ES3055499T3

ES3055499T3 - Hippo and dystrophin complex signaling in cardiomyocyte renewal

Info

Publication number: ES3055499T3
Application number: ES19167895T
Authority: ES
Inventors: James F Martin; Yuka Morikawa; Todd Ryan Heallen; John Leach
Original assignee: Baylor College of Medicine; Texas Medical Center
Current assignee: Baylor College of Medicine; Texas Medical Center
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2026-02-12
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: EP3572513B1; EP4674963A3; US20160312219A1; EP3080269A4; AU2014363988B2; JP2022130749A; DK3572513T3; US20200002702A1; ES2735334T3; JP2020073540A; AU2020230272A1; US12480120B2; US20170306327A1; PT3572513T; EP3080269A1; US11981895B2; JP7281769B2; CA2932624A1; DK3080269T3; WO2015089074A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones que proporcionan terapia para al menos una afección médica que afecta directa o indirectamente a las células musculares cardíacas (también conocidas como cardiomiocitos) en mamíferos, incluyendo humanos, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. La afección médica puede ser de cualquier tipo, incluyendo una afección cardíaca como síntoma o causa principal, o puede ser un síntoma o causa secundaria. El individuo puede ser hombre o mujer y de cualquier edad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Señalización del complejo Hippo y distrofina en la renovación de cardiomiocitos

[0003] Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. N.° 61/913,715 que se presentó el 9 de diciembre de 2013.

[0004] Campo técnico

[0005] La presente descripción se refiere al menos a los campos de la biología celular, la biología molecular y la medicina. Antecedentes

[0006] Distrofia Muscular de Duchene

[0007] La distrofia muscular de Duchenne (DMD, por sus siglas en inglés), un trastorno hereditario ligado a X que ocurre en 1 de cada 3500 nacimientos masculinos (Emery, 2002), se caracteriza por una degeneración rápida y progresiva de las fibras musculares esqueléticas y cardíacas. Es importante destacar que los pacientes con DMD desarrollan una enfermedad cardíaca caracterizada por necrosis miocárdica, fibrosis y miocardiopatía dilatada. La DMD surge de la mutación del gen de la distrofina que codifica una proteína citoesquelética de 427 kd presente en las células musculares esqueléticas, cardíacas y lisas (Hoffman et al., 1987; Hoffman et al., 1988). En los pacientes con DMD, se suprime la expresión de ladistrofina, lo que conduce a la interrupción del complejo de glicoproteínas asociadas a la distrofina (DGC), una estructura esencial de la membrana localizada en el músculo esquelético y cardíaco (Ohlendieck and Campbell, 1991; Ohlendieck et al., 1993). Un valioso modelo de ratón para la DMD es el ratónmdx, una cepa nula para distrofina que muestra un fenotipo de enfermedad similar al de la DMD humana (Bulfield et al., 1984). Aunque son mucho menos graves que la DMD humana, los ratonesmdxtienen características de la enfermedad humana, tales como la degeneración/regeneración del músculo esquelético y la cardiomiopatía después del envejecimiento.

[0008] Introducción a la señalización Hippo

[0009] Los componentes centrales de la señalización Hippo en mamíferos incluyen las quinasas Ste20Mst1yMst2que son ortólogas respecto a la quinasa Hippo enDrosophila. Las quinasas Mst, cuando forman complejos con la proteína de andamiaje Salvador (Salv), fosforilan las quinasas Homólogas de Supresores Tumorales Grandes (Lats).Lats1yLats2de mamífero son quinasas de la familia NDR y son ortólogas con respecto a lasVerrugas de Drosophila.Las quinasas Lat, a su vez, fosforilan a Yap y Taz, dos coactivadores transcripcionales relacionados que son los componentes de señalización Hippo más aguas abajo y asociados con factores de transcripción tales como Tead para regular la expresión génica. Yap también interactúa con β-catenina, un efector de la señalización Wnt canónica para regular la expresión génica. Tras la fosforilación, Yap y Taz se excluyen del núcleo y se vuelven transcripcionalmente inactivos (Fig.1).

[0010] Los estudios previos de pérdida de función cardíaca en ratones revelaron que la señalización Hippo inhibe la proliferación de cardiomiocitos para controlar el tamaño del corazón (Heallen et al., 2011).Los corazones con deficiencia deSalvdesarrollan cardiomegalia con un aumento de 2,5 veces el tamaño del corazón debido a la hiperplasia de los cardiomiocitos. Además, los experimentos que investigan Yap en el desarrollo de cardiomiocitos respaldan la conclusión de que Yap es la principal molécula efectora de Hippo durante el desarrollo de cardiomiocitos (von Gise et al., 2012; Xin et al., 2011). Yap es un cofactor que se asocia con reguladores transcripcionales de unión al ADN. La bibliografía actual indica que los cofactores de la familia Tead son socios primarios de Yap (Halder y Johnson, 2011).

[0011] La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones que abordan una necesidad sentida durante mucho tiempo en la técnica para proporcionar una terapia para condiciones cardíacas, que incluyen al menos DMD, dirigiéndose a la ruta Hippo.

[0012] Breve sumario

[0013] La presente divulgación está dirigida a métodos y composiciones que proporcionan terapia para al menos una condición médica que afecta directa o indirectamente a las células musculares cardíacas (cardiomiocitos) en un individuo mamífero, incluyendo seres humanos, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. La condición médica puede ser de cualquier tipo, incluyendo una condición cardíaca tal como insuficiencia cardíaca, cardiomiopatía, infarto de miocardio, etc. La condición médica puede tener una condición cardíaca como su principal síntoma o causa o puede ser un síntoma o causa secundarios. El individuo puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad. En aspectos particulares de la divulgación, a un individuo que necesita terapia para una condición médica cardíaca se le proporciona una cantidad eficaz de uno o más ácidos nucleicos, o células que comprenden uno o más ácidos nucleicos, en los cuales los ácidos nucleicos proporcionan beneficio terapéutico al individuo. En aspectos específicos de la divulgación, el ácido nucleico está una forma que directa o indirectamente proporciona interferencia con el ARN, lo que incluye al menos el shARN. En aspectos particulares, la composición de shARN se dirige a un miembro de la ruta Hippo. Aunque puede dirigirse a cualquier miembro de la ruta Hippo, en aspectos específicos, el shARN se dirige a Salvador (Sav1).

[0014] En las realizaciones de la divulgación, hay composiciones de ácido nucleico que se dirigen aSav1de un mamífero, y en realizaciones específicas las composiciones de ácido nucleico son moléculas de shARN. En realizaciones específicas, existen composiciones terapéuticas que comprenden un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO:10, un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO:11, y un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO:12. En otros aspectos de la divulgación, hay composiciones terapéuticas que comprenden moléculas de shARN que comprenden uno o más de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12. Las composiciones pueden estar incluidas o no en un vector, incluyendo un vector viral o un vector no viral. En realizaciones particulares, las secuencias de shARN se utilizan en un vector no integrador.

[0015] Sumario

[0016] La invención proporciona una composición de ácido nucleico sintético aislado que comprende un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 10, un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 11, y un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 12, en donde la composición es para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar una cantidad eficaz de la composición al individuo. En algunas realizaciones cada ácido nucleico presenta al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o el 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12 respectivas. En algunos aspectos de la divulgación, hay una composición de ácido nucleico sintético aislado, que comprende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12 y/o un ácido nucleico derivado que comprende al menos el 80 % de identidad con uno de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12. El ácido nucleico derivado puede ser al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o el 99 % idéntico a uno de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12.

[0017] En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 10 (o SEQ ID NO: 11 o 12) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10 (o, respectivamente, SEQ ID NO: 11 o 12), y comprende además una secuencia antisentido de SEQ ID NO:10 (o, respectivamente, SEQ ID NO:11 o 12), en donde cuando la secuencia y la secuencia antisentido se hibridan entre sí para formar una estructura dúplex, la secuencia y la secuencia antisentido están separadas por una estructura en bucle. En ciertos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4 (o SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) y comprende además una secuencia antisentido de SEQ ID NO: 4 (o, respectivamente, SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12), en donde cuando la secuencia y la secuencia antisentido se hibridan entre sí para formar una estructura dúplex, la secuencia y la secuencia antisentido están separadas por una estructura en bucle.

[0018] En realizaciones específicas, el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 43 nucleótidos o no más de 137 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la estructura en bucle tiene entre 5 y 19 nucleótidos de longitud. En realizaciones particulares, uno o más de los ácidos nucleicos tiene 1, 2, 3, 4 o 5 emparejamientos erróneos en comparación con la respectivas SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12. En aspectos de la divulgación, el ácido nucleico derivado tiene 1, 2, 3, 4, o 5 emparejamientos erróneos en comparación con las respectivas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12.

[0019] En algunas realizaciones de la composición, el ácido nucleico está comprendido en un vector, tal como un vector viral o un vector no viral. En algunas realizaciones de la divulgación, el ácido nucleico derivado está comprendido en un vector, tal como un vector viral o un vector no viral. El vector puede ser un vector no integrador. El vector puede ser un vector no integrador que es un vector lentiviral. En algunos aspectos de la divulgación del vector, dos o más ácidos nucleicos que comprenden SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 están presentes en el mismo vector. En realizaciones específicas, la expresión del ácido nucleico está regulada por un promotor específico del tejido o específico de la célula, tal como un promotor específico del cardiomiocito, por ejemplo, la cadena ligera 2 del promotor de miosina cardíaca específica del ventrículo (MLC-2v) de rata; el promotor del gen de la cadena pesada de la alfa miosina (MHC) específica del músculo cardíaco; el promotor mínimo específico de células cardíacas de -137 a 85 del promotor NCX1; la troponina T cardíaca de pollo (cTNT), o una combinación de los mismos. En ciertos aspectos de la divulgación, dos o más de los ácidos nucleicos que comprenden SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 están presentes en el mismo vector. En casos específicos, dos o más ácidos nucleicos están regulados por la misma secuencia reguladora o están regulados por una secuencia reguladora diferente.

[0020] En una realización, la invención proporciona una composición de ácido nucleico sintético aislado que comprende un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 10, un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 11, y un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO: 12, en donde la composición es para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar una cantidad eficaz de la composición al individuo. En ciertas realizaciones, la condición cardíaca en el individuo hace que el individuo necesite renovar los cardiomiocitos. En ciertas realizaciones, el corazón del individuo presenta apoptosis, necrosis, y/o autofagia en los cardiomiocitos. En realizaciones específicas, la condición cardíaca comprende enfermedad cardiovascular, cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, isquemia, necrosis, fibrosis o cardiomiopatía diabética, cardiomiopatía relacionada con la edad. En realizaciones particulares, el individuo tiene distrofia muscular de Duchenne. La composición se le puede proporcionar al individuo más de una vez. La composición se le puede proporcionar al individuo sistémicamente o localmente. En una realización específica, se le proporciona al individuo una terapia adicional para la condición cardíaca.

[0021] En ciertas realizaciones, hay un kit que comprende una composición tal como la incluida en la descripción, en donde la composición está alojada en un recipiente adecuado.

[0022] En realizaciones particulares, la invención proporciona un shARN o siARN que se dirige a Salvador (Savl) para su uso en un método para el tratamiento de una condición cardíaca en un individuo, que comprende el paso de proporcionar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del shARN o siARN que se dirige a Salvador (Sav1). En una realización específica, el shARN o siARN se proporciona al individuo en el vector AAV9. En casos particulares, el individuo tiene distrofia muscular de Duchenne. En algunas realizaciones, la invención proporciona un vector que comprende la composición de ácido nucleico de la invención o el shARN o siARN de la invención, para su uso en un método de tratamiento de una condición cardíaca en un individuo, que comprende el paso de proporcionar una cantidad eficaz del vector al individuo. El vector puede ser un vector viral, un vector no viral, o un vector no integrante, opcionalmente un vector lentiviral. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una composición de ácido nucleico de la invención, un shARN o siARN de la invención, o un vector de la invención, y un portador farmacéutico, para su uso en un método de tratamiento de una condición cardíaca en un individuo, que comprende el paso de proporcionar cantidad eficaz de la composición farmacéutica al individuo. En algunas realizaciones, la invención proporciona una célula huésped que comprende un vector de la invención, para su uso en un método de tratamiento de una condición cardíaca en un individuo, que comprende el paso de proporcionar una cantidad eficaz al individuo.

