ES3054432T3 - Origami-fingerprinting based diagnostics - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un biosensor de origami de ADN capaz de detectar al menos dos oligonucleótidos diana diferentes al mismo tiempo, comprendiendo dicho biosensor al menos una bisagra de origami de ADN y al menos dos sitios de detección, en donde cada sitio de detección comprende una matriz emisora de señales, al menos un bloqueo y al menos una sección móvil, en donde las secciones móviles de los sitios de detección están conectadas entre sí o a una estructura de origami de ADN común a través de la al menos una bisagra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Diagnósticos basados en huellas dactilares de origami

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se dirige a biosensores basados en origami de ADN capaces de detectar oligonucleótidos diana. Antecedentes

[0005] Los ácidos nucleicos asociados al cáncer, que incluyen fragmentos de ADN derivados de tumores, libres de células circulantes (ADNct) que portan alteraciones de secuencia específicas de tumores o microARN circulantes (miARN), se consideran cada vez más como biomarcadores de cáncer potenciales para su uso en estrategias de diagnóstico y monitoreo de enfermedades de cáncer en estadios iniciales no invasivas. Estos ácidos nucleicos están presentes en baja abundancia en la sangre de pacientes con cáncer y sus concentraciones y perfiles son significativamente diferentes en comparación con los de individuos sanos, lo que los convierte en biomarcadores tumorales ideales. Actualmente, el ADNct y los miARN se detectan típicamente mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), secuenciación de próxima generación (NGS) o técnicas de hibridación de micromatrices. Independientemente de su enorme avance analítico, estos métodos tienen algunas limitaciones. Más típicamente, son complejos, implican múltiples etapas, exigen instrumentación costosa y requieren mucho tiempo. Además, los métodos basados en la hibridación de oligonucleótidos directa pueden verse obstaculizados por la dificultad de discriminar fragmentos de ADNct que difieren solo por mutaciones únicas (puntuales). Este también es el caso de los miARN altamente homólogos que difieren por solo una base única, lo que hace que sea igualmente difícil discriminar entre los diferentes miembros de la familia.

[0006] Es importante señalar que la detección de múltiples moléculas biológicas en condiciones complejas se vuelve cada vez más frecuente para el diagnóstico y el monitoreo tempranos. Por lo tanto, existe una necesidad creciente y no satisfecha de enfoques y herramientas más eficientes para detectar ácidos nucleicos asociados al cáncer con alta sensibilidad, especificidad de secuencia y alto rendimiento para su uso en rutinas clínicas y médicas. Estos hechos conducen a una creciente demanda de dispositivos de diagnóstico de atención primaria a escala nanométrica que sean fáciles de usar y alternativas rentables a dispositivos de diagnóstico costosos, pero también altamente sensibles y específicos.

[0007] La nanotecnología del ADN, especialmente el origami de ADN, permite la generación de estructuras a escala nanométrica con geometrías y modalidades funcionales definidas con precisión que pueden diseñarse en dispositivos analíticos de alto rendimiento, rápidos y altamente específicos con sensibilidad a molécula única para aplicaciones biomédicas. Es importante destacar que el origami de ADN permite la ingeniería de estructuras "dinámicas", cuya función depende de los cambios conformacionales inducidos por estímulos externos tales como reacciones de desplazamiento de hebras basadas en ADN. Por lo tanto, los cambios conformacionales pueden generar una señal medible que puede aprovecharse para detectar los estímulos externos. La señal medible puede detectarse mediante técnicas ópticas y electroquímicas. En caso de detección óptica, las estructuras de origami de ADN pueden funcionalizarse con fluoróforos.

[0008] Una característica intrínseca del autoensamble del ADN es la capacidad de generar una disposición tridimensional precisa y predeterminada de redes de fluoróforos para producir señales ópticas fuertes. Esta disposición precisa de múltiples fluoróforos puede usarse para crear transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y/o redes de inactivación. Estas redes fotónicas de ADN basadas en FRET son especialmente relevantes para aplicaciones de detección múltiple. Andersen y otros informaron una de las primeras estructuras de origami de ADN creadas para detectar oligonucleótidos pequeños (ARN viral o miARN). (E. S. Andersen, M. Dong, y otros, Nature, 2009, 459, 73-76). Con los avances en el campo de la nanotecnología, en particular, el desarrollo del método de origami de ADN, se generaron estructuras más complejas y avanzadas que fueron capaces de detectar concentraciones bajas de ácidos nucleicos. El documento WO 2022/072850 A1 describe un biosensor de origami de ADN, que comprende una bisagra de origami de ADN (que es una hebra de andamio) y hebras de unión y hebras de unión colgante. Incluye un cierre con cremallera (cerradura) que consiste en una hebra de cierre y las grapas, la hebra de cierre tiene un dominio de anclaje. Cuando la diana se une al dominio de anclaje y desplaza las hebras de sujeción de grapas del resto de la hebra de cierre, la bisagra está en una configuración abierta. Cada uno de los brazos de la bisagra puede ser una estructura multicapa, y las hebras de grapa pueden unirse a reporteros de fluorescencia, que se activan en dependencia de la unión de la diana y la apertura asociada de la cerradura.

[0009] Sin embargo, las estructuras descritas anteriormente solo son capaces de detectar un tipo de ácidos nucleicos. Dada la multitud de ácidos nucleicos que deben detectarse, existe por lo tanto la necesidad de estructuras de origami de ADN capaces de detectar la presencia de diferentes ácidos nucleicos al mismo tiempo.

[0010] Resumen

[0011] En un aspecto, la invención se dirige a un biosensor de origami de ADN capaz de detectar al menos dos oligonucleótidos diana diferentes al mismo tiempo, dicho biosensor que comprende al menos una bisagra de origami de ADN y al menos dos sitios de detección, en donde cada sitio de detección comprende

[0012] • una matriz de emisión de señales,

[0013] • al menos una cerradura que comprende un primer y un segundo dominio de sujeción y un dominio de anclaje unido al primer o segundo dominio de sujeción, en donde el primer y el segundo dominio de sujeción son capaces de formar un híbrido entre sí y en donde el primer o segundo dominio de sujeción es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana a través del dominio de anclaje, en donde la cerradura es capaz de asumir una configuración abierta o cerrada, en donde la cerradura asume la configuración abierta tras la hibridación del oligonucleótido diana y la configuración cerrada en ausencia del oligonucleótido diana,

[0014] • al menos una sección móvil, en donde la sección móvil se conecta a la al menos una bisagra y se puede mover a través de dicha bisagra y en donde la posición de la sección móvil depende de la configuración de la cerradura, en donde las secciones móviles de los sitios de detección se conectan entre sí o a una estructura de origami de ADN común a través de la al menos una bisagra.

[0015] En otro aspecto, la invención se dirige a un método para detectar al menos dos oligonucleótidos diana en una muestra, el método que comprende

[0016] a) poner en contacto un biosensor de acuerdo con la invención con la muestra.

[0017] En un tercer aspecto, la invención se dirige a un biosensor para su uso en el diagnóstico de una enfermedad, en particular una enfermedad asociada con la alteración de la expresión de miARN, así como también a los métodos de diagnóstico de tales enfermedades.

[0018] Breve descripción de las figuras

[0019] La Figura 1 muestra la caracterización del biosensor de libros de origami de ADN de acuerdo con una modalidad de la presente invención. (a) Representación de las dimensiones del biosensor de libros en su estado cerrado. (b) Vista superior del biosensor de libros con 4 cerraduras a cada lado. (c) Vista lateral del biosensor FRET en el estado abierto. Las esferas representan las matrices de fluoróforos donantes y aceptores. En total, se colocaron 20 pares de FRET a cada lado. (d) Vista lateral del biosensor inactivador en estado abierto. Las esferas representan las matrices de grupos donantes e inactivadores. En total, se colocaron 20 pares de fluoróforo/inactivador en cada lado. Los números (1-4) representan las posiciones de las columnas dentro de la estructura de origami de ADN. Micrografías electrónicas de estructuras de origami de ADN ensambladas en la conformación cerrada (e) y la conformación abierta (f) a 12 mM Mg<2+>(barras de escala 50 nm). Las flechas muestran la abertura de la capa superior en los lados de las estructuras.

[0020] La Figura 2 muestra la determinación de la eficiencia de FRET del biosensor de libro de origami de ADN mediante el uso de espectroscopía de fluorescencia. (a) Cálculos de la distancia relativa entre pares de FRET en un ángulo teórico de apertura de la estructura. (b) Caracterización de espectroscopía de fluorescencia del rendimiento de FRET de columnas individuales dentro de la estructura. (c) Caracterización espectroscópica de la apertura de biosensores de libro de origami de ADN con 5 pares de FRET. (d) Espectros de fluorescencia excitada de donantes de aceptor en estados cerrado y abierto de biosensores de libro de origami de ADN con 5 pares de FRET.

