ES3055366T3

ES3055366T3 - Methods and compositions for preserving bacteria

Info

Publication number: ES3055366T3
Application number: ES17863799T
Authority: ES
Inventors: Daniel Couto; Shilpa Reddy; Jil Ulrich; Scott Michonski
Original assignee: Vedanta Biosciences Inc
Current assignee: Vedanta Biosciences Inc
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2026-02-11
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: US12460175B2; EP3532644A1; AU2024213141A1; EP4660295A3; JP7105768B2; US20200002664A1; EP4660295A2; EP3532644A4; EP3532644B1; AU2017347870A1; US11447738B2; US20230159883A1; WO2018081550A1; US20240141283A1; US11814615B2; AU2017347870B2; CA3041677A1; JP2019532665A

Abstract

La divulgación proporciona métodos y composiciones para la conservación de bacterias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos y composiciones para conservar bacterias

[0003] Campo de la invención

[0004] La divulgación proporciona métodos y composiciones para la conservación de bacterias.

[0005] Antecedentes

[0006] El microbioma intestinal humano incluye un gran número de microorganismos. Un número significativo de estos microorganismos son bacterias anaerobias. Las composiciones que incluyen bacterias anaerobias que se originan a partir del microbioma intestinal humano han mostrado potencial en el tratamiento de enfermedades humanas (véanse, por ejemplo, Atarashiet al., Nature 500, 232, 2013; Atarashiet al., Cell 163, 1, 2015; Mathewsonet al., Nature Immunology 17, 505, 2016). Supone un desafío conservar las bacterias anaerobias debido a su sensibilidad al oxígeno.

[0007] Staabet al. investigaron la viabilidad de anaerobios liofilizados, incluyendo bacteriasClostridium, en dos medios: leche desnatada doblemente concentrada y sacarosa al 12 % en caldo de hidratos de carbono de carne picada (Staabet al., Cryobiology 24, 174, 1987).

[0008] Por tanto, se necesitan composiciones y métodos mejorados para la conservación de bacterias anaerobias.

[0009] Sumario

[0010] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La divulgación referente a composiciones y métodos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención, por ejemplo, cuando la composición no comprende bacterias de la clase Clostridia o cuando la composición no comprende metabisulfito de sodio.

[0011] En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para la conservación de bacterias. Las bacterias pueden conservarse a través de liofilización (secado por congelación), lo que permite el almacenamiento a largo plazo de las bacterias, incluyendo cantidades terapéuticas de bacterias. En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para la liofilización de composiciones bacterianas. En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que permiten la liofilización de cepas bacterianas anaerobias. Antes de la presente divulgación, las composiciones que comprenden tales cepas bacterianas perderían la totalidad, o la mayor parte, de su viabilidad tras la liofilización, impidiendo severamente las opciones para conservar tales cepas bacterianas en cantidades suficientes para aplicaciones terapéuticas. Las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento permiten por primera vez la conservación de cepas bacterianas a través de liofilización. Se piensa que las composiciones divulgadas en el presente documento tienen estas propiedades de conservación deseadas debido a la combinación de lioprotector(es), nutriente(s), y/o excipiente(s) específico(s). Además, o alternativamente, el ciclo de liofilización, tal como la tasa de rampa de temperatura, también puede contribuir a las propiedades de conservación beneficiosas de las composiciones y los métodos descritos en el presente documento.

[0012] En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para la conservación de bacterias. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende un lioprotector, un nutriente, un antioxidante, y un tampón. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el lioprotector es un azúcar. En la invención, el azúcar es un disacárido. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el disacárido es sacarosa. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la sacarosa está a una concentración de sacarosa que es de entre el 6,0 % y el 10,0 %. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la sacarosa está a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %.

[0013] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el disacárido es trehalosa. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la trehalosa está a una concentración de entre el 6,0 % y el 10,0 %. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la trehalosa está a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %.

[0014] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el nutriente es extracto de levadura, caldo de Luria-Bertani, o peptona vegetal. En la invención, el nutriente es extracto de levadura. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la concentración del extracto de levadura es de entre el 0,5 % y el 2,0 %.

[0015] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el antioxidante es inulina, riboflavina, o cisteína. En la invención, el antioxidante es cisteína. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la concentración de cisteína es de entre el 0,01 % y el 0,5 %.

[0016] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el tampón es un tampón histidina o un tampón Tris. En la invención, el tampón es un tampón histidina, en el que el pH del tampón es de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el tampón está a una concentración de entre 10 mM y 50 mM.

[0017] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición se ha reducido.

[0018] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye trehalosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM.

[0019] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye sacarosa, extracto de levadura, cisteína y un tampón histidina. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM.

[0020] Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede comprender además un excipiente. En algunas realizaciones, el excipiente es un agente estabilizante. En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un agente reductor. En la invención, el agente reductor es metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, el metabisulfito de sodio está al 0,05 %.

[0021] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye trehalosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y un excipiente. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye sacarosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y un excipiente. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio.

[0022] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye bacterias de una o más familias, clases, géneros y/o especies. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias son bacterias anaerobias. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias anaerobias son bacterias anaerobias estrictas. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias anaerobias son bacterias anaerobias facultativas.

[0023] En la invención, las bacterias son de la clase Clostridia. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas pertenecientes a la familia Clostridiaceae. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas pertenecientes al géneroClostridium.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas seleccionadas del grupo que consiste enClostridium bolteae,Anaerotruncus colihominis,Ruminococcus torques,Clostridium symbiosum,Blautia producta,Dorea longicatena,Erysipelotrichaceae bacterium, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones, la una o más cepas bacterianas comprenden una o más secuencias de ARNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-8. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye al menos 1 x 10<8>unidades formadoras de colonias de bacterias por mililitro de la composición.

[0024] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición es una composición estabilizante. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, una composición estabilizante permite la recuperación de al menos el 1 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o hasta el 100 % de las unidades formadoras de colonias de las bacterias a lo largo de un periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo es de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 4 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 6 meses, o al menos 1 año o más.

[0025] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, una composición estabilizante permite la recuperación de al menos el 1 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o hasta el 100 % de las unidades formadoras de colonias después de un evento específico. En algunas realizaciones, el evento específico es uno o más ciclos de congelación-descongelación o ciclos de liofilización.

[0026] En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para conservar bacterias. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye añadir bacterias a una composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y someter la composición que incluye las bacterias a un ciclo de liofilización. En algunas realizaciones, el ciclo de liofilización comprende una o más etapas de una tasa de rampa de temperatura de entre 0,5 ºC/min y 3 ºC/min. En algunas realizaciones, el ciclo de liofilización comprende una o más etapas de una tasa de rampa de temperatura que es de 2,5 ºC/min. En algunas realizaciones, la composición comprende además evaluar las bacterias en un ensayo de sensibilidad antes de añadir las bacterias a la composición. En algunas realizaciones, el ensayo de sensibilidad es una tinción de Gram o un ensayo de congelación-descongelación. En algunas realizaciones, si se evalúa que las bacterias son sensibles, (i) se añade un excipiente a la composición; y/o (ii) el ciclo de liofilización comprende una o más etapas de una tasa de rampa de temperatura de 2,5 ºC/min. En algunas realizaciones, el excipiente es un agente estabilizante. En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un agente reductor. En la invención, el agente reductor es metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, el metabisulfito de sodio está al 0,05 %.

[0027] En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye además medir el número de unidades formadoras de colonias después de someter la composición que comprende las bacterias al ciclo de liofilización. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye además medir el número de unidades formadoras de colonias antes de someter la composición que comprende las bacterias al ciclo de liofilización. En algunas realizaciones del método proporcionado en el presente documento, el método comprende además comparar el número de unidades formadoras de colonias antes de someter la composición que comprende las bacterias al ciclo de liofilización y el número de unidades formadoras de colonias después de someter la composición que comprende las bacterias al ciclo de liofilización, y determinar un nivel de conservación. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método da como resultado la conservación de al menos el 1 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, hasta el 100 % de las unidades formadoras de colonias.

[0028] En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para generar las composiciones proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye crear una mezcla combinando el lioprotector, el nutriente, el antioxidante, y el tampón, y reducir la mezcla generando de ese modo la composición. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, comprendiendo además añadir un excipiente a la mezcla. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el excipiente es un agente estabilizante. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el agente estabilizante es un agente reductor. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el agente reductor es metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método comprende además añadir bacterias a la mezcla.

[0029] En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, las bacterias son bacterias anaerobias estrictas. En la invención, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas pertenecientes a la clase Clostridia. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas pertenecientes a la familia Clostridiaceae. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas pertenecientes al géneroClostridium.

[0030] En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas seleccionadas del grupo que consiste enClostridium bolteae,Anaerotruncus colihominis,Ruminococcus torques,Clostridium symbiosum,Blautia producta,Dorea longicatena,Erysipelotrichaceae bacterium, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas que comprenden secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-8.

[0031] En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método comprende además evaluar las bacterias en un ensayo de sensibilidad antes de añadir las bacterias a la mezcla. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el ensayo de sensibilidad es una tinción de Gram o un ensayo de congelación-descongelación. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, si se evalúa que las bacterias son sensibles, se añade un excipiente a la mezcla.

[0032] En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio.

[0033] En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y una o más cepas bacterianas pertenecientes a la clase Clostridia. En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y una o más cepas bacterianas pertenecientes a la clase Clostridia. En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, y una o más cepas bacterianas pertenecientes a la clase Clostridia. En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que comprenden el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, y una o más cepas bacterianas pertenecientes a la clase Clostridia.

[0034] Estos y otros aspectos de la invención, así como diversas realizaciones de los mismos, resultarán más evidentes en referencia a los dibujos y la descripción detallada de la invención.

[0035] Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar diversas realizaciones de la invención. Por tanto, se anticipa que cada una de las limitaciones de la invención que implica un elemento cualquiera o combinaciones de elementos cualesquiera puede incluirse en cada aspecto de la invención. Esta invención no está limitada en cuanto a su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ponerse en práctica o de llevarse a cabo de diversas formas que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

[0036] Breve descripción de los dibujos

[0037] No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. Las figuras son sólo ilustrativas y no se requieren para la habilitación de la divulgación. Por motivos de claridad, no todos los componentes pueden estar marcados en cada dibujo. En los dibujos:

[0038] La figura 1 muestra una visión general esquemática de los experimentos de ejemplo descritos en los ejemplos. La figura 2 muestra una tabla que incluye las formulaciones descritas en el ejemplo 1.

[0039] La figura 3 muestra fotografías de tortas de liofilización representativas generadas en el ejemplo 1.

[0040] La figura 4 muestra una tabla que incluye las formulaciones de ejemplo usadas en el ejemplo 1.

[0041] La figura 5 muestra una tabla que incluye los resultados descritos en el ejemplo 3.

[0042] La figura 6 muestra un gráfico de la presión durante el ciclo de liofilización descrito en el ejemplo 5.

