ES3055381T3 - Compositions comprising amino acids for prevention and/or treatment of cancer - Google Patents

Abstract

Composición para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer en un sujeto, comprendiendo la composición un agente activo, conteniendo dicho agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones que comprenden aminoácidos para la prevención y/o el tratamiento del cáncer

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente descripción se refiere en general a composiciones que comprenden aminoácidos para su uso en la prevención y el tratamiento del cáncer.

[0005] Antecedentes

[0006] Los cánceres tienen un perfil metabólico diferente con respecto a los tejidos normales y están surgiendo pruebas contrastadas sobre el papel de la actividad mitocondrial en la proliferación de las células cancerosas. El llamado efecto Warburg, el uso preferente de glucosa incluso en presencia de oxígeno, es una de las características distintivas de las células tumorales. Este fenómeno, definido inicialmente como "glucólisis aeróbica", condujo a la primera hipótesis de una función mitocondrial defectuosa en el cáncer. Sin embargo, se ha demostrado que este escenario es más complejo, y ahora existe un acuerdo general de que las mitocondrias del cáncer, durante la oncogénesis, participan en funciones pleiotrópicas, tales como la biosíntesis macromolecular, la resistencia a la apoptosis y la activación de la señalización oncogénica. Sin embargo, en los tumores se encuentran muchas mutaciones mitocondriales, y se ha demostrado que una disminución de la tasa de fosforilación oxidativa (OXPHOS), debido a una reducción de las especies reactivas del oxígeno (ROS), da lugar a una ventaja proliferativa y a un aumento de la proliferación de las células cancerosas. Además, dado el papel fundamental de la vía de la glucólisis en el crecimiento del cáncer, y puesto que la OXPHOS y la glucólisis están reguladas recíprocamente, resulta tentador especular con que la mejora de la función mitocondrial podría conducir a la inhibición de la glucólisis y a la muerte de las células cancerosas. Además, se ha prestado mucha atención y se han realizado grandes esfuerzos para desarrollar inhibidores glucolíticos como enfoque farmacéutico en la terapia contra el cáncer; se han desarrollado algunos fármacos de primera y segunda generación, pero su perfil de seguridad y el desarrollo de resistencia han suscitado algunas preocupaciones.

[0007] WO2020/00303 divulga una composición que comprende un agente activo, dicho agente activo contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y los ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico para su uso en el tratamiento de enfermedades hepáticas en un mamífero. EP2676664 divulga un agente para potenciar una actividad antitumoral de un agente quimioterapéutico contra un cáncer que contiene células madre cancerosas, que comprende al menos un tipo de aminoácido de cadena ramificada seleccionado entre isoleucina, leucina y valina.

[0008] WO2019/070750 divulga una composición para inhibir el crecimiento y/o proliferación de células cancerosas que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en uno o más aminoácidos libres seleccionados de prolina, serina, treonina, tirosina, valina, asparagina, glicina, triptófano, lisina, leucina, fenilalanina, metionina, arginina, histidina y cisteína, y opcionalmente un portador, tampón, electrolito, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0009] Sumario de la invención

[0010] La presente descripción tiene por objeto proporcionar nuevas composiciones particularmente eficaces en la prevención y/o el tratamiento del cáncer y dotadas de un perfil de administración seguro. De acuerdo con la presente descripción, el objeto anterior se consigue gracias a la materia específicamente recordada en las reivindicaciones siguientes, que se entiende forman parte integrante de la presente divulgación.

[0011] Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0012] Una realización de la presente descripción proporciona una composición para su uso en la prevención y/o en el tratamiento del cáncer como se define en las reivindicaciones en un sujeto, la composición que comprende un agente activo, dicho agente activo que contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.

[0013] El cáncer se selecciona en el grupo que consiste en melanoma, adenocarcinoma, carcinoma colorrectal, cáncer de mama.

[0014] En una o más realizaciones, el agente activo de la composición puede contener además uno o más aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y tirosina.

[0015] Breve descripción de las cifras

[0016] La invención se describirá a continuación, a modo de ejemplo únicamente, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

[0017] - La figura 1 muestra un ensayo de viabilidad MTT en células cancerosas y normales incubadas durante los tiempos indicados, con un medio normal (DMEM) o con la composición de la aplicación instantánea (α5). * p < 0,01 ** p< 0,05 vs DMEM.

