colores), emolientes, emulsionantes, rellenos (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, aromas, fragancias, deslizantes (potenciadores de flujo), lubricantes, conservantes, tintas de imprenta, sorbentes, agentes suspensores o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato cálcico, fosfato cálcico (dibásico), estearato cálcico, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, parabeno de metilo, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, parabeno de propilo, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio citrato de sodio, sodio, carboximetilcelula glicolato de almidón, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.

[0658] Sales farmacéuticamente aceptables:Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en este documento son formas de los compuestos descritos en los que el resto ácido o base está en su forma de sal (p. ej., según se genera haciendo reaccionar un grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición de ácido representativas incluyen acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, hemisulfosato de glicerofosato,, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, que incluyen, entre otros, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales, p. ej., de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. En algunas realizaciones, se prepara una sal farmacéuticamente aceptable a partir de un compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren los medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se encuentran listas de sales adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, PH Stahl y CG Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, y Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).Solvato farmacéuticamente aceptable:El término "solvato farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a una forma cristalina de un compuesto en donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina. P. ej., los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (p. ej., mono, di y trihidratos),N -metilpirrolidinona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO), W,W-dimetilformamida (DMF), W,W-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetilo-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetilo-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato". En algunas realizaciones, el disolvente incorporado en un solvato es de un tipo o en un nivel que es fisiológicamente tolerable para un organismo al que se administra el solvato (p. ej., en una forma de dosificación unitaria de una composición farmacéutica).

[0659] Farmacocinética:como se usa en este documento, "farmacocinética" se refiere a una o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de sustancias administradas a organismos vivos. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADMe donde: (A) La absorción es el proceso de una sustancia que ingresa a la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) El metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos medicamentos se acumulan de forma irreversible en el tejido corporal.

[0660] Fisicoquímico:como se usa en el presente documento, "fisicoquímico" significa o se relaciona con una propiedad física y/o química.

[0661] Prevención:como se usa en el presente documento, el término "prevenir" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad, trastorno y/o afección particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o condición.

[0662] Profármaco:La presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "profármacos" se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que está en una forma predicada para que esa sustancia, molécula o entidad actúe como terapéutica tras una alteración química o física. Los profármacos pueden unirse covalentemente o secuestrarse de alguna manera hasta que se conviertan en el resto de fármaco activo antes, después o después de la administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando los grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escinden, ya sea en la manipulación rutinaria oin vivo,a los compuestos parentales. Los profármacos incluyen compuestos en los que los grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y el uso de profármacos se discuten en T. Higuchi y V. Stella, "Prodrugs as Novel Delivery Systems", vol.14 de la serie de simposios A.C.S, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987.

[0663] Proliferar:como se usa en este documento, el término "proliferar" significa crecer, expandirse, replicarse o aumentar o hacer crecer, expandirse, replicarse o aumentar. "Proliferativo" significa tener la capacidad de proliferar. "Antiproliferativo" significa tener propiedades contrarias u opuestas a las propiedades proliferativas.

[0664] Proteína de interés:como se usa en el presente documento, los términos "proteínas de interés" o "proteínas deseadas" incluyen los proporcionados en el presente documento y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de los mismos.

[0665] Proximal:como se usa en el presente documento, el término "proximal" significa situado más cerca del centro o de un punto o región de interés.

[0666] Purificado:Como se usa en este documento, el término "purificar" significa hacer sustancialmente puro o claro a partir de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección. "Purificado" se refiere al estado de ser puro. "Purificación" se refiere al proceso de purificación.

[0667] Región:como se usa en este documento, el término "región" se refiere a una zona o área general. En algunas realizaciones, cuando se hace referencia a una proteína o módulo de proteína, una región puede comprender una secuencia lineal de aminoácidos a lo largo del módulo de proteína o proteína o puede comprender un área tridimensional, un epítopo y/o un grupo de eptiopes. En algunas realizaciones, las regiones comprenden regiones terminales. Como se usa en este documento, el término "región terminal" se refiere a regiones ubicadas en los extremos o terminales de un agente dado. Cuando se hace referencia a proteínas, las regiones terminales pueden comprender extremos N y/o C terminales. Los extremos N se refieren al extremo de una proteína que comprende un aminoácido con un grupo amino libre. Los extremos C se refieren al extremo de una proteína que comprende un aminoácido con un grupo carboxilo libre. Las regiones N- y/o C-terminales pueden comprender los extremos N y/o C-terminales así como los aminoácidos circundantes. En algunas realizaciones, las regiones N- y/o C-terminales comprenden de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos, de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 100 aminoácidos y/o al menos 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, las regiones N-terminales pueden comprender cualquier longitud de aminoácidos que incluye el N-terminal, pero no incluye el C-terminal. En algunas realizaciones, las regiones C-terminales pueden comprender cualquier longitud de aminoácidos, que incluyen el C-terminal, pero no comprenden el N-terminal.

[0668] Región de reconocimiento de anticuerpos:como se usa en este documento, el término "región de reconocimiento de anticuerpos" se refiere a una o más regiones en uno o más antígenos o entre dos o más antígenos que se reconocen específicamente y se unen por los anticuerpos correspondientes. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o al menos 10 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, las regiones de reconocimiento de anticuerpos comprenden una unión entre dos proteínas o entre dos dominios de la misma proteína que están muy próximos entre sí.

[0669] Muestra:como se usa en este documento, el término "muestra" se refiere a una alícuota o porción tomada de una fuente y/o proporcionada para análisis o procesamiento. En algunas realizaciones, una muestra es de una fuente biológica tal como un tejido, una célula o un componente (p. ej., un líquido corporal, que incluye, entre otros, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre de cordón umbilical, orina, fluido vaginal y semen). En algunas realizaciones, una muestra puede ser o comprender un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir un organismo entero o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo pero no limitados a, p. ej., plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos, tumores, órganos. En algunas realizaciones, una muestra es o comprende un medio, como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, como proteínas o molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una muestra "primaria" es una alícuota de la fuente. En algunas realizaciones, una muestra primaria se somete a uno o más procesos (p. ej., separación, purificación, etc.). Pasos para preparar una muestra para análisis u otro uso.

[0670] Secuencias de señal:como se usa en este documento, la frase "secuencias de señal" se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína.

[0671] Dosis unitaria única:como se usa en el presente documento, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, evento de administración única. En algunas realizaciones, se proporciona una única dosis unitaria como una forma de dosificación discreta (p. ej., una tableta, cápsula, parche, jeringa cargada, vial, etc.).

[0672] Similitud:como se usa en este documento, el término "similitud" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas,p. ej.,entre moléculas de polinucleótidos (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.

[0673] Dosis dividida:como se usa en este documento, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis.

[0674] Estable:como se usa en el presente documento, "estable" se refiere a un compuesto o entidad que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza de una mezcla de reacción, y preferiblemente capaz de formularse en un agente terapéutico eficaz.

[0675] Estabilizado:Como se usa en este documento, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable. En algunas realizaciones, la estabilidad se mide con relación a un valor absoluto. En algunas realizaciones, la estabilidad se mide en relación con un compuesto o entidad de referencia.

[0676] Sujeto:Como se usa en este documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier organismo al que se puede administrar una composición de acuerdo con la invención, p. ej., con fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.

[0677] Sustancialmente:como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de exhibir una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a la completitud o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en este documento para capturar la posible falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

[0678] Sustancialmente igual:como se usa en este documento en lo que se refiere a diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2%.

[0679] Sustancialmente simultáneamente:como se usa en este documento y en lo que se refiere a una pluralidad de dosis, el término típicamente significa dentro de aproximadamente 2 segundos.

[0680] Padece:una persona que "padece" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticada o muestra uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.

[0681] Susceptible a:Una persona que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o afección no ha sido diagnosticada y/o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno o afección, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad. o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (p. ej., cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o condición; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o condición; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno, y/o condición; y (6) exposición y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.

[0682] Sintético:El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas de la presente invención puede ser química o enzimática.

[0683] Células diana:como se usa en este documento, "células diana" se refiere a una o más células de interés. Las células pueden encontrarsein vitro, in vivo, in s ituo en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano y lo más preferiblemente un paciente.

[0684] Sitio diana:el término "sitio diana", como se usa en este documento, se refiere a una región o área diana de un compuesto o composición dada de la invención. Los sitios diana pueden incluir, pero no se limitan a, células, tejidos, órganos, sistemas de órganos, nichos y similares.

[0685] Agente terapéutico:El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.