[0021] La Figura 3 muestra el límite de detección del libro de origami de ADN con 3 columnas (1-3) a cada lado en un solo nivel de origami de ADN. (a) Apertura en el lado izquierdo del libro de origami de ADN tras la adición de ODN-153. (b) Apertura en el lado derecho del libro de origami de ADN tras la adición de ODN-342. Los histogramas de gris oscuro y gris claro representan la distribución de la eficiencia de FRET antes (0 min) y después (6 min) de la adición de ODN diana y no diana (control) a diferentes concentraciones.

[0022] La Figura 4 muestra el límite de detección del libro de origami de ADN con 2 columnas (1-2) de pares de coloranteinactivador a cada lado a un nivel de dispositivo de origami de ADN. (a) Apertura en el lado izquierdo del libro de origami de ADN tras la adición de ODN-153. (b) Apertura en el lado derecho del libro de origami de ADN tras la adición de ODN-342. Los histogramas de color gris oscuro representan el aumento de la intensidad de fluorescencia después de la adición del diana de interés debido a la apertura de la estructura. Un histograma de color gris claro representa la intensidad de fluorescencia en el estado cerrado.

[0023] La Figura 5 muestra la detección simultánea de miR-21 y let-7a mediante el uso del biosensor de libro con 2 columnas (1-2) de pares de colorante-inactivador a cada lado. Izquierda: Detección de miR-21 a concentraciones de 10 nM y 10 pM. Derecha: Detección de let-7a a concentraciones de 10 nM y 10 pM. Arriba y medio: Detección de miR-21 y let-7a sintéticos. Parte inferior: Detección de miR-21 y let-7a a partir del extracto de células MCF-7. Los histogramas de color gris oscuro representan el aumento de la intensidad de fluorescencia después de la adición del diana de interés debido a la apertura de la estructura. Un histograma de color gris claro representa la intensidad de fluorescencia en el estado cerrado.

[0024] La Figura 6 muestra el enrutamiento del andamio y el diseño de la grapa en una representación bidimensional. Los gráficos y las secuencias se generaron mediante el uso del paquete de software caDNAno.

[0025] La Figura 7 muestra el mapa de un biosensor de libro de origami de ADN que muestra la distancia entre los fluoróforos o inactivadores posicionados.

[0026] La Figura 8 muestra imágenes TEM de biosensores de libros de origami de ADN. Las estructuras se autoensamblaron a 12 mM Mg<2+>y purificado a 8 mM Mg<2+>y se visualizó mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM) depositándolos en las rejillas EM recubiertas de carbono (barras de escala: 100 nm). La Figura 9 muestra la visualización del biosensor del libro de origami de ADN mediante el uso de la microscopía de fuerza atómica (AFM). Las estructuras se ensamblaron con Mg 12 mM<2+>en la conformación cerrada y se absorbieron en la superficie de mica. Las mediciones de AFM se realizaron en modo de contacto con AFM NT-MDT (NTEGRA II).

[0027] La Figura 10 muestra un análisis de gel de agarosa de biosensores de libros de origami de ADN. La presencia de Mg<2+>es necesaria para proteger la cadena principal de fosfato de ADN cargada negativamente, para la formación de hélices dobles de ADN durante el proceso de autoensamble de la estructura de origami de ADN. Para determinar la concentración de Mg<2+>para el autoensamble del biosensor de libros, las estructuras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las estructuras ensambladas se ejecutaron en gel de agarosa al 1,5 % a 70 V junto con una escalera de 1 kb (1), una hebra de andamio p8064 de una sola hebra (2) y una mezcla de grapas (3). Análisis de electroforesis en gel de las estructuras autoensambladas con diferentes concentraciones de Mg<2+>(4: 16 mM Mg<2+>, 5: 12 mM Mg<2+>, 6: 8 mM Mg<2+>, 7: 4 mM Mg<2+>, 8: 2 mM Mg<2+>, 9: 1 mM Mg<2+>). La concentración de Mg<2+>óptima para formar la estructura sin fluoróforo incorporado fue mayor que 8 mM Mg<2+>(Figura 10a). La Figura 10b demuestra el análisis de electroforesis en gel de las estructuras autoensambladas en el estado cerrado (sin fluoróforos) a 12 mM Mg<2+>y purificado a 8 mM Mg<2+>sin (3) o con la adición de oligonucleótidos diana (4: ODN-153, 5: ODN-153+ODN-342 y 6: ODN-342). La imagen del gel muestra las diferencias en la movilidad de las estructuras entre los estados abiertos o cerrados.

[0028] La Figura 11 muestra un estudio de estructura única de la incorporación de los fluoróforos dentro del biosensor de libros de origami de ADN mediante el uso de microscopía de fluorescencia de campo amplio. Para probar la incorporación de los colorantes y medir la señal de fluorescencia generada por las estructuras de libros de origami de ADN, las estructuras se funcionalizaron con biotina para permitir su inmovilización sobre cubiertas, cubiertas con albúmina sérica bovina biotinilada (BSA) y neutravidina. Para determinar si la incorporación de oligonucleótidos marcados dentro de la estructura es eficiente, primero analizamos la estructura del libro de origami de ADN con 1 columna (5 Cy3 o Cy5), 2 columnas (10 Cy3 o Cy5) y 4 columnas (20 Cy3 o Cy5). Se obtuvieron imágenes de las estructuras y se comparó la intensidad media de cada estructura. El aumento en el número de fluoróforos incorporados dentro de la estructura dio como resultado un aumento lineal de la intensidad de fluorescencia media en ausencia de autoinactivación.

[0029] La Figura 12 muestra el análisis de espectroscopia de fluorescencia de la eficiencia de FRET. Para determinar la concentración de Mg<2+>óptima durante las etapas de autoensamble y purificación que dan la diferencia de señal máxima entre los estados abiertos y cerrados, aplicamos el mecanismo de detección basado en FRET mediante el marcaje de oligonucleótidos con fluoróforos Cy3 y Cy5 mediante el uso de la enzima terminal transferasa (TdT) e incorporándolos en la estructura de origami de ADN. Se realizó un análisis FRET de ensamble de los biosensores de libros de origami de ADN mediante el uso de espectroscopía de fluorescencia. La eficiencia de FRET de estructuras autoensambladas abiertas y cerradas con 5 pares de FRET a diferentes concentraciones de Mg<2+>(4-16 mM Mg<2+>) se muestra en la Figura 12a. Los resultados indicaron la señal óptima y la diferencia máxima entre los estados abiertos y cerrados (24 %) observada cuando la estructura se pliega en presencia de 14 mM Mg<2+>. Después de definir la concentración de sal óptima durante el autoensamble que da la diferencia de señal máxima, se determinó la concentración de Mg<2+>óptima para la purificación. Todas las estructuras se ensamblaron a 14 mM Mg<2+>en los estados abiertos y cerrados y se purificaron en presencia de Mg<2+>en el intervalo de 4 mM a 14 mM (Figura 12b). La concentración de purificación óptima se definió como 10 mM, ya que dio la diferencia de FRET máxima entre los estados abiertos y cerrados del dispositivo (25 %). Se usan concentraciones más altas de sal durante el autoensamble para disminuir la repulsión entre las hélices de ADN, lo que facilita mantener el sensor de origami de ADN en el estado cerrado. Por otro lado, la menor concentración de sal usada en la etapa de purificación aumenta la repulsión entre las hélices de ADN, lo que permite la apertura de la estructura tras la unión del ligando. También probamos si un mayor número de fluoróforos incorporados dentro de la estructura requiere más Mg<2+>. La estructura de origami de ADN con 4 columnas (20 fluoróforos) se ensambló en estados abiertos y cerrados en el intervalo de 12 a 22 mM Mg<2+>y la señal óptima se encontró a 16-18 mM Mg<2+>(Figura 12c), mientras que la etapa de purificación fue óptima en el intervalo de 10-12 mM Mg<2+>(Figura 12d).

[0030] La Figura 13 muestra un análisis de estructura única del biosensor del libro de origami de ADN. Las imágenes de fluorescencia se registraron 6 min después de la adición de la diana. (a) Una imagen representativa del método de detección basado en FRET. La imagen muestra los perfiles de emisión de sensores de libros de origami de ADN individuales después de la excitación del donante a 532 nm; el círculo gris claro y el círculo gris oscuro representan las emisiones de Cy3 y Cy5 para el mismo biosensor de libros de origami de ADN, respectivamente. (b) Una imagen representativa del método de detección basado en la inactivación (Cy3+bh2). Muestra la emisión después de la excitación a 532 nm; el círculo gris claro representa una estructura de origami de ADN única. (c) Una imagen representativa del método de detección basado en la inactivación (Cy5+bbq650). Muestra la emisión después de la excitación a 640 nm; el círculo gris oscuro representa una estructura de origami de ADN única.

