ES3055471T3 - Methods and means for genetic alteration of genomes utilizing designer dna recombining enzymes - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos y medios para alterar específicamente la secuencia de ADN en un genoma, en particular para la edición genómica mediante la eliminación o sustitución de una secuencia de interés. Ventajosamente, la invención utiliza dos secuencias no idénticas presentes de forma natural en un genoma como sitios diana, a partir de los cuales se generan enzimas recombinantes de ADN. La invención es particularmente útil en medicina, en particular para reparar una mutación en un genoma o eliminar material genético predefinido de células o tejidos, y para curar enfermedades. Una ventaja de la invención es que permite la alteración precisa del ADN dirigida a un sitio específico sin afectar las vías de reparación del ADN del huésped y, por lo tanto, funciona sin inducir inserciones y deleciones aleatorias (indels). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos y medios para la alteración genética de genomas utilizando enzimas de recombinación de ADN diseñadas

[0003] La invención proporciona métodos y medios para alterar específicamente la secuencia de ADN en un genoma. Se proporcionan vectores y métodos para generar enzimas de recombinación de ADN diseñadas. La invención es útil para la medicina, en particular para reparar una mutación en un genoma o para suprimir material genético predefinido de células o tejidos y para curar enfermedades. Además, la invención es útil para la investigación biológica y biomédica (por ejemplo, para crear modelos animales).

[0004] En las últimas décadas se han identificado muchas mutaciones genéticas que causan enfermedades humanas. Los recientes avances en el campo de la edición del genoma proporcionan ahora una oportunidad real para establecer enfoques innovadores para reparar lesiones del ADN con el fin de reemplazar, modificar o regenerar células que funcionan de manera anómalain vitro,o en el cuerpo.

[0005] Sin embargo, la mayoría de las tecnologías de edición genómica desarrolladas recientemente, como las nucleasas de dedos de zinc (por ejemplo, documento US20150093802 A1), TALEN (por ejemplo, documento WO2014134412 A1) y CRISPR/Cas9 (por ejemplo, documento US 8,697,359 B1) introducen rupturas de ADN de doble cadena en un locus objetivo como primera etapa para la corrección genética. Estas rupturas son posteriormente reparadas por uno de los mecanismos intrínsecos de reparación del ADN de la célula, induciendo típicamente una abundancia de inserciones y supresiones aleatorias (indels) en el locus objetivo. Idealmente, la edición terapéutica del genoma debería, sin embargo, ser eficiente y específica, sin la introducción de inserciones/supresiones.

[0006] Las enzimas de recombinación de ADN, en particular los sistemas de recombinasa específica de sitio (SSR), permiten una manipulación precisa del ADN sin desencadenar las rutas de reparación endógenas del ADN y poseen la capacidad única de realizar tanto la escisión como el resellado inmediato del ADN procesadoin vivo.Además, los sistemas de SSR, como Cre/loxP (EP 02200009 B1) han encontrado un uso generalizado en organismos modelo, lo que demuestra que pueden ser seguros, incluso cuando se expresan de por vida en animales. Las SSR funcionan como tetrámeros en sus sitios objetivo y, dependiendo de la orientación de estos sitios, la recombinación puede dar lugar a una variedad de resultados. Se sabe que la secuencia de aminoácidos de Cre se puede modificar para obtener nuevas recombinasas específicas de sitio (Buchholz F and Stewart AF 2001).

[0007] Otros sistemas de SSR conocidos en la técnica incluyen el sistema Flp/FRT (WO 1999025841 A1 y US 6,774,279 B2), el sistema Dre/rox (US 7,422,889 B2 y US 7,915,037 B2), el sistema VCre/VloxP y el sistema sCre/SloxP (WO 2010/143606 A1), así como los sistemas Vika/vox, Nigri/nox y Panto/pox (WO 2014/016248 A1).

[0008] Las enzimas de recombinación de ADN de origen natural, en particular los sistemas de recombinasa específica de sitio (SSR) (como las SSR de tipo tirosina), generalmente consisten en cuatro monómeros idénticos. En general, reconocen dos sitios objetivo palindrómicos idénticos y simétricos, que consisten cada uno de dos semisitios de 13 nucleótidos de longitud separados por un espaciador asimétrico, frecuentemente de 8 nucleótidos de longitud. Dependiendo del número y la orientación relativa de los sitios objetivo, la enzima de recombinación del ADN provoca una supresión, una inserción, una inversión o un reemplazo del contenido genético.

[0009] Una de las principales limitaciones para el uso de enzimas de recombinación de ADN en la edición terapéutica del genoma ha sido el número limitado de secuencias que se pueden recombinar.

[0010] En el documento WO2008083931A1 esta limitación se abordó en cierta medida mediante la evolución molecular dirigida de recombinasas adaptadas (Tre 1.0) que utilizan secuencias en la repetición terminal larga (LTR) del VIH como sitios de reconocimiento (loxLTR Tre 1.0). Los desarrollos posteriores de este enfoque utilizando sitios objetivo asimétricos se describieron en el documento WO2011147590 A2 (Tre 3.0) y WO2016034553 A1 (Tre 3.1 y uTre/Brec1), así como la publicación Karpinski J et al 2016 (Brec1). Sin embargo, en todos los casos este enfoque tiene una utilidad limitada, porque el sitio de reconocimiento exacto con una longitud de 34 pares de bases debe estar presente dos veces en el genoma (como en la LTR de un provirus HI integrado) para que el sistema funcione.

[0011] El documento WO2009007982A1 describe secuencias de ácidos nucleicos ubicadas en la LTR del VIH-1 como sitios objetivo potenciales para enzimas de recombinación de ADN.

[0012] El documento US2009/0217400 A1 describe una enzima y un método para la recombinación en sitios objetivo asimétricos loxP-M7. Además, Zhang, C. et al. (2015) y US 20170058297 A1 describen un complejo heterotetramérico obligado de dos mutantes Cre que reconocen sitios objetivo asimétricos loxP-M7. Sin embargo, estos sitios de reconocimiento se deben introducir artificialmente en el genoma.

[0013] El documento US 20040003435 A1 describe un método para la inserción dirigida de una secuencia de interés en una planta, dicho método comprende introducir un casete de transferencia que comprende dicha secuencia de nucleótidos de interés flanqueada por o que comprende sitios de reconocimiento no idénticos, que son sitios FRT modificados que aún se pueden reconocer por la recombinasa FLP de tipo silvestre.

[0014] Bolusani et al., (2006) describen un método para identificar secuencias que son sitios objetivo potenciales para las recombinasas de ADN para la integración específica de sitio de una secuencia objetivo en un genoma. En conjunto, la aplicación de los sistemas de recombinasa conocidos en el estado de la técnica está limitada bien por el hecho de que se deben introducir artificialmente dos sitios de reconocimiento en el genoma, o bien porque la secuencia de interés en el genoma debe estar flanqueada por dos secuencias idénticas con una longitud de 34 pares de bases.

[0015] Por lo tanto, los métodos de edición genómica sencillos actuales se basan en nucleasas programables, como las nucleasas guiadas por ARN como CRISPR/Cas9 (por ejemplo, documento US 8,657,359 B1) ya que la especificidad de estas enzimas para un sitio objetivo está definida por el ARN guía, que se puede adaptar de forma versátil a una secuencia de interés.

[0016] Sin embargo, como los sistemas de nucleasas necesitan los mecanismos intrínsecos de reparación del ADN de la célula, típicamente inducen una gran cantidad de inserciones y supresiones aleatorias (indels) en el locus objetivo.

[0017] La edición genómica o terapia génica ideal reemplazará el gen defectuoso con un alelo normal o suprimirá un gen defectuoso en su ubicación natural sin modificar más el genoma. Por lo tanto, la edición genómica ideal debería ser eficiente y específica, sin la introducción de inserciones/supresiones.

[0018] Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un método para alterar una secuencia de nucleótidos en un genoma que supere las desventajas de los métodos de edición genómica mediante nucleasas y que al mismo tiempo sea versátil y adaptable a una secuencia de interés.

[0019] La invención se basa en el hallazgo de que dos secuencias idénticas con una longitud de 34 pares de bases (la longitud de un sitio objetivo habitual de una enzima de recombinación de ADN) rara vez se encuentran en un genoma.

[0020] La invención parte de la constatación de los inventores de que la única restricción para lograr la recombinación por escisión para las enzimas de recombinación de ADN Diseñadas es la conservación de la secuencia espaciadora, típicamente de 8 bp de largo (véase la Fig. 17 para un ejemplo). Debido a que esta secuencia debe ser idéntica para que se produzca la recombinación, establece una restricción para las secuencias que pueden recombinarse. Sin embargo, un análisis bioinformático de diferentes genomas reveló que las repeticiones directas de 8 bp de longitud ocurren con frecuencia en genomas virales, procariotas y eucariotas, incluido el genoma humano (véanse las Fig.18 y 19 para un ejemplo).

[0021] En base a este hallazgo, los inventores se dieron cuenta de que, mediante una combinación de diferentes monómeros de enzimas de recombinación de ADN que evolucionaron para dirigirse a diferentes sitios objetivo en el genoma, la edición precisa del genoma se vuelve posible sin acoplar las rutas de reparación celular. De este modo, se puede generar una combinación de monómeros de enzimas de recombinación de ADN generadas mediante evolución dirigida, diseño racional o una combinación de ambos, para recombinar prácticamente cualquier secuencia de interés en un genoma. En caso de que la recombinación dé como resultado la supresión de una secuencia, se necesitan dos secuencias idénticas con una longitud de aproximadamente 8 pares de bases como secuencia espaciadora en el genoma. Sin embargo, en caso de que la recombinación dé como resultado el reemplazo de una secuencia, es preferible que las secuencias espaciadoras no sean idénticas en el genoma - en este caso, a las secuencias espaciadoras idénticas se les proporciona la secuencia deseada (ADN donante) que reemplazará la secuencia de interés en una secuencia artificial.

[0022] Al combinar monómeros de diferentes enzimas de recombinación de ADN, la invención supera la limitación de las enzimas de recombinación de ADN conocidas con respecto a los sitios objetivo que pueden recombinar y proporciona enzimas de recombinación de ADN diseñadas que son útiles para la edición del genoma y que pueden reconocer secuencias objetivo de origen natural en un genoma.

[0023] En un primer aspecto, se proporcionan enzimas de recombinación de ADN diseñadas que son capaces de inducir una recombinación de ADN específica de sitio para alterar una secuencia de nucleótidos en un genoma al recombinar dos secuencias objetivo no idénticas (preferiblemente naturales) que ocurren en el genoma y un método para preparar las enzimas de recombinación de ADN diseñadas.

[0024] Las enzimas de recombinación de ADN diseñadas de acuerdo con la invención no necesitan, de manera ventajosa, sitios objetivo introducidos artificialmente en el genoma y tampoco requieren la presencia de secuencias idénticas con una longitud superior a 8 nucleótidos (en particular, no 34 nucleótidos), como las repeticiones terminales largas (LTR).

[0025] En el contexto de esta invención, las secuencias objetivo no idénticas significan que los sitios objetivo difieren en al menos dos nucleótidos. De manera ventajosa, los sitios objetivo pueden diferir aún más, en particular en al menos tres nucleótidos. En las realizaciones de la invención, los sitios objetivo difieren en al menos cuatro nucleótidos o incluso ocho nucleótidos. De manera ventajosa, al menos el 20 % o incluso más preferiblemente el 30 % de los nucleótidos y hasta el 70 % o incluso hasta el 90 % de los nucleótidos en los sitios objetivo pueden diferir, lo que significa que el sitio objetivo puede tener una identidad de secuencia de solo el 10 a 80 %, preferiblemente del 30 a 90 %. Cada sitio objetivo comprende un primer semisitio (preferiblemente de 10 a 20 nucleótidos) y un segundo semisitio (preferiblemente de 10 a 20 nucleótidos) separados por una secuencia espaciadora (preferiblemente de 5 a 12 nucleótidos). De manera ventajosa, uno o incluso ambos sitios objetivo pueden ser asimétricos, lo que significa que los semisitios de los sitios objetivo no son complementarios inversos entre sí. De manera ventajosa, al menos el 20 % o incluso más preferiblemente el 30 % de los nucleótidos y hasta el 70 % o incluso hasta el 90 % de los nucleótidos en los semisitios pueden diferir, lo que significa que todos los semisitios pueden tener una identidad de secuencia de solo el 10 a 80 %, preferiblemente del 30 a 90 %. En una realización, las diferencias en los sitios objetivo radican únicamente en los semisitios y las secuencias espaciadoras son idénticas para inducir la supresión de la secuencia de interés. En otra realización, las dos secuencias espaciadoras también son diferentes para permitir el reemplazo de la secuencia de interés al proporcionar una secuencia sintética que comprende dos secuencias idénticas a los sitios objetivo que aparecen en el genoma que rodean una secuencia donante que reemplazará la secuencia de interés. Las enzimas de recombinación de ADN diseñadas de acuerdo con la invención comprenden dos o hasta cuatro monómeros diferentes. En una realización, la enzima de recombinación de ADN diseñada comprende cuatro monómeros diferentes y cada monómero reconoce un semisitio diferente: Sin embargo, también es posible que la enzima de recombinación de ADN diseñada comprenda dos o tres monómeros diferentes, mientras que uno o dos monómeros reconocen un sitio objetivo asimétrico. Incluso es posible que la enzima de recombinación de ADN diseñada comprenda cuatro monómeros idénticos, mientras que la enzima de recombinación de ADN diseñada reconoce dos sitios objetivo asimétricos diferentes. Por diferentes monómeros de acuerdo con la invención se entiende que los monómeros difieren en al menos un 2 %, en particular al menos un 4 %, preferiblemente al menos un 8 % de los residuos de aminoácidos. De manera ventajosa, hasta un 10 % o incluso hasta un 30 % de los residuos de aminoácidos pueden diferir, lo que significa que los monómeros pueden tener una identidad de secuencia de solo el 70 al 98 %, preferiblemente 90 al 96 % o hasta 92 %. Por lo tanto, la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención es un heterotetrámero que comprende dos o hasta cuatro monómeros diferentes.

[0026] En una realización preferida del heterotetrámero, las interfaces monómero-monómero se modifican genéticamente de tal manera que solo los monómeros distintos pueden formar tetrámeros (por ejemplo, como se describe en la publicación Zhang et al., 2015 y en y en el documento US 20170058297 A1). Mediante esta modificación se forma un heterotetrámero obligado, excluyendo los tetrámeros que comprenden un solo monómero.

[0027] La secuencia de interés es una secuencia de nucleótidos que se va a alterar. Preferiblemente es una secuencia que comprende mutación. De acuerdo con la invención, el término mutación incluye todo tipo de aberraciones genéticas o cromosómicas, en particular mutaciones puntuales, mutaciones por desplazamiento del marco de lectura, translocaciones, duplicaciones, supresiones o inserciones.

[0028] Alternativamente, la secuencia de interés es una secuencia que se debe inactivar, en particular una secuencia de un patógeno (un microorganismo como una bacteria, un virus o un parásito) o un oncogén u otro gen, mientras que la actividad causa una enfermedad o se sabe que la inhibición de la actividad genética reduce los síntomas. Un ejemplo es el gen que codifica la PCSK9 (proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9), cuya inhibición se sabe que reduce los niveles de colesterol y la concentración sanguínea de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL).

[0029] En caso de que la secuencia de interés sea una inserción, una duplicación o una secuencia que deba ser inactivada (por ejemplo, una secuencia viral), la recombinación inducida por la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención da como resultado preferiblemente una eliminación de la secuencia insertada o de la secuencia que deba ser inactivada. Esta supresión – además también conocida como Supresión de Genes inducida por enzimas de Recombinación de ADN Diseñadas (DRiGD) - se logra mediante dos secuencias espaciadoras idénticas en los dos sitios objetivo (véase también la Fig. 2 para un ejemplo ilustrativo).

[0030] Alternativamente, la recombinación inducida por la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención da como resultado el reemplazo de la secuencia de interés por una secuencia deseada. Este reemplazo - también conocido además como Reemplazo Génico inducido por Enzimas de Recombinación de ADN Diseñadas (DRiGR) - se logra al proporcionar una secuencia donante sintética que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo, mientras que el primer y el segundo sitio objetivo rodean la secuencia deseada. Al reemplazar la secuencia de interés por la secuencia deseada, en principio es posible corregir cualquier mutación, que incluye las mutaciones puntuales, mutaciones sin sentido, mutaciones de desplazamiento de marco de lectura, duplicaciones e incluso supresiones e inserciones (véase también la Fig. 1 para un ejemplo ilustrativo).

[0031] De manera ventajosa, las enzimas de recombinación de ADN de acuerdo con la invención permiten una edición precisa del genoma sin desencadenar las rutas de reparación de ADN endógenas y poseen la capacidad única de realizar tanto la escisión como el resellado inmediato del ADN procesadoin vivo.

