ES3054696T3

ES3054696T3 - Method

Info

Publication number: ES3054696T3
Application number: ES15756845T
Authority: ES
Inventors: Christian Kjellman; Sofia Jarnum; Lena Winstedt
Original assignee: Hansa Biopharma AB
Current assignee: Hansa Biopharma AB
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2026-02-05
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: EP4663755A3; EP4663755A2; PL3171891T3; IL249981B; WO2016012285A2; US20170209550A1; JP6708641B2; MY196858A; NZ728265A; PT3171891T; US20260000739A1; AU2015294125B2; EP3171891B1; LT3171891T; CL2017000191A1; GB201413240D0; IL249981A0; FI3171891T3; JP2017522384A; CA2955704A1

Abstract

La invención se refiere a un método para mejorar el beneficio de una terapia o un agente terapéutico en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor Fc de las moléculas de IgG séricas; y posteriormente administrar dicha terapia o dicho agente terapéutico. La invención también se refiere a un método para reducir el efecto de los autoanticuerpos patógenos en un sujeto, que comprende (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor Fc de las moléculas de IgG séricas y, opcionalmente, (b) someter posteriormente al sujeto a un tratamiento que elimina los autoanticuerpos endógenos. La invención también se refiere a un kit para llevar a cabo un método de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método

[0003] Campo de la invención

[0004] La divulgación se refiere a un método para mejorar el beneficio de una terapia o un agente terapéutico para un sujeto. El método comprende (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto; y (b) posteriormente administrar dicha terapia o dicho agente terapéutico al sujeto. La divulgación también se refiere a un método para reducir el efecto de los autoanticuerpos patógenos en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto y opcionalmente (b) someter posteriormente al sujeto a un tratamiento que elimine los autoanticuerpos endógenos. La divulgación también se refiere a un kit para llevar a cabo un método de la divulgación.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Los anticuerpos son componentes del sistema inmunitario, que reclutan otros elementos del sistema inmunitario hacia dianas particulares dentro de cuerpo. Los anticuerpos son específicos de los antígenos diana gracias a la especificidad de los dominios Fab. Los anticuerpos reclutan a otros elementos del sistema inmunitario mediante la interacción del dominio cristalizable (Fc) del fragmento del anticuerpo con los receptores de Fc (FcR) expresados en la superficie de las células inmunitarias. Los anticuerpos predominantes en el suero de los mamíferos suelen ser de la clase inmunoglobulina G (IgG): IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Estos anticuerpos se unen a los FcR humanos: FcγRI, RγIIa, RγIIb, RyIIIa y FcγRn, y el receptor de Fc del complemento C1q. La eficacia del reclutamiento del sistema inmunitario celular por las moléculas de IgG se ve influida por la afinidad de Fc al FcR(s). La interacción entre el dominio Fc de un anticuerpo y un FcR es importante tanto para la acción de los anticuerpos que se administran como agentes terapéuticos como para la de los anticuerpos que desempeñan un papel patogénico en diversas afecciones autoinmunitarias, incluido el rechazo de trasplantes mediado por anticuerpos.

[0007] El documento WO 2006/131347 divulga usos de IdeS.

[0008] El documento WO 2013/110946 divulga composiciones que comprenden un agente que reduce la unión al receptor de Fc de anticuerpos séricos endógenos.

[0009] El documento WO 2008/071418 divulga usos de EndoS.

[0010] Baruahet al.J Mol Biol.29 de junio de 2012;420(1-2):1-7 divulga el uso de EndoS para reducir la unión a FcγR de IgG sérica,

[0011] Johanssonet al.PLoS ONE 20083(2): e1692. proporciona información sobre la actividad de escisión de IgG de IdeSin vitroein vivo.

[0012] Sumario de la invención

[0013] La invención se define mediante las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o realización que se exponga en el presente documento, que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones, se proporciona únicamente a título informativo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

[0014] En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso en un método para mejorar el beneficio de una terapia para un sujeto humano, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto la proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG; y (b) administrar posteriormente dicha terapia al sujeto; en donde:

[0015] - dicha terapia es un trasplante de órgano;

[0016] - la cantidad de dicha proteína administrada está entre 0,01 y 1 mg/kg de PC y es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y - las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo que es suficiente para que se elimine la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto y que es como máximo de 6 horas;

[0017] en donde además la proteína que tiene actividad cisteína de IgG es IdeS que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma que comprende o consiste en cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y tiene actividad cisteína proteasa de IgG. Los inventores han demostrado sorprendentemente que es posible utilizar un agente para eliminar de forma completa, rápida, temporal y segura la unión al receptor de Fc por parte de todas o prácticamente todas las moléculas de IgG en el suero de un paciente. Esto crea un periodo de duración definido en el que, si se administra un anticuerpo terapéutico, tendrá una mayor eficacia porque no necesita competir por la unión a los receptores de Fc con la IgG endógena. Por tanto, en una realización, el método puede utilizarse para tratar una enfermedad tratada con un anticuerpo terapéutico. El periodo de duración definida también puede utilizarse para administrar una terapia, tal como un trasplante de órgano, que de otro modo sería ineficaz debido a la acción de los anticuerpos IgG antidonante presentes en el suero del paciente. Por tanto, en una realización, el método puede utilizarse para desensibilizar a un paciente antes de un trasplante de órgano.

[0018] Por tanto, la presente divulgación proporciona un método para mejorar el beneficio a un sujeto de una terapia o un agente terapéutico, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto; y (b) posteriormente administrar dicha terapia o dicho agente terapéutico al sujeto; en donde:

[0019] - la cantidad de dicho agente administrado es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de parte de todas o prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y

[0020] - las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo que es suficiente para que se elimine la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto.

[0021] Dicho intervalo normalmente puede ser de al menos 30 minutos y como máximo 21 días.

[0022] La divulgación también puede utilizarse para eliminar o reducir el efecto de los anticuerpos en un sujeto. Esto puede ser particularmente útil en un paciente que padezca una enfermedad autoinmunitaria mediada total o parcialmente por autoanticuerpos patógenos, tal como el síndrome de Guillain-Barré o el síndrome de Goodpasture. Por tanto, la divulgación también se refiere a un método para eliminar o reducir el efecto de los anticuerpos en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto y opcionalmente (b) someter posteriormente al sujeto a un tratamiento que elimine los autoanticuerpos endógenos; en donde

[0023] - las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo de al menos 2 semanas; y

[0024] - dicho tratamiento que elimina los autoanticuerpos endógenos es la plasmaféresis o la inmunoadsoprción, o es la administración de un agente (tal como un anticuerpo anti-FcRn) que impide el reciclaje de anticuerpos en el suero por el receptor de FcRn, reduciendo de este modo la semivida del anticuerpo.

[0025] La divulgación también proporciona un método para evaluar la cantidad de IgG inalterada en una muestra tomada de un individuo, comprendiendo el método:

[0026] (i) incubar la muestra con un primer agente que se une específicamente a la parte F(ab')<2>de la IgG;

[0027] (ii) incubar la muestra con un segundo agente que se une específicamente a la parte Fc de la IgG;

[0028] (iii) determinar la concentración de IgG inalterada en la muestra mediante la determinación de la presencia de ambos agentes

[0029] La divulgación también proporciona un kit para llevar a cabo un método de la divulgación.

[0030] Breve descripción de las figuras

[0031] Figura 1. Representación esquemática de la escisión de IgG mediante IdeS.La IgG humana inalterada, independientemente del isotipo, se escinde mediante IdeS en dos etapas. La primera etapa genera una IgG con una sola escisión (scIgG) con una cadena pesada inalterada. La segunda etapa genera los productos totalmente escindidos que consisten en un fragmento F(ab')<2>y un fragmento Fc homodimérico unidos por interacciones no covalentes.

[0032] Figura 2. La proteinuria se controló como evaluación de seguridad a lo largo del estudio en seres humanos del ejemplo 1.Se utilizaron Multistix (Siemens) de forma rutinaria en el hospital y se detectó proteinuria transitoria en varios sujetos que se correlacionó con la escisión de IgG. A) Sujetos a los que se administró placebo (n = 9), B) Sujetos a los que se administró una dosis única de 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS (n = 4).

[0033] Figura 3. Farmacocinética de IdeS en suero.Las concentraciones de IdeS en suero se detectaron mediante un método LC-MS/MS basado en cuatro péptidos procedentes de IdeS. A) Comparación de la concentración en suero de IdeS un minuto antes del final de la infusión frente a los niveles de dosis de IdeS (0,01, 0,04, 0,12 y 0,24 mg/kg de peso corporal) (escala logarítmica: los círculos representan las concentraciones individuales). Analito: péptido LFEYFK (n = 20). B) Comparación de la concentración en suero de los valores medios de cuatro péptidos (AFPYLSTK, AIYVTDSDSNASIGMK, GGIFDAVFTR y LFEYFK) frente a perfiles temporales hasta 24 horas después de la infusión de 0,12 o 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS (n = 8).

[0034] Figura 4. El análisis farmacodinámico cualitativo mediante SDS-PAGE mostró una degradación rápida de IgG.Análisis SDS-PAGE del suero de sujetos a los que se administró A) 0,12 mg/kg de peso corporal IdeS y B) 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS mostrando patrones de bandas de proteínas en la predosificación, 14 min, 20 min, 1, 2, 6 y 24 horas después de la dosis. C) Recuperación de IgG en el suero de un sujeto del grupo de 0,24 mg/kg de peso corporal antes de la dosis, 2 horas, 24 horas, 7 días, 14, 21, 28 y 35 días después de la dosis. Las flechas de la derecha en cada figura muestran las diferentes bandas en el marcador IgG que contienen una mezcla de IgG humana, scIgG, F(ab')<2>y Fc. Las líneas a la izquierda de cada figura muestran la masa molecular del patrón kD. Los geles muestran un sujeto representativo en los grupos de dosis de IdeS de 0,12 y 0,24 mg/kg de peso corporal.

[0035] Figura 5. El análisis farmacodinámico cuantitativo mediante ELISA mostró una degradación rápida de IgG.

[0036] Los niveles de IgG en suero de sujetos individuales a los que se les administró con 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS se determinaron mediante un método ELISA validado (que detecta tanto IgG inalterada como scIgG). Para poder seguir tanto la degradación temprana y rápida como la recuperación de IgG, el eje de abscisas se ha dividido en dos. En la primera parte se muestra el tiempo en horas (0 a 24 horas) y en la segunda el tiempo en días (7 a 64 días).

[0037] Figura 6. Valoración in vitro de IdeS en suero humano.Se utilizaron muestras de suero humano de sujetos sanos como sustratos para IdeS y se valoraron mediante ELISA (n = 20; barras de error, media ± EEM). El grupo de dosis más elevada, 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS, corresponde aproximadamente a 6 mg/l de IdeSin vitro,0,12 mg/kg de peso corporal a 3 mg/l, 0,04 mg/kg de peso corporal a 1 mg/l y 0,01 mg/kg de peso corporal a 0,2 mg/l de IdeSin vitro.Los resultados se expresan en porcentaje de IgG restante en el eje de ordenadas en comparación con el valor inicial de cada sujeto. La dosis de IdeS en mg/l está en el eje de abscisas.

[0038] Figura 7. Farmacodinámica específica de antígeno.Se analizaron muestras de suero humano del grupo de 0,24 mg/kg de peso corporal (n = 4) para detectar la presencia de IgG frente a una mezcla de antígenos (difteria, tosferina, tétanos, poliomielitis yHaemophilus influenzaede tipo b). Los resultados se expresan en porcentaje de IgG restante en el eje de ordenadas en comparación con el valor inicial de cada sujeto. Para poder seguir tanto la degradación temprana y rápida como la recuperación de IgG, el eje de abscisas se ha dividido en dos. En la primera parte se muestra el tiempo en horas (0 a 24 horas) y en la segunda el tiempo en días (7 a 64 días).

[0039] Figura 8. El suero de los sujetos a los que se administró IdeS mostró una capacidad de fagocitosis alterada.

[0040] La capacidad opsonizante de IgG en suero humano se midió como porcentaje de células efectoras con al menos una perla fluorescente engullida. A) Antes y 24 horas después de la dosificación de 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS frente a sujetos tratados con placebo. El nivel de fagocitosis previo a la dosis para cada individuo se fijó en el 100 % y el antecedente es la captación espontánea de perlas en ausencia de suero, n = 4 en el grupo de IdeS y n = 2 en el grupo de placebo. B) Se muestra la cinética del potencial fagocítico en suero de un sujeto representativo del grupo de 0,24 mg/kg de peso corporal en diferentes momentos (previo a la dosis, 2, 6, 24, 48 horas, 4, 7 y 14 días). La captación espontánea de perlas en ausencia de IgG se muestra como un recuadro abierto. El valor depse calculó utilizando Mann-Whitney, *** =p<0,01.

[0041] Figura 9. Se realizó un seguimiento de los anticuerpos anti-IdeS antes y durante el estudio.Las muestras de suero humano se analizaron mediante un ensayo CAP-FEIA (ImmunoCAP) específico de IdeS (Thermo Fisher Scientific) en un instrumento Phadia<®>250. El valor de corte (LIC) para IgG fue de 2 mg/l. A) Las muestras de 130 donantes humanos (referencia) se compararon con los 78 sujetos humanos sanos de sexo masculino examinados en este estudio (cribado). Las líneas resaltadas muestran la mediana del grupo de referencia (6,1 mg/l) y del grupo de cribado (10,6 mg/l). B) Cinética de los niveles de IgG anti-IdeS mostrados como media para los grupos de 0,12 y 0,24 mg/kg (n = 8); barras de error, media ± EEM). No se observa ningún aumento de IgG anti-IdeS en cualquiera de los sujetos antes del día 14. C) Niveles de IgG anti-IdeS mostrados para los distintos grupos en el día 14, y D) en el día 182. Las líneas muestran el nivel medio de cada grupo. Los valores depse calcularon mediante Kruskal-Wallis, ANOVA unidireccional y comparación múltiple de Dunn: * =p<0,05 y ** =p<0,02.

[0042] Figura 10. Eficacia de IdeS en suero de veinte donantes analizados (voluntarios sanos y pacientes con IRC en estadio 5).La IgG restante después del tratamiento de suero humano con diferentes concentraciones de IdeS se determinó mediante ELISA. En la figura se muestran las curvas sigmoideas de respuesta a las dosis de los sueros humanos individuales donde se representa la IgG restante en mg/ml frente a la dosis de IdeS (g/l). Los valores calculados de MABEL (0,0031 g/l) y MED (0,025 g/l) se indican en los gráficos (línea azul oscuro). Los sueros de pacientes seleccionados P02, P04, P07, P08 y P09 están resaltados en colores diferentes.

[0043] Figura 11. Eficacia de IdeS sobre IgG anti-HLA en suero del paciente n.º P02 sensibilizado.El gráfico muestra la IMF (sin procesar) frente a antígenos individuales para (gráfico superior) MHC de clase I (A, B y C) y (gráfico inferior) MHC de clase II (DP, DQ y DR) tras el tratamiento simulado (azul) y con IdeS (rojo). IMF: Intensidad media de fluorescencia.

[0044] Figuras 12, 13, 14 y 15. Equivalente a la figura 11 para los pacientes P04, P07, P08 y P09 sensibilizados, respectivamente.

[0045] Figura 16. Esplenocitos de Balb/c (ventana de adquisición P1) teñidos con suero(10 µl no tratados con DTT) de los sujetos 503 y 504 recogidos antes de la dosificación (negro), 24 h después de la dosificación (rojo), 48 h después de la dosificación (verde) y 96 h (azul) después de la dosificación con IdeS o placebo. La unión se detectó con un reactivo secundario contra Fcγ humano. Para el gráfico de IdeS, el gráfico de antes de la dosificación está a la derecha de los tres gráficos de después de la dosificación. Por tanto, existe una reducción de la capacidad del suero de unirse a los esplenocitos de ratón a las 24 h que se mantiene a las 96 h.

[0046] Figura 17. Prueba cruzada xenogénica entre suero de sujeto sano (504) al que se le administró 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS y células del bazo de ratón Balb/c.Las muestras de suero se recogieron antes de la dosis y en los puntos temporales indicados después de la dosis. Los sueros se trataron con DTT para inactivar la IgM. Fotografías superpuestas de pocillos Terasaki que muestran células vivas (verde/brillante) y células muertas (rojo/oscuro). Las células del bazo tratadas únicamente con PBS (sin suero) se utilizaron como control de la muerte celular espontánea.

[0047] En lafigura 18se muestra una representación esquemática de la escisión del glucano unido a N en Asn-297 (numeración de Kabat) de IgG por EndoS.

[0048] En lafigura 19se muestra una comparación de dos métodos para medir los niveles de IgG (turbidimetría y PD-ELISA) en suero de un sujeto (n.º 101) tratado con IdeS. El suero se recogió en diferentes momentos después de la administración de IdeS y se midió utilizando la prueba turbidimétrica convencional de p-IgG en el hospital y utilizando el ensayo PD-ELISA desarrollado por los inventores para discriminar entre IgG inalterada y fragmentos F(ab')<2>generados tras la escisión de IgG por IdeS. LSN = límite superior de la normalidad y LIN = límite inferior de la normalidad para IgG en sujetos humanos sanos.

[0049] En lafigura 20se muestra que IdeS escinde RLB de tipo IgG pero no de tipo IgM en linfocitos B. A, Análisis por citometría de flujo de la señal anti-Fab en células que expresan RLB de tipo IgG (Nu-DUL-1) e IgM (Daudi) después del tratamiento con las cantidades indicadas de IdeS. En el eje de ordenadas se muestra la intensidad media de fluorescencia en FL4. B, Análisis por citometría de flujo de anti-Fab y anti-Fc en la superficie de las células Nu-DUL-1 después del tratamiento con diferentes cantidades de IdeS.

[0050] En lafigura 21se muestra que IdeS escinde RLB de tipo IgG con una eficacia similar a la IgG soluble. A, La sangre periférica heparinizada se trató con PBS o con cantidades diferentes de IdeS. Después del periodo de incubación, se aisló el plasma y se separó en un gel SDS-PAGE. La IgG inalterada, los fragmentos scIgG y F(ab')<2>se indican a la derecha. B, Las PBMC purificadas a partir de la misma sangre tratada con PBS o IdeS se tiñeron doblemente para CD19<+>y anti-Fc o anti-Fab.

[0051] En lafigura 22se muestra que IdeS escinde la IgG de superficie en los linfocitos B de memoria. A, La selección negativa de linfocitos B utilizando RosetteSep dio como resultado >90 % de células CD19<+>. B, La parte F(ab')<2>de la IgG de superficie de las células CD19<+>/CD27<+>es escindida eficazmente por IdeS. La cantidad de epítopos Fc anclados a la membrana celular no cambia después del tratamiento con IdeS.

[0052] En lafigura 23se muestra la recuperación de las células después del tratamiento con IdeS. A, Análisis de citometría de flujo de anti-Fab en la superficie de las células Nu-DUL-1 después del tratamiento con cantidades diferentes de IdeS. Se retiró IdeS y se cultivaron y analizaron las células después de 1 hora y después de 24 horas. B, Las células Nu-DUL-1 se trataron con cantidades diferentes de IdeS o sustancias de control antiproliferativas (citocalasina D y puromicina) y se cultivaron durante 24 horas antes de la administración de BrdU de 6 horas. C, Las células Nu-DUL-1 se trataron con PBS o 30 µg/ml de IdeS durante 24 horas antes de utilizar como lectura un ensayo de viabilidad intracelular basado en la actividad de la hidrogenasa (CCK-8).

[0053] En lafigura 24se muestra la recuperación de la expresión de RLB de tipo IgG en las PBMC tratadas con IdeSex vivo. A, Análisis por citometría de flujo de la señal anti-Fab en células CD19<+>inmediatamente después del tratamiento con PBS o IdeS (30 µg/ml) y después de 16 horas de cultivo sin IdeS. Las células doblemente positivas se encuentran en R2. B, Análisis por citometría de flujo de la señal anti-Fc en células CD19<+>inmediatamente después del tratamiento con PBS o IdeS (30 µg/ml) y después de 16 horas de cultivo. Las células doblemente positivas se encuentran en R2 y se expresan como porcentaje de células en la ventana de adquisición P3.

[0054] En lafigura 25se muestra la recuperación de RLB de tipo IgG en linfocitos B enriquecidos (RosetteSep, >90 % células CD19<+>). A, Análisis por citometría de flujo de la señal anti-Fab en linfocitos B enriquecidos inmediatamente después del tratamiento con PBS o IdeS (30 µg/ml) y en los puntos temporales indicados después del tratamiento. B, Análisis por citometría de flujo de la señal anti-Fc en linfocitos B enriquecidos inmediatamente después del tratamiento con PBS o IdeS (30 µg/ml) y en diferentes puntos temporales después del tratamiento.

[0055] En lafigura 26se muestra que IdeS no afecta a la viabilidad de los linfocitos B. Los linfocitos B enriquecidos con RosetteSep, que contenían >90 % de células CD19<+>, se mantuvieron en cultivo durante varios días después del tratamiento con PBS o IdeS (30 µg/ml) y se midió la viabilidad mediante el ensayo colorimétrico CCK-8.

[0056] En lafigura 27se muestra que el tratamiento con IdeS inhibe la señalización del RLB. Las células Nu-DUL-1 se trataron con PBS o IdeS (30 µg/ml) antes de la reticulación utilizando un anticuerpo específico F(ab')<2>. A, La fosforilación de ERK1/2 se siguió en diferentes puntos temporales después de la estimulación utilizando un anticuerpo fosfoespecífico en citometría de flujo. B, La fosforilación de PLC-γ2 se siguió en diferentes puntos temporales después de la estimulación utilizando un anticuerpo fosfoespecífico en citometría de flujo.

[0057] En lafigura 28se muestra que IdeS bloquea específicamente la maduración de los linfocitos B productores de IgG. Las PBMC se trataron con IdeS y se estimularon con IL2 recombinante y R848 para activar los linfocitos B de memoria y diferenciarlos en células productoras de Ig. Se evaluó el número de células productoras de IgG en las placas de filtro ELISPOT. A, se sembraron 50000 o 100000 células en una placa de filtro y se trataron con o sin IdeS y con o sin rIL2/R848 el día 0. En una configuración, se añadió IdeS en el día 3 de la estimulación con R848 e IL2. B, Número de células productoras de IgA, IgM e IgG después de la estimulación con rIL2/R848 en presencia o ausencia de 30 µg/ml de IdeS durante 96 horas. C, Número de células productoras de IgG después de la estimulación con rIL2/R848 en presencia o ausencia de 0,3 a 30 µg/ml de IdeS durante 72 horas. D, Número de células productoras de IgG después de pretratar las células durante una hora con 0,3 a 30 µg/ml de IdeS antes de eliminar IdeS y someter las células a 72 horas de estimulación con rIL2/R848.

[0058] En lafigura 29se muestra el análisis por citometría de flujo de las células CD19<+/>IgG<+>en diferentes puntos temporales después del tratamiento con IdeS en un sujeto humano sano después de una dosisi.v.única de 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS. Las PBMC purificadas se separaron mediante dispersión lateral directa (P1) y los linfocitos B (CD19<+>) se controlaron como M1 en P1. En el grupo superior se muestran células doblemente positivas para CD19 (FL2) y la parte Fc de IgG (FL4) antes de la dosis y hasta 96 horas después de la dosis. El grupo inferior muestra células doblemente positivas para CD19 (FL2) y la parte Fab de IgG (FL4) antes de la dosis y hasta 96 horas después de la dosis.

