ES3056082T3 - T cell receptors recognizing mutated p53 - Google Patents

Abstract

Se describe un receptor de células T (TCR) aislado o purificado con especificidad antigénica para p53 humano mutado. También se describen polipéptidos y proteínas relacionados, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped, poblaciones celulares y composiciones farmacéuticas. También se describen métodos para detectar la presencia de cáncer en mamíferos y métodos para tratar o prevenir el cáncer en mamíferos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Receptores de células T que reconocen p53 mutada

[0003] Referencia cruzada a la solicitud relacionada

[0004] Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente estadounidense provisional n.º 62/565.383, presentada el 29 de septiembre de 2017.

[0005] Declaración en relación con la investigación o el desarrollo patrocinados por el gobierno federalEsta invención se realizó con el apoyo del gobierno según el número de proyecto BC010985 por parte de los Institutos nacionales de salud, Instituto nacional del cáncer. El gobierno tiene ciertos derechos con respecto a la invención.

[0006] Material presentado por vía electrónica

[0007] En el presente documento se incorpora una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador presentada de manera simultánea con el presente documento e identificada de la siguiente manera: Un archivo de 687.555 bytes de ASCII (texto) llamado “739980_ST25.txt”, con fecha del 7 de septiembre de 2018.

[0008] Antecedentes de la invención

[0009] Algunos cánceres pueden tener opciones de tratamiento muy limitadas, particularmente cuando el cáncer se vuelve metastásico e irresecable. A pesar de los avances en tratamientos tales como, por ejemplo, cirugía, quimioterapia y radioterapia, el pronóstico para muchos cánceres, tales como, por ejemplo, cánceres pancreático, colorrectal, pulmonar, endometrial, ovárico y prostático, puede ser malo. Por consiguiente, existe una necesidad no cumplida de tratamientos adicionales para el cáncer.

[0010] El documento WO 2015/164594 da a conocer receptores de antígenos quiméricos para su uso en terapia y métodos para producir los mismos.

[0011] Breve resumen de la invención

[0012] Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para p53 R175H humana mutada presentada por antígeno leucocitario humano (HLA)-A2, en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1, y en donde el TCR comprende una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92.

[0013] Una realización de la invención proporciona un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional de un TCR que tiene especificidad antigénica para p53 humana con la mutación R175H presentada por HLA-A2, en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1, y en donde la porción funcional comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y una secuencia de aminoácidos de cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92.

[0014] Una realización de la invención proporciona una proteína aislada o purificada que comprende:

[0015] una primera cadena de polipéptido de TCR que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y

[0016] una segunda cadena de polipéptido de TCR que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92,

[0017] en donde la primera cadena de polipéptido de TCR y la segunda cadena de polipéptido de TCR forman una porción funcional de un TCR según la invención, en donde la porción funcional tiene especificidad antigénica por p53 humana con la mutación R175H presentada por HLA-A2, y en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1.

[0018] Otras realizaciones de la invención proporcionan ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas relacionadas con los TCR de la invención. Aún otras realizaciones de la invención proporcionan métodos de detección de la presencia de cáncer en un mamífero y los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped y composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de cáncer en un mamífero.

[0019] Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

[0020] La figura 1 es un gráfico que muestra la concentración de IFN-γ (pg/ml) medida después del cocultivo de PBL autólogos transducidos con uno de los TCR indicados del paciente 4127 después del cocultivo con células dendríticas autólogas (DC) pulsadas con péptido p53-G245 WT (wt) (barras sin sombrear) o péptido p53-G245S mutado (mut) (barras sombreadas) a las concentraciones de péptido decrecientes indicadas (µg/ml).

[0021] La figura 2 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de CD4+ mTCRβ+) detectadas después del cocultivo de PBL autólogos transducidos con uno de los TCR indicados del paciente 4127 con DC autólogas pulsadas con péptido p53-G245 WT (wt) (barras sin sombrear) o péptido p53-G245S mutado (mut) (barras sombreadas) a las concentraciones de péptido decrecientes indicadas (µg/ml).

[0022] La figura 3 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de CD4+ mTCRβ+) detectadas después del cocultivo de PBL autólogos transducidos con uno de los TCR indicados del paciente 4127 con DC autólogas pulsadas con uno de los péptidos mostrados en la tabla A.

[0023] La figura 4 es un gráfico que muestra la concentración de IFN-γ (pg/ml) medida después del cocultivo de TIL del paciente 4127 o células T transducidas con uno de los TCR indicados con células COS7 que se transdujeron con uno de los alelos de HLA indicados y se pulsaron con DMSO o uno de los péptidos indicados.

[0024] La figura 5 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de CD4+ mTCRβ+) detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4127 o células T que se transdujeron con uno de los TCR indicados con células COS7 que se transdujeron con uno de los alelos de HLA indicados y se pulsaron con DMSO o uno de los péptidos indicados.

[0025] La figura 6 es un gráfico que muestra el número de manchas por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de TIL del paciente 4127 con APC alogénicas (DRB3*01:01:01 o DRB3*02:02:01) que (1) se sometieron a electroporación con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas con rayado a la izquierda), p53 WT (p53-WT; barras grises con rayado a la izquierda) o p53 mutada (p53-MUT; barras grises) o (2) se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas con rayado a la derecha) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-G245 WT (LP-p53-wt-G245; barras grises con rayado a la derecha) o secuencia de p53-G245S mutado (LP-p53-mut-G245S; barras negras).

[0026] La figura 7 es un gráfico que muestra el número de manchas por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de células que expresan 4127-TCR1 con APC alogénicas (DRB3*01:01:01 o DRB3*02:02:01) que (1) se sometieron a electroporación con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas con rayado a la izquierda), p53 WT (p53-WT; barras grises con rayado a la izquierda) o p53 mutada (p53-MUT; barras grises) o (2) se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas con rayado a la derecha) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-G245 WT (LP-p53-wt-G245; barras grises con rayado a la derecha) o secuencia de p53-G245S mutado (LP-p53-mut-G245S; barras negras).

[0027] La figura 8A es un gráfico que muestra la secreción de IFN-γ (manchas/2 x 10<4>células) medida después del cocultivo de TIL de la bolsa de infusión usada para tratar al paciente 4196 con células Cos7 transfectadas con plásmidos para TMG1 y el alelo de HLA indicado.

[0028] La figura 8B es un gráfico que muestra la secreción de IFN-γ (manchas/2 x 10<4>células) medida después del cocultivo de TIL de la bolsa de infusión usada para tratar al paciente 4196 con DC autólogas pulsadas con epítopo mínimo candidato (HMTEVVRHC (SEQ ID NO: 530) o (SQHMTEVVRH (SEQ ID NO: 531)). Células T cultivadas solas sirvieron como control.

[0029] Las figuras 9A-9D son gráficos que muestran los porcentajes de células mTCRB+CD8+41BB+ detectadas después del cocultivo de DC pulsadas con un epítopo mínimo WT (círculos) o mutado (mut) (cuadrados) a las concentraciones indicadas (µg/ml) con células transducidas con uno de los siguientes TCR: AV12/BV6-1 (A), AV2/BV6-1 (B), AV6BV11 (C) o AV38/BV10-3 (D). El cocultivo de DC pulsadas con células no transducidas (UT) (triángulos) sirvió como control. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos.

[0030] Las figuras 10A-10B son gráficos que muestran la secreción de IFN-γ (pg/ml) (A) y el porcentaje de células positivas para 4-1BB (%, mTCRβ+) (B) medidos después del cocultivo de células T2 pulsadas con el epítopo mutado mínimo a las concentraciones indicadas con células transducidas con uno de los siguientes TCR: AV12/BV6-1 (triángulos cerrados), AV6/BV11 (círculos) o AV38/BV10-3 (cuadrados). El cocultivo de células T2 pulsadas con células no transducidas (UT) (triángulos abiertos) sirvió como control.

[0031] La figura 11 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras detectadas después del cocultivo de células transducidas con TCR con las líneas celulares diana indicadas. Las células efectoras se transdujeron con AV12/BV6-1 (barras negras), AV6/BV11 (barras rayadas) o AV38/BV10-3 (barras grises). Las células diana transducidas con HLA-A*02:01 se indican mediante LS123-A2, CCRF-CEM-A2 y AU-565-A2. Las células diana pulsadas con péptido se indican mediante (+). Las células diana no pulsadas con péptido se indican mediante (-). Células efectoras no transducidas (barras no sombreadas) cocultivadas con líneas celulares diana se usaron como control.

[0032] La figura 12 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de los fragmentos de TIL F1-F24 del paciente 4238 (n=24) con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por una secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas) o de p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0033] La figura 13 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de los fragmentos de TIL F1-F24 del paciente 4238 (n=24) con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptido de 25 aminoácidos purificado (>95 % por HPLC) compuesto por secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras).

[0034] La figura 14 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de los fragmentos de TIL F1-F24 del paciente 4238 (n=24) con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por una secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas) o de p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0035] La figura 15 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de los fragmentos de TIL F1-F24 del paciente 4238 (n=24) con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptido de 25 aminoácidos purificado (>95 % por HPLC) compuesto por secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras).

[0036] La figura 16 es un gráfico que muestra la cantidad de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24; n=24) del paciente 4253 con APC autólogas (1) pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas), (2) pulsadas con péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248W mutado (LP-p53-R248W-MUT; barras negras), (3) electroporadas con un TMG irrelevante (TMG-IRR; barras sombreadas grises), o (4) electroporadas con p53-mut-TMG que contiene secuencia de p53-R248W mutado.

[0037] La figura 17 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4273 con APC autólogas electroporadas con TMG (TMG) compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas), p53 WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0038] La figura 18 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL F1-F24 del paciente 4273 (n=24) con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por una secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas), p53 WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0039] La figura 19 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4273 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248W mutado (LP-p53-R248W-MUT; barras negras).

[0040] La figura 20 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4273 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248W mutado (LP-p53-R248W-MUT; barras negras).

[0041] La figura 21 es un gráfico que muestra la cantidad de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de PBL autólogos del paciente 4149 (transpuestos con 4149-TCRa2b1 o 4149TCRa2b2) con APC autólogas que (1) se sometieron a electroporación con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras negras rayadas a la derecha), p53 WT (p53-wt-TMG; barras negras rayadas a la izquierda) o p53 mutada (p53-mut-TMG; barras grises) o (2) se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-Y220 WT (LP-p53-Y220-WT; barras negras rayadas horizontales) o secuencia de p53-Y220C mutado (LP-p53-Y220C-MUT; barras negras). 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) e ionomicina (Iono) fueron controles positivos (barras grises).

[0042] La figura 22 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de PBL autólogos del paciente 4149 que se transpusieron con un TCR (4149-TCRa2b 1 o 4149-TCRa2b2) con APC autólogas que (1) se sometieron a electroporación con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras negras con rayas a la derecha), p53 WT (p53-wt-TMG; barras negras con rayas a la izquierda) o p53 mutada (p53-mut-TMG; barras grises) o (2) se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-Y220 WT (LP-p53-Y220-WT; barras negras con rayas horizontales) o secuencia de p53-Y220C mutado (LP-p53-Y220C-MUT; barras negras). PMA e Iono fueron el control positivo (barras grises).

[0043] La figura 23 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ (% de células T CD4+) detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4149 con DC autólogas pulsadas con uno de los péptidos de la tabla F.

[0044] La figura 24 es un gráfico que muestra la secreción de IFN-γ (pg/ml) después del cocultivo de células T transpuestas con 4149-TCRa2b2 con células Cos7 cotransfectadas con alelos de HLA individuales /- TMG. Se pulsaron células no transfectadas con TMG con péptido de 15 meros de p53Y220C. Las células diana pulsadas se indican mediante barras sombreadas. Las células diana transfectadas con TMG se indican mediante barras sin sombrear.

[0045] La figura 25 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F2 y F24) del paciente 4213 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras).

[0046] La figura 26 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de células T CD4+ del paciente 4213 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras). La secreción de IFN-γ se muestra mediante barras abiertas. La expresión de 4-1BB se muestra mediante barras cerradas.

[0047] La figura 27 es un gráfico que muestra el número de puntos positivos para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por secuencias irrelevantes (IRR; barras abiertas), p53 WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0048] La figura 28 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras).

[0049] La figura 29 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras).

[0050] La figura 30 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248Q mutado (LP-p53-R248Q-MUT; barras negras).

[0051] La figura 31 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4266 con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas), p53 WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutado (p53-MUT; barras negras).

[0052] La figura 32 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4266 con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas), p53 WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0053] La figura 33 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4266 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248W mutado (LP-p53-R248W-MUT; barras negras).

[0054] La figura 34 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD8+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4266 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (LP-p53-R248-WT; barras grises) o secuencia de p53-R248W mutado (LP-p53-R248W-MUT; barras negras).

[0055] La figura 35 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las nueve variantes de corte y empalme de p53. SP| P04637-3 |P53 HUMANA (SEQ ID NO: 1); SP| P04637-2 |P53_HUMANA (SEQ ID NO: 535); SP| P04637-3 |P53_HUMANA (SEQ ID NO: 536); SP| P04637-4 |P53_HUMANA (SEQ ID NO: 537); SP| P04637-5 |P53_HUMANA (SEQ ID NO: 538); SP| P04637-6 |P53_HUMANA (SEQ ID NO: 539); SP| P04637-7 |P53 HUMANA (SEQ ID NO: 540); SP| P04637-8 |P53 HUMANA (SEQ ID NO: 541); y SP|P04637-9|P53_HUMANA (SEQ ID NO: 542).

[0056] La figura 36 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de mTCRβ+) detectadas después del cocultivo de células T transducidas con el 4127-O37-TCR con APC autólogas pulsadas con concentraciones decrecientes de péptidos de 25 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53-G245S WT (círculos abiertos) o mutada (cuadrados cerrados).

[0057] Las figuras 37A-37C son gráficos que muestran el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de mTCRβ+) (eje y izquierdo; barras rayadas) e IFN-γ (pg/ml) (eje y derecho; barras negras) medido después del cocultivo de células T transducidas con 4127-O37-TCR (A), 4127-TP53-G245S-TCR1 (B) o 4127-O102-TCR (C) con células COS7 cotransfectadas con uno de los alelos de HLA indicados y pulsadas con el péptido p53-G245S de 25 aminoácidos. La figura 38 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de CD8+) (eje y derecho; barras negras) e IFN-γ (manchas por 2x10<4>células) (eje y izquierdo; barras rayadas) medido después del cocultivo de TIL del paciente 4141 (cultivo de fragmentos 12) con APC autólogas transfectadas con TMG que codifican mutaciones irrelevantes (TMG-IRR), secuencia de p53 WT (TP53-wt-TMG) o secuencia de p53 mutada que incluye R175H (TP53-mut-TMG). Medios solos y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente.

[0058] La figura 39 es un gráfico que muestra la cantidad de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de TIL del paciente 4141 (cultivo de fragmentos 12) con células Cos7 cotransfectadas con los alelos de HLA indicados y sin gen adicional (solo HLA; barras abiertas), TMG de TP53 WT (barras con líneas grises) o TMG de TP53 mutado (barras negras) que contiene la secuencia de p53-R175H. La figura 40 es un gráfico que muestra la concentración de IFN-γ (pg/ml) medida después del cocultivo de células T que expresan simulado (sin TCR) o 4141-TCR1a2 con células tumorales T2 (que expresan HLA-A*02:01). Se pulsaron células T2 con vehículo peptídico (DMSO; barras grises) o péptidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por péptido p53-R175 WT (barras grises sombreadas) o péptido p53-R175H mutado (barras negras). Medios solos (barras abiertas) y PMA e ionomicina (barras reticulares) fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Los datos son media ± EEM (n=3).

[0059] La figura 41 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para la expresión de uno de los marcadores indicados después del cocultivo de células T que expresan 4141-TCR1a2 con células Saos2 (p53-NULL y HLA-A*02:01+), que no estaban manipuladas (barras sin sombrear) o se hicieron que sobreexpresaran la proteína p53-R175H de longitud completa (barras sombreadas). Los datos son media ± EEM (n=3). Se realizaron pruebas t de dos colas de Student para cada citocina entre las dos líneas celulares para análisis estadísticos (** *p<0,001).