[0686] Cantidad terapéuticamente eficaz:como se usa en este documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente a administrar (p. ej., ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico,etc.).que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad o trastorno, y/o condición. En algunas realizaciones, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz en una sola dosis. En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz en un régimen de dosificación que comprende una pluralidad de dosis. Los expertos en la técnica apreciarán que en algunas realizaciones, se puede considerar que una forma de dosificación unitaria comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente o entidad particular si comprende una cantidad que es eficaz cuando se administra como parte de dicho régimen de dosificación.

[0687] Resultado terapéuticamente eficaz:como se usa en este documento, el término "resultado terapéuticamenteeficaz" significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

[0688] Dosis diaria total:como se usa en este documento, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una sola dosis unitaria.

[0689] Factor de transcripción:como se usa en el presente documento, el término "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión al ADN que regula la transcripción del ADN en ARN, p. ej., mediante activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción por sí solos, mientras que otros actúan en concierto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede activar y reprimir la transcripción bajo ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias diana específicas muy similares a una secuencia consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solo o en un complejo con otras moléculas.

[0690] Tratamiento:como se usa en el presente documento, el término "tratar" se refiere a aliviar, mejorar, aliviar, retrasar el inicio, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de infección, enfermedad, trastorno y/o afección en particular. P. ej., "tratar' el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la diseminación de un tumor. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección y/o a un sujeto que exhibe solo los primeros signos de una enfermedad, trastorno y/o afección con el fin de disminuir el riesgo. de desarrollar patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o condición.

[0691] Sin modificar:como se usa en este documento, "sin modificar" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiada de alguna manera. Sin modificar puede, pero no siempre, referirse al tipo salvaje o forma nativa de una biomolécula o entidad. Las moléculas o entidades pueden sufrir una serie de modificaciones mediante las cuales cada producto modificado puede servir como la molécula o entidad de partida "no modificada" para una modificación posterior.

[0692] EQUIVALENTES Y ALCANCE

[0693] Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando sólo experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de acuerdo con la invención descrita en este documento. No se pretende que el alcance de la presente invención se limite a la descripción anterior, sino que es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

[0694] En las reivindicaciones, artículos tales como “un”, “una”, “el” y “ella” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. Las afirmaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, empleados o son relevantes para un producto o proceso determinado, a menos que se indique lo contrario o de otra manera evidente por el contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente, empleado o de otra manera relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno, o la totalidad de los miembros del grupo están presentes, empleados o de otra manera relevantes para un producto o proceso dado.

[0695] También se observa que el término "que comprende" pretende ser abierto y permite pero no requiere la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando el término "que comprende" se usa en este documento, el término "que consiste en" también se incluye y divulga.

[0696] Cuando se dan intervalos, se incluyen los puntos finales. Además, debe entenderse que a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como rangos pueden asumir cualquier valor o subrango específico dentro de los rangos establecidos en diferentes realizaciones de la invención, a la décima parte de la unidad del límite inferior del rango, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0697] Además, se ha de entender que cualquier realización particular de la presente invención que cae dentro de la técnica anterior puede ser excluido explícitamente de una cualquiera o más de las reivindicaciones. Dado que se considera que tales realizaciones son conocidas por un experto en la técnica, pueden excluirse incluso si la exclusión no se establece explícitamente en el presente documento. Cualquier realización particular de las composiciones de la invención (p. ej.,cualquier ácido nucleico o proteína codificada por el mismo; cualquier método de producción; cualquier método de uso;etc).puede excluirse de una o más reivindicaciones, por cualquier motivo, ya sea o no relacionados con la existencia del estado de la técnica.

[0698] Los títulos de las secciones y tablas no pretenden ser limitativos.

[0699] EJEMPLOS

[0700] Ejemplo 1. Sistema de expresión de la proteína

[0701] La expresión de proteínas se lleva a cabo usando células 293E. Las células 293E son células HEK293 que expresan de forma estable EBNA1 (antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr). Estas células son células humanas que modifican de manera postraduccional proteínas con estructuras similares a las humanas (p. ej., glucanos). Estas células son fácilmente transfectables y escalables y pueden crecer hasta densidades elevadas en cultivo en suspensión. Durante la producción de proteínas, las células 293E se cultivan en medio sin suero para facilitar la purificación posterior. Algunas de las proteínas producidas comprenden aminoácidos adicionales que codifican una o más etiquetas detectables para la purificación [p. ej., etiqueta de polihistidina, etiqueta de bandera (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 265), etc.] Las proteínas están marcadas en el extremo N, en el extremo C y/o biotiniladas.

[0702] Algunas de las proteínas producidas comprenden aminoácidos adicionales que codifican uno o más sitios de escisión de proteasa 3C (LEVLFQGP; SEQ ID NO: 266) Tales sitios permiten la escisión entre los residuos Q y G de la proteasa 3C de escisión de sitio tras el tratamiento con proteasa 3C, incluso con proteasa de rinovirus 3c . Se introducen sitios de escisión para permitir la eliminación de marcadores detectables de proteínas recombinantes.

[0703] Las secuencias que codifican proteínas recombinantes de la presente invención se clonan en vectores pTT5 (NRC Biotechnology Research Institute, Montreal, Quebec) para la transfección en células. Dichos vectores son pequeños (~ 4,4 kb), facilitan la transfección transitoria, comprenden un promotor de CMV fuerte para la síntesis de proteínas robusta y comprenden un oriP para la replicación episomal en células que expresan EBNA1.

[0704] Ejemplo 2. Generación de anticuerpos

[0705] Anticuerpos producidos por la generación de anticuerpos monoclonales estándar

[0706] Los anticuerpos se generan en ratones knockout, que carecen del gen que codifica para los antígenos diana deseados. Dichos ratones no están tolerados para los antígenos diana y, por lo tanto, generan anticuerpos contra dichos antígenos que pueden reaccionar de forma cruzada con formas humanas y de ratón del antígeno. Para la producción de anticuerpos monoclonales, los ratones huesped se inmunizan con proteínas recombinantes para provocar linfocitos que se unen específicamente a estas proteínas. Los linfocitos se recogen y fusionan con líneas celulares inmortalizadas. Las células de hibridoma resultantes se cultivan en un medio de cultivo adecuado con agentes de selección para apoyar el crecimiento de sólo células fusionadas.

[0707] Las líneas de células de hibridoma deseadas se identifican entonces mediante la unión análisis de la especificidad de los anticuerpos secretados para el péptido diana y los clones de estas células se subclonaron mediante procedimientos de dilución limitante y se cultivaron mediante métodos estándar. Los anticuerpos producidos por estas células se aíslan y purifican del medio de cultivo mediante procedimientos estándar de purificación de inmunoglobulinas.

[0708] Anticuerpos producidos de forma recombinante.

[0709] Los anticuerpos recombinantes se producen utilizando las células de hibridoma producidas anteriormente. Las secuencias de ADNc de la región variable de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos se determinan usando técnicas bioquímicas estándar. El ARN total se extrae de las células de hibridoma productoras de anticuerpos y se convierte en ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT) (PCR). La amplificación por PCR se lleva a cabo en el ADNc resultante utilizando cebadores específicos para la amplificación de las secuencias de las cadenas pesada y ligera. A continuación, los productos de la PCR se subclonan en plásmidos para el análisis de la secuencia. Una vez secuenciadas, las secuencias codificantes de anticuerpos se colocan en vectores de expresión. Para la humanización, se utilizan secuencias codificantes de dominios constantes de cadena ligera y pesada humana para sustituir secuencias murinas homólogas. Las construcciones resultantes se transfectan en células de mamífero capaces de traducción a gran escala.

[0710] Anticuerpos producidos usando técnicas de cribado de bibliotecas de presentación de fragmentos de anticuerpos.

