ES3055169T3 - Methods for detecting target nucleic acids in a sample - Google Patents

Methods for detecting target nucleic acids in a sample

Info

Publication number
ES3055169T3
ES3055169T3 ES23183318T ES23183318T ES3055169T3 ES 3055169 T3 ES3055169 T3 ES 3055169T3 ES 23183318 T ES23183318 T ES 23183318T ES 23183318 T ES23183318 T ES 23183318T ES 3055169 T3 ES3055169 T3 ES 3055169T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
target
binding
acid molecule
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES23183318T
Other languages
English (en)
Inventor
Rustem Khafizov
Dwayne L Dunaway
Mark Gregory
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bruker Spatial Biology Inc
Original Assignee
Bruker Spatial Biology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bruker Spatial Biology Inc filed Critical Bruker Spatial Biology Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES3055169T3 publication Critical patent/ES3055169T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/30—Characterised by physical treatment
    • C12Q2523/319—Photocleavage, photolysis, photoactivation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/113—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being electroactive, e.g. redox labels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/185—Nucleic acid dedicated to use as a hidden marker/bar code, e.g. inclusion of nucleic acids to mark art objects or animals

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona sondas, métodos, kits y aparatos que proporcionan detección, identificación y cuantificación multiplexada precisa, rápida y sensible de ácidos nucleicos objetivo en una muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Métodos de detección de ácidos nucleicos diana en una muestra
[0003] LISTADO DE SECUENCIAS
[0004] La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado en formato ASCIIvíaEFS-Web y que se incorpora por referencia en su totalidad. Dicha copia de ASCII, creada el 16 de mayo de 2017, se llama NATE-032001WO_ST25.txt y tiene 22.780 bytes de tamaño.
[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0006] Aunque existen actualmente una variedad de métodos de detección de ácidos nucleicos en una muestra biológica, sigue existiendo la necesidad de detección, identificación y cuantificación múltiple mejorada, precisa, rápida y sensible de ácidos nucleicos diana. La presente invención trata esta necesidad.
[0007] SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0008] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación proporciona sondas, métodos, kits y aparatos que proporcionan una detección, identificación y cuantificación multiplexada precisa, rápida y sensible de ácidos nucleicos diana en una muestra.
[0009] Un aspecto de la presente divulgación, que no forma parte de la presente invención, es un método para detectar al menos un ácido nucleico diana en una muestra. El método comprende una primera etapa de contacto de la muestra con al menos una sonda capaz de reconocer y unir una primera región específica de la al menos una molécula diana en la que al menos una sonda comprende un dominio de unión a la diana y un dominio de código de barras en la que el dominio de unión a la diana comprende al menos cuatro nucleótidos, preferiblemente seis o más nucleótidos, y es capaz de reconocer y unir la primera región específica del ácido nucleico diana y en la que el dominio de unión a la diana comprende una secuencia de nucleótidos conocida; en el que el dominio de código de barras comprende un dominio de código de barras que comprende una primera región de unión que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a una primera molécula de ácido nucleico complementaria , una primera molécula de ácido nucleico complementaria de un primer complejo informador o una primera molécula de ácido nucleico hibridante y al menos una segunda región de unión que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a una al menos segunda molécula de ácido nucleico complementaria, al menos una segunda molécula de ácido nucleico complementaria de al menos un segundo complejo informador o una al menos segunda molécula de ácido nucleico hibridante, en la que la secuencia de la primera región de unión es diferente de la secuencia de al menos la segunda región de unión. El método comprende además las etapas de (2) unir a la primera región de fijación una primera molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador que comprende una marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la primera región de fijación; (3) detectar la marca detectable asociada a la primera región de fijación; (4) retirar la primera marca detectable o primera molécula del ácido nucleico complementario; (5) unir a la al menos segunda región de fijación una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador que comprende una marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la al menos segunda región de fijación; y (6) detectar la marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación; en la que el orden lineal o secuencial de las marcas detectables asociadas a la primera región de fijación y la marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra. Las etapas (4) y (5) pueden tener lugar de forma secuencial o simultánea.
[0010] En realizaciones, la retirada del primer ácido nucleico complementario en la etapa (4) comprende poner en contacto la primera región de fijación con una primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, desuniéndose de esta manera la primera molécula del ácido nucleico complementario y uniéndose a la primera región de fijación la primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, o un cambio en el pH, concentración de sales y/o temperatura suficiente para retirar la primera molécula del ácido nucleico complementario.
[0011] En realizaciones, el dominio de código de barras puede comprender una al menos tercera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario, una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos tercer complejo indicador o una al menos tercera molécula del ácido nucleico de hibridación, en las que la secuencia de la al menos tercera región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0012] En realizaciones, el método puede comprender además las etapas de (7) retirar la segunda marca detectable o segunda molécula del ácido nucleico complementario; (8) unir a la al menos tercera región de fijación una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos tercer complejo indicador que comprende una marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la al menos tercera región de fijación; y (9) detectar la marca detectable asociada a la al menos tercera región de fijación, en las que el orden lineal o secuencial de la marca detectable asociada a la primera región de fijación, la marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la marca detectable asociada a la al menos tercera región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra. Las etapas (7) y (8) puede ocurrir secuencialmente o simultáneamente.
[0013] En realizaciones, la retirada del segundo ácido nucleico complementario en la etapa (7) comprende poner en contacto la segunda región de fijación con una segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, desuniéndose de esta manera la segunda molécula del ácido nucleico complementario y uniéndose a la segunda región de fijación la segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, o un cambio en el pH, concentración de sales y/o temperatura suficiente para retirar la segunda molécula del ácido nucleico complementario.
[0014] En realizaciones, el dominio de código de barras puede comprender una al menos cuarta región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos cuarta molécula del ácido nucleico complementario, un al menos cuarto complejo indicador o una al menos cuarta molécula del ácido nucleico de hibridación, en las que la secuencia de la al menos cuarta región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación. En realizaciones, el dominio de código de barras puede comprender una al menos quinta región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos quinta molécula del ácido nucleico complementario, un al menos quinto complejo indicador o una al menos quinta molécula del ácido nucleico de hibridación, en las que la secuencia de la al menos quinta región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación. En realizaciones, el dominio de código de barras puede comprender una al menos sexta región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos sexta molécula del ácido nucleico complementario, un al menos sexto complejo indicador o una al menos sexta molécula del ácido nucleico de hibridación, en las que la secuencia de la al menos sexta región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación. En realizaciones, el dominio de código de barras puede comprender una al menos séptima región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos séptima molécula del ácido nucleico complementario, un al menos séptimo complejo indicador o una al menos séptima molécula del ácido nucleico de hibridación, en las que la secuencia de la al menos séptima región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0015] En realizaciones, las etapas de retirar la respectiva marca detectable o molécula del ácido nucleico complementario; unirse a la respectiva región de fijación a molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o una molécula del ácido nucleico complementario de un complejo indicador que comprende una marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la respectiva de fijación; y detectar la respectiva marca detectable asociada a la región de fijación se repiten hasta que cada región de fijación en el dominio de código de barras se haya unido secuencialmente por una molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable y la marca detectable de la molécula del ácido nucleico complementario secuencialmente unida se haya detectado, en las que el orden lineal o secuencial de las marcas detectables asociadas a cada región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra.
[0016] En realizaciones, la primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable comprende al menos la secuencia del ácido nucleico de la primera molécula del ácido nucleico complementario. En realizaciones, la primera región de fijación puede ser adyacente a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante o análogo de polinucleótido. La primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable puede comprender además una secuencia del ácido nucleico parcialmente complementaria a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante adyacente a dicha primera región de fijación.
[0017] En realizaciones, la al menos segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable comprende al menos la secuencia del ácido nucleico de la al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario.
[0018] En realizaciones, la al menos segunda región de fijación puede ser adyacente a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante o análogo de polinucleótido. La al menos segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable puede comprender una secuencia del ácido nucleico parcialmente complementaria a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante adyacente a la al menos segunda región de fijación.
[0019] En realizaciones, el dominio de código de barras puede comprender un esqueleto sintético que comprende un polisacárido, un péptido, un ácido nucleico peptídico, un polipéptido, o un polinucleótido seleccionado de ADN monocatenario, ARN monocatenario o PNA monocatenario.
[0020] En realizaciones, la al menos una sonda puede comprender un ARN monocatenario o bicatenario, ADN, PNA, u otro análogo de polinucleótido o espaciador de PEG entre el dominio de unión a diana y el dominio de código de barras. El espaciador puede ser un ADN bicatenario.
[0021] En realizaciones, la primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador, al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario y al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador son independientemente ARN, ADN, PNA, u otro análogo de polinucleótido.
[0022] En realizaciones, el al menos tercer o al menos tercer ácido nucleico complementario de un tercer complejo indicador puede ser ARN, ADN, PNA, u otro análogo de polinucleótido.
[0023] En realizaciones, el al menos un nucleótido en dicho dominio de unión a diana puede ser un nucleótido o un análogo de ácido nucleico modificado. Al menos dos, al menos tres, al menos cuatro , al menos cinco o al menos seis nucleótidos en dicho dominio de unión a diana pueden ser un nucleótido modificado o un análogo de ácido nucleico. Cada nucleótido en dicho dominio de unión a diana puede ser un nucleótido o un análogo de ácido nucleico modificado. El al menos un nucleótido o el al menos un análogo de ácido nucleico modificado puede ser un ácido nucleico bloqueado (LNA). El al menos un nucleótido o el al menos un análogo de ácido nucleico modificado puede comprender una base universal.
[0024] En realizaciones, el ácido nucleico diana puede ser en primer lugar inmovilizado a un sustrato uniendo al menos una primera posición del ácido nucleico diana con una primera sonda de captura que comprende un primer reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato. En realizaciones, el ácido nucleico diana se inmoviliza en un sustrato después de unirse a la sonda uniendo al menos una primera posición del ácido nucleico diana con una primera sonda de captura que comprende un primer reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato. En realizaciones, la primera sonda de captura se une al ácido nucleico diana en una posición diferente en el ácido nucleico diana que a la al menos una sonda se une al ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede ser estirado aplicando una fuerza (por ejemplo, gravedad, fuerza hidrodinámica, fuerza electromagnética, estiramiento por flujo, una técnica de menisco retraído, o una combinación de los mismos) suficiente para extender el ácido nucleico diana que se inmoviliza al sustrato en una primera posición. El ácido nucleico diana puede ser inmovilizado adicionalmente al sustrato uniendo una al menos segunda posición del ácido nucleico diana con una al menos segunda sonda de captura que comprende un reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato. Normalmente, la segunda sonda de captura se une el ácido nucleico diana en una posición diferente en el ácido nucleico diana que a la al menos una sonda y la primera sonda de captura se une al ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede ser inmovilizado adicionalmente al sustrato uniendo una al menos una porción de la sonda o una porción de una molécula del ácido nucleico complementario o un complejo indicador con una al menos tercera sonda de captura que comprende un tercer reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato. El ácido nucleico diana puede ser inmovilizado adicionalmente al sustrato uniendo una porción de la sonda, una porción de la al menos una molécula del ácido nucleico complementario o al menos un complejo indicador al sustrato a través de un cuarto reactivo de unión por afinidad. Reactivos de unión por afinidad típicos incluyen ligandos, antígenos, hidratos de carbono, receptores, lectinas, anticuerpos, biotina, avidina, haptenos y ácidos nucleicos que tienen una secuencia conocida. El ácido nucleico diana se puede inmovilizar al sustrato en aproximadamente tres a al menos diez posiciones. La fuerza se puede retirar una vez una segunda posición del ácido nucleico diana se inmoviliza al sustrato. En realizaciones, el ácido nucleico diana inmovilizado es alargado. En realizaciones, la primera sonda de captura puede comprender un segundo reactivo de afinidad.
[0025] En realizaciones, el segundo reactivo de afinidad de la primera sonda de captura es diferente del primer reactivo de afinidad de la al menos una sonda.
[0026] En realizaciones, la primera sonda de captura puede comprender además un tercer reactivo de afinidad que es diferente del segundo reactivo de afinidad.
[0027] En realizaciones, el primer reactivo de afinidad, el segundo reactivo de afinidad y el tercer reactivo de afinidad son diferentes.
[0028] En realizaciones, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana es igual al número de regiones de fijación diferentes en el dominio de código de barras.
[0029] En realizaciones, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana puede ser uno más que el número de regiones de fijación diferentes en el dominio de código de barras.
[0030] En realizaciones, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana es al menos dos veces el número de regiones de fijación en el dominio de código de barras.
[0031] En realizaciones, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana es ocho y el número de regiones de fijación en el dominio de código de barras es tres.
[0032] En realizaciones, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana puede ser al menos uno que el número de regiones de fijación diferentes en el dominio de código de barras.
[0033] En realizaciones, el dominio de unión a diana de la sonda comprende al menos 6 nucleótidos, o al menos 8 nucleótidos.
[0034] En realizaciones, el dominio de unión a la diana de la sonda comprende 10 a 100, 20 a 60 o 3550 nucleótidos. En realizaciones, al menos la primera región de fijación se ramifica a partir de una primera posición en el dominio de código de barras. En realizaciones, la al menos segunda región de fijación se ramifica a partir de una al menos segunda posición en el dominio de código de barras. En realizaciones, cada región de fijación se ramifica a partir de una posición en el dominio de código de barras. El dominio de código de barras puede comprender una primera posición que comprende al menos dos primeras regiones de fijación, en las que las al menos dos primeras regiones de fijación comprenden una secuencia del ácido nucleico idéntica que es capaz de ser unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador. El dominio de código de barras puede comprender una al menos segunda posición que comprende dos al menos segundas regiones de fijación, en las que al menos dos segundas regiones de fijación comprenden una secuencia del ácido nucleico idéntica que es capaz de ser unida por una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario o una segunda molécula del ácido nucleico complementario de un segundo complejo indicador. El dominio de código de barras puede comprender una al menos tercera posición que comprende dos al menos terceras regiones de fijación, en las que las al menos dos terceras regiones de fijación comprenden una secuencia del ácido nucleico idéntica que es capaz de ser unida por una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario o una tercera molécula del ácido nucleico complementario de un tercer complejo indicador.
[0035] En realizaciones, cada posición en un dominio de código de barras puede comprender el mismo número de regiones de fijación. En realizaciones, al menos una posición en un dominio de código de barras puede comprender más de una región de fijación. Cada posición en un dominio de código de barras puede comprender más de una región de fijación.
[0036] En realizaciones, al menos una posición en un dominio de código de barras puede comprender un mayor número de regiones de fijación que otra posición.
[0037] En realizaciones, al menos una posición en un dominio de código de barras puede comprender de una a cincuenta copias de su región de fijación, por ejemplo, cada posición en un dominio de código de barras puede comprender de una a cincuenta copias de su región de fijación.
[0038] En realizaciones, la al menos una sonda puede incluir múltiples copias del dominio de unión a diana operativamente unido a un dominio de código de barras.
[0039] En realizaciones, cada complejo indicador que comprende una marca detectable puede comprender una molécula del ácido nucleico complementario directamente unida a una molécula del ácido nucleico primario.
[0040] En realizaciones, cada complejo indicador que comprende una marca detectable puede comprender una molécula del ácido nucleico complementario indirectamente unida a una molécula del ácido nucleico primario a través de un espaciador de ácido nucleico.
[0041] En realizaciones, cada complejo indicador que comprende una marca detectable puede comprender una molécula del ácido nucleico complementario indirectamente unida a una molécula del ácido nucleico primario a través de un espaciador polimérico con propiedades mecánicas similares a las de un espaciador de ácido nucleico.
[0042] En realizaciones, cada complejo informador que comprende una etiqueta detectable incluye una molécula de ácido nucleico complementaria unida indirectamente a una molécula de ácido nucleico primaria mediante un enlazador escindible.
[0043] En realizaciones, el enlazador escindible es fotoescindible, químicamente escindible o enzimáticamente escindible. Típicamente, cada enlazador escindible es independientemente escindible de todos los demás enlazadores. En realizaciones, el conector fotoescindible se escinde por una fuente de luz, tal como una lámpara de arco, un láser, una fuente de luz UV focalizada o un diodo emisor de luz.
[0044] En realizaciones, cada molécula del ácido nucleico complementario puede comprender entre aproximadamente 8 nucleótidos y aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 12 nucleótidos y aproximadamente 14 nucleótidos.
[0045] En realizaciones, cada molécula del ácido nucleico primario se puede hibridar con al menos una molécula del ácido nucleico secundario, por ejemplo, al menos dos moléculas del ácido nucleico secundario, al menos tres moléculas del ácido nucleico secundario, al menos cuatro moléculas del ácido nucleico secundario, al menos cinco moléculas del ácido nucleico secundario y al menos seis moléculas del ácido nucleico secundario. La molécula o moléculas del ácido nucleico secundario pueden incluir al menos una marca detectable.
[0046] En realizaciones, las moléculas del ácido nucleico secundario pueden incluir un conector escindible. Por ejemplo, el conector escindible es fotoescindible, químicamente escindible o enzimáticamente escindible. En realizaciones, las diversas moléculas del ácido nucleico secundario hibridadas con una molécula del ácido nucleico primario pueden todas incluir el mismo conector escindible, ningún conector escindible, combinaciones de diversos conectores escindibles o combinaciones de diversos conectores escindibles y ningún conector escindible.
[0047] En realizaciones, cada molécula del ácido nucleico secundario se puede hibridar con al menos una molécula del ácido nucleico terciaria que comprende al menos una marca detectable, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete moléculas del ácido nucleico terciario que comprenden al menos una marca detectable.
[0048] En realizaciones, al menos una molécula del ácido nucleico secundario puede comprender una región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario. En realizaciones, cada molécula del ácido nucleico secundario puede comprender una región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario puede comprender la secuencia de nucleótidos de la molécula del ácido nucleico complementario que se une directamente a la molécula del ácido nucleico primario. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario se puede ubicar en un extremo de la molécula del ácido nucleico secundario. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario puede comprender entre aproximadamente 8 nucleótidos y aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 12 nucleótidos.
[0049] En realizaciones, el al menos un ácido nucleico diana puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, o más y cualquier número de diferentes ácidos nucleicos diana en entre.
[0050] En realizaciones, el método puede comprender además detectar al menos una proteína diana en la muestra. En realizaciones, la al menos una proteína diana puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, o más, y cualquier número de diferentes proteínas diana intermedias.
[0051] Se entiende que los términos "uno o más", "al menos uno" y similares incluyen, pero no se limitan a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más y cualquier número intermedias.
[0052] Se entiende que los términos "pluralidad", "al menos dos", "dos o más", "al menos segundo" y similares incluyen, pero no se limitan a, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más y cualquier número intermedias. Por lo tanto, "al menos dos posiciones de fijación de marca" incluyen, pero no se limitan a, dos posiciones de fijación de marca, cuatro posiciones de fijación de marca, seis posiciones de fijación de marca, ocho posiciones de fijación de marca, diez posiciones de fijación de marca, o más.
[0054] La presente divulgación, que no forma parte de la presente invención, también proporciona un método para detectar al menos un ácido nucleico diana en una muestra que comprende: (1) poner en contacto la muestra con al menos una sonda capaz de reconocer y unirse a una primera región específica de la al menos una molécula diana, en donde la al menos una sonda comprende: un dominio de unión a diana y un dominio de código de barras, en donde el dominio de unión a diana comprende al menos cuatro nucleótidos y es capaz de reconocer y unirse a la primera región específica del ácido nucleico diana y en donde el dominio de unión a diana comprende una secuencia de nucleótidos conocida; en donde el dominio de código de barras comprende un dominio de código de barras que comprende una primera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador y una al menos segunda región de fijación unida por una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario o una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador; en donde la primera molécula del ácido nucleico complementario o primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador comprende una primera marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la primera región de fijación; en donde la al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario o al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador comprende una segunda marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la al menos segunda región de fijación; en donde la secuencia de la primera región de fijación es diferente de la secuencia de la al menos segunda región de fijación; (2) detectar la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación y la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación; (3) retirar la primera marca detectable; (4) detectar la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación; en donde el orden lineal o secuencial de la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación y la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra.
[0056] La detección en la etapa (4) puede comprender restar una señal de la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación en la etapa (4) de una señal de la detección de la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación y la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación en la etapa (2).