[0018] - La figura 2 muestra un ensayo de herida por arañazo en células de melanoma B16F10 a cero (0) horas e incubadas durante 24 horas (h) en DMEM (NT) o con la composición α5 (α5).

[0019] - La figura 3 muestra un ensayo de formación de colonias en células HeLa incubadas durante 24 h en DMEM (NT) o en la composición α5 (α5).

[0020] - La figura 4 muestra los resultados del análisis western blot de la translocación del citocromo C (CytC) y los marcadores de apoptosis en células de melanoma M14 incubadas durante 24 h en DMEM (NT) o en la composición α5 (α5). PARTE SUPERIOR: α5 induce la translocación específica de CytC, pero no de COX4, en el citosol (PMS) de las células tratadas. PARTE INFERIOR: Escisión de PARP-1 y caspasa 3 en células M14. - La figura 5 muestra los resultados del análisis western blot de la vía mTOR y HIF1α en células incubadas durante 5 h en DMEM (NT) o en la composición α5 (α5). IZQUIERDA: niveles de fosfo-p70S6K (thr386), como marcador de la actividad de mTOR en fibroblastos M14, Hela, B16F10 y Detroit 573. DERECHA: Expresión de HIF1α en células M14 y Hela. GAPDH se muestra como control de carga.

[0021] - La figura 6 muestra la actividad metabólica en células cancerosas y en células normales. Glucólisis (IZQUIERDA) y OCR (DERECHA) en células HeLa, M14 y HL-1 tras 1 h de tratamiento con DMEM (NT) o en la composición α5 (α5). * p < 0,01 vs NT.

[0022] - La figura 7 se refiere a la proliferación de células de cáncer de mama MCF7. (A) Ensayo de fosfatasa ácida: las células (5.000-20.000/pocillo en placas de 96 pocillos) se trataron con una composición de α5 al 1 % durante 48 h y 1 µM de doxorrubicina (DOX) durante 16 h. (B)

[0023] Ensayo de proliferación: las células (50.000/pocillo en placas de 12 pocillos) se trataron como en (A) y se utilizó el ensayo de exclusión con azul tripán. n = 3 experimentos. *p < 0,05 y **p < 0,01 frente a células no tratadas. Todos los datos se presentan como media ± DE.

[0024] Descripción detallada de las realizaciones preferentes

[0025] En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones.

[0026] La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización" o "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización está incluido en al menos una realización. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta especificación no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. Los títulos que figuran en el presente documento se utilizan únicamente por comodidad y no interpretan el alcance o significado de las realizaciones.

[0027] Una realización de la presente descripción proporciona una composición para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer como se define en las reivindicaciones en un sujeto, la composición que comprende un agente activo, dicho agente activo que contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.

[0028] El cáncer se selecciona en el grupo que consiste en adenocarcinoma, melanoma, carcinoma colorrectal, cáncer de mama.

[0029] La divulgación proporciona además preparaciones combinadas que comprenden la composición divulgada en el presente documento y al menos un agente quimioterapéutico para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención y/o tratamiento de un cáncer como se define en las reivindicaciones en un sujeto.

[0030] El Inventor de la presente solicitud ha encontrado sorprendentemente que la composición divulgada en el presente documento es particularmente eficaz en la reducción de la tasa de proliferación de células cancerosas, tales como células de cáncer cervical, células de melanoma, células de cáncer de colon, células de cáncer de mama y no tiene ningún efecto sobre la tasa de proliferación de células normales. La composición también ha demostrado ser eficaz en la inhibición de la motilidad y el potencial clonogénico de las células cancerosas. Muy importante, la composición ejerce un efecto inhibidor sobre la vía mTOR y esta evidencia es digna de mención, ya que un aumento de la actividad mTOR se asocia a menudo con la tumorigénesis y se sabe que las composiciones a base de aminoácidos esenciales activan la vía mTOR.

[0031] Además, como se muestra en las secciones siguientes, la composición puede administrarse con seguridad sola o en combinación con al menos un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos pueden ser, por ejemplo, al menos una antraciclina, por ejemplo doxorrubicina.

[0032] En una o más realizaciones, la composición divulgada en el presente documento comprende un agente activo, dicho agente activo contiene ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico en combinación con leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, y la proporción en peso entre la cantidad total de ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico y la cantidad total de los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina está comprendida entre 0,05 y 0,3, preferiblemente entre 0,1 y 0,25.

