ES3055338T3 - Method of producing a binder-toxin fusion protein in a plant cell or a whole plant - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir una proteína de fusión aglutinante-toxina que comprende al menos un aglutinante proteico seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento o derivado de anticuerpo con capacidad de unión a la diana, o un mimético de anticuerpo, opcionalmente, un enlazador peptídico y al menos una toxina proteica o protoxina proteica. El método comprende las etapas de: poner en contacto una célula vegetal o una planta completa con una construcción de ácido nucleico que comprende, en enlace operativo, al menos lo siguiente: (A) al menos un polinucleótido que codifica el aglutinante proteico, o una cadena o dominio de unión a la diana del mismo, y B1) un polinucleótido que codifica un enlazador peptídico escindible y un polinucleótido que codifica una toxina proteica, o B2) un polinucleótido que codifica una protoxina proteica, la cual comprende un dominio escindible para su activación, permitiendo que la construcción se integre en el núcleo de la célula vegetal, o de una o más células de la planta completa, y expresar la proteína de fusión codificada por la construcción de ácido nucleico (Fig. 7). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método de producción de una proteína de fusión ligante-toxina en una célula vegetal o en una planta enteraCampo de la invención

[0003] La presente solicitud se refiere al campo de las proteínas de fusión ligante-toxina.

[0004] Antecedentes

[0005] Los conjugados que combinan un ligante de diana y una toxina se desarrollaron hace cuarenta años y ahora representan una gran esperanza para combatir el cáncer. Estos conjugados están representados principalmente por la clase de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que consiste en un anticuerpo monoclonal conjugado químicamente con un agente citotóxico químico a través de un conector. Estos fármacos combinan la especificidad de los anticuerpos monoclonales para dirigirse a células cancerosas con la alta potencia tóxica de la carga activa, para destruir las células diana y, al mismo tiempo, preservar los tejidos sanos.

[0006] Sin embargo, el concepto ha demostrado ser difícil de traducir en éxito clínico. A pesar de su especificidad para las células tumorales, se producen con frecuencia efectos adversos sin que los productos hayan alcanzado su dosis terapéutica efectiva, lo que da como resultado una ventana terapéutica relativamente estrecha que puede limitar su respuesta clínica. La toxicidad limitante de la dosis se observó generalmente en tejidos que expresaban que no eran objetivo (efectos fuera del objetivo), principalmente debido a la liberación no deseada de la toxina debido a la relativa inestabilidad de los conectores utilizados, más que a problemas de especificidad del anticuerpo (Drake y Rabuka (2015).

[0007] Además de la toxicidad fuera del objetivo, se ha mostrado que solo un porcentaje muy pequeño (1-2%) de los conjugados intactos llega al tumor objetivo (Peters y Brown (2015). Debido a esta baja eficacia de direccionamiento, la carga activa citotóxica debe tener una potencia alta para seguir produciendo la muerte celular dirigida en dosis bajas.

[0008] Sin embargo, debido a la relativa inestabilidad de los conectores descrita anteriormente, el uso de toxinas de alta potencia requiere conectores que deben ser estables en el torrente sanguíneo, para evitar la liberación prematura de toxinas, para así ampliar la ventana terapéutica (Parslow et al. (2016)).

[0009] Las cargas activas tóxicas conjugadas químicamente conllevan el riesgo de una disociación no deseada del conector químico, lo que lleva a la toxicidad fuera del objetivo (Alewine et al. (2014)). Esta inestabilidad limita la eficacia de los inmunoconjugados fabricados de esa manera.

[0010] Un enfoque para ampliar la ventana terapéutica de los conjugados de anticuerpo-fármaco es el desarrollo de anticuerpos fusionados con proteínas o péptidos altamente citotóxicos, principalmente de plantas y bacterias. Este enfoque se desarrolló inicialmente a principios de la década de 1980. Una primera generación de dichos conjugados consistía en péptidos citotóxicos acoplados químicamente a un anticuerpo.

[0011] Sin embargo, la inestabilidad relativa ya discutida de la conjugación química, combinada con la alta inmunogenicidad de las proteínas citotóxicas nativas, se consideró un obstáculo importante frente a la usabilidad terapéutica de estos conjugados.

[0012] Sin embargo, estos conjugados tienen, en teoría, un enorme potencial para su uso en terapia. El mecanismo de acción de la mayoría de las toxinas proteicas se basa en la inhibición de la síntesis de proteínas, lo cual difiere de las citotoxinas orgánicas que se utilizan habitualmente (principalmente, inhibidores de tubulina o inhibidores de ARN polimerasa), lo que significa que el perfil de toxicidad no se superpone y facilita la combinación con las terapias convencionales.

[0013] Además, las proteínas citotóxicas parecen ser eficaces también en pacientes quimiorrefractarios, lo que sugiere que no se ven afectadas por los mecanismos de resistencia tumoral observados para las citotoxinas orgánicas. Además, a diferencia de la mayoría de las citotoxinas orgánicas, las proteínas citotóxicas también son eficaces contra las células inactivas, es decir, las células que no se dividen.

[0014] Además, las proteínas citotóxicas se pueden coexpresar con un anticuerpo, es decir, en forma de una proteína de fusión. Dicha producción recombinante de proteínas de fusión reduce la disociación indeseable de la carga activa observada en las tecnologías de conectores químicos.

[0015] La fusión genética de un ligante proteico, p. ej., un anticuerpo, con una proteína citotóxica mediante un conector peptídico proporciona un par de ventajas. Además de la mera función de unión, los conectores pueden afectar al plegamiento, estabilidad, perfil farmacocinético y actividad biológica de la proteína de fusión, así como a su rendimiento de producción en las células hospedantes.

[0016] Existen dos categorías de conectores, en concreto conectores estables y escindibles. Los conectores estables consisten en una secuencia peptídica estable que puede tener una semivida plasmática prolongada y evitar la liberación involuntaria de la proteína citotóxica. Todo el conjugado es internalizado en la célula y luego la toxina es liberada por la degradación intracelular del ligante proteico.

[0017] Se pueden usar muchas secuencias sensibles a proteasas de mamífero como conectores en el diseño de bioconjugados escindibles. En particular, se pueden usar secuencias sensibles a enzimas sobreexpresadas por células cancerosas para activar la proteína de fusión citotóxica en las células diana o en el entorno tumoral. Sin embargo, estas proteínas de fusión complejas que utilizan una secuencia sensible a enzimas de mamífero son difíciles de producir en sistemas convencionales (células de mamíferos (p. ej., CHO o HEK), células de insecto y levaduras) principalmente debido a la presencia de la enzima específica incluso con una expresión de fondo baja. En este caso, el propéptido se activa mediante la liberación de su dominio activo, lo que induce la inhibición de la proliferación de la célula hospedante. Por consiguiente, las proteínas de fusión ligante-toxina con conectores escindibles proteolíticos de mamífero deben producirse en sistemas de expresión de bacterias. Sin embargo, las bacterias no pueden plegar adecuadamente proteínas complejas con múltiples dominios y carecen de la capacidad de formar enlaces disulfuro (Yin et al. (2007)). Estas limitaciones limitan el sistema bacteriano a la producción de fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) y proteínas de fusión ligantetoxina basadas en proteínas citotóxicas aglicosiladas. Sin embargo, el pequeño tamaño de los bioconjugados bacterianos basados en scFv induce un rápido aclaramiento renal, lo que limita la ventana terapéutica de estas moléculas (Guo et al. (2016).

[0018] Stahnke et al. (2011, "Expression and in vitro characterisation of human Granzyme B-based immunotherapeutics for specific targeting of CD64 malignancies", páginas 1-141) describen la expresión de una fusión granzima B-scFv (Gb-H22(scFv)) en células de tabaco. Sin embargo, la expresión de Gb-H22(scFv) en los cloroplastos de hojas de tabaco fallaba o, tras la expresión en el apoplasto y el ER, las hojas de tabaco se marchitaban en cuestión de días. Por lo tanto, no fue posible extraer cantidades utilizables de Gb-H22(scFv). Francisco et al. (1997, "Expression and characterization of bryodin 1 and a bryodin i-based single-chain immunotoxin from tobacco cell culture",Bioconjugate Chemistry, American Chemical Society, EE. UU., vol. 3, páginas 703-713) describen la expresión de proteínas de fusión ligante-toxina inmunoterapéuticas recombinantes compuestas por un pequeño fragmento scFv unido a una toxina proteica con un conector estable.

[0019] La publicación internacional WO2009064815 describe que el cloroplasto de alga contiene la maquinaria necesaria para plegar proteínas de fusión ligante-toxina complejas, evitando la destrucción de las células hospedantes, como se observa en un sistema convencional. De hecho, el algaChlamydomonas reinhardtiitiene un solo cloroplasto como los que se encuentran en procariotas, pero que contiene proteínas que permiten el plegamiento de proteínas complejas (proteína disulfuro isomerasa, chaperonas). La publicación internacional WO2009064815 demostró la idoneidad del cloroplasto del alga verde para producir un anticuerpo monocatenario (CD22) soluble y funcional con dominios bisagra, CH2 y CH3 de una IgG1 humana fusionado con una toxina proteica mediante un conector no escindible que consiste en dos secuencias G4S repetidas (cuatro glicinas seguidas de una serina).

[0020] Tran et al. (2013, "Production of unique immunotoxin cancer therapeutics in algal chloroplasts",Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America, vol.110, n.º 1, páginas E15-E22) describen una inmunotoxina que consiste en una fusión anticuerpo-PE40 producida en cloroplastos de alga.

[0021] Sin embargo, una preocupación importante es la modificación postraduccional de los cloroplastos de microalga, en particular la falta de maquinaria enzimática para la N-glicosilación, un atributo fundamental para los productos biofarmacéuticos (Mathieu-Rivet et al. (2014)).

[0022] Se desarrolló otro enfoque basado en células renales embrionarias humanas (HEK-293T) utilizando una proteína de fusión ligante-toxina no escindible compuesta por un factor de crecimiento endotelial vascular 121 (VEG121) unido a través de un conector estable G4S a una granzima B protegida (Mohamedali et al. (2013)). El dominio funcional de la proteasa Granzima B está protegido por un marcador de histidina adicional unido por un sitio sensible a la enteroquinasa, muy probablemente para evitar la destrucción de la célula hospedante. Después de la producción, el sitio protegido debe eliminarse mediante una etapa adicional de tratamiento con enteroquinasa. Aunque se observó una eficacia antitumoral, la producción de este tipo de proteína de fusión ligante-toxina es compleja.

[0023] Dicha limitación puede superarse mediante el uso de una bioconjugación totalmente recombinante de un resto de direccionamiento unido mediante un conector peptídico a una carga activa peptídica. Dicho inmunoconjugado recombinante se ha diseñado, por ejemplo, usando un fragmento variable monocatenario específico para CD20 (scFv) conjugado con una toxina similar a Shiga modificada y expresado en un sistema de expresión procariota (publicación internacional WO2014164680A1). El compuesto resultante presentaba resultados prometedores en la fase I/Ib en el NHL, lo que demuestra que un inmunoconjugado completamente recombinante puede reducir la toxicidad fuera del objetivo observada en los anticuerpos conjugados químicamente con una toxina peptídica.

[0024] Sin embargo, se ha mostrado que los inmunoconjugados basados en anticuerpos scFv tienen una semivida en sangre muy limitada debido al aclaramiento renal, lo que limita su eficacia, mientras que los modelos bacterianos que se utilizan con frecuencia para producir inmunotoxinas basadas en scFv no son adecuados para producir anticuerpos de longitud completa o estructuras scFv-Fc debido a su incapacidad para permitir la formación de puentes disulfuro. Además, dichos sistemas bacterianos no glicosilan los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos producidos con los mismos, lo que también puede conducir a una semivida reducida o reducir las funciones efectoras de los anticuerpos producidos. Por estas razones, típicamente, se están usando sistemas de expresión de mamífero como las CHO (células de ovario de hámster chino) para producir dichos anticuerpos complejos o fragmentos o derivados de anticuerpos.

[0025] Sin embargo, la producción de una carga activa de toxina proteica activa, o un conjugado que comprenda esta última, es difícilmente alcanzable en células de mamífero, debido a razones de toxicidad, en particular si se usa un sitio de escisión que sea reconocido por una proteasa de mamífero. Sin embargo, es de gran interés tener, en un inmunoconjugado, dicho sitio de escisión que sea reconocido por una proteasa de mamífero. Esto permitiría activar la toxina después de que la proteína de fusión ligante-toxina se haya unido a su diana, p. ej., en el sitio de la enfermedad caracterizado por dicha diana. Debido a su susceptibilidad a las proteasas de mamífero, el sitio de escisión se escindirá y la toxina así activada será liberada.

[0026] Wang et al. (2007, "Recombinant immunoproapoptotic proteins with furin site can translocate and kill HER2-positive cancer cells",Cancer Research, vol. 67, n.º 24, páginas 11830-11839) describen una fusión de granzima B-anticuerpo monocatenario en la que se usó un dominio de furina como conector escindible. Hetzel et al. (2008, "Small cleavable adapters enhance the specific cytotoxicity of a humanized immunotoxin directed against CD64-positive cells",Journal of Immunotherapy, Lippincott Williams & Wilkins, EE. UU., vol.

[0027] 31, n.º 4, páginas 370-376) describen un anticuerpo monocatenario (anti-CD64) fusionado con la RNasa humana angiogenina usando un conector proteolíticamente escindible.

[0028] Xiaoying et al. (2012), "Fusion protein linkers: Property, design and functionality",Advanced Frug Delivery Reviews) es un artículo de revisión que resume los conocimientos sobre las proteínas de fusión recombinantes en 2012 y describe, entre otras cosas, la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden conectores escindibles.

[0029] Sin embargo, ningún documento de la técnica anterior disponible describe la expresión de una inmunotoxina (fusión ligante-toxina) que comprenda una protoxina o un conector peptídico escindible en células vegetales. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de producción eficiente para aprovechar el potencial terapéutico de las nuevas proteínas de fusión ligante-toxina.