[0711] Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse usando métodos de descubrimiento de alto rendimiento. Los anticuerpos sintéticos se diseñan seleccionando antígenos diana utilizando una biblioteca de presentación de fagos. Las bibliotecas de presentación de fagos están compuestas de millones a miles de millones de partículas de fagos, cada una de las cuales expresa un fragmento de anticuerpo Fab único o un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) en su cubierta viral. En las bibliotecas de fragmentos de anticuerpos Fab, el ADNc que codifica cada fragmento contiene la misma secuencia con la excepción de una secuencia única que codifica los bucles variables de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las cadenas Vh de la CDR se expresan como una proteína de fusión, unida al extremo N de la proteína de cubierta viral pIII. La cadena Vl se expresa por separado y monta con el Vh de la cadena en el periplasma antes de incorporación del complejo en la cubierta viral. Los antígenos diana se incuban, in vitro, con miembros de bibliotecas de presentación de fagos y se precipitan las partículas de fagos unidas. El ADNc que codifica las CDR de las subunidades Fab unidas se secuencia a partir del fago unido. La secuencia de ADNc se incorpora directamente en secuencias de anticuerpos para la producción de anticuerpos recombinantes, o se muta y se utiliza para una optimización adicional mediante la maduración por afinidad in vitro.Anticuerpos producidos usando técnicas de maduración por afinidad

[0712] Los Fabs capaces de unirse a antígenos diana se identifican usando las bibliotecas descritas anteriormente y los mutantes de alta afinidad se derivan de estos mediante el proceso de maduración por afinidad. La tecnología de maduración por afinidad se utiliza para identificar secuencias que codifican CDR que tienen la mayor afinidad por el antígeno diana. Usando esta tecnología, las secuencias de CDR aisladas usando el proceso de selección de la biblioteca de presentación de fagos descrito anteriormente se mutan aleatoriamente como un todo o en residuos específicos para crear de millones a miles de millones de variantes. Estas variantes se expresan en proteínas de fusión de fragmentos de anticuerpos Fab en una biblioteca de presentación de fagos y se examinan para determinar su capacidad para unirse al antígeno diana. Se llevan a cabo varias rondas de selección, mutación y expresión para identificar secuencias de fragmentos de anticuerpos con la mayor afinidad por el antígeno diana. Estas secuencias pueden incorporarse directamente en secuencias de anticuerpos para la producción de anticuerpos recombinantes.

[0713] Ejemplo 3. Identificación y caracterización de anticuerpos d irigidos a proteínas recombinantes

[0714] Las proteínas recombinantes se sintetizan según el método del Ejemplo 1 o se obtienen de fuentes comerciales. Las proteínas recombinantes expresadas incluyen los enumerados en la Tabla 17.

[0716] Tabla 17. Proteínas recombinantes

[0719]

[0721] Se expresan isoformas tanto humanas como no humanas (incluyendo, pero no limitadas a ratón) de las proteínas recombinantes que figuran en la Tabla 17.

[0722] Los anticuerpos se generan de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 2, que se unen a proteínas recombinantes expresadas y están sometidos a cribado para identificar anticuerpos con propiedades de unión deseadas. Los ensayos ELISA se utilizan inicialmente para identificar candidatos de anticuerpos que demuestran afinidad por los antígenos deseados, mientras que muestran una afinidad reducida o nula por los antígenos no deseados.

[0723] Identificación de anticuerpos de estabilización dirigidos al TGF-β1 GPC

[0724] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 C4S se criban usando ensayos ELISA para detectar la unión a antígenos de selección positivos y negativos. Los anticuerpos se evalúan en general por su capacidad para asociarse con prodominios (con o sin ligando) y disminuir la señalización de TGF-β. Las placas de ELISA se recubren con neutravidina y se incuban con proteínas recombinantes proTGF-β1 C4S biotiniladas. Para identificar y eliminar anticuerpos que se unen a elementos diversos (p. ej., etiquetas de polihistidina, etiquetas bandera y/o sitios de escisión de proteinasa 3C), se incuban placas ELISA recubiertas con proteínas ICAM-1 humanas que comprenden uno o más de dichos elementos diversos. Para identificar y eliminar los anticuerpos que se unen al factor de crecimiento TGF-β1 libre y/o PAL, se incuban placas ELISA recubiertas con TGF-β1 PAL C4S y/o factor de crecimiento TGF-β1 humano. Los anticuerpos que pueden ser específicos para versiones murinas se identifican incubando placas ELISA recubiertas con muproTGF-β1 C4S biotinilado. Las proteínas recombinantes que se asocian con anticuerpos unidos en placas ELISA se detectan usando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas para la detección (p. ej., colorimétrico, fluorimétrico) que se unen a marcadores detectables presentes en proteínas recombinantes unidas. Los anticuerpos se seleccionan para rondas adicionales de selección o se eliminan de los grupos de pruebas en función de los resultados obtenidos.

[0725] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 C4S se evalúan además para determinar su capacidad para estabilizar TGF-β1 GPC. Células GPC que expresan y/o integrina avp6 se incuban con anticuerpos seleccionados y los sobrenadantes resultantes se utilizan para los cultivos a tratar de células que comprenden construcciones indicadoras susceptibles a TGF-β para detectar actividad de expresión de gen dependiente de factor de crecimiento libre. Se llevan a cabo ensayos adicionales para caracterizar regiones de reconocimiento de anticuerpos unidos por anticuerpos seleccionados, así como la modulación del factor de crecimiento en tipos de células específicas (p. ej., fibroblastos y/o células T). Por último, las estimaciones de unión por afinidad se realizan mediante experimentos de bloqueo cruzado de anticuerpos, así como mediante el uso de instrumentos de análisis de afinidad, incluidos, entre otros, los instrumentos de la familia Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA). Los anticuerpos se seleccionan adicionalmente basándose en su capacidad para estabilizar isoformas alternativas de TGF-β g Pc (p. ej., TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3) y TGF-β1 GPC de otras especies.

[0727] Identificación de la liberación de los anticuerpos dirigidos a la libre TGF-β1 PAL

[0729] Según un modo para la generación de anticuerpos de liberación de TGF-β1 GPC, los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 C4S PAL son evaluados usando ensayos ELISA para detectar la unión a antígenos de selección positivos y negativos. Los anticuerpos se evalúan en general por su capacidad para asociarse con PAL y aumentar los niveles y/o la señalización del factor de crecimiento libre de TGF-β1. Las placas de ELISA se recubren con neutravidina y se incuban con proteínas recombinantes proTGF-β1 PAL C4S biotiniladas. Para identificar y eliminar anticuerpos que se unen a elementos diversos (p. ej., etiquetas de polihistidina, etiquetas bandera y/o sitios de escisión de proteinasa 3C), se incuban placas ELISA recubiertas con proteínas ICAM-1 humanas que comprenden uno o más de dichos elementos diversos. Para identificar y eliminar los anticuerpos que se unen al factor de crecimiento TGF-β1 libre, se incuban placas ELISA recubiertas con factor de crecimiento TGF-β1 humano. Para identificar y eliminar los anticuerpos que se unen al TGF-β1 latente, se incuban placas ELISA recubiertas con TGF-β1 C4S humano. Los anticuerpos que pueden ser específicos para versiones murinas se identifican incubando placas ELISA recubiertas con muTGF-β1 PAL C4S biotinilado. Las proteínas recombinantes que se asocian con anticuerpos unidos en placas ELISA se detectan usando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas para la detección (p. ej., colorimétrico, fluorimétrico) que se unen a marcadores detectables presentes en proteínas recombinantes unidas. Los anticuerpos se seleccionan para rondas adicionales de selección o se eliminan de los grupos de pruebas en función de los resultados obtenidos.

[0731] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 C4S PAL se evalúan además para determinar su capacidad para liberar TGF-β1 de GPC. Las células que expresan GPC y/o integrina avP6 se incuban con anticuerpos seleccionados y los sobrenadantes resultantes se usan para tratar cultivos de células, que comprenden construcciones indicadoras susceptibles a TGF-β para detectar la actividad de expresión genética dependiente del factor de crecimiento libre. Se llevan a cabo ensayos adicionales para caracterizar regiones de reconocimiento de anticuerpos unidos por anticuerpos seleccionados, así como la modulación del factor de crecimiento en tipos de células específicas (p. ej., fibroblastos y/o células T). Por último, las estimaciones de unión por afinidad se realizan mediante experimentos de bloqueo cruzado de anticuerpos bin, así como mediante el uso de instrumentos de análisis de afinidad, incluidos, entre otros, los instrumentos de la familia Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA). Los anticuerpos se seleccionan además en función de su capacidad para elevar el factor de crecimiento libre en relación con el factor de crecimiento latente con isoformas alternativas de TGF-β GPC (p. ej., TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3) y TGF-β1 GPC de otras especies.

