ES3054694T3

ES3054694T3 - Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom

Info

Publication number: ES3054694T3
Application number: ES17786708T
Authority: ES
Inventors: Ingvar Helgason; Dusko Ilic
Original assignee: Faircraft; Kings College London
Current assignee: Faircraft; Kings College London
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2026-02-05
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: US11739217B2; US20190136060A1; GB2555149B; JP7751373B2; AU2022200445A1; CA3021688A1; KR20220025206A; EP3445866B1; US20220403172A1; US11591471B2; EP4603602A3; US11999853B2; CN116463278A; WO2017184967A1; EP3445866A1; AU2022200445B2; EP3445866C0; BR112018071667A2; KR102679152B1; JP2019514423A

Abstract

En el presente documento se describen cueros sintéticos, capas epidérmicas artificiales, capas dérmicas artificiales, estructuras en capas, productos producidos a partir de ellas y métodos para producirlas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Equivalente cutáneo genomanipulado, método de fabricación del mismo y productos derivados del mismo

[0003] Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. núm.62/325,819, presentada el 21 de abril de 2016. La presente invención se refiere a métodos para fabricar cuero sintético.

[0004] Apoyo gubernamental

[0005] Esta invención se llevó a cabo con el apoyo del National Institutes of Health (NIH) con el número de subvención R21 ARO61583 y R01 AR051930, del Medical Research Council (Reino Unido) con el número de subvención G0801061, el Research Service of the Department of Veterans Affairs y la Dystrophic Epidennolysis Bullosa Research Association.

[0006] Sector de la técnica

[0007] La presente invención se refiere a un método para fabricar un cuero sintético como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Otras divulgaciones o casos divulgados en la presente memoria, pero que no se encuentran dentro las reivindicaciones, son para ayudar al experto en la materia a comprender y poner en práctica la presente divulgación, pero no forman parte de la invención reivindicada. Para evitar dudas, se observa que la presente invención no se extiende a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal.

[0008] Antecedentes de la invención

[0009] La patente de EE. UU. núm.2013/255003 divulga la piel y cuero de origen animal genomanipulados mediante capas de células animales productoras de colágeno. En la presente memoria se divulgan métodos para fabricar un cuero sintético. El método comprende formar una capa dérmica artificial que comprende un fibroblasto. El método comprende el curtido de por lo menos una porción de una capa dérmica, formando así un cuero sintético. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, el método puede comprender, además, la formación de una capa epidérmica artificial. Bilousova et al., J. Invest. Derm., vol.131, páginas 857-864 (2010) divulgan la producción de queratinocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un queratinocito. En algunos casos, el método puede comprender la colocación de una capa epidérmica sobre una capa dérmica formando así una estructura en capas. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, un mamífero puede ser un mamífero no humano. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender un pigmento. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto de mamífero. En algunos casos, el fibroblasto de mamífero puede ser un fibroblasto de un mamífero no humano. En algunos casos, el fibroblasto de un mamífero no humano puede ser uno de un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, un no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa epidérmica puede someterse a un procesamiento adicional. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una estructura en capas puede someterse a un procesamiento posterior. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa dérmica puede someterse a un procesamiento adicional. En algunos casos, el procesamiento puede seleccionarse de un grupo que consiste en conservar, remojar, batir, encurtir, desencurtir, diluir, recurtir, lubricar, incrustar, humedecer, escurrir, rebajar, recromar, neutralizar, teñir, engrasar, llenar, pelar, embastecer, emblanquecer, fijar, asentar, secar, acondicionar, fresar, estacar, esmerilar, acabar, aceitar, cepillar, acolchar, impregnar, pulverizar, recubrir con rodillo, recubrir con cortina, pulir, chapar, estampar, planchar, vitrificar, ablandar y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el colágeno se puede producir por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se puede añadir por separado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, un queratinocito, un fibroblasto, un comeocito, un melanocito, una célula de Langerhans, una célula basal, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, en el que la célula epitelial puede comprender una célula escamosa, una célula cuboidal, una célula columnar, una célula basal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender un queratinocito, en el que el queratinocito puede comprender un queratinocito epitelial, queratinocito basal, queratinocito basal proliferante, queratinocito suprabasal diferenciado, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula muscular lisa. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una o más de queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. En algunos casos, una primera capa dérmica puede colocarse sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, un andamiaje puede comprender un adhesivo de tejido natural. En algunos casos, un adhesivo de tejido natural puede comprender cola de fibrina. En algunos casos, un andamiaje puede estar comprendido en parte en un cuero sintético. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica o una capa epidérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica con un suplemento. En algunos casos, un suplemento puede comprender uno o más de colágeno, fibrina, factores de crecimiento, ácido ascórbico, sulfato de dextrano o carragenina. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento natural. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento sintético. En algunos casos, se puede producir una célula madre pluripotente inducida a través de la expresión génica inducida de Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc o una combinación de los mismos en una célula somática adulta. En algunos casos, por lo menos una porción de un artículo de cuero puede formarse a partir de los métodos divulgados en la presente memoria. En algunos casos, un artículo de cuero puede comprender uno o más de los siguientes: una correa de reloj, un cinturón, un embalaje, un zapato, una bota, un calzado, un guante, ropa, equipaje, una bolsa, una bolsa de mano, una cartera, una mochila, una billetera, un sillín, un arnés, un látigo, un interior, un exterior, una tapicería, una encuadernación de libro, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, un interior de coche, un exterior de coche, un interior de barco, un exterior de barco, un interior de avión, un interior de yate, un exterior de yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol, o un dispositivo electrónico de consumo. En algunos casos, un artículo de piel puede ser una correa de reloj. En algunos casos, un artículo de piel puede ser un cinturón. En algunos casos, un artículo de piel puede ser una bolsa. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en un cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en un cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0011] Explicación de la invención

[0013] En la presente memoria se divulgan métodos para fabricar un cuero sintético. En algunos casos, el método puede comprender la colocación de una capa epidérmica artificial sobre una capa dérmica artificial formando así una estructura en capas. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un queratinocito y una capa dérmica puede comprender un fibroblasto. En algunos casos, el método puede comprender el curtido de por lo menos una porción de una estructura en capas, formando así un cuero sintético. En algunos casos, se puede diferenciar un fibroblasto o un queratinocito de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, un mamífero puede ser un mamífero no humano. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender un pigmento. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto de mamífero no humano puede ser uno de un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, un fibroblasto no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa epidérmica puede someterse a un procesamiento adicional. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una estructura en capas puede someterse a un procesamiento posterior. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa dérmica puede someterse a un procesamiento adicional.

[0014] En algunos casos, el procesamiento puede seleccionarse de un grupo que consiste en conservar, remojar, batir, encurtir, desencurtir, diluir, recurtir, lubricar, incrustar, humedecer, escurrir, rebajar, recromar, neutralizar, teñir, engrasar, llenar, pelar, embastecer, emblanquecer, fijar, asentar, secar, acondicionar, fresar, estacar, esmerilar, acabar, aceitar, cepillar, acolchar, impregnar, pulverizar, recubrir con rodillo, recubrir con cortina, pulir, chapar, estampar, planchar, vitrificar, ablandar y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el colágeno se puede producir por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se puede añadir por separado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, un queratinocito, un fibroblasto, un comeocito, un melanocito, una célula de Langerhans, una célula basal, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, en el que la célula epitelial puede comprender una célula escamosa, una célula cuboidal, una célula columnar, una célula basal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender un queratinocito, en el que el queratinocito puede comprender un queratinocito epitelial, queratinocito basal, queratinocito basal proliferante, queratinocito suprabasal diferenciado, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula muscular lisa. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una o más de queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. En algunos casos, una primera capa dérmica puede colocarse sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, un andamiaje puede comprender un adhesivo de tejido natural. En algunos casos, un adhesivo de tejido natural puede comprender cola de fibrina. En algunos casos, un andamiaje puede estar comprendido en parte en un cuero sintético. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica o una capa epidérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica con un suplemento. En algunos casos, un suplemento puede comprender uno o más de colágeno, fibrina, factores de crecimiento, ácido ascórbico, sulfato de dextrano o carragenina. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento natural. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento sintético. En algunos casos, se puede producir una célula madre pluripotente inducida a través de la expresión génica inducida de Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc o una combinación de los mismos en una célula somática adulta. En algunos casos, por lo menos una porción de un artículo de cuero puede formarse a partir de los métodos divulgados en la presente memoria. En algunos casos, un artículo de cuero puede comprender uno o más de los siguientes: una correa de reloj, un cinturón, un embalaje, un zapato, una bota, un calzado, un guante, ropa, equipaje, una bolsa, una bolsa de mano, una cartera, una mochila, una billetera, un sillín, un arnés, un látigo, un interior, un exterior, una tapicería, una encuadernación de libro, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, un interior de coche, un exterior de coche, un interior de barco, un exterior de barco, un interior de avión, un interior de yate, un exterior de yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol, o un dispositivo electrónico de consumo. En algunos casos, un artículo de piel puede ser una correa de reloj. En algunos casos, un artículo de piel puede ser un cinturón. En algunos casos, un artículo de piel puede ser una bolsa. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en un cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en un cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0016] En la presente memoria se divulgan métodos para fabricar un cuero sintético. En algunos casos, el método puede comprender la colocación de una capa epidérmica artificial sobre una capa dérmica artificial formando así una estructura en capas. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un queratinocito y una capa dérmica puede comprender un fibroblasto. En algunos casos, el método puede comprender eliminar por lo menos una porción de una capa epidérmica de una estructura en capas para formar un producto eliminado. En algunos casos, el método puede comprender el curtido de por lo menos una porción de un producto eliminado, formando así un cuero sintético. En algunos casos, se puede diferenciar un fibroblasto o un queratinocito de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender un pigmento. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un producto eliminado puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, un producto eliminado puede someterse a un procesamiento posterior. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto de mamífero no humano puede ser uno de un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, el no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa epidérmica puede someterse a un procesamiento adicional. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una estructura en capas puede someterse a un procesamiento posterior. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa dérmica puede someterse a un procesamiento adicional. En algunos casos, el procesamiento puede seleccionarse de un grupo que consiste en conservar, remojar, batir, encurtir, desencurtir, diluir, recurtir, lubricar, incrustar, humedecer, escurrir, rebajar, recromar, neutralizar, teñir, engrasar, llenar, pelar, embastecer, emblanquecer, fijar, asentar, secar, acondicionar, fresar, estacar, esmerilar, acabar, aceitar, cepillar, acolchar, impregnar, pulverizar, recubrir con rodillo, recubrir con cortina, pulir, chapar, estampar, planchar, vitrificar, ablandar y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el colágeno se puede producir por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se puede añadir por separado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, un queratinocito, un fibroblasto, un comeocito, un melanocito, una célula de Langerhans, una célula basal, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, en el que la célula epitelial puede comprender una célula escamosa, una célula cuboidal, una célula columnar, una célula basal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender un queratinocito, en el que el queratinocito puede comprender un queratinocito epitelial, queratinocito basal, queratinocito basal proliferante, queratinocito suprabasal diferenciado, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula muscular lisa. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una o más de queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. En algunos casos, una primera capa dérmica puede colocarse sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, un andamiaje puede comprender un adhesivo de tejido natural. En algunos casos, un adhesivo de tejido natural puede comprender cola de fibrina. En algunos casos, un andamiaje puede estar comprendido en parte en un cuero sintético. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica o una capa epidérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica con un suplemento. En algunos casos, un suplemento puede comprender uno o más de colágeno, fibrina, factores de crecimiento, ácido ascórbico, sulfato de dextrano o carragenina. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento natural. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento sintético. En algunos casos, se puede producir una célula madre pluripotente inducida a través de la expresión génica inducida de Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc o una combinación de los mismos en una célula somática adulta. En algunos casos, por lo menos una porción de un artículo de cuero puede formarse a partir de los métodos divulgados en la presente memoria. En algunos casos, un artículo de cuero puede comprender uno o más de los siguientes: una correa de reloj, un cinturón, un embalaje, un zapato, una bota, un calzado, un guante, ropa, equipaje, una bolsa, un bolso de mano, una cartera, una mochila, una billetera, un sillín, un arnés, un látigo, un interior, un exterior, una tapicería, una encuadernación de libro, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, un interior de coche, un exterior de coche, un interior de barco, un exterior de barco, un interior de avión, un interior de yate, un exterior de yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol, o un dispositivo electrónico de consumo. En algunos casos, un artículo de piel puede ser una correa de reloj. En algunos casos, un artículo de piel puede ser un cinturón. En algunos casos, un artículo de piel puede ser una bolsa. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en un cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en un cuero sintético se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0018] En la presente memoria se divulgan cueros sintéticos curtidos. En algunos casos, antes del curtido, un cuero sintético curtido puede comprender una capa dérmica artificial que comprende fibroblastos. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, antes del curtido, un cuero sintético curtido puede comprender, además, una capa epidérmica artificial. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, un queratinocito. En algunos casos, una capa epidérmica puede estar sobre una capa dérmica formando así una estructura en capas. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, un pigmento. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, un mamífero puede ser un mamífero no humano. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto de mamífero no humano puede ser uno de un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, un fibroblasto no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, el colágeno se puede producir por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se puede añadir por separado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, un queratinocito, un fibroblasto, un comeocito, un melanocito, una célula de Langerhans, una célula basal, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, en el que una célula epitelial puede comprender una célula escamosa, una célula cuboidal, una célula columnar, una célula basal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender un queratinocito, en el que un queratinocito comprende queratinocito epitelial, queratinocito basal, queratinocito basal proliferante, queratinocito suprabasal diferenciado, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula muscular lisa. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una o más de queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. En algunos casos, una primera capa dérmica puede estar sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, un andamiaje puede comprender un adhesivo de tejido natural. En algunos casos, un adhesivo de tejido natural puede comprender cola de fibrina. En algunos casos, un andamiaje puede estar comprendido en parte en un cuero sintético curtido. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica o una capa epidérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vitro. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en uno o más de los siguientes: una correa de reloj, un cinturón, un embalaje, un zapato, una bota, un calzado, un guante, ropa, equipaje, una bolsa, un bolso de mano, una cartera, una mochila, una billetera, un sillín, un arnés, un látigo, un interior, un exterior, una tapicería, una encuadernación de libro, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, un interior de coche, un exterior de coche, un interior de barco, un exterior de barco, un interior de avión, un interior de yate, un exterior de yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol o un dispositivo electrónico de consumo. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en una correa de reloj. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en un cinturón. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en una bolsa. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en un cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en un cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0019] En la presente memoria se divulgan cueros sintéticos curtidos. En algunos casos, antes del curtido, un cuero sintético curtido puede comprender una estructura en capas. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa dérmica artificial. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender un fibroblasto. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa epidérmica artificial. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un queratinocito. En algunos casos, se puede diferenciar un fibroblasto o un queratinocito de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, un pigmento. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto de mamífero no humano puede ser uno de un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, un fibroblasto no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, el colágeno se puede producir por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se puede añadir por separado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, un queratinocito, un fibroblasto, un comeocito, un melanocito, una célula de Langerhans, una célula basal, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, en el que una célula epitelial puede comprender una célula escamosa, una célula cuboidal, una célula columnar, una célula basal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender un queratinocito, en el que un queratinocito comprende queratinocito epitelial, queratinocito basal, queratinocito basal proliferante, queratinocito suprabasal diferenciado, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula muscular lisa. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una o más de queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. En algunos casos, una primera capa dérmica puede estar sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, un andamiaje puede comprender un adhesivo de tejido natural. En algunos casos, un adhesivo de tejido natural puede comprender cola de fibrina. En algunos casos, un andamiaje puede estar comprendido en parte en un cuero sintético curtido. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica o una capa epidérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vitro. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en uno o más de los siguientes: una correa de reloj, un cinturón, un embalaje, un zapato, una bota, un calzado, un guante, ropa, equipaje, una bolsa, un bolso de mano, una cartera, una mochila, una billetera, un sillín, un arnés, un látigo, un interior, un exterior, una tapicería, una encuadernación de libro, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, un interior de coche, un exterior de coche, un interior de barco, un exterior de barco, un interior de avión, un interior de yate, un exterior de yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol o un dispositivo electrónico de consumo. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en una correa de reloj. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en un cinturón. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en una bolsa. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en un cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en un cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0020] En la presente memoria se divulgan cueros sintéticos curtidos. En algunos casos, antes del curtido, un cuero sintético curtido puede comprender un producto eliminado que comprende una estructura en capas. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa dérmica artificial. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender un fibroblasto. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa epidérmica artificial. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un queratinocito. En algunos casos, se puede eliminar una porción de una capa epidérmica. En algunos casos, se puede diferenciar un fibroblasto o un queratinocito de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un producto eliminado puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, un pigmento. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto de mamífero. En algunos casos, un fibroblasto de mamífero no humano puede ser uno de un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, un fibroblasto no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender, además, colágeno. En algunos casos, el colágeno se puede producir por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se puede añadir por separado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, un queratinocito, un fibroblasto, un comeocito, un melanocito, una célula de Langerhans, una célula basal, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula epitelial, en el que una célula epitelial puede comprender una célula escamosa, una célula cuboidal, una célula columnar, una célula basal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender un queratinocito, en el que un queratinocito comprende queratinocito epitelial, queratinocito basal, queratinocito basal proliferante, queratinocito suprabasal diferenciado, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula productora de colágeno puede comprender una célula muscular lisa. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una o más de queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. En algunos casos, una primera capa dérmica puede estar sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender, además, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, un andamiaje puede comprender un adhesivo de tejido natural. En algunos casos, un adhesivo de tejido natural puede comprender cola de fibrina. En algunos casos, un andamiaje puede estar comprendido en parte en un cuero sintético curtido. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica o una capa epidérmicain vitro. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vitro. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en uno o más de los siguientes: una correa de reloj, un cinturón, un embalaje, un zapato, una bota, un calzado, un guante, ropa, equipaje, una bolsa, un bolso de mano, una cartera, una mochila, una billetera, un sillín, un arnés, un látigo, un interior, un exterior, una tapicería, una encuadernación de libro, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, un interior de coche, un exterior de coche, un interior de barco, un exterior de barco, un interior de avión, un interior de yate, un exterior de yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol o un dispositivo electrónico de consumo. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en una correa de reloj. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en un cinturón. En algunos casos, un cuero sintético curtido puede estar comprendido en una bolsa. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en un cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en un cuero sintético curtido se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0021] En la presente memoria se divulgan capas epidérmicas artificiales. En algunos casos, una capa epidérmica artificial puede comprender una célula del folículo piloso y un melanocito. En algunos casos, una capa epidérmica artificial puede comprender una célula del folículo piloso. En algunos casos, una capa epidérmica artificial puede comprender un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, una célula del folículo piloso puede comprender una célula de la papila dérmica, una célula de la vaina radicular externa o una combinación de las mismas. En algunos casos, un melanocito puede ser un melanocito de mamífero. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, un queratinocito. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, un queratinocito puede ser un queratinocito de mamífero. En algunos casos, el queratinocito de mamífero puede ser un mamífero humano. En algunos casos, un mamífero no humano puede ser un primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. En algunos casos, un fibroblasto puede ser un fibroblasto no mamífero. En algunos casos, un no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un folículo piloso. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en una capa epidérmica artificial se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en una capa epidérmica artificial se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en una capa epidérmica artificial se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0023] En la presente memoria se divulgan estructuras en capas. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa epidérmica artificial. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender una célula del folículo piloso. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa dérmica artificial. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender un fibroblasto. En algunos casos, un fibroblasto se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, un queratinocito. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula del folículo piloso puede ser una célula de la papila dérmica, una célula de la vaina radicular externa o una combinación de las mismas. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, se puede pigmentar una estructura en capas. En algunos casos, se puede estratificar una capa epidérmica. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede estar entre una capa epidérmica y una capa dérmica. En algunos casos, un sustituto de la membrana basal puede comprender una membrana amniótica acelular seca. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, una capa dérmica puede estar sobre un andamiaje. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender uno o más componentes seleccionados de un grupo que consiste en queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, dos o más capas dérmicas. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un folículo piloso. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender, además, un pelaje. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0025] En la presente memoria se divulgan métodos para fabricar una estructura en capas. En algunos casos, el método puede comprender la colocación de una capa epidérmica artificial que comprende una célula del folículo piloso sobre una capa dérmica artificial que comprende una célula diferenciada de una célula madre pluripotente inducida formando así una estructura en capas. En algunos casos, una célula diferenciada de una célula madre pluripotente inducida puede ser un fibroblasto, melanocito, queratinocito o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula diferenciada de una célula madre pluripotente inducida puede ser un fibroblasto. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, un queratinocito. En algunos casos, un queratinocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una célula del folículo piloso puede comprender una célula de la papila dérmica, una célula de la vaina radicular externa o una combinación de las mismas. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender, además, un melanocito. En algunos casos, un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica con un suplemento. En algunos casos, un suplemento puede comprender colágeno, fibrina, factores de crecimiento, ácido ascórbico, sulfato de dextrano, carragenina o una combinación de los mismos. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento natural. En algunos casos, un suplemento puede ser un suplemento sintético. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede ser natural o sintético. En algunos casos, un andamiaje puede comprender seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender quitosano. En algunos casos, se puede colocar una capa dérmica sobre un andamiaje. En algunos casos, se puede estratificar una capa epidérmica. En algunos casos, una capa dérmica puede cultivarse sobre una segunda capa dérmica. En algunos casos, se puede cultivar una capa dérmicain vivo. En algunos casos, una capa dérmica puede no cultivarse sobre una matriz de colágeno. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0027] En la presente memoria se divulgan estructuras en capas. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa epidérmica artificial que comprende una célula del folículo piloso y un queratinocito o un melanocito; una capa dérmica artificial que comprende un fibroblasto, en el que un fibroblasto, un queratocito o un melanocito se puede diferenciar de una célula madre pluripotente inducida, en el que un melanocito expresa Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos, en el que un fibroblasto expresa CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos, en el que un queratinocito expresa KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa epidérmica artificial. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender una célula del folículo piloso. En algunos casos, una capa epidérmica puede comprender un queratinocito o un melanocito. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa dérmica artificial. En algunos casos, una capa dérmica puede comprender un fibroblasto. En algunos casos, se puede diferenciar un fibroblasto, un queratinocito o un melanocito de una célula madre pluripotente inducida. En algunos casos, un melanocito puede expresar Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA o una combinación de los mismos. En algunos casos, un fibroblasto puede expresar CD10, CD73, CD44, CD90, colágeno tipo I, colágeno tipo III, prolil-4-hidroxilasa beta, o una combinación de los mismos. En algunos casos, un queratinocito puede expresar KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 o una combinación de los mismos. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa dérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. En algunos casos, un grosor de una capa epidérmica puede variar de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en una estructura en capas se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0029] En la presente memoria se divulga una capa epidérmica artificial. Una capa epidérmica artificial puede comprender un estrato córneo. Una capa epidérmica artificial puede comprender un estrato granuloso. Una capa epidérmica artificial puede comprender un estrato espinoso. Una capa epidérmica artificial puede comprender un estrato basal. En algunos casos, un estrato córneo, un estrato granuloso, un estrato espinoso o un estrato basal pueden organizarse como se representa en la Figura 6A o la Figura 8A. El grosor de un estrato córneo puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,05 mm. El grosor del estrato granuloso puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,15 mm. El grosor de un estrato espinoso puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,15 mm. Un grosor del estrato basal puede variar de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,15 mm. Un grosor de un estrato córneo puede variar de alrededor del 4 % a alrededor del 20 % de una capa epidérmica artificial. Un grosor de un estrato granuloso puede variar de alrededor del 4 % a alrededor del 60 % de una capa epidérmica artificial. Un grosor de un estrato espinoso puede variar de alrededor del 4 % a alrededor del 40 % de una capa epidérmica artificial. Un grosor de una capa basal puede variar de alrededor del 4 % a alrededor del 40 % de una capa epidérmica artificial. Por lo menos alrededor del 2 % de las células comprendidas en una capa epidérmica artificial se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 10 % de las células comprendidas en una capa epidérmica artificial se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida. Por lo menos alrededor del 50 % de las células comprendidas en una capa epidérmica artificial se pueden diferenciar de una célula madre pluripotente inducida.