[0032] El término enzima de recombinación de ADN comprende toda enzima capaz de inducir un evento de recombinación de ADN específico de sitio, preferiblemente una recombinasa o integrasa, en particular seleccionada de enzimas que llevan a cabo una reacción similar a la de la topoisomerasa, como las familias de recombinasas de serina o tirosina. En una realización, las enzimas de recombinación de ADN conocidas cuyas secuencias objetivo se utilizan en la etapa a) y sobre las cuales se aplica la evolución dirigida molecular en las etapas (b) se seleccionan de Cre, Dre, VCre, sCre, FLP, Tre (que incluye Tre 1.0 a Tre 3.1 y Brec1), Vika, Nigri y Panto.

[0033] El término enzima de recombinación de ADN “diseñada” se refiere al hecho de que estas enzimas se generan para un sitio objetivo determinado y que no se encuentran en la naturaleza.

[0034] Un aspecto se refiere a un método para identificar secuencias que son potenciales sitios objetivo para enzimas de recombinación de ADN que son capaces de inducir una recombinación de ADN específica de sitio de una secuencia de interés en un genoma, que incluye las etapas de:

[0035] i. Cribado del genoma o una parte del mismo que comprende la secuencia de interés para dos secuencias que son secuencias espaciadoras potenciales. Estas secuencias espaciadoras potenciales tienen una longitud de al menos 5 bp, preferiblemente al menos 7 bp, más preferiblemente 8 bp y preferiblemente hasta 12 más preferiblemente hasta 10 bp. Una de la secuencia espaciadora potencial se encuentra en dirección ascendente de la secuencia de interés y la otra secuencia espaciadora potencial se encuentra en dirección descendente de la secuencia de interés. Las dos secuencias tienen preferiblemente una distancia máxima de 100 kb, más preferiblemente 10 kb e incluso más preferiblemente 2 kb y preferiblemente una distancia mínima de 150 bp. ii. Identificación (Definición) de sitios objetivo potenciales: Las secuencias espaciadoras potenciales (obtenidas en la etapa i.) así como las secuencias que las rodean forman los sitios objetivo potenciales. Para cada secuencia espaciadora potencial (obtenida en la etapa i.) los nucleótidos vecinos, preferiblemente 10 a 20 nucleótidos, más preferiblemente 12 a 15 nucleótidos, a lo sumo preferiblemente 13 nucleótidos, en un lado de la misma forman el primer semisitio potencial y los nucleótidos vecinos, preferiblemente 10 a 20 nucleótidos, más preferiblemente 12 a 15 nucleótidos, en el otro lado forman el segundo semisitio potencial. Por lo tanto, ambos semisitios potenciales y la secuencia espaciadora intermedia forman un sitio objetivo potencial. iii. Los sitios objetivo potenciales identificados en la etapa ii. además se criban preferiblemente para seleccionar secuencias objetivo potenciales que no se producen (en otro lugar) en el genoma del huésped para asegurar una recombinación específica de secuencia, en particular una supresión.

[0036] Este método es en particular adecuado para cribar para identificar secuencias que son potenciales sitios objetivo para las enzimas de recombinación de ADN que inducen una supresión (DRiGD) de una secuencia de interés en un genoma. En este caso, el genoma se criba en la etapa i. para dos secuencias idénticas que son secuencias espaciadoras potenciales. Este método también se ilustra en el ejemplo en la Fig.18.

[0037] En una realización, la secuencia de interés que se va a suprimir es una secuencia en el genoma del huésped, por ejemplo, un oncogén u otro gen que se va a inactivar. Por lo tanto, el genoma cribado en la etapa i. es el genoma del propio huésped (o una parte del mismo que comprende la secuencia de interés), por ejemplo, el genoma humano o parte de un cromosoma humano. En este caso, en la etapa iii. se criban preferiblemente las secuencias objetivo potenciales para que no aparezcan en ningún otro lugar (es decir, solo alrededor de la secuencia de interés) en el genoma del huésped para asegurar una supresión específica de secuencia. En otra realización, la secuencia de interés que se va a suprimir es una secuencia en el genoma de un patógeno, por ejemplo, un virus. En el presente documento, la etapa i se realiza en el genoma del patógeno y la etapa iii. en el genoma del huésped, que está infectado por el patógeno. En este caso, en la etapa iii. se criban preferiblemente las secuencias objetivo potenciales para que no se encuentren en el genoma del huésped (es decir, solo en el genoma del patógeno) para asegurar una supresión específica de secuencia. En una etapa preferida adicional iv. las secuencias objetivo se seleccionan a partir de la lista de secuencias objetivo potenciales obtenidas en la etapa ii o iii. que comprenden semisitios que tienen cada uno una homología con un semisitio de un sitio objetivo conocido de una enzima de recombinación de ADN. Homología significa que un cierto número de posiciones de nucleótido llevan bases idénticas. Preferiblemente cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas a un semisitio de sitios objetivo conocidos de una enzima de recombinación de ADN. Además, los semisitios preferiblemente tienen una homología entre sí. Preferiblemente, cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas al otro semisitio de los mismos sitios objetivo y/o los semisitios del otro sitio objetivo. La homología entre los semisitios objetivo aumenta la probabilidad de que se genere un monómero que sea activo en ambos semisitios y, por lo tanto, se reduce el número de monómeros necesarios para la recombinación.

[0038] La selección de la etapa iii. para asegurar una supresión específica de secuencia se puede realizar antes o después de la etapa iv.

[0039] Preferiblemente durante o antes de la etapa i, se determinan las coordenadas de la secuencia de interés que se van a inactivar (preferiblemente un gen o un exón) en el genoma. Se generan ventanas de búsqueda de fragmentos de 150 bp a 10 kb que cubren la secuencia de interés y las secuencias circundantes. Se eliminan los fragmentos que se superponen con otros genes. Para todos los demás fragmentos, se identifican posibles secuencias espaciadoras idénticas - es decir, secuencias espaciadoras que se repiten al menos una vez. En una realización, se seleccionan secuencias espaciadoras antes de la etapa ii. que rodean la secuencia de interés (por ejemplo, un exón del gen que se va a inactivar o al menos se superponen con la secuencia de interés (por ejemplo, el exón). Alternativamente, se identifican sitios objetivo potenciales como se describe en la etapa ii y posteriormente se seleccionan pares de sitios objetivo que rodean la secuencia de interés (por ejemplo, un exón del gen que se va a inactivar) o que al menos se superponen con la secuencia de interés (por ejemplo, el exón).

[0040] En otra realización, el método se utiliza para identificar secuencias que son sitios objetivo potenciales para enzimas de recombinación de ADN que inducen un reemplazo (DRiGR) de una secuencia de interés en un genoma. En este caso, el genoma se analiza en la etapa i. para detectar dos secuencias que son secuencias espaciadoras potenciales y que no son idénticas. En este caso, las secuencias espaciadoras potenciales difieren en al menos un 30 % a un 100 %, preferiblemente en al menos un 50 % de los nucleótidos. Por lo tanto, en este caso, las secuencias espaciadoras potenciales tienen preferiblemente una identidad de secuencia de entre un 0 % y un 50 %, o al menos inferior al 70 %.

[0041] En una realización preferida adicional las secuencias que son potenciales sitios objetivo para enzimas de recombinación de ADN que inducen un reemplazo (DRiGR) de una secuencia de interés en un genoma se identifican por un método que incluye las etapas de:

[0042] i. Cribado del genoma o una parte del mismo que comprende la secuencia de interés para dos secuencias que son potenciales sitios objetivo. Estos sitios objetivo potenciales comprenden un primer semisitio y un segundo semisitio, cada uno con 10 a 20 nucleótidos, más preferiblemente 12 a 15 nucleótidos, separados por una secuencia espaciadora con una longitud de al menos 5 bp, preferiblemente al menos 7 bp, más preferiblemente 8 bp y preferiblemente hasta 12 más preferiblemente hasta 10 bp. Uno del sitio objetivo potencial se encuentra en dirección ascendente de la secuencia de interés y el otro sitio objetivo potencial se encuentra en dirección descendente de la secuencia de interés. Las dos secuencias tienen preferiblemente una distancia máxima de 100 kb, más preferiblemente 10 kb e incluso más preferiblemente 2 kb y preferiblemente una distancia mínima de 150 bp. Para permitir un reemplazo se eligen las secuencias espaciadoras que no son idénticas. Las secuencias espaciadoras difieren en al menos 30 % a 100 % preferiblemente al menos 50 % de los nucleótidos Por lo tanto, las secuencias espaciadoras preferiblemente tienen una identidad de secuencia de 0 % a 50 % o al menos por debajo de 70 %.

[0043] ii. Los sitios objetivo potenciales identificados en la etapa i. además se criban preferiblemente para seleccionar secuencias objetivo potenciales que no se encuentren (en otro lugar) del genoma del huésped para asegurar un reemplazo específico de secuencia (con una secuencia donante, véase más adelante).

[0044] En una etapa preferida adicional iii. las secuencias objetivo se seleccionan a partir de la lista de secuencias objetivo potenciales obtenidas en la etapa i o ii. que comprenden semisitios que tienen cada uno una homología con un semisitio de un sitio objetivo conocido de una enzima de recombinación de ADN. Homología significa que un cierto número de posiciones de nucleótido llevan bases idénticas. Preferiblemente cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas a un semisitio de sitios objetivo conocidos de una enzima de recombinación de ADN.

[0045] La selección de la etapa ii. para asegurar un reemplazo específico de secuencia se puede realizar antes o después de la etapa iii.

[0046] Preferiblemente durante o antes de la etapa i. se determinan las coordenadas de la secuencia de interés (preferiblemente un gen o exón) que se va a reemplazar en el genoma. Se generan ventanas de búsqueda de fragmentos de 150 bp a 10 kb que cubren la secuencia de interés y las secuencias circundantes. Se eliminan los fragmentos que se superponen con otros genes. Para todos los demás fragmentos, se identifican posibles sitios objetivo.

[0047] En una realización, se seleccionan secuencias espaciadoras que rodean la secuencia de interés (por ejemplo, un exón del gen que se va a reemplazar) o que al menos se superponen con la secuencia de interés (por ejemplo, el exón).

[0048] El método para preparar las enzimas de recombinación de ADN diseñadas de acuerdo con las enzimas de la invención que son capaces de inducir una recombinación de ADN específica de sitio para alterar una secuencia de nucleótidos en un genoma al recombinar dos secuencias objetivo de origen natural en el genoma (Reemplazo y Supresión Génica inducida por Recombinasa Diseñadora), comprende las siguientes etapas: a) Seleccionar una secuencia de nucleótidos (preferiblemente con una longitud de 30 a 40 pares base) en dirección ascendente de la secuencia de nucleótidos que se va a alterar (sitio de interés) como primer sitio objetivo y una secuencia de nucleótidos (preferiblemente con una longitud de 30 a 40 pares base) en dirección descendente de la secuencia de nucleótidos que se va a alterar como segundo sitio objetivo, mientras que las secuencias de los sitios objetivo no son idénticas. El término secuencias objetivo no idénticas o no idénticas se define como se indicó anteriormente. Resulta ventajoso que uno o ambos sitios objetivo sean asimétricos, ya que los sitios simétricos son muy difíciles de encontrar en el genoma. Los sitios objetivo cada uno comprende un primer semisitio y un segundo semisitio (como se definió anteriormente, preferiblemente 10 a 20 nucleótidos) separado por una secuencia espaciadora (como se definió anteriormente, preferiblemente 5 a 12 nucleótidos). Las secuencias objetivo se seleccionan preferiblemente para comprender semisitios que tienen cada uno una homología con un semisitio de un sitio objetivo conocido de una enzima de recombinación de ADN. Homología significa que un cierto número de posiciones de nucleótido lleva bases idénticas. Preferiblemente cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas a un semisitio de sitios objetivo conocidos de una enzima de recombinación de ADN. Además, como se explicó anteriormente los semisitios preferiblemente tienen una homología entre sí. Preferiblemente, cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas al otro semisitio de los mismos sitios objetivo y/o los semisitios del otro sitio objetivo.

[0049] b) Aplicar evolución dirigida molecular en al menos una biblioteca, preferiblemente al menos dos y preferiblemente hasta cuatro bibliotecas, de enzimas de recombinación de ADN que utilizan un ácido nucleico que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo como se selecciona en a) como sustrato, hasta que se obtenga al menos una enzima de recombinación de ADN diseñada (mediante evolución dirigida molecular o una combinación de evolución dirigida molecular y diseño racional) que sea activa en el primer sitio objetivo y en el segundo sitio objetivo seleccionado en a1).

[0050] La enzima de recombinación de ADN diseñada se puede seleccionar para dirigirse a cualquier par de secuencias objetivo y, en consecuencia, a cualquier secuencia de interés flanqueada por estos sitios objetivo. Las secuencias objetivo son secuencias de origen natural dentro del genoma de un huésped (por ejemplo, una célula u organismo que no está de acuerdo con la invención reivindicada) o en el genoma de un patógeno, como un virus. “Secuencias de origen natural dentro de un genoma” significa, en el contexto de la invención, que las secuencias objetivo no se introducen artificialmente y que ambas secuencias no idénticas ocurren de forma nativa (natural) en el mismo genoma.

[0051] El genoma se define como todo el material genético de un organismo que no está de acuerdo con la invención reivindicada o un patógeno. Generalmente consiste en ADN (o ARN en los virus de ARN). El genoma incluye los genes (las regiones codificantes o exones), el ADN no codificante (como los intrones y las secuencias reguladoras) y el material genético de las mitocondrias y los cloroplastos.

[0052] Las secuencias objetivo preferidas incluyen aquellas que son únicas en el genoma objetivo de una célula u organismo huésped que no están de acuerdo con la invención reivindicada. Dado que algunos organismos que no están de acuerdo con la invención reivindicada poseen múltiples copias de cromosomas, único significa en este contexto que aparecen solo una vez por conjunto de cromosomas.

[0053] Los inventores han encontrado sorprendentemente (véase ejemplo F9-3, que puede recombinar tanto loxF9a como loxF9b) que una enzima de recombinación de ADN se puede utilizar para recombinar dos sitios objetivo diferentes en caso de que todos los semisitios difieran entre sí en 7 a 9 de 13 posiciones.

[0054] En general, si todos los semisitios difieren entre sí en no más de 7 posiciones, preferiblemente no más de 5, y más preferiblemente no más de 4, se puede utilizar una biblioteca de enzimas de recombinación de ADN para evolucionar una enzima que puede recombinar ambos sitios objetivo, en particular en una reacción de DRiGR (véanse las Fig.15 y 16 y la Tabla de la página 63 para un ejemplo).

[0055] En otro caso, los semisitios muestran una diferencia por pares de un máximo de 7, preferiblemente 5, más preferiblemente 4 desajustes - por lo tanto, ambos sitios objetivo muestran un máximo de 7, preferiblemente 5 o más preferiblemente 4 desajustes entre los semisitios. En este caso, se utilizan dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN para evolucionar una enzima que pueda recombinar ambos sitios objetivo.

[0056] En un caso adicional, solo un sitio objetivo muestra un par de semisitios con un máximo de 7, preferiblemente 5, más preferiblemente 4 desajustes - por lo tanto, el otro sitio objetivo difiere en más de 7, preferiblemente 5, más preferiblemente 4 desajustes y también los semisitios del otro sitio objetivo muestran más de 7, preferiblemente 5, más preferiblemente 4 desajustes comparados entre sí. En este caso, se utilizan 3 o 4 bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN para evolucionar una enzima que pueda recombinar ambos sitios objetivo.

[0057] La biblioteca o bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN utilizadas en la etapa b) se evolucionan para obtener un monómero de enzimas de recombinación de ADN o se coevolucionan para obtener al menos dos monómeros de enzimas de recombinación de ADN que funcionan juntas en el par de sitios objetivo. En caso de que se utilicen dos o más bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN en la etapa b), es preferible que estén ligadas operativamente, preferiblemente en un vector de expresión. En caso de que se utilicen dos o más bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN, es preferible que las bibliotecas se expresen bajo el control de los mismos elementos reguladores, preferiblemente el mismo promotor.

[0058] Preferiblemente, en la etapa b) se utilizan una o dos a cuatro bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN para la coevolución. En particular, en las realizaciones preferidas se utilizan dos o cuatro bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN en la etapa b).

[0059] En caso de que se utilice más de una biblioteca, las diferentes bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN utilizadas difieren con respecto a la especificidad del sitio objetivo.

[0060] En caso de que se utilicen dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN, las enzimas de recombinación de ADN de cada biblioteca reconocen de manera ventajosa diferentes sitios objetivo asimétricos - sitios objetivo compuestos por dos semisitios diferentes.

