ES3055816T3 - Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2 - Google Patents

Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2

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ES3055816T3 ES18711427T ES18711427T ES3055816T3 ES 3055816 T3 ES3055816 T3 ES 3055816T3 ES 18711427 T ES18711427 T ES 18711427T ES 18711427 T ES18711427 T ES 18711427T ES 3055816 T3 ES3055816 T3 ES 3055816T3
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Maureen Magnay
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Catherine Prades
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Abstract

Se proporcionan moléculas de unión multiespecíficas (p. ej., biespecíficas) que comprenden un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a la laminina-2. Además, se proporcionan métodos para la elaboración de dichas moléculas de unión y sus usos para el tratamiento y/o la prevención de alfa-distroglicanopatías. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Moléculas de unión multiespecíficas que tienen especificidad por distroglicano y laminina-2
[0003] REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0004] Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. n.º de serie 62/460.663, presentada el 17 de febrero de 2017, y la solicitud EP n.º EP18305168.9, presentada el 16 de febrero de 2018.PRESENTACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS EN ARCHIVO DE TEXTO ASCII
[0005] El contenido de la siguiente presentación en archivo de texto ASCII es una forma legible por ordenador (CRF) del listado de secuencias (nombre del archivo: 183952028140SEQLIST.txt, fecha de registro: 16 de febrero de 2018, tamaño: 315 KB).
[0006] CAMPO
[0007] La divulgación se refiere a moléculas de unión multiespecíficas (por ejemplo, multiespecíficas y trivalentes, o biespecíficas y bivalentes o tetravalentes) que comprenden un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2. La divulgación también se refiere a métodos de preparación de dichas moléculas de unión y a usos de dichas moléculas de unión para tratar y/o prevenir alfa-distroglicanopatías.
[0008] ANTECEDENTES
[0009] La alfa-distroglicanopatía es un subgrupo de distrofia muscular congénita (DMC) caracterizada por una reducción o ausencia de O-glicosilación en el dominio similar a mucina en alfa-distroglicano (alfa-DG) (Muntoni, F. (2004) Acta. Myol. 23(2), 79-84; Toda, T. (2005) Rinsho Shinkeigaku 45(11), 932-934; Muntoni, F., et al. (2007) Acta. Myol. 26(3), 129-135; Hewitt, J. E. (2009). Biochim. Biophys. Acta. 1792(9), 853-861; Godfrey, C., et al. (2011) Curr. Opin. Genet. Dev.21(3), 278-285). La falta o hipoglicosilación del alfa-distroglicano conduce a la pérdida o disminución de la unión de sus ligandos, que incluyen laminina-2, agrina y perlecano en el músculo esquelético, neurexina en el cerebro y pikachurina en el ojo. El alfa-distroglicano es un componente de membrana periférica del complejo de distrofinaglicoproteína (DGC) (FIG. 1A) común a todos los músculos y el corazón (Matsumura, K., et al. (1993) Neuromuscul. Disord.3(5-6), 533-535). En estos tejidos, el complejo de DGC funciona para unir el citoesqueleto asociado a la actina filamentosa (F-actina) de la fibra muscular a través de la distrofina a la matriz extracelular (ECM, también llamada lámina basal) a través de la laminina-2 (FIG.1B).
[0010] En las alfa-distroglicanopatías, las mutaciones en al menos 18 genes identificados hasta la fecha están ligadas al procesamiento aberrante de O-glicosilación en alfa-DG y a la falta de unión a sus ligandos, lo que conduce a enfermedades. Véase, por ejemplo, Hara, Y., et al. (2011) N. Engl. J. Med.364(10), 939-946; Kim, D. S., et al. (2004) Neurology 62(6), 1009-1011; van Reeuwijk, J., et al. (2005) J. Med. Genet.42(12), 907-912; Murakami, T., et al. (2009) Brain Dev. 31(6), 465-468; Yanagisawa, A., et al. (2009) Eur. J. Med. Genet. 52(4), 201-206; Clement, E. M., et al. (2008) Arch. Neurol.65(1), 137-141; Endo, T., et al. (2010) Methods Enzymol. 479, 343-352; Saredi, S., et al. (2012) J. Neurol. Sci. 318(1-2), 45-50; Longman, C., et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12(21), 2853-2861; Lefeber, D. J., et al. (2009) Am. J. Hum. Genet. 85(1), 76-86; Barone, R., et al. (2012) Ann. Neurol.72(4), 550-558; Toda, T., et al. (2003) Congenit. Anom. (Kyoto) 43(2), 97-104; Toda, T. (2007). Rinsho Shinkeigaku 47(11), 743-748; Puckett, R. L., et al. (2009) Neuromuscul. Disord.19(5), 352-356; Toda, T. (2009). Rinsho Shinkeigaku 49(11), 859-862; Yamamoto, T., et al. (2010) Cent. Nerv. Syst. Agents. Med. Chem. 10(2), 169-179; Kanagawa, M., et al. (2016) Cell. Rep. 14(9), 2209-2223; Yoshida-Moriguchi, T., et al. (2013) Science 341(6148), 896-899). Estos genes incluyen, por ejemplo, muchas glicosiltransferasas, tales como LARGE, que codifica una xilosil- y glucuronil-transferasa dual responsable de añadir repeticiones de xilosa-ácido glucurónico a glicanos para facilitar la unión del ligando (Inamori, K., et al. (2012) Science 335(6064), 93-96; Longman, C., et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12(21), 2853-2861). La función biológica principal de las glicosiltransferasas en esta vía (por ejemplo, LARGE) es ensamblar adecuadamente la O-glicosilación en el dominio similar a mucina en alfa-DG, que es necesaria para la unión estrecha a la laminina-2 en la lámina basal de los músculos, agrina y perlecano en la unión neuromuscular, neurexina en el SNC y pikachurina en el ojo (Michele, D. E., et al. (2002) Nature 418(6896), 417-422; Muntoni, F., et al. (2002) Lancet 360(9343), 1419-1421). En ausencia de O-glicosilación adecuada debido a un defecto en cualquiera de los genes mencionados anteriormente, la unión de alfa-DG a laminina-2 en la matriz extracelular (ECM) se ve comprometida o se pierde (FIG.1C), causando una rotura del enlace mecánico que es necesaria para la integridad del sarcolema. Esto hace que los músculos sean propensos a una lesión inducida por contracción, lo que resulta en daño al sarcolema de la fibra muscular y consecuente distrofia muscular (Barresi, R. y Campbell. K. P. (2006) J. Cell. Sci.119, 199-207).
[0011] Debido a la heterogeneidad genética, las alfa-distroglicanopatías incluyen muchos subtipos de enfermedades que presentan manifestaciones clínicas diversas pero que se superponen desde distrofia muscular muy grave con el sistema nervioso central (SNC) y anomalías oculares hasta fenotipo distrófico muscular relativamente leve sin manifestación del SNC o problema ocular. No existe una correlación genética y fenotípica estricta entre diferentes subtipos de alfa-distroglicanopatías. Las mutaciones en un gen pueden causar diferentes subtipos de enfermedades con manifestaciones clínicas que se superponen, y las mutaciones en diferentes genes pueden conducir a la misma enfermedad o similar (Godfrey, C., et al. (2007) Brain 130, 2725-2735). Debido a esta heterogeneidad, las estrategias para tratar las alfa-distroglicanopatías individuales causadas por mutaciones en genes individuales no han sido atractivas para el desarrollo de fármacos debido a la baja rentabilidad.
[0012] El alfa-distroglicano y el beta-distroglicano están codificados por el mismo gen DAG1 y traducidos a partir de un único ARNm como una proteína transmembranaria de tipo 1 intacta, distroglicano. En su camino a la superficie celular, el distroglicano se escinde proteolíticamente para generar el beta-distroglicano de la proteína transmembranaria y el alfadistroglicano asociado no covalentemente (Holt, K. H., et al. (2000) FEBS Lett.468(1), 79-83). Teóricamente, el alfadistroglicano recombinante con O-glicosilación adecuada se ha propuesto como una terapia de reemplazo de proteínas para las alfa-distroglicanopatías. Sin embargo, el suministro sistémico de alfa-distroglicano recombinante indicó que esta proteína no alcanzó el espacio intersticial muscular para ser incorporado al sarcolema (Han, R., et al. (2009) PNAS 106(31), 12573-12579). Por lo tanto, se cree que utilizar alfa-distroglicano recombinante como terapia de reemplazo de proteínas para las alfa-distroglicanopatías es técnicamente impracticable. El documento de patente US 2003/224981 divulga que las enfermedades de distrofia muscular son causadas mediante mutaciones que afectan a la unión de las lamininas, incluyendo la laminina-2 a alfa-distroglicano. Los inventores reconocieron que las enfermedades de distrofia muscular pueden tratarse sobreexpresando en ratones una proteína artificial que sustituye la unión natural de laminina al distroglicano. Qiao C et al., PNAS, 2005, 102(34), 11999-12004, se refiere a una terapia génica somática usando vectores AAV como sistema de suministro génico para la mini-agrina, que mostró efecto terapéutico en ratones con inactivación de laminina-2. Vannoy CH et al.m American J Pathol, 2017, 187(2), 431-440 usa los mismos vectores mini-agrina de AAV en un tipo diferente de distroglicanopatía caracterizada por una glicosilación insuficiente de manosilo ligado a O del alfa-distroglicano.
[0013] Por lo tanto, existe la necesidad de moléculas terapéuticas para prevenir y/o tratar alfa-distroglicanopatías y sus patologías asociadas.
[0014] BREVE SUMARIO
[0015] Para satisfacer esta y otras necesidades, en el presente documento se proporcionan, entre otras cosas, moléculas de unión multiespecíficas y biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y agentes biológicos bifuncionales que pueden unirse a laminina-2 y distroglicano(s) simultáneamente. Cuando dicho anticuerpo multiespecífico/biespecífico o agente biológico bifuncional se administra a pacientes con alfa-distroglicanopatías, su unión concurrente a laminina-2 en la lámina basal y (alfa- o beta-)distroglicano en el sarcolema puede restaurar el enlace ausente (FIG. 1Dy1E). La presente divulgación demuestra que dicho enfoque puede mejorar los síntomas característicos de las alfadistroglicanopatías en un sistema modelo animalin vivo. En particular, se sabe que los anticuerpos tienen semivida en circulación prolongada (farmacocinética larga)in vivodebido a su unión al receptor Fc neonatal, que media en el reciclaje de anticuerpos. Por lo tanto, esta estrategia de anticuerpos multiespecíficos/biespecíficos (o como alternativa, estrategia biológica bifuncional) representa un enfoque terapéutico novedoso para tratar las alfa-distroglicanopatías. La molécula de unión multiespecífica comprende al menos un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y al menos un segundo dominio de unión que se une a laminina-2. La molécula de unión multiespecífica es una proteína de unión multiespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas.
[0016] La molécula de unión multiespecífica es una proteína de unión trivalente multiespecífica que comprende tres sitios de unión a antígeno. La divulgación proporciona una molécula de unión multiespecífica que comprende al menos un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y al menos un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión multiespecífica es una proteína de unión multiespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, en donde la proteína de unión comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:
[0017] V<L2>-L<1>-V<L1>-L<2>-C<L>[I]
[0018] y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
[0019] V<H1>-L<3>-V<H2>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
[0020] y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
[0021] V<H3>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
[0022] y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
[0023] V<L3>-C<L>[IV]
[0024] en donde:
[0025] V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0026] V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0027] V<L3>es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0028] V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0029] V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0030] V<H3>es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0031] C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0032] C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
[0033] C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
[0034] C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
[0035] bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
[0036] L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores aminoacídicos;
[0037] en donde el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par de cadena ligera-cadena pesada cruzada; y en donde V<H1>y V<L1>forman un sitio de unión a antígeno, en donde V<H2>y V<L2>forman un sitio de unión a antígeno, y en donde V<H3>y V<L3>forman un sitio de unión a antígeno para un total de tres sitios de unión a antígeno, y en donde los tres sitios de unión a antígeno comprenden al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano y al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2.
[0039] En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica comprende un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano y dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2. En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2 se unen a diferentes epítopos de laminina-2. En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2 se unen al mismo epítopo de laminina-2. En algunas realizaciones, V<H1>y V<L1>forman un primer sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, V<H2>y V<L2>forman un segundo sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, y V<H3>y V<L3>forman un tercer sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano.
[0041] En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano y un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano se unen a diferentes epítopos de la porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano se unen al mismo epítopo de la porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, V<H1>y V<L1>forman un primer sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano, V<H2>y V<L2>forman un segundo sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano, y V<H3>y V<L3>forman un tercer sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2.
[0043] En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a la porción extracelular de distroglicano con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM cuando se ensaya como parte de una proteína de unión multiespecífica. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a las porciones extracelulares de distroglicano humano y de ratón. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a beta-distroglicano. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290). En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291). En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a un polipéptido que comprende la secuencia
[0045]
[0048] En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a laminina-2 humana. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a laminina-2 humana con una constante de disociación en equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM cuando se ensaya como parte de una proteína de unión multiespecífica. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a laminina-2 de ratón y humana. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende un dominio 4 similar a laminina G (LG) de laminina-2, un dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2, o ambos. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende el dominio 4 similar a laminina G (LG) y el dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende la secuencia VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:300). En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende la secuencia Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:301). En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende el dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:292). En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:293).
[0050] En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:314; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:346; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:362. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 de AS30SS_Hu6 o AS30SS_Hu9 mostrada en la Tabla A2, D2 o I4; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 de AS30SS_Hu6 o AS30SS_Hu9 mostrada en la Tabla A2, D2 o I4. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de un dominio VH AS30SS_Hu6 o AS30SS_Hu9 mostrado en la Tabla D2 o I4; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de un dominio VL AS30SS_Hu6 o AS30SS_Hu9 mostrado en la Tabla D2 o I4.
[0051] En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 51-55 y 81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-60 y 96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-65 y 111-125; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 66-70 y 126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, 71-75, y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76-80 y 155-169. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:378; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:394. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:410; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:426. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:442; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:458. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:474; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:490. En algunas realizaciones, el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 de C3_Hu10, C3_HU11, C21_HU11 o C21_Hu21 mostradas en la Tabla A2, D2 o I4; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 de C3_Hu10, C3_HU11, C21_HU11, o C21_Hu2, mostradas en la Tabla A2, D2 o I4. En algunas realizaciones, el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de un dominio VH C3_Hu10, C3_HU11, C21_HU11 o C21_Hu21 mostrada en la Tabla D2 o I4; y el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de un dominio VL C3_Hu10, C3_HU11, C21_HU11 o C21_Hu21 mostrada en la Tabla D2 o I4.
[0053] En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:442 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:458; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:410 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:426; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:474 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:490; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384, y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320, y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:442 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:458; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:410 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:426; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448, y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384, y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320, y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:474 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:490; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330.
[0055] En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, L<1>y L<2>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534).
[0057] En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, el dominio C<H3>de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en donde el dominio C<H3>de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V. En algunas realizaciones, el dominio C<H3>de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V; y en donde el dominio C<H3>de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W. En algunas realizaciones, los dominios C<H3>de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos son dominios C<H3>de IgG1 o IgG4 humana, y en donde solo uno de los dominios C<H3>comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, los dominios C<H2>de la segunda y tercera cadena polipeptídica son dominios C<H2>de IgG1 o IgG4 humana que comprenden un residuo de asparagina en la posición 297, un residuo de asparagina en la posición 298, un residuo de alanina en la posición 299 y un residuo de serina o treonina en la posición 300, numeración según el índice EU. En algunas realizaciones, los dominios C<H2>de la segunda y tercera cadena polipeptídica son dominios C<H2>de IgG1 o IgG4 humana que comprenden un residuo de tirosina en la posición 252, un residuo de treonina en la posición 254 y un residuo de ácido glutámico en la posición 256, numeración según el índice EU.
[0059] En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:500, la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:498, la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:499, y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:501. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:504, la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:502, la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:503, y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:505. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:508, la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:506, la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:507, y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:509. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:512, la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:510, la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:511, y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:513. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:516, la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:514, la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:515, y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de SEQ ID NO:517. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende uno, dos, tres o cuatro polipéptidos de triAb 3407, 3423, 3429, 3437 o 3439, como se muestra en la Tabla I2 o I4.
[0061] En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende (a) una primera cadena pesada de anticuerpo que comprende un primer dominio variable de cadena pesada (VH) y una primera región Fc de una inmunoglobulina que comprende una primera región C<H3>, y una primera cadena ligera de anticuerpo que comprende un primer dominio variable de cadena ligera (VL), en donde los primeros dominios VH y VL forman un primer dominio de unión a antígeno que se une a una porción extracelular de distroglicano, y (b) una segunda cadena pesada de anticuerpo que comprende un segundo dominio variable de cadena pesada (VH) y una segunda región Fc de una inmunoglobulina que comprende una segunda región C<H3>, y una segunda cadena ligera de anticuerpo que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera (VL), en donde los segundos dominios VH y VL forman un segundo dominio de unión a antígeno que se une a laminina-2; en donde las secuencias de dichas primera y segunda regiones C<H3>son diferentes y son tales que la interacción heterodimérica entre dichas primera y segunda regiones C<H3>es más fuerte que cada una de las interacciones homodiméricas de dichas primera y segunda regiones C<H3>, y en donde dicha primera proteína homodimérica tiene un aminoácido distinto de Lys, Leu o Met en la posición 409 y dicha segunda proteína homodimérica tiene una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 366, 368, 370, 399, 405 y 407 y/o en donde las secuencias de dichas primera y segunda regiones C<H3>son tales que las constantes de disociación de las interacciones homodiméricas de cada una de las regiones C<H3>están entre 0,01 y 10 micromolar. En algunas realizaciones, la primera cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:518, en donde la segunda cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:519, en donde la primera cadena ligera de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:520, y en donde la segunda cadena ligera de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:521. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende uno, dos, tres o cuatro polipéptidos de AS30_Hu6 x C3_Hu10 Duobody, AS30_Hu6 x C21_Hu11 Duetmab, AS30_Hu6 x C3_Hu10 TBTI, AS30_Hu6 x C21_Hu11 TBTI, AS30_Hu9 x C3_Hu11 CODV o AS30_Hu9 x C21_Hu21 CODV, como se muestra en la Tabla I3 o I4.
[0063] En el presente documento se proporcionan además moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la Tabla G2 o I4. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporcionan células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras aisladas) que comprenden las moléculas de ácido nucleico o vectores de expresión de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporciona un sistema de vector que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena de polipéptido de una molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporciona una célula hospedadora (por ejemplo, una célula hospedadora aislada) que comprende el sistema de vector de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporciona un método de producción de una molécula de unión multiespecífica, comprendiendo el método: cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las realizaciones anteriores en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la molécula de unión multiespecífica; y aislar la molécula de unión multiespecífica de la célula hospedadora.
[0065] También se proporciona en el presente documento un uso de la molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las realizaciones anteriores para tratar o prevenir una alfa-distroglicanopatía en un individuo.
[0067] En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, el individuo tiene una expresión reducida de alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el alfa-distroglicano expresado en el individuo tiene O-glicosilación alterada o aberrante. En algunas realizaciones, el individuo tiene una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en: distroglicano (DAG1), proteína O-manosiltransferasa-1 (POMT1), proteína O-manosiltransferasa-2 (POMT2), subunidad 1 de la proteína O-manosa beta1,2-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT1), subunidad 2 de la proteína O-manosa beta1,4-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT2), xilosil- y glucuroniltransferasa 1 (LARGE1), xilosil- y glucuroniltransferasa 2 (LARGE2), subunidad 1 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM1), subunidad 2 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM2), subunidad 3 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM3), fukutina, proteína relacionada con la fukutina (FKRP), que contiene el dominio de la isopreno sintasa (ISPD), proteína O-manosa cinasa (POMK), beta-1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (B3GALNT2), beta-1,4-glucuroniltransferasa 1 (B4GAT1), dolicol cinasa (DOLK), proteína transmembranaria 5 (TMEM5) y GDP-manosa pirofosforilasa B (GMPPB). En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica se administra mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica se administra mediante inyección intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
[0069] En el presente documento se proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el individuo tiene una expresión reducida de alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el alfa-distroglicano expresado en el individuo tiene O-glicosilación alterada o aberrante. En algunas realizaciones, el individuo tiene una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en: distroglicano (DAG1), proteína O-manosiltransferasa-1 (POMT1), proteína O-manosiltransferasa-2 (POMT2), subunidad 1 de la proteína O-manosa beta1,2-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT1), subunidad 2 de la proteína O-manosa beta1,4-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT2), xilosil- y glucuroniltransferasa 1 (LARGE1), xilosil- y glucuroniltransferasa 2 (LARGE2), subunidad 1 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM1), subunidad 2 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM2), subunidad 3 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM3), fukutina, proteína relacionada con la fukutina (FKRP), que contiene el dominio de la isopreno sintasa (ISPD), proteína O-manosa cinasa (POMK), beta-1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (B3GALNT2), beta-1,4-glucuroniltransferasa 1 (B4GAT1), dolicol cinasa (DOLK), proteína transmembranaria 5 (TMEM5) y GDP-manosa pirofosforilasa B (GMPPB). En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
[0071] En el presente documento se proporciona además un anticuerpo que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y (b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188; y el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de un dominio de unión mostrado en la Tabla A2, D2 o I4, o una secuencia de dominio VH y/o VL de un dominio de unión mostrado en la Tabla D2 o I4 o codificado por una secuencia de polinucleótidos mostrada en la Tabla G2.
[0073] En el presente documento se proporciona además un anticuerpo que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y (b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330; o el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:346 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 362. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de un dominio de unión mostrado en la Tabla A2, D2 o I4, o una secuencia de dominio VH y/o VL de un dominio de unión mostrado en la Tabla D2 o I4 o codificado por una secuencia de polinucleótidos mostrada en la Tabla G2.
[0075] En el presente documento se proporciona además un anticuerpo que se une a laminina-2, en donde el anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 51-55 y 81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-60 y 96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-65 y 111-125; y (b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 66-70 y 126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, 71-75 y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76-80 y 155-169. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228; y el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de un dominio de unión mostrado en la Tabla A2, D2 o I4, o una secuencia de dominio VH y/o VL de un dominio de unión mostrado en la Tabla D2 o I4 o codificado por una secuencia de polinucleótidos mostrada en la Tabla G2.
[0076] En el presente documento se proporciona además un anticuerpo que se une a laminina-2, en donde el anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; (b) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; (c) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; o (d) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464. En algunas realizaciones, (a) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:378 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:394; (b) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:410 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:426; (c) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:442 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:458; o (d) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:474 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:490. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de un dominio de unión mostrado en la Tabla A2, D2 o I4, o una secuencia de dominio VH y/o VL de un dominio de unión mostrado en la Tabla D2 o I4 o codificado por una secuencia de polinucleótidos mostrada en la Tabla G2.
[0078] En el presente documento se proporcionan además moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporcionan células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras aisladas) que comprenden las moléculas de ácido nucleico o vectores de expresión de una cualquiera de las realizaciones anteriores. También se proporciona un método de producción de un anticuerpo, comprendiendo el método: cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las realizaciones anteriores en condiciones tales que la célula hospedadora expresa el anticuerpo; y aislar el anticuerpo de la célula hospedadora.
[0079] La molécula de unión biespecífica comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2. La molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas.
[0080] La molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica, bivalente o tetravalente que comprende dos o cuatro sitios de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la proteína de unión biespecífica comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V<H1>) y un primer dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V<L1>), y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V<H2>) y un segundo dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V<L2>). En algunas realizaciones, el dominio V<H1>comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla A y/o el dominio V<L1>comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla A. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla B o la Tabla C y/o el dominio V<L2>comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla B o la Tabla C.