[0059] En lafigura 30se muestra que IdeS escinde RLB de tipo IgGin vivoen seres humanos. Se administró a sujetos humanos sanos una dosis de 0,24 mg/kg de peso corporal de IdeS y se recogieron PBMC en diferentes puntos temporales después de la administración de la dosis. El porcentaje de células doblemente positivas para CD19 y F(ab')<2>se analizó mediante citometría de flujo. Las horas posteriores a la dosificación se muestran en el eje de abscisas y la IMF × frecuencia celular en el eje de ordenadas.

[0060] En lafigura 31se muestra la viabilidad de los linfocitos B después de la reticulación con anticuerpos de células tratadas con IdeS (arriba) y células tratadas con PBS (abajo) durante un periodo de ensayo de 48 horas.

[0061] Descripción de las secuencias

[0062] En la SEQ ID NO: 1 se muestra la secuencia de aminoácidos de la enzima madura degradadora de inmunoglobulina G deS. pyogenes(IdeS). Esta proteína se denomina a veces MAC1. La secuencia completa de MAC1, incluida la señal de secreción, está disponible en Genbank con el n.º de registro WP_010922160.1. En la SEQ ID NO: 2 se muestra la secuencia de aminoácidos de la endoglucosidasa S madura (EndoS). La secuencia completa incluye la señal de secreción y está disponible en Genbank con el n.º de registro AAK00850.1. En la SEQ ID NO: 3 se muestra la secuencia de aminoácidos de MAC2, una variante de IdeS. La secuencia completa de MAC 2, incluida la señal de secreción, está disponible en Genbank con el n.º de registro AFC67907.1.

[0063] Descripción detallada de la invención

[0064] Debe entenderse que las diferentes aplicaciones de los métodos divulgados pueden adaptarse a las necesidades específicas de la materia. También se ha de entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.

[0065] Además, como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un pulmón" incluye "pulmones", la referencia a "un antígeno" incluye dos o más de dichos antígenos, la referencia a "un sujeto" incluye dos o más de dichos sujetos, y similares.

[0066] Los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente y normalmente se refieren a un ser humano.

[0067] Como se utiliza en el presente documento, "un agente que reduce la unión del receptor de Fc a las moléculas de IgG séricas" significa un agente que consigue este efecto por cualquier mecanismo adecuado. Se conocen varios agentes que reducen la interacción al receptor de Fc de las moléculas de IgG. Estos agentes suelen ser proteínas de origen bacteriano y pueden actuar de distintas maneras.

[0068] Por ejemplo, dicha proteína puede ser una cisteína proteasa de IgG que escinde la IgG de tal manera que los dominios de unión al antígeno y los dominios de interacción Fc se separan entre sí. En dichos casos, la interacción al receptor de Fc de las moléculas de IgG en suero se reduce porque se reduce la cantidad de moléculas de IgG inalteradas en el suero.

[0069] Como otro ejemplo, dicha proteína puede ser una endoglucosidasa de IgG que escinde una estructura de polisacárido en el dominio de interacción Fc de la IgG, en particular el polisacárido biantenario unido a N en la posición Asn-297 (numeración de Kabat). Esta estructura de polisacárido desempeña un papel fundamental en la unión al receptor de Fc. Por tanto, cuando es total o parcialmente eliminada por una proteína, esto conducirá a una unión reducida al receptor de Fc por una molécula de IgG que, por lo demás, estaría inalterada. En dichos casos, la reducción de la unión se traduce preferentemente en un aumento de la constante de unión de equilibrio para la interacción IgG:FcγR en un factor de al menos dos. Preferentemente, el agente aumenta la constante de unión de equilibrio para la interacción IgG:FcγR en un factor de al menos dos, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7 o al menos 8. Más preferentemente, el agente aumenta la constante de unión de equilibrio para la interacción IgG:FcγR en un factor de al menos ocho. Un aumento de la constante de unión de equilibrio representa una disminución de la unión entre la IgG y un FcγR (por ejemplo, entre la IgG y el FcγRIIA).

[0070] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula IgG sérica" se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina gamma (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que está presente en el tejido humano antes de que se lleve a cabo un método de la presente invención. Dichas moléculas de IgG pueden haberse producido de forma endógena a partir de los linfocitos B de un individuo o pueden ser inmunoglobulinas gamma exógenas que se han administrado a un sujeto antes de llevar a cabo el método de la invención.

[0071] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "receptor de Fc" se refiere a los receptores de Fc de inmunoglobulina gamma (FcγR) que están presentes en las células. En los seres humanos, FcγR se denominan uno, algunos o todos de la familia de receptores que comprende FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) y FcγRIIIB (CD16b). Como se utiliza en el presente documento, el término FcγR incluye polimorfismos de origen natural de FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) y FcγRIIIB (CD16b).

[0072] Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en el presente documento, bien anteriormente o a continuación, se incorporan de esta manera en el presente documento por referencia en su totalidad.

[0073] Métodos para mejorar el beneficio de una terapia o de un agente terapéutico

[0074] La presente divulgación proporciona un método para mejorar el beneficio a un sujeto de una terapia o un agente terapéutico. El método comprende dos etapas, que se denominan en el presente documento etapas (a) y (b).

[0075] La etapa (a) comprende administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto. La cantidad del agente administrado es preferentemente suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de todas o prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto.

[0076] La etapa (b) comprende administrar posteriormente al sujeto dicha terapia o agente terapéutico.

[0077] Las etapas (a) y (b) se separarán por un intervalo de tiempo que es preferentemente suficiente para que tenga lugar la eliminación de la unión al receptor de Fc por parte de todas o prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto. Dicho intervalo normalmente puede ser de al menos 30 minutos y como máximo 21 días. La divulgación también proporciona un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en un sujeto para su uso en un método para mejorar el beneficio para dicho sujeto de una terapia o un agente terapéutico, en donde el método comprende: (a) administrar al sujeto una cantidad del agente suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc por todas o prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y (b) posteriormente administrar dicha terapia o dicho agente terapéutico al sujeto, en donde las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo suficiente para que se elimine la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto. Dicho intervalo normalmente puede ser de al menos 30 minutos y como máximo 21 días.

[0078] La divulgación también proporciona el uso de un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en un sujeto en la elaboración de un medicamento para mejorar el beneficio para dicho sujeto de una terapia o un agente terapéutico, en donde dicha mejora comprende: (a) administrar al sujeto una cantidad del agente suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc por todas o prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y (b) posteriormente administrar dicha terapia o dicho agente terapéutico al sujeto, en donde las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo suficiente para que se elimine la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto. Dicho intervalo normalmente puede ser de al menos 30 minutos y como máximo 21 días.

[0079] Programación y orden de las etapas (a) y (b)

[0080] La etapa (a) se realiza antes de la etapa (b), y las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo suficiente para que se elimine la unión al receptor de Fc por parte de todas o prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto. Por "prácticamente todas" se entiende normalmente que la unión al receptor de Fc por la IgG sérica se reduce a menos del 5 % del nivel que estaba presente antes de la etapa (a). Por ejemplo, si el agente administrado es (a) una proteasa (tal como IdeS), el intervalo será el tiempo necesario para que el agente escinda al menos un 95 % de las IgG séricas en el sujeto, según las mediciones de cualquier ensayo adecuado. Dicho intervalo normalmente puede ser de al menos 30 minutos y como máximo 21 días.

[0081] El límite inferior del intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) viene determinado por el tiempo que tarda el agente administrado en la etapa (a) en eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto. Opcionalmente, esto puede determinarse mediante el análisis de una muestra de suero tomada del individuo y la aplicación de cualquier ensayo adecuado. Algunos ensayos ilustrativos adecuados se describen en los ejemplos.

[0082] Un ensayo de este tipo puede comprobar directamente la presencia de moléculas de IgG en una muestra de suero capaces de unirse a uno o más receptores de Fc, por ejemplo en un ELISA. Como alternativa, dicho ensayo puede ser indirecto, en el sentido de que puede comprobar la presencia de uno o más productos de reacción que se espera que resulten del tratamiento de IgG con el agente administrado en la etapa (a). Por ejemplo, donde el agente es una enzima que escinde la proteína IgG, una muestra de suero puede analizarse para detectar la presencia de moléculas de IgG inalteradas o de los fragmentos resultantes de la escisión. Esto puede lograrse mediante cualquier método adecuado, tal como mediante la separación de las moléculas y los fragmentos en función del peso molecular, por ejemplo, mediante espectrometría de masas o SDS-PAGE, o mediante detección específica de las moléculas o fragmentos, por ejemplo, mediante ELISA. Como alternativa, las IgG pueden detectarse mediante la mezcla de suero de un sujeto con células que expresen FcgR y el control de la unión de IgG mediante citometría de flujo utilizando IgG antihumana conjugada con fluorocromo.

[0083] Métodos convencionales para evaluar la cantidad de IgG en una muestra, tal como una muestra de suero, en un entorno clínico se basan en la nefelometría y la turbidimetría debido a su rapidez, facilidad de uso y precisión. Tanto en nefelometría como en turbidimetría, se proyecta una fuente de luz a través de una muestra líquida dentro de un recipiente transparente. La turbidimetría mide la disminución de la intensidad de la luz y la nefelometría mide la dispersión de la luz a su paso por la muestra, que es proporcional a la concentración de la inmunoglobulina en la solución. Ambos principios se basan en la adición de anticuerpos anti-IgG que reaccionan con el antígeno de la muestra para formar un complejo de antígeno y anticuerpo (aglutinación). La adición de PEG permite que la reacción progrese rápidamente hasta el punto final, aumenta la sensibilidad y reduce el riesgo de que las muestras que contienen un exceso de antígeno produzcan resultados falsos negativos. En el caso de análisis de IgG, la parte F(ab')<2>de la IgG se reticula por el anticuerpo anti-IgG y provoca la reacción de aglutinación. Sin embargo, dichos métodos pueden no ser adecuados cuando algunas o todas las IgG presentes pueden no estar inalteradas. Por ejemplo, si se ha administrado una cisteína proteasa de IgG (tal como IdeS) al sujeto del que se ha tomado la muestra, por ejemplo, en un método de la invención, o si se ha administrado dicha proteasa a la muestra, estarán presentes fragmentos de escisión tales como los fragmentos F(ab')<2>y Fc. Esto no afecta a la reacción de aglutinación de los métodos convencionales de nefelometría y turbidimetría mientras los fragmentos F(ab')<2>sigan presentes en la muestra. Debido a la semivida más corta de los fragmentos F(ab')<2>en comparación con la IgG inalterada, la aglutinación disminuirá con el tiempo aunque no es proporcional a la cantidad de IgG inalterada presente en la muestra. Por tanto, las muestras afectadas por la presencia de una cisteína proteasa de IgG (tal como IdeS) no pueden evaluarse mediante métodos convencionales. Los inventores desarrollaron un nuevo ensayo para la concentración de IgG que es compatible con muestras afectadas por la presencia de una cisteína proteasa de IgG (tal como IdeS) y puede utilizarse en cualquier entorno clínico, incluido (pero sin limitación) usos junto con otros métodos de la invención.

[0085] Dicho método es capaz de discriminar entre IgG inalterada y fragmentos F(ab')<2>generados por IdeS. Para ello se utilizaron anticuerpos que detectan los distintos fragmentos, es decir, un anticuerpo anti-Fab y un anticuerpo anti-Fc. Los anticuerpos utilizados en el ensayo no deben ser sustrato de la cisteína proteasa de IgG que afecta a la muestra (normalmente IdeS). Esto evita que los reactivos del ensayo se vean afectados por cualquier proteasa activa que pueda estar presente en una muestra. Esto se puede lograr probando IgG de diferentes especies o utilizando fragmentos de anticuerpos (es decir, fragmentos Fab o fragmentos F(ab')<2>) en lugar de anticuerpos enteros. Normalmente, un agente anti-F(ab')<2>se incuba con la muestra como reactivo de captura. Normalmente, el reactivo de captura está inmovilizado, por ejemplo, en los pocillos de una placa de ensayo. A continuación, la IgG unida se detecta mediante la incubación con un agente anti-Fc como reactivo detector. Por tanto, sólo se detectarán las IgG que posean las partes Fab y Fc, contrariamente a los métodos de nefelometría y turbidimetría. Normalmente, el reactivo detector puede conjugarse directa o indirectamente con una fracción para facilitar la detección, tal como un colorante fluorescente o una enzima que reacciona con un sustrato cromogénico. Los reactivos de captura y de detección pueden ser cualquier otra molécula que reconozca específicamente la parte Fab o Fc de la IgG y se pueden utilizar en el orden inverso, es decir, capturar utilizando anti-Fc y detectar utilizando anti-Fab. El ensayo puede realizarse en cualquier formato adecuado, tal como un ELISA convencional o un formato Meso Scale Discovery.

[0087] En algunos casos, tal como cuando la cisteína proteasa de IgG es IdeS, la muestra puede incluir fragmentos intermedios, tales como scIgG, en los que sólo se escinde una cadena pesada, y el F(ab')<2>permanece unido a la otra cadena pesada inalterada. En dichos casos, el fragmento scIgG puede identificarse incorrectamente por el ensayo como una IgG inalterada. Por tanto, el método puede incluir una etapa complementaria de evaluación de los tamaños de los fragmentos presentes en la muestra. Dado que no hay puentes disulfuro entre las cadenas pesadas por debajo de la región bisagra, la parte Fc de la cadena pesada en un fragmento scIgG se separará de la cadena pesada inalterada en condiciones de desnaturalización como una proteína de aproximadamente 20 a 25 kDa. Los diferentes tamaños de los fragmentos se pueden detectar y cuantificar mediante cualquier método adecuado, tal como SDS-PAGE. Una realización específica del método, incluida la etapa complementaria opcional se describe en el ejemplo 1 (véaseEvaluación de la eficacia). El método es particularmente útil para evaluar la eficacia de IdeS en un entorno clínico.

[0089] Cuando el agente de la etapa (a) es una enzima que escinde una fracción de polisacárido en la IgG, una muestra de suero puede analizarse para detectar la presencia de moléculas de IgG que posean polisacáridos normales o truncados, o de los fragmentos de polisacáridos resultantes de la escisión. Esto puede lograrse mediante cualquier método adecuado, tal como mediante la separación de las moléculas y/o fragmentos en función del peso molecular, por ejemplo, mediante espectrometría de masas o SDS-PAGE, o mediante detección específica de las moléculas o fragmentos, por ejemplo, mediante ELISA.

[0091] El límite inferior del intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) puede seleccionarse de: al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas o al menos 6 horas. El límite inferior puede ser más corto que cualquiera de los anteriores si se determina que la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto se ha eliminado en un punto temporal anterior.

[0093] El límite superior del intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) puede seleccionarse independientemente del límite inferior, y puede determinarse por el tiempo que tarda la producción endógena de IgG en empezar a sustituir o reemplazar completamente las moléculas de IgG que estaban presentes en el suero del sujeto antes de llevar a cabo el presente método. Esto puede determinarse mediante el análisis de una muestra de suero tomada del individuo y la aplicación de cualquier ensayo adecuado, tal como los descritos anteriormente con respecto al límite inferior.

[0094] Normalmente, las IgG recién sintetizadas empiezan a reaparecer en el suero a los 3 o 4 días, con reemplazo total completo en unas 3 semanas (21 días).

[0095] El límite superior del intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) puede seleccionarse independientemente del límite inferior, y puede seleccionarse de: como máximo 21 días, como máximo 18 días, como máximo 14 días, como máximo 13 días, como máximo 12 días, como máximo 11 días, como máximo 10 días, como máximo 9 días, como máximo 8 días, como máximo 7 días, como máximo 6 días, como máximo 5 días, como máximo 4 días, como máximo 3 días, como máximo 2 días, como máximo 24 horas, como máximo 18 horas, como máximo 12 horas, como máximo 10 horas, como máximo 8 horas, como máximo 7 horas, como máximo 6 horas, como máximo 5 horas, como máximo 4 horas, como máximo 3 horas, como máximo 2 horas o como máximo 1 hora.

[0096] Preferentemente, el intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) es como máximo 24 horas, más preferentemente, como máximo 12 horas, lo más preferentemente, como máximo 6 horas, de modo que las etapas (a) y (b) puedan realizarse el mismo día o durante la misma visita a un centro de tratamiento. Esto es muy ventajoso, en particular cuando el acceso a los centros de tratamiento puede estar limitado. Por lo tanto, el intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) debe ser lo suficientemente largo para que el agente administrado en la etapa (a) elimine la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto, pero como máximo alrededor de 6 horas. Por tanto, el intervalo entre las etapas (a) y (b) es preferentemente de 30 minutos a 1 hora, de 30 minutos a 2 horas, de 30 minutos a 3 horas, de 30 minutos a 4 horas, de 30 minutos a 5 horas, de 30 minutos a 6 horas, de 1 a 2 horas, de 1 a 3 horas, de 1 a 4 horas, de 1 a 5 horas, de 1 a 6 horas, de 2 a 3 horas, de 2 a 4 horas, de 2 a 5 horas, de 2 a 6 horas, de 3 a 4 horas, de 3 a 5 horas, de 3 a 6 horas, de 4 a 5 horas, de 4 a 6 horas o de 5 a 6 horas.

[0097] Etapa (a)

[0098] En la etapa (a), se administra al sujeto una cantidad eficaz de un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas. Por "cantidad eficaz" se entiende que la cantidad del agente es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto.

[0099] El agente

[0100] El agente normalmente es una proteína, normalmente de origen bacteriano. El agente puede ser una proteína que tenga actividad cisteína proteasa de IgG, preferentemente que escinda en la región bisagra de la molécula de inmunoglobulina. Un ejemplo de dicha proteína es IdeS (enzima degradadora de inmunoglobulina G deS. pyogenes). IdeS es una proteasa estreptocócica con un grado de especificidad único; escinde los anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG), pero ningún otro sustrato (incluida la IgA, IgD, IgE e IgM). IdeS escinde la IgG humana en fragmentos F(ab')<2>y Fc en un sitio definido COOH-terminal de la región bisagra (véase la figura 1). La secuencia madura de IdeS se proporciona como la SEQ ID NO: 1. El agente puede ser una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o puede ser un homólogo de la misma procedente de una bacteria alternativa.

[0101] Como alternativa, el agente puede ser una variante de la proteína IdeS que comprende o consiste en cualquier secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y que tiene actividad cisteína proteasa de IgG. Una variante preferida es la proteína MAC2, cuya secuencia completa está disponible en Genbank con el n.º de registro AFC67907.1. La secuencia de MAC2 sin secuencia de señal se proporciona como la SEQ ID NO: 3. El agente puede ser una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o puede ser un homólogo de la misma procedente de una bacteria alternativa.

[0102] Una variante de la proteína IdeS puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos en la que se han realizado hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, siempre que la variante tenga actividad cisteína proteasa de IgG. Dichas sustituciones de aminoácidos son preferentemente conservadoras. Las sustituciones conservadoras remplazan unos aminoácidos por otros aminoácidos de estructura química similar, propiedades químicas similares o volumen de cadenas laterales similar. Los aminoácidos introducidos pueden tener polaridad, hidrofilia, hidrofobia, basicidad, acidez, neutralidad o carga similar a los aminoácidos que remplazan. Como alternativa, la sustitución conservadora puede introducir otro aminoácido que sea aromático o alifático en el lugar de un aminoácido aromático o alifático preexistente. Se conocen bien en la materia cambios conservadores de aminoácidos y pueden seleccionarse de acuerdo con las propiedades de los 20 aminoácidos principales como se define en la Tabla 1 a continuación. Cuando los aminoácidos tienen una polaridad similar, esto se puede determinar haciendo referencia a la escala de hidropatía para cadenas laterales de aminoácidos en la Tabla 2.

[0103] Tabla 1 - Pro iedades uímicas de los aminoácidos

[0106]

[0109] Tabla 2 - Escala de hidropatía

[0110] Cadena lateral Hidropatía

[0111] Ile 4,5

[0112] Val 4,2

[0113] Leu 3,8

[0114] Phe 2,8

[0115] Cys 2,5

[0116] Met 1,9

[0117] Ala 1,8

[0118] Gly -0,4

[0119] Thr -0,7

[0120] Ser -0,8

[0121] Trp -0,9

[0122] Tyr -1,3

[0123] Pro -1,6

[0124] His -3,2

[0125] Glu -3,5

[0126] Gln -3,5

[0127] Asp -3,5

[0128] Asn -3,5

[0129] Lys -3,9

[0130] Arg -4,5

[0132] Como alternativa, el agente puede ser una proteína que comprende o consiste en un fragmento de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, y tiene actividad cisteína proteasa de IgG, preferentemente en donde dicho fragmento tiene una longitud de 100 a 300, de 150 a 300 o de 200 a 300 aminoácidos. El fragmento puede crearse mediante la eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Pueden eliminarse hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 restos, o más. Los restos eliminados pueden ser contiguos entre sí.

[0133] El agente puede ser una proteína con actividad endoglucosidasa de IgG, preferentemente que escinde la fracción de polisacárido en Asn-297 (numeración de Kabat) en la región Fc de la IgG. Un ejemplo de dicha proteína es EndoS (Endoglucosidasa deS. pyogenes). EndoS hidroliza el núcleo β-1,4-di-N-acetilquitobiosa del polisacárido ligado a la asparagina de la IgG normalmente glucosilada (véase la figura 18). La secuencia madura de EndoS se proporciona como la SEQ ID NO: 2. El agente puede ser una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o puede ser un homólogo de la misma procedente de una bacteria alternativa, tal comoStreptococcus equioStreptococcus zooepidemicus, oCorynebacterium pseudotuberculosis,Enterococcus faecalisoElizabethkingia meningoseptica. El agente puede ser CP40, EndoE o EndoF<2>.

[0135] Como alternativa, el agente puede ser una variante de la proteína EndoS que comprende o consiste en cualquier secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad endoglucosidasa de IgG. Una variante de la proteína EndoS puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos en la que se han realizado hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, siempre que la variante tenga actividad endoglucosidasa de IgG. Dichas sustituciones de aminoácidos son preferentemente conservadoras. Las sustituciones conservadoras son las definidas anteriormente con respecto a la SEQ ID NO: 1.

[0136] Como alternativa, el agente puede ser una proteína que comprende o consiste en un fragmento de la SEQ ID NO: 2 y tiene actividad endoglucosidasa IgG, preferentemente en donde dicho fragmento tiene una longitud de 400 a 950, de 500 a 950, de 600 a 950, de 700 a 950 o de 800 a 950 aminoácidos. Un fragmento preferido consiste en los aminoácidos 1 a 409 de la SEQ ID NO: 2, que corresponden al dominio α enzimáticamente activo de EndoS generado mediante la escisión por la cisteína proteinasa estreptocócica SpeB. El fragmento puede crearse mediante la eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Se pueden eliminar hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o 550 restos o más. Los restos eliminados pueden ser contiguos a otros.

[0137] Cualquier fragmento o variante de la SEQ ID NO: 2 incluye preferentemente los restos 191 a 199 de la SEQ ID NO: 2, es decir, Leu-191, Asp-192, Gly-193, Leu-194, Asp-195, Val-196, Asp-197, Val-198 y Glu-199 de la SEQ ID NO: 1. Estos aminoácidos constituyen un sitio activo perfecto de la familia 18 de quitinasas, que termina con ácido glutámico. El ácido glutámico en el sitio activo de las quitinasas es esencial para la actividad enzimática. Lo más preferentemente, por lo tanto, es que una variante de la SEQ ID NO: 2 contenga Glu-199 de la SEQ ID NO: 2. La variante de la SEQ ID NO: 2 puede contener los restos 191 a 199 de la SEQ ID NO: 2 que tiene uno o más sustituciones conservadoras, siempre que la variante contenga Glu-199 de la SEQ ID NO: 2.