[0030] Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para la producción de una proteína de fusión ligante-toxina que

[0031] a) permita la formación de puentes disulfuro en la proteína ligante y/o la glicosilación de la proteína ligante b) permita el uso de una toxina proteica que es tóxica para células de mamífero, y/o

[0032] c) permita la incorporación de un sitio de escisión que sea reconocido por una proteasa de mamífero.

[0033] Otro objeto más de la presente invención es permitir la producción de proteínas de fusión ligante-toxina glicosiladas que combinan un resto de direccionamiento fusionado de forma recombinante con una proteína citotóxica que se activa después de la escisión del conector, con una semivida sérica prolongada.

[0034] Sería deseable resolver cualquiera de estos objetos incluso si la proteína ligante real (a) no está glicosilada, (b) usa una toxina que no es tóxica para las células de mamífero o (c) no tiene dicho sitio de escisión, porque el mero hecho de que dicho método permita cualquiera de los tres proporciona una gran flexibilidad y permite producir una gran variedad de proteínas de fusión ligante-toxina.

[0035] Estos y otros objetivos se cumplen con métodos y medios según las reivindicaciones independientes de la presente invención. Las reivindicaciones dependientes están relacionadas con realizaciones específicas.

[0036] Compendio de la invención

[0037] La presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión ligante-toxina. La invención y las ventajas generales de sus características se analizarán en detalle a continuación.

[0038] La invención se define por las características de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas se definen por las características de las reivindicaciones dependientes.

[0039] En particular, la presente invención se refiere a un método para producir una proteína de fusión ligante-toxina que comprende al menos

[0040] a) un ligante proteico seleccionado del grupo que consiste en

[0041] • un anticuerpo

[0042] • un fragmento o derivado de anticuerpo que conserva la capacidad de unión a la diana, o

[0043] •<un mimético>de anticuerpos, y ya sea

[0044] b1) un conector peptídico escindible y una toxina proteica, o

[0045] b2) una protoxina proteica que comprende un dominio escindible,

[0046] comprendiendo dicho método las etapas de:

[0047] (i) poner en contacto una célula vegetal o una planta entera hospedante con una construcción de ácido nucleico que comprende en unión operativa al menos lo siguiente

[0048] A) al menos un polinucleótido que codifica el ligante proteico, o una cadena o dominio de unión a la diana del mismo, y

[0049] B1) un polinucleótido que codifica un conector peptídico escindible y un polinucleótido que codifica una toxina proteica, o

[0050] B2) un polinucleótido que codifica una protoxina proteica, cuya protoxina comprende un dominio escindible para la activación de la misma,

[0051] (ii) permitir que la construcción se integre en el núcleo de la célula vegetal, o de una o más células de la planta entera, y

[0052] (iii) expresar la proteína de fusión codificada por la construcción de ácido nucleico,

[0053] en donde el conector peptídico o el dominio escindible en la protoxina no es escindible por una enzima expresada por la célula vegetal, o una enzima que es producida por la planta hospedante.

[0054] Breve descripción de las figuras

[0055] Figura 1. Se analizaron 30 µg de extractos foliares deNicotiana benthamianadespués de 4 y 6 días postagroinfiltración (4 o 6 dpa) mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-parte Fc de IgG humana. Se usó el vector de transformación binario que contenía el gen supresor de silenciamiento p19 (+) o no (-). Se usaronAgrobacterium tumefaciens(A. t.) LBA4404 (carril 1 a 4) o GV3101 (carril 5 a 8) para expresar la proteína de fusión, las cepas se indican en la parte superior de la figura. Un control negativo que usa un plásmido binario pPZP-ATB vacío en A. t. LBA4404 (C-). Se usaron 200 ng de IgG de suero humano (Sigma, I5154) como control positivo (C+). Las SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizaron en condiciones no reductoras. El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella.

[0056] Figura 2. 25 µg de extractos foliares deNicotiana benthamianadespués de 4 días post-agroinfiltración se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-parte Fc de IgG humana (panel izquierdo) y anti-granzima B humana (panel derecho). Se usaronAgrobacterium tumefaciens(A. t.) LBA4404 sin el gen supresor de silenciamiento p19 para expresar la proteína de fusión. Se usaron 50 ng de IgG de suero humano (Sigma, I5154) como control positivo (C+). La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones reductoras (+ DTT) o no reductoras (- DTT). L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella. El tamaño monomérico integral se indica con Δ.

[0057] Figura 3. Se analizaron 40 µg de extractos foliares deNicotiana benthamianadespués de 4 días postagroinfiltración por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-parte Fc de IgG humana. Se usaron 50 ng de IgG de suero humano (Sigma, I5154) como control positivo (IgG de suero humano). La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones no reductoras. Las construcciones expresadas se indican en la parte superior del carril correspondiente. L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella.

[0058] Figura 4. Citotoxicidad y uniónin vitro

[0059] A: Citotoxicidadin vitromediante el ensayo WST-1.10 µl de scFv-Fc-LINK1-TOX2 purificado, en donde LINK1 es escindible por la familia de proproteínas convertasas de tipo subtilisina, el TOX2 inhibe la síntesis de proteínas y el scFv-Fc se une a una proteína de la superficie celular expresada en células B, se han diluido en 40 µl de medio de crecimiento antes de ser añadidos a células Raji. La viabilidad se ha observado por la lectura de la densidad óptica 72 horas después de incubación. DMSO (5%) o tritón (2%) sirven como controles positivos. Se ha usado control de tampón solo (10 µl en 40 µl de medio de cultivo) para normalizar el efecto de scFv-Fc-LINK1-TOX2 y los controles positivos.

[0061]

[0063] B: Análisis de la capacidad de unión por ELISA. El antígeno se ha aplicado en recubrimiento en una microplaca de 96 pocillos. Se han incubado 50 µl de construcciones purificadas durante 1 hora. Se ha añadido el anticuerpo de cabra anti-Fc humano HRPO para la detección. Se han usado 50 µl de mAb desnudo específico como control positivo (curva roja lineal). Se han usado 50 µl de mAb desnudo no específico como control negativo (curva gris lineal). FCS = sitio de escisión de furina, GB = granzima B

[0065]

[0067] Figura 5. 25 µg de extractos de células vegetales deNicotiana tabacumdespués de 3 días tras cocultivo se analizaron por transferencia Western usando anticuerpos anti-parte Fc de IgG humana (panel izquierdo) y anti-Granzima B humana (panel derecho). Se usaronAgrobacterium tumefaciens(A. t.) LBA4404 que albergan plásmidos binarios con gen supresor de silenciamiento p19 para expresar la proteína de fusión. La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones no reductoras. L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella.

[0068] Figura 6. 33 µl de extractos de células vegetales estables deNicotiana tabacumde 5 días se analizaron por transferencia Western usando el anticuerpo anti-parte Fc de IgG humana. Se ha usado una línea de células vegetales seleccionada que expresa de manera estable scFv-Fc-FCS-granzima B para el análisis de extractos celulares. La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones no reductoras. L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella. Figura 7. Patrones de N-glicosilación producidos por células humanas (izquierda) y plantas o células de tabaco (derecha).

[0069] Figura 8. (Panel izquierdo) Se analizaron 33 µl de extractos de células vegetales deNicotiana tabacumdespués de 3 días tras cocultivo por transferencia Western usando anticuerpo anti-Fc de IgG humana. Se usaronAgrobacterium tumefaciens(A. t.) LBA4404 que albergan plásmidos binarios con gen supresor de silenciamiento p19 para expresar la proteína de fusión. (Panel derecho) Se analizaron 40 µg de extractos de hojas deNicotiana benthamianadespués de 4 días post-agroinfiltración mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-parte Fc de IgG humana. Las SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizaron en condiciones no reductoras. Las construcciones expresadas se indican en la parte superior del carril correspondiente. TOX2 indica una toxina de la clase 2 de toxinas como se describe en el presente documento (inhibidor de la síntesis de proteínas). L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella.

[0070] Figura 9: Estructuras de formatos de ligante-toxina descritos en el presente documento.

[0071] 9A-C: La toxina se fusiona con un extremo C de una cadena de anticuerpo. A: (scFv-FC)-(sitio de escisión)-toxina/protoxina; B: HC más LC-(sitio de escisión)-toxina/protoxina, y C: LC más HC-(sitio de escisión)-toxina/protoxina.

[0072] 9D-G La toxina se fusiona con un extremo N de una cadena de anticuerpo.

[0073] El scFv-Fc es un formato de anticuerpo específico como se comenta en el presente documento. LC es la cadena ligera de un anticuerpo IgG. HC es la cadena pesada de un anticuerpo IgG. CS significa sitio de escisión y Tox significa toxina/protoxina. Las barras entre las diferentes cadenas simbolizan enlaces disulfuro.

[0074] Figura 10: Resultados del análisis de glicoformas peptídicas. Para demostrar que los péptidos extraídos de los anticuerpos descritos en el presente documento y que comprenden un sitio de N-glicosilación tienen glicoformas características que los separan de las proteínas producidas en mamíferos, se utilizaron diferentes cepas deNicotiana benthamiana, algunas de las cuales se glicodiseñaron mediante tecnología de interferencia de ARN (ARNi) (material proporcionado por NOMAD Bioscience GmbH, Múnich), para obtener una regulación por disminución dirigida de la β-1,2-xilosiltransferasa endógena (XylT) y α 1,3-fucosiltransferasa (FucT), la Fig. 10 muestra los espectros de EM de dos de dichos péptidos como se producen en las diferentes cepas.

[0075] Figura 11: Resultados del ensayo de escisión. scFv-Fc-FCS-GB (FCS = sitio de escisión de furina, GB = granzima B) se ha expresado a partir deNicotiana benthamiana. La proteína se purificó mediante cromatografía de proteína A a partir de extractos foliares después de 4 días post-agroinfiltración. El material purificado se ha expuesto a furina recombinante. La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones reductoras. L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). La proteína GB libre que resulta después de la escisión se indica con una estrella. La proteína recombinante April se usó como control de escisión. La banda relacionada con la escisión de April se indica con un Δ.

[0076] Figura 12: Análisis de proteínas purificadas por SDS PAGE con azul Coomassie. Se han expresado varias construcciones a partir deNicotiana benthamiana. La proteína se ha purificado por cromatografía de proteína A a partir de extractos foliares después de 4 días post-agroinfiltración. Se han añadido 7 µl de proteína purificada a 7 µl de tampón de carga (2x). Después, se han cargado 12 µl en el pocillo respectivo. La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones no reductoras. L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella.

[0077] Figura 13: Análisis de proteínas purificadas por SDS PAGE con azul Coomassie. Se han expresado varias construcciones a partir deNicotiana benthamiana. La proteína se ha purificado por cromatografía de proteína A a partir de extractos foliares después de 4 días post-agroinfiltración. Se han añadido 7 µl de proteína purificada a 7 µl de tampón de carga (2x). Después, se han cargado 12 µl en el pocillo respectivo. La SDS-PAGE de acrilamida al 4-20% se realizó en condiciones reductoras. L indica la escala de proteínas (marcador de tamaño de peso molecular). El tamaño de la proteína integral se indica con una estrella.

[0078] Descripción detallada de la invención

[0079] Antes de describir la invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las partes componentes particulares de los dispositivos descritos o a las etapas de procedimiento de los métodos descritos, ya que dichos dispositivos y métodos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende ser limitante. Debe indicarse que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias singulares y/o plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, debe entenderse que, en caso de que se proporcionen intervalos de parámetros que estén delimitados por valores numéricos, se considera que los intervalos incluyen estos valores de limitación.

[0080] Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una proteína de fusión ligante-toxina.

[0081] a) un ligante proteico seleccionado del grupo que consiste en

[0082] <•>un<anticuerpo>

[0083] • un fragmento o derivado de anticuerpo que conserva la capacidad de unión a la diana, o

[0084] • un mimético de anticuerpo,

[0085] y ya sea

[0086] b1) un conector peptídico escindible y una toxina proteica, o

[0087] b2) una protoxina proteica que comprende un dominio escindible,

[0088] comprendiendo dicho método las etapas de:

[0089] (i) poner en contacto una célula vegetal o una planta entera con una construcción de ácido nucleico que comprende en unión operativa al menos lo siguiente

[0090] A) al menos un polinucleótido que codifica el ligante proteico, o una cadena o dominio de unión a la diana del mismo, y

[0091] B1) un polinucleótido que codifica un conector peptídico escindible y un polinucleótido que codifica una toxina proteica, o

[0092] B2) un polinucleótido que codifica una protoxina proteica, cuya protoxina comprende un dominio escindible para la activación de la misma,

[0093] (ii) permitir que la construcción se integre en el núcleo de la célula vegetal, o de una o más células de la planta entera, y

[0094] (iii) expresar la proteína de fusión codificada por la construcción de ácido nucleico,

[0095] en donde el conector peptídico o el dominio escindible de la protoxina no es escindible por una enzima expresada por la célula vegetal, o una enzima que es producida por la planta hospedante.

[0096] Los autores de la invención descubrieron, sorprendentemente, que con dicho método, se pueden producir proteínas de fusión ligante-toxina recombinantes a gran escala y con alta productividad.

[0097] Como se usa en el presente documento, el término "planta" (incluidas las células derivadas de las mismas) se refiere a algas (incluidas Chlorophyta y Charophyta/Streptophyta, así como las Mesostigmatophyceae, Chlorokybophyceae y Spirotaenia), y también a las plantas terrestres (embriofitas), incluidas gimnospermas y angiospermas, incluidas mono y dicotiledóneas.

