ES3053908T3

ES3053908T3 - Method for immunological analysis of free aim in biological sample

Info

Publication number: ES3053908T3
Application number: ES20747633T
Authority: ES
Inventors: Toru Miyazaki; Tomoko Yamazaki; Takeshi Okanoue; Tomohide Asai; Yuka KANETSUKI; Jiro Hirota
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd; Social Welfare Organization Saiseikai Imperial Gift Foundation Inc
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd; Social Welfare Organization Saiseikai Imperial Gift Foundation Inc
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2026-01-27
Anticipated expiration: 2040-01-30
Also published as: WO2020158856A1; EP3919509A4; US20220146529A1; EP3919509A1; CN113710698A; JP7315966B2; JPWO2020158856A1; EP3919509B1

Abstract

La presente invención aborda el problema de detectar únicamente AIM libre en una muestra biológica que contiene AIM complejado y AIM libre. Este problema se puede resolver mediante un método de análisis inmunológico de AIM libre en una muestra biológica que utiliza un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona con AIM libre sin reaccionar con AIM complejado. Dicho anticuerpo se une a un epítopo dentro del dominio SRCR2 de la AIM humana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método para el análisis inmunológico de AIM libre en una muestra biológica

[0003] Campo técnico

[0004] La presente invención se refiere a un método de inmunoensayo para AIM libre en una muestra biológica y a un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo. La presente invención también se refiere a un kit de ensayo para AIM libre en una muestra biológica que comprende el anticuerpo monoclonal.

[0005] Técnica anterior

[0006] AIM (inhibidor de la apoptosis de macrófagos) es una proteína sanguínea secretora con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa producida por macrófagos tisulares. AIM tiene una estructura en la que tres dominios ricos en cisteína receptores depuradores (SRCR) (dominio SRCR1, dominio SRCR2 y dominio SRCR3) que tienen secuencias específicas que contienen muchos residuos de cisteína están conectados en tándem, y se considera que los residuos de cisteína están unidos por disulfuro entre sí en cada dominio para formar una estructura tridimensional esférica compacta.

[0007] Se sabe que AIM tiene la característica de unirse a varias moléculas tales como lipopolisacárido, IgM, factores reguladores del complemento y sintetasas de ácidos grasos. En particular, se sabe que AIM existe en forma de un complejo con IgM en la sangre. Dado que la IgM es un enorme complejo proteico que supera los 500 kDa, AIM no pasa a través del glomérulo y se transfiere a la orina siempre que AIM se una a la IgM, y se mantiene una alta concentración sanguínea de AIM. Cuando se disocia de IgM, AIM se excreta rápidamente en la orina. Por lo tanto, la mayor parte de AIM forma un complejo con IgM en la sangre y rara vez está presente en la sangre en un estado libre en lugar de como un conjugado.

[0008] En los últimos años, se ha aclarado que AIM está involucrado en la progresión de afecciones patológicas en diversas enfermedades como la resistencia a la insulina o la arteriosclerosis. Por ejemplo, el documento de patente 1 notifica una relación entre AIM libre presente en una forma libre no unida a otra pareja de unión y la enfermedad hepática.

[0009] Lista de citas

[0010] Documentos de patente

[0011] Documento de patente 1: El documento WO 2017/043617 se refiere a un método para examinar cáncer de hígado o a un método para ayudar al diagnóstico de cáncer de hígado así como a un kit que puede usarse para este fin.

[0012] Sumario de la invención

[0013] Problema técnico

[0014] Cuando se diagnostica una enfermedad específica en función de un resultado de medición de una cantidad de AIM libre, es necesario eliminar una cantidad de AIM que forma un complejo y medir solo la cantidad de AIM libre. Sin embargo, cuando se detecta AIM libre, también puede detectarse AIM complejo unido a otra pareja de unión. Por lo tanto, existe una demanda de una técnica capaz de eliminar una cantidad de AIM que forma un complejo y medir solo una cantidad de AIM libre sin operaciones complicadas.

[0015] Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de inmunoensayo para AIM libre en una muestra biológica que contiene AIM complejo y AIM libre y un kit de ensayo con excelente especificidad y sensibilidad, y un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre con excelente especificidad y sensibilidad.

[0016] Solución al problema

[0017] Como resultado de estudios intensivos para resolver el problema, el presente inventor produjo un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona con AIM libre sin reaccionar con AIM complejo, y un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona tanto con AIM complejo como con AIM libre. El presente inventor descubrió entonces que el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona con AIM libre sin reaccionar con AIM complejo reconoce el dominio SRCR2 de AIM como epítopo, completando de ese modo la presente invención.

[0018] La presente invención proporciona los métodos de inmunoensayo, los anticuerpos monoclonales y los kits tal como se definen por las reivindicaciones adjuntas.

[0019] Efectos ventajosos de la invención

[0020] Según la presente invención, puede detectarse AIM libre con precisión en una muestra biológica que contiene AIM complejo y AIM libre.

[0021] Breve descripción de los dibujos

[0022] [Figura 1A] La figura 1A es un diagrama que muestra un resultado del estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en un sistema de ECL de medición de AIM.

[0023] [Figura 1B] La figura 1B es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0024] [Figura 1C] La figura 1C es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0025] [Figura 1D] La figura 1D es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0026] [Figura 1E] La figura 1E es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0027] [Figura 1F] La figura 1F es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0028] [Figura 1G] La figura 1G es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0029] [Figura 1H] La figura 1H es un diagrama que muestra un resultado de un estudio sobre la combinación de anticuerpos monoclonales en el método de ECL para la medición de AIM.

[0030] [Figura 2] La figura 2 es un diagrama que muestra un resultado del análisis de identificación de epítopos de anticuerpos monoclonales mediante inmunotransferencia de tipo Western.