[0061] En caso de que se utilicen cuatro bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN, las enzimas de recombinación de ADN en cada biblioteca reconocen preferiblemente cada una un semisitio diferente de un sitio objetivo asimétrico. Por lo tanto, solo se recombinan en el sitio objetivo cuando se coexpresan como heterotetrámero.

[0062] En una realización preferida, la coevolución en la etapa b) se realiza utilizando un vector de expresión que codifica la biblioteca de enzimas de recombinación de ADN o las al menos dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN diferentes y que comprende el primer y segundo sitio objetivo. En particular, en las realizaciones preferidas, el vector de expresión codifica dos o cuatro bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN.

[0063] En una realización preferida del vector un marcador de selección negativa se encuentra entre el primer y segundo sitio objetivo. Por lo tanto, el primer y segundo sitio objetivo, preferiblemente rodean un marcador de selección negativa. Por lo tanto, en caso de que se produzca una recombinación, la secuencia con el marcador de selección negativa se escinde y no se produce ninguna selección negativa. Sin embargo, si no se produce recombinación, el marcador de selección negativa está activo.

[0064] En una realización preferida, el marcador de selección negativa es un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción. Preferiblemente un sitio de reconocimiento único - un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que aparece solo una vez en el vector. Mediante la incubación con la enzima de restricción, los vectores de expresión que no han experimentado recombinación se linealizan. Los vectores de expresión linealizados se seleccionan negativamente, por ejemplo, al elegir un par de cebadores para una PCR que solo amplifica el plásmido no linealizado (como se ejemplifica en las Fig.4 a 7) y/o al digerir el ADN linealizado con una exonucleasa.

[0065] En una realización preferida, la selección negativa comprende más de un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción, preferiblemente dos o tres (o incluso hasta cinco) sitios de reconocimiento para la misma o, en particular, para dos o tres (o incluso hasta cinco) enzimas de restricción diferentes.

[0066] Esto mejora significativamente la eficiencia de la linealización de los vectores de expresión que no han experimentado recombinación. Para mejorar aún más la selección de enzimas que dan como resultado un reemplazo, preferiblemente se agrega una exonucleasa para digerir el ADN linealizado.

[0067] El ácido nucleico de sustrato que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo (preferiblemente que rodea un marcador de selección negativa) se sitúa preferiblemente en el mismo vector que el ADN que codifica la biblioteca de enzimas de recombinación de ADN o las al menos dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN diferentes (como se ejemplifica en las Fig.4 y 7).

[0068] En una realización, el método comprende también la transducción de una célula con el vector de expresión como se definió anteriormente y la expresión de la enzima de recombinación de ADN. Alternativamente, se utiliza un sistema de expresión libre de células.

[0069] En caso de que la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención dé como resultado una supresión (DRiGD), preferiblemente no se utilicen más sustratos o vectores de ADN para una reacción de recombinación. Una recombinación exitosa escinde el marcador de selección negativa y el plásmido se amplifica - preferiblemente mediante PCR (como se ejemplifica en las Fig. 6 y 7: pDuoSLiDE-DRiGD, pQuSLiDE-DRiGD). Como se describió anteriormente, en este caso la primera y la segunda secuencias objetivo comprenden secuencias espaciadoras idénticas (véase también la Fig.2).

[0070] El método para identificar secuencias que son sitios objetivo potenciales para enzimas de recombinación de ADN descrito anteriormente se realiza preferiblemente cuando o antes de seleccionar los sitios objetivo en la etapa a) del método para preparar enzimas de recombinación de ADN diseñadas para supresión o reemplazo. En caso de que la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención dé como resultado un reemplazo (DRIGR) Además del sustrato, se utiliza una secuencia sintética que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo. Como se describió anteriormente, en este caso la primera y la segunda secuencias objetivo comprenden diferentes secuencias espaciadoras para evitar que se produzca una supresión. En consecuencia, la recombinación se desplaza en lugar del reemplazo al recombinar las secuencias objetivo idénticas en el sustrato (en el vector que codifica las bibliotecas) y la secuencia sintética. En el presente documento el marcador de selección negativa se reemplaza al recombinar con la secuencia sintética.

[0071] En una realización preferida, la secuencia sintética es un plásmido deficiente en replicación (véanse también las Fig.4 y 5 para ejemplos). Sin embargo, en una realización alternativa se utiliza una cadena de ADN lineal. En otra realización preferida, las secuencias sintéticas están en un plásmido de alto número de copias (véase Fig.14 para un ejemplo).

[0072] Para seleccionar aún más la enzima de recombinación de ADN que da como resultado un reemplazo, la secuencia sintética comprende preferiblemente un marcador de selección positiva entre el primer y el segundo objetivo. En caso de que se produzca una recombinación, la secuencia con el marcador de selección positiva se insertará en el vector de expresión y los vectores de expresión que contengan el marcador de selección positiva se podrán seleccionar positivamente. En una realización, el marcador de selección positiva es un gen de resistencia a antibióticos. De este modo, tras la transducción del vector en las células, se pueden seleccionar fácilmente las células que contienen vectores con el marcador de selección positiva.

[0073] En una realización (para DRiGR), el vector porta un marcador de selección negativa entre el primer y el segundo sitio objetivo y la secuencia sintética comprende adicionalmente un marcador de selección positiva entre el primer y el segundo sitio objetivo.

[0074] Un experto en la técnica conoce otros marcadores de selección negativos y positivos. Los marcadores de selección negativa aplicables adicionales incluyen enzimas que codifican genes que codifican un gen que codifica una toxina o genes que convierten un profármaco en un fármaco tóxico, como URA3 (que convierte el ácido 5-fluoroorótico en el compuesto tóxico 5-fluorouracilo) o las timidina quinasas virales (que hacen que el huésped sea sensible a la selección de ganciclovir). Los marcadores de selección positiva aplicables adicionales son los genes que codifican enzimas que pueden complementar una auxotrofia.

[0075] Una etapa de la evolución molecular comprende preferiblemente al menos una etapa de selección y al menos una etapa de mutagénesis. Para que las moléculas seleccionadas “evolucionen” entre las etapas de selección, es preferible mutagenizar a los candidatos seleccionados para introducir mutaciones en la secuencia que se probarán en la siguiente ronda de selección. Los métodos adecuados de mutagénesis son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, en particular, la PCR propensa a errores, mutagénesis química, el uso de cepas huésped mutadoras específicas, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de casete combinatoria y mezcla de ADN, así como una combinación de estos métodos.

[0076] Se deben llevar a cabo uno o más, preferiblemente de cinco a cincuenta, preferiblemente de ocho a treinta, ciclos de coevolución, hasta que se evolucionan enzimas de recombinación de ADN que sean activas en los sitios objetivo.

[0077] En algunas realizaciones de la invención, la etapa de coevolución b) se puede realizar directamente en bibliotecas existentes de enzimas de recombinación de ADN.

[0078] En una realización preferida, el método de la invención comprende las siguientes etapas adicionales para obtener las dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN utilizadas en la etapa b). En el presente documento, la etapa a) se denominará en adelante etapa a1).

[0079] a2) Identificar cuatro secuencias que son semisitios de sitios objetivo conocidos de enzimas de recombinación de ADN, mientras la primera secuencia es homóloga al primer semisitio del primer sitio objetivo (seleccionado de acuerdo con a1)), la segunda secuencia es homóloga al segundo semisitio del primer sitio objetivo (seleccionado de acuerdo con a1)), la tercera secuencia es homóloga al primer semisitio del segundo sitio objetivo (seleccionado de acuerdo con a1)), la cuarta secuencia es homóloga al segundo semisitio del segundo sitio objetivo (seleccionado de acuerdo con a1)),

[0080] La Selección de a1) y la Identificación de a2) se realizan preferiblemente de forma simultánea en una sola etapa a), por ejemplo, mediante un programa informático, como el algoritmo SeLOX (Surendranath, V. et al.). (2010). Preferiblemente, las secuencias en dirección ascendente y descendente del sitio de interés se comparan con los sitios objetivo conocidos de enzimas de recombinación de ADN y se selecciona una secuencia objetivo en la que cada semisitio tiene cierta homología con un semisitio de un sitio objetivo conocido de una enzima de recombinación de ADN, como se describe en a1). Los semisitios de los sitios objetivo conocidos identificados de esta manera son los mencionados en a2). El grado de homología es preferiblemente el mencionado en a1).

[0081] Etapa a3):

[0082] En esta etapa se generan preferiblemente sitios objetivo intermedios que son una mezcla entre los semisitios identificados en la etapa a2) y los sitios objetivo seleccionados en la etapa a1).

[0083] Los sitios objetivo intermedios se generan preferiblemente al determinar los nucleótidos dentro de la primera a la cuarta secuencias (como se define en a2)) que difieren de los sitios objetivo seleccionados en a1) y reemplazar uno o más, preferiblemente hasta tres nucleótidos que difieren por los nucleótidos que ocurren en los semisitios correspondientes del sitio objetivo.

[0084] En una realización para la evolución molecular dirigida separada de enzimas de recombinación de ADN en cada sitio objetivo intermedio, los sitios objetivo intermedios son simétricos, por lo que comprenden semisitios idénticos o complementarios inversos. En esta realización, preferiblemente se genera un conjunto de cuatro sitios objetivo intermedios - un sitio objetivo intermedio por cada semisitio de los sitios objetivo seleccionados en a1).

[0085] En otra realización para la coevolución de enzimas de recombinación de ADN, preferiblemente se genera un conjunto de dos sitios objetivo intermedios asimétricos. El primer sitio objetivo intermedio comprende una secuencia que corresponde a la primera secuencia (como se define en a2)) en la que los nucleótidos se reemplazan por nucleótidos que aparecen en el primer semisitio del primer sitio objetivo (como se selecciona en la etapa a1)) y una secuencia que corresponde a la segunda secuencia (como se define en a2)) en la que los nucleótidos se reemplazan por nucleótidos que aparecen en el segundo semisitio del primer sitio objetivo (como se selecciona en a1)). El segundo sitio objetivo intermedio comprende una secuencia que corresponde a la tercera secuencia (como se define en a2)) en la que los nucleótidos se reemplazan por nucleótidos que aparecen en el primer semisitio del segundo sitio objetivo (como se selecciona en la etapa a1)) y una secuencia que corresponde a la cuarta secuencia (como se define en a2)) en la que los nucleótidos se reemplazan por nucleótidos que aparecen en el segundo semisitio del segundo sitio objetivo (como se selecciona en la etapa a1)).

[0086] Etapa a4:

[0087] Aplicar la evolución dirigida molecularmente en enzimas de recombinación de ADN que reconocen las secuencias definidas en la etapa a2) utilizando un ácido nucleico que comprende el primer sitio objetivo intermedio y/o el segundo sitio objetivo intermedio como sustrato.

[0088] En una realización, el ácido nucleico comprende tanto el primer sitio objetivo intermedio como el segundo sitio objetivo intermedio, y se realiza una evolución directa de enzimas de recombinación de ADN en ambos sitios objetivo intermedios (coevolución directa). La coevolución se realiza preferiblemente como se describió anteriormente para la etapa b).

[0089] En una realización preferida, las primeras rondas de evolución dirigida molecular se realizan como una evolución dirigida molecular separada de enzimas de recombinación de ADN (evolución separada) para cada sitio objetivo intermedio (por ejemplo, como se representa en la Fig.8). En una realización adicional, a estos les siguen una o más etapas de coevolución.

[0090] La etapa de evolución molecular dirigida comprende preferiblemente la selección positiva a favor de la recombinación en los sitios objetivo intermedios y/o la selección negativa en contra de la recombinación en otros sitios objetivo.

[0091] Para que las moléculas seleccionadas “evolucionen” entre las etapas de selección, es preferible mutagenizar a los candidatos seleccionados para introducir mutaciones en la secuencia que se analizarán en la siguiente ronda de selección. Los métodos adecuados de mutagénesis son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, en particular, la PCR propensa a errores, mutagénesis química, el uso de cepas huésped mutadoras específicas, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de casete combinatoria y mezcla de ADN, así como una combinación de estos métodos.

[0092] Se deben llevar a cabo uno o más, preferiblemente de ocho a cuarenta, preferiblemente quince ciclos de evolución molecular dirigida, hasta que se desarrollen enzimas de recombinación de ADN que sean activas en los sitios objetivo intermedios.

[0093] La evolución molecular dirigida empleada es preferiblemente una evolución de proteínas ligada al sustrato, en particular como se describe en el documento WO 2002044409 A2. Sin embargo, también son aplicables otras estrategias de evolución dirigida, como la evolución continua (WO2012088381 A2).

[0094] Luego, preferiblemente, se crea un conjunto adicional de sitios objetivo intermedios al adaptar aún más las secuencias a los semisitios de los sitios objetivo (seleccionados en a1)), preferiblemente reemplazando uno o más, preferiblemente hasta tres nucleótidos, que difieren de los nucleótidos que aparecen en los semisitios correspondientes del sitio objetivo.

[0095] Las subetapas de la evolución dirigida molecular, la mezcla y creación de conjuntos adicionales de sitios objetivo intermedios se realizan preferiblemente hasta que los sitios objetivo intermedios solo difieran en uno a tres, preferiblemente uno o dos, nucleótidos por semisitio de los semisitios de los sitios objetivo (seleccionados en a1)).

[0096] En una realización preferida para obtener enzimas de recombinación de ADN que inducen un reemplazo (DRiGR), la etapa b) se lleva a cabo en tres subetapas de evolución molecular.

[0097] En la primera etapa, la biblioteca o bibliotecas se evolucionan como se describió anteriormente para DRiGD sin una secuencia artificial (es decir, sin un vector donante) para seleccionar recombinasas que muestren al menos alguna actividad en el sitio objetivo, es decir, enzimas de recombinación de ADN que muestren al menos actividad de escisión. Esta primera etapa se realiza preferiblemente como se describió anteriormente, primero en un primer conjunto de sitios objetivo intermedios y luego, opcionalmente, en un segundo conjunto de sitios objetivo intermedios y, finalmente, en los sitios objetivo finales.

[0098] En una segunda etapa, la biblioteca o bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN obtenidas como resultado de la etapa i) se evolucionan utilizando una secuencia artificial con un marcador de selección positiva, como un gen de resistencia a antibióticos. La secuencia artificial es preferiblemente un vector donante deficiente en replicación. Por lo tanto, se utiliza un plásmido o una secuencia lineal que no porta un origen de replicación que sea activo en las células huésped (como se ejemplifica en la Fig. 9). La segunda etapa se realiza preferiblemente en los sitios objetivo finales. En la segunda etapa se seleccionan enzimas de recombinación de ADN que son capaces de reemplazar una secuencia mediante DRiGR (que es una reacción más compleja que una escisión pura). Preferiblemente se realizan de 5 a 20 ciclos, más preferiblemente de 8 a 15 ciclos, de evolución molecular ligada al sustrato hasta obtener enzimas que sean activas en los sitios objetivo finales. El uso de un vector donante deficiente en replicación en combinación con un marcador de selección de antibióticos permite separar la primera reacción de recombinación (integración) en el primer sitio objetivo, de la segunda reacción de recombinación (escisión) en el segundo sitio objetivo, necesaria para una reacción de DRiGR exitosa.

[0099] En una tercera etapa, se realiza la evolución molecular con la biblioteca o bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN obtenidas como resultado de la etapa ii) con una secuencia artificial sin un marcador de selección positiva. La secuencia artificial es preferiblemente un vector donante que porta un origen de replicación funcional que es activo en las células huésped utilizadas (como se ejemplifica en la Fig. 14). La tercera etapa se realiza preferiblemente en los sitios objetivo finales. Preferiblemente se realizan de 5 a 20 ciclos, más preferiblemente de 8 a 15 ciclos, de evolución molecular ligada al sustrato hasta obtener enzimas que sean activas en los sitios objetivo finales. En esta tercera etapa, se seleccionan enzimas de recombinación de ADN que muestran una alta actividad de reemplazo sin necesidad de un marcador de selección positivo y con una cinética de recombinación similar en el sitio objetivo 1 y el sitio objetivo 2. Este es un punto importante ya que para muchos usos (en particular un uso médico o también cuando se genera un organismo multicelular con una secuencia modificada que no está de acuerdo con la invención reivindicada) la presencia de un marcador de selección positiva (por ejemplo, un gen de resistencia a los antibióticos) no es una opción favorable.

[0100] Se ha demostrado que este método de tres etapas es muy eficiente para seleccionar enzimas que inducen un reemplazo (DRiGR), en particular cuando se combina con un vector que comprende uno o varios sitios de reconocimiento para la misma o, en particular, para dos o tres (o incluso hasta cinco) enzimas de restricción diferentes entre los sitios objetivo.