[0058] El dominio de código de barras puede comprender una primera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador, una al menos segunda región de fijación unida por una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario o una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador y una al menos tercera región de fijación unida por una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario o una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos tercer complejo indicador; en donde la primera molécula del ácido nucleico complementario o la primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador comprende una primera marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la primera región de fijación; en donde la segunda molécula del ácido nucleico complementario o la segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador comprende una segunda marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la al menos segunda región de fijación; en donde la tercera molécula del ácido nucleico complementario o la tercera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos tercer complejo indicador comprende una tercera marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la al menos tercera región de fijación; en donde las secuencias de la al menos tercera región de fijación, al menos segunda región de fijación y al menos tercera región de fijación son diferentes; (2) detectar la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación, la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación; (3) retirar la primera marca detectable; (4) detectar la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación; (5) retirar la segunda marca detectable; (6) detectar la tercera marca detectable asociada a la al menos tercera región de fijación; en donde el orden lineal o secuencial de la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación, la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra.
[0059] La detección en la etapa (4) puede comprender restar una señal de la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación en la etapa (4) de la señal de la detección de la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación, la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación en la etapa (2).
[0061] La detección en la etapa (6) puede comprender restar una señal de la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación en la etapa (6) de la señal de la detección de la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación y la al menos tercera marca detectable asociada a la tercera región de fijación en la etapa (4).
[0063] La presente divulgación, que no forma parte de la presente invención, también proporciona un método para detectar al menos un ácido nucleico diana en una muestra que comprende: (1) poner en contacto la muestra con al menos una sonda capaz de reconocer y unirse a una primera región específica de la al menos una molécula diana, en donde la al menos una sonda comprende: un dominio de unión a diana y un dominio de código de barras, en donde el dominio de unión a diana comprende al menos cuatro nucleótidos y es capaz de reconocer y unirse a la primera región específica del ácido nucleico diana y en donde el dominio de unión a diana comprende una secuencia de nucleótidos conocida; en donde el dominio de código de barras comprende una primera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario, una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador o una primera molécula del ácido nucleico de hibridación y una al menos segunda región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario, una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador o una al menos segunda molécula del ácido nucleico de hibridación; en donde la secuencia de la primera región de fijación es diferente de la secuencia de la al menos segunda región de fijación; (2) unir a la primera región de fijación una primera molécula del ácido nucleico complementario que comprende una primera marca detectable o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador que comprende una primera marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la primera región de fijación; (3) detectar la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación; (4) retirar la primera marca detectable o primera molécula del ácido nucleico complementario; (5) unir a la al menos segunda región de fijación una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario que comprende una segunda marca detectable o una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador que comprende una segunda marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la al menos segunda región de fijación; y (6) detectar la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación; en donde el orden lineal o secuencial de la primera marca detectable asociada a la primera región de fijación y la segunda marca detectable asociada a la al menos segunda región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra. Las etapas (4) y (5) pueden ocurrir secuencialmente o simultáneamente.
[0065] El dominio de código de barras puede comprender una al menos tercera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario, un al menos tercer complejo indicador o una al menos tercera molécula del ácido nucleico de hibridación; en donde la secuencia de la al menos tercera región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0067] El método puede comprender además: (7) retirar la segunda etiqueta detectable o la segunda molécula de ácido nucleico complementaria; (8) unir a al menos la tercera región de unión al menos una tercera molécula de ácido nucleico complementaria que comprenda una tercera etiqueta detectable o al menos una tercera molécula de ácido nucleico complementaria de al menos un tercer complejo informador que comprenda una tercera etiqueta detectable, asociando así una etiqueta detectable a al menos la tercera región de unión; y (9) detectar la tercera etiqueta detectable asociada con al menos la tercera región de unión; en la que el orden lineal o secuencial de la primera etiqueta detectable asociada con la primera región de unión, la segunda etiqueta detectable asociada con al menos la segunda región de unión, y la tercera etiqueta detectable asociada con al menos la tercera región de unión identifica la región específica de al menos una molécula diana, detectando así al menos un ácido nucleico diana en la muestra. Las etapas (7) y (8) ocurren secuencialmente o simultáneamente.
[0069] La retirada del primer ácido nucleico complementario en la etapa (4) puede comprender: (a) poner en contacto la primera región de fijación con una primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, desuniéndose de esta manera la primera molécula del ácido nucleico complementario y uniéndose a la primera región de fijación la primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, (b) un cambio en el pH, concentración de sales y/o temperatura suficiente para retirar la primera molécula del ácido nucleico complementario.
[0071] La retirada del segundo ácido nucleico complementario en la etapa (7) puede comprender: (a) poner en contacto la segunda región de fijación con una segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, desuniéndose de esta manera la segunda molécula del ácido nucleico complementario y uniéndose a la segunda región de fijación la segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable, (b) un cambio en el pH, concentración de sales y/o temperatura suficiente para retirar la segunda molécula del ácido nucleico complementario.
[0072] El dominio de código de barras puede comprender una al menos cuarta región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos cuarta molécula del ácido nucleico complementario, un al menos cuarto complejo indicador o una al menos cuarta molécula del ácido nucleico de hibridación; en donde la secuencia de la al menos cuarta región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0073] El dominio de código de barras puede comprender una al menos quinta región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos quinta molécula del ácido nucleico complementario, un al menos quinto complejo indicador o una al menos quinta molécula del ácido nucleico de hibridación; en donde la secuencia de la al menos quinta región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0074] El dominio de código de barras puede comprender una al menos sexta región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos sexta molécula del ácido nucleico complementario, un al menos sexto complejo indicador o una al menos sexta molécula del ácido nucleico de hibridación; en donde la secuencia de la al menos sexta región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0075] El dominio de código de barras puede comprender una al menos séptima región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos séptima molécula del ácido nucleico complementario, un al menos séptimo complejo indicador o una al menos séptima molécula del ácido nucleico de hibridación; en donde la secuencia de la al menos séptima región de fijación es diferente de la secuencia de otra región de fijación.
[0076] Las etapas de: (a) retirar la respectiva marca detectable o molécula del ácido nucleico complementario; (b) unirse a la respectiva región de fijación a molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o una molécula del ácido nucleico complementario de un complejo indicador que comprende una marca detectable, asociándose de esta manera una marca detectable con la respectiva de fijación; y (c) detectar la respectiva marca detectable asociada a la región de fijación; se repiten hasta que cada región de fijación en el dominio de código de barras se haya unido secuencialmente por una molécula del ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable y la marca detectable de la molécula del ácido nucleico complementario secuencialmente unida se haya detectado, en donde el orden lineal o secuencial de las marcas detectables asociadas a cada región de fijación identifica la región específica de la al menos una molécula diana, detectándose de esta manera el al menos un ácido nucleico diana en la muestra.
[0077] La primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable puede comprender al menos la secuencia del ácido nucleico de la primera molécula del ácido nucleico complementario.
[0078] La primera región de fijación puede ser adyacente a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante o análogo de polinucleótido.
[0079] La primera molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable adicional puede comprender una secuencia del ácido nucleico parcialmente complementaria a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante adyacente a dicha primera región de fijación.
[0080] La al menos segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable puede comprender al menos la secuencia del ácido nucleico de la al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario.
[0081] La al menos segunda región de fijación puede ser adyacente a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante o análogo de polinucleótido.
[0082] La al menos segunda molécula del ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable puede comprender una secuencia del ácido nucleico parcialmente complementaria a al menos un polinucleótido monocatenario flanqueante adyacente a la al menos segunda región de fijación.
[0083] La retirada de la primera marca detectable en la etapa (3) puede comprender poner en contacto la primera molécula del ácido nucleico complementario o la primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador con una fuerza en una localización de la primera molécula del ácido nucleico complementario suficiente para liberar la primera marca detectable.
[0084] La retirada de la segunda marca detectable en la etapa (5) puede comprender poner en contacto la segunda molécula del ácido nucleico complementario o la segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador con una fuerza en una localización de la segunda molécula del ácido nucleico complementario suficiente para liberar la segunda marca detectable.
[0085] La retirada de la primera marca detectable en la etapa (4) puede comprender poner en contacto la primera molécula del ácido nucleico complementario o la primera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos primer complejo indicador con una fuerza en una localización de la primera molécula del ácido nucleico complementario suficiente para liberar la primera marca detectable.
[0086] La retirada de la segunda marca detectable en la etapa (7) puede comprender poner en contacto la segunda molécula del ácido nucleico complementario o la segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador con una fuerza en una localización de la segunda molécula del ácido nucleico complementario suficiente para liberar la segunda marca detectable.
[0087] Al menos una de la primera molécula del ácido nucleico complementario, primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador, al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario, al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador, al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario o al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos tercer complejo indicador puede comprender al menos un conector escindible. Al menos un enlazador escindible puede seleccionarse independientemente del grupo de los fotoescindibles, químicamente escindibles y enzimáticamente escindibles. Cada conector escindible puede ser independientemente escindible de todos los otros conectores. El conector fotoescindible se puede escindir por una fuente de luz seleccionada del grupo que consiste en una lámpara de arco, un láser, una fuente de luz UV focalizada y un diodo emisor de luz. La fuerza puede ser luz.
[0088] El método de la presente divulgación puede comprender además lavar la sonda del al menos un ácido nucleico diana. El lavado puede comprender un cambio en el pH, concentración de sales y/o temperatura suficiente para retirar la sonda de la molécula diana.
[0089] Los métodos de la presente divulgación pueden comprender además: (i) poner en contacto la muestra con al menos una segunda sonda capaz de reconocer y unirse a una segunda región específica de la al menos una molécula diana, en donde la segunda región específica es diferente de la primera región específica de la al menos una molécula diana; (ii) poner en contacto la muestra con una al menos segunda copia de la primera sonda capaz de reconocer y unirse a la primera región específica de la al menos una molécula diana; o (iii) poner en contacto la muestra con una al menos tercera sonda capaz de reconocer y unirse a una primera región específica de una al menos segunda molécula diana, en donde la al menos segunda molécula diana es diferente de la al menos una molécula diana; en donde la sonda comprende: un dominio de unión a diana y un dominio de código de barras, en donde el dominio de unión a diana comprende al menos cuatro nucleótidos; y, en donde el dominio de código de barras comprende un dominio de código de barras que comprende una primera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador y una al menos segunda región de fijación unida por una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario o una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador.
[0090] Los métodos de la presente divulgación pueden comprender además: (i) poner en contacto la muestra con al menos una segunda sonda capaz de reconocer y unirse a una segunda región específica de la al menos una molécula diana, en donde la segunda región específica es diferente de la primera región específica de la al menos una molécula diana; (ii) poner en contacto la muestra con una al menos segunda copia de la primera sonda capaz de reconocer y unirse a la primera región específica de la al menos una molécula diana; o (iii) poner en contacto la muestra con una al menos tercera sonda capaz de reconocer y unirse a una primera región específica de una al menos segunda molécula diana, en donde la al menos segunda molécula diana es diferente de la al menos una molécula diana; en donde la sonda comprende: un dominio de unión a diana y un dominio de código de barras, en donde el dominio de unión a diana comprende al menos cuatro nucleótidos; y, en donde el dominio de código de barras comprende una primera región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario, una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador o una primera molécula del ácido nucleico de hibridación y una al menos segunda región de fijación que comprende una secuencia del ácido nucleico capaz de ser unida por una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario, una al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador o una al menos segunda molécula del ácido nucleico de hibridación.
[0091] El método puede comprender además repetir las etapas (1) a (6) de la reivindicación 3 con la al menos segunda sonda, la al menos segunda copia de la primera sonda, o la al menos tercera sonda. El método puede comprender además repetir las etapas (1) a (9) con la al menos segunda sonda, la al menos segunda copia de la primera sonda, o la al menos tercera sonda. Después de lavar la sonda del al menos un ácido nucleico diana, las etapas (1) a (6) o etapas (1) a (9) se pueden repetir hasta aproximadamente cincuenta veces.
[0092] La marca detectable puede comprender múltiples restos, cada uno de los cuales es capaz de ser identificado por su espectro de emisión. La marca detectable puede comprender puntos cuánticos, restos fluorescentes, restos colorimétricos o combinaciones de los mismos. Preferentemente, la marca detectable puede comprender restos fluorescentes. El espectro de emisión de cada uno resto puede ser igual o diferente. El espectro de emisión de al menos un resto puede ser diferente de los otros restos. En un aspecto preferible, la señal es un espectro de emisión. En realizaciones, el espectro de emisión o espectros de la marca es una señal detectable.
[0093] El dominio de código de barras puede comprender un esqueleto sintético que comprende un polisacárido, un péptido, un ácido nucleico peptídico, un polipéptido o un polinucleótido seleccionado de ADN monocatenario, ARN monocatenario o PNA monocatenario. Al menos una sonda puede comprender un ARN monocatenario o bicatenario, ADN, PNA, u otro análogo de polinucleótido o espaciador de PEG entre el dominio de unión a diana y el dominio de código de barras. En un aspecto preferido, el espaciador es ADN bicatenario.
[0094] El primer ácido nucleico complementario, primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador, al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario y al menos segunda molécula del ácido nucleico complementario de un al menos segundo complejo indicador puede ser independientemente ARN, ADN, PNA, u otro análogo de polinucleótido. El al menos tercer ácido nucleico complementario o al menos tercer ácido nucleico complementario de un tercer complejo indicador puede ser ARN, ADN, PNA, u otro análogo de polinucleótido.
[0095] Al menos un nucleótido en dicho dominio de unión a diana puede ser un nucleótido o un análogo de ácido nucleico modificado. Al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis nucleótidos en dicho dominio de unión a diana puede ser un nucleótido o un análogo de ácido nucleico modificado. Cada nucleótido en dicho dominio de unión a diana puede ser un nucleótido o un análogo de ácido nucleico modificado. Cada nucleótido en dicho dominio de unión a diana puede ser un nucleótido o un análogo de ácido nucleico modificado, excepto el primer y último nucleótidos.
[0096] El al menos un nucleótido o el al menos un análogo de ácido nucleico modificado puede ser un ácido nucleico bloqueado (LNA). El al menos un nucleótido o el al menos un análogo de ácido nucleico modificado puede comprender una base universal.
[0097] El ácido nucleico diana puede ser en primer lugar inmovilizado a un sustrato antes de entrar en contacto con una sonda, uniendo al menos una primera posición del ácido nucleico diana con una primera sonda de captura que comprende un primer reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato, en donde la primera sonda de captura se une al ácido nucleico diana en una posición diferente en el ácido nucleico diana a la que la al menos una sonda se une al ácido nucleico diana.
[0098] El ácido nucleico diana puede inmovilizarse a un sustrato después de unirse a la sonda uniendo al menos una primera posición del ácido nucleico diana con una primera sonda de captura que comprende un primer reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato, en donde la primera sonda de captura se une el ácido nucleico diana en una posición diferente en el ácido nucleico diana a la que la al menos una sonda se une al ácido nucleico diana.
[0099] El ácido nucleico diana puede estirarse aplicando una fuerza suficiente para extender el ácido nucleico diana que se inmoviliza al sustrato en una primera posición. La fuerza puede ser gravedad, fuerza hidrodinámica, fuerza electromagnética, estiramiento por flujo, una técnica de menisco retraído, o una combinación de los mismos. El ácido nucleico diana puede ser inmovilizado adicionalmente al sustrato uniendo una al menos segunda posición del ácido nucleico diana con una al menos segunda sonda de captura que comprende un segundo reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato, en donde la segunda sonda de captura se une el ácido nucleico diana en una posición diferente en el ácido nucleico diana a la que la al menos una sonda y primera sonda de captura se une al ácido nucleico diana.
[0100] El ácido nucleico diana puede ser inmovilizado adicionalmente al sustrato uniendo una al menos una porción de la sonda o una porción de una molécula del ácido nucleico complementario o un complejo indicador con una al menos tercera sonda de captura que comprende un tercer reactivo de unión por afinidad que se une selectivamente al sustrato.
[0101] La sonda, al menos un ácido nucleico complementario o al menos un complejo indicador pueden comprender un cuarto reactivo de unión por afinidad.
[0102] El ácido nucleico diana puede ser inmovilizado adicionalmente al sustrato uniendo una porción de la sonda, una porción de la al menos una molécula del ácido nucleico complementario o al menos un complejo indicador al sustrato a través del cuarto reactivo de unión por afinidad.
[0103] La fuerza se puede retirar una vez la segunda posición del ácido nucleico diana se inmoviliza al sustrato.
[0104] El reactivo de unión por afinidad se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en un ligando, un antígeno, un hidrato de carbono, un receptor, una lectina, un anticuerpo, biotina, avidina, un hapteno y un ácido nucleico que tiene una secuencia conocida.
[0105] La primera sonda de captura puede comprender un dominio de unión a diana que comprende 20-60 nucleótidos y en donde la primera sonda de captura se une el ácido nucleico diana en una posición diferente en el ácido nucleico diana a la que la al menos una sonda se une al ácido nucleico diana. La primera sonda de captura puede comprender un dominio de unión a diana que comprende 35-50 nucleótidos.
[0106] El primer reactivo de unión por afinidad puede ser diferente del segundo reactivo de unión por afinidad.
[0107] Al menos uno del primer reactivo de unión por afinidad, segundo reactivo de unión por afinidad, tercer reactivo de unión por afinidad y cuarto reactivo de unión por afinidad puede ser diferentes de los otros reactivos de unión por afinidad.
[0108] El número de nucleótidos en un dominio de unión a diana puede ser al menos dos veces el número de regiones de fijación en el dominio de código de barras. El número de nucleótidos en un dominio de unión a diana puede ser 8 y el número de regiones de fijación en el dominio de código de barras puede ser tres. El dominio de unión a diana puede comprender al menos 6 nucleótidos. El dominio de unión a diana puede comprender al menos 8 nucleótidos. El dominio de unión a diana puede comprender 10-100 nucleótidos. El dominio de unión a diana puede comprender 20-60 nucleótidos. El dominio de unión a diana puede comprender 35-50 nucleótidos.
[0109] Cada molécula del ácido nucleico complementario puede comprender entre aproximadamente 8 nucleótidos y aproximadamente 20 nucleótidos. Cada molécula del ácido nucleico complementario puede comprender aproximadamente 12 nucleótidos. Cada molécula del ácido nucleico complementario puede comprender aproximadamente 14 nucleótidos.
[0110] La al menos primera región de fijación puede ramificarse de una primera posición en el dominio de código de barras. La al menos segunda región de fijación puede ramificarse de una al menos segunda posición en el dominio de código de barras. Cada región de fijación puede ramificarse de una posición en el dominio de código de barras. El dominio de código de barras puede comprender una primera posición que comprende al menos dos primeras regiones de fijación, en donde las al menos dos primeras regiones de fijación comprenden una secuencia del ácido nucleico idéntica que es capaz de ser unida por una primera molécula del ácido nucleico complementario o una primera molécula del ácido nucleico complementario de un primer complejo indicador.
[0111] El dominio de código de barras puede comprender al menos una segunda posición que comprende al menos dos segundas regiones de unión, en la que al menos dos segundas regiones de unión comprenden una secuencia de ácido nucleico idéntica que es capaz de unirse a al menos una segunda molécula de ácido nucleico complementaria o a al menos una segunda molécula de ácido nucleico complementaria de al menos un segundo complejo informador.
[0112] El dominio de código de barras puede comprender una al menos tercera posición que comprende al menos dos terceras regiones de fijación, en donde las al menos dos terceras regiones de fijación comprenden una secuencia del ácido nucleico idéntica que es capaz de ser unida por una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario o una al menos tercera molécula del ácido nucleico complementario de un al menos tercer complejo indicador.
[0113] Cada posición en un dominio de código de barras puede comprender el mismo número de regiones de fijación. Al menos una posición en un dominio de código de barras puede comprender más de una región de fijación. Al menos una posición en un dominio de código de barras puede comprender un mayor número de regiones de fijación que otra posición.
[0114] Al menos una sonda puede comprender múltiples copias del dominio de unión a diana operativamente unido a un dominio de código de barras.
[0115] Cada complejo indicador puede comprender una marca detectable que comprende una molécula del ácido nucleico complementario directamente unida a una molécula del ácido nucleico primario. Cada complejo indicador puede comprender una marca detectable que comprende una molécula del ácido nucleico complementario indirectamente unida a una molécula del ácido nucleico primario a través de un espaciador de ácido nucleico. Cada complejo indicador puede comprender una marca detectable que comprende una molécula del ácido nucleico complementario indirectamente unida a una molécula del ácido nucleico primario a través de un espaciador polimérico con propiedades mecánicas similares a las de un espaciador de ácido nucleico. Cada complejo indicador puede comprender una marca detectable que comprende una molécula del ácido nucleico complementario indirectamente unida a una molécula del ácido nucleico primario a través de un conector escindible.
[0116] El enlazador escindible puede seleccionarse independientemente del grupo de los fotoescindibles, químicamente escindibles y enzimáticamente escindibles. Cada conector escindible puede ser independientemente escindible de todos los otros conectores. El conector fotoescindible se puede escindir por una fuente de luz seleccionada del grupo que consiste en una lámpara de arco, un láser, una fuente de luz UV focalizada y un diodo emisor de luz. Cada molécula del ácido nucleico primario se puede hibridar con al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis moléculas del ácido nucleico secundario.