[0060] La figura 42 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para CD4+4-1BB detectadas después del cocultivo de TIL (cultivo de fragmentos 6 del paciente 4259) con APC autólogas (1) electroporadas con TMG compuesto por secuencia irrelevante (TMG-IRR), p53 WT (TMG-p53-WT) o p53 mutada (TMG-p53-MUT) o (2) pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por secuencia de p53-Y220 WT (LP-p53-Y220-WT) o secuencia de p53-Y220C mutado (LP-p53-Y220C-MUT). La figura 43 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para CD4+4-1BB detectadas después del cocultivo de cultivo de fragmentos de TIL (n.º 6) del paciente 4259 con APC autólogas pulsadas con concentraciones decrecientes de péptidos de 25 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53 WT (círculos blancos) o p53-Y220C mutado (cuadrados negros) durante 2 horas a 37 °C.

[0061] La figura 44 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para CD4+4-1BB detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4259 con APC autólogas pulsadas con DMSO, péptido p53-Y220 WT o péptido p53-Y220C mutado.

[0062] La figura 45 es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para 4-1BB (% de CD4+) detectadas después del cocultivo de cultivo de fragmentos de TIL n.º 6 del paciente 4259 con células Cos7 cotransfectadas con los alelos de HLA indicados del paciente 4259 y pulsadas con DMSO (barras abiertas) o el péptido p53-Y220C (barras cerradas).

[0063] La figura 46 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ detectadas después del cocultivo de células diana TC#4259 (que expresan de forma endógena p53-Y220C y HLA-DRB1*04:01:01) con células T efectoras (10<5>) que expresan simulado (sin TCR; barras abiertas) o TCR específico de p53-Y220C (4259-F6-TCR; barras negras). Las células TC#4259 se incubaron con nada, anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase I W6/32, anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase II IVA12 o péptido p53-Y220C mutado. Medios solos (sin TC) y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Los datos son media ± EEM (n=3). Se realizaron pruebas t de dos colas de Student entre grupos como se indica para los análisis estadísticos (**p<0,01 y ** *p<0,001).

[0064] La figura 47 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F22 y F24, n=23) del paciente 4285 con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas), p53 WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0065] La figura 48 es un gráfico que muestra el número de manchas positivas para IFN-γ por 2x10<4>células efectoras medidas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F22 y F24, n=23) del paciente 4285 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R175 WT (LP-p53-R175-WT; barras grises) o secuencia de p53-R175H mutado (LP-p53-R175H-MUT; barras negras).

[0066] La figura 49 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F22 y F24, n=23) del paciente 4285 con APC autólogas electroporadas con TMG compuesto por secuencia irrelevante (IRR; barras abiertas), p53 de tipo WT (p53-WT; barras grises) o p53 mutada (p53-MUT; barras negras).

[0067] La figura 50 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+4-1BB+ detectadas después del cocultivo de fragmentos de TIL (F1-F22 y F24, n=23) del paciente 4285 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO; barras abiertas) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R175 WT (LP-p53-R175-WT; barras grises) o secuencias de p53-R175H mutadas (LP-p53-R175H-MUT; barras negras).

[0068] La figura 51 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ (% de CD4+) detectadas después del cocultivo de cultivos de fragmentos de TIL 4285-F6, 4285-F9 y 4285-F10 con células Cos7 transfectadas con los alelos de HLA indicados y pulsadas con DMSO (vehículo peptídico; barras sombreadas grises y negras) o péptido p53-R175H mutado (barras grises, reticuladas y negras).

[0069] La figura 52 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ (% de CD4+) detectadas después del cocultivo de células T transpuestas con 4285-TCR1 con APC autólogas pulsadas con concentraciones decrecientes de péptidos de 25 o 15 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53-R175H WT (círculos y cuadrados abiertos) o mutada (círculos y cuadrados cerrados).

[0070] La figura 53 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ (% de CD8+) detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4266 con células Cos7 que se cotransfectaron con alelos de HLA individuales del paciente 4266 y se pulsaron sin péptido (barras abiertas), DMSO (vehículo peptídico; barras grises), péptido p53-R248 de tipo silvestre (barras sombreadas grises) o péptido p53-R248W mutado (barras negras). Los datos son media ± EEM (n=3).

[0071] La figura 54 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ (% de CD8+) detectadas después del cocultivo de células T que expresan simulado (sin TCR), 4266-TCR1, 4266-TCR2, 4266-TCR3 o 4266-TCR4 con APC autólogas que se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO; barras grises) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (barras grises sombreadas) o secuencias de p53-R248W mutadas (barras negras). Medios solos (barras abiertas) y PMA e ionomicina (barras reticulares) fueron controles negativos y positivos, respectivamente.

[0072] La figura 55 es un gráfico que muestra el porcentaje de células 4-1BB+ (% de CD8+) detectadas después del cocultivo de células T que expresan simulado (sin TCR) o TCR específicos de p53-R248W (4266-TCR2, 4266-TCR3 o 4266-TCR4) con la línea de células tumorales (TC) establecida a partir del fragmento de tumor xenoinjertado resecado del paciente 4266 y luego pasadas en serie a través de ratones inmunocomprometidos (TC#4266). Las células TC#4266 se incubaron con nada (barras negras), anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase I W6/32 (barras con rayado gris a la derecha), anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase II IVA12 (barras grises) o péptido p53-R248W mutado (barras con rayado gris a la izquierda). Medios solos (sin TC; barras abiertas) y PMA e ionomicina (barras reticulares grises) fueron controles negativos y positivos, respectivamente.

[0073] La figura 56 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+ 4-1BB+ detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4273 con APC autólogas que se transfectaron con TMG que codifica mutaciones irrelevantes (barras grises), secuencias de p53 de tipo silvestre (barras sombreadas grises) o secuencias de p53 mutadas que incluyen p53-R248W (barras negras). Medios solos (barras abiertas) y PMA e ionomicina (barras reticulares) fueron controles negativos y positivos, respectivamente.

[0074] La figura 57 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+ 4-1BB+ detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4273 con APC autólogas que se pulsaron con péptidos de 25 aminoácidos correspondientes al tipo silvestre (círculos abiertos) o mutado (cuadrados cerrados) del neoepítopo p53-R248W. DMSO fue el vehículo peptídico.

[0075] La figura 58 es un gráfico que muestra el porcentaje de células CD4+ 4-1BB+ detectadas después del cocultivo de TIL del paciente 4273 con APC autólogas pulsadas con péptidos de 15 aminoácidos del neoepítopo p53-R248W (sustitución de aminoácidos en negrita) que se solapan con 14 aminoácidos. DMSO fue el vehículo peptídico, medio solo (células T solo) y PMA e ionomicina fueron los controles. Los péptidos de 25 aminoácidos (p53-R248 wt y p53-R248W mutado) fueron controles adicionales para los péptidos de 15 aminoácidos. Los péptidos son: YMCNSSCMGGMNWRP (SEQ ID NO: 592); MCNSSCMGGMNWRPI (SEQ ID NO: 593); CNSSCMGGMNWRPIL (SEQ ID NO: 594); NSSCMGGMNWRPILT (SEQ ID NO: 595); SSCMGGMNWRPILTI (SEQ ID NO: 596); SCMGGMNWRPILTII (SEQ ID NO: 597); CMGGMNWRPILTIIT (SEQ ID NO: 598); MGGMNWRPILTIITL (SEQ ID NO: 599); GGMNWRPILTIITLE (SEQ ID NO: 600); GMNWRPILTIITLED (SEQ ID NO: 601); y MNWRPILTIITLEDS (SEQ ID NO: 602).

[0076] La figura 59 es un gráfico que muestra la concentración de IFN-γ (pg/ml) secretada después del cocultivo de TIL del paciente 4273 con células Cos7 cotransfectadas con alelos de HLA individuales del paciente 4273 y TMG de TP53 WT (barras abiertas) o mutado (barras negras) con o sin el neoantígeno p53-R248W, respectivamente. La figura 60 es un gráfico que muestra el número de manchas de IFN-γ por 2x10<4>células medidas después del cocultivo de células T que expresan simulado (sin TCR) o 4273-TCR1a2 con APC autólogas que se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO; barras grises) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT (barras grises rayadas) o secuencias de p53-R248W mutadas (barras negras). Medios solos (barras abiertas) y PMA e ionomicina (barras reticulares) fueron controles negativos y positivos, respectivamente.

[0077] Descripción detallada de la invención

[0078] La proteína tumoral P53 (también denominada “TP53” o “p53”) actúa como un supresor tumoral mediante, por ejemplo, la regulación de la división celular. La proteína p53 se localiza en el núcleo de la célula, donde se une directamente al ADN. Cuando el ADN se daña, la proteína p53 participa en la determinación de si el ADN se reparará o la célula dañada experimentará apoptosis. Si el ADN puede repararse, p53 activa otros genes para reparar el daño. Si el ADN no puede repararse, la proteína p53 evita que la célula se divida y la señaliza para que experimente apoptosis. Al evitar que las células con ADN mutado o dañado se dividan, p53 ayuda a prevenir el desarrollo de tumores. p53 de longitud completa de tipo silvestre (WT) (normal) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0079] Las mutaciones en la proteína p53 pueden reducir o eliminar la función supresora de tumores de la proteína p53. Alternativa o adicionalmente, una mutación de p53 puede ser una mutación de ganancia de función al interferir con p53 WT de una manera negativa dominante. La proteína p53 mutada puede expresarse en cualquiera de una variedad de cánceres humanos tales como, por ejemplo, colangiocarcinoma, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático o cáncer de vejiga. Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por p53 humana mutada (a continuación en el presente documento, "p53 mutada"). Las mutaciones de p53 se definen en el presente documento mediante referencia a la secuencia de aminoácidos de p53 WT de longitud completa (SEQ ID NO: 1). Por tanto, las mutaciones de p53 se describen en el presente documento por referencia al residuo de aminoácido presente en una posición particular, seguido por el número de posición, seguido por el aminoácido con el que se ha reemplazado ese residuo en la mutación particular en discusión. Por ejemplo, cuando las posiciones son como se definen por SEQ ID NO: 1, el término "R175" se refiere a la arginina presente en la posición 175 de SEQ ID NO: 1, "R175H" indica que la arginina presente en la posición 175 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza por histidina, mientras que "G245S" indica que la glicina presente en la posición 245 de SEQ ID NO: 1 se ha reemplazado por serina. P53 tiene nueve variantes de corte y empalme conocidas. Las mutaciones de p53 descritas en el presente documento se conservan en las nueve variantes de corte y empalme de p53. En la figura 35 se muestra un alineamiento de las nueve variantes de corte y empalme de p53. Por consiguiente, las células T aisladas mediante los métodos de la invención pueden tener especificidad antigénica para cualquier secuencia de aminoácidos de p53 mutada descrita en el presente documento codificada por cualquiera de las nueve variantes de corte y empalme de p53. Cuando las posiciones son como se definen por SEQ ID NO: 1, entonces las posiciones reales de la secuencia de aminoácidos de una variante de corte y empalme particular de p53 se definen con respecto a las posiciones correspondientes de SEQ ID NO: 1, y las posiciones como se definen por SEQ ID NO: 1 pueden ser diferentes de las posiciones reales en una variante de corte y empalme particular. Por tanto, por ejemplo, las mutaciones se refieren a un reemplazo de un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de una variante de empalme particular de p53 correspondiente a la posición indicada de la secuencia de 393 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con el entendimiento de que las posiciones reales en la variante de empalme pueden ser diferentes.

[0081] El TCR tiene especificidad antigénica por p53 humana con una mutación en la posición 175 de SEQ ID NO: 1. El TCR tiene especificidad antigénica por p53 humana con la siguiente mutación de p53 humana: R175H. Por ejemplo, el TCR de la invención puede tener especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos de p53 mutada de SEQ ID NO: 2.

[0083] Los TCR de la invención pueden reconocer p53 mutada de una manera dependiente de moléculas de HLA (antígeno leucocitario humano). “Manera dependiente de molécula de HLA”, tal como se usa en el presente documento, significa que el TCR provoca una respuesta inmunitaria tras unirse a p53 mutada dentro del contexto de una molécula de HLA, molécula de HLA que se expresa por el paciente del que se aisló el TCR. Los TCR de la invención pueden reconocer p53 mutada que se presenta por la molécula de HLA aplicable y pueden unirse a la molécula de HLA además de p53 mutada.

[0085] Los TCR de la invención proporcionan muchas ventajas, incluyendo cuando se expresan por células usadas para transferencia de células adoptiva. p53 mutada se expresa por células cancerosas y no se expresa por células normales no cancerosas. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que los TCR de la invención seleccionan ventajosamente como diana la destrucción de células cancerosas al tiempo que minimizan o eliminan la destrucción de células normales no cancerosas, reduciendo así, por ejemplo, minimizando o eliminando, la toxicidad. Además, los TCR de la invención pueden tratar o prevenir, ventajosamente, de manera satisfactoria, cánceres positivos para p53 mutada que no responden a otros tipos de tratamiento tales como, por ejemplo, quimioterapia, cirugía o radiación. Adicionalmente, los TCR de la invención pueden proporcionar un reconocimiento sumamente ávido de p53 mutada, lo que puede proporcionar la capacidad de reconocer células tumorales no manipuladas (por ejemplo, células tumorales que no se han tratado con interferón (IFN)-γ, transfectadas con un vector que codifica una o ambas de p53 mutada y la molécula de HLA aplicable, pulsadas con un péptido de p53 con la mutación de p53, o una combinación de las mismas). Aproximadamente la mitad de todos los tumores albergan una mutación en p53, aproximadamente la mitad de las cuales será una mutación de sentido erróneo y aproximadamente el 30 % de las mutaciones de sentido erróneo se producen en los siguientes residuos de "punto caliente": R175H, Y220C, G245D, G245S, R248L, R248Q, R248W, R249S, R273C, R273L, R273H y R282W. Además, las mismas mutaciones de "punto caliente" en p53 (por ejemplo, R175H, Y220C, G245D, G245S, R248L, R248Q, R248W, R249S, R273H, R273C, R273L o R282W) ocurren con frecuencia (de forma acumulativa, aproximadamente el 30 % de las mutaciones sin sentido de p53) en tumores de personas no relacionadas. Por consiguiente, los TCR de la invención pueden aumentar el número de pacientes que pueden ser elegibles para el tratamiento con inmunoterapia.

[0087] La frase “especificidad antigénica”, tal como se usa en el presente documento, significa que el TCR puede unirse específicamente a, y reconocer de manera inmunológica, p53 mutada con alta avidez. Por ejemplo, puede considerarse que un TCR tiene "especificidad antigénica" por p53 mutada si de aproximadamente 1 x 10<4>a aproximadamente 1 x 10<5>células T que expresan el TCR secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg/ml o más, 5.000 pg/ml o más, 7.000 pg/ml o más, 10.000 pg/ml o más, 20.000 pg/ml o más, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores) de IFN-γ tras el cocultivo con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno, pulsadas con una baja concentración de péptido p53 mutado (por ejemplo, de aproximadamente 0,05 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, 0,05 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores) o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica p53 mutada de modo que la célula diana expresa p53 mutada. Las células que expresan los TCR de la invención también pueden secretar IFN-γ tras el cultivo conjunto con células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con concentraciones superiores de péptido p53 mutado.