[0033] En una o más realizaciones, la composición puede consistir en leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico y, opcionalmente, vitamina B1 y vitamina B6.

[0034] En una o más realizaciones, el agente activo puede comprender además uno o más aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína, tirosina.

[0035] En una o más realizaciones, La composición puede comprender un agente activo consistente en leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y opcionalmente tirosina, así como ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, siendo dichos aminoácidos los únicos aminoácidos contenidos en la composición.

[0036] En una o más realizaciones, la composición puede estar libre de cualquier otro agente activo, tal como cualquier agente quimioterapéutico, es decir, cualquier agente que inhiba directa o indirectamente la proliferación de células de crecimiento rápido, ejerciendo un efecto antineoplásico.

[0037] En una o más realizaciones, la composición puede consistir en leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína, tirosina, ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico y, opcionalmente, vitamina B1 y/o vitamina B6.

[0038] La composición puede comprender los aminoácidos isoleucina, leucina y valina en una cantidad comprendida entre el 35 % y el 65 % en peso, preferiblemente entre el 42 % y el 56 % en peso con respecto al peso del agente activo.

[0039] La relación en peso entre la leucina y el ácido cítrico puede estar comprendida entre 5 y 1, preferiblemente entre 2,50 y 3,50.

[0040] En otra realización, la cantidad molar o en peso de ácido cítrico es superior a la cantidad molar o en peso de ácido málico y ácido succínico. Preferiblemente, la cantidad en peso o molar de ácido cítrico es superior a la cantidad en peso o molar global de ácido málico más ácido succínico. En otra realización, la relación en peso entre el ácido cítrico y la suma del ácido málico y el ácido succínico está comprendida entre 1,0 y 4,0, preferiblemente entre 1,5 y 2,5. En una realización preferida, la relación en peso ácido cítrico: ácido málico: ácido succínico está comprendida entre 10:1:1 y 2:1,5:1,5, preferiblemente entre 7:1:1 y 1,5:1:1, más preferiblemente entre 5:1:1 y 3:1:1. En una realización preferida, la proporción en peso de ácido cítrico: ácido málico: ácido succínico es de 4:1:1.

[0041] La relación molar isoleucina: leucina preferida está comprendida en el intervalo 0,2-0,7, preferiblemente en el intervalo 0,30-0,60 y/o la relación en peso valina: leucina preferida está comprendida en el intervalo 0,2-0,70, preferiblemente en el intervalo 0,30-0,65.

[0042] En otra realización, la relación molar treonina: leucina está comprendida en el intervalo 0,10-0,90, preferiblemente en el intervalo 0,20-0,70 y/o la relación en peso lisina: leucina está comprendida en el intervalo 0,20-1,00, preferiblemente en el intervalo 0,40-0,90.

[0043] En una realización preferida, la relación entre la cantidad molar global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad molar global de metionina, fenilalanina, histidina y triptófano es superior a 1,35.

[0044] En una o más realizaciones, la relación en peso entre la suma de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la suma de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina está comprendida entre 0,1 y 0,4, preferiblemente entre 0,15 y 0,35.

[0045] En otra realización, la cantidad global en peso de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina más treonina y lisina es superior a la cantidad global en peso de los tres ácidos ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico. Preferiblemente, la cantidad en peso de los ácidos simples (ácido cítrico, ácido succínico o ácido málico) es inferior a la cantidad en peso de cada uno de los aminoácidos simples leucina, isoleucina, valina, treonina y lisina.

[0046] En otra realización, la cantidad molar total de lisina y treonina es superior a la cantidad molar total de los tres ácidos: ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico. preferiblemente, la relación entre la cantidad molar global de los tres ácidos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico y la cantidad molar global de lisina y treonina está comprendida entre 0,1 y 0,7, preferiblemente entre 0,15 y 0,55.

[0047] En una o más realizaciones, la composición divulgada en el presente documento comprende además vitaminas, preferiblemente seleccionadas en el grupo de las vitaminas B, tales como vitamina B<1>y/o vitamina B<6>. La composición puede incluir hidratos de carbono, sustancias aromatizantes, edulcorantes naturales y artificiales, excipientes. Los excipientes pueden seleccionarse entre maltodextrinas, fructosa, aceite de pescado, sucralosa, ésteres de sacarosa, vitamina D3, vitaminas del grupo B.