[0023] El texto que antecede ha delimitado de manera bastante amplia las características y ventajas técnicas de la presente invención de modo que pueda comprenderse mejor la descripción detallada de la invención que figura a continuación. A continuación se describirán las características y ventajas adicionales de la invención que forman el objeto de las reivindicaciones de la invención. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo como divulgación y no forma parte de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán que la concepción y la realización específica descritas podrán utilizarse fácilmente como fundamento para la modificación o diseño de otras estructuras para llevar a cabo los mismos objetivos de la presente invención. Los expertos en la técnica también reconocerán que tales interpretaciones equivalentes no se apartan del espíritu y alcance de la invención como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Las características novedosas que se consideran características de la invención, tanto en cuanto a su organización como en cuanto a su método de funcionamiento, junto con otros objetos y ventajas, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción cuando se considere en relación con las figuras adjuntas. Sin embargo, debe entenderse expresamente que cada una de las figuras se proporciona solo con fines de ilustración y descripción y no se pretende que sea una definición de los límites de la presente invención.

[0024] Breve descripción de los dibujos

[0025] Para lograr un entendimiento más completo de la presente invención, se hará referencia ahora a las siguientes descripciones junto con las figuras adjuntas, en las que:

[0026] la FIG.1 ilustra un ejemplo de un modelo para la señalización Hippo durante el desarrollo y la regeneración; la FIG.2 muestra que Yap regula los genes de motilidad y división celular en la regeneración cardíaca. Los mapas de calor (A) y la validación qRT-PCR (B) que muestran los niveles de transcripción relativos para un subconjunto de dianas Yap. *p<0,05,**p<0,001, ***p<0,0001. Adaptado de (Morikawa et al., 2014);

[0027] la FIG.3 muestra corazones Salv CKO y Salv CKO; mdx; utrn después de la resección del ápice. Los corazones se extirparon el día 8 postnatal, una fase no regenerativa, y se evaluaron mediante inmunohistoquímica a las tres semanas después de la resección. Los corazones mutantes Salv CKO se pueden regenerar como se informó (panel izquierdo y (Heallen et al., 2013). Además, los corazones Salv CKO mutantes compuesto; mdx-; utrn +/también se pueden regenerar como se muestra en el panel de la derecha. Notablemente, los corazones mutantes mdx no se regeneran después de la resección de cardiomiocitos;

[0028] la FIG. 4 demuestra que el agotamiento de Hippo promueve la recuperación funcional cardíaca después de la isquemia crónica y la insuficiencia cardíaca establecida. Los corazones adultos se sometieron a LAD-O (t = 0) y se estudiaron por ecocardiografía tres semanas después. Los corazones que tenían insuficiencia se incorporaron al estudio y se les inyectó tamoxifeno para inactivarSalv. Los ratones se estudiaron por ecocardiografía en intervalos de dos semanas como se muestra. Los corazones con deficiencia de Hippo mostraron una recuperación de la función dos semanas después de la inyección de tamoxifeno y en torno a las seis semanas, la recuperación funcional era completa;

[0029] la FIG.5 muestra que el siARN de Salv reduce de manera eficaz la expresión del ARNm de Salv. Los siARN se transfectaron en cardiomiocitos neonatales y los niveles de ARNm de Salv se estudiaron mediante RT PCR cuantitativa. Los tres siARN redujeron eficazmente los niveles de ARNm de Salv;

[0030] la FIG. 6 ilustra la secuencia de ADNc de Sav1 de ratón. Las regiones en color gris demuestran ejemplos de secuencias de shARN (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente). Los exones alternativos se muestran mediante secuencias que tienen doble subrayado en comparación con las secuencias que no tienen doble subrayado. Los dominios estructurales de proteínas se muestran mediante secuencias que tienen un subrayado sencillo, en orden de 5' a 3'; dominio WW, dominio WW, dominio SARAH.;

[0031] la FIG. 7 ilustra la secuencia de ADNc de Sav1 de cerdo. Las regiones en color gris demuestran ejemplos de secuencias de shARN (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente). Los exones alternativos se muestran mediante secuencias que tienen doble subrayado en comparación con las secuencias que no tienen doble subrayado. Los dominios estructurales de proteínas se muestran mediante secuencias que tienen un subrayado sencillo, en orden de 5' a 3'; dominio WW, dominio WW, dominio SARAH; y

[0032] la FIG. 8 ilustra la secuencia de ADNc de Sav1 humano. Las regiones en color gris demuestran ejemplos de secuencias de shARN (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente). Los exones alternativos se muestran mediante secuencias que tienen doble subrayado en comparación con las secuencias que no tienen doble subrayado. Los dominios estructurales de proteínas se muestran mediante secuencias que tienen un subrayado sencillo, en orden de 5'a 3'; dominio WW, dominio WW, dominio SARAH.

[0033] Descripción detallada

[0034] I. Definiciones ejemplares

[0035] Se debe interpretar que el uso de los términos "un", "uno", "una" y "el" y "la" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) incluye tanto el singular como el plural, salvo que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente. Se debe considerar que las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" son expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye, pero no se limita a"), a menos que se indique lo contrario. Se pretende que la mención de intervalos de valores en la presente memoria sirva solamente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor independiente comprendido en el intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en la presente memoria. Todos los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que se contradiga de otro modo claramente por el contexto. Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos o las expresiones ilustrativas (por ejemplo, "tal como") que se proporcionan en la presente memoria ilumine mejor la invención y no presente una limitación al alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. No se debe interpretar ninguna expresión de la memoria descriptiva como indicación de que algún elemento no reivindicado sea esencial para la puesta en práctica de la invención.

[0036] Como se emplea en la presente memoria, el término "secuencia de nucleótidos complementaria", también conocida como "secuencia antisentido", se refiere a una secuencia de un ácido nucleico que es completamente complementaria a la secuencia de un ácido nucleico "efector" que codifica una proteína (p. ej., complementario a la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementario a una secuencia de ARNm). En la presente memoria, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia complementaria de al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos.

[0037] Como se emplea en la presente memoria, el término "corresponde a una secuencia de nucleótidos" se refiere a una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica una secuencia idéntica. En algunos casos, cuando los nucleótidos (ácidos nucleicos) antisentido o de siARN (ARN inhibidor pequeño) (procesado a partir de shARN) se unen a una secuencia diana, una secuencia de ARN antisentido o de ARN inhibidor pequeño (siARN) particular es sustancialmente complementaria de la secuencia diana, y por lo tanto se unirá específicamente a una porción de un ARNm que codifica un polipéptido. Como tal, típicamente las secuencias de esos ácidos nucleicos serán altamente complementarias a la secuencia diana del ARNm, y no tendrán más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 emparejamientos erróneos en toda la secuencia. En muchos casos, puede ser deseable que las secuencias de los ácidos nucleicos sean emparejamientos exactos, es decir, que sean completamente complementarias a la secuencia a la que se une específicamente el oligonucleótido, y por lo tanto tienen cero emparejamientos erróneos a lo largo del tramo complementario. Las secuencias altamente complementarias típicamente se unirán de manera bastante específica a la región de la secuencia diana del ARNm y, por lo tanto, serán altamente eficaces para reducir, y/o incluso inhibir la traducción de la secuencia de ARNm diana al producto polipeptídico. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,416,849.

[0039] Las secuencias de oligonucleótidos sustancialmente complementarias serán más de aproximadamente el 80 por ciento complementarias (o '% de coincidencia exacta') con la secuencia diana de ARNm correspondiente a la cual se une específicamente el oligonucleótido, y, más preferiblemente, será más de aproximadamente el 85 por ciento complementaria a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que se une específicamente el oligonucleótido. En ciertos aspectos, como se describió anteriormente, será deseable tener secuencias de oligonucleótidos aún más sustancialmente complementarias para su uso en la práctica de la invención, y en tales casos, las secuencias de oligonucleótidos serán más de aproximadamente el 90 por ciento complementarias a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que se une específicamente el oligonucleótido, y en ciertas realizaciones pueden ser más de aproximadamente el 95 por ciento complementarias a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que se une específicamente el oligonucleótido, e incluso hasta el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, e incluso una complementariedad de coincidencia exacta del 100 % con el ARNm diana al que se une específicamente el oligonucleótido diseñado. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,416,849. El porcentaje de similitud o el porcentaje de complementariedad de cualquier secuencia de ácidos nucleicos se pueden determinar, por ejemplo, utilizando cualquier programa informático conocido en la técnica.

[0041] Como se emplea en la presente memoria, el término "modificación genética para reducir la expresión de un gen" o "tecnología de modificación genética para reducir la expresión de un gen" se refiere a una técnica de silenciamiento génico en la que la expresión de un gen o gen diana de interés se reduce en comparación con la expresión del gen antes de la introducción del shARN, que puede conducir a la inhibición de la producción del producto del gen diana. El término "reducido" se utiliza en la presente memoria para indicar que la expresión del gen diana se reduce en 0,1-100 %. Por ejemplo, la expresión se puede reducir en 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o incluso 99 %. La expresión se puede reducir en cualquier cantidad (%) dentro de esos intervalos, tal como por ejemplo, 2-4, 11-14, 16-19, 21-24, 26-29, 31-34, 36-39, 41-44, 46-49, 51-54, 56-59, 61-64, 66-69, 71-74, 76-79, 81-84, 86-89, 91-94, 96, 97, 98 o 99. La modificación genética para reducir de la expresión génica se puede dirigir mediante el uso de siARN o shARN.

[0043] Como se emplea en la presente memoria, el término "secuencia de nucleótidos" se refiere a un polímero de ADN o ARN que puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, conteniendo opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas capaces de incorporarse a polímeros de ADN o ARN. El término "polinucleótido" se usa de manera indistinta con el término "oligonucleótido". El término "secuencia de nucleótidos" es intercambiable con "secuencia de ácidos nucleicos" a menos que se indique lo contrario. "Secuencia de nucleótidos" y "secuencia de ácidos nucleicos" son términos que se refieren a una secuencia de nucleótidos en una molécula de polinucleótido.

[0045] Como se emplea en la presente memoria, el término "unido operablemente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un polinucleótido, de modo que la función de una de las secuencias se ve afectada por la otra. Por ejemplo, se dice que una secuencia de ADN reguladora está "unida operablemente a" una secuencia de ADN que codifica un ARN ("una secuencia codificante de ARN" o "secuencia codificante de shARN") o un polipéptido si las dos secuencias están situadas de manera tal que la secuencia de ADN reguladora afecta a la expresión de la secuencia de ADN codificante (es decir, que la secuencia codificante o el ARN funcional están bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar unidas operablemente a secuencias reguladoras en orientación efectora o antisentido. Una secuencia codificante de ARN se refiere a un ácido nucleico que puede servir como molde para la síntesis de una molécula de ARN, tal como un siARN y un shARN. Preferiblemente, la región codificante de ARN es una secuencia de ADN.

[0047] Como se emplea en la presente memoria, el término "farmacéuticamente aceptable" es un portador, diluyente, excipiente y/o sal que es compatible con los otros ingredientes de la formulación, y no es perjudicial para el receptor de la misma. El ingrediente activo para la administración puede estar presente en forma de polvo o en forma de gránulos; en forma de una solución, una suspensión o una emulsión o como se describe en otra parte a lo largo de la memoria descriptiva.