[0088] Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por p53 mutada si las células T que expresan el TCR secretan al menos el doble de IFN-γ tras el cocultivo con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con una baja concentración de péptido p53 mutado o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica p53 mutada de modo que la célula diana expresa p53 mutada en comparación con la cantidad de IFN-γ expresado por un control negativo. El control negativo puede ser, por ejemplo, (i) células T que expresan el TCR, cocultivadas con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con la misma concentración de un péptido irrelevante (por ejemplo, algún otro péptido con una secuencia diferente del péptido p53 mutado) o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno, en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido irrelevante de modo que la célula diana expresa el péptido irrelevante, o (ii) células T no transducidas (por ejemplo, derivadas de PBMC, que no expresan el TCR) cocultivadas con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con la misma concentración de péptido p53 mutado o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica p53 mutada de modo que la célula diana expresa p53 mutada. La secreción de IFN-γ puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

[0089] Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por p53 mutada si al menos el doble del número de células T que expresan el TCR secretan IFN-γ tras el cocultivo con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con una baja concentración de péptido p53 mutado o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica p53 mutada de modo que la célula diana expresa p53 mutada en comparación con el número de células T de control negativo que secretan IFN-γ. La concentración de péptido y el control negativo pueden ser como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. El número de células que secretan IFN-γ puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, ensayo de immunospot ligado a enzimas (ELISOT). Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por p53 mutada si ELISPOT detecta al menos el doble de manchas para las células T que expresan el TCR tras el cocultivo con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con una baja concentración de péptido p53 mutado o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica p53 mutada de modo que la célula diana expresa p53 mutada en comparación con el número de manchas detectadas por ELISPOT para células T de control negativo cocultivadas con las mismas células diana. La concentración de péptido y el control negativo pueden ser como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por p53 mutada si ELISPOT detecta más de aproximadamente 50 manchas para las células T que expresan el TCR tras el cocultivo con (a) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno pulsadas con una baja concentración de péptido p53 mutada o (b) células diana positivas para la molécula de HLA aplicable, negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica p53 mutada de modo que la célula diana expresa p53 mutada. La concentración de péptido puede ser como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.

[0090] Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por p53 mutada si células T que expresan el TCR regulan por incremento la expresión de uno o ambos de 4-1BB y OX40 tal como se mide mediante, por ejemplo, citometría de flujo tras estimulación con células diana que expresan p53 mutada. La invención proporciona un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas de polipéptido), a saber, una cadena alfa (α) de un TCR y una cadena beta (β) de un TCR. Los polipéptidos del TCR de la invención pueden comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que el TCR tenga especificidad antigénica por p53 mutada.

[0091] El TCR comprende dos cadenas de polipéptido, cada una de las cuales comprende una región variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR. El TCR comprende una primera cadena de polipéptido que comprende una CDR1 de cadena α (CDR1α), una CDR2 de cadena α (CDR2α) y una CDR3 de cadena α (CDR3α), y una segunda cadena de polipéptido que comprende una CDR1 de cadena β (CDR1β), una CDR2 de cadena β (CDR2β) y una CDR3 de cadena β (CDR3β). El TCR comprende las secuencias de aminoácidos de: SEQ ID NO: 87-92. Las seis secuencias de aminoácidos corresponden a la CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β y CDR3β de un TCR, respectivamente.

[0092] En una realización de la invención, el TCR comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena α y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena β que juntas comprenden una de las colecciones de CDR expuestas anteriormente. En este sentido, el TCR humano puede comprender la secuencia de aminoácidos de: ambas de SEQ ID NO: 93-94. Las dos secuencias de aminoácidos corresponden a la región variable de la cadena α y la región variable de la cadena β de un TCR, respectivamente.

[0094] Los TCR de la invención comprenden además una región constante. La región constante puede derivarse de cualquier especie adecuada tal como, por ejemplo, ser humano o ratón. En una realización de la invención, los TCR humanos de la invención comprenden además una región constante murina. Tal como se usa en el presente documento, el término “murino” o “humano”, cuando se refieren a un TCR o a cualquier componente de un TCR descrito en el presente documento (por ejemplo, región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena alfa y/o cadena beta), significan un TCR (o componente del mismo) que se deriva de un ratón o un ser humano, respectivamente, es decir, un TCR (o componente del mismo) que se originó a partir de o se expresó, en un momento, por una célula T de ratón o una célula T humana, respectivamente. En una realización de la invención, el TCR puede comprender una región constante de cadena α murina y una región constante de cadena β murina. La región constante de cadena α murina puede estar modificada o no modificada. Una región constante de cadena α murina modificada puede estar, por ejemplo, sustituida con cisteína, modificada con LVL o tanto sustituida con cisteína como modificada con LVL, como se describe, por ejemplo, en el documento US 2017/0145070. La región constante de cadena β murina puede estar modificada o no modificada. Una región constante de cadena β murina modificada puede estar, por ejemplo, sustituida con cisteína, como se describe, por ejemplo, en el documento US 2017/0145070. En una realización de la invención, el TCR comprende una región constante de cadena α murina modificada por LVL, sustituida con cisteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o 24. En una realización de la invención, el TCR comprende una región constante de cadena β murina sustituida con cisteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.

[0095] En una realización de la invención, el TCR de la invención puede comprender una cadena α de un TCR y una cadena β de un TCR. La cadena α del TCR puede comprender una región variable de una cadena α y una región constante de una cadena α. Una cadena α de este tipo puede aparearse con cualquier cadena β de un TCR. La cadena β puede comprender una región variable de una cadena β y una región constante de una cadena β. En una realización de la invención, el TCR puede comprender las secuencias de aminoácidos de: ambas de SEQ ID NO: 95-96. Las dos secuencias de aminoácidos corresponden a la cadena α y la cadena β de un TCR, respectivamente.

[0097] No se incluyen en el alcance de la invención reivindicada variantes funcionales de los TCR de la invención descritos en el presente documento. El término “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con respecto a un TCR, polipéptido o proteína original, variante funcional que conserva la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína del que es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, las variantes del TCR, polipéptido o proteína descrito en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína original) que conservan la capacidad de unirse específicamente a p53 mutada por el que el TCR original tiene especificidad antigénica o al que se une específicamente el polipéptido o proteína original, en un grado similar, el mismo grado o en un grado superior, al TCR, polipéptido o proteína original. En referencia al TCR, polipéptido o proteína original, la variante funcionar puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o más idéntica en la secuencia de aminoácidos al TCR, polipéptido o proteína original, respectivamente.

[0099] La variante funcional no reivindicada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución de aminoácido conservativa. En la técnica se conocen sustituciones de aminoácido conservativas, e incluyen sustituciones de aminoácido en las que se intercambia un aminoácido que tiene determinadas propiedades físicas y/o químicas por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácido conservativa puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

[0101] Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales no reivindicadas pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución de aminoácido no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácido no conservativa no interfiera con, o inhiba, la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido no conservativa potencia la actividad biológica de la variante funcional, de tal manera que se aumenta la actividad biológica de la variante funcional en comparación con el TCR, polipéptido o proteína original.

[0103] El TCR, polipéptido o proteína puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de manera que otros componentes del TCR, polipéptido o proteína, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambian sustancialmente la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína.

[0104] La invención también proporciona un polipéptido que comprende al menos una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. El término “polipéptido, tal como se usa en el presente documento, incluye oligopéptidos y se refiere a una cadena individual de aminoácidos conectados mediante uno o más enlaces peptídicos.

[0105] Con respecto a los polipéptidos de la invención, la porción funcional puede ser cualquier porción que comprende aminoácidos contiguos del TCR del que forma parte, siempre que la porción funcional tenga especificidad antigénica para p53 humana con la mutación R175H presentada por HLA-A2, en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1, y en donde la porción funcional comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y una secuencia de aminoácidos de cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92. En referencia al TCR original, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 68 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o más, del TCR original.

[0106] La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo-terminal de la porción, o en ambos extremos terminales, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR original. De manera deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, unirse específicamente a p53 mutada; y/o tener la capacidad de detectar cáncer, tratar o prevenir cáncer, etc. De manera más deseable, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original.

[0107] El polipéptido comprende una porción funcional de ambas de las cadenas α y β de los TCR de la invención, tal como una porción funcional que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de la cadena α y la cadena β de un TCR de la invención. El polipéptido comprende una porción funcional que comprende las secuencias de aminoácidos de: todas de SEQ ID NO: 87-92.

[0108] En una realización de la invención, el polipéptido de la invención puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR de la invención que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. En este sentido, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de ambas de: SEQ ID NO: 93-94.

[0109] En una realización de la invención, el polipéptido de la invención puede comprender además la región constante del TCR de la invención expuesto anteriormente. En este sentido, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de (i) una de SEQ ID NO: 23-25 o (ii) SEQ ID NO: 25 y una de SEQ ID NO: 23-24.

[0110] En una realización de la invención, el polipéptido de la invención puede comprender una cadena α y una cadena β del TCR de la invención. En este sentido, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de: ambas de: SEQ ID NO: 95-96.

[0111] La divulgación proporciona además una proteína que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. Por “proteína” quiere decirse una molécula que comprende una o más cadenas de polipéptido. La proteína de la invención puede comprender: una primera cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 87-89 y una segunda cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 90-92.

[0112] En una realización de la invención, la proteína comprende: una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

[0113] En una realización de la invención, la proteína comprende: una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.

[0114] La proteína de la invención puede ser un TCR. Alternativamente, si las cadenas de polipéptido primera y/o segunda de la proteína comprenden además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica para una inmunoglobulina o una porción de la misma, entonces la proteína de la invención puede ser una proteína de fusión. En este sentido, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar cualquier molécula peptídica o proteica, o una parte de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula de MHC, una molécula de CD1, por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.

[0116] La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido de la invención y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido de la invención y/o del otro polipéptido. En la técnica se conocen métodos adecuados de preparación de proteínas de fusión, e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes.

[0118] En algunas realizaciones de la invención, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden expresarse como una única proteína que comprende un péptido enlazador que une la cadena α y la cadena β. En este sentido, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender además un péptido enlazador. El péptido enlazador puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR recombinante, polipéptido y/o proteína en una célula huésped. El péptido enlazador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. Por ejemplo, el péptido enlazador puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Tras la expresión del constructo que incluye el péptido enlazador por una célula huésped, el péptido enlazador puede escindirse, dando como resultado cadenas α y β separadas. En una realización de la invención, el TCR, polipéptido o proteína puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende una cadena α de longitud completa, una cadena β de longitud completa y un péptido enlazador situado entre las cadenas α y β.

[0120] La proteína de la invención puede ser un anticuerpo recombinante, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpo recombinante” se refiere a una proteína recombinante (por ejemplo, modificada por ingeniería genética) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena de polipéptido de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo. El polipéptido de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), o un fragmento Fc, Fab o F(ab)<2>’ de un anticuerpo, etc. La cadena de polipéptido de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. Alternativamente, la cadena de polipéptido de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede existir como polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento.

[0122] Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR, polipéptidos o proteínas conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a p53 mutada; detectar cáncer en un mamífero; o tratar o prevenir cáncer en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud en el intervalo de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como una longitud de 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos. Con respecto a esto, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.

[0124] Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos que se producen de manera natural. Tales aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano-carboxílico, norleucina, ácido α-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, β-fenilserina, β-hidroxifenilalanina, fenilglicina, α-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N’-bencil-N’-metil-lisina, N’,N’-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido α-aminociclopentano-carboxílico, ácido α-aminociclohexano-carboxílico, ácido αaminocicloheptano-carboxílico, ácido α-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido α,y-diaminobutírico, ácido α,βdiaminopropiónico, homofenilalanina y α-terc-butilglicina.

[0126] Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse, por ejemplo, mediante un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.

[0128] El TCR, polipéptido y/o proteína de la invención puede obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, síntesisde novo. Además, pueden producirse polipéptidos y proteínas de manera recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando métodos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). Alternativamente, los TCR, polipéptidos y/o proteínas descritos en el presente documento pueden sintetizarse de manera comercial por empresas, tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). Con respecto a esto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

[0129] Una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención descritos en el presente documento. “Ácido nucleico”, tal como se usa en el presente documento, incluye “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “molécula de ácido nucleico”, y significa de manera general un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace entre nucleótidos natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido sin modificar. En una realización, el ácido nucleico comprende ADN complementario (ADNc). Generalmente se prefiere que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, en algunos casos puede ser adecuado, tal como se comenta en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

[0131] Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en el punto (i) anterior. Para los fines en el presente documento, la replicación puede ser replicaciónin vitroo replicaciónin vivo.

[0133] Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green y Sambrooket al., citado anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N<6>-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina sustituida en N<6>, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N<6>-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, pueden adquirirse uno o más de los ácidos nucleicos de la invención a partir de empresas, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

[0135] En una realización de la invención proporciona, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos y proteínas descritos en el presente documento. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar sustituir un codón nativo por otro codón que codifica para el mismo aminoácido, pero puede traducirse por ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentando por tanto la eficiencia de traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que interferirán con la traducción, aumentando por tanto la eficiencia de traducción.

[0137] La divulgación también proporciona, pero no reivindica, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

[0139] La secuencia de nucleótidos no reivindicada que se hibrida en condiciones rigurosas se hibrida preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad. Por “condiciones de alta rigurosidad” quiere decirse que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es más fuerte de manera detectable que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirán un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que sólo contiene unos pocos apareamientos erróneos dispersados, de una secuencia aleatoria que resultó tener unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, de 3-10 bases) que se apareaban con la secuencia de nucleótidos. Tales regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad hace que puedan distinguirse fácilmente. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirían, por ejemplo, condiciones de bajo contenido en sal y/o alta temperatura, tal como se proporciona mediante NaCl a aproximadamente 0,02-0,1 M o equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si es que toleran algo, de apareamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y la cadena diana o molde, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención. Generalmente se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

[0140] La divulgación también proporciona, pero no reivindica, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 70 % o más, por ejemplo, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Con respecto a esto, el ácido nucleico puede consistir esencialmente en cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento.

[0141] Los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante. Con respecto a esto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. En una realización de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena α, la cadena β y péptido enlazador.

[0142] Para los fines en el presente documento, el término “vector de expresión recombinante” significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido genéticamente modificado que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido mediante una célula huésped, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para hacer que se exprese el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. En su conjunto, los vectores de la invención no se producen de manera natural. Sin embargo, partes de los vectores pueden producirse de manera natural. Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótido, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizarse u obtenerse en parte a partir de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinante pueden comprender enlaces entre nucleótidos que se producen de manera natural, que no se producen de manera natural o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los nucleótidos o enlaces entre nucleótidos que no se producen de manera natural o alterados no dificultan la transcripción o replicación del vector.

[0143] El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula huésped adecuada. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie de transposón/transposasa, la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También pueden usarse vectores de bacteriófagos, tales como λGT10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 y λNM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101,2, pBI101,3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión de animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector de transposón o vector viral, por ejemplo, un vector retroviral.

[0144] Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante convencionales descritas, por ejemplo, en Green y Sambrooket al., citado anteriormente. Pueden prepararse constructos de vectores de expresión, que son circulares o lineales, para contener un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Pueden derivarse sistemas de replicación, por ejemplo, a partir de ColEl, plásmido 2 µ, λ, SV40, virus del papiloma bovino, y similares.

[0145] De manera deseable, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas para el tipo de célula huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en la que va a introducirse el vector, según sea apropiado y teniendo en consideración si el vector está basado en ADN o ARN.

[0146] El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células huésped transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en una célula huésped auxotrófica para proporcionar prototrofía, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

[0147] El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína, o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a, o que se hibrida con, la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína. La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos del desarrollo, se encuentra dentro de las habilidades habituales del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de las habilidades del experto. El promotor puede ser un promotor no viral, por ejemplo, un promotor de factor de elongación humano-1α o un promotor viral, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de VSR, y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murino.

[0149] Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden diseñarse para expresión transitoria, para expresión estable, o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinante pueden realizarse para expresión constitutiva o para expresión inducible.

[0151] Además, los vectores de expresión recombinante pueden realizarse para incluir un gen suicida. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “gen suicida” se refiere a un gen que hace que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad frente a un agente, por ejemplo, un fármaco, en la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando se pone la célula en contacto con o se expone al agente. En la técnica se conocen genes suicidas e incluyen, por ejemplo, el gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), citosina daminasa, purina nucleósido fosforilasa y nitrorreductasa.

[0152] Otra realización de la invención proporciona además una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier tipo de célula que puede contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, de planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente a partir de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula en suspensión, es decir, una célula que crece en suspensión. En la técnica se conocen células huésped adecuadas e incluyen, por ejemplo, célulasE. coliDH5α, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293, y similares. Para los fines de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5α. Para los fines de producir un TCR, polipéptido o proteína recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero. Lo más preferiblemente, la célula huésped es una célula humana. Si bien la célula huésped puede ser de cualquier tipo de célula, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, la célula huésped es preferiblemente un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Más preferiblemente, la célula huésped es una célula T.