[0048] En una o más realizaciones, la composición puede ser una composición farmacéutica que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable como se ha divulgado anteriormente.

[0049] Los aminoácidos descritos en la presente divulgación pueden sustituirse por sus respectivos derivados farmacéuticamente aceptables, es decir, sales.

[0050] Además, en particular al preparar las composiciones según la presente divulgación, y específicamente el agente activo, debe evitarse el aminoácido arginina. Además, otros aminoácidos específicamente excluidos por la composición divulgada en el presente documento son serina, prolina, alanina. Dichos aminoácidos pueden ser contraproducentes o incluso perjudiciales en algunas concentraciones o proporciones estequiométricas dentro de la composición.

[0051] Para uso oral, las composiciones según la descripción pueden presentarse en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos, gel, polvo gelificante, polvo.

[0052] La divulgación también proporciona un procedimiento para prevenir y/o tratar el cáncer en un sujeto, el procedimiento comprende seleccionar una composición que comprende un agente activo, dicho agente activo contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, y los ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, y administrar la composición al sujeto. El agente activo puede comprender además uno o más aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína, tirosina, como se divulga en el presente documento. La composición puede administrarse sola, por lo que el procedimiento consiste en seleccionar la composición y administrar la composición al sujeto. En una o más realizaciones, la composición también puede administrarse -simultánea, separada o secuencialmente- con al menos un agente quimioterapéutico, preferiblemente al menos una antraciclina, más preferiblemente dicha al menos una antraciclina seleccionada en el grupo que consiste en doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, pixantrona, sabarrubicina, valrubicina, derivados de los mismos.

[0053] Otras especificaciones, en términos de cantidades y proporciones entre los diversos aminoácidos proporcionados por las composiciones, están contenidas en las reivindicaciones adjuntas, que forman parte integrante de la enseñanza técnica proporcionada en el presente documento en relación con la invención.Ejemplos

[0054] La Tabla 1 muestra la composición divulgada en la presente solicitud (denominada "α5"). La composición comprende un agente activo que contiene aminoácidos en combinación con ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, y no contiene ningún agente quimioterapéutico.

[0055] Tabla 1

[0058]

[0059]

[0062] La composición de la Tabla 1 anterior puede prepararse en primer lugar tamizando todos los componentes con una malla de 0,8. Para obtener una premezcla, cada ingrediente (en una cantidad <10 % en peso de la cantidad total) se introduce en una bolsa de polietileno junto con una porción de L-lisina HCl hasta obtener el 10 % del peso de la composición total. A continuación, la bolsa se agita manualmente durante 5 minutos. A continuación, la premezcla se carga en una mezcladora (Planetaria) junto con el resto de los ingredientes y se mezcla durante un periodo de 15 minutos a 120 rpm para obtener una composición final homogénea.

[0063] Procedimientos

[0064] Células y tratamientos

[0065] Las líneas celulares utilizadas fueron: B16F10 (melanoma de ratón, ATCC # CRL-6475), C2C12 (mioblastos de ratón, ATCC # CRL-1772), HeLa (adenocarcinoma humano, ATCC # CCL-2), Detroit 573 (fibroblastos humanos, ATCC # CCL-117), NIH3T3 (fibroblastos embrionarios de ratón, ATCC # CRL-1658), MCF-7 (línea celular de cáncer de mama humano, ATCC # HTB-22), HCT116 (células de carcinoma colorrectal humano ATCC # CCL-247), M14 (melanoma humano) [Chee DO et al.1976 Cancer Res.36(4):1503-9], HCT116 TP53 (-/-) (células de carcinoma colorrectal humano p53 nulo) [Sur S et al. 2009 Proc Natl Acad Sci U S A. 10;106(10)], HL-1 (cardiomiocitos de ratón) [Sigma-Aldrich (Milán, Italia) (SCC065)].

[0066] Las células se cultivaron rutinariamente en medio de cultivo estándar “Dulbecco's modified eagle médium” (DMEM) suplementado con 4 mM de glutamina, 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 100units/ml de penicilina/estreptomicina (todos los reactivos de Sigma-Aldrich, Milán, Italia) hasta el 80 % de confluencia. Para los tratamientos con α5, las células se incubaron durante los periodos indicados en DMEM completo o con una solución al 1 % de mezcla de α5 disuelta en el mismo medio.

