ES3056164T3 - Compositions, formulations, and interleukin production and purification - Google Patents

Compositions, formulations, and interleukin production and purification

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ES3056164T3
ES3056164T3 ES20854520T ES20854520T ES3056164T3 ES 3056164 T3 ES3056164 T3 ES 3056164T3 ES 20854520 T ES20854520 T ES 20854520T ES 20854520 T ES20854520 T ES 20854520T ES 3056164 T3 ES3056164 T3 ES 3056164T3
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concentration
construct
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Derek Maclean
Randall J Mrsny
Kevin Yin
Tahir Mahmood
Bittoo Kanwar
Amir Porat
Charles Olson
Sally Postlethwaite
Hyojin Kim
Weijun Feng
Khushdeep Mangat
Sean Dalziel
Rajendra Tandale
Marvin Garovoy
John Koleng
Elizabeth Bhatt
James Andrew Whitney
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Thornhill Therapeutics Inc
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Abstract

Se describen aquí las proteínas de fusión cholix-IL-10 y sus métodos de uso, que se caracterizan por una respuesta específica en un individuo tras su administración. Esta respuesta específica puede comprender cambios en los niveles de uno o más marcadores en el individuo y/o la colocalización de IL-10 en la lámina propia del individuo. En algunas realizaciones, se describen además formulaciones orales de las proteínas de fusión cholix-IL-10. Se describen aquí métodos para la purificación de una construcción de administración de IL-10, incluyendo métodos de replegamiento y enriquecimiento, que pueden resultar en el mantenimiento de un alto porcentaje de las construcciones de administración de IL-10 en la forma de dímero biológicamente activo. Se describen aquí formulaciones orales configuradas para la liberación específica de una proteína terapéutica en el intestino delgado o el colon. En algunos casos, la proteína terapéutica se presenta en forma de dímero, como una construcción de administración de IL-10 capaz de atravesar el epitelio intestinal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Composiciones, formulaciones y producción y purificación de interleucinas
[0003] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0004] Aunque la administración oral puede ser una vía conveniente y deseable para la administración de productos farmacéuticos proteicos, los retos que plantea esta vía de administración incluyen el entorno ácido del estómago, que puede provocar la desnaturalización de la estructura proteica, incluyendo los dímeros, y la hidrólisis de los enlaces químicos, el pH variable en varias regiones del tracto gastrointestinal y la presencia de enzimas proteolíticas que se segregan en el tracto gastrointestinal y descomponen las proteínas en fragmentos más pequeños. Además, incluso si los productos farmacéuticos proteicos son capaces de sobrevivir a estos retos y llegar intactos al tracto gastrointestinal inferior, puede resultar difícil para tales productos farmacéuticos atravesar el epitelio intestinal debido a su gran tamaño.
[0005] Además, algunas proteínas terapéuticas son activas (o más activas) en forma de dímero. Por tanto, su utilidad terapéutica puede verse comprometida cuando se producen o formulan de una manera que no da como resultado una dimerización adecuada. Los protocolos comunes de purificación y procesamiento pueden evitar la formación deseada de dímeros, lo que da como resultado (por ejemplo) una proporción excesivamente alta de monómeros o agregados. El documento WO 2012/036746 divulga sistemas y métodos de administración de agentes bioactivos usando secuencias de transporte derivadas de toxinas bacterianas.
[0006] RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0007] La invención proporciona una formulación oral sólida que comprende:
[0008] a) un constructo de administración que consiste en una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 13, en la que el constructo de administración comprende un portador que promueve la transcitosis del constructo de administración a través de una célula epitelial intestinal polarizada;
[0009] b) uno o más excipientes; en la que uno o más de los excipientes comprenden un lubricante no iónico; y c) una primera capa que comprende dos o más copolímeros, cada uno teniendo un pH de disolución nominal diferente
[0010] en la que la formulación oral está configurada para no liberar sustancialmente nada del constructo de administración de IL-10 después de 1 h de exposición a una solución que tenga un pH de 1,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto, en la que el primer copolímero comprende un polímero de fórmula I:
[0013]
[0015] en la que x, y y n de la fórmula I son cada uno mayores o iguales a uno; y en la que el segundo copolímero comprende un polímero de fórmula II:
[0016]
[0018] en la que x, y, z y n de la fórmula II son cada uno mayores o iguales a uno.
[0019] En algunas realizaciones, el constructo de administración consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el constructo de administración consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el constructo de administración es parte de un homodímero.
[0020] En algunas realizaciones, la solución que tiene un pH de 1,0 es un medio de disolución que contiene ácido clorhídrico. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar por lo menos el 40% del constructo de administración de IL-10 después de 2 horas de exposición a una solución que tiene un pH de 7,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto. En algunas realizaciones, por lo menos el 5%, por lo menos el 10%, por lo menos el 20% o por lo menos el 25% de los constructos de administración de IL-10 liberados después de 2 horas de exposición a la solución que tiene un pH de 7,0 se encuentran en forma de dímero. En algunas realizaciones, la solución que tiene un pH de 7,0 es un tampón de citrato/fosfato. En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 comprende un portador. En algunas realizaciones, el portador se deriva de un polipéptido segregado por una bacteria. En algunas realizaciones, la bacteria es Vibrio cholerae. En algunas realizaciones, el polipéptido segregado por Vibrio cholerae es un polipéptido de cholix.
[0021] En algunas realizaciones, los constructos de administración de IL-10 tienen una sustitución V1L en la posición 1 del aminoácido del portador. En algunas realizaciones, la formulación oral es una cápsula o un comprimido. En algunas realizaciones, un primer copolímero tiene por lo menos un 50% de disolución nominal a un pH > 5,5 y un segundo copolímero tiene por lo menos un 50% de disolución nominal a un pH > 7,0. En algunas realizaciones, el primer copolímero comprende ácido metacrílico y acrilato de etilo. En algunas realizaciones, el primer polímero tiene una masa molecular media en peso de 200.000 g/mol a 450.000 g/mol, o de 250.000 g/mol a 400.000 g/mol, o de 280.000 g/mol a 370.000 g/mol, o de 300.000 g/mol a 340.000 g/mol.
[0022] En algunas realizaciones, la relación entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster en el primer copolímero es de 0,8:1 a 1,2:1. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de 15:85 a 55:45. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de 20:80, 30:70, 40:60 o 50:50. En algunas realizaciones, el segundo copolímero comprende ácido metacrílico, metacrilato de metilo y acrilato de metilo. En algunas realizaciones, el segundo polímero tiene una masa molecular media en peso de 160.000 g/mol a 400.000 g/mol, o de 200.000 g/mol a 360.000 g/mol, o de 240.000 g/mol a 320.000 g/mol, o de 260.000 g/mol a 300.000 g/mol.
[0023] En algunas realizaciones, una relación entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster en el segundo copolímero es de 0,8:1 a 1,2:1. En algunas realizaciones, la primera capa comprende además un agente antiadherente, un plastificante, un surfactante o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la primera capa comprende un agente antiadherente, en la que el agente antiadherente comprende monoestearato de glicerol. En algunas realizaciones, la primera capa comprende un plastificante, en la que el plastificante es citrato de trietilo. En algunas realizaciones, la primera capa comprende un surfactante, en la que el surfactante es polisorbato 80. En algunas realizaciones, entre el 5% y el 15% (p/p) de la primera capa es una mezcla de monoestearato de glicerol, citrato de trietilo y polisorbato 80. En algunas realizaciones, la primera capa tiene un espesor sustancialmente equivalente al espesor de una capa de 60 mg en una cápsula de tamaño 1. En algunas realizaciones, la primera capa está dispuesta alrededor de una parte interior en una cantidad de 0,1 mg/mm<2>a 0,2 mg/mm<2>. En algunas realizaciones, la primera capa tiene una masa de 30 mg a 60 mg. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende además una segunda capa exterior a la primera capa. En algunas realizaciones, la segunda capa comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la formulación oral comprende además una tercera capa interior a la primera capa y exterior a los constructos de administración de IL-10 y a uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la tercera capa comprende HPMC.
[0024] [0009] En algunas realizaciones, los constructos de administración de IL-10 están presentes en la formulación oral en una cantidad de 1 mg a 20 mg. En algunas realizaciones, los constructos de administración de IL-10 están presentes en la formulación oral en una cantidad de 1 mg, 5 mg o 20 mg. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un surfactante, un osmolito, una sal y un agente de carga. En algunas realizaciones, la sal comprende fosfato de potasio, el agente de carga comprende glicina, el osmolito comprende sacarosa y el surfactante comprende poloxámero 188. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende una relación en peso entre el osmolito y el constructo de administración de IL-10 de entre 0,45:1 y 0,55:1, preferiblemente de aproximadamente 0,5:1. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende una relación en peso entre el surfactante y el constructo de administración de IL-10 de 0,12:1 a 0,18:1, preferiblemente de aproximadamente 0,15:1. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende una relación en peso entre la sal y el constructo de administración de IL-10 de 0,05:1 a 0,09:1, preferiblemente de aproximadamente 0,07:1. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende una relación en peso entre el agente de carga y el constructo de administración de IL-10 de 0,8:1 a 1,2:1, preferiblemente de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la formulación oral es un sólido. En algunas realizaciones, la formulación oral es una forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones, la formulación oral tiene una vida útil de por lo menos 3 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 12 meses, por lo menos 18 meses o por lo menos 24 meses. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una sal de potasio, glicina, sacarosa o trehalosa, y un poloxámero, en las que el poloxámero tiene una masa molecular media en peso de 15.000 a 25.000 daltons y un contenido de polioxietileno del 70% al 90% en peso; y en las que la formulación oral comprende además: (c) una primera capa que comprende un primer copolímero, en las que el primer copolímero comprende un polímero de fórmula I:
[0027]
[0030] en la que x, y y n son cada uno mayores o iguales a uno; y comprende además un segundo copolímero, en el que el segundo copolímero comprende un polímero de fórmula II:
[0033]
[0036] en la que x, y, z y n son cada uno mayores o iguales a uno; en la que la proporción entre el primer copolímero y el segundo copolímero es de 30:70; y donde la primera capa comprende además de un 5% a un 15% (p/p) de una mezcla de monoestearato de glicerol, citrato de trietilo y polisorbato 80; (d) una segunda capa que comprende HPMC situada exterior de la primera capa; y (e) una tercera capa que comprende HPMC situada el interior de la primera capa y exterior de la carga útil terapéutica y de uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables.
[0038] [0010] En la presente se describe, en ciertas realizaciones, que más del 80% de los constructos de administración de IL-10 se encuentran en forma de dímero. En algunas realizaciones, la composición sólida se liofiliza o se seca por atomización. En algunas realizaciones, la composición sólida es un comprimido o una cápsula. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un surfactante. En algunas realizaciones, el surfactante es un poloxámero. En algunas realizaciones, el poloxámero es poloxámero 188. En algunas realizaciones, el surfactante no incluye un polisorbato. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un osmolito. En algunas realizaciones, el osmolito es sacarosa. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una sal. En algunas realizaciones, la sal es fosfato de potasio. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un agente de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga es glicina. En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 tiene una sustitución V1L en la posición 1 del aminoácido del portador.
[0040] En algunas realizaciones, más del 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% o 90% de los constructos de administración de IL-10 se encuentran en forma de dímero. En algunas realizaciones, del 85% al 92% de los constructos de administración de IL-10 se encuentran en forma de dímero. En algunas realizaciones, la composición sólida comprende una primera capa. En algunas realizaciones, la primera capa comprende un primer copolímero y un segundo copolímero, en las que la primera capa es externa a los constructos de administración de IL-10 y uno o más excipientes. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de aproximadamente 15:85 a aproximadamente 55:45. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de 20:80, 30:70, 40:60 o 50:50. En algunas realizaciones, la composición sólida comprende además una segunda capa exterior a la primera capa. En algunas realizaciones, la segunda capa comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la composición sólida comprende además una tercera capa interior a la primera capa y exterior a los constructos de administración de IL-10 y uno o más de los excipientes. En algunas realizaciones, la tercera capa comprende HPMC.
[0042] En algunas realizaciones, el lubricante no iónico es behenato de glicerilo. En algunas realizaciones, la formulación oral carece de estearato de magnesio. En algunas realizaciones, la formulación oral se encuentra en forma de comprimido. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada de tal manera que sustancialmente nada del constructo de administración de IL-10 se libera de la formulación oral después de 1 hora de exposición a una solución a un pH de 1,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar por lo menos el 40% del constructo de administración de IL-10 después de 2 horas de exposición a una solución a un pH de 7,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende además una primera capa que comprende dos o más copolímeros, cada uno teniendo un pH de disolución nominal diferente. En algunas realizaciones, por lo menos el 45% del constructo de administración de IL-10 se encuentra en forma de dímero. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un agente de carga, un disgregante o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente de carga es celulosa microcristalina silicificada (SMCC). En algunas realizaciones, el disgregante es crospovidona (polivinilpirrolidona reticulada). En algunas realizaciones, la formulación oral se crea mediante la compresión del constructo de administración de IL-10 y uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la compresión se produce con una fuerza de compresión de aproximadamente 2000 libras-fuerza (lbf) a aproximadamente 3500 lbf.
[0044] En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de aproximadamente 15:85 a aproximadamente 55:45. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de 20:80, 30:70, 40:60 o 50:50. En algunas realizaciones, la formulación oral sólida comprende además una segunda capa exterior a la primera capa. En algunas realizaciones, la segunda capa comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la formulación oral sólida comprende además una tercera capa interior a la primera capa y exterior a los constructos de administración de IL-10 y uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la tercera capa comprende HPMC. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además una sal de potasio, glicina, sacarosa o trehalosa, y un poloxámero, en las que el poloxámero tiene una masa molecular media en peso de 15.000 a 25.000 daltons y un contenido de polioxietileno del 70% al 90% en peso; y en las que la formulación oral comprende además: (c) una primera capa que comprende un primer copolímero, en las que el primer copolímero comprende un polímero de fórmula I:
[0045]
[0048] en la que x, y y n son cada uno mayores o iguales a uno; y comprende además un segundo copolímero, en la que el segundo copolímero comprende un polímero de fórmula II:
[0051]
[0054] en la que x, y, z y n son cada uno mayores o iguales a uno; en la que la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero es de 30:70; y en la que la primera capa comprende además de un 5% a un 15% (p/p) de una mezcla de monoestearato de glicerol, citrato de trietilo y polisorbato 80; (d) una segunda capa que comprende HPMC situada exterior a la primera capa; y (e) una tercera capa que comprende HPMC situada interior a la primera capa y exterior a la carga útil terapéutica y a uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables.
[0056] En ciertas realizaciones, en la presente se describe que la administración de una dosis de la formulación oral a un individuo da como resultado una respuesta inmunomoduladora seleccionada del grupo que consiste en: (i) una disminución de la concentración de calprotectina fecal (FCP) con respecto a un valor inicial de FCP, (ii) una disminución de la concentración de proteína C reactiva (CRP) con respecto a un valor inicial de CRP, (iii) una disminución en el índice de Geboes con respecto a un índice de Geboes de referencia, y (iv) una combinación de (i)-(iii). En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende la disminución de FCP con respecto al valor inicial de la FCP. En algunas realizaciones, la concentración de FCP se determina a partir de una muestra fecal o una biopsia colónica. En algunas realizaciones, la disminución en la concentración de FCP es una disminución de por lo menos un 20%, un 30%, un 40% o un 50% con respecto al valor inicial de FCP.
[0058] [0015] En algunas realizaciones, el valor inicial de FCP es una concentración inicial de FCP en el individuo antes de la administración. En algunas realizaciones, la concentración inicial de FCP puede ser indicativa de una indicación gastrointestinal del individuo. En algunas realizaciones, la concentración inicial de FCP es mayor de 150 µg/g. La formulación oral de la reivindicación 178 o la reivindicación 179, en la que la indicación gastrointestinal es colitis ulcerosa (CU) o enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, la concentración de FCP se reduce por lo menos en un 50% con respecto a la concentración inicial de FCP, y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3 mg. En algunas realizaciones, el valor inicial de FCP es un valor inicial de FCP ajustado al placebo. En algunas realizaciones, la concentración de FCP se reduce en por lo menos un 20% con respecto al valor inicial de FCP ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3 mg. En algunas realizaciones, la concentración de FCP se reduce a 50 µg/g o menos. En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende la disminución de la concentración de CRP con respecto al valor inicial de CRP. En algunas realizaciones, la concentración de CRP es una concentración sistémica de CRP. En algunas realizaciones, la concentración de CRP se determina a partir de una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la disminución de la concentración de CRP es una disminución de por lo menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70% o el 80% con respecto al valor inicial de CRP. En algunas realizaciones, el valor inicial de CRP es una concentración inicial de CRP en el individuo antes de la administración. En algunas realizaciones, la concentración inicial de CRP es mayor de 5 mg/l. En algunas realizaciones, la concentración inicial de CRP es indicativa de una indicación gastrointestinal del individuo.
[0060] En algunas realizaciones, la indicación gastrointestinal es la enfermedad del intestino irritable (EII). En algunas realizaciones, la concentración de CRP se reduce en por lo menos un 40% con respecto a la concentración inicial de CRP y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3 mg. En algunas realizaciones, el valor inicial de CRP es un valor inicial de CRP ajustado al placebo. En algunas realizaciones, la concentración de CRP se reduce em por lo menos un 10% con respecto al valor inicial de CRP ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 3 mg. En algunas realizaciones, la concentración de CRP se reduce en por lo menos un 40% con respecto al valor inicial de CRP ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg. En algunas realizaciones, la concentración de CRP se reduce a menos de 5 mg/l. En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende la disminución del índice de Geboes con respecto al valor inicial del índice de Geboes. En algunas realizaciones, el valor inicial del índice de Geboes es un índice de Geboes inicial antes de la administración. En algunas realizaciones, el valor inicial del índice de Geboes es un valor inicial del índice de Geboes ajustado al placebo. En algunas realizaciones, el índice de Geboes se reduce en por lo menos 2 unidades con respecto al valor inicial del índice de Geboes ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg.
[0062] En algunas realizaciones, menos del 5% de la IL-10 administrada se introduce en el torrente sanguíneo del individuo. En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora se observa después de la administración diaria de la dosis de la formulación oral durante 14 días. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de 10 mg o menos. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de 1 mg a 10 mg, de 3 mg a 10 mg, o de 1 mg a 3 mg. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de 1 mg, 3 mg o 10 mg. En algunas realizaciones, la formulación oral es una cápsula.
[0064] En algunas realizaciones, la formulación oral es biodegradable. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además un surfactante. En algunas realizaciones, el surfactante es poloxámero 188. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además un osmolito. En algunas realizaciones, el osmolito es sacarosa. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además una sal. En algunas realizaciones, la sal es fosfato de potasio. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además un agente de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga es glicina. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de aproximadamente 15:85 a 55:45. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de 20:80, 30:70, 40:60 o 50:50.