[0030] Breve descripción de los dibujos

[0031] Las características novedosas divulgadas en la presente memoria se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos divulgados en la presente memoria que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones son para ayudar al experto en la materia a comprender y poner en práctica la invención divulgada, pero no forman parte de la invención reivindicada. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de las características divulgadas en la presente memoria por la referencia a la siguiente descripción detallada que expone ejemplos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de las características descritas en la presente memoria, y los dibujos que la acompañan en los que:

[0032] La figura 1 ilustra un esquema de producción de cuero sintético.

[0033] Las figuras 2A-2F ilustran una estructura en capas. La figura 2A representa una estructura en capas que comprende una capa epidérmica y una capa dérmica en un andamiaje. La figura 2B representa una estructura en capas que comprende una capa epidérmica, un sustituto de la membrana basal y una capa dérmica en un andamiaje. La figura 2C representa una estructura en capas que comprende una capa epidérmica y múltiples capas dérmicas en un andamiaje. La figura 2D representa una estructura en capas que comprende una capa epidérmica, un sustituto de la membrana basal y múltiples capas dérmicas en un andamiaje. La figura 2E representa una estructura en capas que comprende una capa epidérmica, un sustituto de la membrana basal y múltiples capas dérmicas. La figura 2F representa una estructura en capas que comprende una capa epidérmica y múltiples capas dérmicas.

[0034] La figura 3 ilustra el desarrollo de una estructura en capas.

[0035] Las figuras 4A-4C ilustran un análisis comparativo del cuero (figura 4A), la piel nativa (figura 4B) y el equivalente epidérmico (figura 4C).

[0036] Las figuras 5A-5C ilustran un análisis comparativo delestrato córneode la piel nativa y el equivalente epidérmico. La figura 5A representa una imagen de la superficie epidérmica. La figura 5B representa una imagen de un corneodesmosoma. La figura 5C representa una imagen de CDSN/Hoechst.

[0037] Las figuras 6A-6E ilustran un análisis comparativo delestrato granulosode la piel nativa y el equivalente epidérmico. La figura 6A representa una tinción con loricrina (LOR). La figura 6B representa un gradiente de Ca<++>epidérmico capturado en microscopía electrónica de transmisión como precipitados densos en electrones. La figura 6C representa una evaluación de la integridad de la barrera de permeabilidad por perfusión de lantano. La figura 6D ilustra que la proteína de unión estrecha 1/zonula ocludens-1 (TJP1/ZO-1) ancla las proteínas de las cadenas de unión estrecha, que pueden ser estructuras similares a fibrillas dentro de la bicapa lipídica, al citoesqueleto de actina. La figura 6E ilustra que los monómeros de filagrina (FLG), agrupados en tándem en un gran precursor proteico de 350 kDa conocido como profilagrina, se encuentran presentes en los gránulos de queratohialina en las células del SG.

[0038] Las figuras 7A-7C ilustran una formación de bicapa lipídica en piel nativa y el equivalente epidérmico evaluado con TEM. La figura 7A representa la secreción normal de lípidos en el límite de SC y SG. La figura 7B representa los cuerpos lamelares en el SG. La figura 7C representa la morfología normal de bicapa lipídica (LB) de la piel nativa. Las figuras 8A-8C ilustran un análisis comparativo de los marcadores de las capas suprabasales de la piel nativa y del equivalente epidérmico, incluyendo la queratina 10 (KRT10; figura 8A), queratina 1 (KRT1; figura 8B), desmocolina 1 (DCL1; figura 8C), marcadores de las capas suprabasales. La figura 8D representa los desmosomas tanto en la piel nativain vivocomo en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro.

[0039] Las figuras 9A-9C ilustran un análisis comparativo delestrato basalde la piel nativa y el equivalente epidérmico. MKI67 (figura 9A), un marcador de proliferación, queratina 14 (KRT14; figura 9B), y el factor de transcripción TP63 (figura 9C) muestran la distribución típica de la capa basal tanto en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) como en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro. La figura 9D representa hemidesmosomas tanto en piel nativain vivocomo equivalentes epidérmicos generadosin vitro.

[0040] Las figuras 10A-10F ilustran un análisis comparativo de los componentes de la matriz extracelular de la membrana basal. La figura 10A representa la expresión de la integrina β1. La figura 10B representa la expresión de la fibronectina. La figura 10C representa la expresión del colágeno IV. La figura 10D representa la expresión del colágeno VI. La figura 10E representa la expresión del colágeno VII. La figura 10F representa la expresión de la laminina 5.

[0041] Las figuras 11A-11I ilustran un análisis estructural de un equivalente cutáneo de grosor completo (FSE). Las figuras 11A y 11B representan secciones transversales del FSE que visualizan distintas capas celulares de la epidermis con un aumento de 2600x (figura 11A) y un aumento de 5200x (figura 11B). La figura 11C representa una superficie de un FSE con un aumento de 900x. Las figuras 11D - 1F representan secciones longitudinales del andamiaje dérmico con fibroblastos dérmicos residentes y una matriz extracelular rica con un aumento de 91x (figura 11D), un aumento de 162x (figura 11E) y un aumento de 405x (figura 11F). Las figuras 11G - 11I representan andamiajes dérmicos con fibroblastos dérmicos residentes y una matriz extracelular rica con un aumento de 80x (figura 11G), un aumento de 695x (figura 11H) y un aumento de 2700x (figura 11I).

[0042] Las figuras 12A-12R ilustran una evolución temporal del equivalente dérmico geomanipulado. Las figuras 12A-12I representan el día 2 después de sembrar fibroblastos dérmicos en el andamiaje con un aumento de 36x (figura 12A), un aumento de 695x (figura 12B), un aumento de 1470x (figura 12C), un aumento de 7750x (figura 12D), un aumento de 2320x (figura 12E), un aumento de 2420x (figura 12F), un aumento de 6560x (figura 12G), un aumento de 17000x (figura 12H) y un aumento de 22000x (figura 12I). Las figuras 12J -12R representan el día 7 después de sembrar fibroblastos dérmicos en el andamiaje con un aumento de 64x (figura 12J), un aumento de 100x (figura 12K), un aumento de 364x (figura 12L), un aumento de 82x (figura 12M), un aumento de 253x (figura 12N), un aumento de 3940x (figura 12O), un aumento de 5550x (figura 12P), un aumento de 9440x (figura 12Q) y un aumento de 21680x (figura 12R).

[0043] Realización preferente de la invención

[0044] A continuación se describen varios aspectos con referencia aplicaciones de ejemplo a modo de ilustración.

[0045] Los ejemplos y aspectos divulgados en la presente memoria que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas son para ayudar al experto en la materia a comprender y poner en práctica la presente divulgación, pero no forman parte de la invención reivindicada. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de las características descritas en la presente memoria.

[0046] La terminología utilizada en la presente memoria tiene como objetivo describir casos particulares. Tal como se usa en la presente memoria, las formas singulares «un», «uno/a» y «el/la» también incluyen las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que se utilicen los términos «incluyendo», «incluye», «teniendo», «tiene», «con» o variantes de los mismos en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichos términos se consideran inclusivos de manera similar al término «que comprende».

[0047] En esta divulgación, el término «aproximadamente» puede significar un intervalo de hasta el 10 % de un valor dado. En esta divulgación, el término «sustancialmente» se refiere a algo que se puede hacer en gran medida o grado. Tal como se usa en la presente memoria, el término «célula madre pluripotente» puede referirse a cualquier célula precursora que tiene la capacidad de formar cualquier célula adulta.

[0048] Tal como se usa en la presente memoria, el término «células madre embrionarias» o «células ES» o «ESC» puede referirse a células precursoras que tienen la capacidad de formar cualquier célula adulta.

[0049] Tal como se usa en la presente memoria, el término «células madre pluripotentes inducidas» o «células iPS» o «iPSC» puede referirse a un tipo de célula madre pluripotente derivada artificialmente de una célula no pluripotente (por ejemplo, una célula somática adulta). Las células madre pluripotentes inducidas pueden ser idénticas a las células madre embrionarias en la capacidad de formar cualquier célula adulta, pero no derivan de un embrión. En algunos casos, las células IPSC divulgadas en la presente memoria pueden ser células IPSC.

[0050] Tal como se usa en la presente memoria, el término «cuero sintético» puede referirse a que los equivalentes de la piel divulgados en la presente memoria pueden servir de equivalente cutáneo para cualquier mamífero o no mamífero, tal como primates no humanos y miembros de las especies bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina, así como roedores tal como ratones, ratas y cobayas, miembros de la familia de los lagomorfos, incluidos los conejos; y no mamíferos tal como peces, incluidos tiburones y rayas, aves, incluido el avestruz, y reptiles, incluidos lagartos, serpientes y cocodrilos. El cuero sintético de mamífero particular que se formará puede depender de la fuente de las células utilizadas en los casos descritos en la presente memoria, por ejemplo, queratinocitos y fibroblastos, por ejemplo, cuando se utilizan queratinocitos y fibroblastos bovinos para formar un equivalente cutáneo, se puede formar un cuero sintético bovino.

[0051] Descripción general

[0052] En la presente memoria se divulgan cueros sintéticos, capas epidérmicas artificiales, capas dérmicas artificiales, estructuras en capas, productos fabricados a partir de los mismos y métodos para producir los mismos. Las diversas características y casos divulgados en los párrafos siguientes no forman parte de la invención. La invención se define en las reivindicaciones. En determinados casos, se divulgan en la presente memoria cueros sintéticos. En algunos casos, un cuero sintético comprende una o una pluralidad de capas. En algunos casos, una o una pluralidad de capas comprende células, en el que las células se cultivanin vitro. En algunos casos, los métodos divulgados en la presente memoria proporcionan métodos de alto rendimiento que escalan de forma fiable, exacta y reproducible hasta niveles comerciales la producción de cuero sintético. Las ventajas del cuero sintético, equivalente epidérmico genomanipulado, equivalente cutáneo de grosor completo genomanipulado y los métodos para fabricar los mismos que se divulgan en la presente memoria incluyen la producción de tejidos personalizados de forma reproducible, con alto rendimiento y fácilmente escalable, y con un aspecto, textura, grosor y durabilidad atractivos. Tal como se usa en la presente memoria, un equivalente cutáneo de grosor completo puede comprender por lo menos una capa dérmica y por lo menos una capa epidérmica. Tal como se usa en la presente memoria, equivalente cutáneo de grosor completo y equivalente cutáneo completo pueden usarse de forma intercambiable.

[0053] Un cuero sintético divulgado en la presente memoria puede comprender una capa de capa dérmica artificial que comprende un fibroblasto y una capa epidérmica artificial que comprende un queratinocito. La capa dérmica y la capa epidérmica pueden formar una estructura en capas. Un cuero sintético puede comprender una o más estructuras en capas. El cuero sintético se puede curtir y procesar adicionalmente. Las células que forman la capa sintética se pueden diferenciar de las células madre, por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La capa dérmica se puede colocar sobre un andamiaje, tal como la seda, para conseguir el grosor y la textura naturales del cuero.

[0054] También se divulgan en la presente memoria métodos para fabricar un cuero sintético. El método puede comprender formar una estructura en capas que comprende una capa dérmica artificial y una capa epidérmica artificial, y curtir la estructura en capas. Los métodos pueden comprender, además, el procesamiento adicional de las capas dérmicas artificiales y las capas epidérmicas, por ejemplo, para lograr el grosor y la textura naturales del cuero.

[0055] Cuero sintético

[0056] Un cuero sintético puede comprender una o más capas celulares. Por ejemplo, un cuero sintético puede comprender uno o más de: una capa dérmica, una capa epidérmica y una membrana basal o un sustituto de la membrana basal. Un cuero sintético puede comprender, además, hipodermis, escamas, placa, osteodermis, o una combinación de los mismos. En algunos casos, una capa sintética comprende un equivalente cutáneo de grosor completo. Dicho equivalente cutáneo de grosor completo puede comprender cualquiera o una combinación de las capas divulgadas en la presente memoria. Una porción de una o más capas celulares en un cuero sintético puede eliminarse, por ejemplo, mediante rebajado. En algunos casos, el cuero sintético se puede curtir. El curtido se puede realizar después de la formación de una o más de las capas celulares o estructuras en capas. El curtido se puede realizar después de que por lo menos una porción de una capa celular se pueda eliminar de un cuero sintético. En algunos casos, un cuero sintético se puede procesar adicionalmente. En algunos casos, un cuero sintético puede comprender una célula del folículo piloso y un melanocito. La célula del folículo piloso y/o el melanocito se pueden diferenciar de una célula madre (por ejemplo, una iPSC).

[0057] Un cuero sintético curtido puede comprender una estructura en capas. Una estructura en capas puede comprender una capa dérmica artificial que comprende un fibroblasto. Una estructura en capas puede comprender, además, una capa epidérmica artificial que comprende un queratinocito. En algunos casos, una estructura en capas puede comprender una capa dérmica artificial que comprende un fibroblasto y una capa epidérmica artificial que comprende un queratinocito. En algunos casos, se puede diferenciar un fibroblasto o un queratinocito de una célula madre pluripotente inducida.

[0058] En algunos casos, un cuero sintético curtido puede comprender por lo menos parte de una capa dérmica. En algunos casos, un cuero sintético curtido no comprende una capa dérmica. En algunos casos, se puede eliminar una capa dérmica.

[0059] Capa dérmica

[0060] Un cuero sintético puede comprender una capa dérmica (por ejemplo, una capa dérmica artificial). Una capa dérmica puede ser un equivalente de la dermis genomanipulado, por ejemplo, una capa dérmica artificial formadain vitro. Una capa dérmica puede comprender células de tejido conjuntivo. Por ejemplo, una capa dérmica puede comprender fibroblastos. Los fibroblastos en la capa dérmica pueden expresar uno o más marcadores que incluyen, pero no se limitan a, el grupo de diferenciación 10 (CD10), el grupo de diferenciación 73 (CD73), grupo de diferenciación 44 (CD44), grupo de diferenciación 90 (CD90), colágeno tipo I, colágeno tipo III, y fibroblastos de prolil-4-hidroxilasa beta. En algunos casos, una capa dérmica comprende, además, otros tipos de células, tales como células inmunitarias, macrófagos, adipocitos, o una combinación de los mismos.

[0061] Una capa dérmica puede comprender, además, componentes de matriz además de células. Los ejemplos de componentes de la matriz incluyen, pero no se limitan a, uno o más de colágeno, elastina y matriz extrafibrilar, una sustancia extracelular similar a un gel compuesta principalmente de glucosoaminoglicanos (por ejemplo, hialuronano), proteoglicanos y glicoproteínas.

[0062] Una capa dérmica puede comprender un soporte de matriz. Un soporte de matriz puede ser un andamiaje. El soporte de matriz puede comprender geles de colágeno contraídos. Las alternativas a una matriz de colágeno puro pueden ser una malla de ácido poliglicólico, por ejemplo, como se describe en Hansbrough et al., J. Burn Care Rehabil., 15:346-53 (1994), o una matriz de colágeno y glucosaminoglicano cubierta con una membrana silástica (C-GAG), como se describe en Burke et al., Ann. Surg., 194:413-420 (1981) o varios biopolímeros, por ejemplo, el quitosano, como se describe en Kellouche et al., Biochem Biophys Res Commun., 363:472-478 (2007). En algunos casos, la matriz puede sembrarse con fibroblastos, por ejemplo, para dar lugar a modelos organotípicos. La dermis de origen natural, procedente de piel alogénica de cadáver, también se puede utilizar con láminas de queratinocitos. Una variación de esta técnica puede usar dermis desvitalizada liofilizada de piel de cadáver para admitir las láminas de queratinocitos.

[0064] El grosor de las unidades de cuero puede expresarse en milímetros, onzas o hierros. (Una onza equivale a<1>ൗ 64 pulg. o 0,0156 pulg. o 0,396 mm. Un hierro equivale a 0,0208<1>ൗ 48 pulg. o 0,53 mm.)

[0066] El grosor de una capa dérmica puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, el grosor de una capa dérmica puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, el grosor de una capa dérmica puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm, o 0,01 mm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener un grosor de por lo menos alrededor de 50 mm.

[0068] La longitud de una capa dérmica puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una capa dérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la longitud de una capa dérmica puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la longitud de una capa dérmica puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm, o 0,01 mm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m.

[0070] La anchura de una capa dérmica puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una anchura de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una anchura de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una anchura de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la anchura de una capa dérmica puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la anchura de una capa dérmica puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700 o 1000 mm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm. En algunos casos, una capa dérmica puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o 400 m.

[0071] Un cuero sintético puede comprender una o más capas dérmicas. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40, 60, 80 o 100 capas dérmicas. Cuando un cuero sintético comprende más de una capa dérmica, una capa dérmica puede colocarse sobre otra capa dérmica. Por ejemplo, un cuero sintético puede comprender dos capas dérmicas, por ejemplo, una primera capa dérmica y una segunda capa dérmica. La primera capa dérmica puede colocarse sobre la segunda capa dérmica.

[0072] Una capa dérmica puede estratificarse, por ejemplo, tener una pluralidad de subcapas. Las subcapas pueden tener diferentes composiciones, por ejemplo, diferentes concentraciones de las fibras. Las subcapas de una capa dérmica pueden tener diferentes grosores y densidades. Por ejemplo, una capa dérmica puede tener una capa dérmica papilar, una capa dérmica reticular, o cualquier combinación de las mismas. Una capa dérmica papilar puede comprender tejido conjuntivo areolar suelto y/o fibras dispuestas sueltas, por ejemplo, fibras de colágeno. Una capa dérmica reticular puede comprender tejido conjuntivo denso e irregular, que incluye fibras de colágeno y fibras elásticas dérmicas.

[0073] Una capa dérmica puede comprender una matriz o red de colágeno libre, que puede ser contraíble en todas las direcciones, y homogénea. Los fibroblastos y, cuando corresponda, otros tipos de células de la dermis, pueden distribuirse en un gel de colágeno continuo. El equivalente de la dermis puede comprender por lo menos una matriz de colágeno tipo I en la que se distribuyen los fibroblastos. También puede contener otros constituyentes de la matriz extracelular. Un componente de la matriz extracelular puede incluir colágenos, por ejemplo, colágeno IV, lamininas, entactina, fibronectina, proteoglicanos, glucosoaminoglicanos o ácido hialurónico. Una capa dérmica puede contener colágeno tipo IV y laminina, entactina, o una combinación de los mismos. Las concentraciones de estos diversos constituyentes se pueden ajustar. Por ejemplo, la concentración de laminina puede ser de alrededor del 1 % a alrededor del 15 % del volumen final. Por ejemplo, la concentración de colágeno IV puede ser de alrededor del 0,3 % a alrededor del 4,5 % del volumen final. Por ejemplo, la concentración de entactina puede ser de alrededor del 0,05 % y el 1 % del volumen final. El colágeno utilizado puede ser de origen bovino, de cola de rata o de pescado, o cualquier otra fuente de colágeno natural o colágeno producido por ingeniería genética que permita la contracción en presencia de fibroblastos. En algunos casos, el colágeno puede proceder de una fuente no natural. La matriz puede ser un gel de colágeno que no puede tensarse, obtenido por contracción tanto horizontal como verticalmente, lo que no impone una organización preferencial de los fibroblastos. Tal matriz, también denominada «libre», puede no adherirse al soporte y los volúmenes de la misma pueden modificarse sin límite, confiriéndole un grosor y diámetro variables. El grosor del equivalente de la dermis puede ser de por lo menos 0,05 cm y, en algunos casos, aproximadamente de 0,05 a 2 cm. El grosor también puede aumentarse sin dañar las propiedades ventajosas del cuero sintético o equivalente cutáneo. En algunos casos, el grosor puede ser de alrededor de 3 mm a alrededor de 20 cm o más.Capa epidérmica

[0074] Un cuero sintético puede comprender una capa epidérmica (por ejemplo, una capa epidérmica artificial). Una capa epidérmica puede ser un equivalente de la epidermis genomanipulado, por ejemplo, una capa epidérmica artificial formadain vitro.