[0049] Como se emplea en la presente memoria, el término "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos, generalmente aguas arriba (5’) de su secuencia codificante, que dirige y/o controla la expresión de la secuencia codificante proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y otros factores requeridos para la correcta transcripción. "Promotor" incluye un promotor mínimo que es una secuencia corta de ADN comprendida por una caja TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de inicio de la transcripción, a la que se añaden elementos reguladores para el control de la expresión. "Promotor" también se refiere a una secuencia de nucleótidos que incluye un promotor mínimo más elementos reguladores que son capaces de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora consiste en elementos aguas arriba y proximales y más distales, referidos los últimos elementos a menudo como potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de ADN que estimula la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad tisular de un promotor. Es capaz de operar en ambas orientaciones (efectora o antisentido), y puede funcionar incluso cuando se mueve aguas arriba o aguas abajo del promotor. Tanto los potenciadores como otros elementos promotores aguas arriba se unen a proteínas de unión a ADN específicas de la secuencia que median sus efectos. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Un promotor también puede contener secuencias de ADN que participan en la unión de factores proteicos que controlan la eficacia del inicio de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo. Se considera cualquier promotor conocido en la técnica que regula la expresión de la secuencia codificante de shARN o ARN en la práctica de la invención.

[0050] Como se emplea en la presente memoria, el término "elemento informador" o "marcador" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido susceptible de ser detectado en un ensayo de escrutinio. Los ejemplos de polipéptidos codificados por elementos informadores incluyen, pero no se limitan a, lacZ, GFP, luciferasa y cloranfenicol acetiltransferasa. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,416,849. Muchos elementos indicadores y genes marcadores son conocidos en la técnica y se consideran para su uso en las invenciones descritas en la presente memoria.

[0051] Como se emplea en la presente memoria, el término "transcrito de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por una ARN polimerasa de una secuencia de ADN. "Transcrito de ARN mensajero (ARNm)" se refiere al ARN que no tiene intrones y que puede ser traducido a proteína por la célula.

[0052] Como se emplean en la presente memoria, los términos "interferente pequeño" o "ARN de interferencia pequeño" o "siARN" se refieren a un dúplex de ARN de nucleótidos que se dirige a un gen deseado y que son capaces de inhibir la expresión de un gen con el que comparten homología. El dúplex de ARN comprende dos ARN complementarios de hebra sencilla de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos que forman 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de bases y poseen salientes 3' de dos nucleótidos. El dúplex de ARN está formado por el emparejamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN. El siARN está "dirigido" a un gen porque la secuencia de nucleótidos de la porción dúplex del siARN es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen elegido como diana. En algunas realizaciones, la longitud del dúplex de los siARN es inferior a 30 nucleótidos. El dúplex puede tener 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos de longitud. La longitud del dúplex puede ser una longitud de 17-25 nucleótidos. El ARN dúplex se puede expresar en una célula a partir de una sola construcción.

[0053] Como se emplea en la presente memoria, el término "shARN" (ARN de horquilla corta) se refiere a un dúplex de ARN en donde una porción del siARN es parte de una estructura en horquilla (shARN). Además de la porción dúplex, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle posicionada entre las dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede tener una longitud variable. En algunas realizaciones, el bucle tiene 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos de longitud. La estructura de la horquilla también puede contener porciones salientes de 3' o 5'. En algunos aspectos, el saliente es un saliente 3' o 5' de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En un aspecto de esta invención, una secuencia de nucleótidos en el vector sirve como molde para la expresión de un ARN de horquilla corto, que comprende una región efectora, una región de bucle y una región antisentido. Tras la expresión, las regiones efectora y antisentido forman un dúplex. Es este dúplex, que forma el shARN, el que hibrida, por ejemplo, con el ARNm deSav1y reduce la expresión deSav1.

[0054] Como se emplea en la presente memoria, el término "tratar" se refiere a mejorar al menos un síntoma, curar y/o prevenir el desarrollo de una enfermedad o trastorno tal como, por ejemplo, pero no limitado a, cardiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, miocardiopatía,etc.

[0055] Como se emplea en la presente memoria, el término "vector" se refiere a cualquier vector viral o no viral, así como a cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario en forma lineal o circular de hebra doble o sencilla que puede o no ser auto-transmisible o móvil, y que puede transformar células anfitrionas procarióticas o eucarióticas mediante la integración en el genoma celular o que puede existir extracromosómicamente (p. ej., plásmido de replicación autónoma con un origen de replicación). Se considera cualquier vector conocido en la técnica para su uso en la práctica de esta invención.

[0056] II. Aspectos generales

[0057] Los aspectos de la descripción se refieren a métodos y composiciones para el tratamiento de condiciones médicas cardíacas, incluyendo aquellas en las que los cardiomiocitos necesitan ser renovados. Los cardiomiocitos pueden necesitar renovación por cualquier motivo, incluyendo enfermedad, condición genética subyacente y/o trauma, por ejemplo. En aspectos específicos, el individuo presenta lesión de los cardiomiocitos, necrosis y/o fibrosis del corazón, tal como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), por ejemplo.

[0058] En aspectos específicos, se emplean métodos y composiciones para un individuo con DMD. El corazón enfermo en pacientes con DMD tiene una lesión generalizada de los cardiomiocitos, necrosis y fibrosis. De manera similar los ratones mutantesmdx, que sirven como modelo para la DMD humana tienen cardiomiopatía con insuficiencia cardíaca y fibrosis severa y dilatación. La ruta de señalización Hippo se identificó como un represor crítico de la regeneración cardíaca después de una amputación tisular o un infarto de miocardio (Heallen et al., 2013). Además, los datos indican que Hippo regula la transcripción de los genes relacionados con la DMD en el corazón. Tomados en conjunto, se consideró que la señalización Hippo inhibe una respuesta de reparación a la cardiomiopatía de Duchenne. Como se muestra en la presente memoria, los corazonesmdxneonatales no se regeneran después de la resección del vértice, en contraste con los corazones neonatos regenerativos de tipo salvaje. En particular, esta capacidad regenerativa se restauró en gran medida en Hippo; corazones mutantes para el compuestomdx, lo que indica la supresión genética del fenotipo del corazónmdx. En conjunto, la modulación de la señalización Hippo sirve como un enfoque poderoso para reparar el músculo cardíaco, tal como el músculo cardíaco con DMD. Además de mejorar la cardiomiopatía por DMD, se muestra en la presente memoria que la inhibición de la ruta Hippo después de la insuficiencia cardíaca (HF) establecida mejoró drásticamente la función cardíaca en un modelo de ratón de cardiomiopatía isquémica y HF. Los ratones con cardiomiopatía isquémica establecida y HF se generaron esperando tres semanas después de la inducción de un infarto de miocardio para agotar la ruta Hippo. En el punto temporal de tres semanas, se inactivó la ruta Hippo y se realizó un seguimiento de la función cardíaca a intervalos de dos semanas mediante ecocardiografía. La deficiencia de Hippo mejora considerablemente la reparación cardíaca en el contexto de la HF establecida, de modo que los mutantes para Hippo recuperan una función igual a la de los controles simulados no operados.

[0059] En la presente memoria se demuestra un conjunto único, pero ilustrativo, de tres ARN en horquilla cortos (shARN) que se dirigen específicamente al miembro de la ruta Hippo Salvador (Sav1).Los shARN proporcionan reducción selectiva en los niveles de ARNm deSav1similar a una eliminación genética knockout en un modelo de ratón. En realizaciones específicas, los shARN se pueden suministrar utilizando un vector AAV9 (Virus Adeno Asociado de serotipo 9) que tiene tropismo para el corazón. Realizaciones particulares de la descripción contemplan la secuencia de shARN de nucleótidos específicos para la dianaSav1.

[0060] III. Salvador

[0061] En aspectos particulares, el miembro de la ruta Hippo Salvador (familia WW de salvador que contiene la proteína 1) se dirige al shARN en tratamientos para condiciones médicas cardíacas. El gen puede denominarse homólogo de salvador 1, Salv, SAV1, SAV, WW45 o WWP4. Se proporciona un ácido nucleico representativo en el N.º CR457297.1 de acceso de GenBank<®>, y se proporciona una secuencia de proteína representativa en el N.º Q9H4B6 de acceso de GenBank<®>.

[0062] El gen codifica una proteína que incluye 2 dominios WW (un dominio de proteína modular que media interacciones específicas con ligandos de proteína) y una región de bobina enrollada. Se expresa de forma ubicua en tejidos adultos. También incluye un dominio SARAH (Sav/Rassf/Hpo) en el extremo C (tres clases de supresores de tumores eucarióticos que dan su nombre al dominio). En las familias Sav (Salvador) y Hpo (Hippo), el dominio SARAH media la transducción de señales desde Hpoa travésde la proteína de andamiaje Sav hasta el componente Wts (verrugas) aguas abajo; la fosforilación de Wts por Hpo desencadena la detención del ciclo celular y la apoptosis por regulación negativa la ciclina E, Diap 1 y otras dianas. El dominio SARAH también puede estar implicado en la dimerización.

[0063] IV. Ejemplos de métodos de tratamiento

[0064] En aspectos de la divulgación, existen métodos para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca utilizando ácidos nucleicos que se dirigen al genSav1. En aspectos específicos, la condición cardíaca incluye cardiomiocitos que necesitan renovación, ya sea debido a una enfermedad (contraída o genética, por ejemplo) ya sea debido a un trauma, por ejemplo. En aspectos específicos, el individuo presenta una enfermedad cardíaca. El individuo puede tener cardiomiocitos que necesitan renovarse por cualquier motivo. Los cardiomiocitos en el individuo pueden ser apoptóticos, autofágicos, o el tejido puede ser necrótico, por ejemplo.

[0065] En aspectos específicos, el individuo puede tener insuficiencia cardíaca, fibrosis del corazón, cardiomiopatía, cardiomiopatía isquémica, necrosis miocárdica, miocardiopatía dilatada, degeneración de fibras musculares esqueléticas y/o cardíacas, cardiomiopatía diabética, cardiomiopatía relacionada con la edad, etc. En aspectos específicos, los métodos de la descripción facilitan la facultad de los cardiomiocitos para volver a entrar en el ciclo celular. El individuo puede necesitar una función cardíaca mejorada por cualquier motivo, incluso debido a su edad, enfermedad, trauma, etc.

[0066] En aspectos particulares, al individuo se le proporciona una cantidad eficaz de ácido nucleico que se dirige aSav1, de modo que los cardiomiocitos existentes en el individuo puedan renovarse. En otros aspectos, se le proporcionan al individuo ácidos nucleicos que se dirigen aSav1, en donde los ácidos nucleicos ya están presentes en una célula en el momento del suministro, incluyendo un cardiomiocito o una célula madre, por ejemplo.

[0067] Las composiciones de ácido nucleico de la descripción se pueden proporcionar al individuo una vez o más de una vez. El suministro se puede producir tras el diagnóstico de una necesidad de renovación de cardiomiocitos o tras el diagnóstico de una condición cardíaca. Se puede producir el suministro a una persona que es susceptible de una condición cardíaca, por ejemplo que tiene antecedentes personales o familiares, sobrepeso, colesterol alto y/o hábito de fumar. El suministro puede cesar o continuar una vez que se determina que un síntoma cardíaco mejora y/o que los cardiomiocitos se renuevan.

[0068] V. Ácidos nucleicos que se dirigen aSav1

[0069] En realizaciones particulares, hay uno o más ácidos nucleicos que se dirigen aSav1, de manera que la expresión deSav1se reduce de forma detectable. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, pero en realizaciones específicas, los ácidos nucleicos son ARN, tal como shARN.