[0138] Administración y dosis

[0139] En la etapa (a), preferentemente, el agente se administra por infusión intravenosa, pero puede administrarse mediante cualquier vía adecuada incluyendo, por ejemplo, intradérmica, subcutánea, percutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intraarticular, intraósea u otras vías de administración adecuadas. La cantidad de dicho agente que se administra puede estar entre 0,01 mg/kg de PC y 2 mg/kg de PC, entre 0,04 y 2 mg/kg de PC, entre 0,12 mg/kg de PC y 2 mg/kg de PC, preferentemente entre 0,24 mg/kg y 2 mg/kg de PC y lo más preferentemente entre 1 mg/kg y 2 mg/kg de PC. El agente puede estar presente en una forma sustancialmente aislada. Se puede mezclar con portadores o diluyentes (como los discutidos a continuación) que no interferirán con el uso previsto y aún se considerarán sustancialmente aislados. También puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 %, 98 % o 99 % de la proteína en la preparación.

[0140] Formulaciones y composiciones

[0141] El agente se administra preferentemente junto con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más ingredientes terapéuticos. El portador o portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el destinatario de la misma. Normalmente, los portadores inyectables y la formulación final son estériles y sin pirógeno.

[0142] La formulación de una composición adecuada se puede llevar a cabo usando compuestos químicos y metodologías de formulación farmacéutica convencionales, todas ellas muy asequibles al experto en la materia. Por ejemplo, el agente se puede combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son generalmente agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el individuo que recibe la composición, y que pueden administrarse sin producir excesiva toxicidad. Algunos excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos, tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol, tioglicerol y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una profunda discusión de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables se puede encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J.1991).

[0143] Tales composiciones se pueden preparar, envasar o comercializar en una forma adecuada para la administración en embolada o para la administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, envasar o comercializar en formas farmacéuticas unitarias, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contengan un conservante. Las composiciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. Dichas composiciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. En una realización de una composición para administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, un polvo o granulado) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógeno) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones se pueden preparar, envasar o comercializar en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la materia conocida, y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales, tales como agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Dichas formulaciones inyectables estériles se pueden preparar con un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites no volátiles, tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos.

[0144] Otras composiciones útiles que se pueden administrar por vía parenteral incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero moderadamente soluble o una sal moderadamente soluble.

[0145] Etapa (b)

[0146] En la etapa (b), se administra una terapia o agente terapéutico al sujeto. Normalmente, la terapia o agente terapéutico se administrará o practicará justamente de la misma manera que se habrían utilizado si no se hubiera realizado primero la etapa (a).

[0147] Agente terapéutico

[0148] En una realización, el agente terapéutico es un anticuerpo que se administra para el tratamiento de un cáncer u otra enfermedad. El agente terapéutico puede ser inmunoglobulina intravenosa (IGIV). En el contexto de la presente realización, el método puede describirse como alternativa como un método para el tratamiento de un cáncer u otra enfermedad en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto; y (b) administrar posteriormente al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que es un tratamiento para dicho cáncer o dicha otra enfermedad; en donde: - la cantidad de dicho agente administrada es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y

[0149] - las etapas (a) y (b) se separan por un intervalo de tiempo de al menos 2 horas y como máximo 21 días.

[0150] La divulgación también proporciona el agente para su uso en dicho método para el tratamiento de un cáncer u otra enfermedad. La divulgación también proporciona el uso del agente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un cáncer u otra enfermedad mediante dicho método.

[0151] El cáncer puede ser leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con SIDA, cáncer de ano, cáncer de apéndice, astrocitoma, cáncer de cerebelo o cerebral de la infancia, carcinoma basocelular, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, tumor cerebral, ependimoma, tumor cerebral, meduloblastoma, tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de sitio primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cáncer cervicouterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de linfocitos T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing, tumor de células germinales extracraneales, infantil, tumor de las células germinales extragonadales, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, cáncer ocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales: extracraneales, extragonadales o de ovarios, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco encefálico, glioma, astrocitoma cerebral infantil, glioma, vía óptica infantil e hipotalámico, carcinoide gástrico, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico y de la vía óptica, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas), sarcoma de Kaposi, cáncer renal (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias, leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas, cáncer de labio y de la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, linfomas microcíticos, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos T cutáneo, linfoma de Hodgkin, linfomas no de Hodgkin (una clasificación vieja de todos los linfomas excepto el de Hodgkin), linfoma del sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenström, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno en adultos, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda en adultos, leucemia mieloide aguda infantil, mieloma múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y los senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor de estroma de epitelio superficial), tumor de células germinales de ovario, tumor ovárico de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer pancreático de las células de los islotes, cáncer del seno paranasal y de la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma pituitario, neoplasia de células plasmáticas, mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejido blando, sarcoma de útero, síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer microcítico de pulmón, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello con tumor primario oculto metastásico, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma cutáneo de linfocitos T, véase micosis fungoide y síndrome de Sézary, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico, cáncer de células transicionales del uréter y la pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer uterino endometrial, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma de la vía óptica e hipotalámico, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenström y tumor de Wilms (cáncer de riñón).

[0153] El cáncer es, preferentemente, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), cáncer de esófago, cáncer de tiroides, cáncer de piel, linfoma, melanoma o leucemia.

[0154] El anticuerpo administrado en la etapa (b) es preferentemente específico para un antígeno tumoral asociado a uno o más de los anteriores tipos de cáncer. Las dianas de interés para un anticuerpo para su uso en el método incluyen CD2, CD3, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD32, CD33, CD40, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD80, CD86, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphA2, EphB2, FAP, av integrina, mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CA1X, 5T4, integrina α4β7, Her2. Otras dianas son citocinas, tales como las interleucinas IL-I a IL-13, factores de necrosis tumoral α y β, interferones α, β y γ, factor de crecimiento tumoral beta (TGF-β), factor estimulador de las colonias (CSF) y factor estimulador de las colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF). Véase Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawalet al.eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991). Otras dianas son hormonas, enzimas y mensajeros intracelulares e intercelulares, tales como adenil ciclasa, guanil ciclasa y fosfolipasa C. Otras dianas de interés son los antígenos de leucocitos, tales como CD20 y CD33. Los fármacos también pueden ser dianas de interés. Las moléculas diana pueden ser humanas, de mamíferos o bacterianas. Otras dianas son antígenos, tales como proteínas, glucoproteínas e hidratos de carbono de patógenos microbianos, tanto víricos como bacterianos, y tumores. Otras dianas más se describen en el documento U.S.4.366.241.

[0156] Por "otra enfermedad" se entiende cualquier otra enfermedad que sea tratable mediante la administración de un anticuerpo. La otra enfermedad puede ser la ascitis maligna, en cuyo caso el anticuerpo que sirve para tratar la enfermedad es normalmente catumaxomab o un anticuerpo que se une a la misma diana que catumaxomab.

[0158] Ya sea un tratamiento contra el cáncer u otra enfermedad, el anticuerpo puede unirse directa o indirectamente a una fracción citotóxica o a un marcador detectable. El anticuerpo puede administrarse a través de una o más vías de administración mediante uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la materia. La vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos incluyen la administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral", tal como se usa en el presente documento, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo general por inyección. Como alternativa, un anticuerpo puede administrarse por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. También se prefiere la administración local, incluyendo la infusión peritumoral, yuxtatumoral, intratumoral, intralesional, perilesional, intracavitaria, administración intravesicular e inhalación.

[0160] Un médico especialista experto puede determinar una dosificación adecuada de un anticuerpo. Los niveles reales de dosificación de un anticuerpo se pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y un modo de administración particulares, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad del anticuerpo particular empleado, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del anticuerpo, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud general y los antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las materias médicas.

[0162] Una dosis adecuada de un anticuerpo puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente a tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.

[0164] Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, pueden administrarse un bolo único, o la etapa (b) del método puede comprender varias dosis divididas administradas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica, siempre que el intervalo requerido entre etapas (a) y (b) no exceda. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Como se utiliza en el presente documento, la forma farmacéutica unitaria se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico necesario.

[0166] El anticuerpo de la etapa (b) puede administrarse en combinación con una quimioterapia o radioterapia. Además, el método puede comprender la administración de un anticuerpo anticanceroso adicional u otro agente terapéutico, que puede administrarse junto con el anticuerpo de la etapa (b) en una composición única o en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, el anticuerpo de la etapa (b) puede administrarse antes, después o al mismo tiempo que el otro agente.

[0168] El anticuerpo puede ser abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ALD518, alemtuzumab, alirocumab, pentetato de altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atinumab, atlizumab (= tocilizumab), atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bimagrumab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, blosozumab, brentuximab vedotina, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab ravansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, Ch.14.18, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetán, conatumumab, concizumab, crenezumab, CR6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetán, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, FBTA05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotina, golimumab, gomiliximab, GS6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetano, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuzimab ravtansina, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lampalizumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lodelcizumab, lorvotuzumab mertansina, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-CD3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentano, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pinatuzumab vedotina, pintumomab, placulumab, polatuzumab vedotina, ponezumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetida, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, TGN1412, ticilimumab (= tremelimumab), tildrakizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab (=atlizumab), toralizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotina, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab o zolimomab aritox.

[0170] Los anticuerpos preferidos incluyen natalizumab, vedolizumab, belimumab, atacicept, alefacept, otelixizumab, teplizumab, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, epratuzumab, alemtuzumab, abatacept, eculizumab, omalizumab, canakinumab, meplizumab, reslizumab, tocilizumab, ustekinumab, briakinumab, etanercept, inlfliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, trastuzumab, gemtuzumab, ozogamicina, ibritumomab, tiuxetan, tostitumomab, cetuximab, bevacizumab, panitumumab, denosumab, ipilimumab, brentuximab y vedotina.

[0171] Terapia

[0172] En otra realización, la terapia es un trasplante de órgano. El órgano puede seleccionarse de riñón, hígado, corazón, páncreas, pulmón o intestino delgado.

[0173] El sujeto a tratar preferentemente puede estar sensibilizado o muy sensibilizado. Por "sensibilizado" se entiende que el sujeto ha desarrollado anticuerpos contra antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) humano (también denominado sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA)). Los anticuerpos anti-HLA se originan a partir de linfocitos B sensibilizados de manera alogénica y normalmente están presentes en pacientes que previamente se han sensibilizado por transfusión sanguínea, trasplante previo o embarazo (Jordanet al., 2003).

[0174] Si un posible receptor del trasplante está sensibilizado o no puede determinarse por cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede usar una prueba de panel reactivo de anticuerpos (PRA) para determinar si un receptor está sensibilizado. Se considera que una puntuación de PRA >30 % normalmente significa que el paciente está "en alto riesgo inmunológico" o "sensibilizado". Como alternativa, se puede realizar una prueba de compatibilidad cruzada, en la que una muestra de la sangre del posible donante del trasplante se mezcla con la del receptor previsto. Una compatibilidad cruzada positiva significa que el receptor tiene anticuerpos que reaccionan con la muestra donante, lo que indica que el receptor está sensibilizado y no se debería realizarse el trasplante. Las pruebas de compatibilidad cruzada normalmente se realizan como un examen final inmediatamente antes del trasplante.

[0175] La presencia de anticuerpos de alto título contra antígenos MHC del posible donante (es decir, anticuerpos específicos de donante (AED) es una contraindicación directa para el trasplante debido al riesgo de rechazo agudo mediado por anticuerpos. En resumen, la sensibilización para los antígenos MHC del donante obstaculiza la identificación de un donante adecuado. Una prueba de compatibilidad cruzada positiva constituye una barrera inequívoca para el trasplante. Puesto que aproximadamente un tercio de los pacientes que esperan para un trasplante de riñón están sensibilizados, y hasta un 15 % que están altamente sensibilizados, esto conduce a una acumulación de pacientes que esperan un trasplante. En los Estados Unidos, el tiempo medio en la lista de espera para el trasplante renal en 2001-2002 era de 1.329 días para aquellos con una puntuación de panel reactivo de anticuerpos (PRA) del 0 al 9 %, 1.920 días para aquellos con PRA del 10 al 79 % y 3.649 días para aquellos con PRA del 80 % o más (base de datos OPTN, 2011).

[0176] Una estrategia aceptada para superar la barrera de AED es aplicar intercambio de plasma o inmunoadsorción, con frecuencia junto con, por ejemplo, globulina gamma intravenosa (IVIg) o rituximab, para bajar los niveles de AED a un nivel donde puede considerarse el trasplante (Jordanet al., 2004; Montgomeryet al., 2000; Voet al., 2008a; Voet al., 2008b). Sin embargo, el intercambio de plasma, la inmunoadsorción y los tratamientos con IVIg tienen la desventaja de ser poco eficaces y requerir un planeamiento riguroso puesto que implican tratamientos repetidos durante un periodo prolongado de tiempo. Cuando un órgano de un donante muerto llega a estar disponible se tiene que trasplantar en horas puesto que el tiempo de isquemia en frío prolongado es uno de los factores de riesgo más importantes para la función retrasada del injerto y la pérdida de aloinjertos en el trasplante renal (Ojoet al., 1997). Por el contrario, el método de la presente divulgación permite la eliminación rápida, temporal y segura de AED en un posible receptor de trasplante. La administración del agente justo antes del trasplante tiene la capacidad de desensibilizar de manera eficaz un paciente altamente sensibilizado, permitiendo de este modo el trasplante y evitando el rechazo agudo mediado por anticuerpo. Una dosis única del agente antes del trasplante permitirá el trasplante de miles de pacientes con anticuerpos IgG específicos del donante.

[0177] En el contexto de la presente realización, el método puede describirse alternativamente como un método para el tratamiento de insuficiencia orgánica en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto; y (b) posterior trasplante de un órgano de sustitución al sujeto; en donde:

[0178] - la cantidad de dicho agente administrada es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y

[0179] - las etapas (a) y (b) se separan por un intervalo de tiempo de al menos 2 horas y como máximo 21 días.

[0180] Esta realización puede describirse como un método para prevenir el rechazo de un órgano trasplantado en un sujeto, particularmente el rechazo agudo de trasplante mediado por anticuerpo, comprendiendo el método, al menos 2 horas y como mucho 21 días antes del trasplante del órgano, administrar al sujeto un agente que reduzca la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto, en donde la cantidad de dicho agente administrada es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto. Se apreciará que la administración del agente y el posterior trasplante están separados por un intervalo de tiempo que es equivalente al intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) en las formulaciones alternativas del método presentado anteriormente. Por tanto, los distintos límites superior e inferior para el intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) descritos anteriormente se aplican igualmente a este intervalo de tiempo. En esta realización, es particularmente preferido que el intervalo de tiempo sea lo suficientemente corto como para permitir que el método se lleve a cabo durante una única visita al hospital. Por tanto, los intervalos preferidos son de 1 a 6 horas o de 1 a 12 horas.

[0181] La divulgación también proporciona el uso del agente en dicho método para tratar la insuficiencia orgánica o prevenir el rechazo de trasplante, particularmente, el rechazo agudo de trasplante mediado por anticuerpo. La divulgación también proporciona el uso del agente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia orgánica o para la prevención del rechazo de trasplante mediante dicho método.

[0182] En esta realización, el método de la divulgación además puede comprender una etapa realizada en el momento del trasplante o inmediatamente antes, etapa que comprende la supresión por inducción de los linfocitos T y/o los linfocitos B en el paciente. Dicha supresión de la inducción normalmente puede comprender administrar un cantidad eficaz de un agente que destruye o inhibe los linfocitos T y/o administrar una cantidad eficaz de un agente que destruye o inhibe los linfocitos B. Los agentes que destruyen o inhiben los linfocitos T incluyen muromonab, basiliximab, daclizumab, un anticuerpo globulina antitimocítica (GAT) y una inmunoglobulina de linfocito, preparación de globulina antitimocítica (ATGAM). Se sabe que rituximab destruye o inhibe los linfocitos B.

[0183] Método para eliminar anticuerpos o reducir el efecto de los anticuerpos en un sujeto

[0184] La divulgación también proporciona un método para eliminar anticuerpos o reducir los efectos de los anticuerpos en un sujeto. Los anticuerpos a los que afecta el método son normalmente autoanticuerpos patógenos. El método comprende una primera etapa, denominada etapa (a) y una segunda etapa opcional, denominada etapa (b).

[0185] La etapa (a) comprende administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto. La cantidad del agente administrado es preferentemente suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto.

[0186] Si se lleva a cabo, la etapa (b) comprende, después de la etapa (a), someter al sujeto a un tratamiento que elimine los anticuerpos endógenos; en donde dicho tratamiento que elimina los anticuerpos endógenos es la plasmaféresis o la inmunoadsoprción, o es la administración de un agente (tal como un anticuerpo anti-FcRn) que impide el reciclaje de anticuerpos en el suero por el receptor de FcRn, reduciendo de este modo la semivida, y en donde las etapas (a) y (b) están separados por un intervalo de tiempo de al menos 2 semanas.

[0187] El método puede además comprender la repetición de la etapa (a). La etapa (a) se repite preferentemente sólo si el paciente tiene un nivel bajo de respuestas de anticuerpos contra el agente. La cantidad de moléculas de IgG antiagente en el suero de un paciente puede determinarse mediante cualquier método adecuado, tal como una prueba CAP FEIA (ImmunoCAP) específica del agente. Sólo se repetiría la etapa (a) si el resultado de la CAP FEIA está por debajo de un umbral que determinará el facultativo. Normalmente, para evitar el desarrollo de una respuesta contra el agente excesiva, la etapa (a) no debe repetirse con más frecuencia que una vez cada 6 meses.

[0188] Los afectados por el método pueden ser normalmente autoanticuerpos patógenos específicos para un autoantígeno que es diana en una enfermedad autoinmunitaria mediada total o parcialmente por autoanticuerpos.

[0189] En la Tabla 3 se ex one una lista de dichas enfermedades los autoantí enos asociados.

[0192]

[0193] (continuación)

[0194]

[0195] (continuación)

[0198]

[0200] En esta realización, el método puede describirse alternativamente como un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en el sujeto; y opcionalmente (b) administrar posteriormente al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que es un tratamiento para dicho cáncer o dicha enfermedad autoinmunitaria; en donde la cantidad administrada de dicho agente es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y las etapas (a) y (b) se separan por un intervalo de tiempo de al menos 2 horas y como máximo 21 días. La divulgación también proporciona el agente para su uso en dicho método para el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria. La divulgación también proporciona el uso del agente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria mediante dicho método.

[0201] La enfermedad autoinmunitaria es preferentemente una enfermedad autoinmunitaria crónica mediada total o parcialmente por autoanticuerpos. La enfermedad autoinmunitaria puede ser una de las enfermedades enumeradas en la Tabla 3.

[0202] Etapa adicional opcional del método

[0203] En los métodos de la invención, el agente administrado en la etapa (a) normalmente no actúa sólo sobre las moléculas de IgG del suero. Los inventores también han hecho el sorprendente descubrimiento de que el agente también puede actuar sobre las moléculas de IgG unidas a la membrana que están presentes como parte de un complejo receptor de linfocitos B (RLB).

[0204] El RLB contiene una parte de unión al ligando y otra de señalización. La parte de unión al ligando consiste en un anticuerpo con un dominio transmembrana y la parte de señalización consiste en un heterodímero denominado Igα/Ig-β (CD79a/CD79b). Las proteínas CD79 abarcan la membrana plasmática y tienen una cola citoplasmática con un motivo de activación basado en la tirosina inmunorreceptora (ITAM, del inglésimmunoreceptor tyrosine-based activation motif). Al ligarse al receptor, el ITAM se fosforila por la cinasa de la familia SRC LYN y recluta a la tirosina cinasa esplénica (SYK, del inglésspleen tyrosine kinase) hacia el receptor. La activación de la SYK conduce a la formación de un complejo de señalización asociado a la membrana plasmática, llamado signalosoma, que ensambla moléculas de señalización, tales como la fosfolipasa-Cy2 (PLC γ2), (fosfoinositido 3-cinasa (PI3K), tirosina cinasa de Bruton (BTK), VAV1 y moléculas adaptadoras. Dos intermediarios fundamentales e intensamente estudiados en las cascadas de señalización del RLB, PLC γ2 y PI3K, generan segundos mensajeros clave, lo que a su vez, activan la cinasa IκB (IKK) y las cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK1/2; AKA MAPK3 y 1). Las decisiones sobre el destino de los linfocitos B, es decir, la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la muerte celular están estrechamente reguladas por el equilibrio entre estos eventos de señalización. Durante el desarrollo de los linfocitos B, los linfocitos B maduros indiferenciados abandonan la médula ósea, pasan por una hipermutación somática en los centros germinales y un cambio de clase antes de convertirse en células plasmáticas longevas de alta afinidad y linfocitos B de memoria listos para responder intensamente cuando se activan por estimulación antigénica. Los linfocitos B de memoria responden al antígeno a través de la unión al RLB y una parte sustancial de los linfocitos B de memoria en circulación tienen un RLB de tipo IgG.

[0206] Por tanto, el agente administrado en la etapa (a) de un método de la invención puede actuar también sobre la parte IgG del RLB de los linfocitos B de memoria y puede inhibir la activación normal de estas células mediante la unión al ligando. Como resultado, habrá un intervalo en el que se reduzca la activación de los linfocitos B de memoria en el individuo. Este intervalo normalmente termina unas 12 horas después de la finalización de la etapa (a), pero puede ser más largo. Al final del intervalo, se han recuperado los niveles de IgG inalterada unida a la membrana (y, por tanto, de RLB normal), normalmente como resultado de la renovación de la membrana de la célula afectada. Posteriormente, a continuación, se produce un nuevo intervalo al final del cual la IgG recién sintetizada comienza a reaparecer en el suero. Este intervalo normalmente termina unos 3 a 4 días después de la finalización de la etapa (a).

[0208] La acción sobre los linfocitos B de memoria del agente administrado en la etapa (a) de los métodos de la invención proporciona, por tanto, la oportunidad de incluir una etapa adicional opcional en cualquier método de la invención. Esta etapa, denominada etapa (a1), se lleva a cabo después de la etapa (a) y, si está presente la etapa (b), antes de la etapa (b) en un método de la invención. La etapa (b) se llevará a cabo normalmente tan pronto como sea posible o práctico después de la etapa (a1). La etapa (a1) puede realizarse (i) en el intervalo posterior a la etapa (a), pero antes de la recuperación de los niveles de IgG inalterada unida a la membrana en las superficies celulares del sujeto, o (ii) en el intervalo posterior a (i), pero antes de que la IgG recién sintetizada comience a reaparecer en el suero del sujeto. La recuperación del nivel de IgG inalterada unida a la membrana o la reaparición de IgG en suero puede determinarse mediante cualquier método adecuado. Métodos ilustrativos se describen en los ejemplos.

[0210] El intervalo de (i) normalmente termina en torno a las 12 horas, 16 horas o 24 horas después de la etapa (a). Por lo tanto, si la etapa (a1) se realiza en el intervalo (i), puede realizarse hasta 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas o 24 horas después de la etapa (a), preferentemente hasta 1 o 2 horas después de la etapa (a).

[0212] El intervalo de (ii) comienza al final del intervalo de (i) y normalmente termina 3 o 4 días después de la etapa (a). Por tanto, el intervalo de (ii) es normalmente desde 12 horas hasta 4 días (96 horas) después de la etapa (a). Por lo tanto, si la etapa (a1) se realiza en el intervalo (ii), se realiza entre 12 horas y 96 horas después de la etapa (a1), y puede realizarse entre 12 horas y 24 horas, entre 12 horas y 48 horas, o entre 12 horas y 72 horas después de la etapa (a). Para la conveniencia del sujeto, en general, es preferible realizar la etapa (a1) lo antes posible dentro del intervalo (ii). Por tanto, se prefiere realizar la etapa (a1) entre 12 horas y 24 horas después de la etapa (a).