[0043] Descripción detallada

[0044] La conservación de composiciones bacterianas, incluyendo bacterias anaerobias, ha supuesto un desafío. Aunque las bacterias pueden congelarse y volver a hacerse crecer en placas o en disolución, ha sido difícil normalizar este procedimiento. Existe la necesidad de conservar bacterias que pueden usarse con propósitos terapéuticos. Los procedimientos de conservación, tales como crioconservación y liofilización, se han establecido bien para bacterias aerobias, y se entienden muchos factores que afectan a la supervivencia y recuperación de bacterias aerobias en el procedimiento de conservación (Prakashet al. FEMS Microbiol Lett (2013)339:1-9). Sin embargo, el desarrollo de procedimientos de conservación para su uso con bacterias anaerobias no es suficiente. Tal desarrollo e investigación usando bacterias anaerobias se ve obstaculizado por las dificultades significativas de trabajar con bacterias anaerobias (Moriet al. “The Challenges of Studying the Anaerobic Microbial World”, Microbes Environ. (2014) 29(4) 335-337). Dado que las bacterias anaerobias, tales como cepas bacterianas obtenidas a partir del microbioma intestinal humano, han mostrado potencial en el tratamiento de enfermedades humanas, se necesitan métodos mejorados para conservar bacterias anaerobias que permitan altos niveles de recuperación bacteriana. La liofilización es un procedimiento reconocido para la conservación de péptidos y proteínas, y puede usarse en la preparación de composiciones terapéuticas que van a resuspenderse y administrarse a sujetos. Sin embargo, la liofilización de composiciones bacterianas, en particular bacterias anaerobias, ha supuesto un desafío. Esta divulgación proporciona por primera vez composiciones que permiten la liofilización de bacterias anaerobias sin ninguna pérdida de viabilidad. La divulgación también proporciona composiciones y métodos para conservar bacterias que se considera que son sensibles y difíciles de conservar sin pérdida sustancial de viabilidad. La divulgación enseña que las formulaciones que incluyen determinados lioprotectores, tales como disacáridos, por ejemplo, trehalosa y sacarosa, permiten la conservación de bacterias anaerobias, mientras que lioprotectores estrechamente relacionados, tales como manitol y sorbitol, no lo permiten.

[0045] Además, muchos métodos propuestos para generar composiciones liofilizadas que contienen bacterias incluyen productos de origen animal. Por ejemplo, Staabet al. notifican el secado por congelación (liofilización) de bacterias anaerobias usando caldo de hidratos de carbono de carne picada complementado con el 12 % de sacarosa o leche desnatada doblemente concentrada (Staabet al. Cryobiology (1987)24:174-178). Phillipset al. demostraron que muchas de las bacterias ruminales anaerobias sometidas a prueba conservaron su viabilidad después del secado en suero de caballo complementado con glucosa (Philips,et al. J. Appl. Bact. (1975)38:319-322). Finalmente, Šourek recomienda una mezcla de suero de ternera o sangre de oveja desfibrinada y lactosa para la liofilización de la mayoría de las bacterias (Šourek, Int. J. Sys. Bacteriol. (1974) 24(3):358-365). Importante para la administración de productos terapéuticos a sujetos humanos, las composiciones descritas en el presente documento no incluyen productos animales o productos de origen animal.

[0046] Esta invención no está limitada en cuanto a su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ponerse en práctica o de llevarse a cabo de diversas formas que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

[0047] Además, la fraseología y terminología usadas en el presente documento tienen el propósito de descripción y no deben considerarse como limitativas. Se pretende que el uso de “que incluye”, “que comprende”, o “que tiene”, “que contiene”, “que implica”, y variaciones de los mismos en el presente documento, abarque los elementos enumerados a continuación y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.

[0048] En el presente documento se divulgan composiciones y métodos para la conservación de bacterias. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende un lioprotector, un nutriente, un antioxidante, y un tampón. En algunas realizaciones, las composiciones también comprenden un excipiente, tal como un agente estabilizante. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el lioprotector es un azúcar. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el azúcar es un disacárido, tal como sacarosa, trehalosa, lactosa, maltosa, celobiosa, quitobiosa, o lactulosa. En algunas realizaciones, la composición no incluye manitol. En algunas realizaciones, la composición no incluye sorbitol.

[0049] La invención proporciona una composición liofilizada que comprende bacterias de la clase Clostridia, un disacárido, extracto de levadura, cisteína, metabisulfito de sodio y un tampón histidina, en la que el pH del tampón es de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3.

[0050] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el disacárido es sacarosa. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la sacarosa está a una concentración de entre el 6,0 % y el 10,0 %, inclusive, tal como el 6,0 %, el 6,1 %, el 6,2 %, el 6,3 %, el 6,4 %, el 6,5 %, el 6,6 %, el 6,7 %, el 6,8 %, el 6,9 %, el 7,0 %, el 7,1 %, el 7,2 %, el 7,3 %, el 7,4 %, el 7,5 %, el 7,6 %, el 7,7 %, el 7,8 %, el 7,9 %, el 8,0 %, el 8,1 %, el 8,2 %, el 8,3 %, el 8,4 %, el 8,5 %, el 8,6 %, el 8,7 %, el 8,8 %, el 8,9 %, el 9,0 %, el 9,1 %, el 9,2 %, el 9,3 %, el 9,4 %, el 9,5 %, el 9,6 %, el 9,7 %, el 9,8 %, el 9,9 %, el 9,0 %, o el 10,0 %. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la sacarosa está a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, inclusive, tal como el 7,0 %, el 7,1 %, el 7,2 %, el 7,3 %, el 7,4 %, el 7,5 %, el 7,6 %, el 7,7 %, el 7,8 %, el 7,9 %, o el 8,0 %.

[0051] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el disacárido es trehalosa. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la trehalosa está a una concentración de entre el 6,0 % y el 10,0 %, inclusive, tal como el 6,0 %, el 6,1 %, el 6,2 %, el 6,3 %, el 6,4 %, el 6,5 %, el 6,6 %, el 6,7 %, el 6,8 %, el 6,9 %, el 7,0 %, el 7,1 %, el 7,2 %, el 7,3 %, el 7,4 %, el 7,5 %, el 7,6 %, el 7,7 %, el 7,8 %, el 7,9 %, el 8,0 %, el 8,1 %, el 8,2 %, el 8,3 %, el 8,4 %, el 8,5 %, el 8,6 %, el 8,7 %, el 8,8 %, el 8,9 %, el 9,0 %, el 9,1 %, el 9,2 %, el 9,3 %, el 9,4 %, el 9,5 %, el 9,6 %, el 9,7 %, el 9,8 %, el 9,9 %, el 9,0 %, o el 10,0 %. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la trehalosa está a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, inclusive, tal como el 7,0 %, el 7,1 %, el 7,2 %, el 7,3 %, el 7,4 %, el 7,5 %, el 7,6 %, el 7,7 %, el 7,8 %, el 7,9 %, o el 8,0 %.

[0052] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el nutriente es extracto de levadura, caldo de Luria-Bertani, o peptona vegetal. En la invención, el nutriente es extracto de levadura. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la concentración del extracto de levadura es de entre el 0,5 % y el 2,0 %, inclusive, tal como el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,1 %, el 1,2 %, el 1,3 %, el 1,4 %, el 1,5 %, el 1,6 %, el 1,7 %, el 1,8 %, el 1,9 %, o el 2,0 %. En algunas realizaciones, la composición comprende un nutriente que no es un producto animal. En algunas realizaciones, la composición comprende un nutriente que no es sangre animal.

[0053] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el antioxidante es inulina, riboflavina, o cisteína. En la invención, el antioxidante es cisteína. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la concentración de cisteína es de entre el 0,01 % y el 0,5 %, inclusive, tal como el 0,01 %, el 0,02 %, el 0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, el 0,10 %, el 0,11 %, el 0,12 %, el 0,13 %, el 0,14 %, el 0,15 %, el 0,16 %, el 0,17 %, el 0,18 %, el 0,19 %, el 0,20 %, el 0,21 %, el 0,22 %, el 0,23 %, el 0,24 %, el 0,25 %, el 0,26 %, el 0,27 %, el 0,28 %, el 0,29 %, el 0,30 %, el 0,31 %, el 0,32 %, el 0,33 %, el 0,34 %, el 0,35 %, el 0,36 %, el 0,37 %, el 0,38 %, el 0,39 %, el 0,40 %, el 0,41 %, el 0,42 %, el 0,43 %, el 0,44 %, el 0,45 %, el 0,46 %, el 0,47 %, el 0,48 %, el 0,49 %, o el 0,50 %.

[0054] En algunas realizaciones, se añade un antioxidante distinto de, o además de, cisteína a la composición. Los antioxidantes que pueden añadirse a la composición distintos de, o además de, cisteína incluyen inulina, riboflavina, ácido ascórbico (vitamina C), tocoferol, tocotrienol, vitamina E, carotenoides, caroteno, provitamina A, vitamina A, galato de propilo, terc-butilhidroquinona, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ubiquinol, glutatión, tioles, polifenol, catecoles, titilazad, NXY-059 (disufentón sódico, Cerovive), ácido oxálico, ácido fítico, taninos, eugenol, ácido lipoico, ácido úrico, coenzima Q, melatonina, y combinaciones de los mismos.

[0055] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el tampón es un tampón histidina o un tampón Tris (tris(hidroximetil)aminometano; también conocido como THAM; 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol; trometamina; o trometamol). En la invención, el tampón es un tampón histidina. En la invención, el pH del tampón es de 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la concentración del tampón es de entre 10 mM y 50 mM, inclusive, tal como 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, o 50 mM.

[0056] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye un excipiente. En algunas realizaciones, el excipiente es un agente estabilizante. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el agente estabilizante es un agente reductor, agente quelante, aminoácido ácido, aminoácido básico, o tensioactivo neutro, o polímero. En algunas realizaciones, el excipiente es un agente estabilizante. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, el agente estabilizante está presente en la composición a una concentración de entre el 0,01 % y el 0,1 %, inclusive, tal como el 0,01 %, el 0,02 %, el 0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, o el 0,1 %.

[0057] En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un agente reductor. En la invención, el agente reductor es metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la composición comprende metabisulfito de sodio entre el 0,01 % y el 0,1 %, inclusive, tal como el 0,01 %, el 0,02 %, el 0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, o el 0,1 %. En algunas realizaciones, la composición comprende metabisulfito de sodio al 0,05 %.

[0058] En algunas realizaciones, el agente reductor es ácido ascórbico. En algunas realizaciones, el agente reductor es ácido cítrico. En algunas realizaciones, el agente quelante es ácido cítrico.

[0059] En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un aminoácido ácido.

[0060] En algunas realizaciones, el aminoácido ácido es glutamato de sodio. En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un aminoácido básico. En algunas realizaciones, el aminoácido básico es arginina.

[0061] En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un tensioactivo neutro. En algunas realizaciones, el tensioactivo neutro es poloxámero. En algunas realizaciones, el agente estabilizante es un polímero. En algunas realizaciones, el polímero es copolímero tribloque no iónico. En algunas realizaciones, el polímero es poloxámero. En algunas realizaciones, el polímero es polivinilpirrolidona (por ejemplo, KOLLIDON<®>).

[0062] En algunas realizaciones, el excipiente no es un polímero.

[0063] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición se ha reducido. En la técnica se conocen métodos para reducir una composición e incluyen poner la composición en un entorno anaerobio y exponer la composición a la atmósfera de gas mixto en la cámara anaerobia.

[0064] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye sacarosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye sacarosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición comprende el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones, la composición también incluye una cepa bacteriana. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana es una cepa bacteriana anaerobia.

[0065] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye sacarosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y un excipiente. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye sacarosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición comprende el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la composición también incluye una cepa bacteriana. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana es una cepa bacteriana anaerobia. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana pertenece a la clase Clostridia.