[0075] Una capa epidérmica puede comprender uno o más tipos de células, que incluyen queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans, células de Merkel y células inflamatorias. Por ejemplo, una capa epidérmica puede comprender queratinocitos. Los queratinocitos en una capa epidérmica pueden incluir queratinocitos epiteliales, queratinocitos basales, queratinocitos basales proliferantes, queratinocitos suprabasales diferenciados, o cualquier combinación de los mismos.

[0076] En algunos casos, una capa epidérmica comprende por lo menos queratinocitos basales, por ejemplo, queratinocitos que no se diferencian. Una capa epidérmica puede comprender, además, queratinocitos parcialmente diferenciados, así como queratinocitos completamente diferenciados. En una o más capas epidérmicas en un cuero sintético puede haber una transición de queratinocitos basales indiferenciados a queratinocitos completamente diferenciados a medida que se avanza desde la unión dermoepidérmica donde se localizan los queratinocitos basales.

[0077] Los queratinocitos basales pueden expresar hemidesmosomas, que sirven para ayudar a unir las capas epidérmica y dérmica. Los queratinocitos basales también pueden servir para regenerar la piel. Una capa epidérmica en un cuero sintético en la presente memoria puede tener queratinocitos basales que sirven para estas funciones. Así, un cuero sintético que comprende tales queratinocitos basales puede ser capaz de regenerarse. Otras distinciones entre los queratinocitos basales y los queratinocitos diferenciados en una o más capas epidérmicas en un cuero sintético pueden ser que tanto la cadherina E como la cadherina P están presentes en los queratinocitos epidérmicos a lo largo de la zona de la membrana basal (BMZ), pero los queratinocitos que están diferenciados y ubicados lejos de la BMZ solo expresan cadherina E.

[0078] Los queratinocitos basales de una capa epidérmica pueden alinearse en una capa en contacto directo con la capa dérmica, que sirve de límite entre los queratinocitos diferenciados y los fibroblastos. En casos alternativos, hay espacios entre los queratinocitos basales y la capa dérmica. Aún más, puede haber espacios entre los queratinocitos basales y otros queratinocitos basales, dejando espacios entre los queratinocitos diferenciados y la capa dérmica. En estos últimos casos en los que hay espacios entre los queratinocitos basales o diferenciados y la capa dérmica, las capas dérmica y epidérmica no están en contacto uniformemente entre sí, sino que están adyacentes entre sí. Son adyacentes en el sentido de que pueden ser generalmente fluidos, pero no hay sustancialmente otros materiales intermedios, tales como capas de células, colágeno, matrices u otros soportes entre las capas dérmica y epidérmica.

[0079] Los queratinocitos en una capa epidérmica pueden expresar uno o más marcadores. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, queratina 14 (KRT14), proteína tumoral p63 (p63), desmogleína 3 (DSG3), integrina, beta 4 (ITGB4), laminina, alfa 5 (LAMA5), queratina 5 (KRT5), una isoforma de la proteína tumoral p63 (por ejemplo, Tap63), laminina, beta 3 (LAMB3) y queratina 18 (KRT18).

[0081] El grosor de una capa epidérmica puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso del cuero sintético. Una capa epidérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,001 mm a alrededor de 10 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 1, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,8 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,4 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,2 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 0,1 mm, de alrededor de 0,05 mm a alrededor de 0,4 mm, de alrededor de 0,05 mm a alrededor de 0,2 mm, de alrededor de 0,05 mm a alrededor de 0,1 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,4 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,2 mm, de alrededor de 0,08 mm a alrededor de 1 mm, o de alrededor de 0,05 mm a alrededor de 1,5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 2 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,22 mm. En algunos casos, el grosor de una capa epidérmica puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, el grosor de la capa dérmica puede ser de como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, los valores de grosor descritos en la presente memoria pueden ser el grosor de una capa epidérmica y un sustituto de la membrana basal.

[0083] La longitud de una capa epidérmica puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una capa epidérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una longitud de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la longitud de una capa epidérmica puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la longitud de una capa epidérmica puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, una capa epidérmica puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, una capa epidérmica puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm. En algunos casos, una capa epidérmica puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o 400 m.

[0084] La anchura de una capa epidérmica puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una capa epidérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una anchura de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener un grosor de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una anchura de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una anchura de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la anchura de una capa epidérmica puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la anchura de una capa epidérmica puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, una capa epidérmica puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, una capa epidérmica puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm. En algunos casos, una capa epidérmica puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m.

[0085] Un cuero sintético puede comprender una o más capas epidérmicas. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener por lo menos alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40, 60, 80 o 100 capas epidérmicas. Cuando un cuero sintético comprende más de una capa epidérmica, una capa epidérmica puede colocarse sobre otra capa epidérmica. Por ejemplo, un cuero sintético puede comprender dos capas epidérmicas, por ejemplo, una primera capa epidérmica y una segunda capa epidérmica. La primera capa epidérmica puede colocarse sobre la segunda capa epidérmica.

[0086] Una capa epidérmica puede estratificarse, por ejemplo, tener una pluralidad de subcapas. Las subcapas pueden tener diferentes composiciones celulares, por ejemplo, diferentes tipos de queratinocitos. Las subcapas de una capa epidérmica pueden tener diferentes grosores y/o densidades. Por ejemplo, una capa epidérmica puede tener una o más de una capa cornificada (estrato córneo), capa transparente/translúcida (estrato lúcido), capa granular (estrato granuloso), capa espinosa (estrato espinoso), capa basal/germinal (estrato basal/germinativo), o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, una capa epidérmica comprende una barrera funcional de permeabilidad epidérmica (por ejemplo, bicapas lipídicas organizadas en el estrato córneo). En algunos casos, un estrato córneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinoso o estrato basal/germinativo puede tener un grosor de alrededor de 0,0001 mm a alrededor de 5 mm. En algunos casos, un estrato córneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinoso o estrato basal/germinativo puede tener un grosor de por lo menos alrededor de 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,15 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, un estrato córneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinoso o estrato basal/germinativo puede tener un grosor máximo de alrededor de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,15 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm.

[0087] Una capa epidérmica puede comprender, además, células que producen pigmentos, por ejemplo, melanina. Dichas células productoras de pigmentos pueden ser melanocitos. Los melanocitos de la capa epidérmica pueden expresar uno o más marcadores. Dichos marcadores pueden incluir, pero no se limitan a, el gen 10 que contiene SRY-box (Sox-10), el factor de transcripción asociado a la microftalmia (MITF-M), la proteína premelanosoma (gp-100), la dopacromo tautomerasa (DCT), la tirosinasa (TYR) y la melan-A (MLANA).

[0088] Células de cuero sintético

[0089] Un cuero sintético puede comprender células de la capa dérmica y la capa epidérmica divulgadas en la presente memoria. En algunos casos, un cuero sintético comprende, además, células del folículo piloso, células endoteliales, células de la papila dérmica, células del sistema inmunitario (tales como linfocitos, células dendríticas, macrófagos o células de Langerhans), adipocitos, células nerviosas y una mezcla de las mismas.

[0090] Una o más células de un cuero sintético pueden ser células manipuladas genéticamente. El término «manipulado genéticamente» puede referirse a una alteración provocada por el hombre del contenido de ácido nucleico de una célula. Por lo tanto, las células manipuladas genéticamente pueden incluir células que contienen una inserción, eliminación y/o sustitución de uno o más nucleótidos en el genoma de una célula, así como alteraciones que incluyen la introducción de ácidos nucleicos extracromosómicos autorreplicables insertados en la célula. Las células manipuladas genéticamente también incluyen aquellas en las cuales la transcripción de uno o más genes se ha alterado, por ejemplo, aumentado o reducido.

[0091] En algunos casos, un cuero sintético tiene por lo menos uno de los componentes de la piel nativa tales como melanocitos, folículos pilosos, glándulas sudoríparas y terminaciones nerviosas. En determinados casos, un cuero sintético puede distinguirse de la piel nativa normal por la falta de por lo menos uno de estos componentes. En algunos casos que muestran fenotipos anormales o tienen por lo menos una célula con un genotipo alterado, un cuero sintético puede incluir todos estos componentes.

[0092] En algunos casos, se pueden añadir componentes adicionales a un cuero sintético. Dichos componentes adicionales pueden incluir células mioepiteliales, células ductales, células secretoras, células alveolares, células de langerhans, células de Merkel, adhesiones, glándulas mamarias, o cualquier mezcla de las mismas. En algunos casos, un cuero sintético comprende uno o más de: células neuronales, tejido conjuntivo (incluidos hueso, cartílago, células que se diferencian en células formadoras de hueso y condrocitos, y tejidos linfáticos), células epiteliales (incluidas las células endoteliales que forman revestimientos en cavidades y vasos o canales, células epiteliales secretoras exocrinas, células epiteliales absorbentes, células epiteliales queratinizantes y células de secreción de la matriz extracelular) y células indiferenciadas (tales como células embrionarias, células madre, y otras células precursoras).

[0093] Un cuero sintético puede comprender folículos pilosos. Un folículo piloso puede comprender una o más estructuras, que incluyen la papila, la matriz, la vaina radicular, la protuberancia, el infundíbulo, los músculos arrector pili, las glándulas sebáceas y las glándulas sudoríparas apócrinas. Un folículo piloso puede comprender una o más células del folículo piloso, que incluyen célula de la papila dérmica, célula de la vaina radicular externa, o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, un folículo piloso puede estar en capas epidérmicas. En algunos casos, un folículo piloso puede estar en una capa dérmica. Una célula del folículo piloso se puede diferenciar de un progenitor, por ejemplo, una célula madre tal como una iPSC. En algunos casos, por lo menos alrededor del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % de las células del folículo piloso se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas.

[0094] En algunos casos, un cuero sintético puede carecer de pelo, vasos sanguíneos, glándulas sebáceas, folículo piloso, glándulas sebáceas, nervios o una combinación de los mismos

[0095] En algunos casos, un cuero sintético puede comprender pelos, por ejemplo, en una o más estructuras en capas. Por ejemplo, un cuero sintético puede comprender pelaje. Los pelos (por ejemplo, pelaje) pueden ser naturales, sintéticos o una combinación de los mismos. Los pelos (por ejemplo, pelaje) pueden crecer a partir de células en el cuero sintético, o añadirse al cuero sintético a partir de una fuente exógena. En otros casos, un cuero sintético puede no tener pelos.

[0096] Célula madre

[0097] Una o más células de un cuero sintético se pueden diferenciar de las células progenitoras, tales como las células madre. Por ejemplo, los fibroblastos en un cuero sintético se pueden diferenciar de las células madre. Por ejemplo, los queratinocitos en un cuero sintético se pueden diferenciar de las células madre. Por ejemplo, los melanocitos en un cuero sintético se pueden diferenciar de las células madre. En algunos casos, por lo menos alrededor del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % de las células divulgadas en la presente memoria se pueden diferenciar de las células madre. En algunos casos, por lo menos alrededor del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % de los fibroblastos se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas. En algunos casos, por lo menos alrededor del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % de los queratinocitos se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas. En algunos casos, por lo menos alrededor del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % de las células de los melanocitos se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas.

[0098] Las células madre pueden ser células madre embrionarias (ESC), células madre adultas (es decir, células madre somáticas) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, una célula madre puede ser pluripotente o multipotente, por ejemplo, células madre adultas y células madre de sangre del cordón umbilical).

[0099] Las células madre pluripotentes inducidas se pueden obtener a través de la expresión inducida de uno o más de los genes Oct3, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc en cualquier célula somática (por ejemplo, célula somática adulta) tal como fibroblastos. En algunos casos, también se pueden inducir uno o más otros genes para reprogramar una célula somática a una célula madre pluripotente inducida. Los ejemplos de tales genes incluyen NANOG, UTF1, LIN28, SALL4, NR5A2, TBX3, ESSRB, DPPA4, SV40LT, REM2, MDM2 y ciclina D1.

[0100] Se pueden usar varios métodos de administración para modular la expresión de genes para reprogramar una célula somática a una iPSC. Los métodos de administración ejemplares incluyen administración de ADN desnudo, adenovirus, administración eléctrica, administración química, administración mecánica, sistemas basados en polímeros, microinyección, retrovirus (por ejemplo, retrovirus derivados de mmLV) y lentivirus (por ejemplo, lentivirus extraíbles). En algunos casos, se pueden obtener células madre pluripotentes inducidas según el protocolo descrito por Takahashi et al., Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72 (2007), o por Yu et al., Science 318, 1917 - 1920 (2007). En algunos casos, las células somáticas (por ejemplo, células somáticas adultas) se transfectan con vectores virales, tales como vectores retrovíricos, que comprenden los genes Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, y c-Myc. En algunos casos, los virus Sendai se utilizan como sistema de administración, por ejemplo, los virus Sendai producidos por ID Pharma Co., Ltd., Japón.

[0101] Fuentes de células

[0102] Un cuero sintético puede comprender células derivadas de animales de una o más especies. Por ejemplo, las células de un cuero sintético se pueden derivar de mamíferos, pájaros, reptiles, anfibios, peces, invertebrados o cualquier combinación de los mismos.

[0103] Un cuero sintético puede comprender células derivadas de células de mamíferos, por ejemplo, células de mamíferos o no mamíferos. Una célula de mamífero no humano puede ser un antílope, un oso, un castor, un bisonte, un jabalí, un camello, un caribú, un gato, ganado, un ciervo, un perro, un elefante, un alce, un zorro, una jirafa, una cabra, una liebre, un caballo, un íbice, un canguro, un león, una llama, un lince, un visón, un alce, un buey, un pecarí, un cerdo, un conejo, un rinoceronte, una foca, una oveja, una ardilla, un tigre, una ballena, un lobo, un yak o una cebra. En algunos casos, un mamífero puede ser primate, bovino, ovino, porcino, equino, canino, felino, roedor o lagomorfo. Una célula de no mamífero puede ser un pez, un pájaro o un reptil.

[0104] Un cuero sintético puede comprender células derivadas de otras especies. En algunos casos, las células se derivan de aves, tales como el pollo, el pato, el emu, el ganso, el urogallo, el avestruz, el faisán, la paloma, la codorniz o el pavo. En algunos casos, las células se obtienen de reptiles tales como la tortuga, la serpiente, el cocodrilo o el caimán. En algunos casos, las células se derivan de anfibios tales como la rana, la tortuga, la salamandra o el tritón. En algunos casos, las células se derivan de peces, tales como la anchoa, el robalo, el pez gato, la carpa, el bacalao, la anguila, el lenguado, el pez globo, el mero, el eglefino, el fletán, el arenque, la caballa, el mahi-mahi, el rayo manta, el marlín, el pez naranja rugoso, la perca, el lucio, el abadejo, el salmón, la sardina, el tiburón, el pargo, la lenguado, el pez raya, el pez espada, la tilapia, la trucha, el atún o el lucio.

[0105] En algunos casos, todas las células de un cuero sintético se derivan de la misma especie. Por ejemplo, todas las células de un cuero sintético pueden ser células bovinas. En otros casos, un cuero sintético comprende células derivadas de múltiples especies. Por ejemplo, un cuero sintético puede comprender células bovinas y células de caimán. En algunos casos, un cuero sintético está compuesto por células derivadas de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10 especies.

[0106] Los progenitores de las células de un cuero sintético también se pueden derivar de las fuentes descritas en la presente memoria. Por ejemplo, las células madre (por ejemplo, las iPSC), las células somáticas (por ejemplo, las que se reprograman a iPSC), las células primarias utilizadas en células sintéticas, las células de la capa dérmica, las células de la capa epidérmica, o cualquier célula sintética y los progenitores de las mismas se pueden derivar de las fuentes descritas en la presente memoria.

[0107] Cualquier célula puede ser una célula viva o muerta. Cuando hay múltiples células presentes, una célula puede ser una célula viva, puede ser una célula muerta, o cualquier combinación de las mismas.

[0108] Estructura en capas

[0109] Un cuero sintético puede comprender una o más estructuras en capas. Se puede formar una estructura en capas al colocar un primer tipo de capa sobre un segundo tipo de capa. El primer tipo de capa y el segundo tipo de capa pueden ser iguales o diferentes. En algunos casos, se puede formar una estructura en capas al colocar una capa epidérmica sobre una capa dérmica. Por ejemplo, se puede formar una estructura en capas al colocar una capa epidérmica sobre una capa dérmica, con un sustituto de la membrana basal entre ellas.

[0110] Una estructura en capas puede comprender dos o más capas. En algunos casos, una estructura en capas comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 o 1000 capas. En algunos casos, una estructura en capas comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 o 1000 capas del primer tipo, y por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 capas del segundo tipo. Por ejemplo, una estructura en capas puede comprender por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 o 1000 capas dérmicas, y por lo menos 2, 3, 4, 56, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 o 1000 capas de capas epidérmicas.

[0111] Una estructura en capas puede comprender uno o más tipos de células descritos en la presente memoria. Por ejemplo, una estructura en capas puede comprender células en una capa dérmica, tal como fibroblastos, células en una capa epidérmica, tal como queratinocitos, o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, una estructura en capas comprende, además, células que no sean fibroblastos y queratinocitos. Por ejemplo, una estructura en capas puede comprender melanocitos.

[0112] Una estructura en capas puede tener un grosor de alrededor de 0,001 mm a alrededor de 100 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener un grosor de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 50 mm, de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 1 mm, o de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 0,5 mm. En algunos casos, el grosor de una estructura en capas puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 10 mm, 20 mm, 40 mm, 60 mm, 80 mm o 100 mm. En algunos casos, el grosor de una estructura en capas puede ser como máximo de 100 mm, 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener un grosor de por lo menos alrededor de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 u 800 mm.

[0113] La longitud de una estructura en capas puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una estructura en capas puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una longitud de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una longitud de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una longitud de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la longitud de una estructura en capas puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la longitud de una estructura en capas puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm, o 0,01 mm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o 400 m.

[0115] La anchura de una estructura en capas puede genomanipularse para adaptarse a la función o uso de un cuero sintético. Una estructura en capas puede tener una anchura de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una anchura de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una anchura de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una anchura de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener una anchura de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la anchura de una estructura en capas puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la anchura de una estructura en capas puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 cm. En algunos casos, una estructura en capas puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o 400 m.

[0117] Una estructura en capas puede comprender fibroblastos y queratinocitos en cualquier relación de por lo menos alrededor de 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10 o 1:100. En algunos casos, la relación entre fibroblastos y queratinocitos puede ser de alrededor de 20:1 a alrededor de 3:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 4:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 5:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 10:1, o de alrededor de 20:1 a alrededor de 15:1.

[0119] Una estructura en capas puede comprender fibroblastos y melanocitos en cualquier relación de por lo menos alrededor de 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10 o 1:100. En algunos casos, la relación entre fibroblastos y melanocitos puede ser de alrededor de 20:1 a alrededor de 3:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 4:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 5:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 10:1, o de alrededor de 20:1 a alrededor de 15:1.

[0121] Una estructura en capas puede comprender queratinocitos y melanocitos en cualquier relación de por lo menos aproximadamente 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10 o 1:100. En algunos casos, la relación entre queratinocitos y melanocitos puede ser de alrededor de 20:1 a alrededor de 3:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 4:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 5:1, de alrededor de 20:1 a alrededor de 10:1, o de alrededor de 20:1 a alrededor de 15:1.

[0123] Un tipo de células en una estructura en capas puede comprender como máximo el 99 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % del total de población celular de la estructura en capas. Un tipo de células en una estructura en capas puede representar alrededor de por lo menos el 1 %, el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % del total de población celular de la estructura en capas. Por ejemplo, los fibroblastos en una estructura en capas pueden representar aproximadamente por lo menos el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % del total de población celular de la estructura en capas.

[0125] Cuero sintético

[0126] Un cuero sintético puede formarse por una o más estructuras en capas. Por ejemplo, un cuero sintético puede formarse a partir de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 estructuras en capas.

[0127] Un cuero sintético puede tener varios grosores. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener un grosor similar a un cuero natural. En algunos casos, un cuero sintético puede tener un grosor de alrededor de 0,001 mm a alrededor de 100 mm. Por ejemplo, una estructura en capas puede tener un grosor de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 50 mm, de alrededor de 0,005 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,5 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,5 mm a alrededor de 3 mm, de alrededor de 0,8 mm a alrededor de 3 mm, de alrededor de 0,8 mm a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,8 mm a alrededor de 1,8 mm, de alrededor de 0,8 mm a alrededor de 1,6 mm, de alrededor de 0,9 mm a alrededor de 1,4 mm, de alrededor de 1 mm a alrededor de 1,5 mm, de alrededor de 1 mm a alrededor de 1,4 mm, o de alrededor de 1 mm a alrededor de 1,3 mm. En algunos casos, el grosor de un cuero sintético puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 10 mm, 20 mm, 40 mm, 60 mm, 80 mm o 100 mm. En algunos casos, el grosor de un cuero sintético puede ser como máximo de 100 mm, 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, el grosor de un cuero sintético puede ser de alrededor de 1,2 mm.

[0129] Un cuero sintético puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una longitud de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una longitud de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una longitud de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una longitud de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la longitud de un cuero sintético puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la longitud de un cuero sintético puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm. En algunos casos, un cuero sintético puede tener una longitud de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m.

[0131] Un cuero sintético puede tener una anchura de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 50 m. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una anchura de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 8 mm, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,02 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,05 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,8 mm, o de alrededor de 0,1 a alrededor de 0,5 mm. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una anchura de alrededor de 0,02 mm a 5 mm. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una anchura de alrededor de 0,1 mm a 0,5 mm. Por ejemplo, un cuero sintético puede tener una anchura de alrededor de 0,2 mm a 0,5 mm. En algunos casos, la anchura de un cuero sintético puede ser de por lo menos 0,001 mm, 0,01 mm, 0,02 mm, 0,04 mm, 0,08 mm, 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm o 10 mm. En algunos casos, la anchura de un cuero sintético puede ser como máximo de 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,8 mm, 0,4 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, 0,08 mm, 0,04 mm, 0,02 mm o 0,01 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm. En algunos casos, un cuero sintético puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 cm. En algunos casos, un cuero sintético puede tener una anchura de por lo menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m.