[0101] En general, y a lo largo de esta especificación, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar un ácido nucleico al que se ha ligado. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla, de doble cadena o parcialmente de doble cadena; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (por ejemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, como mediante técnicas estándar de clonación molecular. Otro tipo de vector es el vector viral, en el que están presentes secuencias de ADN o ARN derivadas de virus en el vector para su empaquetamiento en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus con defectos de replicación, adenovirus, adenovirus con defectos de replicación y virus adenoasociados - AAV). Los vectores virales también incluyen polinucleótidos transportados por un virus para la transfección a una célula huésped. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped al ser introducidos en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped.

[0102] Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. Los vectores de expresión comunes que resultan útiles en las técnicas de ADN recombinante suelen tener forma de plásmidos.

[0103] El vector de expresión es preferiblemente un plásmido, un virus o un cromosoma artificial.

[0104] Otro objeto de la invención son el vector o vectores utilizados en el método.

[0105] Los vectores de expresión preferidos comprenden:

[0106] i) Uno, dos, tres o cuatro genes, cada uno de los cuales codifica una biblioteca (diferente) de enzimas de recombinación de ADN, mientras que los genes que codifican las bibliotecas están bajo el control del mismo promotor,

[0107] ii) un ácido nucleico de sustrato que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo que rodean un marcador de selección negativa, que es preferiblemente un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción, que solo ocurre una vez en el vector de expresión (un sitio de reconocimiento único).

[0108] Para seleccionar enzimas de recombinación de ADN que inducen una supresión (DRiGD) del sitio de interés, no se necesita ADN de sustrato adicional, ya que la recombinación tendrá lugar únicamente entre el primer sitio objetivo intermedio y el segundo sitio objetivo intermedio en el vector de expresión.

[0109] Para seleccionar enzimas de recombinación de ADN que inducen un reemplazo (DRiGR) del sitio de interés por una secuencia deseada, preferiblemente se utiliza un ácido nucleico sintético (preferiblemente un plásmido deficiente en replicación) que comprende el primer sitio objetivo intermedio y/o el segundo sitio objetivo intermedio como un vector adicional (donante). Preferiblemente, un marcador de selección positiva se encuentra entre el primer y el segundo sitio objetivo intermedio. De este modo, el primer y el segundo sitio objetivo intermedio rodean preferiblemente un marcador de selección positiva, como un gen de resistencia a los antibióticos).

[0110] El método de acuerdo con la invención para preparar enzimas de recombinación de ADN puede comprender la siguiente etapa de:

[0111] c) aislar el ácido nucleico de al menos una enzima de recombinación de ADN obtenida en la etapa b) de la biblioteca; y preferiblemente

[0112] d) clonar el ácido nucleico obtenido en la etapa c) en un vector de suministro adecuado.

[0113] La presente divulgación comprende también las enzimas de recombinación de ADN diseñadas y obtenidas mediante el método descrito en el presente documento.

[0114] Con la invención presentada, los inventores proporcionan una solución para la edición del genoma basada en la recombinación que permite la alteración flexible e impecable de la información genética. Estos métodos permiten, en particular, la generación de enzimas de recombinación de ADN para reemplazar mutaciones genéticas que causan enfermedades humanas, o para suprimir material genético predefinido de las células. De este modo, las enzimas de recombinación de ADN de acuerdo con la invención se utilizan para alterar una secuencia de nucleótidos, en particular para reparar una mutación o para suprimir una secuencia del genoma o una secuencia introducida por un virus. Las mutaciones que se pueden reparar de acuerdo con la invención comprenden en particular mutaciones puntuales, mutaciones por desplazamiento del marco de lectura, supresiones e inserciones.

[0115] De manera ventajosa, la enzima de recombinación de ADN puede utilizar secuencias objetivo de origen natural en un genoma, que incluyen el genoma de una célula huésped, un órgano huésped o un organismo huésped que no está de acuerdo con la invención reivindicada, o incluso el genoma de un patógeno, como un virus. Una ventaja de la invención es que permite la alteración precisa y dirigida del ADN sin activar las rutas de reparación del ADN del huésped y, por lo tanto, funciona sin inducir inserciones y supresiones aleatorias (indels).

[0116] Por lo tanto, también se proporciona un método para modificar el genoma al inducir la recombinación específica de sitio en sitios objetivo de origen natural y que no son idénticos. El método comprende el suministro en el huésped de una enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, ya sea mediante el suministro de la propia proteína o mediante la introducción y expresión de una secuencia de nucleótidos que la codifica, ya sea a partir de un mRNA o de una plantilla de ADN.

[0117] Como se definió anteriormente, “de origen natural” significa que los sitios objetivo no se introducen artificialmente - están presentes de forma nativa en el mismo genoma.

[0118] Las células huésped adecuadas son en particular las células eucariotas, que incluyen las células madre como las células madre hematopoyéticas, células madre neuronales, células madre derivadas del tejido adiposo, células madre fetales, células madre del cordón umbilical, células madre pluripotentes inducidas y células madre embrionarias. En el caso de las células madre embrionarias humanas, estas no se derivan de la destrucción de embriones. Además, se excluye la modificación de la estirpe germinal humana y de los gametos humanos como células huésped.

[0119] Los órganos huéspedes adecuados para el suministro de una enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención comprenden cualquier célula del cuerpo, que incluye la médula ósea, la piel, los músculos, el hígado, los pulmones, los ganglios linfáticos y el bazo.

[0120] El método de acuerdo con la invención puede realizarsein vitro(fuera de un organismo vivo). El método in vitro incluye la manipulación de células y/o órganos aislados.

[0121] En un aspecto, se proporciona un método para reemplazar o suprimir una secuencia de interés en un genoma como se describió anteriormente.

[0122] En un aspecto, la divulgación se refiere al uso (preferiblemente no terapéutico) de una enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención para crear una célula o un organismo multicelular no humano, no de acuerdo con la invención reivindicada, con una secuencia de interés inactivada (por ejemplo, un gen o exón) o que porta una secuencia modificada (por ejemplo, un transgén).

[0123] En el método, la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención o los genes que codifican la enzima de acuerdo con la invención (un gen por monómero) se introducen en un método de suministro. La enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención induce una recombinación específica de sitio en un genoma en dos sitios objetivo no idénticos que rodean una secuencia de interés. Para modificar el genoma mediante la inducción de recombinación específica de sitio para la supresión (DRiGD) de una secuencia de interés (por ejemplo, una inserción o una secuencia viral) no se necesita ADN ni ARN adicional.

[0124] Para modificar el genoma al inducir la recombinación específica de sitio para el reemplazo (DRiGR) de una secuencia de interés (por ejemplo, una mutación puntual), la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención introduce adicionalmente en el huésped una secuencia sintética que comprende una secuencia deseada (ADN Donante). La secuencia sintética comprende la secuencia deseada (ADN Donante) que reemplaza la secuencia de interés, mientras que la secuencia deseada está flanqueada por el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo que son reconocidos por la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención.

[0125] En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para generar una célula eucariota modelo que comprende un gen o polinucleótido asociado a una enfermedad mutado o alterado, o secuencias mutadas o alteradas, seleccionadas de genes y polinucleótidos asociados a rutas bioquímicas de señalización. Ejemplos de estos genes y polinucleótidos se enumeran a continuación en las tablas A a C.

[0126] Otra aplicación que no está de acuerdo con la invención reivindicada consiste en alterar específicamente una secuencia de interés en un genoma, en particular al introducir una mutación o introducir o reemplazar una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, para crear una célula eucariota modelo o un modelo animal, que preferiblemente porte una mutación particular que corresponda a una enfermedad humana y/o que contenga una secuencia humanizada. De manera ventajosa el método permite la generación dirigida de modelos animales sin inducir inserciones y supresiones aleatorias (indels) ni otras modificaciones indeseadas e incontroladas del material genético. En algunas realizaciones, la mutación introducida se asocia con un aumento del riesgo de padecer o desarrollar una enfermedad.

[0127] En una realización preferida, el método que no está de acuerdo con la invención reivindicada se utiliza para crear modelos animales, que son útiles para la investigación biomédica, por ejemplo, como modelos para enfermedades humanas. En caso de que el método no esté de acuerdo con la invención reivindicada se lleva a cabo en un animal, preferiblemente se llevará para un uso no terapéutico del animal.

[0128] Los huéspedes adecuados que no están de acuerdo con la invención reivindicada incluyen invertebrados y vertebrados, en particular Bóvidos, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, medaka, pez cebra, Mus musculus, ratus norvegicus o embriones de estos organismos.

[0129] Sin embargo, las plantas y los hongos, así como sus células, también se pueden utilizar como huéspedes. En algunas realizaciones, uno o más vectores descritos en el presente documento se utilizan para producir un animal transgénico no humano que no está de acuerdo con la invención reivindicada o una planta transgénica. En algunas realizaciones, el animal transgénico que no está de acuerdo con la invención reivindicada es un mamífero, como un ratón, rata o conejo. En ciertas realizaciones, el organismo o sujeto es una planta. En ciertas realizaciones, el organismo o sujeto o planta es un alga. En la técnica se conocen métodos para producir plantas y animales transgénicos que no están de acuerdo con la invención reivindicada, y que generalmente comienzan con un método de transfección celular. También se proporcionan animales transgénicos que no están de acuerdo con la invención reivindicada, así como plantas transgénicas, especialmente cultivos y algas. El animal o planta transgénico que no está de acuerdo con la invención reivindicada puede resultar útil en aplicaciones distintas a la de proporcionar un modelo de enfermedad. Esto puede incluir la producción de alimentos o piensos mediante la expresión de, por ejemplo, niveles más altos de proteínas, carbohidratos, nutrientes o vitaminas de lo que se observaría típicamente en el tipo silvestre. En este sentido, se prefieren las plantas transgénicas, especialmente las legumbres y los tubérculos, y los animales que no están de acuerdo con la invención reivindicada, especialmente los mamíferos como el ganado (vacas, ovejas, cabras y cerdos), pero también las aves de corral y los insectos comestibles.

[0130] Para la introducción y expresión de la enzima de recombinación de ADN en un huésped se puede utilizar un vector de suministro u otros métodos de suministro, como ADN, mRNA o proteínas empaquetadas en liposomas o nanopartículas (por ejemplo, como lo describen Wang M et al., (2016)), o también son aplicables electroporación ex vivo, o compresión celular.

[0131] El método de suministro utilizado depende del huésped, la célula huésped o el tejido objetivo en el huésped en el que se alterará la secuencia de interés.

[0132] Asimismo, la elección del vector de suministro utilizado depende del huésped, la célula huésped o el tejido objetivo en el huésped en el que se alterará la secuencia de interés. Los vectores de suministro adecuados son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen plásmidos, cromosomas artificiales, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de espumavirus y vectores adenovirales, pero también agrobacterias que albergan vectores lanzadera. Entre los vectores de suministro ventajosos se incluyen los lentivirus y los virus adenoasociados, y también se pueden seleccionar tipos de dichos vectores (en particular los vectores virales adenoasociados) para dirigirlos a tipos específicos de células o tejidos.

[0133] El vector de suministro comprende preferiblemente un elemento regulador. El término “elemento regulador” pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada ribosomal internos (IRES) y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de terminación de la transcripción, como señales de poliadenilación y secuencias poli-U). En algunas realizaciones, el elemento regulador es un promotor celular, bacteriano, viral o híbrido, en el que dicho promotor es preferiblemente un promotor constitutivo o inducible. Asimismo, el promotor se selecciona preferentemente en función del huésped, la célula huésped o el tejido objetivo en el huésped. Los promotores adecuados también son conocidos por el experto en la técnica. Los promotores constitutivos preferidos se seleccionan a partir de los promotores del citomegalovirus, virus del sarcoma de Rous, retrovirus relacionados con el virus de la leucemia murina, gen de la fosfogliceroquinasa, virus formador de focos esplénicos murinos o factor de elongación 1 alfa humano.

[0134] Para el reemplazo de una secuencia de interés (DRiGR) el vector de suministro preferiblemente también contiene la secuencia donante que comprende los dos sitios objetivo no idénticos reconocidos por la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención y mientras los sitios objetivo rodean una secuencia deseada (ADN Donante) que reemplaza la secuencia de interés, mientras la secuencia deseada es flanqueada por el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo.

[0135] Alternativamente, la secuencia donante se proporciona en una molécula de ácido nucleico o vector separado (por ejemplo, un plásmido deficiente en replicación).

[0136] La invención comprende también ácidos nucleicos o vectores que codifican una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención. En una realización preferida, los ácidos nucleicos que codifican los monómeros de una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención son una molécula de ácido nucleico o están en un vector. Preferiblemente, los monómeros de las enzimas de recombinación de ADN diseñadas se expresan bajo el control de un promotor u otro elemento regulador. La divulgación también comprende un método para la transducción de una célula con

[0137] 1. un vector de expresión o vector de suministro como se describió anteriormente que codifica una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención, mientras la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención induce una recombinación específica de sitio en un genoma en dos sitios objetivo no idénticos que rodean una secuencia de interés

[0138] 2. una secuencia de nucleótidos como secuencia donante que comprende los mismos dos sitios objetivo no idénticos que rodena una secuencia deseada (AND Donante) que reemplaza la secuencia de interés, mientras la secuencia deseada está flanqueada por el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo, y la expresión de la enzima de recombinación de ADN.

[0139] La secuencia donante se puede ubicar en el vector de expresión o de suministro, o bien, proporcionar como un ácido nucleico separado, preferiblemente un plásmido deficiente en replicación. Preferiblemente, la secuencia donante se proporciona en múltiples copias por célula para aumentar la probabilidad de reemplazo de la secuencia objetivo (véase también Fig.3).

[0140] En un aspecto adicional la invención se refiere a un conjunto o kit que comprende:

[0141] i) una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención o un ácido nucleico o vector que codifica una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención, mientras que la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención induce una recombinación específica de sitio en un genoma en dos sitios objetivo no idénticos que rodean una secuencia de interés;

[0142] ii) una secuencia de nucleótidos como secuencia donante que comprende los mismos dos sitios objetivo no idénticos que rodean una secuencia deseada (ADN Donante) que reemplaza la secuencia de interés, mientras que la secuencia deseada está flanqueada por el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo. Preferiblemente, la secuencia donante se proporciona en múltiples copias por célula para aumentar la probabilidad de reemplazo de la secuencia objetivo (véase también Fig.3).

[0143] De nuevo, la secuencia donante se ubica en el mismo vector (que codifica la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención ) o se proporciona como un ácido nucleico separado, preferiblemente un plásmido deficiente en replicación.

[0144] Generalmente, para un reemplazo (DRiGR), la secuencia deseada en la secuencia donante es preferiblemente una secuencia que corresponde a la secuencia de interés, pero en la que la mutación se reemplaza por la secuencia de tipo silvestre (un gen o parte del mismo, como un exón) o una variante funcional de la misma (por ejemplo, una mutación silenciosa o una mutación que aumenta la actividad).

[0145] Otra parte importante de la presente divulgación es la aplicación médica de las enzimas de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos o vectores de acuerdo con la invención o el conjunto/kit de acuerdo con la invención.

[0146] Para una aplicación médica, la secuencia de interés es un gen o polinucleótido “asociado a una enfermedad”, que se altera para curar la enfermedad o al menos reducir los síntomas o prolongar la vida.

[0147] En un aspecto, la divulgación se refiere a un método in vitro aplicado a células u órganos aislados como se describió anteriormente.

[0148] En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de un sujeto, preferiblemente humano o animal, que comprende la etapa de aplicación de una enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, un ácido nucleico o vector que codifica una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención o el kit de acuerdo con la invención.

[0149] Los métodos y vectores de suministro se seleccionan preferiblemente como se describió anteriormente. En una realización, el sujeto que se va a tratar lleva una mutación en una secuencia de nucleótidos (secuencia de interés) que le hace padecer una enfermedad, en particular una mutación que provoca una función reducida o la pérdida de función del producto génico, por ejemplo, una mutación en el gen del factor 9 que causa la hemofilia. Mediante el suministro de la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, un ácido nucleico o vector que la codifica y una secuencia donante que contiene una secuencia deseada, una variante de tipo silvestre u otra variante funcional del gen (o una parte del mismo - como un exón), la parte mutante del gen se reemplaza por la secuencia (funcional) deseada. Para permitir la recombinación específica de sitio, las secuencias deseadas en la secuencia donante están flanqueadas por los sitios objetivo para la enzima de recombinación de ADN.

[0150] En otra realización, el sujeto que se va a tratar lleva una secuencia de nucleótidos (secuencia de interés) que causa una enfermedad o la inhibición reduce los síntomas de la misma. En el presente documento la secuencia de interés se suprime al aplicar el método de acuerdo con la invención y suministrar la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, un ácido nucleico o un vector que la codifica. En el presente documento, la secuencia de interés es en particular una secuencia de un patógeno (un microorganismo como una bacteria, un virus o un parásito) o un oncogén u otro gen, mientras que la actividad causa una enfermedad o se sabe que la inhibición de la actividad del gen reduce los síntomas (como por ejemplo el gen que codifica PCSK9). La invención comprende además una composición farmacéutica que incluye una enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, un ácido nucleico o vector que codifica una enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención o el conjunto de acuerdo con la invención, así como portadores adecuados.