[0066] En algunas realizaciones, la formulación oral comprende además una segunda capa situada interior a la primera capa y exterior a la IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la segunda capa comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la formulación oral comprende además una tercera capa interior a la primera capa y exterior a la IL-10 y uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la tercera capa comprende HPMC. En algunas realizaciones, la IL-10 forma parte de un constructo de administración de IL-10 que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 comprende un portador. En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 tiene una sustitución V1L en la posición 1 del aminoácido del portador. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una sal de potasio, glicina, sacarosa o trehalosa, y un poloxámero, en las que el poloxámero tiene una masa molecular media en peso de 15.000 a 25.000 daltons y un contenido de polioxietileno del 70% al 90% en peso; y en las que la formulación oral comprende además: (c) una primera capa que comprende un primer copolímero, en las que el primer copolímero comprende un polímero de fórmula I:
[0067]
[0070] en la que x, y y n son cada uno mayores o iguales a uno; y comprende además un segundo copolímero, en la que el segundo copolímero comprende un polímero de fórmula II:
[0073]
[0076] en la que x, y, z y n son cada uno mayores o iguales a uno; en la que la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero es de 30:70; y en la que la primera capa comprende además de un 5% a un 15% (p/p) de una mezcla de monoestearato de glicerol, citrato de trietilo y polisorbato 80; (d) una segunda capa que comprende HPMC situada exterior a la primera capa; y (e) una tercera capa que comprende HPMC situada interior a la primera capa y exterior a la carga útil terapéutica y a uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables.
[0078] [0020] En ciertas realizaciones, se describen en la presente formulaciones orales que comprenden IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en las que la administración de una dosis de la formulación oral de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 60 mg a un individuo da como resultado un aumento de más del 20% en la concentración plasmática de IL-1Ra en el individuo con respecto a una concentración plasmática de referencia de IL-1Ra. En ciertas realizaciones, se describen en la presente métodos para tratar un trastorno inflamatorio en un individuo que comprenden administrar una dosis de una formulación oral que comprende IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables al individuo, en las que la administración da como resultado un aumento de más del 20% en la concentración plasmática de IL-1Ra en el individuo con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg y el aumento en la concentración plasmática de IL-1Ra con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es de más del 30%. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg y el aumento en la concentración plasmática de IL-1Ra con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es del 30% al 45%, del 30% al 35% o del 40% al 43%. En algunas realizaciones, la administración de la dosis de la formulación oral al individuo da como resultado una concentración plasmática de IL-10 en el individuo que no excede 1500 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 100 pg/ml o 10 pg/ml. En algunas realizaciones, la administración de la formulación oral al individuo da como resultado la colocalización de la IL-10 con una célula que expresa CD3 en la lámina propia del individuo. En algunas realizaciones, la célula que expresa CD3 es un linfocito. En algunas realizaciones, el linfocito es un linfocito T. En algunas realizaciones, la administración de la formulación oral al individuo da como resultado la colocalización de la IL-10 con un macrófago en la lámina propia del individuo. En algunas realizaciones, la administración de la formulación oral al individuo no da lugar a la colocalización de la IL-10 con una célula en la lámina propia del individuo, en las que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula dendrítica, un linfocito B, una célula endotelial y una combinación de los mismos.
[0080] En ciertas realizaciones, se describe en la presente que la administración de la formulación oral a un individuo da lugar a un aumento de la concentración de IL-1Ra en el plasma del individuo de por lo menos 5000 pg/ml con respecto a los niveles de referencia y por lo menos uno de los siguientes: (1) una concentración plasmática máxima de IL-10 de menos de 50 pg/ml y (2) la colocalización de la IL-10 con una célula que expresa CD3 en la lámina propia del individuo. En ciertas realizaciones, se describen en la presente métodos para tratar un trastorno inflamatorio en un individuo que comprenden administrar una formulación oral que comprende IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables al individuo, en las que la administración da como resultado un aumento de la concentración de IL-1Ra en el plasma del individuo de por lo menos 5000 pg/ml con respecto a los niveles de referencia y por lo menos uno de los siguientes (1) una concentración plasmática máxima de IL-10 de menos de 50 pg/ml y (2) la colocalización de la IL-10 con una célula que expresa CD3 en la lámina propia del individuo. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa, proctitis, pouchitis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), artritis reumatoide o psoriasis. En algunas realizaciones, la concentración máxima de IL-1Ra en plasma del individuo se obtiene entre 2 y 4 horas, o entre 2 y 3 horas, después de la administración. En algunas realizaciones, la administración de la formulación oral al individuo da como resultado una concentración máxima de IL-10 en plasma del individuo de menos de 10 pg/ml, 2,5 pg/ml o 1,5 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de IL-1Ra alcanza un máximo de 25.000 pg/ml a 28.000 pg/ml. En algunas realizaciones, la administración de la formulación oral a un individuo da como resultado un aumento en la relación de expresión de IL-Ra con respecto a la interleucina 1 beta en el tejido colónico del individuo. En algunas realizaciones, la relación entre el IL-1Ra y la IL-1 beta es de por lo menos 2:1. En algunas realizaciones, la administración de la formulación oral a un individuo da como resultado un aumento en la expresión del agonista del receptor de la interleucina 1 (IL-1Ra) en el tejido colónico del individuo.
[0082] La formulación oral está configurada de tal manera que prácticamente no se libera nada del constructo de administración de IL-10 de la formulación oral después de 1 hora de exposición a una solución a un pH de 1,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar por lo menos el 40% del constructo de administración de IL-10 después de 2 horas de exposición a una solución a un pH de 7,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto. En algunas realizaciones, la primera capa comprende una mezcla homogénea de polímeros, cada uno teniendo un pH de disolución nominal diferente. En algunas realizaciones, por lo menos el 45% del constructo de administración de IL-10 se encuentra en forma de dímero.
[0084] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes comprenden un agente de carga, un disgregante o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente de carga es celulosa microcristalina silicificada (SMCC). En algunas realizaciones, el disgregante es crospovidona (polivinilpirrolidona reticulada).
[0086] En ciertas realizaciones, se describen en la presente formulaciones orales en forma de comprimidos que comprenden IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables encapsulados por un recubrimiento entérico, en las que, después de 1 hora de inmersión de la formulación oral en una solución a pH 7,0 en un aparato de disolución de Tipo 4, el porcentaje de IL-10 en forma de dímero es de por lo menos el 45%. En algunas realizaciones, la solución a pH 7,0 es un tampón de citrato/fosfato. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico tiene un espesor de 4 mg/cm<2>a 20 mg/cm<2>, de 4 mg/cm<2>a 6 mg/cm<2>, de 5 mg/cm<2>a 10 mg/cm<2>, o de 5 mg/cm<2>a 20 mg/cm<2>.
[0088] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además un surfactante. En algunas realizaciones, el surfactante es poloxámero 188. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además un osmolito. En algunas realizaciones, el osmolito es sacarosa. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además una sal. En algunas realizaciones, la sal es fosfato de potasio. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además un agente de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga es glicina. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden además por lo menos un excipiente de compactación. En algunas realizaciones, el por lo menos un excipiente de compactación comprende además un agente de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga es celulosa microcristalina silicificada (SMCC). En algunas realizaciones, el por lo menos un excipiente de compactación comprende un disgregante. En algunas realizaciones, el disgregante es crospovidona (polivinilpirrolidona reticulada). En algunas realizaciones, el por lo menos un excipiente de compactación comprende un lubricante. En algunas realizaciones, el lubricante es un surfactante no iónico. En algunas realizaciones, el surfactante no iónico es behenato de glicerilo. En algunas realizaciones, el surfactante no iónico es dibehenato de glicerilo. En algunas realizaciones, el por lo menos un excipiente de compactación está comprendido en una fase intragranular, una fase extragranular o una combinación de las mismas.
[0090] En algunas realizaciones, la formulación oral se crea mediante la compresión de la IL-10 y el por lo menos un excipiente de compactación. En algunas realizaciones, la compresión se produce con una fuerza de compresión de aproximadamente 2000 libras-fuerza (lbf) a aproximadamente 3500 lbf.
[0091] En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en el recubrimiento entérico es de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 20:80 en peso. En algunas realizaciones, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en el recubrimiento entérico es de aproximadamente 25:75 a aproximadamente 35:65 en peso. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico es del 5% al 12% del peso de la formulación oral. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico no es más del 12% del peso de la formulación oral. En algunas realizaciones, la formulación oral comprende además un segundo recubrimiento entérico situado interior al recubrimiento entérico y exterior a la IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el segundo recubrimiento entérico comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, el segundo recubrimiento entérico es del 3% al 5% del peso de la formulación oral. En algunas realizaciones, el porcentaje de IL-10 en forma de dímero es de por lo menos el 45% cuando la formulación oral se encuentra en una forma sólida.
[0093] En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico comprende acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), en las que el recubrimiento entérico es externo a la IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el HPMCAS comprende un primer HPMCAS y un segundo HPMCAS. En algunas realizaciones, el primer HPMCAS es soluble a un pH de más de o igual a 6,8. En algunas realizaciones, el primer HPMCAS comprende HPMCAS-HF. En algunas realizaciones, el segundo HPMCAS es soluble a un pH de más de o igual a 6,0. En algunas realizaciones, el segundo HPMCAS comprende HPMCAS-MF. En algunas realizaciones, la relación entre el primer HPMCAS y el segundo HPMCAS es de aproximadamente 40:60 a aproximadamente 60:40.
[0095] En ciertas realizaciones, se divulgan en la presente las formulaciones de administración de IL-10 descritas en la presente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad celíaca, proctitis, pouchitis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), artritis reumatoide, artritis psoriásica y psoriasis.
[0097] En ciertas realizaciones, se describen en la presente las formulaciones de administración de IL-10 descritas en la presente para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un individuo refractario o resistente por lo menos a un agente antiinflamatorio. En algunas realizaciones, el agente antiinflamatorio es un aminosalicilato. En algunas realizaciones, el aminosalicilato se selecciona del grupo que consiste en ácido 5-aminosalicílico (5-ASA; mesalazina), ácido 4-aminosalicílico (4-ASA), balsalazida, olsalazina y sulfasalazina. En algunas realizaciones, el agente antiinflamatorio es un corticosteroide. En algunas realizaciones, el corticosteroide es prednisona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es un corticosteroide administrado por vía oral o un corticosteroide administrado por vía intravenosa (IV). En algunas realizaciones, el agente antiinflamatorio es un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, el agente inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en azatioprina, 6-mercaptopurina y una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el agente antiinflamatorio es un inhibidor de TNFα. En algunas realizaciones, el inhibidor de TNFα se selecciona del grupo que consiste en adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab e infliximab. En algunas realizaciones, el por lo menos un agente antiinflamatorio es un inhibidor de la Janus quinasa (JAK). En algunas realizaciones, el inhibidor de JAK se selecciona del grupo que consiste en filgotinib, upadacitinib, peficitinib y tofacitinib. En algunas realizaciones, el por lo menos un agente antiinflamatorio es un antagonista del receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P). En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de S1P se selecciona del grupo que consiste en ozanimod, amiselimod y etrasimod. En algunas realizaciones, el por lo menos un agente antiinflamatorio es un bloqueador de la integrina. En algunas realizaciones, el bloqueador de la integrina se selecciona del grupo que consiste en etrolizumab, natalizumab, vedolizumab, abrilumab y carotegrast metilo. En algunas realizaciones, el por lo menos un agente antiinflamatorio es un inhibidor de IL-23. En algunas realizaciones, el inhibidor de IL-23 se selecciona del grupo que consiste en ustekinumab, mirikizumab, brazikumab, guselkumab y risankizumab. En algunas realizaciones, el por lo menos un agente antiinflamatorio es un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4). En algunas realizaciones, el por lo menos un inhibidor de la PDE4 se selecciona del grupo que consiste en apremilast, cilomilast, roflumilast, tetomilast y rolipram. En algunas realizaciones, el por lo menos un agente antiinflamatorio es laquinimod. En algunas realizaciones, al individuo se le administra la formulación diariamente durante por lo menos 5, 7, 10, 12 o 14 días.
[0099] [0031] En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa, proctitis, pouchitis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), artritis reumatoide o psoriasis. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un surfactante. En algunas realizaciones, el surfactante se selecciona del grupo que consiste en: polisorbato 80, polisorbato 20 y poloxámero 188. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un osmolito. En algunas realizaciones, el osmolito se selecciona del grupo que consiste en sacarosa y trehalosa. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una sal. En algunas realizaciones, la sal se selecciona del grupo que consiste en fosfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y sulfato de sodio. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un agente de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en glicina y manitol. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un disgregante. En algunas realizaciones, el disgregante se selecciona del grupo que consiste en: celulosa microcristalina (MCC), celulosa microcristalina silicificada (SMCC), almidón, glicolato de almidón sódico, veegum, bentonita, ácido algínico, alginato cálcico, croscarmelosa sódica (carboximetilcelulosa sódica reticulada) y crospovidona (polivinilpirrolidona reticulada). En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un agente aglutinante. En algunas realizaciones, el agente aglutinante se selecciona del grupo que consiste en: sacarosa, lactosa, almidón, celulosa, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP) y polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un lubricante. En algunas realizaciones, el lubricante se selecciona del grupo que consiste en: estearato de magnesio, behenato de glicerilo, dibehenato de glicerilo, fumarato de estearilo sódico, ácido esteárico, talco, sílice, estearato de calcio, carbonato de magnesio, aceite hidrogenado, aceite mineral, polietilenglicol (PEG) y monoestearato de glicerilo.
[0101] En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa, proctitis, pouchitis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), artritis reumatoide o psoriasis.
[0103] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un surfactante. En algunas realizaciones, el surfactante se selecciona del grupo que consiste en: polisorbato 80, polisorbato 20 y poloxámero 188. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un osmolito. En algunas realizaciones, el osmolito se selecciona del grupo que consiste en sacarosa y trehalosa. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una sal. En algunas realizaciones, la sal se selecciona del grupo que consiste en fosfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y sulfato de sodio. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un agente de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en glicina y manitol. En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un disgregante. En algunas realizaciones, el disgregante se selecciona del grupo que comprende: celulosa microcristalina (MCC), celulosa microcristalina silicificada (SMCC), almidón, glicolato de almidón sódico, veegum, bentonita, ácido algínico, alginato cálcico, croscarmelosa sódica (carboximetilcelulosa sódica reticulada) y crospovidona (polivinilpirrolidona reticulada). En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un agente aglutinante. En algunas realizaciones, el agente aglutinante se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, lactosa, almidón, celulosa, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP) y polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un lubricante. En algunas realizaciones, el lubricante se selecciona del grupo que consiste en: estearato de magnesio, behenato de glicerilo, dibehenato de glicerilo, fumarato de estearilo sódico, ácido esteárico, talco, sílice, estearato de calcio, carbonato de magnesio, aceite hidrogenado, aceite mineral, polietilenglicol (PEG) y monoestearato de glicerilo.
[0105] En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona las formulaciones de administración de IL-10 descritas en la presente para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, el método comprendiendo administrar por vía oral un agente terapéutico de IL-10 al sujeto y administrar un inmunosupresor no de IL-10 al sujeto. En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona las formulaciones de administración de IL-10 descritas en la presente para su uso en un método para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, el método comprendiendo administrar por vía oral un agente terapéutico de IL-10 al sujeto, en el que el sujeto recibe concomitantemente un inmunosupresor no de IL-10. En realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona las formulaciones de administración de IL-10 descritas en la presente para su uso en un método para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en las que el sujeto tuvo una respuesta inadecuada a un inmunosupresor no de IL-10, el método comprendiendo administrar por vía oral un agente terapéutico de IL-10 al sujeto.
[0107] En algunos casos, el método comprende además administrar el inmunosupresor no de IL-10 con el agente terapéutico de IL-10. En algunos casos, el sujeto fue tratado con el inmunosupresor no de IL-10 durante por lo menos 6 semanas antes de determinar la respuesta inadecuada. En algunos casos, el sujeto fue tratado con el inmunosupresor no de IL-10 durante por lo menos 12 semanas antes de determinar la respuesta inadecuada. En algunos casos, la respuesta inadecuada es una respuesta parcial.
[0109] En algunos casos, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, psoriasis en placas, hidradenitis supurativa, artritis psoriásica, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, espondilitis anquilosante, sepsis bacteriana, enfermedad de Crohn, enfermedad de Crohn fistulizante, colitis ulcerosa de moderada a grave, colitis ulcerosa de leve a moderada, colitis ulcerosa, colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis de derivación, síndrome de Behçet, colitis indeterminada, pancreatitis, inflamación hepática, pouchitis, proctitis, uveítis, enfermedad de injerto contra huésped y lesión de células epiteliales. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: artritis reumatoide, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
[0110] En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide y el sujeto con una respuesta inadecuada tiene una o más articulaciones con enfermedad activa. En algunos casos, una o más de las articulaciones con enfermedad activa se identifican mediante imagenología óptica fluorescente o imagenología por resonancia magnética. En algunos casos, el sujeto con una respuesta inadecuada tiene además dos o más articulaciones que son sensibles. En algunos casos, el sujeto con una respuesta inadecuada tiene además dos o más articulaciones que están inflamadas.
[0112] En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es colitis ulcerosa, y el sujeto con una respuesta inadecuada presenta colitis ulcerosa de moderada a grave. En algunos casos, el sujeto con una respuesta inadecuada presenta una puntuación modificada de la Clínica Mayo (MMS) de entre aproximadamente 4 puntos y aproximadamente 9 puntos. En algunos casos, el sujeto con una respuesta inadecuada presenta una subpuntuación endoscópica de MCS leída centralmente de grado 2 o mayor. En algunos casos, el sujeto con una respuesta inadecuada tiene una subpuntuación MMS de sangrado rectal de 1 punto o mayor. En algunos casos, el sujeto con una respuesta inadecuada tiene una enfermedad que se extiende 15 cm o más desde el borde anal. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente terapéutico de IL-10 es un constructo de administración de IL-10.
[0114] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Los términos "realización" y "realizaciones" deben interpretarse como realización o realizaciones de la invención solo en la medida en que se encuentren dentro del alcance de las presentes reivindicaciones. De lo contrario, se refieren únicamente a realizaciones de la divulgación.
[0116] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0118] El expediente de la patente o la solicitud contiene por lo menos un dibujo en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con el dibujo o dibujos en color previa solicitud y pago de la tasa correspondiente. Las varias características de la divulgación se exponen con detalle en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación, y los dibujos acompañantes, en los que:
[0120] LaFIG.1ilustra la estructura de un homodímero de constructo de administración de cholix-IL-10 (un dímero que comprende dos subunidades idénticas de la SEQ ID NO: 5) según se determina mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS).