[0067] Las células MCF-7 se cultivaron en DMEM como se ha indicado anteriormente y se trataron con composición α5 al 1 % durante 48 h y doxorrubicina (DOX; Sigma-Aldrich, Milán, Italia) 1 µM durante 16 h (Figura 7). Ensayo de viabilidad

[0068] La viabilidad de las células se determinó mediante el ensayo estándar MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]. Todos los tratamientos se realizaron utilizando 2×10<4>células/pocillo en una placa de 96 pocillos en 100 µl de medio. Los cristales de formazán púrpura se disolvieron en SDS al 5 %/0,1M de HCl (100 µl/pocillo), y la absorbancia se registró en un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm.

[0069] Ensayo de cicatrización en monocapa

[0070] Las células se cultivaron hasta confluencia total en placas de 24 pocillos en sus medios de crecimiento y luego se incubaron durante la noche en medios de control o en medios que contenían α5. A continuación, se rascaron los cultivos celulares con una punta de pipeta estéril de 200 µl y se lavaron abundantemente con PBS para eliminar las células desprendidas y los restos. Para evaluar la recuperación de la capacidad de migración, se tomaron imágenes microscópicas después de 16-24 h.

[0071] Clonogénico ensayo de supervivencia.

[0072] Se sembraron de 100 a 1000 células por triplicado en placas de seis pocillos un día antes del tratamiento con DMEM de control o composición α5. A continuación, se dejó crecer a las células en medios DMEM o α5 hasta que formaron colonias durante unos 10 días. Las colonias supervivientes se fijaron con metanol al 100 % y se tiñeron con azul de metileno en metanol. Se realizaron al menos tres experimentos biológicos independientes. Análisis Western blot

[0073] Los extractos de células enteras se aislaron utilizando tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Na pirofosfato, 1 % Triton X-100, 10 % glicerol) complementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. La concentración de las proteínas aisladas se determinó mediante el ensayo de proteínas BCA Se separaron 15-20 microgramos de la proteína en un gel de Tris-glicina al 4-20 % y se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa o PVDF (Bio-Rad, Segrate (MI) - Italia). Tras incubar con leche en polvo descremada al 5 % en TBS-T (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) durante 60 min, se lavó la membrana una vez con TBS-T y se incubó con los anticuerpos apropiados a 4 °C durante 12 h. Las membranas se lavaron tres veces durante 10 min y se incubaron con una dilución 1:3000 de anticuerpos anti-ratón o anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 2 h. Las manchas se lavaron tres veces con TBS-T y se revelaron con el sistema ECL. Los anticuerpos utilizados fueron: pp70S6K (Thr389) (Cell Signaling cat # 9205), p70S6K (Cell Signaling cat # 9202), HIF1-α (BD Biosciences cat # 610958), GAPDH (Cell Signaling cat # 2118), CytC (Cell Signaling cat # 4280), COXIV (Cell Signaling cat # 4844), PARP (Trevigen # 4338), Caspasa 3 (Cell Signaling cat # 9662).

[0074] Medición de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y de la tasa de acidificación extracelular (ECAR)La tasa de cambio del O<2>disuelto (tasa de consumo de oxígeno, OCR) y la tasa de cambio del pH (tasa de acidificación extracelular, ECAR) se midieron en el analizador XF24 (Seahorse Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante.

[0075] Las células (2-4x10<3>por pocillo) se colocaron en microplacas de cultivo celular XF24 (Seahorse Biosciences, MA, EE.UU.) y, tras 18 h, se equilibraron con DMEM sin bicarbonato (Seahorse Biosciences) suplementado con glucosa a 37 °C durante 1 h en una incubadora sin CO<2>. Tras la medición basal de la OCR, se inyectaron en los pocillos los compuestos oligomicina (2 µM), el desacoplador cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP) (1 µM) y los inhibidores del transporte de electrones rotenona y antimicina A (R/A) (ambos 0,5 µM) para controlar la respiración desacoplada, máxima y no mitocondrial, respectivamente. Los compuestos se inyectaron en los pocillos a las horas indicadas.

[0076] Ensayo de fosfatasa ácida

[0077] Para cuantificar el crecimiento de células MCF7, se utilizó el ensayo de fosfatasa ácida descrito [Yang TT et al.