[0067] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye trehalosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye trehalosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones, la composición también incluye una cepa bacteriana. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana es una cepa bacteriana anaerobia.

[0069] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye trehalosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y un excipiente. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye trehalosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la composición también incluye una cepa bacteriana. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana es una cepa bacteriana anaerobia.

[0071] En un aspecto, las composiciones proporcionadas en el presente documento permiten la conservación de bacterias. Las composiciones permiten que las bacterias pasen por un ciclo de secado por congelación con una pérdida mínima de viabilidad. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye bacterias. En algunas realizaciones, la composición incluye una o más cepas bacterianas. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias son bacterias anaerobias (por ejemplo, bacterias anaerobias estrictas). En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias anaerobias son bacterias anaerobias estrictas. En la invención, las bacterias son de la clase Clostridia. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias son de la familia Clostridiaceae. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias son del géneroClostridium.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias pertenecen al grupo IV, XIVa, XVI, XVII, o XVIII deClostridium. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias pertenecen al grupo IV, XIVa, o XVII deClostridium. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, las bacterias pertenecen al grupo IV o XIVa deClostridium.

[0073] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una o más de las siguientes cepas bacterianas:Clostridium bolteae,Anaerotruncus colihominis,Eubacterium fissicatena,Clostridium symbiosum,Blautia producta,Dorea longicatena,Erysipelotrichaceae bacterium, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una o más de las siguientes cepas bacterianas:Clostridium bolteae90A9,Anaerotruncus colihominisDSM17241,Sellimonas intestinalis,Clostridium bacteriumUC5.1-1D4,Dorea longicatenaCAG:42,Erysipelotrichaceae bacterium21-3, yClostridium orbiscindens1_3_50AFAA. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 6, 7, u 8) de las siguientes cepas bacterianas:Clostridium bolteae,Anaerotruncus colihominis,Eubacterium fissicatena,Clostridium symbiosum,Blautia producta,Dorea longicatena,Erysipelotrichaceae bacterium, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones, la composición incluyeClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición incluyeAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición incluyeEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición incluyeClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición incluyeBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición incluyeDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición incluyeErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición incluyeSubdolinogranulum spp.

[0075] En un aspecto, tal como se muestra en el presente documento (por ejemplo, en los ejemplos), las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento permiten la estabilización y conservación de cepas bacterianas anaerobias. En un aspecto, tal como se muestra en el presente documento (por ejemplo, en los ejemplos), las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento permiten la estabilización y conservación de cepas bacterianas anaerobias pertenecientes al grupo IV, XIVa, o XVII deClostridium. En un aspecto, tal como se muestra en el presente documento (por ejemplo, en los ejemplos), las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento permiten la estabilización y conservación de las cepas bacterianas anaerobiasClostridium bolteae,Anaerotruncus colihominis,Eubacterium fissicatena,Clostridium symbiosum,Blautia producta,Dorea longicatena,Erysipelotrichaceae bacterium, ySubdolinogranulum spp.Las cepas bacterianas a modo de ejemplo de las composiciones divulgadas en el presente documento también pueden identificarse por sus secuencias de ARNr 16S (SEQ ID NO: 1-8). La identificación de bacterias por sus secuencias permite además la identificación de cepas bacterianas adicionales que son idénticas o altamente similares a las bacterias ejemplificadas. Por ejemplo, las secuencias de ARNr 16S de las cepas bacterianas se usaron para identificar el pariente más cercano (basándose en el porcentaje de identidad) a través de la secuenciación de genoma completo y la comparación de estas secuencias con bases de datos de 16S (tabla 1). Además, basándose en la secuenciación de genoma completo y la comparación del genoma completo con bases de datos de genoma completo, las cepas bacterianas que tienen las secuencias de ARNr 16S proporcionadas por las SEQ ID NO: 1-8 son las más estrechamente relacionadas con las siguientes especies bacterianas:Clostridium bolteae90A9,Anaerotruncus colihominisDSM17241,Dracourtella massiliensisGD1,Clostridium symbiosumWAL-14163,Clostridium bacteriumUC5.1-1D4,Dorea longicatenaCAG:42,Erysipelotrichaceae bacterium21_3, yClostridium orbiscindens1_3_50AFAA (véase, por ejemplo, la tabla 1). Por tanto, en un aspecto, debe apreciarse que, en cada fila de la tabla 1, las cepas bacterianas son altamente similares y/o son idénticas. En algunas realizaciones, en el contexto de la presente divulgación, los nombres de las cepas bacterianas dentro de una fila de la tabla 1 pueden usarse de manera intercambiable.

[0077] Tabla 1: Ejemplos de especies bacterianas de las composiciones divulgadas en el presente documento

[0080]

[0083] En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, ySubdolinogranulum spp.

[0085] En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, ySubdolinogranulum spp.

[0087] En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, ySubdolinogranulum spp.

[0089] En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición incluye el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, ySubdolinogranulum spp.

[0091] Aspectos de la divulgación se refieren a cepas bacterianas con secuencias de ADNr 16S que tienen homología con una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las secuencias de las cepas o especies bacterianas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana tiene al menos el 80 %, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,5 %, el 99,6 %, el 99,7 %, el 99,8 % o el 99,9 % de homología con respecto a cualquiera de las cepas o especies bacterianas descritas en el presente documento a lo largo de una región especificada de secuencia de ácido nucleico o aminoácidos o a lo largo de toda la secuencia. Un experto en la técnica apreciaría que el término “homología” o “porcentaje de homología”, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos, se refiere a una medida de la similitud entre dos o más secuencias o porción/porciones de las mismas. La homología puede existir a lo largo de una región de una secuencia que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más preferiblemente a lo largo de una región que tiene una longitud de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la homología existe a lo largo de la longitud de la secuencia de ARNr 16S o ADNr 16S, o una porción de la misma.

[0093] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una o más cepas bacterianas, en la que la una o más cepas bacterianas incluyen una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,9 %, o hasta el 100 % de homología con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8.

[0095] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8.

[0097] Adicionalmente, o alternativamente, pueden evaluarse dos o más secuencias para determinar la identidad entre las secuencias. Los términos “identidad” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son “sustancialmente idénticas” si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,5 %, el 99,6 %, el 99,7 %, el 99,8 % o el 99,9 % de identidad de secuencia) a lo largo de una región especificada de una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos o a lo largo de toda la secuencia, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación, o región designada, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más preferiblemente a lo largo de una región que tiene una longitud de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la identidad existe a lo largo de la longitud de la secuencia de ARNr 16S o ADNr 16S.

[0099] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una o más cepas bacterianas, en la que la una o más cepas bacterianas incluyen una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,9 %, o hasta el 100 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8.

[0100] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una cepa bacteriana, en la que la cepa bacteriana incluye una o más secuencias de ADNr 16S que tienen al menos el 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8.

[0102] Adicionalmente, o alternativamente, pueden evaluarse dos o más secuencias para determinar la alineación entre las secuencias. Los términos “alineación” o porcentaje de “alineación”, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias están “sustancialmente alineadas” si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,5 %, el 99,6 %, el 99,7 %, el 99,8 % o el 99,9 % idénticas) a lo largo de una región especificada de la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos o a lo largo de toda la secuencia, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación, o región designada, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la alineación existe a lo largo de una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más preferiblemente a lo largo de una región que tiene una longitud de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la identidad existe a lo largo de la longitud de la secuencia de ARNr 16S o ADNr 16S.

[0104] Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. En la técnica se conocen bien métodos de alineación de secuencias para su comparación. Véanse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math.2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:2444, mediante las implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Genetics Wisconsin, Genetics Computer Group. Madison. WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase. por ejemplo, Brentet al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)). Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschulet al., Nuc. Acids Res. (1977) 25:3389-3402, y Altschulet al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410, respectivamente.

[0106] Debe apreciarse que los términos “bacterias” y “cepas bacterianas”, tal como se usan en el presente documento, son intercambiables.

[0108] En algunas realizaciones, las cepas bacterianas se hacen crecer a partir de una única colonia. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas son cepas bacterianas purificadas. Tal como se usa en el presente documento, el término “purificada” se refiere a una cepa bacteriana, o a una composición que la comprende, que se ha separado a partir de uno o más componentes, tales como contaminantes. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana está sustancialmente libre de contaminantes. En algunas realizaciones, una o más cepas bacterianas de una composición pueden purificarse independientemente a partir de una o más de otras bacterias producidas y/o presentes en un cultivo o una muestra que contiene la cepa bacteriana. En algunas realizaciones, una cepa bacteriana se aísla o purifica a partir de una muestra y luego se cultiva en condiciones apropiadas para la replicación bacteriana, por ejemplo, en condiciones de cultivo anaerobio. Posteriormente, las bacterias que se hacen crecer en condiciones apropiadas para la replicación bacteriana pueden aislarse/purificarse a partir del cultivo en el que se hacen crecer.

[0110] Las cepas bacterianas de la composición pueden fabricarse usando técnicas de fermentación bien conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, los principios activos se fabrican usando fermentadores anaerobios, que pueden soportar el rápido crecimiento de cepas bacterianas anaerobias. Los fermentadores anaerobios pueden ser, por ejemplo, reactores de tanque agitado o biorreactores de ondas desechables. Pueden usarse medios de cultivo tales como medio BL y medio EG, o versiones similares de estos medios desprovistas de componentes animales, para soportar el crecimiento de las especies bacterianas. El producto bacteriano puede purificarse y concentrarse a partir del caldo de fermentación mediante técnicas tradicionales, tales como centrifugación y filtración. Generalmente, las bacterias se sedimentan antes de introducir las bacterias en la composición que ya incluye el lioprotector, el nutriente, el tampón, y el antioxidante. En algunas realizaciones, las bacterias se sedimentan antes de introducir las bacterias en la composición que ya incluye el lioprotector, el nutriente, el tampón, el antioxidante, y el excipiente (por ejemplo, agente reductor).

[0112] En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen aproximadamente 10, aproximadamente 10<2>, aproximadamente 10<3>, aproximadamente 10<4>, aproximadamente 10<5>, aproximadamente 10<6>, aproximadamente 10<7>, aproximadamente 10<8>, aproximadamente 10<9>, aproximadamente 10<10>, aproximadamente 10<11>, aproximadamente 10<12>, aproximadamente 10<13>o más bacterias. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen aproximadamente 10, aproximadamente 10<2>, aproximadamente 10<3>, aproximadamente 10<4>, aproximadamente 10<5>, aproximadamente 10<6>, aproximadamente 10<7>, aproximadamente 10<8>, aproximadamente 10<9>, aproximadamente 10<10>, aproximadamente 10<11>, aproximadamente 10<12>, aproximadamente 10<13>o más bacterias por mililitro. Debe apreciarse que algunas de las bacterias pueden no ser viables. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen aproximadamente 10, aproximadamente 10<2>, aproximadamente 10<3>, aproximadamente 10<4>, aproximadamente 10<5>, aproximadamente 10<6>, aproximadamente 10<7>, aproximadamente 10<8>, aproximadamente 10<9>, aproximadamente 10<10>, aproximadamente 10<11>, aproximadamente 10<12>, aproximadamente 10<13>o más unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen aproximadamente 10, aproximadamente 10<2>, aproximadamente 10<3>, aproximadamente 10<4>, aproximadamente 10<5>, aproximadamente 10<6>, aproximadamente 10<7>, aproximadamente 10<8>, aproximadamente 10<9>, aproximadamente 10<10>, aproximadamente 10<11>, aproximadamente 10<12>, aproximadamente 10<13>o más unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias por mililitro.