[0214] Si la etapa (a1) se realiza en el intervalo (i), normalmente comprende la administración de un agente dirigido específicamente a un epítopo presente en la IgG o fragmento de IgG que resulta de la acción sobre un linfocito B del agente de la etapa (a). Por ejemplo, la etapa (a1) puede comprender la administración de un agente que se une específicamente a un fragmento Fc unido a la membrana (tal como el producido por la acción de IdeS) o que se une específicamente a una IgG unida a la membrana con glucosilación alterada (tal como la producida por la acción de EndoS). El epítopo puede ser de nueva creación por la acción del agente de la etapa (a), o puede ser un epítopo que ya esté presente en la IgG inalterada, siempre que sea retenida por la IgG o el fragmento de IgG resultante de la acción del agente de la etapa (a).

[0215] Dicho de otro modo, la invención también puede proporcionar un método en el que una etapa adicional (a1) se lleva a cabo después de la etapa (a) y, si está presente la etapa (b), antes de la etapa (b), en donde la etapa (a1) comprende administrar al sujeto un agente que se une específicamente a un epítopo producido por la acción del agente administrado en la etapa (a) sobre la IgG unida a la membrana en el complejo RLB, en donde dicha administración se lleva a cabo en un intervalo después de la etapa (a), pero antes de que el nivel de IgG inalterada unida a la membrana en los complejos RLB se haya recuperado al mismo nivel tal cual estaba presente antes de la etapa (a). Es decir, el intervalo (i) como se ha descrito anteriormente. El epítopo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fc unido a la membrana (tal como el producido por la acción de IdeS). El agente administrado en la etapa (a1) de dicho método puede ser cualquier agente que se una específicamente al epítopo, tal como un anticuerpo. La unión del agente producirá normalmente una reducción de la activación y/o la muerte de una célula en la que esté presente la diana. Dicha célula es normalmente un linfocito B de memoria. El agente puede opcionalmente conjugarse con una citotoxina (ejemplos adecuados incluyen los enumerados en la Tabla 4), radioisótopo u otra fracción para promover dicha activación reducida o muerte de dicha célula. Por tanto, en esta realización, la administración de un agente en la etapa (a1) produce normalmente la muerte de los linfocitos B de memoria que presentan una molécula de IgG que ha sido alterada por la acción del agente de la etapa (a). Por tanto, la inclusión de la etapa (a1) puede aumentar los efectos beneficiosos de un método de la invención, por ejemplo, prolongando o manteniendo la ausencia de moléculas de IgG en suero.

[0216] Tabla 4

[0219]

[0222] Si la etapa (a1) se realiza en el intervalo (ii), normalmente comprende la administración de un agente dirigido específicamente a la IgG inalterada unida a la membrana. Dicho agente sólo afectará a los linfocitos B de memoria cuyos niveles de IgG unida a la membrana en el complejo RLB se hayan recuperado. Dentro de este intervalo, todas las demás formas de IgG inalterada (por ejemplo, IgG circulante o IgG unida a células efectoras por receptores de Fc en la membrana celular) se habrán eliminado por la acción del agente administrado en la etapa (a) y los fragmentos resultantes se habrán aclarado. Por tanto, el agente administrado en la etapa (a1) puede utilizarse para dirigirse a todos los linfocitos B de memoria que hayan recuperado un RLB inalterado. Como alternativa, el agente puede utilizarse para dirigirse a la región Fab específica del RLB de los linfocitos B de memoria que son específicos para un antígeno en particular, es decir, el agente administrado en la etapa (a1) puede ser antiidiotípico. Por ejemplo, el agente administrado en la etapa (a1) puede utilizarse para dirigirse a la región Fab de anticuerpos específicos del donante en un receptor de trasplante, o a la región Fab de anticuerpos específicos de antígenos autoinmunitarios en un paciente autoinmune, tal como un paciente que padezca un trastorno de los enumerados en la Tabla 3.

[0224] Dicho de otro modo, la invención también puede proporcionar un método en el que una etapa adicional (a1) se lleva a cabo después de la etapa (a) y antes de la etapa (b) si la etapa (b) está presente, en donde la etapa (a1) comprende administrar al sujeto un agente que se une específicamente a un epítopo de IgG inalterada unida a la membrana, en donde dicha administración se lleva a cabo en el intervalo después de la etapa (a) en el que el nivel de IgG inalterada unida a membrana en los complejos RLB ha vuelto a un nivel similar, sustancialmente igual o igual al nivel que estaba presente antes de la etapa (a), pero la IgG recién sintetizada aún no ha reaparecido en el suero. Es decir, el intervalo (ii) como se ha descrito anteriormente. El agente administrado en la etapa (a1) de dicho método puede ser cualquier agente que se una específicamente al epítopo, tal como un anticuerpo. La unión del agente producirá normalmente una reducción de la activación y/o la muerte de una célula en la que esté presente la diana. El agente puede opcionalmente conjugarse con una citotoxina (ejemplos adecuados incluyen los enumerados en la tabla 4), radioisótopo u otra fracción para promover dicha activación reducida o muerte de dicha célula. En esta realización, la administración de un agente en la etapa (a1) puede provocar la muerte de todos los linfocitos B de memoria que muestren una molécula de IgG inalterada unida a la membrana. Como alternativa, puede provocar la muerte únicamente de los linfocitos B de memoria que presentan una especificidad particular de la molécula de IgG unida a la membrana. En cualquier caso, la inclusión de la etapa (a1) puede aumentar los efectos beneficiosos de un método de la invención, por ejemplo, prolongando o manteniendo la ausencia de todas las moléculas de IgG en suero, o prolongando o manteniendo la ausencia de un subconjunto específico de moléculas de IgG en suero específicas de una diana en particular. Esto último puede ser particularmente ventajoso, ya que permitirá la eliminación selectiva de subconjuntos no deseados de moléculas de IgG de la población de IgG recién sintetizada en el suero del sujeto al que se aplica el método de la invención.

[0226] Kit

[0228] La divulgación también proporciona un kit adecuado para su uso en un método de la invención, conteniendo el kit una cantidad de un agente que reduce la unión al receptor de Fc de las moléculas de IgG séricas en un sujeto, cuya cantidad es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc de todas o casi todas las moléculas de IgG presentes en el suero de un sujeto.

[0229] Los kits de la divulgación pueden comprender adicionalmente uno o más reactivos o instrumentos que permitan llevar a cabo cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente. Dichos reactivos o instrumentos incluyen uno o más de los siguientes: una cantidad terapéuticamente eficaz de una agente terapéutico, que es un anticuerpo, tampón(es) adecuado(s) (soluciones acuosas), medios para administrar el agente a un sujeto como infusión intravenosa (tal como un recipiente o un instrumento que comprende una aguja). Los reactivos pueden estar presentes en el kit en estado seco de tal manera que una muestra fluida resuspenda los reactivos. El kit también puede, opcionalmente, comprender instrucciones que permiten utilizar el kit en el método de la invención o detalles sobre los pacientes para los que puede utilizarse el método.

[0230] Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

[0231] Ejemplo 1

[0232] Estudio preclínico

[0233] Las investigaciones preclínicas de cumplimiento con las BPL diseñadas para investigar la toxicología y farmacología en conejo blanco de Nueva Zelanda de una IdeS producida según las PCF demostraron que IdeS escindió el conjunto plasmático completo de IgG en los 5 minutos siguientes a la administración de IdeS con <1 % de IgG restante un día después del tratamiento. El nivel de IgG alcanzó su nivel más bajo 24 a 48 horas después del tratamiento con IdeS y, a continuación, aumentó gradualmente durante los días siguientes. Los niveles normales de IgG se restablecieron aproximadamente 3 semanas después de una dosis única de IdeS. El producto final, es decir, los fragmentos F(ab')<2>y Fc, tiene una semivida significativamente más corta que la IgG inalterada y sólo se detectan niveles bajos al día siguiente de una dosis única de IdeS. IdeS tiene una rápida distribución, mostró una farmacocinética proporcional a la dosis y una eliminación multifásica con una semivida plasmática de aproximadamente 1 hora en conejos. Basándose en estudios toxicológicos de dosis repetidas, la dosis sin efecto adverso observado (DSEAO) para el IdeS se fijó en 2 mg/kg de peso corporal (PC). Datos no mostrados.

[0234] El efecto de IdeS en los anteriores experimentosin vitroein vivofue espectacular y proporcionó la base para la investigación posterior en voluntarios humanos sanos.

[0235] Estudio en seres humanos

[0236] Materiales y métodos

[0237] Diseño del estudio

[0238] Se trató de un en sayo con doble enmascaramiento, aleatorizado, unicéntrico en sujetos varones sanos (número EudraCT: 2012-000969-21) realizado en la unidad de Fase Uno del Hospital Universitario de Lund, Suecia. El protocolo fue aprobado por el comité de ética local antes del reclutamiento y todos los sujetos dieron su consentimiento informado firmado antes de someterse a cualquier procedimiento específico del estudio. El objetivo primario era evaluar la seguridad y tolerabilidad de IdeS tras la administración intravenosa de dosis únicas ascendentes. Los objetivos secundarios eran evaluar la eficacia de IdeS (es decir, la reducción de IgG en suero), farmacocinética e inmunogenia en sujetos humanos sanos.

[0239] La farmacia del hospital preparó la solución de infusión diluida del IdeS producido según las PCF (Hansa Medical AB, Suecia) en una solución salina isotónica tamponada con fosfato en una jeringuilla de infusión con un equipo de infusión que incluía un filtro de 0,2 µm (B. Braun, Alemania). La dosis inicial seleccionada de 0,010 mg/kg de PC era 10 veces inferior a la dosis prevista con efecto biológico mínimo (MABEL, del inglésMinimal Anticipated Biological Effect Level) determinada preclínicamente y 200 veces inferior a la dosis sin efecto adverso observado (DSEAO) determinado durante la toxicología animal. El diseño del estudio permitió un aumento gradual de la dosis con un control intensivo de la seguridad.

[0240] Para cumplir los criterios de inclusión, los sujetos debían estar sanos de acuerdo con el reconocimiento médico de cribado, edad entre 18 y 45 años, tener venas adecuadas para la canulación, un índice de masa corporal (IMC) entre 19 y 30 kg/m<2>y pesar entre 50 y 100 kg. Los sujetos excluidos del estudio fueron los que tenían (o habían tenido antecedentes de) cualquier inmunodeficiencia clínicamente significativa, incluida, aunque no de forma limitativa, la deficiencia de inmunoglobulina A, tenían niveles elevados de IgG anti-IdeS (>15 mg/l), dieron positivo en el antígeno de superficie de la hepatitis B en suero, anticuerpo de la hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tuberculosis en curso, sífilis en curso, infección activa por herpes simple o herpes zóster durante el cribado.

[0241] Cada sujeto tuvo un periodo de ingreso de tres días en la Unidad de Ensayos Clínicos y fue aleatorizado a IdeS o placebo (solución salina tamponada con fosfato) y recibieron la dosis a la mañana siguiente al ingreso. Dos sujetos de cada grupo de dosis recibieron la dosis el primer día (un IdeS y un placebo) y los siguientes sujetos del grupo la recibieron al cabo de una semana. Después de cada cohorte, el Comité de Seguimiento de Datos evaluó los datos de seguridad y decidió el siguiente nivel de dosis. El tiempo transcurrido desde la última dosis de un nivel de dosis hasta el inicio del siguiente nivel de dosis fue de al menos 14 días. Las infusiones se administraron durante 30 minutos a los dos primeros sujetos de cada grupo y durante 15 minutos a los sujetos posteriores de ese grupo. Durante el periodo de ingreso, se realizó un control intensivo de la seguridad y muestreos sanguíneos seriados para evaluar la seguridad, farmacocinética, eficacia y anticuerpos antifármacos. Los sujetos fueron dados de alta el día 4 y realizaron al menos ocho visitas intermedias de seguimiento con reconocimiento médico y toma de muestras de sangre hasta el final del estudio el día 64.

[0242] Todos los sujetos participantes en el estudio se trataron con antibióticos (Spektramox si no eran hipersensibles a los betalactámicos) como profilaxis contra las infecciones bacterianas. El tratamiento profiláctico comenzó el día de la dosis y continuó hasta que los niveles en plasma de IgG fueron >4,5 g/l. No se permitió ninguna otra medicación o terapia simultánea, excepto el paracetamol, durante los primeros 28 días siguientes a la administración de la dosis, a menos que lo prescribiera el investigador y se considerara necesario para la seguridad y el bienestar del sujeto.Evaluaciones de seguridad

[0243] Los acontecimientos adversos (AA) se recogieron desde el momento del ingreso y durante todo el periodo de estudio, incluido el periodo de seguimiento. Se registró toda la información sobre un AA, incluida la descripción, tiempo de inicio/parada, grado de los criterios comunes de toxicidad (de acuerdo con CTCAE), gravedad, causalidad (improbable, posible o probable), acción tomada, interrupción y resultados. Las constantes vitales, temperatura corporal, frecuencia cardíaca y la presión arterial en decúbito supino se registraron regularmente durante el periodo de ingreso y en todas las visitas posteriores. Además, los sujetos se controlaron con un ECG telemétrico de 5 derivaciones durante la infusión y a las 24 horas siguientes. Se analizaron muestras de seguridad para química clínica, hematología, coagulación, biomarcadores de seguridad (IL-6, IL-8 y TNFα) e IgG plasmáticas mediante métodos rutinarios en Labmedicin Skåne, Suecia. Se evaluó el análisis de orina (U-glucosa, U-hemoglobina y U-proteína) utilizando Multistix (Siemens, Alemania).

[0244] Muestras de suero para eficacia, farmacocinética y evaluación de anticuerpos anti-IdeS

[0245] Las muestras de sangre previstas para los estudios de eficacia se recogieron en tubos al vacío BD de suero CAT modificados (BD Diagnostics, NJ, EE. UU) con ácido iodoacético 2 mM para evitar una mayor escisión proteolítica por IdeS. Se tomaron muestras de sangre en los siguientes momentos: antes de la dosis, 1 minuto antes del final de la infusión (14 o 29 min), 5 minutos después del final de la infusión (20 o 35 min) y 45 minutos después del final de la infusión (1 h o 1 h y 15 min). Además, se recogieron muestras 2, 6, 24, 48 y 72 horas después del inicio de la infusión, así como los días 7, 14, 21, 28 y 64 después de la infusión. Las muestras de sangre previstas para los estudios farmacocinéticos se recogieron en tubos al vacío BD de suero normales en los siguientes momentos: antes de la dosis, 1 minuto antes del final de la infusión, 5 minutos después del final de la infusión, 45 min después del final de la infusión y 2, 6, 24, 48, 72 y 144 horas después de la dosificación. Las muestras de sangre previstas para el análisis de anticuerpos anti-IdeS se recogieron en recipientes al vació BD de suero normal el día 1 (antes de la dosis), 2 (24 h), 3 (48 h), 4 (72 h), 7 (1 semana), 14, (2 semanas), 21 (3 semanas), 28 (4 semanas) y 64 (2 meses). Fuera del protocolo del estudio, se pidieron a los sujetos muestras de suero opcionales los días 182 (6 meses) y 365 (1 año). Todas las muestras se almacenaron por debajo de -60 °C hasta su análisis.

[0246] Evaluación de eficacia

[0247] La escisión y el procesamiento de IgG por IdeS se investigaron con diferentes métodos; Se utilizaron ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para determinar la presencia de IgG y fragmentos de IgG en el suero e investigar la dinámica de los fragmentos que contienen Fab y Fc. Los ensayos cuantitativos no pudieron diferenciar completamente entre los productos de escisión de IdeS; es decir, F(ab')<2>, Fc e IgG con una sola escisión (scIgG) (en la que una de las cadenas pesadas está escindida). La prueba ELISA desarrollada y realizada por Covance Ltd, RU, midió la IgG inalterada y scIgG. El Fab-ELISA midió todos los fragmentos de IgG que contenían Fab; es decir, IgG inalterada, scIgG y F(ab')<2>y el Fc-ELISA midió todos los fragmentos que contenían Fc; es decir, IgG inalterada, scIgG y Fc libre.

[0248] El ensayo realizado por Covance Ltd, RU, se validó formalmente. En resumen, las muestras de suero se analizaron mediante un ELISA en el que se permitió que la IgG se uniera al anticuerpo receptor, F(ab')<2>de cabra anti-IgG humana (n.º 109-006-097, Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA, EE. UU.). Se utilizó un calibrador cuantificado de proteínas séricas humanas (IgG) (X0908, Dako, Dinamarca) para preparar los patrones y las muestras de calidad. La IgG unida se detectó mediante la adición posterior de un fragmento F(ab')<2>de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa, fragmento Fcγ específico (n.º 109-036-098, Jackson ImmunoResearch Labs) y un sustrato cromogénico (TMB). El límite inferior de cuantificación fue de 5 ng/ml (en 100 % de suero). Los análisis del suero se realizaron en Covance Laboratories Limited (Harrogate, Reino Unido).

[0249] En el ELISA-Fc se utilizó un fragmento F(ab')<2>de cabra anti-IgG humana (fragmento Fcγ específico) (n.º 109-006-098 Jackson ImmunoResearch Labs Inc, PA, EE. UU.) como anticuerpo receptor y un fragmento F(ab')<2>de cabra anti-IgG humana (fragmento Fcγ específico) conjugado con biotina (n.º 109066098 Jackson ImmunoResearch) como detector.

[0250] En el Fab-ELISA se utilizó un fragmento F(ab')<2>de ratón anti-IgG humana purificado por afinidad específico de anticuerpo (n.º 209-005-097 Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA, EE. UU.) como anticuerpo receptor y CaptureSelect IgG-CH1 biotinilado (n.º 710.3120.100 BAC B.V., Naarden, Países Bajos) como detector. Se utilizó un conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante (SA-HRP) (n.º 21126 de Pierce), Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) para la detección secundaria. Se prepararon el calibrador y las muestras de control de calidad (LSC, LIC, H-OC, M-QC y L-QC) a partir de gammaglobulina humana intravenosa IVIg (Octagam<®>). Todas las diluciones se realizaron en PBS BSA al 0,1 % y en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano Nunc MaxiSorp<®>(Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca) se lavaron con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Las muestras de suero y las muestras de control de calidad se analizaron por triplicado. Se utilizó sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (TMBW-1000-01, BioFx Laboratories Inc., MD, EE. UU.) como sustrato cromogénico y la reacción enzimática se detuvo mediante la adición de H<2>SO<4>0,5 M. La absorbancia se midió en un lector de placas ELISA (Multiscan EX, Thermo Electron Corp.) (Programa informático: Ascent Software v.2.6) a λ = 450 nm.

[0251] En la figura 19 se muestra una comparación del Fab-ELISA y un análisis turbidimétrico convencional de IgG en suero. Como se muestra, el ensayo turdidimétrico sólo detecta un pequeño cambio en el nivel de IgG inalterada a lo largo del tiempo después del tratamiento con IdeS, porque no puede discriminar entre F(ab')<2>e IgG inalterada. Por el contrario, el Fab-ELISA muestra una eliminación casi completa y una recuperación de los niveles de IgG en el mismo periodo de tiempo.

[0252] Para evaluar más a fondo los datos cuantitativos del ELISA, las muestras de suero se analizaron también mediante análisis cualitativos SDS-PAGE. Los análisis SDS-PAGE se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.). En resumen, se separaron 0,25 µl de suero en geles prefabricados Mini-PROTEAN<®>TGX<™>al 4-20 % (BioRad) a 200 V durante 40 minutos en condiciones no reducidas. Se utilizaron como marcadores SeeBlue MW convencional (Life Technologies) y una mezcla preparada internamente de IgG humana, scIgG, F(ab')<2>y Fc. Los geles se tiñeron con el reactivo de tinción GelCode Blue (Pierce, Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se escanearon los geles.

[0253] Evaluación farmacocinética

[0254] Se analizaron cuatro péptidos derivados de IdeS, es decir, AFPYLSTK, AIYVTDSDSNASIGMK, GGIFDAVFTR y LFEYFK, en muestras de suero mediante un ensayo LC-MS/MS cualificado (Karlssonet al.2012). Las muestras se prepararon para el análisis MS como se describió anteriormente (Karlssonet al.2012). Las mediciones de control de reacciones seleccionadas (SRM, del inglésselected reaction monitoring) se realizaron en un espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) equipado con una columna PicoChip rellena de Reprosil-PUR C18 (New Objective, MA, EE. UU.) y un sistema Easy-nLC II (Thermo Fisher Scientific). Los datos brutos se procesaron y analizaron con el programa informático de análisis SRM Skyline (MacLeanet al.2010) con validación manual e inspección de los resultados. El volumen de inyección fue de 1 µl, correspondiente a 12,5 nl de suero (es decir, 1 µg de proteína total). Las zonas totales de máximo de péptidos sin normalizar del suero enriquecido con IdeS se utilizaron para usar una curva de regresión lineal (cuantificación de proteínas sin marcador). Las concentraciones de los péptidos individuales en las muestras humanas desconocidas se interpolaron desde la regresión lineal. Se utilizó una mezcla equimolar comercial de péptidos trípticos de 6 proteínas bovinas (6 Bovine Tryptic Digest Equal Molar Mix, Michrom Bioresources) como muestra de control de calidad y se analizó cada 4 a 6 muestras analíticas (Telemanet al.2012).

[0255] Los datos de concentración en suero frente a tiempo se analizaron mediante análisis no compartimental (ANC) en PhoenixTM WinNonlin<®>versión 6.3, compilación 6.2.0.495 (Pharsight<®,>, St. Louis, Missouri, EE. UU.). No se observaron desviaciones importantes (>20 %) entre los tiempos de muestreo y las dosis nominales y reales, para los cálculos del ANC se utilizaron tiempos de muestreo y dosis nominales. El ensayo LC-MS/MS no se validó y no se definió formalmente un límite mínimo de detección (LIC). El valor de corte para los cálculos de FC se fijó en 24 horas después de la dosis para los cuatro péptidos e individuos.

[0256] Evaluación de IgG anti-IdeS

[0257] Thermo Fisher Scientific (Phadia<®>) desarrolló en Uppsala, Suecia, una prueba CAP-FEIA (ImmunoCAP) para la cuantificación de IgG específica anti-IdeS. Las pruebas iniciales indicaron que era posible un intervalo de medición de 3 logaritmos utilizando la prueba y se demostró que el límite de detección (LDD) para la prueba CAP-FEIA específica de IgG IdeS era siete veces inferior al valor de corte bajo sugerido para la prueba (es decir, 2,0 mg/l). Los análisis de las muestras clínicas se realizaron en un instrumento Phadia<®>250 utilizando la prueba con una repetición de acuerdo con el manual del usuario de Phadia<®>250. La prueba estaba prevista únicamente para usar en investigación.

[0258] Eficacia específica de antígeno

[0259] En Hansa Medical AB se desarrolló un ensayo ELISA de grado de investigación para abordar la eficacia específica de antígeno al final del estudio. La respuesta de IgG de los sujetos frente a una vacuna incluida en el calendario de vacunación infantil sueco se utilizó como sustituto de la ausencia de autoantígenos en los sujetos sanos incluidos en el estudio de fase 1. En resumen, la vacuna DTaP-IPV//PRP~T (Pentavac<®>/Pentaxim<®>-Sanofi Pasteur) se diluyó 100 veces en PBS antes de recubrir las placas MaxiSorp (Nunc) a 4 °C. Se utilizó IgG humana normal (IVIg, Octagam<®>) como calibrador y un F(ab')<2>anti-Fc humano conjugado con biotina-SP específico de cabra (Jackson n.º 109-066-098) como detector. Asimismo, se utilizó SA-HRP (Pierce n.º 21126) y las señales se revelaron con sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories n.º TMBW-1000-01), se detuvieron con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron a 450 nm.