[0117] La molécula o moléculas del ácido nucleico secundario pueden comprender al menos una marca detectable. Cada molécula del ácido nucleico secundario se puede hibridar con al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete moléculas del ácido nucleico terciario que comprenden al menos una marca detectable. Al menos una molécula del ácido nucleico secundario puede comprender una región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario puede comprender la secuencia de nucleótidos de la molécula del ácido nucleico complementario que se une directamente a la molécula del ácido nucleico primario. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario se puede ubicar en un extremo de la molécula del ácido nucleico secundario. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario puede comprender entre aproximadamente 8 nucleótidos y aproximadamente 20 nucleótidos. La región que no se hibrida con una molécula del ácido nucleico primario y no se hibrida con una molécula del ácido nucleico terciario puede comprender aproximadamente 12 nucleótidos.
[0118] La presente divulgación también proporciona un kit que comprende los reactivos para realizar cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento.
[0119] Cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores se puede combinar con cualquier otro aspecto o realización. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención.
[0120] Como se usa en el presente documento, las formas en singular de una palabra también incluyen la forma en plural de la palabra, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario; como ejemplos, se entiende que los términos "un", "una", "el" y "la" son singular o plural y el término "o" se entiende que es incluyente. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos.
[0121] En toda la memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "que comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento establecido, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.
[0122] Se puede entender que aproximadamente está dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o del 0,01 % del valor establecido. A menos que se deduzca claramente del contexto, todos los valores numéricos en el presente documento se proporcionan modificados por el término "aproximadamente".
[0123] DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
[0124] La patente o archivo de file contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color serán proporcionadas por la oficina previa solicitud y pago de la tasa correspondiente.
[0125] Los rasgos anteriores y adicionales serán más claramente apreciadas a partir de la siguiente descripción detallada cuando se toma junto con los dibujos adjuntos.
[0126] La Figura 1 muestra un esquema de una sonda a modo de ejemplo de la presente invención.
[0127] La Figura 2 muestra un esquema de una sonda a modo de ejemplo de la presente invención.
[0128] La Figura 3 muestra un esquema de una sonda a modo de ejemplo de la presente invención.
[0129] La Figura 4 muestra un esquema de una sonda a modo de ejemplo de la presente invención.
[0130] La Figura 5A ilustra una etapa de un método de la presente invención.
[0131] La Figura 5B ilustra una etapa del método de la presente invención empezado en la Figura 5A.
[0132] La Figura 5C ilustra una etapa del método de la presente invención empezado en la Figura 5A.
[0133] La Figura 5D ilustra una etapa del método de la presente invención empezado en la Figura 5A.
[0134] La Figura 6 ilustra un ejemplo de una purificación de una etapa en la que una sonda y una sonda de captura se añaden juntas a un ácido nucleico diana, formando de esta manera un complejo tripartito. El complejo tripartito se purifica siendo inmovilizado a un sustrato a través del reactivo de afinidad por sonda de captura.
[0135] La Figura 7 ilustra otro ejemplo de una purificación de una etapa en la que una sonda de captura que comprende un resto de unión se une a un ácido nucleico diana, entonces el complejo de sonda de capturaácido nucleico diana se inmoviliza a un sustrato a través del resto de unión y entonces una sonda se une al complejo inmovilizado.
[0136] La Figura 8A ilustra un ejemplo de purificación de múltiples etapas. Aquí, una sonda que comprende un reactivo de afinidad se une a un ácido nucleico diana, y entonces un complejo de sonda-ácido nucleico diana se purifica a través del reactivo de afinidad por sonda (no mostrado). Después, una sonda de captura que comprende un resto de unión se une al complejo para formar un complejo tripartito. Por último lugar, el complejo tripartito se purifica siendo inmovilizado a un sustrato a través del resto de unión a sondas de captura.
[0137] La Figura 8B ilustra otro ejemplo de purificación de múltiples etapas. Aquí, una sonda que comprende un reactivo de afinidad se une a un ácido nucleico diana, y entonces un complejo de sonda-ácido nucleico diana se purifica a través del reactivo de afinidad por sonda (no mostrado). Una sonda de captura, que previamente se ha inmovilizado al sustrato a través de resto de unión, captura el complejo de sonda-ácido nucleico diana purificado, formando así un complejo tripartito purificado e inmovilizado.
[0138] La Figura 8C ilustra otro ejemplo de purificación de múltiples etapas. Aquí, una sonda que comprende un reactivo de afinidad se une a un ácido nucleico diana, y entonces un complejo de sonda-ácido nucleico diana se purifica a través del reactivo de afinidad por sonda (no mostrado). Después, una sonda de captura que comprende un resto de unión y un reactivo de afinidad (que es diferente del reactivo de afinidad en la sonda) se une al complejo para formar un complejo tripartito. El complejo tripartito se purifica a través del reactivo de afinidad en la sonda de captura (no mostrado). Por último lugar, el complejo tripartito purificado se inmoviliza en un sustrato a través del resto de unión en la sonda de captura. La Figura 8D ilustra otro ejemplo de purificación de múltiples etapas. Aquí, una sonda de captura que comprende un resto de unión y un reactivo de afinidad se une a un ácido nucleico diana, y entonces un complejo de sonda de captura-ácido nucleico diana se purifica a través del reactivo de afinidad por sonda de captura (no mostrado). Después, una sonda se une al complejo para formar un complejo tripartito. Por último lugar, el complejo tripartito se purifica siendo inmovilizado a un sustrato a través del resto de unión de la sonda de captura.
[0139] La Figura 8E ilustra otro ejemplo de purificación de múltiples etapas. Aquí, una sonda de captura que comprende un resto de unión y un reactivo de afinidad y un resto de unión se une a un ácido nucleico diana, y entonces un complejo de sonda de captura-ácido nucleico diana se purifica a través del reactivo de afinidad por sonda de captura (no mostrado). Después, una sonda que comprende un reactivo de afinidad (que es diferente del reactivo de afinidad en la sonda de captura) se une al complejo para formar un complejo tripartito. El complejo tripartito se purifica a través del reactivo de afinidad en la sonda. Por último lugar, el complejo tripartito purificado se inmoviliza en un sustrato a través del resto de unión en la sonda de captura.
[0140] La Figura 9A muestra una etapa inicial de un método de la presente invención.
[0141] La Figura 9B muestra un esquema de un complejo indicador que comprende marcas detectables. La Figura 9C muestra una pluralidad de complejos indicadores que comprenden cada uno de ellos marcas detectables.
[0142] La Figura 9D muestra una etapa adicional del método empezado en la Figura 9A.
[0143] La Figura 9E muestra una etapa adicional del método empezado en la Figura 9A.
[0144] La Figura 9F muestra una etapa adicional del método empezado en la Figura 9A.
[0145] La Figura 10 muestra una ilustración alternativa de las etapas mostradas en la Figura 9D y la Figura 9E y datos ejemplares obtenidos de los mismos. El fragmento de la sonda mostrado tiene la secuencia de SEQ ID NO: 70.
[0146] La Figura 11 ilustra una variación del método mostrado en la Figura 10. El fragmento de la sonda mostrado tiene asimismo la secuencia de SEQ ID NO: 70.
[0147] La Figura 12A muestra diversos diseños de complejos indicadores de la presente invención.
[0148] La Figura 12B muestra recuentos de fluorescencia obtenidos de los complejos indicadores mostrados en la Figura 12A.
[0149] La Figura 12C muestra recetas a modo de ejemplo para construir complejos indicadores de la presente invención.
[0150] La Figura 13A muestra diseños de complejos indicadores que comprenden "asas extra".
[0151] La Figura 13B muestra recuentos de fluorescencia obtenidos de los complejos indicadores que tienen "asas extra".
[0152] La Figura 14A muestra la cinética de hibridación de dos diseños a modo de ejemplo de complejos indicadores de la presente invención.
[0153] La Figura 14B muestra la cinética de hibridación de dos diseños a modo de ejemplo de complejos indicadores de la presente invención.
[0154] La Figura 15A describe un diseño de sonda de código de barras pequeña.
[0155] La Figura 15B muestra datos obtenidos con un método de la presente invención cuando las sondas se proporcionan a una menor concentración.
[0156] La Figura 15C muestra datos obtenidos con un método de la presente invención cuando las sondas se proporcionan a una mayor concentración.
[0157] La Figura 16A muestra datos obtenidos con un método de la presente invención en el que una pluralidad de ácidos nucleicos diana se detectan simultáneamente.
[0158] La Figura 16B compara datos obtenidos con los presentes métodos y datos obtenidos con sondas que comprenden marcas detectables.
[0159] La Figura 17A demuestra la hibridación y captura de recuentos y detección de dianas de ADN específicas. La Figura 17B muestra la detección de dianas en un panel de captura 100-ple.
[0160] La Figura 18 muestra las distribuciones de intensidad de los indicadores multicolor.
[0161] La Figura 19 muestra las tasas de error para un modelo de 14 clases (izquierda) y un modelo de 10 clases. La Figura 20 muestra un esquema de sondas indicadoras de dos colores.
[0162] La Figura 21 muestra el flujo de trabajo de la hibridación de sondas para la captura dirigida de ácidos nucleicos.
[0163] La Figura 22 muestra la captura dirigida de ácidos nucleicos usados para la inferencia de largo alcance de haplotipos.
[0164] La Figura 23 es un diagrama que ilustra los ciclos de secuenciación usando BC precomplejado con RPTR escindibles, también conocido como moléculas del ácido nucleico complementario que incluyen una marca detectable y conector escindible.
[0165] La Figura 24 es un diagrama que ilustra el método de identificación de cada RPTR usando escisión de RPTR y resta de imagen.
[0166] La Figura 25 es un diagrama de la construcción de sondas RPTR escindibles y muestra ejemplos de modificaciones de escisión.
[0167] La Figura 26 muestra que el tiempo de incubación de la hibridación fue variable y los recuentos totales por campo de vista se usaron para determinar la eficiencia relativa del complejo BC/RPTR en comparación con BC solo seguido por RPTR que se unen a una segunda etapa. BC y RPTR usados se muestran en la Figura 27. Los complejos BC/RPTR tienen cinética de unión más lenta que BC solo, pero pueden lograr eficiencia de unión similar con tiempos de incubación más largos.
[0168] La Figura 27 muestra que las identidades de RPTR se pueden determinar usando el enfoque de resta de imagen. El código de barras BRAFex15-BC3 se precomplejó con RPTR escindibles y se procesó durante un ciclo completo. Se subrayan cuatro rasgos de una porción pequeña de una imagen y los cambios en cada canal fluorescente se muestran en los gráficos de barras. La escisión se realizó primero para la RPTR unido al punto 3 (pt3) usando la mezcla de enzimas USER, una mezcla de uracil ADN glicosilasa (UDG) y ADN glicosilasa-liasa endonucleasa VIII, luego se realizó la escisión para el punto 1 (pt1) usando exposición a luz UV. RPTR unido al punto 2 (pt2) no fue escindible.
[0169] La Figura 28 muestra la detección y correcta identificación de RPTR GY de medio color tras la escisión. Se complejaron BC con un RPTR escindible por UV y dos RPTR no escindibles y se hibridaron con una diana de ADN inmovilizada sobre la superficie de la celda de flujo. Las intensidades fluorescentes de RPTR se determinaron antes y después de la exposición a UV para escindir el RPTR individual para determinar la exactitud/grado al que el medio color (es decir, GY en lugar de GG, un RPTR a todo color) se podría detectar en presencia de otros indicadores.
[0170] La Figura 29 muestra la detección y correcta identificación de RPTR GY a color completo tras la escisión para la comparación con la Figura 6. Se complejaron BC con un RPTR escindible por UV y dos RPTR no escindibles y se hibridaron con una diana de ADN inmovilizada sobre la superficie de la celda de flujo. Las intensidades fluorescentes de RPTR se determinaron antes y después de la exposición a UV para escindir el RPTR individual para determinar la exactitud/grado al que se podría detectar un color completo (es decir, GG) en presencia de otros indicadores.
[0171] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0172] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La divulgación proporciona sondas, métodos, kits y aparatos que proporcionan una detección, identificación y cuantificación multiplexada precisa, rápida y sensible de moléculas diana en una muestra.
[0173] Sondas para detectar uno o más ácidos nucleicos en una muestra
[0174] La presente invención se refiere a una sonda que comprende un dominio de unión a diana y un dominio de código de barras. El dominio de unión a diana y el dominio de código de barras pueden estar unidos operativamente, por ejemplo, unidos covalentemente. Una sonda comprende opcionalmente un espaciador entre el dominio de unión a diana y el dominio de código de barras. El espaciador puede ser cualquier polímero con propiedades mecánicas apropiadas, por ejemplo, un espaciador de ADN mono- o bicatenario (de 1 a 100 nucleótidos, por ejemplo, 2 a 50 nucleótidos). Los ejemplos no limitantes de espaciadores de ADN bicatenario incluyen las secuencias cubiertas por SEQ ID NO: 25 a SEQ ID NO: 29. Secuencias adicionales a modo de ejemplo que se pueden incluir en un dominio de código de barras se enumeran en SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 69.
[0175] Ejemplos no limitantes de sondas de la presente invención se muestran en las Figuras 1 a 5.
[0176] La Figura 1 muestra un esquema de una sonda de la presente invención. La sonda a modo de ejemplo tiene un dominio de unión a diana de seis nucleótidos. El dominio de unión a diana de cada sonda tiene una secuencia de nucleótidos conocida. El dominio de código de barras comprende una o más regiones de fijación; en la Figura 1, existen seis regiones de fijación. Se observan una primera región de fijación, una tercera región de fijación y quinta región de fijación. La quinta posición comprende dos regiones de fijación. Cada posición en un dominio de código de barras puede tener múltiples regiones de fijación. Por ejemplo, una posición puede tener 1 a 50 regiones de fijación. Ciertas posiciones en un dominio de código de barras pueden tener más regiones de fijación que otras posiciones (como se muestra aquí en la posición 5 con respecto a las posiciones 1 a 4 y 6); alternativamente, cada posición en un dominio de código de barras tiene el mismo número de regiones de fijación. Aunque no se muestra, cada región de unión comprende al menos unas(es decir,de una a cincuenta,por ejemplo,de diez a treinta) copias de una(s) secuencia(s) de ácido nucleico capaz(s) de unirse reversiblemente a una molécula de ácido nucleico complementaria (ARN o ADN). En la Figura 1, las regiones de fijación son integrales a la molécula de polinucleótido lineal que constituye el dominio de código de barras. El orden lineal de posiciones de fijación y/u orden lineal de posiciones identifican una región específica de un ácido nucleico diana al que se une el dominio de unión a diana.
[0177] La Figura 2 muestra un esquema de una sonda de la presente invención. La sonda a modo de ejemplo tiene un dominio de unión a diana de cinco nucleótidos. El dominio de unión a diana de cada sonda tiene una secuencia de nucleótidos conocida. Se observa primera región de fijación; la primera posición en el dominio de código de barras comprende dos primeras regiones de fijación que están unidas a (no son integrales) al dominio de código de barras. Están rodeadas cuarta posición en el dominio de código de barras, que comprende una porción del dominio de código de barras y dos cuartas regiones de fijación. Se observan dos sextas regiones de fijación. Aquí, cada posición tiene dos regiones de fijación; sin embargo, cada posición en un dominio de código de barras puede tener una región de fijación o múltiples regiones de fijación, por ejemplo, 2 a 50 regiones de fijación. Aunque no se muestra, cada región de unión comprende al menos unas(es decir,de una a cincuenta,por ejemplo,de diez a treinta) copias de una(s) secuencia(s) de ácido nucleico capaz(s) de unirse reversiblemente a una molécula de ácido nucleico complementaria (ARN o ADN). En la Figura 2, el dominio de código de barras es una molécula de polinucleótido lineal a la que están unidas/ramificadas las regiones de fijación; las regiones de fijación no son integrales a la molécula de polinucleótido. El orden lineal de posiciones de fijación y/u orden lineal de posiciones identifican una región específica de un ácido nucleico diana al que se une el dominio de unión a diana.
[0179] La Figura 3 muestra otro esquema de una sonda de la presente invención. La sonda a modo de ejemplo tiene un dominio de unión a diana de cuatro nucleótidos. Cada posición se muestra con tres regiones de fijación que están unidas a/ramificadas de la posición.
[0181] La Figura 4 muestra otro esquema más de una sonda de la presente invención. La sonda a modo de ejemplo tiene un dominio de unión a diana de diez nucleótidos. Sin embargo, solo los primeros seis nucleótidos son específicos del ácido nucleico diana. Los séptimos a décimos nucleótidos (indicados por "n<1>a n<4>") se añaden para aumentar la longitud del dominio de unión a la diana, afectando así a la probabilidad de que una sonda se hibridice y permanezca hibridzada con un ácido nucleico diana. Los "n" nucleótidos pueden tener bases universales (por ejemplo, inosina, derivados de 2'-desoxiinosina (desoxinucleótido de hipoxantina), nitroindol, análogos de nitroazol, y bases aromáticas hidrófobas que no se unen a hidrógeno) que pueden emparejar bases con cualquiera de las cuatro bases canónicas. En realizaciones, "n" nucleótidos pueden preceder a los nucleótidos específicos del dominio de unión a diana. En realizaciones, "n" nucleótidos pueden seguir a los nucleótidos específicos del dominio de unión a diana. En la Figura 4, se muestran cuatro "n" nucleótidos; sin embargo, un dominio de unión a diana puede incluir más o menos de cuatro "n" nucleótidos. Un dominio de unión a diana puede carecer de "n" nucleótidos. La segunda posición incluye seis regiones de fijación que están unidas a/ramificadas de la segunda posición del dominio de código de barras.
[0183] El dominio de unión a diana tiene al menos cuatro nucleótidos, por ejemplo, al menos, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más nucleótidos. El dominio de unión a diana puede incluir 10-100, 20-160 o 35-50 nucleótidos. El dominio de unión a diana es preferentemente un polinucleótido. El dominio de unión a diana es capaz de unirse a un ácido nucleico diana.
[0185] Una sonda puede incluir múltiples copias del dominio de unión a diana unido operativamente a un esqueleto sintético.
[0187] Las sondas se pueden diseñar para controlar la probabilidad de hibridación y/o deshibridación y las tasas a las que estas ocurren. En general, cuanto más baja es la Tm de una sonda, más rápidos y más probable que la sonda se deshibridará con/de un ácido nucleico diana. Por lo tanto, el uso de sondas de Tm más baja disminuirá el número de sondas unidas a un ácido nucleico diana.
[0189] La longitud de un dominio de unión a diana afecta, en parte, la probabilidad de una sonda que se hibrida y que queda hibridada con un ácido nucleico diana. En general, cuanto más largo (mayor número de nucleótidos) sea un dominio de unión a diana, menos probable es que una secuencia complementaria esté presente en el nucleótido diana. En cambio, cuanto más corto sea un dominio de unión a diana, más probable será que una secuencia complementaria esté presente en el nucleótido diana. Por ejemplo, existe una probabilidad 1/256 de que una secuencia tetrámera se ubique en un ácido nucleico diana frente a una probabilidad de 1/4096 de que una secuencia hexámera se ubique en el ácido nucleico diana. Por consiguiente, un conjunto de sondas más cortas se unirá probablemente en más localizaciones para una extensión dada de un ácido nucleico cuando se compara con un conjunto de sondas más largas.
[0191] El término "ácido nucleico diana" debe significar una molécula del ácido nucleico (ADN, ARN o PNA) cuya presencia en una muestra va a ser determinada por las sondas, métodos y aparatos de la invención. En general, los términos "ácido nucleico diana", "molécula del ácido nucleico", "secuencia del ácido nucleico", "ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente y pretenden incluir, pero no se limitan a, una forma polimérica de nucleótidos que tiene diversas longitudes, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos incluyen un gen, un fragmento de gen, un exón, un intrón, ADN intergénico (incluyendo, sin limitación, ADN heterocromático), ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ARN interferente pequeño (ARNip), ARN no codificante (ARNnc), ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de una secuencia, ARN aislado de una secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores.
[0192] En ciertas realizaciones específicas, esa molécula diana no es un cromosoma. En otras realizaciones específicas, la molécula diana no es superior a 1.000 kb (o 1 mb) de tamaño, no superior a 500 kb de tamaño, no superior a 250 kb de tamaño, no superior a 175 kb de tamaño, no superior a 100 kb de tamaño, no superior a 50 kb de tamaño, no superior a 20 kb de tamaño, o no superior a 10 kb de tamaño. En aún otras realizaciones específicas, la molécula diana se aísla de su medio celular.