[0733] Identificación de la estabilización de anticuerpos dirigidos a la TGF-β1 GPC en el contexto de LTBP

[0735] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 complejado con LTBP1 S se criban mediante ELISA para detectar la unión a antígenos de selección positivos y negativos. Los anticuerpos se evalúan en general por su capacidad para asociarse con prodominios y disminuir la señalización de TGF-β. Las placas de ELISA se recubren con neutravidina y se incuban con proTGF-β1 biotinilado complejado con grupos de anticuerpos LTBP1S y se incuban con proteínas recombinantes que comprenden uno o más marcadores detectables. Para identificar y eliminar anticuerpos que se unen a elementos diversos (p. ej., etiquetas de polihistidina, etiquetas de bandera y/o sitios de escisión de proteinasa 3C), se incuban placas ELISA recubiertas con proteínas ICAM-1 humanas que comprenden uno o más de dichos elementos diversos. Para identificar y eliminar los anticuerpos que se unen al TGF-β1 libre, se incuban placas de ELISA recubiertas con factor de crecimiento TGF-β1 humano. Los anticuerpos que pueden ser específicos para versiones murinas se identifican incubando placas ELISA recubiertas con muproTGF-β1 complejado con LTBP1S. Las proteínas recombinantes que se asocian con anticuerpos unidos en placas ELISA se detectan usando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas para la detección (p. ej., colorimétrico, fluorimétrico) que se unen a marcadores detectables presentes en proteínas recombinantes unidas. Los anticuerpos se seleccionan para rondas adicionales de selección o se eliminan de los grupos de pruebas en función de los resultados obtenidos.

[0737] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 complejado con LTBP1S se evalúan además para determinar su capacidad para estabilizar TGF-β1 GPC contra la activación por avp6 expresado en células. Las células que expresan GPC y/o integrina avP6 se incuban con anticuerpos seleccionados y los sobrenadantes resultantes se utilizan para los cultivos a tratar de células que comprenden construcciones informadoras susceptibles a TGF-β para detectar la actividad de la expresión génica dependiente del factor de crecimiento libre. Se llevan a cabo ensayos adicionales para caracterizar regiones de reconocimiento de anticuerpos unidos por anticuerpos seleccionados, así como la modulación del factor de crecimiento en tipos de células específicas (p. ej., fibroblastos y/o células T). Por último, las estimaciones de unión por afinidad se realizan mediante experimentos de bloqueo cruzado de anticuerpos bin, así como mediante el uso de instrumentos de análisis de afinidad, incluidos, entre otros, los instrumentos de la familia Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA). Los anticuerpos se seleccionan adicionalmente basándose en su capacidad para estabilizar isoformas alternativas de TGF-β g Pc (p. ej., TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3) y TGF-β1 GPC de otras especies.

[0738] Identificación de la liberación de anticuerpos dirigidos a TGF-β1 PAL en el contexto de GARP

[0739] Los anticuerpos dirigidos a TGF-β1 PAL complejado con sGARP se criban usando ensayos ELISA para detectar la unión a antígenos de selección positivos y negativos. Los anticuerpos se evalúan en general por su capacidad para asociarse con PAL, pero no con GARP libre y por su capacidad para aumentar los niveles y/o la señalización del factor de crecimiento libre de TGF-β1. Las placas de ELISA se recubren con neutravidina seguido de incubación con TGF-β1 PAL biotinilado complejado con grupos de anticuerpos sGARP y se incuban con proteínas recombinantes que comprenden uno o más marcadores detectables. Para identificar y eliminar anticuerpos que se unen a elementos diversos (p. ej., etiquetas de polihistidina, etiquetas bandera y/o sitios de escisión de proteinasa 3C), se incuban placas ELISA recubiertas con proteínas ICAM-1 humanas que comprenden uno o más de dichos elementos diversos. Para identificar y eliminar los anticuerpos que se unen a GARP libre, las placas ELISA recubiertas se incuban con sGARP. Los anticuerpos que pueden ser específicos para versiones murinas se identifican incubando placas ELISA recubiertas con muTGF-β1 PAL complejado con sGARP. Las proteínas recombinantes que se asocian con anticuerpos unidos en placas ELISA se detectan usando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas para la detección (p. ej., colorimétrico, fluorimétrico) que se unen a marcadores detectables presentes en proteínas recombinantes unidas. Los anticuerpos se seleccionan para rondas adicionales de selección o se eliminan de los grupos de pruebas en función de los resultados obtenidos.

[0740] Los anticuerpos dirigidos a TGF-β1 PAL complejado con sGARP se evalúan además para determinar su capacidad para liberar TGF-β1 de GPC. Las células que expresan GPC y/o integrina avp6 se incuban con anticuerpos seleccionados y resultantes sobrenadantes se usan para tratar cultivos de células, que comprende construcciones informadoras susceptibles a TGF-β para detectar el crecimiento libre de actividad de la expresión génica dependiente de factor.

[0741] Los anticuerpos también se ensayan para determinar la capacidad de expresión de genes de activación de específicos a células T dependientes de TGF-Β. FoxP3 es un factor de transcripción expresado en células T, conocido por ser inmunomodulador. Se sabe que está regulado por TGF-β asociado con GARP de superficie de células T. Las células que expresan GPC así como GARP se incuban con anticuerpos seleccionados y los sobrenadantes resultantes se usan para tratar cultivos de células EL4 que comprenden construcciones informadoras FoxP3.

[0742] Los ensayos adicionales se llevan a cabo para caracterizar las regiones de reconocimiento de anticuerpos unidas por los anticuerpos seleccionados, así como la modulación del factor de crecimiento en tipos celulares específicos (p. ej., fibroblastos y/o células T). Por último, las estimaciones de unión por afinidad se realizan mediante experimentos de bloqueo cruzado de anticuerpos bin, así como mediante el uso de instrumentos de análisis de afinidad, incluidos, entre otros, los instrumentos de la familia Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA). Los anticuerpos se seleccionan además en función de su capacidad para elevar el factor de crecimiento libre en relación con el factor de crecimiento latente con isoformas alternativas de TGF-β GPC (p. ej., TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3) y TGF-β1 GPC de otras especies.

[0743] Identificación de la estabilización de anticuerpos dirigidos a la TGF-β1 GPC en el contexto de GARP

[0744] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 complejado con sGARP se criban mediante ELISA para detectar la unión a antígenos de selección positivos y negativos. Los anticuerpos se evalúan en general por su capacidad para asociarse con prodominios y disminuir la señalización de TGF-β. Las placas de ELISA se recubren con neutravidina, seguido de incubación con proTGF-β1 biotinilado complejado con grupos de anticuerpos sGARP y se incuban con proteínas recombinantes que comprenden uno o más marcadores detectables. Para identificar y eliminar anticuerpos que se unen a elementos diversos (p. ej., etiquetas de polihistidina, etiquetas bandera y/o sitios de escisión de proteinasa 3C), se incuban placas ELISA recubiertas con proteínas ICAM-1 humanas que comprenden uno o más de dichos elementos diversos. Para identificar y eliminar los anticuerpos que se unen al GARP libre, se incuban placas ELISA recubiertas con sGARP humano. Los anticuerpos que pueden ser específicos para versiones murinas se identifican incubando placas ELISA recubiertas con muproTGF-β1 complejado con sGARP. Las proteínas recombinantes que se asocian con anticuerpos unidos en placas ELISA se detectan usando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas para detección colorimétrica (p. ej., peroxidasa de rábano picante) que se unen a marcadores detectables presentes en proteínas recombinantes unidas. Los anticuerpos se seleccionan para rondas adicionales de selección o se eliminan de los grupos de pruebas en función de los resultados obtenidos.

[0745] Los anticuerpos dirigidos a proTGF-β1 complejado con sGARP se evalúan además para determinar su capacidad para estabilizar TGF-β1 GPC. Las células que expresan GPC se incuban con anticuerpos seleccionados y los sobrenadantes resultantes se usan para tratar cultivos de células que comprenden construcciones informadoras que responden a TGF-β para detectar la actividad de expresión génica dependiente del factor de crecimiento libre.

[0746] Los anticuerpos también se ensayan para determinar la capacidad de reducir la expresión génica dependiente de células T específica a TGF-β. Las células que expresan GPC así como GARP se incuban con anticuerpos seleccionados y los sobrenadantes resultantes se usan para tratar cultivos de células EL4 que comprenden construcciones informadoras FoxP3. Se llevan a cabo ensayos adicionales para caracterizar regiones de reconocimiento de anticuerpos unidos por anticuerpos seleccionados, así como la modulación del factor de crecimiento en tipos de células específicas (p. ej., fibroblastos y/o células T). Por último, las estimaciones de unión por afinidad se realizan mediante experimentos de bloqueo cruzado de anticuerpos bin, así como mediante el uso de instrumentos de análisis de afinidad, incluidos, entre otros, los instrumentos de la familia Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA). Los anticuerpos se seleccionan adicionalmente basándose en su capacidad para estabilizar isoformas alternativas de TGF-β GPC (p. ej., TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3) y TGF-β1 GPC de otras especies.