[0031] Descripción de realizaciones

[0032] Muestra biológica

[0033] Los ejemplos de una muestra biológica analizable en la presente invención incluyen tejidos sólidos y fluidos corporales derivados de cuerpos vivos (organismos), y se usan preferiblemente fluidos corporales. La muestra biológica analizable en la presente invención es más preferiblemente una muestra de fluido corporal tal como sangre, suero, plasma, orina, saliva, esputo, fluido lagrimal, otorrea o fluido prostático, más preferiblemente sangre, suero, plasma u orina. Los ejemplos del cuerpo vivo o el sujeto incluyen seres humanos o animales (por ejemplo, ratones, cobayas, ratas, monos, perros, gatos, hámsteres, caballos, bovinos y cerdos), y son preferiblemente seres humanos. La muestra biológica del sujeto puede recogerse o prepararse en el momento de la implementación de la presente invención o puede recogerse o prepararse y almacenarse preliminarmente. La persona que prepara la muestra y la persona que analiza la cantidad de AIM libre en la muestra pueden ser diferentes. La muestra biológica puede ser una muestrain vivo. En la presente invención, la muestra biológica contiene tanto AIM libre como AIM complejo.

[0034] AIMAIM (inhibidor de la apoptosis de macrófagos) es una proteína sanguínea secretora con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa producida por macrófagos tisulares. AIM tiene una estructura en la que tres dominios ricos en cisteína receptores depuradores (SRCR), es decir, secuencias específicas que contienen muchos residuos de cisteína, están conectados en tándem, y se considera que los residuos de cisteína están unidos por disulfuro entre sí en cada dominio para formar una estructura tridimensional esférica compacta.

[0035] AIM humano se compone de 347 aminoácidos representados por SEQ ID NO: 1 y contiene tres dominios SRCR ricos en cisteína. El dominio SRCR1 corresponde a los números de aminoácido 24 a 125 en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1. El dominio SRCR2 corresponde a los números de aminoácido 138 a 239 en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1. El dominio SRCR3 corresponde a los números de aminoácido 244 a 346 en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.

[0036] La secuencia de aminoácidos de AIM humano es tal como sigue.

[0037]

[0039] Específicamente, las secuencias de aminoácidos del dominio SRCR1, el dominio SRCR2 y el dominio SRCR3 en AIM humano son las siguientes.

[0040] DominioSRCR1:

[0043]

[0046] Dominio SRCR2:

[0049]

[0052] Dominio SRCR3:

[0055]

[0058] AIM libre

[0059] En esta descripción, el "AIM libre" significa AIM que existe en un estado libre sin estar unido a otras sustancias tales como lipopolisacárido o IgM. Por otro lado, en esta descripción, AIM unido a otras sustancias tales como lipopolisacárido o IgM y existente en un estado de un complejo se denomina AIM complejo. El AIM libre es preferiblemente AIM libre humano, y el AIM complejo es preferiblemente AIM complejo humano.

[0060] En esta descripción, "reacción no específica" significa que una sustancia distinta de AIM libre, particularmente AIM complejo, se une a un anticuerpo monoclonal anti-AIM usado en la presente invención.

[0061] Anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo

[0062] Un método de inmunoensayo de la presente invención usa un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo. "Reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo" significa reaccionar con AIM libre y no reaccionar sustancialmente con otras sustancias, particularmente con AIM complejo. El significado de "no reaccionar sustancialmente" se describirá más adelante. A continuación en el presente documento, el "anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo" puede denominarse "anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre". En esta descripción, en contraste con el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre, un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona tanto con AIM libre como con AIM complejo se denomina simplemente "anticuerpo monoclonal anti-AIM".

[0063] En la presente invención, "usar un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo" significa cuantificar AIM libre usando el anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo. "Usar un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo" puede incluir las siguientes etapas.

[0064] Una etapa de poner el anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo en contacto con una muestra biológica.

[0065] En el método de inmunoensayo de la presente invención, se usan preferiblemente dos o más anticuerpos monoclonales anti-AIM que tienen la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo. Los dos o más anticuerpos monoclonales anti-AIM reconocen preferiblemente epítopos diferentes respectivos.

[0066] En el método de inmunoensayo de la presente invención, además del anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo, puede usarse además un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar tanto con AIM libre como con AIM complejo. El anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo y el anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar tanto con AIM libre como con AIM complejo preferiblemente reconocen epítopos diferentes respectivos.

[0067] El anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo usado en el método de inmunoensayo de la presente invención se une a un epítopo en el dominio SRCR2 de AIM humano, en donde el epítopo tiene una estructura tridimensional, en donde el dominio SRCR2 de AIM humano se representa por SEQ ID NO: 3. El anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo usado en el método de inmunoensayo de la presente invención preferiblemente no se une al dominio SRCR1, y más preferiblemente, no se une ni al dominio SRCR1 ni al dominio SRCR3.

[0068] Aunque "reaccionar" con AIM libre, "reconocer" AIM libre y "unirse" a AIM libre se usan como sinónimos en esta descripción, estos deben interpretarse en el sentido más amplio sin limitarse a estas ejemplificaciones. Si un anticuerpo "reacciona" con un antígeno (compuesto) tal como AIM libre, puede confirmarse mediante un método de ELISA de fase sólida de antígeno, un método de ELISA competitivo, un método de ELISA de tipo sándwich, etc., así como mediante un método (método de SPR) que usa el principio de resonancia de plasmón superficial, etc. El método de SPR puede realizarse usando dispositivos, sensores y reactivos disponibles comercialmente bajo el nombre de Biacore (marca registrada).

[0069] Afirmar que el anticuerpo usado "no reacciona con" un determinado compuesto significa que el anticuerpo usado en la presente invención no reacciona sustancialmente con un determinado compuesto. Afirmar que "no reacciona sustancialmente" significa que la reactividad mejorada del anticuerpo usado en la presente invención no se reconoce cuando se usa Biacore (marca registrada) T100 o T200 para inmovilizar el anticuerpo de la presente invención para realizar la medición basándose en el método de SPR, por ejemplo. Específicamente, esto significa que la reactividad entre el anticuerpo y el compuesto no es significativamente diferente de la reactividad de un control (sin compuesto añadido). Obviamente, puede confirmarse que el anticuerpo "no reacciona sustancialmente" con el compuesto mediante un método o medio bien conocido por los expertos en la técnica distinto del método de SPR.