[0151] La secuencia de interés a la que se dirige una enzima de recombinación de ADN de acuerdo con la invención puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariota. Por ejemplo, la secuencia de interés puede ser un polinucleótido que reside en el núcleo o las mitocondrias de la célula eucariota, o un virus integrado o no en el genoma de la célula huésped. La secuencia de interés puede ser una secuencia que codifica un producto génico (por ejemplo, una proteína) o una secuencia no codificante (por ejemplo, un intrón o un polinucleótido regulador).

[0152] La secuencia de interés a la que se dirigen las enzimas de recombinación de ADN de acuerdo con la invención puede incluir una serie de genes y polinucleótidos asociados a enfermedades, así como genes y polinucleótidos asociados a rutas bioquímicas de señalización.

[0153] Un gen o polinucleótido “asociado a una enfermedad” se refiere a cualquier gen o polinucleótido que produce productos de transcripción o traducción a un nivel anormal o en una forma anormal en células derivadas de tejidos afectados por una enfermedad, en comparación con tejidos o células de un control sin la enfermedad. Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, donde la expresión alterada se correlaciona con la aparición y/o progresión de la enfermedad. Un gen asociado a una enfermedad también se refiere a un gen que posee una(s) mutación(es) o variación genética que son directamente responsables o están en desequilibrio de ligamiento con uno(s) gen(es) responsables de la etiología de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos y pueden estar en un nivel normal o anormal. Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a enfermedades están disponibles en el Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética de la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, Md.), disponibles en la World Wide Web.

[0154] La secuencia de interés a la que se dirigen las enzimas de recombinación de ADN, de acuerdo con la invención, puede incluir varios genes y polinucleótidos asociados a enfermedades, así como genes y polinucleótidos asociados a rutas bioquímicas de señalización, como se enumeran en la patente estadounidense US8697359 B1.

[0155] En las Tablas A y B se enumeran ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a enfermedades. Se puede obtener información específica sobre enfermedades del Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética de la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y del Centro Nacional de Información Biotecnológica de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, Md.), disponibles en la World Wide Web. En la Tabla C se enumeran ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a rutas bioquímicas de señalización.

[0156] Las mutaciones en estos genes y rutas pueden dar lugar a la producción de proteínas inadecuadas o en cantidades inadecuadas, lo que afecta a su función. De acuerdo con la invención, dichos genes, proteínas y rutas pueden ser la secuencia de interés a la que se dirigen las enzimas de recombinación de ADN.

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[0174] Las realizaciones de la divulgación también se relacionan con métodos y composiciones relacionados con la inactivación de genes, amplificación de genes y reparación de mutaciones particulares, que incluyen mutaciones puntuales, mutaciones de desplazamiento de marco de lectura, supresiones o inserciones.

[0175] En todavía otro aspecto de la invención, se puede utilizar la invención para corregir defectos oculares que surgen de diversas mutaciones genéticas.

[0176] Varios aspectos se relacionan con la corrección de defectos asociados a una amplia gama de enfermedades genéticas, que se describen con más detalle en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud en la subsección temática Trastornos Genéticos (sitio web en health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). Las enfermedades cerebrales genéticas pueden incluir, pero no se limitan a, Adrenoleucodistrofia, Agenesia del Cuerpo Calloso, Síndrome de Aicardi, Enfermedad de Alpers. Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Barth, Enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneración Cerebelosa, Enfermedad de Fabry, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Enfermedad de Huntington y otros Trastornos por Repetición de Tripletes, Enfermedad de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Enfermedad de Menkes, Miopatías Mitocondriales y Colpocefalia NINDS. Estas enfermedades se describen con más detalle en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud, en la subsección Trastornos Cerebrales Genéticos.

[0177] En algunas realizaciones, la afección puede ser una neoplasia. En algunas realizaciones, cuando la afección es neoplasia, los genes a los que se dirigen son cualquiera de los enumerados en la Tabla A (en este caso PTEN y así sucesivamente). En algunas realizaciones, la afección puede ser Degeneración Macular relacionada con la Edad. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Esquizofrénico. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno de Repetición de Trinucleótidos. En algunas realizaciones, la afección puede ser el Síndrome del Cromosoma X Frágil. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Relacionado con la Secretasa. En algunas realizaciones, la afección puede ser un trastorno relacionado con Priones. En algunas realizaciones, la afección puede ser ALS. En algunas realizaciones, la afección puede ser una adicción a las drogas. En algunas realizaciones, la afección puede ser Autismo. En algunas realizaciones, la afección puede ser Enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afección puede ser inflamación. En algunas realizaciones, la afección puede ser Enfermedad de Parkinson. Ejemplos de proteínas asociadas con la enfermedad de Parkinson incluyen, pero no se limitan a, α-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Synphilin-1 y NURR1.

[0178] Ejemplos de proteínas relacionadas con la adicción pueden incluir ABAT, por ejemplo.

[0179] Ejemplos de proteínas relacionadas con la inflamación pueden incluir la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimiocinas C-C tipo 5 (CCR5) codificado por el gen Ccr5, el receptor de IgG IIB (FCGR2b, también denominado CD32) codificado por el gen Fcgr2b, o la proteína Fc epsilon R1g (FCER1g) codificada por el gen Fcer1g, por ejemplo.

[0180] Ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina 12 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.

[0181] Ejemplos de proteínas asociadas a la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la proteína receptora de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR) codificada por el gen VLDLR, la enzima activadora del modificador similar a la ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1, o la proteína de la subunidad catalítica de la enzima activadora NEDD8 E1 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.

[0182] Ejemplos de proteínas asociadas al Trastorno del Espectro Autista pueden incluir la proteína 1 asociada al receptor de benzodiazepina (periférico) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la proteína 2 del miembro de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominada MFR2), la proteína homóloga autosómica 1 del retraso mental del cromosoma X frágil (FXR1) codificada por el gen FXR1, o la proteína homóloga autosómica 2 del retraso mental del cromosoma X frágil (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.

[0183] Ejemplos de proteínas asociadas a la Degeneración Macular pueden incluir el casete de unión a la proteína ATP, la proteína 4 (ABCA4) del miembro de la subfamilia A (ABC1) codificada por el gen ABCR, la proteína apolipoproteína E (APOE), codificada por el gen APOE, o la proteína de Ligando 2 (CCL2) de la quimiocina (motivo C-C codificada por el gen CCL2, por ejemplo.

[0184] Ejemplos de proteínas asociadas a la Esquizofrenia pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B y combinaciones de las mismas.

[0185] Ejemplos de proteínas implicadas en la supresión tumoral pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 (homólogo 2 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB3 (homólogo 3 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB4 (homólogo 4 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica v-erb-b2), Notch 1, Notch 2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.

[0186] Ejemplos de proteínas asociadas con un trastorno de secretasa pueden incluir PSENEN (homólogo del potenciador de presenilina 2 (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora del beta amiloide (A4)), APH1B (homólogo B del defecto de la faringe anterior 1 (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (Enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima 1 de escisión de APP en el sitio beta), por ejemplo.

[0187] Ejemplos de proteínas asociadas con la Esclerosis Lateral Amiotrófica pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionada en sarcoma), TARDBP (proteína de unión al ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A), VAGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B) y VAGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), y cualquier combinación de las mismas. Ejemplos de proteínas asociadas con las enfermedades priónicas pueden incluir SODI (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionada en sarcoma), TARDBP (proteína de unión al ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A), VAGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B) y VAGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), y cualquier combinación de las mismas.

[0188] Ejemplos de proteínas relacionadas con afecciones neurodegenerativas en trastornos priónicos pueden incluir A2M (Alfa-2-Macroglobulina), AATF (Factor de transcripción antagonista de la apoptosis), ACPP (Fosfatasa ácida de próstata), ACTA2 (Actina alfa 2 músculo liso aorta), ADAM22 (dominio de metalopeptidasa ADAM), ADORA3 (Receptor de adenosina A3) o ADRA1D (Receptor adrenérgico Alfa-1D para el adrenoreceptor Alfa-1D), por ejemplo.

[0189] Ejemplos de proteínas asociadas con la Inmunodeficiencia pueden incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 2]; o ABCA3 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo. Ejemplos de proteínas asociadas con Trastornos por Repetición de Trinucleótidos incluyen AR (receptor de andrógenos), FMR1 (retraso mental del cromosoma X frágil 1), HTT (huntingtina),o DMPK (proteína quinasa de la distrofia miotónica), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.

[0190] Ejemplos de proteínas asociadas con Trastornos de la Neurotransmisión incluyen SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (adrenérgico, alfa-2A-, receptor), ADRA2C (adrenérgico, alfa-2C-, receptor), TACR1 (receptor de taquiquinina 1) o HTR2c (receptor 2C de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), por ejemplo.

[0191] Ejemplos de secuencias asociadas al neurodesarrollo incluyen A2BP1 [proteína 1 de unión a la ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1] o ABCA13 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 13], por ejemplo.

[0192] Ejemplos adicionales de afecciones preferidas que se pueden tratar con la presente invención se pueden seleccionar de: Síndrome de Aicardi-Goutières; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos Relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipos II y III); Síndrome de Alström; Síndrome de Angelman; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroidea Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Óptica Bilateral y Atrofia Óptica Tipo 1 (Infantil); Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome Cerebrooculofacioesquelético 1 [COFS1]; Xantomatosis Cerebrotendinosa; Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Priónicas Genéticas; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Inicio Temprano; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Orgánicas; Linfohistiocitosis hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad Infantil por Almacenamiento de Ácido Siálico Libre; Neurodegeneración Asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermólisis Ampollosa Juntural; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh y NARP Asociados al ADN Mitocondrial; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad de la Orina con Olor a Jarabe de Arce; Síndrome de Duplicación de MECP2; Trastornos del Transporte de Cobre Relacionados con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogénesis de Peroxisomas, Espectro del Síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con Trastornos de Acumulación Cerebral de Hierro; Deficiencia de Esfingomielinasa Ácida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatía por Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogénesis Imperfecta Relacionada con COL1A 1/2; Síndromes de Supresión del ADN Mitocondrial; Trastornos Relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Enfermedad de Almacenamiento de Glucógeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Rizomélica Punctata Tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Desaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal, Ataxia Espinocerebelosa de Inicio Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia Tanatofórica Tipo 1; Trastornos Relacionados con el Colágeno Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de Lipasa Ácida Lisosomal; y Xeroderma Pigmentoso.

[0193] Como se verá, se prevé que el presente sistema se pueda utilizar para dirigirse a cualquier secuencia de polinucleótidos de interés. Anteriormente se enumeran algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que podrían tratarse eficazmente utilizando el sistema actual, y también se proporcionan ejemplos de genes actualmente asociados con dichas afecciones. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.Ejemplo F-9:

[0194] En una realización preferida de DRiGR, la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención reemplaza una mutación en el exón 8 del gen F9 que es responsable de la hemofilia B. El exón 8 muta con frecuencia en las formas graves de hemofilia B y se conocen las mutaciones que ocurren en la población (www.factorix.org).

[0195] En una realización, la enzima de recombinación de ADN diseñada F9 es un heterotetrámero que comprende dos monómeros diferentes: un monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.1 (Rec F9-1) o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1 y un monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.2 (Rec F9-2) o una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % o incluso 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.2.

[0196] Un objeto de la divulgación es una enzima de recombinación de ADN diseñada que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.1 (Rec F9-1) o SEQ ID NO.2 (Rec F9-2) o una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % o incluso 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.1 o 2.

[0198]

[0200] En el monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.1 (Rec F9-1) preferiblemente las siguientes posiciones portan los siguientes residuos de aminoácidos:

[0201] X17 es cualquier aminoácido, preferiblemente D o G

[0202] X19 es cualquier aminoácido, preferiblemente T o A

[0203] X22 es cualquier aminoácido, preferiblemente G o E

[0204] X30 es un aminoácido apolar pequeño, preferiblemente seleccionado de V, L, I, A o G, más preferiblemente V o A

[0205] X43 es un aminoácido con carga positiva, preferiblemente K o R,

[0206] X60 es cualquier aminoácido, preferiblemente N o D

[0207] X68 es cualquier aminoácido, preferiblemente P o S

[0208] X69 es un aminoácido con carga positiva o con carga negativa, preferiblemente seleccionado de D, E, K o R, más preferiblemente E o K,

[0209] X81 es un aminoácido polar, preferiblemente seleccionado de S, T, C, K o R, más preferiblemente C o R, X84 es cualquier aminoácido, preferiblemente A o T

[0210] X89 es cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q

[0211] X93 es un aminoácido pequeño, preferiblemente seleccionado de C, S y A, más preferiblemente C o A, X140 es cualquier aminoácido, preferiblemente I o T

[0212] X166 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o V, X177 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o V, X182 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o V, X183 es un aminoácido con carga positiva, preferiblemente K o R,

[0213] X186 es un aminoácido polar, preferiblemente S o T

[0214] X206 es cualquier aminoácido, preferiblemente A o T

[0215] X222 es cualquier aminoácido, preferiblemente V o E

[0216] X225 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o V, X237 es un aminoácido polar, preferiblemente seleccionado de S, T, C o Y, más preferiblemente Y o C X239 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L, V o F, más preferiblemente F o I X249 es un aminoácido apolar pequeño, preferiblemente seleccionado de V, L, I, A o G, más preferiblemente V o A

[0217] X259 es cualquier aminoácido, preferiblemente F o P

[0218] X260 es cualquier aminoácido, preferiblemente T o A

[0219] X264 es cualquier aminoácido, preferiblemente A o D

[0220] X278 es cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q

[0221] X284 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o V, X318 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o L, X342 es cualquier aminoácido, preferiblemente G o D

[0222] Las letras mayúsculas representan el código de una sola letra de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC. Las secuencias preferidas de acuerdo con la SEQ ID No 1 se seleccionan de las secuencias de acuerdo con la SEQ ID No 28, SEQ ID No 3 y SEQ ID No 5 y las secuencias con al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % o incluso 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID No.28, SEQ ID No 3 o SEQ ID No 5.

[0225]

[0226] En el monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.2 (Rec F9-2) preferiblemente las siguientes posiciones portan los siguientes residuos de aminoácidos:

[0227] X3 es cualquier aminoácido, preferiblemente K o N

[0228] X5 es cualquier aminoácido, preferiblemente P o Q

[0229] X8 es cualquier aminoácido, preferiblemente H o T

[0230] X14 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L o V, más preferiblemente I o L,

[0231] X16 es un aminoácido apolar pequeño, preferiblemente seleccionado de V, L, I, A o G, más preferiblemente V o A

[0232] X18 es un aminoácido pequeño, preferiblemente A o G

[0233] X19 es cualquier aminoácido, preferiblemente T o A

[0234] X20 es un aminoácido polar, preferiblemente seleccionado de S, T, N o Q, más preferiblemente S o N X21 es cualquier aminoácido, preferiblemente D o G

[0235] X31 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L, V y F, más preferiblemente L o F X39 es un aminoácido con carga positiva o con carga negativa, preferiblemente seleccionado de D, E, K o R, más preferiblemente K o E,

[0236] X80 es cualquier aminoácido, preferiblemente T o A

[0237] X84 es cualquier aminoácido, preferiblemente T o A

[0238] X93 es cualquier aminoácido, preferiblemente C o A

[0239] X97 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L, V y M, más preferiblemente L o M X125 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L y V, más preferiblemente I o V

[0240] X 132 es un aminoácido con carga positiva, preferiblemente K o R

[0241] X182 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L y V, más preferiblemente I o V

[0242] X 183 es un aminoácido con carga positiva, preferiblemente K o R

[0243] X186 es un aminoácido polar, preferiblemente T o S,

[0244] X195 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L y V, más preferiblemente I o V X206 es cualquier aminoácido, preferiblemente A o T

[0245] X216 es cualquier aminoácido, preferiblemente G o R

[0246] X249 es un aminoácido apolar pequeño, preferiblemente seleccionado de V, L, I, A o G, más preferiblemente V o A

[0247] X253 es cualquier aminoácido, preferiblemente I o T

[0248] X259 es cualquier aminoácido, preferiblemente P o S

[0249] X260 es cualquier aminoácido, preferiblemente A o T

[0250] X264 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L y V, más preferiblemente V o I (o L) X266 es un aminoácido pequeño, preferiblemente A o G

[0251] X273 es un aminoácido aromático o heteroaromático, preferiblemente H o Y

[0252] X276 es cualquier aminoácido, preferiblemente K o Q

[0253] X278 es cualquier aminoácido, preferiblemente A o D

[0254] X306 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L y V, más preferiblemente L o I X325 es un aminoácido apolar, preferiblemente seleccionado de I, L y V, más preferiblemente L o I

[0255] De nuevo, las letras mayúsculas representan el código de una sola letra de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC.