[0193] Los presentes métodos identifican y cuantifican una molécula del ácido nucleico obtenida de una muestra, por ejemplo, una muestra de un organismo, y, preferentemente, sin una etapa de conversión (o amplificación). Como ejemplo, para los métodos de identificación de ARN, los presentes métodos no requieren la conversión de una molécula de ARN en una molécula de ADN(es decir,mediante síntesis de ADNc) antes de que el ARN pueda ser identificado. Puesto que no se requiere amplificación o conversión, en la mayoría de las circunstancias, un ácido nucleico en la presente invención retendrá cualquier base única y/o marcador epigenético presente en el ácido nucleico cuando el ácido nucleico está en la muestra o cuando se obtuvo de la muestra. Dichas bases únicas y/o marcadores epigenéticos se pierden en muchos métodos conocidos en la técnica.
[0194] El ácido nucleico diana se puede obtener de cualquier muestra o fuente de ácido nucleico, por ejemplo, cualquier célula, tejido u organismo,in vitro, sintetizador químico, etc. El ácido nucleico diana se puede obtener por cualquier método reconocido en la técnica. En realizaciones, el ácido nucleico se obtiene de una muestra de sangre de un sujeto clínico. El ácido nucleico se puede extraer, aislar o purificar de la fuente o muestras usando métodos y kits bien conocidos en la técnica.
[0195] Como será apreciado por los expertos en la técnica, la muestra puede comprender cualquier número de cosas, que incluyen, pero no se limitan a: células (incluyendo tanto células primarias como líneas de células cultivadas), lisados o extractos celulares (incluyendo, pero no se limitan a, extractos de ARN; ARNm purificado), tejidos y extractos de tejido (incluyendo, pero no se limitan a, extractos de ARN; ARNm purificado); líquidos corporales (incluyendo, pero no se limitan a, sangre, orina, suero, linfa, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido intersticial, humor acuoso o vítreo, calostro, esputo, líquido amniótico, saliva, secreciones anales y vaginales, transpiración y semen, un trasudado, un exudado (por ejemplo, líquido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infección o inflamación) o líquido obtenido de una articulación (por ejemplo, una articulación normal o una articulación afectada por enfermedad, tal como artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artritis séptica) de prácticamente cualquier organismo, siendo preferidas las muestras de mamífero y siendo particularmente preferidas las muestras humanas; muestras medioambientales (incluyendo, pero no se limitan a, muestras de aire, agrícolas, agua y tierra); muestras de agentes de guerra biológica; muestras de investigación, que incluyen líquidos extracelulares, sobrenadantes extracelulares de cultivos celulares, cuerpos de inclusión en bacterias, compartimentos celulares, periplasma celular, compartimento mitocondrial.
[0196] Las muestras biomoleculares pueden derivar indirectamente de especímenes biológicos. Por ejemplo, donde la molécula diana de interés es un transcrito celular, por ejemplo, un ARN mensajero, la muestra biomolecular de la invención puede ser una muestra que contiene ADNc producido por una transcripción inversa de ARN mensajero. En otro ejemplo, la muestra biomolecular de la invención se genera sometiendo un espécimen biológico a fraccionamiento, por ejemplo, fraccionamiento por tamaño o fraccionamiento en membrana.
[0197] Las muestras biomoleculares de la invención pueden ser "nativas", es decir, no sujetas a manipulación o tratamiento, o "tratadas", que pueden incluir cualquier número de tratamientos, que incluyen exposición a agentes candidato que incluyen fármacos, ingeniería genética (por ejemplo, la adición o deleción de un gen).
[0198] Una molécula del ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana puede ser fragmentada mediante cualquier medio conocido en la técnica. Preferentemente, la fragmentación se realiza por un medio enzimático o mecánico. Los medios mecánicos pueden ser sonicación o cizallamiento físico. Los medios enzimáticos pueden realizarse por digestión con nucleasas (por ejemplo, desoxirribonucleasa I (DNasa I)) o con una o más endonucleasas de restricción.
[0199] Cuando una molécula del ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana es un cromosoma intacto, deben tomarse medidas para evitar la fragmentación del cromosoma.
[0200] El ácido nucleico diana puede incluir nucleótidos naturales o no naturales, que comprenden nucleótidos modificados, como son muy conocidos en la técnica.
[0201] Las sondas de la presente invención pueden tener longitudes globales (incluyendo dominio de unión a diana, dominio de código de barras y cualquier dominio opcional) de aproximadamente 20 nanómetros a aproximadamente 50 nanómetros. El esqueleto de una sonda puede ser una molécula de polinucleótido que comprende aproximadamente 120 nucleótidos.
[0202] El dominio de código de barras comprende un esqueleto sintético. El esqueleto sintético y el dominio de unión a diana están unidos de forma operable,por ejemplo,están unidos covalentemente o unidos mediante un enlazador. El esqueleto sintético puede comprender cualquier material, por ejemplo, polisacárido, polinucleótido, polímero, plástico, fibra, péptido, ácido nucleico peptídico o polipéptido. Preferentemente, el esqueleto sintético es rígido. En realizaciones, el esqueleto comprende "origami de ADN" de seis dobles hélices de ADN (Véase, por ejemplo,Lin et al, "Submicrometre geometrically encoded fluorescent barcodes self-assembled from DNA." Nature Chemistry; 2012 Oct; 4(10): 832-9). Un código de barras se puede preparar de baldosas de origami de ADN (Jungmann et al, "Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT", Nature Methods, Vol.
[0203] 11, No.3, 2014).
[0204] El dominio del código de barras comprende una pluralidad de posiciones, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más posiciones. El número de posiciones puede ser inferior a, igual a, o superior al número de nucleótidos en el dominio de unión a diana. En las realizaciones, es preferente incluir nucleótidos adicionales en un dominio de unión a diana que el número de posiciones en el dominio vertebral, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más nucleótidos. En realizaciones, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana es al menos dos veces el número de regiones de fijación en el dominio de código de barras. En realizaciones adicionales, el número de nucleótidos en un dominio de unión a diana es 8 y el número de regiones de fijación en el dominio de código de barras es tres. La longitud del dominio de código de barras no se limita en tanto que haya espacio suficiente para al menos cuatro posiciones, como se ha descrito anteriormente. Cada posición en el dominio de código de barras comprende al menos una región de fijación, por ejemplo, una a 50, o más, regiones de fijación. Ciertas posiciones en un dominio de código de barras pueden tener más regiones de fijación que otras posiciones (por ejemplo, una primera posición puede tener tres regiones de fijación mientras que una segunda posición puede tener dos posiciones de fijación); alternativamente, cada posición en un dominio de código de barras tiene el mismo número de regiones de fijación. Cada región de unión comprende al menos unas(es decir,de una a cincuenta,por ejemplo,de diez a treinta) copias de una(s) secuencia(s) de ácido nucleico capaz(s) de ser unida reversiblemente por una molécula de ácido nucleico complementaria (por ejemplo, ADN o ARN).
[0205] Cada región de unión puede estar unida a un monómero modificado (por ejemplo, un nucleótido modificado) en el esqueleto sintético, de forma que la región de unión se ramifique a partir del esqueleto sintético. En realizaciones, las regiones de fijación son integrales a un esqueleto de polinucleótido; es decir, el esqueleto es un polinucleótido individual y las regiones de fijación son partes de la secuencia del polinucleótido individual. En realizaciones, los términos "dominio de código de barras" y "esqueleto sintético" son sinónimos.
[0206] Para cada sonda, la secuencia de nucleótidos para cada región de fijación en una posición es idéntica. Por lo tanto, en la sonda, cada primera región de fijación en una primera posición tiene la misma secuencia de nucleótidos. Asimismo, cada novena región de fijación en una novena posición tiene la misma secuencia de nucleótidos. En una sonda, cada región de fijación o las regiones de fijación dentro de una posición tendrán una secuencia única. Por tanto, la región de fijación de una primera posición incluirá una secuencia del ácido nucleico diferente de la región de fijación de una segunda posición. Por lo tanto, a una secuencia del ácido nucleico en una región de fijación en una primera posición no se le unirá una molécula del ácido nucleico complementario que es específica de una región de fijación de una segunda posición. Por tanto, a una región de fijación en una segunda posición no se le unirá una molécula del ácido nucleico complementario que es específica de una región de fijación de una tercera posición.
[0207] Cada posición en un dominio de código de barras puede incluir uno o más regiones de fijación (hasta cincuenta, preferentemente diez a treinta); por lo tanto, cada región de fijación puede unirse a uno o más moléculas del ácido nucleico complementario (hasta cincuenta, preferentemente diez a treinta). En una realización, al menos una posición en un dominio de código de barras comprende más de una región de fijación. En otra realización, al menos una posición en un dominio de código de barras comprende un mayor número de regiones de fijación que otra posición. Como ejemplos, la sonda en la Figura 1 tiene una quinta posición que comprende dos regiones de fijación y la sonda en la Figura 4 tiene una segunda posición que tiene seis regiones de fijación. En realizaciones, las secuencias del ácido nucleico de regiones de fijación a una posición son idénticos; por lo tanto, las moléculas del ácido nucleico complementario que se unen a esas regiones de fijación son idénticas.
[0208] En realizaciones alternativas, las secuencias de ácido nucleico de las regiones de unión en una posición no son idénticas; por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico complementarias que se unen a esas regiones de unión no son idénticas, por ejemplo, cada una comprende una secuencia de ácido nucleico diferente y/o un marcador detectable. Por lo tanto, en la realización alternativa, la combinación de moléculas de ácido nucleico no idénticas (por ejemplo, sus marcadores detectables) unidas a una región de unión proporciona conjuntamente un código para identificar un nucleótido en el ácido nucleico diana.
[0209] La Tabla 1 proporciona secuencias a modo de ejemplo, para fines de ilustración solo, de regiones de fijación para sondas que tienen hasta seis posiciones en su dominio de código de barras y marcas detectables en el ácido nucleico complementario que se unen a ellas.
[0210] Tabla 1:
[0211]
[0213] Como se observa en la Tabla 1, la secuencia del ácido nucleico de una primera región de fijación puede ser una de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, la secuencia del ácido nucleico de una segunda fijación puede ser una de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 8, y la secuencia del ácido nucleico de una tercera fijación puede ser una de SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 12.
[0214] La Tabla 1 muestra que una región de fijación dada se puede unir con uno de cuatro posibles ácidos nucleicos complementarios que comprenden una marca detectable o complejos indicadores que comprenden marcas detectables. Por lo tanto, una primera posición se puede marcar con GFP, si la región de fijación de la primera posición comprende SEQ ID NO: 1; alternativamente, la primera posición se puede marcar con RFP, si la región de fijación de la primera posición comprende SEQ ID NO: 2. Se pueden usar marcas detectables distintas de GFP, RFP, CFP y YFP. Además, la secuencia de nucleótidos para una región de fijación puede ser diferentes de la enumerada en la Tabla 1.
[0215] Cuando la región de fijación de la primera posición comprende SEQ ID NO: 1, la segunda región de fijación de la segunda posición comprende SEQ ID NO: 5 y la segunda región de fijación de la tercera posición comprende SEQ ID NO: 9, la sonda tendrá una primera, segunda y tercera posición que se marca con GFP. Este código GFP de tres posiciones (es decir, un orden lineal de marcadores detectables) identifica el ácido nucleico diana unido por el sitio de unión a la diana de la sonda (por ejemplo,GATA3).
[0216] Sin embargo, por ejemplo, cuando la región de fijación de la primera posición comprende SEQ ID NO: 1, la segunda región de fijación de la segunda posición comprende SEQ ID NO: 6 y la segunda región de fijación de la tercera posición comprende SEQ ID NO: 12, la sonda tendrá una primera, segunda y tercera posición que se marca con GFP, RFP y YFP, respectivamente. Este código GFP-RFP-YFP de tres posiciones (es decir, un orden lineal de marcadores detectables) identifica el ácido nucleico diana unido por el sitio de unión a la diana de la sonda (por ejemplo,MafB).Juntos, la selección de regiones de fijación para cada posición define un código de color lineal que puede producir un esqueleto de sonda; este código lineal está asociado con un ácido nucleico diana específico que es complementario a una secuencia de nucleótidos conocida del dominio de unión a diana.
[0217] Similarmente, por ejemplo, cuando la región de fijación de la primera posición comprende SEQ ID NO: 1, la segunda región de fijación de la segunda posición comprende SEQ ID NO: 6 y la segunda región de fijación de la tercera posición comprende SEQ ID NO: 11, la sonda tendrá una primera, segunda, y tercera posición que se marca con GFP, RFP y CFP, respectivamente. Este código GFP-RFP-CFP de tres posiciones (es decir, un orden lineal de etiquetas detectables) identifica el ácido nucleico diana unido por el sitio de unión a la diana de la sonda (por ejemplo,Fat3)..
[0218] Juntas, las tres sondas que se unen respectivamente aGATA3, MafB,yFat3pueden aplicarse simultáneamente a una muestra y la presencia y cantidad de cada una deGATA3, MafB,yFat3pueden detectarse debido a una diferencia en su orden lineal de etiquetas detectables.
[0219] En realizaciones, a molécula del ácido nucleico complementario se pueden unir por una marca detectable. En realizaciones alternativas, a ácido nucleico complementario está asociado con a complejo indicador que comprende marcas detectables.
[0220] La secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico complementario no está limitada; preferentemente, carece de homología sustancial (por ejemplo, 50 % al 99,9 %) con una secuencia de nucleótidos conocida; esto ayuda a evitar la hibridación no deseable de un ácido nucleico complementario y un ácido nucleico diana.
[0221] Un ejemplo del complejo indicador útil en la presente invención se muestra en la Figura 9B. En este ejemplo, un ácido nucleico complementario se une a (se ramifica a partir de) una molécula del ácido nucleico primario, que a su vez se hibrida con una pluralidad de moléculas del ácido nucleico secundario, cada una de las cuales se hibrida a su vez con una pluralidad de moléculas del ácido nucleico terciario que tienen unido a ellas una o más marcas detectables.
[0222] En realizaciones, una molécula del ácido nucleico primario puede comprender aproximadamente 90 nucleótidos. Una molécula del ácido nucleico secundario puede comprender aproximadamente 87 nucleótidos. Una molécula del ácido nucleico terciario puede comprender aproximadamente 15 nucleótidos.
[0223] La Figura 9C muestra una población de complejos informadores ejemplares. En el panel superior izquierdo de la Figura 9C están incluidos los cuatro complejos que se hibridan con la región de fijación 1 de una sonda. Existe un tipo de complejo indicador para cada nucleótido posible que puede estar presente en la posición de nucleótido 1 del dominio de unión a diana de una sonda.
[0224] Los complejos indicadores pueden ser de diversos diseños. Por ejemplo, una molécula del ácido nucleico primario se puede hibridar con al menos una molécula del ácido nucleico secundario (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más). Cada molécula del ácido nucleico secundario se puede hibridar con al menos una molécula del ácido nucleico terciario (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más). Complejos indicadores a modo de ejemplo se muestran en la Figura 12A. Aquí, el complejo informador "4x3" tiene una molécula de ácido nucleico primaria (que está unida a/se ramifica a partir de una molécula de ácido nucleico complementaria) hibridada a cuatro moléculas de ácido nucleico secundarias, cada una de las cuales está hibridada a tres moléculas de ácido nucleico terciarias (cada una de las cuales comprende un marcador detectable). En esta Figura, cada ácido nucleico complementario de un complejo es 12 nucleótidos de largo ("12 bases"); sin embargo, la longitud del ácido nucleico complementario no está limitada y puede ser inferior a 12 o superior a 12 nucleótidos. El complejo derecho inferior incluye una región espaciadora entre su ácido nucleico complementario y su molécula del ácido nucleico primario. El espaciador se identifica como 20 a 40 nucleótidos de largo; sin embargo, la longitud de un espaciador no es limitante y puede ser más corta de 20 nucleótidos o más larga de 40 nucleótidos.
[0225] La Figura 12B muestra recuentos (fluorescentes) promedio variables obtenidos de los cuatro complejos indicadores a modo de ejemplo mostrados en la Figura 12A. En la Figura 12B, 10 pM de molde diana biotinilado se unió a una superficie de celda de flujo recubierta de estreptavidina, se hizo fluir 10 nM de un complejo indicador sobre la celda de flujo; después de una incubación de un minuto, se lavó la celda de flujo, se obtuvieron imágenes de la celda de flujo y se contaron los rasgos fluorescentes.
[0226] En realizaciones, los complejos indicadores son "preconstruidos". Es decir, cada polinucleótido en el complejo se hibrida antes de poner en contacto el complejo con una sonda. Una receta a modo de ejemplo para preconstruir cinco complejos indicadores modo de ejemplo se muestra en la Figura 12C.
[0227] La Figura 13A muestra complejos indicadores alternos en los que las moléculas del ácido nucleico secundario tienen "asas extra" que no están hibridadas con una molécula del ácido nucleico terciario y son distales a la molécula del ácido nucleico primario. En esta Figura, cada "asa extra" es de 12 nucleótidos de largo ("12-mera"); sin embargo, sus longitudes no están limitadas y pueden ser inferiores a 12 o superiores a 12 nucleótidos. En realizaciones, cada una de las "asas extra" comprende la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico complementario; por lo tanto, cuando un complejo indicador comprende "asas extra", el complejo indicador se puede hibridar con una sonda ya sea a través del ácido nucleico complementario del complejo indicador o a través de un "asa extra". Por consiguiente, la probabilidad de que un complejo indicador se una a una sonda es elevada. El diseño de "asa extra" también puede mejorar la cinética de hibridación. Sin quedar ligado a teoría, las "asas extra" aumentan esencialmente la concentración eficaz del ácido nucleico complementario de complejo indicador.
[0228] La Figura 13B muestra recuentos (fluorescentes) promedio variables obtenidos de los cinco complejos indicadores a modo de ejemplo que tienen "asas extra" usando el procedimiento descrito para la Figura 12B.
[0230] La Figura 14A y 14B muestra la cinética de hibridación e intensidades fluorescentes para dos complejos indicadores a modo de ejemplo. En aproximadamente cinco minutos, los recuentos totales empiezan a estabilizarse, que indica que el máximo complejo indicador añadido ha encontrado una diana disponible.
[0232] Un resto detectable, marca o indicador se puede unir a un ácido nucleico complementario o a una molécula del ácido nucleico terciario en una variedad de formas, que incluye la fijación directa o indirecta de un resto detectable, tal como un resto fluorescente, resto colorimétrico y similares. Una marca detectable puede incluir múltiples restos detectables que tienen cada uno un espectro de emisión individual que puede ser igual o diferente. Por ejemplo, una marca detectable puede incluir múltiples fluoróforos cada uno de los cuales tiene un espectro de emisión que puede ser igual o diferente. Un experto en la técnica puede consultar referencias referidas al marcado de ácidos nucleicos. Los ejemplos de restos fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína verde fluorescente (GFP), proteína cian fluorescente (CFP), proteína roja fluorescente (RFP), umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cianinas, cloruro de dansilo, ficocianina, ficoeritrina y similares. Marcas fluorescentes y su fijación a nucleótidos y/u oligonucleótidos se describen en muchas revisiones, que incluyen Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, novena edición (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller y Manak, DNA Probes, 2.ª edición (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); y Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:227-259 (1991). Metodologías particulares aplicables a la invención se desvelan en la siguiente muestra de referencias: las patentes de EE. UU. n.º 4,757.141; 5.151.507; y 5.091.519. En un aspecto, se utilizan uno o más colorantes fluorescentes como etiquetas para secuencias diana marcadas, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. Nos.5,188,934 (colorantes de 4,7-diclorofluoresceína); 5,366,860 (colorantes de rodamina espectralmente resolubles); 5,847,162 (colorantes de 4,7-diclororhodamina); 4,318,846 (colorantes de fluoresceína sustituidos por éter); 5,800,996 (colorantes de transferencia de energía); Leeet al.5,066,580 (colorantes de xantina); 5,688,648 (colorantes de transferencia de energía); y similares. El marcado también se puede llevar a cabo con puntos cuánticos, como se desvela en las siguientes patentes y publicaciones de patente: las patentes de EE. UU. n.º 6.322.901; 6.576.291; 6.423.551; 6.251.303; 6.319.426; 6.426.513; 6.444.143; 5.990.479; 6.207.392; 2002/0045045; y 2003/0017264. Como se usa en el presente documento, el término "marca fluorescente" comprende un resto de señalización que transporta información a través de las propiedades de absorción y/o emisión fluorescente de una o más moléculas. Dichas propiedades fluorescentes incluyen intensidad de fluorescencia, vida útil de la fluorescencia, características del espectro de emisión, transferencia de energía, y similares. Una marca fluorescente, como se usa en el presente documento, puede incluir múltiples restos detectables, cada uno de los cuales tiene una propiedad de absorción y/o emisión fluorescente individual que puede ser igual o diferente. Por ejemplo, una marca fluorescente puede incluir múltiples fluoróforos, cada uno de los cuales tiene un espectro de emisión que puede ser igual o diferente. En un ejemplo adicional no limitante, una marca fluorescente puede incluir cualquier combinación de los fluoróforos ALEXA FLUOR<™>350, ALEXA FLUOR<™>405, ALEXA FLUOR<™>430, ALEXA FLUOR<™>532, ALEXA FLUOR<™>546, ALEXA FLUOR<™>568, ALEXA FLUOR<™>594 y ALEXA FLUOR<™>647.