[0078] 1996 Anal Biochem.241(1):103-8]. Brevemente, se colocaron células MCF7 en placas de 96 pocillos a una densidad de 5.000 a 20.000 células por pocillo y se trataron con α5 al 1% (durante 48 h) y 1 µM de DOX (durante 16 h). Se retiró el medio de cultivo y cada pocillo se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2), y se añadió con 100 µl de tampón que contenía acetato sódico 0,1 M (pH 5,0), 0,1 % de Triton X-100 y 5 mM de p-nitrofenilfosfato (pNPP). A continuación, las placas se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 2 h. La reacción se detuvo con la adición de 10 µl de NaOH 1 N, y el desarrollo del color se evaluó a 405 nm. La hidrólisis no enzimática de pNPP se midió en pocillos sin células.

[0079] Análisis estadístico

[0080] Las comparaciones por pares entre las medias de los distintos grupos se realizaron mediante una pruebade Student(de dos colas, no apareada). Los datos se consideraron significativos con p < 0,05.

[0081] Resultados

[0082] Efecto inhibidor de la α5 composición sobre la proliferación, motilidad y capacidad de formación de clones de células cancerosas

[0083] En primer lugar se probó el efecto de la administración de la composición α5 sobre la proliferaciónin vitrode células cancerosas. Para ello, se incubaron varias líneas celulares cancerosas con la composición α5 (1 %). Como se muestra en la figura 1, la composición α5 disminuyó el crecimiento de las células cancerosas con respecto a las células cultivadas únicamente con medio de control. Y lo que es más importante, el tratamiento con α5 no afectó al crecimiento de células normales no cancerosas. Cabe señalar que α5 redujo la viabilidad tanto de HCT116 de tipo salvaje (WT) como de p53 -/-, demostrando así su eficacia también en ausencia de p53; dado que p53, que es uno de los genes supresores tumorales más importantes, está mutado e inactivo en muchos tumores, este dato amplía enormemente el rango de acción de α5.

[0084] Cabe destacar que la mezcla α5 fue capaz de inhibir el crecimiento de las células cancerosas ya 24 h después del inicio del tratamiento. Este rápido efecto fue especialmente pronunciado en las células HCT116 WT y p53 -/- y Hela (49 %, 44 % y 46 % de inhibición, respectivamente); el efecto inhibidor del crecimiento de α5 siguió aumentando a las 48 h y, a las 72 h, alcanzó el 74 %, 61 % y 70 % de inhibición. Sin embargo, la mezcla también fue eficaz en células de melanoma humano y de ratón; en particular, a las 72 h, α5 inhibió el crecimiento del melanoma de ratón B 16F 10 en un 87 %.

[0085] La administración de la composición α5 también redujo la motilidad de las células cancerosas, evaluada mediante el ensayo de rascado-herida en B16F10. Las células confluentes se rayaron (0 h) y luego se incubaron en medios de control o de composición α5. Como se muestra en la figura 2, 24 h después del rayado, las células incubadas en medios de control reanudaron la proliferación y la motilidad, mientras que las incubadas en α5 no lo hicieron, mostrando así una capacidad de migración reducida.

[0086] Además, la composición α5 también bloqueó por completo la capacidad de formación de clones en células HeLa, cuando se cuestionó el potencial clonogénico unicelular en un ensayo de formación de colonias. Como se muestra en la figura 3, mientras que las células incubadas en el medio de control formaron eficientemente colonias derivadas de una sola célula durante diez días de crecimiento, la incubación en la composición α5 redujo en gran medida la capacidad de las células HeLa para formar colonias, confirmando por tanto que α5 bloquea la capacidad reproductiva de las células cancerosas y la capacidad del cáncer para someterse a una división ilimitada.

[0087] La composición α5 promueve la muerte celular apoptótica de las células cancerosa.