[0114] En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen entre 10 y 10<13>, entre 10<2>y 10<13>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<13>, entre 10<8>y 10<13>, entre 10<9>y 10<13>, entre 10<10>y 10<13>, entre 10<11>y 10<13>, entre 10<12>y 10<13>, entre 10 y 10<12>, entre 10<2>y 10<12>, entre 10<3>y 10<12>, entre 10<4>y 10<12>, entre 10<5>y 10<12>, entre 10<6>y 10<12>, entre 10<7>y 10<12>, entre 10<8>y 10<12>, entre 10<9>y 10<12>, entre 10<10>y 10<12>, entre 10<11>y 10<12>, entre 10 y 10<11>, entre 10<2>y 10<11>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<11>, entre 10<8>y 10<11>, entre 10<9>y 10<11>, entre 10<10>y 10<11>, entre 10 y 10<10>, entre 10<2>y 10<10>, entre 10<3>y 10<10>, entre 10<4>y 10<10>, entre 10<5>y 10<10>, entre 10<6>y 10<10>, entre 10<7>y 10<10>, entre 10<8>y 10<10>, entre 10<9>y 10<10>, entre 10 y 10<9>, entre 10<2>y 10<9>, entre 10<3>y 10<9>, entre 10<4>y 10<9>, entre 10<5>y 10<9>, entre 10<6>y 10<9>, entre 10<7>y 10<9>, entre 10<8>y 10<9>, entre 10 y 10<8>, entre 10<2>y 10<8>, entre 10<3>y 10<8>, entre 10<4>y 10<8>, entre 10<5>y 10<8>, entre 10<6>y 10<8>, entre 10<7>y 10<8>, entre 10 y 10<7>, entre 10<2>y 10<7>, entre 10<3>y 10<7>, entre 10<4>y 10<7>, entre 10<5>y 10<7>, entre 10<6>y 10<7>, entre 10 y 10<6>, entre 10<2>y 10<6>, entre 10<3>y 10<6>, entre 10<4>y 10<6>, entre 10<5>y 10<6>, entre 10 y 10<5>, entre 10<2>y 10<5>, entre 10<3>y 10<5>, entre 10<4>y 10<5>, entre 10 y 10<4>, entre 10<2>y 10<4>, entre 10<3>y 10<4>, entre 10 y 10<3>, entre 10<2>y 10<3>, o entre 10 y 10<2>bacterias totales. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen entre 10 y 10<13>, entre 10<2>y 10<13>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<13>, entre 10<8>y 10<13>, entre 10<9>y 10<13>, entre 10<10>y 10<13>, entre 10<11>y 10<13>, entre 10<12>y 10<13>, entre 10 y 10<12>, entre 10<2>y 10<12>, entre 10<3>y 10<12>, entre 10<4>y 10<12>, entre 10<5>y 10<12>, entre 10<6>y 10<12>, entre 10<7>y 10<12>, entre 10<8>y 10<12>, entre 10<9>y 10<12>, entre 10<10>y 10<12>, entre 10<11>y 10<12>, entre 10 y 10<11>, entre 10<2>y 10<11>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<11>, entre 10<8>y 10<11>, entre 10<9>y 10<11>, entre 10<10>y 10<11>, entre 10 y 10<10>, entre 10<2>y 10<10>, entre 10<3>y 10<10>, entre 10<4>y 10<10>, entre 10<5>y 10<10>, entre 10<6>y 10<10>, entre 10<7>y 10<10>, entre 10<8>y 10<10>, entre 10<9>y 10<10>, entre 10 y 10<9>, entre 10<2>y 10<9>, entre 10<3>y 10<9>, entre 10<4>y 10<9>, entre 10<5>y 10<9>, entre 10<6>y 10<9>, entre 10<7>y 10<9>, entre 10<8>y 10<9>, entre 10 y 10<8>, entre 10<2>y 10<8>, entre 10<3>y 10<8>, entre 10<4>y 10<8>, entre 10<5>y 10<8>, entre 10<6>y 10<8>, entre 10<7>y 10<8>, entre 10 y 10<7>, entre 10<2>y 10<7>, entre 10<3>y 10<7>, entre 10<4>y 10<7>, entre 10<5>y 10<7>, entre 10<6>y 10<7>, entre 10 y 10<6>, entre 10<2>y 10<6>, entre 10<3>y 10<6>, entre 10<4>y 10<6>, entre 10<5>y 10<6>, entre 10 y 10<5>, entre 10<2>y 10<5>, entre 10<3>y 10<5>, entre 10<4>y 10<5>, entre 10 y 10<4>, entre 10<2>y 10<4>, entre 10<3>y 10<4>, entre 10 y 10<3>, entre 10<2>y 10<3>, o entre 10 y 10<2>bacterias totales por mililitro.

[0116] En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen entre 10 y 10<13>, entre 10<2>y 10<13>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<13>, entre 10<8>y 10<13>, entre 10<9>y 10<13>, entre 10<10>y 10<13>, entre 10<11>y 10<13>, entre 10<12>y 10<13>, entre 10 y 10<12>, entre 10<2>y 10<12>, entre 10<3>y 10<12>, entre 10<4>y 10<12>, entre 10<5>y 10<12>, entre 10<6>y 10<12>, entre 10<7>y 10<12>, entre 10<8>y 10<12>, entre 10<9>y 10<12>, entre 10<10>y 10<12>, entre 10<11>y 10<12>, entre 10 y 10<11>, entre 10<2>y 10<11>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<11>, entre 10<8>y 10<11>, entre 10<9>y 10<11>, entre 10<10>y 10<11>, entre 10 y 10<10>, entre 10<2>y 10<10>, entre 10<3>y 10<10>, entre 10<4>y 10<10>, entre 10<5>y 10<10>, entre 10<6>y 10<10>, entre 10<7>y 10<10>, entre 10<8>y 10<10>, entre 10<9>y 10<10>, entre 10 y 10<9>, entre 10<2>y 10<9>, entre 10<3>y 10<9>, entre 10<4>y 10<9>, entre 10<5>y 10<9>, entre 10<6>y 10<9>, entre 10<7>y 10<9>, entre 10<8>y 10<9>, entre 10 y 10<8>, entre 10<2>y 10<8>, entre 10<3>y 10<8>, entre 10<4>y 10<8>, entre 10<5>y 10<8>, entre 10<6>y 10<8>, entre 10<7>y 10<8>, entre 10 y 10<7>, entre 10<2>y 10<7>, entre 10<3>y 10<7>, entre 10<4>y 10<7>, entre 10<5>y 10<7>, entre 10<6>y 10<7>, entre 10 y 10<6>, entre 10<2>y 10<6>, entre 10<3>y 10<6>, entre 10<4>y 10<6>, entre 10<5>y 10<6>, entre 10 y 10<5>, entre 10<2>y 10<5>, entre 10<3>y 10<5>, entre 10<4>y 10<5>, entre 10 y 10<4>, entre 10<2>y 10<4>, entre 10<3>y 10<4>, entre 10 y 10<3>, entre 10<2>y 10<3>, o entre 10 y 10<2>unidades formadoras de colonias de bacterias. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento contienen entre 10 y 10<13>, entre 10<2>y 10<13>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<13>, entre 10<8>y 10<13>, entre 10<9>y 10<13>, entre 10<10>y 10<13>, entre 10<11>y 10<13>, entre 10<12>y 10<13>, entre 10 y 10<12>, entre 10<2>y 10<12>, entre 10<3>y 10<12>, entre 10<4>y 10<12>, entre 10<5>y 10<12>, entre 10<6>y 10<12>, entre 10<7>y 10<12>, entre 10<8>y 10<12>, entre 10<9>y 10<12>, entre 10<10>y 10<12>, entre 10<11>y 10<12>, entre 10 y 10<11>, entre 10<2>y 10<11>, entre 10<3>y 10<13>, entre 10<4>y 10<13>, entre 10<5>y 10<13>, entre 10<6>y 10<13>, entre 10<7>y 10<11>, entre 10<8>y 10<11>, entre 10<9>y 10<11>, entre 10<10>y 10<11>, entre 10 y 10<10>, entre 10<2>y 10<10>, entre 10<3>y 10<10>, entre 10<4>y 10<10>, entre 10<5>y 10<10>, entre 10<6>y 10<10>, entre 10<7>y 10<10>, entre 10<8>y 10<10>, entre 10<9>y 10<10>, entre 10 y 10<9>, entre 10<2>y 10<9>, entre 10<3>y 10<9>, entre 10<4>y 10<9>, entre 10<5>y 10<9>, entre 10<6>y 10<9>, entre 10<7>y 10<9>, entre 10<8>y 10<9>, entre 10 y 10<8>, entre 10<2>y 10<8>, entre 10<3>y 10<8>, entre 10<4>y 10<8>, entre 10<5>y 10<8>, entre 10<6>y 10<8>, entre 10<7>y 10<8>, entre 10 y 10<7>, entre 10<2>y 10<7>, entre 10<3>y 10<7>, entre 10<4>y 10<7>, entre 10<5>y 10<7>, entre 10<6>y 10<7>, entre 10 y 10<6>, entre 10<2>y 10<6>, entre 10<3>y 10<6>, entre 10<4>y 10<6>, entre 10<5>y 10<6>, entre 10 y 10<5>, entre 10<2>y 10<5>, entre 10<3>y 10<5>, entre 10<4>y 10<5>, entre 10 y 10<4>, entre 10<2>y 10<4>, entre 10<3>y 10<4>, entre 10 y 10<3>, entre 10<2>y 10<3>, o entre 10 y 10<2>unidades formadoras de colonias de bacterias por mililitro.

[0117] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye al menos 1 x 10<8>unidades formadoras de colonias de bacterias por mililitro.

[0118] Las composiciones que incluyen cepas bacterianas pueden liofilizarse para conservar la cepa bacteriana. La composición de la invención está liofilizada. En la técnica se conocen métodos para liofilizar composiciones, incluyendo composiciones que comprenden bacterias. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense 3.261.761; la patente estadounidense 4.205.132; las publicaciones PCT WO 2014/029578, WO 2012/098358, WO 2012/076665 y WO 2012/088261. Sin embargo, hallar condiciones que permitan la liofilización de determinadas bacterias, tales como bacterias anaerobias, ha supuesto un desafío. Véase, por ejemplo, Peirenet al., Appl Microbol Biotechnol (2015) 99: 3559. Debe apreciarse que, en un aspecto, los métodos de estabilización y conservación proporcionados en el presente documento permiten la capacidad de generar composiciones que permiten la fabricación de cepas bacterianas, en particular cepas bacterianas anaerobias. Antes de la presente divulgación, ninguno de los métodos publicados proporcionaba niveles de estabilización y conservación que permitieran la fabricación de cepas bacterianas, en particular cepas bacterianas anaerobias.

[0119] Aspectos de la divulgación proporcionan métodos para conservar bacterias que implican someter una composición que comprende las bacterias a un ciclo de liofilización. En general, la liofilización es un procedimiento de desecación para conservar un material, tal como bacterias, que implica secado por congelación. El agua se elimina a partir del material congelando el material y luego colocando el material a vacío, durante lo cual el hielo experimenta sublimación. En algunas realizaciones, el ciclo de liofilización implica las etapas de congelación, secado primario, y secado secundario. El término “tasa de rampa de temperatura” se refiere a la tasa a la que se ajusta la temperatura entre las etapas del ciclo de liofilización.