[0031] La Figura 14 muestra el efecto de la cantidad y la posición de las cerraduras dentro del biosensor de libros de origami de ADN sobre la eficiencia de FRET mediante el uso de microscopía de fluorescencia de campo amplio. Representación esquemática del posicionamiento de cerraduras dentro del biosensor de libros de origami de ADN. Se ensamblaron cuatro estructuras diferentes con 15 pares de FRET con diferentes combinaciones de cerraduras: (a) combinación de las cuatro cerraduras, (b) con 3 cerraduras (1, 3 y 4), (c) 2 cerraduras en los bordes (1 y 4) y (d) 2 cerraduras en el medio (2 y 3). La detección de 100 pM de ADN diana, ODN-153 se realizó mediante el uso de estas estructuras. Los resultados se representaron en histogramas donde el gris oscuro y el gris claro representan la distribución de la eficiencia de FRET antes (0 min) y después (6 min) de la adición de ADN diana. La Figura 15 muestra un estudio de estructura única del límite de detección para la multidetección de dianas de ADN. El límite de detección del biosensor de libro con 10 pares de inactivación a ambos lados y con la adición de 2 dianas de ADN al mismo tiempo. Izquierda: Apertura en el lado izquierdo del libro de origami de ADN tras la adición de ODN-153. Derecha: Apertura en el lado derecho del libro de origami de ADN tras la adición de ODN-342. Los histogramas de color gris oscuro representan el aumento de la intensidad de fluorescencia después de la adición del diana de interés debido a la apertura de la estructura. Un histograma de color gris claro representa la intensidad de fluorescencia en el estado cerrado.

[0032] La Figura 16 muestra el marcaje de la transferasa terminal (TdT) de oligonucleótidos con Cy3 y Cy5. Cinco oligonucleótidos de cada columna se marcaron con ddUTP conjugado con Cy3 o Cy5 mediante el uso de la enzima TdT. La eficiencia del marcaje se analizó mediante el uso de HPLC. Los resultados mostraron que el marcaje de oligonucleótidos con Cy3 o Cy5 fue eficiente con un rendimiento aproximado del 93 %.

[0033] La Figura 17 muestra la estructura del puente. Consiste en tres capas donde la capa superior se conecta a la capa media con bisagras en ambos extremos para permitir la apertura de la capa superior desde el centro. Esto da como resultado una mayor flexibilidad y capacidad para separar las hélices como dedos para poder detectar cuatro biomarcadores diferentes.

[0034] La Figura 18 muestra la estructura M. Consiste en una capa de hélices de ADN que se asemeja a una lámina de papel doblada. Para los tres diseños, las cerraduras basadas en hibridación en ambos lados mantienen constitutivamente todas las capas en un estado cerrado. La presencia del miARN diana promueve la apertura de las capas mediante hibridación por desplazamiento, lo que da como resultado el cambio de la señal FRET del fluoróforo o el aumento de la señal de fluorescencia mediante la liberación de la inactivación.

[0035] Descripción detallada

[0036] En una modalidad, la invención se dirige a un biosensor de origami de ADN capaz de detectar al menos dos oligonucleótidos diana diferentes al mismo tiempo, dicho biosensor que comprende al menos una bisagra de origami de ADN y al menos dos sitios de detección, en donde cada sitio de detección comprende

[0037] • una matriz de emisión de señales,

[0038] • al menos una cerradura que comprende un primer y un segundo dominio de sujeción y un dominio de anclaje unido al primer o segundo dominio de sujeción, en donde el primer y el segundo dominio de sujeción son capaces de formar un híbrido entre sí y en donde el primer o segundo dominio de sujeción es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana a través del dominio de anclaje, en donde la cerradura es capaz de asumir una configuración abierta o cerrada, en donde la cerradura asume la configuración abierta tras la hibridación del oligonucleótido diana y la configuración cerrada en ausencia del oligonucleótido diana,

[0039] • al menos una sección móvil, en donde la sección móvil se conecta a la al menos una bisagra y se puede mover a través de dicha bisagra y en donde la posición de la sección móvil depende de la configuración de la cerradura, en donde las secciones móviles de los sitios de detección se conectan entre sí o a una estructura de origami de ADN común a través de la al menos una bisagra.

[0040] Como se usa en la presente, el término "biosensor" se refiere a una herramienta analítica que consiste de componentes biológicos tales como ácidos nucleicos o proteínas que se usa para detectar la presencia de una diana, generando una señal tras la detección de la diana.

[0041] De acuerdo con la invención, el biosensor es capaz de detectar la presencia de oligonucleótidos diana, es decir, oligonucleótidos de circulación libre que están presentes en una muestra.

[0042] Las estructuras de origami de ADN usan ADN como material de construcción para formar formas geométricas a escala nanométrica. El origami de ADN usa numerosos ácidos nucleicos cortos de una sola hebra denominados "hebras de grapa" que se hibridan con porciones de uno o más polinucleótidos largos de una sola hebra denominados "hebra de andamio" para formar formas particulares prediseñadas (Rothemund, P. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature 440, 297-302 (2006). Douglas SM, Dietz H, Liedl T, Högberg B, Graf F, Shih WM. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature 459 (7245), 414-418 (2009). Doerr, A. DNA origami in 3D. Nat Methods 8, 454 (2011). Han D, Pal S, Nangreave J, Deng Z, Liu Y, Yan H. DNA Origami with Complex Curvatures in Three-Dimensional Space. Science 332 (6027), 342-346 (2011)). Las hebras de grapa pueden contener nucleótidos adicionales en el extremo 5' o 3' denominados salientes que pueden funcionalizarse, por ejemplo, biotinilados, modificados con restos químicos o diseñados para hibridar con oligonucleótidos diana.

[0043] El biosensor de acuerdo con la invención comprende al menos una bisagra de origami de ADN. Una bisagra se define en la presente descripción como una estructura que permite que las secciones conectadas a la misma cambien su posición, es decir, que se muevan de una posición a otra. En algunas modalidades, el biosensor de acuerdo con la invención comprende exactamente una bisagra. En algunas modalidades, el biosensor comprende exactamente 2, 3, 4 o 5 bisagras.

[0044] El biosensor de acuerdo con la invención comprende además al menos dos sitios de detección. Un sitio de detección se define en la presente descripción como un sitio que permite la detección de un oligonucleótido diana. Un sitio de detección es capaz de detectar la presencia del oligonucleótido diana mediante la unión de este a una de las cerraduras de los sitios de detección, lo que da como resultado un cambio en la posición de la sección móvil y la emisión de una señal desde la matriz de emisión de señales.

[0045] Un biosensor capaz de detectar dos oligonucleótidos diana diferentes comprende dos sitios de detección, cada uno capaz de detectar un oligonucleótido diana diferente, es decir, para cada oligonucleótido diana a detectar, el biosensor comprende un sitio de detección diferente.

[0046] Cada sitio de detección comprende una matriz de emisión de señales. La señal emitida por las matrices de emisión de señales es una señal de fluorescencia. De acuerdo con alguna modalidad, la señal de fluorescencia puede basarse en FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) o inactivación. Una matriz de emisión de señales comprende al menos una hilera de fluoróforos donantes que se oponen a al menos una hilera de fluoróforos aceptores o al menos una hilera de fluoróforos que se oponen a al menos una hilera de inactivadores. Preferentemente, una hilera de fluoróforos o inactivadores comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 fluoróforos o inactivadores. En una modalidad preferida, una hilera de fluoróforos o inactivadores comprende 5 fluoróforos o inactivadores. En algunas modalidades, una matriz de emisión de señales puede comprender 2, 4, 6, 8 o 10 filas opuestas de fluoróforos o inactivadores. En una modalidad preferida, las matrices de emisión de señales comprenden 8 hileras de fluoróforos o inactivadores que se oponen entre sí, es decir, cuatro hileras que se oponen a cuatro hileras. En el contexto de la matriz de emisión de señales, los términos "hilera" y "columna" se usan indistintamente. Cuantos más fluoróforos comprenda una matriz de emisión de señales, más fuerte será la señal de fluorescencia, lo que facilita la lectura de la señal.

[0047] Las matrices de emisión de señales se construyen mediante el marcaje de hebras de grapa individuales con fluoróforos o inactivadores. Los ejemplos de fluoróforos y de inactivadores incluyen el inactivador de agujero negro (BHQ), el inactivador de agujero negro-2 (bh2), BHQ3, FAM, AlexaFluor 488, AlexaFluor 555, AlexaFluor 647, Cy3, Cy5, puntos cuánticos en las longitudes de onda de fluoróforo equivalentes, RQ negro de lowa, FQ negro de lowa, inactivador de moras 650 (bbq650), ATTO 488, ATTO 550 y 647N. Los fluoróforos y los inactivadores usados en la presente descripción pueden ser cualquier colorante fluorescente conocido en la técnica. En una modalidad preferida, Cy3 y Cy5 se usan como fluoróforos donantes y aceptores, respectivamente. En otro ejemplo preferido, Cy3 se usa como fluoróforo y bh2 o bb650q se usan como inactivadores.

[0048] Cada área de detección comprende además al menos una cerradura que comprende un primer y un segundo dominio de sujeción y un dominio de anclaje unido al primer dominio de sujeción, en donde el primer y el segundo dominio de sujeción son capaces de formar un híbrido entre sí y en donde el primer dominio de sujeción es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana a través del dominio de anclaje, en donde la cerradura es capaz de asumir una configuración abierta o cerrada, en donde una cerradura asume la configuración abierta tras la hibridación del oligonucleótido diana y la configuración cerrada en ausencia del oligonucleótido diana.