[0260] Ensayo funcional in vitro

[0261] Se desarrolló un ensayo de fagocitosis con modificaciones (Ackermanet al., 2011). Se recubrieron perlas de neutravidina fluorescente (n.º F8776, Molecular Probes) durante la noche con CH1 anti-IgG biotinilado (CaptureSelect, n.º 710.3120.100 BAC B.V., Naarden, Países Bajos) a 0,1 mg/ml. El reactivo CaptureSelect es específico para la cadena pesada de IgG humana en el dominio CH1, es decir, esta proteína capturará IgG inalterada, scIgG y fragmentos F(ab')<2>, pero no IgM. Las perlas recubiertas se lavaron y mezclaron con suero diluido 1:100 de los sujetos del estudio y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para permitir que la IgG del suero se uniera a las perlas recubiertas. Se preparó un control mediante la mezcla de las perlas recubiertas con tampón de dilución (PBS con BSA al 0,1 %). Todas las muestras se prepararon por duplicado. Después de la incubación, las perlas cargadas con IgG se lavaron y mezclaron con 75000 células THP-1/muestra y se incubaron en una incubadora de CO<2>a 37 °C durante 1,5 a 3 horas. Después de la incubación, las muestras se fijaron en formalina tamponada con fosfato al 2 % enfriada en hielo y se controló la captación fluorescente en células THP-1 utilizando un citómetro de flujo Accuri C6.

[0262] Análisis estadístico

[0263] Las medias, medianas, desviaciones típicas y análisis estadísticos básicos se realizaron con el programa informático GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA, EE. UU.).

[0264] Resultados

[0265] Descripción del estudio

[0266] Se llevó a cabo un estudio de fase I, el primero en seres humanos, aleatorizado, con doble enmascaramiento, con dosis únicas ascendentes de IdeS después de la aprobación de las autoridades reguladoras y éticas suecas. Los objetivos eran evaluar la seguridad, eficacia, farmacocinética e inmunogenia de IdeS en sujetos humanos sanos después de su administración intravenosa.

[0267] Se incluyeron 29 sujetos sanos, divididos en cuatro grupos de dosis. Los sujetos de cada grupo de dosis se aleatorizaron y recibieron IdeS o placebo. Las infusiones se administraron por vía intravenosa durante 30 minutos a los dos primeros sujetos de cada grupo y durante 15 minutos a los sujetos posteriores. La dosis inicial fue de 0,01 mg/kg de PC (N<IdeS>: 8 y N<Placebo>: 4) y después de la evaluación por el comité de seguimiento de datos, la dosis se aumentó gradualmente a 0,04 mg/kg de PC (N<IdeS>: 4 y N<Placebo>: 2), 0,12 mg/kg de PC (N<IdeS>: 4 y N<Placebo>: 1) y, por último, 0,24 mg/kg de PC (N<IdeS>: 4 y N<Placebo>: 2). Los sujetos se controlaron hasta el día 64 después de la administración de la dosis, con un control más intensivo durante la primera semana. Todos los sujetos eran varones caucásicos con una mediana de edad de 23 años (intervalo: 20 a 41) años, peso 76 (intervalo: 59 a 100) kg con un IMC de 23 (intervalo: 20 a 30) kg/m<2>y no hubo diferencias estadísticamente significativas en los datos demográficos entre los grupos.Evaluación de la seguridad

[0268] Se observó un total de 77 acontecimientos adversos (AA) en 24 de los 29 sujetos, con 39 AA (en 14 sujetos) clasificados como relacionados (es decir, posibles o probables) (Tabla 1.1). Entre estos 39 AA, 35 tenían un grado 1 en los criterios de toxicidad comunes. Cuatro AA fueron de grado 2 y todos ellos procedían de un sujeto (506) que experimentó una probable reacción a la infusión. Los síntomas se resolvieron en los 15 minutos siguientes al tratamiento con antihistamínico (2 mg de Tavegyli.v.) y corticosteroides (8 mg de Betapredi.v.) y no se interrumpió la infusión de IdeS. Ninguno de los AA se consideró grave, cumplieron algún criterio de toxicidad limitante de la dosis, o condujeron a la retirada del fármaco del estudio.

[0269] Entre los 77 AA, el más frecuente fue la nasofaringitis, cefalea y fatiga. Se notificó nasofaringitis en diez de los veinte sujetos que recibieron IdeS y en seis de los nueve que recibieron placebo. Siete sujetos informaron de cefalea en nueve ocasiones (todos con IdeS) mientras que seis sujetos (cinco con IdeS y uno con placebo) informaron de siete incidencias de fatiga.

[0270] No se identificaron cambios clínicamente significativos en la hematología, química clínica o coagulación. Sin embargo, se observó una proteinuria transitoria al cabo de 24 a 48 horas en sujetos a los que se administró una dosis de IdeS que produjo una escisión significativa de IgG (Figura 2). Este pico reflejaba probablemente la eliminación de los productos de escisión de IgG desde la circulación. Dado que la IdeS degrada los anticuerpos IgG, en un principio se temió que los sujetos del estudio tuvieran un mayor riesgo de infección, por lo que se les sometió a pruebas de detección de trastornos hereditarios de inmunoglobulinas, por ejemplo, déficit de IgA, antes de su inclusión en el estudio. Asimismo, se planteó la preocupación de que los sujetos del estudio pudieran ser portadores subclínicos de agentes bacterianos (por ejemplo, neumococos) con un mayor riesgo de infección debido a la reducción de IgG en plasma. Por tanto, los sujetos recibieron profilaxis antibiótica hasta que los niveles en suero de IgG volvieron a ser >4,5 g/l. Todos los sujetos del estudio cumplieron el tratamiento antibiótico y no se observaron signos de aumento de la tasa de infecciones.

[0271] Tabla 1.1 Sumario de acontecimientos adversos notificados para cada sujeto.

[0274]

[0276] Farmacocinética de IdeS

[0277] Las concentraciones de IdeS en suero se midieron mediante un método LC-MS/MS basado en cuatro péptidos derivados de IdeS, y los datos de concentración en suero frente al tiempo se analizaron mediante un análisis no compartimental, Los parámetros farmacocinéticos se calcularon hasta 24 horas después de la administración, ya que las concentraciones restantes estaban en torno o por debajo del intervalo cuantitativo estimado del método.

[0278] De 29 sujetos, nueve recibieron placebo y 20 recibieron IdeS en los grupos de dosis 0,01, 0,04, 0,12 y 0,24 mg/kg de PC. Ninguno de los péptidos analizados pudo detectarse en las muestras previas a la dosis ni en las muestras de los nueve sujetos con placebo. Sin embargo, se pudo detectar IdeS en las muestras de los 20 sujetos a los que se les administró IdeS, confirmando de este modo la dosificación. La concentración de IdeS aumentó con la dosis y el aumento de la concentración en suero un minuto antes del final de la infusión fue proporcional a la dosis (Figura 3A), En sujetos a los que se les administró 0,12 y 0,24 mg/kg de PC, se recogieron un total de 10 muestras de sangre por sujeto hasta 1 semana después de la dosis, La concentración en suero de IdeS podría describirse como una curva de eliminación multifásica en la que la fracción principal de la exposición se eliminó durante las primeras 24 horas después de la dosificación. Durante las primeras 6 horas después de la dosificación, la t½ media fue de 4,1 (±2,6) horas con 0,12 mg/kg de PC y de 4,9 (±2,8) horas con 0,24 mg/kg de PC. La C<máx>fue de 5,0 (±2,5) mg/l a 0,12 mg/kg de PC y de 8,3 (±3,7) mg/l a 0,24 mg/kg de PC (Figura 3B).

[0279] Eficacia y farmacodinámica de IdeS

[0280] La eficacia y farmacodinámica de la escisión de IgG por IdeS se evaluó mediante análisis SDS-PAGE y ELISA de muestras de suero de los sujetos. IdeS escinde la IgG en dos etapas (Ryanet al., 2008; Vindebroet al., 2013). La primera reacción es una escisión muy rápida y eficaz de una de las dos cadenas pesadas que genera una IgG con una sola escisión (scIgG), que tiene inalterada una de las dos cadenas pesadas. La scIgG es un sustrato menos sensible, pero aún funcional, para IdeS, y esta segunda escisión genera fragmentos F(ab')<2>y Fc.

[0281] El análisis SDS-PAGE reveló que IdeS tenía un efecto completo o casi completo en las 6 horas en los 8 sujetos a los que se les administró 0,12 o 0,24 mg/kg de PC, es decir, el grupo de IgG se convirtió en fragmentos F(ab')<2>y Fc (Figura 4A y B). El efecto fue notablemente rápido y el grupo de IgG se convirtió en scIgG ya durante la dosificación (14 min después de iniciar la administración, es decir, 1 min antes de la dosis completa) y el efecto máximo se alcanzó entre 2 y 6 horas después de la dosificación en todos los sujetos. La IgG inalterada recién sintetizada era detectable en el suero dos semanas después de la dosificación y, al cabo de tres semanas, el nivel de IgG inalterada había aumentado aún más y constituía la principal fracción de IgG en el suero. (Figura 4C).

[0282] La dinámica de los fragmentos que contienen Fab y Fc en el suero se analizó utilizando un método ELISA específico para Fab y otro para Fc. Los ELISA no distinguieron completamente entre las diferentes muestras de IgG; es decir, F(ab')<2>, Fc, scIgG e IgG inalterada. El Fab-ELISA midió todos los fragmentos de IgG que contenían Fab; es decir, IgG inalterada, scIgG y F(ab')<2>, y el Fc-ELISA midió todos los fragmentos que contenían Fc; es decir, IgG inalterada, scIgG y Fc libre.

[0283] Los fragmentos F(ab')<2>así como los Fc alcanzaron niveles mínimos entre uno y siete días después de la dosificación, tras lo cual los niveles aumentaron en todos los sujetos debido a la síntesis de IgG inalterada (datos no mostrados). La eliminación de los fragmentos Fc fue algo más rápida que la de los fragmentos F(ab')<2>y las concentraciones estables se alcanzaron ya un día después de la dosificación. La rápida escisión de la IgG humana en F(ab')<2>y Fc detectada por el análisis SDS-PAGE fue confirmada por ELISA (Figura 5), mostrando que de 2 a 6 horas después de la dosificación se alcanzaron concentraciones estables bajas con menos del 5 % de señal restante. Se concluyó que esta señal procedía principalmente de la scIgG. La degradación de IgG en los sujetos humanos se correlacionó bien con las concentraciones de IdeS previamente valoradas necesarias para escindir IgG en muestras de suero de 20 sujetos humanos sanos (Figura 6).

[0284] IdeS y anticuerpos IgG específicos de antígeno

[0285] La mayoría de la población sueca tiene anticuerpos IgG contra los componentes antigénicos de la vacuna DTaP-IPV//PRP~T (Pentavac<®>) (difteria, tétanos, tos ferina, poliomielitis yHaemophilusde tipo b). La vacuna forma parte del calendario sueco de vacunación infantil y la mayoría de las personas han recibido repetidas inyecciones de ésta o de una vacuna similar. Esto se utilizó en un estudio exploratorio en el que se midieron las IgG preexistentes contra estos antígenos. Los resultados mostraron que el efecto de IdeS sobre la IgG específica de antígeno mostraba el mismo patrón que sobre la IgG total en cada individuo. Además, la reaparición de estos anticuerpos IgG específicos de antígeno fue similar a la de la IgG total (Figura 7).

[0286] Tratamiento con IdeS y actividad fagocítica

[0287] Para evaluar la actividad funcional de las IgG restantes después de la dosificación con IdeS, el suero de los sujetos se sometió a un ensayo de fagocitosis. Las IgG de las muestras de suero recogidas antes de la dosis y en diferentes puntos temporales después de la dosis de IdeS se capturaron en perlas fluorescentes, se lavaron y se mezclaron con células efectoras y la fagocitosis se midió como porcentaje de las células efectoras con al menos una perla fagocitada. Como base del ensayo, se utilizaron perlas sin suero para controlar la captación espontánea de perlas vacías mediante las células efectoras. El ensayo de fagocitosis mostró que todos los sujetos a los que se les administró 0,24 mg/kg de PC de IdeS alcanzaron niveles fagocíticos de base 24 horas después de la dosificación (Figura 8A). Además, demostró que las IgG o fragmentos de IgG restantes en el suero de los sujetos tratados con 0,24 mg/kg de PC de IdeS tenían una capacidad fagocítica significativamente disminuida ya en el punto de muestreo de dos horas y que la capacidad fagocítica permaneció reducida durante siete días (Figura 8B).

[0288] IdeS e inmunogenia

[0289] Trabajos anteriores han demostrado que una proporción significativa de la población tiene anticuerpos IgG preformados contra IdeS (Åkessonet al., 2004). Podría presumirse que los individuos con anticuerpos IdeS preformados tienen un mayor riesgo de hipersensibilidad/reacciones de tipo infusión contra IdeS. Por lo tanto, se ha desarrollado una pruebain vitroespecífica para la medición cuantitativa de anticuerpos específicos de IdeS. La prueba es un inmunoensayo enzimático CAP Fluoro (CAP-FEIA / ImmunoCap) y se utilizó para cribar a los sujetos del estudio antes de su inclusión. Los sujetos con valores elevados de anticuerpos IgG (>15 mg/l) fueron excluidos de este estudio. Un grupo de referencia de 130 sujetos humanos fue sometido a la prueba antes del inicio del estudio. Los resultados se muestran en la figura 9A (primera columna). Diez de 130 tenían IgG específica de IdeS por debajo del valor de corte (<2 mg/l). El nivel medio de IgG anti-IdeS fue de 6,1 mg/l (intervalo <2-78 mg/l; n = 130) con el percentil del 80 % en 15 mg/l. Los 78 varones sanos examinados en este estudio tenían IgG detectable contra IdeS antes del tratamiento. Los resultados se muestran en la segunda columna de la figura 9A. La mediana del nivel de IgG anti-IdeS fue de 10,6 mg/l (intervalo de 2,1 a 90,8 mg/l). El 28 % de los individuos analizados tenían valores de IgG anti-IdeS superiores a 15 mg/l y fueron excluidos del estudio.

[0290] La mayoría de los sujetos del estudio respondieron con un aumento de IgG anti-IdeS. La respuesta no era detectable una semana después de la dosificación, pero había alcanzado niveles próximos a los máximos dos semanas después de la dosificación y a continuación disminuyó lentamente (Figura 9B). La mediana del nivel previo a la dosis (todos los sujetos) de IgG anti-IdeS fue de 5,3 mg/l (intervalo: 2,0 a 10,6 mg/l), y en el día 14 el nivel medio de todos los sujetos a los que se les administró IdeS fue de 104 mg/l (intervalo: 3,1 a 1744 mg/l). Dos meses después de la dosificación, los niveles de IgG anti-IdeS habían empezado a disminuir en la mayoría de los individuos y la mediana del nivel de IgG anti-IdeS de todos los sujetos dosificados con IdeS fue de 87,8 mg/l (intervalo: 10,5 a 764 mg/l). Aunque la variación individual en la magnitud de la respuesta de IgG anti-IdeS fue grande, hubo claramente una respuesta más fuerte entre los sujetos que recibieron 0,12 o 0,24 mg/kg de PC de IdeS en comparación con los sujetos que recibieron 0,01 o 0,04 mg/kg (Figura 9C). El día 182, los niveles de IgG anti-IdeS de 19 de los 20 individuos a los que se les administró IdeS estaban dentro del intervalo normal de los sujetos analizados previamente (intervalo <2 a 90,8 mg/l; N = 208) (Figura 9D). Sólo un sujeto seguía teniendo niveles de IgG anti-IdeS ligeramente por encima del intervalo normal en el día 182 (101 mg/l). Este sujeto estaba en el grupo de dosis de 0,01 mg/kg y en el día 365, los niveles de IgG anti-IdeS estaban dentro del intervalo normal para este sujeto (40,5 mg/l). Puede decirse que la respuesta de IgG anti-IdeS es muy similar en cinética y magnitud a la respuesta notificada para otros fármacos proteínicos de origen bacteriano, tales como la estreptocinasa y la estafilocinasa.

[0291] Análisis

[0292] Este primer estudio clínico de su clase demuestra que IdeS convierte la IgG plasmática en IgG con una sola escisión (scIgG) sólo unos minutos después de su administración. Se ha demostrado que la ScIgG tiene funciones efectoras comprometidas con una unión reducida a los receptores de Fcγ y una citotoxicidad mediada por Fc reducida (Brezskiet al., 2009). A pesar de la ausencia de autoanticuerpos patógenos en los sujetos sanos incluidos en el estudio, la IgG normal podría controlarse como biomarcador e IdeS mostró una eficacia impresionante en la escisión de IgG dentro del intervalo de dosis probado. Se observó un efecto total o casi total sobre la IgG total, es decir, la conversión en fragmentos F(ab')<2>y Fc en todos los sujetos a los que se les administró 0,12 y 0,24 mg/kg de PC de IdeS y el fármaco del estudio mostró un perfil de seguridad favorable. Sólo seis horas después de la administración podían detectarse concentraciones bajas de IgG (<5 %) en sangre y las IgG permanecieron persistentemente bajas durante más de una semana hasta que las IgG recién sintetizadas repoblaron el plasma. Estos resultados podrían compararse con los que se obtienen generalmente utilizando, por ejemplo, la plasmaféresis, en la que un solo recambio de volumen plasmático produce una reducción de IgG hasta aproximadamente un 35 % del nivel original y 24 h después de la plasmaféresis los niveles de IgG han aumentado hasta el 60 % debido principalmente al drenaje linfático en el espacio vascular (Ismailet al., 2001).

[0293] Como consecuencia de que IdeS es una proteína bacteriana y la mayoría de los seres humanos han tenido contacto previo conS. pyogenes,todos los sujetos tenían anticuerpos IgG anti-IdeS preformados y reaccionaron como era de esperar con una respuesta de IgG que alcanzó su máximo 2 a 3 semanas después de la infusión de IdeS. La amplitud de la respuesta antifármaco varió sustancialmente entre individuos, aunque se observó un patrón de respuesta a la dosis. De seis a doce meses después de la dosificación, todos los sujetos volvieron a tener niveles de anticuerpos anti-IdeS dentro del intervalo normal (es decir, <2 a 91 mg/l) y teniendo en cuenta los anticuerpos potencialmente neutralizantes y el aspecto de la seguridad, se prevé que el tratamiento con IdeS podría repetirse al cabo de 6 a 12 meses. La prueba CAP FEIA específica de IdeS desarrollada en paralelo con este ensayo clínico podría ser una herramienta valiosa para orientar a los facultativos a la hora de considerar la repetición de la dosis.

[0294] Además de la IgG plasmática total, el estudio investigó el efecto de IdeS sobre un biomarcador específico utilizado como vacuna contra la difteria, tétanos, tosferina, polio yHaemophilusde tipo b dentro del calendario sueco de vacunación infantil. Los resultados mostraron que no había diferencias importantes en la especificidad antigénica con respecto a la eficacia de IdeS sobre la IgG total, y que todos los sujetos habían recuperado totalmente su IgG específica de antígeno en el momento en que se recuperó todo el grupo de IgG.

[0295] El estudio también evaluó la relevancia funcional de la escisión de IgG con IdeS en un ensayo de fagocitosis, donde se espera que la interacción con el receptor de Fcγ desempeñe un papel importante. Este ensayo demostró que ya unas horas después de la administración de IdeS, el efecto fagocítico de IgG/fragmentos de IgG restantes se redujo significativamente en todos los sujetos evaluados, un efecto que se mantuvo siete días después. Los resultados muestran que IdeS tiene la capacidad de inactivar la función efectora mediada por Fcin vivoen seres humanos. En conjunto, los datos aquí presentados demuestran que una dosis única de IdeS es segura, inactiva rápida y eficazmente las IgG en los seres humanos y que el efecto se mantiene durante varias semanas. IdeS solo y/o junto con otros fármacos atenuantes de los linfocitos B (por ejemplo, Rituximab o Bortezumib) es un enfoque terapéutico muy atractivo para muchas afecciones en las que los autoanticuerpos IgG contribuyen a la patología. La naturaleza inmunogénica de IdeS probablemente impide el tratamiento crónico, aunque es posible repetirlo una o dos veces al año. Sin embargo, mediante la aplicación de un enfoque terapéutico juicioso que utilice la alta eficacia de IdeS junto con otros fármacos o tecnologías, tales como la adsorción inmunitaria o la plasmaféresis, debería ser posible mantener niveles en plasma bajos de anticuerpos patógenos durante un periodo de tiempo prolongado.

[0296] La eliminación de IgG por IdeS fue temporal, lo que sugiere que su mejor uso puede ser para afecciones con un curso monofásico, tal como el rechazo del injerto mediado por anticuerpos. Esto se está investigando actualmente en un estudio de fase II con IdeS.

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[0328] Ejemplo 2

[0329] Introducción

[0330] El trasplante en presencia de anticuerpos específicos del donante (AED) corre el riesgo de provocar un rechazo hiperagudo mediado por anticuerpos con pérdida aguda del aloinjerto. El estudio del ejemplo 1 demuestra que IdeS es seguro y bien tolerado hasta 0,24 mg/kg de PC. A esta dosis, IdeS escindió completamente el grupo de IgG en plasma en los 14 minutos siguientes al inicio de la infusión. El nivel de IgG inalterada se redujo a menos del 5 % de su nivel original. Los datos indicaron claramente que una dosis única de IdeS es superior tanto a la plasmaféresis como a la inmunoadsorción con respecto a la eficacia y la tasa de reducción de IgG en plasma.

[0331] Por lo tanto, el tratamiento con IdeS de pacientes renales sensibilizados justo antes del trasplante debería escindir rápida y eficazmente la IgG en fragmentos F(ab')<2>y Fc, reduciendo de este modo los niveles en suero de AED citotóxicos a un nivel que permita el trasplante de donante vivo y fallecido (DV y DF). Los fragmentos F(ab')<2>específicos del donante que siguen en circulación en el momento del trasplante también pueden impedir la unión de, por ejemplo, IgM de baja afinidad o IgG residual al trasplante, protegiendo de este modo al órgano del rechazo. El objetivo de este estudio era investigar si el tratamiento con una dosis clínicamente relevante de IdeS puede convertir una prueba de compatibilidad cruzada positiva en negativa utilizando suero de pacientes sensibilizados e investigar la correlación entre la reducción de los niveles de IgG total y de IgG específica de las clases I y II de HLA.

[0332] Material y métodos

[0333] Muestras de suero

[0334] A los pacientes investigados se les diagnosticó una IRC en estadio 5 y estaban en lista de espera para un trasplante renal. Todos los pacientes estaban sensibilizados y eran positivos para anti-HLA. Los pacientes fueron reclutados por el prof. H. Ekberg en la Unidad de Trasplantes, Departamento de Nefrología y Trasplantes, Hospital Universitario de Skåne en Malmö, Suecia y el prof. G. Tufveson del dpto. de Cirugía de Trasplantes, Hospital Universitario de Uppsala, Uppsala, Suecia. Los pacientes recibieron información escrita y firmaron el consentimiento informado antes de iniciar cualquier procedimiento relacionado con el estudio. El suero se aisló de 10 ml de sangre venosa de acuerdo con el procedimiento hospitalario. Para garantizar la confidencialidad, el investigador principal impidió que los investigadores conocieran la identidad de los pacientes asignando un número de identificación (PXX) a las muestras de suero. Las muestras se enviaron a la División de Inmunología Clínica del Hospital Universitario de Uppsala para su almacenamiento y una fracción de cada suero se envió a continuación a Hansa Medical AB en Lund para los análisis relacionados con IdeS.