[0121] LasFIGS. 2A-2Bilustran un proceso ejemplar para expresar, replegar y purificar IL-10 o constructos de administración de IL-10. LaFIG. 2Ailustra un proceso ejemplar para expresar, replegar y purificar IL-10 o constructos de administración de IL-10 con un paso de sulfitólisis. LaFIG. 2Bilustra un proceso ejemplar para expresar, replegar y purificar IL-10 o constructos de administración de IL-10 sin un paso de sulfitólisis.
[0122] LaFIG.3ilustra un sistema SHIME® adaptado que simula las condiciones fisiológicas del estómago, el intestino delgado y el colon dentro del mismo reactor a lo largo del tiempo.
[0123] LaFIG.4ilustra un perfil de pH de un tracto gastrointestinal simulado en condiciones de ayuno. Las flechas indican el momento y el pH correspondiente de las muestras tomadas durante la fase de incubación en el estómago (ST0; ST45) y la fase de incubación en el intestino delgado (SI0; SI0,5; SI1; SI1,5; SI2; SI3).
[0124] LasFIGS.5A-5Eilustran la liberación media de cafeína (mg) de cápsulas de tamaño 1 con varias composiciones de recubrimiento y espesores de recubrimiento, tal como se muestra en las formulaciones de cápsulas de laTABLA 12.La liberación media se determinó a partir de 3 cápsulas individuales. Los puntos temporales con condiciones que simulan el estómago se representan mediante ST0 y ST45. Los puntos temporales con condiciones que simulan el intestino delgado se representan mediante SI0, SI0,5, SI1, SI1,5, SI2 y SI3. Los puntos temporales con condiciones que simulan el colon se representan mediante C0, C0,5, C1, C1,5, C2, C3, C4 y C18. LaFIG.5Ailustra la liberación de cafeína de una cápsula de la formulación A. Las diferencias en las muestras en comparación con la muestra anterior se indican con un asterisco (*), que representa un cambio estadísticamente significativo (p<0,05). Las puntuaciones visuales de las cápsulas se indican encima de las barras (1: cápsula intacta; 2: cápsula dañada, pero casi todo el producto permanece en la cápsula; 3: cápsula dañada y todo el producto liberado; 4: cápsula destruida). LaFIG.5Bilustra la liberación de cafeína de una cápsula de la formulación B. LaFIG.5Cilustra la liberación de cafeína de una cápsula de la formulación C. LaFIG.5Dilustra la liberación de cafeína de una cápsula de la formulación D. LaFIG. 5Eilustra la liberación de cafeína de una cápsula de la formulación E.
[0125] LasFIGS.6A-6Cilustran el porcentaje de liberación de cafeína de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 7,0. LaFIG. 6Ailustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG.6Bilustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG.6Cilustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0126] LasFIGS.7A-7Cilustran el porcentaje de liberación de cafeína de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 6,5. LaFIG. 7Ailustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG.7Bilustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG.7Cilustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0127] LasFIGS.8A-8Cilustran el porcentaje de liberación de cafeína de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 6,0. LaFIG. 8Ailustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG.8Bilustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG.8Cilustra el porcentaje de liberación de cafeína de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0128] LasFIGS.9A-9Cilustran el porcentaje de liberación del constructo diana (SEQ ID NO: 5) de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 7,0. LaFIG.9Ailustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG. 9Bilustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG.9Cilustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H. LasFIGS. 10A-10Cilustran el porcentaje de liberación del constructo diana (SEQ ID NO: 5) de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 6,5. LaFIG.10Ailustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG. 10Bilustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG. 10Cilustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0129] LasFIGS. 11A-11Cilustran el porcentaje de liberación del constructo diana (SEQ ID NO: 5) de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 6,0. LaFIG.11Ailustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG. 11Bilustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG. 11Cilustra el porcentaje de liberación del constructo diana de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0130] LasFIGS.12A-12Cilustran el porcentaje de liberación de los constructos diana (SEQ ID NO: 5) en forma de dímero de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 7,0. LaFIG.12Ailustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG. 12Bilustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG. 12Cilustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0131] LasFIGS.13A-13Cilustran el porcentaje de los constructos diana liberados (SEQ ID NO: 5) en forma de dímero de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 6,5. LaFIG.13Ailustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG. 13Bilustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG. 13Cilustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0132] LasFIGS.14A-14Cilustran el porcentaje de los constructos diana liberados (SEQ ID NO: 5) en forma de dímero de varios recubrimientos de cápsulas, la primera hora a pH 1,0 y el tiempo restante a pH 6,0. LaFIG.14Ailustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas A-B. LaFIG. 14Bilustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas C-F. LaFIG. 14Cilustra el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero de los recubrimientos de cápsulas G-H. En laTABLA 23se describen los recubrimientos de cápsulas A-H.
[0133] LasFIGS.15A-15Cilustran los niveles séricos en monos cynomolgus de IL-10, cafeína y antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1RA) durante las 8 horas siguientes a la administración a los monos de cápsulas que contienen un constructo diana (SEQ ID NO: 5) y cafeína con uno de los recubrimientos de cápsula A, B o C, como se muestra en laTABLA 25.LaFIG.15Ailustra los niveles séricos de IL-10. LaFIG.15Bilustra los niveles séricos de cafeína. LaFIG.15Cilustra los niveles séricos de IL-1RA. Los ejes X e Y son una escala logarítmica. La media de cada grupo se representa con barras que representan el error estándar de la media.
[0134] LasFIGS. 16A-16Cilustran los niveles séricos en monos cynomolgus de IL-10, cafeína e IL-1RA durante las 8 horas siguientes a la administración a los monos de cápsulas que contienen un constructo diana (SEQ ID NO: 5) y cafeína con uno de los recubrimientos de cápsulas A, G y H, como se muestra en laTABLA 25.LaFIG. 16Ailustra los niveles séricos de IL-10. LaFIG.16Bilustra los niveles séricos de cafeína. LaFIG.16Cilustra los niveles séricos de IL-1RA. Los ejes X e Y están en escala logarítmica. La media de cada grupo se representa con barras que indican el error estándar de la media.
[0135] LasFIGS. 17A-17Cilustran los niveles séricos en monos cynomolgus de IL-10, cafeína e IL-1RA durante las 8 horas siguientes a la administración a los monos de cápsulas que contienen un constructo diana (SEQ ID NO: 5) y cafeína con uno de los recubrimientos de cápsulas A, C, D, E y F, como se muestra en laTABLA 25.LaFIG.
[0136] 17Ailustra los niveles séricos de IL-10. LaFIG.17Bilustra los niveles séricos de cafeína. LaFIG.17Cilustra los niveles séricos de IL-1RA. Los ejes X e Y son una escala logarítmica. La media de cada grupo se representa con barras que representan el error estándar de la media.
[0137] LaFIG.18ilustra un cromatograma de exclusión por tamaño (SEC) de combinaciones de diferentes excipientes de compactación y un polvo de constructo diana liofilizado (SEQ ID NO: 5) después de incubarlas a 40 ºC durante 3 días. Los excipientes de compactación examinados incluyeron: almidón, croscarmelosa sódica, estearato de magnesio, behenato de glicerilo, celulosa microcristalina (MCC), lactosa, crospovidona y celulosa microcristalina silicificada (SMCC).
[0138] LaFIG. 19ilustra un cromatograma de exclusión por tamaño (SEC) que muestra la pureza del dímero del constructo diana (SEQ ID NO: 5), así como la pureza del dímero del constructo diana (SEQ ID NO: 5) de las formulaciones F1 y F2.
[0139] LasFIGS.20A-20Dilustran la recuperación total del constructo diana (SEQ ID NO: 5), la recuperación del dímero y el porcentaje de dímero después de la disolución de diferentes formulaciones de comprimidos. LaFIG.20Ailustra la recuperación total del constructo diana, la recuperación del dímero y el porcentaje de dímero después de la disolución de un comprimido F1 creado usando una fuerza de compresión de 2000 libras-fuerza (lbf). LaFIG.20Bilustra la recuperación total del constructo diana, la recuperación del dímero y el porcentaje de dímero después de la disolución de un comprimido F1 creado usando una fuerza de compresión de 2500 lbf. LaFIG. 20Cilustra la recuperación total del constructo diana, la recuperación del dímero y el porcentaje de dímero después de la disolución de un comprimido F2 creado usando una fuerza de compresión de 2500 lbf. LaFIG. 20Dilustra la recuperación total del constructo diana, la recuperación del dímero y el porcentaje de dímero después de la disolución de un comprimido F2 creado usando una fuerza de compresión de 3000 lbf. En estos experimentos, la recuperación del dímero indicó la cantidad absoluta de dímero identificada con respecto a un estándar de referencia. En estos experimentos, la pureza del dímero indicaba el porcentaje de dímero con respecto a todas las formas detectadas del constructo de administración de IL-10 (que incluía agregados y monómeros). El análisis se llevó a cabo a un pH de 7,0.
[0140] LaFIG. 21ilustra el porcentaje de los constructos diana (SEQ ID NO: 5) en forma de dímero en diferentes formulaciones de liofilización antes y después de una incubación a 25 ºC. La línea horizontal indica la pureza del dímero en el pico principal para la muestra de referencia (1x PBS, sin excipientes) después de 3 días a 25 ºC. LaFIG. 22ilustra el porcentaje de los constructos diana (SEQ ID NO: 5) en forma de dímero en diferentes formulaciones de liofilización antes y después de 5 ciclos de congelación/descongelación (F/T) a -20 ºC.
[0141] LasFIGS. 23A-23Bilustran el efecto de 5 ciclos de congelación/descongelación, a -20 ºC y -80 ºC, sobre los agregados y dímeros de las construcciones objetivo (SEQ ID NO: 5). LaFIG.23Ailustra el efecto de 5 ciclos de congelación/descongelación sobre el porcentaje de agregados (HMW) del constructo diana. LaFIG.23Bilustra el efecto de 5 ciclos de congelación/descongelación sobre el porcentaje de dímeros de las construcciones objetivo. LasFIGS.24A-24Bilustran el cambio en el porcentaje de agregados o dímeros objetivo a 4 ºC o 25 ºC a lo largo de una semana en diferentes formulaciones de tampón de liofilización de laTABLA 11.Se examinaron dos concentraciones diferentes de los constructos diana (SEQ ID NO: 5) (20 mg/ml y 40 mg/ml) en los tampones de liofilización para cada una de las cuatro formulaciones diferentes. LaFIG.24Ailustra el cambio en el porcentaje de agregados del constructo diana a 4 ºC. LaFIG.24Bilustra el cambio en el porcentaje de dímeros diana a 4 ºC. LaFIG.24Cilustra el cambio en el porcentaje de agregados del constructo diana a 25 ºC. Las flechas indican el tampón de liofilización que contiene sacarosa a pH 7,5. LaFIG.24Dilustra el cambio en el porcentaje del dímero del constructo diana a 25 ºC. Las flechas indican el tampón de liofilización que contiene sacarosa a pH 7,5. LasFIGS.25A-25Bilustran la eficiencia de replegamiento al variar la concentración de arginina y la concentración del constructo diana (SEQ ID NO: 5) de la solución de replegamiento. LaFIG.25Amuestra un gráfico de contorno de la eficiencia de replegamiento (% de dímero al final del replegamiento). LaFIG. 25Bmuestra un gráfico de barras de las eficiencias de replegamiento.
[0142] LasFIGS. 26A-26Bilustran la eficiencia de replegamiento del constructo diana (SEQ ID NO: 5) al variar la concentración de glicerol y el pH de la solución de replegamiento. LaFIG.26Amuestra un gráfico de contorno de la eficiencia de replegamiento. LaFIG.26Bmuestra un gráfico de barras de las eficiencias de replegamiento. LasFIGS. 27A-27Bilustran la eficiencia de replegamiento del constructo diana (SEQ ID NO: 5) al variar la concentración de sacarosa y la concentración de PEG 3350 de la solución de replegamiento. LaFIG.27Amuestra un gráfico de contorno de la eficiencia de replegamiento. LaFIG. 27Bmuestra un gráfico de barras de las eficiencias de replegamiento.
[0143] LaFIG. 28ilustra un cromatograma de cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño (SE-HPLC) que muestra los agregados, dímeros y monómeros del constructo diana (SEQ ID NO: 5) para cada una de las cuatro soluciones de replegamiento. "A" representa la solución de replegamiento de control que contiene 0,7 M de arginina. "B" representa una solución de replegamiento con 1 M de arginina. "C" representa una solución de replegamiento con 1 M de arginina más 0,25 M de sacarosa más un 0,2% de PEG3350. "D" representa 1 M de arginina más 0,25 M de sacarosa.
[0144] LaFIG.29ilustra la eficiencia de replegamiento de cada una de las cuatro soluciones de replegamiento ilustradas en laFIG.28.
[0145] LaFIG. 30ilustra la tinción con azul de Coomassie de los constructos diana en varios pasos intermedios del proceso de purificación después del SDS-PAGE. Los carriles 1 y 11 contienen marcadores de peso molecular de marca 12. Los carriles 8, 9, 10, 18, 19 y 20 están en blanco. Las muestras de los carriles 2 a 10 del SDS-PAGE se procesaron en condiciones reducidas. Las muestras de los carriles 12 a 20 se procesaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reducidas. Los carriles 2 y 12 contienen el constructo diana (SEQ ID NO: 5). Los carriles 3 y 13 contienen retentado TFF-2 filtrado (ciclo Nº 1). Los carriles 4 y 14 contienen retentado TFF-2 filtrado (ciclo Nº 2). Los carriles 5 y 15 contienen eluido agrupado Capto™ Q. Los carriles 6 y 16 contienen el eluido agrupado de CHT. Los carriles 7 y 17 contienen el retentado final TFF-3.
[0146] LasFIGS. 31A-31Bilustran realizaciones de las formulaciones orales3200y3205descritas en la presente. LaFIG.31Ailustra una formulación oral3200que comprende una región interior que comprende proteína terapéutica(3201),una primera capa(3203),una segunda capa(3202)y una tercera capa(3204).LaFIG. 31Bilustra una formulación oral que comprende una primera capa (3203).
[0147] LasFIGS.32A-32Bilustran el tiempo de liberación del radiomarcador de las cápsulas con un recubrimiento de la formulación 1, 2 o 3, tal como se describe en laTABLA 35.LaFIG.32Ailustra el tiempo de liberación inicial del radiomarcador después de la administración de formulaciones de recubrimiento de cápsulas orales en voluntarios sanos. LaFIG. 32Bilustra el tiempo de liberación completa del radiomarcador después de la administración de formulaciones de recubrimiento de cápsulas orales en voluntarios sanos.
[0148] LasFIGS.33A-33Bilustran la localización anatómica de la liberación del radiomarcador desde cápsulas con un recubrimiento de la formulación 1, 2 o 3, tal como se describe en laTABLA 35.LaFIG.33Ailustra la localización anatómica de la liberación inicial del radiomarcador después de la administración de formulaciones de recubrimiento de cápsulas orales en voluntarios sanos. LaFIG.33Bilustra la localización anatómica de la liberación completa del radiomarcador después de la administración de formulaciones de recubrimiento de cápsulas orales en voluntarios sanos. PSB = intestino delgado proximal; DSB = intestino delgado distal; AC = colon ascendente; TC = colon transverso; DC = colon descendente
[0149] LaFIG. 34ilustra un cromatograma de exclusión por tamaño (SEC) que identifica los picos que representan el dímero, el agregado y el monómero del constructo diana (SEQ ID NO: 5).
[0150] LaFIG.35ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre el cambio porcentual en el peso corporal en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. El peso corporal de los ratones se registró diariamente antes y después de la lesión. Los datos se expresan como media ± SEM; n por grupo: sin tratamiento (5), vehículo (10), constructo de administración de IL-10 (15), 5-ASA (15). Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional con la prueba post hoc de Dunnett para comparar la diferencia de cada grupo frente al vehículo en cada día. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001,****p<0,0001.
[0151] LaFIG. 36ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre las tasas de supervivencia en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. La mortalidad en los ratones se registró diariamente antes y después de la lesión. Los datos se expresan como porcentaje de supervivencia.
[0152] LaFIG. 37ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre la gravedad de la enfermedad en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. La gravedad se evaluó mediante marcadores colónicos de inflamación 7 días después de la lesión.
[0153] LaFIG.38Ailustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre el peso del colon en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. El peso del colon se midió 7 días después de la lesión.
[0154] LaFIG.38Bilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre la positividad en la prueba de sangre oculta en heces en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. LaFIG.38Cilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre la consistencia de las heces en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona.
[0155] LaFIG.38Dilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre el índice de actividad de la enfermedad en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona.
[0156] LaFIG.38Eilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre los niveles séricos del factor estimulante de colonias de macrófagos 1 (MCSF) en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona.
[0157] LaFIG.38Filustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre los niveles séricos de la proteína IL12 p70 en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona.
[0158] LaFIG.38Gilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre los niveles séricos de IL-3 en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona.
[0159] LasFIGS.39A-39Eilustran los efectos de la administración oral del constructo de administración de IL-10 sobre la expresión celular de proteínas relevantes para los procesos inflamatorios asociados con la colitis ulcerosa. Se analizaron mediante inmunohistoquímica secciones transversales del colon proximal, medio y distal de ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. LaFIG. 39Ailustra el efecto de la administración oral del constructo de administración de IL-10 sobre la expresión celular de NFκB. LaFIG.39Bilustra el efecto de la administración oral del constructo de administración de IL-10 sobre la expresión celular de TNFα. LaFIG.39Cilustra el efecto de la administración oral del constructo de administración de IL-10 sobre la expresión celular de CD4. LaFIG. 39Dilustra el efecto de la administración oral del constructo de administración de IL-10 sobre la expresión celular de IL-4. LaFIG.39Eilustra el efecto de la administración oral del constructo de administración de IL-10 sobre la expresión celular de Foxp3.
[0160] LasFIGS.40A-40Bilustran una matriz Luminex de citoquinas sistémicas después de la administración oral de una solución de dosificación de un constructo de administración de IL-10. LaFIG.40Ailustra una matriz Luminex de IL-6 después de la administración oral de una solución de dosificación de un constructo de administración de IL-10. LaFIG. 40Bilustra una matriz Luminex de IL-23 después de la administración oral de una solución de dosificación de un constructo de administración de IL-10.
[0161] LasFIGS. 41A-41Jilustran la concentración de 10 citoquinas en muestras de plasma usando el panel proinflamatorio 1 de MSD después de los tratamientos indicados. LaFIG.41Ailustra la concentración plasmática de IFNγ. LaFIG.41Bilustra la concentración plasmática de IL-10. LaFIG.41Cilustra la concentración plasmática de IL-12p70. LaFIG. 41Dilustra la concentración plasmática de IL-1β. LaFIG. 41Eilustra la concentración plasmática de IL-2. LaFIG.41Filustra la concentración plasmática de IL-4. LaFIG.41Gilustra la concentración plasmática de IL-5. LaFIG. 41Hilustra la concentración plasmática de IL-6. LaFIG. 41Iilustra la concentración plasmática de KC/GRO. LaFIG.41Jilustra la concentración plasmática de TNF-α.