[0234] Los análogos de nucleótidos fluorescentes comercialmente disponibles que se incorporan fácilmente a secuencias de nucleótidos y/u oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, Cy3-dCTP, Cy3-dUTP, Cy5-dCTP, Cy5-dUTP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), fluoresceína-12-dUTP, tetrametilrhodamina-6-dUTP, TEXAS RED<™>-5-dUTP, CASCADE BLUE<™>-7-dUTP, BODIPY TMFL-14-dUTP, BODIPY TMR-14-dUTP, BODIPY TMTR-14-dUTP, RHODAMINE GREEN<™>-5-dUTP, OREGON GREENR<™>488-5-dUTP, TEXAS RED<™>- 12-dUTP, BODIPY TM 630/650- 14-dUTP, BODIPY TM 650/665- 14-dUTP, ALEXA FLUOR<™>488-5-dUTP, ALEXA FLUOR<™>532-5-dUTP, ALEXA FLUOR<™>568-5-dUTP, ALEXA FLUOR<™>594-5-dUTP, ALEXA FLUOR<™>546- 14-dUTP, fluoresceína- 12-UTP, tetrametilrhodamina-6-UTP, TEXAS RED<™>-5-UTP, mCherry, CASCADE BLUE<™>-7-UTP, BODIPY TM FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, BODIPY TM TR-14-UTP, RHODAMINE GREEN<™>-5-UTP, ALEXA FLUOR<™>488-5-UTP, LEXA FLUOR<™>546- 14-UTP (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) y similares. Alternativamente, los fluoróforos anteriores y los mencionados en el presente documento se pueden añadir durante la síntesis de oligonucleótidos usando, por ejemplo, química de fosforamidito o NHS. Se conocen en la técnica protocolos para la síntesis personalizada de nucleótidos que tienen otros fluoróforos (Véase,Henegariuet al.(2000) Nature Biotechnol. 18:345). La 2-aminopurina es una base fluorescente que se puede incorporar directamente en la secuencia de oligonucleótidos durante su síntesis. El ácido nucleico también podría teñirse, a priori, con un colorante intercalante como DAPI, YOYO- 1 , bromuro de etidio, colorantes de cianina (por ejemplo, SYBR Green) y similares.
[0235] Otros fluoróforos disponible para la fijación postsintética incluyen, pero no se limitan a, ALEXA FLUOR<™>350, ALEXA FLUOR<™>405, ALEXA FLUOR<™>430, ALEXA FLUOR<™>532, ALEXA FLUOR<™>546, ALEXA FLUOR<™>568, ALEXA FLUOR<™>594, ALEXA FLUOR<™>647, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, Cascade Blue, Cascade Yellow, dansilo, rodamina B Lissamine, azul marino, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific Blue, Pacific Orange, rodamina 6G, verde de rodamina, rojo de rodamina, tetrametilrrodamina, Texas Red (disponible de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y similares. También se pueden usar fluoróforos en tándem FRET, que incluyen, pero no se limitan a, PerCP-Cy5,5, PE-Cy5, PE-Cy5,5, PE-Cy7, PE-Texas Red, APC-Cy7, colorantes PE-Alexa (610, 647, 680), colorantes APC-Alexa y similares.
[0236] Pueden utilizarse partículas metálicas de plata u oro para mejorar la señal de secuencias de nucleótidos y/u oligonucleótidos marcadas con fluorescencia (Lakowiczet al.(2003) BioTechniques 34:62).
[0237] Otros marcadores adecuados para una secuencia de oligonucleótidos pueden incluir fluoresceína (FAM, FITC), digoxigenina, dinitrofenol (DNP), dansilo, biotina, bromodesoxiuridina (BrdU), hexahistidina (6xHis), fósforoaminoácidos (por ejemplo, P-tyr, P-ser, P-thr) y similares. En una realización, se usan los siguientes pares de hapteno/anticuerpo para la detección, en los que cada uno de los anticuerpos se derivatiza con una marca detectable: biotina/a-biotina, digoxigenina/a-digoxigenina, dinitrofenol (DNP)/a-DNP, 5-carboxifluoresceína (FAM)/a-FAM.
[0238] Las marcas detectables descritas en el presente documento son resolubles espectralmente. "Resoluble espectralmente" en referencia a una pluralidad de marcadores fluorescentes significa que las bandas de emisión fluorescente de los marcadores son suficientemente distintas,es decir,suficientemente no superpuestas, para que los marcadores moleculares a las que están unidas las etiquetas respectivas puedan distinguirse sobre la base de la señal fluorescente generada por los marcadores respectivas mediante sistemas de fotodetección estándar, por ejemplo, empleando un sistema de filtros de paso de banda y tubos fotomultiplicadores, o similares, como se ejemplifica en los sistemas descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 4,230,558; 4,811,218; o similares, o en Wheeless et al., pgs. 21-76, en Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985). En un aspecto, los colorantes orgánicos resolubles espectralmente, tales como fluoresceína, rodamina y similares, significa que los máximos de emisión de la longitud de onda están separados al menos 20 nm, y en otro aspecto, al menos 40 nm. En otro aspecto, compuestos de lantánidos quelados, puntos cuánticos y similares, espectralmente resolubles significa que los máximos de emisión de longitud de onda están espaciados al menos 10 nm, y en otro aspecto, al menos 15 nm.
[0239] Método de detección de un ácido nucleico
[0240] La presente divulgación se refiere a métodos para detectar un ácido nucleico utilizando una sonda de la presente invención. Los ejemplos del método se muestran en las Figuras 6 a 11.
[0241] El método comprende la hibridación reversible de al menos una sonda, de la presente invención, a un ácido nucleico diana que está inmovilizado (por ejemplo, en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más posiciones) a un sustrato.
[0242] El sustrato puede ser cualquier soporte sólido conocido en la técnica, por ejemplo, un portaobjetos recubierto y un dispositivo microfluídico, que es capaz de inmovilizar un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, el sustrato es una superficie, membrana, perla, material poroso, electrodo o matriz. El ácido nucleico diana se puede inmovilizar sobre cualquier sustrato evidente para los expertos en la técnica.
[0243] En realizaciones, el ácido nucleico diana es unido por una sonda de captura que comprende un dominio que es complementario a una porción del ácido nucleico diana. La porción puede ser un extremo del ácido nucleico diana o no hacia un extremo.
[0244] Sustratos útiles a modo de ejemplo incluyen los que comprenden un resto de unión seleccionado del grupo que consiste en ligandos, antígenos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, receptores, lectinas y anticuerpos. La sonda de captura comprende un resto de unión capaz de unirse con el resto de unión del sustrato. Sustratos útiles a modo de ejemplo que comprenden restos reactivos incluyen, pero no se limitan a, superficies que comprenden epoxi, aldehído, oro, hidrazida, sulfhidrilo, NHS-éster, amina, tiol, carboxilato, maleimida, hidroximetilfosfina, imidoéster, isocianato, hidroxilo, pentafluorofenil-éster, psoraleno, disulfuro de piridilo o vinilsulfona, polietilenglicol (PEG), hidrogel o mezclas de los mismos. Dichas superficies se pueden obtener de fuentes comerciales o preparar según técnicas convencionales. Sustratos útiles a modo de ejemplo que comprenden restos reactivos incluyen, pero no se limitan a, grupo NHS de OptArray-DNA (Accler8), Nexterion Slide AL (Schott) y Nexterion Slide E (Schott).
[0245] En realizaciones, la fracción de unión de la sonda de captura es biotina y el sustrato comprende avidina (por ejemplo, estreptavidina). Existen en el mercado sustratos útiles que comprenden avidina, incluyendo TB0200 (Accelr8), SAD6, SAD20, SAD100, SAD500, SAD2000 (Xantec), SuperAvidin (Array-It), portaobjetos de estreptavidina (catálogo #MPC 000, Xenopore) y STREPTA VIDINnslide (catálogo #439003, Greiner Bio-one). En realizaciones, la fracción de unión de la sonda de captura es avidina (por ejemplo, estreptavidina) y el sustrato comprende biotina. Sustratos útiles que comprenden biotina que están comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, Optiarray-biotin (Accler8), BD6, BD20, BD100, BD500 y BD2000 (Xantec).
[0246] En realizaciones, el resto de unión a la sonda de captura puede comprender un resto reactivo que es capaz de ser unido al sustrato por fotoactivación. El sustrato podría comprender el resto fotorreactivo, o la primera porción del nanoindicador podría comprender el resto fotorreactivo. Algunos ejemplos de resto fotorreactivo incluyen aril azidas, tales como N((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida; aril azidas fluoradas, tales como ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico; reactivos basados en benzofenona, tales como el éster succinimidílico de ácido 4-benzoilbenzoico; y 5-bromo-desoxiuridina.
[0247] En realizaciones, el resto de unión a la sonda de captura se puede inmovilizar al sustrato a través de otros pares de unión evidentes para los expertos en la técnica.
[0248] Después de unirse al sustrato, el ácido nucleico diana puede elongarse aplicando una fuerza (por ejemplo,gravedad, fuerza hidrodinámica, fuerza electromagnética "electroestiramiento", estiramiento por flujo, una técnica de menisco en retroceso, y combinaciones de las mismas) suficiente para extender el ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana se puede unir por una segunda sonda de captura que comprende un dominio que es complementario a una segunda porción del ácido nucleico diana. La porción puede ser un extremo del ácido nucleico diana o no hacia un extremo. La unión de una segunda sonda de captura puede ocurrir después de o durante el estiramiento del ácido nucleico diana o con un ácido nucleico diana que no se ha estirado. La segunda sonda de captura puede tener una unión como se ha descrito anteriormente.
[0249] Una sonda de captura puede comprender o estar asociada con una marca detectable, es decir, un punto de referencia.
[0250] La sonda de captura es capaz de aislar un ácido nucleico diana de una muestra. Aquí, una sonda de captura se añade a una muestra que comprende el ácido nucleico diana. La sonda de captura se une el ácido nucleico diana a través de la región de la sonda de captura que es complementaria a una región del ácido nucleico diana. Cuando el ácido nucleico diana entra en contacto con un sustrato que comprende un resto que une el resto de unión a la sonda de captura, el ácido nucleico se inmoviliza sobre el sustrato.
[0251] Para garantizar que un usuario "capture" tantas moléculas del ácido nucleico diana como sea posible de muestras altamente fragmentadas, es útil incluir una pluralidad de sondas de captura, cada una complementaria a una región diferente del ácido nucleico diana. Por ejemplo, puede haber tres conjuntos de sondas de captura, con un primer conjunto complementario a regiones del ácido nucleico diana cerca de su extremo 5', un segundo conjunto complementario a regiones en el centro del ácido nucleico diana y un tercer conjunto cerca de su extremo 3'. Esto puede ser generalizado a "n regiones de interés" por ácido nucleico diana. En este ejemplo, cada grupo individual de ácido nucleico diana fragmentado se une a una sonda de captura que comprende o está unida a una etiqueta de biotina. Se aísla 1/n de la muestra de entrada (donde n = el número de regiones distintas en el ácido nucleico diana) para cada cámara de pool. La sonda de captura se une al ácido nucleico diana de interés. Entonces, el ácido nucleico diana se inmoviliza, a través de la biotina de la sonda de captura, a una molécula de avidina adherida al sustrato. Opcionalmente, el ácido nucleico diana se estira,por ejemplo,mediante flujo o fuerza electrostática. Todos los n-conjuntos pueden ser estirados y unidos simultáneamente, o, para maximizar el número de moléculas completamente estiradas, el conjunto 1 (que captura la mayoría de la región 5') puede estirarse y unirse primero; luego el conjunto 2 (que captura el centro de la región diana puede ser estirado y unido; finalmente, el conjunto 3 puede ser estirado y unido.
[0252] El número de distintas sondas de captura requeridas está inversamente relacionado con el tamaño del fragmento del ácido nucleico diana. En otras palabras, se necesitarán más sondas de captura para un ácido nucleico diana muy fragmentado. Para tipos de muestras con ácidos nucleicos diana altamente fragmentados y degradados(por ejemplo,Tejido fijado en formol e incluido en parafina) puede ser útil incluir múltiples grupos de sondas de captura. Por otra parte, para muestras con largos fragmentos de ácido nucleico diana, por ejemplo, ácidos nucleicos aislados obtenidosin vivo, puede ser suficiente una única sonda de captura en un extremo 5'.
[0253] Una sonda o una sonda de captura de la presente invención puede comprender uno o más reactivos de afinidad, cada uno seleccionado del grupo que consiste en ligandos, antígenos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, receptores, lectinas, haptenos y anticuerpos. El reactivo de afinidad permite la purificación de un complejo formado por la sonda o la sonda de captura y un ácido nucleico diana. Dicha purificación enriquece la concentración de los ácidos nucleicos diana que van a detectarse.
[0254] En realizaciones, el reactivo de afinidad es biotina y un medio de purificación (por ejemplo, unido a un soporte sólido) comprende avidina (por ejemplo, estreptavidina).
[0255] En realizaciones, el reactivo de afinidad es avidina(por ejemplo,estreptavidina) y el medio de purificación (por ejemplo, unido a un soporte sólido) comprende biotina.
[0256] En realizaciones, el reactivo de afinidad comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia conocida. Por lo tanto, la sonda o la sonda de captura que comprende el reactivo de afinidad se puede purificar de una muestra usando una sonda de purificación que comprende un ácido nucleico complementario al reactivo de afinidad. Asimismo, un complejo que comprende la sonda o la sonda de captura que comprende el reactivo de afinidad se puede purificar de una muestra usando una sonda de purificación que comprende un ácido nucleico complementario al reactivo de afinidad. Los restos de afinidad para una sonda y para una sonda de captura para el mismo ácido nucleico diana pueden tener secuencias del ácido nucleico diferentes. Alternativamente, el reactivo de afinidad para una sonda y el reactivo de afinidad para una sonda de captura, cada uno para el mismo ácido nucleico diana, pueden tener la misma secuencia del ácido nucleico. Cada reactivo de afinidad para cada sonda en una población de sondas puede tener la misma secuencia del ácido nucleico. Cada reactivo de afinidad para cada sonda de captura en una población de sondas de captura puede tener la misma secuencia del ácido nucleico. Cada reactivo de afinidad para cada sonda en una población de sondas puede tener una secuencia del ácido nucleico diferente. Cada reactivo de afinidad para cada sonda de captura en una población de sondas de captura puede tener una secuencia del ácido nucleico diferente.
[0257] Enrealizaciones, el reactivo de afinidad es un hapteno y un medio de purificación (por ejemplo, unido a un soporte sólido) comprende un dominio de unión a proteínas (por ejemplo, un anticuerpo).
[0258] La Figura 5A muestra un esquema de una sonda unida a un ácido nucleico diana. Aquí, el ácido nucleico diana comprende la secuencia de TCAGTG. El dominio de código de barras de la sonda se diseñó con regiones de fijación que identificaban específicamente un TCAGTG unido con un código de color lineal particular u "orden lineal de marcas detectables". En la parte superior se muestra un primer grupo de ácidos nucleicos complementarios que comprenden una etiqueta detectable o complejos informadores, cada miembro del grupo tiene una secuencia de nucleótidos diferente y una etiqueta detectable asociada(por ejemplo,una etiqueta de color verde y una etiqueta de color cian). Como un ejemplo, los ácidos nucleicos en el primer conjunto tienen secuencias complementarias a SEQ ID NO: 1 a 4 de la Tabla 1.Enla Figura 5A, las primeras regiones de unión de la sonda incluye una o más secuencia(s) de nucleótidos que especifica(n) que la primera posición debe etiquetarse con una etiqueta de color cian (por ejemplo, la región de unión comprende SEQ ID NO: 3 de la Tabla 1). Por lo tanto, solo el ácido nucleico complementario específico de la primera posición de fijación y que lleva una marca cian puede unirse a la primera posición del dominio de código de barras de la sonda mostrada. La marca cian es el primer color en un código de color lineal que identifica un ácido nucleico diana unido.
[0259] Se visualiza el color asociado a la primera posición y se registra en un sistema de la presente invención.
[0260] El número de conjuntos de ácidos nucleicos complementarios o complejos indicadores es idéntico al número de posiciones en el dominio de código de barras. Por lo tanto, para un dominio de código de barras que tiene seis posiciones, se someterán a ciclos seis conjuntos sobre las sondas.
[0261] Se puede proporcionar una sonda a un ácido nucleico diana inicialmente cuando la sonda de captura se añade a una muestra que comprende el ácido nucleico diana (véase, Figura 6). Dichas sondas se pueden proporcionar en diferentes concentraciones, diferentes condiciones de tampón, tales como sal, y diferentes temperaturas para aumentar la sensibilidad y especificidad por el ácido nucleico diana.
[0262] Las sondas de captura y la sonda pueden tener un reactivo de afinidad para purificaciones por purificación de múltiples etapas (véase, Figuras 7 y 8A a 8E). Donde se pueda usar cualquiera de las purificaciones solas o purificaciones de ambos extremos. La purificación aumentará la especificidad y pureza de la captura de dianas. Se puede proporcionar una sonda a un ácido nucleico diana e inicialmente unida al ácido nucleico diana que carece completamente de ácidos nucleicos complementarios que comprenden marcas detectables o complejo indicador que comprende marcas detectables. Dicha sonda será más pequeña que una sonda que comprende ácidos nucleicos complementarios detectables. Dichas sondas se pueden proporcionar a mayores concentraciones que una sonda que comprende marcas detectables. Dichas sondas pequeñas se unirán más rápidamente y más eficientemente a un ácido nucleico diana. Por lo tanto, proporcionan datos en una fracción de tiempo de la requerida usando sondas que comprenden marcas detectables.
[0263] Alternativamente, antes de poner en contacto un ácido nucleico diana con una sonda, la sonda se puede hibridar en su primera posición a un ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o un complejo indicador. Por lo tanto, cuando entra en contacto con su ácido nucleico diana, la sonda es capaz de emitir una señal detectable de su primera posición y no es necesario proporcionar un primer conjunto de ácidos nucleicos complementarios o complejos indicadores que sean dirigidos a la primera posición en el dominio de código de barras.
[0264] La Figura 5B continúa el método mostrado en la Figura 5A. Aquí, los primeros ácidos nucleicos complementarios (o complejos indicadores) que se unieron a regiones de fijación en la primera posición del dominio de código de barras se han sustituido con un primer ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable. El primer ácido nucleico de hibridación y que carece de una marca detectable desplaza los ácidos nucleicos complementarios previamente unidos que comprenden una marca detectable o los complejos indicadores previamente unidos. Así, la primera posición del dominio de código de barras ya no emite una señal detectable. Un ácido nucleico de hibridación y que carece de una marca detectable puede comprender una secuencia idéntica a la de los ácidos nucleicos complementarios previamente unidos que comprenden una marca detectable o los complejos indicadores previamente unidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24). Preferentemente, el ácido nucleico de hibridación y que carece de una marca detectable será más largo que los ácidos nucleicos complementarios previamente unidos que comprenden una marca detectable o los complejos indicadores previamente unidos. Para esto, el ácido nucleico de hibridación incluye además una secuencia que es complementaria a un polinucleótido monocatenario o región de análogo de polinucleótido adyacente a la región de fijación. Sin desear quedar ligado a teoría, un ácido nucleico de hibridación que es más largo que su ácido nucleico complementario relacionado que comprende una marca detectable tendrá una mayor afinidad por el dominio de código de barras y fácilmente desplaza el ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable. Dichos ácidos nucleicos de hibridación que son más largos que sus ácidos nucleicos complementarios relacionados se muestran en las Figuras 10 y 11.
[0265] En realizaciones, los ácidos nucleicos complementarios que comprenden una marca detectable o complejos indicadores se pueden retirar de la región de fijación, pero no sustituir con un ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable. Esto puede ocurrir, por ejemplo, añadiendo un agente caotrópico, aumentando la temperatura, cambiando la concentración de sales, ajustando el pH y/o aplicando una fuerza hidrodinámica. En estas realizaciones se necesitan menos reactivos(es decir,ácidos nucleicos de hibridación que carecen de marcadores detectables).
[0266] La Figura 5C continúa el método de la invención reivindicada. Un segundo conjunto de ácidos nucleicos complementarios o complejos indicadores se muestra en la parte superior (por ejemplo, que tienen secuencias complementarias a SEQ ID NO: 5 a 8 de la Tabla 1), cada miembro del conjunto tiene una marca detectable diferente y una secuencia de nucleótidos diferente. Además, las secuencias de nucleótidos para los ácidos nucleicos complementarios o ácidos nucleicos complementarios de los complejos indicadores del primer conjunto son diferentes de las secuencias de nucleótidos del segunda conjunto. Aquí, solo ácidos nucleicos complementarios del segundo conjunto y que comprenden una marca detectable de color amarillo se unen a la segunda posición del dominio de código de barras (por ejemplo, el ácido nucleico complementario tiene una secuencia complementaria a SEQ ID NO: 8 de la Tabla 1).