[0081] Por lo tanto, la divulgación proporciona una molécula de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, en donde la molécula de unión biespecífica comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman cuatro sitios de unión a antígeno, en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0082] V<L1>-L<1>-V<L2>-L<2>-C<L>[I]
[0083] y dos cadenas polipeptídicas comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0084] V<H2>-L<3>-V<H1>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
[0085] en donde:
[0086] V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0087] V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0088] V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0089] V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0090] C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0091] C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
[0092] C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
[0093] C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
[0094] bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
[0095] L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores aminoacídicos; en donde los dominios V<H1>y V<L1>forman un par de unión V<H1>/V<L1>, y en donde los dominios V<H2>y V<L2>forman un par de unión V<H2>/V<L2>.
[0096] En algunas realizaciones, los dominios V<H1>y V<L1>se cruzan para formar el par de unión V<H1>/V<L1>. En algunas realizaciones, los dominios V<H2>y V<L2>se cruzan para formar el par de unión V<H2>/V<L2>. En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son cada uno de 0 a 50 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son cada uno de 0 a 25 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son cada uno de 0 a 14 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 5 residuos aminoacídicos de longitud y L<4>es 5 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>es 14 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 2 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 14 residuos aminoacídicos de longitud, y L<4>es 2 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<3>comprenden cada uno la secuencia EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296), y en donde L<2>y L<4>comprenden cada uno la secuencia GG. En algunas realizaciones, L<1>es 7 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 1 residuo aminoacídico de longitud, y L<4>es 2 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GQPKAAP (SEQ ID NO:297); L<2>comprende la secuencia TKGPS (SEQ ID NO:298); L<3>comprende un residuo de serina; y L<4>comprende la secuencia RT. En algunas realizaciones, L<1>es 10 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 10 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 0 residuos aminoacídicos de longitud y L<4>es 0 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<2>comprenden cada uno la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299). En algunas realizaciones, uno o ambos de los dominios variables de los polipéptidos de fórmula I y/o fórmula II son dominios variables humanos, humanizados o de ratón.
[0097] La divulgación también proporciona una molécula de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, en donde la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas ligeras que comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0099] V<L1>-L<5>-V<L2>-L<6>-C<L>[III]
[0101] y dos cadenas pesadas que comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0103] V<H1>-L<7>-V<H2>-L<8>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[IV]
[0105] en donde:
[0106] V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0107] V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0108] V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0109] V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0110] C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0111] C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
[0112] C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
[0113] C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
[0114] bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
[0115] L<5>, L<6>, L<7>y L<8>son conectores aminoacídicos; en donde los dominios V<H1>y V<L1>forman un par de unión V<H1>/V<L1>, y en donde los dominios V<H2>y V<L2>forman un par de unión V<H2>/V<L2>.
[0117] En algunas realizaciones, L<5>, L<6>, L<7>y L<8>son cada uno de 0 a 50 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<5>, L<6>, L<7>y L<8>son cada uno de 0 a 25 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<5>, L<6>, L<7>y L<8>son cada uno de 0 a 14 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, los conectores L<5>y L<7>comprenden la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:294), y en donde los conectores L<6>y L<8>tienen cada uno 0 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, uno o ambos de los dominios variables de los polipéptidos de fórmula III y/o fórmula IV son dominios variables humanos, humanizados o de ratón.
[0118] En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a la porción extracelular de distroglicano, y en donde el par de unión V<H2>/V<L2>se une a laminina-2. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/ V<L1>se une a la porción extracelular del distroglicano humano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/ V<L1>se une a la porción extracelular de distroglicano humano con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a las porciones extracelulares de distroglicano humano y de ratón. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a betadistroglicano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290). En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291). En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une al alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a la laminina-2 humana. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a la laminina-2 humana con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a laminina-2 humana y de ratón. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende un dominio 4 similar a laminina G (LG) de laminina-2, un dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2, o ambos. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende el dominio 4 similar a laminina G (LG) y el dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende la secuencia VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:300). En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende la secuencia Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:301). En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende el dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:292). En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:293).
[0120] En algunas realizaciones, el dominio V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y/o en donde el dominio V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones, el dominio V<H1>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188. En algunas realizaciones, el dominio V<L1>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el dominio V<H1>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246 y 248. En algunas realizaciones, el dominio V<L1>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247 y 249. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:51-55 y 81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-60 y 96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-65 y 111-125; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 66-70 y 126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, 71-75, y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76-80 y 155-169. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 y 288. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287 y 289.
[0122] En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a laminina-2, y en donde el par de unión V<H2>/V<L2>se une a la porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/ V<L2>se une a la porción extracelular del distroglicano humano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/ V<L2>se une a la porción extracelular de distroglicano humano con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a las porciones extracelulares de distroglicano humano y de ratón. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a betadistroglicano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290). En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291). En algunas realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une al alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a la laminina-2 humana. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a la laminina-2 humana con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a laminina-2 humana y de ratón. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende un dominio 4 similar a laminina G (LG) de laminina-2, un dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2, o ambos. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende el dominio 4 similar a laminina G (LG) y el dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende la secuencia VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:300). En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende la secuencia Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:301). En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende el dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2. En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:292). En algunas realizaciones, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:293).
[0124] En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246 y 248. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247 y 249. En algunas realizaciones, el dominio V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:51-55 y 81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-60 y 96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-65 y 111-125; y/o en donde el dominio V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 66-70 y 126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, 71-75, y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76-80 y 155-169. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 y 288. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287 y 289.
[0126] En una realización, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, la divulgación proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, la divulgación proporciona una célula hospedadora aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores o que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, la divulgación proporciona un sistema de vector que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena de polipéptidos de una molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, la divulgación proporciona un sistema de vector que comprende uno o más vectores que codifican dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de una molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, la divulgación proporciona una célula hospedadora aislada que comprende el sistema de vector según una cualquiera de las realizaciones anteriores.
[0128] En una realización, la divulgación proporciona un método de producción de una molécula de unión biespecífica, comprendiendo el método: a) cultivar una célula hospedadora según una cualquiera de las realizaciones anteriores en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la molécula de unión biespecífica; y b) aislar la molécula de unión biespecífica de la célula hospedadora. En una realización, la divulgación proporciona un método de producción de una proteína de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, comprendiendo el método: a) cultivar una primera célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende el primer dominio de unión en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la primera cadena polipeptídica como parte de una primera proteína de unión monoespecífica con un primer dominio CH3; b) cultivar una segunda célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende las condiciones del segundo dominio de unión de modo que la célula hospedadora expresa la segunda cadena polipeptídica como parte de una segunda proteína de unión monoespecífica con un segundo dominio CH3; c) aislar la primera proteína de unión monoespecífica de la primera célula hospedadora; d) aislar la segunda proteína de unión monoespecífica de la segunda célula hospedadora; e) incubar las primera y segunda proteínas de unión monoespecíficas aisladas en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas en la región bisagra experimenten isomerización de enlaces disulfuro; y f) obtener la proteína de unión biespecífica, en donde el primer y segundo dominios CH3 son diferentes y son tales que la interacción heterodimérica entre dichos primer y segundo dominios CH3 es más fuerte que cada una de las interacciones homodiméricas de dichos primer y segundo dominios CH3.
[0130] En una realización, la divulgación proporciona la molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar o prevenir una alfa-distroglicanopatía en un individuo. En algunas realizaciones, el individuo tiene una expresión reducida de alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el alfa-distroglicano expresado en el individuo tiene O-glicosilación alterada o aberrante. En algunas realizaciones, el individuo tiene una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en: distroglicano (DAG1), proteína O-manosiltransferasa-1 (POMT1), proteína O-manosiltransferasa-2 (POMT2), subunidad 1 de la proteína O-manosa beta1,2-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT1), subunidad 2 de la proteína O-manosa beta1,4-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT2), xilosil- y glucuroniltransferasa 1 (LARGE1), xilosil- y glucuroniltransferasa 2 (LARGE2), subunidad 1 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM1), subunidad 2 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM2), subunidad 3 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM3), fukutina, proteína relacionada con la fukutina (FKRP), que contiene el dominio de la isopreno sintasa (ISPD), proteína O-manosa cinasa (POMK), beta-1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (B3GALNT2), beta-1,4-glucuroniltransferasa 1 (B4GAT1), dolicol cinasa (DOLK), proteína transmembranaria 5 (TMEM5) y GDP-manosa pirofosforilasa B (GMPPB). En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica se administra mediante infusión intravenosa. En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica se administra mediante inyección intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
[0132] En una realización, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión biespecífica según una cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el individuo tiene una expresión reducida de alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, el alfa-distroglicano expresado en el individuo tiene O-glicosilación alterada o aberrante. En algunas realizaciones, el individuo tiene una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en: distroglicano (DAG1), proteína O-manosiltransferasa-1 (POMT1), proteína O-manosiltransferasa-2 (POMT2), subunidad 1 de la proteína O-manosa beta1,2-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT1), subunidad 2 de la proteína O-manosa beta1,4-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT2), xilosil- y glucuroniltransferasa 1 (LARGE1), xilosil- y glucuroniltransferasa 2 (LARGE2), subunidad 1 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM1), subunidad 2 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM2), subunidad 3 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM3), fukutina, proteína relacionada con la fukutina (FKRP), que contiene el dominio de la isopreno sintasa (ISPD), proteína O-manosa cinasa (POMK), beta-1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (B3GALNT2), beta-1,4-glucuroniltransferasa 1 (B4GAT1), dolicol cinasa (DOLK), proteína transmembranaria 5 (TMEM5) y GDP-manosa pirofosforilasa B (GMPPB). En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
[0134] Las realizaciones específicas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones y las reivindicaciones.
[0136] Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para un experto en la materia.
[0138] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0140] LasFIG. 1Ay1Bmuestran las interacciones y funciones de proteínas normales del complejo de glicoproteínas asociado a distrofina. Los glicanos ligados a O en el dominio similar a mucina de alfa-distroglicano sirven como receptores para varios ligandos, incluyendo laminina-2 en los músculos. LaFIG. 1Amuestra el complejo de glicoproteínas asociado a distrofina, donde el distroglicano está O-glicosilado normalmente. LaFIG. 1Bmuestra la laminina-2 en la lámina basal que interactúa con el alfa-distroglicano O-glicosilado. El beta-distroglicano interactúa con la distrofina, que a su vez se asocia con la actina filamentosa dentro de la membrana celular.
[0141] LaFIG. 1Cmuestra la etiología de la alfa-distroglicanopatía. En ausencia de glicosilación ligada a O en alfadistroglicano, se pierde la unión de laminina-2 y alfa-distroglicano, lo que resulta en el desprendimiento de la lámina basal del sarcolema muscular y conduce a daño en la membrana durante el ejercicio y la distrofia muscular.
[0142] LasFIG. 1Dy1Emuestran la estrategia de emplear anticuerpos multiespecíficos o biespecíficos para tratar la alfadistroglicanopatía. Los anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos reconocen específicamente y se unen a la laminina-2 con uno o más brazos y alfa-distroglicano (FIG. 1D) o beta-distroglicano (FIG. 1E) con uno o más brazos diferentes, restaurando así el enlace entre la laminina-2 y el distroglicano para tratar las alfa-distroglicanopatías. LaFIG. 2Amuestra una alineación de secuencias de dominios globulares (LG)-4/5 de laminina humana y de ratón. Las secuencias de proteínas de LG-5 humana y de ratón tienen una homología significativa, con un 88 % de identidad.
[0143] Se usaron las secuencias en recuadro en las subunidades alfa-2 de laminina-2 humana y murina para la expresión de proteínas y la generación de anticuerpos. Se muestran SEQ ID NO: 305 (superior) y 300 (inferior). LaFIG.2Bmuestra una alineación de secuencias de dominios extracelulares de beta-distroglicano (DG) humano y de ratón. Las secuencias de proteínas de los dominios extracelulares beta-DG humano y de ratón tienen un homólogo con un 88,4 % de identidad. Se usaron las secuencias en recuadro en beta-DG humanas y murinas para la expresión de proteínas y la generación de anticuerpos. Se muestran SEQ ID NO: 303 (superior) y 304 (inferior).
[0144] LasFIG. 3Ay3Bmuestran datos del ensayo cinético de resonancia de plasmones superficiales (Biacore; GE Healthcare) del anticuerpo anti-laminina-2 derivado del clon de hibridoma C21 que se une a LG-4/5 humana (FIG.3A) y de ratón (FIG.3B).
[0145] LaFIG.3Cmuestra el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) del anticuerpo anti-laminina-2 derivado del clon de hibridoma C21 que se une a LG-4/5 humana y de ratón expresada en células HEK293.
[0146] LaFIG.3Dmuestra una inmunotransferencia por puntos con diversas cantidades de laminina-2 humana recombinante, LG-5 murina (mLG5), LG-5 humana (hLG5) y LG-4/5 humana (hLG4/LG5) aplicadas sobre nitrocelulosa, luego sondeadas con anticuerpo anti-laminina-2 derivado del clon de hibridoma C21. La cantidad de laminina-2 en el lisado celular C2C12 estaba por debajo del límite de detección.
[0147] LasFIG. 3Ey3Fmuestran datos del ensayo cinético de resonancia de plasmones superficiales (Biacore; GE Healthcare) del anticuerpo anti-laminina-2 derivado del clon de hibridoma C3 que se une a LG-4/5 humana (FIG. 3F) y de ratón (FIG.3G).
[0148] LaFIG.3Gmuestra el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) del anticuerpo anti-laminina-2 derivado del clon de hibridoma C3 que se une a LG-4/5 humana y de ratón expresada en células HEK293.
[0149] LaFIG.3Hmuestra una inmunotransferencia por puntos con diversas cantidades de laminina-2 humana recombinante (Hu 211), LG-5 murina (mLG5), LG-5 humana (hLG5) y LG-4/5 humana (hLG4/LG5) aplicadas sobre nitrocelulosa, luego sondeadas con anticuerpo anti-laminina-2 derivado del clon de hibridoma C3. La cantidad de laminina-2 en el lisado celular C2C12 estaba por debajo del límite de detección.
[0150] LasFIG.3Iy3Jmuestran datos del ensayo cinético de resonancia de plasmones superficiales (Biacore; GE Healthcare) del anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS30 que se une a beta-DG humana (FIG. 3I) y de ratón (FIG.3J).
[0151] LaFIG. 3Kmuestra una inmunotransferencia por puntos con diversas cantidades de ECD de beta-DG murino recombinante (m βDG), ECD de beta-DG humano (Hu βDG) o distroglicano recombinante (rhDG) aplicado sobre nitrocelulosa, luego sondeado con anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS30. La cantidad de βDG en el lisado celular C2C12 y el lisado de células del músculo tibial anterior (lisado de TA) estaban por debajo del límite de detección. Se usó Fabrazyme (agalsidasa beta, Genzyme) como control negativo.
[0152] LaFIG. 3Lmuestra una transferencia Western de muestras generadas mediante inmunoprecipitación de beta-DG a partir de lisados celulares C2C12 usando anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS30. El primer carril muestra el control positivo, el segundo carril muestra la muestra de inmunoprecipitación sondeada con el anticuerpo anti-beta-DG derivado de un clon de presentación en fagos B06 (que tiene baja afinidad por βDG y, por lo tanto, una captura mínima de βDG y alfa-DG), y el tercer carril muestra la muestra de inmunoprecipitación sondeada con el anticuerpo anti-beta-DG de alta afinidad derivado del clon de hibridoma AS30 (donde se inmunoprecipitaron abundantes βDG y alfa-DG).
[0153] LasFIG. 3My3Nmuestran datos del ensayo cinético de resonancia de plasmones superficiales (Biacore; GE Healthcare) del anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS19 que se une a beta-DG humano (FIG.
[0154] 3M) y de ratón (FIG.3N).
[0155] LaFIG. 3Omuestra una inmunotransferencia por puntos con diversas cantidades de ECD de beta-DG murino recombinante, ECD de beta-DG humano o distroglicano recombinante aplicado sobre nitrocelulosa, luego sondeado con anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS19. Lisado celular C2C12, lisado de células del músculo tibial anterior (lisado de TA). Se usó Fabrazyme (agalsidasa beta, Genzyme) como control negativo.
[0156] LaFIG. 3Pmuestra una transferencia Western de muestras generadas mediante inmunoprecipitación de beta-DG a partir de lisados celulares C2C12 usando anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS19. El primer carril muestra el control positivo, el segundo carril muestra la muestra de inmunoprecipitación sondeada con el anticuerpo anti-beta-DG derivado de clon de presentación en fagos B06 (que tiene baja afinidad por βDG y, por lo tanto, una captura mínima de βDG y alfa-DG), y el tercer carril muestra la muestra de inmunoprecipitación sondeada con el anticuerpo anti-beta-DG derivado del clon de hibridoma AS19.
[0157] LasFIG. 4Ay4Bmuestran secciones de tejido muscular humano y de ratón congeladas no fijadas teñidas con anticuerpo anti-laminina-2 derivado de clones de hibridoma C21 (FIG. 4A) y C3 (FIG. 4B), luego detectados con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia. El anticuerpo secundario solo no reveló ninguna tinción (no mostrada).
[0158] LasFIG. 4Cy4Dmuestran secciones de tejido muscular humano y de ratón congeladas no fijadas teñidas con anticuerpo anti-beta-DG derivado de clones de hibridoma AS30 (FIG. 4C) y AS19 (FIG. 4D), luego detectados con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia. El anticuerpo secundario solo no reveló ninguna tinción (no mostrada).
[0159] LaFIG. 5Amuestra un diseño esquemático para anticuerpos de formato IgG en tándem biespecíficos tetravalentes (anticuerpos TBTI) que son específicos para beta-DG y laminina-2, según algunas realizaciones.
[0160] LaFIG. 5Bmuestra un diseño esquemático para anticuerpos biespecíficos de formato IgG de dominio variable dual (CODV) cruzados que son específicos para beta-DG y laminina-2, según algunas realizaciones.
[0161] LasFIG. 6Ay6Bmuestran datos del análisis de unión de resonancia de plasmones superficiales secuenciales (Biacore; GE Healthcare) para anticuerpos monoclonales progenitores (AS19, C3 y C21) y anticuerpos biespecíficos (T1T2, C5C6 y T5T6) para LG-4/5 humana y beta-DG humano (FIG.6A) o para LG-4/5 murina y beta-DG murino (FIG.
[0162] 6B).
[0163] LaFIG.7muestra los resultados del ELISA tipo sándwich de doble cubierta para la unión simultánea de LG-4/5 y beta-DG a anticuerpos biespecíficos. Se ensayaron anticuerpos monoclonales progenitores (AS19, C3 y C21) con beta-DG añadido y anticuerpos biespecíficos (T1T2, C5C6 o T5T6) con o sin beta-DG añadido para determinar la unión. Solo los anticuerpos biespecíficos T1T2, T5T6 y C5C6 mostraron una unión significativa a LG-4/5 y beta-DG simultáneamente.
[0164] LasFIG. 8Ay8Bmuestran secciones congeladas no fijadas de tejido muscular murino natural (FIG. 8A) o tejido muscular murino de LARGE<myd-3J/GrsrJ>(FIG.8B) teñido con anticuerpos monoclonales progenitores (AS19, C3 y C21) o anticuerpos biespecíficos (T1T2, C5C6 o T5T6) y detectado con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia.
[0165] LaFIG. 8Cdescribe el plan de estudio de inyección intramuscular biespecífico para probar el efecto de anticuerpos biespecíficos sobre el daño muscular inducido por el ejercicio. Se inyectaron anticuerpos biespecíficos por vía intramuscular en los músculos anteriores tibiales (TA) de ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>el día 1 y el día 4 del experimento. Se inyectó tinte azul Evans (EB) el día 5 para rastrear el daño de la fibra muscular. Los ratones se sometieron a ejercicios forzados en la cinta de correr y se sacrificaron el día 6.
[0166] LaFIG.8Dmuestra el número promedio de fibras musculares positivas para el azul Evans (es decir, dañadas) para el tratamiento con el anticuerpo biespecífico T1T2 frente a una mezcla de anticuerpos monoclonales progenitores (AS19 y C3). Se observó menos daño con el tratamiento con anticuerpos biespecíficos que con el tratamiento con anticuerpos parentales de control.
[0167] LaFIG. 8Emuestra tejido muscular teñido de ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>que se trataron con anticuerpo biespecífico T1T2 o una mezcla de anticuerpos monoclonales progenitores (AS19 y C3). La tinción con colorante azul Evans (flechas) es mucho más marcada en el tejido tratado con anticuerpos monoclonales progenitores que con el anticuerpo biespecífico T1T2. Se muestra la tinción del anticuerpo biespecífico T1T2 o una mezcla de anticuerpos monoclonales progenitores (AS19 y C3) usando un anticuerpo secundario fluorescente.
[0168] LaFIG. 8Fmuestra la farmacocinética y biodistribución del anticuerpo biespecífico T1T2 (administrado ya sea mediante inyección en la vena de la cola o intraperitoneal) y de anticuerpos parentales derivados de los clones de hibridoma AS19 o C3 después del suministro sistémico. Los anticuerpos biespecíficos todavía son detectables en la sangre 4 días después de la administración.
[0169] LasFIG. 9Aa9Cmuestran pruebas de comportamiento de ratones naturales (triángulos apuntando hacia abajo), ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpos progenitores monoclonales de control (triángulos apuntando hacia arriba) y ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpos biespecíficos (cuadrados).
[0170] LaFIG. 9Amuestra que los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpo biespecífico mostraron una mejora en la prueba de fuerza de agarre en comparación con los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>no tratados. LaFIG.9Bmuestra que los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpo biespecífico mostraron una mejora en la prueba de suspensión en alambre en comparación con los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>no tratados. LaFIG. 9Cmuestra que los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpo biespecífico mostraron una mejora en la prueba del tiempo corriendo con respecto a los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>no tratados.
[0171] LaFIG.9Dmuestra que los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpos biespecíficos tienen niveles de creatina cinasa disminuidos en comparación con los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>no tratados, lo que sugiere menos daño muscular. LaFIG.10muestra el número promedio de fibras musculares positivas para el azul Evans (es decir, dañadas) en tejido de ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con el anticuerpo biespecífico T1T2 (grupo 1 T1T2) frente a una mezcla de anticuerpos monoclonales parentales AS19 y C3 (control del grupo 2). Se utilizaron ratones no tratados naturales (grupo 3 WT) como control. Se observó menos daño con el tratamiento con anticuerpo biespecífico T1T2 que con el tratamiento con anticuerpos parentales de control en ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>.
[0172] LaFIG. 11muestra la tinción por inmunofluorescencia de tejidos de ratón LARGE<myd-3J/GrsrJ>4 días después de la inyección con el anticuerpo biespecífico T1T2, el anticuerpo monoclonal precursor AS19 o C3, o PBS como control negativo. Los portaobjetos se lavaron y montaron usando medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Labs). IV: inyección intravenosa; IP: inyección intraperitoneal.
[0173] LaFIG.12Amuestra la estructura global del Fab AS30 unido al antígeno beta-DG humano, mostrándose el antígeno entre la cadena pesada y la cadena ligera. LaFIG. 12Bmuestra una vista de cerca de la interacción entre las CDR del Fab AS30 y el beta-DG del antígeno. Los residuos implicados en la interacción se muestran como barras; las flechas en las CDR indican orientación desde el extremo N al extremo C.
[0174] LaFIG. 12Cmuestra la estructura global del Fab C21 unido al dominio LG-5 de laminina-2 humana del antígeno, mostrándose el antígeno entre la cadena pesada y la cadena ligera.
[0175] LaFIG.12Dmuestra una vista de cerca de la interacción entre las CDR del Fab C21 y el dominio LG-5 de laminina-2 del antígeno. Los residuos implicados en la interacción se muestran como barras; las flechas en las CDR indican orientación desde el extremo N al extremo C.
[0176] LaFIG.13muestra una representación esquemática de una proteína de unión trivalente (triAb) que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno para unirse a laminina-2 o beta-DG, según algunas realizaciones.