[0162] LaFIG.42ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre el cambio porcentual en el peso corporal en ratones después de una colitis inflamatoria inducida por oxazolona.
[0163] LaFIG.43ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre el porcentaje de supervivencia en ratones después de una colitis inflamatoria inducida por oxazolona. La mortalidad en ratones se registró diariamente antes y después de la lesión con oxazolona. Los datos se expresan como porcentaje de supervivencia.
[0164] LaFIG.44ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre la gravedad de la enfermedad en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. El índice de actividad de la enfermedad (DAI) se puntuó según la consistencia fecal y la positividad de Hemoccult (prueba de sangre oculta en heces) después de la exposición a la oxazolona. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0165] LaFIG. 45ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO. 5 sobre la relación peso/longitud del colon en ratones después de una inflamación colónica inducida por oxazolona. El peso y la longitud del colon se midieron 7 días después de la exposición a la oxazolona. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0166] LaFIG.46ilustra la histopatología del colon proximal, medio y distal después de una inflamación colónica inducida por oxazolona en ratones. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0167] LasFIGS.47A-47LLilustran las concentraciones sistémicas de citoquinas, quimiocinas y factores de crecimiento circulantes en ratones. Las concentraciones plasmáticas de citoquinas circulantes se analizaron usando la matriz de perlas Luminex. Los datos se expresan como media ± SEM. LaFIG.47Ailustra la concentración sistémica de GCSF/CSF3. LaFIG. 47Bilustra la concentración sistémica de GMCSF. LaFIG. 47Cilustra la concentración sistémica de MCSF. LaFIG.47Dilustra la concentración sistémica de VEGF. LaFIG.47Eilustra la concentración sistémica de LIF. LaFIG.47Filustra la concentración sistémica de Eotaxina. LaFIG.47Gilustra la concentración sistémica de GROA. LaFIG.47Hilustra la concentración sistémica de IP10. LaFIG.47Iilustra la concentración sistémica de LIX. LaFIG. 47Jilustra la concentración sistémica de MCP1. LaFIG. 47Kilustra la concentración sistémica de MCP3. LaFIG.47Lilustra la concentración sistémica de MIP1α. LaFIG.47Milustra la concentración sistémica de MIP1β. LaFIG.47Nilustra la concentración sistémica de MIP2. LaFIG.47Oilustra la concentración sistémica de RANTES. LaFIG.47Pilustra la concentración sistémica de IL-1α. LaFIG.47Qilustra la concentración sistémica de IL-1β. LaFIG. 47Rilustra la concentración sistémica de IL-2. LaFIG. 47Silustra la concentración sistémica de IL-3. LaFIG. 47Tilustra la concentración sistémica de IL-4. LaFIG. 47Uilustra la concentración sistémica de IL-5. LaFIG. 47Vilustra la concentración sistémica de IL-6. LaFIG. 47Wilustra la concentración sistémica de IL-9. LaFIG.47Xilustra la concentración sistémica de IL-12p70. LaFIG.47Yilustra la concentración sistémica de IL-13. LaFIG. 47Zilustra la concentración sistémica de IL-15/IL-15R. LaFIG. 47AAilustra la concentración sistémica de IL-17A. LaFIG.47BBilustra la concentración sistémica de IL-18. LaFIG.47CCilustra la concentración sistémica de IL-23. LaFIG.47DDilustra la concentración sistémica de IL-27. LaFIG.47EEilustra la concentración sistémica de IL-28. LaFIG.47FFilustra la concentración sistémica de IL-31. LaFIG.47GGilustra la concentración sistémica de IFN-α. LaFIG.47HHilustra la concentración sistémica de IFN-γ. LaFIG.47IIilustra la concentración sistémica de TNF-α. LaFIG.47JJilustra la concentración sistémica de IL-10. LaFIG.47KKilustra la concentración sistémica de IL-22. LaFIG.47LLilustra la concentración sistémica de TGF-β.
[0168] LasFIGS. 48A-48Jilustran las concentraciones de 10 citoquinas en muestras de plasma usando el panel proinflamatorio V-PLEX. LaFIG. 48Ailustra la concentración plasmática de IFNγ. LaFIG. 48Bilustra la concentración plasmática de IL-10. LaFIG.48Cilustra la concentración plasmática de IL-12p70. LaFIG.48Dilustra la concentración plasmática de IL-1B. LaFIG.48Eilustra la concentración plasmática de IL-2. LaFIG.48Filustra la concentración plasmática de IL-4. LaFIG.48Gilustra la concentración plasmática de IL-5. LaFIG.48Hilustra la concentración plasmática de IL-6. LaFIG.48Iilustra la concentración plasmática de KC/GRO. LaFIG.48Jilustra la concentración plasmática de TNF-α. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0169] LasFIGS. 49A-49Dilustran la expresión sistémica y colónica de IL-1Ra en ratones después de una colitis inflamatoria inducida por oxazolona. LaFIG.49Ailustra la concentración plasmática sistémica de IL-1Ra. LaFIG.
[0170] 49Bilustra la expresión génica de IL-1Ra en el tejido colónico de ratones tratados con vehículo, sin tratamiento y con 9 mg/kg de IL-10. LaFIG.49Cilustra la expresión génica de IL-1β en el tejido colónico de ratones sin tratar, tratados con vehículo y tratados con 9 mg/kg del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5. LaFIG. 49Dilustra la relación IL-1Ra/IL-1β. Los niveles de transcrito de ARNm se normalizaron con respecto a GAPDH. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0171] LaFIG. 50Ailustra la cronología de la inducción de colitis por sulfato de dextrano sódico (DSS) y el tratamiento con sonda oral diaria del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 (según lo designado) disuelto en 100 ml de PBS en los días designados por una flecha hacia abajo.
[0172] LaFIG.50Bilustra la pérdida de peso inducida por DSS durante la parte del estudio realizada en vida.
[0173] LaFIG.50Cilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre el peso corporal después de una colitis inducida por DSS. El peso corporal se presenta como cambio porcentual con respecto al valor inicial después de inflamación inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0174] LaFIG.51ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre el índice de actividad de la enfermedad (DAI) después de una colitis inducida por DSS. Se sumaron las puntuaciones individuales de pérdida de peso, consistencia de las heces y hemoccult en las heces (puntuadas de 0 a 3) para obtener un DAI (intervalo de 0 a 9) en respuesta a la inflamación inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM. LasFIGS.52A-Bilustran el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre la longitud del colon(FIG.52A)y el peso(FIG.52B)después de una colitis inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0175] LaFIG. 53ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO. 5 sobre los parámetros histológicos sumados (inflamación, pérdida glandular, erosión e hiperplasia) después de una colitis inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM. ****p<0,0001, *p<0,05.
[0176] LaFIG. 54ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO. 5 sobre la anchura del edema después de una colitis inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM. ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05.
[0177] LaFIG.55ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5 sobre el espesor de la mucosa colónica después de una colitis inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM. ****p<0,0001, ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05.
[0178] LaFIG. 56ilustra el efecto del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO. 5 sobre la hiperplasia colónica después de una colitis inducida por DSS. Los datos se expresan como media ± SEM. ****p<0,0001, **p<0,01.
[0179] LasFIGS.57A-57Bilustran la detección variable de IL-10 humana y la inducción de IL-1Ra en el estudio con DSS. Las concentraciones sistémicas se midieron mediante inmunoensayos sándwich después de una lesión con DSS. Los datos se expresan como media ± SEM. LaFIG.57Ailustra las concentraciones sistémicas del constructo de administración de IL-10, detectadas mediante anticuerpos de detección anti-cholix o anti-IL-10. LaFIG.57Bilustra las concentraciones sistémicas de IL-1Ra después de una lesión con DSS.
[0180] LaFIG. 58ilustra la concentración plasmática de IL-10 total en primates no humanos (NHP) después de la administración de la dosis con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Las concentraciones sistémicas de IL-10 total se midieron mediante inmunoensayo después de la administración oral de cápsulas del constructo de administración de IL-10. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0181] LaFIG.59ilustra la concentración plasmática de IL-1Ra en NHP después de la administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Concentraciones sistémicas de IL-1Ra medidas mediante inmunoensayo después de la administración oral de cápsulas del constructo de administración de IL-10. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0182] LaFIG.60ilustra la concentración plasmática de cafeína en NHP después de la administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Concentraciones sistémicas de cafeína medidas mediante inmunoensayo después de la administración oral de cápsulas del constructo de administración de IL-10. Los datos se expresan como media ± SEM.
[0183] LasFIGS.61A-61Eilustran las concentraciones plasmáticas de citoquinas proinflamatorias seleccionadas en NHP después de la administración de la dosis oral del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG.
[0184] 61Ailustra la concentración plasmática de IFNγ. LaFIG.61Bilustra la concentración plasmática de IL-1β. LaFIG.
[0185] 61Cilustra la concentración plasmática de IL-2. LaFIG.61Dilustra la concentración plasmática de IL-8. LaFIG.
[0186] 61Eilustra la concentración plasmática de IL-6.
[0187] LaFIG.62ilustra que el constructo de administración de IL-10 mostró poca o ninguna colocalización con lisosomas positivos para LAMP1 en enterocitos durante un estudio de 15 minutos.
[0188] LaFIG.63ilustra una imagen de inmunofluorescencia de células que contienen CD11c (células dendríticas) e IL-10.
[0189] LaFIG.64ilustra una imagen de inmunofluorescencia de células que contienen CD19 (linfocitos B) e IL-10. LaFIG.65muestra una imagen de inmunofluorescencia de células que contienen CD34 (endotelio) y cholix. LaFIG.66muestra una imagen de inmunofluorescencia de células que contienen CD3 (linfocitos T) e IL-10. LaFIG.67ilustra el direccionamiento celular del constructo de administración de IL-10 hacia las células T y los macrófagos en la submucosa gastrointestinal.
[0190] LaFIG.68ilustra la disolución de cápsulas recubiertas que contienen el constructo de administración de IL-10 en un aparato de disolución de Tipo 4. Leyenda de símbolos: cuadrados: solo recubrimiento intermedio de HPMC; círculos: recubrimiento intermedio de HPMC más recubrimiento de eudragit 50:50 durante 80 min; signos más: recubrimiento intermedio de HPMC más recubrimiento de eudragit 50:50 durante 120 min; rombos: recubrimiento intermedio de HPMC más recubrimiento de eudragit 50:50 durante 120 min más recubrimiento de HPMC durante 20 min; y triángulos: recubrimiento intermedio de HPMC más recubrimiento de eudragit 50:50 durante 120 min más recubrimiento de HPMC durante 60 min.
[0191] LaFIG.69ilustra la disolución de comprimidos recubiertos que contienen el constructo de administración de IL-10 en un aparato de disolución de Tipo 4.
[0192] LaFIG.70ilustra la recuperación de las formas diméricas del constructo de administración de IL-10 (sección inferior de cada barra), así como las formas monoméricas (LMW) y agregadas (HMW) (sección superior de cada barra) del constructo de administración de IL-10 a lo largo de todo el curso temporal mostrado en laFIG.68y laFIG.69.
[0193] Los datos ilustran el área bajo la curva desde t=0 hasta el último punto temporal medido. De izquierda a derecha, las barras representan: (1) comprimido sin recubrimiento (2) comprimido con 8 mg de recubrimiento con una relación en peso de 20:80 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D; (3) comprimido con 13 mg de recubrimiento con una relación en peso de 20:80 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D; (4) comprimido con 20 mg de recubrimiento con una relación en peso de 20:80 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D; (5) comprimido con 8 mg de recubrimiento con una relación en peso de 50:50 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D; (6) comprimido con 13 mg de peso de recubrimiento con una relación en peso de 50:50 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D; (7) comprimido con 8 mg de peso de recubrimiento con una relación en peso de 50:50 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D; (8) Entérico-No; (9) Entérico-80 m; (10) Entérico-120 m; (11) Entérico 120 m HPMC 60 m; (12) Entérico 120 m HPMC 20 m.
[0194] LasFIGS. 71A-71Cilustran las concentraciones sistémicas de ciertos marcadores medidas durante 24 horas mediante inmunoensayo, después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a 1, 3 y 10 mg (n = 3/grupo). Los datos se expresan como media ± SEM, no se realizó análisis estadísticos. LaFIG.71Ailustra la concentración sistémica de IL-10. LaFIG.71Bilustra la concentración sistémica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG. 71Cilustra la concentración sistémica de IL-1Ra.
[0195] LaFIG.72ilustra la concentración sistémica de IL-6 medida durante 24 horas mediante inmunoensayo, después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a 1, 3 y 10 mg (n = 3/grupo). Los datos se expresan como media ± SEM, no se realizó análisis estadístico.
[0196] LaFIG. 73ilustra la concentración de IL-1Ra medida durante 24 h mediante inmunoensayo, después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a 1, 3 y 10 mg. Los datos se expresan como media ± SEM; n por dosis del constructo de administración de IL-10: predosis (2), 15 min (3), 30 min (3), 45 min (3), 8 h (1) y 24 h (1); no se realizó análisis estadístico.
[0197] LaFIG. 74ilustra la fosforilación de STAT3 en el tejido colónico, medida por la relación entre pSTAT3 y STAT3 total. La fosforilación y la expresión total se midieron mediante inmunoensayo durante 45 minutos, después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a 1, 3 y 10 mg. Los datos se expresan como media ± SEM, n por dosis del constructo de administración de IL-10: predosis (2), 15 min (3), 30 min (3) y 45 min (3), no se realizó análisis estadístico.
[0198] LaFIG. 75ilustra la concentración tisular de IL-6 medida durante 24 h mediante inmunoensayo, después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a 1, 3 y 10 mg. Los datos se expresan como media ± SEM; n por dosis del constructo de administración de IL-10: predosis (2), 15 min (3), 30 min (3), 45 min (3), 8 h (1) y 24 h (1); no se realizó análisis estadístico.
[0199] LaFIG. 76ilustra la regulación de los genes antiinflamatorios colónicos evaluada a las 8 h después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en dosis de 1, 3 y 10 mg; n por grupo: predosis (4), todas las dosis del constructo de administración de IL-10 (2). Los datos se expresan como media; no se realizó análisis estadístico. Para cada dosis, las barras de izquierda a derecha ilustran el cambio observado para: CD163, SCNN1G, STC1, HGF, SGK1, MIR24-2, SCNN1B, PTGDR, MTNR1A, ACE2, NOX1, BEST2, VNN2, LTB4R2, B3GALT5, AQP8, SLC9A3 y CYP1A1.
[0200] LaFIG. 77ilustra la regulación de los genes proinflamatorios colónicos evaluada 8 horas después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en dosis de 1, 3 y 10 mg; n por grupo: predosis (4), todas las dosis del constructo de administración de IL-10 (2). Los datos se expresan como media; no se realizó análisis estadístico. Para cada dosis, las barras de izquierda a derecha ilustran: MHC-II, HPGDS, FCER1A, PLA2G2D, CCL13, FUT3, CCL28, UGT1A1, CCL20, NLRP1 y TPH.
[0201] LaFIG. 78ilustra la regulación de los genes proinflamatorios colónicos evaluada 8 horas después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en dosis de 1, 3 y 10 mg; n por grupo: predosis (4), todas las dosis del constructo de administración de IL-10 (2). Los datos se expresan como media de 2-3 sondas por objetivo; no se realizó análisis estadístico. Para cada dosis, las barras e es de izquierda a derecha ilustran: MMP19, LIPG, MMP1, CHI3L1, MMP3, LAMC2, S100A8, CXCL1, FIGF, PCSK1, CASP5, CXCL2 y CHGB.
[0202] LaFIG. 79ilustra la regulación de los genes de reparación del tejido colónico evaluada 8 horas después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en dosis de 1, 3 y 10 mg; n por grupo: predosis (4), todas las dosis del constructo de administración de IL-10 (2). Los datos se expresan como media; no se realizó análisis estadístico. Para cada dosis, las barras de izquierda a derecha ilustran: SCNN1G, STC1, TIMP1, SCNN1B, BEST2, B3GALT5, AQP8 y SLC9A3.
[0203] LaFIG. 80ilustra la regulación de los genes antimicrobianos del colon evaluada 8 horas después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en dosis de 1, 3 y 10 mg; n por grupo: predosis (4), todas las dosis del constructo de administración de IL-10 (2). Los datos se expresan como media; no se realizó análisis estadístico. Para cada dosis, las barras de izquierda a derecha ilustran: PI15, P13, BDKRB1, CCI28 y SERPINE2.
[0204] LasFIGS.81A-81Cilustran la tinción con hematoxilina y eosina de secciones del colon de ratón. LaFIG.81Aes una sección de colon sin tratamiento, laFIG.81Bes una sección del colon de un ratón tratado con oxazolona y laFIG. 81Ces una sección del colon de un ratón tratado con oxazolona y 8,5 mg/kg de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[0205] LasFIGS.82A-82Gilustran la expresión de marcadores inflamatorios después del tratamiento con un constructo de administración oral de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG.82Amuestra la expresión de IL-4. LaFIG.82Bmuestra la expresión de IL-6. LaFIG.82Cmuestra la expresión de IL-1β. LaFIG.82Dmuestra la expresión de IL-17A. LaFIG. 82Emuestra la expresión de IL-10. LaFIG. 82Fmuestra la expresión de MIP1α. LaFIG. 82Gmuestra la expresión de GCSF/CSF3. *p < 0,05; ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Tukey.
[0206] LaFIG.83Ailustra la relación entre pSTAT3 y STAT3 total después del tratamiento con una cantidad equimolar de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5; 1 mg/kg) o IL-10 humana recombinante (0,9 mg/kg). LaFIG. 83Bilustra el nivel de IL-1Ra sistémico después del tratamiento con una cantidad equimolar de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5; 10 mg/kg) o IL-10 humana recombinante (3 mg/kg).
[0207] LaFIG.84ilustra la expresión sistémica de IL-1Ra después del tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (las dosis se muestran en el eje x en mg/kg).
[0208] LaFIG.85Ailustra la expresión de IL-1Ra en el colon de ratones tratados con vehículo o 9 mg/kg de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), medida por qPCR y normalizada al nivel de expresión en un ratón sin tratamiento previo.
[0209] LaFIG.85Bilustra la expresión de IL-1β en el colon de ratones tratados con vehículo o 9 mg/kg de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), medida mediante qPCR y normalizada al nivel de expresión en un ratón sin tratamiento previo.