[0154] Para los fines en el presente documento, la célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria, o una célula T a partir de una línea de células T cultivada, por ejemplo, Jurkat, SupT1, etc., o una célula T obtenida a partir de un mamífero. Si se obtiene a partir de un mamífero, la célula T puede obtenerse a partir de numerosas fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o líquidos. Las células T también pueden enriquecerse o purificarse. Preferiblemente, la célula T es una célula T humana. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede ser de cualquier fase de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a, células T doble positivas CD4<+>/CD8<+>, células T cooperadoras CD4<+>, por ejemplo, células Th<1>y Th<2>, células T CD4<+>, células T CD8<+>(por ejemplo, células T citotóxicas), linfocitos de infiltración tumoral (TIL), células T de memoria (por ejemplo, células T de memoria centrales y células T de memoria efectoras), células T vírgenes, y similares.

[0156] La invención también proporciona una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinante, o una célula distinta de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped (por ejemplo, que consiste esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población de células clonal, en la que todas las células de la población son clones de una única célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante, de tal manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante tal como se describe en el presente documento.

[0158] En una realización de la invención, los números de células en la población pueden expandirse rápidamente. La expansión de los números de células T puede lograrse mediante cualquiera de varios métodos tal como se conoce en la técnica tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 8.034.334; la patente estadounidense 8.383.099; la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2012/0244133; Dudley et al., J. Immunother., 26: 332-42 (2003); y Riddell et al., J. Immunol. Methods, 128: 189-201 (1990). En una realización, la expansión de los números de células T se lleva a cabo mediante el cultivo de las células T con anticuerpo OKT3, IL-2 y PBMC alimentadoras (por ejemplo, PBMC alogénicas irradiadas).

[0160] Los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped y anticuerpos (incluyendo poblaciones de los mismos) de la invención, pueden aislarse y/o purificarse. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento significa que se ha retirado de su entorno natural. El término “purificado” tal como se usa en el presente documento significa que se ha aumentado su pureza, en el que “pureza” es un término relativo, y que no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o puede ser de aproximadamente el 100 %.

[0162] Los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) de la invención, todos los cuales se denominan de manera colectiva “materiales de TCR de la invención” a continuación en el presente documento, pueden formularse para dar una composición, tal como una composición farmacéutica. En este sentido, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión y células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas), descritos en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualquiera de los materiales de TCR de la invención pueden comprender más de un material de TCR de la invención, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR de la invención en combinación con otro(s) fármaco(s) o agente(s) farmacéuticamente activo(s), tal como un agente quimioterápico, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

[0164] Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para el material de TCR de la invención particular en consideración. Los métodos para preparar composiciones administrables son conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ª ed., Pharmaceutical Press (2012). Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que no tiene efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

[0166] La elección del portador estará determinada en parte por el material de TCR de la invención particular, así como por el método particular usado para administrar el material de TCR de la invención. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intratumoral o interperitoneal. Puede usarse más de una vía para administrar los materiales de TCR de la invención, y en determinados casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.

[0168] Preferiblemente, el material de TCR de la invención se administra mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando el material de TCR de la invención es una célula huésped que expresa el TCR de la invención, el portador farmacéuticamente aceptable para las células para inyección puede incluir cualquier portador isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente el 0,90 % p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), disolución de electrolito NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), dextrosa a aproximadamente el 5 % en agua, o lactato de Ringer. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable se complementa con albúmina sérica humana.

[0170] Para los fines de la invención en la que el material de TCR de la invención es para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, la cantidad o dosis (por ejemplo, números de células cuando el material de TCR de la invención es una o más células) del material de TCR de la invención administrado debe ser suficiente para provocar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal a lo largo de un intervalo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR de la invención debe ser suficiente para unirse a un antígeno de cáncer (por ejemplo, p53 mutada), o detectar, tratar o prevenir cáncer en un periodo de desde aproximadamente 2 horas o más largo, por ejemplo, de 12 a 24 o más horas, desde el momento de la administración. En determinadas realizaciones, el periodo de tiempo puede ser incluso más largo. La dosis estará determinada por la eficacia del material de TCR de la invención particular y el estado del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) que va a tratarse.

[0172] En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la invención en la que el material de TCR de la invención es para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, un ensayo, que comprende comparar el grado en el que se someten células diana a lisis o se secreta IFN-γ por células T que expresan el TCR, polipéptido o proteína de la invención tras la administración de una dosis dada de tales células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos a cada uno de los cuales se les administra una dosis diferente de las células T, podría usarse para determinar una dosis inicial que va a administrarse a un mamífero. El grado en el que se someten células diana a lisis o se secreta IFN-γ tras la administración de una determinada dosis puede someterse a ensayo mediante métodos conocidos en la técnica.

[0173] La dosis del material de TCR de la invención también estará determinada por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR de la invención particular. Normalmente, el médico encargado decidirá la dosificación del material de TCR de la invención con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en consideración una variedad de factores, tales como edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de TCR de la invención que va a administrarse, vía de administración, y la intensidad del cáncer que está tratándose. En una realización en la que el material de TCR de la invención es para su uso en el tratamiento o la prevención de cáncer y en el que el material de TCR de la invención es una población de células, el número de células administradas por infusión puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 1 x 10<6>y aproximadamente 1 x 10<12>células o más. En determinadas realizaciones en las que el material de TCR de la invención es para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, pueden administrarse menos de 1 x 10<6>células.

[0175] Un experto habitual en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR inventivos de la invención pueden modificarse de cualquiera de varias maneras, de tal modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR de la invención se aumenta mediante la modificación. Por ejemplo, los materiales de TCR de la invención pueden conjugarse o bien directa o bien indirectamente a través de un puente a un resto quimioterápico. La práctica de conjugar compuestos a un agente quimioterapéutico se conoce en la técnica. Un experto habitual en la técnica reconoce que sitios en los materiales de TCR de la invención, que no son necesarios para la función de los materiales de TCR de la invención, son sitios ideales para acoplar un puente y/o un agente quimioterápico, siempre que el puente y/o agente quimioterápico, una vez acoplado a los materiales de TCR de la invención, no interfiera con la función de los materiales de TCR de la invención, es decir, la capacidad de unirse a p53 mutada o de detectar, tratar o prevenir cáncer.

[0177] Se contempla que las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped o poblaciones de células de la invención pueden usarse en métodos de tratamiento o prevención de cáncer. Sin limitarse a ninguna teoría particular, se cree que los TCR de la invención se unen específicamente a p53 mutada, de tal manera que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionado), cuando se expresa por una célula, puede mediar en una respuesta inmunitaria frente a una célula diana que expresa p53 mutada. A este respecto, una realización que no forma parte de la invención reivindicada proporciona un método para tratar o prevenir cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos o proteínas descritas en el presente documento, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas descritas en el presente documento, o cualquier célula huésped o población de células que comprende un vector recombinante que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritas en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir cáncer en el mamífero.

[0179] Una realización de la invención proporciona cualquiera de las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas descritos en el presente documento, o cualquier célula huésped o población de células que comprende un vector recombinante que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, para su uso en el tratamiento o la prevención de cáncer en un mamífero.

[0181] Los términos “tratar” y “prevenir” así como palabras que se deriven de los mismos, tal como se usan en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o prevención del 100% o completo. En vez de eso, hay diversos grados de tratamiento o prevención de los cuales un experto habitual en la técnica reconoce que tienen un posible beneficio o efecto terapéutico. En este sentido, los materiales de TCR de la invención para su uso pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionado por el material de TCR de la invención puede incluir tratamiento o prevención de uno o más estados o síntomas de cáncer que está tratándose o previniéndose. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención puede incluir fomentar la regresión de un tumor. Además, para fines en el presente documento, la “prevención” puede abarcar retrasar la aparición del cáncer o un síntoma o estado del mismo. De manera alternativa o adicional, la “prevención” puede abarcar prevenir o retrasar la reaparición del cáncer o un síntoma o estado del mismo.

[0183] También se proporciona por una realización de la invención un método de detección de la presencia de un cáncer en un mamífero. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas de la invención descritos en el presente documento, formando así un complejo, y detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia del cáncer en el mamífero.

[0185] Con respecto al método de la invención de detección de cáncer en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteínas completas, o una fracción de ácido nucleico.

[0186] Para los fines del método de detección de la invención, la puesta en contacto esin vitro.

[0187] Además, la detección del complejo puede producirse mediante cualquiera de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped o poblaciones de células de la invención, descritos en el presente documento, pueden marcarse con una etiqueta detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano), y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).

[0188] Para los fines de los métodos en los que los materiales de TCR son para su uso, en donde se administran células huésped o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas con respecto al mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas con respecto al mamífero.

[0189] Con respecto a los métodos de la invención o métodos en los que los materiales de TCR de la invención son para su uso, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, el canal anal o el anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, la vesícula biliar o la pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o el oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de esófago, cáncer cervical uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de la orofaringe, cáncer de ovarios, cáncer del pene, cáncer pancreático, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer del intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer del útero, cáncer de uretra y cáncer de la vejiga urinaria. En una realización preferida, el cáncer es un cáncer que expresa p53 mutada. El cáncer puede expresar p53 con una mutación en una cualquiera o más de las posiciones 175, 220, 245, 248, 249, 273 y 282 de SEQ ID NO: 1. El cáncer puede expresar p53 con una cualquiera o más de las siguientes mutaciones de p53 humana: R175H, Y220C, G245D, G245S, R248L, R248Q, R248W, R249S, R273H, R273C, R273L y R282W. Preferiblemente, el cáncer es un cáncer epitelial o colangiocarcinoma, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), glioblastoma, cáncer cervical uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático o cáncer de vejiga.

[0190] El mamífero al que se hace referencia en los métodos de la invención o métodos en los que los materiales de TCR inventivos son para su uso puede ser cualquier mamífero. Tal como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Lagomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros). Se prefiere más que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluyendo equinos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del orden de primates, cébidos o simoides (monos) o del orden Anthropoids (seres humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse como que limitan de ninguna manera su alcance.

[0191] Ejemplos

[0192] Las secuencias de aminoácidos expuestas en las tablas 1-3 se emplearon en los experimentos descritos en los siguientes ejemplos. En las tablas 1-2, "LP" significa "péptido largo". En la tabla 3, "TMG" significa "minigén en tándem".

[0193] Tabla 1

[0196]

[0197]

[0199] Las versiones WT de los péptidos de la tabla 1 se exponen en la tabla 2.

[0200] Tabla 2

[0203]

[0205] Tabla 3

[0208]

[0210] Ejemplo 1

[0211] Este ejemplo demuestra el aislamiento y la reactividad específica de cuatro TCR anti-p53 mutada del paciente 4127.

[0212] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 1-7, 36 y 37A-37C para el paciente 4127. Las células T reactivas con p53 mutada para este paciente se identificaron mediante el método descrito en la solicitud de patente estadounidense número 2017/0224800 ("método de Tran"). Los métodos para aislar los TCR individuales se exponen a continuación.

[0213] Se transdujeron PBL autólogos con uno de los TCR mostrados en la figura 1 y se sometieron a prueba 2 semanas después. Se sembraron en placa células DC autólogas a 3x10<4>células/pocillo y se pulsaron durante la noche con péptido p53-G245 WT (wt) o péptido p53-G245S mutado (mut) a concentraciones de péptido decrecientes. Se añadieron 3x10<4>células T transducidas por pocillo y se cocultivaron durante la noche a 37 °C. Se recogieron sobrenadantes para ELISA de IFN-γ. Los resultados del ELISA de IFN-γ se muestran en la figura 1. La expresión de 4-1BB se midió mediante selección con FACS: linfocitos\PI(neg)CD3<+>\CD3<+>mTCR<+>\CD8(neg)CD4<+>. Los resultados de FACS se muestran en la figura 2.

[0214] Se transdujeron PBL autólogos con uno de los TCR mostrados en la figura 3 y se cocultivaron tal como se describió para el experimento de la figura 2, excepto que las DC se pulsaron con DMSO (vehículo peptídico) o uno de los péptidos p53-G245S de 15 meros con 14 aminoácidos solapantes mostrados en la tabla A. La expresión de 4-1BB se llevó a cabo tal como se describió para la figura 2. Los resultados se muestran en la figura 3.

[0215] Tabla A

[0218]

[0220] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5 x 10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Después de 20 horas, las células se cotransfectaron con alelos de HLA individuales. Después de 20 horas, las células se pulsaron con péptido p53G245S-15-meros durante 3 horas a 37 °C a 10 µg/ml. Después del lavado, se añadieron células T (10<5>) a los pocillos y se cocultivaron durante la noche (durante 20 horas) a 37 °C. La secreción de IFN-γ se midió mediante ELISA; predicción mediante NetMHCIIpan: cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/. Se midió la expresión de 4-1BB mediante FACS. Selección con FACS: linfocitos → vivos (negativos para PI) → CD3+ (células T) → CD4+ (4127-TIL) o CD4+mTCR+ (células T transducidas con TCR). Los resultados se muestran en las figuras 4-5 y la tabla B.

[0221] Tabla B

[0224]

[0226] DRB3*02 se expresa por 1367 de 3719 (37 %) de pacientes tipificados por DRB en la base de datos de HLA del NCI y 5 de 9 (56 %) pacientes con cáncer de endometrio y ovario en NCI-SB (National Cancer Institute Surgery Branch). La frecuencia notificada del alelo DRB3*02 es muy alta según el sitio web allelefrequencies.net. Por ejemplo, este sitio web notifica que la frecuencia del alelo DRB3*02 es 0,3447 de la población de Oriente Medio o la costa norte de África del NMDP de EE. UU.

[0227] Se cocultivaron TIL del paciente 4127 con células presentadoras de antígeno (APC) alogénicas (DRB3*01:01:01 o DRB3*02:02:01) que (1) se sometieron a electroporación con minigenes en tándem (TMG) compuestos por secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada o (2) se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)) compuestos por secuencia de p53-G245 WT o secuencia de p53-G245S mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 6. Se cocultivaron células T que expresan el 4127-TCR1 específico para p53-G245S con APC alogénicas como se describe para el experimento de la figura 6. Los resultados se muestran en la figura 7.

[0228] Se pulsaron APC autólogas con concentraciones decrecientes de péptidos de 25 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53-G245 WT o p53-G245S mutada. Se cocultivaron células T transducidas con el 4127-O37-TCR del paciente 4127 durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. Se sometió a ensayo la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células individuales → vivas → CD3+mTCR+. Los resultados se muestran en la figura 36.

[0229] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5x10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, se cotransfectaron células con alelos de HLA individuales del paciente 4127. Al día siguiente, el péptido p53-G245S de 25 aminoácidos se pulsó en células Cos7 transfectadas. El exceso de péptido se eliminó por lavado. Se transdujeron células T con uno de los TCR del paciente 4127. Las células T transducidas se añadieron (2x10<4>células/pocillo) al cocultivo con las células Cos7. Los cocultivos se incubaron durante la noche a 37 °C. La secreción de IFN-γ se evaluó mediante ELISA. Se sometió a ensayo la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células individuales → vivas CD3+mTCR+. Los resultados se muestran en las figuras 37A-37C.

[0230] La secuencia de TCR4127-TP53-G245S-TCR1,que se aisló del paciente 4127, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 30), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 31), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 32), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 27), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 28) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 29). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 34) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 33) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 36) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 35) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[0231] Nombre del TCR: 4127-TP53-G245S-TCR1

[0232] Reconocimiento de la mutación de p53: G245S

[0233] Método: Método de Tran

[0234] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar el fragmento de TIL 4127-F10 con péptido largo G245S, células T CD4+41BB+ clasificadas (RT-PCR unicelular solamente)

[0235] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular (a continuación), Adaptive Pairseq (fragmento 4127-F10), 5'RACE del clon de TIL O71

[0236] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 31,3 % (observado 5 veces de 16 pares) Orientación del TCR: beta-alfa

[0237] Vector de expresión: retrovirus gamma

[0240]

[0242] Las estadísticas para el TCR4127-TP53-G245S-TCR1para el paciente 4127 se exponen en la tabla 4 a continuación.