[0070] En una realización, el shARN es una molécula de ARN en "horquilla" o en bucle, que comprende una región efectora, una región bucle y una región antisentido complementaria a la región efectora. En otras realizaciones el shARN comprende dos moléculas de ARN distintas que están asociadas de forma no covalente para formar un dúplex. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,195,916.

[0071] En casos particulares, el shARN es una molécula de ARN de hebra sencilla que forma una estructura en buclein vivo,y puede tener una longitud de aproximadamente 40 a 135 nucleótidos. En al menos ciertos casos, el bucle de 5 a 19 nucleótidos conecta los dos fragmentos complementarios de ARN de 19 a 29 nucleótidos que crean el tallo de doble hebra mediante el emparejamiento de bases. La transcripción y la síntesis de shARNin vivoestá dirigida por el promotor Pol III, y a continuación el shARN resultante es escindido por Dicer, una enzima ARNasa III, para generar el siARN maduro. El siARN maduro entra en el complejo RISC. Por lo tanto, en realizaciones específicas, el shARN para la inhibición de la expresión deSav1de acuerdo con la presente divulgación contiene tanto secuencias de nucleótidos sentido como antisentido.

[0072] Aunque la presente descripción proporciona ejemplos específicos de shARN dirigidos aSav1(SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12), se pueden emplear otras composiciones de shARN. Los expertos en la técnica pueden identificar secuencias apropiadas de cualquier manera, pero en realizaciones específicas se puede alinear el gen de dos o más organismos, escanear las regiones solapantes para la secuencia que codifica los aminoácidos, revisar la secuencia para determinar regiones de una cierta longitud (tal como, por ejemplo, 19 nt), revisar la secuencia para determinar aquellas que tienen repeticiones de no más de 3 nt, y/o secuencias de potencial blast para asegurar que haya una homología <15 pb con cualquier otra parte del genoma humano.

[0073] Cuando se dirige apropiadamente a través de su secuencia de nucleótidos a un ARNm específico en las células, el shARN suprime específicamente la expresión génica deSav1.En al menos algunos casos, los shARN pueden reducir el nivel celular de los ARNm específicos, y disminuir el nivel de proteínas codificadas por dichos ARNm. Los shARN utilizan la complementariedad de secuencia para dirigirse a un ARNm para su destrucción, y son específicos de secuencia. Por lo tanto, pueden ser altamente específicos de la diana, y en mamíferos se ha demostrado que se dirigen a los ARNm codificados por diferentes alelos del mismo gen.

[0074] En realizaciones específicas, un shARN que corresponde a una región de un gen diana que va a ser regulado por disminución o modificado genéticamente para reducir la expresión del gen se expresa en la célula. El dúplex de shARN puede tener una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente el 80 %, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o el 99 % idéntico) a la secuencia del gen diana para la regulación por disminución. En realizaciones específicas, no hay más de 5 emparejamientos erróneos entre la secuencia del shARN y la secuencia dianaSav1. En realizaciones específicas, se utiliza una homología de un mínimo de 18 pb para la región de complementariedad entre la secuencia de shARN y su diana. En realizaciones particulares, se utilizan ensayos específicos para someter a prueba los emparejamientos erróneos adecuados para el shARN y su diana. En ciertas realizaciones, se puede emplear un algoritmo para identificar los emparejamientos erróneos adecuados para el shARN y su diana.

[0075] Por lo tanto, se debe observar que no se requiere una complementariedad completa entre la secuencia diana y el shARN. Es decir, el siARN antisentido resultante (después del procesamiento del shARN) es suficientemente complementario con la secuencia diana. La hebra efectora es sustancialmente complementaria a la hebra antisentido para la reasociación (hibridación) con la hebra antisentido en condiciones biológicas.

[0076] En particular, la secuencia polinucleotídica complementaria de shARN se puede diseñar para que hibride específicamente con una región particular de una proteína o ARNm diana deseados para interferir en la replicación, la transcripción o la traducción. El término "hibridar" o variaciones del mismo, se refiere a un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento entre una secuencia de nucleótidos antisentido y un ADN o ARNm diana, de modo que se produzca una unión estable y específica entre ellos. En particular, es deseable un 100 % de complementariedad o emparejamiento, pero no es necesario. La hibridación específica se produce cuando se produce una hibridación suficiente entre la secuencia de nucleótidos antisentido y sus ácidos nucleicos diana deseados en ausencia sustancial de unión no específica de la secuencia de nucleótidos antisentido a secuencias no diana en condiciones predeterminadas ,p. ej.,para fines de tratamientoin vivo, preferiblemente en condiciones fisiológicas. Preferiblemente, la hibridación específica da como resultado la interferencia con la expresión normal del producto génico codificado por el ADN o ARNm diana.

[0077] Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos antisentido se puede diseñar para que hibride específicamente con las regiones reguladoras de la replicación o la transcripción de un gen diana, o las regiones reguladoras de la traducción tales como la región de inicio de la traducción y las uniones exón/intrón, o las regiones codificantes de un ARNm diana. En realizaciones específicas, el shARN se dirige a una secuencia que codifica la región N-terminal de la proteínaSav1, secuencia que codifica la mitad de la proteínaSav1, o secuencia que codifica la región C-terminal de la proteínaSav1.

[0078] shARN: Síntesis

[0079] Como se conoce generalmente en la técnica, los oligonucleótidos utilizados comúnmente son oligómeros o polímeros de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico que tienen una combinación de bases de purina y pirimidina naturales, azúcares y enlaces covalentes entre nucleósidos que incluyen un grupo fosfato en un enlace fosfodiéster. Sin embargo, se observa que el término "oligonucleótidos" también abarca diversos miméticos y derivados no naturales,es decir,formas modificadas, de oligonucleótidos naturales como se describe a continuación.

[0080] Las moléculas de shARN de la descripción se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ADN y ARN. Estos incluyen mecanismos para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN se pueden generar mediante transcripciónin vitroein vivode secuencias de ADN que codifican la molécula de shARN. Tales secuencias de ADN pueden ser incorporadas a una gran variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados tales como promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, las construcciones de ADNc antisentido que sintetizan shARN de forma constitutiva o inducible, dependiendo del promotor utilizado, se pueden introducir de forma estable en líneas celulares.

[0081] Las moléculas de shARN se pueden sintetizar químicamente utilizando ribonucleósido fosforamiditas protegidas adecuadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los servicios de síntesis de shARN personalizados están disponibles en proveedores comerciales tales como Ambion (Austin, Texas, EE. UU.) y Dharmacon Research (Lafayette, Colorado, EE. UU.). Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0082] Se pueden introducir diversas modificaciones bien conocidas de las moléculas de ADN como un medio para aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Las modificaciones útiles incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso del fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de conexiones fosfodiesterasa dentro de la cadena principal del oligodesoxirribonucleótido. Se puede construir un ácido nucleico antisentido de la invención utilizando la síntesis química o reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Un oligonucleótido antisentido se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de manera diferente diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y efector (p. ej., se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina).

[0083] Las moléculas de shARN de la invención pueden ser varios equivalentes modificados de las estructuras de cualquier shARN deSav1. Un "equivalente modificado" significa una forma modificada de una molécula de siARN particular que tiene la misma especificidad por la diana (es decir, que reconoce las mismas moléculas de ARNm que complementan la molécula de siARN particular no modificada). Por lo tanto, un equivalente modificado de una molécula de siARN no modificada puede tener ribonucleótidos modificados, es decir, ribonucleótidos que contienen una modificación en la estructura química de una base nucleotídica no modificada, azúcar y/o fosfato (o enlace fosfodiéster). Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0084] Preferiblemente, las moléculas de shARN modificadas contienen cadenas modificadas o enlaces internucleosídicos no naturales, p. ej., cadenas modificadas que contienen fósforo y cadenas no fosforadas, tales como cadenas de morfolino; cadenas de siloxano, sulfuro, sulfóxido, sulfona, sulfonato, sulfonamida, y sulfamato; cadenas de formacetilo y tioformacetilo; cadenas que contienen alqueno; cadenas de metilenimino y metilenhidracino; cadenas de amida, y similares. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0085] Los ejemplos de cadenas principales modificadas que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotioatos quirales, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, alquil fosfonatos, tionoalquil fosfonatos, fosfinatos, fosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquil fosfotriésteres, y borano fosfatos y diversas formas salinas de los mismos. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0086] Los ejemplos de las cadenas que no contienen fósforo descritas anteriormente son conocidos en la técnica, p. ej., la patente de EE. UU. N.º 5,677,439. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0087] Las formas modificadas de compuestos de shARN también pueden contener nucleósidos modificados (análogos de nucleósidos), es decir, bases de purina o pirimidina modificadas, p. ej., pirimidinas sustituidas en la posición 5, 6-azapirimidinas, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxi benceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (p. ej., 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (p. ej.,ribotimidina), 5-halouridina (p. ej.,5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (p. ej.,6-metiluridina), 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-(carboxihidroxi metil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetil uridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 4-acetilcitidina, 3-metilcitidina, propino, quesosina, wibutosina, wibutoxosina, beta-D-galactosilqueosina, purinas sustituidas en N-2, N-6 y purinas O-sustituidas, inosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 2-metiltio-N-6-isopentenil adenosina, beta-D-manosilqueosina, ácido uridino-5-oxiacético, 2-tiocitidina, derivados de treonina, y similares. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0088] Además, los compuestos de shARN modificados también pueden tener radicales de azúcar sustituidos o modificados, p. ej., radicales de azúcar 2'-O-metoxietilo. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944. Además, para ayudar en el diseño de los shARN para el silenciamiento eficaz de cualquier gen diana, varias compañías de suministro mantienen herramientas de diseño basadas en la red que utilizan estas pautas generales para "seleccionar" los shARN cuando se presentan con el ARNm o la secuencia de ADN codificante del gen diana. Se pueden encontrar ejemplos de tales herramientas en los sitios web de Dharmacon, Inc.(Lafayette, Colo.), Ambion, Inc. (Austin, Tex.). Como ejemplo, la selección de shARN implica la elección de un sitio/secuencia únicos para el gen diana (es decir, secuencias que no comparten una homología significativa con otros genes distintos al que se está seleccionando como diana), de modo que otros genes no sean atacados inadvertidamente por el mismo shARN diseñado para esta secuencia diana particular.

[0089] Otro criterio que considerar es si la secuencia diana incluye o no un sitio polimórfico conocido. Si es así, los shARN diseñados para dirigirse a un alelo en particular pueden no dirigirse eficazmente a otro alelo, ya que los emparejamientos erróneos de una sola base entre la secuencia diana y su hebra complementaria en un shARN dado pueden reducir en gran medida la eficacia del ARNi inducido por ese shARN. Dada esa secuencia diana y tales herramientas de diseño y criterios de diseño, un experto en la materia informado de la presente descripción debería ser capaz de diseñar y sintetizar compuestos de siARN adicionales útiles en la reducción del nivel de ARNm deSav1.

[0090] shARN: Administración

[0091] La presente divulgación proporciona una composición de un polímero o excipiente y uno o más vectores que codifican una o más moléculas de shARN. El vector se puede formular en una composición farmacéutica con portadores adecuados y se puede administrar a un mamífero utilizando cualquier ruta de administración adecuada. Debido a esta precisión, se pueden reducir o eliminar los efectos secundarios típicamente asociados con los medicamentos tradicionales. Además, los shARN son relativamente estables y, al igual que los antisentido, también se pueden modificar para lograr características farmacéuticas mejoradas, tales como una mayor estabilidad, capacidad de suministro y facilidad de fabricación. Además, debido a que las moléculas de shARN obtienen ventaja de una ruta celular natural, es decir, la interferencia de ARN, son muy eficaces para destruir las moléculas de ARNm elegidas como diana. Como resultado, es relativamente fácil lograr una concentración terapéuticamente eficaz de un compuesto de shARN en un sujeto. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,410,944.