[0049] El primer y el segundo dominio de sujeción son salientes de hebras de grapa que son accesibles para la unión de oligonucleótidos diana. El primer y el segundo dominio de sujeción de cada cerradura son capaces de hibridar entre sí en ausencia del oligonucleótido diana y formar un híbrido. Es decir, en ausencia de su oligonucleótido diana respectivo, el primer y el segundo dominio de sujeción de la cerradura pueden hibridar, de modo que la cerradura asuma una configuración cerrada.

[0050] Si el oligonucleótido diana está presente, puede hibridarse con el dominio de anclaje y además con el primer dominio de sujeción, de esta manera reemplaza el segundo dominio de sujeción del híbrido. La cerradura asumirá entonces una configuración abierta.

[0051] Preferentemente, cada área de detección comprende varias cerraduras que son capaces de hibridar con el mismo nucleótido diana. Esto mejora la sensibilidad y la especificidad del biosensor.

[0052] Cada sitio de detección comprende además al menos una sección móvil, en donde la sección móvil se conecta a la al menos una bisagra y es móvil a través de dicha bisagra y en donde la posición de la sección móvil depende de la configuración de la cerradura, es decir, cuando la cerradura asume la posición abierta, la sección móvil se mueve de una primera posición a una segunda posición y cuando la cerradura asume la posición cerrada, la sección móvil vuelve a la primera posición. En la presente descripción, el término "extremo de la sección móvil" se refiere al extremo de la sección móvil distal a la bisagra.

[0053] En una modalidad preferida, el primer dominio de sujeción de la cerradura se une a la sección móvil de dicha área de detección y el segundo dominio de sujeción se une a la estructura de ADN común o a la sección móvil de otra área de detección. Dado que los dominios de sujeción de una cerradura están unidos a diferentes partes del biosensor, la apertura de la cerradura permite un cambio en la posición de la sección móvil.

[0054] Cada sección móvil comprende al menos una hilera de fluoróforos o inactivadores de la matriz de emisión de señales que pertenece al sitio de detección respectivo. La hilera o hileras opuestas de fluoróforos o inactivadores de la matriz de emisión de señales pueden ubicarse en la estructura de origami de ADN común, por ejemplo, en una de las capas rígidas, o en la sección móvil de un sitio de detección diferente. Cuando la sección móvil se mueve de una primera a una segunda posición, la distancia entre las hileras opuestas de fluoróforos o inactivadores cambia y, por lo tanto, se genera, aumenta o se suprime una señal de fluorescencia.

[0055] En una modalidad, el biosensor comprende al menos una capa rígida que sirve como la estructura de origami de ADN común. En algunas modalidades, la estructura comprende 2, 3 o 4 capas rígidas. Las capas se encuentran una encima de la otra. En una modalidad preferida, la estructura común del biosensor comprende 2 capas rígidas.

[0056] En una modalidad preferida, el biosensor comprende al menos una capa rígida y una bisagra de origami de ADN, dicha bisagra se conecta a la al menos una capa rígida y se ubica en el medio de al menos una capa rígida, en donde dicha bisagra se conecta a todas las secciones móviles del biosensor. Preferentemente, el biosensor comprende dos o cuatro sitios de detección y dos o cuatro secciones móviles. Los sitios de detección pueden estar en el mismo o en diferentes lados de la capa rígida. Tal biosensor que tiene dos sitios de detección en el mismo lado de la capa rígida tiene la estructura de un libro. En esta modalidad, los primeros dominios de sujeción se ubican en el extremo de cada sección móvil y los segundos dominios de sujeción se ubican en ambos extremos de la capa rígida.

[0057] En otra modalidad, el biosensor comprende al menos una capa rígida y dos bisagras de origami de ADN conectadas a la al menos una capa rígida, las bisagras se ubican en los extremos opuestos de la al menos una capa rígida, en donde cada bisagra se conecta a al menos una sección móvil. Preferentemente, el biosensor comprende dos o cuatro sitios de detección y dos o cuatro secciones móviles. Los sitios de detección pueden estar en el mismo o en diferentes lados de la capa rígida. Tal biosensor que tiene dos sitios de detección en el mismo lado de la capa rígida tiene la estructura de un puente basculante. En esta modalidad, los primeros dominios de sujeción se ubican en el extremo de cada sección móvil y los segundos dominios de sujeción se ubican en el medio de la capa rígida.

[0058] En aún otra modalidad, el biosensor no comprende capas rígidas, sino tres bisagras de origami de ADN y tres áreas de detección, en donde cada área de detección comprende dos secciones móviles y en donde cada bisagra se conecta a al menos dos secciones móviles. Tal biosensor tiene la estructura de la letra M. En esta modalidad, los dominios de sujeción se ubican en ambos extremos de cada sección móvil.

[0059] Todos los elementos del biosensor se forman por al menos una hebra de andamio y al menos una hebra de grapa, es decir, el biosensor comprende al menos una hebra de andamio y al menos una hebra de grapa. En una modalidad, la hebra de andamio comprende una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.

[0060] En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 120. Estas hebras principales también se denominan (hebras) grapa centrales. Ellos dan forma al andamio y forman la estructura. En una modalidad, las grapas centrales no se modifican.

[0061] En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 121 a 137. Estas hebras de grapa también se denominan (hebras) grapas de pie. Se encuentran en el centro del biosensor, en particular de la estructura de origami de ADN común, y conectan secciones móviles a la capa rígida.

[0062] En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 138 a 149. Estas hebras de grapa también se denominan (hebras) grapas de bisagra y forman la bisagra.

[0063] En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 150 a 155. En una modalidad, estas hebras de grapa se modifican con biotina, lo que permite la inmovilización del biosensor sobre una superficie de vidrio. En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 156 a 183. Estas hebras de grapa también se denominan (hebras) grapas de tapa y se ubican al final de la estructura de origami de ADN común. Se extienden con la secuencia CCC para evitar la unión no específica de estructuras de ADN individuales entre sí. En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 184 a 263. Estas hebras centrales forman las hileras de las matrices de emisión de señales a las que se unen los fluoróforos o inactivadores. En una modalidad preferida, estas hebras de grapa se usan como se muestra en la tabla más abajo:

[0064] Tabla 1

[0067]

[0068]

[0069]

[0072] En una modalidad, las hebras de grapa comprenden una secuencia polinucleotídica que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 264 a 295. Estas hebras centrales forman las cerraduras e incluyen los dominios de sujeción. Sus oligonucleótidos diana pueden verse en la Tabla 1 más abajo:

[0074] Tabla 2

[0076]

[0077]

[0079] En estas secuencias, los dominios de sujeción se marcan en negrita. De acuerdo con la invención, estos dominios de sujeción pueden reemplazarse de acuerdo con el oligonucleótido diana.

[0080] En una modalidad preferida, el biosensor comprende una hebra de andamio que es al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y hebras de grapa que son al menos 90 % idénticas a la SEQ ID NO 1: 295.

[0081] El biosensor de acuerdo con la invención es capaz de detectar al menos dos oligonucleótidos diana. El oligonucleótido diana puede ser cualquier oligonucleótido de interés de una sola hebra o de doble hebra. En una modalidad, los oligonucleótidos diana se seleccionan del grupo que consiste en miARN, ARNm, ARNci, ARNr, ADN y ADNct.

[0082] En una modalidad preferida, los oligonucleótidos diana se asocian con una afección o enfermedad médica, es decir, los oligonucleótidos diana son biomarcadores. Por lo tanto, el biosensor de acuerdo con la invención es útil para diagnosticar una enfermedad, en particular una enfermedad asociada con la alteración de la expresión de miARN. Las enfermedades que pueden diagnosticarse con la ayuda del biosensor de acuerdo con la invención incluyen enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades neurodegenerativas, afecciones metabólicas, enfermedades renales, enfermedades pulmonares, enfermedades infecciosas y cáncer.

[0083] En una modalidad, los oligonucleótidos diana se seleccionan del grupo que consiste en let-7a, miR-139-5p, miR-191, miR-223-3p, miR-376c, let-7b-3p, miR-14, 1-3p miR-192-3p, miR-223-5p, miR-376c-3p, let-7b-5p, miR-141-5p, miR-192-5p, miR-23a, miR-378, let-7c-3p, miR-142-5p, miR-198, miR-27a-3p, miR-423-5p, let-7g, miR-146b-3p, miR-199a-3p, miR-27a-5p, miR-4257-3p, miR-1, miR-148a, miR-199a-5p, miR-28-3p, miR-451, miR-100, miR-148b, miR-19b-3p, miR-296-5p, miF 301a, miR-625, miR-107, miR-15b, miR-205-3p, miR-30a, miR-7, miR-10a, miR-16, miR-205-5p, miR-30a-3p, miR-320b, miR-801, miR-1246, miR-181-5p, miR-210-3p, miR-34, miR-885-5p, miR-125a-3p, miR-181a-5p, miR-214, miR-342-5p, miR-92a, miR-126-3p, miR-181b, miR-215, miR-34a, miR-92b, miR-127-3p, miR-181c, miR-216, miR-361-3p, miR-93, miR-1290, miR-182-5p, miR-218

[0084] Todos estos miARN están relacionados con el cáncer y, por lo tanto, su detección es útil en el contexto del diagnóstico de cáncer. Dado que el biosensor de acuerdo con la invención puede detectar dos o más oligonucleótidos diana al mismo tiempo, es particularmente útil para una detección confiable del cáncer. Por lo tanto, el biosensor de acuerdo con la invención es para su uso en el diagnóstico del cáncer.

