ES3055180T3

ES3055180T3 - Proteoform specific process validation

Info

Publication number: ES3055180T3
Application number: ES21870197T
Authority: ES
Inventors: Fred Regnier; Jinhee Kim; Meena Narsimhan; Paul Dreier
Original assignee: NOVILYTIC LLC
Current assignee: NOVILYTIC LLC
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2026-02-10
Anticipated expiration: 2041-09-16
Also published as: US20220137063A1; EP4204158A1; EP4204158C0; EP4667931A3; EP4667931A2; GB202303660D0; EP4204158A4; US12379383B2; US20250354997A1; EP4204158B1; WO2022060947A1; GB2633729A

Abstract

Se proporciona un sistema y un método para validar el proceso de fabricación de composiciones biológicas complejas y, en particular, para proporcionar información de validación del proceso para su evaluación por una agencia reguladora federal. El sistema y el método evalúan de forma continua y cronológica la concentración de proteoformas en la composición biológica durante su producción en un fermentador. Las muestras del fermentador se analizan en un conjunto preseleccionado de columnas de análisis, donde los datos generados por las columnas se acumulan y evalúan, y se comparan, en particular, con los datos de etapas anteriores del proceso de producción. Un sistema de validación continua del proceso incluye sectores de análisis descendentes y ascendentes, cada uno con varias columnas de análisis diferentes que el controlador puede seleccionar para una composición biológica y un proceso de producción específicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Validación de procesos específicos de proteoformas

[0005] Estado de la técnica

[0007] Los extractos celulares y los fluidos corporales pueden contener desde decenas de miles hasta un millón o más de proteínas. La identificación de estas proteínas depende en gran medida del uso de espectrometría de masas (MS,mass spectrometry) y bases de datos de ADN para predecir secuencias proteicas. Las muestras de esta complejidad requieren separación por cromatografía líquida (LC) o electroforesis capilar (CE) antes del análisis por MS. Se sabe que, con LC-MS o CE-MS, la discriminación entre proteínas a menudo comienza dividiendo las muestras en un centenar o más de fracciones según sus propiedades estructurales antes de MS. Posteriormente, la MS fracciona aún más la muestra en función de la masa del analito. El análisis de proteínas intactas mediante MS se conoce generalmente como proteómica descendiente (“top-down”). (Véase,Catherman A D, Skinner O S, Kelleher N L. Top down proteomics: facts and perspectives. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 445(4): 683-693). En la espectrometría de masas se logra otro nivel de discriminación mediante la fragmentación de iones moleculares y la separación de los iones fragmento únicos resultantes según su masa. Estos análisis basados en péptidos se denominan proteómica ascendiente (“bottom-up”). (Véase, Angel, T.E.; Arial, U.K.; Hengelo, S.M.; Baker, E.S.; Kelly, R.T.; Robinson, E.W.; Smith, R.D. Mass spectrometry-based proteomics: existing capabilities and future directions. Chem. Soc. Rev. (2012), 41 (10): 3912-28.).

[0009] A nivel celular, se sabe que la biosíntesis de proteoformas comienza con la transcripción del ADN, dando lugar a la formación de especies de pre-ARNm y ARNm primario mediante una combinación de impronta epigenética, escisión de intrones, reordenamiento y/o recombinación de exones, fusión de exones y regulación del número de copias de ARNin vivo,tal como se refleja en el gráfico deFIG. 2.A continuación, se produce el procesamiento postranscripcional en el compartimentoin vivo, donde se generan especies de ARNm maduro con variaciones en el empalme, la edición enzimática y el desplazamiento de marco de lectura. En promedio,un solo gen codificador de proteínas puede generar cinco o más especies de ARNm durante el transcurso de estas etapas de procesamiento. El empalme alternativo del ARNm, los polimorfismos de un solo aminoácido (SAP,single amino acid polymorphism) y un gran número de modificaciones postraduccionales (PTM)in vivodesempeñan un papel adicional en la formación de proteoformas. No contempla capas adicionales de complejidad derivadas de las interacciones entre el genoma, el epigenoma, el transcriptoma, el proteoma y el metaboloma de las células huésped, junto con los efectos ambientales y la biología de sistemas de procesos.

[0011] La etapa final en la creación de una familia de proteoformas es la modificación postraduccional (MPT)in vitro.Con las MPTin vitro, las proteínas pueden ser modificadas por enzimas excretadas al medio de cultivo, además de las enzimas y las reacciones no enzimáticas en el propio medio de cultivo (FIG. 2).La expresión de una familia de proteoformas y la proporción de proteoformas en la misma es dinámica. Es de particular importancia el impacto de las variables ambientales en la expresión de proteínas. (Véase,Li, W.; Kerwin, J.L.; Schiel, J.; Formolo, T.; Davis, D.; Mahan, A.; Benchaar, S.A. Structural elucidation of post-translational modifications in monoclonal antibodies. Véase, ACS Symp. Series (2015), 1201, 119-183; Gault, J.; Malosse, C.; Machata, S.; Millien, C.; Podglajen, I.; Ploy, M.-C.; Costello, C.E.; Dumenil, G.; Chamot-Rooke, J., Complete posttranslational modification mapping of pathogenic Neisseria meningitidis pilins requires top-down mass spectrometry. Proteomics (2014), 14, (10), 1141-1151)). La transición de la fase exponencial a la fase estacionaria de crecimiento es otra variable. (Véase, Sandalio, L.M.; Gotor, C.; Romero, L.C.; Romero-Puertas, M.C. Multilevel regulation of peroxisomal proteome by post-translational modifications. Intern. J. Mol. Sciences (2019), 20(19), 4881)

[0013] Esto atañe al núcleo de la continuidad de monitorización del proceso en la biosíntesis de proteoformas. Además el hecho de que las variantes de mAb con modificaciones postraduccionales (PTM) puedan variar en su actividad biológica, algunas PTM confieren toxicidad o inmunogenicidad. En el caso de los mAb, las PTMin vitromás comunes son la formación de ácido piroglutámico en los extremos N-terminales de las proteínas, la degradación en los extremos N- y C-terminales, los cambios conformacionales que implican la reorganización de los puentes sulfhidrilo y disulfuro, la desamidación, la oxidación de la metionina, la glicación y las variantes de glicosilación; algunas de las cuales constituyen atributos críticos de calidad (CQA,critical quality attributes) de un mAb. Muchas de estas isoformas son no naturales y varían sustancialmente en magnitud, actividad biológica, inmunogenicidad y propensión a la agregación. A través de todas estas etapas, una familia de anticuerpos monoclonales presenta aproximadamente 130 glicoformas y una serie de otras modificaciones postraduccionales (PTM) distribuidas en una misma familia.

[0015] La monitorizaciónde procesos mediante estos procedimientos utiliza estructuras de proteoformas como herramientas de diagnóstico, pero de una manera distinta a otros procedimientos de diagnóstico. En el diagnóstico de salud y enfermedad, se emplean biomarcadores para evaluar el estado biológico de una célula u organismo, pero solo después de analizar el proteoma completo en busca de proteínas asociadas al fenómeno biológico en cuestión y confirmar dicha asociación en miles de pacientes. La FDA exige niveles de validación rigurosos antes de aprobar procedimientos de diagnóstico clínico basados en biomarcadores.

[0017] [0006]El diagnósticode procesos es lo opuesto. Se desconoce el estado biológico exacto de las células huésped al tomar una muestra para su análisis. Además, dicho estado biológico generalmente no puede replicarse, como sí es posible en células sanas y enfermas. El uso de células huésped modificadas genéticamente para producir una familia de proteomas con una proporción de concentración fija no está sujeto a un control celular estricto. Por ello, las variables ambientales o del entorno tienen un impacto tan grande en las proporciones de proteoformas y CQA. La biología de sistemas aún no ha evolucionado lo suficiente como para que sea posible un control regulatorio estricto de las proporciones de proteoformas y CQA.

[0018] El diagnóstico requiere un punto, o puntos, de referencia a lo que se considera un continuo normal o una evolución gradual hacia un nuevo estado biológico. El envejecimiento celular constituiría dicha evolución hacia un nuevo estado. En un fermentador se dispone de cinco puntos de referencia:

[0019] (i) la proporción proteoforma/CQA en un punto temporal particular justo antes de tomar una muestra;

[0020] (ii) la proporción proteoforma/CQA de una ejecución de producción anterior idéntica en el mismo tiempo transcurrido; (iii) proporciones de metabolitos y nutrientes en los mismos puntos en el tiempo;

[0021] (iv) proporciones de proteínas de la célula huésped concomitantes al mismo tiempo; y

[0022] (v) datos de sensores ambientales o del entorno tomados en el mismo tiempo relativo.

[0023] Resumen de la divulgación

[0024] Haciendo referencia al diagrama de flujo de lafigura 1, los problemas de monitorización del proceso en el procesamiento de proteoformas se abordan identificando los problemas potenciales a medida que se producen (Segmento A), seleccionando y priorizando los procedimientos de confirmación (Segmento B), confirmando la existencia del problema (Segmento C) y, posteriormente, implementando una solución en el Segmento D. Se extraen muestras del fermentador cada hora. Las proteínas terapéuticas intactas se analizan cromatográfica o electroforéticamente en un primer sector de la instrumentación del sistema analítico mediante estrategias analíticas invariables preseleccionadas. Los datos de estos análisis se digitalizan y el sistema de datos los compara con puntos de referencia previos en el Segmento A. El sistema de datos determina los cambios aparentes en la concentración relativa de proteoformas, metabolitos, nutrientes, proteínas de la célula huésped y sensores ambientales o del entorno basándose en datos de referencia previos. Las desviaciones aparentes de estos puntos de referencia desencadenan que el sistema de datos busque los procedimientos de confirmación más apropiados en el Segmento B e inicien los procedimientos seleccionados en un segundo sector de la instrumentación (Segmento C). El objetivo de las etapas del Segmento C es: (i) identificar la(s) proteoforma(s) probable(s) que contribuyen a los cambios basándose en las propiedades de separación; y (ii) predecir los fragmentos peptídicos resultantes de la digestión con tripsina a partir de estas proteoformas, lo que permitiría verificar la identificación de la(s) proteoforma(s). A nivel metodológico, esto requiere que el sistema de datos en el Segmento B: (i) seleccione y aplique secuencialmente una serie de procedimientos que seleccionarán por afinidad la(s) proteoforma(s) relevante(s); (ii) seleccione procedimientos que conduzcan a la digestión enzimática de las proteoformas e identifiquen los péptidos característicos; (iii) realice la cuantificación basada en MRM de los fragmentos peptídicos predichos; y (iv) identifique los iones fragmento inducidos por CID del péptido o péptidos predichos como fragmentos mediante LC-MS. La confirmación del problema se logra mediante un análisis de datos adicional en el Segmento D.

[0025] La concentración y las proporciones constituyentes de las proteínas de la célula huésped (HCP) se examinan mediante cromatografía o electroforesis tras la eliminación de las proteínas terapéuticas por afinidad. Las HCP se obtienen transfiriendo las fracciones aparentemente variantes de un sector de la instrumentación de arriba hacia abajo al segundo sector para el análisis de péptidos, del mismo modo que se utiliza con las proteínas terapéuticas. Los cambios aparentes en la concentración y la proporción en el primer sector analítico se extraen de los datos analíticos y se registran. La identificación estructural adicional de las HCP se obtiene transfiriendo las fracciones aparentemente variantes del sector de arriba hacia abajo al segundo sector para el análisis de péptidos.

[0026] Los exometabolitos y nutrientes se analizan eliminando primero los componentes mayores de mil daltons mediante cromatografía de exclusión molecular. Las HCP también pueden eliminarse con una columna de afinidad de reconocimiento de HPC aguas abajo. La absorbancia antes y después de la eliminación de las HCP proporciona una estimación aproximada de la concentración de HCP. De nuevo, se extraen los cambios aparentes de concentración y proporción en el primer sector analítico a partir de los datos analíticos y se registran. La fracción de metabolitos y nutrientes se transfiere a continuación a una columna cromatográfica donde se adsorben en la entrada de la columna y las sales inorgánicas se dejan pasar para eliminarse. Las identificaciones se consiguen mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). La dinámica de estas sustancias refleja el consumo de nutrientes por las células huésped, la excreción y la muerte celular.

[0027] Descripción de las figuras

[0028]

[0029] LaFIG.1es un diagrama de flujo de las etapas de un procedimiento para la validación de procesos específicos de proteoformas según la presente divulgación.

[0030] LaFIG.2es un gráfico que describe la síntesis de proteoformas en un fermentador.