[0070] La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre usado en el método de inmunoensayo de la presente invención a AIM libre no está particularmente limitada siempre que pueda obtenerse el efecto de la presente invención y, por ejemplo, la afinidad de unión a IgM puede ser Kd de al menos aproximadamente 10<-4>M, al menos aproximadamente 10<-5>M, al menos aproximadamente 10<-6>M, al menos aproximadamente 10<-7>M, al menos aproximadamente 10<-8>M, al menos aproximadamente 10<-9>M, al menos aproximadamente 10<-10>M, al menos aproximadamente 10<-11>M, al menos aproximadamente 10<-12>M o más. El anticuerpo usado en el método de inmunoensayo de la presente invención puede producirse disolviendo AIM libre como antígeno (inmunógeno) en un disolvente tal como solución salina tamponada con fosfato y administrando esta solución a un animal para la inmunización. La inmunización puede realizarse usando una emulsión después de añadir un adyuvante adecuado a la solución según sea necesario. El adyuvante puede ser un adyuvante ampliamente usado, tal como emulsión de agua en aceite, emulsión de agua en aceite en agua, emulsión de aceite en agua, liposoma o gel de hidróxido de aluminio, así como una proteína o sustancia peptídica derivada de componentes biogénicos. Por ejemplo, puede usarse preferiblemente adyuvante incompleto o completo de Freund. Aunque no está particularmente limitado, se desea que la vía de administración, la dosis administrada y el tiempo de administración del adyuvante se seleccionen adecuadamente de modo que pueda potenciarse una respuesta inmunitaria deseada en un animal que va a inmunizarse mediante el antígeno.

[0071] Aunque no se limita particularmente, el tipo de animal usado para la inmunización es preferiblemente un mamífero y puede ser un ratón, rata, bovino, conejo, cabra y oveja, y es más preferible un ratón o una rata. El animal puede inmunizarse según una técnica común y, por ejemplo, la inmunización puede lograrse inyectando al animal por vía subcutánea, intracutánea, intravenosa o intraperitoneal una solución de un antígeno, preferiblemente una mezcla con el adyuvante. Dado que una respuesta inmunitaria es generalmente diferente dependiendo de un tipo y cepa del animal que va a inmunizarse, es deseable que se establezca adecuadamente un programa de inmunización dependiendo del animal que va a usarse. La administración del antígeno se repite preferiblemente varias veces después de la inmunización inicial.

[0073] Aunque se realizan continuamente las siguientes operaciones para obtener un anticuerpo monoclonal, la operación no se limita a las mismas, y un método de producción del propio anticuerpo monoclonal se conoce bien en la técnica y se usa ampliamente, de modo que los expertos en la técnica pueden producir fácilmente el anticuerpo monoclonal usado en el método de inmunoensayo de la presente invención usando el antígeno descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988), capítulo 6)).

[0075] Después de la inmunización final, puede producirse un hibridoma extrayendo células del bazo o de ganglios linfáticos, que son células productoras de anticuerpos, de un animal inmunizado y fusionando las células con una línea celular derivada de mieloma que tiene alta capacidad proliferativa. Se usan preferiblemente células que tienen una alta capacidad de producción de anticuerpos (cuantitativa y cualitativa) para la fusión celular, y la línea celular derivada de mieloma es preferiblemente compatible con el animal del que se derivan las células productoras de anticuerpos que van a fusionarse. La fusión celular puede realizarse de acuerdo con un método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede emplearse un método de polietilenglicol, un método que usa el virus Sendai o un método que utiliza corriente eléctrica. El hibridoma obtenido puede hacerse proliferar de acuerdo con condiciones ampliamente usadas en la industria. El hibridoma deseado puede seleccionarse mientras se confirma una propiedad de un anticuerpo producido. El hibridoma puede clonarse mediante un método bien conocido tal como un método de dilución limitante o de agar blando, por ejemplo.

[0077] El hibridoma puede seleccionarse de manera eficiente en la fase de selección teniendo en cuenta las condiciones en las que el anticuerpo producido se usa realmente en la medición. Por ejemplo, un anticuerpo obtenido inmunizando un animal se hace reaccionar con AIM libre inmovilizado sobre una fase sólida en presencia de un compuesto (AIM complejo) para el que se desea confirmar la reactividad cruzada, y la reactividad puede compararse con aquella en ausencia del compuesto (AIM complejo) para el que se desea confirmar la reactividad cruzada para seleccionar de manera más eficaz el hibridoma que produce un anticuerpo deseado. Alternativamente, un anticuerpo obtenido inmunizando un animal se hace reaccionar con AIM libre inmovilizado sobre una fase sólida en presencia de un componente derivado de muestra biológica, y la reactividad puede compararse con aquella en ausencia del componente derivado de muestra biológica para seleccionar de manera más eficaz el hibridoma que produce un anticuerpo deseado.

[0079] Después de una etapa de clonación, la capacidad de unión del anticuerpo producido a AIM libre puede someterse a ensayo usando un método tal como un método de ECL, un método de ELISA, un método de RIA y un método de anticuerpo fluorescente para confirmar si el hibridoma seleccionado produce un anticuerpo monoclonal que tiene una propiedad deseada.

[0081] Un anticuerpo monoclonal que tiene una propiedad deseada puede producirse mediante el cultivo en masa del hibridoma seleccionado tal como se describió anteriormente. Aunque un método de cultivo en masa no está particularmente limitado, los ejemplos del mismo pueden incluir un método de producción del anticuerpo monoclonal en medios de cultivo cultivando el hibridoma en medios de cultivo apropiados. Los ejemplos también pueden incluir un método de producción del anticuerpo en hidropesía abdominal inyectando el hibridoma en la cavidad abdominal de un mamífero para su proliferación. El anticuerpo monoclonal puede purificarse combinando adecuadamente los métodos para purificar un anticuerpo a partir del antisuero descrito anteriormente, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico de DEAE, cromatografía de afinidad, un método de fraccionamiento con sulfato de amonio, un método de fraccionamiento con PEG y un método de fraccionamiento con etanol.