[0098] En un ejemplo, la planta o célula vegetal con la que se pone en contacto la construcción de ácido nucleico no es un cloroplasto, o no es un cloroplasto de un alga, en particular no es el cloroplasto deChlamydomonas reinhardtii. En otro ejemplo, la estructura de la planta o célula vegetal con la que se pone en contacto la construcción de ácido nucleico no es un cloroplasto, o no es un cloroplasto de un alga, en particular no es el cloroplasto deChlamydomonas reinhardtii.

[0099] Como se usa en el presente documento, la expresión "toxina proteica" o "protoxina proteica" se entiende que abarca proteínas citotóxicas y/o citostáticas. o las pro-variantes de las mismas.

[0100] Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína citostática" se refiere a una proteína que puede inhibir la proliferación celular o la división celular sin destruir necesariamente la célula. Adecuadamente, el agente citostático inhibe la proliferación de células tumorales.

[0101] Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína citotóxica" se refiere a una proteína que es dañina para las células y, en última instancia, produce la muerte celular. En algunos ejemplos, la proteína citotóxica daña células que se dividen rápidamente, tales como las células tumorales, y produce la muerte de células tumorales, especialmente la muerte de células tumorales a la vez que no produce daño o produce menos daño a las células no tumorales.

[0102] Las expresiones "toxina proteica" o "protoxina proteica" se refieren, sin limitación, a toxinas que, por su naturaleza química, son proteínas (es decir, péptidos que tienen una longitud de ≥ 50 restos de aminoácidos) o polipéptidos (es decir, péptidos que tienen una longitud de ≥ 10 - ≤ 50 restos de aminoácidos). Una protoxina, en el sentido de la presente invención, es un precursor de una toxina, también denominada toxina latente, que necesita ser activada, p. ej., por escisión de una secuencia de aminoácidos inhibidora o experimentando un cambio conformacional. Los términos "protoxina" y "protoxina proteica" se usan indistintamente aquí y significan el mismo objeto.

[0103] La expresión de proteínas recombinantes de origen vegetal se ha desarrollado durante 3 décadas. En la actualidad, varias proteínas terapéuticas, tales como anticuerpos monoclonales (mAb), producidas en plantas o células vegetales (tales como el tabaco o células del tabaco) se han ensayado en ensayos clínicos y se comercializan o están a punto de serlo (Yao et al. (2015)). Expresión de proteínas recombinantes de origen vegetal, incluidos anticuerpos. también se puede llevar a cabo en algas. (Hempel et al., 2011)

[0104] Las plantas tienen un par de ventajas sobre los sistemas de células procariotas y eucariotas en relación con su bajo coste de producción, seguridad inherente del producto, facilidad de escalado, su capacidad para plegar y ensamblar proteínas complejas y llevar a cabo modificaciones postraduccionales complejas.

[0106] Además, los cultivos de células vegetales en suspensión ofrecen una mayor reproducibilidad y seguridad durante la producción (sin microbios, insectos o patógenos de mamíferos conocidos) y cumplen con los requisitos actuales de producción de buenas prácticas de fabricación. Los cultivos de células vegetales en suspensión solo requieren nutrientes definidos simples para crecer, lo que ofrece costes operativos mucho menos caros que los sistemas microbianos o de mamíferos.

[0108] La expresión "proteína de fusión", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que tiene un componente peptídico unido operativamente a al menos un componente adicional y que difiere de una proteína natural en la composición y/u organización de sus dominios.

[0110] La expresión "unido operativamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a dos o más polinucleótidos, significa una situación en la que los diferentes polinucleótidos están puestos en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor efectúa la transcripción de la secuencia codificante. Del mismo modo, la secuencia codificante de un péptido señal está unida operativamente a la secuencia codificante de un polipéptido si el péptido señal efectúa la secreción extracelular de ese polipéptido. Según una realización de la presente descripción, cuando los respectivos polinucleótidos codifican diferentes péptidos, "unidos operativamente" significa que los respectivos polinucleótidos son contiguos y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, los marcos de lectura abiertos están alineados.

[0112] La expresión "conector peptídico escindible", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos interna dentro de la proteína de fusión que contiene restos que unen el grupo ligante y la proteína toxina para hacer así que la proteína toxina sea incapaz de ejercer su efecto tóxico fuera de la célula diana o limitar su capacidad de proteína toxina para inhibir el crecimiento celular (citostasis) o producir la muerte celular (citotoxicidad). De esta manera, la toxina proteica se mantiene inactiva mientras está en el plasma, hasta que llega a la célula diana, donde la carga activa citotóxica será liberada y/o activada de forma selectiva (Grawunder y Stein, 2017). Dentro de la célula diana, la secuencia conectora escindible se escinde y la proteína toxina se vuelve activa o tóxica. La proteína de fusión descrita en el presente documento está compuesta por un grupo ligante específico de la célula y un grupo toxina proteica unidos por un resto de aminoácido o secuencia de aminoácidos específicos que tiene un sitio de reconocimiento de escisión para proteasas específicas, particularmente, pero no limitadas a, proteasas específicas de cáncer, y/o se pueden escindir en condiciones específicas tales como, sin limitación, condiciones ácidas y/o reductoras. Las secuencias que codifican los sitios de reconocimiento de escisión para proteasas específicas pueden identificarse entre las proteasas humanas ubicuas conocidas y/o ensayando la expresión de la proteasa asociada al cáncer. Además, la secuencia del conector no debe interferir con el papel del grupo ligante en la unión celular y la internalización en los lisosomas.

[0114] La expresión "dominio escindible" de una protoxina se refiere a una secuencia que, una vez escindida por hidrólisis o escisión enzimática, activa la parte de toxina de la protoxina. Muchas protoxinas tienen un dominio de aminoácidos que es escindido específicamente por una enzima o por hidrólisis dependiente del pH (p. ej., después de endocitosis en los endosomas), para liberar así la parte de toxina activa en el citosol. Dichos dominios escindibles actúan doblemente como conectores peptídicos escindibles "de origen natural" (o "sitios de escisión intrínsecos"), a diferencia de los conectores peptídicos escindibles que deben usarse en caso de que la toxina no comprenda un dominio escindible para la activación, por ejemplo, porque no se encuentra en forma de protoxina.

[0116] La expresión "activación/liberación selectiva" se refiere a la activación de la capacidad de la protoxina o la toxina proteica para inhibir el crecimiento celular (citostasis) o producir la muerte celular (citotoxicidad) en condiciones particulares. Esta activación selectiva se refiere a un grupo de activación modificable no natural o no encontrado de forma natural de una toxina proteica que, tras la modificación, convierte la toxina inactiva (protoxina proteica) en una toxina activa o un conector escindible nativo de una protoxina. Cuando el grupo de activación modificable selectivamente es un componente de la proteína de fusión de la toxina, la modificación del grupo de activación modificable puede dar como resultado directamente que la protoxina se vuelva tóxica para la célula diana, o puede dar como resultado que la protoxina adopte una forma que es activable de forma nativa para volverse tóxica para la célula diana. Las protoxinas activables de forma nativa comprenden, por ejemplo, la modificación del grupo de activación modificable de manera que sea sensible a componentes endógenos de la célula diana o al entorno que rodea a las células diana. (p. ej., una proteasa específica de la célula diana o una proteasa ubicua) y/o condiciones específicas tales como, sin limitación, condiciones ácidas y/o reductoras. La toxina activa de forma nativa se puede modificar para que sea inactiva (protoxina) en la fusión de la toxina usando un grupo de activación modificable natural o no natural y no encontrado de forma natural, de modo que sea sensible a componentes endógenos de la célula diana, o al entorno que rodea a las células diana y/o a condiciones específicas tales como, sin limitación, condiciones ácidas y/o reductoras. El grupo de activación modificable se define como conector escindible en la presente invención.

[0117] Por lo tanto, aunque un conector escindible proporciona ventajas claras frente a un conector estable en lo que respecta al perfil de actividad, su uso complica la producción de los respectivos conjugados de proteína de unión-toxina en células de mamífero, insecto y levaduras, porque la escisión del conector conduce a la autointoxicación del sistema de producción. Sin embargo, esto no se aplica a los sistemas de producción basados en plantas, porque

[0118] (i) no escinden el conector (debido a la falta de las respectivas proteasas o condiciones reductoras/hidrolizantes) y/o

[0119] (ii) la respectiva toxina proteica que es tóxica para mamíferos o células de mamífero no es tóxica para plantas o células vegetales.

[0120] Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se referirá a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea, es decir, una población homogénea que consiste en una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno o derivado de la misma. Se prefiere particularmente que dicho anticuerpo se seleccione del grupo que consiste en IgG, IgD, IgE, IgA y/o IgM, o un fragmento o derivado del mismo.

[0121] Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se referirá a fragmentos de dicho anticuerpo que conservan las capacidades de unión a la diana, p. ej.

[0122] <•>una<CDR (región determinante de la complementariedad),>

[0123] • una región hipervariable,

[0124] • un dominio variable (Fv),

[0125] • una cadena pesada de IgG (que consiste en las regiones VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3),

[0126] • una cadena ligera de IgG (que consiste en las regiones VL y CL), y/o

[0127] •<un Fab y/o F(ab)>2

.

[0128] Como se usa en el presente documento, el término "derivado" se referirá a construcciones de proteína que son estructuralmente diferentes del concepto de anticuerpo común, pero que todavía tienen alguna relación estructural con él, p. ej., scFv, scFv-Fc, Fab y/o F(ab)<2>, así como a construcciones de anticuerpos bi, triespecíficos o superiores o anticuerpos monovalentes, y que conservan además las capacidades de unión a la diana. Todos estos elementos se explican a continuación.

[0129] Otros derivados de anticuerpos conocidos por los expertos en la técnica son los diacuerpos, anticuerpos de camélidos, nanocuerpos, anticuerpos de dominio, homodímeros bivalentes con dos cadenas que consisten en scFv, IgA (dos estructuras de IgG unidas por una cadena J y un componente secretor), anticuerpos de tiburón, anticuerpos que consisten en una región armazón de primates del nuevo mundo más CDR de primates no del nuevo mundo, construcciones dimerizadas que comprenden CH3+VL+VH y conjugados de anticuerpos (p. ej., anticuerpo o fragmentos o derivados unidos a una toxina, una citocina, un radioisótopo o un marcador). Estos tipos están bien descritos en la bibliografía y los pueden usar los expertos en la técnica basándose en la presente descripción, con la adición de actividad inventiva adicional.

[0130] Los métodos para la producción de una célula de hibridoma se han descrito previamente (véase Köhler y Milstein 1975). Esencialmente, p. ej., un ratón se inmuniza con una proteína guanil-ciclasa soluble humana (sGC), seguido del aislamiento de las células B de dicho ratón y la fusión de las células B aisladas con una célula de mieloma.

[0131] Los métodos para la producción y/o selección de mAb quiméricos o humanizados son conocidos en la técnica. Esencialmente, p. ej., las secuencias de proteína del anticuerpo anti-sGC murino que no están implicadas en la unión a la diana se sustituyen por secuencias humanas correspondientes. Por ejemplo, el documento US6331415 de Genentech describe la producción de anticuerpos quiméricos, mientras que el documento US6548640 del Medical Research Council describe técnicas de injerto de CDR y el documento US5859205 de Celltech describe la producción de anticuerpos humanizados.

[0132] Los métodos para la producción y/o selección de mAb completamente humanos son conocidos en la técnica. Estos pueden implicar el uso de un animal transgénico que se inmuniza con sGC humana, o el uso de una técnica de presentación adecuada, como la presentación en levaduras, presentación en fagos, presentación en células B o presentación en ribosomas, donde los anticuerpos de una biblioteca se criban frente a la sGC humana en una fase estacionaria.

[0133] Las bibliotecas de anticuerpos in vitro se describen, entre otros, en los documentos US6300064 de MorphoSys y US6248516 de MRC/Scripps/Stratagene. Las técnicas de presentación en fagos se describen, por ejemplo, en el documento US5223409 de Dyax. Las plataformas de mamíferos transgénicos se describen, por ejemplo, en el documento EP1480515A2 de TaconicArtemis.

[0134] IgG, scFv, scFv-Fc, Fab y/o F(ab)<2>son formatos de anticuerpos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las técnicas que lo facilitan relacionadas están disponibles en los respectivos libros de texto.

[0135] Como se usa en el presente documento, el término "Fab" se refiere a un fragmento de IgG que comprende la región de unión al antígeno, estando compuesto dicho fragmento por un dominio constante y uno variable de cada cadena pesada y ligera del anticuerpo.

[0136] Como se usa en el presente documento, el término "F(ab)<2>" se refiere a un fragmento de IgG que consiste en dos fragmentos Fab conectados entre sí por uno o más enlaces disulfuro.

[0137] Como se usa en el presente documento, el término "scFv" se refiere a un fragmento variable monocatenario que es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas, unidas entre sí con un conector corto, normalmente serina (S) o glicina (G). Esta molécula quimérica conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción de un péptido conector.

[0138] Como se usa en el presente documento, el término "scFv-FC" se refiere a un formato de anticuerpo específico. Este formato es particularmente estable y se puede expresar con alto rendimiento en células vegetales y plantas. Las construcciones scFv-FC se describen, por ejemplo, en Bujak et al. (2014). Las construcciones scFv-Fc son construcciones diméricas que comprenden dos cadenas asociadas entre sí, por ejemplo, por uno o más enlaces disulfuro, en donde cada una de las cuales consiste en una estructura de la siguiente manera (en la dirección N->C):

[0139] V<L>-conector-V<H>-conector-FC, o

[0140] V<H>-conector-V<L>-conector-FC

[0141] siendo V<L>el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo, siendo V<H>el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo y siendo FC el dominio constante de un anticuerpo.

[0142] El uso de un anticuerpo con forma de IgG de longitud completa o un dominio de unión scFv-Fc confiere una semivida más larga al conjugado. Además, la parte Fc del anticuerpo puede ser de suma importancia cuando se requiere la activación de la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) o ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo).