[0031] LaFIG.3es un diagrama anotado de un sistema de validación continua de procesos según la presente divulgación. LaFIG.4es un diagrama del sistema de validación continua de procesos según la presente divulgación.

[0032] LasFIGURAS 5A-Dson un diagrama que muestra las etapas en la detección específica de proteoformas.

[0033] LaFIG.6son diagramas químicos que muestran péptidos sintetizados que contienen modificaciones PTM.

[0034] LaFIG.7es un diagrama que muestra las etapas en la derivatización de péptidos glicados y glicosilados.

[0035] Descripción detallada

[0036] Con el fin de promover la comprensión de los principios de la presente divulgación, a continuación se hará referencia a las realizaciones ilustradas en los dibujos y descritas en la siguiente memoria descriptiva escrita.

[0037] Las realizaciones preferidas de la presente invención están dirigidas a identificar y evaluar cuantitativamente las desviaciones en las proporciones proteoforma/CQA con respecto a los puntos de referencia a través de la serie de etapas del diagrama de flujo de lafigura 1. De manera específica, como comprenderá cualquier experto en la materia, a continuación se describen diversas iteraciones y realizaciones de los procedimientos y posibles análisis. Si bien las realizaciones descritas en el presente documento abordan diferentes aspectos de la separación, detección, identificación y cuantificación de proteoformas/CQA, proteínas de la célula huésped, metabolitos y nutrientes, estas etapas pueden realizarse en distinto orden, en múltiples combinaciones y en distintos puntos de tiempo, según lo indique el análisis de sistemas, en función de la calidad y las características de la muestra procedente del fermentador.

[0038] La presente divulgación contempla un sistema de validación continua de procesos para implementar las etapas del procedimiento de laFIG.1.El sistema de validación de procesos10,que se muestra en lasFIGURAS 3,4,incluye dos sectores,14, 16, que procesan muestras obtenidas de un fermentadorFmediante un sistema de muestreo12.El fermentadorFpuede tener un diseño convencional para la biosíntesis de proteoformas. El sistema de muestreo12puede tener un diseño convencional configurado para extraer muestras del fermentador, e incluye un componente de eliminación de partículas12ay un componente de alicuotado de muestras12b.Los sectores del sistema de validación de procesos10incluyen un sector descendente14y un sector ascendente16.A modo de ejemplo, lasFIGURAS 3-4demuestran que una muestra de proteína intacta procedente de un fermentador puede analizarse de siete maneras diferentes dentro del sector descendente12,tal como se describe con más detalle a continuación. Dentro de estos modos, la resolución de proteínas puede lograrse en función de la carga, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la afinidad por una lectina inmovilizada, el contenido de histidina, la afinidad por un anticuerpo, el tamaño molecular o cualquier combinación de los mismos. El sistema CPV10incluye una válvula de acoplamiento de sector18que puede acoplar la salida14aa la entrada16adel sector ascendente16.Gracias a esta capacidad de transportar la alícuota de muestra entre sectores y derivaciones dentro de los sectores del sistema de validación de procesos, los analitos resueltos con un modo de separación específico pueden detectarse mediante absorbancia con un detector de UV-Vis/matriz de diodos40,fluorescencia con un detector de fluorescencia50o análisis de masas con un espectrómetro de masas40.Además, los analitos identificados tentativamente en el sector descendente14con concentraciones variables pueden confirmarse en el sector ascendente16mediante el uso de procedimientos seleccionados por el análisis del sistema implementado por un controlador20.Al igual que en el sector descendente14,en el sector ascendente16se pueden utilizar múltiples modos de separación y combinaciones de los mismos para resolver péptidos derivados de proteínas y proteoformas. En total, los dos sectores14 y 16proporcionan más de 500 combinaciones de procedimientos utilizando las estrategias analíticas multimodales de cuatro dimensiones descritas en el presente documento.

[0039] Los términos empleados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por una persona con conocimientos técnicos en la materia. Si bien los términos en el presente documento se utilizan para describir realizaciones y versiones particulares de la presente invención, no pretenden limitar el alcance de la presente invención, salvo lo expresamente indicado en las reivindicaciones.

[0040] Según las versiones de la presente invención, un “analito” se refiere a una proteoforma, proteína de la célula huésped, metabolito o nutriente presente en una muestra cuya medición se desea realizar. Los “analitos de interés” se refieren a proteínas, CQA, metabolitos o nutrientes, cuyos cambios en su concentración podría afectar la calidad de la proteína terapéutica, independientemente de si se sabe que están presentes en la muestra.

[0041] Como es bien sabido por los expertos en la materia, un anticuerpo monoclonal (mAb) generalmente se compone de múltiples isoformas proteicas estructuralmente relacionadas. Los términos “analito mAb” y “expresión de mAb” se refieren a una familia de mAb de isoformas estructuralmente relacionadas, denominadas proteoformas o CQA, que están codificadas por el genoma celular de las células huésped y el entorno en un fermentador. Tal como se observa en lafigura 2, se entiende que,a través de múltiples niveles de transcripción de ADN, se forman especies de pre-ARNm y ARNm primario en los núcleos celulares como resultado de la impronta epigenética, la escisión de intrones, la reorganización de exones, la fusión de exones y la regulación del número de copias de ARN, junto con el procesamiento postranscripcional y las modificaciones postraduccionales; el resultado neto es una familia de proteoformas que posee múltiples elementos estructurales idénticos, pero que difiere en sitios estructurales específicos.

[0042] [0018] El término “analizar”, tal como se describe en el presente documento, se refiere a la aplicación de técnicas apropiadas en el sector descendiente14o seleccionadas mediante análisis de sistemas en el sector ascendiente16, que determinan uno o más analitos de interés utilizando técnicas analíticas cuantitativas que miden la concentración de uno o más analitos de interés mediante el uso de procedimientos de detección por absorbancia, fluorescencia o espectrometría de masas.

[0044] Una "muestra" se refiere a una alícuota de medio de fermentación obtenida del fermentadorFque contiene analitos de interés extraídos de un fermentador durante el desarrollo del proceso o una campaña de producción.

[0046] La "purificación" de una muestra, según las versiones de la presente invención, se refiere a la separación, al menos parcial, de los analitos de interés, si los hubiere, de los demás componentes de la muestra sin alterar sustancialmente las propiedades del analito de interés. La purificación se refiere a un procedimiento que aumenta la cantidad de analitos de interés, si los hubiere, en relación con otros componentes de la muestra que podrían interferir con la detección óptica o el análisis por espectrometría de masas de los analitos de interés. Esta reducción relativa no requiere la eliminación sustancial o total de la sustancia que interfiere con el análisis.

[0048] El término “límite inferior de cuantificación”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al punto más bajo en el que el analito produce una señal suficiente en un detector para ser identificable, discreto y reproducible, con una desviación estándar relativa inferior al 20 % y una precisión superior al 80 %. El “límite de detección” es el punto en el que el valor medido mediante detección óptica o espectrometría de masas es igual o inferior a la incertidumbre asociada a dicho valor, y se define como tres veces la desviación estándar relativa de la media a concentración cero.

[0050] Tal como se acepta en el campo de la proteómica, el término “descendiente” o “top-down” se refiere en la presente divulgación a los procedimientos de identificación y cuantificación de proteínas e isoformas proteicas utilizando proteínas intactas. “Ascendente” o “bottom-up” se refiere a los procedimientos utilizados en la identificación, caracterización y cuantificación de proteínas y proteoformas de péptidos derivados de digestiones proteolíticas de las mismas.

[0052] En la presente divulgación, el término "sistema de validación de procesos" se refiere a una plataforma de instrumentos diseñada para ejecutar la identificación, caracterización y cuantificación de proteínas y proteoformas, tanto descendiente como ascendiente, tal como se muestra en el sistema10ilustrado en lasfiguras 3-4.Las características distintivas de este sistema instrumental son que: (i) las muestras analíticas libres de células se extraen automáticamente de un fermentador mediante el sistema de muestreo12a intervalos fijos de tiempo durante toda una campaña de producción; (ii) los análisis descendientes (TD) y ascendentes (BU) se ejecutan automáticamente en sectores separados dentro de la plataforma; (iii) la detección mediante las columnas del conjunto de columnas25del sector TD14se basa en el reconocimiento molecular y es específica de proteoformas; (iv) los procedimientos y la secuencia en que se aplican se determinan en el sector BU16mediante inteligencia artificial (IA); (v) la detección y cuantificación de péptidos característicos mediante las columnas de los conjuntos de columnas26 y 27del sector BU16se basa en el análisis de la proporción isotópica por espectrometría de masas; (vi) los sectores TD y BU14 y 16pueden funcionar en paralelo o en tándem; (vii) los analitos se pueden transferir entre los sectores para la construcción de procedimientos multietapa; (viii) los múltiples modos de análisis se ejecutan en cada sector; (ix) los modos analíticos y la secuencia en que se aplican en cada sector son variables y se seleccionan para garantizar la evaluación de la continuidad del proceso; (x) la selección y secuenciación de los procedimientos analíticos se controlan mediante inteligencia artificial; (xi) los datos analíticos se vuelven inmutables durante la adquisición; y (xii) el sistema puede funcionar en un entorno de fabricación. Cuando se utiliza en la monitorización continua de procesos ascendente, la plataforma se denomina aquí sistema de “validación continua de procesos” (sistema CPV,continuous process validation).

[0054] [0024] El sistema de muestreo12puede configurarse para extraer muestras directamente del fermentador mediante acustoforesis, filtración por membrana o una combinación de ambas. Una alícuota libre de partículas se transporta desde el fermentador a la entrada de muestra del sistema CPV mediante una bomba de baja presión22.Además de eliminar partículas y restos celulares, el sistema de muestreo12no realiza fraccionamiento a nivel molecular. La(s) muestra(s) se dirige(n) a través de conjuntos de columnas de análisis25, 26 y 27.El conjunto de columnas25del sector TD incluye columnas de afinidad, IMAC (cromatografía de afinidad a metales inmovilizados), HIC (cromatografía de interacción hidrofóbica), HILIC (cromatografía de interacción hidrofílica), WAX y WCX (intercambio aniónico y catiónico débil) y SEC (exclusión por tamaño), como se conoce bien en la técnica. En una realización específica, las columnas del conjunto de columnas TD25tienen un diámetro interno de aproximadamente 4,6 mm o, en algunos casos, de aproximadamente 7,8 mm. El conjunto de columnas26del sector BU16incluye columnas SAX y SCX (intercambio aniónico y catiónico fuerte), HILIC, RPC (cromatografía de fase inversa), WAX y SEC, como se conoce también en la técnica. El conjunto de columnas27del sector BU incluye columnas de afinidad de boronato, afinidad (con medios de afinidad seleccionados) e IEC (intercambio iónico), como se conoce en la técnica. En una realización específica, las columnas del conjunto de columnas TD25tienen un diámetro interno inferior a aproximadamente 1 mm. Cada conjunto de columnas incluye una derivación respectiva25a, 26a o 27aa la que se puede acceder para evitar las columnas de análisis. Las válvulas mcsv (válvula de selección multicanal)30-32dirigen la muestra a las columnas apropiadas o a la derivación dentro de los conjuntos de columnas25-27.Se entiende que cada una de las columnas en los conjuntos25-27está configurada para un tipo específico de análisis de la alícuota de muestra. La bomba mcvs22bombea la alícuota de muestra a través del sector TD14,mientras que una bomba mcvs23extrae la muestra a través de las columnas26, 27del sector BU16.Una tercera bomba mcvs24puede bombear una muestra a través de una columna PCR (reactor post-columna)38para la detección de cierto material genético.

[0056] En términos generales, el sistema CPV10que se muestra en lasFIGURAS 3-4está acoplado a un fermentadorFexistente que es monitorizado constantemente mediante sensores ambientales o del entorno55.Los datos de los sensores se envían a un controlador20que está configurado para ejecutar un software que evalúa los datos de los sensores y, en particular, para determinar los puntos de referencia del proceso que tiene lugar en el fermentador. Cuando se dan las condiciones ambientales o del entorno predeterminadas en el fermentadorF,el controlador20dirige el sistema de muestreo12para extraer una muestra del fermentador. A continuación, el controlador20hace funcionar los dos sectores basado en un protocolo de validación específico para determinar la integridad de la muestra y, por tanto, la validez del proceso que tiene lugar en el fermentador. El controlador20activa de este modo al menos la bomba22para dirigir la muestra al sector TD14.Según el protocolo de validación, el controlador puede dirigir la inyección de reactivo(s) específico(s) en la muestra a través de uno correspondiente de los puertos41 o 42antes de que la muestra pase a una de las columnas de análisis del conjunto de columnas25(26o27). El controlador acciona entonces la válvula mcsv30para dirigir la muestra a una de las columnas de análisis seleccionadas del conjunto25,de nuevo siguiendo el protocolo de validación predeterminado. En algunos casos, el controlador dirige la muestra a la derivación25apara que la muestra pueda pasar de la salida14adel sector TD al sector BU16.En otros casos, la muestra ha pasado por una de las columnas de análisis y a continuación debe dirigirse desde la salida14aal sector BU16.