[0092] Los compuestos de shARN se pueden administrar a mamíferos por diversos métodos a través de diferentes rutas. También se pueden suministrar directamente a un órgano o tejido en particular mediante cualquier método de administración localizada adecuado, tal como la inyección directa en un tejido diana. Alternativamente, se pueden administrar encapsulados en liposomas, por iontoforesis o por incorporación en otros vehículos tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas.

[0093] La inhibiciónin vivode la expresión génica específica por ARNi inyectado por vía intravenosa se ha logrado en diversos organismos, incluidos los mamíferos. En realizaciones particulares, las moléculas de shARN están comprendidas en un vector, incluyendo un vector viral o no viral. En realizaciones específicas, el vector no es integrativo, aunque en otras realizaciones es integrativo. Los vectores virales pueden ser lentivirales, adenovirales, virales adenoasociados y retrovirales, por ejemplo. Los vectores no virales incluyen plásmidos. En realizaciones específicas, se emplea el vector AAV9 (Piras et al., 2013). Los vectores pueden ser suministrados a un individuo sistémicamente o localmente. En ciertas realizaciones, los vectores utilizan promotores específicos de tejido o específicos de célula, tales como promotores específicos de cardiomiocitos. En aspectos específicos, los vectores se suministran por medio de inyección local.

[0094] Una ruta de administración de moléculas de shARN de la invención incluye la inyección directa del vector en un sitio de tejido deseado, tal como, por ejemplo, en tejido cardíaco enfermo o en tejido cardíaco isquémico.

[0095] En general, se incluye en la invención un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos, y un promotor unido operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un primer segmento, un segundo segmento ubicado inmediatamente en 3' del primer segmento, y un tercer segmento localizado inmediatamente en 3' del segundo segmento, en donde el primer y el tercer segmentos tienen cada uno menos de 30 pares de bases de longitud y cada uno más de 10 pares de bases de longitud, y en donde la secuencia del tercer segmento es el complemento de la secuencia del primer segmento. El segundo segmento, ubicado inmediatamente 3' del primer segmento, codifica una estructura en bucle que contiene de 4-10 nucleótidos (es decir, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). La secuencia de ácidos nucleicos se expresa como un siARN y funciona como una molécula de ARN en horquilla corta (shARN) dirigida contra una secuencia de ácidos nucleicos designada.

[0096] Más específicamente, la presente divulgación incluye composiciones y métodos para reducir selectivamente la expresión del producto génico deSav1.La presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un shARN dirigido contraSav1.El shARN forma una estructura de horquilla que comprende una estructura dúplex y una estructura en bucle. La estructura del bucle puede contener de 4 a 10 nucleótidos, tal como 4, 5 o 6 nucleótidos. El dúplex tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, tal como de 10 a 27 nucleótidos. El shARN puede comprender además una región saliente. Tal saliente puede ser una región saliente 3' o una región saliente 5'. La región saliente puede tener, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos de longitud.

[0097] La divulgación proporciona, entre otros, un método para tratar a un mamífero administrando al mamífero una composición que comprende uno o más vectores descritos en la presente memoria. En un aspecto de la divulgación, múltiples vectores, cada uno de los cuales codifica un shARN diferente (dirigido a una región distinta de la secuencia de ácido nucleicoSav1), que pueden administrarse simultáneamente o consecutivamente al mamífero. Un vector individual puede codificar múltiples shARN dirigidos a diferentes áreas del mismo gen; es decir, que comprende dos o más shARN que comprenden SEQ ID NO: 10 y shARN que comprende SEQ ID NO: 11 y un shARN que comprende SEQ ID NO: 12. En otro aspecto, un vector individual puede codificar múltiples copias de shARN que comprenden SEQ ID NO: 10 o múltiples copias de shARN que comprenden SEQ ID NO: 11 o múltiples copias de shARN que comprenden SEQ ID NO: 12, en cualquier proporción.

[0098] El vector de la invención puede comprender además un promotor. Los ejemplos de promotores incluyen promotores regulables y promotores constitutivos. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor de CMV o RSV. El vector puede comprender además una señal de poliadenilación, tal como una señal de poliadenilación mínima sintética. Muchos de los promotores son conocidos en la técnica y son previstos para su en esta invención. En otros casos, el promotor puede ser un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de tejido cardíaco.

[0099] El vector puede comprender adicionalmente uno o más genes marcadores o genes informadores. Se conocen en la técnica muchos genes marcadores y genes informadores. La presente invención contempla el uso de uno o más genes marcadores y/o genes informadores conocidos en la técnica en la práctica de la invención. Los genes marcadores o genes informadores proporcionan un método para rastrear la expresión de uno o más genes vinculados. Los genes marcadores o los genes informadores tras la expresión dentro de la célula, proporcionan productos, generalmente proteínas, detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros Los productos de expresión génica, ya sean del gen de interés, de los genes marcadores o de los genes informadores también se pueden detectar mediante marcaje. Las marcas previstas para su uso en las invenciones incluidas en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, colorantes fluorescentes, reactivos densos a electrones, enzimas (por ejemplo, como las empleadas comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que se pueden volver detectables, , p. ej., incorporando una marca radiactiva al péptido o se pueden utilizar para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 7,419,779.

[0100] En un aspecto de la divulgación, uno o más vectores que comprenden uno o más de los shARN de la invención se pueden volver a administrar un número ilimitado de veces después de una primera administración en cualquier intervalo o intervalos de tiempo después de la primera administración.

[0101] shARN: Composiciones farmacéuticas

[0102] Los ácidos nucleicos que codifican el shARN de la presente invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas, que se preparan de acuerdo con técnicas de composición farmacéutica convencionales. Ver, p.ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del vector que codifica shARN. Estas composiciones pueden comprender, además del vector, un excipiente, portador, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. El portador puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, p. ej., intravenosa, oral, intramuscular, subcutánea, intratecal, epineural o parenteral.

[0104] Cuando los vectores de la invención se preparan para su administración, se pueden combinar con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables para formar una formulación farmacéutica o una forma de dosificación unitaria. El total de ingredientes activos en tales formulaciones incluye de 0,1 al 99,9 % en peso de la formulación.

[0106] En otro aspecto de la invención, los vectores de la invención se pueden formular adecuadamente e introducir en el entorno de la célula por cualquier medio que permita que una porción suficiente de la muestra entre en la célula para inducir el silenciamiento génico, si es que se produce. Muchas formulaciones para vectores son conocidas en la técnica y se pueden utilizar siempre que los vectores entren en las células diana para que puedan actuar.

[0107] Por ejemplo, los vectores se pueden formular en soluciones tampón tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato que comprenden liposomas, estructuras micelares y cápsides. Las formulaciones farmacéuticas de los vectores de la invención también pueden adoptar la forma de una solución o dispersión acuosa o anhidra, o alternativamente la forma de una emulsión o suspensión. Las formulaciones farmacéuticas de los vectores de la presente invención pueden incluir, como ingredientes opcionales, agentes solubilizantes o emulsionantes, y sales del tipo que son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos no limitantes específicos de los portadores y/o diluyentes que son útiles en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua y soluciones salinas fisiológicamente aceptables. Otros portadores farmacéuticamente aceptables para preparar una composición para su administración a un individuo incluyen, por ejemplo, disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol o ésteres orgánicos inyectables. Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción del vector codificante de shARN. Otros vehículos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizadores o excipientes, solución salina, soluciones de dextrosa, soluciones de fructosa, etanol , o aceites de origen animal, vegetal o sintético. El portador también puede contener otros ingredientes, por ejemplo, conservantes.

[0109] Se reconocerá que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, que incluye un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la ruta de administración de la composición. La composición que contiene los vectores también puede contener un segundo reactivo, tal como un reactivo de diagnóstico, una sustancia nutricional, una toxina o un agente terapéutico adicional. Muchos agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad cardíaca son conocidos en la técnica y se contemplan para su uso junto con los vectores de esta invención.

[0111] Las formulaciones de vectores con lípidos catiónicos se pueden utilizar para facilitar la transfección de los vectores en células. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos catiónicos, tales como lipofectina, derivados catiónicos de glicerol, y moléculas policatiónicas, tales como polilisina. Los lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, Oligofectamina y Lipofectamina (Life Technologies) que se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0113] Se deben introducir cantidades adecuadas de vector y estas cantidades se pueden determinar empíricamente utilizando métodos convencionales. Típicamente, las concentraciones eficaces de especies de vectores individuales en el entorno de una célula serán aproximadamente 50 nanomolar o menos 10 nanomolar o menos, o composiciones en las cuales se pueden utilizar concentraciones de aproximadamente 1 nanomolar o menos. En otros aspectos, los métodos utilizan una concentración de aproximadamente 200 picomolar o menos e incluso se puede utilizar una concentración de aproximadamente 50 picomolar o menos en muchas circunstancias. Un experto en la técnica puede determinar la concentración eficaz para cualquier sujeto mamífero particular utilizando métodos convencionales.

[0115] El shARN se administra preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad real administrada y la velocidad y período de tiempo de administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de la condición, enfermedad o trastorno que esté siendo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, la cronología, etc., es responsabilidad de los médicos generales o especialistas, y generalmente tiene en cuenta el trastorno, la condición o la enfermedad a tratar, la condición del sujeto mamífero individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los profesionales. Se pueden encontrar ejemplos de técnicas y protocolos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.).

[0116] Alternativamente, se pueden utilizar terapias de direccionamiento para suministrar los vectores codificantes de shARN más específicamente a ciertos tipos de células, mediante el uso de sistemas de direccionamiento tales como anticuerpos o ligandos específicos de células. La orientación puede ser deseable por una variedad de razones, p. ej., si el agente fuera inaceptablemente tóxico, o si de otro modo necesitara una dosis demasiado alta, o si de otra manera no pudiera ingresar en las células diana.

[0118] shARN: Terapia génica

[0120] El siARN también se puede administrar a células de mamíferos, particularmente células humanas, mediante un enfoque de terapia génica, utilizando un vector de ADN a partir del cual los compuestos de siARN, p. ej., en forma de horquilla corta (shARN), se pueden transcribir directamente. Estudios recientes han demostrado que, si bien los siARN de doble hebra son muy eficaces en la mediación de ARNi, los ARN cortos, de hebra sencilla, en forma de horquilla también pueden mediar en ARNi, probablemente porque se pliegan en dúplex intramoleculares que se procesan a siARN de doble hebra por enzimas celulares. Este descubrimiento tiene implicaciones importantes y de gran alcance, ya que la producción de tales shARN se puede lograr fácilmente in vivo mediante la transfección de células o tejidos con vectores de ADN que llevan repeticiones invertidas cortas separadas por un pequeño número (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) nucleótidos que dirigen la transcripción de tales ARN en horquilla corta. Además, si se incluyen mecanismos para dirigir la integración del vector o un segmento de vector en el genoma de la célula anfitriona, o para asegurar la estabilidad del vector de transcripción, el ARNi causado por los shARN codificados se puede hacer estable y heredable. Estas técnicas no solo se han utilizado para "modificar genéticamente para reducir" la expresión de genes específicos en células de mamíferos, sino que ahora se han empleado con éxito para modificar genéticamente para reducir la expresión de transgenes expresados de forma exógena, así como genes endógenos en el cerebro y el hígado de ratones vivos.