[0256] Las secuencias preferidas de acuerdo con la SEQ ID No 2 se seleccionan de las secuencias de acuerdo con la SEQ ID No.29, SEQ ID No 4 y SEQ ID No 6 y las secuencias con al menos 85 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % o incluso 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID No.29, SEQ ID No 4 o SEQ ID No 6.

[0257] Los pares de monómeros preferidos para formar la enzima de recombinación de ADN diseñada F9 de acuerdo con la invención portan las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEQ 28 y 29, y en particular la SEQ 3 y 4 así como la SEQ 5 y 6.

[0258] En otra realización, la enzima de recombinación de ADN diseñada F9 comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID No. 36 (Rec F9-3) o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia, preferiblemente 95 %, más preferiblemente 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.36. En este caso, la enzima de recombinación de ADN diseñada F9 es preferiblemente un homotetrámero.

[0259] La enzima de recombinación de ADN diseñada F9 de acuerdo con la invención se ha obtenido utilizando el método de acuerdo con la invención descrita en el presente documento y reconoce los sitios objetivo loxF9-A y loxF9-A asimétricos de acuerdo con la SEQ ID No 7 y SEQ ID No 8:

[0261]

[0264] Estas secuencias se presentan en el genoma humano y flanquean el exón 8 del gen F9. La divulgación comprende un ácido nucleico seleccionado de la SEQ ID NO. 7 (loxF9a) y SEQ ID NO. 8 (loxF9b) o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95 % de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 99 % de identidad de secuencia, con la SEQ ID NO.7 o SEQ ID NO.

[0265] 8 o una secuencia de ácidos nucleicos inversa complementaria a una de estas secuencias y su uso como sitio objetivo para una enzima de recombinación de ADN, preferiblemente una enzima de recombinación de ADN diseñada F9 de acuerdo con la invención. En una realización estos ácidos nucleicos de acuerdo con la invención tienen una longitud de 30 a 40 nucleótidos, preferiblemente 32 a 36, más preferiblemente 34 nucleótidos.

[0266] La invención también comprende ácidos nucleicos y vectores que codifican la enzima de recombinación de ADN diseñada F9 de acuerdo con la invención.

[0267] La divulgación también comprende un método para la transducción de una célula con:

[0268] 1. un vector de suministro que comprende un ácido nucleico que codifica la enzima de recombinación de ADN diseñada F9 de acuerdo con la invención,

[0269] 2. una secuencia donante que comprende los sitios loxF9a y LoxF9b que rodean una secuencia que codifica el exón 8 del gen F9 o un mutante funcional del mismo, y la expresión de la enzima de recombinación de ADN. La secuencia donante se puede ubicar en el vector de expresión o de suministro, o bien, se proporciona como un ácido nucleico separado, preferiblemente un plásmido deficiente en replicación. Preferiblemente, la secuencia donante se proporciona en múltiples copias por célula para aumentar la probabilidad de reemplazo de la secuencia objetivo (véase también Fig.3 y ejemplificado en la Fig.11).

[0270] La presente divulgación comprende además un método para reemplazar un exón 8 mutante (no mutante o defectuoso) del gen F9 en una célula, al introducir en una célula:

[0271] - una enzima de recombinación de ADN F9 diseñada de acuerdo con la invención o un ácido nucleico o vector que la codifique y exprese,

[0272] - una secuencia donante que comprende una secuencia que codifica el exón 8 del gen F9 o un mutante funcional del mismo flanqueado por los sitios objetivo loxF9a y loxF9b, mientras que la enzima de recombinación de ADN de diseño F9 reemplaza una secuencia que comprende el exón 8 mutante por la secuencia donante mediante recombinación específica de sitio.

[0273] La invención también comprende un kit que comprende

[0274] - una enzima de recombinación de ADN F9 de diseño de acuerdo con la invención o un ácido nucleico o vector que la codifique,

[0275] - una secuencia donante que comprende una secuencia que codifica el exón 8 del gen F9 o un mutante funcional del mismo flanqueado por los sitios objetivo loxF9a y loxF9b.

[0276] En una realización preferida, la secuencia del exón 8 defectuoso de F9 se reemplaza por una secuencia donante que lleva la mutación hiperactiva de Padua (R338L) (PMID: 23197580).

[0277] Las secuencias donantes preferidas particulares para los métodos mencionados anteriormente y el kit se seleccionan de la SEQ ID No.26 (exón 8 de tipo silvestre) y SEQ ID No.27 (exón 8 con mutación Padua). La secuencia donante se puede ubicar en el vector que codifica la enzima de recombinación de ADN de diseño F9 (véase Fig. 11 para un ejemplo) o se proporciona como ácido nucleico separado, preferiblemente un plásmido deficiente en replicación.

[0278] Preferiblemente, la secuencia donante se proporciona en los métodos mencionados anteriormente y el kit en múltiples copias por célula (por ejemplo, en un vector AAV) para aumentar la probabilidad de reemplazo de la secuencia objetivo (véase también la Fig.11 para un ejemplo).

[0279] Ejemplo Hex:

[0280] En una realización preferida de DRiGD, la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la invención suprime una secuencia en el cromosoma humano 7. Esta enzima de recombinación de ADN diseñada se denomina además enzima de recombinación de ADN diseñada Hex y reconoce los sitios objetivo asimétricos Hex1 y Hex2 de acuerdo con la SEQ ID No 40 y SEQ ID No 41:

[0282]

[0285] En una realización, la enzima de recombinación de ADN diseñada es un heterotetrámero que comprende dos monómeros diferentes: un monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.46 (Hex-R-#7) o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.46 y un monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.47 (Hex-L-#7) o una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % o incluso 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.47.

[0286] En otra realización, la enzima de recombinación de ADN diseñada es un heterotetrámero que comprende dos monómeros diferentes: un monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.48 (Hex-R-#30) o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.48 y un monómero con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.49 (Hex-L-#30) o una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente 95 % o incluso 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.49.

[0287] La invención también comprende ácidos nucleicos y vectores que codifican la enzima de recombinación de ADN diseñada Hex de acuerdo con la invención.

[0288] En un aspecto adicional la divulgación incluye las enzimas de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos o vectores de acuerdo con la invención o el conjunto /kit de acuerdo con la invención para uso en medicina, en particular para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con uno de los genes o polinucleótidos asociados a enfermedades mencionados anteriormente o los genes y polinucleótidos asociados a la ruta bioquímica de señalización mencionados anteriormente.

[0289] En un aspecto similar, la divulgación incluye la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con uno de los genes o polinucleótidos de enfermedades mencionados anteriormente o con los genes y polinucleótidos asociados a la ruta bioquímica de señalización mencionados anteriormente, que comprende las enzimas de recombinación de ADN de acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos o vectores de acuerdo con la invención o el conjunto/kit de acuerdo con la invención o utilizando un método de acuerdo con la invención.

[0290] Se observa que en la presente divulgación, y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, términos como “comprende”, “comprendido”, “que comprende” pueden significar “incluye”, “incluido”, “que incluye” y similares; y que términos como “que consiste esencialmente en” y “consiste esencialmente en” permiten elementos no mencionados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención. Estas y otras realizaciones se divulgan o resultan obvias a partir de y que están abarcadas por la siguiente Descripción Detallada.

[0291] Además, las realizaciones descritas en la presente divulgación se pueden combinar entre sí.

[0292] La invención se ilustra mediante las siguientes Figuras y ejemplos no limitantes:

[0293] La Fig.1 muestra un esquema general de un sistema preferido de Reemplazo de Genes inducido por la enzima de Recombinación de ADN Diseñada (DRiGR) de acuerdo con la invención. Se muestran diferentes monómeros R1-4 de enzimas de recombinación de ADN y sus respectivas secuencias de unión al ADN loxR1-loxR4 (semisitios de los sitios objetivo). El sitio de interés en el genoma (cara triste) se reemplaza por una secuencia deseada (cara sonriente).

[0294] La Fig.2 muestra un esquema general de una Supresión Genética inducida por una enzima de Recombinación de ADN Diseñada (DRiGD). De nuevo, en el esquema superior se muestran diferentes monómeros R1-4 de enzimas de recombinación de ADN que se unen a sus respectivas secuencias de unión al ADN loxR1-loxR4. En el presente documento, los sitios objetivo llevan espaciadores idénticos de 8 bp cada uno. En el presente documento se recorta el sitio de interés en el genoma (cara triste).

[0295] La Fig. 3 ilustra que si el vector donante está en exceso con respecto al ADN genómico, el Reemplazo de Genes inducido por la enzima de recombinación de ADN se dirige hacia el reemplazo del ADN genómico con el ADN del vector donante. Preferiblemente, el vector donante está presente en múltiples copias en el núcleo de la célula objetivo, como en los vectores AAV, lo que da como resultado una reparación eficiente de las mutaciones celulares.

[0296] La Fig.4 demuestra un método general para obtener una enzima de Recombinación de ADN para DRiGR al aplicar una novedosa estrategia de evolución dirigida (Duo-SLiDE DRiGR) que suministra un par de monómeros de enzimas de recombinación de ADN que trabajan conjuntamente para recombinar dos sitios objetivo diferentes (triángulo blanco lox 1 y triángulo negro lox 2) presentes en el genoma, a partir de un vector fuente con dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN. La expresión de recombinasas individuales en este sistema también es factible (véase Fig. 15). R1, R2 y R3 representan tres enzimas de restricción diferentes o los sitios de restricción respectivos. P1 y P2 representan dos cebadores de PCR diferentes o los sitios de unión de los cebadores respectivos.

[0297] Cuando estos monómeros de enzimas de recombinación de ADN se expresan junto con una plantilla de ADN que también contiene los dos sitios objetivo (en este caso, el plásmido pDonor), la recombinación en ambos sitios objetivo conduce al intercambio de los fragmentos de ADN. Debido a que el fragmento de ADN entrante elimina un sitio de restricción del vector pDuoSLiDE, las recombinasas efectivas que promovieron el reemplazo se pueden amplificar mediante PCR después de la digestión del ADN con la enzima de restricción. El análisis cíclico de este sistema, en combinación con la mutagénesis aleatoria y la mezcla de ADN, descubre las recombinasas más eficientes que promueven la reacción. Al utilizar un origen de replicación (R6K-ori) en pDonor que está inactivo en el huésped, se puede desacoplar el proceso de integración a través de un sitio objetivo (por ejemplo, lox1) y la escisión a través del otro sitio objetivo (por ejemplo, lox2). Además, la integración se puede identificar mediante la selección con antibióticos en placas que contienen kanamicina. La Fig. 5 demuestra un método similar para obtener una enzima de Recombinación de ADN para DRiGR al aplicar una novedosa estrategia de evolución dirigida (QuSLiDE DRiGR) que suministra dos pares de monómeros de enzimas de recombinación de ADN que trabajan conjuntamente para recombinar dos sitios objetivo diferentes. En el presente documento cada monómero se dirige a un semisitio de un sitio objetivo (triángulo blanco lox 1 y triángulo negro lox 2) presente en el genoma, comenzando con un vector fuente con cuatro bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN. (R1, R2 y R3, así como P1 y P2, tienen el significado como en la Fig.4).

[0298] Si el ADN del vector donante contiene el alelo de tipo silvestre y el genoma contiene una mutación causante de enfermedad, el defecto genético se repara en las células (véase la Fig.1).

[0299] La Fig.6 demuestra un método general para obtener una enzima de Recombinación de ADN para DRiGD al aplicar una novedosa estrategia de evolución dirigida (Duo-SLiDE DRiGD) que suministra un par de monómeros de enzimas de recombinación de ADN que trabajan conjuntamente para recombinar dos sitios objetivo diferentes (triángulo blanco lox 1 y triángulo negro lox 2) presentes en el genoma, a partir de un vector fuente con dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN. (R1, R2 y R3, así como P1 y P2, tienen el significado como en la Fig.4).

[0300] Cuando se expresan estos monómeros de enzimas de recombinación de ADN, la recombinación entre dos copias del vector pDuoSLiDE elimina un sitio de restricción del vector pDuoSLiDE; las recombinasas efectivas que promovieron la supresión se pueden amplificar mediante PCR después de la digestión del ADN con la enzima de restricción. El análisis cíclico de este sistema, en combinación con la mutagénesis aleatoria y la mezcla de ADN, descubre las recombinasas más eficientes que promueven la reacción.

[0301] La Fig. 7 demuestra un método similar para obtener una enzima de Recombinación de ADN para DRiGD al aplicar una novedosa estrategia de evolución dirigida (QuSLiDE DRiGD)) que suministra dos pares de monómeros de enzimas de recombinación de ADN que trabajan conjuntamente para recombinar dos sitios objetivo diferentes. En el presente documento cada monómero se dirige a un semisitio de un sitio objetivo (triángulo blanco lox 1 y triángulo negro lox 2) presente en el genoma, comenzando con un vector fuente con cuatro bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN. (R1, R2 y R3, así como P1 y P2, tienen el significado como en la Fig.4).

[0302] Este conjunto de monómeros permite suprimir un sitio de interés en un Genoma (véase la Fig.2).

[0303] La Fig.8 muestra un método conocido en el estado de la técnica para obtener una recombinasa adaptada que trabaja en sitios objetivo mediante evolución de proteínas ligada al sustrato (SLiPE) (Buchholz F and Stewart AF, 2001). En el presente documento el vector solo contiene una biblioteca y dos sitios objetivo idénticos (triángulos discontinuos).

[0304] La Fig.9 muestra la aplicación de la invención para reemplazar una mutación en el exón 8 del gen F9 mediante Duo-SLiDE DRiGR. La Fig.9A muestra la presentación esquemática del exón 8 y la secuencia flanqueante del gen F9. Las dos secuencias objetivo seleccionadas (loxF9a - SEQ ID No. 3 y loxF9b - SEQ ID No.4) están indicadas por triángulos (negro y blanco) y se muestran la secuencia de nucleótidos y las posiciones cromosómicas. La Fig.9B ilustra el método para obtener los dos monómeros de recombinasa F9-1 (SEQ ID No.1, 3, 5 y 28) y F9-2 (SEQ ID No.2, 4, 6 y 29) y la reacción de reemplazo. La secuenciación de ADN confirmó que las reacciones de recombinación se habían producido según lo previsto. La Fig. 9C muestra un gel de agarosa que demuestra el patrón de restricción para pDuoF9 (fuente) (carril 1) y pDuoF9 (producto) (carril 2) después de la digestión con Ndel y Sacl. M = marcador molecular.

[0305] La Fig. 10 muestra un proceso de evolución de ejemplo de adaptación de las bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN a un sitio objetivo determinado - en el presente documento aplicado a los sitios objetivo loxF9a y loxF9b. En el presente documento se obtuvieron enzimas de recombinación de ADN que son activas en el sitio loxF9a (F9A) al diseñar dos sitios intermedios simétricos AL y AR y realizar 20 o 17 ciclos de SLiPE (véase Fig.8). Después de combinar y mezclar las bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN obtenidas, se realizaron 108 ciclos de SLiPE en el sitio asimétrico loxF9a (F9A). Se muestran geles de agarosa de los ciclos de generación indicados, donde la línea con dos triángulos indica la banda no recombinada y la línea con un triángulo muestra el tamaño de la banda recombinada. El triángulo gris debajo de las imágenes del gel indica la cantidad reducida de L-arabinosa agregada al medio de cultivo. Para obtener enzimas de recombinación de ADN que sean activas en el sitio loxF9b (F9B), se diseñó un primer conjunto de dos sitios intermedios simétricos BLS y BRS y se realizaron 9 ciclos de SLiPE (véase Fig.8). Después de mezclar de nuevo las bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN, se realizó SLiPE en un segundo conjunto de sitios intermedios simétricos BL (30 ciclos) y BR (22 ciclos). Finalmente, después de combinar y mezclar bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN obtenidas, se realizaron 17 ciclos de SLIPE en el sitio asimétrico loxF9b (F9B). Finalmente (no se muestra), se clonaron las dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN obtenidas en el sitio loxF9a y el sitio loxF9b en pDuoF9 (fuente) - véase la Fig.9.

[0306] La Fig.11 ilustra el uso de las enzimas de recombinación de ADN F9 diseñadas en un entorno terapéutico; ambas secuencias codificantes F9-1 y F9-2 se clonan en un vector de suministro (como un vector viral adenoasociado) junto con la secuencia donante que contiene loxF9a y loxF9b flanqueando el tipo silvestre o la mutación Padua (R338L) del exón 8 del gen F9. El suministro de dicho vector en las células objetivo en múltiples copias reemplaza la mutación inactivadora en el genoma.