[0058] Para una muestra dirigida al sector BU, el controlador orienta la válvula de acoplamiento de sector18de manera que uno de los bucles de ramificación internos18acoloca la bomba23en comunicación entre la salida14adel sector TD y la entrada16adel sector BU. El controlador también puede dirigir los reactivos que se introducirán en la muestra a través de uno de los puertos correspondientes45-46.En el sector BU16,el controlador20puede activar las válvulas mcsv31 y 32para dirigir la muestra a la columna apropiada en los conjuntos de columnas26, 27.

[0060] Antes de salir del sector BU16,la muestra pasa a través de un detector UV-Vis/matriz de diodos y un espectrómetro de masas40.En algunos protocolos, antes de entrar en el sector BU, la muestra se dirige a través de una columna de proteólisis Pep-Fc60mediante la válvula de acoplamiento de sector18,en la que se puede digerir una familia de proteoformas no fraccionadas que se ha seleccionado por afinidad antes del análisis de las clases de péptidos resultantes en las columnas del sector BU, en las que la columna de afinidad del conjunto de columnas27es resistente a la digestión con tripsina.

[0062] En otros protocolos de validación, la muestra no necesita pasar a través del sector BU16,por lo que la válvula de acoplamiento de sector18puede ser orientada por el controlador para dirigir la muestra al desechoWo a la columna de PCR38,o alternativamente a través de una derivación, alimentada por la bomba mcsv24,para su posterior evaluación mediante un detector de fluorescencia50.Los reactivos pueden introducirse en la muestra en la bomba mcsv24a través de los puertos43-44.

[0064] Tal como se describe con más detalle en el presente documento, el funcionamiento del sistema CPV10se gestiona mediante el controlador20según protocolos de validación predefinidos. Además de las etapas predefinidas de los protocolos, el controlado monitoriza los datos generados por cada una de las columnas de análisis de los conjuntos25-27.La determinación de si una muestra concreta se dirige al sector BU16puede basarse en los resultados del análisis en el sector TD14,por lo que el controlador evalúa los datos del sector TD para realizar esa determinación. De este modo, el controlador está configurado para tomar decisiones en tiempo real según sea necesario para gestionar el proceso de validación. Otros detalles del sistema CPV10y del controlador20se describen a continuación con ejemplos específicos.

[0066] Las columnas de análisis identificadas en la realización específica de lasFIGURAS 3-4se seleccionan para el análisis de anticuerpos monoclonales. Una realización preferida del sistema CPV para el análisis de anticuerpos monoclonales (mAb) utiliza el cambio de columnas entre las columnas del conjunto de columnas25en el sector14,mediante la válvula mcsv30,y las columnas de los conjuntos26, 27en el sector16,mediante las válvulas mcsv31, 32,respectivamente, para permitir un cambio rápido, automatizado y secuencial de un modo cromatográfico o electroforético a otro en un lapso de tiempo de 30 a 60 minutos durante la validación continua del proceso, según lo determina el controlador20.La retención relativa de las proteoformas varía entre los modos de separación de manera específica de estructura, controlada por el controlador20utilizando inteligencia artificial (IA). Si bien los modos preferidos pueden variar entre familias de proteoformas, la cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrofóbica, afinidad por metales inmovilizados e interacción hidrofílica son las preferidas para la separación de proteínas intactas, aunque los modos de separación electroforética también pueden ser adecuados. Los analitos que se eluyen en cada modo de separación se identifican, cuantifican y representan gráficamente como una proporción de concentración y las gráficas se comparan con análisis previos en el ciclo de producción y tiempos de fermentación equivalentes de muestras estándar aceptadas, en un componente de adquisición de datos del controlador20.Una interfaz de usuario20aestá conectada al controlador y puede incluir una pantalla para visualizar los datos generados por este, tal como se describe en este documento. La función del análisis multimodal es validar, mediante múltiples modos de análisis, el grado de continuidad en un proceso de fabricación.

[0067] Una de las columnas del conjunto25del sector TD14implementa cromatografía de exclusión molecular (SEC) o electroforesis capilar para el análisis de agregados de proteoformas de mAb. En una realización, se puede conectar un módulo de electroforesis convencional a la derivación25a.Las condiciones ambientales o del entorno en un fermentador pueden variar lo suficiente como para causar la formación de agregados inmunogénicos de mAb, lo que disminuye la calidad del producto. La SEC y la electroforesis en gel son capaces de detectar agregados de mAb que contienen hasta cuatro proteoformas. El efluente de la columna SEC que contiene metabolitos y nutrientes se dirige a los conjuntos de columnas en el sector BU16para su separación y cuantificación, tal como se refleja en el Segmento A del diagrama de flujo en laFIG.1.

[0069] En una realización preferida, el controlador20implementa inteligencia artificial (IA) en el análisis de los datos generados en el sector TD14para detectar posibles variaciones en el proceso de fabricación y seleccionar péptidos para su análisis en el sector BU16.Este enfoque proporciona una validación independiente de las variaciones estructurales. Los modos de análisis en el sector BU16están dirigidos por IA (Segmento B de laFIG.1).

[0071] Un modo de funcionamiento preferido en el sector TD14del sistema CPV es diseñar proteoformas intactas detectadas específicamente con alta sensibilidad a medida que eluyen de las columnas, mediante el marcaje no covalente de los analitos con un reactivo de marcaje fluorescente, introducido a través de uno de los puertos41 o 42.Los agentes de marcaje de analitos (ATA,Analyte tagging agents), tal como se describen en el presente documento, se unen de forma específica a un motivo estructural concreto dentro de todos los miembros de una familia de proteoformas mediante reconocimiento molecular. Más concretamente, el reconocimiento molecular es una interacción entre un analito y un ATA que presenta complementariedad molecular con el analito a través de enlaces no covalentes; ejemplos de estos enlaces son los enlaces de hidrógeno, la coordinación metálica, las fuerzas hidrofóbicas, las fuerzas de van der Waals, las interacciones π-π y/o los efectos electrostáticos. Otra realización preferida es que los ATA de reconocimiento molecular tengan un bajo peso molecular para permitir su unión en un espacio reducido dentro de una proteína; los péptidos, los aptámeros y los afímeros son los reactivos de reconocimiento preferidos. Como es bien sabido por los expertos en la materia, un fluoróforo puede ser un componente estructural de un ATA, lo que permite la detección de fluorescencia de diversas maneras. Una realización preferida con el sistema CPV es mediante transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), donde un fluoróforo donante, unido por reconocimiento molecular en un sitio específico en la superficie de un analito, se excita y emite energía fluorescente que excita a un fluoróforo aceptor adyacente en un ATA unido de forma similar por reconocimiento molecular en la superficie del analito.

[0073] El sector BU16del sistema CPV está configurado para conseguir la identificación y cuantificación mediante la adición de patrones internos marcados isotópicamente a los productos de digestión proteolíticos, que posteriormente se analizan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). El patrón interno es una mezcla de todos los péptidos característicos posibles, que se añade en una cantidad conocida antes del análisis de una muestra, donde el patrón interno es generado mediante la síntesis de péptidos que contienen aminoácidos marcados con<13>C o mediante el marcaje de aminas primarias con un reactivo derivatizante marcado con<13>C, introducido a través de uno de los puertos45, 46.Esto permite que cualquier péptido característico seleccionado por el análisis de sistemas para la identificación del analito esté presente en la mezcla del patrones internos. Un procedimiento de marcaje alternativo, utilizado con proteínas glicadas y glicoproteínas, consiste en acilar una o más aminas primarias en todos los péptidos con un agente acilante marcado con un isótopo pesado; el acetato con<2>H<3>y el propionato marcado con<13>C<3>>son los agentes de marcaje preferidos. Las proteoformas de anticuerpos monoclonales pueden variar sustancialmente en cantidad, atributos de calidad críticos y eficacia terapéutica, tal como se indicó anteriormente. Por estas razones, la calidad suele clasificarse de forma global como “alta” o “de moderada a baja” según las propiedades de la familia en su conjunto. La evaluación de la variabilidad del proceso durante un ciclo de producción se logra más fácilmente mediante la obtención del perfil cualitativo y cuantitativo de una familia en función del tiempo, en lugar de mediante CQA.

[0075] El sistema de validación continua de procesos (CPV)10representado en lasFIGURAS 3-4es una plataforma instrumental única que proporciona: i) identificación tentativa rápida, cuantificación y proporciones de concentración de proteoformas en el sector TD14cada hora; ii) selección basada en IA de procedimientos y péptidos característicos para confirmar las mediciones del sector TD en el sector BU16; iii) ejecución de estos procedimientos en presencia de altas concentraciones de proteínas de células huésped, metabolitos y medio de cultivo; iv) reconocimiento y cuantificación de múltiples tipos de PTM dentro de una familia de proteoformas; v) diferenciación entre proteoformas que surgen en diferentes compartimentos celulares; y vi) ejecución automática de estos procedimientos en línea en un entorno de procesamiento aguas arriba no de laboratorio cada hora durante dos semanas.

[0077] El procedimiento y el sistema divulgados en el presente documento pueden utilizarse para monitorizar la producción de cualquier proteína recombinante, aunque la plataforma instrumental y los procedimientos que permite fueron diseñados específicamente para monitorizar cualitativa y cuantitativamente productos compuestos de múltiples proteoformas.

[0079] Muestreo del fermentador

[0080] El sistema de muestreo12y el componente de eliminación de partículas12aestán configurados para eliminar asépticamente células y residuos de los componentes solubles de la muestra en el caldo de fermentación. La acustoforesis y la filtración por membrana son los procedimientos preferidos. En la acustoforesis, una corriente de caldo se transporta a través de un canal rectangular que contiene un resonador de media longitud de onda que dirige una onda acústica a través del canal de flujo. Las células que se desplazan a través del canal experimentan una fuerza acústica mayor que las macromoléculas y hace que se concentren en una posición específica de la corriente de flujo. Al equilibrar la velocidad lineal y la potencia acústica, las partículas se segregan axialmente y se dirigen a una salida específica, mientras que los analitos solubles salen por otra salida. Las células y los restos celulares se devuelven al fermentador o se desechan. Entre las ventajas del muestreo acustoforético se encuentran que el canal de separación no se obstruye durante una campaña de producción, el sistema es pequeño y fácil de esterilizar, los volúmenes de muestreo son pequeños en comparación con el volumen del fermentador y la focalización acústica es lo suficientemente suave como para no dañar las células.

[0081] La filtración por membrana mediante un sistema de fibra hueca es una segunda opción de muestreo, ya sea por transporte difusivo solo o con un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF,tangential flow filtration) del tipo utilizado por Repligen. Con TFF, las proteínas solubles se extraen continuamente del fermentador. Esto facilita el muestreo y, accidentalmente, elimina las partículas. El permeado obtenido mediante un sistema TFF puede utilizarse para la validación continua del proceso. La porosidad y el tamaño de poro de la membrana determinan la producción y el peso molecular de los analitos seleccionados. En una realización específica, el límite de peso molecular de elección para los anticuerpos monoclonales y muchas proteínas terapéuticas es de 500 kilodaltons (kDa). Esto impide el transporte de células, restos celulares y muchos virus al permeado, al tiempo que permite la recogida de mAb.

[0082] En ausencia de un sistema de recogida por membrana a escala de producción en el fermentador, en ciertas realizaciones específicas se puede utilizar un pequeño sistema analítico KrosFlo<®>Research II con un monitor de presión digital, un cartucho de membrana MCO de 500 kDa de 65 cm de longitud, 60 cm<2>de área superficial y 2 ml de volumen de cartucho de membrana de Spectrum (filial de Repligen). El permeado se transporta directamente al sistema CPV, mientras que el permeado no utilizado se envía al desechoW.El sistema de muestreo por membrana de Spectrum puede funcionar en modo de diálisis o TFF.