[0210] LaFIG.85Cilustra la relación entre IL-1Ra e IL-1β en lasFIGS.85AyB.
[0211] LaFIG. 86ilustra el efecto del tratamiento con un constructo de administración de IL-10 sobre la relación entre STAT3 fosforilada (pSTAT3) y STAT3 total en el tejido del colon.
[0212] LaFIG.87ilustra la expresión de marcadores proinflamatorios en monosMacaca fascicularis(de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 kg) a los que se les administró un constructo de administración de IL-10 mediante sigmoidoscopia colónica en las dosis indicadas.
[0213] LaFIG. 88ilustra la expresión de marcadores antiinflamatorios en monosMacaca fascicularis(de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 kg) a los que se les administró un constructo de administración de IL-10 mediante sigmoidoscopia colónica en las dosis indicadas.
[0214] LaFIG.89ilustra la expresión de biomarcadores asociados con la reparación de tejidos y la cicatrización de heridas en monosMacaca fascicularis(de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 kg) a los que se les administró un constructo de administración de IL-10 mediante sigmoidoscopia colónica en las dosis indicadas.
[0215] LasFIGS.90A-90Bilustran las mediciones de PK y PD en primates no humanos después de la administración de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG.90Ailustra las concentraciones sistémicas de IL-10 después de la administración del constructo de administración de IL-10 por vía oral (PO, N = 6), subcutánea (SC, N = 3) o intravenosa (IV, N = 3) en las dosis indicadas en monosMacaca fascicularis. LaFIG.90Bilustra las concentraciones sistémicas de IL-1Ra después de la administración del constructo de administración de IL-10 por vía oral (PO, N = 6), subcutánea (SC, N = 3) o intravenosa (IV, N = 3) en las dosis indicadas en monosMacaca fascicularis.
[0216] LaFIG.91ilustra la relación entre IL-1Ra e IL-10 (relación de la AUC media) después de la administración de un constructo de administración de IL-10 por vía oral (PO, N = 6), subcutánea (SC, N = 3) o intravenosa (IV, N = 3) en las dosis indicadas en monosMacaca fascicularis.
[0217] LaFIG.92ilustra la turbidez de las soluciones que comprenden un constructo de administración de IL-10 antes y después de la agitación, tanto con cómo sin surfactante.
[0218] LaFIG.93ilustra un cromatograma SEC-HPLC antes de la agitación en vórtice.
[0219] LaFIG.94ilustra un cromatograma SEC-HPLC después de la agitación en vórtice.
[0220] LaFIG.95ilustra la estabilidad del constructo de administración de IL-10 en PBS cuando se compacta con varios componentes diferentes. Las muestras se reconstituyeron en PBS a 0,3 mg/ml de constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en viales Eppendorf, montados en un agitador tipo rotisserie a 37 ºC durante 5 h. Se retiraron muestras periódicamente para su análisis por SEC.
[0221] LaFIG.96ilustra la compatibilidad del constructo de administración de IL-10/excipiente en solución.
[0222] LaFIG.97ilustra la compatibilidad de varios excipientes de lubricantes con un constructo de administración de IL-10.
[0223] LaFIG. 98ilustra la liberación del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) desde comprimidos recubiertos con Eudragit (50/50 L30D55/FS30D) en un aparato de disolución de Tipo 4.
[0224] LaFIG. 99ilustra la liberación del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) desde comprimidos recubiertos con Eudragit (20/80 L30D55/FS30D) en un aparato de disolución de Tipo 4.
[0225] LaFIG.100ilustra la disolución de comprimidos recubiertos con HPMC-AS (aparato de tipo 4). La disolución se inició con una solución de HCL 0,1 N durante 40 minutos antes de cambiar el medio a un tampón fosfato de pH 7,0.
[0226] LaFIG. 101ilustra la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) desde cápsulas recubiertas con HPMC-AS (aparato de Tipo 4).
[0227] LaFIG.102ilustra la disolución de comprimidos F3 recubiertos con HPMC-AS en un aparato de disolución de Tipo 4.
[0228] LaFIG.103ilustra la disolución de comprimidos F3 recubiertos con HPMC-AS en un aparato de disolución de Tipo 2.
[0229] LasFIGS. 104A-104Cilustran la concentración plasmática de varias proteínas (por ejemplo, biomarcadores) después de la administración oral o intravenosa de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO:5). LaFIG. 104Ailustra la concentración plasmática de IL-10. LaFIG. 104Bilustra la concentración plasmática de IL-1Ra. LaFIG.104Cilustra la concentración de IFN-γ.
[0230] LasFIGS.105A-105Dilustran la concentración sistémica o en el tejido del colon de varios biomarcadores después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en primates no humanos (NHP). LaFIG.105Ailustra la concentración sistémica de IL-10. LaFIG.105Bilustra la concentración sistémica de IL-1Ra. LaFIG.105Cilustra la concentración de IL-10 en el tejido del colon. LaFIG.105Dilustra la concentración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en el tejido del colon.
[0231] LasFIGS.106A-106Dilustran los niveles de rhIL-10, medidos por ELISA, en tejido intestinal normal e inflamado (colon proximal, medio y distal) y suero en el plazo de los 10 y 40 minutos siguientes a la inyección intraluminal de PBS, rhIL-10 (159 pmoles) o el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) (159 pmoles). LaFIG.106Ailustra los niveles de rhIL-10 en tejido intestinal normal 10 minutos después de la inyección intraluminal de PBS, rhIL-10 o el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG.106Bilustra los niveles de rhIL-10 en tejido intestinal inflamado 10 minutos después de la inyección intraluminal de PBS, rhIL-10 o el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG.106Cilustra los niveles de rhIL-10 en tejido intestinal normal 40 minutos después de la inyección intraluminal de PBS, rhIL-10 o el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). LaFIG.106Dilustra los niveles de rhIL-10 en tejido intestinal inflamado 40 minutos después de la inyección intraluminal de PBS, rhIL-10 o el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[0232] LaFIG.107ilustra la localización tisular de rhIL-10 y pSTAT3 después de la inyección intraluminal del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en el yeyuno de ratones Balb/C.
[0233] LaFIG. 108ilustra un análisis temporal de la inducción de pSTAT después de la inyección intraluminal del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en el yeyuno de ratones Balb/C.
[0234] LaFIG.109ilustra imágenes de inmunofluorescencia del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y el tráfico a través del epitelio intestinal en diferentes modelos murinos.
[0235] LaFIG.110ilustra la actividad de pSTAT3 a lo largo de lalámina propiadel intestino de ratón.
[0236] LaFIG.111ilustra la expresión de IL-1Ra después de una única dosis del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a 6 dosis (1 mg, 3 mg, 10 mg, 30 mg, 60 mg, 120 mg) o placebo.
[0237] LaFIG.112ilustra el escalado de dosis múltiples ascendentes (MAD) en un ensayo de Fase 1b del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[0238] LaFIG. 113ilustra una reducción de la FCP después de solo 14 días de tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en pacientes con colitis ulcerosa (CU) con una FCP de referencia de >150 µg/g.
[0239] LaFIG. 114ilustra una reducción de la CRP en la circulación sistémica después de solo 14 días de tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en pacientes con CU con una CRP de referencia de >5 mg/L.
[0240] LaFIG. 115ilustra la reducción del índice de Geboes después de 14 días de tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[0241] LaFIG.116representa imágenes histológicas previas a la dosis (panel A) y posteriores al tratamiento (panel B) de un paciente con CU en el ensayo de Fase 1b al que se le dosificaron 10 mg del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), en el que el índice de Geboes mejoró de una puntuación de 15 a una puntuación de 3 usando una escala de 22 puntos, en la que las puntuaciones más altas indican una actividad más grave de la enfermedad.
[0242] LasFIGS.117A-117Cmuestran imágenes microscópicas que demuestran la transcitosis de una IL-10 a través de células epiteliales intestinales polarizadas en ratas Wistar en varios puntos temporales después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de la rata. La fluorescencia verde indica la presencia de IL-10 (mediante tinción con un anticuerpo anti-IL-10). La fluorescencia azul indica la tinción con DAPI, que marca el ADN, y la fluorescencia roja indica la presencia de CK-8 (citoqueratina-8) con la que puede estar colocalizado durante la transcitosis un portador derivado de cholix (por ejemplo, en una región supranuclear de una célula epitelial). Las flechas blancas Nº 1 resaltan la membrana apical de las células epiteliales, las flechas blancas Nº 2 resaltan la membrana basal de las células epiteliales y la flecha blanca Nº 3 indica la presencia de IL-10 en lalámina propia.LaFIG.117Amuestra el alcance de la transcitosis de IL-10 un minuto después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de rata. LaFIG.117Bmuestra el alcance de la transcitosis de IL-10 cinco minutos después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de rata. LaFIG.117Cmuestra el alcance de la transcitosis de IL-10 diez minutos después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de rata.
[0243] LaFIG.118ilustra los resultados de un sistema modelo intestinal de monocapas SMI-100 humanas polarizadas y confluentes. Una transferencia western anti-hIL-10 detecta el alcance de las aplicaciones equimolares de un constructo de administración de IL-10 (carril 2, apical, t = 0 h) o hIL-10 comercial (carril 3, apical, t = 0 h) que se transporta al compartimento basal de los transwells respectivos (carril 4, constructo de administración de IL-10, de referencia, t=2 h y carril 5, hIL-10, de referencia, t=2 h). Se unieron los carriles de una única transferencia western para facilitar las comparaciones y se indican con líneas negras.
[0244] LaFIG.119ilustra la dimerización de los receptores IL-10A e IL-10B diseñados en células de osteosarcoma U2OS inducida por un constructo de administración de IL-10 o hIL-10 después de 6 h.
[0245] LaFIG. 120ilustra la inducción de la fosforilación de STAT3, con respecto al contenido total de STAT3, en una línea celular J774.2 similar a los macrófagos de ratón después de 20 minutos de estimulación. Los datos son representativos de múltiples estudios con resultados similares.
[0246] LaFIG. 121ilustra el análisis por citometría de flujo de monocitos CD45+ CD14+ vivos (PBMC) obtenidos de donantes sanos, que muestra el efecto supresor de la IL-10 sobre la secreción de TNFa inducida por LPS; datos de intensidad de fluorescencia media (MFI) como medias ± SEM (n = 3) analizados mediante ANOVA bidireccional con prueba post hoc de Dunnett. .p<0,5, ..p<0,01, ".p<0,001, '...p<0,0001 en comparación con los valores de concentración de 0 pM.
[0247] LaFIG. 122ilustra el análisis por citometría de flujo de monocitos CD45+ CD14+ vivos seleccionados (PBMC) obtenidos de donantes sanos, que muestra el efecto supresor de la IL-10 sobre la secreción de IL-6 inducida por LPS; datos de intensidad de fluorescencia media (MFI) como medias ± SEM (n = 3) analizados mediante ANOVA bidireccional con prueba post hoc de Dunnett..p<0,5,..p<0,01, ''.p<0,001, '...p<0,0001 en comparación con los valores de concentración de 0 pM.
[0248] LaFIG. 123ilustra el análisis por citometría de flujo de monocitos CD45+ CD14+ vivos seleccionados (PBMC) obtenidos de donantes sanos que muestran el efecto supresor de la IL-10 sobre la expresión superficial de HLA-DR inducida por LPS; datos de intensidad de fluorescencia media (MFI) como medias ± SEM (n = 3) analizados mediante ANOVA bidireccional con prueba post hoc de Dunnett.p<0,5,..p<0,01, ''.p<0,001, '...p<0,0001 en comparación con los valores de concentración de 0 pM.
[0249] LaFIG.124ilustra la colitis inducida por oxazolona en ratones BALB/c alimentados por sonda oral con PBS. Se capturaron imágenes de un solo canal y se fusionaron en una composición con núcleos (azul), IL-10 (verde) y pSTAT3 (rojo).
[0250] LaFIG.125ilustra la colitis inducida por oxazolona en ratones BALB/c alimentados por sonda oral con hIL-10. Se capturaron imágenes de un solo canal y se fusionaron en una composición con núcleos (azul), IL-10 (verde) y pSTAT3 (rojo).
[0251] LaFIG. 126ilustra la colitis inducida por oxazolona en ratones BALB/c alimentados por sonda oral con un constructo de administración de IL-10. Se capturaron imágenes de un solo canal y se fusionaron en una composición con núcleos (azul), IL-10 (verde) y pSTAT3 (rojo).
[0252] LaFIG. 127ilustra el porcentaje de células que expresan pSTAT3 en la segmentación del tejido del intestino delgado.
[0253] LaFIG.128ilustra los resultados de un ELISA de hIL-10 realizado con PBS, IL-10 y un constructo de administración de IL-10 después de la inyección intraluminal en los tejidos intestinales indicados y el suero en el modelo de transferencia de células T inflamadas.
[0254] LaFIG. 129ilustra la colocalización de los elementos del portador derivado de cholix (rojo) y hIL-10 (verde) del constructo de administración de IL-10, lo que demuestra su transporte y retención simultáneos dentro de las células de la lámina propia. Se obtuvieron imágenes de microscopía de inmunofluorescencia del yeyuno de rata después de una inyección intraluminal de 50 ul de un constructo de administración de IL-10 preparado en PBS a ~40 uM. Para lasFIGS. 129-133:flecha = membrana epitelial apical (luminal); línea discontinua = demarcación entre la célula epitelial y la membrana basal; l-p = lámina propia; G = célula caliciforme. Núcleos celulares teñidos con DAPI (azul).
[0255] LaFIG.130ilustra la tinción del elemento hIL-10 (verde) del constructo de administración de IL-10 y Rab7 (rojo), que demostró preferencias apicales para el primero y preferencias de referencia para el segundo.
[0256] LaFIG.131ilustra la tinción del elemento hIL-10 (verde) del constructo de administración de IL-10 y Rab 11 (rojo), que demostró preferencias apicales para el primero y preferencias de referencia para el segundo.
[0257] LaFIG. 132ilustra la reorganización de LMAN1 y la colocalización con el constructo de administración de IL-10 dentro de los enterocitos, pero no dentro de las células de la lámina propia, en un curso temporal después de la inyección intraluminal de un constructo de administración de IL-10 en el yeyuno de una rata.
[0258] LaFIG. 133ilustra la ausencia de redistribución o colocalización de LAMP dentro de los enterocitos, pero una amplia colocalización dentro de las células de la lámina propia en un curso temporal después de la inyección intraluminal de un constructo de administración de IL-10 en el yeyuno de ratas.
[0259] LaFIG. 134muestra la localización de células T (CDC3+) y células pSTAT3+ en tejido intestinal de ratón. Una célula pSTAT3+ CDC3+ se indica mediante una flecha blanca.
[0260] LaFIG. 135ilustra la localización de macrófagos (F4/80+) y células pSTAT3+ en tejido intestinal de ratón. Una célula pSTAT3+ F4/80+ se indica mediante una flecha amarilla.
[0261] LaFIG.136ilustra un aumento mayor de un área de laFIG.135.Las células pSTAT3+ F4/80+ se indican mediante flechas amarillas.
[0262] LaFIG.137ilustra imágenes adicionales de células intestinales pSTAT3+ F4/80+.
[0263] LaFIG.138ilustra una imagen de células del colon pSTAT3+ F4/80+.
[0264] LaFIG.139ilustra la concentración de hIL-10 en suero de ratón a lo largo del tiempo después de la administración mediante sonda oral de 10 mg/kg de un constructo de administración de IL-10.
[0265] LaFIG.140muestra la concentración de hIL-10 en el tejido del intestino delgado distal de ratones a lo largo del tiempo después de la administración mediante sonda oral de 10 mg/kg de un constructo de administración de IL-10.
[0266] LaFIG. 141ilustra la concentración de hIL-10 en el tejido intestinal colónico de ratones a lo largo del tiempo después de la administración mediante sonda oral de 10 mg/kg de un constructo de administración de IL-10. LaFIG. 142ilustra la concentración de IL-1Ra en el suero de ratón a lo largo del tiempo después de la administración mediante sonda oral de 10 mg/kg de un constructo de administración de IL-10.
[0267] LaFIG.143ilustra la concentración del constructo de administración de IL-10 en una biopsia por corte del tejido colónico después de la pulverización intracolónica con la dosis indicada del constructo de administración de IL-10. LaFIG. 144ilustra la concentración de IL-10 en una biopsia de tejido colónico después de la pulverización intracolónica con la dosis indicada del constructo de administración de IL-10.
[0268] LaFIG.145ilustra la concentración sérica del constructo de administración de IL-10 después de la pulverización intracolónica con la dosis indicada del constructo de administración de IL-10.
[0269] LaFIG.146ilustra la concentración sérica de IL-10 después de la pulverización intracolónica con la dosis indicada del constructo de administración de IL-10.
[0270] LaFIG.147ilustra la concentración sérica de IL-1Ra después de la pulverización intracolónica con la dosis indicada del constructo de administración de IL-10.
[0271] LaFIG.148ilustra la relación entre pSTAT3 y STAT3 total después de la pulverización intracolónica con la dosis indicada del constructo de administración de IL-10.
[0272] LaFIG. 149ilustra una transferencia western sondeada para el componente de IL-10 humana (hIL-10) del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO. 5 (carril 2) y rhIL-10 comercial que muestra formas monoméricas (flecha) y diméricas (flecha doble) (carril 3). El carril 1 contiene estándares de peso molecular. LaFIG.150ilustra los resultados de la cromatografía de fase inversa seguida de espectrometría de masas en el constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO.5. Se observaron masas correspondientes a las formas diméricas y monoméricas.
[0273] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN
[0274] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Los términos "realización" y "encarnaciones" deben interpretarse como realización o realizaciones de la invención solo en la medida en que se encuentren dentro del alcance de las presentes reivindicaciones. De lo contrario, se refieren a realizaciones de la divulgación solamente.
[0275] La IL-10 es una citoquina antiinflamatoria que puede limitar el daño a los tejidos provocado por infecciones o inflamaciones, lo que la convierte en una proteína atractiva para el desarrollo de fármacos terapéuticos. Una proteína de fusión que comprende IL-10 y un portador, denominada en la presente "constructo de administración de IL-10", puede formularse en una forma adecuada para la administración oral, como un comprimido o una cápsula. Además, estos comprimidos o cápsulas pueden formularse de tal manera que mantengan sustancialmente la integridad estructural de los dímeros del constructo de administración de IL-10. Además, los recubrimientos entéricos alrededor de estas formulaciones orales pueden contribuir a un perfil de disolución distinto del constructo de administración de IL-10. La administración a un individuo de tales formulaciones orales puede caracterizarse por una respuesta farmacodinámica (PD) y farmacocinética (PK) distinta en el individuo.