[0243] Tabla 4

[0246]

[0247]

[0249] La secuencia de TCR4127-TP53-G245S-TCR4,que se aisló del paciente 4127, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 40), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 41), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 42), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 37), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 38) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 39). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 44) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 43) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 46) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 45) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[0250] Nombre del TCR: 4127-TP53-G245S-TCR4

[0251] Reconocimiento de la mutación de p53: G245S

[0252] Método: Método de Tran

[0253] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar el fragmento de TIL 4127-F10 con péptido largo G245S, células T CD4+41BB+ clasificadas (RT-PCR unicelular solamente)

[0254] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular (a continuación) y Adaptive Pairseq (fragmento 4127-F10) Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 12,5 % (observado 2 veces de 16 pares) Orientación del TCR: beta-alfa

[0255] Vector de expresión: retrovirus gamma

[0258]

[0260] Las estadísticas para el TCR4127-TP53-G245S-TCR4para el paciente 4127 se exponen en la tabla 5 a continuación.

[0261] Tabla 5

[0264]

[0265] TCR emparejados totales

16,7 %

[0266] La secuencia de TCR4127_O102_TCR,que se aisló del paciente 4127, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 50), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 51), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 52), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 47), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 48) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 49). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 54) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 53) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 56) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 55) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0267] Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[0268] Nombre del TCR: 4127_O102_TCR

[0269] Reconocimiento de la mutación de p53: G245S

[0270] Método: Método de Tran

[0271] Cocultivo para identificar TCR: No realizado. El TCR se identificó directamente a partir del ARN del clon de células T (0102) usando RACE 5'. El clon se desarrolló clasificando células T OX40+ y estableciendo clones de células T mediante dilución limitante. Se examinaron los clones de células T usando el método de Tran. Método para identificar TCR: 5'RACE a partir del clon de TIL 0102

[0272] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 100 % del clon de células T (no aplicable) Orientación del TCR: beta-alfa

[0273] Vector de expresión: retrovirus gamma

[0276]

[0278] La secuencia de TCR4127-O37-TCR,que se aisló del paciente 4127, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 460), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 461), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 462), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 457), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 458) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 459).

[0279] La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 464) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 463) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 466) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 465) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0280] Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[0281] Nombre del TCR: 4127-O37-TCR

[0282] Reconocimiento de la mutación de p53: G245S

[0283] Método: Método de Tran

[0284] Cocultivo para identificar TCR: No realizado. El TCR se identificó directamente a partir del ADN genómico del clon de células T (O37) usando exámenes de TCRAD y TCRB adaptativos (plataforma de secuenciación de última generación (NGS)). El clon O37 se desarrolló clasificando células T OX40+ y estableciendo clones de células T mediante dilución limitante. Se examinaron los clones de células T usando el método de Tran. Método para identificar TCR: Secuenciación de TCR adaptativa (NGS) del clon de TIL O37 Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 100 % del clon de células T (n/a) Orientación del TCR: beta-alfa

[0285] Vector de expresión: retrovirus gamma

[0288]

[0290] Ejemplo 2

[0291] Este ejemplo demuestra el aislamiento y la reactividad específica de tres TCR anti-p53 mutada del paciente 4196. Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 8-11 para el paciente 4196. Las células T reactivas con p53 para este paciente se identificaron mediante el método de Tran, tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense número 2017/0224800. Se usó el método de Fluidigm para aislar los TCR individuales. Las estadísticas para el paciente 4196 se muestran en la tabla D.

[0292] Caracterización de células reactivas con p53: desafíos con la identificación del epítopo mínimo: El primer péptido predicho con el aminoácido mutado p53 R175H se muestra en la tabla C.

[0293] Tabla C

[0296]

[0298] TMG1 frente a 4196-Rx1 TIL: Se transfectaron células Cos7 con plásmidos para TMG1 y el alelo de HLA. Se cocultivaron células con una bolsa de infusión de 4196 Rx1 TIL durante 20 horas (h). Los resultados se muestran en la figura 8A.

[0299] Péptido mínimo P53-R175H frente a 4196-Rx1 TIL: El día 4, se pulsaron DC autólogas con el epítopo mínimo candidato (HMTEVVRHC (SEQ ID NO: 530) o (SQHMTEVVRH (SEQ ID NO: 531)) durante 2 h. Las células se lavaron y se cocultivaron con una bolsa de infusión de 4196 Rx1 TIL durante 20 h. Los resultados se muestran en la figura 8B.

[0300] El tetrámero de TP53 restringido a A*02:01 puede usarse para aislar células reactivas con TP53 de la bolsa de infusión de TIL: El aislamiento de células reactivas con TP53 usando clasificación 4-1BB+ después del cocultivo con péptido TP53 fue técnicamente limitado. Para aislar las células reactivas con TP53, se generó un tetrámero A*02:01-TP53. Se generó un tetrámero irrelevante (A*02:01-gp100) como control. Se llevó a cabo un análisis FACS en células vivas, CD3+, CD8+. Para el tetrámero A*02:01-TP53, se detectó un 14,9 % de células tetrámero+ de p53. Para el tetrámero A*02:01-gp100, se detectó un 0,7 % de células tetrámero+ de p53.

[0301] Aislamiento y caracterización de células reactivas con TP53: La estrategia para el aislamiento y la caracterización de células reactivas con TP53 fue como sigue: (1) clasificar para células positivas para tetrámero usando FACS tal como se describió anteriormente. (2) Llevar a cabo PCR unicelular. (3) Llevar a cabo la secuenciación de filtración Vβ.

[0302] Se identificaron varios clones candidatos para el TCR de TP53 usando PCR unicelular, tal como se muestra en la tabla D. TCR-1a y TCR-1b eran clones candidatos alternativos.

[0303] Tabla D

[0306]

[0308] Los plásmidos que codifican TCR candidatos se clonaron con vectores MSGV1. Se usó transducción retroviral para introducir TCR en linfocitos de donantes.

[0309] El epítopo mínimo de grado HPLC se pulsó el día 4 en DC A*02:01 durante 2 h. Las DC se cocultivaron con células transducidas con TCR durante 20 h. Los resultados se muestran en las figuras 9A-9D. Se identificaron tres receptores TP53 restringidos a A*02:01 diferentes.

[0310] Se descongelaron células T2 y se dejaron en reposo durante 24 horas, después se pulsaron con concentraciones decrecientes de epítopo mínimo de HPLC durante 2 h. A continuación, las células se lavaron y se cultivaron conjuntamente con células transducidas con TCR de TP53 durante 17 h. Los resultados se muestran en las figuras 10A-10B.

[0311] Las siguientes líneas de células tumorales parentales se transdujeron con HLA-A*02:01: Línea de colon - LS123 (ATCC CCL-255) con R175H pero estado desconocido de HLA-A2. Línea de leucemia: CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119, leucemia) con R175H pero estado desconocido de HLA-A2. Línea de mama: AU-565 (ATCC CRL-2351, adenocarcinoma de mama) con R175H pero estado desconocido de HLA-A2. Línea celular de melanoma: MEL624; expresión endógena de HLA-A2 y R175 wt.

[0312] Se recogieron células tumorales transducidas diana y se sembraron en placa la mañana del cocultivo (1 x 10<5>células/pocillo). Se pulsó el epítopo mínimo de R175H sobre células diana (HPLC, 5 µg/ml) durante 2 h. Las células se lavaron dos veces y se cocultivaron con 2 x 10<4>células transducidas con TCR de TP53 durante 20 h (paciente 4196). Se usó ELISPOT de IFN-γ para la lectura de la respuesta. Los resultados se muestran en la figura 11. En el ejemplo 15, se proporcionan datos experimentales adicionales con respecto a la expresión de HLA-A2 y TP53 de células diana y la reactividad de los TCR de este ejemplo.

[0313] La secuencia de TCR4196_AV12-1_WITH_BV6-1,que se aisló del paciente 4196, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 70), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 71), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 72), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 67), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 68) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 69). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 24). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 74) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 73) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 76) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 75) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación.

[0314] Nombre del TCR: 4196_AV12-1_con_BV6-1

[0315] Reconocimiento de la mutación de p53: R175H

[0316] Método: Método de Tran

[0319]

[0321] La secuencia de TCR4196_AV38-1_con_BV10-3,que se aisló del paciente 4196, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 80), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 81), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 82), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 77), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 78) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 79). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 24). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 84) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 83) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 86) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 85) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación.

[0322] Nombre del TCR: 4196_AV38-1_con_BV10-3

[0323] Reconocimiento de la mutación de p53: R175H

[0324] Método: Método de Tran

[0327]

[0328] La secuencia de TCR4196_AV6_con_BV11-2,que se aisló del paciente 4196, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 90), la segunda región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 91), la tercera región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 92), la cuarta región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 87), la quinta región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 88) y la sexta región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 89). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 24). La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 94) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 93) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 96) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 95) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación.

[0329] Nombre del TCR: 4196_AV6_withBV11-2

[0330] Reconocimiento de la mutación de p53: R175H

[0331] Método: Método de Tran

[0334]

[0336] Ejemplo 3

[0337] Este ejemplo demuestra el aislamiento de TCR anti-p53 mutada del paciente 4238.

[0338] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 12-15 para el paciente 4238.

[0339] Los fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4238 se cocultivaron con APC autólogas sometidas a electroporación con TMG compuesto por la secuencia irrelevante o de p53 mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 12. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 14.

[0340] Los fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4238 se cocultivaron conjuntamente con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptido de 25 aminoácidos purificado (>95 % por HPLC) compuesto por la secuencia de p53-R248Q mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 13. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 15.

[0341] Los fragmentos de TIL F10, F11 y F17 fueron fuentes de TCR después de clasificar células T CD8+41BB+. La secuencia de TCR4238-F10-TCR1,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 207), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 208), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 209), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 210), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 211) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 212). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 213) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 214) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 215) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 216) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0342] Nombre del TCR: 4238-F10-TCR1

[0343] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0344] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0345] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F10 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0346] Método para identificar TCR: reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa unicelular (RT-PCR)

[0347] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 25,0 % (observado 3 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0348] Vector de expresión: Transposón SB

[0351]

[0353] Las estadísticas para TCR4238-F10-TCR1para el paciente 4238 se exponen en la tabla 6 a continuación. Tabla 6

[0356]

[0358] La secuencia de TCR4238-F10-TCR2,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 217), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 218), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 219), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 220), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 221) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 222). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 223) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 224) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 225) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 226) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método usado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0359] Nombre del TCR: 4238-F10-TCR2

[0360] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0361] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0362] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F10 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0363] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0364] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 25,0 % (observado 3 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0365] Vector de expresión: Transposón SB

[0368]

[0370] Las estadísticas para TCR4238-F10-TCR2para el paciente 4238 se exponen en la tabla 7 a continuación. Tabla 7

[0373]

[0375] La secuencia de TCR4238-F10-TCR3,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 227), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 228), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 229), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 230), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 231) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 232). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 233) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 234) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 235) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 236) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0376] Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0377] Nombre del TCR: 4238-F10-TCR3

[0378] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0379] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0380] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F10 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0381] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0382] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 58,3 % (observado 7 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0383] Vector de expresión: Transposón SB

[0386]

[0388] Las estadísticas para TCR4238-F10-TCR3para el paciente 4238 se exponen en la tabla 8 a continuación. Tabla 8

[0391]

[0393] La secuencia de TCR4238-F10-TCR4,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 237), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 238), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 239), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 240), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 241) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 242). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 243) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 244) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 245) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 246) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0394] Nombre del TCR: 4238-F10-TCR4

[0395] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0396] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0397] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F10 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0398] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0399] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 58,3 % (observado 7 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0400] Vector de expresión: Transposón SB

[0403]

[0405] Las estadísticas para TCR4238-F10-TCR4para el paciente 4238 se exponen en la tabla 9 a continuación. Tabla 9

[0408]

[0410] La secuencia de TCR4238-F11-TCR1,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 247), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 248), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 249), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 250), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 251) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 252). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 253) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 254) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 255) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 256) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0411] Nombre del TCR: 4238-F11-TCR1

[0412] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0413] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0414] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F11 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0415] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0416] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 25,0 % (observado 3 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0417] Vector de expresión: Transposón SB

[0420]

[0422] Las estadísticas para TCR4238-F11-TCR1para el paciente 4238 se exponen en la tabla 10 a continuación. Tabla 10

[0425]

[0427] La secuencia de TCR4238-F11-TCR2, que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 257), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 258), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 259), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 260), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 261) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 262). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 262). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 263) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 264) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 265) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 266) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0428] Nombre del TCR: 4238-F11-TCR2

[0429] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0430] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0431] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F11 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0432] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0433] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 25,0 % (observado 3 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0434] Vector de expresión: Transposón SB

[0437]

[0439] Las estadísticas para TCR4238-F11-TCR2para el paciente 4238 se exponen en la tabla 11 a continuación. Tabla 11

[0442]

[0444] La secuencia de TCR4238-F11-TCR3,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 267), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 268), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 269), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 270), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 271) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 272). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 273) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 274) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 275) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 276) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0445] Nombre del TCR: 4238-F11-TCR3

[0446] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0447] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0448] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F11 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0449] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0450] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 16,7 % (observado 2 veces de 12 pares)Orientación del TCR: alfa-beta

[0451] Vector de expresión: Transposón SB

[0454]

[0456] Las estadísticas para TCR4238-F11-TCR3para el paciente 4238 se exponen en la tabla 12 a continuación. Tabla 12

[0459]

[0461] La secuencia de TCR4238-F11-TCR4,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 277), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 278), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 279), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 280), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 281) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 282). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 283) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 284) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 285) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 286) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0462] Nombre del TCR: 4238-F11-TCR4

[0463] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0464] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0465] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F11 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0466] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0467] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 16,7 % (observado 2 veces de 12 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0468] Vector de expresión: Transposón SB

[0469]

[0471] Las estadísticas para TCR4238-F11-TCR4para el paciente 4238 se exponen en la tabla 13 a continuación. Tabla 13

[0474]

[0476] La secuencia de TCR4238-F17-TCR1,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 287), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 288), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 289), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 290), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 291) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 292). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 293) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 294) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 295) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 296) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0477] Nombre del TCR: 4238-F17-TCR1

[0478] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0479] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0480] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F17 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0481] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0482] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 33,3 % (observado 2 veces de 6 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0483] Vector de expresión: Transposón SB

[0484]

[0486] Las estadísticas para TCR4238-F17-TCR1para el paciente 4238 se exponen en la tabla 14 a continuación. Tabla 14

[0489]

[0491] La secuencia de TCR4238-F17-TCR2,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 297), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 298), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 299), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 300), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 301) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 302). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 303) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 304) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 305) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 306) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0492] Nombre del TCR: 4238-F17-TCR2

[0493] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0494] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0495] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F17 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0496] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0497] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 33,3 % (observado 2 veces de 6 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0498] Vector de expresión: Transposón SB

[0499]

[0501] Las estadísticas para TCR4238-F17-TCR2para el paciente 4238 se exponen en la tabla 15 a continuación. Tabla 15

[0504]

[0506] La secuencia de TCR4238-F17-TCR3,que se aisló del paciente 4238, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 307), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 308), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 309), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 310), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 311) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 312). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 313) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 314) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 315) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 316) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0507] Nombre del TCR: 4238-F17-TCR3

[0508] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0509] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0510] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4238-F17 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0511] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0512] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 33,3 % (observado 2 veces de 6 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0513] Vector de expresión: Transposón SB

[0514]

[0516] Las estadísticas para TCR4238-F17-TCR3para el paciente 4238 se exponen en la tabla 16 a continuación. Tabla 16

[0519]

[0521] Ejemplo 4

[0522] Este ejemplo demuestra el aislamiento de TCR anti-p53 mutada del paciente 4253.

[0523] Se llevó a cabo un experimento tal como se describió para la figura 16 para el paciente 4253.