[0133] Sustituto de la membrana basal

[0135] Un cuero sintético puede comprender, además, un sustituto de la membrana basal. Un sustituto de la membrana basal puede estar entre dos capas celulares, por ejemplo, entre una capa dérmica y una capa epidérmica. Un sustituto de la membrana basal puede ser una unión dermoepidérmica similar a la que existein vivo, desde un punto de vista estructural y/o desde un punto de vista bioquímico. Desde el punto de vista bioquímico, un sustituto de la membrana basal puede comprender componentes de la membrana basal, de la lámina densa, de la lámina lúcida y de la zona subbasal, tales como colágeno IV, colágeno VII, laminina 5, entactina fibronectina, o cualquier combinación de las mismas.

[0137] Un sustituto de la membrana basal en un cuero sintético puede ser la membrana basal urinaria (UBM), la membrana basal hepática (LBM), el amnio, el corión, aloinjerto de pericardio, aloinjerto de dermis acelular, membrana amniótica, gelatina de Wharton, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, un sustituto de la membrana basal puede ser una membrana amniótica acelular seca. En determinados casos, un sustituto de la membrana basal puede ser un polímero, por ejemplo, un nanopolímero. Por ejemplo, un sustituto de la membrana basal puede ser el polihidroxibutirato-cohidroxivalerato (PHBV) nanofibroso, tal como lo describen Bye et al. en el Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, vol.4, 1-7, 2014.

[0139] Andamiaje

[0141] Una capa celular (por ejemplo, una capa dérmica), una estructura en capas o un cuero sintético pueden colocarse en un andamiaje. Un andamiaje puede proporcionar determinada firmeza (por ejemplo, resistencia al desgarro), elasticidad o ambas cosas. En algunos casos, una parte o la totalidad del andamiaje puede estar comprendida en el cuero sintético. En otros casos, un andamiaje puede no estar comprendido en el cuero sintético. Después de ayudar a la formación de una capa en un cuero sintético, se puede eliminar un andamiaje del producto de cuero sintético final. En determinados casos, un andamiaje comprendido en un cuero sintético puede degradarse después de un período de tiempo. Un andamiaje descrito en la presente memoria puede comprender un patrón trabecular.

[0143] Un andamiaje puede estar hecho de materiales naturales, materiales sintéticos o una combinación de los mismos. Los ejemplos de andamiajes incluyen un andamiaje formado mediante el uso de una red hecha de un polímero sintético bioabsorbible, un andamiaje formado por la unión de una red de nailon a una película de silicona, un andamiaje que tiene una estructura de dos capas de una esponja de colágeno y una lámina de silicona, un andamiaje formado por el uso de una esponja de colágeno atelógena hecha en una lámina, un andamiaje formado por la combinación de esponjas de colágeno que tienen diferentes tamaños de poro, y matrices dérmicas acelulares (ADM) formadas mediante el uso de cola de fibrina o piel alogénica que ha sido descelularizada.

[0145] Un andamiaje puede comprender sustancias naturales tales como colágeno (por ejemplo, matriz de colágeno), adhesivo natural (por ejemplo, cola de fibrina, colas frías, cola animal, cola de albúmina de sangre, cola de caseína, o colas vegetales tales como el almidón y la cola de dextrina). En algunos casos, un andamiaje comprende seda. Por ejemplo, un andamiaje puede estar hecho de seda. En algunos casos, un andamiaje puede comprender fibroína de seda, celulosa, algodón, acetato, acrílico, fibras de látex, lino, nailon, rayón, terciopelo, modacrílico, poliéster olefina, saran, vinilo, lana, yute, cáñamo, bambú, lino o una combinación de los mismos. En algunos casos, un andamiaje puede comprender fibras. En algunos casos, las fibras pueden ser fibras de seda, algodón, lana, lino, celulosa extraída especialmente de madera, verduras o algas, poliamida, celulosa modificada (rayón, viscosa, acetato, especialmente acetato de rayón), poli(p-fenilenetereftalamida), fibras acrílicas, por ejemplo, las de polimetilmetacrilato o de poli-2-hidroxietilmetacrilato, fibras de poliolefina, por ejemplo, fibras de polietileno o polipropileno, vidrio, sílice, aramida, carbono, por ejemplo, en forma de grafito, poli(tetrafluoroetileno), colágeno insoluble, poliésteres, cloruro de polivinilo o cloruro de polivinilideno, alcohol polivinílico, poliacrilonitrilo, quitosano, poliuretano, poli(uretano-urea) o ftalato de polietileno, y fibras formadas a partir de una mezcla de polímeros tales como los mencionados anteriormente, tales como fibras de poliamida/poliéster o cualquier combinación de los mismos.

[0147] Un andamiaje puede comprender polímeros. Un polímero puede ser un biopolímero. Un biopolímero puede incluir, pero no se limita a, quitina, quitosano, elastina, colágeno, queratina o polihidroxialcanoato. Los polímeros pueden ser biodegradables, bioestables o combinaciones de los mismos. El polímero en un andamiaje puede ser polímeros naturales. Los polímeros naturales ejemplares incluyen polisacáridos tales como alginato, celulosa, dextrano, pullano, ácido polihialurónico, quitina, poli(3-hidroxialcanoato), poli(3-hidroxioctanoato) o poli(ácido 3-hidroxigraso). En algunos casos, un andamiaje comprende, además, derivados químicos de los polímeros naturales. Tales derivados químicos pueden incluir sustituciones y/o adiciones de grupos químicos tales como alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones, así como otras modificaciones familiares para los expertos en la materia. Los polímeros naturales también pueden seleccionarse de proteínas tales como colágeno, zeína, caseína, gelatina, gluten y albúmina de suero. El polímero en un andamiaje puede ser polímeros sintéticos biodegradables, que incluyen polialfa-hidroxiácidos tales como el ácido poliláctico (PLA), el ácido poliglicólico (PGA) o copolímeros de los mismos (por ejemplo, el ácido poli(D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA)) y ácido hialurónico.

[0149] Un andamiaje puede ser bioabsorbible. Un andamiaje bioabsorbible puede ser una estructura o sustancia no citotóxica que puede ser capaz de contener o admitir células vivas y mantenerlas en una configuración deseada por un período de tiempo. El término «bioabsorbible» puede referirse a cualquier material que el cuerpo pueda descomponer en subproductos no tóxicos que se excretan del cuerpo o se metabolizan en él. Los materiales bioabsorbibles ejemplares para un andamiaje incluyen, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(carbonato de trimetileno), poli(dimetiltrimetilencarbonato), poliaminoácidos, policarbonatos derivados de tirosina, policarbonatos, policaprolactona, poli(para-dioxanona), poliésteres, poliésteramidas, polianhídridos, poliortoésteres, colágeno, gelatina, albúmina de suero, proteínas, polisacáridos, mucopolisacáridos, carbohidratos, glucosoaminoglicanos, polietilenglicoles, poliglicoles de propileno, ésteres de poliacrilato, ésteres de polimetacrilato, alcohol polivinílico, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, heparina, sulfato de dermatano, versicano, copolímeros, mezclas de polímeros y oligómeros que contienen enlaces bioabsorbibles.

[0150] Un andamiaje puede tener varios grosores. Por ejemplo, un andamiaje puede tener un grosor que puede ser adecuado para formar una capa celular. Por ejemplo, un andamiaje puede tener un grosor de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 10 mm, como de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 5 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 4 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 3 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 2 mm, de alrededor de 0,1 mm a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,2 mm a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,3 mm a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,4 mm a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,5 mm a alrededor de 1 mm, de alrededor de 0,3 mm a alrededor de 1,5 mm, de alrededor de 0,4 mm a alrededor de 1,2 mm, de alrededor de 0,6 mm a alrededor de 1,2 mm, o de alrededor de 0,7 mm a alrededor de 1,5 mm. Por ejemplo, un andamiaje puede tener un grosor de alrededor de 0,5 mm a 1 mm. En algunos casos, un andamiaje puede tener un grosor de por lo menos 0,1 mm, 0,2 mm o 0,3 mm, 0,4 mm, 0,5 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm o 5 mm. En algunos casos, un andamiaje puede tener un grosor máximo de 0,5 mm, 0,8 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm o 10 mm. En algunos casos, un andamiaje puede tener una longitud y/o una anchura de una capa celular para colocarse y/o crecer sobre un andamiaje. En algunos casos, un andamiaje puede tener una longitud y/o una anchura de una capa celular descrita en la presente memoria.

[0152] Un andamiaje puede tener un área de superficie en una cara de un cuero sintético. Por ejemplo, un andamiaje puede tener un área de superficie de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 100 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 95 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 90 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 85 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 80 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 75 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 70 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 65 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 60 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 55 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 50 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 45 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 40 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 35 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 30 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 25 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 20 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 15 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 10 mm<2>, de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 5 mm<2>, o de alrededor de 0,1 mm<2>a alrededor de 1 mm<2>. En algunos casos, un andamiaje puede tener un área de superficie de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 100 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 95 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 90 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 85 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 80 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 75 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 70 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 65 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 60 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 55 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 50 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 45 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 40 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 35 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 30 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 25 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 20 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 15 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 10 cm<2>, de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 5 cm<2>, o de alrededor de 0,1 cm<2>a alrededor de 1 cm<2>. En algunos casos, un andamiaje puede tener un área de superficie de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 100 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 95 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 90 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 85 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 80 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 75 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 70 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 65 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 60 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 55 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 50 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 45 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 40 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 35 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 30 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 25 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 20 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 15 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 10 m<2>, de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 5 m<2>, o de alrededor de 0,1 m<2>a alrededor de 1 m<2>.

[0154] En algunos casos, un andamiaje puede tener un área de superficie de por lo menos alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 o 100 mm<2>. En algunos casos, un andamiaje puede tener un área de superficie de por lo menos alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 o 100 cm<2>. En algunos casos, un andamiaje puede tener un área de superficie de por lo menos alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 o 100 m<2>.

[0156] De forma alternativa, una capa celular puede no formarse en un andamiaje. Por ejemplo, una capa dérmica puede no formarse en un andamiaje (por ejemplo, matriz de colágeno). En algunos casos, un cuero sintético no comprende un andamiaje.

[0158] Pigmentos

[0159] Un cuero sintético puede comprender uno o más pigmentos. Una o más estructuras en capas del cuero sintético pueden pigmentarse. Un pigmento en un cuero sintético puede ser un pigmento natural producido en células que forman el cuero sintético. Por ejemplo, un pigmento puede ser melanina, que incluye eumelanina (por ejemplo, eumelanina marrón y eumelanina negra), feomelanina, neuromelanina, o cualquier combinación de las mismas. Un pigmento en un cuero sintético puede ser un pigmento exógeno, tal como un tinte de pigmento de cuero.

[0160] Colágeno

[0161] Un cuero sintético puede comprender colágeno. El colágeno puede referirse a cualquier miembro de una familia de por lo menos 28 tipos de colágeno distintos. Los colágenos pueden caracterizarse por un triplete repetitivo de aminoácidos, -(Gly-X-Y)n-, de manera que aproximadamente un tercio de los residuos de aminoácidos que están en el colágeno son glicina. X puede ser prolina e Y puede ser hidroxiprolina. Así, la estructura de colágeno puede tener unidades triples gemelas de cadenas de péptidos de diferentes longitudes. Un cuero sintético puede comprender colágeno de una o más especies. En algunos casos, un cuero sintético comprende colágeno de diferentes animales. Diferentes animales pueden producir diferentes composiciones de aminoácidos del colágeno, lo que puede dar lugar a diferentes propiedades (y diferencias en el cuero resultante).

[0162] Los monómeros de fibra de colágeno se pueden producir a partir de cadenas alfa de alrededor de 1050 aminoácidos de longitud, de manera que la hélice triple toma la forma de una varilla de alrededor de 300 nm de longitud, con un diámetro de alrededor de 1,5 nm.

[0163] Un cuero sintético puede comprender uno o más tipos de colágeno. El colágeno comprendido en un cuero sintético puede incluir colágeno fibrilar, colágeno no fibrilar, o una combinación de los mismos. Los colágenos fibrilares incluyen colágenos tipo I, tipo II, tipo III, tipo V y tipo XI. Los colágenos no fibrilares incluyen colágenos asociados a fibrilas con hélices triples interrumpidas (por ejemplo, tipo IX, tipo XII, tipo XIV, tipo XVI y tipo XIX), colágenos de cadena corta (por ejemplo, tipo VIII y tipo X), colágenos de membrana basal (tipo IV), multiplexina (dominios de múltiples hélices triples con interrupciones) (por ejemplo, tipo XV y tipo XVIII) y colágenos MACIT (colágenos asociados a la membrana con hélices triples interrumpidas) (por ejemplo, tipo XIII y tipo XVII).

[0164] El colágeno puede estar comprendido en una o más partes de un cuero sintético. Por ejemplo, los colágenos pueden estar comprendidos en una o más capas dérmicas, una o más capas epidérmicas, o una combinación de las mismas, en un cuero sintético. Por ejemplo, los colágenos pueden estar comprendidos en una o más estructuras en capas de un cuero sintético. En algunos casos, cuando parte del cuero sintético puede eliminarse durante el proceso, el colágeno también puede comprender el producto eliminado.

[0165] El colágeno en un cuero sintético puede proceder de una o más fuentes. Por ejemplo, el colágeno puede producirse mediante células productoras de colágeno en el cuero sintético. Por ejemplo, el colágeno se puede añadir al cuero por separado. En algunos casos, un cuero sintético comprende colágeno producido por células productoras de colágeno y colágeno añadido por separado.

[0166] Por lo menos parte del colágeno en un cuero sintético puede producirse mediante células productoras de colágeno. Dichas células productoras de colágeno pueden estar comprendidas en el cuero sintético. Las células productoras de colágeno ejemplares incluyen células epiteliales, fibroblastos, queratinocitos, comeocitos, melanocitos, células de Langerhans, células basales, células musculares lisas, o una combinación de los mismos. Las células epiteliales pueden incluir células escamosas, células cuboidales, células columnares, células basales, o una combinación de las mismas. Los fibroblastos pueden incluir fibroblastos dérmicos. Los queratinocitos pueden incluir queratinocitos epiteliales, queratinocitos basales, queratinocitos basales proliferantes, queratinocitos suprabasales diferenciados, o una combinación de los mismos. El colágeno en un cuero sintético puede producirse mediante uno o más tipos de células productoras de colágeno.

[0167] Aditivos

[0168] Un cuero sintético puede comprender, además, uno o más aditivos. Dichos aditivos pueden mejorar el atractivo comercial (por ejemplo, aspecto, color u olor). Los aditivos ejemplares incluyen minerales, fibra, ácidos grasos y aminoácidos, proteínas. Un aditivo puede ser un odorizante.

[0169] Los aditivos pueden incluir uno o más de: proteínas de matriz, proteoglicanos, antioxidantes, perfluorocarbonos y factores de crecimiento. Un factor de crecimiento puede ser una proteína, un polipéptido, o un complejo de polipéptidos, que incluye citocinas (por ejemplo, que son producidas por una célula y que pueden afectarse a sí mismas y/o a una variedad de otras células vecinas o distantes). Los factores de crecimiento pueden afectar el crecimiento y/o la diferenciación de tipos específicos de células, ya sea en el desarrollo o en respuesta a una multitud de estímulos fisiológicos o ambientales. Algunos, pero no todos, los factores de crecimiento son hormonas. Los factores de crecimiento ejemplares incluyen insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), incluidos el FGF básico (bFGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), incluidos PDGF-AA y PDGF-AB, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α), factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), incluidos TGFpi y TGFP3, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleucina-6 (IL-6), IL-8, y similares. También se pueden añadir otros polipéptidos o moléculas (por ejemplo, agentes curativos; enzimas tales como enzimas degradantes de la matriz e inhibidores de enzimas degradantes de la matriz (por ejemplo, TIMP), antibióticos y antimicóticos) a un cuero sintético.

[0170] Los aditivos pueden incluir, además, conservantes conocidos en la materia. Los conservantes ejemplares incluyen conservantes antimicrobianos tales como propionato cálcico, nitrato sódico, nitrito sódico, sulfitos (por ejemplo, dióxido de azufre, bisulfato sódico, sulfito de hidrógeno potásico, etc.), ácido etilenodiammetetraacético disódico (EDTA), antioxidante como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT).

[0172] En determinados casos, un cuero sintético puede comprender una matriz extracelular o tejido conjuntivo. Por ejemplo, un cuero sintético puede comprender, además, colágeno, queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, proteoglicano de sulfato de dermatano, glucosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, carbohidrato y una combinación de los mismos.

[0174] Patrón de cuero sintético

[0176] El cuero sintético se puede estampar. Por ejemplo, el cuero sintético se puede estampar con un patrón de piel de un animal seleccionado entre antílope, oso, castor, bisonte, jabalí, camello, caribú, gato, ganado, ciervo, perro, elefante, alce, zorro, jirafa, cabra, liebre, caballo, íbice, canguro, león, llama, lince, visón, alce, buey, pecarí, cerdo, conejo, foca, oveja, ardilla, tigre, ballena, lobo, yak, cebra, tortuga, serpiente, cocodrilo, caimán, dinosaurio, rana, sapo, salamandra, tritón, pollo, pato, emú, ganso, urogallo, avestruz, faisán, paloma, codorniz, pavo, anchoa, lubina, pez gato, carpa, bacalao, anguila, lenguado, fugu, mero, eglefino, halibut, arenque, caballa, mahi mahi, manta raya, marlín, pez naranja, perca, lucio, abadejo, salmón, sardina, tiburón, pargo, lenguado, pez espada, tilapia, trucha, atún, lucio y una combinación de los mismos. El patrón puede ser un patrón de piel de un animal de fantasía seleccionado de dragón, unicornio, grifo, sirena, fénix, esfinge, cíclope, sátiro, Medusa, Pegaso, Cerbero, Tifeo, gorgona, Caribdis, empusa, quimera, Minotauro, Cetus, hidra, centauro, hada, sirena, monstruo del lago Ness, Sasquatch, pájaro del trueno, yeti, chupacabra y una combinación de los mismos.

[0178] Se puede fabricar un cuero sintético para que se parezca a la piel animal no humana tradicional, cuero en bruto o productos de cuero y a los parámetros de diseño (por ejemplo, tipos de células, aditivos, tamaño, forma). En algunos casos, un cuero sintético comprende una capa celular caracterizada por una composición que puede ser sustancialmente similar a la piel animal no humana tradicional, cuero en bruto o productos de cuero. Por ejemplo, dicha capa puede caracterizarse por una composición que puede ser sustancialmente de alrededor del 60 % al 80 % de fluido acuoso, del 14 % al 35 % de proteína y del 1 % al 25 % de grasa. En algunos casos, los queratinocitos de la capa celular están alineados. Por ejemplo, los queratinocitos pueden alinearse mediante la aplicación de un campo eléctrico. Por ejemplo, los queratinocitos pueden alinearse mediante la aplicación de un estímulo mecánico, tal como el estiramiento cíclico y la relajación del sustrato. En algunos casos, los queratinocitos alineados (por ejemplo, electroorientados y mecanoorientados) tienen sustancialmente la misma orientación entre sí como se puede encontrar en muchos tejidos de piel animal.

[0180] Artículos de cuero

[0182] Un cuero sintético en la presente memoria puede ser por lo menos una porción de un artículo de cuero. Por ejemplo, un cuero sintético puede usarse como sustituto del cuero natural en un artículo de cuero. Los artículos de cuero ejemplares incluyen una correa de reloj, un cinturón, tirantes, embalaje, zapatos, botas, calzado, guantes, ropa (por ejemplo, camisetas, pantalones y prendas de abrigo), equipaje, bolso (por ejemplo, un bolso de mano con o sin correa para el hombro), bolsa de mano, cartera, monedero, billetero, llavero, estuche para tarjetas de crédito, estuche para bolígrafos, mochila, estuches, billetera, sillín, arnés, látigo, artículos de viaje (por ejemplo, un baúl, una maleta, una bolsa de viaje, un neceser o un kit de aseo), morral, portafolios, bolsa para documentos, maletín, maletín de trabajo, artículo para mascotas (por ejemplo, una correa o collar), artículos de caza y pesca (por ejemplo, un estuche para armas, un estuche para cubiertos o una funda para armas de fuego), un artículo de papelería (por ejemplo, un bloc de notas, una funda de libro, un estuche para cámara, un estuche para gafas, un estuche para cigarrillos, un estuche para puros, un estuche para joyas o una funda para teléfono móvil), un artículo deportivo (por ejemplo, un balón tal como un balón de baloncesto, un balón de fútbol o un balón de rugby), el interior de un edificio, el exterior de un edificio, una tapicería, una encuadernación, un mueble, una lámpara, una pantalla de lámpara, un mantel, un revestimiento de pared, un revestimiento de suelo, un revestimiento de techo, el interior de un coche, el exterior de un coche, el interior de un barco, el exterior de un barco, el interior de un avión, el interior de un yate, el exterior de un yate, una funda de almohada, una sábana, una funda nórdica, joyas, un accesorio, unas gafas, unas gafas de sol o un dispositivo electrónico de consumo. Por ejemplo, un artículo de piel puede ser una pulsera de reloj. Por ejemplo, un artículo de piel puede ser un cinturón. Por ejemplo, un artículo de piel puede ser una bolsa.

[0183] Injerto de piel

[0184] Un cuero sintético o porciones del mismo también se pueden usar como un injerto de piel, por ejemplo, un aloinjerto o un xenoinjerto para trasplantar a un sujeto. Por ejemplo, el cuero sintético, la capa dérmica, la capa epidérmica y/o una estructura en capas pueden ser una fuente de injerto de piel para aloinjerto o xenoinjerto. En algunos casos, el cuero sintético, la capa dérmica, la capa epidérmica y/o una estructura en capas se pueden producir con células modificadas genéticamente para reducir el rechazo inmunitario en el receptor del injerto.