[0177] LasFIG. 14A y 14Bmuestran los resultados de ensayos ELISA tipo sándwich de unión dual que examinan la unión de triAb a LG4/5 o beta-DG humano. En laFIG. 14A,las placas se recubrieron con N'Avi-HPC4-LG4/5 humana biotinilado y se detectó la unión a beta-DG humano. En laFIG.14B,las placas se recubrieron con beta-DG humano-HPC4-Avi-C', y se detectó la unión a LG4/5 humana.
[0178] LaFIG.14Cmuestra la unión secuencial de triAb 3407, 3437 o 3439 a LG4/5 humana, después beta-DG humano. Por el contrario, los anticuerpos anti-LG4/5 monovalentes C3_HU11, C21_HU11, C21_Hu21 y C3_Hu10 solo se unieron a LG4/5, mientras que el anticuerpo anti-beta-DG monovalente AS30_Hu6 solo se unió a beta-DG, y triAb de control negativo no mostró unión.
[0179] LaFIG. 15muestra los efectos del tratamiento con triAb 3407, 3437 o 3439 sobre la función muscular en ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>usando un ensayo de resistencia al agarre. La administración con los triAb indicados se comparó con la administración de solución salina o triAb de control negativo. También se midió el rendimiento de ratones naturales en el ensayo.
[0180] LaFIG. 16muestra los efectos del tratamiento con triAb 3407, 3437 o 3439 sobre la función muscular en ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>usando un ensayo de suspensión en alambre. La administración con los triAb indicados se comparó con la administración de solución salina o triAb de control negativo. También se midió el rendimiento de ratones naturales en el ensayo.
[0181] LaFIG. 17muestra los efectos del tratamiento con triAb 3407, 3437 o 3439 sobre la función muscular en ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>usando un ensayo de cinta de correr. La administración con los triAb indicados se comparó con la administración de solución salina o triAb de control negativo. También se midió el rendimiento de ratones naturales en el ensayo.
[0182] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0183] La presente divulgación proporciona moléculas de unión multiespecíficas y biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, las moléculas de unión son biespecíficas y comprenden un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, las moléculas de unión son multiespecíficas y comprenden un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano, un segundo dominio de unión que se une a laminina-2 y uno o más dominios de unión adicionales que se unen a una o más dianas adicionales. La presente divulgación proporciona múltiples configuraciones de moléculas de unión multiespecíficas/biespecíficas que son capaces de unirse al distroglicano y a la laminina-2 simultáneamente y mejorar los síntomas de la alfa-distroglicanopatía en un sistema modelo in vivo.
[0184] La siguiente descripción expone métodos, parámetros y similares a modo de ejemplo.
[0185] Definiciones
[0186] Como se utiliza según la presente divulgación, se debe entender que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados. A menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán las pluralidades, y los términos plurales incluirán el singular.
[0187] El término "antígeno" o "antígeno diana" o "diana de antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o una porción de una molécula que es capaz de ser unida por una proteína de unión, y adicionalmente es capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos. Con respecto a cada antígeno diana reconocido por una proteína de unión, la proteína de unión es capaz de competir con un anticuerpo intacto que reconoce el antígeno diana. Los antígenos diana a modo de ejemplo descritos en el presente documento incluyen distroglicano (por ejemplo, una porción extracelular del mismo) y laminina-2.
[0188] El término "epítopo" incluye cualquier determinante, por ejemplo un determinante de polipéptido, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. En determinadas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo o proteína de unión. En determinadas realizaciones, se dice que una proteína de unión se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En algunas realizaciones, una proteína de unión se dice que se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio es ≤ 10<-6>M, por ejemplo cuando la constante de disociación en equilibrio es ≤ 10<-9>M, y, por ejemplo, cuando la constante de disociación es ≤ 10<-10>M. La constante de disociación (K<D>) de una proteína de unión puede determinarse, por ejemplo, por resonancia de plasmones superficiales. En general, el análisis por resonancia de plasmones superficiales mide interacciones de unión en tiempo real entre ligando (un antígeno diana en una matriz biosensora) y analito (una proteína de unión en disolución) por resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). El análisis de plasmones superficiales también puede realizarse inmovilizando el analito (proteína de unión en una matriz de biosensor) y presentando el ligando (antígeno diana). El término "K<D>", como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de la interacción entre una proteína de unión particular y un antígeno diana.
[0189] El término "se une específicamente a", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una proteína de unión o un fragmento de unión al antígeno de la misma para unirse a un antígeno que contiene un epítopo con una K<D>de al menos aproximadamente 1 × 10<-6>M, 1 × 10<-7>M, 1 × 10<-1>M, 1 × 10<-9>M, 1 × 10<-10>M, 1 × 10<-11>M, 1 × 10<-12>M, o más, y/o para unirse a un epítopo con una afinidad que es al menos dos veces superior a su afinidad por un antígeno no específico.
[0190] La expresión "proteína de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que no es de origen natural (o es recombinante o está manipulada) que se une específicamente a al menos un antígeno diana. La expresión "proteína de unión monoespecífica" se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a una diana antigénica.
[0191] La expresión "proteína de unión monovalente" se refiere a una proteína de unión que tiene un sitio de unión a antígeno. La expresión "proteína de unión biespecífica" se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a dos dianas antigénicas diferentes. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es normalmente un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/cadena ligera diferentes y dos sitios de unión o epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una diversidad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos F(ab').
[0192] La expresión "proteína de unión bivalente" se refiere a una proteína de unión que tiene dos sitios de unión o dominios. El término "polinucleótido", como se usa en este documento, se refiere a polímeros de ácido nucleico monocatenarios o bicatenarios de al menos 10 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido puede ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases, tales como bromuridina, modificaciones de ribosa, tales como arabinósido y 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones de enlaces internucleotídicos, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El término "polinucleótido" incluye específicamente formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.
[0193] Un "polinucleótido aislado" es un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que: (1) no se asocia a todo o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) se une a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
[0194] Un "polipéptido aislado" es uno que: (1) está libre de al menos algunos otros polipéptidos con los que se encontraría normalmente, (2) está esencialmente libre de otros polipéptidos de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente un 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales con los que está asociado en la naturaleza, (5) no está asociado (por interacción covalente o no covalente) con partes de un polipéptido con las que el "polipéptido aislado" está asociado en la naturaleza, (6) está asociado de forma funcional (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza, o (7) no se produce en la naturaleza. Dicho polipéptido aislado puede estar codificado por ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. Preferentemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación o de otro modo).
[0195] Los anticuerpos de origen natural comprenden normalmente un tetrámero. Cada uno de dicho tetrámero está compuesto normalmente por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" de longitud completa (que tiene normalmente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (que tiene normalmente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las expresiones "cadena pesada" y "cadena ligera", como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tiene secuencia del dominio variable suficiente para conferir especificidad por un antígeno diana. La parte aminoterminal de cada cadena ligera y pesada incluye normalmente un dominio variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que normalmente es responsable del reconocimiento de antígeno. La parte carboxiterminal de cada cadena define normalmente un dominio constante responsable de la función efectora. Por tanto, en un anticuerpo de origen natural, un polipéptido de inmunoglobulina de la cadena pesada de longitud completa incluye un dominio variable (V<H>) y tres dominios constantes (C<H1>, C<H2>y C<H3>), en donde el dominio V<H>está en el extremo amínico del polipéptido y el dominio C<H3>está en el extremo carboxílico, y un polipéptido de inmunoglobulina de la cadena ligera de longitud completa incluye un dominio variable (V<L>) y un dominio constante (C<L>), en donde el dominio V<L>está en el extremo amínico del polipéptido y el dominio C<L>está en el extremo carboxílico.
[0196] Las cadenas ligeras humanas se clasifican normalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y las cadenas pesadas humanas se clasifican normalmente como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La IgM tiene subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgM1 e IgM2. La IgA se subdivide similarmente en subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgA1 e IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, los dominios variables y constantes se unen normalmente por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, por ejemplo, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2.ª ed., 1989). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman normalmente un sitio de unión a antígeno. Los dominios variables de anticuerpos que origen natural presentan normalmente la misma estructura general de regiones flanqueantes (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas normalmente por las regiones estructurales, que puede permitir la unión a un epítopo específico. Del extremo amínico al extremo carboxílico, los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la pesada comprenden normalmente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
[0198] La expresión "conjunto de CDR" se refiere a un grupo de tres CDR que se producen en una única región variable que puede unirse al antígeno. Los límites exactos de estas CDR se han definido de forma diferente según sistemas diferentes. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites precisos de residuos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) descubrieron que determinadas subpartes dentro de las CDR de Kabat adoptaban conformaciones de cadena principal peptídica casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad al nivel de secuencia de aminoácidos. Estas subpartes se designaron L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 donde "L" y "H" indican las regiones de la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR de Chothia, que tienen límites que se solapan con las CDR de Kabat. Otros límites que definen las CDR que se solapan con las CDR de Kabat se han descrito por Padlan, 1995, FASEB J.9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol.262(5): 732-45; y Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol.27: 55-77. Otras definiciones de límites de CDR adicionales pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas del presente documento, pero sin embargo se solaparán con las CDR de Kabat, aunque se pueden acortar o alargar a la luz de la predicción o hallazgos experimentales de que residuos o grupos particulares de residuos o incluso CDR enteras no afectan significativamente la unión al antígeno. Los métodos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas según cualquiera de estos sistemas, aunque determinadas realizaciones usan CDR definidas por Kabat o Chothia. La identificación de CDR previstas usando la secuencia de aminoácidos es bien conocida en el campo, tal como en Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains", en Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlín, pág. 33-51 (2010). La secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera también se puede inspeccionar para identificar las secuencias de las CDR por otros métodos convencionales, por ejemplo, por comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Las secuencias numeradas pueden alinearse a simple vista o empleando un programa de alineación, tal como uno del paquete de programas CLUSTAL, como se describe en Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Se usan convencionalmente modelos moleculares para delinear correctamente las regiones estructurales y CDR y corregir de ese modo las asignaciones basadas en secuencia.
[0200] El término "Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une al antígeno resultante de la digestión de un anticuerpo o producido por otros medios, tanto en forma monomérica como multimérica, y puede contener la región bisagra. En algunas realizaciones, la fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es normalmente de origen humano y puede ser de cualquiera de las inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG1 e IgG2. Las moléculas de Fc están constituidas por polipéptidos monoméricos que pueden unirse en formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas oscila desde 1 hasta 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA e IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Un ejemplo de un Fc es un dímero unido por disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG. El término "Fc", como se usa en el presente documento, es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.
[0202] Un fragmento F(ab) incluye normalmente una cadena ligera y los dominios V<H>y C<H1>de una cadena pesada, en donde la porción de cadena pesada V<H>-C<H1>del fragmento F(ab) no puede formar un enlace disulfuro con otro polipéptido de cadena pesada. Como se usa en este documento, un fragmento F(ab) también puede incluir una cadena ligera que contiene dos dominios variables separados por un conector de aminoácidos y una cadena pesada que contiene dos dominios variables separados por un conector de aminoácidos y un dominio C<H1>.
[0204] Un fragmento F(ab') incluye normalmente una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene más de la región constante (entre los dominios C<H1>y C<H2>), de manera que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')<2>.
[0206] Una molécula "recombinante" es una que se ha preparado, expresado, creado o aislado por medios recombinantes.
[0207] Una realización de la divulgación proporciona proteínas de unión que tienen especificidad biológica e inmunológica por entre uno y tres antígenos diana. Otra realización de la divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cadenas polipeptídicas que forman dichas proteínas de unión. Otra realización de la divulgación proporciona vectores de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cadenas polipeptídicas que forman dichas proteínas de unión. Otra realización más de la divulgación proporciona células hospedadoras que expresan dichas proteínas de unión (es decir, que comprenden moléculas de ácido nucleico o vectores que codifican cadenas polipeptídicas que forman dichas proteínas de unión).
[0209] La expresión "capacidad de intercambio", como se usa en el presente documento, se refiere a la intercambiabilidad de dominios variables dentro del formato de proteína de unión y con retención de plegamiento y afinidad de unión final. "Capacidad de intercambio completa" se refiere a la capacidad de cambiar el orden de tanto los dominios V<H1>como V<H2>y, por lo tanto, el orden de los dominios V<L1>y V<L2>, en la cadena polipeptídica de fórmula I o la cadena polipeptídica de fórmula II (es decir, para invertir el orden), mientras se mantiene la funcionalidad completa de la proteína de unión como se demuestra por la retención de la afinidad de unión. Además, debe observarse que las denominaciones V<H>y V<L>se refieren solo a la localización del dominio en una cadena de proteína particular en el formato final. Por ejemplo, V<H1>y V<H2>podrían derivar de dominios V<L1>y V<L2>en anticuerpos precursores y colocados en las posiciones V<H1>y V<H2>en la proteína de unión. Asimismo, V<L1>y V<L2>podrían derivar de dominios V<H1>y V<H2>en anticuerpos precursores y colocados en las posiciones V<H1>y V<H2>en la proteína de unión. Por lo tanto, las designaciones V<H>y V<L>se refieren a la presente localización y no a la localización original en un anticuerpo progenitor. Los dominios V<H>y V<L>son, por lo tanto, "intercambiables".
[0211] Una molécula o proteína de unión "aislada" es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para la proteína de unión, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En algunas realizaciones, la molécula o proteína de unión se purificará: (1) hasta más del 95 % en peso de anticuerpo como se ha determinado por el método de Lowry, y en algunas realizaciones más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos aminoterminal o interna por uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o tinción con plata. Las moléculas o proteínas de unión aisladas incluyen las moléculas/proteínasin situdentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural no estará presente.
[0213] Las expresiones "sustancialmente puro" o "sustancialmente purificado", como se usan en el presente documento, se refieren a un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en términos molares es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie comprende al menos aproximadamente un 50 % (en términos molares) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de todas las especies macromolares presentes en la composición. En otras realizaciones más, la especie se purifica hasta homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
[0215] El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) que se usa para transferir información de codificación a una célula hospedadora. El término "vector" incluye una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a una molécula de ADN bicatenario circular en la que pueden insertarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde pueden insertarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores tienen la capacidad de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente en este documento, ya que un plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la divulgación pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
[0217] La expresión "célula hospedadora recombinante" (o "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Una célula hospedadora recombinante o célula hospedadora pretende referirse no solo a la célula en cuestión particular, sino también a la descendencia de dicha célula. Como pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero dichas células aún se incluyen dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se usa en el presente documento. Puede usarse una amplia variedad de sistemas de expresión de células hospedadoras para expresar las proteínas de unión, incluyendo sistemas de expresión bacterianos, de levadura, baculovíricos y de mamífero (así como sistemas de expresión por presentación en fagos). Un ejemplo de un vector de expresión bacteriano adecuado es pUC19. Para expresar una proteína de unión recombinantemente, una célula hospedadora se transforma o transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas de polipéptidos de la proteína de unión de forma que las cadenas de polipéptidos se expresan en la célula hospedadora y se secretan en el medio en que las células hospedadoras se cultivan, de cuyo medio se puede recuperar la proteína de unión.
[0218] El término "transformación", como se usa en este documento, se refiere a un cambio en las características genética de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para que contenga un nuevo
[0219] ADN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente de su estado natural. Tras la transformación, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula por integración física en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episómico sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado establemente cuando el ADN se replica con la división de la célula. El término "transfección", como se usa en el presente documento, se refiere a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. Se conocen bien en la técnica varias técnicas de transfección. Dichas técnicas pueden usarse para introducir una o más moléculas de ADN exógeno en células hospedadoras adecuadas. La expresión "de origen natural", como se usa en el presente documento y se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza y no se ha manipulado por el ser humano. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el ser humano es de origen natural. Asimismo, "de origen no natural", como se usa en el presente documento, se refiere a un objeto que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado estructuralmente o se ha sintetizado por el ser humano.
[0220] Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales; aminoácidos no naturales y análogos, tales como aminoácidos α-,α-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes adecuados para las cadenas polipeptídicas de las proteínas de unión. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en este documento, la dirección a mano izquierda es la dirección del extremo amínico y la dirección a mano derecha es la dirección del extremo carboxílico, según el uso y las convenciones habituales.
[0221] Los residuos de origen natural pueden dividirse en clases basadas en propiedades comunes de la cadena lateral:
[0222] (1) hidrófobos: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
[0223] (2) hidrófilos polares: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
[0224] (3) alifáticos: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
[0225] (4) hidrófobos alifáticos: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
[0226] (5) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0227] (6) ácidos: Asp, Glu;
[0228] (7) básicos: His, Lys, Arg;
[0229] (8) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
[0230] (9) aromáticos: His, Trp, Tyr, Phe; y
[0231] 10. (10) hidrófobos aromáticos: Phe, Trp, Tyr.
[0232] Sustituciones aminoacídicas conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase.
[0233] Un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de las cadenas polipeptídicas de las proteínas de unión usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un experto en la materia puede identificar zonas adecuadas de una cadena polipeptídica que pueden cambiarse sin destruir la actividad al dirigirse a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. Como alternativa, un experto en la materia puede identificar residuos y partes de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. Además, incluso zonas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura se pueden someter a sustituciones aminoacídicas conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente a la estructura del polipéptido.
[0234] El término "paciente" (los términos "individuo" y "sujeto" pueden usarse indistintamente en el presente documento), como se usa en el presente documento, incluye sujetos humanos y animales (por ejemplo, mamíferos, incluyendo, pero no se limitan a, perros, gatos y otras mascotas domésticas; caballos, vacas, cabras, conejos, búfalos y otros animales; y animales de investigación tales como primates no humanos, ratones, etc.).
[0235] En algunas realizaciones, los términos "tratamiento" o "tratar", como se usan en el presente documento, se refieren al tratamiento terapéutico, por ejemplo, reducir o mitigar la gravedad o presencia de uno o más síntomas.
[0236] En otras realizaciones, el término "prevenir", como se usa en el presente documento, puede referirse a medidas profilácticas o preventivas, por ejemplo, prevenir o retrasar la aparición de uno o más síntomas, por ejemplo, en un individuo en riesgo de desarrollar una afección patológica descrita en la presente.
[0237] Las expresiones "composición farmacéutica" o "composición terapéutica", como se usan en este documento, se refieren a un compuesto o composición que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.
[0238] La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable", como se usa este documento, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para llevar a cabo o potenciar la administración de una proteína de unión.
[0239] Las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz", cuando se usan en referencia a una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de unión, se refieren a una cantidad o dosis suficiente para producir un resultado terapéutico deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de una proteína de unión suficiente para inhibir, durante un cierto periodo de tiempo, uno o más de los procesos patológicos clínicamente definidos asociados a la afección que se está tratando. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la proteína de unión específica que se esté usando, y también depende de una variedad de factores y condiciones relacionadas con el paciente que se esté tratando y la gravedad del trastorno. Por ejemplo, si la proteína de unión se va a administrarin vivo, factores tales como la edad, el peso y la salud del paciente, así como las curvas de respuesta a la dosis y los datos de toxicidad obtenidos en trabajo preclínico en animales, estarían entre los factores considerados. La determinación de una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica dada está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la materia.
[0240] Una realización de la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión.
[0241] Moléculas de unión
[0242] Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a moléculas de unión multiespecíficas que comprenden uno o más dominios de unión que se unen a una porción extracelular de distroglicano y uno o más dominios de unión que se unen a laminina-2. La molécula de unión multiespecífica es una proteína de unión multiespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas. La molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica bivalente o tetravalente que comprende dos o cuatro sitios de unión a antígeno. La molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión multiespecífica trivalente que comprende tres sitios de unión a antígeno. Las expresiones "dominio de unión" y "sitio de unión" se usan indistintamente en el presente documento.
[0243] En la técnica se conocen diversos formatos y configuraciones para proteínas de unión multiespecíficas y son adecuados para su uso como se describe en el presente documento. A continuación se proporcionan descripciones de formatos a modo de ejemplo. Cualquiera de los formatos y características opcionales de los mismos descritos en la publicación internacional n.º WO2017/180913 puede usarse en las proteínas de unión (por ejemplo, proteínas de unión multiespecíficas) descritas en el presente documento.
[0244] Proteínas de unión trivalentes multiespecíficas
[0245] La presente divulgación proporciona una proteína de unión multiespecífica. La proteína de unión multiespecífica es una proteína de unión trivalente que comprende tres sitios de unión a antígeno y que se dirige colectivamente a dos o más antígenos diana. La proteína de unión multiespecífica comprende al menos un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y al menos un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión multiespecífica es una proteína de unión multiespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, en donde la proteína de unión comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:
[0246] V<L2>-L<1>-V<L1>-L<2>-C<L>[I]
[0247] y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
[0248] V<H1>-L<3>-V<H2>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
[0249] y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
[0250] V<H3>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
[0251] y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
[0252] V<L3>-C<L>[IV]
[0253] donde:
[0254] V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0255] V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0256] V<L3>es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0257] V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0258] V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0259] V<H3>es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0260] C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0261] C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
[0262] C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
[0263] C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
[0264] bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
[0265] L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores aminoacídicos,
[0266] en donde el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada; y
[0267] en donde V<H1>y V<L1>forman un sitio de unión a antígeno, en donde V<H2>y V<L2>forman un sitio de unión a antígeno, y en donde V<H3>y V<L3>forman un sitio de unión a antígeno para un total de tres sitios de unión a antígeno, y en donde los tres sitios de unión a antígeno comprenden dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano y un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 o un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano y dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2.
[0268] El polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada. V<H1>y V<L1>forman un sitio de unión a antígeno, V<H2>y V<L2>forman un sitio de unión a antígeno, y V<H3>y V<L3>forman un sitio de unión a antígeno para un total de tres sitios de unión a antígeno. Los tres sitios de unión a antígeno comprenden dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano y un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, o un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano y dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2 y dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano y un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2.
[0269] En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2 se unen a diferentes epítopos de laminina-2. En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2 se unen al mismo epítopo o a epítopos que se solapan de laminina-2. En algunas realizaciones, V<H1>y V<L1>forman un primer sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, V<H2>y V<L2>forman un segundo sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, y V<H3>y V<L3>forman un tercer sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano.
[0270] En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano se unen a diferentes epítopos de la porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, los dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano se unen al epítopo o epítopo que se solapan de la porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, V<H1>y V<L1>forman un primer sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano, V<H2>y V<L2>forman un segundo sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano, y V<H3>y V<L3>forman un tercer sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2.
[0271] Cualquiera de los sitios de unión a antígeno descritos en el presente documento puede encontrar uso en las proteínas de unión (por ejemplo, proteínas de unión multiespecíficas) descritas en el presente documento, por ejemplo, incluyendo, pero no se limitan a, proteínas de unión que comprenden polipéptido(s) según las fórmulas I, II, III y/o IV descritas anteriormente.
[0272] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de GFTFTDSV (SEQ ID NO:316), una CDR-H2 que comprende la secuencia de IYPGSGNF (SEQ ID NO:318) y una CDR-H3 que comprende la secuencia de AMRRSS (SEQ ID NO:320); y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de QTIVHSNSKTY (SEQ ID NO:332), una CDR-L2 que comprende la secuencia de KVS (SEQ ID NO:334) y una CDR-L3 que comprende la secuencia de FQGSHVPLT (SEQ ID NO:336). En algunas realizaciones, los dominios VH y VL forman un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, V<H1>y V<L1>, V<H2>y V<L2>, o V<H3>y V<L3>) que se une a la porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR del anticuerpo AS30SS_Hu6 o AS30SS_Hu9 como se muestra en la Tabla A2.
[0273] En algunas realizaciones, el dominio VH y/o VL están humanizados. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 346 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:362. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH y/o VL del anticuerpo AS30SS_Hu6 o AS30SS_Hu9 como se muestra en la Tabla D2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende un dominio VH codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:306 y/o un dominio VL codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:322. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende un dominio VH codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:338 y/o un dominio VL codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:354.