[0747] Ejemplo 4. Diseño de proteína quimérica usando alineamientos de secuencia

[0748] Para el diseño de proteína quimérica, se construyó la alineación de miembros de la familia TGF-β para identificar características estructurales conservadas y el grado de conservación de estas características (Figura 8). Comparación entre secuencias de la región N-terminal revelaron niveles más altos de conservación entre las regiones N-terminales del prodominio. Sobre la base de esta alineación de secuencia y las características estructurales de estos módulos de proteínas, se adoptó una estrategia de diseño quimérico genérico para los miembros de la familia TGF-β, de modo que se diseñaron quimeras donde los dominios ARM se intercambian (ya sea el dominio ARM completo o subconjuntos del dominio ARM como se indica) entre los miembros de la familia.

[0749] Específicamente, para la generación de quimeras que comprenden módulos de proteínas de TGF-β1, TGF-β2 y/o TGF-β3, se llevó a cabo la alineación de los tres usando enfoques estándar, y estas alineaciones de secuencia se usaron para crear un modelo de homología que compara TGF-β2 y TGF-β3 con la estructura cristalina del TGF-β1 porcino (Shi, M. et al., Latent TGFbeta structure and activation. Nature. 15 de junio de 2011; 474 (7351): 343 -9). Brevemente, la secuencia de TGF-β2 o TGF-β3 se modeló basándose en la estructura de la plantilla y la alineación de la secuencia junto con la satisfacción de las restricciones espaciales estándar usando procedimientos estándar. Estos modelos tridimensionales se analizaron para visualizar cómo las combinaciones quiméricas propuestas pueden comprender áreas de choque estérico. Como se usa en este documento, el término "choque estérico" se refiere a una interacción entre dos o más entidades y/o restos que es disruptiva para la forma y/o conformación de cada entidad, cada resto o entidad que comprende los dos o más restos que participan en la interacción. El modelado tridimensional reveló posibles choques estéricos entre el ciclo de latencia de TGF-β2 y el factor de crecimiento maduro de TGF-β1. Específicamente, el ciclo de latencia de TGF-β2 comprende una secuencia de aminoácidos DYP, cuyas cadenas laterales pueden superponerse con regiones del factor de crecimiento TGF-β1.

[0750] Ejemplo 5. Proteína quimérica de TGF-B1 con bucle de activación de TGF-B2

[0751] El mecanismo de activación para TGF-β2 aún no se comprende completamente. La activación puede depender de una o más asociaciones entre el bucle desencadenante del TGF-β2 y la integrina agPi. Para evaluar este mecanismo de actividad de TGF-β2, se sintetizan proteínas quiméricas que comprenden GPC que comprenden TGF-β1 en las que los módulos de proteína que comprenden la secuencia SGRRGDLATI (SEQ ID NO: 242) se sustituyen por módulos de proteína que comprenden bucles de activación de TGF-β2 que comprenden la secuencia GTSTYTSGDQKTIKSTRKK (SEQ ID NO: 180) El mecanismo de activación de estas proteínas quiméricas (proteínas quiméricas TGF-β1bucle de gatill° (corto) p2) se prueba mediante un ensayo basado en células. Las células (células HEK293 o Sw-480) se transfectan con o sin integrina agPi además de GPC que comprenden TGF-β2, GPC que comprenden TGF-β1bucle de gat¡"° (corto) p2 y/o GPC que comprenden TGF-β2 mutante (como controles no activos) en donde los bucles de activación comprenden las mutaciones Y240A, D245A y/o Q246A. Las líneas de células indicadoras se utilizan para detectar la liberación del factor de crecimiento.

[0752] Ejemplo 6. Evaluación de unión a a9B1-TGF-B2 y liberación del factor de crecim iento

[0753] La unión entre agp1 y TGF-β2 así como la liberación del factor de crecimiento subsiguiente no se entiende bien en la técnica. Si se pueden dilucidar los residuos implicados en esta asociación, se pueden desarrollar anticuerpos diseñados para interrumpir la asociación de agPi-TGF-β2 y utilizarlos para apuntar específicamente a la liberación del factor de crecimiento TGF-β2.

[0754] Las construcciones mutantes, así como las quimeras que comprenden formas alteradas de TGF-β2, se prueban mediante un ensayo de activación de modo que se pueda mapear el sitio de unión de agPi en TGF-β2. Esto se hace generando quimeras TGF-β1/TGF-β2 con deleción y/o mutación de residuos de aminoácidos en o alrededor del bucle desencadenante (en algunas realizaciones, que comprende la secuencia de aminoácidos FAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTP; SEQ ID NO: 65) o con mutaciones específicas de residuo a alanina. En algunos casos, TGF-β1 o TGF-β3 pueden o no servir como controles negativos para la unión de agPi. En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes utilizadas para el mapeo del sitio de unión de agPi pueden incluir las enumeradas en la Tabla 18. Estas incluyen proTGF-β2-M1, proTGF-β2-M2, proTGF-β2-M3, proTGF-β2 -M4 y proTGF-β2-M5 que comprenden deleciones de aminoácidos dentro del bucle de activación. También se incluye proTGF-β2M6 que comprende la mutación de dos residuos, Ile-Asp, a Phe-Thr. Finalmente, se incluye una proteína quimérica que comprende TGF-β2 en donde una parte del bucle desencadenante se ha sustituido por una parte del bucle desencadenante de TGF-β1.

[0757]

[0758]

[0759]

[0760]

[0764]

[0766] El mecanismo de activación de estas proteínas recombinantes se prueba mediante un ensayo basado en células. Las células (células HEK293 o Sw-480) se transfectan con o sin integrina agPi además de GPC que comprenden TGF-β2, GPC que comprenden mutaciones de sustitución de alanina para cada residuo en el bucle desencadenante (en donde cada GPC analizada comprende una sola sustitución) una de las proteínas recombinantes enumeradas en la Tabla 18 y/o GPC que comprenden mutantes inactivos de TGF-β2 (como controles no activos). Las líneas de células indicadoras se utilizan para detectar la liberación del factor de crecimiento en muestras de medios tomadas de las células transfectadas. Los resultados se utilizan para determinar qué residuos dentro del bucle de activación son necesarios para la liberación del factor de crecimiento del TGF-β2 dependiente de agPi.

[0767] Ejemplo 7. Alineación de secuencias

[0768] Se adaptó una alineación de secuencias múltiples de miembros de la familia TGF-β de Shi et. Alabama.2011 (Shi, M. et al., Latent TGF-beta structure and activation. Nature. 15 de junio de 2011; 474 (7351): 343-9). Las secuencias de TGF-β1 humano, TGF-β2, TGF-β3, GDF-11, inhibina Beta A, inhibina alfa A, b Mp 9, BMP2, BMP4, BMP7, BMP6, BMP8A, Lefty 1 y TGF-β1 murino, GDF11, GDF8 y TGF-β1 de mono cinomolgo y GDF8 se agregaron a la alineación usando métodos estándar, y las secuencias incluían las proteínas de longitud completa (excluyendo las secuencias de péptidos señal) (Figura 8).

[0769] Ejemplo 8. Ensayo de proliferación de miostatina

[0770] Mioblastos murinos C2C12 (ATCC, Manassas, VA) se cultivan en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Carlsbad, CA) con suero bovino fetal al 10% (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA) antes de llevar a cabo el ensayo. El porcentaje de FBS se varía y/o se reemplaza con albúmina de suero bovino (BSA) en concentraciones variables. Los ensayos de proliferación celular se realizan en placas de 96 pocillos sin revestir. Los cultivos C2C12 se siembran a 1000 células por pocillo. Después de permitir que las células se adhieran durante 16 horas, se agrega el medio de prueba de miostatina. La miostatina humana recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) se usa para la generación de curvas estándar. Para los sistemas experimentales, se agrega el sobrenadante de las células 293E que sobreexpresan miostatina, después del tratamiento con anticuerpos experimentales. Todas las muestras se ejecutan en repeticiones de 8. Las placas se incuban durante 72 horas en una atmósfera de 37°C y 5% de CO2. La proliferación se evalúa mediante un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI) mediante el cual la lisis celular genera una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente, que es directamente proporcional al número de células presentes en el cultivo. (Thomas, M. et al., Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. 2000.275 (51): 40235-43).

[0771] Ejemplo 9. Inmovilización de GPC por biotinilación y detección de crecim iento mediado por integrinas la liberación del factor

[0772] GPC recombinantes de la presente invención son biotinilados N-terminalmente y se incubaron en las superficies de cultivo recubiertas de estreptavidina/avidina. Las células que expresan diversas integrinas se añaden a las superficies del cultivo celular y se cultivan durante 24 horas. Los medios se retiran y se añaden a cultivos de células indicadoras del factor de crecimiento que expresan luciferasa en respuesta a la actividad del factor de crecimiento. Después de 24 horas, las células se lavan, lisan y analizan para determinar la actividad de luciferasa.