[0088] Para evaluar si la reducción de la proliferación celular observada se debía a un bloqueo de la división celular o a la inducción de la muerte celular, se analizaron diversos marcadores apoptóticos en el melanoma M14. Es bien sabido que, durante la apoptosis, la proteína mitocondrial citocromo C (CytC) se libera en el citosol celular; con este fin, se incubaron células M14 en medios de control o α5 durante 24 h y, a continuación, se realizó el fraccionamiento celular separando las mitocondrias (mito) de la fracción citosólica (sobrenadante postmitocondrial - PMS). A continuación, se evaluó la localización de CytC mediante análisis western blot tanto en mitocondrias como en PMS. Como control, destinado a verificar que la liberación de CytC en el SMP era el resultado específico de la apoptosis y no la consecuencia de un daño mitocondrial (es decir, durante el procedimiento de fraccionamiento), también se evaluó la localización del citocromo oxidasa 4 (Cox4), que no se libera durante la apoptosis.

[0089] Como se muestra en la fig. 4, el análisis de inmunoblot mostró translocación específica de CytC, pero no de Cox4, en PMS de células M14 incubadas en α5 durante 24 h. Además, tras 24 h de tratamiento con composición α5 en células de melanoma M14 se observó una clara división de Parp-1, otro conocido marcador apoptótico. Además, 24 h de composición α5 también indujeron la escisión y formación de la caspasa 3 proapoptótica en células de melanoma M14 (figura 4).

[0090] Estos resultados apoyan firmemente la evidencia de que la composición α5 promueve la muerte celular apoptótica de las células cancerosas.

[0091] Efecto inhibidor de la composición α5 sobre la expresión de fosfo-p70S6k y HIF1α

[0092] Una de las principales dianas de los aminoácidos intracelulares es la vía de la diana mecanicista de la rapamicina (mTOR), un regulador principal del crecimiento y la división celular que integra las señales nutricionales con la inducción de la síntesis de proteínas y el crecimiento celular mediante la fosforilación de su efector corriente abajo, la quinasa p70S6.

[0093] Dado que la vía mTOR está desregulada en varios tipos de cáncer y que su activación se asocia frecuentemente con los procedimientos celulares oncogénicos, potenciando así la tumorigenicidad, el Inventor de la presente solicitud también investigó el estado de fosforilación de p70S6 como indicador de la actividad mTOR en células cancerosas tratadas con el medio de cultivo estándar DMEM o con la composición α5.

[0094] Como se muestra en la figura 5, los niveles de fosforilación de la quinasa p70S6 se redujeron en las células M14, HeLa y B16F10 tratadas con α5 con respecto a las células incubadas en medio de cultivo estándar (columna "NT" o "No tratadas" en la figura 5); estos resultados indican que la composición α5 ejerció sorprendentemente un efecto inhibidor sobre la vía mTOR, descartando así su activación. Curiosamente, la fosforilación de p70S6k no se vio afectada en las células Detroit 573 normales.

[0095] Y lo que es más importante, la composición α5 también reguló a la baja, tanto en las células M14 como en las HeLa, los niveles de expresión del factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF1α), que es uno de los oncogenes más importantes implicados en la tumorigénesis (figura 5).

[0096] Dado que, como oncogén principal, HIF1α es también un regulador fundamental de la glucólisis del cáncer, se analizó la tasa de acidificación extracelular (ECAR), como medida de la tasa glucolítica, tanto en células cancerosas como normales, sin tratar (NT) o incubadas con la composición α5 durante 1 h. Como se muestra en la figura 6, el tratamiento con la composición α5 redujo significativamente la ECAR basal en células cancerosas (p < 0,01 frente a NT), mientras que disminuyó ligeramente la glucólisis en cardiomiocitos HL-1 no tumorales de control (NS). Sin embargo, la OCR no aumentó en M14 y HeLa, mientras que sí lo hizo en los cardiomiocitos de control HL-1 (p < 0,01 frente a NT).

[0097] Estos datos demuestran que la composición aguda de α5 bloquea la glucólisis en las células cancerosas mientras que aumenta simúltanamente la OCR sólo en las células normales.

[0098] El efecto antiproliferativo del DOX se potencia en las células de cáncer de mama MCF7 en presencia de la composición α5

[0099] El efecto de la exposición de la línea celular de cáncer de mama MCF7 a la composición α5 sola o en combinación con doxorrubicina (DOX) se evaluó con dos ensayos diferentes (Figura 7A y 7B). El efecto antiproliferativo del DOX en las células MCF7 no se vio afectado en absoluto por la presencia del aminoácido (Figura 7A y 7B): de forma muy interesante, el efecto antiproliferativo en la célula cancerosa se potencia cuando el DOX se administra junto con la composición α5.