[0185] Métodos

[0186] También se divulgan en la presente memoria métodos para fabricar un cuero sintético. Los métodos pueden comprender formar una capa dérmica artificial, formar una capa epidérmica artificial, o una combinación de las mismas. Los métodos pueden comprender, además, curtir por lo menos una porción de la capa dérmica artificial y/o la capa epidérmica artificial. Las células en un cuero sintético, por ejemplo, las de la capa dérmica y/o la capa epidérmica se pueden diferenciar de las células madre (por ejemplo, iPSC). Los métodos de la presente memoria pueden comprender, además, la diferenciación de células madre (por ejemplo, iPSC) en células del cuero sintético, por ejemplo, células de la capa dérmica y/o la capa epidérmica. En determinados casos, los métodos comprenden colocar una primera capa celular (por ejemplo, una capa epidérmica) sobre una segunda capa celular (por ejemplo, una capa dérmica) formando así una estructura en capas, y curtir por lo menos una porción de la estructura en capas. En algunos casos, los métodos pueden comprender, además, eliminar por lo menos una porción de la primera capa celular (por ejemplo, una capa epidérmica).

[0187] Formación de capas celulares

[0188] Se puede formar una capa celular al preparar una pluralidad de cuerpos multicelulares que comprenden uno o más tipos de células, y disponer dichos cuerpos multicelulares para formar una capa celular. Por ejemplo, se puede formar una capa celular mediante la disposición adyacente de una pluralidad de cuerpos multicelulares, en el que los cuerpos multicelulares se fusionan para formar una capa plana.

[0189] La formación de una capa celular puede requerir un andamiaje. Se puede formar una capa celular al disponer una pluralidad de cuerpos multicelulares en un andamiaje. Por ejemplo, la etapa de formación puede comprender disponer o colocar cuerpos multicelulares sobre un sustrato de soporte que permite que los cuerpos multicelulares se fusionen para formar una capa (por ejemplo, una capa sustancialmente plana). En algunos casos, los cuerpos multicelulares o las capas están dispuestos horizontal y/o verticalmente adyacentes entre sí. De forma alternativa, la formación de una capa celular puede no necesitar un andamiaje.

[0190] Las capas celulares pueden formarse mediante la incrustación de células en un medio o gel. En algunos casos, se pueden formar capas dérmicas mediante el uso de fibroblastos incrustados en un gel de colágeno I o fibrina. También se pueden utilizar otros tipos de medios. Por ejemplo, un medio puede estimular a los fibroblastos a secretar una cantidad suficiente de matriz extracelular para permitir el mantenimiento prolongado de la epidermis sin la necesidad de geles de colágeno.

[0191] Formación de cuerpos multicelulares

[0192] Existen varias maneras de fabricar cuerpos multicelulares que tienen las características descritas en la presente memoria. En algunos casos, un cuerpo multicelular puede fabricarse a partir de una pasta celular que contiene una pluralidad de células, por ejemplo, con una densidad y viscosidad celular deseadas. En otros casos, la pasta celular se puede conformar en una forma deseada y en un cuerpo multicelular formado a través de la maduración (por ejemplo, incubación). En algunos casos, se puede producir un cuerpo multicelular alargado al conformar una pasta celular que incluye una pluralidad de células en una forma alargada (por ejemplo, un cilindro). En otros casos, la pasta celular puede incubarse en un entorno controlado para permitir que las células se adhieran y/o cohesionen entre sí para formar el cuerpo multicelular alargado. Por ejemplo, un cuerpo multicelular se puede producir al conformar una pasta celular que incluye una pluralidad de células vivas en un dispositivo que sostiene la pasta celular en una forma tridimensional. En algunos casos, la pasta celular puede incubarse en un entorno controlado mientras se mantiene en la forma tridimensional durante un tiempo suficiente para producir un cuerpo que tenga cohesión suficiente para sostenerse en una superficie plana, como se describe en la presente memoria.

[0193] Una pasta celular puede proporcionarse mediante: (A) mezclar células o agregados celulares (de uno o más tipos celulares) con un medio de cultivo celular (por ejemplo, en una relación predeterminada) para dar lugar a una suspensión celular, y (B) compactar la suspensión celular para producir una pasta celular con una densidad y viscosidad celular deseadas. La compactación se puede lograr mediante varios métodos, tales como concentrando una suspensión celular particular resultante del cultivo celular para lograr la concentración celular deseada (densidad), viscosidad y consistencia requeridas para la pasta celular. En algunos casos, una suspensión celular relativamente diluida procedente del cultivo celular se puede centrifugar durante un tiempo determinado para lograr una concentración celular en el gránulo que permita conformarlo en un molde. La filtración de flujo tangencial ("TFF") es otro método adecuado para concentrar o compactar las células. En algunos casos, los compuestos se combinan con la suspensión celular para conferir las propiedades de extrusión necesarias. Los compuestos adecuados incluyen colágeno, hidrogeles, Matrigel, nanofibras, nanofibras autoensamblables, gelatina y fibrinógeno. Uno o más componentes de la ECM (o derivados de componentes de la ECM) pueden incluirse, además, mediante la resuspensión del gránulo celular en uno o más tampones fisiológicamente aceptables que contienen los componentes de la ECM (o derivados de componentes de la ECM) y la suspensión celular resultante centrifugada nuevamente para formar la pasta celular.

[0195] Se pueden usar varios métodos para conformar la pasta celular. Por ejemplo, en un caso particular, la pasta celular puede moldearse o presionarse manualmente (por ejemplo, después de la concentración/compactación) para lograr una forma deseada. A modo de ejemplo adicional, la pasta celular puede recogerse (por ejemplo, aspirarse) en un instrumento preformado, tal como una micropipeta (por ejemplo, una pipeta capilar), que conforma la pasta celular para adaptarse a una superficie interior del instrumento. La forma de sección transversal de la micropipeta (por ejemplo, pipeta capilar) puede ser de forma alternativa circular, cuadrada, rectangular, triangular u otra forma de sección transversal no circular. En algunos casos, la pasta celular se puede conformar depositándola en un molde preformado, tal como un molde de plástico, un molde de metal o un molde de gel. En algunos casos, se puede usar fundición centrífuga o fundición continua para conformar la pasta celular.

[0197] La pasta celular puede madurar aún más. En algunos casos, el cultivo celular puede incubarse a alrededor de 37 °C durante un periodo de tiempo (que puede depender del tipo de célula) para favorecer la adherencia y/o la cohesión. De forma alternativa o adicional, la pasta celular puede mantenerse en presencia de un medio de cultivo celular que contiene factores y/o iones para fomentar la adherencia y/o cohesión.

[0199] Disposición de cuerpos multicelulares en un sustrato de soporte para formar capas

[0201] Los cuerpos multicelulares pueden disponerse en un sustrato de soporte para producir una estructura tridimensional deseada (por ejemplo, una capa sustancialmente plana). Por ejemplo, los cuerpos multicelulares pueden colocarse manualmente en contacto entre sí, depositarse en su lugar por extrusión desde una pipeta, boquilla o aguja, o colocarse en contacto mediante una máquina automatizada tal como un biofabricante.

[0203] Un sustrato de soporte puede ser permeable a fluidos, gases y nutrientes y permite que los medios de cultivo celular entren en contacto con todas las superficies de los cuerpos y/o capas multicelulares durante la disposición y la fusión posterior. En algunos casos, un sustrato de soporte puede fabricarse a partir de biomateriales naturales tales como colágeno, fibronectina, laminina y otras matrices extracelulares. En algunos casos, un sustrato de soporte puede fabricarse a partir de biomateriales sintéticos tales como hidroxiapatita, alginato, agarosa, ácido poliglicólico, ácido poliláctico y sus copolímeros. En algunos casos, un sustrato de soporte puede ser sólido, semisólido o una combinación de elementos de soporte sólidos y semisólidos. En algunos casos, un sustrato de soporte puede ser plano para facilitar la producción de capas planas. En algunos casos, un sustrato de soporte puede elevarse por encima de una superficie no permeable, tal como una porción de un entorno de cultivo celular (por ejemplo, una placa de Petri, un matraz de cultivo celular, etc.) o un biorreactor. Un sustrato de soporte permeable y elevado puede contribuir a la prevención de la muerte celular prematura, contribuye a mejorar el crecimiento celular y facilita la fusión de cuerpos multicelulares para formar capas.

[0205] Una vez completado el ensamblaje de una capa, se puede verter un medio de cultivo tisular sobre la parte superior del constructo. En algunos casos, el medio de cultivo de tejido entra en los espacios entre los cuerpos multicelulares para sostener las células en los cuerpos multicelulares. Los cuerpos multicelulares en el constructo tridimensional pueden fusionarse entre sí para producir una capa (por ejemplo, una sustancialmente plana) para su uso en la formación del cuero sintético. Los términos «fusionar», «fusionado» o «fusión» pueden significar que las células de cuerpos multicelulares contiguos se adhieren y/o cohesionan entre sí, ya sea directamente a través de interacciones entre proteínas de la superficie celular, o indirectamente a través de interacciones de las células con componentes de la ECM o derivados de componentes de la ECM. Una capa fundida se puede fundir completamente y los cuerpos multicelulares se han vuelto sustancialmente contiguos. De forma alternativa, una capa fundida puede fundirse sustancialmente o parcialmente y las células de los cuerpos multicelulares se han adherido y/o cohesionado en la medida necesaria para permitir el movimiento y la manipulación de la capa intacta.

[0207] Los cuerpos multicelulares pueden fusionarse para formar una capa en un entorno de cultivo celular (por ejemplo, una placa de Petri, un matraz de cultivo celular o un biorreactor). En algunos casos, los cuerpos multicelulares se fusionan para formar una capa en un entorno con condiciones adecuadas para facilitar el crecimiento de los tipos de células incluidos en los cuerpos multicelulares. En algunos casos, la fusión se produce en alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 minutos, e incrementos de los mismos. En otros casos, la fusión se produce durante alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48 horas, e incrementos de las mismas. En otros casos, la fusión se produce durante alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 y 14 días, e incrementos de los mismos. En otros casos, la fusión se produce durante alrededor de 2 horas a alrededor de 24 horas. Los factores relevantes para el tiempo de fusión pueden incluir tipos de células, relaciones de tipos de células, condiciones de cultivo y la presencia de aditivos tales como factores de crecimiento.

[0209] Una vez completada la fusión de una capa, la capa y el sustrato de soporte se pueden separar. En otros casos, la capa y el sustrato de soporte se separan cuando la fusión de una capa es sustancialmente completa o parcialmente completa, pero las células de la capa se adhieren y/o cohesionan entre sí en la medida necesaria para permitir mover, manipular y apilar la capa sin romperla. La capa y el sustrato de soporte pueden separarse mediante procedimientos estándar de fusión, disolución o degradación del sustrato de soporte. En algunos casos, el sustrato de soporte puede disolverse, por ejemplo, por cambio de temperatura, luz u otros estímulos que no afectan negativamente a la capa. En determinados casos, el sustrato de soporte puede estar hecho de un material flexible y despegarse de la capa. La capa separada se puede transferir a un biorreactor para su posterior maduración. En algunos casos, la capa separada madura y se funde después de incorporarse en una piel animal, cuero en bruto o producto de cuero genomanipulados.

[0210] De forma alternativa, la capa y el sustrato de soporte no pueden separarse. El sustrato de soporte se degrada o biodegrada antes del envasado, congelación, venta o consumo de la piel animal, el cuero en bruto o el producto de cuero ensamblados genomanipulados.

[0212] Se puede formar una capa celular durante un período de tiempo. En algunos casos, una capa celular, por ejemplo, una capa epidérmica o una capa dérmica, puede formarse dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 120, 300 días. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica en alrededor de 1 a 15 días, por ejemplo, 5 a 10 días, o 10 a 12 días. En algunos casos, se puede formar una capa dérmica en alrededor de 5 a 25 días, por ejemplo, 14 a 15 días.

[0214] La presente divulgación proporciona métodos para hacer que el cuero sintético mejore la función de barrera. En algunos casos, los métodos comprenden proporcionar queratinocitos y un medio de cultivo que comprende ácido ascórbico y ácido linoleico; y cultivar los queratinocitos en condiciones tales que se pueda formar un cuero sintético que tenga una función de barrera mejorada. En algunos casos, las condiciones de cultivo incluyen un nivel de humedad de alrededor de entre el 50 % y el 95 %, por ejemplo, alrededor del 75 %. En algunos casos, el ácido ascórbico puede proporcionarse en una concentración de alrededor de 10 a 100 microgramos/ml. En aún más casos, el ácido linoleico puede proporcionarse a una concentración de alrededor de 5 a 80 micromolar. La presente divulgación no se limita al cuero sintético formado a partir de una fuente particular de queratinocitos. De hecho, el cuero sintético puede formarse a partir de una variedad de queratinocitos primarios e inmortales, que incluyen, pero no se limitan a, células de queratinocitos inmortalizados casi diploides (NIKS). En aún más casos, los queratinocitos expresan un factor de tipo silvestre exógeno o variante similar a Kruppel (GKLF). En aún más casos, los queratinocitos se derivan de dos fuentes diferentes. En otros casos, el cuero sintético tiene una capacitancia eléctrica superficial de alrededor de 40 a alrededor de 240 pF. En algunos casos preferidos, el equivalente cutáneo presenta una capacitancia eléctrica de superficie de entre aproximadamente 80 y 120 pF. En otros casos preferidos, el contenido de ceramidas 5, 6 y 7 en el equivalente cutáneo puede variar entre alrededor del 20 % y el 50 % del contenido total de ceramidas. En otros casos preferidos, el contenido de ceramida 2 en el equivalente cutáneo puede ser de alrededor del 10 al 40 % del contenido total de ceramidas. En aún más casos, la presente divulgación proporciona el equivalente cutáneo elaborado con el método recién descrito.

[0216] Disposición de capas para formar una estructura en capas

[0218] Se pueden disponer múltiples capas celulares para formar una estructura en capas, produciendo así los cueros sintéticos descritos en la presente memoria. En algunos casos, las capas dérmicas y las capas epidérmicas se forman por separado y se ensamblan al colocar las capas epidérmicas en la parte superior de las capas dérmicas (por ejemplo, cuando tanto una capa epidérmica como una capa dérmica están completamente formadas). En algunos casos, una capa epidérmica puede crecer encima de una capa dérmica. En determinados casos, se puede colocar una membrana basal o un sustituto de la membrana basal entre una capa dérmica y una capa epidérmica. Por ejemplo, las capas celulares pueden colocarse manualmente en contacto entre sí o depositarse en su lugar mediante una máquina automatizada, asistida por ordenador, tal como un biofabricante, según un guion informático.

[0220] Antes de ensamblar múltiples capas celulares, se pueden realizar una o más etapas de control de calidad. Por ejemplo, la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se puede realizar en la epidermis antes de su colocación en la dermis (por ejemplo, el día 0), seguida de un análisis histológico (por ejemplo, un mínimo de 3 a 5 días). Mediante los métodos proporcionados en la presente memoria, el riesgo de que se forme una estructura en capas o equivalentes cutáneos de grosor completo inadecuados puede ser bajo.

[0221] Se pueden ensamblar múltiples capas celulares de varias maneras. En algunos casos, una capa epidérmica y una capa dérmica (con o sin un sustituto de la membrana basal) se colocan sobre un andamiaje (por ejemplo, seda), por ejemplo, para lograr el grosor y la resistencia a la tracción del cuero natural. En algunos casos, se ensamblan una capa epidérmica y múltiples capas dérmicas (con o sin un sustituto de la membrana basal) sin usar un andamiaje. Dicho ensamblaje puede lograr un grosor y una resistencia a la tracción que se parezcan al cuero natural. En algunos casos, una capa epidérmica y múltiples capas dérmicas (con o sin un sustituto de la membrana basal) se colocan en un andamiaje (por ejemplo, seda) para lograr un grosor y una resistencia a la tracción similares a la piel nativa.

[0222] En algunos casos, se pueden realizar ensayos químicos, mecánicos, de rendimiento, resistencia, durabilidad, humedad, dimensionales o una combinación de los mismos en una o más capas celulares múltiples, cueros sintéticos, capas epidérmicas artificiales, capas dérmicas artificiales, estructuras en capas, productos producidos a partir de las mismas. En algunos casos, se pueden realizar ensayos químicos, mecánicos, de rendimiento, resistencia, durabilidad, humedad, dimensionales o una combinación de los mismos mediante un ensayo no estándar. En algunos casos, se pueden realizar ensayos químicos, mecánicos, de rendimiento, resistencia, durabilidad, humedad, dimensionales o una combinación de los mismos mediante un ensayo estándar. En algunos casos, se puede realizar un ensayo según lo indicado y/o adoptado y/o ratificado y/o desarrollado por la Organización Internacional de Normalización (ISO), el organismo europeo de normalización (CEN), ASTM International o la Unión Internacional de Técnicos y Químicos del Cuero (IULTCS). En algunos casos, se puede realizar un ensayo de cualquiera de las Tablas 1 a 11 o cualquier variación del mismo, utilizando uno o más métodos correspondientes o cualquier variación de los mismos.

[0224] Tabla 1.

[0226]

[0227] Tabla 2.

[0228]

[0229]

[0231] Tabla 3.

[0232] É

[0233]

[0235] Tabla 4.

[0236]

[0237]

[0239] Tabla 5.

[0240]

[0241] Tabla 6.

[0242]

[0243]

[0245] Tabla 7.

[0246]

[0248] Tabla 8.

[0249]

[0250]

[0252] Tabla 9.

[0254]

[0256] Tabla 10.

[0258]

[0259]

[0261] Tabla 11.

[0262]

[0263]

[0266] En algunos casos, los productos de cuero pueden tener propiedades físicas similares a las del cuero real. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una resistencia a la tracción según la medición de ASTM D-2209-95 de por lo menos alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 lbs/in<2>. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una resistencia a la tracción según la medición de ASTM D-2209-95 menor que alrededor de 5000, 4000, 3000, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 lbs/in<2>.

[0268] En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una hendidura de por lo menos alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 lbs según la medición de ASTM-D2212-94. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una hendidura menor que alrededor de 200, 150, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 lbs según la medición de ASTM-D2212-94. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una puntada de por lo menos alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 cuando se mide según ASTM-D4705-93. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una puntada menor que alrededor de 200, 150, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener valores de hendidura y puntada de por lo menos alrededor de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 libras, cuando se miden según sus respectivos ensayos. En algunos casos, un cuero sintético divulgado en la presente memoria o un producto de cuero fabricado a partir de la misma puede tener una flexión Bally de por lo menos alrededor de 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50,000, 55000, 60000, 65000, 70000, 80000, según la medición de ASTM D6182.

[0269] Se pueden ensamblar múltiples capas celulares para formar un cuero sintético (por ejemplo, un equivalente cutáneo de grosor completo). Un cuero sintético puede comprender una parte superior, una parte central y una parte inferior. La parte superior puede comprender una capa epidérmica. Por ejemplo, la parte superior puede ser una sola capa epidérmica. La parte intermedia puede comprender un sustituto de la membrana basal. En algunos casos, la parte central no tiene un sustituto de la membrana basal. Por ejemplo, la parte intermedia puede tener una capa de grosor insignificante. La parte inferior puede tener una o más capas dérmicas. En algunos casos, la parte inferior tiene una sola capa dérmica colocada sobre un andamiaje (por ejemplo, seda). En algunos casos, la parte inferior tiene múltiples capas dérmicas (por ejemplo, hasta 5 capas) sin ningún andamiaje. En algunos casos, la parte inferior tiene múltiples capas dérmicas apiladas una sobre otra y colocadas en un andamiaje (por ejemplo, seda).

[0271] La adherencia entre las capas epidérmicas y dérmicas puede ser lo suficientemente fuerte como para resistir la separación de las capas. En algunos casos, las capas celulares pueden ensamblarse adhiriéndose a un andamiaje. Para el ensamblaje se pueden utilizar adhesivos naturales o sintéticos. Un adhesivo natural puede ser cola de fibrina, colas frías, cola animal (por ejemplo, cola ósea, cola para peces, cola para cuero, cola para pezuñas, cola para piel de conejo, cola de carne), cola de albúmina de sangre, cola de caseína, colas vegetales (por ejemplo, almidón, colas de dextrina, bálsamo de Canadá, cola a base de resina de pino, coconia, goma arábiga, goma de sello postal, látex, pasta de biblioteca, metilcelulosa, mucílago, resina de resorcinol o resina de urea-formaldehído), o cualquier combinación de los mismos. Un adhesivo sintético puede ser acrilonitrilo, cianoacrilato (por ejemplo, cola de n-butil-2-cianoacrilato), acrílico, cola de resorcinol, resinas epoxi, masilla epoxi, acetato de etileno-vinilo, resina de fenolformaldehído, poliamida, resinas de poliéster, polietileno, polipropileno, polisulfuros, poliuretano, acetato de polivinilo (incluida cola blanca (por ejemplo, cola Elmer) y cola amarilla de carpintero (resina alifática), alcohol polivinílico, cloruro de polivinilo (PVC), emulsión de cloruro de polivinilo (PVCE), cemento de caucho de polivinilpirrolidona, siliconas y copolímero acrílico de estireno. Por ejemplo, el ensamblaje se puede realizar mediante cola de fibrina. Por ejemplo, el ensamblaje se puede realizar mediante cola de n-butil-2-cianoacrilato.

[0273] En algunos casos, las capas celulares (por ejemplo, capas sustancialmente planas) se apilan para formar un cuero sintético. Una capa celular puede tener una orientación definida por la colocación, patrón u orientación de cuerpos multicelulares. En algunos casos, cada capa puede apilarse con una orientación particular con respecto al sustrato de soporte y/o una o más otras capas. Por ejemplo, una o más capas pueden apilarse con una orientación que incluye rotación respecto al sustrato de soporte y/o a la capa inferior, en el que la rotación puede variar entre 0,1 y 180 grados, por ejemplo, alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 y 180 grados, o incrementos de los mismos. En otros casos, todas las capas están orientadas sustancialmente de manera similar.

[0274] Una vez completado el apilado de las capas, se puede permitir que las capas del constructo tridimensional se fusionen entre sí para producir un cuero sintético. En algunos casos, las capas se fusionan en un entorno de cultivo celular (por ejemplo, una placa de Petri, un matraz de cultivo celular, un biorreactor, etc.). En algunos casos, la fusión se produce en alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 minutos, e incrementos de los mismos. En otros casos, la fusión se produce entre 1 y 48 horas, por ejemplo, durante alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, y 48 horas, e incrementos de las mismas. Por ejemplo, la fusión puede tener lugar durante alrededor de 2 horas a alrededor de 24 horas.