[0275] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de GFTFSSYT (SEQ ID NO:380), una CDR-H2 que comprende la secuencia de ISSSGSNT (SEQ ID NO:382) y una CDR-H3 que comprende la secuencia de ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:384); y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de QSISNN (SEQ ID NO:396), una CDR-L2 que comprende la secuencia de YAS (SEQ ID NO:398) y una CDR-L3 que comprende la secuencia de QQQSKSWPRT (SEQ ID NO:400). En algunas realizaciones, los dominios VH y VL forman un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, V<H1>y V<L1>, V<H2>y V<L2>, o V<H3>y V<L3>) que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR del anticuerpo C3_Hu10 como se muestra en la Tabla A2.
[0277] En algunas realizaciones, el dominio VH y/o VL están humanizados. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 378 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:394. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH y/o VL del anticuerpo C3_Hu10 como se muestra en la Tabla D2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende un dominio VH codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:370 y/o un dominio VL codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:386.
[0279] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de GFTFSSYT (SEQ ID NO:380), una CDR-H2 que comprende la secuencia de ISSSGSNT (SEQ ID NO:382) y una CDR-H3 que comprende la secuencia de ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:384); y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de QSIGNN (SEQ ID NO:428), una CDR-L2 que comprende la secuencia de YAS (SEQ ID NO:398) y una CDR-L3 que comprende la secuencia de QQQSKSWPRT (SEQ ID NO:400). En algunas realizaciones, los dominios VH y VL forman un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, V<H1>y V<L1>, V<H2>y V<L2>, o V<H3>y V<L3>) que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR del anticuerpo C3_HU11 como se muestra en la Tabla A2.
[0281] En algunas realizaciones, el dominio VH y/o VL están humanizados. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 410 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:426. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH y/o VL del anticuerpo C3_HU11 como se muestra en la Tabla D2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende un dominio VH codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:402 y/o un dominio VL codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:418.
[0283] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de GFTFSSYT (SEQ ID NO:444), una CDR-H2 que comprende la secuencia de ISSSGSNT (SEQ ID NO:446) y una CDR-H3 que comprende la secuencia de ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:448); y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de QSISNY (SEQ ID NO:460), una CDR-L2 que comprende la secuencia de YAS (SEQ ID NO:462) y una CDR-L3 que comprende la secuencia de QQQSKSWPRT (SEQ ID NO:464). En algunas realizaciones, los dominios VH y VL forman un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, V<H1>y V<L1>, V<H2>y V<L2>, o V<H3>y V<L3>) que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR del anticuerpo C21_Hu11 como se muestra en la Tabla A2.
[0285] En algunas realizaciones, el dominio VH y/o VL están humanizados. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 442 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:458. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH y/o VL del anticuerpo C21_Hu11 como se muestra en la Tabla D2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende un dominio VH codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:434 y/o un dominio VL codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:450.
[0287] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende: un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de GFTFSSYT (SEQ ID NO:444), una CDR-H2 que comprende la secuencia de ISSSGDNT (SEQ ID NO:478) y una CDR-H3 que comprende la secuencia de ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:448); y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de QSISNY (SEQ ID NO:460), una CDR-L2 que comprende la secuencia de YAS (SEQ ID NO:462) y una CDR-L3 que comprende la secuencia de QQQSKSWPRT (SEQ ID NO:464). En algunas realizaciones, los dominios VH y VL forman un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, V<H1>y V<L1>, V<H2>y V<L2>, o V<H3>y V<L3>) que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR del anticuerpo C21_Hu21 como se muestra en la Tabla A2.
[0289] En algunas realizaciones, el dominio VH y/o VL están humanizados. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 474 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:490. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH y/o VL del anticuerpo C21_Hu21 como se muestra en la Tabla D2. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende un dominio VH codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:466 y/o un dominio VL codificado por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:482.
[0291] En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:500, una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:498, una tercera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:499, y una cuarta cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:501. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 cadenas polipeptídicas de triAb 3407, por ejemplo, como se muestra en la Tabla I2 o I4.
[0293] En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448 y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:442 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:458; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:504, una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:502, una tercera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:503, y una cuarta cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:505. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 cadenas polipeptídicas de triAb 3423, por ejemplo, como se muestra en la Tabla I2 o I4.
[0295] En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448 y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:410 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:426; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:474 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:490; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:508, una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:506, una tercera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:507, y una cuarta cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:509. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 cadenas polipeptídicas de triAb 3429, por ejemplo, como se muestra en la Tabla I2 o I4.
[0297] En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:442 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:458; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:410 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:426; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:512, una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:510, una tercera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:511, y una cuarta cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:513. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 cadenas polipeptídicas de triAb 3437, por ejemplo, como se muestra en la Tabla I2 o I4.
[0299] En algunas realizaciones, V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448 y V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384 y V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; y V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y V<L3>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, V<H1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:474 y V<L1>comprende la secuencia de SEQ ID NO:490; V<H2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:378 y V<L2>comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; y V<H3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:314 y V<L3>comprende la secuencia de SEQ ID NO:330. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:516, una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:514, una tercera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:515, y una cuarta cadena polipeptídica que comprende la secuencia de SEQ ID NO:517. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 cadenas polipeptídicas de triAb 3439, por ejemplo, como se muestra en la Tabla I2 o I4.
[0300] Formatos de unión biespecífica
[0301] La presente divulgación proporciona una proteína de unión biespecífica. La proteína de unión biespecífica es una proteína de unión bivalente que comprende dos sitios de unión a antígeno y que se dirige colectivamente a dos antígenos diana o una proteína de unión tetravalente que comprende cuatro sitios de unión a antígeno y que se dirige colectivamente a dos antígenos diana.
[0302] En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V<H1>) y un primer dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V<L1>), y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V<H2>) y un segundo dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V<L2>). En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica, tal como un anticuerpo biespecífico.
[0303] La presente divulgación proporciona una molécula de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, en donde la molécula de unión biespecífica comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman cuatro sitios de unión a antígeno, en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0304] V<L1>-L<1>-V<L2>-L<2>-C<L>[I]
[0305] y dos cadenas polipeptídicas comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0306] V<H2>-L<3>-V<H1>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
[0307] en donde:
[0308] V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0309] V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0310] V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0311] V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0312] C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0313] C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
[0314] C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
[0315] C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
[0316] bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
[0317] L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores aminoacídicos;
[0318] en donde los dominios V<H1>and V<L1>forman un par de unión V<H1>/V<L1>, y en donde los dominios V<H2>y V<L2>forman un par de unión V<H2>/V<L2>.
[0319] En algunas realizaciones, las fórmulas I y II describen la disposición de dominios dentro de las cadenas polipeptídicas respectivas en orden desde aminoterminal hasta carboxiterminal. En algunas realizaciones, una o más de las cadenas polipeptídicas pueden comprender una secuencia o secuencias adicionales, por ejemplo, en los extremos aminoterminal o carboxiterminal.
[0320] Para descripciones a modo de ejemplo de este formato, véase, por ejemplo, la publicación internacional n.º WO2012/135345, la patente de EE. UU. n.º 9.221.917 y la patente EP. n.º EP2691416B1.
[0321] En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas polipeptídicas según la fórmula II que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:530 y dos cadenas polipeptídicas según la fórmula I que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:531. En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas polipeptídicas según la fórmula II que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:532 y dos cadenas polipeptídicas según la fórmula I que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:533. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende dos cadenas polipeptídicas mostradas para AS30_Hu9xC3_HU11 CODV o AS30_Hu9xC21_Hu21 CODV en la Tabla I3 o 14. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un dominio variable que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR mostradas en la Tabla A2. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 dominios variables mostrados en la Tabla D2, I3 o 14.
[0322] En algunas, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a la porción extracelular de distroglicano, y en el par de unión V<H2>/V<L2>se une a laminina-2. En otras realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a la porción extracelular de distroglicano, y el par de unión V<H1>/V<L1>se une a laminina-2.
[0323] En algunas realizaciones de cualquiera de las moléculas de unión multiespecíficas descritas anteriormente, los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula II forman un par de cadena pesada-cadena ligera cruzada. En algunas realizaciones, los dominios V<H1>y V<L1>se cruzan para formar el par de unión V<H1>/V<L1>. En algunas realizaciones, los dominios V<H2>y V<L2>se cruzan para formar el par de unión V<H2>/V<L2>. En algunas realizaciones, el término "conector", como se usa en el presente documento en referencia al formato anterior, se refiere a uno o más residuos aminoacídicos insertados entre dominios de inmunoglobulina para proporcionar movilidad suficiente para que los dominios de las cadenas ligeras y pesadas se plieguen en las inmunoglobulinas de región variable doble cruzada. Un conector se inserta en la transición entre dominios variables o entre dominios variables y constantes, respectivamente, a nivel de secuencia. La transición entre dominios puede identificarse debido a que se entiende bien el tamaño aproximado de los dominios de inmunoglobulina. La localización precisa de una transición de dominio puede determinarse localizando tramos peptídicos que no forman elementos estructurales secundarios, tales como láminas beta o hélices alfa, como se demuestra por datos experimentales o como puede suponerse por técnicas de modelado o predicción de estructuras secundarias. Los conectores L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son independientes, pero en algunos casos pueden tener la misma secuencia y/o longitud.
[0324] En algunas realizaciones, un conector de la presente divulgación comprende la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<1>y L<2>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). Cualquiera de los conectores y combinaciones de conectores descritos en la publicación internacional n.º WO2017/180913 puede usarse en las proteínas de unión (por ejemplo, proteínas de unión multiespecíficas) descritas en el presente documento.
[0325] En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>tienen cada uno de 0 a 50 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 40 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 30 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 25 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 20 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 18 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 16 residuos aminoacídicos de longitud o de 0 a 14 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, los conectores L<1>, L<2>, L<3>y L<4>varían de ningún aminoácido (longitud=0) a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o menos de 100, 50, 40, 30, 20 o 15 aminoácidos o menos. Los conectores también pueden ser de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido de longitud. Todos de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>en una proteína de unión pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o todos pueden tener secuencias de aminoácidos diferentes.
[0326] En determinadas realizaciones, L<1>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<4>es 5 residuos aminoacídicos de longitud. En determinadas realizaciones, L<1>es 14 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 2 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 14 residuos aminoacídicos de longitud, L<4>es 2 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<3>comprenden cada uno la secuencia EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296), y/o L<2>y L<4>comprenden cada uno la secuencia GG. En determinadas realizaciones, L<1>es 7 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 1 residuo aminoacídico de longitud y L<4>es 2 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GQPKAAP (SEQ ID NO:297), L<2>comprende la secuencia TKGPS (SEQ ID NO:298), L<3>comprende un residuo de serina (por ejemplo, la secuencia S) y L<4>comprende la secuencia RT. En determinadas realizaciones, L<1>es 10 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 10 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 0 residuos aminoacídicos de longitud y L<4>es 0 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<2>comprenden cada uno la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299).
[0327] En algunas realizaciones, uno o ambos de los dominios variables de los polipéptidos de fórmula I y/o fórmula II son dominios variables humanos, humanizados o de ratón.
[0328] La divulgación también proporciona una molécula de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, en donde la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas ligeras que comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0329] V<L1>-L<5>-V<L2>-L<6>-C<L>[III]
[0330] y dos cadenas pesadas que comprenden una estructura representada por la fórmula:
[0331] V<H1>-L<7>-V<H2>-L<8>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[IV]
[0332] en donde:
[0333] V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0334] V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0335] V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0336] V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
[0337] C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
[0338] C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
[0339] C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
[0340] C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
[0341] bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y L<5>, L<6>, L<7>y L<8>son conectores de aminoácido;
[0342] en donde los dominios V<H1>and V<L1>forman un par de unión V<H1>/V<L1>, y en donde los dominios V<H2>y V<L2>forman un par de unión V<H2>/V<L2>.
[0343] En algunas realizaciones, las fórmulas III y IV describen la disposición de dominios dentro de las cadenas polipeptídicas respectivas en orden desde aminoterminal hasta carboxiterminal. En algunas realizaciones, una o más de las cadenas polipeptídicas pueden comprender una secuencia o secuencias adicionales, por ejemplo, en los extremos aminoterminal o carboxiterminal.
[0344] Para descripciones a modo de ejemplo de este formato, véase, por ejemplo, la publicación de patente preconcedida de EE. UU. n.º US20130209469.
[0345] En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas pesadas que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:522 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:523. En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas pesadas que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:528 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:529. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende dos cadenas polipeptídicas mostradas para AS30_Hu6xC3_Hu10 o AS30_Hu6xC21_HU11 en la Tabla I3 o I4. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un dominio variable que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR mostradas en la Tabla A2. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende 1, 2, 3 o 4 dominios variables mostrados en la Tabla D2, 13 o I4.
[0346] En algunas, el par de unión V<H1>/V<L1>se une a la porción extracelular de distroglicano, y en el par de unión V<H2>/V<L2>se une a laminina-2. En otras realizaciones, el par de unión V<H2>/V<L2>se une a la porción extracelular de distroglicano, y el par de unión V<H1>/V<L1>se une a laminina-2.
[0347] En algunas realizaciones, uno o ambos de los dominios variables de los polipéptidos de fórmula III y/o fórmula IV son dominios variables humanos, humanizados o de ratón.
[0348] Conectores
[0349] En algunas realizaciones, L<5>, L<6>, L<7>y L<8>tienen cada uno de 0 a 50 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 40 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 30 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 25 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 20 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 18 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 16 residuos aminoacídicos de longitud o de 0 a 14 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, los conectores L<5>, L<6>, L<7>y L<8>varían de ningún aminoácido (longitud=0) a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o menos de 100, 50, 40, 30, 20 o 15 aminoácidos o menos. Los conectores también pueden ser de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido de longitud. Todos de L<5>, L<6>, L<7>y L<8>en una proteína de unión pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o todos pueden tener secuencias de aminoácidos diferentes.
[0350] En algunas realizaciones, un conector de la presente divulgación comprende la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<1>y L<2>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534). Cualquiera de los conectores y combinaciones de conectores descritos en la publicación internacional n.º WO2017/180913 puede usarse en las proteínas de unión (por ejemplo, proteínas de unión multiespecíficas) descritas en el presente documento.
[0351] En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>tienen cada uno de 0 a 50 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 40 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 30 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 25 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 20 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 18 residuos aminoacídicos de longitud, de 0 a 16 residuos aminoacídicos de longitud o de 0 a 14 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, los conectores L<1>, L<2>, L<3>y L<4>varían de ningún aminoácido (longitud=0) a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o menos de 100, 50, 40, 30, 20 o 15 aminoácidos o menos. Los conectores también pueden ser de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido de longitud. Todos de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>en una proteína de unión pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o todos pueden tener secuencias de aminoácidos diferentes.
[0352] En determinadas realizaciones, L<1>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<4>es 5 residuos aminoacídicos de longitud. En determinadas realizaciones, L<1>es 14 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 2 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 14 residuos aminoacídicos de longitud, L<4>es 2 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<3>comprenden cada uno la secuencia EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296), y/o L<2>y L<4>comprenden cada uno la secuencia GG. En determinadas realizaciones, L<1>es 7 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 5 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 1 residuo aminoacídico de longitud y L<4>es 2 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GQPKAAP (SEQ ID NO:297), L<2>comprende la secuencia TKGPS (SEQ ID NO:298), L<3>comprende un residuo de serina (por ejemplo, la secuencia S) y L<4>comprende la secuencia RT. En determinadas realizaciones, L<1>es 10 residuos aminoacídicos de longitud, L<2>es 10 residuos aminoacídicos de longitud, L<3>es 0 residuos aminoacídicos de longitud y L<4>es 0 residuos aminoacídicos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<2>comprenden cada uno la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299).
[0353] En determinadas realizaciones, los conectores L<5>y L<7>comprenden la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:294), y/o los conectores L<6>y L<8>tienen cada uno 0 residuos aminoacídicos de longitud.
[0354] Los ejemplos enumerados anteriormente (por ejemplo, para L<1>, L<2>, L<3>, L<4>, L<5>, L<6>, L<7>o L<8>) no pretenden limitar el alcance de la divulgación en modo alguno, y los conectores que comprenden aminoácidos elegidos aleatoriamente seleccionados del grupo que consiste en valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina y prolina son adecuados en las proteínas de unión.
[0355] La identidad y secuencia de residuos aminoacídicos en el conector puede variar dependiendo del tipo de elemento estructural secundario necesario para conseguir el conector. Por ejemplo, se usan glicina, serina y alanina para conectores flexibles. Alguna combinación de glicina, prolina, treonina y serina es útil si es necesario un conector más rígido y agrandado. Cualquier residuo aminoacídico puede considerarse un conector en combinación con otros residuos aminoacídicos para construir conectores peptídicos más grandes según sea necesario dependiendo de las propiedades deseadas.
[0356] Regiones constantes / Fc
[0357] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una mutación de "botón" en una segunda cadena de polipéptidos y una mutación de "ojal" en la tercera cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una mutación de "botón" en la tercera cadena polipeptídica y una mutación de "ojal" en una segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la mutación de "botón" comprende una o más sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y/o 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son S354C, T366W, T366Y, S354C y T366W, o S354C y T366Y. En algunas realizaciones, la mutación de "botón" comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son S354C y T366W. En algunas realizaciones, la mutación de "ojal" comprende una o más sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 407 y, opcionalmente, 349, 366 y/o 368 y de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son Y407V o Y407T y, opcionalmente, Y349C, T366S y/o L368A. En algunas realizaciones, la mutación de "ojal" comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son Y349C, T366S, L368A y Y407V.
[0358] En algunas realizaciones, el dominio C<H3>de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU (por ejemplo, S354C y T366W); y en el dominio C<H3>de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU (por ejemplo, Y349C, T366S, L368A y Y407V). En algunas realizaciones, el dominio C<H3>de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU (por ejemplo, Y349C, T366S, L368A y Y407V); y el dominio C<H3>de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU (por ejemplo, S354C y T366W).
[0359] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para mejorar la purificación, por ejemplo, modulando la afinidad por un reactivo de purificación. Por ejemplo, se conoce que proteínas de unión heterodiméricas pueden purificarse selectivamente de sus formas homodiméricas si una de las dos regiones Fc de la forma heterodimérica contiene mutación (mutaciones) que reducen o eliminan la unión a proteína A, debido a que la forma heterodimérica tendrá una afinidad intermedia por la purificación basada en proteína A que la forma homodimérica y se puede eluir selectivamente de la proteína A, por ejemplo, usando un pH diferente (véase, por ejemplo, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep.5:17943). En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana. En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones aminoacídicas son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, los dominios C<H3>de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos son dominios C<H3>de IgG1 o IgG4 humana, y solo uno de los dominios C<H3>comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU (por ejemplo, H435R y Y436F). En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende mutaciones de botón y ojal y una o más mutaciones para mejorar la purificación.
[0361] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para aumentar la semivida, por ejemplo, la semividain vivo. En algunas realizaciones, una proteína de unión comprende una o más de las mutaciones descritas en la patente de EE. UU. n.º 7.083.784. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los dominios C<H2>de la segunda y tercera cadena polipeptídica son dominios C<H2>de IgG1 o IgG4 humana que comprenden un residuo de tirosina en la posición 252, un residuo de treonina en la posición 254 y un residuo de ácido glutámico en la posición 256, numeración según el índice EU.
[0362] En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende una o más mutaciones que dan como resultado una región Fc con glicosilación alterada y/o función efectora reducida. En algunas realizaciones, una proteína de unión comprende una o más de las mutaciones descritas en la patente de EE. UU. n.º 9.790.268. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los dominios C<H2>de la segunda y tercera cadena polipeptídica son dominios C<H2>de IgG1 o IgG4 humana que comprenden un residuo de asparagina en la posición 297, un
[0364] residuo de asparagina en la posición 298, un residuo de alanina en la posición 299 y un residuo de serina o treonina en la posición 300, numeración según el índice EU.
[0366] Otra plataforma de proteínas de unión biespecífica contemplada para su uso en el presente documento se describe en la publicación de patente preconcedida de EE. UU. n.º US2013/0039913 y Labrijn, A.F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci.110:5145-5150. En este enfoque, cada dominio de unión se produce en una forma homodimérica, luego se ensamblain vitropara formar una proteína de unión biespecífica heterodimérica. Este enfoque emplea mutaciones específicas (por ejemplo, en el dominio CH3 del anticuerpo) para promover el intercambio de brazos Fab, lo que conduce a proteínas de unión heterodiméricas que son más estables que cualquier forma homodimérica. En algunas realizaciones, estas mutaciones ocurren, por ejemplo, en las posiciones 366, 368, 370, 399, 405, 407 y/o 409, según el índice EU, como se describe en Kabat et al. Las mutaciones específicas se describen con mayor detalle en la publicación de patente preconcedida de EE. UU. n.º US2013/0039913 y Labrijn, A.F. et al (2013) Proc. Natl. Acad. SCI.
[0367] 110:5145-5150.
[0369] A continuación se describen brevemente plataformas de proteínas de unión biespecíficas adicionales contempladas para su uso en el presente documento. Una estrategia fue propuesta por Carter et al. (Ridgway et al., 1996, Protein Eng.9(7): 617-21; Carter, 2011, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15) para producir un heterodímero de Fc usando un conjunto de mutaciones de "botón en ojal" en el dominio C<H3>de Fc. Estas mutaciones conducen a la alteración de la complementariedad de empaquetamiento de residuos entre la interfaz del dominio C<H3>dentro del núcleo hidrófobo conservado estructuralmente de modo que se favorece la formación del heterodímero en comparación con homodímeros, lo que logra una buena expresión del heterodímero a partir del cultivo celular de mamífero. Aunque la estrategia condujo a un mayor rendimiento de heterodímeros, los homodímeros no se suprimieron completamente (Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol.16(7): 677-81).
[0371] Para mejorar los rendimientos de las proteínas de unión, en algunas realizaciones, los dominios C<H3>se pueden alterar por la tecnología de "botón en ojal" que se describe con detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, la publicación internacional n.º WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Protein Eng.9: 617-21; y Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol.
[0372] 16: 677-81. Específicamente, las superficies de interacción de los dos dominios C<H3>se alteran para aumentar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios C<H3>. Cada uno de los dos dominios C<H3>(de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro adicional estabiliza los heterodímeros (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) y aumenta el rendimiento. En realizaciones particulares, el botón está en el dominio CH3 de una cadena polipeptídica. En otras realizaciones, el botón está en el primer par de polipéptidos que tiene la orientación cruzada. En aún otras realizaciones, los dominios C<H3>no incluyen un botón en ojal.
[0374] En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una mutación de "botón" en una cadena polipeptídica y una mutación de "ojal" en la otra cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la mutación de "botón" comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son S354C y T366W. En algunas realizaciones, la mutación de "ojal" comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son Y349C, T366S, L368A y Y407V.
[0376] En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para mejorar semivida en suero (véase, por ejemplo, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende mutaciones de botón y ojal y una o más mutaciones para mejorar semivida en suero.
[0378] Otra plataforma de proteínas de unión biespecífica contemplada para su uso en el presente documento es el formato que contiene Fc de anticuerpo bivalente heterodimérico descrito en el documento de patente WO2011131746. Cualquiera de los sitios de unión a antígeno descritos en el presente documento puede combinarse en este formato biespecífico heterodimérico. En algunas realizaciones, una proteína de unión multiespecífica (por ejemplo, biespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena pesada de anticuerpo que comprende un primer dominio variable de cadena pesada (VH) y una primera región Fc de una inmunoglobulina que comprende una primera región C<H3>, y una primera cadena ligera de anticuerpo que comprende un primer dominio variable de cadena ligera (VL), en donde los primeros dominios VH y VL forman un primer dominio de unión a antígeno que se une a una porción extracelular de distroglicano, y una segunda cadena pesada de anticuerpo que comprende un segundo dominio variable de cadena pesada (VH) y una segunda región Fc de una inmunoglobulina que comprende una segunda región C<H3>, y una segunda cadena ligera de anticuerpo que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera (VL), en donde los segundos dominios VH y VL forman un segundo dominio de unión a antígeno que se une a laminina-2. En algunas realizaciones, las secuencias de dichas primera y segunda regiones C<H3>son diferentes y son tales que la interacción heterodimérica entre dichas primera y segunda regiones C<H3>es más fuerte que cada una de las interacciones homodiméricas de dichas primera y segunda regiones C<H3>. En algunas realizaciones, la primera proteína homodimérica tiene un aminoácido distinto de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la segunda proteína homodimérica tiene una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada entre: 366, 368, 370, 399, 405 y 407, y/o las secuencias de dichas primera y segunda regiones C<H3>son tales que las constantes de disociación de las interacciones homodiméricas de cada una de las regiones C<H3>están entre 0,01 y 10 micromolar. En algunas realizaciones, la primera cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:518, la segunda cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:519, la primera cadena ligera de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:520, y la segunda cadena ligera de anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:521. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo y dos cadenas pesadas de anticuerpo mostradas para el AS30_Hu6xC3_Hu10 Duobody en la Tabla 13.