[0120] En algunas realizaciones, el ciclo de liofilización incluye una o más etapas que tienen una tasa de rampa de temperatura de entre 0,5 ºC/min y 3 ºC/min. En algunas realizaciones, la tasa de rampa de temperatura es de 0,5 ºC/min, 0,6 ºC/min, 0,7 ºC/min, 0,8 ºC/min, 0,9 ºC/min, 1,0 ºC/min, 1,1 ºC/min, 1,2 ºC/min, 1,3 ºC/min, 1,4 ºC/min, 1,5 ºC/min, 1,6 ºC/min, 1,7 ºC/min, 1,8 ºC/min, 1,9 ºC/min, 2,0 ºC/min, 2,1 ºC/min, 2,2 ºC/min, 2,3 ºC/min, 2,4 ºC/min, 2,5 ºC/min, 2,6 ºC/min, 2,7 ºC/min, 2,8 ºC/min, 2,9 ºC/min, o 3,0 ºC/min. En algunas realizaciones, el ciclo de liofilización incluye una o más etapas que tienen una tasa de rampa de temperatura de 1,0 ºC/min. En algunas realizaciones, el ciclo de liofilización incluye una o más etapas que tienen una tasa de rampa de temperatura de 2,5 ºC/min.

[0121] En algunas realizaciones, cada una de las etapas del ciclo de liofilización tiene una tasa de rampa de temperatura de entre 0,5 ºC/min y 3 ºC/min. En algunas realizaciones, la tasa de rampa de temperatura es de 0,5 ºC/min, 0,6 ºC/min, 0,7 ºC/min, 0,8 ºC/min, 0,9 ºC/min, 1,0 ºC/min, 1,1 ºC/min, 1,2 ºC/min, 1,3 ºC/min, 1,4 ºC/min, 1,5 ºC/min, 1,6 ºC/min, 1,7 ºC/min, 1,8 ºC/min, 1,9 ºC/min, 2,0 ºC/min, 2,1 ºC/min, 2,2 ºC/min, 2,3 ºC/min, 2,4 ºC/min, 2,5 ºC/min, 2,6 ºC/min, 2,7 ºC/min, 2,8 ºC/min, 2,9 ºC/min, o 3,0 ºC/min. En algunas realizaciones, cada una de las etapas del ciclo de liofilización tiene una tasa de rampa de temperatura de 1,0 ºC/min. En algunas realizaciones, cada una de las etapas del ciclo de liofilización tiene una tasa de rampa de temperatura de 2,5 ºC/min.

[0122] Tal como se comenta en el presente documento, en algunas realizaciones, puede determinarse que las bacterias son sensibles, por ejemplo, en un ensayo de sensibilidad, y se aumenta la tasa de rampa de temperatura en la liofilización. En algunas realizaciones, puede determinarse que las bacterias son sensibles y el ciclo de liofilización incluye una o más etapas que tienen una tasa de rampa de temperatura de 2,5 ºC/min.

[0123] En un aspecto, las composiciones proporcionadas en el presente documento que incluyen bacterias están en forma sólida. En algunas realizaciones, la forma sólida es una torta liofilizada (también denominada “liotorta”). Tal como se usa en el presente documento, los términos “torta de liofilización” y “liotorta” se refieren a la composición sólida formada por la liofilización de una composición, tal como una composición que comprende bacterias. Puede evaluarse el aspecto de la torta de liofilización. En unas realizaciones, se desea una torta de liofilización que parece intacta y no colapsada.

[0124] Debe apreciarse que la divulgación abarca composiciones sólidas. Las composiciones sólidas pueden generarse, por ejemplo, después de la liofilización de una de las composiciones que incluyen bacterias divulgadas en el presente documento. La forma sólida de la composición tendrá los mismos componentes que la formulación líquida usada para generar la forma sólida. Por tanto, por ejemplo, si una composición líquida incluía un lioprotector, un nutriente, un antioxidante, y un tampón y la composición líquida se sometió a liofilización, la liotorta generada tendría los mismos componentes. La definición de la cantidad/porcentaje de cada uno de los componentes es diferente cuando se describe la formulación sólida. Los indicadores “mM” y “pH” no son apropiados para describir componentes sólidos. Sin embargo, debe apreciarse que la reconstitución de una formulación sólida en la misma cantidad de líquido debe dar como resultado la misma composición. En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones sólidas que se han generado por la liofilización de las composiciones proporcionadas en el presente documento.

[0126] En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición sólida que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende un lioprotector, un nutriente, un antioxidante, y un tampón. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición sólida que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende un lioprotector, un nutriente, un antioxidante, un tampón, y un excipiente (por ejemplo, un agente estabilizante). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición sólida que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende sacarosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición sólida que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende sacarosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición sólida que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende trehalosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición sólida que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende trehalosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una liotorta que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende sacarosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una liotorta que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende sacarosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una liotorta que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende trehalosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una liotorta que incluye bacterias generadas por la liofilización de una composición líquida que comprende trehalosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y metabisulfito de sodio.

[0128] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0130] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0132] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0134] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0135] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yBlautia producta.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yDorea longicatena.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0136] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0137] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0138] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium bolteae.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0139] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yAnaerotruncus colihominis.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0140] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yEubacterium fissicatena.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0141] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yClostridium symbiosum.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0142] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yBlautia producta.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yBlautia producta.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta. En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yDorea longicatena.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yDorea longicatena.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0143] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, yErysipelotrichaceae bacterium.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0144] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición incluye una composición sólida generada por la liofilización del 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, ySubdolinogranulum spp.En algunas realizaciones, la composición sólida es una liotorta.

[0145] En algunas realizaciones, las composiciones sólidas que incluyen las cepas bacterianas proporcionadas en el presente documento pueden formularse para su administración como composición farmacéutica, por ejemplo, mediante la reconstitución de un producto liofilizado. El término “composición farmacéutica”, tal como se usa en el presente documento, significa un producto que es el resultado del mezclado o la combinación de una formulación sólida proporcionada en el presente documento y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0146] Un excipiente “aceptable” se refiere a un excipiente que debe ser compatible con el principio activo (por ejemplo, la cepa bacteriana) y no perjudicial para el sujeto al que se le administra. En algunas realizaciones, el excipiente farmacéuticamente aceptable se selecciona basándose en la vía de administración prevista de la composición, por ejemplo, una composición para administración oral o nasal puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable diferente al de una composición para administración rectal. Los ejemplos de excipientes incluyen agua estéril, solución salina fisiológica, un disolvente, un material de base, un emulsionante, un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizador, un agente aromatizante, un compuesto aromático, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, un diluyente, un agente de ajuste de tonicidad, un agente calmante, un agente de carga, un agente disgregante, un agente tampón, un agente de recubrimiento, un lubricante, un colorante, un edulcorante, un agente espesante, y un solubilizador.

[0147] En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones que permiten la conservación de bacterias. En algunas realizaciones, las bacterias son bacterias anaerobias. Las composiciones útiles para las conservaciones de bacterias también se denominan en el presente documento composiciones estabilizantes. Una composición que permite la conservación de bacterias (por ejemplo, bacterias anaerobias) o la estabilización de bacterias, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que fomenta la viabilidad de las bacterias en la misma y permite la recuperación de las bacterias tras un ciclo de liofilización. La funcionalidad de estabilización o conservación de la composición puede evaluarse comparando el número de bacterias viables (por ejemplo, unidades formadoras de colonias) en dos puntos de tiempo específicos (por ejemplo, el día 1 y el día 100). En algunas realizaciones, la funcionalidad de estabilización o conservación de la composición se evalúa comparando el número de bacterias viables (por ejemplo, unidades formadoras de colonias) en un primer punto de tiempo con el número de bacterias viables (por ejemplo, unidades formadoras de colonias) en un segundo punto de tiempo. Si el número de unidades formadoras de colonias es igual o sustancialmente igual en los dos puntos de tiempo o a lo largo de un periodo de tiempo, la composición es una composición estabilizante perfecta. Una gran disminución en el número de unidades formadoras de colonias entre dos puntos de tiempo o a lo largo de un periodo de tiempo indica que la composición no es una buena composición estabilizante.

[0148] La funcionalidad de estabilización de la composición también puede evaluarse comparando el número de bacterias viables (por ejemplo, unidades formadoras de colonias) antes y después de un evento específico (por ejemplo, liofilización o un evento de congelación-descongelación). Si el número de unidades formadoras de colonias es igual o sustancialmente igual, la composición es una composición estabilizante perfecta. Una gran disminución en el número de unidades formadoras de colonias después de un evento específico, con respecto a antes del evento específico, indica que la composición no es una buena composición estabilizante.

[0150] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, la composición es una composición estabilizante. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye trehalosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye trehalosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye trehalosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y un excipiente (por ejemplo, un agente estabilizante). En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye el 7,5 % de trehalosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye trehalosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio.

[0152] En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye sacarosa, extracto de levadura, cisteína, y un tampón histidina. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye sacarosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones, la composición estabilizante comprende el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM. En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye sacarosa, extracto de levadura, cisteína, un tampón histidina, y un excipiente (por ejemplo, un agente estabilizante). En algunas realizaciones, la composición estabilizante incluye sacarosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la composición estabilizante comprende el 7,0 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio.

[0154] Aspectos de la divulgación se refieren a evaluar las bacterias en un ensayo de sensibilidad. En algunas realizaciones, las bacterias se someten a un ensayo de sensibilidad antes de añadir las bacterias a una composición para la liofilización. Pueden usarse ensayos de sensibilidad para determinar si las bacterias pueden ser más sensibles, por ejemplo, a estrés, tales como la presencia de oxígeno o estrés de la membrana/pared celular. El rendimiento de las bacterias en un ensayo de sensibilidad también puede indicar o predecir cómo sobrevivirán (permanecerán viables) las bacterias a través de un ciclo de liofilización. En general, someter las bacterias que se determina que son sensibles, o más sensibles con respecto a otras bacterias, a un ciclo de liofilización puede dar como resultado una recuperación reducida de bacterias viables; por tanto, en algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles, puede añadirse un excipiente a la composición y/o puede aumentarse la tasa de rampa de temperatura del ciclo de liofilización. En algunas realizaciones, el ensayo de sensibilidad puede determinar la sensibilidad de las bacterias a estrés.

[0156] En algunas realizaciones, la sensibilidad de las bacterias se compara con la sensibilidad de otras bacterias o con un valor de referencia. En algunas realizaciones, el rendimiento de las bacterias en el ensayo de sensibilidad puede compararse con el rendimiento de otras bacterias o con un valor de referencia. Los ejemplos de ensayos de sensibilidad incluyen, por ejemplo, tinción de Gram y ensayos de congelación-descongelación.