[0335] Escisión de IdeS en suero de pacientes

[0336] Los sueros (100 µl) de cinco pacientes (P02, P04, P07, P08 y P09) se trataron con IdeS (lote BX1001865; 9,9 g/l). Se preparó una disolución de partida de IdeS a 6 g/l en PBS/BSA al 0,1 %. Se añadieron 100 µl de suero a 12 µl de HCl 0,1 M para ajustar el pH del suero a un nivel fisiológico (pH 7,4) y, a continuación, se añadieron 2,4 µl de la disolución de partida de IdeS (6 g/l) para alcanzar una concentración final de 125 µg/ml de IdeS en 115 µl. Todas las preparaciones se hicieron en hielo. La escisión se realizó a 37 °C (Thermomixer; Eppendorf) durante 2 horas y se detuvo poniendo las muestras en el congelador (-20 °C) hasta análisis posteriores. Las muestras de control de cada paciente se trataron de forma idéntica con tampón de dilución (PBS/BSA al 0,1 %) en lugar de IdeS.

[0337] Cuantificación de IgG humana

[0338] Las muestras de suero se enviaron al Departamento de Química Clínica del Hospital Universitario de Skåne en Lund, Suecia, para la determinación de las concentraciones totales de IgG. Las muestras de suero humano tratadas con IdeS se analizaron en busca de IgG inalterada mediante un ensayo ELISA desarrollado por Hansa Medical AB. Las placas ELISA MaxiSorp de 96 pocillos se recubrieron con tampón de carbonato (pH 9,6) durante la noche a 4-8 °C con 100 ng/pocillo de fragmento F(ab')<2>antihumano de cabra de AffiniPure, específico del fragmento F(ab')<2>(Jackson n.º 109-006-097). Las placas se lavaron con PBS+Tween20 (0,05 %) y se bloquearon con PBS+BSA al 2 % durante una hora a temperatura ambiente. Los calibradores y las muestras se diluyeron en PBS+BSA al 0,1 % (tampón de dilución). Después de lavar los calibradores diluidos (M-l, suero de un voluntario sano; 11,2 g/l), las muestras de suero se añadieron a la placa y se dejaron incubar durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y se añadieron 50 µl de fragmento de F(ab')<2>de cabra anti-IgG humana de biotina-SP-AffiniPure, específico de fragmento Fcγ (Jackson n.º 109-066-098) diluido 1:20000, en tampón de dilución, y se incubó durante 30 minutos. Después de otro lavado, se añadieron 50 µl de SA-HRP (Pierce n.º 21126) diluido 1:40000 en tampón de dilución y después de 30 minutos de incubación se lavó la placa y se desarrolló la reacción con TMB (BioFX Laboratories n.º TMBW-1000-01), se detuvo con H<2>SO<4>0,5 M y se leyó a λ = 450 nm. Los calibradores formaron una curva con un ajuste logístico de cuatro parámetros (y = b (a-b)/(1+xc)^d) dentro del intervalo analizado y para las cuantificaciones se utilizaron preferentemente diluciones de muestras que produjeron valores de DO lo más próximos posible al valor CI<50>de la curva convencional.

[0339] Evaluación de la eficacia e inmunogenia del IdeS

[0340] El ensayo ELISA para la eficacia de IdeS se realizó como en el ejemplo 1, como el ensayo CAP FEIA (ImmunoCap) para las respuestas de anticuerpos específicos IdeS. Los resultados se utilizaron sólo con fines comparativos con los resultados comunicados en el ejemplo 1 y no se muestran.

[0341] Análisis de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y de perlas de antígeno único (PAU) (Luminex)Se analizaron los sueros tratados con IdeS y placebo para detectar anticuerpos IgG anti-HLA mediante análisis PAU frente a un grupo de antígenos MHC de clase I y II (LABScreen Single Antigen, One Lambda). También se analizaron los sueros y se puntuó su reactividad en una prueba de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en linfocitos T y B de 23 donantes. Los linfocitos T y B se enriquecieron utilizando perlas magnéticas CD8 y MHC de clase II (Dynal), respectivamente. Los análisis PAU y CDC se realizaron utilizando métodos validados en un entorno clínico por el Dr. Mats Bengtsson en la División de Inmunología Clínica, Departamento de Oncología, Radiología e Inmunología Clínica, Laboratorio Rudbeck, University Hospital, Uppsala, Suecia. Las reacciones de CDC se puntuaron de acuerdo con el procedimiento del International Workshop (Fulleret al.,1982).

[0342] Pruebas de compatibilidad cruzada linfocitotóxica dependiente del complemento (CDC-CXM)

[0343] Los esplenocitos se prepararon a partir de ratones Balb/c mediante separación de Ficoll. Las células se lavaron en PBS (×2) y se resuspendieron a 2 × 10<6>células/ml en DMEM:F12 (Difco) con BSA al 0,1 % inactivada por calor. Las muestras de suero se trataron con DTT para inactivar la IgM mediante la mezcla de 45 µl de suero con 5 µl de DTT 50 mM y la incubación durante 30 a 45 minutos a 37 °C. La prueba CXM se realizó mediante la adición de 1 µl de suspensión celular (es decir, 2000 células) y 1 µl de muestra (es decir, suero o controles) a una placa Terasaki de 60 pocillos (Nunc). Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió complemento de conejo bebé (5 µl) (Cedarlane) y la mezcla se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadió FluoroQuench AO/EB Stain Quench (5 µl) (One Lambda inc.) a cada pocillo y se incubó la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. La citotoxicidad se puntuó (puntuación 1 a 8) y se documentó con microscopía de fluorescencia.

[0344] Procesamiento de datos

[0345] Los gráficos se construyeron utilizando GraphPad Prism versión 5.0d para Mac OS X, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com.

[0346] Resultados y análisis

[0347] Tratamiento con IdeS de sueros de pacientes

[0348] Se recogió suero de doce patentes sensibilizadas con IRC en estadio 5 en espera de trasplante renal. Se valoró la dosis de IdeS en cada suero para determinar la eficacia del tratamiento con IdeS y se pudo concluir que IdeS escinde eficazmente la IgG en todos los sueros de los pacientes en el intervalo de concentración probado, aunque había diferencias individuales en la concentración mínima de IdeS necesaria para alcanzar el efecto máximo (Figura 10). Se analizaron los niveles totales de IgG en el suero de los pacientes y se comprobó que estaban dentro de los intervalos normales (mediana: 9,3 g/l; intervalo 6,5 a 16,2 g/l). Asimismo, se determinaron los niveles de anti-IdeS mediante el análisis IdeS-ImmunoCAP y los 12 sueros contenían niveles bajos (mediana: 4,5 mg/l; intervalo <2 a 14,8 mg/l) de IgG anti-IdeS (HMed Doc. N.º: 2012-041). No hubo una correlación clara entre los niveles individuales de anti-IdeS o los niveles de IgG total y la eficacia de IdeS. Se seleccionaron cinco sueros representativos; es decir, P02, P04, P07, P08 y P09, para análisis posteriores de anticuerpos anti-HLA.

[0349] Los sueros se trataron con IdeS o placebo (PBS) durante dos horas a 37 °C y se analizaron para determinar las IgG restantes mediante el ELISA descrito. Como comparación, se realizó una inmunoadsorción exhaustiva con sefarosa de proteína A y se analizaron las IgG restantes en paralelo a las muestras tratadas con IdeS. Los resultados demostraron que el tratamiento con IdeS redujo el nivel de IgG de 7,5-15,9 g/l a 0,17-0,4 g/l (tabla 2.1). La inmunoadsorción fue en general menos eficaz con 0,18 a 1,5 g/l de IgG restante.

[0350] Tabla 2.1 Sueros de cinco pacientes (P02, P04, P07, P08 y P09) tratados con IdeS, PBS o sometidos a inmunoadsorción (IA). IgG en g/l.

[0353]

[0355] Estos resultados deben compararse con los obtenidos generalmente utilizando, por ejemplo, la plasmaféresis, en la que un solo intercambio de volumen de plasma produce una reducción de IgG a aproximadamente un 35 % del nivel original y 24 h después del intercambio de plasma los niveles de IgG han aumentado al 60 % debido principalmente al drenaje linfático en el espacio vascular (Ismailet al.,2001). Incluso ciclos repetidos de plasmaféresis, de hasta cinco, dan lugar a niveles de IgG oscilantes entre el 10 % al final del procedimiento y el 20 a 25 % antes del siguiente procedimiento. Los estudios preclínicos descritos en el ejemplo 1 demostraron que una única inyección intravenosa de IdeS en conejos produce una reducción rápida (en 1 h) de la IgG inalterada hasta el 2 a 3 % del nivel original y que el nivel de IgG permanece bajo durante varios días después del tratamiento. Se obtuvieron resultados similares en el ensayo clínico de fase I descrito en el ejemplo 1 después de administrar IdeS a sujetos humanos sanos. El grupo de IgG plasmática se convirtió completamente en scIgG ya durante la administración de 0,24 mg/kg de PC de IdeS (14 minutos después del inicio de la infusión) y dos horas después de la dosificación al grupo de IgG se había convertido además en F(ab')<2>y Fc. Los datos mostraron que los niveles correspondientes a <5 % de los niveles originales, la mayoría de los cuales consistían en scIgG, se podían alcanzar ya entre 2 y 6 horas después de la dosificación y que pasaron varios días antes de que el nivel empezara a aumentar gradualmente.

[0356] Análisis de CDC

[0357] El suero tratado con IdeS y placebo de los pacientes P02, P04, P07, P08 y P09 se sometió a una prueba de detección de suero por CDC frente a un grupo de linfocitos T (es decir, células enriquecidas para CD8+) y linfocitos B (es decir, células enriquecidas para MHC de clase-II+) de donantes seleccionados y bien caracterizados. Los resultados, presentados en las tablas 2.2 y 2.3 (véase también el sumario de los resultados de pacientes individuales, más abajo), demostraron claramente que el tratamiento con IdeS tenía la capacidad de anular por completo la citotoxicidad dependiente del complemento mediada por suero que contenía IgG específica del donante. En la prueba con linfocitos T, que abordaba principalmente los anticuerpos anti-MHC de clase I, el tratamiento con IdeS podría desensibilizar completamente a los pacientes P02, P04, P07 y P09 y mejorar significativamente el grado de sensibilización del paciente P08 (tabla 2.2). En la prueba con linfocitos B, que abordaba los anticuerpos anti-MHC de clase I y de clase II, el tratamiento con IdeS mejoró el grado de sensibilización de todos los pacientes (tabla 2.3). Se pudo concluir que el tratamiento con IdeS redujo claramente la reactividad del CDC frente a posibles donantes, aumentando de este modo las posibilidades de encontrar un donante adecuado para todos los pacientes analizados. De los datos presentados aquí también se desprende claramente que el tratamiento con IdeS tiene la capacidad de convertir una prueba cruzada positiva previa al trasplante en negativa, haciendo de este modo que un paciente sensibilizado pueda ser trasplantado.

[0358] Análisis anti-HLA

[0359] Para verificar que la reducción de IgG total después del tratamiento con IdeS se reflejaba en una reducción de los niveles de anticuerpos anti-HLA en los sueros de los pacientes sensibilizados, las muestras tratadas con IdeS o placebo se sometieron a análisis PAU. La disposición incluía 188 variantes alélicas de MHC, entre ellas 97 antígenos de MHC de clase I (HLA-A, -B y -C) y 91 de MHC de clase II (HLA-DP, -DQ, and –DR. Los resultados confirmaron que el tratamiento con IdeS podía reducir los niveles de IgG anti-HLA en el suero de los pacientes sensibilizados y se pudo concluir que la reactividad del suero de todos los pacientes analizados frente a moléculas MHC individuales de clase I y clase II se redujo significativamente después del tratamiento con IdeS (Figuras 11 a 15 y apéndices I y II). A menudo se utiliza un umbral con una IMF (bruta) >1000 (a veces >2000) como valor de corte para una reactividad significativa frente a un antígeno HLA específico cuando se considera el trasplante de un paciente sensibilizado. El tratamiento con IdeS pudo reducir claramente el número de antígenos HLA por encima de estos umbrales en todos los pacientes analizados, tanto en MHC de clase I como de clase II (tablas 2.4 y 2.5; Apéndice I a II).

[0360] El tratamiento con IdeS tiene la capacidad de convertir un CXM positivo en negativo

[0361] Los anticuerpos de origen natural contra estructuras [Gal α-1,3-Gal] (anticuerpos anti-Gal) son los principales efectores del rechazo hiperagudo (RHA) humano del tejido no humano. A diferencia de la mayoría de los mamíferos, los seres humanos carecen de un gen α-1,3-galactosiltransferasa (GalT) funcional y producen abundantes anticuerpos anti-Gal, supuestamente en respuesta a bacterias entéricas GalT+ (Dinget al.,2008 y Pierson 2009). El objetivo era investigar si la reactividad anti-Gal de primates frente a la de no primates se puede explotar como pseudo marcador para analizar el efecto de IdeS utilizando muestras de suero clínico del estudio de fase I del ejemplo 1.

[0362] El nivel de IgG se midió en muestras de suero consecutivas recogidas antes y después de la dosificación de 0,24 mg/kg de IdeS a sujetos humanos sanos utilizando un ELISA PD validado (tabla 2.6). Los datos demostraron que había aproximadamente una disminución de 10 veces en IgG dos horas después de la dosificación y una disminución de 20 veces 24 horas después de la dosificación de IdeS. El ELISA-PD no discrimina entre IgG inalteradas totalmente funcionales y scIgG con una función Fc-efectora atenuada. Los análisis SDS-PAGE indicaron que scIgG constituía la fracción dominante de las IgG restantes en estos sueros, lo que sugiere que el nivel de IgG totalmente funcional es bajo ya minutos después del tratamiento con IdeS (Véase el ejemplo 1).

[0364] Tabla 2.2. Prueba de detección de sueros de pacientes sensibilizados (P02, P04, P07, P08 y P09) tratados con IdeS o placebo (PBS) frente a linfocitos T de un grupo de donantes (N = 23). La reactividad se calificó mediante la asignación de un número del 1 al 8, donde 1 corresponde al 0%de citotoxicidad y 8 corresponde a >80%de citotoxicidad.

[0366]

[0369] Tabla 2.3. Prueba de detección de sueros de pacientes sensibilizados (P02, P04, P07, P08 y P09) tratados con IdeS o placebo (PBS) frente a linfocitos B de un grupo de donantes (N = 23). La reactividad se calificó mediante la asignación de un número del 1 al 8, donde 1 corresponde al 0%de citotoxicidad y 8 corresponde a >80%de citotoxicidad.

[0371]

[0372] continuación

[0374]

[0376] Tabla 2.4. Análisis PAU frente a 31 antígenos HLA-A, 50 HLA-B y 16 HLA-C. En la tabla se muestra el número de antígenos que tiene una IMF (Sin procesar) superior a 1000 o superior a 2000 en cada paciente antes y después del tratamiento con IdeS. Pacientes P02, P04, P07, P08 e P09.

[0379]

[0381] Tabla 2.5. Análisis PAU frente a 26 antígenos HLA-DP, 29 HLA-DQ y 36 HLA-DR. En la tabla se muestra el número de antígenos que tiene una IMF (Sin procesar) superior a 1000 o superior a 2000 en cada paciente antes y después del tratamiento con IdeS. Pacientes P02, P04, P07, P08 e P09.

[0384]

[0385] <continuación>

[0388]

[0391] Tabla 2.6. Nivel de IgG medido en muestras de suero de sujetos sanos dosificados con placebo (503) o IdeS (504-506 mediante un PD-ELISA validado ue mide la I G inalterada más scI G .

[0394]

[0397] Para investigar si las muestras de suero humano contenían IgG que se unen a antígenos murinos (por ejemplo, antigal), se tiñeron células de bazo de ratón para análisis FACS con muestras consecutivas de suero sin diluir recogidas antes y en diferentes puntos temporales después de la dosificación de 0,24 mg/kg de IdeS en sujetos humanos sanos. La unión de la IgG a las células se detectó utilizando un reactivo específico de hFcγ. Los datos demostraron un claro cambio 24 horas después del tratamiento con IdeS que se mantuvo hasta 96 horas después del tratamiento (gráfico representativo en la figura 16) coherente con la reducción demostrada de IgG total. Los productos de escisión, es decir, los fragmentos F(ab')<2>y Fcγ, tienen una rápida eliminación de la circulación y alcanzan concentraciones estables bajas 1 a 2 días después del tratamiento con IdeS (Véase el ejemplo 1). En consecuencia, se esperaba que la competencia entre las IgG potencialmente inalteradas y los fragmentos F(ab')<2>para unirse a los antígenos diana fuera insignificante en este ensayo. Se concluyó que las muestras previas a la dosis recogidas en el ensayo de fase I contienen IgG que se unen a las células de ratón y que el tratamiento con IdeS redujo esta reactividad.

[0399] Se ha demostrado que el suero humano contiene reactividad contra los antígenos Gal que resulta de la fijación del complemento por IgG e IgM (Pierson, 2009). Esto se confirmó mediante la demostración de que el suero humano reaccionaba fuertemente en una prueba de compatibilidad cruzada dependiente del complemento (CDC-CXM) (prueba de Terasaki) frente a células del bazo de ratón (Balb/c) (Datos no mostrados). Dado que IdeS es muy específico para IgG, todas las muestras se trataron con DTT para inactivar la IgM presente en los sueros analizados. Muestras de suero consecutivas recogidas antes de la dosificación, dos horas después de la dosificación y 24 horas después de la dosificación de tres sujetos sanos (504, 505 y 506) a los que se les administró 0,24 mg/kg de PC se probaron en un CDC-CXM frente a células del bazo de ratón Balb/c. Todas las muestras previas a la dosis reaccionaron fuertemente (Puntuación 8), mientras que las muestras recogidas a las 2 y 24 horas después del tratamiento con IdeS fueron completamente negativas (Puntuación 1) (tabla 2.7 y figura 17).

[0402]

[0405] En conjunto, se concluyó que el tratamiento con IdeS puede reducir el nivel en suero de IgG específicas con capacidad de unirse a dianas de la superficie de células murinas y que este efecto se mantiene durante varios días después del tratamiento con IdeS. El hecho de que las IgG no se recuperaran ya en el primer o los primeros días tras el tratamiento con IdeS indicaba claramente que IdeS no sólo escindía las IgG plasmáticas, sino también las IgG localizadas dentro del sistema vascular, es decir, en el líquido intersticial. Asimismo, el suero recogido dos y 24 horas después del tratamiento con IdeS de sujetos tratados con 0,24 mg/kg de IdeS no pudo mediar citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) frente a células diana de ratón, demostrando claramente que IdeS puede convertir un resultado CMX positivo en negativo.

[0406] Sumario de los resultados de cada paciente

[0407] Paciente P02

[0408] El suero del paciente P02 demostró reactividad CDC frente a linfocitos T de 4 donantes y el tratamiento con IdeS pudo neutralizar completamente esta reactividad (Puntuación: 1) (tabla 2.2). Además, el suero antes del tratamiento reaccionó frente a 16 de los 23 donantes de linfocitos B y después del tratamiento, la reactividad (reducida) permaneció frente a sólo dos donantes (tabla 2.3) mientras que los restantes fueron negativos (Puntuación: 1). Los análisis PAU demostraron que antes del tratamiento con IdeS el suero del paciente tenía reactividad (es decir, IMF >1000) frente a antígenos HLA-A, -B y -C, así como frente a antígenos HLA-DP, -DQ y -DR (tablas 2.4 y 2.5; figura 11). El tratamiento con IdeS redujo la reactividad frente a todos los antígenos y muy pocos (es decir, dos antígenos HLA-DR) tenían una reactividad superior a la IMF: 1000 (no estaban por encima de la IMF: 2000) (tablas 2.4 y 2.5; figura 11). La conclusión general es que IdeS puede acercarse a desensibilizar completamente el suero del paciente P02.

[0409] Paciente P04

[0410] El suero del paciente P04 reaccionó frente a cinco donantes en la prueba de CDC de linfocitos T y el tratamiento con IdeS pudo neutralizar completamente esta reactividad (es decir, puntuación: 1) (tabla 2.2). Los análisis PAU del MHC clase I demostraron una fuerte reactividad principalmente frente a los antígenos HLA-B, pero también frente a algunos antígenos HLA-A y HLA-C (tabla 2.4; figura 12). Después del tratamiento con IdeS se mantuvo una reactividad reducida pero significativa frente a algunos antígenos HLA-B. Cabe destacar que el donante PC:17 tiene el genotipo HLA-B*35:01 y el suero de P04 reaccionó fuertemente en el ensayo de CDC frente a este donante (tabla 2.3). Además, en el ensayo PAU, el suero reaccionó fuertemente frente al antígeno HLA-B*35:01 (IMF: 21463) (Apéndice I). Sin embargo, el tratamiento con IdeS neutralizó por completo la reactividad frente al donante PC:17 (desde una puntuación de 8 a 1) aunque la reactividad frente al antígeno HLA-B*35:01 en el ensayo PAU seguía siendo una de las más elevadas (IMF: 2517).

[0411] En la prueba de CDC de linfocitos B, el suero reaccionó fuertemente (es decir, puntuación: 8) frente a 8 de los 23 donantes probados y el tratamiento con IdeS redujo la reactividad frente a todos estos donantes (tabla 3). El suero del paciente P04 fue positivo en la prueba PAU frente a los antígenos HLA-DQ y HLA-DR (tabla 2.5; figura 12). Sin embargo, el tratamiento con IdeS fue muy eficaz y después del tratamiento solo dos de los antígenos HLA-DR analizados tuvieron una reactividad significativa. La conclusión general es que el tratamiento con IdeS es muy eficaz para reducir la reactividad anti-HLA en el suero del paciente P04.

[0412] Paciente P07

[0413] El suero del paciente P07 tenía una amplia reactividad en la prueba de CDC y demostró una fuerte reactividad (es decir, puntuación CDC: 8) frente a 15 de los 23 donantes analizados en la prueba de CDC con linfocitos T. El tratamiento con IdeS neutralizó por completo (es decir, puntuación: 1) la reactividad frente al conjunto de estos 15 donantes (tabla 2.2). Los análisis PAU de MHC de clase-I demostraron una fuerte reactividad frente a 34 de los antígenos HLA-B probados, sin reactividad frente a los antígenos HLA-A o -C (tabla 2.5; figura 13 y apéndice I). Después del tratamiento con IdeS, ningún antígeno MHC de clase I tenía una señal significativa, es decir, las IMF medidas eran todas inferiores a 1000.