[0085] En otro aspecto, la invención se dirige a un método para detectar al menos dos oligonucleótidos diana en una muestra, el método que comprende

[0086] a) poner en contacto un biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con la muestra. La muestra puede ser cualquier muestra biológica que pueda contener oligonucleótidos, por ejemplo tejido, células o partes de estos, sobrenadante de cultivo celular, sangre, suero u otros fluidos corporales.

[0087] En una modalidad, en el método de acuerdo con la invención, se añade una sonda secundaria a la muestra después de la etapa a), la sonda secundaria es capaz de hibridar con el primer o segundo dominio de sujeción al que no se une el dominio de anclaje. El primer o segundo dominio al que no se une el dominio de anclaje no es capaz de hibridar con el nucleótido diana. En consecuencia, dicho dominio está libre cuando el otro dominio se hibrida con el nucleótido diana y es capaz de hibridar con la sonda secundaria. La sonda secundaria no es capaz de hibridar con ningún dominio de sujeción mientras los dominios de sujeción se hibridan entre sí y es capaz de hibridar solo con un dominio de sujeción libre. La sonda secundaria puede comprender un resto para la amplificación de la señal, por ejemplo, un resto fluorescente, radiactivo, luminiscente o cromogénico, nanopartículas o partículas de oro o plata que permiten la detección a través de SERS.

[0088] En otra modalidad, durante la etapa a), se añade un aglutinante molecular a la muestra. Un aglutinante molecular es un polímero inerte capaz de modular el plegado, el ensamble, las estructuras y las interacciones de macromoléculas tales como oligonucleótidos a través de efectos físicos, que incluyen la exclusión de volumen y la deshidratación, sin una interacción directa con las macromoléculas. Los ejemplos de aglutinantes moleculares incluyen polietilenglicol (PEG), dietilenglicol (DEG) y polivinilpirrolidona (PVP). La adición de un aglutinante molecular a la muestra es ventajosa ya que mejora la velocidad de hibridación de las moléculas de ADN y la cinética de intercambio de hebras, lo que facilita de esta manera el desplazamiento del dominio de sujeción por los oligonucleótidos diana. Esto aumenta la sensibilidad del biosensor de origami de ADN.

[0089] En otro aspecto más, la invención está dirigida a un método para diagnosticar cáncer, el método usa el biosensor de acuerdo con la invención.

[0090] Ejemplos

[0091] Ejemplo 1

[0092] Diseño y ensamble de un biosensor de libro de origami de ADN

[0093] La estructura se diseñó mediante el uso del software caDNAno (http://cadnano.org/) (S. M. Douglas, A. H. Marblestone, S. Teerapittayanon, A. Vazquez, G. M. Church y W. M. Shih, Nucleic Acids Res, 2009, 37, 5001-5006). El archivo generado del software caDNAno se presentó a CanDo (Computer-aided engineering for DNA origami, http://candodna-origami.org/) para una evaluación adicional de la forma, flexibilidad y dinámica. El ensamble del biosensor del libro de origami de ADN se logra mediante la mezcla de ADN de andamio de una sola hebra de 10 nM (tipo: p8064, Europhins MWG Operon, Ebersberg, Alemania) con hebras principales no modificadas (100 nM cada una) (purificado por HPSF, LubioScience-Switzerland IDT, Zúrich, Suiza) y 1 µM de hebras principales modificadas con fluoróforos (ddUTP-Cy3 y ddUTP-Cy5, Jena Bioscience, Alemania), oligonucleótidos con bh2 y bbq650q (Biomers, Ulm, Alemania) y 1 µM de oligonucleótidos modificados con biotina (Biomers, Ulm, Alemania). Todos los oligonucleótidos modificados se purificaron por HPLC. Las secuencias de todos los oligonucleótidos usados se dan en las Tablas 1, 2 y 3. La hibridación de la mezcla de ADN de andamio y hebras de grapa se realizó mediante el uso del método de rampa de temperatura: calentar la solución de mezcla a 80 °C durante 5 min, enfriar a 65 °C durante los primeros 15 min y enfriar aún más hasta 4 °C durante 16 horas.

[0094] SEQ ID NO: 1

[0095]

[0096]

[0097]

[0099] Tabla 3

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0106] Marcaje de oligonucleótidos con fluoróforos Cy3 y Cy5 mediante transferasa terminal (TdT)

[0107] Las hebras de grapa no modificadas se compraron a una concentración de 100 µM. Las seleccionados se marcaron con ddUTP-Cy3 y ddUTP-Cy5, mediante el uso de transferasa terminal (TdT) (Roche, Suiza). La reacción de TdT se realizó en un volumen total de 20 µl que consistió en tampón de reacción de TdT (1x), CoCl<2>(5 mM), 100 pmol de hebras centrales no modificadas y 500 pmol de conjugados de ddUTP modificados. La solución se mezcló bien y se incubó con TdT (400 U/reacción) durante 30 min a 37 °C. La reacción de TdT se detuvo al calentar la mezcla a 70 °C durante 10 min y los oligonucleótidos se precipitaron con NaOAc (0,1 M, pH 5,2) y 2,5 volúmenes de EtOH al 96 % durante 1 h a -20 °C. La precipitación seguida de centrifugación durante 30 min a 13000 g dio como resultado un sedimento del producto, que se lavó con EtOH al 70 %, se secó y se disolvió en agua. Estos oligonucleótidos marcados se analizaron en HPLC (sistema Agilent Technologies 1260 Infinity II) con una columna HPLC Agilent Bio SAX, no porosa de 4,6 mm X 250 mm, 5 µm, y después se usaron para el autoensamble (Figura 16).

[0108] Ensayos de desplazamiento de movilidad en gel de agarosa

[0109] Los biosensores de libros de origami de ADN ensamblados se cargaron en el gel de agarosa al 1,5 % que contenía MgCl<2>11 mM y se dejaron migrar durante 2 horas a 70 V. Para detectar las estructuras migradas, los geles se tiñeron con 1x SYBR Gold durante 30 min y se visualizaron con BioRad Gel Doc XR+.

[0110] Purificación de la estructura

[0111] Las estructuras de biosensor de libros de origami de ADN se ensamblaron con un exceso de hebras de grapa y la purificación de hebras de grapa no incorporadas se realizó con dos métodos diferentes. El primer método se basó en filtros centrífugos Amicon Ultra-0,5 ml de 100 kDa (Millipore, Alemania). Los filtros Amicon se humedecieron previamente llenándolos con tampón de hibridación (1x TAE/10 mM Mg<2+>) con 500 µl y se centrifugaron a 8000 g durante 10 min. Después las muestras se cargaron en el filtro (100 µl) y se completaron hasta 500 µl con el tampón de hibridación. La muestra se centrifugó a 8000 g durante 8 min y se lavó 4 veces con 400 μl de tampón de hibridación. El segundo método usado para la purificación fue la electroforesis en gel de agarosa. La muestra que contenía la estructura biosensor de libro ensamblada (100 μl) y glicerol 6x (20 μl) se cargó en gel de agarosa al 1 %. El gel se ejecutó a 70 V durante 1 h y la banda correspondiente para estructuras marcadas con fluorescencia se cortó del gel mediante el uso de una cuchilla de afeitar y se extrajo del gel mediante compresión con un portaobjetos de vidrio. Obtención de imágenes por AFM

[0112] La mica recién escindida se incubó con 10 µl de tampón de hibridación que contenía MgCl 2 mM<2>durante 1 min y se enjuagó con ddH<2>O antes de la deposición de la muestra purificada (5-10 µl de muestra de 0,8-1 nM) durante 2 min. La obtención de imágenes se realizó mediante el uso de un AFM NT-MDT (NTEGRA II). Todas las imágenes se analizaron mediante el uso del software de análisis Gwyddion.

[0113] Obtención de imágenes por TEM

[0114] Las rejillas de carbono TEM (Formvar/carbono, malla 400, Cu, TedPella, Inc., EE. UU.) se expusieron al plasma durante 1 min (24 W). Se colocó una muestra (5 µl) y se incubó en la rejilla durante 30 s y después se retiró con papel de filtro. Subsecuentemente, las muestras se tiñeron negativamente con una solución acuosa de acetato de uranilo al 1 % (5 μl) que contenía NaOH 25 mM durante 15 s y el exceso de solución de colorante se eliminó con papel de filtro. La obtención de imágenes se realizó mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión JEM-1011 (JEOL) operado a 80 kV.