[0267] Se visualiza el color asociado a la segunda posición y se registra en un sistema de la presente invención.
[0268] En realizaciones, las etapas mostrada en la Figura 5C son posteriores a las etapas mostradas en la Figura 5B. Aquí, una vez el primer conjunto de ácidos nucleicos complementarios o complejos indicadores (de la Figura 5A) se ha sustituido con primeros ácidos nucleicos de hibridación que carecen de una marca detectable (en la Figura 5B), entonces se proporciona un segundo conjunto de ácidos nucleicos complementarios o complejos indicadores (como se muestra en la Figura 5C). Alternativamente, las etapas mostradas en la Figura 5C son concurrentes con las etapas mostradas en la Figura 5B. Aquí, los primeros ácidos nucleicos de hibridación que carecen de una marca detectable (en la Figura 5B) se proporcionan simultáneamente con un segundo conjunto de ácidos nucleicos complementarios o complejos indicadores (como se muestra en la Figura 5C).
[0269] La Figura 5D continúa el método mostrado en la Figura 5C. Aquí, la primera a quinta posiciones en el dominio de código de barras se unieron por ácidos nucleicos complementarios que comprenden marcas detectables o complejos indicadores, se representó color asociado a sus posiciones y se registró, y los ácidos nucleicos complementarios se sustituyeron con ácidos nucleicos de hibridación que carecen de marcas detectables. La sexta posición del dominio de código de barras está actualmente unida por un ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable o complejo indicador, que identifica la sexta posición en el dominio de unión a diana como que está unida a una guanina (G).
[0270] Se visualiza el color asociado a la sexta posición y se registra en un sistema de la presente invención.
[0271] En este momento, se ha detectado todo el código de color lineal (es decir, un orden lineal de marcas detectables) de un esqueleto de sonda; entonces este código lineal está asociado con el ácido nucleico diana específico que es complementario a una secuencia de nucleótidos conocida del dominio de unión a diana. Como un ejemplo, una sonda que puede emitir un código de color lineal de verde, cian, rojo, amarillo, amarillo, rojo es capaz de ser unida aFat2.Por lo tanto, si el sistema de la presente invención registra un código de color lineal de verde, cian, rojo, amarillo, amarillo, rojo, entonces un usuario sabrá queFat2estaba presente en la muestra.
[0272] Puesto que cada color asociado al dominio de esqueleto de una sonda se detecta secuencialmente, puede ser innecesario que el esqueleto de sonda se estire para distinguir y resolver cada marca de color. Esto es una ventaja con respecto a las generaciones previas de sondas detectoras de ácido nucleico.
[0273] Como se ha mencionado anteriormente, los ácidos nucleicos complementarios que comprenden marcas detectables o complejos indicadores se pueden retirar de regiones de fijación, pero no se sustituyen con ácido nucleico de hibridación que carece de marcas detectables.
[0274] Si es necesario, la tasa de intercambio de etiquetas detectables puede acelerarse mediante la incorporación de pequeños oligonucleótidos monocatenarios que aceleran la velocidad de intercambio de etiquetas detectables(por ejemplo,Sondas "Toe-Hold";véase, por ejemplo,Seeling et al., "Catalyzed Relaxation of a Metastable DNA Fuel"; J. Am. Chem. Soc.2006, 128(37), pp12211-12220).
[0275] Al igual que las Figuras 5A a 5D, las Figuras 9A y 9D a 9F muestran etapas de método de la presente invención; sin embargo, las Figuras 9A y 9D a 9F muestran claramente que complejos indicadores (que comprenden marcas detectables) están unidos a regiones de fijación de sondas. Las Figuras 9D y 9E muestran señales fluorescentes emitidas secuencialmente de sondas hibridadas con complejos indicadores.
[0276] La Figura 10 resume las etapas mostradas en las Figuras 9D y 9E. En la parte superior de la figura se muestra la secuencia de nucleótidos de una sonda a modo de ejemplo e identifica dominios significativos de la sonda. La sonda incluye un espaciador de ADN bicatenario opcional entre su dominio de unión a diana y su dominio de código de barras. El dominio de código de barras comprende, en orden, una porción de "Flanco 1", una porción de "AR-1", una porción de "AR-1/Flanco 2", una porción de "AR-2" y una porción de "AR-2/Flanco 3". En la etapa 1, el "AR-1 detect." se hibrida con las porciones "AR-1" y "AR-1/Flanco 2" de la sonda. "AR-1 detect." corresponde a un complejo indicador o ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable que codifica una timidina en primera posición. Por lo tanto, la etapa 1 corresponde a la Figura 9D. En la etapa 2, la "Carece 1" se hibrida con las porciones "Flanco 1" y "AR-1" de la sonda. "Carece 1" corresponde con el ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable que es específica de la primera región de fijación de la sonda (como se muestra en la Figura 9E como una barra negra que cubre la primera región de fijación). Hibridándose con la posición "Flanco 1", que está aguas arriba con respecto al complejo indicador o ácido nucleico complementario, el ácido nucleico de hibridación desplaza más eficientemente el complejo indicador/ácido nucleico complementario desde la sonda. Las porciones "Flanco" también se conocen como "puntos de apoyo". En la etapa 3, "AR-2 detect." se hibrida con las porciones "AR-2" y "AR-2/Flanco 3" de la sonda. "AR-2 detect." corresponde a un complejo indicador o ácido nucleico complementario que comprende una marca detectable que codifica una guanina en segunda posición. Por lo tanto, la etapa 3 corresponde a la Figura 9E. En esta realización, se proporcionan secuencialmente un ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable y ácidos nucleicos complementarios que comprenden marcas detectables/complejos indicadores.
[0277] Alternativamente, el ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable y los ácidos nucleicos complementarios que comprenden marcas detectables/complejos indicadores se proporcionan simultáneamente. Esta realización alternativa se muestra en la Figura 11. En la etapa 2, se proporciona "Carece 1" (ácido nucleico de hibridación que carece de una marca detectable) junto con "AR-2 detect." (complejo indicador que codifica una guanina en la segunda posición). Esta realización alternativa puede ser más eficaz en el tiempo que la realización ilustrada en la Figura 10 debido a que combina dos etapas en una.
[0278] Las marcas detectables de la presente divulgación se pueden detectar mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la marca detectable se puede detectar por un sistema que comprende uno o más de un microscopio, cámara, microprocesador y/o sistema informático. En un aspecto, la cámara es una cámara CCD. En un aspecto, el microscopio, la camera y el sistema informático pueden comprender un semiconductor de óxido metálico complementario (chip CMOS).
[0279] Detección múltiple de una pluralidad de ácidos nucleicos
[0280] En realizaciones, una pluralidad de ácidos nucleicos se detecta simultáneamente, es decir, detección múltiple. Para esto, se proporciona un conjunto o población de distintas sondas a una muestra de dianas de ácido nucleico inmovilizadas. Un conjunto o población de sondas incluye preferentemente al menos dos, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más especies de sondas.
[0281] Puede predefinirse un conjunto de sondas basándose en el tipo de célula o tipo tejido a seleccionar. Por ejemplo, si el tejido es un cáncer de mama, entonces el conjunto de sondas incluirá sondas dirigidas a ácidos nucleicos expresados relevantes para células de cáncer de mama (por ejemplo,Her2, EGFR,y PR) y/o sondas dirigidas a ácidos nucleicos expresados en tejidos de mama normales. Además, el conjunto de sondas puede predefinirse basándose en el estado de desarrollo de una célula o tejido a seleccionar.
[0282] Los sistemas y métodos NanoString Technologies<®>nCounter<®>permiten la identificación múltiple simultánea de una pluralidad (800 o más) de proteínas diana y/o ácidos nucleicos diana distintos.
[0283] Definiciones:
[0284] En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, los términos "hibridar" e "hibridación," como se usan en el presente documento, se usan indistintamente para significar la formación de un dúplex estable. En un aspecto, dúplex estable significa que una estructura dúplex no se destruye por un lavado riguroso en condiciones tales como una temperatura de aproximadamente 5 °C por debajo o aproximadamente 5 °C por encima de la Tm de una hebra del dúplex y baja concentración de sal monovalente, por ejemplo, menos de 0.2 M, o menos de 0.1 M o concentraciones de sal conocidas por los expertos en la materia. El término "perfectamente apareado", cuando se usa en referencia a un dúplex, significa que la cadenas de polinucleótidos y/u oligonucleótidos que constituyen el dúplex forman una estructura bicatenaria entre sí de forma que cada nucleótido en cada cadena experimenta un apareamiento de bases de Watson-Crick con un nucleótido en la otra cadena. El término "dúplex" comprende, pero no se limita a, el apareamiento de análogos de nucleósidos, tales como desoxiinosina, nucleósidos con bases de 2-aminopurina, PNA y similares, que se pueden emplear. Un "desapareamiento" en un dúplex entre dos oligonucleótidos significa que un par de nucleótidos en el dúplex deja de experimentan unión de Watson-Crick. Como se usa en el presente documento, el término "condiciones de hibridación" incluirá normalmente concentraciones de sales inferiores a aproximadamente 1 M, más normalmente inferiores a aproximadamente 500 mM e incluso más normalmente inferiores a aproximadamente 200 mM. Las temperaturas de hibridación pueden ser tan bajas como 5 °C, pero son típicamente superiores a 22 °C, más típicamente superiores a aproximadamente 30 °C, y a menudo superiores a aproximadamente 37 °C. Las hibridaciones suelen realizarse en condiciones estrictas, por ejemplo, condiciones en las que una sonda se hibrida específicamente con su subsecuencia diana. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y son diferentes en diferentes circunstancias. Fragmentos más largos pueden requerir mayores temperaturas de hibridación para la hibridación específica. Como otros factores puede afectar la rigurosidad de la hibridación, que incluyen composición de bases y longitud de las hebras complementarias, la presencia de disolventes orgánicos y el grado de desapareamiento de bases, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de una cualquiera sola. Generalmente, condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5 °C inferiores a la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Condiciones rigurosas a modo de ejemplo incluyen concentración de sales de al menos 0,01 M a no superior a concentración de ion Na 1 M (u otras sales) a un pH 7,0 a 8,3 y una temperatura de al menos 25 °C. Por ejemplo, condiciones de 5X SSPE (NaCl 750 mM, fosfato de Na 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4) y una temperatura de 25-30 °C son adecuados para las hibridaciones de sondas específicas de alelo. Para condiciones rigurosas, véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsche y Maniatis, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª ed." Cold Spring Harbor Press (1989) y Anderson Nucleic Acid Hybridization, 1ª ed., BIOS Scientific Publishers Limited (1999). Como se usa en el presente documento, los términos "hibridar específicamente con" o "específicamente hibridar con" o términos similares se refieren a la unión, duplexado o hibridación de una molécula sustancialmente con una secuencia o secuencias de nucleótidos particulares en condiciones rigurosas.
[0285] Marcas detectables asociadas a una posición particular de una sonda pueden ser "leídas" (por ejemplo, detectada su fluorescencia) una vez o múltiples veces; una "lectura" pueden ser sinónimo del término "llamada de bases". Múltiples lecturas mejoran exactitud.
[0286] Como se usa en el presente documento, un "ciclo de hibridación y secuenciación" se refiere a todas las etapas requeridas para detectar cada región de fijación en una sonda o población de sondas particular. Por ejemplo, para una sonda capaz de detectar seis posiciones en un ácido nucleico diana, un "ciclo de hibridación y secuenciación" incluirá, al menos, hibridar la sonda al ácido nucleico diana, ácidos nucleicos de hibridación complementarios/complejos indicadores a la región de fijación en cada una de las seis posiciones en el dominio de código de barras de la sonda, y detectar las marcas detectables asociadas a cada una de las seis posiciones. El término "sonda k-mera" es sinónimo de una sonda de la presente invención.
[0287] Los métodos descritos en el presente documento se pueden implementar y/o los resultados registrar usando cualquier dispositivo capaz de implementar los métodos y/o registrar los resultados. Los ejemplos de dispositivos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, dispositivos informáticos electrónicos, que incluyen ordenadores de todos los tipos. Cuando los métodos descritos en el presente documento se implementan y/o registran en un ordenador, el programa informático que se puede usar para configurar el ordenador para llevar a cabo las etapas de los métodos puede estar contenido en cualquier medio legible por ordenador capaz de contener el programa informático. Los ejemplos de medios legibles por ordenador que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, disquetes, CD-ROM, DVD, ROM, RAM, medios legibles por ordenador no transitorios y otros dispositivos de memoria y almacenamiento informático. El programa informático que se puede usar para configurar el ordenador para llevar a cabo las etapas de los métodos, identificar los ácidos nucleicos diana unidos y/o registrar los resultados también se puede proporcionar en una red electrónica, por ejemplo, en internet, una intranet, u otra red. Una "tarjeta consumible" se puede incorporar en un dispositivo de obtención de imágenes de fluorescencia conocido en la técnica. Cualquier microscopio de fluorescencia con varios rasgos variables es capaz de realizar esta lectura. Por ejemplo, se pueden usar iluminación de lámpara de campo amplio, láser, LED, multifotónica, confocal o de reflexión total interna para la excitación y/o detección. Son posibles una cámara (simple o múltiple) y/o un tubo fotomultiplicador (simple o múltiple) con resolución espectral basada en filtros o basada en rejillas (una o más longitudes de onda de emisión resueltas espectralmente) en el canal de emisión-detección del microscopio de fluorescencia. Los ordenadores habituales pueden controlar tanto la tarjeta consumible, los reactivos que circulan a través de la tarjeta, como la detección por el microscopio de fluorescencia.
[0288] Las sondas pueden detectarse y cuantificarse utilizando cartuchos, software y sistemas disponibles en el mercado, por ejemplo, el sistema nCounter<®>utilizando el cartucho nCounter<®>.
[0289] Enseñanzas adicionales relevantes para la presente invención se describen en uno o más de los siguientes: EE. UU.8,148,512, EE. UU.7,473,767, EE. UU.7,919,237, EE. UU.7,941,279, EE. UU.8,415,102, EE. UU.8,492,094, EE. UU. 8,519,115, EE. UU. 2009/0220978, EE. UU. 2009/0299640, EE. UU. 2010/0015607, EE. UU.
[0290] 2010/0261026, EE. UU. 2011/0086774, EE. UU. 2011/0145176, EE. UU. 2011/0201515, EE. UU. 2011/0229888, EE. UU. 2013/0004482, EE. UU. 2013/0017971, EE. UU. 2013/0178372, EE. UU. 2013/0230851, EE. UU.
[0291] 2013/0337444, EE. UU. 2013/0345161, EE. UU. 2014/0005067, EE. UU. 2014/0017688, EE. UU. 2014/0037620, EE. UU.2014/0087959, EE. UU.2014/0154681, EE. UU.2014/0162251, y EE. UU.14/946,386.
[0292] EJEMPLOS
[0293] Ejemplo 1: La presente invención proporciona detección rápida y altamente eficiente de ácidos nucleicos diana
[0294] En la Figura 15A, sondas de "códigos de barras pequeños" contuvieron secuencias de código de barras y secuencias de detección diana en el intervalo de 30-50-mera. La "sonda B" tuvo una secuencia específica (30-50-mera) y una marca universal con biotina para la deposición a una superficie.
[0295] Se pueden proporcionar y aplicar altas concentraciones de sondas a una muestra que comprende ácidos nucleicos diana. Las sondas de la presente invención se pueden proporcionar a concentraciones 10 veces a 1000 veces mayores que las sondas que comprenden marcas detectables. Dichas sondas de alta concentración proporcionan, en parte, la rápida detección de ácidos nucleicos diana.
[0296] En la Figura 15B, se proporcionaron sondas a 250 pM y en la Figura 15C se proporcionaron sondas a 2,5 nM. En otros experimentos que utilizan flujo de trabajo habitual nCounter, sondas que comprenden marcas detectables se proporcionan a 25 pM. En la Figura 15A, se proporcionaron sondas de captura a 100 pM y en la Figura 15B se proporcionaron sondas de captura a 2,5 nM. En otros experimentos que utilizan flujo de trabajo habitual nCounter, se proporcionan sondas de captura que comprenden marcas detectables a 100 pM. Las Figuras 15A y 15B muestran que un ácido nucleico diana se puede detectar después de diez minutos. Se logró una detección diana significativa en estos experimentos con sondas de menor concentración en aproximadamente dos horas y en el plazo de aproximadamente treinta minutos con las sondas de mayor concentración (Fig. 16A). En otros experimentos que utilizan flujo de trabajo habitual nCounter, sondas que comprenden marcas detectables requieren aproximadamente dieciséis horas y media para detectar un ácido nucleico diana.
[0297] La Figura 16A muestra recuentos promedio cuando cuatro ácidos nucleicos diana se detectaron simultáneamente usando sondas y métodos de la presente invención. Aquí, los cuatro ácidos nucleicos diana fueron Myc (verde), Oaz1 (azul), RPL13A (naranja) y TubB (rojo). Sondas y sondas de captura se proporcionaron a 2,5 nM, ácido nucleico diana fue 100 ng de ARN de referencia humano. La Figura 16B muestra que los presentes métodos son aproximadamente nueve veces más eficientes que los métodos en los que sondas se proveen de marcas detectables (identificadas en la Figura como "Carrera"). Estos resultados muestran un marcado aumento en la eficiencia en un tiempo mucho más corto en comparación con el flujo de trabajo nCounter habitual.
[0298] Ejemplo 2: Preparación de muestras para procesar tejido de FFPE para su uso en hibridación y recuentosEn primer lugar, se extrae el (los) ácido(s) nucleico(s) a secuenciar de tejido incorporado en parafina y fijado en formol (FFPE) en un proceso de una etapa. Se calientan uno o más pliegues de FFPE de 10 µm de espesor en un tampón de extracción de ácido nucleico basado en agua para fundir simultáneamente la cera de parafina, descomponer el tejido y liberar el ácido nucleico de las células. Se conocen en la técnica tampones de extracción adecuados y normalmente incluyen proteinasas, detergentes, tales como Triton-100, agentes quelantes tales como EDTA e iones amonio. El pliegue de FFPE y el tampón de extracción se incuban a 56 °C durante 30 minutos para separar la parafina del tejido y permitir que la proteinasa K digiera la estructura de tejido y exponer las células incorporadas en el detergente para permitir la lisis celular. La disolución se invierte tres veces en intervalos de 8 minutos para ayudar en la mezcla de los reactivos durante la desparafinización de tejidos y el proceso de digestión. Tras esta etapa, la disolución se calienta hasta 98 °C para facilitar la inversión de las reticulaciones de formaldehído para ayudar más en la extracción de ácidos nucleicos.
[0300] Una vez se han extraído los ácidos nucleicos del tejido de FFPE, la disolución se filtra usando un filtro de fibra de vidrio con 2,7 µm de tamaño de poro (Whatman) para retirar residuos de tejido y parafina congelada. La disolución resultante es una disolución semiopaca homogénea que contiene ácidos nucleicos que están altamente fragmentados debido al proceso de fijación en formol y las condiciones de almacenamiento. Si se requiere fragmentación adicional, el ADN se puede triturar mecánicamente usando un Focused-ultrasonicator de Covaris. Debido a las condiciones del tampón, se requiere una amplia sonicación para cizallar los ácidos nucleicos. Se usó sonicación usando los ajustes convencionales de potencia incidente pico de 50 W, 20 % de factor de trabajo, 200 ciclos/ráfaga durante 600 segundos para lograr el máximo aumento en dianas capturadas (como se observa en la figura). Para lograr longitud de fragmento más corta, se puede precipitar parafina emulsionada en la disolución filtrada centrifugando a 21.000 g y 4 °C durante 15 minutos. Esto permite cizallar el ADN hasta aproximadamente 225 pb.
[0302] A continuación, se realiza la captura de dianas uniendo pares de sondas de captura a dianas durante una etapa de hibridación rápida. La sonda de captura en 5' contiene un resto de biotina en 3' que permite que la diana se una a la superficie de la celda de flujo recubierta con estreptavidina durante el proceso de deposición de dianas. La sonda de captura en 3' contiene una secuencia de marca en 5' (secuencia G) que permite unirse a perlas durante el proceso de purificación. La velocidad de reacción es accionada por la concentración de la sonda de captura que se añade en el intervalo nanomolar bajo para maximizar la velocidad de reacción. Las sondas de captura se hibridan con la diana de un modo que flanquea la región de interés para generar una ventana. Para cada diana de ADN, el juego de sondas de captura también incluye un oligonucleótido compuesto de la misma secuencia que la ventana para hibridarse con la hebra no codificante diana y prevenir la rehibridación. La disolución que contiene las sondas de captura se calienta hasta 98 °C durante 3 minutos para desnaturalizar el ADN genómico, seguido por una incubación de 15 minutos a 65 °C. Se usa la concentración de NaCl en el intervalo de 400 mM a 600 mM para esta reacción de hibridación. Un panel de más de 100 dianas que se han validado experimentalmente se enumera en la Tabla 2, detallando el gen y exón de la región de ADN seleccionada.