[0158] La tinción de Gram es un método usado normalmente para evaluar la estructura de pared celular (peptidoglicano) de las bacterias. Tal como resultará evidente para un experto habitual en la técnica, una tinción de Gram implica someter las bacterias a una serie de etapas: en primer lugar, poner las bacterias en contacto con un colorante soluble en agua (violeta de cristal) y una disolución de yodo, luego una etapa de decoloración, y finalmente una etapa de contratinción, normalmente con safranina. El violeta de cristal se una al peptidoglicano de la pared celular bacteriana y forma complejos con el yodo. Las bacterias que tienen capas gruesas de peptidoglicano aparecen de color morado en una tinción de Gram y se denominan Gram positivas (Gram ), mientras que las bacterias que tienen capas más delgadas de peptidoglicano o están rodeadas por una membrana exterior aparecen de color rosa en una tinción de Gram, ya que estas células se tiñen con la contratinción y no con violeta de cristal. Estas células se denominan bacterias Gram negativas (Gram -). Las bacterias que se caracteriza como Gram positivas (por ejemplo, que se sabe en la técnica que tienen la estructura de peptidoglicano de bacterias Gram positivas) pero no aparecen como Gram positivas en una tinción de Gram pueden considerarse sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias. En algunas realizaciones, las bacterias se someten a una tinción de Gram y se determina que son sensibles.

[0160] En algunas realizaciones, el ensayo de sensibilidad es un ensayo de congelación-descongelación. Tal como resultará evidente para un experto habitual en la técnica, los ensayos de congelación-descongelación implican congelar las bacterias, por ejemplo, en un congelador o un baño de hielo seco/etanol, y luego descongelar las bacterias. En algunas realizaciones, el ensayo de congelación-descongelación implica uno o más ciclos de congelación y descongelación de las bacterias. En algunas realizaciones, la viabilidad de las bacterias se evalúa después del ensayo de congelación-descongelación. El procedimiento de congelación-descongelación puede provocar la lisis y, por tanto, una viabilidad reducida (recuperación reducida) de bacterias sensibles. En algunas realizaciones, una viabilidad reducida de bacterias en un ensayo de congelación-descongelación puede indicar que las bacterias son sensibles o son más sensibles en comparación con otras bacterias.

[0162] En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento implican evaluar las bacterias en un ensayo de sensibilidad. En algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias, se añade un excipiente a las composiciones que contienen las bacterias sensibles. En algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias, se añade un agente estabilizante a las composiciones que contienen las bacterias sensibles. En algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias, se añade un agente reductor a las composiciones que contienen las bacterias sensibles. Sin desear estar limitados por ninguna teoría particular, la presencia de un agente reductor puede eliminar el oxígeno en la composición, mejorando de ese modo la viabilidad de bacterias sensibles. En algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias, se añade el 0,05 % de metabisulfito de sodio a las composiciones que contienen las bacterias sensibles.

[0164] En algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias, la composición que comprende las bacterias sensibles se somete a un ciclo de liofilización que tiene una tasa de rampa de temperatura aumentada (por ejemplo, mayor de 1 ºC/min). Sin desear estar limitados por ninguna teoría particular, aumentar la tasa de rampa de temperatura puede reducir la exposición potencial de las bacterias al oxígeno. En algunas realizaciones, si se determina que las bacterias son sensibles o más sensibles en comparación con otras bacterias, las composiciones liofilizadas que comprenden las bacterias sensibles se generan sometiendo una composición que comprende las bacterias sensibles a un ciclo de liofilización que tiene una o más etapas de una tasa de rampa de temperatura de 2,5 ºC/min.

[0166] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, una composición estabilizante es una composición que permite la recuperación de al menos el 1 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, hasta el 100 % de las unidades formadoras de colonias a lo largo de un periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo es de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 4 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 6 meses, o al menos 1 año o más. En algunas realizaciones, el porcentaje de unidades formadoras de colonias recuperadas o el nivel de conservación se determina comparando el número de unidades formadoras de colonias de bacterias (por ejemplo, de una cepa bacteriana o bacterias totales) en un primer punto de tiempo con respecto al número de unidades formadoras de colonias de bacterias (por ejemplo, de una cepa bacteriana o bacterias totales) en un segundo punto de tiempo a lo largo de un periodo de tiempo. Por ejemplo, una recuperación del 50 % o una conservación del 50 % de bacterias indica que la mitad de las bacterias permanecieron viables a lo largo del periodo de tiempo; y una recuperación del 100 % o una conservación del 100 % de bacterias indica que la totalidad (o sustancialmente la totalidad) de las bacterias permanecieron viables a lo largo del periodo de tiempo.

[0168] En algunas realizaciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento, una composición estabilizante es una composición que permite la recuperación de al menos el 1 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, hasta el 100 % de las unidades formadoras de colonias después de un evento específico. En algunas realizaciones, el evento específico es un ciclo de congelación-descongelación o un ciclo de liofilización. En algunas realizaciones, el porcentaje de unidades formadoras de colonias recuperadas o el nivel de conservación se determina comparando el número de unidades formadoras de colonias de bacterias (por ejemplo, de una cepa bacteriana o bacterias totales) antes del evento específico con respecto al número de unidades formadoras de colonias de bacterias (por ejemplo, de una cepa bacteriana o bacterias totales) después del evento específico. Por ejemplo, una recuperación del 50 % o una conservación del 50 % indica que la mitad de las bacterias permanecieron viables después del evento específico; y una recuperación del 100 % o una conservación del 100 % indica que la totalidad (o sustancialmente la totalidad) de las bacterias permanecieron viables después del evento específico.

[0169] En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para conservar bacterias. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye añadir bacterias a cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento y someter la composición a la que se le han añadido las bacterias a un ciclo de liofilización. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye añadir bacterias a una composición que incluye sacarosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM y someter la composición a la que se le han añadido las bacterias a un ciclo de liofilización. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye añadir bacterias a una composición que incluye sacarosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio y someter la composición a la que se le han añadido las bacterias a un ciclo de liofilización. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye añadir bacterias a una composición que incluye trehalosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, y tampón histidina 20 mM y someter la composición a la que se le han añadido las bacterias a un ciclo de liofilización. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye añadir bacterias a una composición que incluye trehalosa a una concentración de entre el 7,0 % y el 8,0 %, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, tampón histidina 20 mM, y el 0,05 % de metabisulfito de sodio y someter la composición a la que se le han añadido las bacterias a un ciclo de liofilización.

[0170] En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye además medir el número de unidades formadoras de colonias después de someter la composición que comprende las bacterias al ciclo de liofilización. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método da como resultado la conservación de al menos el 1 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, hasta el 100 % de las unidades formadoras de colonias.

[0171] En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para generar las composiciones proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye crear una mezcla combinando el lioprotector, el nutriente, el antioxidante, y el tampón, seguido de reducción de la mezcla generando de ese modo la composición. En algunas realizaciones, el método incluye además la adición de bacterias.

[0172] En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye crear una mezcla combinando trehalosa, extracto de levadura, cisteína y tampón histidina para crear una mezcla, seguido de reducción de la mezcla generando de ese modo la composición. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye crear una mezcla combinando trehalosa, extracto de levadura, cisteína, tampón histidina, y un excipiente para crear una mezcla, seguido de reducción de la mezcla generando de ese modo la composición. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye crear una mezcla combinando sacarosa, extracto de levadura, cisteína, y tampón histidina para crear una mezcla, seguido de reducción de la mezcla generando de ese modo la composición. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, el método incluye crear una mezcla combinando sacarosa, extracto de levadura, cisteína, tampón histidina, y un excipiente para crear una mezcla, seguido de reducción de la mezcla generando de ese modo la composición.

[0173] SEQ ID NO: 1 Cepa 1, ARN ribosómico 16S,Clostridium bolteae

[0175]

[0177] SEQ ID NO: 2 Cepa 2, ARN ribosómico 16S,Anaerotruncus colihominis

[0178]

[0179] SEQ ID NO: 3 Cepa 3, ARN ribosómico 16S,Ruminococcus torques

[0181]

[0182] SEQ ID NO: 4 Cepa 4, ARN ribosómico 16S,Clostridium symbiosum

[0183]

[0184] SEQ ID NO: 5 Cepa 5, ARN ribosómico 16S,Blautia producta

[0186]

[0187] SEQ ID NO: 6 Cepa 6, ARN ribosómico 16S,Dorea longicatena

[0188]

[0189] SEQ ID NO: 7 Cepa 7, ARN ribosómico 16S,Erysipelotrichaceae bacterium

[0191]

[0192] SEQ ID NO: 8 Cepa 8, ARN ribosómico 16S,Subdoligranulum spp

[0193]

[0195] Esta invención no está limitada en cuanto a su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ponerse en práctica o de llevarse a cabo de diversas formas. Además, la fraseología y terminología usadas en el presente documento tienen el propósito de descripción y no deben considerarse como limitativas. Se pretende que el uso de “que incluye”, “que comprende”, o “que tiene”, “que contiene”, “que implica”, y variaciones de los mismos en el presente documento, abarque los elementos enumerados a continuación y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.

[0196] A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Los métodos y las técnicas de la presente divulgación se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, bioquímica, enzimología, biología molecular y celular, microbiología, virología, cultivo celular o tisular, genética, y química de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente divulgación se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario.

[0197] La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse en modo alguno como más limitativos. Sin embargo, no se pretende que la cita de cualquier referencia sea una admisión de que la referencia es técnica anterior.

[0198] Ejemplos

[0199] EJEMPLO 1 (ÚNICAMENTE CON PROPÓSITOS ILUSTRATIVOS; NO FORMA PARTE DE LA INVENCIÓN)Visión general

[0200] Se evaluó una variedad de formulaciones de liofilización para la liofilización de la bacteria anaerobiaDorea longicatena.El diseño experimental se representa en la figura 1.

[0201] Cultivo bacteriano

[0202] Se inició un inóculo deDorea longicatenaa partir de una única colonia hasta que alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,68, correspondiente a la fase logarítmica tardía, y luego se transfirió a un matraz más grande. Se sedimentaron alícuotas de 40 ml de bacterias. Las bacterias sedimentadas eran 1,6 x 10<7>UFC/ml (UFC = unidades formadoras de colonias).

[0203] Preparación de tampón de liofilización

[0204] Se prepararon las formulaciones representadas en la figura 2 y la tabla 2 en una cámara anaerobia. El manitol y el sorbitol eran cristalinos, mientras que la sacarosa y la trehalosa eran amorfas. Además de los componentes de formulación mostrados en la figura 2, todas las formulaciones incluían el 1 % de extracto de levadura y el 0,05 % de cisteína. Las concentraciones de tampón base de Tris e histidina eran de 20 mM. Se filtraron las formulaciones a través de un filtro de 0,22 microM. Se almacenaron dieciséis tubos cónicos de 50 ml que contenían sedimentos bacterianos en una cámara a 2-8 ºC. El número de bacterias en cada tubo era de 1,6 x 10<7>UFC/ml. Se lavaron los sedimentos con 20 ml de formulación de liofilización dos veces y se centrifugaron a 3900 rpm durante 10 minutos. La osmolalidad de las formulaciones osciló desde 292 hasta 329 mOsm. Se resuspendieron los sedimentos lavados con 25 ml de tampón de liofilización y se prepararon 5 viales para cada formulación de liofilización. Se usaron cuatro viales en el ciclo de liofilización y se mantuvo un vial a -80 ºC como control. Se taparon parcialmente los viales con tapones de clorobutilo elastomérico de tipo I de 20 mm de diámetro. Se lavó uno de los dieciséis tubos cónicos de 50 ml con medio de cultivo y se usó como control para el ciclo de liofilización.