[0115] Mediciones de fluorescencia de biosensores de libros de origami de ADN mediante espectrofotometría

[0116] Una solución que contenía las estructuras de biosensor de libros de origami de ADN autoensamblados y purificados (45 µl, 0,5 nM), se cargó en una cubeta con un volumen final de 60 µl (Hellma). Las mediciones de fluorescencia se realizaron mediante el uso de un espectrofluorómetro (Horiba, espectrómetro de fluorescencia y absorbancia Duetta) y se recogieron espectros de emisión de los diferentes biosensores de libros después de la excitación de los fluoróforos donantes a 530 nm y los fluoróforos aceptores a 630 nm.

[0117] Mediciones de moléculas individuales mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio

[0118] El portaobjetos de vidrio de 12 pocillos (Ibidi, Alemania) con cámaras de silicio desmontables se incubó con 50 µl de solución de albúmina sérica bovina biotinilada de 0,5 mg/ml (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) durante 15 min a temperatura ambiente, se lavó tres veces con 1x TAE/12 mM Mg<2+>, y se incubó con 50 µl de solución de neutravidina de 0,5 mg/ml (Thermo Fisher Scientific, Basilea, Suiza) durante 15 min y se lavó con 1x TAE/12 mM Mg<2+>. Muestras de libros de origami de ADN biotinilado (100 pM en 1x TAE/12 mM Mg<2+>) se incubaron durante 15 min y se lavaron tres veces con 1x TAE/12 mM Mg<2+>. La mezcla del sistema de captura de oxígeno consistió en una relación 1:1:1 de 1x PCA, 1x PCD y 1x mezcla de Trolox en 1x TAE/12 mM Mg<2+>se añadió a las cámaras de portaobjetos de vidrio donde se funcionalizaron las estructuras. En particular, el sistema de captura de oxígeno se preparó a partir de las soluciones madre. La solución madre de Trolox 100x contiene 100 mg de Trolox, 430 μl de metanol y 345 μl de NaOH (1 M) en 3,2 ml de agua. La solución madre de PCA 40× contiene 154 mg de PCA en 10 ml de agua (pH 9,0). La solución madre de PCD 100x contiene 9,3 mg de PCD y 13,3 ml de tampón (solución madre de glicerol al 50 % en KCl 50 mM, EDTA 1 mM y Tris-HCl 100 mM, pH 8,0).

[0119] Los experimentos se realizaron en un microscopio de campo amplio TIRF construido en casa, basado en un cuerpo invertido de Olympus IX83. Se usaron líneas láser de 532 y 640 nm (gem, Laser quantum), filtradas por un filtro de limpieza (ZET532/640x). Se usaron espejos dicróicos (DM) para unir la trayectoria y se incluye Pol λ/4 para la polarización circular. Después, la luz láser se enfocó mediante dos lentes (AC508-100-A-ML y AC254-030-A-ML, Thorlabs, Alemania) en el plano focal posterior del objetivo UPLAPO100xOHR (1,5 NA, Olympus). Después, se usó un conjunto de doble banda láser (ET-532/640 nm, DM3) para excitar la muestra y filtrar la emisión simultáneamente. La emisión se dividió en dos canales mediante el uso de DM4 (T635Ipxr) en un sistema de derivación Optosplit II (Cairn), para finalmente llegar al chip de la cámara CMOS (C14440 ORCA-Fusion, Hamamatsu). Para obtener imágenes de las estructuras con detección basada en FRET, usamos un láser de 532 nm a 1,0 mW para Cy3, y para las estructuras con una detección basada en la inactivación, usamos láseres de 532/640 nm a 1,0 mW para Cy3/Cy5 con excitación directa. Después de la excitación, se tomaron imágenes cada 2 min durante 10 min, y los puntos de datos se recogieron mediante el uso de dos canales, el primero para la emisión de Cy3 y el segundo para la emisión de Cy5. Para el mecanismo de detección basado en inactivación, la excitación directa de Cy3 o Cy5 se recogió mediante el uso del canal respectivo.

[0120] El análisis de datos se realizó en un software de Python desarrollado internamente. Con este software, pudimos encontrar una estructura individual, ajustarla mediante el uso de un modelo gaussiano 2D al centro de la sección y extraer su intensidad de todos los píxeles relevantes en cada imagen tomada. Cálculos de la eficiencia de transferencia de energía para mediciones donde el donante se excita y se miden tanto las intensidades del donante como las del aceptor:

[0123]

[0125] donde E es la eficiencia de transferencia de energía, IA es la intensidad del aceptor, e I<D>es la intensidad del donante.27 Para la detección basada en la inactivación, el aumento de la fluorescencia se calculó de la manera que la intensidad en el período de 0 min se resta de 6 min. La diferencia entre las dos intensidades se dividió después por los 0 min del mismo biosensor de libro de origami de ADN. El punto de datos final fue un aumento de la intensidad con el tiempo. Aislamiento de los miARN

[0126] Las células de cáncer de mama humano MCF-7 se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO<2>, y 95 % de humedad en el medio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con Glutamax, suero bovino fetal (FBS) al 10 % y penicilina y estreptomicina al 1 %. Todos los reactivos de cultivo celular se compraron de Thermo Fischer Scientific (Basilea, Suiza). Los miARN se extrajeron de células MCF-7 (25 ng/µl para 10<6>células) mediante el uso de un sistema comercial (kit de aislamiento de miARN de alta pureza; Roche, Suiza). La extracción se realizó como se describe en el protocolo del kit.

[0127] Ejemplo 2

[0128] El libro de origami de ADN se diseñó mediante el uso del software caDNAno (S. M. Douglas, A. H. Marblestone, S. Teerapittayanon, A. Vazquez, G. M. Church y W. M. Shih, Nucleic Acids Res, 2009, 37, 5001-5006.28Y. Ke, S. M. Douglas, M. Liu, J. Sharma, A. Cheng, A. Leung, Y. Liu, W. M. Shih y H. Yan, J Am Chem Soc, 2009, 131, 15903-15908.). La estructura rectangular consiste en tres capas de hélices de ADN empaquetadas en una red cuadrada con dimensiones de 78,5 x 33,9 x 8 nm (Figura 1a) de manera que la capa superior consiste en dos partes conectadas a la capa media con una bisagra desde el centro, lo que permite la apertura de la capa superior a ambos lados. Cada parte de la capa tiene una serie de fluoróforos colocados con precisión (Figura 1, Figura 6).

[0129] Para la detección basada en FRET, se colocaron dos matrices de fluoróforos en las capas superior y media: una matriz con fluoróforos donantes en la capa media orientada hacia la capa superior, y la otra en la capa superior con fluoróforos aceptores correspondientes (Figura 1c). Cada matriz consiste en 4 columnas de 5 fluoróforos ubicados con precisión (Figura 1d). Para el enfoque de detección basado en la inactivación, la capa media del libro de origami de ADN se decoró con una serie de diferentes tipos de fluoróforos (Cy3 o Cy5), y la capa superior del libro se decoró con moléculas de inactivador (inactivador de agujero negro-2 (bh2) y/o inactivador de mora 650 (bbq650)) orientadas hacia el fluoróforo correspondiente en la capa media (Figura 1d). La distancia entre cada fluoróforo en una capa de ADN dentro de una columna es de 5,8 nm y la distancia entre dos columnas es de 6,6 nm, de acuerdo con nuestro diseño. El mapeo de toda la estructura se puede encontrar en la Figura 7.

[0130] Las cerraduras parcialmente hibridadas a ambos lados mantienen constitutivamente las capas en un estado cerrado tras el ensamble (Figura 1b). Cada una de las cuatro cerraduras a cada lado del libro forma un híbrido de 15 pb de largo donde una de las hebras se alarga con 8 bases que permiten la unión de la clave diana complementaria de 23 bases mediante desplazamiento de hebras mediado por el punto de anclaje. Una vez que se une al anclaje, el oligonucleótido diana desplaza la hebra de cerradura más corta del híbrido. Que promueve la apertura de las capas debido a la repulsión electrostática del ADN y la entropía del dispositivo. El cambio entre el estado abierto y cerrado da como resultado un aumento de la distancia entre los fluoróforos donantes y aceptores, lo que provoca la disminución de la transferencia de energía entre los pares de fluoróforos en ambos mecanismos (Figuras 1c y 1d) y el aumento de la señal de fluorescencia de los fluoróforos donantes mediante la liberación del par FRET respectivo. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) demostraron la formación de estados abiertos y cerrados del biosensor del libro de origami de ADN (Figura 1e y f, Figura 8). Además, las imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) realizadas en modo de barrido mostraron la formación de un sensor de libro de origami de ADN en un estado cerrado (Figura 9). Para demostrar además la apertura del biosensor de libro de origami de ADN, las estructuras se ensamblaron y se mezclaron con uno o dos dianas de oligonucleótidos de ADN y después se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 10). Se observaron las diferencias en el desplazamiento electroforético (movilidad) entre las estructuras en estados cerrados o abiertos (un lado o dos lados), lo que demuestra de esta manera la funcionalidad del biosensor de libros de origami de ADN en respuesta a la presencia de una diana oligonucleotídica correspondiente.