[0304] Tabla 2
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0313] Después de que las regiones de ADN seleccionadas se unan con sondas de captura, se purifican del resto del ADN genómico para crear una disolución enriquecida de las dianas. Se incuban perlas recubiertas con el oligonucleótido antisentido (anti-secuencia G) con la secuencia que se une a las sondas de captura en 3' con la mezcla de reacción de captura durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la etapa de unión, las perlas se lavan tres veces con 0,1x SSPE para retirar el ADN no diana y las sondas de captura en 5' que contienen biotina. Después de los lavados, las perlas se resuspenden en 14 µl de 0,1x SSPE, luego se calientan a 45 °C durante 10 minutos para eluir las dianas de ADN purificadas de las perlas. Después de la elución, se añade 1 µl de NaCl 5 M para garantizar que las sondas de captura queden unidas a las dianas de ADN.
[0315] La etapa final del proceso de preparación de muestras es la deposición de las dianas de ADN sobre la superficie de la celda de flujo, donde se pueden analizar usando las sondas de la presente invención como se desvela en el presente documento. Se utiliza una bomba de jeringa para controlar la tasa a la que las dianas se cargan en el canal fluídico de la celda de flujo, de forma que todas las dianas tengan tiempo para difundir a través de la altura del canal y se unan a la superficie de la estreptavidina. Este método de carga genera un gradiente de densidad de dianas, donde el número más alto de moléculas por unidad de área es mayor en la entrada del canal fluídico y disminuye a lo largo de la longitud del canal en la dirección de flujo fluídico hacia la salida. Con un caudal de 0.35 µl/segundo se consigue una captura cuantitativa en una longitud de canal de aproximadamente 10 mm para una anchura de canal de 1.6 mm y una altura de 40 µm. Una vez las dianas está unidas a la superficie por la sonda de captura en 5' biotinilada, se inyecta una disolución de oligonucleótido biotinilado (ganchos en G) que son el complemento inverso de la secuencia que se une a las sondas de captura en 3' para localizar el extremo libre de las dianas para crear una estructura de puente, donde la región de ADNmc en el centro es la ventana de interés. A continuación, se añade una disolución de oligonucleótidos de secuencia G para hibridarse con el exceso de ganchos en G sobre la superficie para reducir la cantidad de ADNmc sobre la superficie.
[0317] Para identificar las dianas que han sido enriquecidas, se diseñaron sondas 15-meras de forma que pudieran unirse específicamente a una única diana en el panel. Estas sondas se sintetizaron con una secuencia adaptadora en el extremo 3' que podría unirlas a un oligonucleótido de código de barras único. Cada oligonucleótido de código de barras contuvo tres dominios de unión indicadores únicos capaces de unirse a sondas indicadoras para la identificación de dianas, que permite que una lectura 64-ple usando una química indicadora de cuatro colores. Estas sondas de identificación se inyectan en el canal fluídico y se incubaron durante 1 minuto para permitir que se hibridaran con las dianas. Posteriormente, se usa un lavado riguroso de 0,1x SSPE para retirar oligonucleótidos no unidos y específicamente no unidos. Se usan tres rondas de hibridación con sonda indicadora para identificar las dianas, basándose en los códigos de barras únicos de dianas. La combinación de los sistemas de sonda de captura doble para capturar regiones seleccionadas del genoma con el uso de sondas de identificación específicas de diana proporciona un sistema altamente específico para el enriquecimiento y la detección de dianas. La Figura 17A representa la especificidad en la que un panel de 40 dianas se captura y enumera a partir de 3 µg de ADNg cizallado purificado. El carril 1 demuestra los recuentos generales detectados de dianas cuando todas las sondas de captura se usan juntas, en comparación con el carril 2 donde no estaba presente ADNg. La especificidad del sistema se verifica incluyendo solo sondas de captura que enriquecen dianas que se detectan con indicadores azul y amarillo en el carril 3 o verde y rojo en el carril 4.
[0319] Este flujo de trabajo de extracción, captura y detección de ADN se aplicó a tres tipos de tejido FFPE: amígdala, pulmón y melanoma. Para todos los tipos de tejido, la captura y detección de un panel de dianas del cáncer 100-ple produjo >95 % de dianas identificadas en la uniformidad de 1 logaritmo. Los recuentos para estas dianas en los tres tipos de tejido se presentan en la Figura 17B.
[0321] Ejemplo 3: Procesamiento de imágenes indicadoras multicolor para hibridación y secuenciación
[0323] El proceso de tratamiento de imágenes incluye las siguientes etapas: resta de fondo, registro, detección de rasgos y clasificación. En la resta de fondo, la media del fondo de cualquier canal dado es una función del ruido de disparo y la exposición. En nuestro sistema, el canal azul tiene los niveles de fondo más altos acoplados con mayor varianza. Se aplica un simple filtro de sombrero de copa con un elemento estructurante circular de radio 7 píxeles se aplica para realizar la resta de fondo localizada.
[0325] Para el registro, es imperativo que los rasgos de interés estén perfectamente alineados para el análisis de rasgos multicolor y multiciclo. Este sistema requiere dos formas de registro. Para la primera forma, se aplica una transformación afín local a todos los canales de imagen de una misma pila de adquisición. Esta transformación es una función del sistema óptico y, por lo tanto, es coherente para un instrumento determinado. Esta función se calcula de antemano para cada ejecución y se aplica a cada imagen adquirida. Para la segunda forma, se calcula una transformación global en forma de desplazamiento rígido usando la correlación cruzada normalizada para capturar la deriva del pórtico mecánico durante la ejecución.
[0327] La siguiente etapa es la detección de rasgos. Una vez se han registrado todas las imágenes, los rasgos se detectan usando un filtro adaptado, es decir, un filtro LoG (Laplace de Gauss). El filtro se aplica con un tamaño de núcleo fijo (adaptado al límite de difracción de los rasgos) y una desviación estándar variable (adaptada a la longitud de onda del canal correspondiente) para ajustar para mejorar la respuesta del punto. Se usan máximos locales para identificar posibles ubicaciones de los indicadores. Los valores de intensidad asociados a cada rasgo identificado se recuperan para la clasificación.
[0329] La etapa final es la clasificación. Las intensidades de los reporteros multicolor se clasifican mediante el modelo gaussiano naive-Bayes. El modelo asume que las intensidades de los indicadores son independientes y siguen una distribución normal. A continuación, el modelo calcula la probabilidad de que un rasgo específicoŷ(especificado por las intensidades en todos los canales
[0331] ) pertenece a una determinada clase (Ck) utilizando una regla demáximo a posteriorio MAP:
[0332]
[0334] En la Figura 18 se informan las distribuciones de intensidad para un código de dos colores. La figura ilustra el esquema de codificación usando 2 colorantes azul y rojo. Hay seis clases (incluido el fondo) posibles en un escenario de codificación de 2 colores. En el sistema implementado, la elección de cuatro colores da como resultado 14 clases posibles. Obsérvese que existe cierto solapamiento entre las distribuciones de medio colorante individuales y colorante completo. En consecuencia, la clasificación entre estas clases presenta una mayor tasa de error, como se muestra en la Figura 19, con una tasa máxima de clasificación errónea del 11.8 % entre'xG'y'GG'.Las tasas de error de clasificación para el modelo de 10 clases son inferiores al 0,2 %. Dado que cada indicador requiere un máximo de ocho clases, resulta sencillo elegir las que presentan un menor error de clasificación.
[0335] Ejemplo 4: Función, diseño, preparación y prueba de sondas indicadoras de dos colores
[0336] Las sondas reporteras de dos colores se unen secuencialmente a tres regiones (R<1>, R<2>, R<3>) en el dominio de código de barras de la sonda. Cada región codifica ocho "colores" definidos por combinaciones fluorescentes de dos colores, tales como "azul-azul" o "verde-amarillo". Para cada sonda se informan tres "colores" secuenciales que, a su vez, corresponden a la lectura de tres dinucleótidos que constituyen la secuencia del hexámero. La sonda indicadora de dos colores está diseñada de la siguiente manera: la sonda indicadora de dos colores es una estructura ramificada de 37 oligómeros de ADN diseñada para contener 15 colorantes fluorescentes para cada color, con un total de 30 colorantes por sonda indicadora. Los 37 oligómeros se clasifican en tres tamaños: (1) una rama principal de 96 nt consiste en dos partes, una secuencia de ADN monocatenario de 12-mera usada posteriormente para informar del hexámero y seis 14-meros hibridados con seis subramas, (2) cada una de las seis subramas de 89 nt consiste en dos partes, un 14-mero hibridado con la rama principal y cinco repeticiones 15-meras hibridadas con cinco oligonucleótidos de colorante, (3) cada uno de los cinco oligonucleótidos de colorante de 15 nt tiene una modificación de colorante fluorescente en el extremo 5' del oligonucleótido.
[0337] Uno de las rasgos clave del diseño de la sonda indicadora de dos colores son las distintas secuencias de subrama y oligonucleótidos de colorante entre los cuatro colorantes fluorescentes diferentes. Esto evita el "intercambio de colores" o la hibridación cruzada entre los diferentes colorantes fluorescentes. Por ejemplo, cada oligonucleótido de colorante 15-mero para el fluoróforo Alexa 488, o color azul, corresponde a secuencias complementarias únicamente a la subrama azul. La subrama azul tiene además una secuencia 14-mera distinta que es únicamente complementaria a las secuencias 14-meras azules de la rama principal, pero no a las amarillas, rojas o verdes. Por lo tanto, una rama principal específica tendrá secuencias de dos colores específicas que dictarán qué 15 más 15 combinaciones de colorantes contendrá.
[0338] Otro rasgo importante del diseño de la sonda indicadora de dos colores es la secuencia 12-mera en la rama principal, que debe satisfacer lo siguiente: (1) secuencias distintas de 12-meras entre R<1>, R<2>y R<3>(2) codificar ocho colores diferentes por región con alta especificidad (3) alta eficiencia de unión y uniformidad entre los ocho colores diferentes y (4) eliminación eficiente de todos los 12-meros a través de la secuencia competitiva de sombrero de copa.
[0339] La sonda indicadora de dos colores se prepara como se describe a continuación. Cuatro colorantes fluorescentes (B= azul, G= verde, Y= amarillo, R= rojo) forman diez posibles combinaciones de dos colores (BB, BG, BR, BY, GG, GR, GY, RR, YR, YY). Solo se usan ocho de las diez combinaciones de dos colores para cada una de las tres regiones de código de barras de la sonda, lo que da como resultado 24 sondas indicadoras diferentes (8+8+8 =24). La preparación de la sonda indicadora de dos colores se realiza en dos etapas secuenciales de hibridación: (1) oligonucleótidos de colorante con subrama y luego (2) colorante subrama con rama principal. Se preparan cuatro reacciones separadas de colorante con respecto a subrama combinando 100 uM de subrama y 600 uM de oligonucleótido de colorante en tampón 4,2X SSPE a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se preparan por separado 24 sondas informadoras utilizando 2 uM de MainBranch, 7.2 uM de SubBranch+Dye1 y 7.2 uM de SubBranch+Dye2 en 4.8X SSPE. Estas reacciones se calientan a 45 °C durante 5 minutos y luego se enfrían a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las 24 reacciones colorante+subrama con rama principal se agrupan en tres grupos diferentes correspondientes al dominio del código de barras (es decir, R<1>, R<2>, R<3>). Por ejemplo, se agrupan ocho sondas indicadoras de dos colores diferentes (2 uM cada una) que se unen al dominio del código de barras R<1>, diluyéndolas diez veces hasta alcanzar una concentración de trabajo final de 200 nM de cada sonda indicadora.
[0340] Tras la preparación de la sonda indicadora, se realizan pruebas estándar para garantizar la calidad. Se comprueba la unión de cada uno de los tres grupos de sondas indicadoras a su región de código de barras correspondiente (R<1>, R<2>o R<3>) en tres celdas de flujo separadas. La prueba se realiza en una construcción de sonda modificada, con solo el dominio del código de barras presente e inmovilizado en la celda de flujo. Los ocho 12-meros que representan cada color se multiplexan y se espera que las ocho sondas indicadoras de dos colores se identifiquen con un alto recuento de colores.
[0341] En la Figura 20 se muestra un esquema de una sonda indicadora de dos colores. Estas sondas se usan en el flujo de trabajo directo de hibridación de sondas para la captura selectiva de ácidos nucleicos (representada en la Figura 21). La Figura 22 muestra las capacidades adicionales de estas sondas con respecto a su uso en la identificación de haplotipos de interés.
[0342] Ejemplo 5: Sondas indicadoras tricolores y resta de imagen
[0343] El presente ejemplo demuestra la prehibridación de tres complejos indicadores a la sonda de secuenciación en disolución antes de la unión a la diana inmovilizada en superficie. Se ha demostrado que la hibridación en disolución es mucho más eficaz que la hibridación en superficie y que puede realizarse antes del experimento de secuenciación para reducir drásticamente el tiempo total de ejecución entre la muestra y la respuesta. Las tres identidades indicadoras se determinan separando secuencialmente (mediante métodos químicos u ópticos) los indicadores de la sonda de secuenciación y midiendo la pérdida de intensidad fluorescente.
[0344] La presente divulgación requiere la hibridación de una de un conjunto de 4096 moléculas de código de barras (BC), también descritas en el presente documento como una sonda en la que las regiones del dominio del código de barras pueden estar unidas por moléculas del ácido nucleico complementario que incluyen una marca detectable o moléculas del ácido nucleico complementario de un complejo indicador que incluye una marca detectable, una por cada secuencia hexámera posible, a una molécula diana que se ha inmovilizado en la superficie de una celda de flujo. La identidad del código de barras, y la secuencia hexámera asociada dentro de la diana, requiere la unión y lectura de 3 sondas indicadoras fluorescentes de dos colores (RPTR), también descritas en el presente documento como una molécula del ácido nucleico complementario que incluye una marca detectable o una molécula del ácido nucleico complementario de un complejo indicador que incluye una marca detectable. Los RPTR se introducen en la celda de flujo para hibridarse con el BC, se visualizan y se eliminan mediante la retención del punto de apoyo de forma secuencial, lo que requiere tres ciclos de flujo de RPTR para cada lectura del BC. La Figura 23 muestra la hibridación de las tres sondas RPTR con los BC antes de ser introducidos en una celda de flujo. Este complejo BC/RPTR puede purificarse antes de su uso para garantizar que casi el 100 % de los complejos BC/RPTR se han formado apropiadamente. El complejo BC/RPTR se hibrida con una diana en la superficie y se toma una imagen que contiene la señal fluorescente de los 6 colores (3 RPTR de dos colores). A continuación, se escinde uno de los indicadores, eliminando los colorantes fluorescentes del complejo. Los mecanismos de separación se describen con más detalle en el presente documento. A continuación, se toma una segunda imagen que contiene la señal fluorescente de solo 4 colores (2 RPTR de dos colores).
[0345] Como se muestra en la Figura 24, la identidad del RPTR perdido puede obtenerse comparando las imágenes de 6 colores y 4 colores. A continuación, se elimina un segundo RPTR usando un mecanismo de escisión diferente y se toma una tercera imagen que contiene la señal fluorescente de 2 colores (1 RPTR de dos colores). De nuevo, la identidad del RPTR escindido se determina comparando las imágenes de 2 colores y 4 colores. La señal de fluorescencia restante identifica el tercer RPTR para identificar inequívocamente el BC y, por tanto, la secuencia hexámera presente en la diana.
[0346] Los RPTR escindibles usados en las dos primeras lecturas del ciclo de secuenciación se construyen de forma similar a la versión no escindible, consistiendo en 30 oligonucleótidos teñidos hibridados con 6 oligonucleótidos de "subrama", también descritos en el presente documento como moléculas de ácido nucleico terciario, que finalmente se hibridan con un oligonucleótido de "rama principal", también descrito en el presente documento como molécula de ácido nucleico secundario, como se muestra en la Figura 25. Estos RPTR se hacen escindibles sintetizando el oligonucleótido de "rama principal" con una o más de cualquiera de varias modificaciones escindibles, tales como fotoescindible, químicamente escindible y enzimáticamente escindible, situadas entre la porción de la "rama principal" que une el BC y la porción que une las "subramas" y los colorantes. Un ejemplo de modificación químicamente escindible incluye un resto de disulfuro. Un ejemplo de una modificación enzimáticamente escindible incluye un resto que contiene desoxiuracilo (dU) (escindible usando la mezcla de enzimas 'USER' de New England Biolabs). Las modificaciones escindibles usadas para los dos RPTR dentro de un ciclo de secuenciación deben ser diferentes para permitir la escisión secuencial.
[0347] Los atributos y ventajas clave de este método son: (1) El complejo BC/RPTR puede prepararse antes del proceso de secuenciación, lo que permite un mayor control de la hibridación (es decir, hibridación en solución en lugar de hibridación en superficie y tiempos de hibridación mucho más largos); (2) Este método tiene el potencial de aumentar drásticamente el número de BC identificados sin ambigüedad porque (a) los complejos BC/RPTR pueden purificarse por HPLC para garantizar que cada BC tiene los tres RPTR y (b) la eficiencia de escisión es significativamente mayor que las eficiencias de hibridación y retención de RPTR; y (3) Este método es mucho más rápido en términos de tiempo de ejecución de la secuenciación porque (a) no requiere tiempo de hibridación para cada RPTR que se une al BC, (b) la cinética de escisión es significativamente más rápida que la retención, que también se basa en la hibridación, para eliminar las señales RPTR y (c) requiere muchos menos etapas de flujo de reactivos (8 frente a 14 para el método actual, aunque si se utilizan enlazadores escindibles por UV sólo se requieren 6 etapas de flujo). También requiere que se tomen menos imágenes (4 frente a 7 imágenes, o si se omite una imagen oscura final de lavado con agua, 3 frente a 6 imágenes).
[0349] Se llevó a cabo un experimento de prueba de principio usando un solo BC, un RPTR escindible por UV, un RPTR que contenía desoxiuracilo (dU) (escindible usando la mezcla de enzimas 'USER' de New England Biolabs) y un RPTR habitual. Estos componentes se hibridaron en un complejo BC/RPTR y se hibridaron con una secuencia diana sintética de 50 mer del exón 15 de BRAF inmovilizada en una celda de flujo. Las identidades de los puntos se determinaron obteniendo primero imágenes del complejo BC/RPTR completo, seguido de un tratamiento con la enzima USER para eliminar el RPTR que contenía dU y obteniendo de nuevo imágenes. A continuación, el RPTR fotoescindible se escindió usando exposición a luz UV y se tomó una tercera imagen, como se muestra en la Figura 27. Se procesaron cuatro rasgos agrupados en las imágenes para determinar sus intensidades fluorescentes y una simple resta identificó correctamente las tres identidades de RPTR.
[0351] Un riesgo potencial importante de este enfoque era el tamaño del complejo BC/RPTR y la ralentización asociada de la cinética de hibridación con la diana inmovilizada en superficie. El mayor tamaño del complejo BC/RPTR en comparación con BC solo ralentiza la cinética de unión; sin embargo, esto puede superarse con tiempos de incubación más largos, como se muestra en la Figura 26. La pérdida de tiempo de hibridación en este caso puede compensarse con reducciones de eficiencia y velocidad en otras etapas (es decir, eliminación de hibridaciones de RPTR, reducción en la formación de imágenes, reducción en las etapas de flujo, etc.).
[0353] Los presentes inventores también probaron si los RPTR de medio colorante pueden detectarse usando este método de resta de imágenes. Como estos colorantes tienen una señal más pequeña, puede ser más difícil identificarlos de forma fiable. Para probarlo, se preparó un conjunto de códigos de barras con muchos RPTR de colores similares (principalmente verde y amarillo) donde únicamente el RPTR del punto 1 era escindible, como se muestra en la Figura 28 y Figura 29. Se tomaron imágenes antes y después de la exposición UV para escindir el RPTR del punto 1. Tanto PC-GY como PC-GG fueron detectables y produjeron cambios de intensidad similares a los esperados por el número de colorantes perdidos (por ejemplo, un RPTR GYYYGY escindido a un _YYGY habría perdido el 50 % de su verde y el 25 % de su amarillo). En la siguiente tabla se muestra una serie de colores y clases de colorantes y secuencias relacionadas.