[0414] En la prueba de CDC con linfocitos B, el suero reaccionó fuertemente (es decir, puntuación CDC: 8) frente a 16 de los 23 donantes examinados y, con una excepción (donante PC: 19), fueron los mismos donantes que resultaron fuertemente positivos en CDC con linfocitos T (tablas 2.2 y 2.3). Esto indica que la mayor parte de la reactividad podría atribuirse a la reactividad del MHC de clase I, ya que los linfocitos B son tanto de clase I como de clase II positivas. Curiosamente, aunque IdeS redujo la puntuación frente a la mayoría de los donantes analizados, IdeS no fue tan eficaz como en CDC con linfocitos T correspondiente. Hubo dos donantes (PC:20 y PC:21) en los que IdeS neutralizó completamente la puntuación en CDC con linfocitos T, pero no tuvo ningún efecto en CDC con linfocitos B. La posible explicación podría ser, por ejemplo, valores muy elevados frente a antígenos de clase II o que este paciente tenga valores significativos de anticuerpos IgM frente a antígenos de clase II. Sin embargo, el análisis PAU demuestra claramente que el paciente no tiene anticuerpos contra HLA-DP o -DQ (tabla 2.5; figura 13 y apéndice-II). El paciente tiene una reactividad de baja a intermedia (es decir, IMF de 1200 a 6500) frente a 13 de los antígenos HLA-DR analizados y esta reactividad se neutraliza completamente con el tratamiento con IdeS (IMF <160). En consecuencia, es difícil explicar la reactividad restante en la prueba con linfocitos B por valores elevados frente a antígenos de clase II. Los dos donantes (PC:20 y PC:21) en los que el tratamiento con IdeS tuvo pleno efecto en CDC con linfocitos T, pero ningún efecto en CDC con linfocitos B, son portadores de los siguientes alelos de HLA-DR; PC:20 - DRB1*11:01, DBR3*02:02 y PC:21 - DRB1*01:01, DBR1*16:01:01, DRB5*0202. Todos estos antígenos están presentes en la matriz PAU. El suero del paciente P07 reacciona con reactividad intermedia contra DRB1*11:01 (IMF: 4552) y débilmente contra DBR3*02:02 (IMF: 1203), pero después del tratamiento con IdeS la señal es inferior a 100 para ambos antígenos. El suero no presenta reactividad frente a DRB1*01:01, DRB1*16:01:01 o DRB5*0202 ni antes ni después del tratamiento con IdeS. La conclusión es que la IgG contra los antígenos MHC de clase II no puede explicar la falta de efecto en CDC con linfocitos B utilizando estos donantes y es tentador especular que la IgM podría estar implicada. La conclusión general es que el IdeS es muy eficaz para reducir los niveles de anticuerpos anti-HLA en el suero del paciente P07.

[0415] Paciente P08

[0416] El suero del paciente P08 es altamente reactivo contra todos los donantes analizados en las pruebas de CDC con linfocitos T y B (tabla 2.2 y 2.3). En la prueba con linfocitos T hay 14 donantes en los que IdeS puede neutralizar completamente la reactividad y 6 donantes en los que IdeS no tiene ningún efecto medible. En la prueba con linfocitos B hay 5 donantes en los que IdeS puede neutralizar completamente la reactividad y, dado que IdeS también tiene plena actividad en la prueba con linfocitos T utilizando los mismos donantes, es tentador atribuir esta reactividad a que es meramente reactividad de MHC de clase I. Hay una serie de donantes en los que IdeS no tiene efecto ni en las pruebas con linfocitos T ni en con linfocitos B o en los que IdeS sólo tiene un efecto parcial en estas pruebas. Sin embargo, también hay 3 donantes (PC:14, PC:16 y PC:20) en los que IdeS tiene pleno efecto en la prueba con linfocitos T y ningún efecto medible en la prueba con linfocitos B.

[0417] Los análisis PAU demuestran claramente que el paciente P08 tiene anticuerpos contra HLA-A, -B y -C, así como contra HLA-DP, -DQ y -DR. Antes del tratamiento con IdeS, el suero tiene la reactividad más amplia entre los sueros analizados (tablas 2.4 y 2.5; figura 14). Además, los análisis PAU indican que el paciente tiene los valores más elevados de anticuerpos anti-HLA (Figura 15 y apéndices I y II) entre los pacientes analizados. IdeS puede reducir claramente los niveles de anticuerpos MHC de clase I y clase II, aunque la reactividad sigue siendo significativa (es decir, IMF >1000) frente a una proporción bastante elevada de antígenos HLA-DQ y -DR después del tratamiento. Cabe destacar que IdeS fue menos eficaz en el suero P08 cuando se midió la IgG total restante (0,4 g/l) y esto se refleja naturalmente en el nivel de anticuerpos anti-HLA restantes.

[0418] Paciente P09

[0419] El suero del paciente P09 tenía una fuerte reactividad CDC (es decir, puntuación CDC: 8) frente a linfocitos T de 7 donantes y el tratamiento con IdeS pudo neutralizar completamente esta reactividad (tabla 2.2). Además, el suero reaccionó frente a 22 de los 23 donantes de linfocitos B y después del tratamiento, la reactividad (reducida) se mantuvo frente a 6 donantes (tabla 2.3). Los análisis PAU demostraron que antes del tratamiento con IdeS el suero del paciente tenía reactividad (es decir, IMF >1000) principalmente frente a los antígenos HLA-A, así como frente a los antígenos HLA-DQ y -DR (tablas 2.4 y 2.5; figura 15). IdeS redujo la reactividad frente a todos los antígenos y sólo unos pocos antígenos HLA-DQ tenían una reactividad superior a la IMF: 1000 después del tratamiento. La conclusión general es que IdeS puede acercarse a desensibilizar completamente el suero del paciente P09.

[0420] Conclusiones

[0421] El tratamiento de sueros de pacientes sensibilizados que padecen IRC en estadio 5 utilizando una dosis clínicamente relevante de IdeS pudo reducir rápida y sustancialmente el nivel de IgG total. Asimismo, esta actividad se reflejó directamente en una reducción de los niveles de IgG anti-HLA específica y/o de reacción amplia en el suero de estos pacientes. Los análisis PAU demostraron claramente que el tratamiento con IdeS redujo el nivel de anticuerpos IgG frente a todos los antígenos MHC que dieron positivo en el suero de todos los pacientes analizados. En la mayoría de los casos, la reactividad a antígenos MHC individuales después del tratamiento con IdeS fue inferior a la IMF principal, es decir, por debajo de 1000. En CDC-CXM frente a linfocitos T y B de donantes hipotéticos, IdeS pudo reducir la reactividad en todas las muestras de suero de pacientes analizadas y tuvo la capacidad de convertir una prueba cruzada positiva en negativa. Asimismo, el suero recogido de sujetos sanos antes del tratamiento con 0,24 mg/kg de IdeS reaccionó fuertemente en CDC-CXM frente a las células diana de ratón, mientras que el suero recogido dos y 24 horas después del tratamiento con IdeS fue negativo, lo que demuestra aún más que el tratamiento con IdeS tiene la capacidad de convertir un CXM positivo en negativo. En conjunto, los datos presentados en el presente documento muestran claramente que el tratamiento con IdeS justo antes del trasplante tiene el potencial de desensibilizar a un paciente altamente sensibilizado, permitiendo de este modo el trasplante y evitando un rechazo agudo mediado por anticuerpos.

[0422] Ejemplo 2 - Apéndice I - IMF de datos sin procesar - antígenos MHC de clase I

[0423] Tabla A. IMF (Sin procesar) frente a antígenos HLA-A individuales medidos mediante el ensayo PAU.

[0425]

[0426] Tabla B. IMF (Sin procesar) frente a antígenos HLA-B individuales medidos mediante el ensayo PAU.

[0428]

[0429] Tabla C. IMF (Sin procesar) frente a antígenos HLA-C individuales medidos mediante el ensayo PAU.

[0432]

[0434] Ejemplo 2 - Apéndice II - IMF de datos sin procesar - antígenos MHC de clase II

[0435] Tabla D. IMF (Sin procesar) frente a antígenos HLA-DP individuales medidos mediante el ensayo PAU.

[0438]

[0439] Tabla E. IMF (Sin procesar) frente a antígenos HLA-DQ individuales medidos mediante el ensayo PAU.

[0441]

[0442] Tabla F. IMF (Sin procesar) frente a antígenos HLA-DR individuales medidos mediante el ensayo PAU.

[0445]

[0448] Bibliografía

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[0460] Ejemplo 3

[0461] Introducción

[0462] Como se demuestra en los ejemplos 1 y 2, IdeS escinde rápidamente todas las IgG en plasma después de su administración intravenosa a sujetos humanos. Los siguientes datosin vitroyex vivomuestran que IdeS no sólo escinde IgG soluble como se ha demostrado anteriormente, sino que también corta la parte F(ab')<2>del complejo receptor de linfocitos B de los linfocitos B positivos para IgG de superficie. El truncamiento del RLB a través de IdeS tiene fuertes efectos inhibidor sobre la inducción de IgG secretada a partir de linfocitos B de memoria positivos para CD27 activados por R848 e IL-2, mientras que la secreción de IgM de las células RLB de superficie positivas para IgM no se reduce por el tratamiento con IdeS. Esto sugiere que el tratamiento con IdeS de pacientes con anticuerpos específicos del donante no sólo elimina dichos anticuerpos, sino que también hace que los linfocitos B de memoria específicos del donante (al menos al principio) sean incapaces de responder a los antígenos del donante. Por tanto, también se ve afectada cualquier activación inicial de los linfocitos B de memoria y la generación de células en plasma que podrían producir más anticuerpos específicos del donante.

[0463] Material y métodos

[0464] Cribado de estirpes celulares para inmunoglobulina de superficie

[0465] Se examinaron diferentes estirpes celulares de linfoma humano de linfocitos B, es decir, U-2940 (ACC634), NU-DUL-1 (ACC579), Raji (CCL-86) y Daudi (CCL-213) para detectar la presencia de IgG o IgM unidas a la membrana. En resumen, se cultivaron células a 37 °C en CO<2>al 5 % en RPMI1640 complementado con FCS al 10 % y PEST. Las células se trataron durante 30 min a 37 °C con PBS o diferentes concentraciones de IdeS antes del lavado ácido (glicina 0,1 M pH 2,7, NaCl 0,5 M) durante 5 min en hielo. El lavado ácido elimina los anticuerpos presentes en los FcγR o unidos al antígeno, dejando inalteradas las moléculas transmembrana (Gildenet al., 1978, Jenningset al.,2011). Las células se tiñeron con anticuerpos biotinilados específicos para la parte F(ab')<2>(n.º 109-066-097, Jackson, reacciona de forma cruzada con la cadena ligera presente en todas las subclases de inmunoglobulinas) y la parte Fc de la IgG (n.º 109-066-098, Jackson, específico para la cadena pesada de IgG) o IgM (GM-80A, ICL). Se utilizó estreptavidina-APC (n.º 016-130-084, Jackson) para controlar las células en FL4 usando un citómetro de flujo Accuri C6.

[0466] Ensayos de proliferación y viabilidad celular

[0467] La proliferación se midió mediante la incorporación de BrdU. Las células se trataron con PBS o diferentes concentraciones de IdeS y se sembraron 5 × 10<4>células/pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas. Se añadió BrdU a las células y se incubaron durante 6 horas antes de medir la proliferación de acuerdo con la recomendación del fabricante (ELISA de proliferación celular, BrdU colorimétrico, Roche n.º 11 647229001). Se utilizaron citocalasina D (C2618, Sigma) y puromicina (Invitrogen) a diferentes concentraciones como controles antiproliferativos.

[0468] Se utilizó un ensayo colorimétrico sensible (CCK-8) para medir la viabilidad celular. Las células se trataron con PBS o 30 µg/ml de IdeS y se sembraron 2 × 10<4>células/pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas. Se añadió CCK-8 (kit de recuento de células CCK-88, Dojindo Laboratories, Japón) y se siguió la absorbancia a 450 nm en diferentes puntos temporales. En los experimentos con células Nu-DUL-1 se trataron con PBS o 30 µg/ml de IdeS y se sembraron diferentes cantidades de células en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas antes de la adición de CCK-8. En los experimentos con linfocitos B enriquecidos, se recogió sangre periférica en tubos de heparina complementados con IdeS a 30 µg/ml o PBS y se incubó a 37 °C, CO<2>al 5 % durante 30 minutos. Se añadieron 250 µl de cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos RosetteSep<®>(n.º 07905, StemCell Technologies) a 5 ml de sangre, se mezclaron bien y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron con un volumen igual de PBS complementado con FCS al 2 % antes de la separación en gradiente de densidad (Ficoll-PaquePLUS). Los linfocitos B recogidos se contaron y se ajustaron a 20 × 10<4>células/ml en RPMI1640 complementado con FCS al 10 % y PEST. Se sembraron 2 × 10<4>células/pocillo por triplicado en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas antes de añadir CCK-8.

[0469] Abordaje de la eficacia de IdeS en plasma mediante SDS-PAGE

[0470] El plasma recogido durante la separación en gradiente de densidad de la sangre heparinizada tratada con PBS o con diferentes cantidades de IdeS se utilizó para verificar la eficacia de IdeS sobre la IgG soluble. Los análisis SDS-PAGE se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.). En resumen, se separó 1 µl de plasma en geles prefabricados Mini-PROTEAN<®>TGX<™>al 4-20 % (Bio-Rad) a 200 V durante 40 minutos en condiciones no reducidas. Los geles se tiñeron con el reactivo de tinción GelCode Blue (Pierce, Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se escanearon los geles.

[0471] Recuperación de RLB escindidos

[0472] Las células Nu-DUL-1 se trataron con PBS o diferentes cantidades de IdeS durante una hora a 37 °C antes de un lavado exhaustivo para eliminar cualquier IdeS restante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos en RPMI1640 complementado con un FCS al 10 % y PEST. Una placa se utilizó inmediatamente para análisis de citometría de flujo de IgG inalterada y la otra se cultivó (37 °C, CO<2>al 5 %) durante 24 horas antes del análisis. Las células se tiñeron con un anticuerpo biotinilado específico para la parte F(ab')<2>(n.º 109-066-097, Jackson) seguido de estreptavidina-APC (n.º 016-130-084, Jackson) y las células se controlaron en FL4 utilizando un citómetro de flujo Accuri C6.

[0473] Se recogió sangre periférica en tubos de heparina (BD Vacutainer, n.º 367876) de voluntarios sanos y se trató con 30 µg/ml de IdeS o con PBS durante una hora a 37 °C antes de aislar las PBMC mediante separación en gradiente de densidad (Ficoll-PaquePLUS). Se recogió la interfase de PBMC, se lavó en PBS y se resuspendió en medio de cultivo (RPMI1640 complementado con FCS al 10 % y PEST). Se contaron las PBMC, se ajustaron a 2 × 10<6>células/ml y se extrajo una muestra, se fijó en PFA, se lavó en PBS complementado con BSA al 0,1 % y se almacenó a 4 °C hasta el análisis por citometría de flujo. Las células restantes se cultivaron y las muestras se extrajeron y se fijaron con PFA en los puntos temporales indicados. Para la detección de la parte F(ab')<2>de la IgG, se utilizó anti-CH1-IgG biotinilado (n.º 710.3202.100, BAC), para la detección de la parte Fc de IgG se utilizó el fragmento F(ab')<2>anti-Fc humano específico de cabra (n.º 109-066-098, Jackson). Además, las células se tiñeron dos veces con anti-CD19 conjugado con PE (n.º IP-305-T100, ExBio) y estreptavidina-APC n.º 016-130-084, Jackson). La población de linfocitos se separó mediante dispersión lateral directa y se controlaron las células doblemente positivas en FL2 y FL4 utilizando un citómetro de flujo Accuri C6.

[0474] Citometría de flujo intracelular fosfoespecífica (señalización de RLB)

[0475] Las células Nu-DUL-1 se cultivaron durante la noche en medio sin suero para minimizar la fosforilación de fondo antes de iniciar los experimentos de señalización. Al día siguiente, se añadió PBS o 30 µg/ml de IdeS y se cultivaron las células (37 °C, CO<2>al 5 %) durante 30 min. Se extrajeron 1 × 10<6>células y se fijaron durante 5 min en PFA seguido de 10 min de permeabilización en etanol al 70 % en hielo. Las células se lavaron en PBS complementado con BSA al 0,1 % y se almacenaron a 4 °C hasta su análisis (muestra cero). Después de la recolección de la muestra cero, el RLB de las células restantes se reticuló mediante la adición de 10 µg/ml de F(ab')<2>anti-F(ab')<2>human específico de cabra (Jackson n.º 109-006-097) y se recogieron muestras de células en diferentes puntos temporales, se fijaron y permeabilizaron. Las células fijadas se tiñeron para análisis de citometría de flujo utilizando fosfoespecífico de ERK1/2 conjugado con APC (n.º 17-9109-42, eBioscience) y fosfoespecífico de PLC-γ2 conjugado con PE (n.º 558490, BD). Las células se controlaron en FL2 y FL4 utilizando un citómetro Accuri C6.

[0476] Diferenciación de linfocitos B de memoria

[0477] Se recogió sangre periférica en tubos de heparina (BD Vacutainer, n.º 367876) de voluntarios sanos y se aislaron las PBMC mediante separación en gradiente de densidad (Ficoll-PaquePLUS). Se recogió la interfase de PBMC, se lavó en PBS y se resuspendió en medio de cultivo (RPMI1640 complementado con FCS al 10 % y PEST). Las PBMC se ajustaron a 2 × 10<6>células/ml y se sembraron con IdeS (concentración final 0,3, 3 y 30 µg/ml) o con PBS. Las células se estimularon con una mezcla de R848 y rIL-2 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (MabTech) y se cultivaron durante 72 a 96 horas. Las células previstas para los tratamientos de corta duración se dejaron en tubos complementados con PBS o IdeS y se incubaron durante una hora a 37 °C antes de lavar 3 × 12 ml con PBS y 1 × 12 ml en medio de cultivo. Estas células se sembraron y se trataron con R848/rIL-2 como se ha indicado anteriormente.

[0478] Las placas de filtro de ELISpot se humedecieron previamente con etanol al 70 %, se lavaron con agua estéril y se incubaron a 4 °C durante la noche con anticuerpo de captura (kit ELISpotPLUS Mabtech n.º 3850-2HW-Plus para el seguimiento de las células productoras de IgG, ELISpotPLUS Mabtech kit n.º 3845-2HW-Plus para el seguimiento de las células productoras de IgM y ELISpotBASIC Mabtech kit n.º 3860-2H para el seguimiento de las células productoras de IgA). Las placas de filtro de ELISpot se lavaron y bloquearon durante al menos 30 min con medio de cultivo antes de sembrar las células.

[0479] Las células se transfirieron a tubos de 15 ml, se lavaron a fondo, se contaron y se ajustaron a 0,5 × 10<6>células/ml y se prepararon diluciones al doble antes de sembrar las células en las placas de filtro ELISpot preparadas y cultivarlas durante 24 horas. Las placas ELISpot se lavaron y los anticuerpos de detección biotinilados para el análisis de IgG total, IgM e IgA (incluidos en los kits nombrados) se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con estreptavidina-HRP antes de lavarlas e incubarlas con solución de TMB lista para usar y revelarlas hasta que aparecieron manchas distintas. Las placas se lavaron con agua del grifo y se dejaron secar en la oscuridad. Se fotografiaron los filtros y se contaron manualmente las manchas.

[0480] Enriquecimiento de linfocitos B y citometría de flujo

[0481] Para el enriquecimiento de linfocitos B se recogió sangre periférica en tubos de heparina complementados con IdeS a 30 µg/ml o PBS y se incubaron a 37 °C, CO<2>al 5 % durante 30 minutos. Se añadieron 250 µl de cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos RosetteSep<®>(n.º 07905, StemCell Technologies) a 5 ml de sangre, se mezclaron bien y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron con un volumen igual de PBS complementado con FCS al 2 % antes de la separación en gradiente de densidad (Ficoll-PaquePLUS). Los linfocitos B recogidos se contaron y ajustaron a 15 × 10<4>células/ml en PBS complementado con FCS al 2 % antes de sembrarlas en placas de 96 pocillos en forma de V para la tinción por citometría de flujo. Las placas se sometieron a centrifugación a 1500 rpm durante 3 minutos y se eliminó el sobrenadante. Para la detección de la parte F(ab')<2>de la IgG, se utilizaron 10 µg/ml de anti-CH1-IgG biotinilado n.º 710.3202.100, BAC), para la detección de la parte Fc de IgG se utilizaron 0,5 µg/ml del fragmento F(ab')<2>anti-Fc humano específico de cabra (n.º 109-066-098, Jackson). A continuación, las células se tiñeron dos veces con anti-CD19 conjugado con PE (n.º IP-305-T100, ExBio) o anti-CD27 conjugado con PE (n.º 555441, Pharmingen), seguido de estreptavidina-APC (n.º 016-130-084, Jackson). Las células se controlaron en FL2 y FL4 utilizando un citómetro Accuri C6.

[0483] IdeS escinde RLB de tipo IgG en un primer estudio clínico en seres humanos

[0485] Se realizó un estudio de fase I, con doble enmascaramiento y aleatorizado con dosis únicas ascendentes de IdeS en la Unidad de Fase 1, Lund, tras la aprobación de las autoridades reguladoras y éticas suecas (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01802697). Todos los sujetos firmaron un consentimiento informado por escrito antes de iniciar cualquier procedimiento relacionado con el estudio. Como parte exploratoria del estudio, la integridad del RLB de tipo IgG en las células CD19<+>se controló en diferentes puntos temporales después del tratamiento intravenoso con 0,12 o 0,24 mg/kg de PC de IdeS. La sangre periférica se recogió en tubos de heparina y las PBMC se aislaron en las 2 horas siguientes a la recogida mediante separación en gradiente de densidad (Ficoll-PaquePLUS). La interfaz de PBMC se recogió, se lavó en PBS y se fijó en PFA durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron y almacenaron en PBS complementado con BSA al 0,5 % hasta que se recogieron todos los puntos temporales. Las células se tiñeron con 10 µg/ml de anti-CH1-IgG biotinilado (n.º 710.3202.100, BAC) para la detección de la parte F(ab')<2>de la IgG. Para la detección de la parte Fc de IgG se utilizaron 0,5 µg/ml del fragmento F(ab')<2>anti-Fc humano específico de cabra (n.º 109-066-098, Jackson). Además, las células se tiñeron dos veces con anti-CD19 conjugado con PE (n.º 21270194, Immunotools) y estreptavidina-APC (n.º 016-130-084, Jackson). La población de linfocitos se separó en la muestra previa a la dosis para cada individuo y esta separación se utilizó a continuación para todos los puntos temporales de un sujeto. Las células CD19<+>se controlaron en FL2 y la señal F(ab')<2>/Fc se controló en FL4. Se controlaron las células CD19<+>en M1 (FL2) y se siguió controlando la presencia de señal en estas células tras la tinción anti-Fc y anti-Fab (FL4). En cada muestra se recogieron los recuentos de células en la parte superior derecha (SD), así como la intensidad media fluorescente (IMF). Asimismo, la frecuencia de células doblemente positivas se calculó mediante la siguiente fórmula:

[0488]

[0490] Esta fórmula se utilizó para poder apreciar la diferencia en la IMF cuando sólo estaban presentes recuentos bajos de células en SD.

[0492] Resultados

[0494] IdeS escinde RLB de tipo IgG con eficacia similar a la IgG soluble

[0496] Se analizaron cuatro estirpes celulares diferentes de linfoma B para detectar la presencia de IgG o IgM transmembrana utilizando un enfoque de citometría de flujo que incluía una etapa de lavado ácido para eliminar IgG o IgM no unidas a la membrana a través de un dominio transmembrana (Gildenet al.,1978, Jenningset al., 2011). Después de verificar la presencia de RLB de tipo IgG o IgM en las estirpes celulares, Nu-DUL-1 (RLB de tipo IgG) y Daudi (RLB de tipo IgM) se seleccionaron como modelos para análisis posteriores. Se utilizó un anticuerpo F(ab')<2>específico del fragmento Fab para detectar la presencia de la parte Fab del RLB, ya que el anticuerpo presenta reacciones cruzadas con la cadena ligera presente tanto en IgG como en IgM. Para detectar la presencia de la parte Fc, se utilizaron anticuerpos dirigidos a la parte Fc de la IgG. La IgG inalterada unida a la membrana no pudo detectarse en la superficie celular a concentraciones de IdeS superiores a 4 µg/ml. Las células Daudi que tienen un RLB de tipo IgM no se vieron afectadas ni siquiera a concentraciones elevadas de IdeS (Figura 20A). Las células Nu-DUL-1 se trataron con diferentes concentraciones de IdeS y se incubaron a 37 °C durante 30 min antes de la tinción FACS. Se demostró que IdeS elimina eficazmente la parte F(ab')<2>de la IgG presente en el RLB dejando la parte Fc escindida unida a la membrana (Figura 20B).