[0131] Ejemplo 3

[0132] Optimización de la señal de salida de fluorescencia

[0133] Para comprobar la eficiencia de la incorporación de los oligonucleótidos marcados dentro de la estructura, se obtuvieron imágenes de las estructuras del libro de origami de ADN con 1 columna (5 Cy3 o Cy5), 2 columnas (10 Cy3 o Cy5) y 4 columnas (20 Cy3 o Cy5). El aumento en el número de fluoróforos incorporados dentro de la estructura dio como resultado un aumento lineal en la intensidad de fluorescencia media en ausencia de autoinactivación (Figura 11). La señal del biosensor del libro de origami de ADN se basa en la transferencia de energía dependiente de la distancia entre fluoróforos, en realidad entre columnas de donante y aceptor/inactivador. La apertura de la estructura dará como resultado una mayor distancia entre las columnas de los pares donante y aceptor/inactivador que es más cercana a las cerraduras en comparación con la distancia entre las columnas más cercanas a la bisagra. Nuestro cálculo teórico de posibles ángulos de apertura y distancias en nanómetros entre columnas se presenta en la Figura 2a. Este cálculo indicó que la distancia entre columnas dentro de la estructura será diferente, y eso resultaría en variaciones de la FRET. Primero, definimos la concentración óptima de sal para la máxima salida de señal de la estructura en forma de libro que se usó subsecuentemente para los experimentos funcionales adicionales mediante el uso de un espectrofotómetro (Figura 12). Después, estudiamos la eficiencia de FRET para cada columna (que consiste de 5 pares donante/aceptor) en los estados abiertos y cerrados mediante el uso de un espectrofotómetro (Figura 2b). Los resultados confirmaron los cálculos teóricos que las columnas más cercanas a las cerraduras tienen la mayor diferencia en la eficiencia de FRET entre los estados abiertos y cerrados (30 %) mientras que las columnas cercanas a la bisagra tienen una diferencia muy baja en la eficiencia de FRET (1,6 %). Para determinar el tiempo de reacción del biosensor del libro de origami de ADN para abrirse completamente, las estructuras se ensamblaron en el estado cerrado con una sola columna de pares FRET (columna 1). Para cuantificar las eficiencias de FRET, los perfiles de emisión de fluorescencia de los aceptores después de la excitación de los donantes del dispositivo biosensor se registraron mediante espectrofotómetro antes y cada 5 min después de la adición de 1 µM de la clave diana durante un período de 30 min, y se calculó la eficiencia de FRET (Figuras 2c y d). La eficiencia de FRET trazada mostró una disminución con el tiempo, lo que indicó que nuestra estructura se abría dentro de los 10 min después de la adición de la diana. Los tiempos de incubación más largos no mejoraron significativamente la eficiencia de FRET. Estos resultados fueron valiosos para el estudio posterior a nivel de estructura única.

[0135] Ejemplo 4

[0137] Análisis de estructuras únicas de biosensores de libros de origami de ADN mediante el uso de microscopía de fluorescencia de campo amplio

[0139] A continuación, probamos la especificidad de detección de nuestro biosensor de libro mediante el uso de diferentes dianas para el lado izquierdo y el lado derecho de la estructura por separado. Inicialmente usamos análogos de ADN de miARN diana, ODN-153 (para miR-153) y ODN-342 (para miR-342). Se obtuvieron imágenes de las estructuras con 3 columnas (1-3) cada 2 min durante un total de 10 min con la diana añadida después de un minuto. Después, se extrajo la intensidad de las estructuras de origami de ADN y se calculó la eficiencia de FRET (Figura 13). Como experimento de control, se obtuvieron imágenes de las estructuras antes de añadir la diana real en la misma cámara pero en diferentes posiciones para evaluar cómo el láser afectaba a los fluoróforos y para observar el comportamiento de las estructuras. Nuestros resultados mostraron que cuando se añade ADN no diana hay un pequeño cambio en la eficiencia de FRET media para los lados izquierdo (8 %) y derecho (6 %) de la estructura debido a la exposición al láser y al fotodecoloración (Figura 3). La adición de la diana de ADN (ODN-153) para el lado izquierdo da como resultado un cambio significativo en la eficiencia de FRET promedio (26-30 %) para concentraciones en el intervalo de 1 μM a 100 pM, mientras que el cambio para 10 pM fue de alrededor del 10 % (Figura 3a). La adición de la diana de ADN (ODN-342) para el lado derecho en alta concentración activó la apertura de la estructura más rápido que la diana de ADN izquierda. Para las concentraciones en el intervalo de 1 µM a 100 pM, el cambio en la eficiencia de FRET es de aproximadamente 20 %, mientras que la adición de la diana de 10 pM dio como resultado un cambio menor en la eficiencia de FRET, 11 % (Figura 3b). La razón de la apertura más rápida en mayor concentración podría deberse a diferentes % de GC de la secuencia diana. ODN-342 tiene un mayor contenido de GC (52,2 %) en comparación con ODN-153 (40,9 %) (Tabla 4). Estimamos el límite teórico de detección (LoD) de ambas dianas en base a los recuentos normalizados medidos del oligonucleótido no dirigido. Al ajustar todos los puntos de datos medidos (10<1>a 10<6>pM) a una curva asimétrica de cinco parámetros, los LoD de ODN-153 y ODN-342 se determinaron en 1,6 pM y 1 pM, respectivamente. Como el biosensor de origami de ADN tiene 4 cerraduras en cada lado, que mantienen la estructura en un estado cerrado, probamos el impacto del número y la posición de las cerraduras en la detección de la concentración más baja del diana de interés mediante el uso del mecanismo de detección FRET. Las estructuras con 3 columnas (1-3) se ensamblaron con diferentes números (2 o 3) y posiciones de cerraduras seguidas de la adición de 100 pM de ODN-153. Los cambios de FRET obtenidos mostraron que la incorporación de menos cerraduras o la alteración del posicionamiento de las cerraduras dentro de la estructura no aumentó la intensidad media de FRET a la concentración de 100 pM del diana de interés (Figura 14).

[0141] Además, probamos la capacidad de detección del biosensor del libro mediante el uso del mecanismo de inactivación de la fluorescencia como un enfoque de detección alternativo basado en FRET. Para esto, las estructuras se ensamblaron con 2 columnas (1-2) de colorantes Cy3 e inactivadores bh2 en el lado izquierdo y se obtuvieron imágenes cada 2 min durante un total de 10 min, con el ADN diana (ODN-153) añadido después de un minuto. Se extrajo la intensidad de las estructuras de origami de ADN y se calculó el cambio de intensidad de fluorescencia entre 0 min y 6 min. Tras la unión de la diana de interés, la capa superior se abre y la intensidad de fluorescencia de Cy3 aumenta debido a la mayor distancia entre Cy3 y los colorantes inactivadores bh2. Los resultados mostraron que la adición de ODN-153 en el intervalo de 100 pM a 1 µM aumentó la intensidad de fluorescencia (14 a 20 %), mientras que la adición de 10 pM aumenta la intensidad de fluorescencia solo en un 7 %.

[0143] El cambio de intensidad entre las estructuras cerradas y abiertas puede verse en los histogramas (Figura 4a). El mismo experimento se repitió con biosensores de libro que contenían 2 columnas (1-2) de colorantes Cy5 e inactivadores bbq650 en el lado derecho de la estructura. Nuestros resultados mostraron que la adición de ODN-342 en el intervalo de 100 pM a 1 µM dio como resultado un aumento en la intensidad de fluorescencia de Cy5 en el intervalo de 11 a 20 %, mientras que la adición de ODN diana de 10 pM aumentó la intensidad de fluorescencia en un 8 % (Figura 4b). Al ajustar todos los puntos de datos medidos (101 a 106 pM) a una curva de cinco parámetros asimétrica, los LOD de ODN-153 y ODN-342 se determinaron como 3,3 pM y 3,9 pM, respectivamente.

[0144] Tabla 4

[0147]

[0150] Ejemplo 5

[0152] Multidetección de dos miARN diana y miARN extraídos de células cancerosas

[0154] A continuación, realizamos la detección múltiple de dos dianas mediante la adición de ambos oligonucleótidos simultáneamente. Las estructuras se ensamblaron mediante la inclusión de 2 columnas (1-2) de pares de coloranteinactivador Cy3/bh2 en el lado izquierdo y 2 columnas (1-2) de pares de colorante-inactivador Cy5/bbq650 en el lado derecho. Aplicamos el mismo procedimiento descrito anteriormente mediante la adición de dos ADN diana (ODN-153 y ODN-342) al mismo tiempo en el intervalo de 10 pM a 10 nM. Los resultados mostraron que la intensidad de fluorescencia de los colorantes Cy3 y Cy5 aumentó (12 a 20 %) cuando se añadieron dianas en el intervalo de concentración de 100 pM a 10 nM, mientras que la intensidad de fluorescencia permaneció en 10 % a la concentración de 10 pM (Figura 15).