[0524] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24; n=24) del paciente 4253 con APC autólogas (1) pulsadas con vehículo peptídico (DMSO), (2) pulsadas con péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248W mutada, (3) electroporadas con un TMG irrelevante o (4) electroporadas con p53-mut-TMG que contiene la secuencia de p53-R248W mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. La secreción de IFN-γ se evaluó mediante ELISpot. Los resultados se muestran en la figura 16. Se seleccionó F15 para la clasificación de TCR porque era reactivo con tanto p53-mut-TMG como el péptido largo p53-R248W. La secuencia de TCR4253-TIL-TCR1,que se aisló del paciente 4253, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 187), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 188), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 189), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 190), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 191) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 192). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 193) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 194) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 195) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 196) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0525] Nombre del TCR: 4253-TIL-TCR1

[0526] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0527] Método: Cribado universal abreviado de la mutación de "punto caliente" de p53 (solo se evaluó TMG mutado y el péptido largo R248W)

[0528] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4253-F15 con péptido largo p53-R248W, células T CD3+41BB+ clasificadas

[0529] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0530] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 5,6 % (observado 2 veces de 36 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0531] Vector de expresión: Transposón SB

[0534]

[0536] Las estadísticas para TCR4253-TIL-TCR1para el paciente 4253 se exponen en la tabla 17 a continuación. Tabla 17

[0539]

[0541] La secuencia de TCR4253-TIL-TCR2,que se aisló del paciente 4253, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 197), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 198), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 199), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 200), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 201) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 202). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 203) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 204) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 205) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 206) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0542] Nombre del TCR: 4253-TIL-TCR2

[0543] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0544] Método: Cribado universal abreviado de la mutación de "punto caliente" de p53 (solo se evaluó TMG mutado y el péptido largo R248W)

[0545] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4253-F15 con péptido largo p53-R248W, células T CD3+41BB+ clasificadas

[0546] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0547] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 91,7 % (observado 33 veces de 36 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0548] Vector de expresión: Transposón SB

[0551]

[0553] Las estadísticas para TCR4253-TIL-TCR2para el paciente 4253 se exponen en la tabla 18 a continuación. Tabla 18

[0556]

[0558] Ejemplo 5

[0559] Este ejemplo demuestra la identificación de células T anti-p53 mutada en el paciente 4273 mediante el cocultivo de APC autólogas inducidas para expresar p53 mutada dentro de células T autólogas ("cribado universal de mutación de punto caliente de p53"). Este ejemplo también demuestra el aislamiento de dos TCR anti-p53 mutada del paciente 4273.

[0560] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 17-20 y 56-60 para el paciente 4273.

[0561] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4273 con APC autólogas sometidas a electroporación con TMG compuesto por una secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 17. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 18. Los fragmentos TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4273 se cultivaron conjuntamente con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248 WT o la secuencia de p53-R248W mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 19. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 20.

[0562] Para el paciente 4273, F15 fue el fragmento más reactivo y las respuestas de F15 al LP y TMG fueron comparables y principalmente por células T CD4. Por lo tanto, se cocultivó 4273-F15 con APC pulsadas con el R248W LP, y al día siguiente se clasificaron células T CD4+41BB+ como células individuales en los pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos a una célula por pocillo. La placa de PCR tiene una solución de RT-PCR en cada pocillo, que amplifica las regiones CDR3 alfa y beta de TCR en la misma solución. Los pocillos de la placa se dividen luego en dos placas de PCR de 96 pocillos y se realiza una segunda ronda de PCR para amplificar la CDR3 alfa o la CDR3 beta como reacciones separadas. Los productos de PCR de cada pocillo (total de 192 productos de PCR mapeados para cada pocillo - alfa o beta) se secuencian mediante secuenciación de Sanger. La secuencia de nucleótidos se introduce en IMGT/V-QUEST

[0563] (imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanTcR), IgBlast (ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi?CMD=Web&SEARCH_TYPE=TCR&LINK_LOC=igt ab) y traducido por Expasy (web.expasy.org/translate/). La familia variable se determina y se fusiona con la CDR3 y la unión (J o DJ) de la secuencia traducida. La secuencia variable se fusiona con la secuencia constante murina y los TCRalfa y TCRbeta reconstruidos están unidos por furina-flexible-P2A (RAKR-SGSG-ATNFSLLKQAGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 26). Luego, la secuencia se sintetiza en ADNde novoy se clona en un vector de expresión (transposón de retrovirus gamma o SLEEPING BEAUTY (SB) (Universidad de Minnesota, Mineápolis, MN)). Luego se hace que las células T expresen el TCR usando los protocolos estándar de transducción viral o transposición no viral y las células T que expresan TCR murinizados (como se detecta por la cadena constante beta de TCR de ratón) se someten a prueba contra el péptido supuesto.

[0564] Se transfectaron APC autólogas con TMG que que codifica mutaciones irrelevantes, secuencias de p53 WT o secuencias de p53 mutadas que incluyen p53-R248W. Medios solos y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Se cocultivaron TIL del paciente 4273 (cultivos de fragmentos 8 y 15) durante la noche a 37 °C con APC transfectadas con TMG. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 56.

[0565] Se pulsaron APC autólogas con péptidos de 25 aminoácidos correspondientes al neoepítopo p53-R248W WT o mutado durante 2 horas a 37 °C. Se cocultivaron TIL del paciente 4273 (cultivo de fragmentos 15) con especificidad para p53-R248W durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. DMSO fue el vehículo peptídico. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 57.

[0566] Se pulsaron APC autólogas con péptidos de 15 aminoácidos del neoepítopo p53-R248W que se solapan con 14 aminoácidos. Se cocultivaron TIL del paciente 4273 (cultivo de fragmentos 15) con especificidad para p53-R248W durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. DMSO fue el vehículo peptídico, medio solo (células T solo) y PMA e ionomicina fueron los controles. Los péptidos de 25 aminoácidos (p53-R248 wt y p53-R248W mutado) fueron controles adicionales para los péptidos de 15 aminoácidos. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T) → CD4+CD8-. Los resultados se muestran en la figura 58.

[0567] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5x10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, las células se cotransfectaron con alelos de HLA individuales del paciente 4273 y TMG de TP53 de tipo silvestre o mutado con o sin el neoantígeno de p53-R248W, respectivamente. Al día siguiente, se cocultivaron TIL con especificidad para p53-R248W del paciente 4273 (cultivo de fragmentos 15) con células Cos7 transfectadas durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 59.

[0568] Se cocultivaron células T que expresaban simulado (sin TCR) o 4273-TCR1a2 con APC autólogas que se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 de tipo silvestre o secuencias de p53-R248W mutadas. Medios solos y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. La secreción de IFN-γ se evaluó mediante ELISpot. Los resultados se muestran en la figura 60.

[0569] La secuencia de TCR 4273-TP53-R248W-TCR1a1, que se aisló del paciente 4273, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 437), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 438), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 439), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 440), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 441) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 442). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 443) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 444) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 445) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 446) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0570] Nombre del TCR: 4273-TP53-R248W-TCR1a1

[0571] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0572] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0575]

[0577] La secuencia de TCR 4273-TP53-R248W-TCR1a2, que se aisló del paciente 4273, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 447), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 448), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 449), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 450), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 451) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 452). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 453) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 454) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 455) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 456) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0578] Nombre del TCR: 4273-TP53-R248W-TCR1a2

[0579] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0580] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0583]

[0585] Las estadísticas para los TCR del paciente 4273 se exponen en la tabla 19 a continuación. En la tabla 19, 96 pocillos totales clasificados con células T 41BB+ después del cocultivo con proteína p53 mutada (TMG o péptido).

[0586] 77 pocillos tenían pares productivos (lo que significa que tenían (1) una secuencia y (2) sin codones de terminación en la secuencia) para una frecuencia de emparejamiento del 80,2 %. 43 de esos pares fueron la combinación CDR3A/CDR3B para producir 4273-TP53-R248W-TCR1a1 (55,8 % de los pares productivos). 30 de esos pares fueron la combinación CDR3A/CDR3B para producir 4273-TP53-R248W-TCR1a2 (39 % de los pares productivos). En general, las CDR3A y CDR3B para 4273-TP53-R248W-TCR1a1 se encontraron 50 y 83 veces, respectivamente, de 96 pocillos. En general, las CDR3A y CDR3B para 4273-TP53-R248W-TCR1a2 se encontraron 33 y 83 veces, respectivamente, de 96 pocillos.

[0587] Tabla 19

[0590]

[0591]

[0593] Ejemplo 6

[0594] Este ejemplo demuestra la identificación de células T anti-p53 mutada en el paciente 4149. Este ejemplo también demuestra el aislamiento y la reactividad específica de un TCR anti-p53 mutada del paciente 4149.

[0595] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 21-24 para el paciente 4149. El TCR se encontró usando el método de Tran. Luego se usó el TCR para validar el método de "cribado universal de mutación de punto caliente de p53".

[0596] Se transpuso un TCR (4149-TCRa2b1 o 4149-TCRa2b2) en PBL autólogos del paciente 4149 y se cocultivó con APC autólogas que (1) se sometieron a electroporación con TMG compuesto por secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada o (2) se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por secuencia de p53-Y220 WT o secuencia de p53-Y220C mutada. La combinación de PMA e ionomicina fue un control positivo. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 21. La expresión de 4-1BB se evaluó mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T) → CD4+ mTCR+ (células T transpuestas con TCR). Los resultados se muestran en la figura 22.

[0597] También se realizó el porcentaje de células CD4+4-1BB+ mediante secuenciación profunda TCRAD y secuenciación profunda TCRB. Los resultados se muestran en la tabla E.

[0598] Tabla E

[0601]

[0603] Mapeo del supuesto epítopo mínimo de p53<Y220C>reconocido por 4149-F11: Se pulsaron células DC autólogas con péptido (10 µg/ml) y se dejaron reposar durante la noche en factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e IL-4. Los TIL se dejaron reposar durante 2-3 días en IL-2500 CU/ml. Se cocultivaron 2x10<4>TIL y 10<5>células diana durante la noche a 37 °C. Se midió IFN-γ mediante ELISPOT. Los resultados se muestran en la tabla F. La expresión de 4-1BB se midió mediante FACS con la selección linfocitos\PI(neg)CD3+\CD3+CD4+. Los resultados se muestran en la figura 23.

[0604] Tabla F

[0607]

[0608]

[0610] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5 x 10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Después de 20 horas, las células se cotransfectaron con alelos de HLA individuales con o sin TMG. Después de 20 horas, se transfectaron células DC autólogas con TMG en paralelo. Todos los alelos de HLA de clase II se cotransfectaron en un conjunto de pocillos con o sin TMG. Las células no transfectadas con TMG se pulsaron con péptido de 15 meros de p53-Y220C durante 2-3 horas a 37 °C a 10 µg/ml. Después del lavado, se añadieron células T transpuestas con 4149-TCRa2b2 (10<5>) en el día+14 de la segunda REP a los pocillos y se cocultivaron durante la noche a 37 °C. Se midió la secreción de IFN-γ mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 24. Predicción (Tabla G) por NetMHCIIpan: cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/.

[0611] Tabla G

[0614]

[0616] La expresión de DRB3*02 se detectó en 1367 de 3719 (37 %) de pacientes tipificados por DRB en la base de datos de HLA del NCI y en 5 de 9 (56 %) pacientes con cáncer de endometrio y ovario en el NCI-SB. La frecuencia notificada del alelo DRB3*02 es muy alta, tal como se describió en el ejemplo 1.

[0617] La secuencia de TCR4149TCRa2b2,que se aisló del paciente 4149, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 57), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 58), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 59), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 60), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 61) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 62). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 63) incluye la secuencia que comienza desde el extremo aminoterminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 64) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 65) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 66) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0618] Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. Las células reactivas con p53 para este paciente se identificaron mediante el método de transelección tal como se describe en la solicitud estadounidense n.º 2017/0224800.

[0619] Nombre del TCR: 4149TCRa2b2

[0620] Reconocimiento de la mutación de p53: Y220C

[0621] Método de cribado: Usado para validar el cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53 Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar el fragmento de TIL 4149-F11 con el péptido largo p53-Y220C, células T CD4+41BB+ clasificadas

[0622] Método para identificar TCR: Emparejamiento de frecuencia. Se expandieron células T clasificadas CD4+41BB+ en REP (protocolo de expansión rápida) y el cultivo de células T resultante se sometió a secuenciación profunda TCRAD (alfa) y TCRB (beta) por Adaptive Biotechnologies. Los dos mejores TCR alfa se emparejaron con los dos mejores TCR beta en una matriz de 4 TCR en total. El segundo TCR alfa y el segundo TCR beta fue el TCR reactivo, por lo tanto, la nomenclatura TCRa2b2.

[0623] Abundancia de TCR entre todos los TCR: como se indica a continuación

[0624] Orientación del TCR: alfa-beta

[0625] Vector de expresión: Transposón SB

[0628]

[0630] Las estadísticas para TCR4149TCRa2b2del paciente 4149 se exponen en la tabla 20 a continuación.

[0631] Tabla 20

[0634]

[0636] Ejemplo 7

[0637] Este ejemplo demuestra la identificación de células T anti-p53 mutada en el paciente 4213 mediante el cocultivo de APC autólogas inducidas para expresar p53 mutada dentro de células T autólogas ("cribado universal de mutación de punto caliente de p53"). Este ejemplo también demuestra el aislamiento de TCR anti-p53 mutada del paciente 4213.

[0638] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 25-26 para el paciente 4213.

[0639] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F2 y F24) del paciente 4213 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248Q mutada. Se realizaron cocultivos durante la noche a 37 °C. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 25. Las células T CD8+4-1BB+ se clasificaron en pocillos de placas de 96 pocillos. Los TCR se identificaron mediante RT-PCR unicelular.

[0640] Las células T CD4+ provenían de linfocitos de sangre periférica del paciente 4213. El cultivo de células T CD4+ se cocultivó con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248Q mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. La secreción de IFN-γ se evaluó mediante ELISpot. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 26. Las células T CD4+41BB+ se clasificaron en pocillos de placas de 96 pocillos. Los TCR se identificaron mediante RT-PCR unicelular.

[0641] La secuencia de4213-F2-TCR1,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 317), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 318), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 319), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 320), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 321) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 322). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 323) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 324) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 325) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 326) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0642] Nombre del TCR: 4213-F2-TCR1

[0643] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0644] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0645] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4213-F2 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0646] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0647] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 8,3 % (observado 2 veces de 24 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0648] Vector de expresión: Transposón SB

[0651]

[0653] Las estadísticas para TCR4213-F2-TCR1del paciente 4213 se exponen en la tabla 21 a continuación.

[0654] Tabla 21

[0657]

[0659] La secuencia de4213-F2-TCR2,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 327), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 328), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 329), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 330), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 331) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 332). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 333) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 334) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 335) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 336) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0660] Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0661] Nombre del TCR: 4213-F2-TCR2

[0662] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0663] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0664] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4213-F2 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0665] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0666] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 12,5 % (observado 3 veces de 24 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0667] Vector de expresión: Transposón SB

[0670]

[0672] Las estadísticas para TCR4213-F2-TCR2del paciente 4213 se exponen en la tabla 22 a continuación.

[0673] Tabla 22

[0676]

[0678] La secuencia de4213-F2-TCR3,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 337), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 338), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 339), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 340), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 341) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 342). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 343) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 344) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 345) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 346) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0679] Nombre del TCR: 4213-F2-TCR3

[0680] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0681] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0682] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4213-F2 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0683] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0684] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 70,8 % (observado 17 veces de 24 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0685] Vector de expresión: Transposón SB

[0688]

[0690] Las estadísticas para TCR4213-F2-TCR3del paciente 4213 se exponen en la tabla 23 a continuación.

[0691] Tabla 23

[0694]

[0696] La secuencia de4213-F24-TCRa1,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 347), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 348), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 349), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 350), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 351) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 352). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 353) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 354) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 355) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 356) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0697] Nombre del TCR: 4213-F24-TCRa1

[0698] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0699] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0700] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4213-F24 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0701] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0702] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 15,9 % (observado 7 veces de 44 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0703] Vector de expresión: Transposón SB

[0706]

[0708] Las estadísticas para TCR4213-F24-TCRa1del paciente 4213 se exponen en la tabla 24 a continuación.