[0083] El anticuerpo monoclonal usado en el método de inmunoensayo de la presente invención puede ser una molécula de anticuerpo completa, así como un fragmento de un anticuerpo que tiene una actividad de reacción antígenoanticuerpo. El anticuerpo puede obtenerse a través de una etapa de inmunización de un animal tal como se describió anteriormente u obtenerse mediante una técnica de recombinación génica o puede ser un anticuerpo quimérico. El fragmento del anticuerpo es preferiblemente un fragmento funcional, y ejemplos de los mismos incluyen F(ab')2 y Fab'. Estos fragmentos pueden producirse procesando el anticuerpo obtenido tal como se describió anteriormente con una enzima proteolítica (por ejemplo, pepsina o papaína).

[0085] El anticuerpo usado en el método de inmunoensayo de la presente invención puede usarse como anticuerpo inmovilizado (en fase sólida) inmovilizado en un portador insoluble o como anticuerpo marcado que está marcado con una sustancia de marcaje bien conocida por los expertos en la técnica que se describe más adelante. Por ejemplo, el anticuerpo inmovilizado puede producirse haciendo que un portador insoluble se adsorba físicamente o se una químicamente a un anticuerpo monoclonal (puede existir un espaciador adecuado entre ellos). El portador insoluble puede estar hecho de un material de base de polímero tal como una resina de poliestireno, un material de base inorgánico tal como vidrio y un material de base de polisacárido tal como celulosa y agarosa, y la forma del mismo no está particularmente limitada y puede seleccionarse de cualquier forma tal como una forma de placa (por ejemplo, microplaca y membrana), una forma de perla o partícula (por ejemplo, partículas de látex) y una forma tubular (por ejemplo, tubo de ensayo).

[0086] Mediante el uso de un anticuerpo marcado (anticuerpo secundario) que puede unirse al anticuerpo usado en el método de inmunoensayo de la presente invención, puede medirse una cantidad del anticuerpo unido a AIM libre, y de ese modo puede detectarse AIM libre en una muestra biológica. Los ejemplos de la sustancia de marcaje para producir el anticuerpo marcado incluyen enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, biotina, avidina, radioisótopos, partículas de oro coloidal o látex coloreado. Un método para unir la sustancia de marcaje y el anticuerpo puede ser un método tal como un método de glutaraldehído, un método de maleimida, un método de disulfuro de piridilo o un método de ácido peryódico, que pueden usar los expertos en la técnica, y los tipos de los anticuerpos inmovilizados y marcados y los métodos para producir los anticuerpos no se limitan a estos ejemplos. Por ejemplo, cuando se usa una enzima tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (ALP) como sustancia de marcaje, la actividad enzimática puede medirse usando un sustrato específico de la enzima (por ejemplo, O-fenilendiamina (OPD) o 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) cuando la enzima es HRP, fosfato de p-nitrofenilo en el caso de ALP). Cuando se usa biotina como sustancia de marcaje, al menos avidina o avidina modificada enzimáticamente se hace reaccionar normalmente con la misma.

[0087] En esta descripción, un "portador insoluble" puede representarse como una "fase sólida", y el soporte físico o químico de un antígeno o anticuerpo con un portador insoluble o el estado de soporte puede representarse como "inmovilizante", "inmovilizado" o "en fase sólida". El término "ensayo", "detección" o "medición" debe interpretarse en el sentido más amplio, incluyendo la prueba de existencia y/o la cuantificación de AIM libre y no debe interpretarse de una manera limitada en ningún sentido.

[0088] El método de inmunoensayo de la presente invención usa un anticuerpo que reacciona específicamente con al menos un AIM libre. Cuando se realiza un denominado ensayo de tipo sándwich en el que AIM libre que va a medirse se intercala entre dos anticuerpos que reconocen epítopos diferentes, uno de los anticuerpos puede ser un anticuerpo que reacciona específicamente con AIM libre, y el otro anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal anti-AIM; sin embargo, es preferible que ambos de los dos anticuerpos sean anticuerpos que reaccionan específicamente con AIM libre. Cuando se realiza un denominado ensayo de tipo sándwich en el que AIM libre que va a medirse se intercala entre dos anticuerpos que reconocen epítopos diferentes, los dos anticuerpos reconocen preferiblemente epítopos diferentes respectivos. Cuando se realiza el método de ECL o el método de ELISA, un anticuerpo que reacciona específicamente con AIM libre se usa preferiblemente como anticuerpo en fase sólida inmovilizado sobre la fase sólida.

[0089] Método de inmunoensayo

[0090] Los ejemplos del método de inmunoensayo de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (método de ECL), ELISA, inmunoensayo enzimático, un método de tinción inmunohistoquímica, un método de resonancia de plasmón superficial, inmunoensayo de aglutinación de látex, inmunoensayo de quimioluminiscencia, un método de anticuerpo fluorescente, radioinmunoensayo, un método de inmunoprecipitación, un método de inmunotransferencia de tipo Western, inmunocromatografía, el método de EATA (ensayo de transporte de analitos electrocinético) y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Mediante el uso de un anticuerpo marcado (anticuerpo secundario) que puede unirse al anticuerpo usado, puede medirse una cantidad del anticuerpo unido a AIM libre, y de ese modo puede medirse una cantidad de AIM libre en una muestra biológica. Los ejemplos de una sustancia de marcaje para producir el anticuerpo marcado incluyen enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias químicas luminiscentes, biotina, avidina, radioisótopos, partículas de oro coloidal o látex coloreado. Los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente un método de inmunoensayo dependiendo de un anticuerpo y una sustancia de marcaje usados.

[0091] El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (método de ECL) se usa preferiblemente como método de inmunoensayo. El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (método de ECL) significa un método de cálculo de una cantidad de un analito haciendo que una sustancia de marcaje emita luz mediante un estímulo electroquímico y detectando una cantidad de luminiscencia. En el inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (método de ECL), puede usarse un complejo de rutenio como sustancia de marcaje. La cantidad de luminiscencia de este complejo de rutenio puede detectarse disponiendo un electrodo en una fase sólida (microplaca o perlas, etc.) y provocando un estímulo electroquímico en el electrodo.