[0156] Además, para probar la capacidad de detección de ARN de nuestro sistema elegimos dos miARN altamente expresados (miR-21 y let-7a) al rediseñar las cerraduras que responden a estas dianas respectivamente (SEQ ID NO: 280 a 295). Como anteriormente, las estructuras se ensamblaron mediante la inclusión de 2 columnas (1-2) de pares de colorante-inactivador Cy3/bh2 en el lado izquierdo y 2 columnas (1-2) de pares de colorante-inactivador Cy5/bbq650 en el lado derecho. Las cerraduras en el lado izquierdo del biosensor se diseñaron para detectar miR-21 y las cerraduras en el lado derecho se diseñaron para detectar let-7a, de modo que el aumento en la intensidad de fluorescencia de Cy3 revela la detección de miR-21 mientras que un aumento en la intensidad de fluorescencia de Cy5 revela la detección de let-7a. La prueba se realizó a concentraciones de miARN de 10 nM y 10 pM. Los resultados mostraron que la intensidad de fluorescencia de Cy3 y Cy5 después de la adición de la diana a 10 nM aumentó al 18 % a 19 %, respectivamente, lo que indica la detección simultánea de ambos miARN a estas concentraciones (Figura 5). Las intensidades de fluorescencia de ambos colorantes después de añadir la diana a 10 pM fueron de aproximadamente 10 %.

[0158] Finalmente, para validar la capacidad de nuestro ensayo para detectar miARN derivados de células en muestras biológicas, estudiamos con miARN de extractos de células de cáncer de mama MCF-7. El miARN se extrajo de células MCF-7 (25 ng/µl para 106 células) mediante el uso de un sistema comercial. Después, añadimos 100 ng del ARN aislado a nuestra plataforma de biosensor que contenía estructuras de origami de ADN individuales con cerraduras diseñadas para detectar miR-21 y let-7a. Los resultados mostraron un aumento en la intensidad de fluorescencia de alrededor del 10 % para Cy3 y del 11 % para Cy5, que está en el intervalo de detección de nuestro sistema y por encima del LoD de nuestro sistema.

[0160] En resumen, presentamos un biosensor de libro de origami de ADN para la detección dual de oligonucleótidos diana específicos. Nuestro biosensor ofrece dos mecanismos diferentes basados en FRET para la detección: 1) un sistema de detección basado en FRET que puede revelar la presencia de una diana de interés y 2) un sistema de detección basado en la inactivación de fluorescencia que puede detectar simultáneamente dos dianas diferentes. Dentro de nuestra estructura, podemos incorporar 20 pares FRET y/o 20 pares fluoróforos inactivadores en cada lado del libro. En ambos sistemas de detección basados en FRET, nuestro biosensor de libro tiene una señal de salida de alta intensidad a nivel de molécula única. Demostramos que nuestro dispositivo puede detectar oligonucleótidos diana a concentraciones tan bajas como 1-10 pM con un tiempo de detección de 10 min a través de ambos mecanismos de detección. Es importante destacar que nuestro enfoque es altamente versátil, ya que las cerraduras pueden rediseñarse fácilmente para detectar diferentes oligonucleótidos que incluyen diferentes fragmentos cortos de ADNct tumoral o miARN, ADN viral o fragmentos de ARN (por ejemplo, SARS-CoV-2, Zika o HPV), o incluso ARNm más largos mediante la combinación de múltiples cerraduras. Cuando se aplica en forma de matriz, puede expandirse para detectar cientos de dianas diferentes simultáneamente, posiblemente cambiando la forma en que se realizarán los diagnósticos basados en oligonucleótidos en el futuro.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

1. Un biosensor de origami de ADN capaz de detectar al menos dos oligonucleótidos diana diferentes al mismo tiempo, dicho biosensor comprende al menos una bisagra de origami de ADN y al menos dos sitios de detección, en donde cada sitio de detección comprende

• una matriz de emisión de señales,

• al menos una cerradura que comprende un primer y un segundo dominio de sujeción y un dominio de anclaje unido al primer o segundo dominio de sujeción, en donde el primer y el segundo dominio de sujeción son capaces de formar un híbrido entre sí y en donde el primer o segundo dominio de sujeción es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana a través del dominio de anclaje, en donde la cerradura es capaz de asumir una configuración abierta o cerrada, en donde la cerradura asume la configuración abierta tras la hibridación del oligonucleótido diana y la configuración cerrada en ausencia del oligonucleótido diana, • al menos una sección móvil, en donde la sección móvil se conecta a la al menos una bisagra y se puede mover a través de dicha bisagra y en donde la posición de la sección móvil depende de la configuración de la cerradura,

en donde las secciones móviles de los sitios de detección se conectan entre sí o a una estructura de origami de ADN común a través de la al menos una bisagra.

2. El biosensor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en cada sitio de detección, el primer dominio de sujeción de la cerradura se une a la sección móvil de dicha área de detección y el segundo dominio de sujeción se une a la estructura de ADN común o a la sección móvil de otra área de detección.

3. El biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que comprende al menos una, preferentemente dos capas rígidas como la estructura de origami de ADN común.

4. El biosensor de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el biosensor comprende una bisagra de origami de ADN, dicha bisagra se conecta a la al menos una capa rígida y se ubica en el medio de al menos una capa rígida, en donde dicha bisagra se conecta a todas las secciones móviles.

5. El biosensor de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el biosensor comprende dos bisagras de origami de ADN conectadas a la al menos una capa rígida, las bisagras se ubican en los extremos opuestos de la al menos una capa rígida, en donde cada bisagra se conecta a al menos una sección móvil.

6. El biosensor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el biosensor comprende tres bisagras de origami de ADN y tres sitios de detección, en donde cada sitio de detección comprende dos secciones móviles y en donde cada bisagra se conecta a al menos dos secciones móviles.

7. El biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la matriz de emisión de señales comprende al menos una hilera de fluoróforos donantes opuesta a una hilera de fluoróforos aceptores.

8. El biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la matriz de emisión de señales comprende al menos una hilera de fluoróforos opuesta a al menos una hilera de inactivadores.

9. El biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los oligonucleótidos diana se seleccionan del grupo que consiste en miARN, ARNm, ARNlnc, ARNr, ADN y ADNct.

10. Un método para detectar al menos dos oligonucleótidos diana en una muestra, el método que comprende a) poner en contacto un biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con la muestra.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde después de la etapa a), se añade una sonda secundaria a la muestra, la sonda secundaria es capaz de hibridar con el primer o segundo dominio de sujeción.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde durante la etapa a), se añade un aglutinante molecular a la muestra.

13. Un biosensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el diagnóstico de una enfermedad, en donde el biosensor es capaz de detectar oligonucleótidos diana asociados con dicha enfermedad.

14. El biosensor para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la enfermedad se asocia con la expresión alterada de miARN.

15. El biosensor para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades neurodegenerativas, afecciones metabólicas, enfermedades renales, enfermedades pulmonares, enfermedades infecciosas y cáncer.

16. El biosensor para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la enfermedad es cáncer y el oligonucleótido diana asociado con el cáncer se selecciona del grupo de let-7a, miR-139-5p, miR-191, miR-223-3p, miR-376c, let-7b-3p, miR-14, 1-3p miR-192-3p, miR-223-5p, miR-376c-3p, let-7b-5p, miR-141-5p, miR-192-5p, miR-23a, miR-378, let-7c-3p, miR-142-5p, miR-194, miR-23a-3p, miR-382, let-7c-5p, miR-143, miR-195-3p, miR-23b-3p, miR-409-3p, let-7d, miR-145-3p, miR-195-5p, miR-25, miR-411, let-7e, miR-145-5p, miR-196a, miR-26a, miR-421, let-7f miR-146a, miR-198, miR-27a-3p, miR-423-5p, let-7g, miR-146b-3p miR-199a-3p, miR-27a-5p, miR-4257-3p, miR-1, miR-148a, miR-199a-5p, miR-28-3p, miR-451, miR-100, miR-148b, miR-19b-3p, miR-296-5p, miR-4772-3p, miR-100-5p, miR-150, miR-200a, miR-299-5p, miR-486-5p, miR-103, miR-153, miR-200c, miR-29a, miR-497, miR-106a, miR-155-3p, miR-202, miR-29c, miR-601, miR-106b, miR-155-5p, miR-203, miR-301a, miR-625, miR-107, miR-15b, miR-205-3p,miR-30a, miR-7, miR-10a, miR-16, miR-205-5p, miR-30a-3p, miR-718, miR-10b, miR-16-5p, miR-20a-3p, miR-30e-3p, miR-744, miR-10b-3p, miR-17 miR-20a-5p, miR-31, miR-760, miR-122, miR-17-5p, miR-20b-5p, miR-320a, miR-768-3p, miR-1229, miR-18, miR-21, miR-320b, miR-801, miR-1246, miR-181-5p, miR-210-3p, miR-34, miR-885-5p, miR-125a-3p, miR-181a-5p, miR-214, miR-342-5p, miR-92a, miR-126-3p, miR-181b, miR-215, miR-34a, miR-92b, miR-127-3p, miR-181c, miR-216, miR-361-3p, miR-93, miR-1290, miR-182-5p, miR-218, miR-361-5p, miR-9-5p, miR-130, miR-183-5p, miR-22, miR-365, miR-130b, miR-185, miR-221, miR-367, miR-133a, miR-18a, miR-222-3p, miR-372, miR-133b, miR-19, miR-222-5p y miR-375.