[0709] Tabla 24

[0712]

[0714] La secuencia de4213-F24-TCRa2,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 357), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 358), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 359), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 360), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 361) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 362). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 363) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 364) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 365) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 366) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0715] Nombre del TCR: 4213-F24-TCRa2

[0716] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0717] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0718] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4213-F24 con péptido largo R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0719] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0720] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 84,1 % (observado 37 veces de 44 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0721] Vector de expresión: Transposón SB

[0724]

[0726] Las estadísticas para TCR4213-F24-TCRa2del paciente 4213 se exponen en la tabla 25 a continuación.

[0727] Tabla 25

[0730]

[0732] La secuencia de4213-PBL-TCR1,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 367), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 368), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 369), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 370), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 371) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 372). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 373) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 374) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 375) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 376) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0733] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR1

[0734] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0735] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0736] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0737] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 9,5 % (observado 6 veces de 63 pares)Orientación del TCR: alfa-beta

[0738] Vector de expresión: Transposón SB (Universidad de Minnesota, Mineápolis, MN)

[0741]

[0743] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR1del paciente 4213 se exponen en la tabla 26 a continuación.

[0744] Tabla 26

[0747]

[0749] La secuencia de4213-PBL-TCR2,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 377), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 378), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 379), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 380), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 381) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 382). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 383) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 384) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 385) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 386) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0750] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR2

[0751] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0752] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0753] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0754] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 7,9 % (observado 5 veces de 63 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0755] Vector de expresión: Transposón SB

[0758]

[0760] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR2del paciente 4213 se exponen en la tabla 27 a continuación.

[0761] Tabla 27

[0764]

[0766] La secuencia de4213-PBL-TCR3,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 387), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 388), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 389), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 390), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 391) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 392). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 393) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 394) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 395) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 396) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0767] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR3

[0768] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0769] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0770] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0771] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 6,3 % (observado 4 veces de 63 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0772] Vector de expresión: Transposón SB

[0773]

[0775] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR3del paciente 4213 se exponen en la tabla 28 a continuación.

[0776] Tabla 28

[0779]

[0781] La secuencia de4213-PBL-TCR4a1,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 397), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 398), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 399), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 400), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 401) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 402). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 403) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 404) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 405) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 406) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0782] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR4a1

[0783] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0784] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0785] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0786] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 3,2 % (observado 2 veces de 63 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0787] Vector de expresión: Transposón SB

[0788]

[0790] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR4a1del paciente 4213 se exponen en la tabla 29 a continuación. Tabla 29

[0793]

[0795] La secuencia de4213-PBL-TCR4a2,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 407), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 408), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 409), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 410), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 411) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 412). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 413) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 414) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 415) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 416) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0796] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR4a2

[0797] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0798] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0799] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0800] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 3,2 % (observado 2 veces de 63 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0801] Vector de expresión: Transposón SB

[0802]

[0804] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR4a2del paciente 4213 se exponen en la tabla 30 a continuación. Tabla 30

[0807]

[0809] La secuencia de4213-PBL-TCR4a3,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 417), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 418), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 419), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 420), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 421) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 422). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 423) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 424) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 425) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 426) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0810] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR4a3

[0811] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0812] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0813] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0814] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 4,8 % (observado 3 veces de 63 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0815] Vector de expresión: Transposón SB

[0816]

[0818] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR4a3del paciente 4213 se exponen en la tabla 31 a continuación. Tabla 31

[0821]

[0823] La secuencia de4213-PBL-TCR4a4,que se aisló del paciente 4213, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 427), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 428), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 429), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 430), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 431) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 432). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 433) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 434) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 435) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 436) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0824] Nombre del TCR: 4213-PBL-TCR4a4

[0825] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0826] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0827] Cocultivo para identificar TCR: Se cocultivaron células T de memoria CD4+ después de la sensibilización in vitro con péptido largo R248Q con péptido largo R248Q y se clasificaron células T CD4+41BB+ Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0828] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 3,2 % (observado 2 veces de 63 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0829] Vector de expresión: Transposón SB

[0830]

[0832] Las estadísticas para TCR4213-PBL-TCR4a4del paciente 4213 se exponen en la tabla 32 a continuación. Tabla 32

[0835]

[0837] Ejemplo 8

[0838] Este ejemplo demuestra la identificación de células T anti-p53 mutada en el paciente 4268 mediante el cocultivo de APC autólogas inducidas para expresar p53 mutada dentro de células T autólogas ("cribado universal de mutación de punto caliente de p53"). Este ejemplo también demuestra el aislamiento de TCR anti-p53 mutada del paciente 4268.

[0839] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 27-30 para el paciente 4268.

[0840] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas sometidas a electroporación con TMG compuesto por una secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 27.

[0841] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248 WT o la secuencia de p53-R248Q mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 28.

[0842] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248 wt o la secuencia de p53-R248Q mutada. Se realizaron cocultivos durante la noche a 37 °C. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 29. Los fragmentos de TIL F18 y F19 fueron fuentes de TCR después de clasificar células T CD4+41BB+.

[0843] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4268 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248 WT o la secuencia de p53-R248Q mutada. Se realizaron cocultivos durante la noche a 37 °C. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 30. Los fragmentos TIL F7, F8 y F15 fueron fuentes de TCR después de clasificar células T CD8+4-1BB+.

[0844] La secuencia de4268-TCR1,que se aisló del paciente 4268, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 137), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 138), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 139), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 140), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 141) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 142). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 143) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 144) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 145) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 146) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0845] Nombre del TCR: 4268-TCR1

[0846] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0847] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0848] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4268-F7 y 4268-F8 con péptido largo p53-R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0849] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0850] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 78,7 % (observado 48 veces de 61 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0851] Vector de expresión: Transposón SB

[0854]

[0856] Las estadísticas para TCR4268-TCR1del paciente 4268 se exponen en la tabla 33 a continuación.

[0857] Tabla 33

[0860]

[0862] La secuencia de4268-TCR2,que se aisló del paciente 4268, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 147), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 148), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 149), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 150), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 151) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 152). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 153) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 154) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 155) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 156) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0863] Nombre del TCR: 4268-TCR2

[0864] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0865] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0866] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4268-F7 y 4268-F8 con péptido largo p53-R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0867] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0868] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 6,6 % (observado 4 veces de 61 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0869] Vector de expresión: Transposón SB

[0872]

[0874] Las estadísticas para TCR4268-TCR2del paciente 4268 se exponen en la tabla 34 a continuación.

[0875] Tabla 34

[0878]

[0880] La secuencia de4268-TCR3,que se aisló del paciente 4268, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 157), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 158), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 159), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 160), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 161) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 162). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 163) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 164) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 165) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 166) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0881] Nombre del TCR: 4268-TCR3

[0882] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0883] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0884] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4268-F15 con péptido largo p53-R248Q, células T CD8+41BB+ clasificadas

[0885] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0886] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 88,6 % (observado 31 veces de 35 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0887] Vector de expresión: Transposón SB

[0890]

[0892] Las estadísticas para TCR4268-TCR3del paciente 4268 se exponen en la tabla 35 a continuación.

[0893] Tabla 35

[0896]

[0898] La secuencia de4268-TCR4,que se aisló del paciente 4268, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 167), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 168), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 169), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 170), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 171) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 172). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 173) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 174) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 175) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 176) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0899] Nombre del TCR: 4268-TCR4

[0900] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0901] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0902] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4268-F18 con péptido largo p53-R248Q, células T CD4+41BB+ clasificadas

[0903] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0904] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 95,2 % (observado 40 veces de 42 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0905] Vector de expresión: Transposón SB

[0908]

[0910] Las estadísticas para TCR4268-TCR4del paciente 4268 se exponen en la tabla 36 a continuación.

[0911] Tabla 36

[0914]

[0916] La secuencia de4268-TCR5,que se aisló del paciente 4268, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 177), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 178), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 179), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 180), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 181) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 182). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 183) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 184) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 185) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 186) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0917] Nombre del TCR: 4268-TCR5

[0918] Reconocimiento de la mutación de p53: R248Q

[0919] Método: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0920] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4268-F19 con p53-mut-TMG, células T CD4+41BB+ clasificadas Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0921] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 11,8 % (observado 2 veces de 17 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0922] Vector de expresión: Transposón SB

[0925]

[0927] Las estadísticas para TCR4268-TCR5del paciente 4268 se exponen en la tabla 37 a continuación.

[0928] Tabla 37

[0931]

[0933] Ejemplo 9

[0934] Este ejemplo demuestra la identificación de células T anti-p53 mutada en el paciente 4266 mediante el cocultivo de APC autólogas inducidas para expresar p53 mutada dentro de células T autólogas ("cribado universal de mutación de punto caliente de p53"). Este ejemplo también demuestra el aislamiento de cuatro TCR anti-p53 mutada del paciente 4266.

[0935] Se llevaron a cabo experimentos como se describe para las figuras 31-34 y 53-55 para el paciente 4266.

[0936] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4266 con APC autólogas sometidas a electroporación con TMG compuesto por una secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 31. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 32. Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F24, n=24) del paciente 4266 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R248 WT o la secuencia de p53-R248W mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 33. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 34.

[0937] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5x10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, se cotransfectaron células con alelos de HLA individuales del paciente 4266. Al día siguiente, las células se pulsaron sin péptido, DMSO, péptido p53-R248 de tipo silvestre SSCMGGMNRRR (SEQ ID NO: 590) o péptido p53-R248W mutado SSCMGGMNNWR (SEQ ID NO: 591) durante 2 horas a 37 °C a 1 µg/ml. Se añadieron cultivos de TIL del paciente 4266 (10<5>) a los pocillos y se cocultivaron durante la noche a 37 °C. La expresión de 4-1BB se evaluó mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T) → CD4-CD8+. Los resultados se muestran en la figura 53.

[0938] Se cocultivaron células T que expresaban simulado (sin TCR), 4266-TCR1, 4266-TCR2, 4266-TCR3 o 4266-TCR4 con especificidad supuesta para p53-R248W identificados a partir de 4266-TIL con APC autólogas que se pulsaron con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % mediante HPLC) compuestos por secuencia de p53-R248 WT o secuencias de p53-R248W mutadas. Medios solos y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Se realizaron cocultivos durante la noche a 37 °C. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T) → CD4-CD8+. Los resultados se muestran en la figura 54.

[0939] Se estableció una línea de células tumorales (TC) a partir de un fragmento tumoral xenoinjertado resecado del paciente 4266 y luego se pasó en serie a través de ratones inmunocomprometidos (TC#4266). El TC#4266 se cocultivó con células T (10<5>) que expresaban TCR simulados (sin TCR) o específicos de p53-R248W (4266-TCR2, 4266-TCR3 o 4266-TCR4) durante la noche a 37 °C. Las células TC#4266 se incubaron con nada, anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase I W6/32, anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase II IVA12 o péptido p53-R248W mutado SSCMGGMNWR (SEQ ID NO: 591) durante 2 horas a 37 °C. Los anticuerpos se mantuvieron en el cocultivo a una concentración final de 5 µg/ml. Se incubó el péptido a 1 µg/ml y se lavó el péptido en exceso después de la incubación. Medios solos (sin TC) y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T) → CD4-CD8+. Los resultados se muestran en la figura 55.

[0940] La secuencia de4266-TCR1,que se aisló del paciente 4266, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 97), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 98), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 99), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 100), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 101) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 102). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 103) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 104) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 105) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 106) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal.

[0941] Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0942] Nombre del TCR: 4266-TCR1

[0943] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0944] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0945] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4266-F1, 4266-F3, 4266-F5 y 4266-F6 con péptido largo p53mutTMG o R248W (ambos cocultivos detectaron el mismo TCR), células T CD8+41BB+ clasificadas Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0946] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 17,0 % (observado 9 veces de 53 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0947] Vector de expresión: Transposón SB

[0948]

[0950] Las estadísticas para TCR4266-TCR1del paciente 4266 se exponen en la tabla 38 a continuación.

[0951] Tabla 38

[0954]

[0956] La secuencia de4266-TCR2,que se aisló del paciente 4266, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 107), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 108), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 109), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 110), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 111) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 112). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 113) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 114) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 115) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 116) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0957] Nombre del TCR: 4266-TCR2

[0958] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0959] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0960] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4266-F1, 4266-F3, 4266-F5 y 4266-F6 con péptido largo p53mutTMG o R248W (ambos cocultivos detectaron el mismo TCR), células T CD8+41BB+ clasificadas Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0961] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 24,5 % (observado 13 veces de 53 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0962] Vector de expresión: Transposón SB

[0963]

[0965] Las estadísticas para TCR4266-TCR2del paciente 4266 se exponen en la tabla 39 a continuación.

[0966] Tabla 39

[0969]

[0971] La secuencia de4266-TCR3,que se aisló del paciente 4266, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 117), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 118), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 119), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 120), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 121) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 122). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 123) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 124) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 125) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 126) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0972] Nombre del TCR: 4266-TCR3

[0973] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0974] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0975] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4266-F1, 4266-F3, 4266-F5 y 4266-F6 con péptido largo p53mutTMG o R248W (ambos cocultivos detectaron el mismo TCR), células T CD8+41BB+ clasificadas Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0976] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 34,0 % (observado 18 veces de 53 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0977] Vector de expresión: Transposón SB

[0978]

[0980] Las estadísticas para TCR4266-TCR3del paciente 4266 se exponen en la tabla 40 a continuación.

[0981] Tabla 40

[0984]

[0986] La secuencia de4266-TCR4,que se aisló del paciente 4266, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 127), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 128), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 129), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 130), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 131) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 132). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 133) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 134) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 135) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 136) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer usando el método de detección que se expone a continuación. El método utilizado para aislar el TCR se expone a continuación.

[0987] Nombre del TCR: 4266-TCR4

[0988] Reconocimiento de la mutación de p53: R248W

[0989] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[0990] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4266-F1, 4266-F3, 4266-F5 y 4266-F6 con péptido largo p53mutTMG o R248W (ambos cocultivos detectaron el mismo TCR), células T CD8+41BB+ clasificadas Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[0991] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 9,4 % (observado 5 veces de 53 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[0992] Vector de expresión: Transposón SB

[0993]

[0995] Las estadísticas para TCR4266-TCR4del paciente 4266 se exponen en la tabla 41 a continuación.

[0996] Tabla 41

[0999]

[1001] Ejemplo 10

[1002] Este ejemplo demuestra un resumen de las respuestas a las mutaciones de "punto caliente" de p53 por parte de las células T.

[1003] En la tabla 42 se proporciona un resumen de las respuestas a las mutaciones de "punto caliente" de p53 por parte de las células T. Los números 1-15 de la tabla 42 fueron un estudio retrospectivo. Los números 16-33 de la tabla 42 fueron un estudio prospectivo.

[1004] Tabla 42

[1007]

[1008]

[1010] Ejemplo 11

[1011] Este ejemplo demuestra el tratamiento de pacientes con TIL reactivo con la mutación de p53.

[1012] En la tabla 43 se proporciona un resumen del tratamiento de pacientes con TIL reactivo con la mutación de p53. Tabla 43

[1014]

[1016] Ejemplo 12

[1017] Este ejemplo demuestra el aislamiento y la reactividad específica de un TCR del paciente 4141.

[1018] Se transfectaron APC autólogas con TMG que codificaba mutaciones irrelevantes, secuencia de p53 WT o secuencia de p53 mutada que incluye R175H. Medios solos y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Al día siguiente, se cocultivaron TIL del paciente 4141 (cultivo de fragmentos 12) durante la noche a 37 °C con APC transfectadas con TMG. Se evaluó la secreción de IFN-γ mediante ELISPOT. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T) → CD4-CD8+. Los resultados se muestran en la figura 38.

[1019] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5x10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, se cotransfectaron células con alelos de HLA individuales del paciente 4141 y sin gen adicional, TMG de TP53 WT o TMG de TP53 mutado que contenía la secuencia de p53-R175H. Se cocultivaron TIL con especificidad para p53-R175H del paciente 4141 (cultivo de fragmentos 12) al día siguiente con células Cos7 transfectadas y se incubaron durante la noche a 37 °C. La secreción de IFN-γ se evaluó mediante ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 39.