[0380] Otra plataforma de proteínas de unión biespecífica contemplada para su uso en la presente es el diseño "DuetMab" (Mazor, Y. et al. (2015) MAbs 7:377-389). Brevemente, la estrategia de "botón en ojal" descrita anteriormente se combina con el reemplazo de un enlace disulfuro nativo en una de las interfases CH1-CL con un enlace disulfuro modificado para aumentar la eficacia del emparejamiento de las cadenas pesada y ligera afín. En algunas realizaciones, la cadena pesada de un dominio de unión porta una mutación F126C, y la cadena ligera afín para ese dominio de unión porta una mutación S121C, numeración según Kabat. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una proteína de unión multiespecífica (por ejemplo, biespecífica) de la presente divulgación comprende una primera cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO:524, una segunda cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO:525, una primera cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO:526, y una segunda cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO:527. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo y dos cadenas pesadas de anticuerpo mostradas para el duetmab AS30_Hu6xC21_HU11 en la Tabla I3.
[0382] Gunasekaran et al. exploraron la viabilidad de retener la integridad del núcleo hidrófobo mientras se impulsa la formación del heterodímero de Fc cambiando la complementariedad de carga en la interfase del dominio C<H3>(Gunasekaran et al., 2010, J. Biol. Chem.285(25): 19637-46). Aprovechando el mecanismo de dirección electrostática, estas construcciones mostraron una promoción eficaz de la formación de heterodímero de Fc con una mínima contaminación de homodímeros a través de la mutación de dos pares de residuos cargados ubicados periféricamente. En contraste con el diseño de botón en agujero, los homodímeros se suprimieron uniformemente debido a la naturaleza del mecanismo de repulsión electrostática, pero no se evitaron totalmente.
[0384] Davis et al. describen una estrategia de ingeniería de anticuerpos para convertir homodímeros de Fc en heterodímeros interdigitando segmentos de cadena β de dominios C<H3>de IgG e IgA humana, sin la introducción de enlaces disulfuro intercatenarios adicionales (Davis et al., 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 195-202). La expresión de proteínas de fusión SEEDbody (SB) por parte de células de mamífero produce heterodímeros de Sb con alto rendimiento que se purifican fácilmente para eliminar subproductos menores.
[0386] La publicación de solicitud de patente de EE. UU n.º US 2010/331527 A1 describe un anticuerpo biespecífico basado en la heterodimerización del dominio C<H3>, introduciendo en una cadena pesada las mutaciones H95R e Y96F dentro del dominio C<H3>. Estas sustituciones de aminoácidos se originan a partir del dominio C<H3>del subtipo IgG3 y se heterodimerizarán con una cadena principal de IgG1. Una cadena ligera común propensa a emparejarse con cada cadena pesada es un requisito previo para todos los formatos basados en la heterodimerización a través del dominio C<H3>. Por lo tanto, se producen un total de tres tipos de anticuerpos: un 50% que tiene una cadena principal de IgG1 pura, un tercio que tiene una cadena principal mutada H95R y Y96F pura, y un tercio que tiene dos cadenas pesadas diferentes (biespecíficas). El heterodímero deseado se puede purificar a partir de esta mezcla debido a que sus propiedades de unión a la proteína A son diferentes de las de los anticuerpos parentales: los dominios C<H3>derivados de IgG3 no se unen a la proteína A, mientras que la IgG1 sí. Por consiguiente, el heterodímero se une a la proteína A, pero eluye a un pH más alto que el homodímero de IgG1 puro, y esto hace posible la purificación selectiva del heterodímero biespecífico.
[0388] La patente de EE. UU. n.º 7.612.181 describe un anticuerpo biespecífico IgG de dominio variable dual (DVD-IgG) que se basa en el formato Dual-Fv descrito en la patente de EE. UU. n.º 5.989.830. También se describió un formato biespecífico similar en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º US 2010/0226923 A1. La adición de dominios constantes a las respectivas cadenas del Fv dual (C<H1>-Fc a la cadena pesada y dominio constante kappa o lambda a la cadena ligera) conduce a anticuerpos biespecíficos funcionales sin necesidad de modificaciones adicionales (es decir, adición obvia de dominios constantes para potenciar la estabilidad). Algunos de los anticuerpos expresados en el formato DVD-Ig/TBTI muestran un efecto de posición en la segunda posición (o más interna) de unión a antígeno (Fv2). Dependiendo de la secuencia y la naturaleza del antígeno reconocido por la posición Fv2, este dominio de anticuerpo muestra una afinidad reducida por su antígeno (es decir, pérdida de velocidad de asociación en comparación con el anticuerpo progenitor). Una posible explicación para esta observación es que el conector entre V<L1>y V<L2>sobresale en la región CDR de Fv2, haciendo que Fv2 sea algo inaccesible para antígenos más grandes.
[0389] La segunda configuración de un fragmento de anticuerpo biespecífico descrito en la patente de EE. UU. n.º 5.989.830 es la doble cabeza cruzada (CODH), que tiene la siguiente orientación de los dominios variables expresados en dos cadenas:
[0390] V<L1>-conector-V<L2>para la cadena ligera, y
[0391] V<H2>-conector-V<H1>para la cadena pesada.
[0393] Secuencias de dominios CDR, VH y VL
[0395] Abajo se describen secuencias de CDR, dominio VH y dominio VL a modo de ejemplo que pueden usarse en cualquiera de las proteínas de unión multiespecíficas o biespecíficas de la presente divulgación en cualquier número, combinación o configuración.
[0397] En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a laminina-2.
[0399] En algunas realizaciones, el dominio V<H1>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y/o en donde el dominio V<L1>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H1>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188. En algunas realizaciones, el dominio V<L1>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el dominio V<H1>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246 y 248. En algunas realizaciones, el dominio V<L1>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247 y 249.
[0401] En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a laminina-2 (por ejemplo, un dominio 5 similar a laminina G (LG), o LG-5). En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:51-55, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:56-60, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:61-65; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:66-70, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:71-75, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:76-80. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:190, 192, 194, 196 y 198. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197 y 199. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:250, 252, 254, 256 y 258. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:251, 253, 255, 257 y 259.
[0403] En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a laminina-2 (por ejemplo, dominios 4 y/o 5 similares a laminina G (LG), o LG-4/5). En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:111-125; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38 y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:155-169. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 y 288. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287 y 289.
[0405] En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a laminina-2. En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246 y 248. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247 y 249.
[0407] En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a laminina-2 (por ejemplo, un dominio 5 similar a laminina G (LG), o LG-5). En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H2>comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:51-55, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:56-60, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:61-65; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:66-70, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:71-75, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:76-80. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:190, 192, 194, 196 y 198. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197 y 199. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:250, 252, 254, 256 y 258. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:251, 253, 255, 257 y 259.
[0409] En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a laminina-2 (por ejemplo, dominios 4 y/o 5 similares a laminina G (LG), o LG-4/5). En algunas realizaciones de cualquiera de los formatos descritos en el presente documento, el dominio V<H2>comprende una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:111-125; y/o en donde el dominio V<L2>comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38 y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:155-169. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el dominio V<H2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 y 288. En algunas realizaciones, el dominio V<L2>está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287 y 289.
[0411] Las secuencias de CDR a modo de ejemplo adecuadas para su uso en las proteínas de unión de la presente divulgación se proporcionan en las Tablas A-C a continuación. Las secuencias de VH y VL a modo de ejemplo (polipéptidos y ácidos nucleicos) adecuadas para su uso en las proteínas de unión de la presente divulgación se proporcionan en las Tablas D-I a continuación. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el dominio de unión comprende un dominio VH que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla A a continuación y/o un dominio VL que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla A a continuación. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une a laminina-2, en donde el dominio de unión comprende un dominio VH que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla B o la Tabla C a continuación y/o un dominio VL que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 6 secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en la Tabla A o la Tabla C a continuación. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el dominio de unión comprende un dominio VH que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia VH mostrada en la Tabla D a continuación y/o un dominio VL que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia VL mostrada en la Tabla D a continuación. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une a laminina-2, en donde el dominio de unión comprende un dominio VH que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia VH mostrada en la Tabla E o la Tabla F a continuación y/o un dominio VL que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia de VL mostrada en la Tabla E o la Tabla F a continuación. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano, en donde el dominio de unión comprende un dominio VH que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia VH codificada por una secuencia polinucleotídica mostrada en la Tabla G a continuación y/o un dominio VL que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia VL codificada por una secuencia polinucleotídica mostrada en la Tabla G a continuación. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une a laminina-2, en donde el dominio de unión comprende un dominio VH que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia VH codificada por una secuencia polinucleotídica mostrada en la Tabla H o la Tabla I a continuación y/o un dominio VL que comprende una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % idéntica a una secuencia VL codificada por una secuencia polinucleotídica mostrada en la Tabla H o la Tabla I a continuación.
[0413] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:171. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:230 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:231.
[0415] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:173. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:232 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:233.
[0417] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:175. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:234 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:235.
[0419] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 176 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:177. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:236 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:237.
[0421] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:238 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:239.
[0423] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:181. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:240 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:241.
[0425] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:183. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:242 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:243.
[0427] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:185. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:244 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:245.
[0428] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:187. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:246 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:247.
[0430] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:189. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:248 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:249.
[0432] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:76. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:191. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:250 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:251.
[0434] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:77. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:193. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:252 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:253.
[0436] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:78. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:195. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:254 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:255.
[0438] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:197. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:256 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:257.
[0440] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:75, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:80. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:199. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:258 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:259.
[0442] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:155. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:201. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:260 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:261.
[0444] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:82, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:156. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:203. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:262 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:263.
[0446] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:83, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:113; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:157. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:205. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:264 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:265.
[0448] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:84, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:114; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:158. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:207. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:266 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:267.
[0450] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:159. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:209. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:268 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:269.
[0452] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:160. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:211. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:270 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:271.
[0454] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:87, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:161. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:213. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:272 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:273.
[0456] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:118; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:148, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:162. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:215. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:274 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:275.
[0458] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:149, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:163. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:217. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:276 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:277.
[0460] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:150, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:219. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:278 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:279.
[0462] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:151, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:165. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:221. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:280 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:281.
[0464] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:152, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:166. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:223. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:282 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:283.
[0466] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:138, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:153, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:167. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 224 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:225. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:284 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:285.
[0468] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:139, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:168. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:227. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:286 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:287.
[0470] En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125; y/o (b) un dominio VL que comprende (i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140, (ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:154, y (iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:169. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:229. En algunas realizaciones, una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación comprende una secuencia de dominio VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad secuencial con una secuencia de dominio VH codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:288 y/o una secuencia de dominio VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio VL codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:289.
[0472] Un experto en la materia apreciará que las CDR y/o los dominios VH/VL de cualquiera de los anticuerpos antidistroglicano descritos en el presente documento pueden combinarse en una proteína de unión biespecífica con las CDR y/o los dominios VH/VL de cualquiera de los anticuerpos anti-laminina-2 (por ejemplo, anticuerpos que se unen a los dominios LG-4/5 y/o LG-5 de laminina-2) descritos en el presente documento en cualquier combinación o configuración (por ejemplo, que tiene un par de unión V<H1>/V<L1>específico para el dominio extracelular de distroglicano y un par de unión V<H2>/V<L2>específico para laminina-2, o que tiene un par de unión V<H2>/V<L2>específico para el dominio extracelular de distroglicano y un par de unión V<H1>/V<L1>específico para laminina-2).
[0474] Un experto en la materia apreciará que las CDR y/o los dominios VH/VL de cualquiera de los anticuerpos antidistroglicano descritos en la presente pueden combinarse en una proteína de unión multiespecífica con las CDR y/o los dominios VH/VL de cualquiera de los anticuerpos anti-laminina-2 (por ejemplo, anticuerpos que se unen a los dominios LG-4/5 y/o LG-5 de laminina-2) descritos en la presente en cualquier combinación o configuración. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más CDR mostradas en la Tabla A2 o de un dominio variable o secuencia polipeptídica mostrada en las Tablas D2, I2, I3 o I4. En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de dominio variable mostradas en las Tablas D2, I2, I3 o I4, o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de dominio variable codificadas por un polinucleótido mostrado en la Tabla G2 (por ejemplo, 1, 2 o 3 pares de unión VH/VL, comprendiendo cada uno un dominio VH y VL). En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo, proteína de unión multiespecífica) de la presente divulgación comprende 1, 2, 3 o 4 secuencias estructurales de dominio variable mostradas en la Tabla I4.
[0475]
[0478] 
[0481] 
[0484] 
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[0493]
[0494] Tabla E.Secuencias de aminoácidos de regiones VH y VL anti-LG-5.
[0495]
[0496]
[0497]
[0499] 
[0502] 
[0505] 
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[0514]
[0515] Tabla H.Secuencias de ácido nucleico de regiones VH y VL anti-LG-5.
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[0517]
[0518]
[0521] 
[0522]
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[0527]
[0528] Tabla I2.Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión multiespecíficas humanizadas.
[0529]
[0530]
[0531]
[0532]
[0533] Tabla I3.Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión biespecíficas humanizadas.
[0534]
[0535]
[0536]
[0537]
[0539] Tabla I4.Secuencias de aminoácidos y ADN de proteínas de unión humanizadas, multiespecíficas y biespecíficas.
[0540]
[0541]
[0542]
[0543]
[0544]
[0545]
[0546]
[0549] Proteínas diana
[0551] En el presente documento se proporcionan moléculas de unión multiespecíficas (por ejemplo, proteínas de unión) que incluyen un dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un dominio de unión que se une a laminina-2. Los términos "se une" y "se une específicamente" se usan indistintamente en el presente documento. En algunas realizaciones, un dominio de unión que "se une" a un antígeno (por ejemplo, laminina-2 o una porción extracelular de distroglicano) se une al antígeno con una K<D>menor que o igual a aproximadamente 1 × 10<-6>M. En algunas realizaciones, la afinidad de unión (por ejemplo, K<D>) del dominio de unión a antígeno al antígeno (por ejemplo, un epítopo de antígeno) se somete a ensayo usado el dominio de unión a antígeno en un anticuerpo monovalente o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la afinidad de unión (por ejemplo, K<D>) del dominio de unión a antígeno al antígeno (por ejemplo, un epítopo de antígeno) se ensaya usado el dominio de unión a antígeno en un formato multiespecífico de la presente divulgación.
[0553] Como se usa en el presente documento, distroglicano (DG) se refiere a la proteína asociada a distrofina que actúa como un componente del complejo de distrofina que une la matriz extracelular (ECM, también conocida como la lámina basal) al citoesqueleto asociado con F-actina de las fibras musculares. El distroglicano comprende dos subunidades, distroglicano alfa y distroglicano beta, que se escinden postraduccionalmente y se asocian de manera no covalente entre sí. En algunas realizaciones, el distroglicano es distroglicano humano (por ejemplo, una proteína codificada por el genDAG1humano como se expone en el ID génico de NCBI Ref. Seq. n.º 1605, o una proteína correspondiente a la entrada de UniProt Q14118). En algunas realizaciones, el distroglicano es distroglicano de ratón (por ejemplo, una proteína codificada por el genDag1de ratón como se expone en ID génico de NCBI Ref. Seq. n.º 13138, o una proteína correspondiente a la entrada de UniProt Q62165).
[0555] En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a alfa-distroglicano. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a beta-distroglicano. En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un epítopo o región dentro de la secuencia SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un epítopo o región dentro de la secuencia SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291). En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano humano. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano de ratón. En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a las porciones extracelulares de distroglicano humano y de ratón.
[0557] En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano humano con una constante de disociación en equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM, inferior a aproximadamente 500 nM, inferior a aproximadamente 400 nM, inferior a aproximadamente 300 nM, inferior a aproximadamente 200 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión entre un dominio de unión de la presente divulgación y la porción extracelular del distroglicano humano se mide cuando el dominio de unión está en un formato biespecífico, en lugar de como un dominio de unión monoespecífico (tal como un anticuerpo monoespecífico). En algunas realizaciones, un sitio de unión a antígeno de la presente divulgación que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a la porción extracelular de distroglicano humano con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM, inferior a aproximadamente 500 nM, inferior a aproximadamente 400 nM, inferior a aproximadamente 300 nM, inferior a aproximadamente 200 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, o inferior a aproximadamente 1 nM cuando se analiza como parte de una proteína de unión multiespecífica.
[0559] Como se usa en el presente documento, la laminina-2 (también conocida como merosina) se refiere a la proteína de membrana basal extracelular que se une al distroglicano. La laminina-2 se compone de tres subunidades: alfa, beta y gamma. En algunas realizaciones, la laminina-2 es la subunidad alfa 2 de laminina humana (por ejemplo, una proteína codificada por el genLAMA2humano como se expone en ID génico de NCBI Ref. Seq. n.º 3908, o una proteína correspondiente a la entrada de UniProt P24043). En algunas realizaciones, el distroglicano es la subunidad de laminina de ratón alfa 2 (por ejemplo, una proteína codificada por el genLama2de ratón tal como se expone en ID génico de NCBI Ref. Seq. n.º 16773, o una proteína correspondiente a la entrada de UniProt Q60675).
[0561] En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a laminina-2. En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende un dominio 4 similar a laminina G (LG) de laminina-2, un dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2, o ambos. En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:300). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un epítopo o región dentro de la secuencia VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:300). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:292). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un epítopo o región dentro de la secuencia ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO:292). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:301). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un epítopo o región dentro de la secuencia Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:301). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:293). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a un epítopo o región dentro de la secuencia ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO:293). En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a laminina-2 humana. En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a laminina-2 de ratón. En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a laminina-2 humana y de ratón.
[0563] En algunas realizaciones, un dominio de unión de la presente divulgación se une a laminina-2 humana con una constante de disociación en equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM, inferior a aproximadamente 500 nM, inferior a aproximadamente 400 nM, inferior a aproximadamente 300 nM, inferior a aproximadamente 200 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión entre un dominio de unión de la presente divulgación y laminina-2 humana se mide cuando el dominio de unión está en un formato biespecífico, en lugar de como un dominio de unión monoespecífico (tal como un anticuerpo monoespecífico). En algunas realizaciones, un sitio de unión a antígeno de la presente divulgación que se une a laminina-2 humana se une a laminina-2 humana con una constante de disociación en equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM, inferior a aproximadamente 500 nM, inferior a aproximadamente 400 nM, inferior a aproximadamente 300 nM, inferior a aproximadamente 200 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 1 nM cuando se ensaya como parte de una proteína de unión multiespecífica.
[0565] En algunas realizaciones, un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a laminina-2. En algunas realizaciones, un par de unión V<H2>/V<L2>de la presente divulgación se une a la porción extracelular de distroglicano, y un par de unión V<H1>/V<L1>de la presente divulgación se une a laminina-2.
[0567] Anticuerpos
[0569] La presente divulgación también proporciona anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monovalentes y/o monoclonales) que comprenden 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de un dominio de unión mostrado en la Tabla A2, D2 o I4, o una secuencia de dominio VH y/o VL de un dominio de unión mostrado en la Tabla D2 o I4 o codificado por una secuencia de polinucleótidos mostrada en la Tabla G2. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a una porción extracelular de distroglicano. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a laminina-2. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y (b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188; y el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y (b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 346 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 362. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 51-55 y 81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-60 y 96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-65 y 111-125; y (b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 66-70 y 126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, 71-75 y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76-80 y 155-169. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228; y el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 378 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 410 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 426. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:442, y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 458. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 474 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 490.
[0571] Ácidos nucleicos
[0573] En el presente documento se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las moléculas de unión multiespecíficas (por ejemplo, biespecíficas) (por ejemplo, proteínas de unión biespecíficas) de la presente divulgación.
[0575] Se usan metodologías convencionales de ADN recombinante para construir los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que forman las proteínas de unión, incorporar estos polinucleótidos en vectores de expresión recombinante e introducir dichos vectores en células hospedadoras. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3.ª ed.). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica, o como se describe en el presente documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada a propósito de, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descrita en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Similarmente, pueden usarse técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, administración y tratamiento de pacientes.
[0576] Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas de unión o cadenas polipeptídicas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado está unido operativamente a un promotor heterólogo para dirigir la transcripción de la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de unión. Un promotor puede referirse a secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Una primera secuencia del ácido nucleico está unida operativamente a una segunda secuencia del ácido nucleico cuando la primera secuencia del ácido nucleico se pone en una relación funcional con una segunda secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína de unión si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Los ejemplos de promotores pueden incluir, pero no se limitan a, promotores obtenidos de los genomas de virus (tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, virus 40 simio (SV40) y similares), de promotores eucariotas heterólogos (tales como el promotor de actina, un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico y similares), el promotor de CAG (Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991), el promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK), un promotor inducible de tetraciclina (Masui et al., Nucleic Acids Res.33:e43, 2005), el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las regiones principales operadoras y promotoras del fago lambda, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de la fosfatasa ácida de levadura y el promotor de los factores de alfa-apareamiento de levadura. Los polinucleótidos que codifican proteínas de unión de la presente divulgación pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor inducible, o cualquier otro promotor adecuado descrito en el presente documento u otro promotor adecuado que será reconocido fácilmente por un experto en la materia.
[0578] En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado está incorporado en un vector. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión. Los vectores de expresión pueden incluir una o más secuencias reguladoras unidas operativamente al polinucleótido a expresar. La expresión "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Ejemplos de potenciadores adecuados pueden incluir, aunque sin limitación, secuencias potenciadoras de genes de mamífero (tales como globina, elastasa, albúmina, α-fetoproteína, insulina y similares) y secuencias potenciadoras de un virus de células eucariotas (tal como el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, potenciadores de adenovirus y similares). Ejemplos de vectores adecuados pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, episomas, transposones y vectores víricos (por ejemplo, vectores adenovíricos, del virus de la variolovacuna, del virus Sindbis, del virus del sarampión, del virus del herpes, lentivíricos, retrovíricos, de virus adenoasociados, etc.). Los vectores de expresión pueden usarse para transfectar células hospedadoras, tales como, por ejemplo, células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero. Vectores víricos y plasmídicos de ADN biológicamente funcionales con capacidad de expresión y replicación en un hospedador son conocidos en la técnica, y pueden usarse para transfectar cualquier célula de interés.
[0580] En el presente documento se proporcionan además sistemas de vectores que comprenden múltiples vectores, en donde los múltiples vectores codifican colectivamente una proteína de unión biespecífica de la presente divulgación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un sistema de vector comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena polipeptídica de una molécula de unión biespecífica de la presente divulgación. En algunas realizaciones, un sistema de vector comprende una primera, segunda, tercera y cuarta cadena polipeptídica de una molécula de unión biespecífica de la presente divulgación.