[0143] Los formatos de anticuerpos modificados son, por ejemplo, construcciones de anticuerpos bi o triespecíficos, proteínas de fusión basadas en anticuerpos, inmunoconjugados y similares. Estos tipos están bien descritos en la bibliografía y los pueden usar los expertos en la técnica basándose en la presente descripción, con la adición de actividad inventiva adicional. Además, también se han descrito previamente anticuerpos monovalentes en los documentos US 2004/0033561 A1 (denominados en ellos monocuerpos) o WO2007048037.

[0144] Los miméticos de anticuerpos son compuestos orgánicos (en la mayoría de los casos proteínas o péptidos recombinantes) que, al igual que los anticuerpos, pueden unirse específicamente a antígenos, pero que no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Las ventajas comunes frente a los anticuerpos son mejor solubilidad, penetración en los tejidos, estabilidad frente al calor y las enzimas y costes de producción comparativamente bajos. Los miméticos de anticuerpos se están desarrollando como agentes terapéuticos y de diagnóstico y abarcan, entre otras, moléculas de Affibody, Affilin, Ubiquitinas, Affimers Affitin, AlphaBody, anticalinas, avímeros, DARPinas, Fynomer, péptidos de dominio Kunitz, monocuerpos y nanoCLAMP. Los miméticos de anticuerpos se analizan con gran detalle, entre otros, en Gebauer y Skerra (2009).

[0145] En general, el ligante proteico puede consistir en una sola cadena. Este es el caso, p. ej., donde el ligante proteico es un anticuerpo scFv o un scFv-Fc. En este caso, todo el ligante proteico puede ser codificado en un solo polinucleótido.

[0146] En otra realización, el ligante proteico puede comprender dos o más cadenas, como p. ej. en una IgG de tamaño completo o en un fragmento F(ab)2. En dicho caso, se puede proporcionar que la construcción de ácido nucleico pueda comprender dos o más polinucleótidos que codifican las diferentes cadenas o dominios para el ligante proteico.

[0147] En otra realización donde el ligante proteico comprende dos o más cadenas, se puede proporcionar que dos construcciones de ácido nucleico sean proporcionadas, comprendiendo la primera los tres polinucleótidos que codifican la primera cadena del ligante proteico, el conector y la toxina, mientras que la segunda comprende el polinucleótido que codifica la segunda cadena del ligante proteico.

[0148] Según una realización de la invención, el método comprende además la etapa de (iv) recuperar y/o purificar la proteína de fusión expresada en la etapa (iii)

[0149] Según otra realización de la invención, la planta o célula vegetal es del géneroNicotiana.

[0150] En una realización, cuando se usa una planta, la expresión de la proteína de fusión es una expresión transitoria. En otra realización, cuando se usa una célula vegetal, la expresión de la proteína de fusión es una expresión transitoria o estable.

[0151] Como se usa en el presente documento, la frase "expresión transitoria" se refiere a la expresión temporal de genes que se expresan durante un tiempo corto después de que un ácido nucleico, más frecuentemente ADN plasmídico que codifica un casete de expresión, se haya introducido en las células hospedantes o plantas. Como se usa en el presente documento, la frase "expresión estable" se refiere a la expresión de genes que se expresan de forma continua en el tiempo después de que un ácido nucleico, más frecuentemente ADN plasmídico que codifica un casete de expresión, se haya introducido en el genoma de las células hospedantes (integración nuclear o de plástidos). En células transfectadas de forma estable, el gen extraño pasa a formar parte del genoma y, por lo tanto, se replica.

[0152] Tanto la expresión transitoria como la estable podrían inducirse mediante un "promotor inducible". Estos promotores expresan selectivamente una secuencia de ADN unida operativamente después de la presencia de un estímulo endógeno o exógeno o en respuesta a señales químicas, ambientales, hormonales y/o de desarrollo. Estos elementos reguladores son, sin limitación, sensibles al etanol, calor, luz, estrés, jasmona, ácido salicílico, fitohormonas, sal, inundaciones o sequía, según lo revisado por Abdel-Ghany et al. (2015) y discutido en el documento US 10344290 B2. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, los componentes sintéticos discutidos en Ali et al. (2019). El géneroNicotianaabarca las plantas de tabaco. Las plantas o células vegetales de tabaco ya se han ensayado para producir proteínas de fusión ligante-toxina inmunoterapéuticas recombinantes compuestas por un fragmento de sFV pequeño unido a una toxina proteica con un conector estable (Francisco et al. (1997), y US6140075A.

[0153] Otro ejemplo de fusión de proteínas es la producción transitoria enNicotiana benthamianade la inmunocitocina IL2 humana fusionada de forma recombinante con un scFv-Fc por medio de un conector no escindible (Marusic et al. (2016). Sin embargo, la producción de un anticuerpo unido a una toxina proteica altamente potente por medio de un conector escindible nunca se ha descrito en un sistema vegetal.

[0154] Según un ejemplo adicional de la descripción, la célula vegetal es al menos una célula seleccionada del grupo que consiste en:

[0155] •Nicotiana tabacumcv. BY2,

[0156] •Nicotiana tabacumNT-1,

[0157] •Arabidopsis thaliana,

[0158] •Daucus carota, y/o

[0159] •Oyrza sativa.

[0160] Nicotiana tabacumcv. BY2 también conocidas como células BY-2 de tabaco y cv.Nicotiana tabacum1 (NT-1, una hermana de BY-2) son células vegetales no verdes de rápido crecimiento que pueden multiplicar su número hasta 100 veces en una semana en un medio de cultivo adecuado y en buenas condiciones de cultivo. Este cultivar de tabaco se mantiene como un cultivo celular y, más específicamente, como cultivo de células en suspensión (una población especializada de células que crecen en medio líquido, son cultivadas por científicos con el fin de estudiar una propiedad biológica específica de una célula vegetal). En los cultivos de células en suspensión, cada una de las células flota de forma independiente o como máximo solo en cadenas cortas en un medio de cultivo. Cada una de las células tiene propiedades similares a las demás.

[0161] El sistema de planta modelo es comparable al de las células HeLa para la investigación en seres humanos. Debido a que el organismo es relativamente simple y predecible, facilita el estudio de los procesos biológicos y puede ser una etapa intermedia hacia la comprensión de organismos más complejos. Los fisiólogos vegetales y los biólogos moleculares los usan como organismo modelo, y también los usan como sistemas modelo para plantas superiores debido a su homogeneidad relativamente alta y velocidad de crecimiento alta, que siguen caracterizando el comportamiento general de la célula vegetal. La diversidad de tipos de células en cualquier parte de una planta desarrollada de forma natural (in vivo) hace que sea muy difícil investigar y comprender algunos fenómenos bioquímicos generales de las células vegetales vivas. El transporte de un soluto dentro o fuera de la célula, por ejemplo, es difícil de estudiar porque las células especializadas de un organismo multicelular se comportan de manera diferente. Los cultivos de células en suspensión, tales como BY-2 de tabaco, proporcionan buenos sistemas modelo para estos estudios a nivel de una sola célula y sus compartimentos, porque las células BY-2 de tabaco se comportan de manera muy similar entre sí. La influencia del comportamiento de las células vecinas en la suspensión no es tan importante como lo sería en una planta intacta. Como resultado, cualquier cambio observado después de aplicar un estímulo se puede correlacionar estadísticamente y se podría decidir si estos cambios son reacciones al estímulo o simplemente una coincidencia. Las células BY-2 y NT-1 se comprenden relativamente bien y se utilizan con frecuencia en investigación, incluida la expresión de proteínas heterólogas, en particular anticuerpos (Hellwig et al (2004). Dichos métodos se describen en Häkkinen et al. (2018).

[0162] Torres (1989) analiza los métodos para establecer cultivos en suspensión de células de zanahoria (Daucus carota). Shaaltiel et al. (2007) analizan la producción de enzimas utilizando un sistema de expresión basado en células de zanahoria.Daucus carotayOryza sativatambién se analizan como sistemas de expresión adecuados basados en células vegetales en Santos et al. (2016). La producción de proteínas recombinantes enNicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana y Oryza sativase describe en Plasson et al. (2009).

[0163] En general, la presente invención se puede poner en práctica con cualquier variedad de planta para la cual las células de la planta se puedan transformar con una construcción de ADN adecuada para la expresión de un polipéptido extraño y cultivar en condiciones estándar de cultivo de células vegetales. Se prefiere el cultivo en suspensión de células vegetales o de tejidos vegetales, aunque se puede usar el cultivo de callos u otros métodos convencionales de cultivo de células vegetales.

[0164] Según otro ejemplo de la descripción, la planta esNicotiana benthamiana. La producción de anticuerpos en las plantas de Nicotiana se describe, por ejemplo, en Daniell et al. (2001).

[0165] Otras plantas o células vegetales que se pueden usar en el contexto de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, lechuga (Lactuca spp.), espinaca (Spinacia oleracea) y Arabidopsis(Arabidopsis spp).

[0166] Según un ejemplo adicional de la descripción, la etapa (i) de poner en contacto una célula vegetal o una planta entera con una construcción de ácido nucleico implica el uso de un "vector de expresión" solo o mediado porAgrobacterium tumefaciens, un vector derivado del mismo, o por bombardeo de partículas o biolística.

[0167] Como se usa en el presente documento, la frase "vector de expresión" se refiere a vectores tales como plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos, que permiten introducir una construcción de ácido nucleico en una planta o célula vegetal. Los vectores de expresión útiles en los presentes métodos son bien conocidos en la técnica. El término "vector" significa una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, que comprende elementos reguladores y un sitio para introducir la construcción de ácido nucleico.

[0168] En algunas realizaciones, los vectores se pueden basar en, pero no se limitan a, un sistema viral completo, virus deconstruido o elemento no viral. El Geneware (plataforma descrita en la patente de EE. UU. N.º 7,939,318) y MagnIcon, respectivamente, son el sistema viral completo y el sistema viral deconstruido más conocidos, descritos en Altman et al. (2011).

[0169] Normalmente los vectores virales usados se podían clasificar en vectores tanto basados en ARN como en ADN. Como ejemplo, los vectores de ARN podían incluir, sin limitación, el tobamovirus (p. ej., virus del mosaico del tabaco (TMV)), virus del mosaico del caupí (CMV), potexvirus (p. ej., virus X de la patata (PVX)) o tobravirus (p. ej., virus del cascabel del tabaco (TRV)). Los vectores de ADN se han asociado con frecuencia con el colimovirus y el geminivirus, entre los que se incluyen el mastrevirus, curtovirus, topocuvirus y begomovirus. Por ejemplo, el virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) y del enanismo amarillo del tabaco, ambos del mastrevirus, se han utilizado ampliamente.

[0170] Como alternativa, los vectores pueden basarse en elementos no virales e incluir, por ejemplo, regiones no traducidas 5' y 3' que son sintéticas (Peyret et al., 2019) o proceden de otras proteínas (Diamos, et al., 2016). Es importante señalar aquí que los vectores pueden ser replicativos o no replicativos. Además, la replicabilidad del vector podría inducirse una vez que se active el elemento regulador, como en el sistema de activación (Impact) de plantas descrito por Dugdale et al. (2013).

[0171] La transfección de Agrobacterium se describe, por ejemplo, en Mayo et al. (2006). La transfección del TMV se describe, por ejemplo, en Hussain Shah et al. (2013). El bombardeo de partículas/biolística se describen, por ejemplo, en Kikkert et al. (2005).

[0172] Es importante destacar que las ventajas del método según la invención no se limitan a las realizaciones donde se usan plantas o líneas celulares de tabaco. Por ejemplo, el hecho de que los conjugados puedan expresarse en plantas porque la planta o las células vegetales dejan intacto el conector escindible o el dominio escindible es un principio universal para las plantas que permite la expresión de los conjugados sin dañar las plantas o las células vegetales. Por lo tanto, el concepto de la presente invención es aplicable y está permitido en todas las plantas o células vegetales que pueden usarse para la expresión recombinante.

[0173] Los ácidos nucleicos se pueden expresar en plantas o células vegetales bajo el control de un promotor unido operativamente adecuado que sea capaz de expresarse en una planta o célula vegetal determinada. Se puede emplear cualquier método convencional para la transformación, cultivo y regeneración de células vegetales, incluidos, pero sin limitarse a, los descritos en los ejemplos siguientes.

[0174] Para la transformación del genoma nuclear, se pueden usar técnicas convencionales. Se pueden usar todos los medios conocidos para introducir de forma transitoria o estable ADN extraño en las células vegetales, por ejemplo, plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, electroporación, fusión de protoplastos, bombardeo con pistola de partículas o penetración de ADN en células tales como polen, microesporas, semillas y embriones inmaduros. Los vectores virales tales como los virus Gemini o los virus satélite también pueden usarse como medios de introducción.Agrobacterium tumefaciensyrhizogenesconstituyen los medios preferidos para introducir vectores de expresión. En este caso, la secuencia de la invención se introduce en un vector apropiado con todas las secuencias reguladoras necesarias, tales como promotores, terminadores y similares, así como, en el caso de la generación de plantas estables, cualquier secuencia necesaria para seleccionar los transformantes que han integrado las secuencias heterólogas. En el caso particular de expresión inducida, la secuencia de la invención se introduce en un vector que contiene el promotor inducible y todas las secuencias reguladoras necesarias.

[0175] La introducción de una molécula(s) de ácido nucleico en la célula vegetal se puede llevar a cabo de manera transitoria o estable mediante transformación del genoma nuclear, o mediante transformación del genoma del cloroplasto de la célula vegetal, o mediante transformación del genoma mitocondrial.

[0176] La transformación del genoma nuclear de la célula vegetal se lleva a cabo con frecuencia utilizando las señales de direccionamiento mencionadas anteriormente y que determinan el compartimento celular donde se producirá la expresión y/o acumulación de la proteína.

[0177] Las secuencias de direccionamiento pueden, además del péptido, comprender también una señal de retención endoplásmica, que consiste en los péptidos KDEL, SEKDEL o HEKDEL. Estas señales normalmente existen en el extremo C-terminal de la proteína y permanecen en la proteína madura.