[1020] Se cocultivaron células T que expresaban simulado (sin TCR) o 4141-TCR1a2 con células tumorales T2 (que expresan HLA-A*02:01). Las células T2 se pulsaron durante 2 horas a 37 °C con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por péptido p53-R175 WT HMTEVVRRC (SEQ ID NO: 532) o péptido p53-R175H mutado HMTEVVRHC (SEQ ID NO: 530). Medios solos y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. La secreción de IFN-γ se evaluó mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 40.

[1021] Se cocultivaron células T que expresan 4141-TCR1a2 durante la noche a 37 °C con células Saos2 (p53-NULL y HLA-A*02:01+), que no estaban manipuladas o se hizo que sobreexpresaran la proteína p53-R175H de longitud completa. Se añadieron inhibidores de la secreción (monensina y brefeldina A) a los cocultivos para atrapar citocinas dentro de las células T. Después de 6 horas de cocultivo, las células se fijaron y permeabilizaron, luego se tiñeron para IL-2, CD107a, IFN-γ y factor de necrosis tumoral alfa (TNFα). Se usó citometría de flujo para analizar cocultivos basados en una selección de linfocitos. Los resultados se muestran en la figura 41.

[1022] La secuencia de TCR4141-TCR1a2,que se aisló del paciente 4141, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 467), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 468), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 469), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 470), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 471) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 472). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 473) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 474) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 475) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 476) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[1023] Nombre del TCR: 4141-TCR1a2

[1024] Reconocimiento de la mutación de p53: R175H

[1025] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[1026] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar TIL de la bolsa de infusión 4141 con p53mutTMG y células T CD8+41BB+ clasificadas

[1027] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular y luego kit de clonación TA TOPO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para cadena alfa

[1028] Orientación del TCR: alfa-beta

[1029] Vector de expresión: Transposón SB

[1030]

[1032] Las estadísticas para 4141-TCR1a2 del paciente 4141 se exponen en la tabla 44 a continuación.

[1033] Tabla 44

[1036]

[1038] Ejemplo 13

[1039] Este ejemplo demuestra el aislamiento y la reactividad específica de un TCR aislado del paciente 4259.

[1040] El cultivo de fragmentos de TIL (n.º 6) del paciente 4259 se cocultivó con APC autólogas (1) sometidas a electroporación con TMG compuesto por secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada o (2) pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por secuencia de p53-Y220 WT o secuencia de p53-Y220C mutada. Se realizaron cocultivos durante la noche a 37 °C. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 42.

[1041] Se pulsaron APC autólogas con concentraciones decrecientes de péptidos de 25 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53-Y220 WT o p53-Y220C mutada durante 2 horas a 37 °C. El cultivo de fragmentos de TIL (n. ° 6) del paciente 4259 se cocultivó con APC pulsadas con péptidos. Se sometió a ensayo la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 43.

[1042] Se pulsaron células presentadoras de antígeno autólogas con DMSO, péptido p53-Y220 WT RNTFRHSVVPYE (SEQ ID NO: 533) o péptido p53-Y220C mutado RNTFRHSVVVPCE (SEQ ID NO: 534) durante 2 horas a 37 °C. El exceso de péptido se eliminó por lavado. El TIL del paciente 4259 (cultivo de fragmentos 6) con especificidad para p53-Y220C se cocultivó durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 44.

[1043] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5x10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, se cotransfectaron células con alelos de HLA individuales del paciente 4259. Al día siguiente, se pulsaron DMSO o el péptido p53-Y220C RNTFRHSVVVPCE (SEQ ID NO: 534) durante 2 horas en células Cos7 transfectadas. El exceso de péptido se eliminó por lavado. Se añadió el cultivo de fragmentos de TIL n. ° 6 del paciente 4259 (10<5>células/pocillo). Los cocultivos se incubaron durante la noche a 37 °C. La expresión de 4-1BB se analizó mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → vivos → CD3+ (células T) → CD8-CD4+. Los resultados se muestran en la figura 45.

[1044] Se pulsaron APC autólogas para el paciente 4259 con péptidos de 25 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53-Y220 WT o p53-Y220C mutada durante 2 horas a 37 °C. El exceso de péptido se eliminó por lavado. Las células T que expresaban 4259-F6-TCR se cocultivaron durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). El TCR introducido se midió mediante TCRbeta de ratón (mTCR). Los resultados se muestran en la Tabla 45.

[1045] Tabla 45

[1046]

[1048] Se estableció una línea de células tumorales (TC) a partir de un fragmento tumoral xenoinjertado resecado del paciente 4259 y luego se pasó en serie a través de ratones inmunocomprometidos (TC#4259). El TC#4259 se cocultivó con células T (10<5>) que expresaban TCR simulado (sin TCR) o específico de p53-Y220C (4259-F6-TCR) durante la noche a 37 °C. Las células TC#4259 se incubaron con nada, anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase I W6/32, anticuerpo bloqueante específico pan-HLA de clase II IVA12 o péptido p53-Y220C mutado RNTFRHSVVVPCE (SEQ ID NO: 534) durante 2 horas a 37 °C. Los anticuerpos se mantuvieron en el cocultivo a una concentración final de 5 µg/ml. El péptido se incubó a 10 µg/ml y el exceso de péptido se lavó después de la incubación. Medios solos (sin TC) y PMA e ionomicina fueron controles negativos y positivos, respectivamente. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 46.

[1049] La secuencia de TCR4259-F6-TCR,que se aisló del paciente 4259, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 477), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 478), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 479), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 480), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 481) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 482). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 483) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 484) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 485) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 486) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[1050] Nombre del TCR: 4259-F6-TCR

[1051] Reconocimiento de la mutación de p53: Y220C

[1052] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[1053] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4259-F6 con péptido p53-Y220C y células T CD4+41BB+ clasificadas

[1054] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[1055] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 81,1 % (observado 36 veces de 44 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[1056] Vector de expresión: Transposón SB

[1057]

[1059] Las estadísticas para4259-F6-TCRdel paciente 4259 se exponen en la tabla 46 a continuación.

[1060] Tabla 46

[1063]

[1065] Ejemplo 14

[1066] Este ejemplo demuestra el aislamiento y la reactividad específica de un TCR del paciente 4285.

[1067] Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F22 y F24, n=23) del paciente 4285 con APC autólogas sometidas a electroporación con TMG compuesto por una secuencia irrelevante, p53 WT o p53 mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 47. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 49. Se cocultivaron fragmentos de TIL (F1-F22 y F24, n=23) del paciente 4285 con APC autólogas pulsadas con vehículo peptídico (DMSO) o péptidos de 25 aminoácidos purificados (>95 % por HPLC) compuestos por la secuencia de p53-R175 WT o la secuencia de p53-R175H mutada. Los cocultivos se realizaron durante la noche a 37 °C. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la figura 48. Se evaluó la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → células vivas (negativas para PI) → CD3+ (células T). Los resultados se muestran en la figura 50. El fragmento de TIL F6 fue la fuente de 4285-TCR1 después de clasificar células T CD4+41BB+.

[1068] Se pulsaron APC autólogas con péptidos de 15 aminoácidos de la secuencia p53-R175H (sustitución de aminoácidos subrayada en la tabla 45) que se solapan con 14 aminoácidos. Se cocultivaron TIL del paciente 4285 (cultivos de fragmentos 10, 6 y 9) con especificidad para p53-R175H durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. DMSO fue el vehículo peptídico. Se evaluó la secreción de IFN-γ usando el ensayo ELISPOT. Los resultados se muestran en la Tabla 47.

[1069] Tabla 47

[1072]

[1073]

[1075] Se sembraron en placa células Cos7 (2,5x10<4>por pocillo) en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, se cotransfectaron células con alelos de HLA individuales del paciente 4285. Al día siguiente, las células se pulsaron con DMSO o péptido p53-R175H mutado YKQSQHMTEVVRHCPHHERCSDSDG (SEQ ID NO: 2) durante 2 horas a 37 °C a 10 µg/ml. Se cocultivaron cultivos de fragmentos de TIL seleccionados con especificidad para p53-R175H del paciente 4285 (4285-F6, 4285-F9 y 4285-F10) con células Cos7 transfectadas durante la noche a 37 °C. La expresión de 4-1BB se analizó mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → vivos → CD3+ (células T) → CD8-CD4+. Los resultados se muestran en la figura 51.

[1076] Se pulsaron APC autólogas con concentraciones decrecientes de péptidos de 25 o 15 aminoácidos correspondientes a la secuencia de p53-R175H WT o mutada durante 2 horas a 37 °C. Las células T transpuestas con 4285-TCR1 del paciente 4285 se cocultivaron durante la noche a 37 °C con APC pulsadas con péptidos. Se sometió a ensayo la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo después de seleccionar linfocitos → vivos → CD3+ (células T) → CD8-CD4+. Los resultados se muestran en la figura 52.

[1077] La secuencia de4285-TCR1,que se aisló del paciente 4285, se expone a continuación. Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región subrayada es la CDR1alfa (SEQ ID NO: 487), la segunda región subrayada es la CDR2alfa (SEQ ID NO: 488), la tercera región subrayada es la CDR3alfa (SEQ ID NO: 489), la cuarta región subrayada es la CDR1beta (SEQ ID NO: 490), la quinta región subrayada es la CDR2beta (SEQ ID NO: 491) y la sexta región subrayada es la CDR3beta (SEQ ID NO: 492). La región en negrita es el enlazador (SEQ ID NO: 26). Comenzando desde el extremo amino-terminal, la primera región en cursiva es la región constante de cadena alfa (SEQ ID NO: 23) y la segunda región en cursiva es la región constante de cadena beta (SEQ ID NO: 25). La región variable de cadena alfa (SEQ ID NO: 493) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena alfa. La región variable de cadena beta (SEQ ID NO: 494) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina inmediatamente antes del inicio de la región constante de cadena beta. La cadena alfa de longitud completa (SEQ ID NO: 495) incluye la secuencia que comienza desde el extremo amino-terminal y termina inmediatamente antes del inicio del enlazador. La cadena beta de longitud completa (SEQ ID NO: 496) incluye la secuencia que comienza inmediatamente después del enlazador y termina con el extremo carboxilo-terminal. Se identificaron células T reactivas con cáncer tal como se describe a continuación. El TCR se aisló como se describe a continuación.

[1078] Nombre del TCR: 4285-TCR1

[1079] Reconocimiento de la mutación de p53: R175H

[1080] Método de cribado: cribado universal de la mutación de "punto caliente" de p53

[1081] Cocultivo para identificar TCR: Cocultivar 4285-F6 con péptido p53-R175H y células T CD4+41BB+ clasificadas

[1082] Método para identificar TCR: RT-PCR unicelular

[1083] Abundancia de TCR entre todos los TCR emparejados: 81,8 % (observado 36 veces de 44 pares) Orientación del TCR: alfa-beta

[1084] Vector de expresión: Transposón SB

[1085]

[1087] Las estadísticas para 4285-TCR1 del paciente 4285 se exponen en la tabla 48.

[1088] Tabla 48

[1091]

[1093] Ejemplo 15

[1094] Este ejemplo demuestra la reactividad específica de los tres TCR anti-p53 mutada del paciente 4196 del ejemplo 2.

[1095] La expresión de HLA-A*0201 y p53 R175H por diversas líneas celulares diana se presenta en la tabla 49.

[1096] Tabla 49

[1099]

[1100] Las células diana de la tabla 49 se cocultivaron con células que se transdujeron con uno de los TCR del ejemplo 2. Se usaron células transducidas de forma simulada (sin TCR) como células efectoras de control. Se midieron la secreción de IFN-γ (pg/ml) (tabla 50) y la expresión de 4-1BB (% de 4-1BB (de mTCRβ+)) (tabla 51).

[1101] Tabla 50

[1104]

[1106] Tabla 51

[1109]

[1111] Ejemplo 16

[1112] Este ejemplo demuestra un resumen de la reactividad de los TCR de los ejemplos 1-15.

[1113] Los TCR de la tabla 52 se aislaron, se expresaron en células T y se sometieron a prueba contra el antígeno relevante. Se muestra un resumen de los resultados en la tabla 52.

[1115] Tabla 52

[1118]

[1121] Debe interpretarse que el uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y “al menos uno” y referentes similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Debe interpretarse que el uso del término “al menos uno” seguido por una lista de uno o más elementos (por ejemplo, “al menos uno de A y B”) significa un elemento seleccionado de los elementos indicados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos indicados (A y B), a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan “incluyendo, pero sin limitarse a”) a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento tiene la intención de servir simplemente como método abreviado para referirse de manera individual a cada valor independiente que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o, de lo contrario, se contradiga claramente por el contexto. Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos, o términos de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento, simplemente ilustre mejor la invención y no suponga una limitación sobre el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica que ningún elemento no reivindicado sea esencial para la puesta en práctica de la invención.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

1. Receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para p53 R175H humana presentada por antígeno leucocitario humano (HLA)-A2, en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1, y en donde el TCR comprende una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92.

2. TCR de la reivindicación 1, en donde el TCR comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 93 y una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 94.

3. TCR de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 93-94.

4. TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el TCR comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 95 y una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 96.

5. TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 95-96.

6. Polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional de un TCR que tiene especificidad antigénica para p53 humana con la mutación R175H presentada por HLA-A2, en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1, y en donde la porción funcional comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y una secuencia de aminoácidos de cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92.

7. Polipéptido de la reivindicación 6, en donde la porción funcional comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 93 y una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 94.

8. Polipéptido de la reivindicación 6 o 7, en donde la porción funcional comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 93-94.

9. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la porción funcional comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 95 y una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO:96.

10. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde la porción funcional comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 95-96.

11. Proteína aislada o purificada que comprende:

una primera cadena de polipéptido de TCR que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 87, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 88 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 89, y

una segunda cadena de polipéptido de TCR que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 90, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 91 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 92,

en donde la primera cadena de polipéptido de TCR y la segunda cadena de polipéptido de TCR forman una porción funcional de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la porción funcional tiene especificidad antigénica para p53 humana con la mutación R175H presentada por HLA-A2, y en donde la posición 175 se define por referencia a SEQ ID NO: 1.

12. Proteína de la reivindicación 11, en donde la primera cadena de polipéptido de TCR comprende una

secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 93 y la segunda cadena de polipéptido de TCR comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 94.

13. Proteína de la reivindicación 11 o 12, en donde:

la primera cadena de polipéptido de TCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y la segunda cadena de polipéptido de TCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

14. Proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde:

la primera cadena de polipéptido de TCR comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 95 y la segunda cadena de polipéptido de TCR comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 96.

15. Proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde:

la primera cadena de polipéptido de TCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y la segunda cadena de polipéptido de TCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.

16. Ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10 o la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15.

17. Vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 16.

18. Célula huésped aislada o purificada que comprende el vector de expresión recombinante según la reivindicación 17 o una población aislada o purificada de células que comprende la célula huésped.

19. Composición farmacéutica que comprende (a) el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, el ácido nucleico según la reivindicación 16, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 17, la célula huésped según la reivindicación 18 o la población de células según la reivindicación 18 y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Método de detección de la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer con el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, el ácido nucleico según la reivindicación 16, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 17, la célula huésped según la reivindicación 18, la población de células según la reivindicación 18 o la composición farmacéutica según la reivindicación 19, formando de ese modo un complejo; y

(b) detectar el complejo,

en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero, opcionalmente en donde:

(a) el cáncer es un cáncer epitelial, o

(b) el cáncer es colangiocarcinoma, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), glioblastoma, cáncer cervical uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático o cáncer de vejiga.

21. TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, ácido nucleico según la reivindicación 16, vector de expresión recombinante según la reivindicación 17, célula huésped según la reivindicación 18, población de células según la reivindicación 18 o composición farmacéutica según la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero, opcionalmente en donde:

(a) la población de células es autóloga para el mamífero,

(b) la población de células es alogénica para el mamífero,

(c) el cáncer es un cáncer epitelial, o

(d) el cáncer es colangiocarcinoma, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), glioblastoma, cáncer cervical uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático o cáncer de vejiga.