[0092] Aunque el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre puede usarse como anticuerpo en fase sólida o anticuerpo de detección, el inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (método de ECL) se realiza preferiblemente usando el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre como anticuerpo en fase sólida y el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida como anticuerpo de detección (anticuerpo marcado). Cuando se usa un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre como anticuerpo en fase sólida mientras que se usa un anticuerpo monoclonal anti-AIM como anticuerpo marcado, y se usan perlas y un complejo de rutenio como fase sólida y marcador, respectivamente, el principio de medición es el siguiente. Lo siguiente describe el principio de medición en una realización de la presente invención y no limita el alcance de la presente invención en absoluto.

[0093] 1. Cuando las perlas que tienen el anticuerpo que reacciona específicamente con AIM libre unido a las mismas se hacen reaccionar con una muestra, el AIM libre en la muestra se une al anticuerpo en fase sólida unido a las perlas.

[0094] 2. Después de lavar las perlas, se hace reaccionar un anticuerpo marcado con rutenio con el AIM libre unido a las perlas y se une en forma de sándwich.

[0095] 3. Después de lavar las perlas, cuando se aplica energía eléctrica sobre el electrodo, el complejo de rutenio emite luz dependiendo de una cantidad del anticuerpo marcado con rutenio unido a las perlas a través del AIM libre. Mediante la medición de esta cantidad de luminiscencia, puede medirse la cantidad de AIM libre en la muestra. También puede usarse un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida como anticuerpo marcado con rutenio.

[0096] Entre los inmunoensayos, también es preferible el método de ELISA que usa una etiqueta enzimática, ya que puede medirse fácil y rápidamente una diana. En el caso de ELISA de tipo sándwich, puede usarse un portador insoluble que tiene un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre inmovilizado en el mismo y un anticuerpo monoclonal anti-AIM marcado con una sustancia de marcaje y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo inmovilizado. En este caso, el portador insoluble es preferiblemente una placa (inmunoplaca), y la sustancia de marcaje puede seleccionarse y usarse apropiadamente.

[0097] Aunque el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre puede usarse como anticuerpo en fase sólida o anticuerpo de detección, el ELISA de tipo sándwich se realiza preferiblemente usando el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre como anticuerpo en fase sólida y el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida como anticuerpo de detección (anticuerpo marcado). El anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre inmovilizado en el portador insoluble captura el AIM libre en la muestra y forma un complejo de anticuerpo-AIM libre en el portador insoluble. El anticuerpo monoclonal anti-AIM marcado con la sustancia de marcaje se une al AIM libre capturado para formar un sándwich con el complejo de anticuerpo-AIM libre descrito anteriormente. El AIM libre en la muestra puede medirse midiendo una cantidad de la sustancia de marcaje mediante un método correspondiente a la sustancia de marcaje. Para métodos específicos, tales como un método para inmovilizar el anticuerpo en el portador insoluble y un método para unir el anticuerpo y la sustancia de marcaje, pueden usarse sin limitación los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0098] También puede usarse un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida como anticuerpo marcado.

[0099] Un método de inmunoaglutinación de látex (a continuación en el presente documento también denominado método de LTIA) es un inmunoensayo de aglutinación de partículas típico y también es preferible como método de inmunoensayo. En el método de LTIA, se usan partículas de látex que llevan un anticuerpo frente a un componente diana, y se detecta un grado de aglutinación (turbidez) de las partículas de látex provocado por la unión entre un antígeno que es el componente diana y las partículas de látex de soporte de anticuerpo que forman un complejo antígeno-anticuerpo por medios ópticos (por ejemplo, un método turbidimétrico para medir la luz transmitida, un método de turbidez para medir la luz dispersada), de modo que pueda analizarse el componente diana. En el método de inmunoensayo de la presente invención, se usan partículas de látex que llevan el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre, y puede detectarse por medios ópticos un grado de aglutinación de las partículas de látex causado por la unión entre AIM libre que es el componente diana y las partículas de látex de soporte de anticuerpo que forman un complejo antígeno-anticuerpo. Cuando se adopta el método de LTIA, pueden usarse dos o más anticuerpos monoclonales anti-AIM que se unen específicamente a AIM libre, o también puede usarse el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre y el anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar tanto con AIM libre como con AIM complejo.

[0100] También puede usarse el método de cromatografía de líquidos de alta resolución (método de HPLC) o el método de EATA (ensayo de transporte de analitos electrocinético) como método de inmunoensayo. El método de EATA puede realizarse usando µTAS Wako i30 fabricado por FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation.

[0101] Kit de ensayo para la cantidad de AIM libre

[0102] Un kit de ensayo para una cantidad de AIM libre de la presente invención incluye el anticuerpo monoclonal antiAIM que reacciona específicamente con AIM libre. El kit de ensayo de la presente invención también puede incluir otros reactivos de prueba, diluyentes de muestra y/o instrucciones de uso.

[0103] El kit de ensayo para una cantidad de AIM libre de la presente invención puede ser preferiblemente un kit de ensayo de AIM libre usando el método de ECL que incluye (1) y (2) a continuación:

[0104] (1) una fase sólida sobre la que se inmoviliza un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre; y

[0105] (2) un anticuerpo monoclonal anti-AIM marcado con una sustancia luminiscente electroquímica y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo inmovilizado.

[0106] Cuando se usa el método de ECL, el kit de ensayo de la presente invención incluye preferiblemente una fase sólida en la que se inmoviliza un anticuerpo que reacciona específicamente con AIM libre, y un anticuerpo monoclonal anti-AIM marcado con un material luminiscente electroquímico tal como un complejo de rutenio. Por ejemplo, en el kit que usa microperlas como fase sólida, se añade una muestra biológica y se hace reaccionar con las microperlas en las que el anticuerpo que reacciona específicamente con AIM libre está en fase sólida, y luego se retira y se lava la muestra. Posteriormente, se añade y se hace reaccionar un anticuerpo monoclonal anti-AIM marcado con un material luminiscente electroquímico y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo que reacciona específicamente con AIM libre. Después de lavar las microperlas, se aplica energía eléctrica para la luminiscencia, y puede medirse una cantidad de luminiscencia de la sustancia de marcaje para obtener una concentración de AIM libre.