[0773] Ejemplo 10. Purificación de proteínas mediante Ni-NTA

[0774] Se cultivan células (células 293-6E) que expresan proteínas marcadas con His en medio sin suero (medio FreeStyle F17, Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con glutamina 4 mM, 0,1 % Pluronic F68 y 25 pg/ml G418. Una vez que su viabilidad cae por debajo del 50%, se recoge el sobrenadante del cultivo de tejidos y se aclara mediante centrifugación durante 10 minutos a 200 x gravedad a 4°C. A continuación, el sobrenadante se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de poros de 0,22 o 0,45 pm. El sobrenadante filtrado se combina con Tris, NaCl y NiCl2 para una concentración final de Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM y NiCb 0,5 mM. Se recoge 1 ml de la solución ajustada para su posterior análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE) o transferencia Western, mientras que otra porción de la solución ajustada se combina con resina Ni-NTA lavada (Life Technologies, Carlsbad, CA) a concentración de 5-10 ml de resina Ni-NTA por 300 ml de la solución ajustada. Esta solución combinada se agita luego a 4°C usando una barra de agitación magnética suspendida (para evitar la trituración de agarosa Ni-NTA). A continuación, la resina de Ni-NTA se recoge por centrifugación a 200 x gravedad a 4°C durante 10 minutos.

[0775] A continuación, la columna se lava con 15 volúmenes de columna (VC) de tampón de lavado (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM e imidazol 20 mM). Se recoge una alícuota del último lavado para análisis. A continuación, la columna se eluye con 3 VC de tampón de elución (T ris 20 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM e imidazol 300 mM) y se recogen fracciones del volumen de columna 1/3 para análisis.

[0776] Se mide la absorbancia a 280 nm en cada una de las fracciones eluidas recogidas y se compara con la absorbancia a 280 nm del tampón de elución en blanco. Las fracciones anteriores suelen tener una absorción negativa debido al gradiente de imidazol; sin embargo, las fracciones que contienen mayores cantidades de proteína tienen valores positivos. Las fracciones recolectadas se procesan luego en SDS-PAGe para su análisis y las fracciones relevantes se agrupan para una purificación adicional.

[0777] Ejemplo 11. Diseño de quimeras de GDF-8/GDF-11/activina

[0778] El alineamiento basado en la estructura de miembros de la familia de TGF-β se utilizó para construir modelos tridimensionales de proteínas quiméricas potenciales que comprenden combinaciones de módulos de GDF-8 y GDF-11 usando el software Schrodinger Bioluminate. Un modelo quimérico de GDF-8 que comprende una región de brazo de GDF-11 (SEQ ID NO: 216) reveló una región de choque estérico potencial que implica el residuo F95 de GDF-11. Según el modelo, F95 del brazo de GDF-11 provoca la desestabilización de la hélice a2 de la GPC quimérica. Por lo tanto, las quimeras GDF8/GDF11/Activina se diseñaron de modo que la región ARM de la quimera contenga la hélice a2.

[0779] Ejemplo 12. Análisis de ELISA

[0780] Análisis de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se lleva a cabo para evaluar la unión del anticuerpo. Las placas de ensayo ELISA de 96 pocillos se recubren con neutravidina, una versión desglicosilada de estreptavidina con un pl más neutro. Las proteínas diana se expresan con o sin etiquetas de histidina (His) y se someten a biotinilación. Las proteínas diana biotiniladas se incuban con placas de ensayo ELISA recubiertas con neutravidina durante dos horas a temperatura ambiente y las proteínas no unidas se eliminan lavando tres veces con tampón de lavado (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, BSA al 0,1%, TWEEN®-20 al 0,05%). Los anticuerpos primarios que se están probando se agregan a cada pocillo y se dejan incubar a temperatura ambiente durante 1 hora o más. A continuación, el anticuerpo no unido se elimina lavando tres veces con tampón de lavado. Los anticuerpos secundarios capaces de unirse a los anticuerpos primarios que se están probando y conjugando con marcadores detectables se incuban en cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios no unidos se eliminan lavando tres veces con tampón de lavado. Finalmente, los anticuerpos secundarios unidos se detectan mediante reacción enzimática, detección de fluorescencia y/o detección de luminiscencia, dependiendo de la marca detectable presente en los anticuerpos secundarios que se detecten.

[0781] Ejemplo 13. Identificación de anticuerpos usando selección de fagos

[0782] Los programas de cribado se llevan a cabo para generar paneles de anticuerpos que se unen a antígenos diana. La diversidad del panel de anticuerpos se mide mediante la diversidad de epítopos en oposición a la diversidad de secuencias de anticuerpos. Se emplean tanto estrategias de enriquecimiento de fagos en fase sólida como estrategias de enriquecimiento en fase de solución.

[0783] Antígenos diana (para enriquecimiento tanto en la fase sólida como en la fase de solución) se someten a caracterización biofísica antes de su uso, incluyendo la reducción y no reducción de SDS-PAGE para establecer cromatografía de pureza y de exclusión por tamaño (SEC) para establecer los niveles de agregación aceptables. Además, se llevan a cabo ensayos funcionales para verificar la bioactividad del antígeno diana.

[0784] 2-3 rondas de enriquecimiento se llevan a cabo con la expectativa de que serán necesarias sólo tres rondas. Se conservan alícuotas de fagos de las rondas de selección 2-4 para uso posterior. Después del enriquecimiento, los clones seleccionados al azar se criban mediante ELISA para examinar la unión a los antígenos diana así como a los antígenos no diana. Basándose en estos análisis, se seleccionan hasta 500 clones para la secuenciación de nucleótidos y el análisis del número de anticuerpos distintos, así como la frecuencia de aislamiento y el número de regiones Vh y Vl distintas. Sobre la base de estos análisis posteriores, se seleccionan hasta 100 clones para la agrupación de epítopos por relación de epítopos utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie (o enfoque equivalente). Se determinan las constantes de disociación (koff)para cada uno y se seleccionan hasta 50 clones para caracterización adicional.

[0785] Los candidatos finales se expresan como construcciones de anticuerpos bivalentes, se purifican y se determinan los valoreskoff

de cada uno. Los ensayos funcionales basados en células se utilizan para caracterizar anticuerpos bivalentes purificados.

[0786] Ejemplo 14. La identificación de anticuerpos que bloquean la activación de proGDF-8

[0787] Producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar los anticuerpos que se unen proGDF-8 y el bloque de liberación del factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en donde se usa proGDF-8 recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y proGDF-8 biotinilado para el enriquecimiento en fase de solución. Las preparaciones de antígenos se analizan para determinar los niveles de agregación para garantizar que >95% son especies diméricas. En el análisis ELISA de clones enriquecidos, se evalúa la unión a seis antígenos (proGDF-8, prodominio GDF-8, factor de crecimiento GDF-8, proGDF-8 murino, proGDF-11 y proTGF-β1 C4S). Clones seleccionados en base a análisis de ELISA están en secuencia y los anticuerpos son desarrollados de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0788] Ejemplo 15. Identificación de anticuerpos que activan la liberación de factor de crecim iento de GDF-11 de la GPC latente

[0789] La producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar anticuerpos que se unen al prodominio de GDF-11 y activan la liberación del factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en donde se usa el prodominio de GDF-11 recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y el prodominio de GDF-11 biotinilado se usa para el enriquecimiento de la fase de solución. Las preparaciones de antígeno se analizan para determinar los niveles de agregación para garantizar que >95% son especies monoméricas. En el análisis ELISA de los clones enriquecidos, la unión a seis antígenos se evalúa (prodominio de GDF-11, proGDF-11, factor de crecimiento 11-GDF, prodominio GDF-8, prodominio GDF-11 murino y proTGF-β1 C4S). Los clones seleccionados en base al análisis ELISA se secuencian y los anticuerpos se desarrollan de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0790] Ejemplo 16. Identificación de anticuerpos que activan la liberación de TGF-B1 del complejo proTGF-B1/GARPLa producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar anticuerpos que se unen a TGF-β1 PAL que forma complejo con sGARP (TGF-β1 PAL-sGARP) y activan la liberación del factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en los que se usa TGF-β1 PAL-sGARP biotinilado recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y TGF-β1 PAL-sGARP biotinilado para el enriquecimiento en fase de solución. Las preparaciones de antígeno se analizan para determinar los niveles de agregación para asegurar que >95% de las especies comprenden TGF-β1 PAL dimérico complejado con sGARP monomérico. En el análisis ELISA de clones enriquecidos, se evalúa la unión a ocho antígenos (TGF-β1 LAPsGARP, proTGFb1-sGARP, sGARP, TGF-β1 PAL C4S, proTGF-βi C4S, LTBP1-proTGFb1, ICAM-1 N-His, ICAM-1 C-his). Clones seleccionados en base al análisis ELISA se secuencian y se desarrollan anticuerpos de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0791] Ejemplo 17. Identificación de anticuerpos que bloquean la liberación del factor de crecim iento maduro del complejo proTGF-B1/GARP