[0083] En otra realización específica, el muestreo directo del caldo del fermentador se puede realizar de forma aséptica con un sistema de muestreo TAKEONE<™>de All-Pure Technologies, suministrado por AllPure Technologies LLC de New Oxford, PA. Este dispositivo es capaz de extraer simultáneamente hasta nueve corrientes separadas de forma aséptica desde un fermentador. Es posible realizar un muestreo continuo o intermitente a través de cualquiera de estas líneas. Las bacterias, las partículas celulares y los virus se eliminaron de las muestras de caldo en bruto mediante centrifugación. Como alternativa, se puede utilizar este procedimiento con acustoforesis en tándem para eliminar las partículas.

[0084] Intervalo de tiempo de análisis

[0085] Un objetivo del procedimiento de validación de procesos continuos aquí descrito es recopilar datos suficientes para estimar la variabilidad del proceso. El tiempo de muestreo depende de la velocidad a la que la concentración de proteoformas puede cambiar significativamente en un fermentador. Se estima que es inferior al 1 % por hora, tal como se muestra a continuación. El tiempo mínimo de muestreo descendiente a través del sector TD14puede establecerse en 30 minutos, lo que proporcionará un máximo de 672 muestras en un ciclo de producción de dos semanas. Este tiempo también resulta ser el mínimo necesario para que un sistema de cromatografía líquida o electroforesis pueda lograr una separación de alta resolución en la mayoría de los casos.

[0086] Mapeo cuantitativo de perfiles de elución de proteoformas

[0087] El objetivo de la cuantificación en la validación de procesos continuos es evaluar los cambios en la tasa de síntesis de proteoformas que indicarían una desviación del proceso. Tal como se observa en lafigura 2,las proteoformas pueden sintetizarse de diversas maneras. Además, las proteoformas pueden diferir en el contenido de CQA. Las diferencias en los cambios de tasa de síntesis durante la producción influyen en sus proporciones de concentración y, por lo tanto, en la eficacia terapéutica de una familia de proteoformas. El análisis que sigue se centra en los tipos de mediciones que un sistema CPV debe realizar para validar la continuidad del proceso.

[0088] [0043] Los cambios en la tasa de síntesis de proteoformas durante la fermentación se deben a: i) alteraciones en la expresión celular, modificaciones postraduccionalesin vivoy excreción al medio de cultivo; ii) modificaciones postraduccionalesin vitro;iii) la tasa de proliferación celular; iv) el envejecimiento celular; y v) la muerte celular. La cantidad total(Atn) de una proteoformaAsintetizada dentro de un intervalo de tiempo de fermentaciónnserá es la tasa de síntesis deAen el intervalo de tiempon, Aones la cantidad deAen el fermentador al inicio den,ytnes la duración del intervalo de tiempo. La tasa de síntesis por unidad de tiempo es una función de la pendiente en una gráfica de concentración frente al tiempo transcurrido. El intervalo de tiempony el tiempotnse determinan por la porción de la pendiente que permanece constante. Otros procedimientos para evaluar la continuidad del proceso consisten en representar una o ambas proporciones de proteoformas en función del tiempo, y las representaciones de la primera derivada de tiempo frente a concentración.

[0090] Es realista que la tasa de síntesis de proteoformas cambiará varias veces según la ecuación

[0092] El términoAtwrepresenta la cantidad de material producido en un intervalo de tiempo específico,twnes la amplitud de dicho intervalo de tiempo, y es la tasa de síntesis de una proteoformaAen el intervalo de tiempo. Las diferencias en la tasa de síntesis se revelarán mediante múltiples cambios de pendiente en una gráfica de concentración de proteoforma en función del tiempo.

[0093] La facilidad con la que se puede detectar un cambio en la tasa varía con el tiempo debido a la cantidad creciente deAtot.En la etapa dondeAtot = Atw1+ Atw2

, las proporcionesAtw1

/AtotoAtw2/Atotserían mucho mayores que la proporciónAtw50

/Atoten el intervalo de tiempo n.° 50 de un ciclo de producción de dos semanas. Esto se ilustra en el caso ideal donde la tasa de síntesis ( ) es constante durante un ciclo de producción. La cantidad de una proteoforma producida por hora seríaAh(%) =Atot/(100t).Al cabo de 4 días,Ah(%) sería igual a 1% deAtotal, mientras que al final del día 14 sería del 0,3%. Estos cálculos constituyen la base para establecer los tiempos de muestreo de una hora, como se mencionó anteriormente, que son suficientes para detectar cambios en la tasa de síntesis de proteoformas.

[0094] Los cambios ambientales o del entorno repentinos que desencadenan la síntesis de una proteoforma aberrante (A<ab>) son mucho más fáciles de detectar, tal como se observa en la ecuación

Nohay ningún términoAon. El problema

mencionado anteriormente queda eliminado.

[0095] Determinar los cambios en la tasa de síntesis en un sistema de recogida continua es más complicado. Suponiendo que el volumen del medio de cultivo es constante durante el muestreo, la cantidad de

[0096] proteoformaAsintetizada durante un intervalo de tiempotnsería donde es la tasa a la que se recogeA.Los cambios de volumen durante la recogida significarían queAones variable y podría diferir en cada intervalo de tiempo.

[0097] Compartimentación de la síntesis de proteoformas

[0098] Como es sabido en la técnica, la síntesis de una familia de proteoformas en un fermentador se produce en dos compartimentos:in vivoein vitro,tal como se refleja en laFIG. 2.La importancia de esto en la monitorización de procesos radica en que los atributos estructurales de las proteoformas derivadas en estos compartimentos son diferentes y se regulan de forma independiente. Reconocer el compartimento donde se produce una desviación es un diagnóstico importante.

[0099] Gran parte de la estructura primaria de una familia de proteoformas está codificada por exones comunes a todos los miembros de la familia (véase laFIG. 2).La región Fc de una familia de anticuerpos monoclonales es un ejemplo que se explota en la detección específica de mAb del presente documento. Una realización preferida de la detección y monitorización de péptidos característicos con el sistema CPV consiste en determinar la tasa de síntesis y la cantidad total de una familia de proteoformas mediante proteómica ascendente. Esto se logra con mAb utilizando un péptido característico de la región Fc, identificado durante el desarrollo del proceso que es común a todas las proteoformas. Se sintetizó una versión marcada de un isótopo pesado de este péptido característico y se añadió a una alícuota de un producto de digestión proteolítico como patrón interno (SPis) .

[0100] Marcaje y codificación de isótopos

[0101] Se prefiere el marcaje y la codificación con<13>C y<15>N como medio para evitar la separación deSPis>ySPdurante las separaciones por cromatografía líquida. Mediante la codificación de masas con<13>C y<15>N, los péptidos característicosin vivose pueden reconocer como dobletes separados por una masa específica. La proporción isotópicaSPis/SP, obtenida mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM), se evalúa mediante análisis por cromatografía líquida/espectrometría de masas de los productos de digestión proteolítica. Las proporcionesSPis/SPse utilizan para determinar la tasa de síntesis y la cantidad total de miembros de la familia de proteoformas en alícuotas en intervalos de tiempo específicos.Las proporcionesSPis/SPconstantes de los péptidos característicos durante todo un ciclo de producción indican que la tasa de expresión y modificación postraduccional no varían.

[0102] [0051] Un problema potencial de esta estrategia surge cuando otro péptido del producto de digestión proteolítico de una familia de proteoformas tiene la misma masa que elSPisoSP. Si el péptido interferente tiene la misma masa que elSPis, la solución más sencilla al problema consiste en modificar la masa delSPismediante codificación isotópica. Si la masa del péptido interferente coincide con la delSP,lo mejor es utilizar un péptido característico diferente o la fragmentación inducida por colisión de los péptidos en el análisis de la proporción isotópica.

[0103] Los atributos estructurales comunes a múltiples proteoformas, pero no a todas, pueden surgir de la deleción o reordenamiento de exones (véase laFIG. 2) junto con modificaciones postraduccionales. Estas características derivadasin vivotambién presentan péptidos característicos que son cuantificables mediante la monitorización de la proporción isotópica por MRM. Los péptidos característicos pueden codificarse de forma unívoca aumentando el número de átomos de<13>C en el patrón interno, pero la diferencia de masa preferida entre elSPisy elSPutilizado en el presente documento con modificacionesin vivofue de 3 uma.

[0104] Las reaccionesin vitroque implican degradación en los extremos N y C terminales, cambios conformacionales derivados de la reorganización de grupos sulfhidrilo y disulfuro, desamidación, oxidación de metionina y glicación tienen lugar en múltiples sitios. Se utiliza un código de marcaje con<13>C más 4 u 8 para identificar péptidos característicos que contienen PTMin vitro. De nuevo, la proporción isotópicaSPis/SPse utiliza para determinar los cambios en la tasa de síntesis y la concentración total de proteoformas aberrantes. Un aspecto singular de estas característicasin vitroes que la síntesis es incompleta; pueden tener lugar múltiples PTM en la misma proteoforma y no son específicas de la misma. Esto produce un conjunto de variantes de estructura similar. Una proteoforma que ha sido desaminada, por ejemplo, presenta una o todas las demás modificaciones postraduccionales (PTM) posiblesin vitro.

[0105] La heterogeneidad en la glicosilación es de origenin vivoy de gran importancia. Se han observado más de 130 glicopéptidos distintos en anticuerpos terapéuticos, de los cuales un pequeño número afectan negativamente la calidad de los mAb. Dos epítopos glicanos no humanos, galactosa-α-1,3-galactosa (α-gal) y Neu5Gc-α-2,6-galactosa (Neu5Gc), son antigénicos cuando se unen a anticuerpos monoclonales (mAb), mientras que α-gal por sí solo no lo es. La glicosilación de una proteína terapéutica se ve afectada durante la fabricación por el medio de cultivo, los cambios en los niveles de expresión proteica y el estado fisiológico de las células huésped. Las variaciones en las condiciones de fermentación pueden alterar la ocupación de los sitios y la heterogeneidad de los glicanos. Esto, por supuesto, puede influir en el perfil terapéutico de un mAb. La capacidad de evaluar la glicosilación es una herramienta fundamental en la validación continua de procesos. Cómo se realiza esto se explicará más adelante.

[0106] Los atributos estructurales que ocurren exclusivamente en una sola proteoforma son de un tercer tipo, menos común.

[0107] Mezcla de heterogeneidad en un fermentador

[0108] En fermentadores de gran escala, las barreras de flujo axial generan gradientes en la concentración del sustrato, el pH y el oxígeno, lo que somete a las células a un estrés repetitivo al pasar de zonas de alta a baja concentración. Durante las campañas de fermentación, esto provoca una heterogeneidad poblacional que se distribuye a lo largo de la población en lugar de seguir características promedio. Esta heterogeneidad poblacional dificulta la optimización del proceso y afecta la calidad del producto. La heterogeneidad de la mezcla se evalúa determinando la concentración del sustrato en varios puntos de muestreo dentro del fermentador.

[0109] Análisis descendiente de proteoformas

[0110] La identificación y cuantificación de los atributos estructurales de las proteoformas mediante el sistema CPV se basan en el análisis de proteínas intactas en el sector 1 y de sus fragmentos de proteólisis en el sector BU16.Las separaciones cromatográficas y electroforéticas se han utilizado ampliamente para separar e identificar proteoformas según su tiempo de retención. Con anticuerpos monoclonales intactos, la cromatografía de intercambio catiónico fuerte y débil se ha utilizado ampliamente para separar proteoformas con variaciones de carga. El fundamento de este enfoque radica en que las variaciones de carga, tales como en la desamidación, se reconocen más fácilmente mediante cromatografía de intercambio iónico. Evidentemente, la probabilidad de separar las proteoformas depende más de la ubicación de su sitio de interacción cromatográfica en un sorbente que de sus propiedades macroscópicas. Esta es la razón para utilizar columnas en el conjunto de columnas25con diferentes mecanismos de retención en el sector descendiente14. Esto aumenta la probabilidad de que se analicen sitio(s) con estructuras diferentes. El mecanismo mediante el cual se realiza la separación de proteínas con una columna IMAC es muy diferente, por ejemplo, del implicado en separaciones por intercambio catiónico fuerte e interacción hidrofóbica. Las características estructurales adyacentes a los grupos implicados en la adsorción participan activamente en la unión a una fase estacionaria.