[0122] La terapia génica se lleva a cabo de acuerdo con métodos generalmente aceptados que se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 5,837,492 y 5,800,998 y referencias citadas en la presente memoria. Los vectores en el contexto de la terapia génica están destinados a incluir aquellas secuencias polinucleotídicas que contienen secuencias suficientes para expresar un polinucleótido codificado en ellas. Si el polinucleótido codifica un shARN, la expresión producirá la secuencia del polinucleótido antisentido. Por lo tanto, en este contexto, la expresión no requiere que el producto proteico sea sintetizado. Además del shARN codificado en el vector, el vector también contiene un promotor funcional en las células eucarióticas. La secuencia de shARN está bajo el control de este promotor. Los promotores eucarióticos adecuados incluyen los descritos en otras partes de la presente memoria y los conocidos en la técnica. El vector de expresión también puede incluir secuencias, tales como marcadores seleccionables, genes informadores y otras secuencias reguladoras utilizadas convencionalmente.

[0124] Por consiguiente, la cantidad de shARN generadoin situse regula controlando factores tales como la naturaleza del promotor utilizado para dirigir la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos (es decir, si el promotor es constitutivo o regulable, fuerte o débil) y el número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de shARN que están en la célula.

[0126] Para la expresión del shARN deSav1,un promotor está unido operativamente a una secuencia de shARN. Como se emplea en la presente memoria, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN que regula la expresión de la secuencia del gen diana que está unida operativamente a la secuencia del promotor en una determinada célula anfitriona. El término "unido operativamente" significa que un fragmento de ácido nucleico está unido a otro fragmento de ácido nucleico, de modo que la función o expresión del mismo se ve afectada por el otro fragmento de ácido nucleico. El casete de expresión de la presente invención puede comprender adicionalmente varias secuencias reguladoras de la expresión, tales como una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma de ARNm adecuado, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El promotor utilizado en la presente invención puede ser un promotor constitutivo que induce de forma constitutiva la expresión de un gen diana, o un promotor inducible que induce la expresión de un gen diana en una posición y un punto temporal dados. Los ejemplos específicos del promotor pueden incluir el promotor U6, el promotor CMV (citomegalovirus), el promotor SV40, el promotor CAG (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108: 193-199, 1991; y Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), el promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature 313: 810-812,1985), el promotor Rsyn7 (solicitud de patente de EE. UU. N.º de serie 08/991,601), el promotor de ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol.12: 619-632, 1989), el promotor de ALS (solicitud de patente de EE.UU. N.º de serie 08/409,297) y similares. También promotores utilizables se divulgan en las patentes de EE. UU. N.º 5,608,149, 5,608,144, 5,604,121, 5,569,597, 5,466,785, 5,399,680, 5,268,463, 5,608,142, etc.

[0128] El vector recombinante de la presente divulgación puede introducirse en una célula huésped, usando un método convencional conocido en la técnica. La célula huésped puede emplearse para la manipulación del vector o como un medio para transferirlo a un individuo. Preferiblemente, la incorporación intracelular del vector en la célula huésped puede llevarse a cabo mediante un método convencional conocido en la técnica, como cloruro de calcio, bombardeo con microproyectiles, electroporación, fusión mediada por PEG, microinyección, liposomas, etc.

[0129] Los ejemplos de la célula anfitriona que se puede utilizar en la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, células procarióticas tales comoEscherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis,yStaphylococcus,células eucarióticas inferiores tales como hongos (p. ej., Aspergillus), levaduras (p. ej., Pichia pastoris),Saccharomyces cerevisiae, SchizosaccharomycesyNeurospora crassa,y células eucarióticas superiores tales como células de insectos, células de plantas, células de mamíferos. Preferiblemente, la célula anfitriona puede ser una célula humana.

[0131] Mientras, las técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular utilizadas en la presente divulgación son bien conocidas en la técnica y pueden encontrarse en la siguiente literatura: Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W., Experimentos con fusiones génicas, Laboratorio Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor, Nueva York (1984); y Ausubel, F. M. et al., Protocolos actuales en biología molecular, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).

[0133] La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del vector recombinante de la presente invención y un fármaco cardíaco solo o combinado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Como se emplea en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es capaz de producir la respuesta terapéutica deseada mayor que la mostrada por un control negativo. Preferiblemente, la cantidad terapéuticamente eficaz es una dosis suficiente para prevenir o tratar la enfermedad cardiovascular.

[0135] Una cantidad terapéuticamente eficaz del vector recombinante en la presente divulgación puede estar en un rango de 0,0001 a 100 mg/día/kg (peso corporal), preferiblemente 0,005-0,05 mg/día/kg. Sin embargo, una dosis efectiva del medicamento puede variar dependiendo de diversos factores como el tipo y la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso, la salud y el sexo de los pacientes, las vías de administración y la duración del tratamiento.

[0136] Como se emplea en la presente memoria, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que el compuesto es fisiológicamente aceptable, y no causa reacciones alérgicas (tales como trastornos gastrointestinales, y vértigo) o reacciones similares sin efectos inhibidores sobre la acción de un ingrediente activo, cuando se administra a seres humanos o animales. Los ejemplos del portador farmacéuticamente aceptable pueden incluir todos los tipos de disolventes, medios de dispersión, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, composiciones acuosas, liposomas, microesferas y microsomas.

[0138] Mientras, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular de manera apropiada junto con cualquier portador adecuado mediante un método convencional conocido en la técnica, dependiendo de las rutas de administración del fármaco. No hay un límite particular para la vía de administración de la composición farmacéutica. Por lo tanto, la composición de fármaco de acuerdo con la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral. Los ejemplos de la vía de administración parenteral pueden incluir las vías transdérmica, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea e intravenosa.

[0140] Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía oral, la composición farmacéutica junto con cualquier vehículo aceptable por vía oral se puede formular en diversas formas de dosificación tales como polvos, gránulos, comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, soluciones, geles, jarabes, suspensiones y obleas, de acuerdo con un método convencional conocido en la técnica. Los ejemplos de vehículos adecuados pueden incluir diversos tipos de cargas, por ejemplo azúcares tales como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol y maltitol; almidones tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de patata; sustancias celulósicas tales como celulosa, metil celulosa, carboximetil celulosa sódica e hidroxipropil metil celulosa; gelatina, polivinilpirrolidona (PVP) y similares. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar y ácido algínico o alginato de sodio. Además, la composición farmacéutica puede comprender adicionalmente anticoagulantes, lubricantes, agentes humectantes, fragancias, emulsionantes y conservantes.

[0142] Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía parenteral, la composición farmacéutica junto con cualquier vehículo parenteralmente aceptable se puede formular, por ejemplo, en una preparación inyectable, una preparación transdérmica o un inhalante nasal, de acuerdo con un método convencional conocido en la técnica. Tras la formulación de la preparación inyectable, se debe realizar la esterilización junto con la protección de la preparación farmacéutica frente a la contaminación microbiana, incluidas las bacterias y hongos patógenos. Los ejemplos del vehículo adecuado para la preparación inyectable pueden incluir, pero no se limitan a, disolventes o medios de dispersión que incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas de los mismos y/o aceite vegetal. Más preferiblemente, los ejemplos del vehículo adecuado pueden incluir soluciones isotónicas tales como solución de Hank, solución de Ringer, PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contiene trietanolamina, agua estéril para inyectables, etanol al 10 %, propilenglicol al 40 % y dextrosa al 5 %. Para proteger la preparación inyectable frente a la contaminación microbiana, la preparación puede comprender adicionalmente varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcar o cloruro sódico.

[0143] En el caso de la formulación transdérmica, la composición farmacéutica de la invención se puede formular en forma de pomadas, cremas, lociones, geles, soluciones externas, pastas, linimentos o aerosoles. El término "administración transdérmica" significa que una cantidad terapéuticamente eficaz de un ingrediente activo contenido en una composición farmacéutica se transmite a la piel cuando la composición farmacéutica se aplica tópicamente a la piel. Estas formulaciones se describen en la bibliografía que es una guía generalmente conocida en todos los campos de la química farmacéutica (Remington's Pharmaceutical Sciences, 15.sup.th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pa.).

[0144] Para la administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una pulverización en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos,p. ej.,de gelatina, que se utilizan en un inhalador o insuflador, se pueden formular de forma que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en la bibliografía (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.sup.th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).

[0145] La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además uno o más tampones (p. ej., solución salina o PBS), carbohidratos (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa o dextrano), antioxidantes, agentes bacteriostáticos, agentes quelantes (p. ej., EDTA o glutatión), adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio), agentes suspensivos, agentes espesantes, y/o conservantes.

[0146] Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular de manera apropiada mediante un método convencional conocido en la técnica, de modo que sea posible lograr una liberación rápida, sostenida o retardada de ingredientes activos después de la administración de la composición a un mamífero.

[0147] Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar combinada con un fármaco conocido que tiene efectos terapéuticos para el tratamiento de una condición cardíaca.

[0148] EJEMPLOS

[0149] Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ciertos aspectos no limitantes de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que los mecanismos descritos en los siguientes ejemplos representan los mecanismos descubiertos por los autores de la presente invención que funcionan correctamente en la práctica de la invención. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deberían, en vista de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizan muchos cambios en las modalidades específicas divulgadas y aun así obtener un resultado igual o similar sin alejarse del alcance de la invención

[0150] Ejemplo 1

[0151] La señalización Hippo promueve la renovación de cardiomiocitos en adultos

[0152] Mientras que otros órganos tienen capacidad de regeneración, los cardiomiocitos no pueden renovarse o regenerarse lo suficiente como para reparar el corazón dañado (Kikuchi y Poss, 2012). Para investigar la hipótesis de que la señalización Hippo es un regulador negativo de la renovación de cardiomiocitos postnatal, los autores de la presente invención inactivaron los genesSalvyLatsen cardiomiocitos adultos.

[0153] Para poner a prueba el papel deSalv, Lats1,yLats2en cardiomiocitos adultos, se utilizaron alelos nulos condicionales para los genes de Hippo y el transgénMyh6creERT2que dirige la actividad de cre de cardiomiocitos regulada por tamoxifeno (Sohal et al., 2001). Debido a que el corazón contiene múltiples tipos de células, los cardiomiocitos se visualizaron utilizando el aleloR26mTmG(mTmG), que expresa eGFP tras la activación de cre, para rastrear el linaje de los cardiomiocitos (Muzumdar et al., 2007). Se generaron cardiomiocitos adultos que eran mutantes paraSalvyLats1/2al inyectar tamoxifeno a ratones de tres meses (Heallen et al., 2013). Para determinar si la deficiencia de Hippo produce reentrada en el ciclo celular, a los ratones se les inyectó 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). La incorporación de EdU nuclear, que indica una síntesis de ADNde novo, se detectó en cardiomiocitos modificados genéticamente para inactivar la expresión deSalv(CKO) condicional y modificados genéticamente para inactivar la expresión deLats1/2CKO que revela una capacidad de renovación de cardiomiocitos endógenos cuando se elimina la señalización Hippo. La cuantificación de células positivas para EdU mostró inducción significativa de la síntesis de ADN en corazones con deficiencia de Hippo con un mayor aumento en los mutantesLats1/2en comparación con los cardiomiocitosSalv CKO(Heallen et al., 2013). La reentrada en el ciclo celular también se cuantificó en núcleos de cardiomiocitos aislados utilizando el análisis FACS (Bergmann et al., 2009; Heallen et al., 2013). Los núcleos de cardiomiocitos tantoLats1/2 CKOcomoSalv CKOtuvieron un mayor número de cardiomiocitos que expresaban Ki-67 en comparación con los controles (Heallen et al., 2013). Estos resultados muestran que los cardiomiocitos vuelven a entrar en el ciclo celular tras la interrupción de la vía de Hippo, lo que apoya la hipótesis de que la señalización Hippo es un regulador negativo de la renovación de cardiomiocitos adultos.