[0792] La producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar los anticuerpos que se unen al complejo formado por proTGF-β1 y GARP (proTGF-β1-GARP) y la liberación de inhibición del factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en los que se usa proTGF-β1-sGARP biotinilado recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y se usa proTGF-β1-GARP biotinilado para el enriquecimiento en fase de solución. Se analizan los niveles de agregación de las preparaciones de antígenos para asegurar que >95% de las especies comprenden proTGF-β1 dimérico complejado con sGARP monomérico. En el análisis ELISA de clones enriquecidos, se evalúa la unión a ocho antígenos (proTGF-β1-GARP, TGF-βi PAL, proTGF-β1 C4S, complejo proTGF-β1/LTBP1S, TGF-βi PAL-sGARP, sGARP, ICAM-1 C-His, ICAM-1 N-His). Los clones seleccionados en base al análisis ELISA se secuencian y los anticuerpos se desarrollan de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0793] Ejemplo 18. identificación de anticuerpos que bloquean la liberación de TGF-βi de proTGF-βi complejado con LTBP1S

[0794] La producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar los anticuerpos que se unen proTGF-β1 complejado con LTBP1S (proTGF-β1-LTBP1S) y la liberación de inhibición del factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en los que se usa pro TGF-β1-LTBP1S recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y se usa pro TGF-β1-LTBP1S biotinilado para el enriquecimiento en fase de solución. Las preparaciones de antígeno se analizan para determinar los niveles de agregación para asegurar que >95% de las especies comprenden proTGF-β1 dimérico complejado con LTBP1S monomérico. En el análisis ELISA de clones enriquecidos, se evalúa la unión a ocho antígenos (proTGF-β1-LTBP1S, TGF-β1 PAL, factor de crecimiento de TGF-β1, proTGF-β1 C4S, proTGF-β1-LTBP1S murino, LTBP1S, prodominio GDF-8 y proTGF-β2). Los clones seleccionados en base al análisis ELISA se secuencian y los anticuerpos se desarrollan de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0795] Ejemplo 19. Identificación de anticuerpos pan-específicos que bloquean la liberación de TGF-B1 de proTGF-MLa producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar los anticuerpos que se unen proTGF-β1 e inhibir la liberación de factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en donde se usa proTGF-β1 recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y proTGF-β1 biotinilado para el enriquecimiento en fase de solución. Las preparaciones de antígenos se analizan para determinar los niveles de agregación para garantizar que >95% son especies diméricas. En el análisis ELISA de clones enriquecidos, se evalúa la unión a siete antígenos (TGF-β1 PAL, factor de crecimiento TGF-β1, proTGF-β1 C4S, proTGF-β1 C4S murino, prodominio GDF-8 y proTGF-β2). Los clones seleccionados en base al análisis ELISA se secuencian y los anticuerpos se desarrollan de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0796] Ejemplo 20. Identificación de anticuerpos pan-específicos que activan la liberación de TGF-B1 a partir de proTGF-B1

[0797] La producción de un panel diverso de anticuerpos se lleva a cabo para identificar anticuerpos que se unen al TGF-β1 PAL y activan la liberación del factor de crecimiento maduro. La generación de anticuerpos se lleva a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12, en donde se usa TGF-β1 PAL C4S recombinante para el enriquecimiento en fase sólida y TGF-β1 PAL C4S biotinilado para el enriquecimiento en fase de solución. Las preparaciones de antígenos se analizan para determinar los niveles de agregación para garantizar que >95% son especies diméricas. En el análisis ELISA de clones enriquecidos, se evalúa la unión a siete antígenos (TGF-β1 PAL C4S, proTGF-β1 C4S, proTGF-β1 C4S murino, TGF-β1 factor de crecimiento maduro, proGDF-8 y proTGF-β2). Los clones seleccionados en base al análisis ELISA se secuencian y los anticuerpos se desarrollan de acuerdo con los métodos del Ejemplo 12.

[0798] Ejemplo 21. Inmunización de ratones con inactivación de TGF-B1

[0799] Se inmunizan ratones neonatales de acuerdo con los métodos de Oida et al (Oida., T. et al, TGF-β induces surface LAP expression on Murine CD4 T cells independent of FoxP3 induction. Pl Os One 2010. 5 (11): e15523) ratones neonatales deficientes en TGF-β reciben inyecciones de galectina-1 para prolongar la supervivencia (típicamente 3-4 semanas después del nacimiento en estos ratones). Las células que producen establemente proteínas antigénicas (por ejemplo proTGF-β1-GARP o TGF-β1 PAL-GARP; 1-4 x 106 células en 10-25 pl PBS) o proteínas antigénicas purificadas se utilizan para inmunizar a los ratones cada dos días mediante inyección intraperitoneal durante 10 días a partir de la 8° día después del nacimiento. Las células del bazo se recolectan el día 22 después del nacimiento. Las células del bazo recolectadas se fusionan con células de mieloma SP 2/0. Las células de hibridoma resultantes se evalúan para la producción exitosa de anticuerpos anti-proTGF-β1.

[0800] Ejemplo 22. Expresión de complejos de TGF-B1 y análisis de proteínas

[0801] La expresión de proTGF-β1 se llevó a cabo con o sin LTBP1S o sGARP marcada con His de acuerdo con los métodos del Ejemplo 10. El proTGF-β1 expresado sin LTBP1S o sGARP comprendía la mutación C4S para prevenir la asociación del prodominio con estos factores y una etiqueta His N-terminal. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras (para mantener los dímeros o complejos de proteínas). La Figura 11 representa los resultados que indican la expresión satisfactoria de estas proteínas y complejos proteicos.

[0802] Ejemplo 23. Expresión del antígeno basado en células de complejos de TGF-B1/GARP

[0803] Líneas celulares de linfoma de pre-células B que se desarrollaron de manera estable expresan tanto GARP (unido a membrana) como proTGF-β1 o TGF-β1 PAL. GARP asociado a membrana se clonó en el vector pYD7 (NRC Canadá, Ottawa, CA) mientras que proTGF-β1 y TGF-β1 PAL se clonaron en vectores pcDNA3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Estos vectores permiten blasticidina y selección basada en G418, respectivamente. Se transfectaron células derivadas de linfoma de pre-células B de ratones suizos BALB/c (denominadas en el presente documento células 300.19) con control de vector vacío o GARP con coexpresión de proTGF-β1 o TGF-β1 PAL y se seleccionaron con G418 plus blasticidina. Las células resistentes se subclonaron y se seleccionaron colonias individuales. Las células cultivadas de las líneas celulares resultantes se sondaron con anticuerpos (conjugados con partículas fluorescentes) dirigidos a las proteínas expresadas y se examinaron mediante citometría de flujo para determinar la intensidad de la fluorescencia. La Figura 12 muestra los datos de intensidad de fluorescencia recopilados de las células resultantes. Los valores iniciales asociados con las células transfectadas con el control de vector vacío se muestran en la Figura 12A, mientras que la intensidad de fluorescencia elevada en las Figuras 12B y 12C indican la expresión de los complejos GARP en la superficie celular. La cuantificación de las proteínas expresadas en la superficie se llevó a cabo mediante análisis adicionales en los que las mismas células marcadas con fluorescencia utilizadas para generar los datos representados en la Figura 12, se examinaron mediante citometría de flujo junto con perlas con capacidad de unión de anticuerpos definida para la generación de una curva estándar. Estas perlas se marcaron con los mismos anticuerpos utilizados para marcar células y los valores de fluorescencia obtenidos se utilizaron para extrapolar el número de anticuerpos unidos a proteínas expresadas en la superficie. Se determinó que 300.19 células que expresan proTGF-β1-GARP expresan aproximadamente 83.000 copias/célula, mientras que se determinó que 300.19 células que expresan TGF-β1 PAL-GARP expresan aproximadamente 66.000 copias/célula.