[0107] También puede usarse un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida como anticuerpo monoclonal anti-AIM que va a marcarse con un material luminiscente electroquímico.

[0108] Cuando se usa el método de ELISA de tipo sándwich, el kit de ensayo puede ser un kit de ensayo de AIM libre que usa el método de ELISA de tipo sándwich que incluye al menos (1) y (2) a continuación:

[0109] (1) un portador insoluble en el que se inmoviliza un anticuerpo monoclonal anti-AIM (anticuerpo en fase sólida) que reacciona específicamente con AIM libre; y

[0110] (2) un anticuerpo monoclonal anti-AIM (anticuerpo marcado) que está marcado con una sustancia de marcaje y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida.

[0111] En tal kit, en primer lugar, se añade una muestra biológica al portador insoluble en el que se inmoviliza el anticuerpo en fase sólida, y luego se incuba, y la muestra se retira y se lava. El anticuerpo marcado se añade y luego se incuba, y se añade un sustrato para colorear. La concentración de AIM libre en la muestra biológica puede obtenerse midiendo la coloración con un lector de placas, etc.

[0112] También puede usarse un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre y que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida como anticuerpo marcado.

[0113] Cuando se usa el método de LTIA, el kit de ensayo puede ser un kit de ensayo de AIM libre que usa el método de LTIA que incluye al menos (1) y (2) a continuación:

[0114] (1) partículas de látex en las que se inmoviliza un anticuerpo (primer anticuerpo en fase sólida) que reacciona específicamente con AIM libre; y

[0115] (2) partículas de látex en las que se inmoviliza un anticuerpo monoclonal anti-AIM (segundo anticuerpo en fase sólida) que reconoce un epítopo diferente del anticuerpo en fase sólida.

[0116] En tal kit, el látex del primer anticuerpo en fase sólida y el látex del segundo anticuerpo en fase sólida se aglutinan a través de AIM libre. La concentración de AIM libre en la muestra biológica puede obtenerse detectando un grado de aglutinación mediante el uso de medios ópticos.

[0117] También puede usarse un anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona específicamente con AIM libre y que reconoce un epítopo diferente del primer anticuerpo en fase sólida como segundo anticuerpo en fase sólida. La presente invención se describirá específicamente a continuación en el presente documento con ejemplos; sin embargo, estos ejemplos no limitan el alcance de la presente invención. A menos que se describa lo contrario, % denota % en peso.

[0118] Ejemplo

[0119] Ejemplo 1: Producción de anticuerpos

[0120] 1. Producción de anticuerpo monoclonal de ratón anti-AIM humano

[0121] Los anticuerpos n.º 8, 11, 12 y 29 eran anticuerpos monoclonales de ratón anti-AIM humano y se obtuvieron mediante el siguiente procedimiento.

[0122] La emulsión se produjo mezclando rAIM humano de longitud completa (2 mg/ml) como antígeno con una cantidad igual de TiterMax Gold (G-1 Funakoshi). Se usaron dos ratones Balb/c hembra de 8 semanas de edad (Charles River Laboratories) como animales inmunizados, y se administraron 50 µl de una solución de antígeno a la planta de la pata trasera. Se realizó la misma administración 2 semanas después, y después de otras 2 semanas o más, se administraron 50 µg de la solución de antígeno a la planta de la pata trasera para prepararse para la fusión celular realizada 3 días después.

[0123] Se usó P3U1 de ratón para células de mieloma, y se obtuvo un medio usado para cultivo de crecimiento añadiendo glutamina y ácido pirúvico a RPMI1640 (11875-119 GIBCO) y añadiendo FBS (S1560 BWT) al 10 %. Se añadieron penicilina y estreptomicina como antibióticos en cantidades apropiadas.

[0124] Se extrajeron ganglios linfáticos poplíteos asépticamente de los ratones después de recoger sangre cardíaca bajo anestesia y se colocaron en un vaso de precipitados con una malla #200 y se prensaron con una varilla de silicio para preparar una suspensión celular. Las células se lavaron por centrifugación dos veces en RPMI 1640 y luego se contó el número de células. Se recogieron células de mieloma en la fase de crecimiento logarítmico por centrifugación, se lavaron y luego se ajustaron de modo que la relación de linfocitos con respecto a células de mieloma fuera de 5:1, y se realizó la centrifugación de mezclado. La fusión celular se realizó usando PEG1500 (783641 Roche). Específicamente, después de que se hiciera reaccionar un sedimento celular con 1 ml de disolución de PEG durante 3 minutos, se diluyera después en fases y se lavara mediante centrifugación, se añadió un medio y se colocaron 200 µl en cada una de 15 placas de 96 pocillos durante 1 semana de cultivo. Para el medio, se añadió un suplemento HAT (21060-017 GIBCO) a un medio para células de mieloma para ajustar la concentración de FBS al 15 %.

[0125] Después de descongelar las células crioconservadas y realizar el cultivo de proliferación, se administraron 1×10<7>células a la cavidad abdominal de un ratón desnudo (BALB/cAJcl-nu/nu Nippon Claire) al que se le administraron 0,5 ml de pristano (42-002 Cosmo Bio) por vía intraperitoneal 1 semana o más antes, y después de aproximadamente 2 semanas, se obtuvieron de 4 a 12 ml de ascitis. Después de eliminar una materia sólida por centrifugación, la ascitis se crioconservó. Posteriormente, los anticuerpos se purificaron a partir de la ascitis crioconservada para obtener los anticuerpos n.º 8, 11, 12 y 29.

[0126] Ejemplo 2: Cribado de anticuerpos que se unen específicamente a AIM libre

[0127] 1. Producción de perlas magnéticas unidas a anticuerpos

[0128] 1) Se midió la absorbancia del anticuerpo n.º 8 dializado con tampón de fosfato de potasio 150 mM (pH 7,8) y se ajustó a Abs 0,5 usando la misma solución tampón para producir una solución de anticuerpo.

[0129] 2) Con la solución tampón, se lavó 1 ml de Dynabeads M-450 Epoxy (30 mg/ml) fabricadas por Dynamic Biotech 3 veces y se añadió 1 ml de la solución de anticuerpo producida en 1). Se realizó agitación giratoria a 25 °C durante 18 horas o más.