[0100] En conjunto, los resultados muestran que la composición divulgada en el presente documento es capaz de bloquear la proliferación de células cancerosas. Cabe destacar que el efecto es específico para las células cancerosas, ya que la proliferación de células normales no se vio afectada por la composición α5, con un perfil de seguridad sustancial y ausencia de efectos secundarios tóxicos.

[0101] Y lo que es más importante, la composición α5 ejerce un efecto inhibidor sobre la vía mTOR, evaluado por la reducción de la fosforilación (actividad) de su diana descendente p70S6K. Una vez más, esto es digno de mención, ya que el aumento de la actividad mTOR se asocia a menudo con la tumorigénesis y se sabe que las composiciones a base de aminoácidos esenciales activan la vía mTOR.

[0102] La composición divulgada en el presente documento comprende aminoácidos específicos y ácidos tricarboxílicos (intermediarios del ciclo TCA); la administración de la composición puede potenciar la actividad mitocondrial y la OCR y, como consecuencia, desplazar la actividad metabólica de la glucólisis hacia la oxidación de aminoácidos e intermediarios del ciclo TCA, lo que conduce a la regulación a la baja de la glucólisis.

[0103] Sorprendentemente, a pesar de inhibir eficazmente la glucólisis en las células cancerosas, este cambio sólo se produjo en las células no cancerosas (como se muestra en la figura 6). Este resultado podría atribuirse a la extrema sensibilidad de las células cancerosas a la glucólisis, cuya rápida inhibición ejercida por la composición α5, muy probablemente activa el inicio de la apoptosis antes de que pudiera tener lugar cualquier cambio a OCR.

[0104] Por lo tanto, la composición de la presente solicitud ha demostrado ser eficaz para reducir la tasa de proliferación de las células cancerosas sin presentar efectos secundarios.

[0105] La composición puede utilizarse sola o también en preparaciones combinadas con al menos un agente quimioterapéutico; los resultados proporcionados en el presente documento muestran que cuando se administra junto con doxorrubicina, la tasa de proliferación de células cancerosas se reduce aún más. Por lo tanto, el efecto de las terapias combinadas también permite reducir en gran medida la dosificación de los fármacos quimioterápicos, lo que conduce a un enfoque anticanceroso más eficaz y seguro.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer en un sujeto, la composición que comprende un agente activo, dicho agente activo que contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, en el que dicho cáncer se selecciona en el grupo que consiste en adenocarcinoma, melanoma, carcinoma colorrectal y cáncer de mama.

2. Una composición para uso según la reivindicación 1, en la que la relación en peso entre la suma de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la suma de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina más lisina y treonina está comprendida entre 0,05 y 0,3, preferiblemente entre 0,1 y 0,25.

3. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso entre la cantidad global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad global de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina está comprendida entre 0,1 y 0,4, preferiblemente entre 0,15 y 0,35.

4. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso entre el ácido cítrico y la suma del ácido málico y el ácido succínico está comprendida entre 1,0 y 4,0, preferiblemente entre 1,5 y 2,5.

5. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso ácido cítrico: ácido málico: ácido succínico está comprendida entre 10:1:1 y 2:1,5:1,5, preferiblemente entre 7:1:1 y 1,5:1:1, más preferiblemente entre 5:1:1 y 3:1:1.

6. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente activo comprende además al menos un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, tirosina, cisteína.

7. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente activo comprende además histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y opcionalmente tirosina.

8. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación entre la cantidad molar global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad molar global de metionina, fenilalanina, histidina y triptófano es superior a 1,35.

9. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación entre la cantidad molar global de los tres ácidos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico y la cantidad molar global de lisina y treonina está comprendida entre 0,10 y 0,70, preferiblemente entre 0,15 y 0,55.

10. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el peso o la cantidad molar de ácido cítrico es superior al peso o la cantidad molar global tanto de ácido málico como de ácido succínico.

11. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso entre la leucina y el ácido cítrico está comprendida entre 5 y 1, preferentemente entre 2,50 y 3,50.

12. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición no contiene arginina.

13. Una composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composición no contiene serina, prolina, alanina.

14. Una preparación combinada que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y al menos un agente quimioterapéutico para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención y/o tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que dicho cáncer se selecciona en el grupo que consiste en adenocarcinoma, melanoma, carcinoma colorrectal y cáncer de mama.