[0276] La IL-10 se considera un regulador maestro del sistema inmunitario innato y adaptativo, ya que se cree que inhibe no solo el inflamasoma, sino también muchos eventos inflamatorios que se ha descubierto que están asociados con enfermedades, incluyendo la activación de los macrófagos y la secreción de IL-1, IL-6, TNF alfa y MMP-1/2, a la vez que reduce los signos sistémicos de inflamación y el desarrollo de células T reguladoras. Hay una necesidad de terapias combinadas que puedan usarse con inhibidores del TNF alfa. Proporcionar un constructo de administración de IL-10 además del inhibidor del TNF alfa puede ser eficaz y lograr mejores resultados para los pacientes.
[0277] A continuación se analizan los siguientes términos para ilustrar los significados de los mismos tal como se usan en esta memoria descriptiva, además de la comprensión de tales términos por los expertos en la materia. Tal como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta declaración sirva de base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la enumeración de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
[0278] En la presente se presentan ciertos intervalos o números con valores numéricos precedidos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" se usa en la presente para que signifique más o menos un 1%, 2%, 3%, 4% o 5% del número al que se refiere el término. Tal como se usan en la presente, los términos "sujeto" e "individuo" se usan indistintamente y pueden referirse a cualquier animal, incluyendo los mamíferos (por ejemplo, un animal humano o no humano).
[0279] Como se usan en la presente, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" u otros equivalentes gramaticales incluyen aliviar, mitigar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o afección, mejorar, prevenir o reducir la aparición, gravedad o frecuencia de uno o más síntomas adicionales de una enfermedad o afección, mejorar o prevenir las causas subyacentes de uno o más síntomas de una enfermedad o afección, inhibir la enfermedad o afección como, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o afección, aliviar la enfermedad o afección, provocar la regresión de la enfermedad o afección, aliviar una afección provocada por la enfermedad o afección, o inhibir los síntomas de la enfermedad o afección, ya sea de manera profiláctica y/o terapéutica.
[0280] [0047] Como se describe en la presente, el término "porcentaje (%) de identidad de secuencia" y los términos relacionados con el mismo, en el contexto de las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, es el porcentaje de residuos de aminoácidos o de ácidos nucleicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o de ácidos nucleicos, respectivamente, en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos o el porcentaje de identidad de ácidos nucleicos puede lograrse de varias maneras que están dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente, como Clustal Omega, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR), siendo el BLAST el algoritmo de alineamiento preferido. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr el máximo alineamiento en toda la longitud de las secuencias que se están comparando, aunque por simplicidad puede preferirse usar los parámetros predeterminados.
[0281] Interleucina-10 (IL-10) y constructos de administración de IL-10
[0282] La presente divulgación contempla composiciones y métodos para la administración de IL-10 a un sujeto. Como se ha descrito anteriormente, la IL-10 es una citoquina antiinflamatoria que puede limitar el daño a los tejidos provocado por infecciones o inflamaciones, lo que la convierte en una proteína atractiva para el desarrollo de fármacos terapéuticos. La IL-10 humana existe en solución principalmente como un homodímero, en el que dos subunidades de IL-10 están asociadas de manera no covalente y cada subunidad contiene dos enlaces disulfuro intracadena. La alteración de la estructura del dímero, por ejemplo, mediante la reducción o la sulfitólisis de estos enlaces disulfuro, puede provocar la disociación de las subunidades y producir monómeros de IL-10 o agregados de los mismos, que pueden carecer de la actividad biológica de los dímeros. La actividad biológica asociada a IL-10 en forma de dímero puede comprender la inducción de citoquinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), la interleucina-1β (IL-1β), la interleucina-12 (IL-12) y la interleucina-6 (IL-6). La actividad biológica asociada con la IL-10 en forma de dímero puede comprender la regulación negativa de la expresión de citoquinas Th1, antígenos MHC de clase II y moléculas coestimuladoras en los macrófagos; la mejora de la supervivencia, la proliferación y la producción de anticuerpos de las células B; el bloqueo de la actividad del NF-κB; y la regulación de la vía JAK-STAT.
[0283] En la presente se contemplan formulaciones que comprenden IL-10, en las que se mantiene un alto grado de IL-10 en forma de dímero. Además, en la presente se contemplan soluciones y métodos de replegamiento para mejorar la eficiencia de replegamiento de constructos que contienen IL-10, así como métodos de purificación posteriores para producir además niveles altos de dímero que pueden estar presentes en una sustancia farmacéutica seca (por ejemplo, liofilizada), así como en una formulación oral final. ElEJEMPLO 3contiene un protocolo de replegamiento ejemplar. ElEJEMPLO 4contiene un protocolo de purificación ejemplar. ElEJEMPLO 5contiene un protocolo de liofilización ejemplar y el contenido de dímeros resultante de las composiciones previas y posteriores a la liofilización.
[0284] En algunas realizaciones, una molécula de IL-10 se acopla a un portador que puede administrar la IL-10 a través de una célula epitelial intestinal o una célula epitelial polarizada. Esto se denomina constructo de administración de IL-10. Preferiblemente, la IL-10 que se acopla al portador se encuentra en forma de dímero. En algunos casos, el dímero es un homodímero. En algunos casos, el dímero es un heterodímero. En algunos casos, el heterodímero puede comprender un primer monómero de IL-10 y un monómero variante de IL-10 que difiere en secuencia del primer monómero de IL-10 para formar una IL-10 dimérica. Cuando la IL-10 se encuentra en forma de dímero, al portador se le puede acoplar un solo monómero o ambos monómeros. En una realización, cada IL-10 se acopla independientemente a un portador. Un dímero de constructo de administración de IL-10 puede ilustrarse mediante laFIG. 1.El homodímero de constructo de administración de IL-10100puede comprender dos constructos de administración de IL-10 (por ejemplo, SEQ ID NO: 5), cada constructo de administración comprende una IL-10101 conectada por un espaciador102a un portador. El portador puede comprender un dominio de unión103y un dominio de translocación104.
[0285] El porcentaje de dímero en una composición puede describir el porcentaje de la cantidad total de constructos de administración de IL-10 en un dímero. Por ejemplo, cuando una composición tiene tres copias de una proteína de fusión IL-10/portador, dos de las cuales forman un dímero, puede considerarse que el 67% de los constructos de administración están en forma de dímero.
[0286] La IL-10 puede ser una IL-10 humana. La IL-10 humana puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. Las variantes de la IL-10 incluyen aquellas que tienen una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia. Las variantes de IL-10 pueden conservar la capacidad de regular positivamente IL-1Ra en el tejido colónico o el suero después de la administración por atomización intracolónica en monos cynomolgus. En algunos casos, en las composiciones y métodos descritos en la presente se contemplan variantes de IL-10 o la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. Las variantes de IL-10 o la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 pueden ser una secuencia de aminoácidos que tenga por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con respecto a la misma o un fragmento de la misma. Las variantes de IL-10 pueden comprender sustituciones de aminoácidos en uno o más de N36, N36, D73, I87, N110, N115, K117, R128, F129 y N172 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Las variantes de IL-10 pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos, tales como N36Y, N36I, D73V, I87M, N110I, N115K, K117N, R128W, F129L y N172H con respecto a la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, una variante de IL-10 puede comprender las sustituciones N36Y, N110I, K117N y N172H. En algunos casos, una variante de IL-10 puede comprender N36Y, D73V, I87M, N110I, N115K y R128W con respecto a la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, una variante de IL-10 puede comprender N36I, N110I, K117N y F129L con respecto a la SEQ ID NO: 1.
[0287] [0053] Un portador puede ser una proteína u otro tipo de molécula capaz de transportar la carga útil heteróloga a través o dentro de un epitelio (por ejemplo, un epitelio intestinal polarizado de un sujeto, como un humano). Dicho transporte puede incluir la transcitosis. El proceso de transcitosis puede implicar la interacción o interacciones del portador con uno o más receptores y/o proteínas en la superficie o superficies apicales y/o basales, así como en el interior de una célula del epitelio (por ejemplo, una célula epitelial intestinal polarizada). El portador puede ser capaz de transportar una carga útil heteróloga, como IL-10, a través de un epitelio sin comprometer el epitelio, el portador y/o la función biológica y/o terapéutica de la carga útil.
[0289] En algunas realizaciones, un portador de la presente utiliza una vía de tráfico endógena para transportar una carga útil heteróloga acoplada al mismo a través de una célula epitelial polarizada. Dicho portador puede denominarse en la presente portador relacionado con la transcitosis. En algunos casos, un portador de la presente puede utilizar una vía de tráfico endógena para transportar una carga útil heteróloga acoplada al mismo a una célula epitelial polarizada. Dicho portador puede denominarse en la presente portador endocítico. Dentro de los portadores endocíticos, puede haber portadores que administren una carga útil acoplada a los mismos en regiones específicas dentro de las células epiteliales polarizadas, como un compartimento apical, un compartimento supranuclear o un compartimento basal.
[0291] Cualquiera de los portadores de la presente puede transportar moléculas acopladas a los mismos mediante la interacción y/o la colocalización con una o más proteínas endógenas de dicho epitelio. Una o más de las proteínas endógenas pueden ser receptores o enzimas capaces de mover un portador hacia o a través de la célula epitelial. La interacción y/o colocalización con una o más proteínas endógenas de la célula epitelial puede proporcionar a un portador una o más funciones, incluyendo la endocitosis en la célula epitelial, la evitación de una vía de destrucción lisosomal, el tráfico desde un compartimento apical a un compartimento basal, y/o la exocitosis desde la membrana basal de la célula epitelial a un compartimento submucoso, como lalámina propia.
[0293] Un portador puede derivarse de un polipéptido segregado por una bacteria. Dicho portador puede derivarse de un polipéptido segregado porVibrio choleraeoPseudomonas aeruginosa.En algunas realizaciones, el portador es un polipéptido de cholix. En algunas realizaciones, el portador es un polipéptido de cholix segregado porVibrio cholerae,mientras que en otras realizaciones el polipéptido de cholix es una variante del mismo o se deriva de alguna otra especie. El polipéptido de cholix (por ejemplo, un polipéptido de cholix segregado porVibrio choleraeo una variante del mismo) puede, por ejemplo, comprender una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 20-146 dela TABLA 2. LaTABLA 4ilustra portadores ejemplares identificando varias secuencias de residuos de aminoácidos de tales portadores y posiciones C-terminales en las que las SEQ ID NO 20-147 pueden truncarse. En algunas realizaciones, el polipéptido de cholix no comprende ni consiste en la SEQ ID NO: 126. Un polipéptido de cholix puede incluir secuencias de polipéptidos de cholix de origen natural y de origen no natural, así como aquellas secuencias que tienen por lo menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un polipéptido de cholix de origen natural (por ejemplo, las SEQ ID NO: 20-78 o 130-146) o no natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 o 11) descrita en la presente. Un polipéptido de cholix también puede incluir fragmentos de endocitosis y/o transcitosis (por ejemplo, truncamientos N- y/o C-terminales del polipéptido de cholix) de secuencias de polipéptidos de cholix de origen natural o de origen no natural, en el que tales fragmentos de endocitosis y/o transcitosis pueden tener por lo menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con cualquiera de dichas secuencias de polipéptidos de cholix de origen natural o de origen no natural.
[0295] LaTABLA 3proporciona una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 147,FÓRMULA I)de polipéptidos derivados de cholix que pueden usarse en la presente como portadores.
[0297] Por ejemplo, un polipéptido de cholix de origen no natural puede incluir o consistir en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 11(TABLA 1).Un portador de polipéptido de cholix puede ser una variante truncada y/o mutada de un polipéptido de cholix de longitud completa. Ejemplos de portadores relacionados con la transcitosis pueden incluir aquellos que tienen un truncamiento C-terminal de cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 11, 20-78 o 130-146, en los que el truncamiento C-terminal puede producirse en el extremo C-terminal del polipéptido en cualquier posición de aminoácido después del residuo C-terminal en la posición 195 (por ejemplo, truncamiento en cualquiera de las posiciones 195-634 de las SEQ ID NO: 3 o 11). Las posiciones de aminoácidos para el truncamiento pueden determinarse usando el alineamiento de secuencias con la secuencia de consenso SEQ ID NO: 147 o cualquiera de las secuencias de referencia SEQ ID NO: 3 o 11. LaTABLA 4siguiente ilustra los intervalos de aminoácidos que se incluyen en los portadores ejemplares e identifica varias posiciones C-terminales en las que pueden truncarse las SEQ ID NO 3, 11, 20-78 o 130-146. En algunos casos, los portadores relacionados con la transcitosis incluyen aquellos que tienen un truncamiento C-terminal de cualquiera de las SEQ ID NO 3, 11, 20-78 o 130-146.
[0299] [0059] Un portador puede ser una versión truncada de un polipéptido de cholix más largo que no se produce de manera natural. Por ejemplo, el portador puede tener secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten en los residuos de aminoácidos 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 y 1-386 de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 11. Las mutaciones en la variante de origen no natural pueden incluir una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones con respecto a un polipéptido de cholix de origen natural. En algunas realizaciones, un portador de la presente puede comprender una sustitución V1L. Dicho de otra manera, en algunas realizaciones, el portador relacionado con cholix tiene un aminoácido leucina en la posición "1". (La posición 1 se refiere generalmente al primer aminoácido de las variantes que no tienen una metionina N-terminal o a la segunda posición en las variantes que incluyen una metionina N-terminal. En otras palabras, al determinar la longitud de un portador, puede ignorarse una metionina N-terminal, si la hay). En algunas realizaciones, los portadores que comprenden la sustitución V1L experimentan una escisión reducida o eliminada del aminoácido N-terminal. En algunas realizaciones, los portadores que comprenden la sustitución V1L experimentan una acetilación reducida o eliminada del aminoácido N-terminal. Un portador proporcionado en la presente puede tener una actividad de ADP ribosilación reducida (por ejemplo, por lo menos reducida en un 50%) o inactivada (por ejemplo, ribosilación del factor de elongación 2) con respecto a una variante de cholix de origen natural. En algunas realizaciones, el portador puede comprender una metionina N-terminal. En otras realizaciones, no hay metionina N-terminal presente.
[0301] Un portador de la presente puede tener una actividad de ADP ribosilación reducida (por ejemplo, reducida por lo menos en un 50%) o inactivada (por ejemplo, ribosilación del factor de elongación 2). Un portador puede ser un polipéptido derivado de cholix o una variante del mismo que se trunca adicionalmente en cualquiera de las posiciones 206 a 633 en comparación con una secuencia de referencia, por ejemplo, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 11. Un truncamiento de una proteína de cholix (por ejemplo, un truncamiento de la SEQ ID NO: 147 o una variante de la misma) que tiene la capacidad de transportar una carga útil heteróloga a través de la transcitosis, como el constructo de administración de IL-10, puede denominarse fragmento funcional. Los portadores también incluyen variantes de cualquiera de los anteriores que tengan por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias portadoras de la presente. En un caso, un portador comprende la SEQ ID NO: 3. En otro caso, un portador comprende la SEQ ID NO: 4. Cualquiera de los portadores de la presente puede tener una sustitución V1L, sola o en combinación con una metionina N-terminal. En un caso, un portador comprende la SEQ ID NO: 11. En un caso, un portador comprende la SEQ ID NO: 12. Los portadores también incluyen variantes de cualquiera de los anteriores que tengan por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de la presente.
[0303] Un portador puede acoplarse a la IL-10 de manera covalente o no covalente, directa o indirectamente. Cuando una IL-10 se acopla a un portador de manera covalente, puede acoplarse al portador directamente o a través de un espaciador. La IL-10 puede acoplarse al extremo C-terminal o al extremo N-terminal del portador. Cuando para acoplar la IL-10 al portador se usa un espaciador, el espaciador puede incluir uno o más aminoácidos. Los ejemplos de espaciadores contemplados en la presente incluyen secuencias de oligopéptidos tales como S, (GS)<x>, (GGS)<x>, (GGGS)(<x)>,(SEQ ID NO: 7) (GGGGS)<x>(SEQ ID NO: 8) o (GGGGGS)<x>(SEQ ID NO: 9), donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. En algunos casos, un espaciador no incluye un residuo S adyacente a la secuencia IL-10, por ejemplo, SEQ ID NO: 6 (GGGGSGGGGSGGGG).
[0305] El portador y/o la IL-10 pueden comprender además una o más modificaciones en su extremo N-terminal y/o extremo C-terminal. Tales modificaciones pueden incluir un residuo de metionina N-terminal u otro residuo conocido para una expresión en un sistema heterólogo.
[0307] El constructo de administración de IL-10 puede colocalizarse con una célula en lalámina propiaque exprese CD3. La célula que expresa CD3 puede ser un linfocito. El linfocito puede ser una célula T. En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 no está colocalizado con una célula de lalámina propiaque expresa CD11c (por ejemplo, células dendríticas), CD19 (por ejemplo, linfocitos B) o CD34 (por ejemplo, endotelio). El constructo de administración de IL-10 puede colocalizarse con un macrófago en lalámina propia.La colocalización del constructo de administración de IL-10 con una célula puede comprender la interacción o unión del constructo de administración de IL-10 con un receptor en la superficie de la célula. El portador o la IL-10 del constructo de administración de IL-10 pueden interactuar o unirse con el receptor.
[0309] En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. El constructo de administración de IL-10 puede tener por lo menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el constructo de administración de IL-10 comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. El constructo de administración de IL-10 puede tener por lo menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. La expresión y purificación de IL-10, opcionalmente con uno o más portadores y uno o más espaciadores, tal como se proporciona en la presente, puede dar como resultado un aumento sustancial de la concentración de un constructo de administración de IL-10 dimerizado. En un ejemplo, la expresión y purificación de la SEQ ID NO: 5 puede dar como resultado una composición que comprenda más del 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la IL-10 en forma de dímero. En otro ejemplo, la expresión y purificación de la SEQ ID NO: 13 puede dar como resultado a una composición que comprenda más del 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la IL-10 en forma de dímero. Dicha IL-10 puede ser una M-hIL10 o M-cholix<386>-IL-10, en la que la hIL-10 o cholix<386>-IL-10 comprende una metionina (M) N-terminal. Alternativamente, entre el 85% y el 90%, entre el 85% y el 92%, o entre el 85% y el 95% de la IL-10 se encuentra en forma de dímero.
[0311] [0065] En algunas realizaciones, entre el 2% y el 5% de la IL-10 se encuentra en forma de agregado. En algunas realizaciones, no más del 2%, 3%, 4% o 5% de la IL-10 se encuentra en forma de agregado. En algunas realizaciones, entre el 5% y el 7% o entre el 6% y el 7% de la IL-10 se encuentra en forma monomérica. En algunas realizaciones, no más del 5%, 6%, 7% u 8% de la IL-10 se encuentra en forma monomérica.
[0313] Para caracterizar la distribución por tamaños del constructo de administración de IL-10 puede usarse cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC). El porcentaje del constructo de administración de IL-10 que se encuentra en forma de dímero, monómero y agregado en una composición líquida o en una composición liofilizada si se reconstituye en un líquido puede determinarse mediante SEC-HPLC(FIG.34).