[0582] Células hospedadoras y métodos de producción de proteínas de unión
[0584] Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a una célula hospedadora (por ejemplo, una célula hospedadora aislada) que comprende uno o más polinucleótidos aislados, vectores y/o sistemas de vector descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula hospedadora aislada de la presente divulgación se cultivain vitro.En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana (por ejemplo, una célula deE. coli). En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de levadura (por ejemplo, una célula deS.cerevisiae). En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de insecto. Ejemplos de células hospedadoras de insecto pueden incluir, por ejemplo, células deDrosophila(por ejemplo, células S2), células deTrichoplusia ni(por ejemplo, células High Five<™>) y células deSpodoptera frugiperda(por ejemplo, células Sf21 o Sf9). En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero. Ejemplos de células hospedadoras de mamífero puede incluir, por ejemplo, células renales embrionarias humanas (por ejemplo, células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión), células Expi293<™>, células CHO, células de riñón de cría de hámster (por ejemplo, BHK, ATCC CCL 10), células Sertoli de ratón (por ejemplo, células TM4), células de riñón de mono (por ejemplo, CV1 ATCC CCL 70), células de riñón de mono verde africano (por ejemplo, VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma de cuello uterino humano (por ejemplo, HELA, ATCC CCL 2), células de riñón canino (por ejemplo, MDCK, ATCC CCL 34), células de hígado de rata Buffalo (por ejemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (por ejemplo, W138, ATCC CCL 75), células de hígado humano (por ejemplo, Hep G2, HB 8065), células de tumor de mama ratón (por ejemplo, MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células FS4, una línea de hepatoma humano (por ejemplo, Hep G2) y células de mieloma (por ejemplo, células NS0 y SP2/0).
[0586] Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método de producción de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el método incluye a) cultivar una célula hospedadora (por ejemplo, cualquiera de las células hospedadoras descritas en el presente documento) que comprende un ácido nucleico aislado, vector y/o sistema de vector (por ejemplo, cualquiera de los ácidos nucleicos aislados, vectores y/o sistemas de vector descrito en el presente documento) en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la molécula de unión; y b) aislar la molécula de unión de la célula hospedadora.
[0588] En algunas realizaciones, pueden usarse múltiples células hospedadoras para producir componentes de una molécula de unión biespecífica (por ejemplo, proteína), que luego se ensamblan en la molécula de unión biespecífica. En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un método de producción de una proteína de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, comprendiendo el método: a) cultivar una primera célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende el primer dominio de unión en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la primera cadena polipeptídica como parte de una primera proteína de unión monoespecífica con un primer dominio CH3; b) cultivar una segunda célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende las condiciones del segundo dominio de unión de modo que la célula hospedadora expresa la segunda cadena polipeptídica como parte de una segunda proteína de unión monoespecífica con un segundo dominio CH3; c) aislar la primera proteína de unión monoespecífica de la primera célula hospedadora; d) aislar la segunda proteína de unión monoespecífica de la segunda célula hospedadora; e) incubar la primera y segunda proteínas de unión monoespecíficas aisladas en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas en la región bisagra experimenten isomerización de enlaces disulfuro; y f) obtener la proteína de unión biespecífica, en donde el primer y segundo dominios CH3 son diferentes y son tales que la interacción heterodimérica entre dichos primer y segundo dominios CH3 es más fuerte que cada una de las interacciones homodiméricas de dichos primer y segundo dominios CH3. Para mayor descripción, véase, por ejemplo, la publicación de patente preconcedida de EE. UU. n.º US2013/0039913 y Labrijn, A.F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci.110:5145-5150.
[0590] Los métodos de cultivo de células hospedadoras en condiciones para expresar una proteína son bien conocidos por los expertos en la materia. Los métodos de aislamiento de proteínas de células hospedadoras cultivadas se conocen bien por un experto habitual en la técnica, que incluyen, por ejemplo, por cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de dos etapas que comprende cromatografía de afinidad por proteína A seguido por cromatografía de exclusión por tamaño).
[0591] Usos de proteínas de unión
[0592] En el presente documento se proporciona además una molécula de unión biespecífica de la presente divulgación para su uso en métodos para tratar o prevenir una alfa-distroglicanopatía en un individuo. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
[0593] En el presente documento se proporciona además una molécula de unión multiespecífica de la presente divulgación para su uso en métodos para tratar o prevenir una alfa-distroglicanopatía en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo una molécula de unión multiespecífica de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
[0594] En algunas realizaciones, el individuo tiene una expresión reducida de alfa-distroglicano (por ejemplo, en comparación con la expresión en un individuo de control, o uno que carece de una mutación genética descrita en el presente documento). En algunas realizaciones, la expresión se refiere a la expresión en uno o más tejidos, por ejemplo, tejido muscular.
[0595] En algunas realizaciones, el alfa-distroglicano expresado en el individuo tiene O-glicosilación deteriorada o aberrante (por ejemplo, en comparación con la expresión en un individuo de control, o una que carece de una mutación genética descrita en el presente documento).
[0596] En algunas realizaciones, el individuo tiene, se le ha diagnosticado o tiene una propensión a desarrollar una alfadistroglicanopatía. En algunas realizaciones, el individuo tiene una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en: distroglicano (DAG1), proteína O-manosiltransferasa-1 (POMT1), proteína O-manosiltransferasa-2 (POMT2), subunidad 1 de la proteína O-manosa beta1,2-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT1), subunidad 2 de la proteína O-manosa beta1,4-N-acetilglucosilaminiltransferasa (POMGNT2), xilosil- y glucuroniltransferasa 1 (LARGE1), xilosil- y glucuroniltransferasa 2 (LARGE2), subunidad 1 de dolicil-fosfato manosiltransferasa (DPM1), subunidad 2 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM2), subunidad 3 de dolichil-fosfato manosiltransferasa (DPM3), fukutina, proteína relacionada con la fukutina (FKRP), que contiene el dominio de la isopreno sintasa (ISPD), proteína O-manosa cinasa (POMK), beta-1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (B3GALNT2), beta-1,4-glucuroniltransferasa 1 (B4GAT1), dolicol cinasa (DOLK), proteína transmembranaria 5 (TMEM5) y GDP-manosa pirofosforilasa B (GMPPB). En algunas realizaciones, una molécula de unión biespecífica de la presente divulgación se administra mediante infusión intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea.
[0597] Las proteínas de unión se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo e indirecto y ensayos de inmunoprecipitación para la detección y cuantificación de uno o más antígenos diana. Las proteínas de unión se unirán al uno o más antígenos diana con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se emplea.
[0598] También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión biespecífica de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.
[0599] También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión multiespecífica de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.
[0600] La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de aumento de volumen (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), materiales de relleno, monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sal (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alditoles (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronic; PEG; ésteres de sorbitán; polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos - por ejemplo, cloruro de sodio o potasio, o manitol sorbitol), vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18.ª Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), y las ediciones posteriores del mismo. Los materiales de formulación aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.
[0601] La composición farmacéutica óptima será determinada por un experto dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración prevista, el formato de administración y la dosis deseada. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberaciónin vivoy la tasa de depuraciónin vivode la proteína de unión.
[0602] El vehículo o excipiente principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o excipiente adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. Vehículos adicionales a modo de ejemplo son solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina. Otras composiciones farmacéuticas a modo de ejemplo comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En una realización de la divulgación, las composiciones de proteína de unión se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, la proteína de unión puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados, tales como sacarosa.
[0604] Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, normalmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
[0606] Cuando se contempla administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso pueden estar en forma de una disolución acuosa apirógena, aceptable por vía parenteral, que comprende la proteína de unión deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que una proteína de unión se formula como una disolución isotónica estéril, apropiadamente conservada. Otra preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), esferas o liposomas, que proporcionan liberación controlada o mantenida del producto que entonces puede administrarse mediante inyección de absorción retardada. También puede usarse ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos implantables de administración de fármacos.
[0608] También se contempla que determinadas formulaciones puedan administrarse por vía oral. En una realización de la divulgación, las proteínas de unión que se administran de este modo pueden formularse con o sin los vehículos habitualmente usados en la formulación de formas farmacéuticas sólidas, tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula se puede diseñar para liberar la porción activa de formulación en el momento en el tubo gastrointestinal cuando la biodisponibilidad es máxima y la degradación presistémica es mínima. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la proteína de unión. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes.
[0610] Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de proteínas de unión en una mezcla con excipientes atóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse soluciones en forma de dosis unitaria. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
[0612] Composiciones farmacéuticas adicionales de la divulgación serán evidentes para los expertos en la técnica, que incluyen formulaciones que implican proteínas de unión en formulaciones de administración sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una diversidad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como soportes de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de absorción retardada. Los ejemplos adicionales de preparados de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil-metacrilato), etileno-acetato de vinilo o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica.
[0614] Las composiciones farmacéuticas a usar para administraciónin vivonormalmente deben ser estériles. Esto se puede conseguir por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización usando este método puede realizarse antes de, o después de, la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. Además, las composiciones parentales, en general, se disponen en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
[0615] Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de su administración.
[0616] La cantidad eficaz de una composición farmacéutica de proteína de unión a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Por lo tanto, un experto en la materia apreciará que los niveles de dosis apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que se usa la proteína de unión, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y el estado (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el profesional clínico puede ajustar la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.
[0617] La frecuencia de administración dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de unión en la formulación que se esté usando. Normalmente, un profesional clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede almacenar administrar como una dosis única, como dos o más dosis (que pueden o pueden no contener la misma cantidad de molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua por un dispositivo o catéter de implante. El ajuste adicional de la dosis apropiada lo hace rutinariamente el experto en la materia y está dentro del ámbito de las tareas rutinariamente realizadas por ellos. Pueden determinarse dosis apropiadas mediante el uso de datos apropiados de respuesta a la dosis.
[0618] EJEMPLOS
[0619] La presente invención se comprenderá mejor por referencia a los siguientes Ejemplos.
[0620] Ejemplo 1: Identificación de anticuerpos anti-beta-DG ECD, anti-LG-5 y anti-LG-4/5.
[0621] Métodos
[0622] Expresión de proteínas
[0623] Para expresar el dominio extracelular beta-DG murino (ECD de mbeta-DG), se generó una construcción que contenía un casete con codones optimizados deE. colique codificaba una proteína de unión a maltosa aminoterminal, sitio de escisión de TEV, mbeta-DG (UniProt Q62165, aminoácidos 652-746) y una etiqueta HPC4 carboxiterminal, con pET22b como cadena del vector progenitor. La construcción se transformó en células pLysS Origami B (DE3) químicamente competentes (Novagen). La expresión se realizó a 37 °C, con inducción de ITPG a DO = 0,6. Se sedimentó las células y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasa libres de EDTA (Roche) y se lisaron mediante sonicación. Se purificó mbeta-DG-HPC4 a partir del lisado celular clarificado procesando el lisado celular sobre una columna de resina de amilosa (New England Biolabs), escindiendo la proteína de unión a maltosa con proteasa Turbo TEV (Eton Biosciences), procesando el digesto sobre una resina de amilosa y columna His-Trap FastFlow (GE Healthcare) para eliminar la proteína de fusión no digerida y la proteína de unión a maltosa escindida, y procesando el flujo a través de una resina Sepharose 4 FastF4 activada por NHS acoplada con anticuerpo anti-HPC4. Se llevó a cabo una purificación adicional en una columna de exclusión por tamaño Superdex 75 (GE Healthcare), y se recogieron y combinaron las fracciones de eluato con mbeta-DG-HPC4 altamente purificado (según se determinó ejecutando muestras de fracción en un gel SDS-PAGE y tinción de coomassie).
[0624] Para expresar el dominio 5 murino o similar a laminina G (mLG-5 o hLG-5) se generaron construcciones que contenían un casete con codones optimizados de mamífero que codificaba etiquetas Avi y HPC4 aminoterminales, y bien mLG-5 (véase UniProt Q60675, aminoácidos 2932-3118; SEQ ID NO:292) o bien hLG-5 (UniProt P24043, aminoácidos 2936-3122; SEQ ID NO:293). La construcción se usó para transfectar células Expi293F usando el reactivo Expifectamine (Thermo Fisher). Después de 7 días de expresión, la proteína biotinilada soluble se purificó a partir del sobrenadante con resina Sepharose 4 FastFlow activada por NHS (GE Healthcare) acoplada con anticuerpo anti-HPC4 de ratón.
[0625] Para expresar dominios 4 y 5 similares a laminina G murina o humana (mLG-4/5 o hLG-4/5), se generaron construcciones que contenían un casete con codones optimizados de mamífero que codificaba un compañero de fusión mIgG2a aminoterminal, sitio de escisión de TEV, una etiqueta AVI, una etiqueta HPC4 y mLG-4/5 (UniProt Q60675, aminoácidos 2725-3118; SEQ ID NO:292) o hLG-4/5 (UniProt P24043, aminoácidos 2729-3122; SEQ ID NO:293). Las construcciones se usaron para transfectar células Expi293F usando el reactivo Expifectamina (Thermo Fisher). Después de 7 días de expresión, la proteína soluble se purificó a partir del sobrenadante con una columna HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare). Se escindió mIgG2a de la proteína mLG-4/5 usando proteasa Turbo TEV (Nacalai EE. UU.), y se procesó el digesto sobre resina MabSelect Sure (GE Healthcare) y resina Ni-NTA (Qiagen) para eliminar la proteasa mIgG2a y TEV de mLG-4/5 purificada.
[0626] Presentación en fagos
[0627] Se acoplaron mbeta-DG, mLG-5 o mLG-4/5 y hLG-4/5 purificados (por ejemplo, alternando entre el uso de péptidos de ratón y humanos) a perlas magnéticas activadas por tosilo (Invitrogen) y se usaron para enriquecer las colecciones de presentación de fagos para los aglutinantes de mbeta-DG, mLG-5 o mLG-4/5. Se usaron colecciones de presentación en fagos de anticuerpos en selecciones de mbeta-DG, y se usó la colección de presentación en fagos de anticuerpos Dyax FAB 310 para las selecciones de hLG-4/5 y mLG-4/5. En primer lugar, las colecciones se agotaron de aglutinantes no específicos usando perlas no recubiertas y una proteína no relacionada marcada con HPC4-6xHis-Avi. A continuación, se realizaron tres rondas de selección en las colecciones agotadas, usando concentraciones decrecientes de antígeno en cada ronda (antígeno 500 nM en la ronda 1, hasta antígeno 1 nM en la ronda 3). Se sembraron en placas las colecciones enriquecidas, se recogieron clones de colecciones individuales y se cultivaron en un formato de 96 pocillos, y se produjeron anticuerpos monoclonales en fago para cada clon para el ensayo de unión ELISA en fagos.
[0628] Ensayo de unión ELISA en fagos
[0629] El antígeno purificado (mbeta-DG, mLG-5, hLG-5, mLG-4/5 o hLG-4/5) se recubrió en placas ELISA de 96 pocillos Nunc MaxiSorp (Thermo Scientific) a 1 ug/ml. Se añadieron anticuerpos monoclonales en fago de los clones de colecciones seleccionadas a cada pocillo y se detectó unión positiva o negativa usando secundario marcado con europio anti-M13 (GE Healthcare, anticuerpo marcado a medida por Perkin Elmer).
[0630] Secuenciación de la región variable
[0631] Se amplificaron y secuenciaron por PCR las reservas bacterianas de clones de unión positiva, y se identificaron secuencias únicas de cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable (VL).
[0632] Resultados
[0633] Se identificaron varios clones de colecciones de fagos con afinidad de unión específica por beta-DG, LG-5 y LG-4/5: 10 clones se unieron específicamente a beta-DG y 15 clones se unieron específicamente a LG-4/5. La secuenciación de estos clones reveló que las regiones variables pesadas y ligeras variables de cada clon eran distintas, como se muestra en las Tablas D a I, arriba (véanse, por ejemplo, los clones B04, B06, Cl-40968, CL-40992, CL-41136, CL-41400 y CL-41500). Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de estos clones se identifican en las Tablas A a C, arriba.
[0634] Ejemplo 2: Generación de hibridomas, anticuerpos monoclonales y anticuerpos quiméricos dirigidos contra beta-DG, LG-5 y LG-4/5.
[0635] Métodos
[0636] Producción de líneas celulares
[0637] Se crearon líneas celulares estables con expresión en superficie de beta-DG humano o murino mediante construcciones de optimización de codones que contenían una etiqueta myc aminoterminal y los dominios transmembranarios extracelulares y endógenos de beta-DG (UniProt Q62165 de ratón, aminoácidos 652-893; UniProt Q14118 humano, aminoácidos 654-895). Se transfectaron células renales embrionarias humanas adherentes (HEK) y células de ovario de hámster chino adherentes (CHO-K1) usando Lipofectamine (Thermo Fisher) y las células se seleccionaron con Geneticin (Gibco). Las células supervivientes se diluyeron en serie para la clonalidad de una sola célula y la expresión superficial de beta-DG se confirmó mediante citometría de flujo anti-myc.
[0638] Se crearon líneas celulares estables con expresión en superficie de LG-5 humana o murina mediante construcciones de optimización de codones que contenían una etiqueta myc aminoterminal, un conector Gly/Ser, LG-5 (UniProt Q60675 de ratón, aminoácidos 2932-3118; UniProt P24043 humano, aminoácidos 2936-3122) y un dominio transmembranario de Tfrl para la expresión de mamíferos. Se transfectaron células de ovario de hámster chino adherentes (CHO-K1) usando Lipofectamine (Thermo Fisher) y se seleccionaron las células con Geneticin (Gibco). Las células supervivientes se diluyeron en serie para la clonalidad de una sola célula y la expresión superficial de beta-DG se confirmó mediante citometría de flujo anti-myc.
[0639] Se crearon líneas celulares estables con expresión en superficie de LG-4/5 humana o murina mediante construcciones de optimización de codones que contenían una etiqueta myc aminoterminal, un conector Gly/Ser, LG-4/5 (UniProt Q60675 de ratón, aminoácidos 2725-3118; UniProt P24043 humano, aminoácidos 2729-3122) y un dominio transmembranario de Tfrl para la expresión de mamíferos. Se transfectaron células renales embrionarias humanas adherentes (HEK) usando Lipofectamine (Thermo Fisher) y las células se seleccionaron con Geneticin (Gibco). Las células supervivientes se diluyeron en serie para la clonalidad de una sola célula y la expresión superficial de beta-DG se confirmó mediante citometría de flujo anti-myc.
[0640] Inmunización de ratones
[0641] Se inmunizaron ratones BALB/c y Trianni con hbeta-DG, hLG-5 o hLG-4/5, a continuación se reforzaron con estas proteínas 3-4 veces cada dos semanas. Para los ratones inmunizados con hLG-4/5, los ratones se reforzaron adicionalmente 3 veces con merosina humana cada 2 semanas y una vez con un péptido sintético que tiene una secuencia idéntica entre LG-5 humana y de ratón (secuencia de aminoácidos =GFAKAVGGFKVGLDLLVEFE; SEQ ID NO:295).
[0642] Generación de hibridomas
[0643] Las células de hibridoma se prepararon fusionando células de mieloma de ratón (de una línea celular de linfoblastos B de Balb/c, SP2/0, fusionada con virus de Sendai) que son deficientes en adenosina fosforribosiltransferasa (APRT) con células del bazo de los ratones inmunizados. La selección de HAT (hipoxantina, azaserina y timidina) y las diluciones en serie se realizaron para lograr la clonalidad de una sola célula.
[0644] Ensayo de unión de anticuerpos ELISA
[0645] Para los ensayos ELISA, las placas recubiertas en beta-DG humano o LG-4/5 se bloquearon con suero bovino fetal al 5 % en PBS, y cada pocillo se incubó con un sobrenadante de cultivo distinto. Las placas se lavaron con PBS, se incubaron con anticuerpo secundario anti-Fc de ratón conjugado con HRP, se lavaron de nuevo con PBS y se desarrollaron para la medición colorimétrica.
[0646] Ensayo de unión a anticuerpos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
[0647] Para los ensayos FACS, se incubaron células estables con expresión en superficie beta-DG o LG-4/5 humana o murina (véase anteriormente) con sobrenadante de cultivo que contenía anticuerpo, se lavaron con PBS, se incubaron con anticuerpo secundario anti-Fc de ratón conjugado con FITC (Thermo Fisher), se lavaron de nuevo con PBS y se analizaron en un citómetro de flujo.
[0648] Ensayo cinético de resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
[0649] Los anticuerpos de hibridoma (contenidos en el sobrenadante del cultivo)t se caracterizaron adicionalmente midiendo la afinidad de unión de anticuerpo/antígeno y la velocidad de asociación/disociación mediante el ensayo de cinética Biacore, según el protocolo del fabricante (GE Healthcare). Los antígenos usados para la unión fueron beta-DG o LG-4/5 humano o murino.
[0650] Generación de anticuerpos monoclonales
[0651] Los clones de hibridoma se expandieron y se sembraron matraces terminales con suplemento de suero bovino fetal IgG ultra-bajo. Después de 7 días, se recogió el sobrenadante y se purificaron los anticuerpos monoclonales usando una columna HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare). Los anticuerpos resultantes se ensayaron de nuevo mediante ELISA, FACS y ensayo cinético de Biacore (GE Healthcare) para confirmar las propiedades de unión del anticuerpo.
[0652] Inmunofluorescencia
[0653] Se realizó tinción por inmunofluorescencia con secciones de tejido muscular humano y de ratón congeladas no fijadas. Las secciones de tejido muscular se tiñeron con anticuerpos purificados contra beta-DG o LG-4/5, se lavaron, se tiñeron con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia, se lavaron, se montaron y se obtuvieron imágenes usando un microscopio de fluorescencia.
[0654] Secuenciación de la región variable
[0655] El ARN total se aisló de células de hibridoma que produjeron anticuerpos de alta afinidad usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) y el ADNc de primera cadena se sintetizó usando el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech). Los segmentos génicos VH y VL se amplificaron mediante PCR por amplificación rápida en 5' de extremos de ADNc (5'-RACE) usando cebadores específicos de isotipo. Los fragmentos de PCR amplificados se clonaron y secuenciaron. Véanse, por ejemplo, los clones TDG-2, TDI-11, TDI-23, TDI-38, TLF39, TLF86, TLG3/TLG4, TLG26, TLI-3, TLI-7, TTLK71-4-6, TTLK123-3, TTLK145-6-3, TTLK170-2, WJL10 y WJL48.
[0656] Producción de anticuerpos quiméricos
[0657] Las secuencias de VH y VL generadas a partir de la PCR 5'-RACE se optimizaron en codones para la expresión de mamíferos y se sintetizaron. Las secuencias de VH se subclonaron en un vector de expresión de mamífero con IgG1 humana y las secuencias de VL se subclonaron en un vector de expresión de mamífero con la cadena kappa humana constante. Las células Expi293F se cotransfectaron con estas construcciones usando el reactivo de Expifectamina (Thermo Fisher) para expresar anticuerpos quiméricos. Después de 7 días de expresión, los anticuerpos se purificaron del sobrenadante con una columna HiTrap MabSelect SuRe (GE). Los anticuerpos purificados se volvieron a cribar mediante ELISA, FACS y Biacore (GE Healthcare) para confirmar la afinidad de unión a beta-DG, LG-5 o LG-4/5. Para confirmar que los anticuerpos se unían a sus respectivos antígenos en el tejido muscular, se realizó tinción de inmunofluorescencia con secciones de tejido muscular humano y de ratón congeladas no fijadas.
[0658] Resultados
[0659] Para detectar y seleccionar hibridomas que produjeron anticuerpos específicos para beta-DG, LG-5 o LG-4/5, se usaron ELISA, análisis FACS y el ensayo cinético Biacore para evaluar la unión del anticuerpo. Los ensayos ELISA mostraron una gama de afinidades de unión de anticuerpos a beta-DG, LG-5 o LG-4/5, proporcionando varias muestras una fuerte señal colorimétrica (se proporcionan datos a modo de ejemplo para tres anticuerpos en la Tabla J a continuación).
[0660] Tabla J.Cinética de unión de anticuerpo monoclonal anti-LG-5
[0662]
[0664] Las muestras que proporcionaban una señal colorimétrica fuerte se ensayaron usando FACS para determinar la afinidad de unión a células que expresaban beta-DG o LG-4/5 en su superficie. El análisis por FACS reveló que los anticuerpos derivados de los clones C21 y C3 tenían afinidad de unión por LG-4/5 tanto murino como humano (FIG.