[0178] Según una realización de la invención, el conector peptídico o el dominio escindible de la protoxina se puede escindir específica o no específicamente mediante una enzima expresada por una célula de mamífero, o una enzima que es producida por un hospedante mamífero.

[0179] Los ejemplos de dichas enzimas y sus sitios de escisión se muestran en la siguiente tabla (véase también Choi et al. (2012). En esta tabla, se hace referencia a la base de datos "Merops" para obtener más información útil sobre las enzimas respectivas. https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml.

[0181]

[0182]

[0184] El sitio de escisión se describe desde el punto del sitio de escisión (representado por<↓>). La letra x se refiere a todos los aminoácidos. Cuando hay varios aminoácidos preferenciales, están separados por una barra (/). Dicha enzima es preferiblemente una proteasa. En una realización, dicho conector peptídico no es escindible por una enzima vegetal.

[0185] La furina es una enzima que pertenece a la familia de las proproteínas convertasas de tipo subtilisina y escinde las proteínas en el extremo C del motivo de la secuencia de aminoácidos básicos canónicos Arg-X-Arg/Lys-Arg (RX(R/K)R), en donde X puede ser cualquier aminoácido proteinogénico natural. Dicho motivo se denomina un sitio de escisión de furina en el presente documento. Preferiblemente, su secuencia es HRRRKRSLDTS. Las catepsinas son proteasas que se encuentran en todos los animales así como en otros organismos. La mayoría de los miembros se activan al pH bajo que se encuentra en los lisosomas. La catepsina B es capaz de escindir una secuencia peptídica que comprende el motivo dipeptídico Val-Ala (VA). Dicho motivo se denomina un sitio de escisión de la catepsina B en el presente documento. El experto en la técnica encuentra suficiente información oportuna sobre las catepsinas y sus sitios de escisión en Turk el al. (2012).

[0186] La granzima B es una serina proteasa que escinde secuencias tetrapéptidas únicas. Existen más de 580 de dichos sitios de escisión de tetrapéptidos (Wee et al. (2011)). El tetrapéptido Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) se identificó como la secuencia óptima de escisión de tetrapéptidoin vitro. Sin embargo, los nuevos datos sobre los sustratos de la granzima B sugieren que las especificidades de escisiónin vivoson mucho más diversas, ya que numerosos sustratos poseen especificidades de escisión que van más allá de la secuencia del tetrapéptido (VanDamme et al. (2009)).

[0187] La proenzima granzima B nativa se activa por escisión con catepsina C (dipeptidil peptidasa I), en el sitio de escisión que tiene la siguiente secuencia: DAGE'IIGG. De esta manera, la enzima granzima B activada tiene un extremo N que comienza con IIGGHE, y se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, esta es la secuencia N-truncada de la enzima activada que se usa según una realización de la invención. Las caspasas (proteasas cisteína-aspárticas, aspartasas de cisteína o proteasas dirigidas por aspartato dependientes de cisteína) son una familia de enzimas proteasas que desempeñan funciones esenciales en la muerte celular programada. Se han descubierto más de 1500 sustratos de caspasas en el proteoma humano. El motivo de escisión general es DXXD-A/G/S/T, en donde X puede ser cualquier aminoácido proteinogénico natural. El experto en la técnica encuentra suficiente información oportuna sobre las caspasas y sus sitios de escisión en Kumar el al. (2014).

[0188] Las metaloproteinasas de matriz (MMP), también conocidas como matrixinas, son endopeptidasas que contienen zinc dependientes de calcio; otros miembros de la familia son las adamalisinas, serrisinas y astacinas. En conjunto, estas enzimas son capaces de degradar todo tipo de proteínas de la matriz extracelular, pero también pueden procesar varias moléculas bioactivas. El experto en la técnica encuentra suficiente información oportuna sobre las metaloproteasas de matriz y sus sitios de escisión en Eckard el al. (2016). En general, el experto en la técnica es capaz, mediante consideraciones rutinarias y referencias bibliográficas, de seleccionar sitios de escisión específicos que coincidan con la respectiva enzima de mamífero, para controlar la liberación específica en la diana de la toxina proteica o protoxina. Las directrices generales para encontrar estos sitios de escisión se describen, p. ej., en Rawlings (2016).

[0189] Según una realización de la invención, el conector peptídico o el dominio escindible de la protoxina no es escindible por una enzima expresada por una célula vegetal, o una enzima que es producida por una planta hospedante. El experto en la técnica tiene a mano un montón de métodos rutinarios para comprobar si se cumple esta condición. Véase, p. ej., Wilbers et al. (2016).

[0190] Según una realización de la invención, al menos una toxina proteica o protoxina es una enzima. Debido a que las toxinas proteicas actúan con mayor frecuencia como enzimas, una molécula de toxina puede actuar en muchas moléculas de sustrato, teniendo por lo tanto un efecto de toxicidad de multiplexación en la célula, a diferencia de las toxinas no enzimáticas, que normalmente solo funcionan de forma estequiométrica con respecto a la estructura diana.

[0191] Según una realización de la invención, la toxina proteica es al menos una del grupo seleccionado de (1) proteínas inductoras de muerte celular ("toxina de clase 1")

[0192] (2) inhibidores de la síntesis de proteínas ("toxina de clase 2")

[0193] (3) proteínas que alteran la membrana ("toxina de clase 3")

[0194] (4) proteínas que inhiben la división celular ("toxina de clase 4")

[0195] Las proteínas que inducen la muerte celular consisten, sin limitación, en proteínas que actúan directa o indirectamente en la ruta de apoptosis y/o que afectan a los componentes nucleicos. La proteína que induce la muerte celular se dirige a la proteína, ARN y ADN que media la apoptosis, en todos sus formatos, de acuerdo con las actividades proteolíticas y/o nucleolíticas.

[0196] La clase de inhibidores de la síntesis de proteínas comprende proteínas que impiden el funcionamiento adecuado del ribosoma. Esta clase está representada principalmente, sin limitación, por el grupo de proteínas de ADP-ribosilación Estas proteínas catalizaban la ADP-ribosilación del factor de elongación 2 de mamífero, conduciendo a su inactivación y bloqueo del ribosoma.

[0197] Las proteínas que alteran la membrana incluyen, pero no se limitan a, el grupo de proteínas formadoras de poros. Este grupo de proteínas inserta poros en la membrana plasmática, lo que permite el paso libre de electrolitos y otras moléculas pequeñas para alterar la integridad de la membrana conduciendo a la lisis celular. La proteína inhibidora de la división celular es un grupo de proteínas que interrumpen el ciclo celular al actuar sobre un elemento del citoesqueleto (microtúbulos, tubulina, actina) y/o sobre las proteínas que regulan la progresión del ciclo celular. La inhibición de la dinámica de microtúbulos y la alteración de la proteína dependiente de ciclina inducen la detención mitótica y conducen a la eliminación celular.

[0198] Según un ejemplo de la descripción, la toxina proteica o protoxina es una variante desinmunizada de una toxina proteica nativa. Los métodos recombinantes para desinmunizar toxinas proteicas mediante la modificación de la secuencia se describen, p. ej., en Schmohl et al. (2015) o Grinberg y Benhar (2017).

[0199] Según una realización de la invención, al menos una toxina proteica es una toxina de mamífero, preferiblemente seleccionada del grupo de las granzimas, más preferiblemente granzima B, o un fragmento de la misma que retiene la actividad tóxica de dicha toxina proteica.

[0200] Las granzimas son serina proteasas liberadas por los gránulos citoplasmáticos dentro de las células T citotóxicas y las células citolíticas naturales (NK). Inducen la muerte celular programada (apoptosis) en la célula diana, eliminando así las células que se han vuelto cancerosas o que están infectadas con virus o bacterias. Las granzimas también matan las bacterias e inhiben la replicación viral. En las células NK y T, las granzimas se empaquetan en gránulos citotóxicos con perforina. Las granzimas también se pueden detectar en el retículo endoplásmico rugoso, complejo de Golgi y retículo transgolgi. El contenido de los gránulos citotóxicos funciona para permitir la entrada de las granzimas en el citosol de la célula diana. Los gránulos son liberados en una sinapsis inmunitaria formada con una célula diana, donde la perforina media el suministro de las granzimas a los endosomas de la célula diana y, finalmente, al citosol de la célula diana. Las granzimas son parte de la familia de las serina esterasas.

[0201] La granzima B tiene tanto un efecto inductor de la muerte celular como también de inhibición de la división celular (Weidle et al. (2014). Las proteínas citolíticas granzima B inducen la apoptosis después de su liberación del endosoma. Además, la granzima B puede escindir otros sustratos de muerte tales como la poli(ADP ribosa)polimerasa, proteína quinasa dependiente del ADN, componentes del citoesqueleto y del aparato mitótico nuclear, así como las proteínas implicadas en la respuesta al estrés y la homeostasis celular.

[0202] La granzima B activa la apoptosis activando caspasas (especialmente la caspasa-3), que escinden muchos sustratos, incluida la ADNasa activada por caspasas, para producir la muerte celular. La granzima B también escinde la proteína Bid, que recluta las proteínas Bax y Bak para cambiar la permeabilidad de la membrana de las mitocondrias, produciendo la liberación del citocromo C (que es una de las partes necesarias para activar la caspasa-9 a través del apoptosoma), Smac/Diablo y OMI/Htra2 (que suprimen el inhibidor de las proteínas de apoptosis (IAP)), entre otras proteínas. La granzima B también escinde muchas de las proteínas responsables de la apoptosis en ausencia de actividad de caspasa. Las otras granzimas activan la muerte celular mediante mecanismos dependientes e independientes de caspasa.

[0203] Además de matar sus células diana, las granzimas pueden atacar y matar patógenos intracelulares. La granzima B escinde proteínas virales para inhibir la activación y replicación virales. Las granzimas se unen directamente a los ácidos nucleicos ADN y ARN; esto mejora su escisión de las proteínas que se unen a ácidos nucleicos.

[0204] En un ejemplo, dicha toxina proteica o protoxina no es tóxica para las plantas o células vegetales. El experto en la técnica tiene a mano un montón de métodos rutinarios para comprobar si se cumple esta condición. Véase, p. ej., Klaine y Lewis (1995) para una descripción general.

[0205] Según otro ejemplo, se proporciona una proteína de fusión ligante-toxina producida con un método según la descripción anterior. En ejemplos adicionales, dicha proteína de fusión ligante-toxina puede tener todas las limitaciones estructurales o funcionales expuestas en la descripción anterior. Esto incluye, en particular, el formato del ligante proteico, el conector o los sitios de escisión y la toxina específica.

[0206] Según otro ejemplo, se proporciona una proteína de fusión ligante-toxina que comprende al menos:

[0207] a) un ligante proteico seleccionado

[0208] b) opcionalmente, un conector peptídico, y

[0209] c) al menos una toxina proteica o protoxina proteica

[0210] en donde la proteína de fusión ligante-toxina es codificada por una construcción de ácido nucleico que comprende en unión operativa al menos lo siguiente:

[0211] A) al menos un polinucleótido que codifica el ligante proteico, o una cadena o dominio de unión a la diana del mismo, y

[0212] B1) un polinucleótido que codifica un conector peptídico escindible y un polinucleótido que codifica una toxina proteica, o

[0213] B2) un polinucleótido que codifica una protoxina proteica, cuya protoxina comprende un dominio escindible para la activación de la misma.

[0214] De nuevo, en realizaciones adicionales, dicha proteína de fusión ligante-toxina puede tener todas las limitaciones estructurales o funcionales expuestas en la descripción anterior. Esto incluye, en particular, el formato del ligante proteico, el conector o los sitios de escisión y la toxina específica.

[0215] Según un ejemplo, dicha proteína comprende al menos un N-glicano específico de la planta. Los N-glicanos son glicanos que están unidos al grupo amida de restos asparagina (Asn) en una proteína, principalmente en un motivo Asn-X-Thr o Asn-X-Ser (NXT o NXS), donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. Los N-glicanos específicos de plantas típicos se describen en Gomord et al. (2010), y difieren significativamente de los patrones de N-glicanos de mamíferos. Véase también la figura 7.

[0216] Según un ejemplo, el ligante proteico se une al CD20 humano. En un ejemplo, el ligante proteico es un anticuerpo, un fragmento o derivado de anticuerpo que conserva la capacidad de unión a la diana, o un mimético de anticuerpo.

[0217] En un ejemplo, el ligante comprende al menos uno de

[0218] a) un conjunto que comprende las 3 CDR de cadena pesada y las 3 CDR de cadena ligera comprendidas en rituximab (C2B8)

[0219] b) un conjunto de las CDR de cadena pesada/CDR de cadena ligera de a), con la condición de que al menos una de las CDR tenga hasta 3 sustituciones de aminoácidos con respecto a la CDR respectiva como se especifica en a), a la vez que mantiene su capacidad de unirse al CD20 humano,

[0220] c) una combinación de las CDR de cadena pesada/CDR de cadena ligera de a), con la condición de que al menos una de las CDR tenga una identidad de secuencia de ≥ 66% con respecto a la CDR respectiva como se especifica en a), a la vez que mantiene su capacidad de unirse al CD20 humano.

[0221] en donde las CDR están insertadas en una estructura proteica adecuada para poder unirse al CD20 humano. El rituximab (también conocido como C2B8) y las diferentes patentes que describen su secuencia se adjuntan en Storz U (2014).

[0222] Las secuencias de longitud completa de rituximab se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 4 (cadena pesada) y 5 (cadena ligera). Los dominios variables del rituximab se describen, por ejemplo, en la reivindicación 1 y en las figuras 4 y 5 del documento EP2000149B1.

[0223] Las secuencias que corresponden a las CDR de rituximab se describen, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 9 -14 que se muestran en el presente documento más abajo.