[0205] Se lavaron los sedimentos bacterianos usados como controles con 12 ml de medio de cultivo celular dos veces, y se centrifugaron a 3900 rpm durante 10 minutos. Posteriormente se resuspendieron las células con 25 ml de medio de cultivo celular y se llenaron un total de 5 viales: 5 ml llenados en un vial de 20 ml. Se liofilizaron cuatro viales y se mantuvo uno a -80 ºC como control. Se taparon parcialmente los viales con tapones de clorobutilo elastomérico de tipo I de 20 mm de diámetro.

[0206] Tabla 2: Formulaciones usadas en el ejemplo 1.

[0209]

[0211] Ciclo de liofilización:

[0212] Se realizó el ciclo de liofilización con los parámetros de liofilización mostrados en la tabla 3 a continuación.

[0213] Tabla 3. Ciclo de liofilización

[0216]

[0217] Tras completarse el ciclo de liofilización, se realizó relleno de nitrógeno hasta alcanzar 600.000 mTorr y luego se taparon los viales para mantener el N<2>en los viales a vacío. Una vez tapados los viales, se completó el relleno hasta alcanzar 760.000 mTorr. Se recuperaron los productos liofilizados en viales de vidrio a partir del liofilizador y se sellaron inmediatamente con las tapas de engarce de aluminio para prevenir la contaminación por el aire atmosférico y para prevenir la liberación de N<2>a partir del vial. Se determinó la completitud de las etapas de secado primario y secundario basándose en la presión de Pirani. Todos los recipientes liofilizados se almacenaron a -20 ºC para su almacenamiento antes de las pruebas de viabilidad.

[0218] Se enfriaron las muestras hasta 4 ºC durante 2 h y se congelaron a -50 ºC durante 2 h. Como la formulación 16 tendrá diferente Tg’, el secado primario se estableció a -25 ºC. Se sabe que los azúcares amorfos tales como la sacarosa tienen una transición de -32 ºC y el manitol cristalino tiene una temperatura eutéctica de aproximadamente 15 ºC. Se seleccionó el secado primario a -25 ºC de modo que la mayoría de las formulaciones permanecieran por debajo de la temperatura eutéctica o transición o durante la liofilización. El perfil de presión sugiere que la presión de Pirani alcanzó 100 mTorr aproximadamente a las 63 h de liofilización. El secado primario se extendió hasta las 73 h para garantizar la terminación del secado primario. Se eliminó el agua unida durante el secado secundario. Basándose en el perfil de presión de Pirani, el secado secundario se completó a las 81 h de liofilización. La liofilización se extendió hasta las 88 h para garantizar la completa eliminación del agua unida.

[0219] Resultados del ciclo de liofilización

[0220] El aspecto físico de las formulaciones liofilizadas se muestra en la figura 3. Los datos indican que, excepto la formulación que contiene el sorbitol cristalino y la formulación que contiene medio de cultivo, todas las tortas de las 13 formulaciones restantes no colapsan y están intactas. La torta de la formulación que contiene sorbitol colapsó y se elevó con el burbujeo. De manera similar, la formulación que contiene medio de cultivo solo también colapsó. Basándose en los aspectos de las tortas, esta ejecución de liofilización parece aceptable para la formulación que contiene trehalosa y sacarosa amorfas y manitol cristalino. Las tortas de la formulación que contiene sorbitol y medio de cultivo colapsaron después de la liofilización.

[0221] Viabilidad de las muestras liofilizadas

[0222] Se llevaron las tortas liofilizadas a la cámara anaerobia, se abrieron, y se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo, ya que las tortas eran representativas de una muestra de 5 ml (se resuspendieron en el medio de cultivo HiVeg). Se prepararon diluciones desde 10<1>hasta 10<6>hasta 10<7>y se dispensaron 100 microlitros de cada dilución en una placa de Eggerth Gagnon y se esparcieron con la ayuda de perlas de vidrio estériles. Se realizó la siembra en placas de Eggerth Gagnon previamente reducido enriquecidas con sangre de caballo al 5 %. Se realizó la incubación a 37 ºC en la incubadora en la cámara anaerobia. Se contaron las unidades formadoras de colonias 48-72 horas después de la siembra.

[0223] Los resultados combinados del experimento de liofilización y la viabilidad de las muestras evaluadas se muestran en la figura 4 y la tabla 4. Los mejores resultados se obtienen con His / pH 7,0 o Tris / pH 7,5 como tampón y sacarosa o trehalosa como azúcar.

[0224] Tabla 4: Resultados del experimento de formulación

[0227]

[0228]

[0230] EJEMPLO 2 (ÚNICAMENTE CON PROPÓSITOS ILUSTRATIVOS; NO FORMA PARTE DE LA INVENCIÓN)Visión general

[0231] Este estudio evaluó formulaciones de liofilización y componentes para la liofilización de la bacteria anaerobiaDorea longicatena.

[0232] Cultivo bacteriano

[0233] Se inició un inóculo deDorea longicatenaa partir de una única colonia en tubos de centrífuga de 50 ml que contenían 40 ml de medio Vegitone. Se permitió el crecimiento del inóculo durante la noche y se usaron dos tubos para inocular 750 ml de Vegitone en un frasco de 1 litro a una DO inicial de 0,025. Se permitió el crecimiento de esto durante veinte horas y se recogió a una DO de 0,68. Se añadieron alícuotas de 40 ml a dieciséis tubos de centrífuga de 50 ml. Se centrifugaron los tubos a 3560 RCF durante 10 minutos y se descartaron los sobrenadantes. Se sellaron los tubos y se colocaron en un recipiente anaerobio BD EZPak con una bolsa de generación de gas BD EZPak (Becton, Dickinson and Company; Franklin Lakes, NY) para garantizar un entorno anaerobio. Se colocó la caja en una nevera a 2-8 ºC antes de las pruebas de viabilidad.

[0234] Preparación de tampón de liofilización y ciclo de liofilización

[0235] Se prepararon las formulaciones presentadas en la tabla 5 para evaluar la liofilización de los cultivos bacterianos. Cada formulación sometida a prueba tenía el 1 % de extracto de levadura y el 0,05 % de L-cisteína añadidos. Se añadió extracto de levadura para proporcionar nutrientes libres de componentes animales a cada cepa. Se añadió L-cisteína como agente reductor para mitigar la exposición al oxígeno.

[0236] Antes de las pruebas de viabilidad, se resuspendieron los viales en 25 ml de medio y se sembraron para determinar las viabilidades iniciales.

[0237] Cada muestra se lavó dos veces usando los tampones de formulación mostrados en la tabla 5. Se usó un volumen de 25 ml para la resuspensión final, para concentrar la muestra inicial. Cada formulación mostrada en la tabla 5 tenía alícuotas de 5 ml añadidas en viales de 20 ml independientes y luego se liofilizaron usando un secado primario de -25 ºC a 100 mTorr y usando un secado secundario de 20 ºC a 100 mTorr.

[0238] Viabilidad de las muestras liofilizadas

[0239] Después de la liofilización, se determinaron los recuentos de células viables finales resuspendiendo cada vial en 5 ml de medio y sembrando en EGHB (tabla 6). Los datos indican que pudieron recuperarse las bacterias que se liofilizaron en formulaciones que contenían sacarosa o trehalosa como lioprotector. Las formulaciones con manitol dan como resultado bacterias viables no recuperables, y el uso de medio de cultivo solo para la liofilización dio como resultado una recuperación deficiente. Las formulaciones con sorbitol tenían una formación de torta de liofilización deficiente. Se seleccionó histidina como tampón, ya que dio como resultado viabilidad tanto con sacarosa como con trehalosa. Se evaluaron adicionalmente las formulaciones 6 y 10.

[0240] Tabla 5: Formulaciones de liofilización

[0243]

[0244]

[0246] Tabla 6: Viabilidad de las muestras liofilizadas

[0249]