[0130] 3) Las perlas preparadas en 2) se lavaron dos veces con un tampón de bloqueo de perlas [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 0,1 % (libre de ácidos grasos), NaN<3>al 0,09 %, pH 7,8]. El anticuerpo restante en la solución y no unido a las perlas se retiró retirando la solución tampón mediante lavado. Posteriormente, se añadió 1 ml del tampón de bloqueo de perlas y se agitó, y se realizó agitación giratoria a 25 °C durante 18 horas o más.

[0131] 4) Después de lavar las perlas dos veces con el tampón de bloqueo de perlas, se añadió 1 ml del tampón de bloqueo de perlas y se agitó. Estas se usaron como perlas magnéticas unidas al anticuerpo n.º 8.

[0132] 5) Los procedimientos 1) a 4) se repitieron para los anticuerpos n.º 11, 12 y 29 para obtener perlas magnéticas unidas al anticuerpo n.º 11, perlas magnéticas unidas al anticuerpo n.º 12 y perlas magnéticas unidas al anticuerpo n.º 29. Estos cuatro tipos de perlas magnéticas unidas a anticuerpos se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

[0133] 2. Producción de anticuerpo marcado con rutenio

[0134] 1) A 312,5 µl de una solución de anticuerpo n.º 8 dializada con tampón fosfato de potasio 150 mM (pH 7,8), se le añadieron 14,1 µl de complejo de rutenio 10 mg/ml (Origin Tag-NHS ESTER fabricado por IGEN), y la solución se agitó durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron 50 µl de glicina 2 M, y la disolución se agitó durante 20 minutos.

[0135] 2) Se aplicó un anticuerpo marcado con complejo de rutenio producido en 1) a la cromatografía en columna de filtración en gel (Sephadex G-25 fabricado por GE Healthcare Bioscience) empaquetada en un tubo de vidrio con un diámetro de 1 cm y una altura de 30 cm para aislar y purificar un complejo de rutenio no marcado y un anticuerpo n.º 8 marcado con complejo de rutenio. La elución se realizó con tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 6,0). 3) Los procedimientos 1) y 2) se repitieron para los anticuerpos n.º 11, 12 y 29 para obtener un anticuerpo n.º 11 marcado con complejo de rutenio, un anticuerpo n.º 12 marcado con complejo de rutenio y un anticuerpo n.º 29 marcado con complejo de rutenio.

[0136] 3. Cribado de anticuerpos que se unen específicamente a AIM libre

[0137] 1) A partir de suero de paciente con NASH-HCC, se recogieron 10 µl de una muestra y se añadieron a 200 µl de una solución de reacción [HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, Tween 20 al 0,05 %, EDT-4Na 1 mM, BSA al 0,5 %, NaN<3>al 0,09 %, IgG de ratón 100 µg/ml, pH 7,8].

[0138] 2) A la solución, se le añadieron 25 µl de las perlas magnéticas unidas al anticuerpo n.º 11 diluidas hasta una concentración de 0,5 mg/ml con un diluyente de perlas [HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,1 %, EDT-4Na 1 mM, BSA al 0,5 %, NaN<3>al 0,09 %, pH 7,8] y se hizo reaccionar a 30 °C durante 9 minutos (primera reacción). Posteriormente, las perlas magnéticas se atraparon con un imán, se extrajo el líquido en el tubo de reacción y las perlas magnéticas se lavaron dos veces con 350 µl de líquido de lavado [Tris HCl 50 mmol/l, Tween 20 al 0,01 % (p/v), NaCl 0,15 mol/l, pH 7,5] para eliminar las sustancias de unión no específica distintas de la reacción antígenoanticuerpo (separación de BF).

[0139] 3) Posteriormente, se añadieron 200 µl del anticuerpo n.º 12 marcado con rutenio diluido con una solución diluida para rutenio [HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, Tween 20 al 0,05 %, EDT-4Na 1 mM, BSA al 0,5 %, NaN<3>al 0,09 %, IgG de ratón 100 µg/ml, pH 7,8] hasta una concentración de 0,6 µg/ml y se hizo reaccionar a 30 °C durante 9 minutos (segunda reacción).

[0140] Las perlas magnéticas, después de la reacción, se atraparon con un imán, se extrajo el líquido en el tubo de reacción y las perlas magnéticas se lavaron dos veces con 350 µl del líquido de lavado para eliminar las sustancias de unión no específica distintas de la reacción antígeno-anticuerpo (separación de BF).

[0141] 4) Posteriormente, se colocaron 300 µl de tripropilamina en el tubo de reacción y se mezclaron con las perlas magnéticas. Al aplicar energía eléctrica en este estado, el complejo de rutenio emitía luz y la intensidad de emisión la detectaba un detector.

[0142] Después de la operación de añadir las perlas magnéticas al tubo de reacción, esto se realizó en una máquina automática de medición de luminiscencia de complejo de rutenio, Picolumi III.

[0143] La operación descrita anteriormente se realizó en un total de 16 combinaciones de anticuerpos (4 tipos de perlas magnéticas unidas a anticuerpos × 4 tipos de anticuerpos marcados con rutenio) para verificar una cantidad de IgM-AIM incluida en la medición en los sistemas de medición.

[0144] Los resultados se muestran en las figuras 1(A) a 1(H). Se encontró que puede analizarse específicamente AIM libre cuando se usó el anticuerpo n.º 12 para las perlas magnéticas unidas al anticuerpo o el anticuerpo marcado con rutenio.

[0145] Cuando no se usó el anticuerpo n.º 12 para las perlas magnéticas unidas al anticuerpo o el anticuerpo marcado con rutenio, se incluyó IgM-AIM en la medición en los sistemas de medición (solo se muestran 4 sistemas de medición como figuras 1(E) a 1(H) y el resto no se muestra). Por tanto, el anticuerpo n.º 12 se demostró como un anticuerpo específico de AIM libre.