[0224] En algunos ejemplos, al menos una de las CDR tiene una identidad de secuencia de ≥67, preferiblemente ≥68, más preferiblemente cualquiera de ≥69, ≥70, ≥71, ≥72, ≥73, ≥74, ≥75, ≥76, ≥77, ≥78, ≥79, ≥80, ≥81, ≥82, ≥83, ≥84, ≥85, ≥86, ≥87, ≥88, ≥89, ≥90, ≥91, ≥92, ≥93, ≥94, ≥95, ≥96, ≥97, ≥98 o, lo más preferiblemente, ≥99% de identidad de secuencia con respecto a las CDR respectivas.

[0225] En otro ejemplo, al menos una de las CDR se ha modificado mediante maduración por afinidad u otras modificaciones, lo que da como resultado una modificación de secuencia en comparación con las secuencias descritas anteriormente.

[0226] En algunos ejemplos, al menos una de las CDR tiene hasta 2, y preferiblemente 1, sustituciones de aminoácidos con respecto a la CDR respectiva como se especifica en a) o b).

[0227] En un ejemplo, el ligante comprende al menos uno de

[0228] a) el par de dominios variables de cadena pesada/cadena ligera comprendido en rituximab (C2B8) b) el par de dominios variables de cadena pesada/cadena ligera de a), con la condición de que al menos uno de los dominios tiene una identidad de secuencia de ≥80% con respecto a a)

[0229] c) el par de secuencias de dominios variables de cadena pesada/cadena ligera de a), con la condición de que al menos uno de los dominios tiene hasta 10 sustituciones de aminoácidos con respecto a a), respectivamente, a la vez que mantiene su capacidad de unirse al CD20 humano.

[0230] En algunos ejemplos, al menos uno de los dominios tiene una identidad de secuencia de ≥81, preferiblemente ≥82, más preferiblemente ≥83, ≥84, ≥85, ≥86, ≥87, ≥88, ≥89, ≥90, ≥91, ≥92, ≥93, ≥94, ≥95, ≥96, ≥97, ≥98 o lo más preferiblemente ≥99% con respecto al par de dominios variables de cadena pesada/cadena ligera de rituximab (C2B8).

[0231] En algunos ejemplos, al menos uno de los dominios tiene hasta 9, preferiblemente hasta 8, más preferiblemente hasta 7, 6, 5, 4, 3 o 2 y lo más preferiblemente hasta 1 sustituciones de aminoácidos con respecto al par de dominios variables de cadena pesada/cadena ligera de rituximab (C2B8)

[0232] Según algunos ejemplos, al menos una sustitución de aminoácido en el diacuerpo monocatenario es una sustitución de aminoácido conservadora.

[0233] En un ejemplo, el ligante proteico

[0234] - tiene una afinidad de unión a la diana de ≥50% al CD20 humano, en comparación con uno de los ligantes proteicos definidos anteriormente, y/o

[0235] - compite por la unión al CD20 humano con uno de los ligantes proteicos definidos anteriormente.

[0236] Como se usa en el presente documento, la expresión "afinidad de unión a la diana" se refiere a la afinidad de una molécula de unión según la invención, por su diana, y se expresa numéricamente usando valores de "KD". En general, un valor de KD más alto corresponde a una unión más débil. En algunos casos, la "KD" se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (MA) o ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR), usando, p. ej., un BIAcore<™>-2000 o un BIAcore<™>-3000. En ciertas realizaciones, una "constante de velocidad de asociación" o "tasa de asociación" o "velocidad de asociación" o "kon" y una "constante de velocidad de disociación" o "tasa de disociación" o "velocidad de disociación" o "koff" también se determinan con la técnica de resonancia de plasmones superficiales (SPR). En realizaciones adicionales, la "KD", "kon" y "koff" se miden utilizando los sistemas Octet<®>.

[0237] Como se usa en el presente documento, la expresión "compite por la unión" se usa en referencia a uno de los anticuerpos definidos por las secuencias anteriores, lo que significa que el anticuerpo real tiene una actividad que se une a la misma diana, o epítopo diana, o dominio o subdominio, al igual que dicho anticuerpo definido por la secuencia, y es una variante de este último. La eficiencia (p. ej., cinética o termodinámica) de la unión puede ser igual o mayor o menor que la eficiencia de esta última. Por ejemplo, la constante de unión de equilibrio para la unión al sustrato puede ser diferente para los dos anticuerpos.

[0238] Como se usa en el presente documento, la expresión "mantiene la capacidad de unirse a una diana determinada" significa, por ejemplo, que la variante respectiva tiene una afinidad de unión a la diana de ≥50% en comparación con la del péptido no modificado.

[0239] En este contexto, una "sustitución de aminoácido conservadora", como se usa en el presente documento, tiene un efecto menor sobre la función del anticuerpo que una sustitución no conservadora. Aunque hay muchas formas de clasificar los aminoácidos, a menudo se clasifican en seis grupos principales según su estructura y las características químicas generales de sus grupos R.

[0240] En algunos ejemplos, una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Por ejemplo, en la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con

[0241] • cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina),

[0242] • cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico),

[0243] • cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína),

[0244] • cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano),

[0245] • cadenas laterales ramificadas en beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y

[0246] • cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

[0247] Otras sustituciones de aminoácidos conservadas también pueden producirse en familias de cadenas laterales de aminoácidos, como cuando se sustituye el ácido aspártico por una asparagina con el fin de modificar la carga de un péptido. Los cambios conservadores pueden incluir además la sustitución de aminoácidos no naturales químicamente homólogos (es decir, un aminoácido hidrófobo no natural sintético en lugar de leucina, un aminoácido aromático no natural sintético en lugar de triptófano).

[0248] El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (p. ej., un polipéptido), que no comprende adiciones o eliminaciones, para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que el resto de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico aparece en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

[0249] En ejemplos adicionales, la proteína de fusión ligante-toxina tiene una de las siguientes estructuras:

[0250] • (scFv-FC)-(sitio de escisión)-toxina/protoxina (dímero)

[0251] • tetrámero de dos HC y dos LC-(sitio de escisión)-toxina/protoxina

[0252] • tetrámero de dos LC y dos HC-(sitio de escisión)-toxina/protoxina

[0253] Dichas estructuras se muestran, por ejemplo, en la figura 9, en la que CS significa sitio de escisión y Tox significa toxina/protoxina. HC significa cadena pesada de un anticuerpo IgG, LC significa cadena ligera de un anticuerpo IgG. scFv-Fc significa una construcción scFv-Fc.

[0254] En ejemplos adicionales, la proteína de fusión ligante-toxina tiene una de las siguientes estructuras (orientación N->C):

[0255] • (scFv-FC)-CS-toxina (dímero) (->toxina unida a extremo C de la región FC) (véase la Fig.9A)

[0256] • tetrámero de dos HC y dos LC-CS-toxina (->toxina unida al extremo C de LC) (véase la Fig.9B)

[0257] • tetrámero de dos LC y dos HC-CS-toxina (->toxina unida al extremo C de HC) (véase la Fig.9C)

[0258] • toxina-CS-(scFv-Fc) (dímero) (->toxina unida al extremo N de scFv) (véase la Fig.9D)

[0259] • tetrámero de dos HC y dos toxina-CS-LC (->toxina unida al extremo N de LC) (véase la Fig.9E)

[0260] • tetrámero de dos LC y dos toxina-CS-HC (->toxina unida al extremo N de HC) (véase la Fig.9F)

[0261] • toxina-CS-(-Fc-scFv) (dímero) (->toxina unida al extremo N de FC) (véase la Fig.9G)

[0262] En este caso, CS significa "sitio de escisión", que es, en un ejemplo, un sitio de escisión de furina. En una realización, la toxina es granzima B.

[0263] Según otro ejemplo, la proteína de fusión ligante-toxina comprende al menos una de las siguientes

[0264] • la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 17

[0265] • dos secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 4 (HC de C2B8) y dos secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 6 (LC de C2B8-FCS-granzima B)

[0266] • dos secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 7 (HC de C2B8-FCS-granzima B) y dos secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 5 (LC de C2B8)

[0267] Con respecto a la primera opción, la proteína de fusión ligante-toxina puede comprender dos de dichas secuencias, asociadas entre sí por medio de al menos un enlace disulfuro.

[0268] Con respecto a la segunda y tercera opción, la proteína de fusión ligante-toxina puede comprender dos de dichos pares, conjugados entre sí por un conjunto de enlaces disulfuro.

[0269] Además, en el presente documento se describe una composición farmacéutica que comprende al menos la proteína de fusión según cualquiera de las descripciones anteriores y, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0270] Además, en el presente documento se describe una combinación que comprende (i) la proteína de fusión según la descripción anterior o la composición farmacéutica según la descripción anterior y (ii) uno o más compuestos terapéuticamente activos.

[0271] Según ejemplos adicionales, la proteína de fusión ligante-toxina según la descripción anterior, o la composición según la descripción anterior, o la combinación según la descripción anterior, se proporcionan para (la fabricación de un medicamento para) usar en el tratamiento de un sujeto humano o animal

[0272] • que padece de,

[0273] • está en riesgo de desarrollar, y/o

[0274] • se le diagnostica,

[0275] el desarrollo de una enfermedad neoplásica, o para la prevención de dicha afección.

[0276] A este respecto, es importante destacar que los N-glicanos producidos por las plantas son notablemente diferentes de los producidos, p. ej., en mamíferos. En particular, los N-glicanos producidos por las plantas de tabaco tienen

[0277] - un resto fucosa conjugado con el resto N-acetil-glucosamina proximal a través de un enlace glucosídico α3 (en lugar de α6 como en los mamíferos)

[0278] - un resto xilosa conjugado con el resto manosa proximal a través de un enlace glucosídico β2

[0279] - dos restos N-acetil-glucosamina distales, cada uno de los cuales lleva un resto fucosa a través de un enlace glucosídico α3 y un resto galactosa a través de un enlace glucosídico β3 (en lugar de un ácido neuramínico en mamíferos).

[0280] Por otro lado, las proteínas expresadas de forma recombinante, p. ej., en las algas a menudo carecen de cualquier tipo de glicosilación. Sin embargo, las algas son capaces de expresar anticuerpos con forma de IgG o fragmentos de anticuerpos que tienen uno o más puentes disulfuro.

[0281] Por lo tanto, un conjugado ligante-toxina producido por el nuevo método descrito anteriormente también tiene características estructurales novedosas frente a un conjugado ligante-toxina producido en un sistema de expresión diferente. Véase, por ejemplo, la figura 7 para una ilustración de un N-glicano producido por plantas de tabaco.

[0282] Ejemplos

[0283] Si bien la invención se ha ilustrado y descrito en detalle en los dibujos y la descripción anterior, dicha ilustración y descripción deben considerarse ilustrativas o ejemplares y no restrictivas; la invención no se limita a las realizaciones descritas. Los expertos en la técnica pueden entender y realizar otras variaciones de las realizaciones descritas en la práctica de la invención reivindicada, a partir del estudio de los dibujos, la descripción y las reivindicaciones adjuntas. En las reivindicaciones, la palabra "que comprende" no excluye otros elementos o etapas, y el artículo indefinido "un" o "una" no excluye una pluralidad. El mero hecho de que algunas mediciones se mencionen en reivindicaciones dependientes diferentes entre sí no indica que una combinación de estas mediciones no pueda usarse con ventaja. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no debe interpretarse como limitativo del alcance.

[0284] Todas las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento se muestran del extremo N al extremo C; todas las secuencias de ácidos nucleicos descritas en el presente documento se muestran 5'->3'. Materiales y métodos

[0285] Construcción genética

[0286] Se han usado secuencias de HC y LC de rituximab de longitud completa para desarrollar proteínas de fusión ligante-toxina basadas en mAb. Secuencias de las partes variables de las cadenas pesada y ligera de las secuencias de rituximab se han ensamblado en un scFv monocatenario y fusionado con una secuencia de la parte Fc de IgG1 humana. Después se usó una secuencia de escisión de furina humana para fusionar la secuencia de granzima B humana con la parte C-terminal de la LC o la HC del rituximab de longitud completa o con la parte C-terminal del scFv-Fc para obtener las secuencias de proteínas de fusión HC LC-FCS-granzima B, HC-FCS-granzima B LC y scFV-c-FCS-granzima B. Se realizó otra proteína de fusión ligantetoxina con la parte scFv-Fc unida a granzima B sin sitio de escisión para obtener scFv-Fc-granzima B. Estas secuencias se produjeron por síntesis génica flanqueadas por XbaI e IsceI.

[0287] La cadena principal del plásmido binario pPZP200 se usó para construir un nuevo plásmido binario pPZP-ATB que contenía consecutivamente un casete de resistencia a la kanamicinanptII, uno (formato scFv-Fc) o dos (formato mAb) casete(s) de expresión de genes de interés y un casete de expresión de GFP. Los ORF que codifican HC y LC de rituximab, LC-FCS-GB, HC-FCS-GB, scFv-Fc-FCS-GB, scFv-Fc-GB se introdujeron en los plásmidos binarios apropiados entre el promotor p35S (p35S) del virus del mosaico de la coliflor y el terminador de la nopalina sintasa de Agrobacterium (tNOS) utilizando XbaI e IsceI. También se generó una versión del plásmido binario pPZP-ATB que incluía un casete de expresión del gen p19 del virus del enanismo ramificado del tomate entre los casetes del gen de interés y de GFP.

[0288] Expresión transitoria en hojas de la plantaNicotiana benthamiana

[0289] Nicotiana benthaminanacultivada en un ciclo de luz de 16 h de luz/8 h de oscuridad, 22 /- 3°C. Las hojas de las plantas de 7-8 semanas de edad se transformaron transitoriamente mediante infiltración con jeringa. LasAgrobacterium tumefaciensLBA4404 (pBBR1MCS-5.virGN54D) o GV3101 (pMP90RK) que albergaban los plásmidos binarios pPZP-ATB-scFv-Fc-F-GB o pPZP-ATB-scFv-Fc-F-GB-p19 que alcanzaron una densidad óptica a 600 nm (DO<600>) de aproximadamente 0,8-1,0 se recolectaron mediante centrifugación a 3500g durante 10 min. Finalmente, las bacterias se ajustaron a una DO<600>de 0,5 en tampón de infiltración (MgCl210 mM, MES 10 mM, acetosiringona 100 µM, pH 5,6) y la mezcla se infiltró utilizando una jeringa sin aguja. Las regiones infiltradas se recolectaron 4 y 6 días después de agroinfiltración. Las hojas enteras recolectadas 4 días después de agroinfiltración se usaron para la purificación de la proteína A.