[0498] A continuación, se abordó la escisión de RLB en PBMC purificadas de voluntarios sanos. Debido a la reactividad cruzada del anticuerpo específico de Fab con las cadenas ligeras de la IgM, se utilizó el fragmento CaptureSelect específico del dominio anti-IgG-CH1 para teñir la población heterogénea de PBMC. La sangre recogida en tubos de heparina se trató durante 30 minutos (37 °C) con diferentes concentraciones de IdeS. Las PBMC se separaron por gradiente de densidad después del tratamiento con IdeS y se recogió tanto plasma como PBMC. El plasma se analizó en SDS-PAGE para confirmar la eficacia de IdeS sobre la IgG soluble (Figura 21A). La ScIgG se generó ya a 0,9 µg/ml de IdeS y la escisión completa se consiguió a 9 µg/ml.

[0499] Dado que CD19 es un sello distintivo de las estirpes de linfocitos B, las PBMC se tiñeron doblemente con anti-CD19 y anti-Fab o anti-Fc con el fin de controlar la presencia de RLB de IgG inalteradas en los linfocitos B. La citometría de flujo mostró que IdeS podía eliminar la parte F(ab')<2>de la IgG de las células CD19<+>dejando la parte Fc en la membrana (Figura 21B). Como IgG unida a la membrana y escindida presente en el RLB sigue unida a la membrana, el efecto no es totalmente visible por citometría de flujo mientras el producto scIgG esté presente y unido a la membrana. El efecto completo se alcanzó sobre la IgG unida a la membrana a 9 µg/ml de IdeS. Por tanto, estos resultados muestran por primera vez que existe una correlación directa entre la eficacia de IdeS en IgG libres y las IgG unidas a la membrana correspondientemente presentes en los receptores de linfocitos B.

[0500] Para definir mejor el efecto de IdeS sobre el subconjunto de linfocitos B de memoria, se investigó el efecto sobre los linfocitos B de memoria CD19<+>/CD27<+>. Los linfocitos B CD19<+>sólo constituyen un pequeño porcentaje de la población total de PBMC. Por lo tanto, los linfocitos B CD19<+>se enriquecieron mediante selección negativa (RosetteSep), lo que generó >90 % de células CD19<+>(Figura 22A). Aproximadamente un 10 % de esta población presentaba doble positividad para IgG de superficie y CD27 antes del tratamiento con IdeS (Figura 22B). Después del tratamiento con IdeS, menos del 1 % de las células CD19<+>/CD27<+>se tiñeron positivamente para IgG de superficie celular (Figura 22B). Por tanto, estos datos demuestran por primera vez que el RLB de los linfocitos B de memoria con cambio de clase, es decir, los linfocitos CD19<+>/CD27<+>/IgG de superficie<+>, es escindido eficazmente por IdeS.

[0501] El RLB escindido se regenera rápidamente tanto en las estirpes celulares como en las PBMC y no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular

[0502] Para investigar el recambio de membrana del RLB de tipo IgG, las células Nu-DUL-1 se trataron con diferentes concentraciones de IdeS, se lavaron para eliminar IdeS y se cultivaron. Se extrajeron fracciones de células una y 24 horas después del tratamiento y se analizaron mediante citometría de flujo en busca de IgG unidas a la membrana. Una hora después del tratamiento no había IgG detectable en concentraciones de IdeS >4 µg/ml, pero 24 horas después del tratamiento, la señal específica de Fab volvió a los niveles originales demostrando que la IgG unida a la membrana se había recuperado (Figura 23A). También se analizó la capacidad proliferativa de las células Nu-DUL-1 mediante la incorporación de BrdU y no se observaron diferencias en la proliferación después de la escisión del RLB de tipo IgG, incluso cuando el tratamiento con IdeS se prolongó durante 24 horas (Figura 23B). Las sustancias con capacidad antiproliferativa conocida (puromicina y citocalasina D) tuvieron un fuerte efecto antiproliferativo sobre las células. También se investigó la viabilidad de las células Nu-DUL-1 mediante el tratamiento de las células con una dosis elevada de IdeS (30 µg/ml) durante 24 horas y se analizó la viabilidad utilizando el ensayo CCK-8 y no hubo ningún efecto sobre la viabilidad celular después del tratamiento con IdeS (Figura 23C).

[0503] El hecho de que el RLB de tipo IgG se regenerara en las 24 horas en una estirpe celular de linfoma muy proliferante era de esperar, ya que el recambio de membranas en las células proliferativas suele ser muy elevado. Las PBMC de voluntarios sanos se sometieron a un tratamiento similar con el fin de investigar más a fondo el recambio de RLB de tipo IgG en las células primarias. La sangre se recogió en tubos de heparina y se trató con una dosis elevada (30 µg/ml) de IdeS. Después del tratamiento de la sangre, las PBMC se separaron en Ficoll. Las PBMC se lavaron con grandes volúmenes de tampón para eliminar todas las IdeS antes del cultivo. Se extrajo una fracción de células en diferentes puntos temporales, se fijaron y se tiñeron con anti-CD19 para estirpes de linfocitos B y se tiñeron con anti-Fab o anti-Fc para controla RLB de IgG. El RLB de tipo IgG se regeneró rápidamente también en células CD19<+>humanas normales y, ya en las 16 horas posteriores a la escisión, el número de células anti-Fab positivas había vuelto a los niveles previos al tratamiento, aunque todavía no había alcanzado la IMF completa. Esto indica que 16 horas después del tratamiento con IdeS de las PBMC, las células tienen de nuevo RLB de IgG inalterada en la superficie, aunque no todos los RLB de IgG hayan sido sustituidos todavía (Figura 24A). La señal anti-Fc no se vio afectada por el tratamiento, lo que demuestra que el tratamiento con IdeS eliminó el F(ab')<2>del RLB de tipo IgG (Figura 24B). Dado que los linfocitos B sólo representan un pequeño porcentaje de la población total de PBMC, también se utilizó un kit de enriquecimiento de linfocitos B (RosetteSep), que generó >90 % de células CD19<+>. Aproximadamente un 20 % de la población celular enriquecida con CD19 teñida dio positivo para IgG utilizando tanto el reactivo F(ab')<2>como el reactivo específico Fc (Figura 25). El experimento de recuperación de la superficie celular se repitió utilizando estas células purificadas y el tratamiento con IdeS eliminó eficazmente la parte F(ab')<2>de la IgG unida a la membrana dejando inalterada la parte Fc (Figuras 25A y 25B). De nuevo, el recambio fue rápido y ya 16 horas después del tratamiento se había recuperado la IgG de la superficie celular (Figura 25A). La viabilidad celular se siguió durante varios días utilizando el ensayo CCK-8 para evaluar la supervivencia de linfocitos B humanos primarios con o sin un RLB inalterado. No hubo ningún efecto significativo sobre la viabilidad celular al eliminar temporalmente el RLB de tipo IgG de las células enriquecidas en CD19 mediante el tratamiento con IdeS (Figura 26).

[0504] El tratamiento con IdeS inhibe la señalización de RLB

[0505] La señalización de RLB es importante en la activación, supervivencia y diferenciación de los linfocitos B. El evento inicial después de la activación del RLB es la activación de Lyn y Syk, que a continuación se propaga a la activación de PLC-γ2 y ERK1/2. Los experimentos descritos demostraron claramente que IdeS podía escindir el RLB de tipo IgG, que debería tener implicaciones en la señalización de RLB. Para verificarlo, se controló la fosforilación de PLC-γ2 y ERK1/2 como indicadores posteriores de la cascada de señalización de RLB. En una serie de experimentos en los que se reticuló el RLB de las células Nu-DUL-1 utilizando un anticuerpo específico F(ab')<2>, se demostró que las células eran incapaces de señalar a través del RLB después del tratamiento con IdeS (Figuras 27A y 27B). Ni PLC-γ2 ni ERK1/2 se fosforilaron en respuesta al intento de unión del RLB utilizando un anticuerpo específico F(ab')<2>después del tratamiento con IdeS. Las células tratadas con simulacro respondieron normalmente. Estos datos demuestran que las células tratadas con IdeS con un RLB de tipo IgG escindido no pueden responder a la estimulación antigénica.

[0506] IdeS bloquea la maduración de los linfocitos B

[0508] Debido al hallazgo de que IdeS no afecta a la viabilidad de las estirpes celulares o linfocitos B primarios, pero las incapacita para responder al antígeno, se decidió explorar más a fondo la funcionalidad de los linfocitos B de memoria primarios. Por tanto, se recogieron PBMC, se trataron con IdeS y se estimularon con IL2 recombinante y R848 para activar los linfocitos B de memoria y diferenciarlos en células productoras de Ig (Jahnmatzet al.,2013). Después de 72 a 96 horas, las células se lavaron a fondo para eliminar IdeS y se analizó la frecuencia de células productoras de Ig. También se añadió IdeS el tercer día del cultivo con IL2/R848 como control adicional. En este punto temporal no es posible detener la secreción de IgG de los linfocitos B diferenciados IL2/R848. Este control muestra también que la pérdida de señal no se debe a un efecto de arrastre de IdeS que interfiera con los anticuerpos del ensayo ELISPOT (Figura 28A). En la mayoría de los experimentos, IdeS estuvo presente durante todo el periodo de estimulación (96 horas) y los resultados mostraron que el tratamiento con IdeS inhibió la diferenciación de los linfocitos B de memoria y el número de células productoras de IgG, mientras que no tuvo ningún efecto sobre la maduración de las células productoras de IgM o IgA (Figuras 28A y 28B). Hubo un efecto significativo sobre la diferenciación de linfocitos B en todas las concentraciones de IdeS probadas de 0,3 a 30 µg/ml (Figura 28C). Una segunda serie de experimentos en los que se lavó IdeS antes de la estimulación con IL2 y R848 también dio lugar a una reducción significativa del número de células productoras de IgG (Figura 28D), lo que demuestra que la eliminación inicial de la parte de unión a antígeno de RLB de IgG es una etapa importante en la inhibición de la activación de linfocitos B de memoria en células productoras de Ig.

[0510] IdeS escinde RLB de tipo IgG in vivo en seres humanos

[0512] IdeS se ha probado recientemente en un primer estudio en seres humanos en el que se administró a sujetos humanos sanos una dosis únicai.v.ascendente (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01802697) (manuscrito presentado). La dosis máxima probada administrada a cuatro sujetos fue de 0,24 mg/kg de PC. Una parte exploratoria del ensayo consistió en analizar la integridad del RLB de tipo IgG en los linfocitos CD19<+>circulantes en diferentes puntos temporales después de la administración de IdeS. Se recogió sangre periférica y se purificaron las PBMC antes de la dosis, 2 h, 24 h, 48 h y 96 h después de la dosificación. Las células se fijaron inmediatamente para impedir que siguieran metabolizándose y se almacenaron hasta que se pudieron analizar todos los puntos temporales de un sujeto. Las PBMC se tiñeron dos veces para los fragmentos Fc CD19 y F(ab')<2>respectivamente y se analizaron mediante citometría de flujo. El método puede medir la frecuencia y la intensidad media de fluorescencia de las células que tienen F(ab')<2>(es decir, RLB de IgG inalterada) y Fc en su superficie celular. Sin embargo, el método no discrimina entre el RLB inalterado y el de una sola escisión.

[0513] Los resultados demostraron que el número de células CD19<+>que se tiñeron positivamente para F(ab')<2>se redujo ya 2 h después del tratamiento con IdeS (0,24 mg/kg de PC de IdeS) mientras que el número de células que se tiñeron positivamente para Fc no se redujo (Figura 29). Esto demuestra claramente que IdeSin vivoescinde la IgG de superficie en las células CD19<+>. Los datos de los cuatro sujetos, más dos placebos, demuestran que IdeS escinde eficazmente el RLB de tipo IgG en seres humanos y que la frecuencia de células CD19<+>positivas para IgG de superficie se recuperó gradualmente a lo largo de los días siguientes al tratamiento (Figura 30).

[0515] Análisis

[0517] Los datos presentados en el presente documento muestran claramente que IdeS escinde el RLB de tipo IgG e inhibe completamente la señalización del RLB en respuesta a la unión del receptor. Por tanto, los linfocitos B con el RLB de tipo IgG escindido por IdeS son incapaces de unirse al antígeno, lo que provoca la pérdida de los principales acontecimientos celulares posteriores a la unión del receptor, es decir, la internalización, procesamiento y presentación en las moléculas MHC de clase II. Los linfocitos B son células presentadoras de antígenos muy potentes (Lanzavecchia 1990, Avalos y Plough 2015) y pueden presentar con gran eficacia un antígeno en HLA después de una endocitosis específica mediada por RLB, por lo tanto, es probable que la pérdida del fragmento de unión a antígeno del RLB tras la escisión con IdeS repercuta en la presentación del antígeno a los linfocitos T CD4<+>.

[0519] La escisión del RLB de tipo IgG no tiene ningún impacto en la viabilidad celular ni en las estirpes celulares ni en los linfocitos B purificados de sujetos humanos sanos (Figuras 23, 24 y 26). Sin embargo, parecen recuperarse del tratamiento algo más lentamentein vivoquein vitro(Figura 30). Debido a las cantidades muy limitadas de células disponibles para el análisis del estudio de fase 1 en seres humanos, otros marcadores de linfocitos B no pudieron seguirse en este estudio exploratorio. Por lo tanto, no es posible extraer conclusiones sobre el destino de ninguna subpoblación específica de linfocitos B. Las pruebas son coherentes con la recuperación del RLB de tipo IgG en las células escindidas por medios de recambio de membrana como se ha vistoin vitro,pero no se puede descartar que el ligero retraso en la recuperación observadoin vivose deba a la maduración de nuevos linfocitos B y no al mero recambio de membranas.

[0520] Los resultados presentados en el presente documento muestran que IdeS bloquea el desarrollo de células secretoras de anticuerpos IgG, pero no IgA o IgM, si IdeS se utiliza antes de la activación con estimulación policlonal (IL2 y R848). Sin embargo, si IdeS se utiliza después no tiene efecto de bloqueo. Tras la estimulaciónin vitrode las PBMC en cultivo, los antígenos unidos al RLB son internalizados y cargados en las moléculas MHCII y presentados a los linfocitos T, que inducen la proliferación y diferenciación de los linfocitos B (Tangye y Tralington 2009). En ausencia de estimulación antigénica, es decir, tal como ocurre cuando RLB de IgG se escinde por IdeS, el linfocito B no recibirá una segunda señal y proliferará.

[0521] Adicionalmente, esto indica que el complejo de RLB de IgG desempeña un papel importante en la respuesta a la estimulación incluso en ausencia de antígeno, es decir, en el mantenimiento de la señal tónica. Se ha publicado que una mutación de un solo aminoácido en la región extracelular de CD79b del RLB da lugar a agammaglobulemia (Dobbset al.,2007). Este hallazgo indica que la interacción entre las proteínas del RLB en la parte extracelular es importante para la activación celular y se especuló que la interacción entre CD79a/b y la IgG es importante para la generación de un signalosoma adecuado en respuesta a estímulos externos. Un apoyo adicional a esta teoría proviene de una publicación dirigida al dominio extracelular CD79b utilizando un anticuerpo no lítico (Hardyet al.,2014). Se descubrió que la unión a CD79b provocaba anergia de los linfocitos B y pérdida de células productoras de IgG tantoin vitrocomoin vivo.Se propuso que el desensamblaje del RLB mediante la escisión de la parte F(ab')<2>de la IgG da lugar a una falta de respuesta a la activación dependiente de antígeno debido a la pérdida del ensamblaje intracelular adecuado de proteínas y a la generación de un signalosoma funcional.

[0522] IdeS se desarrolla actualmente para la desensibilización de pacientes altamente sensibilizados en lista de espera para un trasplante de riñón. Estos pacientes han desarrollado anticuerpos contra la mayoría de los donantes y hay pocas posibilidades de encontrar un donante compatible. Mediante la eliminación de los anticuerpos específicos del donante (AED) con IdeS antes del trasplante, se puede conseguir que los pacientes sean aptos para el trasplante a pesar de una prueba cruzada positiva antes del tratamiento. Un efecto adicional del tratamiento con IdeS es la generación instantánea de fragmentos libres de F(ab')<2>a partir de AED con capacidad de unión conservada. Estos fragmentos F(ab')<2>pueden unirse y bloquear epítopos en el injerto y puesto que los fragmentos F(ab')<2>han perdido sus funciones mediadas por Fc, tales como la fijación del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), los fragmentos F(ab')<2>pueden tener la capacidad de bloquear IgM y AED IgG de nueva formación y de este modo proporcionar una protección adicional del injerto. Los resultados presentados en el presente documento muestran que IdeS también escinde el RLB de tipo IgG en los linfocitos B de memoria CD27<+>positivos y los incapacita para responder a la estimulación antigénica. Por tanto, no sólo son AED eliminados por IdeS, sino además, los linfocitos B de memoria específicos de AED no son capaces inicialmente de responder a los antígenos del donante. Esto puede tener efectos a largo plazo en la supervivencia del injerto, ya que es probable que la activación inicial de los linfocitos B de memoria y la generación de células plasmáticas de larga vida se vean afectadas por el tratamiento con IdeS.

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[0546] Ejemplo 4

[0547] El siguiente estudio se llevó a cabo para determinar si es posible atacar el RLB de un linfocito B que ha sido tratado con IdeS.

[0548] Materiales y métodos

[0549] En resumen, se sembraron diluciones en dos etapas de las células (Nu-DUL-1, linfoma de linfocitos B con RLB de tipo IgG; ACC 579 de DSMZ) de 80000/pocillo a 1250/pocillo en medio R10 (RPMI1640, PEST y FCS al 10 %) por duplicado en una placa de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos y se utilizaron como calibrador de células viables. Se sembraron 20000 células/pocillo en la placa y se incubaron con o sin 30 µg/ml de IdeS a 37 °C en la incubadora de CO<2>durante 1 hora. Se añadió anti-Fab, anti-Fc o control a los pocillos de prueba hasta una conc. final de 10 µg/ml y la placa se incubó a 37 °C en la incubadora de CO<2>. La primera placa se retiró al cabo de 3 horas, la segunda después de 24 horas y la tercera después de 48 horas. Después de retirar las placas de la incubadora, se añadió el reactivo CCK-8 (del kit de recuento celular CCK-8; Dojindo Laboratories, Japón) y se continuó la incubación durante 1 hora antes de leer la placa a 450 nm en un lector de placas ELISA (espectrofotómetro). El ensayo CCK-8 permite realizar ensayos colorimétricos sensibles para la determinación de la viabilidad celular en ensayos de proliferación celular y citotoxicidad. El agente anti-Fab utilizado fue el fragmento F(ab')<2>específico de F(ab')<2>de cabra (Jackson n.º 109-006-097, 1,3 mg/ml). El agente anti-Fc utilizado fue el fragmento F(ab')<2>específico de Fc de cabra (Jackson n.º 109-006-098, 1,3 mg/ml). El control fue gammaglobulina de ratón (Jackson n.º 015-000-002, 11,4 mg/ml). El control se seleccionó por ser del mismo fabricante que los anti-Fab y anti-Fc probados y porque la IgG de ratón no es escindida por IdeS.

[0550] Resultados y conclusiones

[0553]

[0555] Los resultados muestran que la reticulación del RLB en una célula diana que expresa el RLB de tipo IgG (en este caso una estirpe celular de linfoma de linfocitos B) induce la muerte celular utilizando anticuerpos dirigidos contra la parte F(ab')<2>o la parte Fc. Sin embargo, no es posible utilizar directamente el RLB como diana en un ser humano antes del tratamiento con IdeS debido a la presencia de niveles normales de IgG (~10 mg/ml) en circulación. Sin embargo, el tratamiento previo con IdeS puede disminuir los niveles de anticuerpos que quedan en circulación, al tiempo que deja un fragmento Fc en las células diana todavía disponible para la intervención terapéutica. La focalización en el fragmento Fc después de la escisión con IdeS es al menos tan eficaz en las células tratadas con IdeS como en las células tratadas con simulado. La intervención terapéutica puede llevarse a cabo mediante un anticuerpo dirigido a un epítopo que se crea en el RLB como consecuencia de la escisión con IdeS o incluso dirigiéndose a un epítopo común en el Fc (como se muestra en el presente documento). El anticuerpo terapéutico es preferentemente uno que no es escindido por IdeS y que tiene un grado elevado de funciones efectoras Fc, es decir, CDC, ADCC y ADCP. El anticuerpo también podría estar acoplado a un agente citotóxico, es decir, un radioisótopo o una toxina.

[0556] Otra posibilidad viene dada por la recuperación considerablemente más rápida de IgG inalterada en el RLB unido a la membrana en comparación con la recuperación de IgG en circulación. Esto hace posible utilizar la parte F(ab')<2>como diana y no sólo la parte Fc. La recuperación del RLB de IgG en los linfocitos B de memoria abre la posibilidad de utilizar antígenos (ligados a toxinas o radioisótopos) para dirigirse específicamente a los linfocitos B de memoria con especificidades particulares no deseadas (es decir, anti-HLA o anti-insulina).

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso en un método para mejorar el beneficio de una terapia para un sujeto humano, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto la proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG; y (b) administrar posteriormente dicha terapia al sujeto; en donde:

- dicha terapia es un trasplante de órgano;

- la cantidad de dicha proteína administrada está entre 0,01 y 1 mg/kg de PC y es suficiente para eliminar la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto; y - las etapas (a) y (b) están separadas por un intervalo de tiempo que es suficiente para que se elimine la unión al receptor de Fc por parte de prácticamente todas las moléculas de IgG presentes en el suero del sujeto y que es como máximo de 6 horas;

en donde además la proteína que tiene actividad cisteína de IgG es IdeS que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma que comprende o consiste en cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y tiene actividad cisteína proteasa de IgG.

2. Una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el límite inferior del intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) se selecciona de: al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas o al menos 5 horas.

3. Una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el intervalo de tiempo entre las etapas (a) y (b) es de 30 minutos a 1 hora, de 30 minutos a 2 horas, de 30 minutos a 3 horas, de 30 minutos a 4 horas, de 30 minutos a 5 horas, de 30 minutos a 6 horas, de 1 a 2 horas, de 1 a 3 horas, de 1 a 4 horas, de 1 a 5 horas, de 1 a 6 horas, de 2 a 3 horas, de 2 a 4 horas, de 2 a 5 horas, de 2 a 6 horas, de 3 a 4 horas, de 3 a 5 horas, de 3 a 6 horas, de 4 a 5 horas, de 4 a 6 horas o de 5 a 6 horas.

4. Una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el órgano es un riñón, hígado, corazón, páncreas, pulmón o intestino delgado.

5. Una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el método también comprende una etapa realizada en el momento del trasplante o inmediatamente antes, etapa que comprende la supresión por inducción de los linfocitos T y/o los linfocitos B en el paciente.

6. Una proteína que tiene actividad cisteína proteasa de IgG para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha supresión por inducción comprende la administración de una cantidad eficaz de al menos uno de muromonab, basiliximab, daclizumab, un anticuerpo de globulina antitimocítica (ATG), una inmunoglobulina linfocitaria, preparado de globulina antitimocítica (ATGAM) o rituximab.