[0315] En la presente se describen adicionalmente ácidos nucleicos de origen no natural que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 10, o una secuencia de ácido nucleico con por lo menos un 90%, por lo menos un 92%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10. El ácido nucleico puede estar optimizado por codones. El ácido nucleico puede estar codificado por un vector. El vector puede ser un plásmido o un vector viral. El vector viral puede ser un lentivirus, un adenovirus, un virus adenoasociado (AAV), un retrovirus o un virus del herpes simple. El vector puede ser competente para la replicación o incompetente para la replicación. El vector puede ser un vector integrador o un vector no integrador. Una célula puede transformarse con cualquiera de los vectores descritos en la presente. La célula puede ser una célula bacteriana. La célula bacteriana puede ser una célulade Escherichia coli. La célula puede ser una célula de levadura. La célula de levadura puede ser una célula deSaccharomyces cerevisiae.
[0317] TABLA 1 - Secuencias
[0319]
[0320] continuación
[0321]
[0322] continuación
[0323]
[0324] continuación
[0325]
[0326] continuación
[0327]
[0329] TABLA 2: Poli é tidos de cholix adicionales
[0330]
[0331] continuación
[0332]
[0333] continuación
[0334]
[0335] continuación
[0336]
[0337] continuación
[0338]
[0339] continuación
[0340]
[0341] continuación
[0342]
[0343] continuación
[0344]
[0345] continuación
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[0347] continuación
[0348]
[0349] continuación
[0350]
[0351] continuación
[0352]
[0353] continuación
[0354]
[0355] continuación
[0356]
[0357] continuación
[0358]
[0359] continuación
[0360]
[0361] continuación
[0362]
[0363] continuación
[0364]
[0365] continuación
[0366]
[0367] continuación
[0368]
[0369] continuación
[0370]
[0371] continuación
[0372]
[0373] continuación
[0374]
[0375] continuación
[0376]
[0377] continuación
[0378]
[0379] continuación
[0380]
[0381] continuación
[0382]
[0383] continuación
[0384]
[0385] continuación
[0386]
[0387] continuación
[0388]
[0389] continuación
[0390]
[0391] continuación
[0392]
[0393] continuación
[0394]
[0395] continuación
[0396]
[0397] continuación
[0398]
[0399] continuación
[0400]
[0401] continuación
[0402]
[0403] continuación
[0404]
[0405] continuación
[0406]
[0407] continuación
[0408]
[0409] continuación
[0410]
[0411] continuación
[0412]
[0413] continuación
[0414]
[0417] TABLA 3 -FÓRMULA I
[0418] continuación
[0419]
[0420] continuación
[0421]
[0423] TABLA 4 - Portadores relacionado con la transcitosis ejemplares que identifican residuos de aminoácidos de cual uiera de las SEQ ID NO: 20-147
[0425]
[0426] continuación
[0427]
[0428] continuación
[0431]
[0433] Métodos de fabricación
[0434] En una realización, la expresión, el aislamiento, la purificación y el replegamiento (por ejemplo, de un constructo de administración de IL-10) pueden realizarse de acuerdo con el proceso descrito en laFIG.2A.En otra realización, la expresión, el aislamiento, la purificación y el replegamiento (por ejemplo, de un constructo de administración de IL-10) pueden realizarse de acuerdo con el proceso descrito en laFIG.2B.
[0435] [0069] En el paso201de laFIG.2Ao en el paso301de laFIG.2B,se manipulan y cultivan células para expresar de manera recombinante un constructo de administración de IL-10, como SEQ ID NO: 5, mediante la transformación de las células con un plásmido que codifica el constructo de administración de IL-10. En algunas realizaciones, el plásmido incluye un ácido nucleico correspondiente a la secuencia de la SEQ ID NO.10 (o una secuencia que tenga por lo menos un 90%, por lo menos un 92%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con respecto a la misma), que es una secuencia mejorada en codones para su expresión en bacterias. El plásmido puede comprender además un marcador de resistencia a los antibióticos. El antibiótico al que el plásmido puede conferir resistencia puede ser kanamicina, ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. En algunos casos, las células son células bacterianas. La bacteria puede serEscherichia coli.Las células transformadas pueden expandirse adicionalmente. La expansión de las células transformadas puede ser una expansión clonal. Las células expandidas pueden transferirse a un biorreactor de producción para su fermentación. La fermentación puede producirse en un biorreactor de 1500 L. En algunas realizaciones, la fermentación se produce en presencia del antibiótico al que el plásmido confiere resistencia. La fermentación de producción puede comprender una fase de crecimiento celular seguida de una fase de expresión. La fase de expresión puede comprender el uso de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) como inductor. El constructo de administración de IL-10 puede expresarse intracelularmente como cuerpos de inclusión insolubles. Al final de la producción, las células pueden recogerse por centrifugación. Esta centrifugación puede producir un primer sedimento que comprende las células. El primer sedimento puede volver a suspenderse en un primer tampón. El primer tampón puede comprender de 40 mM a 60 mM de Tris, preferiblemente 50 mM. El primer tampón puede variar de un pH de 7,5 a 8,5, preferiblemente un pH de 8,0. El primer tampón puede comprender además de 15 mM a 25 mM de EDTA, preferiblemente 20 mM de EDTA. La relación en peso entre las células del primer sedimento y el primer tampón puede ser de 1:4 a 1:6, preferiblemente 1:5. El primer sedimento puede mezclarse en el primer tampón durante 50 a 70 minutos, preferiblemente 60 minutos, hasta que se obtenga una mezcla homogénea.
[0437] En el paso202en laFIG. 2Ao el paso302en laFIG. 2B,las células cultivadas se altean, por ejemplo, mediante lisis para liberar los cuerpos de inclusión. El lisado puede comprender homogeneización a alta presión. La homogeneización a alta presión puede producirse en un microfluidizador. La homogeneización a alta presión puede producirse de 16.000 a 20.000 psi, o aproximadamente 18.000 psi. Pueden realizarse dos rondas de lisis para garantizar que se hayan lisado sustancialmente todas las células. Las células lisadas pueden centrifugarse a de 6000 a 10.000 rpm, o aproximadamente 8000 rpm. La centrifugación puede durar de 30 a 50 minutos, o aproximadamente 40 minutos, y puede producir un segundo sedimento.
[0439] Puede retirarse el sobrenadante y el segundo sedimento puede volver a suspenderse en un segundo tampón. El segundo tampón puede comprender de 40 mM a 60 mM de Tris, preferiblemente 50 mM. El segundo tampón puede variar de pH 7,5 a 8,5, preferiblemente un pH de 8,0. El segundo tampón puede comprender además de 15 mM a 25 mM de EDTA, preferiblemente 20 mM de EDTA. El segundo tampón puede comprender además de un 2% a un 3% de Trion X-100, preferiblemente un 2,5%. El segundo tampón puede comprender además de 450 mM a 550 mM de NaCl, preferiblemente 500 mM. La relación en peso entre el segundo sedimento y el segundo tampón puede ser de 1:4 a 1:6, preferiblemente 1:5. La resuspensión del segundo sedimento en el segundo tampón puede centrifugarse a de 6000 a 10.000 rpm, o aproximadamente 8000 rpm. La centrifugación puede durar de 15 a 25 minutos, o aproximadamente 20 minutos, y puede producir un tercer sedimento.
[0441] Puede retirarse el sobrenadante y el tercer sedimento puede volver a suspenderse en un tercer tampón. El tercer tampón puede comprender de 40 mM a 60 mM de Tris, preferiblemente 50 mM. El tercer tampón puede variar de pH 7,5 a 8,5, preferiblemente un pH de 8,0. El tercer tampón puede comprender además de 15 mM a 25 mM de EDTA, preferiblemente 20 mM de EDTA. La relación en peso entre el tercer sedimento y el tercer tampón puede ser de 1:4 a 1:6, preferiblemente 1:5. La resuspensión del tercer sedimento en el tercer tampón puede centrifugarse a de 6000 a 10.000 rpm, o aproximadamente 8000 rpm. La centrifugación puede durar de 15 a 25 minutos, o aproximadamente 20 minutos, y puede producir un cuarto sedimento.
[0443] El sobrenadante puede retirarse y puede volverse a suspender el cuarto sedimento en un cuarto tampón. El cuarto tampón puede comprender de 40 mM a 60 mM de Tris, preferiblemente 50 mM. El cuarto tampón puede variar de pH 7,5 a 8,5, preferiblemente un pH de 8,0. La relación en peso entre el cuarto sedimento y el cuarto tampón puede ser de 1:4 a 1:6, preferiblemente 1:5. La resuspensión del cuarto sedimento en el cuarto tampón puede centrifugarse a 6000-10.000 rpm, o aproximadamente 8000 rpm. La centrifugación puede durar de 35 a 55 minutos, o aproximadamente 45 minutos, y puede producir un quinto sedimento. El quinto sedimento puede comprender los cuerpos de inclusión que comprenden el complejo de administración de IL-10. El quinto sedimento que comprende los constructos de administración de IL-10 puede congelarse antes de su uso posterior. Los constructos pueden congelarse a entre -15 ºC y -25 ºC, preferiblemente a -20 ºC.
[0445] En el paso203de laFIG. 2Ao el paso303de laFIG. 2B,los cuerpos de inclusión con el constructo de administración de IL-10 se solubilizan usando una solución de solubilización. La solución de solubilización puede comprender un agente caotrópico. La solución de solubilización puede comprender el agente caotrópico en una concentración de 5 M a 8 M, de 6 M a 7 M, aproximadamente 6,6 M o aproximadamente 6 M. El agente caotrópico puede comprender clorhidrato de guanidina, urea o una combinación de los mismos. El agente caotrópico puede comprender una sal clorhidrato de guanidina. La solución de solubilización puede comprender además Tris. La solución de solubilización puede comprender Tris en una concentración de 40 mM a 60 mM, o de aproximadamente 50 mM. La solución de solubilización puede tener un pH de 7 a 9 o de aproximadamente 8. La solución de solubilización puede añadirse al sedimento que comprende los 10 constructos de administración obtenidos después de la lisis de la célula. La relación entre el sedimento que comprende los constructos de administración de IL-10 y la solución de solubilización puede ser de 1:8 a 1:12 o de aproximadamente 1:10 (p/p). Puede permitirse que la solubilización se mezcle durante por lo menos unos 60 minutos.
[0446] En algunas realizaciones, como se muestra en el paso204de laFIG.2A,el constructo de administración de IL-10 se modifica mediante un agente de sulfitólisis o un agente reductor. Dicha modificación puede producirse simultáneamente o posteriormente a la solubilización de los cuerpos de inclusión, tal como se representa en el paso203.En algunos casos, a la solución de solubilización se le añade un agente de sulfitólisis o un agente reductor antes de poner en contacto los cuerpos de inclusión con la solución de solubilización. En tales casos, los pasos de solubilización y sulfitólisis/reducción pueden producirse al mismo tiempo. En otras realizaciones, los cuerpos de inclusión se solubilizan primero en una solución de solubilización y, a continuación, se añade el agente de sulfitólisis o el agente reductor. Dicho de otro modo, el agente de sulfitólisis o reductor puede añadirse después de que se hayan solubilizado sustancialmente los constructos de administración de IL-10. En algunas realizaciones, el agente de sulfitólisis comprende sulfito de sodio. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede comprender la adición de sulfito de sodio a la solución de solubilización. En algunas realizaciones, a la solución de solubilización se le añaden de 30 mM a 50 mM, de 35 mM a 45 mM, de 38 mM a 42 mM, o aproximadamente 40 mM de sulfito de sodio. En algunas realizaciones, el método comprende incubar la solución de solubilización que comprende el sulfito de sodio durante 25 a 35 minutos o, más preferiblemente, durante aproximadamente 30 minutos. La incubación de la solución de solubilización que comprende el sulfito de sodio puede realizarse a temperatura ambiente. A continuación, a la solución de solubilización se la puede añadir tetrationato de potasio. El tetrationato de potasio puede añadirse a la solución de solubilización después de la adición del sulfito de sodio. En algunas realizaciones, a la solución de solubilización se añaden de 23 mM a 43 mM, de 28 mM a 38 mM, de 31 mM a 35 mM, o aproximadamente 33 mM de tetrationato de potasio. El tetrationato de potasio puede mezclarse con la solución de solubilización durante entre 55 y 65 minutos o aproximadamente 60 minutos. Esta mezcla e incubación puede realizarse a temperatura ambiente. Cuando se usa un agente de sulfitólisis para alterar los enlaces disulfuro pueden obtenerse mayores rendimientos de un constructo de administración de IL-10 en forma de dímero en comparación con cuando se usa DTT para alterar los enlaces disulfuro. Por ejemplo, el uso del agente de sulfitólisis puede dar como resultado, tras el replegamiento, un rendimiento del constructo de administración de IL-10 en forma de dímero que es por lo menos dos veces más alto que el rendimiento obtenido, tras el replegamiento, cuando se usa DTT para la reducción/alteración. Por ejemplo, cuando los constructos de administración de IL-10 se procesan usando DTT para la reducción, menos del 5% del rendimiento resultante de los constructos de administración de IL-10 puede estar en forma de dímero, mientras que los constructos de administración de IL-10 procesados usando un agente de sulfitólisis pueden dar como resultado más del 10% del rendimiento resultante de los constructos de administración de IL-10 en forma de dímero.
[0448] En algunas realizaciones, el paso204de laFIG. 2Aes opcional (o está explícitamente ausente). Dicho de otro modo, en algunas realizaciones, la IL-10 solubilizada, los constructos de administración de IL-10 o los cuerpos de inclusión solubilizados que contienen IL-10 o constructos de administración de IL-10 se procesan (por ejemplo, se clarifican, se concentran y/o se administran a una solución de replegamiento) sin tratamiento ni contacto con un agente reductor o un agente de sulfitólisis(FIG. 2B). En otras palabras, en algunas realizaciones, los cuerpos de inclusión (IB) se solubilizan con un agente caotrófico y posteriormente se diluyen en una solución de replegamiento (por ejemplo, un cóctel redox) sin someter los cuerpos de inclusión a un agente reductor o un agente de sulfitólisis.
[0450] El método puede comprender la clarificación de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos para producir constructos de administración de IL-10 clarificados (paso205en laFIG.2Ao paso304en laFIG.2B). La clarificación puede comprender la eliminación del material insoluble residual después de la solubilización y la sulfitólisis y puede realizarse antes de los pasos de purificación en sentido descendente posteriores. La clarificación puede comprender una filtración en profundidad. La clarificación puede comprender una clarificación primaria. La clarificación primaria puede comprender el filtrado de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos a través de un filtro con un tamaño nominal de 0,5 µm a 10 µm. La clarificación puede comprender una clarificación secundaria. La clarificación secundaria puede realizarse después de la clarificación primaria. La clarificación secundaria puede comprender el filtrado de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos a través de un filtro, tal como un filtro con un tamaño nominal de 0,2 µm a 2 µm. El método puede comprender además la realización de una filtración estéril de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos. La filtración estéril puede comprender la filtración a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm a 0,3 µm. El filtro puede ser un filtro de cápsula. La realización de la filtración estéril puede realizarse después de la clarificación.
[0452] El método puede comprender realizar un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede comprender la primera filtración de flujo tangencial (TFF-1) del paso206de laFIG.2A.El método puede comprender la realización de un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos. En algunas realizaciones, cuando no se usa un agente de sulfitólisis, el método no comprende un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento(FIG. 2B). Dicho de otro modo, en algunas realizaciones, el paso206está explícitamente ausente cuando también está ausente el paso205 (FIG.2A).
[0454] [0079] En algunos casos, la purificación sin el uso de un agente de sulfitólisis o un agente reductor produce un porcentaje más alto de dímeros del constructo de administración de IL-10 en comparación con la solubilización usando sulfitólisis o un agente reductor. En algunos casos, la purificación sin el uso de sulfitólisis o un agente reductor produce un mayor rendimiento del constructo de administración de IL-10 en comparación con la solubilización mediante sulfitólisis o con un agente reductor. En algunos casos, la purificación sin usar un agente de sulfitólisis o un agente reductor produce menos agregados de HMW de constructos de administración de IL-10 en comparación con la solubilización mediante sulfitólisis o un agente reductor.
[0456] Además, en algunas realizaciones, la purificación sin el uso de un agente de sulfitólisis o un agente reductor no requiere un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento, lo que puede acortar el proceso de purificación en aproximadamente 1 o 2 días. No realizar el paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede evitar una pérdida del 10% al 40%, del 10% al 15%, del 15% al 30% o del 30% al 35% del constructo de administración de IL-10 purificado con respecto a un proceso de purificación que incluye sulfitólisis y un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento.
[0458] El primer paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede realizarse después de la clarificación. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede realizarse después de la filtración estéril de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede comprender ultrafiltración. La ultrafiltración puede comprender la concentración de los constructos de administración de IL-10 a entre 15 mg/ml y 25 mg/ml, entre 18 mg/ml y 22 mg/ml, o aproximadamente 20 mg/ml. La ultrafiltración puede producirse a una presión transmembrana (TMP) de 10 a 20 psi, de 12 a 18 psi o de aproximadamente 15 psi. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede comprender diafiltración. La diafiltración puede producirse después de la ultrafiltración. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede comprender ultrafiltración y diafiltración (UF/DF). La diafiltración puede comprender un primer diavolumen, un segundo diavolumen, un tercer diavolumen, un cuarto diavolumen y un quinto diavolumen. El primer diavolumen, el segundo diavolumen, el tercer diavolumen, el cuarto diavolumen y el quinto diavolumen pueden comprender un tampón. El tampón puede comprender un agente caotrópico. El tampón puede comprender de 3,5 M a 4,5 M del agente caotrópico, preferiblemente 4 M. El agente caotrópico puede ser guanidina HCl. El tampón puede comprender Tris. El tampón puede comprender de 40 mM a 60 mM de Tris, preferiblemente 50 mM. El tampón puede tener un pH de 7 a 8,5. La diafiltración puede producirse a una presión transmembrana (TMP) de 10 a 20 psi, de 12 a 18 psi, o aproximadamente 15 psi.