[0146] Ejemplo 3: Análisis de epítopos

[0147] 1. Análisis de epítopos mediante el método de ELISA

[0148] El método ELISA se realizó usando AIM libre (SRCR1+2+3) y SRCR1+2 de AIM (péptido compuesto por los dominios SRCR1 y SRCR2) como antígenos y usando los anticuerpos n.º 8, 11, 12 y 29 como anticuerpos monoclonales anti-AIM para analizar los epítopos de los anticuerpos n.º 8, 11, 12 y 29. Los fragmentos de AIM humano usados en el experimento se obtuvieron solicitando a Takara Bio Inc. que los produjera.

[0149] El AIM libre y el SRCR1+2 de AIM (péptido compuesto por el dominio SRCR1 dominio SRCR2) se inmovilizaron en una placa y se añadieron los anticuerpos n.º 8, 11, 12 y 29. Después del lavado, se hizo reaccionar un anticuerpo monoclonal anti-IgG de ratón marcado con HRP y se coloreó con un sustrato de HRP. Los resultados se muestran en las tablas 1 y 2.

[0150] Tabla 1

[0152]

[0154] Tabla 2

[0157]

[0159] La tabla 1 muestra los valores de medición de ELISA, y la tabla 2 muestra la reactividad de los anticuerpos frente a los antígenos en función de los valores de medición de ELISA. "+" indica que es reactivo y "-" indica que no es reactivo.

[0160] Los anticuerpos n.º 8, 11 y 29 no reaccionaron con el péptido compuesto por los dominios SRCR1 y SRCR2 y reaccionaron con AIM libre. El anticuerpo n.º 12 reaccionó tanto con AIM libre como con el péptido compuesto por los dominios SRCR1 y SRCR2.

[0161] Por lo tanto, se encontró a partir del resultado de ELISA que el anticuerpo n.º 12 reconoce el dominio SRCR1 o el dominio SRCR2 como epítopo y que los anticuerpos n.º 8, 11 y 29 reconocen el dominio SRCR3 como epítopo.

[0162] 2. Análisis de epítopos mediante inmunotransferencia de tipo Western

[0163] Se realizó inmunotransferencia de tipo Western usando el péptido compuesto por el dominio SRCR1 de AIM ("1" en la figura 2), el péptido compuesto por el dominio SRCR2 de AIM ("2" en la figura 2), el péptido compuesto por los dominios SRCR2 y SRCR3 de AIM ("23" en la figura 2) y AIM humano ("hAIM" en la figura 2) como antígenos y usando los anticuerpos n.º 11 y 12 como anticuerpos monoclonales anti-AIM para analizar los epítopos de los anticuerpos n.º 11 y 12. Cada uno de los antígenos se mezcló con tampón de muestra y se separó mediante el método de SDS-PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon, Millipore), y se realizó una reacción de anticuerpo primario con los anticuerpos n.º 11 y 12 a 4 °C durante la noche. Se usó un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP como anticuerpo secundario, se usó sustrato de HRP Luminata Forest Western (Millipore) como reactivo de detección, y las señales se detectaron mediante Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare). Los resultados se muestran en la figura 2.

[0164] Dado que el anticuerpo n.º 12 reaccionó con hAIM (SRCR1 2+3), el péptido compuesto por los dominios SRCR2 y SRCR3 y el péptido compuesto por SRCR2, se consideró que el epítopo del anticuerpo n.º 12 era SRCR2. El anticuerpo n.º 12 no reaccionó con SRCR1.

[0165] Por otro lado, el anticuerpo n.º 11 reaccionó con hAIM (SRCR1+2+3) y el péptido compuesto por SRCR2 y SRCR3 y, por lo tanto, se descubrió que era un anticuerpo que reaccionaba con SRCR3. El anticuerpo n.º 11 no reaccionó ni con el péptido compuesto por SRCR1 ni con el péptido compuesto por SRCR2.

[0166] A partir de lo anterior, se reveló que el anticuerpo n.º 12 reconoce el dominio SRCR2 como epítopo y el anticuerpo n.º 11 reconoce el dominio SRCR3 como epítopo. Los SRCR usados en el experimento se obtuvieron usando células HEK293, y cuando se usaron células HEK293, se obtiene una proteína en un estado cercano a la estructura en el cuerpo vivo y, por lo tanto, el anticuerpo n.º 12 se consideró que era un anticuerpo que reconoce la estructura tridimensional en el dominio SRCR2.

[0167] Por tanto, se reveló que, mediante el cribado de un anticuerpo monoclonal que reconoce el dominio SRCR2 como epítopo, puede obtenerse el anticuerpo monoclonal anti-AIM que reacciona con AIM libre sin reaccionar con AIM complejo.

[0168] Aplicabilidad industrial

[0169] Según la presente invención, puede detectarse específicamente AIM libre solo en una muestra biológica que contiene AIM complejo y AIM libre.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Método de inmunoensayo para AIM libre en una muestra biológica que comprende:

usar un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo, en donde el anticuerpo monoclonal anti-AIM es un anticuerpo que se une a un epítopo en un dominio SRCR2 de AIM humano, en donde el epítopo tiene una estructura tridimensional, en donde "AIM libre" significa AIM que existe en un estado libre sin estar unido a otras sustancias y en donde el dominio SRCR2 de AIM humano está representado por SEQ ID NO: 3.

2. Método de inmunoensayo según la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es una muestra de fluido corporal.

3. Método de inmunoensayo según la reivindicación 2, en donde la muestra de fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma, sangre y orina.

4. Método de inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se usa además un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar tanto con AIM libre como con AIM complejo.

5. Anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar con AIM libre y no reaccionar con AIM complejo, en donde el anticuerpo monoclonal se une a un epítopo en el dominio SRCR2 de AIM, en donde el epítopo tiene una estructura tridimensional, en donde "AIM libre" significa AIM que existe en un estado libre sin estar unido a otras sustancias y en donde el dominio SRCR2 de AIM humano está representado por SEQ ID NO: 3.

6. Kit de ensayo para AIM libre en una muestra biológica que comprende el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5.

7. Kit de ensayo para AIM libre según la reivindicación 6, que comprende además un anticuerpo monoclonal anti-AIM que tiene la propiedad de reaccionar tanto con AIM libre como con AIM complejo.