[0251] *Las formulaciones corresponden a las formulaciones presentadas en la tabla 5.;[0252] ^Muestra contaminada; no puede determinarse el valor.;[0253] EJEMPLO 3 (ÚNICAMENTE CON PROPÓSITOS ILUSTRATIVOS, NO FORMA PARTE DE LA INVENCIÓN)Visión general;[0254] Se evaluaron varias formulaciones de liofilización optimizadas seleccionadas para determinar la liofilización de ocho cepas anaerobias diferentes. El diseño experimental se representa en la figura 1.;[0255] Cultivos bacterianos;[0256] Se inició un inóculo de cada una de las cepas bacterianas mostradas en la tabla 7 a partir de una única colonia hasta que alcanzó la DO mostrada en la tabla 8 y luego se transfirió a un matraz más grande. Se sedimentaron alícuotas de 40 ml de bacterias. Las UFC de las bacterias sedimentadas se muestran en la figura 5.;[0257] Tabla 7. Cepas bacterianas usadas en el ejemplo 3;[0260] ;[0261] ;[0263] Las cepas bacterianas se identificaron mediante el pariente conocido más cercano identificado por homología/identidad de secuencia.;[0264] Tabla 8: DO600 de las cepas bacterianas usadas en el ejemplo 3;[0267] ;[0269] Preparación de tampón de liofilización;[0270] Se evaluaron dos formulaciones de liofilización:;[0271] - Formulación A: histidina 20 mM pH 7,0, 1 % de extracto de levadura, 0,05 % de cisteína y 7,5 % de trehalosa con una osmolalidad de 305 mOsm/kg.;[0272] - Formulación B: histidina 20 mM pH 7,0, 1 % de extracto de levadura, 0,05 % de cisteína y 7,0 % de sacarosa con una osmolalidad de 315 mOsm/kg.;[0273] Se prepararon las formulaciones en la cámara anaerobia. Se usaron dieciséis tubos cónicos de 50 ml que contenían los sedimentos bacterianos. El número de bacterias en cada tubo varió según la cepa y varió entre 1,4 x 10<7>y 2,75 x 10<9>UFC/ml (véase la figura 5). Se lavaron los sedimentos bacterianos con 20 ml de formulación de liofilización dos veces, y se centrifugaron a 3900 rpm durante 10 minutos. La osmolalidad de las formulaciones osciló desde 305 hasta 315 mOsm. Se resuspendieron los sedimentos con 20 ml de tampón de formulación de liofilización y se llenaron 4 viales para cada uno (5 ml llenados en un vial de 20 ml). Se liofilizaron tres viales y se mantuvo un vial a -80 ºC como control. Se taparon parcialmente los viales con tapones de clorobutilo elastomérico de tipo I de 20 mm de diámetro.;[0274] Ciclo de liofilización:;[0275] Se realizó la ejecución de liofilización con los parámetros de liofilización mostrados en la tabla 9 a continuación. Tabla 9: Ciclo de liofilización;[0278] ;[0279] Tras completarse el ciclo de liofilización, se realizó relleno de nitrógeno hasta alcanzar 600.000 mTorr y luego se taparon los viales para mantener el N<2>en los viales a vacío. Una vez tapados los viales, se completó el relleno hasta alcanzar 760.000 mTorr. Se recuperaron las muestras liofilizadas en viales de vidrio a partir del liofilizador y se sellaron inmediatamente con las tapas de engarce de aluminio para prevenir la contaminación por el aire atmosférico y para prevenir la liberación de N<2>a partir del vial. Se determinó la completitud de las etapas de secado primario y secundario basándose en que la presión de Pirani alcanzó la presión en anaquel establecida. Todos los recipientes liofilizados se almacenaron a -20 ºC antes de las pruebas de viabilidad.;[0280] Se enfriaron las muestras hasta 4 ºC durante 10 minutos y se congelaron a -50 ºC durante 2 h. Como la formulación 2 tendrá diferente Tg’, el secado primario se estableció a -25 ºC. Se sabe que los azúcares amorfos tales como la sacarosa tienen una transición de -32 ºC, mientras que la temperatura de transición de la trehalosa (-29 ºC) es aproximadamente 3 ºC mayor que la de la sacarosa. Se seleccionó el secado primario a -25 ºC de modo que la mayoría de las formulaciones permanecieran por debajo de la transición durante la liofilización. El perfil de presión sugiere que la presión de Pirani alcanzó 100 mTorr aproximadamente a las 56 h de liofilización. El secado primario se extendió hasta las 66 h para garantizar la terminación del secado primario. Se eliminó el agua unida durante el secado secundario. Basándose en el perfil de presión de Pirani, el secado secundario se completó a las 76 h de liofilización.;[0281] Resultados del ciclo de liofilización;[0282] El aspecto físico de cada dato de formulación liofilizada mostró que ninguna de las tortas colapsó. El color de las tortas de liofilización varió ligeramente entre cepas bacterianas.;[0283] Viabilidad de las muestras liofilizadas;[0284] Se llevaron las tortas liofilizadas a la cámara anaerobia, se abrieron, y se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo, ya que las tortas eran representativas de una de muestra 5 ml (se resuspendieron en medio de peptonaextracto de levadura-glucosa con Tween). Se prepararon diluciones desde 10<1>hasta 10<6>hasta 10<7>y se dispensaron 100 microlitros de cada dilución en una placa de Eggerth Gagnon y se esparcieron con la ayuda de perlas de vidrio estériles. Se realizó la siembra en placas de Eggerth Gagnon previamente reducido enriquecidas con sangre de caballo al 5 %. Se realizó la incubación a 37 ºC en la incubadora en la cámara anaerobia. Se contaron las unidades formadoras de colonias 48-72 horas después de la siembra.;[0285] Los resultados del experimento de liofilización y la viabilidad de las muestras evaluadas se muestran en la figura 5 y la tabla 10. Las formulaciones A y B proporcionan una buena recuperación para las cepas bacterianas 2-5 y 7-8.Evaluación de liofilización (secado por congelación) frente a congelación únicamente;[0286] Se evaluó el impacto del ciclo de liofilización sobre las cepas bacterianas en las formulaciones A y B comparando la liofilización de muestras frente a la congelación de muestras únicamente (es decir, congelación de las muestras a -80 ºC, pero sin la exposición de las muestras a “congelación-descongelación” a vacío). Se evaluó la viabilidad de las muestras de congelación-descongelación del mismo modo que la viabilidad para la muestra que se sometió al ciclo de liofilización.;[0287] Los resultados del experimento de ciclo de congelación-descongelación se muestran en la figura 5 y la tabla 10. Las formulaciones A y B proporcionan una buena estabilidad para las cepas bacterianas 2-5 y 7-8. Se evaluaron adicionalmente las cepas 1 y 6.;[0288] Tabla 10: Resultados de viabilidad del ejemplo 3;[0291] ;[0292] ;[0294] EJEMPLO 4;[0295] Se evaluaron adicionalmente las formulaciones de liofilización para las cepas bacterianas 1 y 6 (Clostridium bolteaeyDorea longicatena) usando excipientes adicionales (tablas 11 y 12) para mejorar el rendimiento después de la liofilización. Las formulaciones que no comprenden bacterias de la clase Clostridia, un disacárido, extracto de levadura, cisteína, metabisulfito de sodio y un tampón histidina, en las que el pH del tampón es de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3, no se encuentran dentro del alcance de la invención y se presentan únicamente con propósitos ilustrativos.;[0296] Las cepas 1 y 6 se recogieron a una DO de 2,83 y 1,27, respectivamente. Se dividieron alícuotas de los cultivos en tubos de centrífuga y se sedimentaron a 3560 RCF durante 10 minutos. Se descartaron los sobrenadantes y se colocaron los sedimentos en un recipiente anaerobio BD EZPak con una bolsa de generación de gas BD EZPak hasta su uso en los estudios.;[0297] Antes de las pruebas de viabilidad, se lavaron los sedimentos dos veces usando los tampones de formulación que iban a someterse a prueba, se dividieron alícuotas de 5 ml de la resuspensión final en viales y se liofilizaron. La liofilización usó un secado primario de -25 ºC a 100 mTorr y usó un secado secundario de 20 ºC a 100 mTorr. La tasa de rampa de temperatura usada en el ciclo de liofilización se aumentó hasta 2,5 ºC/min entre condiciones, en comparación con 1,0 ºC/min usada en los ejemplos 1-3.;[0298] Para evaluar la viabilidad de las cepas bacterianas, se resuspendieron las bacterias liofilizadas finales en 5 ml de medio y se sembraron para determinar el recuento de células viables después de la liofilización. Los excipientes en las formulaciones y los resultados para las cepas 1 y 6 se muestran en las tablas 11 y 12, respectivamente. Los recuentos de células viables iniciales antes de la liofilización para las cepas 1 y 6 eran de 2,14×10<9>UFC/ml y 5,15×10<7>UFC/ml, respectivamente. El promedio después de la liofilización es el promedio de resultados de dos viales.;[0299] Tabla 11: Excipientes en la formulación de liofilización y viabilidad de la cepa 1;[0302] ;[0304] Tabla 12: Excipientes en la formulación de liofilización y viabilidad de la cepa 6;[0307] ;[0308] ;[0310] EJEMPLO 5 (ÚNICAMENTE CON PROPÓSITOS ILUSTRATIVOS, NO FORMA PARTE DE LA INVENCIÓN) Este estudio se realizó para evaluar los parámetros de liofilización en las bandejas de secado por congelación (por ejemplo, bandejas de secado por congelación GORE<®>Lyoguard<®>) que se usarían para el aumento de escala del procedimiento de liofilización para la fabricación. Los estudios previos descritos en los ejemplos 1-4 se realizaron en viales de 20 ml. Se comparó un lote de ingeniería de la cepa 3 (Ruminococcus torques) con una bandeja de tampón de formulación en bandejas de secado por congelación independientes.;[0311] Se hizo crecer el cultivo bacteriano en un volumen de fermentador de 10 litros que se sometió a diafiltración en la formulación de 7 % de sacarosa, 1 % de extracto de levadura, 0,05 % de L-cisteína, tampón histidina 20 mM, pH 7,0. Se llenaron las bandejas de secado por congelación con un volumen de 750 ml. Se ejecutó el ciclo de liofilización con la tasa de rampa de 1 ºC/min. Los datos del ciclo de liofilización se muestran en la figura 6. El perfil de presión muestra que la presión de Pirani alcanzó 70 mTorr a las 48 h. Se eliminó el agua unida durante el secado secundario y la presión de Pirani alcanzó 70 mTorr a las 57 horas. El aspecto de las bandejas de secado por congelación después de la liofilización mostró tortas de liofilización que estaban intactas y no colapsaron (datos no mostrados), lo que demuestra la idoneidad del ciclo. La etapa de secado primario que usa 70 mTorr y -10 ºC junto con una etapa de secado secundario que usa 70 mTorr y 20 ºC liofilizaron con éxito la cepa 3 en las bandejas de secado por congelación. Este procedimiento con aumento de escala para la liofilización de composiciones bacterianas puede aplicarse a las demás cepas bacterianas.;[0312] EJEMPLO 6;[0313] Se realizaron estudios adicionales para evaluar la recuperación bacteriana usando el 0,05 % de metabisulfito de sodio como excipiente en la formulación y una rampa de temperatura aumentada de 2,5 ºC/min. Se inoculó un cultivo de cepa bacteriana 2 (Anaerotruncus colihominis) a partir de un criovial de 1 ml en un frasco de centrífuga de 500 ml. Se hizo crecer el cultivo durante la noche y se recogió a una DO de 0,325. Se centrifugaron estas bacterias y se lavaron con un tampón de formulación de liofilización que contenía el 7 % de sacarosa, el 1 % de extracto de levadura, el 0,05 % de cisteína, el 0,05 % de metabisulfito de sodio, e histidina 20 mM. Se sedimentaron de nuevo las bacterias, se descartó el sobrenadante, y se resuspendió el sedimento en un volumen final de 100 ml del mismo tampón de formulación de liofilización. Se dividieron alícuotas de siete mililitros de la resuspensión en viales de 20 ml y se liofilizaron usando una tasa de rampa de temperatura de 2,5 ºC/min entre puntos de mantenimiento de temperatura.;[0314] Se midió que la viabilidad de la cepa 2 antes de la liofilización era de 6,4×10<8>UFC/ml. La viabilidad después de la liofilización era de 1,93×10<8>UFC/ml, dando como resultado una viabilidad del 30 %. Este era un rendimiento mejorado con respecto a las ejecuciones previas, por lo que el tampón de formulación seleccionado para la cepa 2 incluía el 0,05 % de metabisulfito de sodio como excipiente. Se seleccionó la tasa de congelación de 2,5 ºC/min para la cepa 2 basándose en esta ejecución, que se usó como tasa de la tasa de rampa de temperatura entre todas las etapas durante la liofilización.;[0315] Las formulaciones y las condiciones del ciclo de liofilización para cada una de las cepas bacterianas 1-8 se muestran en la tabla 13.;[0316] Tabla 13: Formulaciones y condiciones de liofilización (las formulaciones que no comprenden bacterias de la clase Clostridia, un disacárido, extracto de levadura, cisteína, metabisulfito de sodio y un tampón histidina, en las que el pH del tampón es de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3, no se encuentran dentro del alcance de la invención y se presentan únicamente con propósitos ilustrativos);[0319] ;[0320] ;[0322] *La numeración de cepas corresponde a la tabla 7.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Composición liofilizada que comprende bacterias de la clase Clostridia, un disacárido, extracto de levadura, cisteína, metabisulfito de sodio y un tampón histidina, en la que el pH del tampón es de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el disacárido es trehalosa.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que la concentración de trehalosa es del 7,5 %, la concentración de extracto de levadura es del 1 %, la concentración de cisteína es del 0,05 %, y la concentración de tampón histidina es de 20 mM.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que el disacárido es sacarosa.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que la concentración de sacarosa es del 7,0 %, la concentración de extracto de levadura es del 1 %, la concentración de cisteína es del 0,05 %, y la concentración de tampón histidina es de 20 mM.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la concentración de metabisulfito de sodio es del 0,05 %.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que las bacterias pertenecen al grupo IV, XIVa, XVI, XVII, o XVIII deClostridium.

8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que las bacterias comprenden una o más cepas bacterianas seleccionadas del grupo que consiste enClostridium bolteae,Anaerotruncus colihominis,Ruminococcus torques,Clostridium symbiosum,Blautia producta,Dorea longicatena, ySubdolinogranulum spp.

9. Método para conservar bacterias, comprendiendo el método añadir bacterias de la clase Clostridia a una composición que comprende un disacárido, extracto de levadura, cisteína, metabisulfito de sodio y un tampón histidina, en la que el pH del tampón es de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, ó 7,3; y someter la composición que comprende las bacterias a un ciclo de liofilización.

10. Método según la reivindicación 9, en el que las bacterias pertenecen al grupo IV, XIVa, XVI, XVII, o XVIII deClostridium.