[0307] La Fig.12 muestra el resultado de un cribado del Gen PCSK9 humano en el Cromosoma 1 para repeticiones de 8 bp. Los exones del Gen PCSK9 están indicados con recuadros en negrita. Las repeticiones de 8 bp están separadas por al menos 150 bp y no más de 2 kb y se encuentran en sitios objetivo potenciales (indicados por líneas verticales) con una longitud de 34 bp, que se cribaron para que no ocurrieran en ninguna otra parte del genoma. Las secuencias de interés entre los posibles sitios objetivo se indican mediante líneas horizontales. La Fig.13 muestra el resultado de un cribado similar del genoma del virus del papiloma humano 16 (HPV16) para repeticiones de 8 bp que están separadas por al menos 150 bp y no más de 2 kb y se encuentran en sitios objetivo potenciales de 34 bp, que se cribaron para que no ocurrieran en el genoma humano. Las secuencias que codifican las proteínas virales se indican en recuadros en negrita con flechas (signos mayor que).

[0308] La Fig.14 demuestra un método general diferente para obtener una enzima de Recombinación de ADN para DRiGR utilizada en la etapa 3 del ejemplo 3, al aplicar una nueva estrategia de evolución dirigida (SLiDE DRiGR 2.0) que suministra una biblioteca de enzimas de recombinación de ADN que recombina dos sitios objetivo diferentes (triángulo blanco lox 1 y triángulo negro lox 2) presentes en el genoma inicial. R1, R2, R3, R4 y R5 representan cinco enzimas de restricción diferentes o los sitios de restricción respectivos. P3 y P4 representan dos cebadores de PCR diferentes o los sitios de unión de los cebadores respectivos. Cuando esta biblioteca de enzimas de recombinación de ADN se expresa en presencia de una plantilla de ADN que también contiene los dos sitios objetivo (en el presente documento, el plásmido pDonor-ex8), la recombinación en ambos sitios objetivo conduce al intercambio de los fragmentos de ADN. Debido a que el fragmento de ADN entrante elimina los sitios de restricción del vector pF9, las recombinasas efectivas que promovieron el reemplazo se pueden amplificar mediante PCR después de la digestión del ADN con las enzimas de restricción R1-3 y RecBCD. El análisis cíclico de este sistema en combinación con la mutagénesis aleatoria y la mezcla de ADN descubre las recombinasas más eficientes que promueven la reacción de DRIGR.

[0309] La Fig.15 destaca las etapas de la novedosa estrategia de evolución dirigida (SLiDE DRiGR) utilizada en el ejemplo 3, etapa 3. En una subetapa 1, pF9 (fuente) y pDonor se transforman en bacterias. Solo si se induce la expresión de las recombinasas, se puede observar el crecimiento de colonias resistentes al antibiótico. En la subetapa 2, el ADN plasmídico de las colonias obtenidas se digiere utilizando las enzimas de restricción R1-3. Esto enriquecerá los clones que se hayan sometido con éxito a DRIGR y dará como resultado una preparación pura de pF9 (producto). La pureza de la preparación del plásmido se verifica con una digestión de restricción utilizando las enzimas Xhol y Xmal, que muestra el patrón de restricción único de pDuoF9 (producto). Adicionalmente, la secuenciación de ADN revela la secuencia correcta de pF9 (producto).

[0310] La Fig. 16 muestra un método general diferente para obtener una enzima de Recombinación de ADN para DRiGR al aplicar una novedosa estrategia de evolución dirigida (Duo-SLiDE DRiGR 2.0) que suministra uno o un par de monómeros de enzimas de recombinación de ADN que trabajan conjuntamente para recombinar dos sitios objetivo diferentes (triángulo blanco lox 1 y triángulo negro lox 2) presentes en el genoma, a partir de un vector fuente con una o dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN. R1, R2, R3, R4 y R5 representan cinco enzimas de restricción diferentes o los sitios de restricción respectivos. P3 y P4 representan dos cebadores de PCR diferentes o los sitios de unión de los cebadores respectivos. Cuando estos monómeros de enzimas de recombinación de ADN se expresan junto con una plantilla de ADN que también contiene los dos sitios objetivo (en el presente documento, el plásmido de alto número de copias pDonor-ex8), la recombinación en ambos sitios objetivo conduce al intercambio de los fragmentos de ADN. Debido a que el fragmento de ADN entrante elimina un sitio de restricción del vector pDuoSLiDE, las recombinasas efectivas que promovieron el reemplazo se pueden amplificar mediante PCR después de la digestión del ADN con la enzima de restricción. Es importante destacar que en este ensayo no se utiliza ningún marcador de selección de antibióticos. El análisis cíclico de este sistema, en combinación con la mutagénesis aleatoria y la mezcla de ADN, descubre las recombinasas más eficientes que promueven la reacción.

[0311] La Fig. 17 muestra la alineación entre Cre (estado de la técnica), una recombinasa obtenida después de la etapa 1 del ejemplo 3 (R#1), una recombinasa obtenida después de la etapa 2 del ejemplo (3R#7-B5) y una recombinasa obtenida después de la etapa 3 del ejemplo 3 (F9-3). La alineación muestra cómo han surgido mutaciones adicionales durante fases posteriores de la evolución.

[0312] La Fig.18 muestra un esquema general del método de la invención, ejemplificado por el método DRiGD y las etapas de la invención.

[0313] Las Fig.19 y 20 muestran un esquema más detallado del método de la invención, ejemplificado por el método DRiGD y aplicado al genoma humano.

[0314] La Fig.21 ilustra el método DRIGD de la invención aplicado a un sitio objetivo en el cromosoma humano 7 -descrito con más detalle en el ejemplo 5. A. muestra los sitios objetivo: Hex 1 y Hex 2 son los sitios objetivo utilizados para la escisión - HexL, HexR, HexR1 y HexR2 son sitios objetivo intermedios. B. muestra la evolución de recombinasas específicas para los sitios objetivo Hex1 y Hex2. C. muestra la eficiencia de recombinación de dos clones (Clon #7 y Clon #30) obtenidos.

[0315] La Fig.22 muestra la escisión precisa de una secuencia de un sustrato de plásmido utilizando las recombinasas obtenidas en el ejemplo 5.

[0316] Ejemplo 1:

[0317] Para demostrar la utilidad de DRiGD, los inventores han cribado el genoma humano en busca de todas las repeticiones de 8 bp, separadas por al menos 150 bp: Los sitios objetivo potenciales son las secuencias indicadas a 13 bp a la izquierda y 13 bp a la derecha de la repetición de 8 bp que no se produce en ninguna otra parte del genoma humano en una ventana para suprimir un máximo de 2 kb del genoma. La Fig.12 muestra los resultados para todos los 309 sitios objetivo posibles para las enzimas de recombinación de ADN en el gen humano PCSK9. La Fig.13 muestra los resultados para todos los 176 sitios objetivo posibles para las enzimas de recombinación de ADN en el virus del papiloma humano 16 (HPV16).

[0318] Ejemplo 2:

[0319] Para demostrar la viabilidad de la invención DRiGR, los inventores han generado recombinasas que, cuando se aplican en conjunto, pueden reemplazar el exón ocho del gen del factor humano 9 (F9). Este exón frecuentemente lleva mutaciones en pacientes que padecen hemofilia B. Nuestros resultados demuestran que este exón puede ser reemplazado eficientemente por una secuencia diferente que proporciona un vector donante apropiado y la expresión de dos recombinasas que trabajan en conjunto (Fig.6, Fig.9 y Fig.11).

[0320] Se utilizan los materiales y métodos como se describe en los documentos WO 2008/083931 A1, WO 2011/147590 A1, WO2016034553 A1 y en la publicación Buchholz F and Stewart AF, 2001, a menos que se especifique lo contrario.

[0321] Las secuencias objetivo (loxF9a - SEQ ID No. 7 y loxF9b - SEQ ID No. 8) se seleccionaron comparando secuencias en el genoma humano con los semisitios de los sitios objetivo previamente identificados (LoxP, LoxH, LoxM7, LoxM5, loxLTR, LoxBTR) de las enzimas de recombinación de ADN:

[0323]

[0326] En la tabla, el primer (izquierdo) y el segundo (derecho) semisitios en los sitios objetivo están subrayados. En una primera etapa, las dos bibliotecas de recombinasas se evolucionaron por separado utilizando el enfoque SLiDE como se describió anteriormente (Buchholz and Stewart, 2001 y WO 2002044409 A2 - véase la Fig.8). En resumen, cada biblioteca evolucionó hacia la recombinación de sitios objetivo intermedios (AL, AR, BLS, BLRS, BL, BR) y finalmente hacia la recombinación de uno de los dos sitios objetivo, loxF9a o loxF9b. Se introdujeron nuevas mutaciones a través de PCR propensa a errores y mezcla de ADN, y la presión selectiva se reguló aún más a través del nivel de expresión de las recombinasas. Las recombinasas activas se seleccionaron por su capacidad de recombinar el sitio objetivo respectivo para suprimir la secuencia flanqueada por los sitios objetivo del vector (véase la Fig.8).

[0327] Se utilizaron las siguientes secuencias intermedias:

[0329]

[0332] Las secuencias codificadoras de recombinasa de estas dos bibliotecas se clonaron luego en la estructura principal del vector pDuoF9 (fuente) (SEQ ID No. 21, véase la Fig.9). En este vector, las dos bibliotecas de recombinasas se expresan a partir de un promotor inducible compartido en una estructura similar a un operón, que liga transcripcionalmente ambas enzimas. El tamaño de esta biblioteca superaba los 100.000 clones. Para llevar a cabo DRiGR, se transformaron 50 µl de células electrocompetentes de E. coli XL1-Blue con 1 ng de la biblioteca pDuoF9 (fuente) y se cultivaron durante la noche en 200 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de cloranfenicol. Al día siguiente, se utilizó 1 ml del cultivo nocturno para inocular 100 ml de medio fresco y se cultivó durante 2 h. Luego, el cultivo se dividió en 2 x 50 ml y se agregó L-arabinosa hasta una concentración final de 50 µg/ml para inducir la expresión de la recombinasa en uno de los cultivos. Después de 2.5 h de incubación, las células se pusieron en hielo y se prepararon para la electroporación como se describió anteriormente (Sambrook and Russell, 2001). Las células electrocompetentes se resuspendieron en 200 µl de agua y se utilizaron inmediatamente 50 µl de la suspensión celular para la transformación de 0.4 ng de pDonor a 1700 V. A continuación, se dejó que las bacterias se recuperaran durante 2 h en medio SOC antes de sembrar toda la suspensión en placas de agar LB que contenían 15 µg/ml de kanamicina.

[0333] No crecieron colonias durante la noche en las placas de agar donde se habían sembrado células no inducidas, lo que valida que la expresión de la recombinasa era necesaria para la integración del vector pDonor (SEQ ID No.22). Todas las colonias que crecieron a partir de las muestras inducidas se agruparon y cultivaron en 220 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de kanamicina y 50 µg/ml de L-arabinosa para permitir la posible recombinación a través del segundo par de sitios objetivo.

[0334] Al día siguiente se aisló el ADN plasmídico del cultivo. Para enriquecer los clones que habían pasado por DRiGR con éxito, el ADN se digirió con enzimas que escindían cualquier - selección negativa - que no fuera pDuoF9 (producto) y se volvió a transformar. Para ello, se digirieron 500 ng de preparación de plásmido con 1 µl de cada uno de Ndel, AvrII y PspXl. Después de 3 h de incubación a 37 °C, el ADN se precipitó y se resuspendió en 50 µl de agua. Se utilizó 1 µl de esto para la transformación de 50 µl de células electrocompetentes de E. coli XL1-Blue. Las células transformadas se cultivaron en 220 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de kanamicina - selección positiva -.

[0335] Al día siguiente se aisló el ADN plasmídico del cultivo. Las bibliotecas de recombinasa se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores P1 y P2 (SEQ ID No. 23 y 24) y los productos de PCR se purificaron en una columna y se sometieron a una digestión con las enzimas de restricción Sacl y Sbfl. Las bibliotecas de recombinasa aisladas se volvieron a ligar en pDuoF9 (fuente) para iniciar otro ciclo de DRiGR. Se realizaron tres rondas de Duo-SLiDE DRIGR (véase Fig.10) para enriquecer las recombinasas que pueden llevar a cabo de manera eficiente DRiGR en los sitios objetivo loxF9a y LoxF9b.

[0336] Cebador utilizado:

[0339]

[0342] La secuencia del plásmido pDuoF9 (producto) se proporciona en la SEQ ID No.25.

[0343] Mediante este método se obtuvieron las secuencias de los siguientes pares de monómeros de recombinasa: Rec F9-1a: SEQ ID NO.: 3 y Rec F9-2a: SEQ ID NO.: 4

[0344] Rec F9-1b: SEQ ID NO.: 5 y Rec F9-2b: SEQ ID NO.: 6

[0346] Ejemplo 3

[0347] Etapa 1:

[0348] En una primera etapa, las dos bibliotecas de recombinasas se evolucionaron por separado utilizando el enfoque SLiDE como se describió anteriormente (Buchholz and Stewart, 2001 y WO 2002044409 A2 - véase la Fig.8). En resumen, cada biblioteca evolucionó como se describe en el ejemplo 2 hacia la recombinación de sitios objetivo intermedios (loxF9-AL, AR, BLS, BLRS, BL, BR -véase el ejemplo 2) y finalmente hacia la recombinación de uno de los dos sitios objetivo, loxF9a o loxF9b. Se introdujeron nuevas mutaciones a través de PCR propensa a errores y mezcla de ADN, y la presión selectiva se reguló aún más a través del nivel de expresión de las recombinasas. Las recombinasas activas se seleccionaron por su capacidad de recombinar el sitio objetivo respectivo para suprimir la secuencia flanqueada por los sitios objetivo del vector (véase la Fig. 8).

[0349] Etapa 2:

[0350] En una segunda etapa, se evolucionó una única biblioteca de recombinasa para llevar a cabo DRiGR siguiendo un esquema de selección con el pDonor deficiente en replicación (véase Fig. 9). Esto implicó clonar las secuencias codificadoras de la recombinasa de las bibliotecas generadas en la etapa 1 en la estructura principal del vector pF9 (fuente) (= pDuoF9 SEQ ID No. 21). En este vector se pueden expresar de una a cuatro bibliotecas de recombinasas a partir de un promotor inducible compartido en una estructura similar a un operón, que liga transcripcionalmente ambas enzimas. El tamaño de esta biblioteca superaba los 100.000 clones.

[0351] Para llevar a cabo DRiGR, se transformaron 50 µl de células electrocompetentes de E. coli XL1-Blue con 1 ng de la biblioteca pDuoF9 (fuente) y se cultivaron durante la noche en 200 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de cloranfenicol. Al día siguiente, se utilizó 1 ml del cultivo nocturno para inocular 100 ml de medio fresco y se cultivó durante 2 h. Luego, el cultivo se dividió en 2 x 50 ml y se agregó L-arabinosa hasta una concentración final entre 1-200 µg/ml para inducir la expresión de la recombinasa en uno de los cultivos. Después de 2.5 h de incubación, las células se pusieron en hielo y se prepararon para la electroporación como se describió anteriormente (Sambrook and Russell, 2001). Las células electrocompetentes se resuspendieron en 200 µl de agua, y 200 µl de la suspensión celular se utilizaron inmediatamente para la transformación de 80 ng de pDonor a 1700 V. A continuación, se dejó que las bacterias se recuperaran durante 2 h en medio SOC antes de utilizar toda la suspensión para inocular 200 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de cloranfenicol, 5 µg/ml de kanamicina y 1-200 µg/ml de L-arabinosa. Una pequeña parte de la suspensión se sembró en placas de agar para estimar el tamaño de la biblioteca.

[0352] Al día siguiente se verificó que no habían crecido colonias en las placas de agar donde se habían sembrado células no inducidas, validando que la expresión de la recombinasa era necesaria para la integración del vector pDonor (SEQ ID No.22). El ADN plasmídico se aisló del cultivo líquido. Para enriquecer los clones que habían pasado por DRiGR con éxito, el ADN se digirió con enzimas que escindían cualquier - selección negativa - que no fuera pDuoF9 (producto) y se volvió a transformar. Para ello, se digirieron 500 ng de preparación de plásmido con 1 µl de cada uno de Ndel, AvrII, PspXl y Fspl. Después de 3 h de incubación a 37 °C, el ADN se purificó mediante microdiálisis en un filtro de membrana. Se utilizaron 3 µl de este digerido para la transformación de 50 µl de células electrocompetentes de E. coli XL1-Blue. Las células transformadas se cultivaron en 100 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de cloranfenicol y 15 µg/ml de kanamicina - selección positiva -Al día siguiente se aisló el ADN del plásmido del cultivo y se digirieron 500 ng de ADN con 1 µl de cada uno de Ndel y Avrll. Las bibliotecas de recombinasa se amplificaron mediante PCR propensa a errores utilizando los cebadores P1# y P2# (SEQ ID No. 30 y 31) y los productos de PCR se purificaron en una columna y se sometieron a una digestión con las enzimas de restricción Sacl y Sbfl. Las bibliotecas de recombinasa aisladas se volvieron a ligar en pDuoF9 (fuente) para iniciar otro ciclo de DRiGR. Después de los ciclos 3 y 8, se llevó a cabo una mezcla de ADN como se describió anteriormente (Buchholz and Stewart, 2001). Se realizaron once rondas de Duo-SLiDE DRIGR para enriquecer las recombinasas que pueden llevar a cabo de manera eficiente DRiGR en los sitios objetivo loxF9a y loxF9b.