[0275] Condiciones de cultivo

[0276] Las células y las capas celulares pueden cultivarse en varias condiciones de cultivo celular. Las células o capas celulares pueden cultivarsein vitro. Por ejemplo, una capa dérmica y/o una capa epidérmica pueden cultivarsein vitro. De forma alternativa, las células o capas celulares pueden cultivarsein vivo. Por ejemplo, una capa dérmica y/o una capa epidérmica pueden cultivarsein vivo.

[0277] Las células y las capas celulares pueden cultivarse con uno o más suplementos. Los uno o más suplementos pueden ser suplementos naturales, suplementos sintéticos o una combinación de los mismos. En algunos casos, un suplemento puede ser un aditivo. En algunos casos, uno o más de los suplementos inducen la producción y el ensamblaje de la matriz extracelular a partir de fibroblastos derivados de iPSC, mejorando así el aspecto natural del cuero sintético. lLos aditivos ejemplares pueden incluir componentes de ECM tales como colágeno y fibrina, factores de crecimiento, moléculas pequeñas tales como ácido ascórbico o similares, macromoléculas tales como sulfato de dextrano, carragenina o similares.

[0278] Las capas celulares se pueden cultivar con determinada humedad del aire. Por ejemplo, las capas celulares (por ejemplo, las capas dérmicas o epidérmicas) pueden cultivarse con una humedad que varía de alrededor del 20 % a alrededor del 100 %. Por ejemplo, la humedad puede variar de alrededor del 40 % a alrededor del 100 %, de alrededor del 50 % a alrededor del 95 %, de alrededor del 45 % a alrededor del 90 %, de alrededor del 55 % a alrededor del 95 %, de alrededor del 60 % a alrededor del 90 %, de alrededor del 70 % a alrededor del 80 %, de alrededor del 71 % a alrededor del 79 %, de alrededor del 72 % a alrededor del 78 %, de alrededor del 73 % a alrededor del 77 %, de alrededor del 74 % a alrededor del 76 %, de alrededor del 60 % a alrededor del 70 %, de alrededor del 65 % a alrededor del 75 %, de alrededor del 70 % a alrededor del 80 %, de alrededor del 75 % a alrededor del 85 %, de alrededor del 80 % a alrededor del 90 %, de alrededor del 85 %a alrededor del 95 %, o de alrededor del 90 % a alrededor del 100 %, de alrededor del 40 % a alrededor del 60 %, de alrededor del 45 % a alrededor del 55 %, de alrededor del 46 % a alrededor del 54 %, de alrededor del 47 % a alrededor del 53 %, de alrededor del 48 % a alrededor del 52 %, de alrededor del 48 % a alrededor del 53 %, de alrededor del 49 % a alrededor del 54 %, o de alrededor del 47 % a alrededor del 51 %.

[0279] Procesamiento del cuero

[0280] Curtido

[0281] Los métodos de la presente memoria pueden comprender el curtido de por lo menos una porción de un cuero sintético, por ejemplo, por lo menos una porción de una capa dérmica y/o una capa epidérmica en el cuero sintético. El curtido puede hacer que un cuero sintético se parezca a una piel nativa, la cual puede ser un material duradero y flexible creado a partir del curtido de cuero en bruto y piel de animales, a menudo de ganado. El curtido en la presente memoria puede referirse al proceso de tratar la capa celular de la piel de animales para producir cuero. El curtido se puede realizar de varias maneras, que incluyen el curtido al vegetal (por ejemplo, con tanino), el curtido al cromo (sales de cromo, incluido el sulfato de cromo), el curtido con aldehído (utilizando glutaraldehído o compuestos de oxazolidina), sintanos (taninos sintéticos, utilizando polímeros aromáticos), teñido bacteriano y similares.

[0282] El curtido se puede realizar para convertir las proteínas del cuero en bruto/de la piel en un material estable que no se pudra, a la vez que permite que el material permanezca flexible. El cromo se puede utilizar como material de curtido. El pH de la capa celular o de la estructura en capas puede ajustarse (por ejemplo, reducirse; a un pH de alrededor de 2,8-3,2) para mejorar el curtido; tras el curtido, el pH puede elevarse ("basificación" a un nivel ligeramente más alto, por ejemplo, a un pH de alrededor de 3,8-4,2).

[0283] El curtido se puede realizar en capas celulares, por ejemplo, capas dérmicas y capas epidérmicas. El curtido puede realizarse, además, en estructuras en capas, por ejemplo, estructuras en capas que comprenden por lo menos una capa dérmica y por lo menos una capa epidérmica. En algunos casos, el curtido también se puede realizar en un cuero sintético. Por ejemplo, el curtido se puede realizar después de formar capas celulares, por ejemplo, capas dérmicas o capas epidérmicas. Por ejemplo, el curtido se puede realizar después de formar estructuras en capas.

[0284] El curtido se puede realizar modificando el material de la matriz extracelular (ECM). El curtido se puede realizar modificando el colágeno de la ECM. El curtido se puede realizar utilizando un agente de curtido, por ejemplo, sulfato de cromo(III) ([Cr(H2O6 ]2(SO4)3 ). El sulfato de cromo(III) se puede disolver para dar el catión hexaacuacromo(III), [Cr(H2 O)6 ]<3+>, que a un pH más alto se somete a procesos llamados olación para dar compuestos de policromo(III) que están activos en el curtido, siendo la reticulación de las subunidades de colágeno. Algunos ligandos incluyen el anión sulfato, los grupos carboxilo del colágeno, los grupos amina de las cadenas laterales de los aminoácidos, así como agentes enmascarantes. Los agentes enmascarantes pueden ser ácidos carboxílicos, tales como el ácido acético, que se utilizan para suprimir la formación de cadenas de policromo(III). Los agentes enmascarantes pueden permitir que el curtidor aumente aún más el pH para incrementar la reactividad del colágeno sin inhibir la penetración de los complejos de cromo(III). El curtido puede aumentar el espaciado entre las cadenas proteicas en el colágeno (por ejemplo, de 10 a 17 Å), consistente con la reticulación por especies de policromo, del tipo resultante de la olación y la oxolación. El cromo puede reticularse con el colágeno. El cuero curtidao con cromo puede contener entre alrededor del 4 % y el 5 % de cromo. Esta eficiencia puede caracterizarse por su mayor estabilidad hidrotérmica del cuero y su resistencia a la contracción en agua caliente. Se pueden utilizar otros agentes de curtido para curtir el cuerpo en capas y modificar el colágeno.

[0285] El curtido también se puede realizar con otros minerales. En algunos casos, el curtido se puede realizar con el uso de un agente a base de alumbre, circonio, titanio, sales de hierro, o una combinación de los mismos,Procesamiento posterior

[0286] Las capas celulares, las estructuras en capas y los cueros sintéticos fabricados en la presente memoria pueden procesarse adicionalmente después del curtido. En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente memoria comprenden, además, una o más etapas de procesamiento de cuero (por ejemplo, las usadas en la formación tradicional de cuero). Algunos ejemplos de etapas de procesamiento incluyen: conservar, remojar, calcificar, despellejar, descarnar, separar, descalcificar, recalcificar, batir, desengrasar, frisar blanquear, colorar, capar, decapar, curtir, recurtir (por ejemplo, si el color se pierde durante el procesamiento), diluir, recurtir, lubricar, incrustar, humedecer, escurrir, rebajar, recromar, neutralizar, teñir, engrasar, llenar, pelar, embastecer, emblanquecer, fijar, asentar, secar, acondicionar, fresar (por ejemplo, fresado en seco), estacar, esmerilar, acabar, aceitar, cepillar, acolchar, impregnar, pulverizar, recubrir con rodillo, recubrir con cortina, pulir, chapar, estampar, planchar, vitrificar y ablandar.

[0287] El cuero sintético puede conformarse, por ejemplo, al controlar el número, el tamaño y la disposición de los cuerpos multicelulares y/o las capas usadas para construir la piel animal, cuero en bruto o cuero. En otros casos, la piel animal, el cuero en bruto o el cuero se pueden conformar mediante, por ejemplo, corte, presión, moldeo o estampado. La forma del cuero sintético se puede realizar para que se parezca a una piel animal tradicional, cuero en bruto o producto de cuero.

[0288] Los métodos de la presente memoria pueden comprender eliminar una porción de un cuero sintético producido en la presente memoria. En algunos casos, el método comprende eliminar por lo menos una porción de la capa epidérmica para formar un producto eliminado. Por ejemplo, la eliminación puede ser el rebajado.

[0289] Pigmentación

[0290] Los métodos de la presente descripción pueden comprender pigmentar el cuero sintético. En algunos casos, la pigmentación se puede realizar introduciendo pigmentos que producen células (por ejemplo, melanocitos) en el cuero sintético. En algunos casos, el cuero sintético comprende melanocitos vivos funcionales. Los melanocitos pueden tener una ubicación similar a la de la piel humana. En algunos casos, los melanocitos pueden producir melanina de forma constitutiva. En algunos casos, la melanina puede transferirse a los queratinocitos. En algunos casos, los melanocitos se producen mediante estimulación, por ejemplo, mediante radiación UV o mediante la propigmentación de agentes activos, tales como la hormona estimulante de alfa-melanocitos (aMSH), la endotelina 1 (ET1), el factor de células madre (SCF), las prostaglandinas E2 y F2α (PGE2, PGF2α), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) o factor de crecimiento nervioso (NGF).

[0291] Diferenciación de células progenitoras en células de un cuero sintético

[0292] Se pueden derivar células en capas epidérmicas, tales como queratinocitos y melanocitos, así como células en capas dérmicas, tales como fibroblastos, por ejemplo, diferenciadas de células progenitoras, tales como las iPSC. En otro caso, las células primarias o células cultivadas derivadas de células primarias pueden usarse para formar capas celulares para fabricar cuero sintético.

[0293] Se pueden usar varios métodos para diferenciar las iPSC de las células en un cuero sintético, por ejemplo, queratinocitos, melanocitos o fibroblastos. En algunos casos, la diferenciación de las iPSC en queratinocitos y la construcción de una epidermis 3D a partir de los queratinocitos derivados de las iPSCs se puede llevar a cabo utilizando el método descrito por Petrova et al., en 3DIn vitromodel of a functional epidermal permeability barrier from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports.24 Abr 2014;2(5):675-89. En otros casos, las capas celulares se pueden formar mediante el uso de células primarias. Por ejemplo, la construcción de epidermis 3D a partir de queratinocitos primarios se puede llevar a cabo utilizando el método descrito en Sun R. et al., Lowered humidity produces human epidermal equivalents with enhanced barrier properties. Tissue Eng Part C Methods. Ene 2015;21(1):15-22.

[0295] En algunos casos, los métodos divulgados en la presente memoria proporcionan métodos de alto rendimiento que escalan de forma fiable, exacta y reproducible hasta niveles comerciales la producción de cuero sintético. Las ventajas del cuero sintético, del equivalente epidérmico genomanipulado, del equivalente cutáneo de grosor completo genomanipulado y de los métodos para fabricación los divulgados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, la producción de tejidos personalizados de forma reproducible, de alto rendimiento y fácilmente escalable, con un aspecto, textura, grosor y durabilidad atractivos. En algunos casos, los métodos descritos en la presente memoria pueden producir un aumento del rendimiento de una o más de una capa epidérmica, capa dérmica, estructura en capas o cuero sintético. En algunos casos, el aumento del rendimiento puede ser por lo menos de alrededor de 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13 o alrededor de 15 veces el rendimiento en comparación con un método comparable. En algunos casos, los métodos divulgados en la presente memoria pueden reducir el coste de la fabricación de cueros sintéticos, capas epidérmicas artificiales, capas dérmicas artificiales, estructuras en capas y productos producidos a partir de los mismos. En algunos casos, los métodos divulgados en la presente memoria pueden producir cueros sintéticos de grosor uniforme, capas epidérmicas artificiales, capas dérmicas artificiales, estructuras en capas y productos producidos a partir de los mismos. En algunos casos, los cueros sintéticos, las capas epidérmicas artificiales, las capas dérmicas artificiales, las estructuras en capas y los productos producidos a partir de los mismos pueden tener un grosor, longitud y/o anchura sustancialmente uniformes. En algunos casos, las células en cualquiera o más de las capas epidérmicas, capas dérmicas, estructuras en capas pueden distribuirse de manera homogénea. En algunos casos, las células en cualquiera o más de las capas epidérmicas, capas dérmicas, estructuras en capas pueden distribuirse de forma heterogénea.

[0297] Análisis comparativo del equivalente epidérmico

[0299] La figura 4A-4C Ilustra un análisis comparativo de cuero fino, piel nativa y el equivalente epidérmico. La figura 4A ilustra FESEM de secciones longitudinales de la piel nativa y cuero fino. La figura 4A muestra estructuras morfológicas distintas de la epidermis (e) y de la dermis (d). El curtido alteró permanentemente la estructura de la piel. Los límites entre las células individuales de la epidermis se volvieron indistinguibles. La eliminación de la humedad hizo que los paquetes de colágeno de la dermis se volvieran más compactos y duraderos. Aumento: 1000x.

[0301] La figura 4B representa imágenes FESEM. En un caso, la figura 4B ilustra que tanto la superficie de cuero fino como la superficie de equivalentes epidérmicos tienen un aspecto liso similar, lo que indica que probablemente inducirán una experiencia táctil (tacto) comparable, aumento: 2000x.

[0303] La figura 4C representa FESEM de secciones longitudinales de cuero fino y el equivalente epidérmico. Antes del curtido, similar a la epidermis de la piel nativa (figura 4A), se pueden distinguir capas celulares individuales en el equivalente epidérmico. Dado que el colágeno en la dermis puede ser responsable en gran medida de la resistencia a la tracción de la piel, los paquetes de colágeno pueden dar grosor y durabilidad a la piel (recuadro), pero pueden no dar experiencia sensorial, lo que puede depender completamente de las capas externas de la epidermis.

[0305] La figura 5A-5C ilustra un análisis comparativo delestrato córneo(SC; capa cornificada) de la piel nativa y del equivalente epidérmico. La figura 5A muestra imágenes de FESEM que indican que la superficie de los equivalentes epidérmicos es más lisa que la de la piel nativa, lo que podría deberse al entorno controlado del cultivo celular. La figura 5B ilustra que los corneodesmosomas observados mediante TEM (flechas), las principales uniones «mecánicas» del SC, se pueden detectar como áreas más densas en electrones en equivalentes epidérmicos. La figura 5C ilustra que la corneodesmosina (CDSN) puede ser sintetizada y excretada en los espacios extracelulares por las células del SG, poco antes del inicio de la cornificación. La CDSN puede incrustarse dentro de las porciones intercelulares de los desmosomas del SG ocupados por cadherinas y de manera que puede formar corneodesmosomas. Las flechas señalan acumulaciones punteadas alineadas de CDSN en el SC de la piel nativa y su equivalente epidérmico, que probablemente representan corenodesmosomas. SC,estrato córneo; SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso.

[0307] La figura 6A-6E ilustra un análisis comparativo delestrato granuloso(SG; capa granular) de la piel nativa y del equivalente epidérmico. La figura 6A ilustra la tinción con loricrina (LOR). La LOR es un componente proteico importante de la envoltura celular cornificada y puede expresarse en la capa granular del epitelio queratinizante. Se detectó un patrón de expresión de LOR similar (pigmento marrón oscuro en secciones de tejido teñidas con H&E señaladas con flechas) en el SG tanto en la epidermis de la piel nativa (lado izquierdo del panel) como en el equivalente epidérmico (lado derecho del panel). d, dermis; H&E, hematoxilina y eosina; SB,estrato basal; SC,estrato córneo; SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso; *, membrana de filtro Transwell. En la figura 6B, el gradiente de Ca<++>epidérmico se puede capturar en microscopía electrónica de transmisión como precipitados densos en electrones. Los depósitos de Ca<++>estaban presentes en el SG y ausentes del SC tanto en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) como en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso. En la figura 6C, la integridad de la barrera de permeabilidad se evaluó mediante perfusión de lantano. El lantano se visualizó como depósitos densos en electrones en los espacios extracelulares del SG viable, lo que demuestra que el lantano y, por extensión, el agua y otros iones pequeños pueden pasar entre los queratinocitos en este estrato. Por el contrario, el lantano no puede penetrar más en el SC porque una barrera lipídica funcional bloquea su movimiento hacia arriba. El equivalente epidérmico generadoin vitrodemostró una barrera de permeabilidad tan funcional como la piel nativa. SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso. La figura 6D ilustra que la proteína de unión estrecha 1/zonula ocludens-1 (TJP1/ZO-1) ancla las proteínas de las cadenas de unión estrecha, que son estructuras similares a fibrillas dentro de la bicapa lipídica, al citoesqueleto de actina. Las flechas señalan acumulaciones de TJP1/ZO-1 asociadas a membranas celulares de color verde brillante alineadas de forma similar en el SG de la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) y equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). SC,estrato córneo; SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso. La figura 6E ilustra que los monómeros de filagrina (FLG), agrupados en tándem en un gran precursor proteico de 350 kDa conocido como profilagrina, están presentes en los gránulos de queratohialina en las células del SG. Las flechas señalan acumulaciones de FLG asociadas a gránulos y membranas celulares de color rojo brillante alineadas de forma similar en el SG de piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) y en equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). SC,estrato córneo; SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso.;[0309] La figura 7A-7C ilustra la formación de una bicapa lipídica en la piel nativa y los equivalentes epidérmicos evaluados con TEM. En la figura 7, las flechas blancas apuntan a la secreción normal de lípidos en el borde del SC y SG, tanto en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) como en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). En la figura 7B, se observan cuerpos lamelares (puntas de flecha blancas) en el SG tanto de la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) como de los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). La figura 7C representa la morfología normal de bicapa lipídica (LB) de la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel). Las bicapas lipídicas en equivalentes epidérmicos, generadasin vitro(lado derecho del panel), tenían un aspecto similar. SC,estrato córneo.;[0311] La figura 8A-8D ilustra el análisis comparativo de los marcadores de las capas suprabasales de la piel nativa y del equivalente epidérmico. En relación con la figura 8A, figura 8B y figura 8C, la queratina 10 (KRT10), la queratina 1 (KRT1), la desmocolina 1 (DCL1), los marcadores de las capas suprabasales, elestrato espinoso(SS) y elestrato granuloso(SG), tienen un patrón de expresión similar en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) y los equivalentes epidérmicos, generadosin vitro(lado derecho del panel) como se demuestra por inmunohistoquímica (KRT10; pigmento marrón oscuro en secciones de tejido teñidas con H&E señaladas con flechas) e inmunofluorescencia (tinción citoplasmática roja /KRT1/ y membrana de eritrocitos /DCL1/ indicada con flechas). d, dermis; H&E, hematoxilina y eosina; SB,estrato basal; SC,estrato córneo; SG,estrato granuloso; SS,estrato espinoso; *, membrana de filtro Transwell. En la figura 8D, los desmosomas (flechas) se definen claramente tanto en la piel nativain vivocomo en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro. SS,estrato espinoso.

[0313] La figura 9A-9D ilustra un análisis comparativo delestrato basal(SB; capa basal) de la piel nativa y del equivalente epidérmico. En relación con la figura 9A, figura 9B, figura 9C y figura 9D, MKI67, un marcador de proliferación, queratina 14 (KRT14) y el factor de transcripción TP63 muestran una distribución típica de la capa basal tanto en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) como en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel), como se demuestra mediante inmunohistoquímica (MKI67; pigmento marrón oscuro en secciones de tejido teñidas con H&E, señalado con flechas) e inmunofluorescencia (tinción citoplasmática verde de /KRT14/ y nuclear blanca de /TP63/, indicada con flechas). Los hemidesmosomas (flechas) están claramente definidos tanto en la piel nativain vivocomo en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro. BM, membrana basal; Cy, citoplasma; d, dermis; H&E, hematoxilina y eosina; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; TM, membrana de filtro Transwell.

[0315] Las figuras 10A-10F ilustran el análisis comparativo de los componentes de la matriz extracelular de la membrana basal. La membrana basal (BM) puede formarse a partir de redes condensadas de proteínas de la matriz extracelular (ECM), que pueden proporcionar un soporte estructural esencial en la unión dermoepidérmica. La integrina β 1 regula múltiples funciones celulares epiteliales conectando las células con la ECM y puede ser crucial para el mantenimiento de la BM en la unión dermoepidérmica. En la figura 10A, la integrina β1 muestra una distribución típica de la capa basal tanto en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) como en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel), tal como se indica con las flechas (tinción asociada a la membrana celular) y las puntas de las flechas (en la punta de las células que sobresalen a través de los orificios de la membrana Transwell). BM, membrana basal; d, dermis; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; SG,estrato granuloso; TM, membrana Transwell. La fibronectina puede desempeñar un papel en la adhesión celular. La figura 10B ilustra que en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) la fibronectina puede expresarse principalmente en la dermis y puede detectarse relativamente poca en el área de la BM. De manera similar, en equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel), se puede detectar fibronectina en la punta de las células que sobresalen a través de los orificios de la membrana Transwell (puntas de flecha rojas). d, dermis; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; SG,estrato granuloso; TM, membrana Transwell.

[0316] El soporte mecánico proporcionado por la BM puede determinarse mediante el colágeno IV o, en el caso de equivalentes epidérmicos, el andamiaje. En la figura 10C, como se indica con las flechas, la expresión del colágeno IV presenta un patrón moteado similar en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) y en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). BM, membrana basal; d, dermis; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; SG,estrato granuloso; TM, membrana Transwell.