[0665] 3C y 3G,respectivamente). Estos anticuerpos no se unieron a células de control que carecían de expresión superficial de beta-DG o LG-4/5, como se muestra por detección de fluorescencia insignificante.
[0666] Diversas cantidades de laminina-2 humana recombinante (de Biolamina), LG-5 murino, LG-5 humano, LG4/5 humano se inmutransfirieron por puntos sobre membrana de nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpo anti-laminina-2. Los resultados indicaron que los anticuerpos reconocieron laminina-2 o sus fragmentos que contenían LG-5 (FIG. 3D,arriba para C21). Para determinar la especificidad del anticuerpo, diferentes isoformas de laminina con diferentes cadenas alfa se inmutransfirieron por puntos sobre la inmunotransferencia. Solo se reconocieron mLG-5 y laminina-2 humana que contenía alfa-2, lo que respaldaba la especificidad de unión de los anticuerpos (FIG.3D,abajo para C21;
[0667] FIG.3Hpara C3).
[0668] También se caracterizaron clones de anticuerpos anti-distroglicano. La cinética reveló que todos los anticuerpos probados mostraban una alta afinidad por sus respectivos antígenos, con la mayoría de KD en el intervalo de 10<-9>M (sensibilidad nanomolar), como se muestra en la Tabla K y lasFIG.3I y 3J(clon AS30) y3M y 3N(clon AS19). Además, las velocidades de asociación y disociación para los anticuerpos evaluados fueron bastante típicas para los anticuerpos de alta afinidad, con la excepción del clon AS19 anti-beta-DG, que tenía velocidades de asociación y disociación muy altas (Tabla K).
[0669] Tabla K.Cinética de unión del anticuerpo monoclonal anti-beta-DG.
[0671]
[0673] Para caracterizar los clones AS30 y AS19, diversas cantidades de ECD de beta-DG de ratón o humano recombinante, distroglicano recombinante (de R&D Systems), lisado celular C2C12, lisado TA y Fabrazyme como control negativo se inmunotransfirieron por puntos sobre membrana de nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpo anti-beta-DG (FIG.
[0674] 3Kpara AS30;FIG.3Opara AS19). Los resultados indican que se detectaron todas las proteínas que contenían beta-DG. No se detectó ninguna señal con el lisado de C2C12 o TA, probablemente debido a una cantidad muy baja de beta-DG en estas muestras. Como se esperaba, los anticuerpos tampoco detectaron Fabrazyme de control negativo. La inmunoprecipitación de beta-DG a partir de lisados celulares C2C12 solubilizados en condiciones no desnaturalizantes se realizó con el clon anti-beta-DG AS30 o AS19. El complejo beta-DG/anticuerpo se capturó mediante perlas de proteína A y se ejecutó en SDS-PAGE, después se resondeó con anti-alfa-DG y anti-beta-DG de R&D Systems. Tanto alfa-DG como beta-DG se inmunoprecipitaron, lo que indica que permanecen en complejo después de la solubilización, y la unión de clones de anticuerpos anti-beta-DG no interfirió con la unión de alfa-DG a beta-DG (FIG.3Lpara AS30;FIG.3Ppara AS19).
[0675] Después de expandir los clones de hibridoma y purificar los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos se volvieron a cribar mediante ELISA, FACS y Biacore para confirmar la afinidad de unión. Los resultados fueron extremadamente similares a los generados para los anticuerpos a partir del sobrenadante del cultivo, lo que confirma que los anticuerpos conservan sus características cinéticas después de la amplificación.
[0676] Para determinar si los anticuerpos podrían unirse al tejido muscular, que contiene abundante beta-DG y LG-4/5, se realizó tinción de inmunofluorescencia en tejido muscular de ratón y humano usando anticuerpos purificados. Se usó tejido no fijado de modo que se conservara la conformación del antígeno nativo. Se demostró claramente la tinción característica del sarcolema muscular para tejidos humanos y de ratón, lo que indica la unión específica de LG-4/5 para C21 (FIG. 4A) y C3 (FIG. 4B), y unión de beta-DG específica para AS30 (FIG. 4C) y AS19 (FIG. 4D). Las secciones teñidas con solo anticuerpo secundario no revelaron ninguna señal fluorescente.
[0677] Ejemplo 3: Generación de anticuerpos biespecíficos que reconocen beta-DG y el dominio LG-4/5 de la subunidad alfa de laminina-2
[0678] Métodos
[0679] Generación de anticuerpos Ig en tándem biespecífico tetravalente (TBTI)
[0680] Las secuencias de VH y VL obtenidas a partir de células de hibridoma generadas se optimizaron en codones para la expresión de mamíferos y se sintetizaron (GenScript). Para generar construcciones que expresan las cadenas ligeras, se fusionaron una secuencia de VL específica para beta-DG, un conector (G4S)<2>, una secuencia de VL específica para LG-4/5 y la cadena kappa humana (Genbank Q502W4) o la cadena kappa murina (Genbank BAB33404) y se clonaron en el vector de expresión episómico transitorio PXL, un análogo del vector de PTT descrito por Durocher et al. (Nucl. Acids Res. 2002, 30(2), E9). Para generar construcciones que expresan las cadenas pesadas, se fusionaron entre sí una secuencia de VH específica para beta-DG, un conector (G4S)<2>, una secuencia de VH específica para LG-4/5 e IgG1 humana (Genbank Q569F4) o IgG1 murina (GenBank AAA75163.1) (Fig. 4A) y se clonaron en el vector de expresión pXL. Las secuencias de VH y VL usadas se obtuvieron de los clones AN01, C3 y C21 para la unión específica de LG-4/5, y del clon B6, AS19 y AS30 para la unión específica de beta-DG.
[0681] Estas construcciones se cotransfectaron en células HEK293 Freestyle 293-F o Expi293 (Thermo Fisher). Después de 7 días de expresión, los anticuerpos se purificaron del sobrenadante con una columna de proteína A HiTrap MabSelect<™>SuRe<™>(GE Healthcare).
[0682] Generación de anticuerpos de dominio variable dual Ig (CODVIg) cruzados
[0683] Las secuencias de VH y VL obtenidas a partir de células de hibridoma generadas se optimizaron en codones para la expresión de mamíferos y se sintetizaron (GenScript). Para generar construcciones que expresan las cadenas ligeras, se fusionaron una secuencia de VL específica para LG-4/5, un conector L<1>, una secuencia de VL específica para beta-DG, un conector L<2>y la cadena kappa humana (Genbank Q502W4) o cadena kappa murina (Genbank BAB33404) y se clonaron en el vector de expresión PXL. Para generar construcciones que expresan las cadenas pesadas, se fusionaron entre sí una secuencia de VH específica para beta-DG, un conector L<3>, una secuencia de VH específica para LG-4/5, un conector L<4>e IgG1 humana (Genbank Q569F4) o IgG1 murina (GenBank AAA75163.1) y se clonaron en el vector de expresión pXL. A continuación se proporcionan combinaciones específicas de secuencias conectoras usadas.
[0684] Estas construcciones se cotransfectaron en células HEK293 Freestyle 293-F o Expi293 (Thermo Fisher). Después de 7 días de expresión, los anticuerpos se purificaron del sobrenadante con una columna de proteína A HiTrap MabSelect<™>SuRe<™>(GE Healthcare).
[0685] Análisis secuencial de unión a Biacore
[0686] Los anticuerpos monoclonales progenitores (AS19, C3 y C21) y tres anticuerpos biespecíficos (AS19 x C3 y AS30 x C3 en TBTI y AS30 x C3 en CODVIg) se inmovilizaron cada uno en chips individuales CM5 Series S Biacore (GE Healthcare). Se hizo circular LG-4/5 humana o murina, seguido en secuencia por beta-DG humano o murino, sobre cada chip y se evaluó la unión.
[0687] ELISA tipo sándwich de doble cubierta
[0688] Se recubrieron placas de 96 pocillos con 50 ng de LG-4/5 humana y se bloquearon con suero bovino fetal al 5 % en PBS. Cada pocillo se incubó con 1 µg de los anticuerpos biespecíficos generados (esqueleto de IgG murina). Después de 2 horas, los pocillos se lavaron con PBS y se volvieron a incubar con 16 ng a 1 µg por pocillo de beta-DG humano fusionado a la región de anticuerpo Fc de hIgG1 humana (hbeta-DG-HFc). Después de 2 horas, los pocillos se lavaron con PBS, se incubaron con un anticuerpo secundario anti-HFC conjugado con HRP durante 45 minutos, se lavaron de nuevo con PBS y se desarrollaron para la medición colorimétrica.
[0689] Resultados
[0690] Los anticuerpos se modificaron por ingeniería genética en múltiples formatos biespecíficos incluyendo el formato de IgG en tándem biespecífico tetravalente (TBTI;FIG.5A) así como el formato de IgG de dominio variable dual cruzado (CODVIg;FIG.5B) como se ha descrito anteriormente. Para crear estos formatos se sintetizó una cadena ligera y un plásmido de cadena pesada para cada construcción. Una con una región de cadena ligera variable de un anti-βDG de las secuencias monoclonales enumeradas seguida de un conector y luego una
[0691] región de cadena ligera variable de un monoclonal anti-LG4/5 seguida de un conector adicional y luego el dominio de cadena ligera constante. Se usó el mismo principio para desarrollar los plásmidos de cadena pesada y después para la expresión estos se cotransfectaron en células de mamífero. Se intentaron múltiples combinaciones de conectores y se ensayaron ambas orientaciones de la región variable (es decir, que tenían el anti-LG4/5 más lejos de la región constante en lugar de la región variable anti-βDG y viceversa).
[0692] Se generaron anticuerpos biespecíficos (biAb) que reconocían beta-DG (usando los clones B06, AS19 y AS30) y LG-4/5 (usando los clones AN01, C3 y C21) en formato TBTI o CODVIg.
[0693] Se intentaron múltiples combinaciones de conectores y se ensayaron ambas orientaciones de la región variable (es decir, que tenían el anti-LG4/5 más lejos de la región constante en lugar de la región variable anti-βDG y viceversa). Para TBTI, (T1T2 y T5T6), el conector entre las regiones variables de cadena ligera consistía en 10 residuos que eran glicina o serina (por ejemplo, GGGGGSGGGS; SEQ ID NO:294) y no se usó ningún conector entre la segunda región variable y la región constante. Se usó el mismo conector (10 residuos que eran glicina o serina) entre las regiones variables de cadena pesada y no se usó conector entre la segunda variable de cadena pesada y la constante. Para el formato CODVIg, se usaron dos conjuntos de longitudes de conector: 10-10-0-0 y 7-5-1-2 (n.º de residuos para L<1>-L<2>-L<3>-L<4>). Los conectores CODVIg C5C6 consistieron en 10 residuos que eran glicina o serina entre cadenas ligeras variables y 10 residuos que eran glicina o serina entre la segunda región variable y la región constante ligera. No se usaron conectores en la cadena pesada. Las secuencias conectoras para estas combinaciones son las siguientes (representadas como L<1>, L<2>, L<3>, L<4>): GQPKAAP (SEQ ID NO:297), TKGPS (SEQ ID NO:298), S, RT; GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299), GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299), 0,0; y EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296), GG, EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296), GG. Una lista de anticuerpos biespecíficos creados se proporciona en la Tabla L a continuación.
[0694] Tabla L.Configuraciones de anticuerpos biespecíficos CODY y TBTI evaluadas.
[0696]
[0697]
[0699] Para confirmar que los biAb tienen la capacidad de unirse a LG-4/5 y beta-DG al mismo tiempo, se realizaron análisis secuencial de Biacore (GE Healthcare) y ensayos ELISA de doble cubierta.
[0700] Los mAb progenitores para LG-4/5 o beta-DG y biAb de anti-LG4/5 y beta-DG se capturaron en chips Biacore, y después fluyeron con LG4/5 humana y beta-DG humano secuencialmente para determinar sus uniones concurrentes a ambos antígenos. El análisis secuencial de Biacore reveló que los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a LG-4/5 humana (1.<er>pico,FIG.6A) o murina (1.<er>pico,FIG.6B) primero, y después se asocian adicionalmente con beta-DG humano (2.º pico,FIG. 6A) o murino (2.º pico,FIG. 6B). Por el contrario, los anticuerpos monoclonales progenitores solo pudieron unirse a una diana, ya sea LG-4/5 (C3 y C21 en lasFIG. 6A y 6B) o beta-DG (AS19 en lasFIG. 6A y6B).
[0701] El ELISA tipo sándwich de doble cubierta reveló que los anticuerpos biespecíficos pueden unirse simultáneamente a hLG-4/5 y hbeta-DG. Las señales colorimétricas se pudieron detectar solo cuando se añadieron hLG-4/5 y hbeta-DG-HFc en el ensayo (FIG. 7). No se detectó señal cuando se usaron anticuerpos monoclonales progenitores o cuando se omitió hbeta-DG-hFc. Tres anticuerpos biespecíficos (biAb), T1T2, T5T6 y C5C6, tenían la señal esperada que indicaba la unión simultánea a ambas dianas. Los mAb anti-LG4/5 o anti-beta-DG progenitores, o biAb sin beta-DG-HFc en la 2.ª etapa fueron todos negativos en este ensayo.
[0702] Ejemplo 4: Inyección intramuscular de anticuerpos biespecíficos en ratones LARGEmyd-3J/GrsrJ.
[0703] Métodos
[0704] Modelo de ratón LARGEmyd-3J/GrsrJ
[0705] Los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>(n.º de existencias 008581) de Jackson Lab es un modelo de ratón de alfadistroglicanopatía provocada por una mutación en el gen LARGE. La mutación de los mapas del gen LARGE entre D8Mit65 y DMit249, con marcadores a 44,4 Mb y 83,8 Mb, respectivamente; el gen LARGE está ubicado a 75,7 Mb. Los ratones homocigóticos para LARGE generalmente comienzan a mostrar evidencia de degeneración muscular a los dos a tres meses de edad, aunque algunos animales pueden presentar síntomas tan pronto como en la edad de destete. La incapacidad de extender las patas traseras hacia afuera cuando se sujeta al animal por la cola es un fenotipo inicial que progresa con la edad hasta incluir una marcha tambaleante y, posteriormente, un arrastre de las patas traseras.
[0706] Inyección de anticuerpos biespecíficos
[0707] A un grupo de 10 ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>se les administró inyecciones intramusculares en los músculos anteriores tibiales (TA) izquierdo y derecho. El TA izquierdo recibió dos inyecciones de biAb (T1T2; esqueleto de Fc murino) a 0,7 µg/µl en 50 µl de solución salina por inyección. El TA derecho recibió dos inyecciones de control de una mezcla 1:1 en peso por peso de anticuerpos AS19 y C3 parentales a 0,7 µg/µl en 50 µl de solución salina por inyección. Las dos inyecciones fueron con 3 días de diferencia.
[0708] Daño tisular inducido por el ejercicio
[0709] Un día después de la última inyección intramuscular, todos los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (IP) de colorante azul Evans (EBD) a 10 mg/ml con 50 µl administrados por 10 g de peso corporal. Un día después de la IP de EBD, todos los ratones fueron sometidos a ejercicio en una cinta de correr forzada hasta el agotamiento. Los animales se sacrificaron con CO<2>según el protocolo habitual de IACUC.
[0710] Preparación de tejidos y tinción de inmunofluorescencia
[0711] Después de la eutanasia, los músculos TA se retiraron, se cortaron y se colocaron en un compuesto de temperatura de corte óptima. A continuación, el tejido se congeló rápidamente mediante un baño de hielo seco con 2-metilbutano.
[0712] El tejido se criocortó en un criótomo, con un grosor de 10 micras. Se cortaron cuatro niveles diferentes (por triplicado) del TA, separados 100 micras.
[0713] Las secciones de portaobjetos se sumergieron rápidamente en PBS frío y se fijaron en acetona enfriada con hielo durante 15 minutos. Los portaobjetos se lavaron y se bloquearon (BSA al 2 % y suero de cabra normal al 1 % en PBS) durante una noche a 4 °C. Al día siguiente, los portaobjetos se incubaron con Alexa Fluor 488 anti-mIgG (Invitrogen) a una dilución 1:100 durante 2 horas (temperatura ambiente). Los portaobjetos se lavaron y montaron usando medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Labs). Los portaobjetos se visualizaron con un microscopio invertido (Olympus IX71) utilizando conjuntos de filtros apropiados.
[0714] Evaluación del daño de miofibras con colorante azul de Evans (EBD)
[0715] Las secciones de tejido se procesaron como anteriormente excepto sin tinción de inmunofluorescencia. Todas las fibras positivas para EBD en cada sección se contaron manualmente tanto para el TA izquierdo (biAb IM) como para el TA derecho (anticuerpo monoclonal progenitor IM).
[0716] Resultados
[0717] Con el fin de determinar si los biAb son capaces de unirse a antígenos nativos en tejidos musculares de ratón, se tiñeron secciones congeladas no fijadas de ratones de origen natural o LARGE<myd-3J/GrsrJ>, que son un modelo murino para la alfa-distroglicanopatía, con biAb (T1T2, T5T6, C5C6) o mAb progenitores. Los resultados indicaron que los biAb fueron capaces de unirse, así como también los mAb progenitores monoespecíficos, en secciones de tejido muscular de ratón tanto de origen natural (FIG.8A) como LARGE<myd-3J/GrsrJ>(FIG.8B).
[0718] A continuación, se administraron anticuerpos biespecíficos por vía intramuscular a ratones de origen natural o LARGE<myd-3J/GrsrJ>(el esquema del estudio se muestra en laFIG. 8C). Para evaluar el efecto de los anticuerpos biespecíficos sobre el daño tisular inducido por el ejercicio, se realizó inmunofluorescencia y tinción de miofibras con colorante azul de Evans sobre tejido de ratones sometidos a ejercicio. La inmunofluorescencia reveló que los anticuerpos biespecíficos se unieron bien al tejido muscular de ratón (músculo anterior tibial (TA) izquierdo o derecho) y fueron detectables 2 días después de la última inyección de anticuerpo (FIG. 8E). Los TA izquierdas tratados con biAb tenían significativamente menos fibras positivas para EBD en comparación con los TA de control contralaterales derechos (FIG. 8D). El tinte azul de Evans penetró muchas fibras musculares de tejido de ratón LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratado con una mezcla de anticuerpos progenitores, lo que indica daño inducido por el ejercicio ya que el tinte solo penetra y tiñe las fibras musculares con daño en la membrana (FIG.8E). Por el contrario, el tinte azul de Evans penetró significativamente menos fibras musculares del tejido de ratón LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratado con anticuerpos biespecíficos (FIG. 8E). Esto indica que la inyección local de anticuerpos biespecíficos, pero no de anticuerpos monoclonales progenitores, protegió el músculo del daño inducido por el ejercicio en un modeloin vivode alfa-distroglicanopatía en mamíferos.
[0719] Ejemplo 5: Suministro sistemático de anticuerpos biespecíficos en ratones LARGEmyd-3J/GrsrJ.
[0720] Métodos
[0721] Suministro de anticuerpos
[0722] Para las pruebas de daño tisular inducidas por el ejercicio, se inyectaron por vía intravenosa a cuatro grupos diferentes de ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>una dosis única de anticuerpo parental o biespecífico (con región Fc murina) a través de la vena lateral de la cola (IV) o intraperitoneal (IP). Cada grupo recibió uno de los siguientes: anti-LG-4/5 parental (clon C3, IV), anti-beta-DG parental (clon AS19, IV), biAb (AS19 x C3, IV) y biAb (AS19 x C3, IP). Un día después de la inyección, todos los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (IP) de colorante azul de Evans (EBD) a 10 mg/ml con 50 µl administrados por 10 g de peso corporal.
[0723] Para las pruebas de comportamiento, mediciones de creatina cinasa y experimentos de inmunofluorescencia de biodistribución, se aleatorizaron ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>(de 11-19 semanas de edad) en dos grupos (n=16) antes del tratamiento. Se administró a un grupo de ratones 30 mg de biAb (T1T2) por kg de ratón dos veces a la semana durante 7 semanas. El segundo grupo de ratones se administró con una mezcla de anticuerpos monoclonales parentales (AS19 y C3, 15 mg de anticuerpo por kg de ratón cada uno) dos veces a la semana durante 7 semanas. Para prevenir la reacción anafiláctica, se administraron previamente 5 mg por kg de difenhidramina por vía intraperitoneal 10 minutos antes de la administración de anticuerpos. Los ratones de origen natural se trataron con solución salina como control.
[0724] Daño tisular inducido por el ejercicio
[0725] 1 día después de la inyección intraperitoneal de EBD, todos los ratones fueron sometidos a ejercicio en una cinta de correr forzada hasta el agotamiento. Los animales se sacrificaron con CO<2>según el protocolo habitual de IACUC.
[0726] Pruebas conductuales y mediciones de creatina cinasa
[0727] Para la prueba de resistencia al agarre, se permitió que los ratones se aclimataran a la sala de ensayo durante 10 min antes de la prueba. El medidor de fuerza de agarre (Columbia Instruments, Columbus, OH) se montó horizontalmente sobre una superficie estable. El ratón de prueba se colocó suavemente en la parte superior de la rejilla de modo que se dejara que ambas patas delanteras y traseras se agarraran sobre la rejilla. A continuación, se tiró suavemente del animal hacia atrás por la cola hasta que se soltó el agarre. La cantidad de fuerza generada en el punto de liberación se registró en el medidor de esfuerzo (gramos). Este procedimiento se realizó 3 veces para cada animal y el valor de fuerza de agarre se calculó entonces como el promedio de tres ensayos.
[0728] Para la prueba de suspensión en alambre, cada animal se puso en una pantalla de alambre, que se desplazó suavemente de lado a lado hasta que el animal agarró el alambre. A continuación, la pantalla de alambre se levantó a aproximadamente 60,96 cm (2 pies) por encima de una almohadilla acolchada y se le dio la vuelta. Se registró el tiempo (latencia) del animal desde que se cayó de la pantalla de alambre hasta la almohadilla acolchada, con un tiempo de corte máximo de 60 segundos. Cada animal se evaluó dos veces con un tiempo de reposo de al menos 5 min entre las pruebas.
[0729] Los niveles de creatina cinasa (CK) se midieron al comienzo del estudio (antes del tratamiento con anticuerpos biespecíficos) y al final del estudio (1 h después de ejercicio en la cinta de correr después de 7 semanas de tratamiento con anticuerpos biespecíficos) mediante un ensayo colorimétrico habitual.
[0730] Preparación de tejidos y tinción de inmunofluorescencia
[0731] Para la detección de anticuerpos biespecíficos en órganos diana, los animales se sacrificaron 4 días después de la última inyección intramuscular de anticuerpo biespecífico. Los músculos TA se retiraron, se cortaron y se colocaron en un compuesto de temperatura de corte óptima. A continuación, el tejido se congeló rápidamente mediante un baño de hielo seco con 2-metilbutano. El tejido se criocortó en un criótomo, con un grosor de 10 micras.
[0732] Para las muestras de daño tisular inducido por el ejercicio, los músculos TA se retiraron, se cortaron y se colocaron en un compuesto de temperatura de corte óptima después del ejercicio. A continuación, el tejido se congeló rápidamente mediante un baño de hielo seco con 2-metilbutano. El tejido se criocortó en un criótomo, con un grosor de 10 micras. Se cortaron cuatro niveles diferentes (por triplicado) del TA, separados 100 micras.
[0733] Para ambos conjuntos de muestras de tejido, los portaobjetos se lavaron y se bloquearon (BSA al 2 % y suero de cabra normal al 1 % en PBS) durante una noche a 4 °C. Al día siguiente, los portaobjetos se incubaron con Alexa Fluor 488 anti-mIgG (Invitrogen) a una dilución 1:100 durante 2 horas (temperatura ambiente). Los portaobjetos se lavaron y montaron usando medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Labs). Los portaobjetos se visualizaron con un microscopio invertido (Olympus IX71) utilizando conjuntos de filtros apropiados
[0734] .