[0111] [0058] La generación de un mapa de retención de proteoformas mediante múltiples modos de cromatografía, tal como el mapa que se muestra en la Tabla 1 a continuación, tendría la mayor probabilidad de validar la continuidad de un proceso. La razón de este enfoque radica en que se analizan múltiples características estructurales. En un ejemplo, se sintetizó una serie de proteoformas de subtilisina mediante sustituciones de un solo aminoácido en el aminoácido 166 para evaluar este fenómeno. Tal como se observa en la Tabla 1 a continuación, las identificaciones son más definitivas al utilizar los tiempos de retención de las proteoformas de múltiples modos cromatográficos. El orden de elución de las proteoformas de subtilisina que difieren en un solo aminoácido varía sustancialmente según el modo de separación. Si bien el nivel de especificidad observado con la subtilisina podría no ser aplicable a todas las familias de proteoformas, la diferenciación entre proteoformas con múltiples modos de retención seguirá siendo superior a un solo modo de separación. Esta es la base para el uso de la diferenciación multimodal entre proteoformas en el sistema CPV. Dependiendo del grado de modificación postraduccionalin vitro, podrían haberse generado cincuenta o más proteoformas con concentraciones relativas que varían cien veces o más. Por lo tanto, las proteoformas más abundantes observadas en el modo descendente serán de origenin vivo.

[0113] TABLA 1

[0114] Diferencias de selectividad entre los modos de separación

[0115] Sustitución de Orden de elución

[0116] aminoácido SCX IMAC HIC

[0118] D166 1 2 1

[0120] E166 2 1 2

[0121] G(wt) 3 9 10

[0123] N166 4 4 4

[0125] S166 5 8 9

[0127] M166 6 3 12

[0129] H166 7 11 3

[0131] R166 8 7 6

[0133] K166 9 10 7

[0135] P166 10 5 5

[0137] V166 11 3 11

[0139] Y166 12 6 8

[0140] Purificación cromatográfica de afinidad de analitos

[0141] El sistema CPV aplica procedimientos tanto descendientes como ascendentes para confirmar la continuidad del proceso mediante un formato de árbol de decisión. Tal como se explica con más detalle a continuación, una rama del árbol de decisión del modo cromatográfico utiliza los procedimientos de análisis de proteoformas intactas descritos anteriormente. Una segunda rama del árbol aplica análisis ascendiente para confirmar adicionalmente que se ha producido una desviación a nivel estructural utilizando fragmentos peptídicos.

[0142] Al eluir las proteoformas de las columnas en el modo de separación descendiente, aún se encuentran contaminadas con proteínas de la célula huésped, metabolitos y materiales de alimentación. Se logra una purificación adicional haciendo pasar el efluente de una columna en el conjunto de columnas25, en el sector TD14,o a través de una derivación de sector25a,hacia una matriz de afinidad de tipo de reconocimiento molecular. Cuando se examinan las características estructurales de una familia completa de proteoformas, la válvula mcsv30del sector TD se coloca en la posición de la derivación hacia la derivación de sector25a,lo que permite que una muestra del fermentador pase directamente a la columna de afinidad/proteólisis. Se prefiere la derivación del sector TD cuando se concentran analitos de un gran volumen de muestra en la columna de afinidad/proteólisis del conjunto27en el sector BU16.En este caso, las muestras contienen la familia completa de proteoformas.

[0143] En un ejemplo concreto, se utiliza una fase estacionaria dirigida a la región Fc del mAb para capturar las proteoformas del mAb en una columna de 2,1 × 50 mm rellena con un sorbente de partículas de 10 µm y poros de 100 µm de diámetro. Basado en el hecho de que las proteoformas adsorbidas se digieren con tripsina soluble en la columna de afinidad, se emplean selectores de afinidad no digeribles con tripsina; los sorbentes preferidos son un péptido inmovilizado, un afímero o un aptámero.

[0144] Análisis ascendiente

[0145] Una característica que complica las modificaciones postraduccionales basadas en fermentadores es el mecanismoin vivoein vitroen el que se forman (véase laFIG. 2).En ambos casos, es mucho más fácil buscar variantes de modificaciones postraduccionales (PTM) en el modo ascendiente que en el modo descendiente. La glicosilaciónin vivopuede producir más de cien variantes de glicopéptidos tras la digestión con tripsina de una familia de anticuerpos monoclonales. Este nivel de diferencia no se puede examinar con proteínas intactas.

[0146] Tal como se describió anteriormente, se utilizan sorbentes de afinidad estacionarios dirigido a la región Fc que resisten a la digestión con tripsina para capturar las proteoformas de mAb. Una vez completada la selección de afinidad por la proteoforma o familia de proteoformas, se bombea a la columna de afinidad60un volumen de tripsina termoestabilizada (en tampón pH 7,8) equivalente al doble del volumen muerto de la columna de afinidad, a un caudal de 45 µL/min. Al finalizar la carga de tripsina, se termina el flujo de enzima hacia la columna de afinidad del conjunto de columnas27al revertir el detector 50 en línea con el sector descendiente. Esto permite el uso continuado del sector descendiente para la separación de proteínas intactas, mientras que el segundo sector se utiliza para análisis ascendiente.

[0147] La proteólisis se consigue en modo de flujo detenido en la columna de afinidad60a una temperatura de 25-50 °C. La estabilización térmica de la enzima proteolítica se mejora aún más en algunos casos con un aditivo soluble, tal como el glicerol, introducido a través de uno de los puertos43-44.A temperatura elevada: i) se altera la conformación de las proteínas unidas; ii) los analitos se desorben frecuentemente de la matriz de afinidad; iii) se reduce el tiempo de digestión; y iv) se evita la necesidad de reducción y alquilación. Los dipéptidos con puente -SS- resultantes también permiten el análisis de los enlaces disulfuro de las proteoformas. Los cambios conformacionales desenmascaran los sitios de digestión y desorben las proteínas de la columna de afinidad, lo que acelera la proteólisis. Si bien en la mayoría de los casos se utiliza tripsina, se puede emplear cualquier enzima proteolítica, sola o en combinación, para realizar la digestión de proteínas en la columna de afinidad de aptámeros.

[0148] La proteólisis no tiene que ser completa para generar péptidos característicos específicos de proteoformas para la cuantificación y el análisis de glicopéptidos. El tiempo requerido para la proteólisis es específico de cada proteoforma y debe determinarse durante el desarrollo del proceso.

[0149] Tras completar la proteólisis, la bomba de gradiente ascendiente23se purgó con tampón fosfato 10 mM (pH 7,8) y se conectó en serie con una columna del conjunto de columnas27en el sector BU16a un caudal de 45 µL/min. La columna del sector BU puede ser de boronato de fenilo, una columna de intercambio iónico o una columna de fase inversa. A pH 7,8, la fase estacionaria de la columna de boronato de fenilo se carga negativamente y la tripsina se adsorbe electrostáticamente (pI ~10,1-10,5), mientras que las especies con dioles vecinales se retuvieron mediante la formación de un éster de boronato. La mayoría de los péptidos no glicosilados no se retuvieron y se adsorben en una columna de cromatografía de fase inversa (RPC) de 2,1 × 30 mm situada aguas abajo en el conjunto de columnas26.

[0150] Una vez completada la transferencia del analito fuera de la columna de afinidad/proteólisis, las columnas de afinidad y boronato del conjunto27se desconectan, mientras que la columna RPC permanece conectada en línea a la bomba de gradiente sectorial ascendiente. A continuación, la columna RPC se purga con dos volúmenes de columna de fase móvil acuosa para eliminar las sales no volátiles antes de conectarla en línea al espectrómetro de masas40.La columna RPC se eluye en gradiente con un gradiente de fase móvil que varía desde ácido acético (AA) o trifluoroacético (TFA) acuoso al 0,1 % hasta acetonitrilo acuoso al 80 %/AA o TFA al 0,1 % (v/v). La fase móvil óptima para cada mAb se desarrolló para cada anticuerpo monoclonal terapéutico durante la etapa de calificación del proceso del desarrollo del procedimiento. Se utilizaron agentes de emparejamiento hidrofóbicos, catiónicos y aniónicos para maximizar la resolución de péptidos, especialmente en el caso de la detección de péptidos con modificaciones postraduccionales (PTM) generadosin vitro. La detección se conseguía habitualmente mediante absorbancia a 215 nm y análisis LC-MS. La cuantificación se lleva a cabo generalmente mediante análisis ascendiente mediante monitorización de reacciones múltiples utilizando codificación de isótopos estables, tal como se describe a continuación.

[0151] Una vez finalizado el análisis RPC del péptido no glicosilado, la bomba de gradiente sectorial ascendiente se conecta en serie con la columna de boronato en el conjunto de columnas27y la línea de derivación26aen el conjunto de columnas26a un caudal de 45 µL/min. La tripsina se eluye de la columna de boronato mediante un gradiente de fuerza iónica de 10 mM a 200 mM de NaCl en tampón Tris (10 mM, pH 7,5). La elución se monitoriza con el detector de absorbancia a 280 nm. El objetivo de esta etapa es eliminar la tripsina del componente glicopeptídico de la mezcla de péptidos que se está analizando.

[0152] Tras la elución con tripsina, la columna de boronato del conjunto de columnas27se conecta en serie con la columna HILIC o RPC del conjunto de columnas26mediante las válvulas mcsv31, 32,y se purga. La columna HILIC se utiliza para analizar la glicosilación, mientras que la selectividad de la columna RPC es máxima con la porción peptídica de los glicopéptidos. La desorción de glicopéptidos de la columna de boronato requiere una fase móvil ácida volátil. Los ésteres de boronato implicados en la retención de glicopéptidos en la fase estacionaria de boronato de fenilo se hidrolizan mediante una fase móvil ácida y el uso de fases móviles volátiles permite el análisis posterior por LC-MS. Cuando los glicopéptidos se transportan a una columna HILIC posterior, la fase móvil tiene un alto contenido de disolvente orgánico para asegurar su captura en la entrada de la columna HILIC. También se examina la transferencia a una columna RPC utilizando fases móviles acuosas ácidas. La cuantificación de glicopéptidos se logra mediante la monitorización de reacciones múltiples, como se explica con más detalle a continuación.

[0153] Es fundamental destacar que la estructura y el tiempo de retención de los péptidos que eluyen de las columnas HILIC y RPC del conjunto de columnas26se determinan durante el desarrollo del proceso mediante análisis LC-MS de péptidos sintéticos. Asimismo, los tiempos de retención de las columnas utilizadas en la campaña de monitorización del proceso se recalibran diariamente con los mismos patrones internos de péptidos sintéticos.

[0154] Análisis de agregados proteicos

[0155] [0071] En determinadas condiciones, durante la fermentación se forman agregados de mAb, los de mayor tamaño son inmunogénicos. La concentración de agregados de proteoformas (Pf<n>) disminuye con el tamaño, donde n es el número de proteoformas en el complejo. La composición de las proteoformas es menos importante que el grado de agregación y la cantidad relativa. La detección de agregados que contienen más de cuatro proteoformas generalmente se encuentra por debajo de los límites de detección. En una realización específica, se utilizan columnas de cromatografía de exclusión molecular (SEC) de 4,6 × 300 mm rellenas con partículas de 3 µm de diámetro de poro de 30 µm para evaluar el tamaño de los agregados.

[0156] Purificación por afinidad preanalítica de una familia de proteoformas

[0157] Recordando que todas las formas de un mAb se encuentran mezcladas con proteínas de la célula huésped, los agregados de mAb que eluyen de la columna SEC se mezclan con contaminantes y son difíciles de detectar. Este problema se puede abordar de dos maneras. Se puede incorporar una columna de cromatografía de afinidad (AFF)34en el sector TD14(antes de la válvula mcsv30) al sistema CPV10para purificar todas las formas del mAb, mientras que las impurezas se dirigen a través de la línea de derivación25amediante la válvula mcsv30hacia el desechoW,HCP o el análisis de metabolitos. El sorbente de afinidad en la columna AFF34permite la desorción a un pH cercano al fisiológico en condiciones suaves. Esto permite la separación posterior de las proteoformas en cualquiera de las columnas conectadas a la válvula mcsv30.Dado que todas las sustancias que eluyen de la columna AFF34son proteoformas de mAb, se detectan por absorbancia a 215m. El segundo modo de detección es mediante detección de flujo continuo, tal como se describe a continuación.

[0158] Detección de proteoformas mediante flujo continuo

[0159] En el monitorización continua del proceso de producción de anticuerpos monoclonales es necesario: i) permitir la identificación y cuantificación de múltiples proteoformas mediante la distinción estructural específica entre analitos y no analitos; ii) realizar esta tarea en una hora para permitir el reconocimiento de desviaciones del proceso; iii) repetir este análisis de 300 a 500 veces durante un ciclo de producción; v) digitalizar estas mediciones de analitos a medida que se realizan; vi) evaluar la calidad y/o la continuidad del proceso en tiempo real; y vii) utilizar estos datos para desarrollar procedimientos de análisis posteriores.