[0154] Se evaluó si los cardiomiocitosSalv CKOyLats1/2 CKOprogresan a través de la mitosis y la citocinesis. La inmunohistoquímica se realizó con el marcador de fase M Aurora B quinasa (Aurkb) para determinar si se producía citocinesis en cardiomiocitos con deficiencia de Hippo. La expresión deAurkbenen los cardiomiocitosLats1/2ySalv CKOfue claramente detectable en el surco de escisión proporcionando evidencia directa de citocinesis (Heallen et al., 2013). A diferencia de los corazones con deficiencia de Hippo, no se detectó la expresión deAurkben los corazones de control.

[0155] En resumen, la inactivación de la ruta Hippo en el corazón del ratón adulto sin estrés da como resultado una mayor renovación de los cardiomiocitos con un aumento de entrada en la fase S del miocardio y progresión a través de la mitosis (Heallen et al.,2013). Estos hallazgos descubren un papel inhibidor para la señalización Hippo en la renovación de cardiomiocitos adultos.

[0156] Ejemplo 2

[0157] La señalización Hippo promueve la regeneración del corazón adulto en un modelo de lesión aguda

[0158] La resección del ápice cardíaco en los primeros seis días de vida da como resultado la regeneración cardíaca, mientras que las resecciones realizadas el día postnatal (P) 7 y más tarde producen fibrosis y cicatrización (Porrello et al., 2011).

[0159] Para someter a prueba la capacidad regenerativa, se realizó la resección del ápice de tamaño uniforme en la fase P8 normalmente no regenerativa en corazones de control y con deficiencia de Hippo. Para inactivarSalv,se les inyectaron a los ratones cuatro dosis de tamoxifeno antes y después de la resección. Tanto la fluorescencia de GFP, que detecta la recombinación en el informadormTmGcomo la inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-Salv indicaron una eliminación eficaz deSalven el miocardio mutante a los cuatro días de la resección (4 dpr). La evaluación de 21 corazones dpr por medio de seccionamiento en serie reveló una cicatrización severa de los corazones de control en todos, excepto algunos casos. En contraste, los corazones con deficiencia de Hippo resecados regeneraron de manera eficaz el miocardio con una reducción del tamaño de la cicatriz (Heallen et al., 2013). El ápice cardíaco regenerado se obtuvo principalmente de cardiomiocitos preexistentes.

[0160] La oclusión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) se realizó tanto en P8 como a los dos meses de edad. En los corazones P8, después de la oclusión de LAD (LADO) hubo una recuperación funcional y una reducción del tamaño de la cicatriz cuando se analizó a los veintiún días de la oclusión. La histología también confirmó la recuperación del miocardio con menos tejido cicatricial después de LADO (Heallen et al., 2013). En los corazones adultos, hubo evidencia histológica y funcional igualmente fuerte para la regeneración de cardiomiocitos después de LADO. El Acortamiento Fraccionado y la Fracción de Eyección evaluados por ecocardiografía indicaron que a las tres semanas de LADO, los corazones adultos con deficiencia de Hippo habían recuperado una función comparable a la de los animales operados de manera simulada, lo que sugiere que los cardiomiocitos con deficiencia de Hippo tienen una mayor supervivencia y/o proliferación después de un daño isquémico (Heallen et al., 2013).

[0161] Ejemplo 3

[0162] Los cardiomiocitos deficientes en Hippo proliferan extensamente y adquieren propiedades migratorias durante la regeneración

[0163] Se evaluaron con mayor profundidad cuatro corazones dpr (P12) con deficiencia de Hippo. Cuatro horas antes de la cosecha, los corazones se pulsaron con EdU para visualizar las células que habían entrado en el ciclo celular. En los corazones de control, las células positivas para EdU se encontraron principalmente en el linaje no cardiomiocítico negativo para GFP cerca de la zona resecada y, muy probablemente, son células inflamatorias infiltrantes y fibroblastos cardíacos en proliferación. También se observaron células negativas para GFP en proliferación similares en corazonesSalv CKO. A diferencia de los controles, los corazones resecados conSalv CKOtenían cardiomiocitos doblemente positivos para EdU/GFP tanto en la zona limítrofe como en las regiones distales del corazón (Heallen et al., 2013; Morikawa et al., 2014).

[0164] La deficiencia de Hippo mejora la capacidad de los cardiomiocitos para volver a entrar en el ciclo celular en todo el corazón. En los corazones mutantesSalv CKO, las células derivadas del linaje de cardiomiocitos se desprendieron de los cardiomiocitos de la zona del borde circundante y entraron en la zona resecada que contenía un gran número de células no cardiomiocíticas. Además, las células derivadas de miocardio positivas para GFP con deficiencia de Hippo extendieron protuberancias similares a lamelipodios. En los corazones de control, las células positivas para GFP se agruparon dentro de la zona fronteriza y no se infiltraron en la región resecada del corazón (Morikawa et al., 2014).

[0165] Ejemplo 4

[0166] YAP regula directamente los genes que promueven la progresión del ciclo celular y la remodelación citosquelética

[0167] Para obtener información adicional sobre las dianas directas de la señalización Hippo en la regeneración cardíaca, se realizaron experimentos de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) utilizando un anticuerpo contra el efector de Hippo Yap. Los autores de la presente invención utilizaron datos de expresión de ARNm de experimentos de micromatrices para solapar el conjunto de datos de ChIP-seq con genes regulados por incremento en corazones mutantes paraNkx2.5cre Salv(FIGS.2 A, B). Los cambios en la expresión génica se validaron mediante experimentos de qRT-PCR (FIG.2 B). El análisis Ontológico de Genes indicó que Yap regula directamente los genes implicados en la progresión del ciclo celular y la dinámica del citoesqueleto (FIG. 2 A y (Morikawa et al., 2014)). También están incluidas entre los genes del ciclo celular regulados por Yap las quinasas dependientes de ciclina, tales comoCdk6,y la diana de Yap previamente validada,CiclinaE2.Otra diana de Yap, el gen del ciclo celularLin9,es un miembro del complejo MuvB, que mejora la transición G2/M (Kleinschmidt et al., 2009; Sadasivam et al., 2012) (FIGS.2 A, B).

[0168] Los genes diana de Yap que regulan tanto la progresión citoesquelética como del ciclo celular incluyenAurkbyBirc5(survivina) (FIGS.2 A, B). TantoAurkbcomoBirc5son componentes del complejo pasajero del cromosoma y son importantes para la condensación y la segregación cromosómica durante la mitosis, así como para la citocinesis. De manera importante, se había demostrado previamente queBirc5,está regulado por la señalización Hippo en el corazón en desarrollo (Heallen et al., 2011). Los genes expresados en el surco citocinético y la zona media del huso que regulan la citocinesis, tales comoAnillin, Pkp4,yEct2,son genes diana directos de Yap, lo que indica que Yap promueve la citocinesis en la regeneración de cardiomiocitos (Hesse et al., 2012; Matthews et al., 2012; Wolf et al., 2006).

[0169] Ejemplo 5

[0170] YAP regula directamente los genes que promueven la remodelación citosquelética y la motilidad celular durante la regeneración cardiaca

[0171] De acuerdo con los cambios drásticos en la morfología celular, los autores de la presente invención encontraron que Yap también se une directamente a los genes que regulan el citoesqueleto de actina (FIGS.2 A, B). Se sabe que varias dianas reguladas por Yap se localizan en lamelipodios y filopodios tales comoEnah,un regulador de actina Ena/VASP que causa disfunción cardíaca cuando se desorganiza en ratones (Mejillano et al., 2004; Morikawa et al., 2014).

[0172] Yap también se une a los genes implicados en la transmisión de fuerza entre los cardiomiocitos y la matriz extracelular (ECM). Estos incluyen genes que están implicados en la conexión del citoesqueleto de actina a la membrana citoplásmica. El sarcoglicano delta (Sgcd) y la Sintrofina B1 (Sntb1) son componentes del complejo de la glicoproteína distrofina (DGC), que es importante para conectar el citoesqueleto de actina a la ECM y puede transmitir fuerza entre las células musculares (Barton, 2006; Goyenvalle et al. , 2011). Ambos genes están mutados en pacientes humanos con distrofia muscular y estabilizan la membrana plasmática en respuesta al estrés mecánico. La proteína de unión a actina ,Talina 2,conecta el citoesqueleto de actina a las integrinas y la ECM. Por último,Ctnna3,un gen asociado a la cadherina expresado en el disco intercalar (ICD), conecta el citoesqueleto de actina tanto al ICD como a la ECM y probablemente detecta la tensión entre los cardiomiocitos (Li et al., 2012).

[0173] Ejemplo 6

[0174] El agotamiento de hippo rescata el defecto de regeneración cardíaca en los corazones mutantes mdx.

[0175] Para determinar si la pérdida de función de la vía de Hippo podría suprimir el fenotipo de regeneración fallidamdxlos autores de la presente invención generaron corazones dobles mutantesSalv; mdxy realizaron la resección del ápice el día 8 postnatal en muestras de los dobles mutantes y de control. Como se muestra en la FIG. 3, losSalvCKO ySalv;los dobles mutantesmdxregeneraron el miocardio en contraste con los mutantesmdxque no pueden regenerar el miocardio (Morikawa et al., 2014). Esto indica que el agotamiento de Hippo, con la regulación por incremento de Yap resultante y la regulación por incremento del gen diana de Yap, puede suprimir el fenotipo del corazónmdx. Los hallazgos de los autores de la presente invención indican que el agotamiento de Hippo en el miocardio es un enfoque prometedor para tratar la cardiomiopatía por DMD.

[0176] Ejemplo 7

[0177] El agotamiento de Hippo promueve la regeneración de cardiomiocitos en el contexto de la insuficiencia cardíaca establecida

[0178] Se determinó si la inactivación de la ruta Hippo tres semanas después del infarto de miocardio todavía promueve la regeneración de cardiomiocitos con una función cardíaca mejorada. Esta es una pregunta clínicamente importante ya que muchos pacientes sufren infartos crónicos que conducen a remodelación cardíaca patológica con insuficiencia cardíaca y muerte. Antes de esto, se desconocía si el agotamiento de Hippo podía promover eficazmente la regeneración del corazón en el contexto de una cicatriz madura establecida. Se introdujo un infarto de miocardio en los corazones de control y los corazonesSalvCKO que o habían recibido inyección en el punto temporal cero (FIG. 4). Los ratonesSalvCKO que no habían recibido inyección todavía expresan niveles de control deSalv.Los controles simulados también se establecieron en tiempo cero. Tres semanas después del infarto, todos los ratones se estudiaron cuidadosamente mediante ecocardiografía y los ratones operados que se encontraban en insuficiencia cardíaca con EF reducida se incluyeron en el estudio y recibieron una inyección de tamoxifeno para inactivar la vía de Hippo.

[0179] Los parámetros de la función cardíaca se evaluaron en todos los corazones a intervalos de dos semanas después de la inyección de tamoxifeno (FIG.4). Los mutantesSalvCKO tuvieron una recuperación funcional a partir del punto temporal de dos semanas (5 semanas después del MI) y la función continuó mejorando hasta que alcanzó el nivel de los controles no operados (9 semanas después del MI). La inactivación de la vía de Hippo después de una insuficiencia cardíaca establecida da como resultado una reparación cardíaca con retorno de la función cardíaca.