[0290] Expresión en células deN. tabacum

[0291] Células en suspensión de la plantaNicotiana tabacumse cultivaron 5 días a 130 rpm, 25°C en medios de cultivo de plantas como describen Nagata et al. (1992). LasAgrobacterium tumefaciensLBA4404 (pBBR1MCS-5.virGN54D) que albergaba los plásmidos binarios pPZP-ATB que alcanzaron una densidad óptica a 600 nm (OD<600>) de aproximadamente 0,8-1,0 se recolectaron por centrifugación a 2000g durante 5 min. Luego, las células vegetales y bacterianas se cultivaron conjuntamente en medios de cocultivo durante 30 min antes de una centrifugación de 2000g 5 min. Después de separar el líquido sobrenadante, las células se sembraron en placa en medios de cocultivo sólidos durante dos días. En el caso de transformación transitoria, las células después se recogieron y se lavaron tres veces y se cultivaron en medios de cultivo de plantas que contenían cefotaxim y carbeniclina antes de recolectarlas para su posterior análisis. En el caso de transformación estable, después de 2 días de cocultivo sólido, las células se lavaron y se sembraron en placa en medios vegetales que contenían los antibióticos kanamicina selectiva y cefotaxim y carbenicilina. Los callos se seleccionaron 4 semanas después y se subcultivaron en medios sólidos o en cultivos en suspensión líquida para su posterior análisis.

[0292] Análisis de proteínas: ELISA, SDS-PAGE y transferencia Western

[0293] Los tejidos de las hojas recogidas (120 mg) se trituraron en 400 μl de tampón de extracción (sorbitol 250 mM, Tris 60 mM, Na2EDTA, Polyclar AT al 0,6%, PMSF 1 mM, pH 8,0, complementados con 2 μg/ml de cada uno de los inhibidores de proteasa: leupeptina, aprotinina, antipaína, pepstatina A, quimostatina). El tejido homogeneizado se centrifugó a 4°C durante 40 min a 18.200g. Después se recuperó el líquido sobrenadante, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -20°C.

[0294] El tejido extraído se analizó por transferencia Western. Las proteínas se hirvieron durante 5 min en tampón de carga de SDS reductor o no reductor (Tris-HCl 80 mM, pH 6,8, SDS al 2%, glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0,005% complementado con PMSF 1 mM y cóctel de inhibidores de proteasa: 2 µg/ml de cada uno de leupeptina, aprotinina, antipaína, quimostatina y pepstatina), se centrifugaron durante 5 min a 13.000 rpm y se separaron por SDS-PAGE (poliacrilamida al 4-20%). Para la transferencia Western, las proteínas se electrotransfirieron sobre una membrana de PVDF (Biorad) usando un dispositivo electroforético semiseco (Biorad Trans-Blot Turbo); luego, la membrana se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente con leche en polvo desnatada al 3% (p/v) en tampón TBST (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,5%, pH 7,5) y luego se incubó (TBS-Tween al 0,1% leche en polvo desnatada al 0,5%) durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos conjugados con HRP contra la región específica Fc anti-IgG humana (A0170; Sigma-Aldrich), a una dilución de 1:10.000 o anticuerpo primario contra la granzima B humana (EPR20129-217; Abcam) a una dilución de 1:10.000. Al anticuerpo anti-granzima B le siguieron los anticuerpos anti-conejo conjugados con HRP (0545; Sigma), a una dilución de 1:10.000. Las proteínas se detectaron por quimioluminiscencia mejorada (Amersham Imager 600/GE; GE Healthcare).

[0295] ELISA anti-CD20

[0296] Para el análisis de especificidad del conjugado anti-CD20, los extractos de plantas se analizaron mediante microplacas de 96 pocillos (Greiner) que se recubrieron con 100 μl de CD205 μg/ml (AcroBioSystems) durante 2 h a 37°C y luego se lavaron 5 veces en tampón de lavado (TBS Tween al 0,1%). Después se llevó a cabo el bloqueo con 200 µl de BSA al 1% en TBS a pH 8,0 durante 30 min a TA y luego se lavó 5 veces. Se cargaron 100 µl de anticuerpo de control anti-CD20 para hacer una curva de calibración de entre 5 y 0 µg/ml y se cargaron muestras de 100 µl en las mismas placas de 96 pocillos para comparación durante 2 h a TA y luego se lavaron 5 veces. Se cargaron 100 µl de anticuerpo de detección diluido 1/150.000 (anti-HRPO humano de cabra, Bethyl) y se incubaron 1 h a TA. Después se llevó a cabo el revelado con 100 µl de tampón de reacción TMB (Zentech) durante 30 min y, finalmente, finalizador con H<3>PO<4>1 M. La actividad enzimática se analizó luego por espectrometría a 450 nm.

[0297] ELISA adicional

[0298] Para el análisis de especificidad de un conjugado específico para un antígeno no descrito (estructura expresada en la superficie de células humanas y sobreexpresada en algunos cánceres, denominado en el presente documento antígeno X), se analizó una proteína de fusión ligante-toxina purificada que comprendía un ligante contra X mediante microplaca de 96 pocillos (Greiner). Los pocillos se recubrieron con 50 µl de antígeno X (2,5 µg/ml) durante 1 h a 37°C y luego se lavaron 5 veces con 250 µl de tampón de lavado (PBS Tween al 0,1%). A continuación, se realizó el bloqueo con 150 ml de hidrocaseína (3,6%) en PBST durante 30 min a TA y luego se lavó 5 veces. Se cargaron 50 µl de anticuerpo de control anti-antígeno para hacer una curva de calibración entre 5 y 0 µg/ml y se cargaron muestras de 50 µl en las mismas placas de 96 pocillos para comparación durante 1 h a TA y luego se lavaron 5 veces. Se cargaron 50 µl de anticuerpo de detección diluido 1/200.000 (anti-HRPO humano de cabra, Bethyl) y se incubaron 1 h a TA. Después se llevó a cabo el revelado con 50 µl de tampón de reacción TMB (Zentech) durante 15 min y, finalmente se detuvo con H<3>PO<4>1 M. La actividad enzimática se analizó luego por espectrometría a 450 nm. Los resultados se muestran en la Fig.4B.

[0299] Purificación de proteína A

[0300] Cuatro días después de agroinfiltración, las hojas se recogieron, pesaron y trituraron en una mezcladora usando 2 ml de tampón de extracción (sorbitol 250 mM, Tris 60 mM, Na2EDTA, Polyclar AT al 0,6%, PMSF 1 mM, pH 8,0 complementado con 2 µg/ml de cada uno de los inhibidores de proteasa: leupeptina, aprotinina, antipaína, pepstatina A, quimostatina) por gramo de hojas agroinfiltradas recientes. La mezcla después se filtró a través de una capa doble de Miracloth (Millipore). El filtrado después se centrifugó a 4°C durante 30 min a 20.000g. El líquido sobrenadante después se cargó sobre una resina de proteína A preequilibrada con tampón de extracción. La resina después se lavó con 10 volúmenes de columna de Tris 60 mM a pH 8,0 y la elución se realizó usando glicina 100 mM a pH 3,0 directamente tamponada con Tris 1 M al 10% a pH 8,0. Las fracciones de proteína enriquecidas después se recogieron y se congelaron en nitrógeno líquido.

[0301] Ensayo de citotoxicidadin vitro

[0302] Los efectos del anticuerpo anti-CD20 rituximab y de conjugados basados en rituximab en células diana Raji (CD20+) y células no diana Loucy (CD20) se evalúan por un ensayo de citotoxicidadin vitro(MTT). En resumen, las líneas celulares Raji y Loucy se cultivan y resuspenden a una densidad de 1.10<5>células/50 µl en medio de cultivo exento de FBS y 50 µl de la suspensión celular se distribuyeron en una placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, el rituximab y los conjugados que comprenden este último se incuban con las células en diversas concentraciones durante 6, 24 y 48 h a 37°C, con 5% de CO<2>. Para cada punto temporal, la citotoxicidad se evalúa usando un kit de ensayo MTT (Roche). La viabilidad celular se calcula midiendo la absorbancia a 550 nm. Se calculó la media de viabilidad para ensayos por triplicado.

[0303] Ensayo adicional de citotoxicidadin vitro

[0304] Se analizó el efecto de una proteína de fusión ligante-toxina purificada que comprende un ligante contra el antígeno X no descrito sobre la viabilidad de líneas celulares y se evaluó usando el reactivo de proliferación celular WST-1 (Merck, 5015944001). El WST-1 (disulfonato de 4-[3-(4-yodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benceno) es el sustrato para las deshidrogenasas mitocondriales y se escinde en formazán. La cantidad de colorante formazán formado se correlaciona directamente con el número de células metabólicamente activas en el cultivo.

[0305] Las células se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocillos a una densidad de 30.000 células/pocillo en 50 ml de medio de crecimiento. Las diluciones de la proteína de fusión ligante-toxina o tampón se prepararon añadiendo 10 ml de proteína de fusión ligante-toxina o tampón a 40 ml de medio de crecimiento y la mezcla se incubó en las células. Las proteínas de fusión ligante-toxina se ensayaron por duplicado. El tampón y el control positivo (Tritón al 2% y DMSO al 5%) se ensayaron por triplicado.

[0306] Después de 72 h de incubación a 37°C con 5% de CO<2>, se añadieron 10 ml del reactivo de proliferación celular WST-1 (Merck, 5015944001) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 4 h adicionales a 37°C y 5% de CO<2>. El colorante formazán se cuantificó leyendo la DO de las placas a 450 nm y 690 nm para restar el fondo. Para determinar el % de viabilidad de las células no tratadas y las células tratadas con proteína de fusión ligante-toxina y controles positivos, se calculó el valor de DO promedio de los pocillos tratados con tampón (DO<450 nm>-DO<690 nm>) y se ajustó a una viabilidad de 100%. Los resultados se muestran en la Fig.4A.

[0307] Análisis de glicoformas peptídicas

[0308] Para demostrar que las proteínas de fusión ligante-toxina preparadas con el método según la presente invención son estructuralmente diferentes de las proteínas de fusión ligante-toxina preparadas en otros sistemas de expresión, como, p. ej., en mamíferos, se analizaron las glicoformas de los péptidos EEQYNSTYR y (NFSNDIMLLQLER, que comprendían ambos un sitio de N-glicosilación marcado en negrita, descritos como SEQ ID NO 15 y 16 en el presente documento, y que están comprendidos en algunas de las proteínas de fusión ligante-toxina descritas en el presente documento) preparadas con diferentes cepas deNicotiana benthamiana. ATB_3 y ATB_4 son de tipo natural, mientras que para ATB_22 y ATB_24 se redujo la expresión mediante ARNi de los genes endógenos de β1,2-xilosiltransferasa (XylT o XT) y α1,3-fucosiltransferasa (FucT o FT) (para los métodos, véase Strasser et al (2008).

[0310]

[0312] En resumen, las muestras se digirieron en solución. Las proteínas se alquilaron en S con yodoacetamida y se digirieron con tripsina (Promega).

[0313] Las muestras digeridas se cargaron en una columna BioBasic C18 (BioBasic-18, 150 x 0,32 mm, 5 µm, Thermo Scientific) usando tampón de formiato de amonio 80 mM como disolvente acuoso. Se aplicó un gradiente de 5% de B (B: ACCN al 80%) a 40% de B en 45 minutos, seguido de un gradiente de 15 min de 40% de B a 90% de B que facilita la elución de péptidos grandes, con un caudal de 6 µl/min. La detección se realizó con un QTOF MS (Bruker maXis 4G) equipado con la fuente ESI estándar en modo DDA, de ion positivo (= se cambia al modo MSMS para eluir los picos). Se registraron los barridos de MS (intervalo: 150-2200 Da) y los 3 picos más altos se seleccionaron para la fragmentación. La calibración del instrumento se realizó usando una mezcla de calibración ESI (Agilent). Los tres posibles glicopéptidos se identificaron como conjuntos de picos que consisten en el grupo peptídico y el N-glicano unido que varían en el número de unidades de HexNAc, restos hexosa, desoxihexosa y pentosa. Las masas teóricas de estos glicopéptidos se determinaron con una hoja de cálculo usando las masas monoisotópicas para los aminoácidos y monosacáridos.

[0314] Las búsquedas manuales de glicopéptidos se hicieron utilizando DataAnalysis 4.0 (Bruker). Para la cuantificación de las diferentes glicoformas, las áreas de los picos de los EIC (cromatogramas de iones extraídos) de los cuatro primeros picos isotópicos

[0315] Ensayos de escisión

[0316] La capacidad de escisión que permite la liberación de la toxina se ha demostradoin vitrotras la adición de furina recombinante a scFv-Fc-FCS-GB purificada (proteína de fusión ligante-toxina). La reacción se llevó a cabo durante la noche a 25 grados después de la adición de 25 unidades/ml de furina (NEB P8077S) a 6 microgramos de proteína de fusión ligante-toxina en 35 µl de tampón de escisión (Hepes 20 mM, Triton X-100 al 0,1%, CaCl2 1 mM, pH 7,5). La escisión se ha visualizado por SDS Page con gel azul Coomassie (poliacrilamida al 4-20%). Se usó un ligando inductor de proliferación (APRIL) de ratón como control de la escisión por la furina. APRIL (SRP3189 - Sigma-Aldrich, 20 µg de proteína liofilizada) se resuspendió en 20 µl de agua que contenía BSA al 0,1%.