[0160] La detección específica de proteoformas, tal como se describe en el presente documento, se realiza mediante una serie de etapas acopladas utilizando reactivos de reconocimiento molecular introducidos a través de uno de los puertos41-46.La primera etapa consiste en la resolución de las proteoformas por medios cromatográficos o electroforéticos antes de su detección. Esto evita el problema de discriminación de proteoformas mencionado anteriormente. El grado de diferenciación de las proteoformas depende del poder de resolución del procedimiento de separación. La resolución cromatográfica en cada sector se puede maximizar mediante una combinación de elución con gradiente de fase móvil, forma del gradiente, pH y fuerza iónica de la fase móvil, y temperatura de la columna.

[0161] Un segundo nivel de discriminación consiste en marcar cada proteoforma de forma no covalente con un agente de marcaje 1 de tipo reconocimiento molecular de alta afinidad (ATA1), que posee propiedades espectrales únicas. El sitio de unión a ATA1 debe encontrarse en un dominio estructural común a todas las proteoformas. Cuando los analitos se marcan previamente con un reactivo de marcaje marcado de forma fluorescente de unión fuerte (véase laFIG.5A),el complejo analito:reactivo permanece intacto durante la separación mediante cromatografía IEC (conjunto de columnas27), HIC o IMAC (conjunto de columnas25) y la mayoría de los modos electroforéticos. Es fundamental que las fases móviles no disminuyan la asociación de los complejos de proteoformas marcadas. A medida que los complejos de proteoformas se eluyen del sistema de separación, se detectan directamente por su fluorescencia. Los problemas de este procedimiento pueden ser que el agente de marcaje disminuye la resolución de las proteoformas. La fluorescencia puede aumentar o disminuir por el analito. No se obtiene una fluorescencia equimolar. Disociar el agente de marcaje de afinidad de las proteoformas antes de la detección evita este problema (FIG.5A).

[0162] También se puede utilizar la detección por transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) (véase laFIG.5B).Además de marcar las proteoformas con ATA1 en el dominio Fc, se añade continuamente un segundo agente de marcaje de alta especificidad (ATA2) al efluente de la columna cromatográfica o electroforética. Dado que los sitios de unión a ATA1 y ATA2 se encuentran en el dominio Fc, están lo suficientemente cerca como para permitir la transferencia de energía de fluorescencia entre la especie donante ATA1 y el aceptor ATA2, lo que posibilita la FRET. Los péptidos, afímeros o aptámeros son los reactivos de reconocimiento molecular preferidos. La distancia de separación donante-aceptorrno debe superar normalmente los 10m. La relación entre la transferencia de energía

[0164] por resonancia de Förster (E) y la distanciarse muestra en la ecuación.

constante de distancia de FörsterR₀ es función de i) la superposición de los espectros de emisión del donante y de absorción del aceptor y ii) la distancia a la que la eficiencia de transferencia de energía para un par donante-aceptor específico es del 50 %. El hecho de que la energía FRET (E) sea inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia (r) entre las etiquetas donante y aceptor implica que los sitios de unión de las etiquetas deben estar relativamente cerca. Esta es la razón por la que se utilizan reactivos de afinidad de reconocimiento molecular pequeñs en ATA1 y ATA2, que se unen a la región Fc de los mAbs. La gran ventaja de este enfoque radica en la eliminación de la adsorción en fase sólida, así como en el reciclaje del sorbente en fase sólida.

[0165] [0077] Otros procedimientos de marcaje posteriores a la separación que requieren un componente de extracción en fase sólida se observan en lasFIG 5C-5E.El procedimiento ilustrado en laFIG.5Cimplica el uso de un exceso de reactivo de marcaje por afinidad fluorescente que se une con alta especificidad y afinidad a todas las proteoformas a medida que eluyen del sistema de separación. La solución se pasa entonces a través de una columna de cromatografía de afinidad que retiene el reactivo de marcaje. La columna de afinidad se recicla periódicamente. Una limitación de este procedimiento es que la respuesta molar relativa de todas las proteoformas es idéntica.

[0166] El procedimiento ilustrado en laFIG.5Des el inverso del de laFIG.5C. En este procedimiento,la proteoforma marcada con fluorescencia se extrae mediante una columna de afinidad y se detecta el agente de marcaje fluorescente residual. Una ventaja de este procedimiento de laFIG. 5Dsobre el procedimiento de laFIG. 5Ces que evita el problema de la respuesta molar relativa. Otra característica de este procedimiento es que el perfil de elución muestra picos negativos. La concentración de la proteoforma se observa como picos negativos en el perfil de elución.

[0167] El procedimiento ilustrado en laFIG.5Eutiliza la amplificación enzimática para la detección de proteoformas. Un reactivo que marca anticuerpos conjugados con una enzima de alta actividad se añade continuamente al efluente del sistema de separación para permitir el marcaje enzimático no covalente de las proteoformas. Tras la formación del complejo proteoforma:enzima, el exceso de agente de marcaje se elimina mediante el pase por sorbente de afinidad en fase sólida. Después del pase a través del sorbente de afinidad, se añade el sustrato al complejo proteoforma:enzima y se hace pasar a través de un capilar tubular abierto antes de la detección del producto. Una limitación de este procedimiento es el tiempo adicional necesario para la formación del producto.

[0168] Codificación y marcaje de isótopos

[0169] La cuantificación a nivel de péptido ascendiente generalmente se logra mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM) con patrones marcados con isótopos pesados, tal como se ilustra en lasFIGURAS 6-7.Los procedimientos empleados se basan en la adición de cantidades conocidas de patrones pesados a las muestras, seguida de un análisis isotópico mediante espectrometría de masas para determinar la proporción de péptidos marcados y no marcados en las muestras. Tal como se indicó anteriormente, un anticuerpo monoclonal es en realidad una familia de más de cien proteoformas estructuralmente relacionadas. Más allá de las aproximadamente cinco isoformas que surgen de variaciones en el empalme, la edición enzimática y los desplazamientos en el marco de lectura a nivel del procesamiento génico, la mayoría de las proteoformas se originan a partir de modificaciones postraduccionalesin vivoein vitro(véase laFIG.2).Las modificaciones postraduccionales (PTM)in vivoson mucho más frecuentes; se originan a partir de variaciones en el N-glicoma unidas al péptido tríptico EEQYNSTYR en la región Fc de las proteoformas. Se generó un número mucho menor de PTMin vitro.

[0170] Entre las modificaciones postraduccionales (PTM)in vitrocomunes la formación de piroglutamato en los extremos N terminales, la degradación en los extremos N y C terminales, la reorganización de los puentes sulfhidrilo y disulfuro, la desamidación, la oxidación de metionina, la oxidación de triptófano, la oxidación de histidina y la glicación mediante un reordenamiento de Amidori (FIG.6)son las más comunes. La secuencia y la ubicación de las PTM en los péptidos se determinan mediante LC-MS en la etapa de descubrimiento/desarrollo del desarrollo del proceso. Tras la digestión con tripsina de las proteoformas, los péptidos que presentan estas PTM generalmente se encuentran en secuencias peptídicas características de menos de 10 aminoácidos con una lisina o arginina en su extremo C-terminal. La codificación con isótopos pesados se logra con estos péptidos mediante síntesisde novoincorporando aminoácidos marcados con<13>C y<15>N en posiciones específicas de la secuencia. Los aminoácidos utilizados en la codificación se muestran en la Tabla 2 a continuación. Con lisina o arginina marcadas uniformemente (U-<13>C<6>,<15>N), la diferencia de masa entre los péptidos marcados y los de la muestra fue de 8 o 10 daltons (Da), respectivamente. Se utilizaron péptidos característicos marcados con al menos tres unidades de masa atómica más pesados que los péptidos de la muestra para evitar la superposición de picos isotópicos.

[0171] TABLA 2

[0172] Aminoácidos marcados utilizados en l síntesis de é tidos característicos

[0174]

[0176] Codificación por derivatización

[0177] LaFIG.7muestra la manera en que los péptidos glicadosin vitroy los péptidos glicosiladosin vivodifieren en origen y estructura de los péptidos PTM observados en laFIG. 6.Dada la complejidad de los péptidos glicados y glicosilados, la síntesisde novosería difícil y costosa. Además, la digestión con tripsina produce al menos una amina primaria en un péptido glicado o glicosilado, lo que permite la acilación de la amina. Utilizando N-hidroxisuccinimidil-<2>H<3>-acetato como patrón interno, se preparan péptidos 3 daltons más pesados que los péptidos de muestra acetilados. Un pequeño número de péptidos glicados con una lisina C-terminal constituyen una excepción. En este caso, el patrón interno y el péptido de muestra difirieron en 6 daltons.

[0178] Servicios preanalíticos

[0179] Un experto en la materia comprenderá que todos los consumibles de un sistema de monitorización de procesos deben reemplazarse antes de cada ciclo de producción y que el sistema debe recalibrarse con patrones de analito. Los patrones de péptidos característicos y las muestras de proteoformas intactas sirven como conjunto de entrenamiento de tiempos de retención para las proteoformas y los péptidos característicos que encontrarán las nuevas columnas y fases móviles antes de su uso en una campaña de producción.

[0180] El componente de software

[0181] Tal como se describe en el diagrama de flujo de laFIG.1, la función del software del sistema CPV implementado en el controlador20es: i) recopilar rápidamente datos cronológicos sobre múltiplesvariablesbiológicas y ambientales durante la producción que afectan la calidad de la proteína terapéutica; ii) evaluar la continuidad del proceso mediante muestreo horario durante un ciclo de producción; iii) identificar tentativamente variantes de proteoformas a partir de datos descendentes; iv) desarrollar protocolos analíticos para confirmar la identidad de las variantes mediante inteligencia artificial; v) comparar los resultados con campañas de fabricación de referencia; y vi) implementar una decisión. El términovariable, tal como se utiliza en el análisis de datos, se define como una característica ambiental, estructural o de proporción de componentes específica que, al alterarse, podría modificar la eficacia terapéutica. Las mediciones de variables estructurales que afectan la eficacia y los atributos críticos de calidad (CQA) se denominan mediciones directas de calidad . Ejemplos conocidos de variables directas son: i) la tasa de síntesis de proteoformas de mAb; ii) los cambios en la proporción de proteoformas durante la producción derivados de la expansión, el envejecimiento y la muerte celular; y iii) los cambios en la eficacia terapéutica (actividad biológica) que se originan a partir de variaciones en las proporciones de proteoformas. Evaluación de variables ambientales, tales como la temperatura y el pH que podrían alterar la calidad y se denominan medicionesindirectas, ya que no monitorizan directamente la calidad.

[0182] La adquisición y el análisis de datos se pueden gestionar con cinco tipos de herramientas de software implementadas por el controlador20.El software de Tipo1(calibración del sistema) garantiza que i) la plataforma analítica esté configurada correctamente para funcionar de forma autónoma durante toda un ciclo de producción, ii) mediante la monitorización continua del consumo de fase móvil y reactivos. La etapa uno de la lista de verificación previa al análisis consiste en que el usuario especifique todos los procedimientos analíticos que la inteligencia artificial selecciona y utiliza en el análisis de muestras durante la campaña de producción, incluyendo el número probable de muestras que se analizarán. Los procedimientos se pueden fijar estipulando la"repetición de la configuración del último ciclo de producción".La construcción de estos procedimientos se realiza con el software de gestión analítica de Tipo II, tal como se describe a continuación. Con esta información, el sistema determina los consumibles necesarios y si se cargan en el sistema mediante un lector de código de barras (no se muestra). El uso de las columnas en los conjuntos de columnas25-27se registra durante la producción, se compara con la vida media de la columna y forma parte de la salida analítica para cada análisis. Se activa una alarma del sistema si el uso de la columna supera la vida media recomendada. Los volúmenes de fases móviles (P<m>) y reactivos se monitorizan por masa y se registran como porcentaje de volumen residual, de nuevo registrado junto con los datos del análisis de la muestra. Se activa una alarma cuando se ha usado el 75 % de P<m>o de un reactivo. La plataforma también monitoriza las fugas de la válvula de retención y la precisión del bombeo, pero solo informa de estos datos cuando se detecta un problema.