[0180] Ejemplo 8

[0181] Diseño de ARN pequeños en forma de horquilla (shARN) para inactivar la vía Hippo en el corazón adulto Tres ejemplos de shARN contra Salv en regiones de la molécula que se conservan entre ratón, ser humano y cerdo, de modo que se pueden utilizar indistintamente entre estas tres especies utilizando métodos convencionales ((Tafer, 2014); FIGS. 6, 7, y 8). La eficacia funcional de cada shARN se validó, utilizando experimentos de modificación genética para disminuir la expresión de un gen con siARN, para suprimir la expresión endógena deSalven cardiomiocitos neonatales (FIG.5). Los tres shARN modificaron genéticamente la expresión de Salv disminuyéndola de manera eficaz en aproximadamente 70 % con shARN N.º 3, lo que proporciona la mayor eficiencia de modificación genética para disminuir la expresión de un gen.

[0182] Referencias

[0183] Barton, E.R. (2006). Impact of sarcoglycan complex on mechanical signal transduction in murine skeletal muscle. American journal of physiology Cell physiology 290, C411-419.

[0184] Bergmann, O., Bhardwaj, R.D., Bernard, S., Zdunek, S., Barnabe-Heider, F., Walsh, S., Zupicich, J., Alkass, K., Buchholz, B.A., Druid, H., et al. (2009). Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science 324, 98-102. Bulfield, G., Siller, W.G., Wight, P.A., and Moore, K.J. (1984). X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 1189-1192.

[0185] Emery, A.E. (2002). The muscular dystrophies. Lancet 359, 687-695.

[0186] Goyenvalle, A., Seto, J.T., Davies, K.E., and Chamberlain, J. (2011). Therapeutic approaches to muscular dystrophy. Hum Mol Genet 20, R69-78.

[0187] Halder, G., y Johnson, R.L. (2011). Hippo signaling: growth control and beyond. Development 138, 9-22.

[0188] Heallen, T., Morikawa, Y., Leach, J., Tao, G., Willerson, J.T., Johnson, R.L., and Martin, J.F. (2013). Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development 140, 4683-4690.

[0189] Heallen, T., Zhang, M., Wang, J., Bonilla-Claudio, M., Klysik, E., Johnson, R.L., y Martin, J.F. (2011). Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science 332, 458-461.

[0190] Hesse, M., Raulf, A., Pilz, G.A., Haberlandt, C., Klein, A.M., Jabs, R., Zaehres, H., Fugemann, C.J., Zimmermann, K., Trebicka, J., et al. (2012). Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nature communications 3, 1076.

[0191] Hoffman, E.P., Brown, R.H., Jr., and Kunkel, L.M. (1987). Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919-928.

[0192] Hoffman, E.P., Hudecki, M.S., Rosenberg, P.A., Pollina, C.M., and Kunkel, L.M. (1988). Cell and fiber-type distribution of dystrophin. Neuron 1, 411-420.

[0193] Kikuchi, K., and Poss, K.D. (2012). Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual review of cell and developmental biology 28, 719-741.

[0194] Kleinschmidt, M.A., Wagner, T.U., Liedtke, D., Spahr, S., Samans, B., and Gaubatz, S. (2009). lin9 is required for mitosis and cell survival during early zebrafish development. The Journal of biological chemistry 284, 13119-13127. Li, J., Goossens, S., van Hengel, J., Gao, E., Cheng, L., Tyberghein, K., Shang, X., De Rycke, R., van Roy, F., and Radice, G.L. (2012). Loss of alphaT-catenin alters the hybrid adhering junctions in the heart and leads to dilated cardiomyopathy and ventricular arrhythmia following acute ischemia. Journal of cell science 125, 1058-1067. Matthews, H.K., Delabre, U., Rohn, J.L., Guck, J., Kunda, P., and Baum, B. (2012). Changes in Ect2 localization couple actomyosin-dependent cell shape changes to mitotic progression. Dev Cell 23, 371-383.

[0195] Mejillano, M.R., Kojima, S., Applewhite, D.A., Gertler, F.B., Svitkina, T.M., and Borisy, G.G. (2004). Lamellipodial versus filopodial mode of the actin nanomachinery: pivotal role of the filament barbed end. Cell 118, 363-373. Morikawa, Y., Zhang, M., Heallen, T., Leach, J., Tao, G., Xiao, Y., Bai, Y., Willerson, J.T., and Martin, J.F. (2014). Actin cytoskeletal remodeling with protrusion formation is essential for heart regeneration in Hippo deficient mice. submitted.

[0196] Muzumdar, M.D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., and Luo, L. (2007). A global double fluorescent Cre reporter mouse. Genesis 45, 593-605.

[0197] Ohlendieck, K., and Campbell, K.P. (1991). Dystrophin-associated proteins are greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. J Cell Biol 115, 1685-1694.

[0198] Ohlendieck, K., Matsumura, K., Ionasescu, V.V., Towbin, J.A., Bosch, E.P., Weinstein, S.L., Sernett, S.W., and Campbell, K.P. (1993). Duchenne muscular dystrophy: deficiency of dystrophin-associated proteins in the sarcolemma. Neurology 43, 795-800.

[0199] Piras, B. A., O'Connor, D.M., French, B.A. (2013). Systemic Delivery of shRNA by AAV9 Provides Highly Efficient Knockdown of Ubiquitously Expressed GFP in ouse Heart, but Not Liver. PLOS One 8(9), 1-11.

[0200] Porrello, E.R., Mahmoud, A.I., Simpson, E., Hill, J.A., Richardson, J.A., Olson, E.N., and Sadek, H.A. (2011). Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science 331, 1078-1080.

[0201] Sadasivam, S., Duan, S., and DeCaprio, J.A. (2012). The MuvB complex sequentially recruits B-Myb and FoxM1 to promote mitotic gene expression. Genes Dev 26, 474-489.

[0202] Sohal, D.S., Nghiem, M., Crackower, M.A., Witt, S.A., Kimball, T.R., Tymitz, K.M., Penninger, J.M., and Molkentin, J.D. (2001). Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res 89, 20-25.

[0203] Tafer, H. (2014). Bioinformatics of siRNA design. Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 1097, 477-490. von Gise, A., Lin, Z., Schlegelmilch, K., Honor, L.B., Pan, G.M., Buck, J.N., Ma, Q., Ishiwata, T., Zhou, B., Camargo, F.D., et al. (2012). YAP1, the nuclear target of Hippo signaling, stimulates heart growth through cardiomyocyte proliferation but not hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 2394-2399.

[0204] Wolf, A., Keil, R., Gotzl, O., Mun, A., Schwarze, K., Lederer, M., Huttelmaier, S., and Hatzfeld, M. (2006). The armadillo protein p0071 regulates Rho signalling during cytokinesis. Nature cell biology 8, 1432-1440.

[0205] Xin, M., Kim, Y., Sutherland, L.B., Qi, X., McAnally, J., Schwartz, R.J., Richardson, J.A., Bassel-Duby, R., and Olson, E.N. (2011). Regulation of insulin-like growth factor signaling by Yap governs cardiomyocyte proliferation and embryonic heart size. Science signaling 4, ra70.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición de ácido nucleico sintético asilado, que comprende un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad de SEQ ID NO:10, un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad de SEQ ID NO:11, y un ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad de SEQ ID NO:12, en donde la composición es para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar al individuo una cantidad efectiva de la composición.

2. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde cada ácido nucleico es al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o el 99 % idéntico a las respectivas SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:12.

3. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde:

(a) el ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad de SEQ ID NO:10 comprende la secuencia de SEQ ID NO:10 y comprende además una secuencia antisentido SEQ ID NO: 10, en donde cuando la secuencia y la secuencia antisentido se hibridan entre sí para formar una estructura en dúplex, la secuencia y la secuencia antisentido se separan por una estructura en bucle;

(b) el ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad de SEQ ID NO: 11 comprende la secuencia de SEQ ID NO:11 y comprende además una secuencia antisentido SEQ ID NO:11, en donde cuando la secuencia y la secuencia antisentido se hibridan entre sí para formar una estructura en dúplex, la secuencia y la secuencia antisentido se separada por una estructura en bucle; y

(c) el ácido nucleico que comprende al menos el 80 % de identidad de SEQ ID NO: 12 comprende la secuencia de SEQ ID NO:12 y comprende además una secuencia antisentido de SEQ ID NO:12, en donde cuando la secuencia y la secuencia antisentido se hibridan entre sí para formar una estructura en dúplex, la secuencia y la secuencia antisentido se separada por una estructura en bucle.

4. La composición pasa su uso de la reivindicación 3, en donde:

(a) cada ácido nucleico tiene al menos 43 nucleótidos de longitud; y/o

(b) cada ácido nucleico no tiene más de 137 nucleótidos de longitud; y/o

(c) la estructura en bucle de cada ácido nucleico tiene entre 5 y 19 nucleótidos de longitud.

5. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde uno o más de los ácidos nucleicos tiene 1, 2, 3, 4, o 5 emparejamientos erróneos en comparación con las respectivas SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:12.

6. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico está comprendido en un vector.

7. La composición pasa su uso de la reivindicación 6, en donde:

(i) el vector es un vector viral; o

(ii) el vector es un vector no viral; o

(iii) el vector es un vector no integrador.

(iv) La expresión del ácido nucleico está regulada por un promotor específico del tejido o de la célula, opcionalmente

en donde el promotor es un promotor específico de cardiomiocitos, además opcionalmente

en donde el promotor específico de cardiomiocitos es promotor específico del ventrículo derecho de la cadena ligera 2 de miosina cardíaca (MLC-2v); promotor del gen de la cadena pesada de miosina alfa específica del músculo cardíaco (MHC); promotor mínimo específico de las células cardíacas desde -137 hasta 85 del promotor NCX1; troponina T cardíaca de pollo (cTNT), o una combinación de los mismos; o

(v) los ácidos nucleicos que comprenden al menos el 80 % de identidad de cada una de las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, y SEQ ID NO:12 están presentes en el mismo vector, opcionalmente

en donde: (i') los ácidos nucleicos están regulados por la misma secuencia reguladora; o

(ii') los ácidos nucleicos están regulados por diferentes secuencias reguladoras.

8. La composición para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde: (a) la condición cardíaca en el individuo hace que el individuo necesite renovación de cardiomiocitos; y/o (b) el corazón del individuo presenta apoptosis, necrosis, y/o autofagia de cardiomiocitos; y/o

(c) la condición cardíaca comprende enfermedad cardiovascular, cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, isquemia, necrosis, fibrosis, o cardiomiopatía diabética, cardiomiopatía relacionada con la edad; o (d) el individuo tiene distrofia muscular de Duchenne.

9. La composición para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde: (a) la composición se proporciona al individuo más de una vez; y/o

(b) la composición se proporciona al individuo (i) sistémicamente o (ii) localmente; y/o

(c) al individuo se le proporciona una terapia adicional para la condición cardíaca.

10. Un kit que comprende una composición para su uso de una cualquiera de la reivindicaciones anteriores, en donde la composición es almacenada en un recipiente adecuado.

11. Un shARN o siARN que se dirige a Salvador(Savl)para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva del shARN o siARN que se dirige a Salvador (Sav1).

12. El shARN o siARN para su uso en el método de la reivindicación 11, en donde el shARN o siARN se proporciona al individuo en un vector, opcionalmente un vector AAV9.

13. Un vector que comprende la composición de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el shARN o siARN de la reivindicación 11 o 12, en donde el vector es para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar al individuo una cantidad efectiva del vector, y opcionalmente en donde el vector es:

a) un vector viral;

b) un vector no viral; o

c) un vector no integrador, opcionalmente en donde el vector no integrador es un vector lentiviral.

14. Una composición farmacéutica que comprende la composición de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el shARN o siARN de la reivindicación 11 o 12, o el vector de la reivindicación 13, y un portador farmacéuticamente adecuado, en donde la composición farmacéutica es para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar al individuo una cantidad efectiva de la composición farmacéutica.

15. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 13, para su uso en un método para el tratamiento de un individuo con una condición cardíaca, que comprende el paso de proporcionar al individuo una cantidad efectiva de la célula huésped.