[0804] A continuación, se ensayaron las líneas celulares para determinar la actividad de TGF-β1 en presencia de células que expresan integrinas avp6, conocidas por liberar el factor de crecimiento TGF-β1 de las GPC latentes. Los medios acondicionados de estos cocultivos se usaron para tratar células informadoras que comprenden receptores de TGF-β así como el gen de luciferasa, impulsado por un promotor que responde a TGF-β, PAI-1. Esto se realizó en presencia o ausencia de un anticuerpo neutralizante, anti-TGF-β, clon 1D11. La actividad luciferasa resultante se evaluó mediante luminometría. Los resultados indican que los medios condicionados de células que expresan vectores vacíos y los complejos TGF-β1 PAL-GARP no pudieron inducir la expresión de luciferasa en comparación con los valores iniciales, mientras que los medios condicionados de células que expresan proTGF-β1-GARP mostraron una capacidad mejorada para inducir luciferasa expresión (véase la Figura 12D).

[0805] Ejemplo 24. Expresión del antígeno basado en células de proTGF-B1-ltbp1

[0806] Fibroblastos de ratón NIH 3T3 se desarrollan que expresan de manera estable proTGF-β1-ltbp1. Estas proteínas secretadas se unen a la superficie celular o se depositan en la matriz extracelular.

[0807] Ejemplo 25. Expresión de LTBP3

[0808] Las proteínas LTBP3 recombinantes se expresan con o sin varios módulos, fragmentos, secuencias señal de secreción N-terminal (p. ej., SEQ ID NO: 257) y/o etiquetas de histidina N- o C-terminales. Módulos incluidos en algunos expresadas proteínas incluyen los enumerados en la Tabla 19.

[0811]

[0812] Fragmentos de LTBP3 incluidos en algunas proteínas expresadas incluyen los enumerados en la Tabla 20.

[0814]

[0815]

[0817] Otras proteínas expresadas incluyen las enumeradas en la Tabla 21.

[0819]

[0822]

[0823]

[0826] Ejemplo 26. Ensayo 293T CAGA-luciferasa para la actividad de GDF-8

[0827] Los ensayos de CAGA luciferasa se llevan a cabo a los anticuerpos de prueba que modulan la actividad de GDF-8. Se prepara una solución de fibronectina de 50 pg/ml y se añaden 100 pl a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Las placas se incuban durante 30 min a temperatura ambiente antes de que la fibronectina libre se elimine por lavado usando PBS. Células 293T que comprenden expresión transitoria o estable de pGL4 (Promega, Madison, WI) bajo el control de un promotor de control o promotor que comprende secuencias CAGA sensibles a Smad1/2 a continuación se utilizan para pocillos recubiertos de fibronectina de semillas (2 x 104 células/pocillo en medio de cultivo completo). Al día siguiente, las células se lavan con 150 pl/pocillo de medio de cultivo celular con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% antes del tratamiento con GDF-8 con o sin anticuerpo de prueba. Las células se incuban a 37°C durante 6 horas antes de la detección de la expresión de luciferasa usando el reactivo BRIGHT-GLO™ (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0828] Ejemplo 27. Detección de la expresión de miogenina por FACS

[0829] Células 257384 Lonza (Lonza, Basilea, Suiza) se siembran en placas de 24 pocillos a 4 x 104 células/pocillo. Al día siguiente, el medio celular se reemplaza con medio de diferenciación [medio de Eagle modificado de dulbecco (DMEM)/F12 con suero de caballo al 2%.] También se incluyen concentraciones variables de GDF-8 en el medio de diferenciación en presencia o ausencia de anticuerpos de prueba. A continuación, se deja que las células se diferencien durante 3 días.

[0830] Después del período de 3 días, el estado de diferenciación de cada pocilio se analiza a través de análisis de niveles de expresión de miogenina. Las células de cada grupo de tratamiento se agrupan y se someten a tratamiento usando el Transcription Factor Buffer Set de BD Pharmingen (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey), número de producto 562574 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la fijación y la permeabilización, se añaden a las células 5 pl de ficoeritrina (PE)-miogenina o 1,25 pl de control de PE y se incuban a 4°C durante 50 minutos. A continuación, las células se lavan y se resuspenden en tampón FACS antes del análisis de la fluorescencia celular mediante FACS.

[0831] Ejemplo 28. Ensayo de proliferación de células HT2

[0832] Los anticuerpos se analizan para determinar la capacidad de modular actividad TGF-β usando un ensayo de proliferación de células HT2. La proliferación de células HT2 en medio que contiene IL-4 se reduce en presencia de factor de crecimiento TGF-β libre. Los anticuerpos con la capacidad de modular los niveles de factor de crecimiento libre estabilizando TGF-β GPC o promoviendo la liberación y/o acumulación de factor de crecimiento libre pueden probarse usando el sistema de cultivo HT2 descrito aquí. Las células que expresan proTGF-β se cocultivaron con células que expresan integrina avp6s. Los cultivos se tratan con diversas concentraciones de anticuerpo de prueba, TGF-β1 purificado (como control positivo) o anticuerpo anti-TGF-β1D11 (R&D Systems, Minneapolis, MN) como control negativo.

[0833] Las células HT2 se cultivan en medios de crecimiento (RPMI 1640, 10% de FBS, 1% P/S, 4 mM Gln, 50 pm beta-mercaptoetanol y 10 ng/ml de IL-2) a 1,5 x 105 células/ml para asegurarse de que las células estén en fase de crecimiento logarítmico al día siguiente. Al día siguiente, los sobrenadantes celulares que se están analizando se diluyen en medio de ensayo HT2 (RPMI 1640, FBS al 10%, P/S al 1%, Gln 4 mM, betamercaptoetanol 50 pm y 7,5 ng/ml de IL-4). Los cultivos de células HT2 y las células se lavan con medio libre de citocinas. Sobrenadantes diluidos se añadieron a cada pocillo de cultivo de células HT2 y células HT2 se cultivaron durante 48 horas a 37°C y 5% de CO2. A continuación, se determina la viabilidad celular en los cultivos de células HT2 usando el reactivo CELL-TITER GLO® (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se obtienen como unidades de luz relativa (RLU) que se correlacionan con la viabilidad celular.

[0834] Ejemplo 29. Análisis de GDF-8expresado de forma recombinante

[0835] ProGDF-8 etiquetado con histidina se expresó de acuerdo con fueron los métodos del Ejemplo 10. Las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras (para mantener los dímeros de proteína). La Figura 13 representa los resultados que indican la expresión satisfactoria de estas proteínas y complejos proteicos.

[0836] Ejemplo 30. Quimeras TGF-B2

[0837] Las proteínas quiméricas se sintetizan que comprenden TGF-β2 con sustituciones de región del brazo de TGF-β1 y TGF-β3. Las proteínas quiméricas también comprenden mutaciones N-terminales C5S. Estas proteínas quiméricas expresadas (enumeradas en la Tabla 22) tienen una estabilidad mejorada sobre algunas otras proteínas quiméricas.

[0840]

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para generar un anticuerpo que inhibe la liberación de GDF-8 de un complejo factor de crecimientoprodominio (GPC), en el que el anticuerpo se prepara usando un antígeno recombinante que comprende la SEQ ID NO: 5, o un antígeno recombinante que comprende un GPC que comprende la SEQ ID NO: 70.

2. Un método para generar un anticuerpo que inhibe la liberación de GDF-8 de un complejo factor de crecimientoprodominio (GPC) que comprende:

(a) seleccionar un anticuerpo de un conjunto de dos o más anticuerpos candidatos sobre la base de la capacidad de asociarse con un antígeno, en el que el antígeno comprende un GPC, que comprende un prodominio de GDF-8 y un factor de crecimiento de GDF-8; y

(b) seleccionar un anticuerpo del conjunto de dos o más anticuerpos candidatos sobre la base de la capacidad de inhibir los niveles y/o la actividad del factor de crecimiento de GDF-8.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende usar un ensayo de liberación del factor de crecimiento a base de células para seleccionar un anticuerpo por su capacidad de inhibir la liberación del factor de crecimiento de GPC.

4. El método de la reivindicación 1, o el método de las reivindicaciones 2 o 3, en el que el anticuerpo se prepara mediante el método de la reivindicación 1, que comprende inmunizar a un huésped con el antígeno recombinante, en el que opcionalmente el antígeno recombinante es un antígeno a base de células.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo se prepara usando células de hibridoma.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo se prepara usando técnicas de cribado de bibliotecas de presentación de alto rendimiento, opcionalmente usando tecnología de presentación en fagos.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es humano o humanizado.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo es de isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA o IgA2.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo está formulado en una composición farmacéutica con por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.