[0735] Evaluación del daño de miofibras con colorante azul de Evans (EBD)
[0736] Las secciones de tejido se procesaron como anteriormente excepto sin tinción de inmunofluorescencia. Todas las fibras positivas para EBD en cada sección se contaron manualmente tanto para el TA izquierdo (biAb IM) como para el TA derecho (anticuerpo monoclonal progenitor IM).
[0737] Resultados
[0738] Se administró a ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>30 mg/kg de biAb (T1T2) y los anticuerpos progenitores como control, ya sea mediante inyección en la vena de la cola (IV) o intraperitoneal (IP) para comparación. Las muestras de sangre se recogieron mediante sangrado ocular 24, 48, 72 y 96 h después de la administración, y los niveles de anticuerpos se midieron mediante ELISA recubierto con beta-DG (FIG. 8F) o LG4/5 (no mostrado). El biAb tuvo una tasa de aclaramiento similar a los mAb parentales. La administración IP dio como resultado una concentración elevada, pero la farmacocinética global del biAb fue similar a la administrada por IV. El mAb progenitor anti-LG4/5 no tenía señal cuando se usó beta-DG para el recubrimiento como era de esperar.
[0739] A continuación, se administraron anticuerpos biespecíficos IV a ratones de origen natural o LARGE<myd-3J/GrsrJ>. Las pruebas conductuales revelaron que los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>a los que se les administraron anticuerpos biespecíficos tuvieron un mejor rendimiento en la prueba de resistencia al agarre y la prueba de suspensión en alambre (FIG. 9A y 9B), que son medidas de la función muscular, que los ratones tratados con anticuerpos parentales monoclonales (FIG. 9A y 9B). Los ratones de origen natural de control tratados con solución salina también se muestran en lasFIG. 9A y 9B. Estos datos demuestran que los anticuerpos biespecíficos mejoraron la función muscular. Los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>a los que se les administraron anticuerpos biespecíficos también mantuvieron el rendimiento en la prueba de la cinta de correr, mientras que los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpo de control mostraron deterioro del rendimiento (FIG.9C).
[0740] A pesar de un bajo rendimiento en la prueba de la cinta de correr, los ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpo de control mostraron niveles aumentados de CK. La elevación significativa de los niveles séricos de CK indica daño muscular agudo como resultado de la falta de protección del sarcolema. Al final del estudio, los niveles de creatina cinasa fueron significativamente más bajos para ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratados con anticuerpos biespecíficos en comparación con ratones tratados con anticuerpos parentales monoclonales (FIG.9D). El tratamiento con anticuerpos biespecíficos redujo los niveles de creatina cinasa en ratones LARGE<myd-3J/GrsrJ>, lo que indica que los anticuerpos biespecíficos ayudaron a proteger los músculos del daño.
[0741] Para evaluar el efecto de los anticuerpos biespecíficos sobre el daño tisular inducido por el ejercicio, se realizó tinción de miofibras con colorante azul de Evans sobre tejido de ratones sometidos a ejercicio. El tinte azul de Evans penetró muchas fibras musculares de tejido de ratón LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratado con una mezcla de anticuerpos progenitores, lo que indica daño inducido por el ejercicio ya que el tinte solo penetra y tiñe las fibras musculares con daño en la membrana. Por el contrario, el tinte azul de Evans penetró significativamente menos fibras musculares del tejido de ratón LARGE<myd-3J/GrsrJ>tratado con anticuerpos biespecíficos que de ratones tratados con anticuerpos progenitores (FIG.10). Esto indica que el suministro sistemático de anticuerpos biespecíficos, pero no de anticuerpos monoclonales progenitores, protegió el músculo del daño inducido por el ejercicio.
[0742] Para la detección de anticuerpos biespecíficos en órganos diana, los animales se sacrificaron 4 días después de la última inyección intramuscular de anticuerpo biespecífico y se realizó tinción por inmunofluorescencia. La tinción reveló que incluso después de 4 días, el anticuerpo biespecífico T1T2 (AS19xC3) administrado por vía IV o intraperitoneal aún se unió específicamente al tejido muscular en el cuádriceps, TA, diafragma y corazón, pero no teñía el tejido cerebral, que se usó como control negativo (FIG.11,primera y segunda fila). El anticuerpo monoclonal parental AS19 no teñía bien el tejido muscular (FIG.11,tercera fila), potencialmente debido a una velocidad de disociación rápida del anticuerpo (véase la Tabla K). Sin embargo, el anticuerpo monoclonal parental C3 tiñó bien el tejido muscular (FIG.11,cuarta fila), como es consistente con laFIG.4B.
[0743] Se determinó la estructura global del Fab AS30 unido al antígeno beta-DG, mostrándose el antígeno entre la cadena pesada y la cadena ligera (FIG.12A). LaFIG.12Bmuestra una vista de cerca de las regiones CDR y el antígeno. Se mezclaron Fab AS30 y βDG humano a una relación molar 1:1 y se incubaron en hielo durante 30 minutos antes de someterse a una columna SEC Superdex 20010/300 GL (GE Healthcare) a 4 °C. El complejo AS30:βDG se cristalizó y su estructura se determinó con reemplazo molecular y se refinó hasta 2,55 Å. El Fab AS30 y la secuencia βDG D<738>RDPEKSSEDD<748>(SEQ ID NO:302) fueron visibles en el mapa de densidad de electrones. La estructura cristalina muestra que el anticuerpo AS30 reconoce el péptido lineal D<738>RDPEKSSEDD<748>(SEQ ID NO:302) en βDG.
[0744] Además, se determinó la estructura global del Fab C21 unido al dominio LG-5 de laminina-2 humana del antígeno, mostrándose el antígeno entre la cadena pesada y la cadena ligera (FIG. 12AC). LaFIG. 12Dmuestra una vista de cerca de las regiones CDR y el antígeno. La estructura del complejo C21:LG5 se obtuvo de una manera similar a AS30:βDG y se refinó hasta 2,70 Å. El Fab C21 y LG5 humana fueron ambos visibles en la electrodensidad, y C21 reconoce un epítopo conformacional en LG5.
[0745] Ejemplo 6: Generación de anticuerpos trivalentes multiespecíficos que reconocen beta-DG y laminina-2 Métodos
[0746] Humanización de anticuerpos
[0747] La humanización de los anticuerpos de hibridoma principales se realizó usando técnicas de injerto de CDR y modelado 3D. Los métodos para la humanización de anticuerpos se describen en Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988); Sims et al., J Immunol 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J Mol Biol 196: 901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151: 2623 (1993); las patentes de EE. UU. n.º 5.589.205; 5.565.332; 6.180.370; 6.632.927; 7.241.877; 7.244.615; 7.244.832; 7.262.050; y la publicación de patente de EE.UU. n.º 2004/0236078 (presentada el 30 de abril de 2004).
[0748] Expresión y purificación de anticuerpos
[0749] Los anticuerpos trivalentes contra aDG se construyeron creando vectores de expresión de mamíferos con regiones constantes de cadena pesada que contienen las variantes de botón en ojal, NNA, YTE y RF y regiones constantes de cadena ligera. Los dominios variables de ADN con los conectores deseados se sintetizaron e insertaron en los vectores de cadena pesada o ligera deseados. La configuración de cada triAb se muestra en la Tabla M (numeración de los dominios de unión a antígeno según el diagrama en laFIG.13, es decir, VH1/VL1 y VH2/VL2 forman el brazo CODV, y VH3/VL3 forma el brazo Fab). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de los triAb se proporcionan en la Tabla I2.
[0750] Tabla M.Configuraciones de triAb.
[0752]
[0754] Se produjeron anticuerpos trivalentes mediante cotransfección transitoria de cuatro plásmidos en células Expi293F con Expifectamine (Thermo Fisher Scientific, A14635). Los anticuerpos se purificaron con columnas MabSelect Sure (GE Healthcare, 11003494) seguido de intercambio catiónico con columnas HiTrap SP HP (GE Healthcare, 17115201). A continuación, se evaluaron todas las proteínas para determinar la concentración, pureza y agregación.
[0755] Doble unión de anticuerpos a antígenos humanos
[0756] Se realizó un ELISA tipo sándwich de unión dual recubriendo placas de 96 pocillos SA inmovilizadas Nunc de Thermo con 2 ug/ml de N'Avi-HPC4-LG4/5 humana biotinilada o beta-DG humano-HPC4-Avi-C' biotinilada. Después de la incubación durante la noche a 4 °C, las placas se bloquearon con PBS+BSA al 1%+Tween al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar (BioTek ELx405 Select CW) con PBS, los anticuerpos trivalentes o progenitores se añadieron a la placa comenzando a 8 ug/ml y se realizó una dilución doble a través de la placa, el anticuerpo se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el segundo antígeno de beta-DG-MFE (FIG 1A) o LG4/5-MFC a 5 ug/ml. Después del segundo antígeno, se añadió un anticuerpo secundario de burro anti-ratón (Jackson ImmunoResearch) a una dilución 1:2.000 durante 30 minutos. Se resuspendió ABTS en tampón ABTS (Roche) y se añadió a los pocillos para su detección. La señal resultante se leyó con el lector de placas EnVision Multimode de Perkin Elmer a 405 nm.
[0757] Para la unión dual secuencial de antígenos a anticuerpos trivalentes, se usó un chip de proteína G de sensor de la serie S (GE Healthcare, 29179315) con un T100 Biacore. Este chip se usó para inmovilizar el anticuerpo trivalente o progenitor en la superficie (60 segundos con 5 ug/ml de anticuerpo). Después de la captura, se hizo fluir 200 nM de LG4/5 sobre el chip durante 60 segundos seguido de 200 nM de beta-DG durante 60 segundos. La unión al anticuerpo trivalente se observó mediante el cambio de masa detectado en el chip en unidades relativas (UR).
[0758] Ensayo de cinética de unión
[0759] Los datos del ensayo cinético de resonancia de plasmones superficiales ("SPR;" T100 Biacore; GE Healthcare) con los anticuerpos trivalentes se realizaron inmovilizando los anticuerpos (10 ug/ml) en un chip de proteína G Sensor S y luego haciendo circular diluciones en serie de antígeno sobre el chip (LG4/5: 80 nM-1,25 nM, BDG: 5 nM -0,31 nM y 4 nM-0,25 nM). Los datos se evaluaron con un modelo de unión 1:1 usando el software BIAevaluation.
[0760] Resultados
[0761] Se generaron anticuerpos trivalentes (triAb) según el formato mostrado en laFIG. 13. Estos triAb tenían un brazo CODV con dos dominios de unión al antígeno anti-laminina-2 distintos (VH-1/VL-1 y VH-2/VL-2 en laFIG. 13) y un brazo Fab (VH-3/VL-3 en laFIG.13) con un dominio de unión a antígeno anti-beta-DG.
[0762] Para mostrar la unión de los triAb a ambos antígenos, se realizó un ELISA tipo sándwich de unión dual como se describió anteriormente usando 2 ug/ml de N'Avi-HPC4-LG4/5 humana biotinilada (FIG. 14A) o beta-DG humano-HPC4-Avi-C' biotinilada (FIG. 14B). En ambas orientaciones, todos los triAb evaluados mostraron unión dual simultánea.
[0763] Además, se realizó resonancia de plasmones superficiales para mostrar la unión secuencial de los antígenos de laminina-2 y beta-DG humanos (FIG.1C). Los triAb mostraron unión a ambos antígenos, mientras que los anticuerpos monoclonales (variantes C3 y C21 humanizadas para unirse a laminina-2 y variante de AS30 humanizada para unirse a beta-DG) solo se unieron a su antígeno respectivo.
[0764] Se usó SPR como se ha descrito anteriormente para analizar la cinética de la unión de triAb a la laminina-2 (Tabla N) o beta-DG (Tabla O).
[0765] Tabla N.Unión de triAb a laminina-2 (SPR).
[0767]
[0768]
[0770] Tabla O.Unión de triAb a beta-DG (SPR).
[0772]
[0774] Como se muestra en la Tabla N, cinco triAb fueron capaces de unirse a beta-DG humano con afinidad nanomolar (K<D>entre 1,3-2,1 nM), comparable a la del dominio de unión a antígeno AS30 humanizado usado en formato de anticuerpo monovalente (0,8 nM). De manera similar, la Tabla O muestra que los mismos triAb también fueron capaces de unirse a laminina-2 humana con afinidad nanomolar (K<D>entre 10,2-14,9 nM), comparable a las de los dominios de unión a antígeno C3 y C21 humanizados usados en formato de anticuerpo monovalente (9,8 nM y 9,0 nM, respectivamente). Estos datos demuestran que anticuerpos anti-laminina-2/beta-DG biespecíficos en el formato trivalente ilustrado en laFIG. 13fueron capaces de unirse simultáneamente de forma dual a sus dianas con afinidad de unión similar en comparación con un formato de anticuerpo monovalente tradicional.
[0775] Ejemplo 7: Mejora de las funciones musculares de ratones LARGEmyd-3J/GrsrJ en pruebas de comportamiento después del tratamiento con anticuerpos trivalentes multiespecíficos que reconocen beta-DG y laminina-2 Métodos
[0776] Administración de anticuerpos
[0777] Los ratones LARGE/myd-3j descritos en el Ejemplo 4 (edades a las 8-16 semanas) se aleatorizaron en cinco grupos basándose en su puntuación de extensión de las patas traseras, puntuación de suspensión en alambre, fuerza de agarre y cinta de correr para garantizar que estas puntuaciones fueran similares entre los grupos (n=11) antes del tratamiento. A continuación, los ratones se administraron con 30 mg/kg dos veces a la semana mediante inyección en la vena de la cola (lunes y jueves) con TriAb (3407, 3437 y 3439) y un TriAb de control que reconoce dianas proteicas no relacionadas, así como un grupo salino como controles durante hasta 3,5 semanas con 7 dosis. Además, se incluyó un grupo de ratones de origen natural (n=6) como referencias para las pruebas conductuales. Para prevenir la reacción anafiláctica, se administraron previamente IP 5 mg/kg de difenhidramina 10 min antes de la administración de anticuerpos. La fuerza de agarre y la suspensión en alambre se evaluaron semanalmente comenzando en la semana 2. Los de origen natural se trataron con solución salina como referencias para diversas pruebas conductuales.Pruebas conductuales
[0778] Para la prueba de extensión de las patas traseras, los ratones se levantaron por sus colas, y se registraron y clasificaron las posiciones de las patas traseras con respecto al cuerpo.
[0779] La prueba de suspensión en alambre se llevó a cabo colocando ratones en una rejilla de alambre y aclimatando durante 1 min; a continuación, se le dio la vuelta a la rejilla de alambre con el ratón agarrándose a una velocidad definida de 2 s, y se registró el tiempo que el ratón mantuvo sobre la rejilla, con un tiempo de corte de 60 s. La prueba se repitió 3 veces para cada ratón y se promediaron los resultados.
[0780] La fuerza de agarre se evaluó colocando los ratones en un medidor de fuerza de agarre (Columbus Instruments), permitiendo que el ratón agarrara firmemente la rejilla metálica y tirando de la cola horizontalmente hasta que el ratón se soltara; a continuación, se registró la fuerza. La prueba se repitió 5 veces con un reposo de 1 min entremedias. Se eliminaron las lecturas más altas y más bajas de cada ratón y los resultados fueron el promedio de las tres lecturas restantes.
[0781] Para el tiempo corriendo en la cinta de correr, se colocó a los ratones en carriles individuales de una cinta de correr equipada con una rejilla de descargas eléctricas (modelo 1055SRM Exer-3/6, Columbus Instruments). Los animales se aclimataron a la cinta de correr durante 5 min, y después los ratones se ensayaron con un protocolo definido con velocidad creciente. Cuando un ratón pasó más de 3 s en la rejilla de descargas sin poder correr, la rejilla de descargas se apagó y se registró el tiempo total corriendo.
[0782] Todas las pruebas conductuales se realizaron mientras estaban cegadas a la identidad y el tratamiento del ratón, con los resultados sin enmascarar después de la prueba.
[0783] Resultados
[0784] Los triAb generados en el Ejemplo 6 se evaluaron para determinar sus efectos sobre la función muscular en ratones LARGE/myd-3j.
[0785] Los ratones LARGE/myd-3j mostraron un rendimiento significativamente mejorado en la resistencia al agarre (FIG.15) y suspensión en alambre (FIG. 16) después de dos semanas de tratamiento con TriAb 3407, 3437 o 3439, como se observó con el tratamiento con biAb descrito previamente (véase el Ejemplo 5). El rendimiento de la cinta de correr se mantuvo o mejoró ligeramente con el tratamiento con TriAb (FIG. 17), sin embargo, sin importancia estadística en comparación con los controles, que en su lugar demostraron un ligero deterioro. Normalmente, la mejora estadísticamente significativa en el tiempo corriendo en la cinta de correr requiere más tiempo de tratamiento.
[0786] Tomados en conjunto, los resultados de múltiples ensayos funcionales demostraron que el tratamiento con anticuerpos trivalentes y biespecíficos anti-laminina-2/beta-DG condujo a una función muscular mejorada en un modelo murino para la alfa-distroglicanopatía.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES
1. Una molécula de unión multiespecífica que comprende al menos un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y al menos un segundo dominio de unión que se une a laminina-2, en donde la molécula de unión multiespecífica es una proteína de unión multiespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas,
en donde la proteína de unión comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L2>-L<1>-V<L1>-L<2>-C<L>[I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H1>-L<3>-V<H2>-L<-4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H3>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L3>-C<L>[IV]
en donde:
VL1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VH1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
CH2 es un dominio constante de la cadena pesada CH2 de inmunoglobulina;
CH3 es un dominio constante de la cadena pesada CH3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios CH1 y CH2; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores aminoacídicos;
en donde el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada; y
en donde V<H1>y V<L1>forman un sitio de unión a antígeno, en donde V<H2>y V<L2>forman un sitio de unión a antígeno, y en donde V<H3>y V<L3>forman un sitio de unión a antígeno para un total de tres sitios de unión a antígeno, y en donde los tres sitios de unión a antígeno comprenden al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano y al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2.
2. La molécula de unión multiespecífica de la reivindicación 1, que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano y dos sitios de unión a antígeno que se unen a laminina-2, preferiblemente en donde V<H1>y V<L1>forman un primer sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, V<H2>y V<L2>forman un segundo sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, y V<H3>y V<L3>forman un tercer sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano.
3. La molécula de unión multiespecífica de la reivindicación 1, que comprende dos sitios de unión a antígeno que se unen a la porción extracelular de distroglicano y un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2, preferiblemente en donde V<H1>y V<L1>forman un primer sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano, V<H2>y V<L2>forman un segundo sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano, y V<H3>y V<L3>forman un tercer sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2.
4. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:
(a) el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a la porción extracelular de distroglicano con una constante de disociación de equilibrio (K<D>) inferior a aproximadamente 1 µM cuando se ensaya como parte de una proteína de unión multiespecífica;
(b) el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a las porciones extracelulares de distroglicano humano y de ratón;
(c) el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano se une a betadistroglicano o alfa-distroglicano;
(d) el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a laminina-2 humana;
(e) el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a laminina-2 de ratón y humana; y/o (f) el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 se une a un polipéptido que comprende un dominio 4 similar a laminina G (LG) de laminina-2, un dominio 5 similar a laminina G (LG) de laminina-2, o ambos.
5. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4,
en donde el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-8, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9-17 y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18-27; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28-37, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:38-42 y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:43-50; y/o
en donde el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51-55 y 81-95, una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 56-60 y 96-110, y una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 61-65 y 111-125; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66-70 y 126-140, una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 38, 71-75 y 141-154, y una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76-80 y 155-169.
6. La molécula de unión multiespecífica de la reivindicación 5, en donde:
(a) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186 y 188; y
(b) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 y 189; y/o
(c) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 y 228; y
(d) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227 y 229.
7. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde
el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:316, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:318 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:320; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:332, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:334, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:336; y/o
el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400; o
el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464.
8. La molécula de unión multiespecífica de la reivindicación 7, en donde:
(a) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:314; y
(b) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:330; o
(c) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:346; y
(d) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a la porción extracelular de distroglicano comprende la secuencia de SEQ ID NO:362.
9. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-8, en donde el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:396, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400, o
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:380, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:382 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:384; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:428, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:398, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:400.
10. La molécula de unión multiespecífica de la reivindicación 9, en donde:
(a) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:378; y
(b) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:394; o
(a) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:410; y
(b) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:426.
11. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-8, en donde el al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende:
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:446 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464; o
(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:444, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:478 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:448; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:460, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:462, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:464.
12. La molécula de unión multiespecífica de 11, en donde:
(a) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:442; y
(b) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:458; o
(a) el dominio VH del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:474; y
(b) el dominio VL del al menos un sitio de unión a antígeno que se une a laminina-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:490.
13. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde L<1>y L<2>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534), o en donde L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534), o en donde L<1>, L<2>, L<3>y L<4>comprenden la secuencia DKTHT (SEQ ID NO: 534).
14. Una molécula de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2,
en donde la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, y
en donde la molécula de unión biespecífica comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman cuatro sitios de unión a antígeno, en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden una estructura representada por la fórmula:
V<L1>-L<1>-V<L2>-L<2>-C<L>[I]
y dos cadenas polipeptídicas comprenden una estructura representada por la fórmula:
V<H2>-L<3>-V<H1>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
en donde:
V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores aminoacídicos;
en donde los dominios V<H1>and V<L1>forman un par de unión V<H1>/V<L1>, y en donde los dominios V<H2>y V<L2>forman un par de unión V<H2>/V<L2>.
15.La molécula de unión biespecífica de la reivindicación 14, en donde L<1>, L<2>, L<3>y L<4>tienen cada uno de 0 a 50 residuos aminoacídicos de longitud, preferiblemente en donde L<1>, L<2>, L<3>y L<4>tienen cada uno de 0 a 25 residuos aminoacídicos de longitud, o tienen cada uno de 0 a 14 residuos aminoacídicos de longitud.
16.Una molécula de unión biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a una porción extracelular de distroglicano y un segundo dominio de unión que se une a laminina-2,
en donde la molécula de unión biespecífica es una proteína de unión biespecífica que comprende una o más cadenas polipeptídicas, y
en donde la molécula de unión biespecífica comprende dos cadenas ligeras que comprenden una estructura representada por la fórmula:
V<L1>-L<5>-V<L2>-L<6>-C<L>[III]
y dos cadenas pesadas que comprenden una estructura representada por la fórmula:
V<H1>-L<7>-V<H2>-L<8>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[IV]
en donde:
V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
C<H3>es un dominio constante de la cadena pesada C<H3>de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios C<H1>y C<H2>; y
L<5>, L<6>, L<7>y L<8>son conectores aminoacídicos;
en donde los dominios V<H1>and V<L1>forman un par de unión V<H1>/V<L1>, y en donde los dominios V<H2>y V<L2>forman un par de unión V<H2>/V<L2>.
17.Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la molécula de unión biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16.
18.Un sistema de vectores que comprende:
(a) uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena polipeptídica de una molécula de unión multiespecífica de la reivindicación 1; o
(b) uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena polipeptídica de una molécula de unión biespecífica de la reivindicación 14, o
(c) uno o más vectores que codifican dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de una molécula de unión biespecífica de la reivindicación 16.
19.Una célula hospedadora aislada que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 17, o que comprende el sistema de vectores de la reivindicación 18.
20. Un método de producción de una molécula de unión multiespecífica o una molécula de unión biespecífica, comprendiendo el método:
a) cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 19 en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la molécula de unión multiespecífica o molécula de unión biespecífica; y
b) aislar la molécula de unión multiespecífica o molécula de unión biespecífica de la célula hospedadora.
21. La molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la molécula de unión biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16 para su uso en un método para tratar o prevenir una alfadistroglicanopatía en un individuo.
22. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la molécula de unión biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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