[0317] El colágeno VI puede desempeñar un papel en la adhesión celular y puede asociarse con la fibronectina. En la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel), el colágeno VI se puede expresar principalmente en la dermis y puede detectarse relativamente poco en el área de la BM, como se muestra en la figura 10D. De manera similar, en equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel), el colágeno VI puede detectarse en la punta de las células que sobresalen a través de los orificios de la membrana Transwell (puntas de flecha), figura 10D. BM, membrana basal; d, dermis; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; SG,estrato granuloso; TM, membrana Transwell. El colágeno VII puede anclar la membrana basal para las fibrilas de colágeno I y III en la dermis. En la figura 10E, como se indica con las puntas de las flechas, la expresión del colágeno VII presenta un patrón moteado similar en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) y en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). BM, membrana basal; d, dermis; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; SG,estrato granuloso; TM, membrana Transwell.

[0318] La laminina 5 (composición de cadenas α3β3γ2) puede ser un componente principal de los filamentos de anclaje y puede ser esencial para el ensamblaje inicial de la BMin vivo. En la figura 10F, como se indica con las flechas, la expresión de la laminina 5 presenta un patrón similar en la piel nativain vivo(lado izquierdo del panel) y en los equivalentes epidérmicos generadosin vitro(lado derecho del panel). Además de su abundancia adicional en los equivalentes epidérmicos, se pueden ver trazas de laminina 5 en la membrana celular de las células de la capa basal (flechas). BM, membrana basal; d, dermis; SB,estrato basal; SS,estrato espinoso; SG,estrato granuloso; TM, membrana Transwell.

[0319] Las figuras 11A-11I ilustran un análisis estructural del equivalente cutáneo de grosor completo (FSE). La figura 11A y la figura 11B muestran secciones transversales del FSE que representan distintas capas celulares de la epidermis con un aumento de 2600x (figura 11A) y 5200x (figura 11B). La figura 11C muestra la superficie de un FSE con un aumento de 900x, que presenta un aspecto liso similar al del cuero fino, lo que indica que un FSE puede inducir una experiencia táctil (tacto) comparable. Las figuras 11D - 11F representan secciones longitudinales de andamiaje dérmico con fibroblastos dérmicos residentes y una rica matriz extracelular con un aumento de 91x (figura 11D), 162x (figura 11E) y 405x (figura 11F). Las figuras 11G - 11I muestran andamiajes dérmicos con fibroblastos dérmicos residentes y una matriz extracelular rica con un aumento de 80x (figura 11G), 695x (figura 11H) y 2700x (figura 11I).

[0320] Las figuras 12A-12R ilustran la evolución temporal del equivalente dérmico geomanipulado. Las figuras 12A -12I muestran el día 2 después de sembrar fibroblastos dérmicos en el andamiaje con un aumento de 36x (figura 12A), 695x (figura 12B), 1470x (figura 12C), 7750x (figura 12D), 2320x (figura 12E), 2420x (figura 12F), 6560x (figura 12G), 17000x (figura 12H) y 22000x (figura 12I). Las células pueden empezar a migrar hacia las estructuras huecas de un andamiaje y secretar matriz extracelular. Las figuras 12J -12R muestran el día 7 después de sembrar fibroblastos dérmicos en el andamiaje con un aumento de 64x (figura 12J), 100x (figura 12K), 364x (figura 12L), 82x (figura 12M), 253x (figura 12N), 3940x (figura 12O), 5550x (figura 12P), 9440x (figura 12Q) y 21680x (figura 12R). Las secciones longitudinales (figuras 12J - 12L) y transversales (figuras 12M - 12R) pueden mostrar células más densas y una matriz extracelular más rica, con algunas áreas que presentan una obstrucción casi completa de la estructura hueca del andamiaje (figuras 12M - 12P).

[0321] Ejemplos

[0322] Los ejemplos divulgados en la presente memoria que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas son para ayudar al experto en la materia a comprender y poner en práctica la presente divulgación, pero no forman parte de la invención reivindicada.

[0323] Ejemplo 1. Diferenciación de las iPSC en queratinocitos

[0324] Para inducir la diferenciación, las iPSC no diferenciadas se transfieren a un entorno de atmósfera del 20 % de O<2>y se tratan con mTESR1 u otro medio basal de células madre pluripotentes suplementado con 1 mM de ATRA (Sigma-Aldrich) y 25 ng/ml de BMP4 (I+D) durante 7 días (inducción).

[0325] Para seleccionar células con adquisición temprana de destino ectodérmico, se cosechan las células y se vuelven a sembrar en un ECM 3D HDF recién preparado u otro tipo de ECM a una densidad de 5~10 x 10<3>células por cm<2>y se cultivan en un medio Eagle modificado de Dulbecco/Ham F12 (3:1; Life Technologies) o en un medio de queratinocitos suplementado con un sustituto de suero, tal como el lisado de plaquetas humanas, y con 1 mM de ATRA y 25 ng/ml de BMP4 durante 7 días adicionales (selección).

[0326] Para enriquecer los supuestos progenitores epidérmicos, se puede utilizar la adhesión rápida a placas recubiertas de colágeno tipo IV, y las células que se adhieren rápidamente se cultivan en un medio de queratinocitos-SFM definido u otro medio de queratinocitos suplementado con 1 mM de ATRA durante 7 días (enriquecimiento). A continuación, las células se cultivan en medio EpiLife (Life Technologies) u otro medio para queratinocitos durante 7 días adicionales (expansión) antes de la cosecha final y el análisis.

[0327] Ejemplo 2. Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en un linaje de queratinocitosRecubrimiento de placas de cultivo de tejido con Geltrex y Col

[0328] El procedimiento se puede realizar en una cabina de seguridad biológica utilizando técnicas asépticas. Al igual que Matrigel, la matriz Geltrex se solidifica rápidamente a temperatura ambiente (RT). Haga alícuotas de cada nuevo lote de la matriz a su llegada y utilice puntas de pipeta, gradillas y tubos preenfriados mientras trabaja con el reactivo. Se preparan alícuotas de 50, 100 y 200 μL y se almacenan a -80 °C. Utilice Geltrex en diluciones de 1:100.

[0329] El procedimiento de recubrimiento que se describe a continuación es aplicable a una placa de cultivo de tejido de 60 mm. Si se va a utilizar una placa más grande, ajuste el volumen de la solución de recubrimiento en consecuencia.

[0330] 1. Retire una alícuota de 50 μL de Geltrex del congelador a -80 °C y colóquela sobre hielo en la cabina de seguridad biológica. 2. Añada 5 ml de DMEM/F12 estéril frío a un tubo cónico de 15 ml.3. Utilice una pipeta de vidrio de 1 ml, tome 1 ml de DMEM/F12 frío del tubo cónico de 15 ml preparado en la etapa 2 y añádalo al Geltrex congelado. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para descongelar y disolver el Geltrex. Transfiera el Geltrex disuelto al resto de DMEM/F12 en el tubo cónico de 15 ml preparado en la etapa 2. Pipetee para mezclar el Geltrex diluido.4. Añada 50 μL de solución madre de ColI de 3 mg/mL en el Geltrex diluido de la etapa 3. Pipetee para mezclar el Geltrex diluido con ColI. Añada 4 ml de solución de recubrimiento en una placa de 60 mm. Golpee o mueva la placa para asegurarse de que toda la superficie esté recubierta.5. Incube la placa con la solución de recubrimiento Geltrex/ColI a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares durante por lo menos 1 h.6. Una vez completado el recubrimiento, deje la solución de recubrimiento en la placa y continúe con el recubrimiento de las iPSC como se describe en la subsección siguiente. De forma alternativa, aspire la solución de recubrimiento y añada 2 ml de DMEM/F12 fresco en la placa recubierta para evitar que se seque antes de colocar las células en la placa.

[0331] Colocación de las iPSC para la diferenciación

[0332] Prepare una placa de cultivo de tejido de 60 mm con las iPSC sin alimentador, cultivadas a alrededor de un 70 % de confluencia. Examine las células bajo un microscopio para confirmar la ausencia de contaminación y el mantenimiento de su fenotipo indiferenciado. Si las células están estresadas o mueren, comienzan a diferenciarse, presentándose como zonas «adoquinadas» con células polimórficas más grandes, y no deben utilizarse para la diferenciación hacia los queratinocitos.

[0333] Para la diferenciación de las iPSC hacia queratinocitos, una relación de división de 1:8 de iPSC. 1. Precaliente el medio N2B27 y Dispase en el baño de agua a 37 °C. 2. Con el microscopio, confirme que las colonias están listas para el subcultivo. Aspire suavemente el medio de la placa. Añada 2 ml de PBS 1x, agite la placa para lavar las células y aspire suavemente el PBS.3. Añada 1 mL de Dispase y vuelva a colocar la placa en la incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 3-5 minutos.4. Mientras las células se están incubando con Dispase, aspire suavemente la solución de recubrimiento de Geltrex/ColI (o DMEM/F12) de la etapa 6 del procedimiento de recubrimiento de Geltrex/ColI y añada 4 ml de medio N2B27 completo en la placa recubierta.5. Después de 3 a 5 minutos de incubación con Dispase, confirme que las células están listas para ser recogidas buscando bordes enrollados o doblados alrededor de las colonias.6. Transfiera la placa a la cabina de seguridad biológica y aspire cuidadosamente la Dispase. Después del tratamiento con Dispase, las colonias se adhieren muy flojas a la superficie de la placa y pueden desprenderse si se usa demasiada fuerza. 7. Añada suavemente 2 ml de DMEM/F12 liso. Aspire el medio y repita el lavado 3 veces. 8. Añada 2 ml de N2B27 completo en la placa y raspe suavemente las colonias de la placa. Transfiera las células de la placa a un tubo cónico de 15 ml y añada 6 ml de N2B27 completo para llevar el volumen total de la suspensión celular a 8 ml.9. Mezcle suavemente la suspensión celular para romper los grumos grandes de células. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a la placa recubierta preparada en la etapa 3 de la subsección actual. Deseche o vuelva a colocar las células sobrantes utilizando las condiciones establecidas para un laboratorio determinado. 10. Transfiera las células, recién colocadas en la placa, a la incubadora y agite suavemente la placa de un lado a otro para distribuir las células uniformemente. Incubar las células durante la noche en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C.

[0334] Diferenciación de las iPSC con RA y BMP4

[0335] La diferenciación y el subcultivo de queratinocitos derivados de iPSC se deben realizar en una cabina de seguridad biológica utilizando técnicas asépticas. Examine la nueva placa el día siguiente al subcultivo para confirmar la correcta adhesión de las iPSC. Si las iPSC empiezan a formar colonias, continúe con el protocolo de diferenciación que se indica a continuación.

[0336] 1. Precaliente el DKSFM completo (con antibióticos y suplemento de DKSFM) en el baño de agua a 37 °C.2. Añada 5 ml de DKSFM precalentado de la etapa anterior a un tubo cónico de 15 ml, añada 5 μl de 1 mM de RA para lograr una concentración de trabajo final de 1 μM y 5 μl de 25 μg/ml de BMP4 para lograr una concentración de trabajo final de 25 ng/ml, mezcle bien. 3. Aspire el medio N2B27 de la placa con las iPSC, lave una vez con 4 ml de 1 x PBS y añada 4 ml de DKSFM que contenga 1 μM de RA y 25 ng/ml de BMP4 de la etapa anterior. Este es el día 1 del procedimiento de diferenciación.4. Transfiera las células a la incubadora e incube durante 48 h.5. Sustituya el medio por DKSFM fresco que contenga 1 μM de RA y 25 ng/ml de BMP4 después de 48 h de incubación. Transfiera la célula a la incubadora durante otras 48 h.6. Después de la segunda ronda de 48 h de inducción (día 4 de diferenciación), sustituya el medio por DKSFM completo sin RA y BMP4. Incube las células en la incubadora durante 10 días en DKSFM completo, cambiando el medio cada dos días. 7. El día 14 de la diferenciación, prepare el medio CnT-07 completo añadiendo los antibióticos y suplementos proporcionados, precaliente el medio. En este día, la mayoría de las células de la colonia iPSC sobrecrecida comienzan a mostrar un fenotipo de tipo epitelial.8. Aspire el DKSFM de las células diferenciadas y sustitúyalo por 4 ml de CnT-07 completo. Incube las células en la incubadora de cultivo celular durante otros 10 días, cambiando el medio CnT-07 completo cada dos días.

[0337] Adhesión y cultivo rápidos de queratinocitos derivados de iPSC

[0338] En el día 24 de diferenciación, muchas células que migran lejos de la colonia iPSC sobrecrecida presentan un fenotipo similar al de los queratinocitos, y comienzan a expresar p63, un regulador maestro necesario para el compromiso del ectodermo con un destino de queratinocitos, y Krt14. A día de hoy, la placa de 60 mm utilizado para la diferenciación de iPSC está completamente confluente y debe ser subcultivado. Para enriquecer los queratinocitos derivados de iPSC durante el subcultivo, el cultivo de iPSC diferenciadas se adhiere rápidamente a las placas recubiertas con ColI/ColIV. Se utilizan hasta cuatro placas de cultivo de tejido recubiertas con ColI/ColIV de 100 mm para realizar el procedimiento de adhesión rápida a partir de una placa de 60 mm que contiene iPSC diferenciadas. Si solo se va a utilizar una placa de 100 mm, coloque una cuarta parte del cultivo de iPSC diferenciadas para el procedimiento de adhesión rápida.

[0339] Placas de recubrimiento con ColI y ColIV

[0340] El procedimiento se puede realizar en la cabina de seguridad biológica utilizando técnicas asépticas.1. Reconstituya el polvo de ColIV a una concentración de 2 mg/ml en ácido acético glacial estéril al 0,25 %. Disuelva durante varias horas a 2⁓8 °C, agitando de vez en cuando. Realice alícuotas y consérvelas a -20 °C.2. Descongele la alícuota de la solución madre de ColIV (2 mg/mL) muy lentamente, colocando el vial en un cubo de hielo y manteniéndolo a 4 °C durante varias horas.3. Vuelva a suspender la solución madre ColIV en el volumen adecuado (5 ml por cada placa de 100 mm) de ácido acético glacial al 0,25 % estéril hasta una concentración de trabajo final de 7 μg/ml. Añada un volumen adecuado de solución de ColI para alcanzar una concentración final de trabajo de 30 μg/mL. Recubra las placas utilizando 5 ml de solución de trabajo para recubrir una placa de 100 mm. Incube las placas a temperatura ambiente en la cabina de seguridad biológica durante 1 h.4. Aspire el líquido de las placas recubiertas, enjuague las placas una vez con 5 ml de 1 x PBS estéril y una vez con 5 ml de ddH2O.5. Seque al aire las placas lavadas en la cabina de seguridad biológica. Utilice las placas directamente o séllelas con Parafilm y guárdelas a 4 °C durante un máximo de 6 meses. Para usar una placa recubierta con ColIV almacenada previamente, deje que la placa se caliente a temperatura ambiente en la cabina de seguridad biológica durante por lo menos 1 h antes de colocar las células en la placa.

[0341] Adhesión rápida de queratinocitos derivados de iPSC

[0342] 1. El día 24 de la diferenciación, precaliente completamente la CnT-07, la Accutase y la(s) placa(s) recubiertas con ColI/ColIV.2. Lave las células con 1 x PBS, añada 2 ml de Accutase e incube en la incubadora de cultivos celulares durante 5 minutos. Confirme bajo el microscopio que las células comienzan a desprenderse.3. Añada 3 ml de Cnt-07 completo, pipetee hacia arriba y hacia abajo para desplazar las células y recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugue las células a 260 x g durante 5 minutos y aspire el sobrenadante.

[0343] Resuspenda el gránulo en 10 mL de medio Cnt-07 completo, repita la centrifugación a 260 x g durante 5 minutos y aspire el sobrenadante. 4. Resuspenda el gránulo en 4 ml de CnT-07 completo, pipetee hacia arriba y hacia abajo para deshacer los grumos celulares en células individuales.5. Añada 9 ml de medio CnT-07 completo en cada placa recubierta con ColI/ColIV y transfiera 1 ml de suspensión celular de la etapa 4 anterior a cada placa recubierta con ColI/ColIV. Permita que las células se fijen a la placa recubierta a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos.6. Aspire con cuidado el medio que contiene las células en suspensión (son iPSC no diferenciadas o parcialmente diferenciadas). No altere las células adheridas (son células positivas Krt14 derivadas de iPSC). Añada 10 ml de medio CnT-07 completo fresco en la placa con las células adheridas. Deje que las células se expandan en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C, cambiando el medio cada dos días. Subcultive células según sea necesario con Accutase en CnT-07 o EpiLife (con suplemento EDGS) en placas recubiertas con ColI. Después de la etapa 2 o 3 y tras la etapa de adhesión rápida, el cultivo debe consistir en ~90 % de células positivas para Krt 14 que presentan un fenotipo similar al de los queratinocitos. El fenotipo similar al de los queratinocitos del cultivo obtenido puede verificarse mediante análisis de inmunoflorescencia estándar para la expresión de Krt14 y por la capacidad de reconstituir una epidermis estratificada normal en cultivos organotípicos.

[0344] Ejemplo 3. Preparación de la capa epidérmica a partir de queratinocitos primarios

[0345] Los queratinocitos primarios se aíslan de un único prepucio neonatal y se cultivan en un medio de 0,07 mm Ca<2+>154CF (Life Technologies) suplementado con un suplemento de crecimiento para queratinocitos. Se siembra una suspensión de queratinocitos de primer subcultivo (inserto de 2,21 X 10<5>/cm<2>) en insertos de PET recubiertos con Cellstart CTS (Life Technologies) (u otro sustrato ECM), de 0,4 mm (EMD Millipore) en medio CnT-07 (CELLnTEC) o medio CnT-Prime (CELLnTEC) según el protocolo del fabricante.

[0346] Día 3 (D3) después de la siembra, los medios se cambian a CnT-02-3D (CELLnTEC) o a CnT-3D Barrier (CELLnTEC). El día 4, los HEE se exponen al aire alimentando la parte inferior del inserto con CnT-02-3D o CnT-3D Barrier. A partir del día 4, los HEE se alimentan diariamente con CnT-02-3D o CnT-3D Barrier hasta la cosecha. Los HEE se cultivan en una incubadora húmeda (con una humedad relativa del 100 %) o seca (con una humedad relativa del 50 %) a 37 °C y un 5 % de CO2. Se utiliza un hidrómetro de dial (Fisher Scientific) para medir la humedad de la incubadora. La humedad baja de la incubadora se mantiene retirando la bandeja de agua.

[0347] Para controlar posibles cambios en la osmolaridad, los medios se actualizan diariamente. Con este protocolo no se detectan cambios significativos en la osmolaridad, tal como se mide con un microosmómetro (Precision Systems). Los insertos de doce pocillos se utilizan para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), microscopía óptica y microscopía electrónica, mientras que los insertos de seis pocillos se utilizan para mediciones de pérdida de agua transepidérmica (TEWL) e inmunotransferencia.

[0348] Ejemplo 4. Cultivo de una capa epidérmica

[0349] Los queratinocitos se siembran a una densidad de 2,0-2,5 x 10<5>células/cm<2>de membrana de tereftalato de polietileno (PET) con insertos de poro de 0,4 µm (EMD Millipore; Cat. No.: MCHT12H48) en medio CnT-07 (CELLnTEC) o medio CnT-Prime (CELLnTEC).

[0350] Día 3 (D3) después de la siembra, los medios se cambian a CnT-02-3D (CELLnTEC) o a CnT-3D Barrier (CELLnTEC). El día 4, las células se exponen al aire alimentando la parte inferior del inserto con CnT-02-3D CnT-3D Barrier. A partir del día 4, la capa epidérmica se alimenta a diario con CnT-02-3D o CnT-3D Barrier hasta su cosecha en el día 14.

[0351] Ejemplo 5. Preparación del sustrato de soporte

[0352] Para preparar una solución de agarosa al 2 %, se disuelven 2 g de agarosa ultrapura de bajo punto de fusión (LMP) en 100 ml de agua ultrapura o solución tampón (1:1, v/v). La solución tampón puede ser opcionalmente PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1×) o HBSS (solución salina equilibrada de Hanks 1×). La solución de agarosa puede colocarse en un vaso de precipitados que contenga agua caliente (más de 80 °C) y mantenerse en la placa caliente hasta que la agarosa se disuelva completamente. La solución de agarosa permanece líquida mientras la temperatura esté por encima de 36 °C. Por debajo de 36 °C, se produce una transición de fase, la viscosidad aumenta y, finalmente, la agarosa forma un gel.

[0353] Para preparar el sustrato de soporte de agarosa, pueden depositarse 10 ml de agarosa líquida al 2 % (temperatura >40 °C) en una placa de Petri de 10 cm de diámetro y extenderse uniformemente para formar una capa uniforme. Se permite que la agarosa forme un gel a 4 °C en un frigorífico.

[0354] Ejemplo 6. Producción de un cuero sintético que comprende fibroblastos, queratinocitos y melanocitosEl esquema del protocolo puede ser el siguiente: a) poner en contacto fibroblastos y una solución de colágeno, y luego incubar durante un período de tiempo suficiente para obtener una matriz de colágeno contraída en la que se distribuyen los fibroblastos, constituyendo un equivalente de la dermis; b) sembrar el equivalente de la dermis obtenido en a) con una mezcla de queratinocitos y melanocitos, y realizar un cultivo de inmersión en un medio líquido; c) sumergir todo el cultivo (queratinocitos y melanocitos sembrados en el equivalente de la dermis) obtenido en b), y continuar el cultivo en la interfaz aire-líquido hasta obtener un equivalente de la epidermis pluriestratificada que contenga melanocitos, sobre un equivalente de la dermis que contenga fibroblastos en una matriz de colágeno, constituyendo así un equivalente cutáneo.