[0317] Resultados

[0318] En este estudio, los autores de la invención diseñaron varias proteínas de fusión ligante-toxina recombinantes compuestas por un grupo de unión fusionado con una toxina mediante un conector escindible y se expresaron con éxito en células vegetales o plantas enteras. Como grupos de unión se usaron el mAb de longitud completa basado en rituximab (C2B8), el formato scFv-Fc y el formato scFv. El rituximab y su secuencia se describen en Storz (2014). La secuencia de escisión de la furina (FCS) que tiene la secuencia de aminoácidos HRRRKRSLDTS se usó como conector escindible. También se usó otra proteína de fusión ligante-toxina construida con scFv-Fc unido de forma recombinante a la granzima B nativa sin secuencia de escisión como ejemplo de conectores recombinantes no escindibles. La granzima B humana se usó como ejemplo de carga activa. La posición de la carga activa puede variar en el grupo de unión. En este estudio, se ilustró la fusión de la granzima B en el extremo C de las cadenas pesadas o ligeras de un mAb de longitud completa.

[0319] Se han construido varias proteínas de fusión ligante-toxina recombinantes basadas en el formato scFv-Fc: scFv-Fc-FCS-Granzima B, scFv-Fc-Granzima B, también se construyó scFv-Fc solo como control. Se han construido dos proteínas de fusión ligante-toxina basadas en mAb de longitud completa: HC+LC-FCS-Granzima B, HC-FCS-Granzima B+LC. También se construyó el mAb no conjugado solo como control.

[0320] La siguiente tabla resume los conjugados producidos en el presente documento:

[0322]

[0324] La secuencia de ADN de cada construcción de ADN se optimizó respecto a los codones vegetales y se introdujo en un vector de transformación binario de Agrobacterium pPZP-ATB entre el promotor p35S (p35S) del virus del mosaico de la coliflor y el terminador de la nopalina sintasa de Agrobacterium (tNOS). Los enfoques para la optimización de codones en las plantas de tabaco se describen en Rouwendal et al. (1997).

[0325] La misma construcción también se introdujo en un pPZP-ATB-p19 que llevaba un casete de expresión complementario para el gen supresor de silenciamiento p19. En este ejemplo, se insertó un casete adicional de neomicina fosfotransferasa II (nptII) de resistencia a la kanamicina para una selección estable de clones. Todas las construcciones se sometieron a electroporación enAgrobacterium tumefaciensLBA4404 o GV3101. Sistema de expresión de plantas enteras

[0326] Las cepas de Agrobacterium se usaron por primera vez para transformar transitoriamenteNicotiana benthamianapor agroinfiltración con jeringa con una construcción que codificaba un conjugado scFv-Fc-F-granzima B. Los extractos de tejido vegetal agroinfiltrado se analizaron luego por transferencia Western usando anticuerpos anti-parte Fc de IgG humana (Figura 1) después de 4 y 6 días post-agroinfiltración (dpa). Se evaluó el impacto del uso de las cepas deAgrobacterium tumefaciensLBA4404 o Agrobacterium GV3101 así como del día de recolección y coexpresión de p19 en la expresión de la proteína de fusión. La proteína de fusión es expresada y parece prácticamente intacta después de 4 días post-agroinfiltración cuando se expresa usando la cepa deAgrobacterium tumefaciensLBA4404 (Fig.1, carriles 1 y 2). Parece que aparece más producto de degradación después de 6 días post-agroinfiltración o usando la cepa GV3101. La adición del gen supresor de silenciamiento p19 parece no tener efecto en la expresión cuando la lleva a cabo la cepa LBA4404 (Figura 1, carriles 2 y 4) en comparación con la GV3101 que muestra expresión solo en presencia de p19 (Figura 1, carriles 6 y 8). En cuanto al tiempo de la recolección, aparecen más fragmentos de degradación después de 6 días post-agroinfiltración (Figura 1, carriles 3, 4 y 8).

[0327] La proteína de fusión scFv-Fc-FCS-granzima B está compuesta por dos formas monoméricas de 80 kDa, que dan como resultado una forma dimérica completa de aproximadamente 160 kDa. Cada componente monomérico se ha identificado por transferencia Western en extractos de proteínas después de la infección porAgrobacterium tumefaciensLBA4404, como se usa en la figura 1 (panel izquierdo), usando un mAb de detección específico dirigido contra la parte Fc de IgG humana (Figura 2, izquierda) o la granzima B humana (Figura 2, derecha) en condiciones reductoras (+DTT) y no reductoras (-DTT). La detección del scFv-Fc-FCS-granzima B de tamaño completo (Figura 2) se confirma por la detección de una señal a aproximadamente 250 kDa usando el anti-parte Fc de IgG (panel izquierdo, -DTT) y por la detección de una señal del mismo tamaño (panel derecho, -DTT) usando un anticuerpo anti-granzima B. Obsérvese que las IgG de suero humano de aproximadamente 150 kDa también dan como resultado una señal a aproximadamente 250 kDa. En condiciones reductoras, la forma monomérica también es detectada tanto por el anticuerpo anti-Fc de IgG como por el anticuerpo anti-granzima B con una señal entre 70 y 100 kDa (indicada por Δ en el panel izquierdo y derecho) cerca del tamaño esperado del monómero de 80 kDa.

[0328] Otros formatos de proteínas de fusión ligante-toxina se han expresado transitoriamente enNicotiana benthamianautilizandoAgrobacterium tumefaciensLBA4404, los extractos de hojas de plantas se presentan en la Figura 3. scFv-Fc-FCS-granzima B, scFv-Fc-granzima B se detectan en el tamaño esperado. Además, la proteína de fusión ligante-toxina basada en el mAb completo HC-FCS-Granzyme B+ LC también se detecta en el tamaño esperado.

[0329] Sistema de expresión de células vegetales

[0330] Las cepas de Agrobacterium también se usaron para transformar transitoriamente células deNicotiana tabacumcv. amarillo brillante-2 (células BY-2). Se han expresado transitoriamente diferentes proteínas de fusión ligantetoxina enNicotiana tabacumcv. BY-2. Los extractos intracelulares después se analizaron por transferencia Western usando un anti-Fc de IgG humana.

[0331] La expresión de la identidad scFv-Fc-Fcs-granzima B se ha confirmado en la figura 5, la proteína de fusión dimérica de tamaño completo es detectada a un tamaño de aproximadamente 250 kDa por el anticuerpo antiparte Fc de IgG humana y el anti-granzima B.

[0332] Estas proteínas de fusión ligante-toxina también se pueden expresar de manera estable en células vegetales en suspensión. Como un ejemplo, se llevó a cabo una transformación estable de células vegetales deNicotiana tabacumcv. BY-2 mediante cocultivo con la cepa de Agrobacterium. En este caso, el casete de resistencia a la kanamicina se usó para seleccionar clones de células vegetales estables. La figura 6 muestra la presencia de la proteína de fusión ligante-toxina scFv-FCS-granzima B en las células vegetales en suspensión estables en el tamaño integral esperado, lo que indica que este tipo de molécula puede ser expresada de manera estable en el sistema de células vegetales.

[0333] Una nueva proteína de fusión ligante-toxina compuesta por un scFv-Fc, un sitio de escisión de furina y una toxina de entre la familia de toxinas 2 (scFv-Fc-FCS-TOX2) también se expresó con éxito en células vegetales (Figura 8, panel izquierdo) y en la planta entera (Figura 8, panel derecho). TOX2 es una toxina de clase 2 como se describe en el presente documento (inhibición de síntesis de proteínas). La proteína de fusión ligante-toxina de tamaño completo se detecta a su tamaño esperado, que es similar al scFv-Fc-FCS-granzima B ya presentado anteriormente.

[0334] En conjunto, estos datos confirman que las proteínas de fusión ligante-toxina compuestas por un ligante proteico unido mediante una secuencia humana escindible a una carga activa proteica citotóxica se pueden producir en plantas enteras o sistemas de células vegetales.

[0335] La función de unión del conjugado scFv-Fc-GB producido en células vegetales se ha evaluado por ELISA anti-CD20, y tiene una afinidad comparable con la del rituximab (datos no mostrados). También se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro en células CD20+ (células Raji). Se espera una citotoxicidad similar o mejorada en comparación con la de rituximab. Estos resultados sugieren que la parte Fc del scFv-Fc-GB es funcional y presenta citotoxicidad biológica en las células diana.

[0336] Análisis de glicoformas peptídicas

[0337] En la Fig.10, se muestran los espectros de MS de los glicositios (EEQYNSTYR yNFSNDIMLLQLER) (SEQ ID NO 15 y 16), comprendidos en algunos de los péptidos de fusión ligante-toxina descritos en el presente documento.

[0338] Las principales glicoformas identificadas eran glicanos de tipo complejo (GnGn/GnGnXF). También se detectaron otras glicoformas (Man5-Man9, GnGnF, GnGnX, MMXF, Man5Gn y GnM(X)(F)). La tabla 1 indica las estructuras y sus proporciones relativas. Todas las muestras contenían péptido no glicosilado.

[0339] Las alturas de los picos en los espectros de MS reflejan aproximadamente las relaciones molares de las glicoformas (hay que indicar que hay más de un estado de carga por glicoforma). EnError No se pudo encontrar la fuente de referencia.y en la Tabla 2 se muestra la cuantificación de las diferentes glicoformas (cuantificada mediante la integración del EIC de los 4 primeros picos isotópicos). Para una explicación de las abreviaturas de las diferentes glicoformas, véase Strasser et al. (2008).

[0340]

[0342] Proporción de glicoformas en % para EEQYNSTYR

[0344]

[0346] Proporción de glicoformas en % para NFSNDIMLLQLER

[0347] Por favor, obsérvese que se da un posible isómero y que el método usado solo da la composición de los glicanos. Para los nombres de los glicanos, se usó la nomenclatura de los proglicanos (http://www.proglycan.com/protein-glycosylation-analysis/nomenclature). Véase también el documento de referencia "What's your name, sugar ? - A simple abbreviation system for complex N-glycan structures" Según esta nomenclatura, MGnX significa, por ejemplo

[0350]

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[0402] Abreviaturas como se usan en el presente documento

[0403] HC = cadena pesada del anticuerpo

[0404] LC = cadena ligera del anticuerpo

[0405] TOX = Toxina

[0406] CS = sitio de escisión

[0407] FCS = Sitio de escisión de furina

[0408] LINK = Conector/sitio de escisión

[0409] LINK2: Conector de clase 2 (= sitio de escisión citosólica),

[0410] LINK3: Conector de clase 3 (= sitio de escisión de superficie celular)

[0411] GB = Granzima B

[0412] TOX2: Toxina de clase 2 (= inhibición de la síntesis de proteínas),

[0413] TOX3: Toxina de clase 3 (= proteína que altera la membrana),

[0414] scFv: formato de cadena única

[0415] scFv-FC: formato scFv-FC

[0416] Secuencias

[0417] Las siguientes secuencias forman parte de la descripción de la presente solicitud. También se proporciona con esta solicitud una lista de secuencias electrónica compatible con el sistema ST 25 de la OMPI. Para evitar dudas, si existen discrepancias entre las secuencias de la tabla siguiente y la lista de secuencias electrónica, se considerará que las secuencias de esta tabla son las correctas.

[0418]

[0419]

[0420]

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una proteína de fusión ligante-toxina que comprende al menos:

a) un ligante proteico seleccionado del grupo que consiste en

- un anticuerpo

- un fragmento o derivado de anticuerpo que conserva la capacidad de unión a la diana, o

- un mimético de anticuerpo,

y ya sea

b1) un conector peptídico escindible y una toxina proteica, o

b2) una protoxina proteica que comprende un dominio escindible,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) poner en contacto una célula vegetal o una planta entera hospedante con una construcción de ácido nucleico que comprende en unión operativa al menos lo siguiente

A) al menos un polinucleótido que codifica el ligante proteico, o una cadena o dominio de unión a la diana del mismo, y

B1) un polinucleótido que codifica un conector peptídico escindible y un polinucleótido que codifica una toxina proteica, o

B2) un polinucleótido que codifica una protoxina proteica, cuya protoxina comprende un dominio escindible para la activación de la misma,

(ii) permitir que la construcción se integre en el núcleo de la célula vegetal, o de una o más células de la planta entera, y

(iii) expresar la proteína de fusión codificada por la construcción de ácido nucleico,

en donde el conector peptídico o el dominio escindible de la protoxina no es escindible por una enzima expresada por la célula vegetal, o una enzima que es producida por la planta hospedante.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de

(iv) recuperar y/o purificar la proteína de fusión expresada en la etapa (iii).

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriormente mencionadas, en donde la planta o célula vegetal es del géneroNicotiana.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriormente mencionadas, en donde el conector peptídico o el dominio escindible en la protoxina es escindible específica o no específicamente por una enzima expresada por una célula de mamífero, o una enzima que es producida por un hospedante mamífero.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriormente mencionadas, en donde el conector escindible o el dominio escindible en la protoxina comprende al menos un sitio de escisión seleccionado del grupo que consiste en

a) Sitio de escisión de proteasas endosómico y/o lisosómico

b) Sitio de escisión de proteasa citosólico, y/o

c) Sitio de escisión de proteasas de la superficie celular.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriormente mencionadas, en donde al menos una toxina proteica o protoxina es una enzima.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriormente mencionadas, en donde la toxina proteica es al menos una del grupo seleccionado de

(1) Proteínas inductoras de muerte celular

(2) Inhibidores de la síntesis de proteínas

(3) Proteínas que alteran la membrana

(4) Proteínas inhibidoras de la división celular

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriormente mencionadas, en donde al menos una toxina proteica es una toxina de mamífero, preferiblemente seleccionada del grupo de granzimas, más preferiblemente granzima B, o un fragmento de la misma que retiene la actividad tóxica de dicha toxina proteica.