[0183] El software de tipo II (gestión analítica) puede ser de dos tipos. Uno está diseñado para almacenar y ejecutar procedimientos individuales a petición. Para cada procedimiento se almacenaron las columnas necesarias, la selección de la bomba, la selección de la fase móvil, la programación del gradiente, el modo de detección y un protocolo de reciclaje de columnas. Se pueden construir y almacenar entre 30 y 50 procedimientos durante el desarrollo del proceso. Todos estos procedimientos se pueden cargar desde un centro de I+D al controlador 20 del sistema CPV10.El espectrómetro de masas (MS)40puede utilizar un sistema de datos independiente para almacenar los procedimientos, almacenando procedimiento individuales de la misma manera. En una etapa final de la preparación de la plataforma, el sistema de datos determina que las columnas correctas de los conjuntos25-27,las fases móviles y los reactivos estén cargados y sean suficientes para la campaña del proceso. Los reactivos se pueden introducir en los conjuntos de columnas25-27a través de las entradas41-46correspondientes.

[0184] [0087] Muchos análisis requieren el uso de múltiples procedimientos analíticos que funcionan de forma independiente en diferentes sectores,14y16,o secuencialmente en un solo sector,14o16. Esto se resuelve con un segundo tipo de software de gestión analítica que integra los procedimientos individuales en un protocolo analítico integrado. De nuevo, el orden de ejecución de los distintos procedimientos para analizar una muestra se puede determinar durante el desarrollo del proceso e integrarse en el software de Tipo II del controlador(20).Este conjunto de procedimientos se recupera e integra mediante un nombre de ejecución específico. En un nivel superior, una serie de estos protocolos integrados se implementan secuencialmente mediante software que permite la comunicación con otros programas de software.

[0185] El software de tipo III (adquisición de datos) se utiliza para adquirir datos de un detector de fluorescencia (FD)50,un detector de absorbancia y un espectrómetro de masas40,así como de todos los sensores ambientales o del entorno55para cada muestra. Si bien los sensores ambientales o del entorno55generan datos de forma continua, solo se registran los datos correspondientes al inicio del muestreo. Los datos de cromatografía o electroforesis se representan en un formato bidimensional, donde el tiempo de elución constituye el eje X y la intensidad de la señal el eje Y. Cada pico se cuantifica e identifica en función del tiempo de retención de los patrones del conjunto de entrenamiento de tiempos de retención y un algoritmo que compensa la deriva del tiempo de retención para cada columna durante un ciclo de producción. Los datos de los sensores ambientales o del entorno se registran como un único valor de intensidad para cada uno de los sensores55.El conjunto completo de datos analíticos de cada muestra se integra, se enumera en orden cronológico y se le asigna una marca de tiempo.

[0186] El software de tipo IV (análisis de datos) es de dos tipos: una parael análisis descendentede proteoformas intactas y otra parael análisis ascendente,empleado en la identificación y cuantificación de péptidos característicos. La función principal del software descendente es identificar cambios en el proceso a nivel de proteoforma mediante la identificación basada en el tiempo de retención, la determinación de las proporciones de concentración y la identificación de cambios en su tasa de síntesis. Esto se logra mediante análisis estadísticos multivariados de los datos cromatográficos o electroforéticos adquiridos. La validación del proceso se presenta en forma de intervalos de confianza, gráficos que muestran los intrvalos de aceptación y diagramas de distribución de variables intralote e interlote. Los gráficos de control T<2>se pueden usar para detectar desviaciones en el proceso.

[0187] En cambio, los análisis ascendentes se centran en identificar las variables biológicas del sistema de fermentación que cambiaron durante la producción. Estabiología de sistemasse define como el análisis matemático y la modelización computacional de fenómenos biológicos complejos, tal como se ilustra en el gráfico de laFIG. 2.

[0188] Estas variables biológicas se describen en la sección anterior “Compartimentación de la síntesis de proteoformas”. ES accidental que muchos de estos cambios se identifiquen fácilmente en familias de proteoformas mediante péptidos característicos. En base al uso de péptidos característicos de patrón interno marcados con<13>C en el procedimiento MRM de cuantificación de péptidos, estos procedimientos son muy precisos. Se utilizan los mismos procedimientos de análisis estadístico multivariante descritos anteriormente, pero con el objetivo de comprender mejor la validación de procesos continuos a nivel de biología de sistemas.

[0189] Estos dos procedimientos de análisis de datos proporcionan procedimientos diferentes, pero simultáneos, para validar la naturaleza de las desviaciones del proceso. El software de Tipo IV informa al fabricante en tiempo real sobre el grado de cumplimiento del proceso de fabricación con los estándares de reproducibilidad. Esto, a su vez, permite el control por retroalimentación. En base a la información del perfil de elución monitorizada de las proteoformas, obtenida del detector de absorbancia y fluorescencia50y del espectrómetro de masas40, a saber la concentración, el tiempo de retención, la intensidad del pico y el área del pico, se obtienen las proporciones relativas de intensidad de pico o proporciones relativas de área del pico de las muestras deseadas. Para detectar posibles valores atípicos o cambios significativos en la muestra deseada, se utilizan diversos procedimientos estadísticos. El controlador20calcula la desviación estándar, la mediana, la primera y la segunda derivada, el coeficiente de variación porcentual (CV%), el análisis de varianza (ANOVA), la desviación absoluta mediana de la mediana (MAD) y el rango intercuartílico (IQR), y el software de Tipo IV del controlador los utiliza para validar y cuantificar el proceso. La variación significativa del cambio de pico individual está determinada según el proceso físico y biológico, o por la proporción relativa de las proteoformas individuales.

[0190] El software de tipo V (codificación de procedencia) ejecutado por el controlador20mantiene el historial de todo lo realizado durante una campaña de fabricación; incluir fuentes de datos, archivar la naturaleza y fuentes de materias primas, datos analíticos de materias primas, guardar todos los datos adquiridos por el sistema, todos los cálculos realizados por el sistema, los algoritmos utilizados para proporcionar análisis estadísticos multivariados de las desviaciones del proceso, rastrear el intercambio de datos entre ordenadores, llevar nuevos datos a definiciones de calidad aceptable del producto, comparar estándares de calidad con los datos adquiridos, proporcionar resultados a prueba de manipulaciones y generar informes automáticamente que sirven como base para la comunicación con las agencias reguladoras.

[0191] El controlador20es un procesador u ordenador adaptado para ejecutar el software descrito anteriormente. El controlador20puede interactuar con una interfaz de usuario20aque está configurada para permitir la entrada de datos, la carga de datos al software del controlador, la salida de datos y la visualización de la información generada por el software, tal como se describió anteriormente.

[0192] Definición de términos:

[0193]

[0194] ● Detector de absorbancia = un dispositivo utilizado en cromatografía líquida para detectar y cuantificar la absorbancia del analito durante su paso a través de una celda de flujo iluminada.

[0195] ● Fluoróforo aceptor = una especie molecular fluorescente de un par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) que acepta luz de un fluoróforo donante adyacente.

[0196] ● Selector de cromatografía de afinidad = una especie molecular inmovilizada en la superficie de un soporte de cromatografía cuya estructura se asocia específicamente con alta afinidad y retiene un analito mediante reconocimiento molecular a medida que se eluyen las impurezas.

[0197] ● Columnas de afinidad = una columna de cromatografía de lecho empaquetado que contiene un selector de cromatografía de afinidad.

[0198] ● Agente de reconocimiento por afinidad (ATA) = una especie molecular soluble, cuya estructura se asocia específicamente con un dominio estructural complementario.

[0199] ● Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 594 = un par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en el que Alexa Fluor 546 es el fluoróforo donante y Alexa Fluor 594 es el fluoróforo aceptor.

[0200] ● Columna de boronato de aminofenilo (ABC) = cuando se inmoviliza en un soporte de cromatografía de fase sólida ABC captura especies moleculares que contienen un diol vecinal de muestras eluidas a través de la columna. ● La cromatografía de intercambio catiónico = las proteínas y los péptidos con carga neta positiva se adsorben a baja fuerza iónica en fases estacionarias cromatográficas que están cargadas negativamente, lo cual se puede lograr aumentando la fuerza iónica de la fase móvil o aumentando el pH.

[0201] ● Atributo de calidad crítico = una propiedad química que debe estar dentro de un límite, intervalo o distribución apropiados para asegurar la calidad deseada del producto.

[0202] ● Fluoróforo donante = una especie molecular fluorescente utilizada en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) que dona luz de un fluoróforo aceptor adyacente.

[0203] ● Endometabolitos = metabolitos contenidos dentro de una célula.

[0204] ● Exometabolitos = metabolitos presentes en el medio de cultivo que rodea las células en un fermentador. ● Glicación = el proceso por el cual un azúcar se unein vitroa una proteína a través de un reordenamiento de Amadori.

[0205] ● Glicano = un oligosacárido

[0206] ● Proteína glicada = una proteína a la que se une un monosacárido mediante una formación basada en Schiff con un reordenamiento de Amadori.

[0207] ● Glicoma = la totalidad de los glicanos acoplados a proteínas.

[0208] ● Glicopéptido = es un péptido de interés en el caso de un mAb que tiene un oligosacárido unido a un residuo. ● Proteína glicosilada = una proteína a la que se le acoplan glicanos a través de una vía biosintética.

[0209] ● La cromatografía de interacción hidrofílica = separa las moléculas según su hidrofilicidad. Es un tipo de separación en la que una molécula polar en una fase móvil orgánica se adsorbe en una fase estacionaria polar y se eluye al aumentar el contenido acuoso de la fase móvil.

[0210] ● La cromatografía de interacción hidrofóbica = un tipo de cromatografía en la que la fase estacionaria es una especie débilmente hidrofóbica. La interacción del analito proteico con la fase estacionaria se ve favorecida por una alta concentración de una sal que induce una alta tensión superficial, tal como el sulfato de amonio o el sulfato de sodio y al disminuir la concentración de la sal se produce la elución.

[0211] ● Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados = Un tipo de cromatografía en la que las proteínas y los péptidos que contienen histidina y cisteína con alta afinidad por los metales quelados se pueden separar en el intervalo de pH de 6 a 8.

[0212] ● Cromatografía de afinidad con lectinas = un tipo de cromatografía de afinidad en la que la fase estacionaria es una proteína (lectina) con afinidad por un tipo particular de glicano.

[0213] ● Monitorización de reacciones moleculares = la adición de una concentración conocida de una versión marcada de un isótopo pesado de una sustancia a una muestra como patrón interno que, cuando se analiza mediante espectrometría de masas, permite realizar mediciones de concentración relativa basadas en el análisis de la proporción isotópica.

[0214] ● Reconocimiento molecular = una interacción específica entre dos o más moléculas que presentan complementariedad molecular, basada en enlaces no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, coordinación de metales, fuerzas hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals, interacciones π-π y/o efectos electrostáticos.

[0215] ● Péptido no glicosilado = péptido que no contiene un glicano asociado covalentemente.

[0216] ● Familia de proteoformas = un grupo de proteínas con dominios estructurales sustancialmente similares. ● Proteoforma = un miembro de una familia de proteoformas.

[0217] ● Células modificadas genéticamente = células que han sido modificadas genéticamente para producir proteína(s) de una secuencia de aminoácidos determinada.

[0218] ● Validación de procesos = evaluar el grado de reproducibilidad de un proceso de fabricación.

[0219] ● Proteínas recombinantes = proteínas expresadas por células modificadas genéticamente.

[0220] ● Cromatografía de fase inversa = un tipo de cromatografía en la que la fase estacionaria es un hidrocarburo inmovilizado covalentemente.

[0221] ● Péptido característico (“signature peptide”) = un fragmento peptídico derivado de una sola proteoforma o de varios miembros de una familia de proteoformas que tienen una secuencia de aminoácidos que es i) única de uno o más miembros de la familia o ii) contiene un tipo particular de modificaciones postraduccionales.

[0222] ● Cromatografía de exclusión por tamaño = una forma de cromatografía líquida que separa las especies moleculares en función de su volumen hidrodinámico.