[0356] La etapa a) se puede llevar a cabo con colágeno tipo I, especialmente de origen bovino, o con una mezcla de colágenos I y III (aproximadamente el 30 % en relación con el volumen final de la red) en suspensión homogénea. Ventajosamente, se añaden otros componentes, tales como laminina (en particular, del 1 % a 15 % en relación con el volumen final), colágeno IV (en particular, del 0,3 % al 4,5 % en relación con el volumen final) y/o entactina (en particular, del 0,05 % al 1 % en relación con el volumen final) para obtener una suspensión homogénea. Los fibroblastos se obtienen de la piel. Se cultivan en un medio adecuado y, a continuación, se suspenden antes de mezclarse con la suspensión de colágeno y factores de crecimiento. La mezcla se incuba durante 1 a 6 días, preferentemente durante 4 o 5 días, a una temperatura de aproximadamente 37 °C, generalmente de 36 °C a 37,5 °C. Ventajosamente, la mezcla se incuba sobre un soporte que no permite la adhesión de la misma, en particular, que evita la adhesión de la mezcla a los bordes del soporte; tal soporte puede obtenerse, en particular, mediante el tratamiento previo de su superficie, por ejemplo, recubriendo dicha superficie con albúmina bovina o suero. Así se obtiene un gel de colágeno que se contrae libremente en varias direcciones, mientras descarga el medio nutritivo, y en el que se incrustan los fibroblastos.

[0358] Para llevar a cabo la etapa b), se pueden utilizar queratinocitos procedentes de la piel, preferentemente de la piel adulta. Los queratinocitos se amplifican antes de la siembra según la técnica de Rheinwald y Green (Cell, vol.6, 331-344, 1975) mediante cultivo en un soporte alimentador constituido por fibroblastos 3T3 en un medio adecuado conocido por los expertos en la materia, en presencia de factores de crecimiento, en particular aminoácidos, suero, toxina colérica, insulina, triyodotironina y solución tampón de pH. En particular, tal medio de cultivo puede contener especialmente por lo menos un factor de crecimiento mitógeno para queratocitos (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o factor de crecimiento de queratocitos (KGF), en particular KGF), insulina, hidrocortisona y, opcionalmente, un antibiótico (por ejemplo: gentamicina, anfotericina B).

[0360] Los melanocitos pueden ser melanocitos procedentes de piel animal de animal joven o adulta. Se amplifican mediante cultivo en un medio adecuado, en ausencia de éster de fórbol, compuesto por un medio base tal como DMEM/F12 o MCDB153 y suplementado con factores de crecimiento específicos de melanocitos (tales como, por ejemplo, bFGF, SCF, ET-1, ET3 o αMSH), y, en particular, en medio M2 (Promocell) u otros medios como M254 (Cascades Biologics<TM>).

[0361] Las suspensiones celulares de melanocitos y de queratinocitos se preparan a partir de estos cultivos, y se mezclan para obtener suspensiones mixtas de queratocitos/melanocitos. La relación de melanocitos/queratinocitos puede ser de 1:10 a 2:1, y generalmente es aproximadamente 1:1. Esta suspensión mixta se deposita en el equivalente de la dermis. El equivalente de la dermis se adhiere ventajosamente a un soporte a través de un material biológico tal como colágeno. La suspensión de melanocitos/queratinocitos se deposita en un anillo o cualquier medio equivalente para mantenerla en una parte de superficie delimitada. Se añade un medio nutritivo líquido de manera que cubra la mezcla de células. Este medio contiene factores de crecimiento conocidos por los expertos en la materia, en particular EGF y/o KGF. El medio se reemplazará regularmente y el cultivo continuará como una inmersión, generalmente durante un período de 2 a 10 días, en particular de 5 a 8 días, y aproximadamente 7 días. El medio contiene KGF a partir del segundo día de inmersión y, idealmente, a partir del cuarto día de inmersión.

[0363] Posteriormente, las pieles se sumergen, de una manera conocida en sí misma, para obtener la diferenciación de los queratinocitos y la formación de un equivalente de la epidermis estratificada. Esta etapa c), correspondiente al cultivo como inmersión en la interfaz aire-líquido, se prolonga hasta que se obtiene una estructura diferenciada, generalmente durante aproximadamente 7 días. Sin embargo, la etapa c) puede continuarse por un período de tiempo más largo, por ejemplo, durante aproximadamente 28 días, mientras al mismo tiempo se conserva un equivalente cutáneo que tiene las características ventajosas especificadas en el texto anterior. El medio de cultivo nutritivo se actualizará regularmente. A continuación, se retira el equivalente cutáneo para realizar los ensayos necesarios.

[0365] Ejemplo 7. Inducción de la formación de folículos en muestras de piel cultivadas

[0367] Las células DP expandidas se mezclan con células ORS cultivadas, se lavan y se resuspenden cuidadosamente en 20 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, Sigma) a densidades celulares adecuadas. Las células DP y ORS cultivadas utilizadas en cada experimento se obtienen de donantes diferentes, ya que la diferente duración del cultivo para las células DP y ORS no permite la preparación de los dos tipos de células del mismo donante. La suspensión celular se inyecta lentamente en la dermis de los trozos de piel cultivados 1 día después de establecer el cultivo.

[0368] Ejemplo 8. Cultivo de poblaciones de células del folículo piloso

[0369] Los folículos pilosos se obtienen de la región occipital. Las células de la papila dérmica (DP) se preparan y cultivan como se describe en Randall et al., A comparison of the culture and growth of dermal papilla cells from hair follicles from non-balding and balding (androgenetic alopecia) scalp. Br J Dermatol 1996: 134: 437–444.

[0370] En resumen, el DP de los folículos pilosos se aísla bajo un microscopio de disección y se transfiere de forma individual a una placa de cultivo celular de 24 pocillos (Sarstedt). El cultivo celular se realiza en DMEM, suplementado con FCS al 1 5 % (Sigma). Después del inicio de la proliferación celular, las células se cultivan hasta la confluencia y se expanden durante dos subcultivos. Para el aislamiento de las células de la vaina radicular externa (ORS), se extirpa la parte media de los folículos pilosos, que contienen la región de la protuberancia, y se someten a una tripsinización leve. Se usan por lo menos células de 10 folículos pilosos para cada cultivo. Las células obtenidas se lavan dos veces en medio RPMI-1640 (Sigma) y se someten a cultivo celular en medio de queratinocitos estándar (Epilife, Sigma). Las células se recogen después de 1 semana de cultivo.

[0371] Ejemplo 9. Equivalentes cutáneos curtidos de grosor completo

[0372] Los equivalentes cutáneos de grosor completo se curten mediante el curtido al cromo. La primera etapa es el tratamiento con hielo y ácido sulfúrico. Esto abre el tejido para que pueda recibir el cromo. A continuación, se añade el cromo junto con óxido de magnesio.

[0373] El proceso reduce el nivel de pH de los equivalentes cutáneos de grosor completo a alrededor de 3. Una vez que el cromo ha penetrado en los equivalentes cutáneos de grosor completo, se introduce el licor curtiente, lo que eleva el nivel de pH a alrededor de 4. A continuación, se realiza un baño de agua caliente y, a continuación, se prensa con rodillos para eliminar el exceso de líquido. La etapa final consiste en aplicar un tratamiento superficial si es necesario y, a continuación, secar los equivalentes cutáneos de grosor completo mientras están estirados, y volver a prensarlos cuando esté hecho.

[0374] Ejemplo 10. Protocolo de curtido con X-tan

[0375] Los equivalentes cutáneos de grosor completo se pueden curtir utilizando un procedimiento de curtido con X-tan. Antes del curtido, se calcificó un equivalente cutáneo de grosor completo, que comprende las etapas de remojar el equivalente cutáneo, añadir un sustrato, ajustar el pH y lavar. Después, el equivalente cutáneo se descalcificó lavando el equivalente cutáneo, añadiendo un tampón de descalcificación previa, descalcificando el equivalente cutáneo y lavando. A continuación, el equivalente cutáneo se curtió mediante rehumectación, adición de un sustrato de curtido, ajuste del pH a un nivel adecuado para el curtido, realización de ciclos de fijación y engrasado para obtener el equivalente cutáneo curtido.

[0376] Ejemplo 11. Equivalentes cutáneos de grosor total

[0377] Se puede depositar una matriz de colágeno tipo I (que contiene 0,5 x 10<6>fibroblastos derivados de iPSC) en membranas de tereftalato de polietileno (BD Biosciences) y se puede dejar polimerizar. Después de incubar la matriz polimerizada durante alrededor de 7 días, se pueden sembrar 1 x10<6>queratinocitos derivados de iPSC y 0,1 x 10<6>melanocitos derivados de iPSC en la matriz, y se pueden incubar durante otros 7 días. El cultivo compuesto puede elevarse hasta la interfaz aire-líquido y alimentarse desde abajo para inducir la diferenciación epidérmica. Los equivalentes cutáneos de grosor completo se pueden cosechar alrededor de 14 días más tarde y se pueden congelar en LN2 o incrustar en cera. Para cuantificar la melanina

[0378] Ejemplo 12. Inmunotinción de la sección congelada

[0379] Fijación:Los tejidos pueden fijarse en solución salina tamponada con paraformaldehído/fosfato (PBS) al 3,8 %, pH 7,2-7,6, durante 30 minutos. Las muestras se pueden lavar tres veces durante 5 minutos en PBS. Las muestras de tejido se pueden infiltrar con una serie de gradientes estériles de sacarosa (10 % de sacarosa durante la noche, 15 % de sacarosa durante 6-8 h, 30 % de sacarosa durante la noche y, finalmente, 30 % de sacarosa mezclada 1:1 con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) durante la noche) rotando a 4 °C. Las muestras se pueden incrustar en OCT y congelar en vapor de nitrógeno líquido. Los bloques criogénicos se pueden almacenar a -80 °C.

[0380] Corte de secciones:El día anterior al corte, los bloques criogénicos se pueden transferir a -20 °C durante la noche. Las secciones (10 μm) se pueden preparar utilizando un criostato estándar. Las secciones se pueden mantener a -20 °C hasta el procesamiento.

[0381] Procesamiento:Se pueden incluir incubaciones de control. Se pueden utilizar sueros preinmunes o anticuerpos no inmunes coincidentes con el isotipo en lugar de los anticuerpos primarios. Las secciones pueden sumergirse en acetona fría al 90 % durante 10 minutos o en triton X-100/PBS al 0,2 % durante 5 minutos para exponer los antígenos. Las muestras se pueden lavar tres veces durante 5 minutos en PBS. La reactividad de anticuerpos inespecíficos se bloqueó sumergiendo las secciones en una solución de BSA al 5 % con Triton X-100 al 0,1 % durante 1 h. A continuación, las secciones se pueden incubar durante la noche a 4 °C con una mezcla de los dos anticuerpos: i) 2,5 μg/ml de IgG total de burro ChromPure (con fines de bloqueo; todos los anticuerpos secundarios pueden producirse en burro); ii) 1 μg/ml del anticuerpo primario adecuado. Las secciones se pueden enjuagar tres veces durante 5 minutos en PBS. Las secciones pueden incubarse durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario adecuado específico de la especie, producido en burro, y conjugado con un fluoróforo rojo o verde. Las secciones se pueden lavar tres veces durante 5 minutos en PBS. Después, las secciones se pueden incubar durante 10 minutos con 10 μg/ml de Hoechst 33342 a temperatura ambiente. Las secciones se pueden lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS.

[0382] Visualización:Las muestras pueden montarse con el medio Vectashield (Vector) y las muestras pueden visualizarse con un microscopio de epifluorescencia (Zeiss), equipado con los filtros adecuados.

[0383] Ejemplo 13. Inmunotinción de secciones incrustadas en parafina

[0384] Fijación:Los tejidos pueden fijarse en solución salina tamponada con paraformaldehído/fosfato (PBS) al 3,8 %, pH 7,2-7,6, durante 30 minutos. Las muestras se pueden lavar tres veces durante 5 minutos en PBS. Las muestras de tejido se pueden deshidratar en series ascendentes de etanol (50 %, 70 %, 2 x 100 %; 20 min cada una) y agente de aclarado (xileno, 2 x 20 min). Las muestras se pueden perfundir con cera de parafina a 65 °C durante 2 h, repitiendo el proceso dos veces, y se pueden incrustar en bloques de parafina. Los bloques de parafina se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su uso posterior.

[0385] Corte de secciones:El tejido se seccionó a un grosor de 5 μm con el uso de un micrótomo estándar. Las secciones pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento.

[0386] Procesamiento:Se pueden incluir incubaciones de control. Se pueden utilizar sueros preinmunes o anticuerpos no inmunes coincidentes con el isotipo en lugar de los anticuerpos primarios. Las secciones se pueden rehidratar en series ascendentes de xileno/etanol: 2x xileno, 2x etanol al 100 % y 1x al 70 % y 50 %; 10 minutos cada una. A continuación, las secciones se pueden enjuagar brevemente con agua corriente. A continuación, las secciones se pueden teñir con hematoxilina durante 5 minutos. A continuación, las secciones se pueden lavar con dH2O hasta que la solución sea transparente. Las secciones se pueden teñir con eosina al 0,5 % durante 10 minutos. A continuación, las secciones se pueden enjuagar brevemente con agua corriente. La reactividad de los anticuerpos inespecíficos se bloqueó sumergiendo las secciones en BSA al 5 % durante 1 h. A continuación, las secciones se pueden incubar durante la noche a 4 °C con una mezcla de los dos anticuerpos: i) 2,5 μg/ml de IgG total de burro ChromPure (con fines de bloqueo; todos los anticuerpos secundarios se producen en burro); ii) 1 μg/ml de anticuerpo primario adecuado. Las secciones se pueden enjuagar tres veces durante 5 minutos en PBS. Las secciones pueden incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario adecuado específico de la especie, producido en burro y conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las secciones se pueden lavar tres veces durante 5 minutos en PBS.

[0387] Visualización:Las muestras se pueden incubar con el kit de sustrato de 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) (VectorLaboratories) según el protocolo del fabricante. La DAB produce una mancha marrón. Si se añade cloruro de níquel a la solución del sustrato, puede producirse una mancha gris-negra. Las muestras se pueden deshidratar en series ascendentes de etanol (50 %, 70 %, 2 x 100 %; 10 min cada una) y agente de aclarado (xileno, 2 x 10 min). Las muestras pueden montarse en un medio de montaje y visualizarse con un microscopio de contraste de fases (Zeiss) equipado con cámara digital.

[0388] Ejemplo 14. Microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FESEM)

[0389] Fijación:Las muestras pueden fijarse durante 24 h a 4 °C con paraformaldehído al 4 % y glutaraldehído al 2 % en tampón de cacodilato sódico 0,1 M (pH 7,4) y colocarse en un tampón de cacodilato sódico 0,1 M y mantenerse a 4 °C antes de continuar el procesamiento.

[0390] Procesamiento:Las muestras pueden fijarse posteriormente durante 1 h con OsO4 acuoso al 1 %. Después de la deshidratación en una serie ascendente de etanol (50 %, 70 %, 2 x 100 %; 10 min cada una), las muestras se pueden secar en el punto crítico con CO2 líquido en un aparato Tousimis Autosamdri-815B, montar con cinta de cobre de doble cara en soportes de aluminio de 15 mm y revestir por pulverización catódica con 40 Å de paladio dorado utilizando un recubrimiento por pulverización catódica Denton DeskII.

[0391] Visualización:Las secciones transversales de muestras duplicadas se pueden montar en soportes SEM de perfil bajo de 45/90 grados para el análisis de la morfología interna. La visualización se puede realizar con un FESEM Zeiss Sigma (microscopio de Carl Zeiss, Thornwood, NY) operado a 2-3 kV, utilizando la detección de electrones secundarios (SE) de inLens, así como la detección de señal mixta de InLens/SE2 (75/25 %) a una distancia de trabajo de 3-5 mm. Las imágenes se pueden capturar en TIFF utilizando una resolución de almacenamiento de 2048x1536 y un algoritmo de reducción de ruido con promediado de líneas.

[0392] Procesamiento:Las muestras previamente secas (es decir, cuero) se pueden cortar a medida y revestir por pulverización catódica con 40 Å de paladio dorado utilizando un recubrimiento por pulverización catódica Denton DeskII.

[0393] Visualización:Las secciones transversales de muestras duplicadas se pueden montar en soportes SEM de perfil bajo de 45/90 grados para el análisis de la morfología interna. La visualización se realizó con un FESEM Zeiss Sigma (microscopio de Carl Zeiss, Thornwood, NY) operado a 2-3 kV, utilizando la detección de electrones secundarios (SE) de inLens, así como la detección de señal mixta de InLens/SE2 (75/25 %) a una distancia de trabajo de 3-5 mm. Las imágenes se pueden capturar en TIFF utilizando una resolución de almacenamiento de 2048x1536 y un algoritmo de reducción de ruido con promediado de líneas.

[0394] Ejemplo 15. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

[0395] Fijación:Las muestras pueden fijarse durante 30 minutos a 4 °C en glutaraldehído al 2 % y paraformaldehído al 2 % con cloruro cálcico al 0,06 % en tampón de cacodilato sódico 0,1 M, pH 7,4. A continuación, las muestras pueden colocarse en tampón de cacodilato sódico 0,1 M y mantenerse a 4 °C antes de su procesamiento posterior.

[0396] Procesamiento:A continuación, las muestras se pueden lavar y colocar en tetróxido de rutenio al 0,2 % (para la visualización de las bicapas lipídicas) o en tetróxido de osmio al 1,5 % con ferrocianuro de potasio al 1,5 %, en cacodilato sódico 0,1 M, pH 7,4, a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 45 minutos. Después de enjuagar en tampón, las muestras se pueden deshidratar en una serie de etanol graduado (50 %, 70 %, 2 x 100 %; 10 min cada una) y, posteriormente, se pueden incrustar en una resina epoxi de baja viscosidad.

[0397] Visualización:Las secciones semifinas se pueden teñir con azul de toluidina al 1 % y azul azure II al 1 % en soluciones de borax al 1 % y se pueden visualizar con un microscopio de contraste de fases (Zeiss). Las secciones ultrafinas pueden recogerse y teñirse con acetato de uranilo al 3 % saturado con agua y/o contrastarse con citrato de plomo al 2,5 % en rejillas de níquel sin recubrimiento. Las secciones ultrafinas se pueden visualizar con un microscopio electrónico Zeiss de 10 A operado a 60 kV. Las imágenes se pueden capturar en TIFF.

[0398] Citoquímica de captura de iones (gradiente de Ca++):

[0399] Fijación:Para la localización ultraestructural deCa ++, las muestras pueden fijarse en paraformaldehído al 2 %, glutaraldehído al 2 %, oxalato potásico 0,09 M, que contiene sacarosa 0,04 M. Las muestras se pueden fijar posteriormente durante la noche a 4 °C.

[0400] Procesamiento:Las muestras pueden fijarse posteriormente en tetróxido de osmio al 1 % que contiene piroantimonato de potasio al 2 %, pH 7,4 durante 2 h a 4 °C en la oscuridad. A continuación, las muestras de tejido pueden lavarse en agua alcalinizada (pH 10) y transferirse a soluciones de etanol (50 %, 70 %, 2 x 100 %; 10 min cada una) para su deshidratación e incrustación en una resina epoxi de baja viscosidad.

[0401] Visualización:Las secciones ultrafinas pueden recogerse y teñirse con acetato de uranilo al 3 % saturado con agua y/o contrastarse con citrato de plomo al 2,5 % en rejillas de níquel sin recubrimiento. Las secciones ultrafinas se pueden visualizar con un microscopio electrónico Zeiss de 10 A operado a 60 kV. Las imágenes se pueden capturar en TIFF.

[0402] Perfusión de lantano:

[0403] Fijación:La vía de perfusión se evaluó en todos los sujetos mediante la inmersión de muestras en nitrato de lantano al 4 % en un tampón Tris 0,05 M que contenía el 2 % de glutaraldehído y el 1 % de paraformaldehído, con un pH de 7,4, durante 1 h a temperatura ambiente.

[0404] Procesamiento:Las muestras se pueden lavar y colocar en tetróxido de osmio al 1,5 % con ferrocianuro de potasio al 1,5 %, en cacodilato sódico 0,1 M, pH 7,4, a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 minutos. Después de enjuagar en tampón de cacodilato, las muestras se pueden deshidratar en una serie de etanol graduado (50 %, 70 %, 2 x 100 %; 10 minutos cada una) y, posteriormente, se pueden incrustar en una resina epoxi de baja viscosidad.

[0405] Visualización:Las secciones ultrafinas pueden recogerse y teñirse con acetato de uranilo al 3 % saturado con agua y/o contrastarse con citrato de plomo al 2,5 % en rejillas de níquel sin recubrimiento. Las secciones ultrafinas se pueden visualizar con un microscopio electrónico Zeiss de 10 A operado a 60 kV. Las imágenes se pueden capturar en TIFF.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar un cuero sintético que comprende:

a. formar una capa dérmica artificial que comprende un fibroblasto en un andamiaje que comprende celulosa o celulosa modificada;

b. eliminar una o más capas celulares de dicha capa dérmica artificial; y

c. curtir por lo menos una porción de dicha capa dérmica artificial tras la eliminación de dicha

una o más capas celulares, formando así dicho cuero sintético.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha capa dérmica artificial comprende además colágeno, en el que dicho colágeno es producido por lo menos en parte por una célula productora de colágeno, se añade por separado, o cualquier combinación de los mismos.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el cuero sintético comprende, además, uno o más de los siguientes: queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, sulfato de dermatano proteoglicano, glucosaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácidos graso, carbohidrato, o una combinación de los mismos.

4. El método según la reivindicación 1, en el que un grosor de dicha capa dérmica artificial varía de alrededor de 0,02 mm a alrededor de 5 mm.

5. El método según la reivindicación 1, en el que el curtido comprende: tratar la porción de la capa dérmica artificial con ácido sulfúrico, cromo o un licor de curtido.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la celulosa o una versión modificada de la misma comprende rayón.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el cuero sintético se fabrica con una capa dérmica artificial.

in vivo in vitro (biopsia cutánea ) (equivalente epidérmico)

Corneodesmosomas

in vivo in vitro (biopsia cutánea ) (equivalente epidérmico)

Perfusión de

lantano

in vivo<in vitro>

(biopsia cutánea ) (equivalente epidérmico)

in vivo<in vitro>(biopsia cutánea ) (equivalente epidérmico)

KRT1/

Hoechst

DCL1/

Hoechst

desmosomas

in vivo in vitro (biopsia cutánea) (equivalente epidérmico)

KRT14/

Hoechst

hemidesmosomas

in vivo in vitro (biopsia cután (equivalente epidérmico) integrina β1

fibronectina

colágeno IV

colágeno VI

colágeno VII

laminina 5