[0355]
[0356]
[0357]

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. Un complejo compuesto por:
una sonda capaz de unirse a una región específica de al menos un ácido nucleico diana, en la que la al menos una sonda comprende un dominio de unión a la diana y un dominio de código de barras,
en el que el dominio de unión a la diana comprende de 10 a 100 nucleótidos y es capaz de unirse a la región específica del ácido nucleico diana, y en el que el dominio de unión a la diana comprende una secuencia de nucleótidos conocida,
en el que el dominio de código de barras comprende una primera región de unión unida por una primera molécula de ácido nucleico complementaria y al menos una segunda región de unión unida por al menos una segunda molécula de ácido nucleico complementaria,
en la que la primera molécula de ácido nucleico complementaria es una primera molécula de ácido nucleico complementaria de un primer complejo informador, en el que el primer complejo informador comprende:
i) la primera molécula de ácido nucleico complementaria unida indirectamente a una molécula de ácido nucleico primaria mediante un enlazador fotocomponible; y
ii) un primer marcador detectable, asociando así un marcador detectable a la primera región de fijación, en el que la segunda molécula de ácido nucleico complementaria es una segunda molécula de ácido nucleico complementaria de un segundo complejo informador, en el que el segundo complejo informador comprende un segundo marcador detectable, asociando así un marcador detectable con al menos la segunda región de unión, en la que las secuencias de la primera región de unión y de al menos la segunda región de unión son diferentes.
2. El complejo de la reivindicación 1, en el que el dominio de unión al objetivo comprende:
i) 20 a 60 nucleótidos; o
ii) 35 a 50 nucleótidos.
3. El complejo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el segundo complejo informador comprende la segunda molécula de ácido nucleico complementaria unida indirectamente a una molécula de ácido nucleico primaria a través de un enlazador fotocomponible.
4. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio de código de barras comprende además al menos una tercera región de unión unida por al menos un tercer ácido nucleico complementario, en la que la tercera molécula complementaria de ácido nucleico comprende un tercer marcador detectable, asociando así un marcador detectable con al menos la tercera región de unión.
5. El complejo de la reivindicación 4, en el que la tercera molécula de ácido nucleico complementaria es una tercera molécula de ácido nucleico complementaria de un tercer complejo informador, en el que el tercer complejo informador comprende la tercera molécula de ácido nucleico complementaria está indirectamente unida a una molécula de ácido nucleico primaria a través de un enlazador fotocleavable.
6. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las moléculas de ácido nucleico primarias se hibridan con al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis moléculas de ácido nucleico secundarias, opcionalmente en el que las segundas moléculas de ácido nucleico comprenden un enlazador fotocontraíble y/o al menos un marcador detectable.
7. El complejo de la reivindicación 6, en el que las moléculas de ácido nucleico secundario se hibridan con al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete moléculas de ácido nucleico terciario que comprenden al menos un marcador detectable.
8. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los marcadores detectables comprenden múltiples moléculas, cada una de las cuales puede identificarse por su espectro de emisión preferiblemente, en los que las fracciones son fracciones fluorescentes.
9. Un método de detección de al menos un ácido nucleico diana en una muestra, el método comprende: a) proporcionar el complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el complejo se hibrida con al menos un ácido nucleico diana de la muestra;
b) detectar el primer marcador detectable asociada a la primera posición de fijación y la segunda etiqueta detectable asociada a al menos la segunda posición de fijación;
c) retirar el primer marcador detectable;
d) detectar el segundo marcador detectable asociada a al menos la segunda posición de fijación; y
e) detectar el al menos un ácido nucleico diana en la muestra basándose en los marcadores detectables detectados en las etapas b) y d).
10. El método de la reivindicación 9, en el que la detección en la etapa (d) comprende restar una señal de la segunda etiqueta detectable asociada con al menos la segunda región de unión en la etapa (d) de una señal de detección de la primera etiqueta detectable asociada con la primera región de unión y la segunda etiqueta detectable asociada con al menos la segunda región de unión en la etapa (b).
11. El método de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10, en el que la etapa (b) comprende además detectar el tercer marcador detectable asociada con al menos la tercera posición de fijación.
12. El método de la reivindicación 11, en el que la etapa (d) comprende además detectar el tercer marcador detectable asociado con al menos la tercera posición de fijación.
13. El método de la reivindicación 12, en el que el método comprende además, después de la etapa (d) y antes de la etapa (e):
d<1>) eliminar el segundo marcador detectable; y
d<2>) detectar el tercer marcador detectable asociado a al menos la tercera región de unión,
y en el que la etapa (e) comprende detectar al menos un ácido nucleico diana en la muestra con base en los marcadores detectables detectados en la etapa (b), la etapa (d), y la etapa (d<2>).
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que la muestra es una muestra de tejido.
ES23183318T 2016-05-16 2017-05-16 Methods for detecting target nucleic acids in a sample Active ES3055169T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662337074P 2016-05-16 2016-05-16
US201762492889P 2017-05-01 2017-05-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3055169T3 true ES3055169T3 (en) 2026-02-10

Family

ID=58772988

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES23183318T Active ES3055169T3 (en) 2016-05-16 2017-05-16 Methods for detecting target nucleic acids in a sample
ES17726083T Active ES2956732T3 (es) 2016-05-16 2017-05-16 Métodos de detección de ácidos nucleicos diana en una muestra

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17726083T Active ES2956732T3 (es) 2016-05-16 2017-05-16 Métodos de detección de ácidos nucleicos diana en una muestra

Country Status (9)

Country Link
US (4) US20170327876A1 (es)
EP (3) EP4674976A3 (es)
JP (3) JP7457457B2 (es)
KR (1) KR102490693B1 (es)
CN (2) CN116200462B (es)
AU (2) AU2017268257B2 (es)
ES (2) ES3055169T3 (es)
SG (1) SG11201809913PA (es)
WO (1) WO2017201073A1 (es)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3604555B1 (en) 2011-10-14 2024-12-25 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
EP4328322A3 (en) 2014-07-30 2024-05-22 President and Fellows of Harvard College Probe library construction
EP3901282B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
EP4613756A3 (en) 2016-04-25 2025-11-12 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
US11352667B2 (en) 2016-06-21 2022-06-07 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
CN118853848A (zh) 2016-08-31 2024-10-29 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
EP4556575A3 (en) * 2016-11-21 2025-10-08 Bruker Spatial Biology, Inc. A method for sequencing nucleic acids
KR102145417B1 (ko) * 2017-05-24 2020-08-19 지니너스 주식회사 무세포 핵산으로부터 수득된 서열 분석 데이터에 대한 배경 대립인자의 빈도 분포를 생성하는 방법 및 이를 이용하여 무세포 핵산으로부터 변이를 검출하는 방법
US11788123B2 (en) 2017-05-26 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
CN120210336A (zh) 2017-10-06 2025-06-27 10X基因组学有限公司 Rna模板化连接
WO2019200326A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Rarecyte, Inc. Kits for labeling of biomarkers and methods of using the same
EP3794146B1 (en) * 2018-05-14 2025-12-10 Bruker Spatial Biology, Inc. Method for identifying a predetermined nucleotide sequence
BR112020024727A2 (pt) 2018-06-11 2021-03-23 Foundation Medicine, Inc. composições e métodos para avaliação de alterações genômicas
WO2020014036A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Ultivue, Inc. Methods for multicolor multiplex imaging
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
EP3870704A4 (en) * 2018-10-25 2023-01-11 Illumina, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFICATION OF LIGANDS ON ARRAYS WITH INDEXES AND BARCODES
WO2020123316A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
US12529094B2 (en) 2018-12-10 2026-01-20 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
EP3894583A4 (en) * 2018-12-13 2022-11-09 President and Fellows of Harvard College AMPLIFICATION METHODS AND SYSTEMS FOR MERFISH AND OTHER APPLICATIONS
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN119220641A (zh) 2019-05-31 2024-12-31 10X基因组学有限公司 检测目标核酸分子的方法
KR102336454B1 (ko) * 2019-06-17 2021-12-08 강릉원주대학교산학협력단 핵산 검출 방법
WO2020254672A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Therycell Gmbh Spatial characterisation of target structures in a sample
WO2021003258A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 Davinci Bio, Inc. High capacity molecule detection
KR102375106B1 (ko) * 2019-10-04 2022-03-17 프로지니어 주식회사 핵산 검출 시스템
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP4073246A4 (en) * 2019-12-12 2023-12-06 President And Fellows Of Harvard College COMPOSITIONS AND METHODS FOR LIGHT-DIRECTED BIOMOLECULAR BARCODING
GB201919032D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Cartana Ab Method of detecting an analyte
CN115135984B (zh) 2019-12-23 2025-12-23 10X基因组学有限公司 可逆固定试剂及其使用方法
ES2982420T3 (es) 2019-12-23 2024-10-16 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial mediante el uso de la ligazón con plantilla de ARN
EP4081656A1 (en) 2019-12-23 2022-11-02 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
US12365942B2 (en) 2020-01-13 2025-07-22 10X Genomics, Inc. Methods of decreasing background on a spatial array
US12405264B2 (en) 2020-01-17 2025-09-02 10X Genomics, Inc. Electrophoretic system and method for analyte capture
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
EP4097251A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for analyte detection
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US12110548B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Bi-directional in situ analysis
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021158925A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US12281357B1 (en) 2020-02-14 2025-04-22 10X Genomics, Inc. In situ spatial barcoding
CN115485391A (zh) 2020-02-17 2022-12-16 10X基因组学有限公司 染色质相互作用的原位分析
EP4484571A3 (en) 2020-02-21 2025-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for integrated in situ spatial assay
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US12188085B2 (en) 2020-03-05 2025-01-07 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial transcriptomics with sequencing readout
EP4139485B1 (en) 2020-04-22 2023-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
EP4153776B1 (en) 2020-05-22 2025-03-05 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4414459B1 (en) 2020-05-22 2025-09-03 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4421186B1 (en) 2020-06-08 2025-08-13 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US12209273B2 (en) 2020-06-12 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Nucleic acid assays using click chemistry bioconjugation
US12492427B2 (en) 2020-06-18 2025-12-09 Resolve Biosciences Gmbh Multiplex method for detecting different analytes in a sample
ES2994976T3 (en) 2020-06-25 2025-02-05 10X Genomics Inc Spatial analysis of dna methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US12209280B1 (en) 2020-07-06 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
US12297499B2 (en) 2020-08-17 2025-05-13 10X Genomics, Inc. Multicomponent nucleic acid probes for sample analysis
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US12071667B2 (en) 2020-11-04 2024-08-27 10X Genomics, Inc. Sequence analysis using meta-stable nucleic acid molecules
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US12509717B2 (en) 2020-12-11 2025-12-30 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
EP4729631A2 (en) 2020-12-21 2026-04-22 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US12060603B2 (en) 2021-01-19 2024-08-13 10X Genomics, Inc. Methods for internally controlled in situ assays using padlock probes
US12275984B2 (en) 2021-03-02 2025-04-15 10X Genomics, Inc. Sequential hybridization and quenching
US20220316004A1 (en) * 2021-04-06 2022-10-06 Akoya Biosciences, Inc. Detection of labeled analytes in biological samples
EP4305196B1 (en) 2021-04-14 2025-04-02 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
EP4320271B1 (en) 2021-05-06 2025-03-19 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
EP4341847A1 (en) * 2021-05-19 2024-03-27 Leica Microsystems CMS GmbH Marker, method and device for analyzing a biological sample
JP2024520987A (ja) * 2021-05-24 2024-05-28 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 指数関数的な放射輝度と結びつく連鎖増幅
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
AU2022317053B2 (en) 2021-07-30 2025-01-02 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for synchronizing reactions in situ
US12139751B2 (en) 2021-07-30 2024-11-12 10X Genomics, Inc. Circularizable probes for in situ analysis
US12460251B2 (en) 2021-08-03 2025-11-04 10X Genomics, Inc. Stabilization and/or compaction of nucleic acid molecules
US12391984B2 (en) 2021-08-03 2025-08-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for rolling circle amplification
US12553079B2 (en) 2021-08-03 2026-02-17 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
US12529096B2 (en) 2021-08-03 2026-01-20 10X Genomics, Inc. Stabilization and/or compaction of nucleic acid structures
WO2023014825A1 (en) * 2021-08-03 2023-02-09 Akoya Biosciences, Inc. Rna detection by selective labeling and amplification
EP4446426B1 (en) 2021-08-16 2026-03-04 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
CN118974836A (zh) 2022-03-08 2024-11-15 10X基因组学有限公司 将光学拥挤最小化的原位代码设计方法
WO2023183881A2 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Digital Biology Inc. Tissue spatial omics
EP4505177A1 (en) 2022-04-01 2025-02-12 10x Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
WO2023215603A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences
US20240084378A1 (en) 2022-05-11 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for in situ sequencing
EP4540607A1 (en) 2022-06-17 2025-04-23 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
WO2024040060A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 10X Genomics, Inc. Ap50 polymerases and uses thereof
EP4482979B1 (en) 2022-11-09 2025-10-01 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of multiple analytes in a biological sample
EP4662234A2 (en) * 2023-02-08 2025-12-17 Toreador Therapeutics, Inc. Super-resolution microscopy (srm) multiplexing with cleavable moieties
WO2024196728A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Nanostring Technologies, Inc. Nucleic acid probes for combined sequencing and spatial analysis
EP4680764A2 (en) 2023-03-17 2026-01-21 Bruker Spatial Biology, Inc. Assay for recombinase accessible chromatin and related compositions and methods
WO2025029831A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 10X Genomics, Inc. Methods and systems for targeted rna cleavage and target rna-primed rolling circle amplification

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230558A (en) 1978-10-02 1980-10-28 Coulter Electronics, Inc. Single drop separator
US4318846A (en) 1979-09-07 1982-03-09 Syva Company Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US5091519A (en) 1986-05-01 1992-02-25 Amoco Corporation Nucleotide compositions with linking groups
US4811218A (en) 1986-06-02 1989-03-07 Applied Biosystems, Inc. Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing
US5151507A (en) 1986-07-02 1992-09-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US5066580A (en) 1988-08-31 1991-11-19 Becton Dickinson And Company Xanthene dyes that emit to the red of fluorescein
US5366860A (en) 1989-09-29 1994-11-22 Applied Biosystems, Inc. Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
US5188934A (en) 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5654419A (en) 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US5800996A (en) 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5847162A (en) 1996-06-27 1998-12-08 The Perkin Elmer Corporation 4, 7-Dichlororhodamine dyes
US5853993A (en) * 1996-10-21 1998-12-29 Hewlett-Packard Company Signal enhancement method and kit
US6322901B1 (en) 1997-11-13 2001-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US5990479A (en) 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6251303B1 (en) 1998-09-18 2001-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble fluorescent nanocrystals
US6426513B1 (en) 1998-09-18 2002-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble thiol-capped nanocrystals
WO2000053805A1 (en) * 1999-03-10 2000-09-14 Asm Scientific, Inc. A method for direct nucleic acid sequencing
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
US6576291B2 (en) 2000-12-08 2003-06-10 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of nanocrystallites
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
JP4567436B2 (ja) 2001-07-20 2010-10-20 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 発光ナノ粒子およびそれらの調製方法
US7057026B2 (en) * 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
JP4761202B2 (ja) * 2003-01-31 2011-08-31 学校法人慶應義塾 切断可能な対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法
WO2004094666A1 (en) * 2003-04-24 2004-11-04 Dzieglewska, Hanna Allele-specific mutation detection assay
CN101189345A (zh) * 2005-02-01 2008-05-28 Ab先进基因分析公司 珠基测序的试剂、方法和文库
EP1954708A4 (en) 2005-11-23 2009-05-13 Univ Utah Res Found Methods and compositions involving intrinsic genes
JP2009519717A (ja) * 2005-12-16 2009-05-21 アプレラ コーポレイション 位相を固定した配列決定のための方法およびシステム
WO2007076128A2 (en) 2005-12-23 2007-07-05 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
JP5700911B2 (ja) 2005-12-23 2015-04-15 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレーテッド 配向され、固定化された巨大分子を含む組成物とその製造法
CA2653095C (en) 2006-05-22 2013-07-16 Nanostring Technologies, Inc. Systems and methods for analyzing nanoreporters
US7745129B1 (en) * 2006-07-12 2010-06-29 Kenneth David Schatz Methods for sequencing of a necleic acid
WO2008069884A2 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 Panomics, Inc. Two-stage nucleic acid amplification using an amplification oligomer
CA2687292C (en) 2007-04-10 2017-07-04 Nanostring Technologies, Inc. Methods and computer systems for identifying target-specific sequences for use in nanoreporters
JP2010539982A (ja) * 2007-10-01 2010-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー チェイスライゲーション配列決定法
EP2227563B1 (en) * 2007-12-05 2012-06-06 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US20090298709A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
ES2457534T3 (es) 2008-05-30 2014-04-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Perfiles de expresión génica para predecir desenlaces en cáncer de mama
GB2461026B (en) * 2008-06-16 2011-03-09 Plc Diagnostics Inc System and method for nucleic acids sequencing by phased synthesis
US8519115B2 (en) 2008-08-14 2013-08-27 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
CN102858995B (zh) * 2009-09-10 2016-10-26 森特瑞隆技术控股公司 靶向测序方法
WO2011047087A2 (en) 2009-10-13 2011-04-21 Nanostring Technologies, Inc. Protein detection via nanoreporters
EP2516681B1 (en) 2010-02-11 2017-10-18 Nanostring Technologies, Inc Compositions and methods for the detection of preferably small rnas by bridge hybridisation and ligation
EP2539355B1 (en) * 2010-02-26 2016-10-05 Ventana Medical Systems, Inc. In-situ hybridization with polytag probes
US20110229888A1 (en) 2010-03-16 2011-09-22 Hengen Paul N Compositions and Methods for the Detection of Genomic Features
US20120003648A1 (en) * 2010-07-01 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Signal Multiplexing and Signal Amplification
EP2685988A4 (en) 2011-03-15 2014-08-20 Univ North Carolina Methods of treating breast cancer with anthracycline therapy
US9758834B2 (en) 2011-03-28 2017-09-12 Nanostring Technologies, Inc. Compositions and methods for diagnosing cancer
US20140227706A1 (en) * 2011-05-16 2014-08-14 Dna Chip Research Inc. Method for assessing progression of clinical state of malignant neoplasm by quantitative detection of DNA in blood
EP2722388B1 (en) * 2011-06-16 2017-08-09 Nippon Steel & Sumikin Eco-Tech Corporation Nucleic acid probe for assaying nucleic acids
CA2839705A1 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Nanostring Technologies, Inc. Multivariate diagnostic assays and methods for using same
EP3604555B1 (en) * 2011-10-14 2024-12-25 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
JP6144695B2 (ja) 2011-11-30 2017-06-07 ユニバーシティー オブ ノースカロライナ アット チャペル ヒル タキサン療法を用いて乳癌を処置する方法
CA2874492C (en) 2012-05-22 2021-10-19 British Columbia Cancer Agency Branch Nano46 genes and methods to predict breast cancer outcome
US20140037620A1 (en) 2012-06-29 2014-02-06 British Columbia Cancer Agency Branch Methods of Treating Breast Cancer with Gemcitabine Therapy
WO2014075067A1 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Nanostring Technologies, Inc. Methods to predict breast cancer outcome
WO2014182598A1 (en) * 2013-05-06 2014-11-13 Physicians Choice Laboratory Services, Llc Diagnostic assay combining cellular and cell free nucleic acid
AU2014278152A1 (en) * 2013-06-14 2015-12-24 Nanostring Technologies, Inc. Multiplexable tag-based reporter system
WO2016081740A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Nanostring Technologies, Inc. Enzyme- and amplification-free sequencing

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017268257B2 (en) 2023-09-07
WO2017201073A1 (en) 2017-11-23
CA3023566A1 (en) 2017-11-23
CN116200462B (zh) 2025-10-03
EP4324929B1 (en) 2025-09-17
US20190271028A1 (en) 2019-09-05
CN109715825B (zh) 2023-01-06
JP2022122964A (ja) 2022-08-23
SG11201809913PA (en) 2018-12-28
CN109715825A (zh) 2019-05-03
EP4324929A1 (en) 2024-02-21
US20240309432A1 (en) 2024-09-19
AU2017268257A1 (en) 2018-11-29
AU2023278046A1 (en) 2024-01-04
JP7457457B2 (ja) 2024-03-28
AU2023278046B2 (en) 2026-04-23
US20220282313A1 (en) 2022-09-08
KR102490693B1 (ko) 2023-01-19
KR20190012184A (ko) 2019-02-08
EP3458601A1 (en) 2019-03-27
CN116200462A (zh) 2023-06-02
EP4674976A3 (en) 2026-03-25
EP3458601B1 (en) 2023-07-05
US20170327876A1 (en) 2017-11-16
JP2024161084A (ja) 2024-11-15
JP2019522463A (ja) 2019-08-15
ES2956732T3 (es) 2023-12-27
EP4674976A2 (en) 2026-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3055169T3 (en) Methods for detecting target nucleic acids in a sample
JP7532458B2 (ja) 化学組成物とそれを利用する方法
JP6674951B2 (ja) 酵素不要及び増幅不要の配列決定
CN118265800A (zh) 用于多路fish的比率计量符号与顺序编码
CA3023566C (en) Methods for detecting target nucleic acids in a sample