[0223] ● Tripsina = una enzima proteolítica que hidroliza la ruptura del enlace amida entre el grupo carboxilo de una arginina o lisina y otro aminoácido.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Procedimiento analítico integrado para evaluar cronológicamente la concentración de proteoformas en una familia de variantes de proteínas contenidas en composiciones biológicas complejas obtenidas de un fermentador (F) que forma parte de un proceso de fabricación para la producción de las composiciones biológicas complejas, estando las composiciones derivadas de un cultivo celular nativo o genéticamente modificado en expansión de origen microbiano, vegetal, animal o humano, comprendiendo el proceso las etapas de:

a) proporcionar al menos un sistema de separación de dos sectores que incluye;

un sector ascendente (TD, top-down) (14) que incluye una pluralidad de columnas de análisis TD distintas (25) que están configuradas y pueden funcionar para la resolución de proteoformas intactas, la detección de proteoformas de analito específicas en muestras que contienen proteínas de células huésped, proteoformas y metabolitos, la identificación y cuantificación de estos componentes con el fin de validar cronológicamente la reproducibilidad del proceso de fabricación;

un sector descendente (BU, bottom-up) (16) que incluye una pluralidad de columnas de análisis BU distintas (26, 27) configuradas y funcionan para la purificación por afinidad y la proteólisis de proteoformas durante el transporte al sector BU (16); y

un controlador (20) configurado y que puede funcionar para seleccionar y ensamblar protocolos analíticos que identificarán péptidos característicos mientras los dos sectores funcionan de forma independiente, ya sea en tándem o en paralelo;

(b) elegir las condiciones, los tiempos de muestreo, las etapas del procedimiento analítico y una configuración del sistema para el sector TD (14) para automatizar la generación de datos analíticos para validar un proceso de fabricación que incorpora el fermentador (F), en el que los datos de las etapas analíticas individuales son convertidos cronológicamente por el controlador (20) en bloques de datos digitales que proporcionan un medio para evaluar i) la variación del analito durante una ciclo de producción en relación con puntos de tiempo anteriores dentro del proceso y etapas cronológicas equivalentes en ciclos de producción anteriores, ii) la presencia de proteoformas que contienen atributos estructurales positivos y negativos que afectan la salud humana, iii) la necesidad de remediación a corto y largo plazo de las desviaciones del proceso y iv) la continuidad del proceso en relación con ciclos de producción anteriores,

(c) obtener muestras analíticas de la compleja composición biológica del fermentador (F) en los tiempos designados y eliminar la materia particulada antes del suministro de la muestra analítica a uno de los sectores (14, 16);

(d) maximizar la resolución de proteoformas de una familia específica de proteoformas de anticuerpos monoclonales en múltiples modos de separación cromatográfica o electroforética de diferente selectividad, dentro de una o más de las columnas de análisis TD y BU (25, 26, 27), para identificar y cuantificar proteoformas solo mediante procedimientos de separación;

(e) detectar miembros individuales de una familia de analitos en presencia de proteínas de células huésped a medida que eluyen de las columnas de análisis en el sector TD (14);

(f) acumular secuencialmente y asignar una marca de tiempo a los datos de detección de analitos de muestras dentro de una familia de proteoformas que pasan por el sector TD (14), y adquirir datos contemporáneos de sensores (55) que detectan el entorno del fermentador (F), datos de rendimiento del instrumento y datos de tiempo de funcionamiento, y a continuación construir curvas de respuesta analógica en función del tiempo que son digitalizadas y guardadas como datos digitales por el controlador (20),

(g) comparar los datos actuales con los datos de tiempos de muestra anteriores y muestras y datos cronológicamente equivalentes de ciclos de producción anteriores; con lo cual las similitudes cualitativas y cuantitativas entre los datos actuales y anteriores son utilizadas por el controlador (20) para evaluar una o más desviaciones potenciales en el proceso de fabricación;

(h) confirmar dicha una o más desviaciones potenciales en el sector BU (16) utilizando una proteoforma derivada del sector TD (14) o una familia de proteoformas no fraccionadas que haya sido seleccionada por afinidad, reducida o digerida con una columna de proteólisis Pep-Fc (60) antes del análisis de las clases de péptidos resultantes en el sector BU (16), donde la columna de afinidad es resistente a la digestión con tripsina;

(i) proporcionar análisis individuales de las clases de péptidos mediante uno de los múltiples modos selectivos de cromatografía líquida designados por el controlador (20) en combinación con espectrometría de masas, donde los modos de cromatografía líquida pueden ser por boronato de fenilo, fase inversa, interacción hidrofílica o cromatografía de afinidad basada en reconocimiento molecular;

(j) proporcionar detección y análisis de absorbancia y/o espectrometría de masas de los péptidos característicos separados en el sector BU (16);

(k) proporcionar cuantificación de los péptidos mediante monitorización de reacciones múltiples por espectrometría de masas;

(l) convertir cronológicamente datos analíticos de uno o más detectores en el sector BU (16) en datos digitales que puedan ser evaluados por el controlador (20) para evaluar y confirmar i) las variaciones durante una ciclo de producción en relación con puntos de tiempo anteriores dentro del proceso y etapas cronológicas equivalentes en ciclos de producción anteriores, ii) la presencia de proteoformas características que contengan atributos estructurales positivos y negativos que afectan la salud humana, iii) la necesidad de remediación a corto y largo plazo de las desviaciones del proceso, y iv) la continuidad del proceso en relación con ciclos de producción anteriores, y

(m) construir una procedencia digital del registro de fabricación al final del ciclo de producción basada en los datos

analíticos cronológicos que pueden ser evaluados por una agencia reguladora federal y que posteriormente se pueden utilizar para mejorar el proceso.

2. Procedimiento, según de la reivindicación 1, en el que en la etapa (a) cada uno de dichos al menos dos sectores (14, 16) incluye una válvula de conmutación (30, 31, 32) que es controlable por el controlador (20) para seleccionar entre la pluralidad de columnas de análisis (25, 26, 27) en el sector correspondiente (14, 16) para la selección de una fracción específica de cualquier columna en el sector TD (14) para su transporte al sector BU (16), para la selección por afinidad molecular y la proteólisis entre los sectores TD y BU (14, 16), y para el transporte de péptidos al sector BU (16) para la resolución y separación de péptidos en múltiples modos de separación.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que el controlador (20) acciona la válvula de conmutación (30) para el sector TD (14) de modo que las muestras extraídas del fermentador (F) eviten la pluralidad de columnas de análisis de TD (25), y acciona una válvula de acoplamiento de sector (18) para conectar la derivación del sector TD (14) a una columna de afinidad de proteoformas (60) en la pluralidad de columnas de análisis de BU (26, 27) para la proteólisis y análisis de péptidos ascendente posteriores en el sector BU (16).

4. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que se pueden seleccionar al menos dos tipos diferentes de cromatografía líquida para el análisis de proteoformas en un modo de análisis descendente o ascendente en los sectores TD y BU (14, 16), en el que los tipos de cromatografía líquida incluyen uno o más de intercambio iónico (IEC), fase inversa (RPC), interacción hidrofóbica (HIC), interacción hidrofílica (HILIC), afinidad por metal inmovilizado (IMAC), afinidad por reconocimiento molecular, exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de afinidad por lectina.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que en las etapas (b) y (g) el controlador (20) evalúa las proporciones de proteoformas, los cambios en la tasa de síntesis de proteoformas y los cambios en las proporciones de péptidos característicos para determinar las desviaciones del proceso.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que en la etapa (e) los analitos que eluyen de una columna de análisis de TD se derivatizan de forma no covalente con uno o más agentes de reconocimiento por afinidad de tipo de reconocimiento molecular (ATA) que contienen un resto que posteriormente facilita la detección del analito por absorbancia, fluorescencia o transferencia de energía por resonancia de Förster.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que un fluoróforo donante se une covalentemente a un primer reactivo de reconocimiento por afinidad (ATA<1>), cuya estructura se une específicamente a todas las proteoformas de una familia relacionada estructuralmente y un fluoróforo aceptor se acopla covalentemente a un segundo reactivo de reconocimiento por afinidad (ATA<2>) que se une a las proteoformas del analito en un segundo sitio, añadiéndose el par continuamente al efluente de una columna de separación para su detección por transferencia de energía por resonancia de Förster.

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que en la etapa (e) se evita el sector TD (14) y se transporta una muestra a una columna de afinidad para purificar una familia de proteoformas para su posterior análisis ascendente o análisis directo mediante espectrometría de masas descendente.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que en la etapa (k) los cambios en la concentración, la tasa de síntesis y las proporciones de concentración de proteoformas y péptidos dentro de un ciclo de producción del proceso de fabricación se identifican mediante análisis estadístico multivariante y se cuantifican utilizando datos de sensores de fermentador, cromatográficos o electroforéticos y de espectrometría de masas.

10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que se crea, almacena y compara una procedencia digital del ciclo de producción más actual del proceso de fabricación con ciclos de producción anteriores con el fin de comprender las fallas de producción, mejorar un proceso de fabricación y comunicarse con las agencias reguladoras federales.

11. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que en la etapa (e) los cambios en el estrés oxidativo durante un ciclo de producción del proceso de fabricación se reconocen seleccionando por cromatografía de afinidad una familia de proteoformas y cuantificando comparando la concentración de proteína oxidada de un ciclo de producción actual con la concentración encontrada en ciclos de producción anteriores.

12. Sistema de validación continua de procesos (CPV) (10) para evaluar cronológicamente la concentración de proteoformas en una familia de variantes de proteínas contenidas en composiciones biológicas complejas obtenidas de un fermentador (F) que forma parte de un proceso de fabricación para la producción de las composiciones biológicas complejas, comprendiendo el sistema CPV:

un sistema de muestreo (12) asociado con el fermentador (F) y que puede funcionar para extraer una muestra de la composición biológica del fermentador (F);

un sector descendente (TD) (14) que incluye una pluralidad de columnas de análisis de TD distintas (25) que están configuradas y pueden funcionar para la resolución de proteoformas intactas, la detección de proteoformas de analitos específicas en muestras que contienen componentes que incluyen proteínas de células huésped, proteoformas y metabolitos, y para generar datos que identifican y cuantifican estos componentes;

una válvula de selección multicanal de TD (mcsv) (30) dispuesta entre el sistema de muestreo (12) y la pluralidad de columnas de análisis de TD (25), la válvula mcsv de TD (30) que puede funcionar para dirigir la muestra a una o más de las columnas de la pluralidad de columnas de análisis de TD (25);

un sector ascendente (BU) (16) que incluye una pluralidad de columnas de análisis BU distintas (26, 27) configuradas y que pueden funcionar para la purificación por afinidad y la proteólisis de proteoformas durante el transporte al sector BU (16) y para generar datos relacionados con ello;

una válvula de acoplamiento de sector (18) configurada para conectar selectivamente el sector TD (14) al sector BU (16) para el paso de la muestra desde el sector TD (14) al sector BU (16);

una válvula de selección multicanal de BU (mcsv) (31, 32) dispuesta entre la válvula de acoplamiento de sector (18) y la pluralidad de columnas de análisis de BU (26, 27), la válvula mcsv BU (31, 32) que puede funcionar para dirigir la muestra a una o más de las columnas de la pluralidad de columnas de análisis de BU (26, 27);

una pluralidad de sensores (55) para detectar el entorno del fermentador (F); y

un controlador (20) configurado y que puede funcionar para:

recibir datos de dicha pluralidad de sensores (55) y utilizar dichos datos para accionar selectivamente el sistema de muestreo (12), la válvula mcsv de TD (30), la válvula de acoplamiento de sector (18) y la válvula mcsv de BU (31, 32) para controlar el flujo de la muestra entre la pluralidad de columnas de análisis de TD (25) y la pluralidad de columnas de análisis de BU (26, 27) de acuerdo con un protocolo adaptado para validar el proceso de fabricación para la producción de las composiciones biológicas complejas;

recibir y evaluar los datos de los sectores TD y BU (14, 16) de acuerdo con el protocolo;

determinar a partir de los datos del sector TD (14) si se ha producido una desviación en el proceso de fabricación y dirigir la muestra del sector TD (14) al sector BU (16) para la confirmación de la desviación por parte del sector BU (16).

13. Sistema CPV (10), según la reivindicación 12, en el que:

la pluralidad de columnas de análisis de TD (25) se selecciona entre columnas de afinidad, IMAC (cromatografía de afinidad por metal inmovilizado), HIC (cromatografía de interacción hidrofóbica), HILIC (cromatografía de interacción hidrofílica), WAX (intercambio aniónico débil) y WCX (intercambio catiónico débil) y SEC (exclusión por tamaño); y la pluralidad de columnas de análisis de BU (26, 27) se selecciona entre columnas SAX (intercambio aniónico fuerte) y SCX (intercambio catiónico fuerte), HILIC (cromatografía de interacción hidrofílica), RPC (cromatografía de fase inversa), WAX (intercambio aniónico débil) y SEC (exclusión por tamaño), afinidad por boronato e IEC (intercambio iónico).

14. Sistema CPV (10), según la reivindicación 12, que comprende además una columna de PCR (reactor post columna) (38) separada de la pluralidad de columnas de análisis de TD y BU (25, 26, 27), estando la columna de PCR (38) conectada selectivamente al sector TD (14) mediante la operación de la válvula de acoplamiento de sector (18) por el controlador (20).