[0353] Etapa 3:

[0354] En una tercera etapa, se evolucionó una única biblioteca de recombinasas para llevar a cabo DRiGR 2.0 siguiendo un esquema de selección diferente (véase Fig.14) con el plásmido de alto número de copias pDonorex8 (véase Fig.14, SEQ ID 37) sin selección de antibióticos y sin separar la integración de la resolución del vector donante. Esto implicó clonar las secuencias codificadoras de la recombinasa de la biblioteca generada en la etapa 2 en la estructura principal del vector pF9 (fuente) (=pDuoF9 (fuente) SEQ ID NO.: 21). Luego, la biblioteca se transformó en células E. coli XL1-Blue electrocompetentes que ya portaban pDonor-ex8. Las células transformadas se cultivaron en 100 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de cloranfenicol, 5 µg/ml de kanamicina y 1 - 200 µg/ml de L-arabinosa. El tamaño de esta biblioteca superaba los 100.000 clones.

[0355] Al día siguiente se aisló el ADN del plásmido del cultivo y se digirieron 1000 ng de ADN con 1 µl de cada uno de Ndel, Avrll, PspXI (enzimas de restricción R1, R2 y R3 - véase la Fig.14 y 15) y la exonucleasa RecBCD. Las bibliotecas de recombinasa se amplificaron mediante PCR propensa a errores utilizando los cebadores P3 y P4 (SEQ ID No. 32 y 33) y los productos de PCR se purificaron en una columna y se sometieron a una digestión con las enzimas de restricción Sacl y Sbfl. Las bibliotecas de recombinasa aisladas se volvieron a ligar en pF9 (fuente) y se transformaron en células electrocompetentes de E. coli XL1-Blue que portaban pDonor-ex8. Las células transformadas se cultivaron en 100 ml de medio LB que contenía 15 µg/ml de cloranfenicol, 5 µg/ml de kanamicina y 1 - 200 µg/ml de L-arabinosa y así comenzó el siguiente ciclo. Cada tres ciclos se realizó una recombinación de ADN como se describió anteriormente (Buchholz and Stewart, 2001). Se realizaron once rondas de SLiDE DRIGR (véase Fig. 14) para enriquecer las recombinasas que pueden llevar a cabo DRiGR de manera eficiente en los sitios objetivo loxF9a y LoxF9b sin selección de antibióticos y sin separar la integración de la resolución del vector donante.

[0356] Cebadores utilizados:

[0359]

[0360] Mediante este método se obtuvieron las secuencias de los siguientes monómeros de recombinasa: R#1 (SEQ ID NO.: 34) después de la etapa 1: R#7-B5 (SEQ ID No.35) después de la etapa 2 y Rec F9-3 (SEQ ID No.36) después de la etapa final 3.

[0361] La eficiencia de recombinasa (eficiencia DRGR) de las recombinasas obtenidas después de las etapas 1, 2 y 3 se compara en la siguiente tabla:

[0363]

[0366] Ejemplo 4

[0367] Para utilizar las recombinasas F9 en un entorno terapéutico, las secuencias codificantes F9-1 y F9-2 se clonan en un vector de suministro (como un vector viral adenoasociado) junto con la secuencia donante que contiene loxF9a y loxF9a flanqueando el tipo silvestre o la mutación Padua (R338L) del exón 8 del gen F9. El suministro de dicho vector en las células objetivo en múltiples copias reemplaza la mutación inactivadora en el genoma (véase Fig.11).

[0368] Ejemplo 5:

[0369] Se evolucionaron las recombinasas DRiGD para demostrar la utilidad de la escisión de una secuencia de ADN específica en el cromosoma 7 del genoma humano.

[0370] En primer lugar, se evolucionaron dos bibliotecas de recombinasas diferentes utilizando el protocolo descrito de evolución dirigida ligada al sustrato (Buchholz and Stewart, 2001 y WO 2002044409 A2 - véase la Fig.8). Las bibliotecas evolucionaron contra el semisitio izquierdo o derecho (HexL o HexR) de los sitios objetivo finales Hex1 y Hex2 (véase Fig.21A). Para evolucionar las bibliotecas de recombinasa para HexR, se utilizaron dos sitios objetivo intermedios (HexR1 y HexR2) (véase Fig. 21B). A lo largo del proceso de evolución se introdujeron nuevas mutaciones con PCR propensa a errores (utilizando los Cebadores P1# y P2#) y mezcla de ADN, y la presión selectiva se reguló aún más a través del nivel de expresión de las recombinasas. Las recombinasas activas se seleccionaron por su capacidad de recombinar el sitio objetivo respectivo para suprimir la secuencia flanqueada por los sitios objetivo del vector (véase Fig.8 - SLiPE estándar y Fig.21 B).

[0371] A continuación, ambas bibliotecas (obtenidas en HexR y HexL) se combinaron para recombinar los sitios objetivo finales Hex1 y Hex2. Por lo tanto, las bibliotecas (el tamaño de la biblioteca era mayor que 100.000 recombinasas) se clonaron en el mismo plásmido de expresión y se coexpresaron a partir de un promotor inducible compartido en una estructura similar a un operón, que liga transcripcionalmente ambas enzimas (véase la Fig. 6 pDUO-SLiDE DRiGD). Los plásmidos que llevan ambas bibliotecas se transformaron posteriormente en células de E. coli XL-1 blue. Después de recuperar las células en 1 ml de medio SOC durante una hora, se sembraron 10 µl en una placa de agar LB con 15 µg/ml de cloranfenicol. Al día siguiente se seleccionaron 32 clones y se cultivaron en 500 µl de LB con 25 µg/ml de cloranfenicol durante 8 h. A continuación, se utilizaron 250 µl de precultivo para inocular 2 x 5 ml de LB con 25 µg/ml de cloranfenicol. En uno de los cultivos de 5 ml se añadieron 10 µg/ml de L-arabinosa para inducir la expresión del dímero de recombinasa. Al día siguiente se aisló el ADN plasmídico y se digirió con Sacl (R2) y Sbfl (R3) para estimar la eficiencia de recombinación en la muestra inducida y no inducida.

[0372] Con este método se obtuvieron dos dímeros de recombinasa (Clon #7 y Clon #30) que pueden llevar a cabo la reacción de escisión con alta eficiencia. La escisión precisa se confirmó al secuenciar el pDUO-SLiDE DRiGD recombinado - véase Fig.22.

[0373] En la siguiente tabla se enumeran los sitios objetivo, los sitios objetivo intermedios y los cebadores utilizados:

[0376]

[0377]

[0380] Mediante este método se obtuvieron las secuencias de los siguientes pares de monómeros de recombinasa: Hex-R-#7: SEQ ID No.46 y Hex-L-#7: SEQ ID No.47

[0381] Hex-R-#30: SEQ ID No.48 y Hex-L-#30: SEQ ID No.49

[0383] Literatura de no patente citada

[0384] Bolusani et al. (2006). Evolution of variants of yeast site-specific recombinase Flp that utilize native genomic sequences as recombination target sites. Nucleic Acid Research, 34(18):5259-5269.

[0385] Buchholz, F., & Stewart, A. F. (2001). Alteration of Cre recombinase site specificity by substrate-linked protein evolution. Nature Biotechnology, 19(11), 1047-1052.

[0386] Karpinski J, Hauber I, Chemnitz J, et al. (2016). Directed evolution of a recombinase that excises the provirus of most HIV-1 primary isolates with high specificity. Nat Biotechnol 34(4):401-9.

[0387] Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd edition).

[0388] Surendranath, V. et al. (2010). SeLOX--a locus of recombination site search tool for the detection and directed evolution of site-specific recombination systems. Nucleic Acids Res.2010, 38(W293-W298)

[0389] Wang M et al. (2016). Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS 113:2868-2873.

[0390] Zhang, C et al. (2015) Redesign of the monomer-monomer interface of Cre recombinase yields an obligate heterotetrameric complex. Nucleic Acids Res.2015, 43 (18): 9076-9085.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

1. Método para identificar secuencias que son potenciales sitios objetivo para enzimas de recombinación de ADN que son capaces de inducir una recombinación de ADN específica de sitio de una secuencia de interés en un genoma, que incluye las etapas de:

i. Cribado del genoma o una parte del mismo que comprende la secuencia de interés para dos secuencias que son secuencias espaciadoras potenciales, con una longitud de al menos 5 y hasta 12 bp, en el que una de las secuencias espaciadoras potenciales se encuentra en dirección ascendente de la secuencia de interés y la otra secuencia espaciadora potencial se encuentra en dirección descendente de la secuencia de interés y en la que las dos secuencias tienen una distancia máxima de 100 kb y una distancia mínima de 150 bp,

ii. Identificación de los sitios objetivo potenciales al determinar para cada secuencia espaciadora potencial los nucleótidos vecinos, preferiblemente 10 a 20 nucleótidos, en un lado de la secuencia espaciadora que forma el primer semisitio potencial, y los nucleótidos vecinos, preferiblemente 10 a 20 nucleótidos, más preferiblemente 12 a 15 nucleótidos, en el otro lado de la secuencia espaciadora que forma el segundo semisitio potencial, en la que ambos semisitios potenciales y la secuencia espaciadora intermedia forman un sitio objetivo potencial,

iii. Cribado adicional de los sitios objetivo potenciales identificados en la etapa ii. para seleccionar secuencias objetivo posibles que no aparecen en ningún otro lugar del genoma del huésped para asegurar una recombinación específica de secuencia, y

iv. Selección de secuencias objetivo a partir de la lista de secuencias objetivo potenciales obtenidas en la etapa ii. o iii. que comprenden semisitios que

- tienen cada uno una homología con un semisitio de sitios objetivo conocidos de una enzima de recombinación de ADN, en la que la homología significa que cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas a un semisitio de un sitio objetivo conocido de una enzima de recombinación de ADN; y

- tienen una homología entre sí, en la que homología significa que cada semisitio tiene al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, preferiblemente al menos 30 % de posiciones de nucleótidos idénticas al otro semisitio de los mismos sitios objetivo;

en el que las secuencias de los sitios objetivo potenciales identificados difieren en al menos dos nucleótidos.

2. Método para preparar enzimas de recombinación de ADN diseñadas que son capaces de inducir una recombinación de AND específica de sitio para alterar una secuencia de nucleótidos en un genoma al recombinar dos secuencias objetivo de origen natural en el genoma, que comprende:

a) Seleccionar una secuencia de nucleótidos en dirección ascendente de la secuencia de nucleótidos que se va a alterar como primer sitio objetivo y una secuencia de nucleótidos en dirección descendente de la secuencia de nucleótidos que se va a alterar como segundo sitio objetivo, en el que las secuencias de los sitios objetivo difieren en al menos dos nucleótidos, en los que cada sitio objetivo comprende un primer semisitio y un segundo semisitio, cada uno tiene 10 a 20 nucleótidos separados por una secuencia espaciadora que tiene 5 a 12 nucleótidos,

en el que las etapas de la reivindicación 1 se realizan antes de la etapa a);

b) Aplicar evolución dirigida molecular en al menos una biblioteca de enzimas de recombinación de ADN utilizando un vector que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo como se selecciona en a) como sustrato, hasta que se obtiene al menos una enzima de recombinación de ADN diseñada que se activa en el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo como se selecciona en a), en el que dicha enzima de recombinación de ADN comprende al menos dos monómeros diferentes, en los que los monómeros diferentes significan que los monómeros difieren en al menos 2 % de los residuos de aminoácidos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las enzimas de recombinación de ADN son adecuadas para la supresión y en el que las secuencias espaciadoras potenciales son idénticas.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las enzimas de recombinación de ADN son adecuadas para reemplazo, y en el que las secuencias espaciadoras potenciales no son idénticas.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la etapa b) se realiza en presencia de una secuencia sintética que comprende el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo para seleccionar la recombinación entre el vector y la secuencia sintética.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la secuencia de nucleótidos que se va a alterar es una secuencia que comprende una mutación, en particular una mutación puntual, una mutación por desplazamiento de marco de lectura, una supresión o una inserción.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el vector utilizado en la etapa b) es un vector de expresión que codifica al menos dos bibliotecas de enzimas de recombinación de ADN y que comprende un marcador de selección negativa que se encuentra entre el primer y segundo sitio objetivo, preferiblemente en el que el marcador de selección negativa es al menos un sitio de reconocimiento único para una enzima de restricción.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para preparar enzimas de recombinación de ADN diseñadas que sean adecuadas para reemplazo, en el que la secuencia sintética comprende un marcador de selección positiva que se encuentra entre el primer y segundo sitio objetivo.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para preparar enzimas de recombinación de ADN diseñadas que sean adecuadas para reemplazo, en el que la etapa b) se lleva a cabo en tres subetapas:

i) las al menos dos bibliotecas evolucionan sin una secuencia artificial,

ii) las al menos dos bibliotecas obtenidas como resultado de la etapa i) evolucionan utilizando una secuencia artificial con un marcador de selección positiva,

iii) las al menos dos bibliotecas obtenidas como resultado de la etapa ii) evolucionan con una secuencia artificial sin un marcador de selección positiva.

10. Enzima de recombinación de ADN diseñada, que comprende al menos dos monómeros diferentes, en la que monómeros diferentes significa que los monómeros difieren en al menos 2 % de los residuos de aminoácidos, en la que la enzima es capaz de inducir una recombinación de ADN específica de sitio en un genoma de un organismo huésped al recombinar dos secuencias objetivo de origen natural en el genoma, en la que las secuencias de los sitios objetivo difieren en al menos dos nucleótidos,

en la que un primer monómero comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, 5, 46 o 48, o una secuencia con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, 5, 46 o 48 y

en la que un segundo monómero comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, 6, 47 o 49, o una secuencia con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, 6, 47 o 49.

11. La enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende la secuencia de acuerdo con

SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4;

SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO: 46 (Hex-R-#7) y SEQ ID NO: 47 (Hex-L-#7);

SEQ ID NO: 48 (Hex-R-#30) y SEQ ID NO: 49 (Hex-L-#30).

12. La enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11 para uso en medicina, o un ácido nucleico o vector que codifica la enzima de recombinación de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 o 11 para uso en medicina, en la que una recombinación de ADN específica de sitio para alterar una secuencia de nucleótidos de interés se induce en un genoma al recombinar un primer sitio objetivo y un segundo sitio objetivo, en el que ambos sitios objetivo son de origen natural en el genoma y difieren en al menos dos nucleótidos, al introducir la enzima de recombinación de ADN diseñada o un ácido nucleico o vector que codifica la enzima de recombinación de ADN, en la que los sitios objetivo rodean la secuencia de interés y cada sitio objetivo comprende un primer semisitio y un segundo semisitio con 10 a 20 nucleótidos separados por una secuencia espaciadora con 5 a 12 nucleótidos.

13. La enzima de recombinación de ADN diseñada o el ácido nucleico o el vector para uso en medicina de acuerdo con la reivindicación 12, en la que ambos sitios objetivo comprenden secuencias espaciadoras idénticas y la recombinación resulta en una supresión de la secuencia de interés.

14. La enzima de recombinación de ADN diseñada o el ácido nucleico o el vector para uso en medicina de acuerdo con la reivindicación 12, en la que ambos sitios objetivo comprenden secuencias espaciadoras no idénticas y adicionalmente se proporciona una secuencia donante sintética que comprende ambos sitios objetivo que rodean una secuencia deseada y la recombinación resulta en un reemplazo de la secuencia de interés por la secuencia deseada.

15. Ácido nucleico o vector que codifica la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, o una célula huésped u órgano huésped que comprende dicho ácido nucleico o dicho vector.

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que los sitios objetivo son los sitios objetivo del gen F9 que comprende el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7 (loxF9a) o una secuencia de ácidos nucleicos inversa complementaria al mismo; y el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 8 (loxF9b) o una secuencia de ácidos nucleicos inversa complementaria al mismo.

17. Kit para reemplazar una secuencia de interés en un genoma mediante recombinación de ADN específica de sitio al recombinar dos secuencias objetivo de origen natural en el genoma que comprende:

la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, o el ácido nucleico o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15,

una secuencia sintética que comprende una secuencia deseada que reemplaza la secuencia de interés flanqueada por el primer sitio objetivo y el segundo sitio objetivo.

18. Composición farmacéutica que comprende la enzima de recombinación de ADN diseñada de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, o el ácido nucleico o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.