[0460] El método puede comprender poner en contacto los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos con una solución de replegamiento para producir constructos de administración de IL-10 replegados (paso207en laFIG.2Ao paso305en laFIG.2B). Los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos pueden estar en un retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento de los constructos de administración de IL-10 solubilizados y/o reducidos. La solución de replegamiento puede comprender glutatión reducido y glutatión oxidado. La relación (p/p) entre el glutatión reducido y el glutatión oxidado puede ser de 0,8:1 a 1,2:1, preferiblemente 1:1. La relación molar entre el glutatión reducido y el glutatión oxidado puede ser de 0,8:2 a 1,1:2, preferiblemente 1:2. En algunas realizaciones, la solución de replegamiento comprende de 0,75 mM a 1,5 mM de glutatión reducido, preferiblemente 1,0 mM. En algunas realizaciones, la solución de replegamiento comprende de 0,25 mM a 0,75 mM de glutatión oxidado, preferiblemente 0,5 mM. En algunas realizaciones, la solución de replegamiento comprende arginina, sacarosa, Tris, EDTA o una combinación de los mismos. La solución de replegamiento puede comprender de 900 mM a 1,1 M de arginina, preferiblemente 1 M. En algunas realizaciones, la arginina es arginina-HCl. La solución de replegamiento puede comprender de 200 mM a 300 mM de sacarosa, preferiblemente 250 mM. La solución de replegamiento puede comprender de 75 mM a 125 mM de Tris, preferiblemente 100 mM. El Tris puede tener un pH de aproximadamente 8,5. La solución de replegamiento puede comprender de 1,75 mM a 2,25 mM de EDTA, preferiblemente 2 mM. En algunas realizaciones, la solución de replegamiento comprende polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, del 0,1% al 0,3% (p/p) de la solución de replegamiento es polietilenglicol (PEG), preferiblemente el 0,2%. El PEG puede ser PEG 3350. La solución de replegamiento puede tener un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5. La solución de replegamiento puede tener un pH de aproximadamente 8,0. La solución de replegamiento puede comprender un pH de aproximadamente 8,5. El retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento puede mezclarse con la solución de replegamiento en el transcurso de 50 a 70 minutos, preferiblemente 60 minutos, para alcanzar una concentración objetivo de los constructos de administración de IL-10 de 0,8 mg/ml a 1,2 mg/ml, preferiblemente 1 mg/ml. El contacto posterior con la solución de replegamiento puede producirse durante 12 a 18 horas. El contacto con la solución de replegamiento puede producirse durante por lo menos 16 horas. Durante el contacto, la solución de replegamiento puede estar a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC, o a aproximadamente 4 ºC. Antes del contacto, la solución de replegamiento puede enfriarse previamente a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC, o a aproximadamente 4 ºC. El contacto puede producir constructos de administración de IL-10 replegados.
[0462] El método puede comprender realizar un primer filtrado estéril de los constructos de administración de IL-10 replegados. El primer filtrado estéril puede comprender la filtración a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm a 0,3 µm, preferiblemente de 0,2 µm. El filtro puede ser un filtro de cápsula. El primer filtrado estéril de los constructos de administración de IL-10 replegados puede producirse antes de un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX).
[0463] En algunas realizaciones, los dímeros del constructo de administración de IL-10 pueden almacenarse en tampón, por ejemplo, a 25 ºC durante dos días. Dicho tampón puede comprender una sal tal como PBS 1X, 150 mM o 200 mM de NaCl tamponado en fosfato sódico 10 mM a pH 7,0. Los dímeros del constructo de administración de IL-10 pueden ser más estables cuando se almacenan en un tampón que comprende una sal como 1X PBS, 150 mM o 200 mM de NaCl tamponado en 10 mM de fosfato de sodio a pH 7,0 que en un tampón que comprende solo 10 mM de fosfato de sodio a pH 7,0.
[0465] El método puede comprender realizar un paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX). El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede comprender la segunda filtración de flujo tangencial (TFF-2) del paso208de laFIG.2Ao la primera filtración de flujo tangencial (TFF-1) del paso306de laFIG.
[0466] 2B.El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede producirse después del primer filtrado estéril. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede comprender ultrafiltración. La ultrafiltración puede producirse a una presión transmembrana (TMP) de 10 a 20 psi, de 12 a 18 psi, o de aproximadamente 15 psi. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede comprender diafiltración. La diafiltración puede producirse después de la ultrafiltración. El paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede comprender ultrafiltración y diafiltración (UF/DF). La diafiltración puede comprender un primer diavolumen, un segundo diavolumen, un tercer diavolumen y un cuarto diavolumen. El primer diavolumen y el segundo diavolumen pueden comprender un tampón frío (por ejemplo, de 2 a 8 grados C, o a aproximadamente 4 ºC). El tercer diavolumen y el cuarto diavolumen pueden comprender un tampón a temperatura ambiente. El tampón frío y el tampón a temperatura ambiente pueden comprender Tris y NaCl. El Tris puede estar en una concentración de 20 mM a 30 mM, preferiblemente de 25 mM. El NaCl puede estar en una concentración de 75 mM a 125 mM, preferiblemente de 100 mM. El tampón frío y el tampón a temperatura ambiente pueden estar a un pH de 7 a 8, preferiblemente de 7,5. El retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede mantenerse durante la noche a temperatura ambiente. El retentado obtenido después el paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede mantenerse durante la noche a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC o a aproximadamente 4 ºC. El retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede comprender el constructo de administración de IL-10 replegado.
[0468] El método puede comprender realizar un segundo filtrado estéril del constructo de administración de IL-10 replegado. El segundo filtrado estéril puede comprender el filtrado del retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm a 0,3 µm. El filtro puede ser un filtro de cápsula. El segundo filtrado estéril del constructo de administración de IL-10 replegado puede producirse después del paso de filtrado de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX).
[0470] En algunas realizaciones, los pasos del método, desde el replegamiento hasta, e incluyendo, el paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) se llevan a cabo a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC o de 3 ºC a 5 ºC. En algunas realizaciones, los pasos del método, desde el replegamiento hasta, e incluyendo, el paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) se llevan a cabo a una temperatura de aproximadamente 4 ºC. El método puede comprender la realización de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) (paso209en laFIG.2Ao paso307en laFIG. 2B)sobre el retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial entre los pasos de replegamiento y cromatografía de intercambio aniónico (AEX). La realización de la cromatografía AEX puede comprender la unión de los dímeros del constructo de administración de IL-10 a una columna de intercambio aniónico y, posteriormente, la elución de los dímeros del constructo de administración de IL-10 de la columna de intercambio aniónico. La realización de la cromatografía AEX sobre el grupo de constructos de administración de IL-10 puede crear de este modo una primera pluralidad de fracciones de constructos de administración de IL-10. La cromatografía AEX puede ser Capto™ Q ImpRes.
[0472] El porcentaje de constructos de administración de IL-10 en forma de dímero en cada fracción de la primera pluralidad de fracciones se determina usando, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), como la cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión por tamaño (SE-HPLC). El porcentaje de constructos de administración de IL-10 en forma de dímero puede compararse con un primer umbral. El primer umbral puede ser del 70%, por lo menos del 75%, por lo menos del 80%, por lo menos del 85% o por lo menos del 90%. Preferiblemente, el primer umbral puede ser del 75%. Cualquier fracción que contenga un porcentaje de dímeros de constructos de administración de IL-10 de más del umbral puede agruparse en un primer grupo enriquecido.
[0474] [0089] El método puede comprender realizar un paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica (CHT) en el primer grupo enriquecido (paso210en laFIG.2Ao paso308en laFIG.2B). La realización de la cromatografía CHT en el primer grupo enriquecido puede crear de este modo una segunda pluralidad de fracciones de constructos de administración de IL-10 en forma de dímero. En algunas realizaciones, la concentración de los constructos de administración de IL-10 en la segunda pluralidad de fracciones es de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml o de aproximadamente 20 mg/ml. En algunas realizaciones, el método no comprende cromatografía de intercambio catiónico. En algunas realizaciones, el método no comprende cromatografía de filtración en gel.
[0476] El porcentaje de constructos de administración de IL-10 en forma de dímero en cada fracción de la segunda pluralidad de fracciones se determina usando, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), como la cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión por tamaño (SE-HPLC). El porcentaje de constructos de administración de IL-10 en forma de dímero puede compararse con un segundo umbral. El segundo umbral puede ser por lo menos del 75%, por lo menos del 80%, por lo menos del 85%, por lo menos del 90% o por lo menos del 95%. Preferiblemente, el segundo umbral puede ser del 80%. Cualquier fracción que contenga un porcentaje de dímeros de constructos de administración de IL-10 de más del umbral puede agruparse en un segundo grupo enriquecido. El porcentaje de constructos de administración de IL-10 en el segundo grupo enriquecido puede ser mayor que el porcentaje de constructos de administración de IL-10 en el primer grupo enriquecido. El segundo grupo enriquecido puede comprender más del 80%, más del 85% o más del 90% de los constructos de administración de IL-10 en forma de dímero.
[0478] El método puede comprender un primer filtrado estéril del segundo grupo enriquecido. El primer filtrado estéril del segundo grupo enriquecido puede comprender el filtrado a través de un filtro, tal como un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm a 0,3 µm. El filtro puede ser un filtro de cápsula.
[0480] El método puede comprender realizar un paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica. El paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica puede comprender la tercera filtración de flujo tangencial (TFF-3) de la etapa211de laFIG.
[0481] 2Ao la segunda filtración de flujo tangencial (TFF-2) del paso309de laFIG.2B. El paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica puede comprender ultrafiltración. La ultrafiltración puede producirse a una presión transmembrana (TMP) de 10 a 20 psi, de 12 a 18 psi, o de aproximadamente 15 psi. El paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica puede comprender diafiltración. La diafiltración puede producirse después de la ultrafiltración. El paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica puede comprender ultrafiltración y diafiltración (UF/DF). La diafiltración puede comprender un primer diavolumen, un segundo diavolumen, un tercer diavolumen, un cuarto diavolumen y un quinto diavolumen. El primer diavolumen, el segundo diavolumen, el tercer diavolumen, el cuarto diavolumen y el quinto diavolumen pueden comprender un tampón. El tampón puede ser un tampón de liofilización. El tampón puede comprender una sal, un agente de carga y un osmolito. El tampón puede comprender de 8 mM a 12 mM de sal, preferiblemente 10 mM. El tampón puede comprender de un 1% a un 3% de agente de carga, preferiblemente un 2%. El tampón puede comprender de un 0,5% a un 1,5% de osmolito, preferiblemente un 1%. La sal puede ser fosfato de potasio. El agente de carga puede ser glicina. El osmolito puede ser sacarosa. El método puede comprender un segundo filtrado estéril. El segundo filtrado estéril puede realizarse después de la diafiltración. El método puede comprender la adición de un surfactante al tampón. El surfactante puede añadirse después del segundo filtrado estéril. Después de la adición del surfactante al tampón, el tampón puede comprender de un 0,2% a un 0,4% del surfactante, preferiblemente un 0,3%. El surfactante puede ser un poloxámero. El poloxámero puede ser poloxámero 188. En algunas realizaciones, la mezcla del tampón con los constructos de administración de IL-10 replegados puede ser la composición líquida descrita anteriormente en la presente. El paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica puede producirse después del primer filtrado estéril del segundo grupo enriquecido. El método puede comprender realizar un segundo filtrado estéril del segundo grupo enriquecido. El segundo filtrado estéril puede comprender la filtración a través de un filtro, tal como un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm a 0,3 µm, preferiblemente de 0,2 µm. El filtro puede ser un filtro de cápsula. El segundo filtrado estéril puede producirse después del paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica. El retentado obtenido después de la tercera filtración de flujo tangencial puede congelarse a entre -70 ºC y -90 ºC, preferiblemente a -80 ºC. El retentado obtenido después del paso de filtración de flujo tangencial después del paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica puede ser la composición líquida descrita en la presente. El retentado obtenido después de la tercera filtración de flujo tangencial puede comprender más del 80%, más del 85% o más del 90% de los constructos de administración de IL-10 en forma de dímero.
[0483] En algunos casos, el método puede comprender realizar una cromatografía de intercambio catiónico, por ejemplo, con una columna Sulfate 650F. El paso de cromatografía de intercambio catiónico puede realizarse después de un paso de cromatografía de intercambio aniónico y un paso de purificación con hidroxiapatita cerámica (CHT), antes de un paso de cromatografía de intercambio aniónico y un paso de purificación con hidroxiapatita cerámica (CHT), o entre un paso de cromatografía de intercambio aniónico y un paso de purificación con hidroxiapatita cerámica (CHT). Como se muestra en el Ejemplo 39 y en la Tabla 61, la realización de un paso de cromatografía de intercambio catiónico, seguido de un paso de cromatografía de intercambio aniónico y un paso de purificación con hidroxiapatita cerámica (CHT), dio como resultado la recuperación del 20% de los dímeros del constructo de administración de IL-10 con una pureza del 96%.
[0484] Formulaciones orales
[0485] Las soluciones de la presente que comprenden altos niveles de una forma dimérica de IL-10 (ya sea sola o como parte de un constructo de administración de IL-10) pueden procesarse adicionalmente para su administración oral.
[0486] En primer lugar, tales soluciones pueden secarse mediante un proceso que no implique la concentración del constructo de administración de IL-10 en una solución, los ejemplos de dicho proceso incluyen la liofilización (secado por congelación, FD) o el secado por atomización (SD), para producir una forma seca o sólida de la composición de IL-10/constructo de administración de IL-10. El secado por congelación puede realizarse uszando un liofilizador con colector múltiple Virtis Advantage, con software Intellitronics. Los viales de vidrio que contienen una formulación proteica terapéutica congelada pueden taparse parcialmente con un tapón de neopreno para liofilización y, a continuación, colocarse en frascos conectados al colector de liofilización y al vacío (por ejemplo, 1-100 militorrs o menos) durante aproximadamente 12-48 horas. La composición liofilizada puede usarse para producir una formulación en cápsulas o comprimidos. En algunas realizaciones, más del 80%, más del 85% o más del 90% de la IL-10 en la composición liofilizada se encuentra en forma de dímero.
[0487] Una formulación que comprende IL-10 puede administrarse al intestino delgado o al colon en una formulación descrita en la presente. La formulación puede administrarse por vía oral o rectal. En algunas realizaciones, dichas formulaciones pueden facilitar el paso del constructo a través de la barrera celular epitelial intestinal (por ejemplo, mediante transcitosis), lo que de otro modo podría impedir que se alcance el pleno potencial terapéutico de la IL-10. Además, la administración dirigida de IL-10 directamente al tejido gastrointestinal por vía oral puede evitar los efectos secundarios que se experimentan con la administración sistémica y puede traducirse en concentraciones mucosas más altas y reducciones clínicamente significativas de la inflamación y la enfermedad.
[0488] Formulaciones orales recubiertas para la administración dirigida en el tracto gastrointestinal
[0489] En la presente se contemplan formulaciones orales que comprenden una carga útil terapéutica y uno o más excipientes que proporcionan un perfil de liberación mejorado que permite la administración selectiva de cualquier carga útil a una cierta región dentro del tracto gastrointestinal (GI) de un sujeto. Preferiblemente, las formulaciones orales están configuradas para la liberación específica en el sitio de la carga útil terapéutica en el íleon terminal, el colon proximal o el colon distal. ElEJEMPLO 13describe formulaciones orales recubiertas configuradas para la liberación específica en el tracto gastrointestinal
[0490] Las cargas útiles contempladas en la presente pueden ser de cualquier naturaleza, incluyendo las terapéuticas, las diagnósticas y las de imagenología. Una carga útil puede formar parte de un constructo de administración. Un constructo de administración puede incluir un portador acoplado a una carga útil heteróloga. La carga útil puede estar acoplada al portador de forma directa o indirecta, covalente o no covalente. Cuando se une de forma covalente, una carga útil puede unirse directamente a un portador o a través de un espaciador. Aunque en una realización la carga útil es una proteína terapéutica como IL-10 o un constructo de administración de IL-10 (como los constructos de administración de IL-10 descritos en la presente), la divulgación de la presente no está limitada a ninguna proteína terapéutica, portador o carga útil.
[0491] La formulación oral para la administración de una carga útil, como una proteína terapéutica, al tracto gastrointestinal inferior puede comprender una cápsula o comprimido con un recubrimiento configurado para que se disuelva a un pH que se encuentra en el intestino delgado o el colon, que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el recubrimiento está configurado para que no se disuelva en el pH altamente ácido del estómago, que puede variar de un pH de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3,5.
[0492] [0100] Una formulación oral de la presente puede estar configurada para pasar a través del estómago sin liberar la carga útil en una medida apreciable. La liberación de la carga útil puede producirse después de la disolución total o parcial de por lo menos un recubrimiento de una cápsula o comprimido que comprenda la carga útil. La liberación de la carga útil puede producirse después del daño de una cápsula o comprimido, incluyendo el daño microscópico, de manera que la cápsula o comprimido pueda parecer intacto. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1% o el 0% de la carga útil en el estómago. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar la carga útil en regiones específicas dentro del intestino delgado o el colon, como el íleon terminal, el colon proximal y el colon distal. El íleon terminal, o el extremo distal del intestino delgado, se interseca con el colon, y la inflamación en esta localización a menudo puede estar asociada con trastornos gastrointestinales como la enfermedad de Crohn. Por lo tanto, la liberación específica en el íleon terminal de cargas útiles terapéuticas con propiedades antiinflamatorias puede ser deseable como forma de tratar dichos trastornos. La formulación oral puede estar configurada para liberar entre aproximadamente un 20% y el 100% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,0 durante un periodo de 2 a 8 horas. La solución puede ser un tampón de citrato/fosfato al pH adecuado. La solución puede ser un fluido digestivo. El fluido digestivo puede ser ácido estomacal, jugo intestinal (succus entericus)o una combinación de los mismos. El fluido digestivo puede comprender enzimas digestivas. El fluido digestivo se encuentra en el estómago, el intestino delgado, el colon o una combinación de los mismos.
[0493] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar del 80% al 100% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente a un pH de 7,0, durante 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar del 75% al 100%, del 75% al 85%, o del 85% al 95% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de 6,9 a 7,1, preferiblemente a un pH de 7,0, durante 2 horas. La formulación oral puede configurarse para liberar por lo menos el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente a un pH de 7,0, durante 2 horas. En algunos casos, la exposición a la solución puede realizarse a 37 ºC.
[0494] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar entre el 80% y el 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente un pH de 7,0, durante un periodo de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 75% a un 100%, de un 75% a un 85%, o de un 85% a un 95% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente un pH de 7,0, durante 2 horas. La formulación oral puede configurarse para liberar por lo menos un 80%, un 85%, un 90% o un 95% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente un pH de 7,0, durante 2 horas. En algunos casos, la exposición a la solución puede realizarse a 37 ºC.
[0495] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 50% a un 100% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante aproximadamente de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 50% a un 95%, de un 60% a un 70%, o de un 75% a un 90% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de 6,4 a 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante 2 o 3 horas. La formulación oral puede configurarse para liberar por lo menos un 60%, un 65%, un 70%, un 75%, un 80%, un 85% o un 90% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de 6,4 a 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante 2 o 3 horas. En algunos casos, la exposición a la solución puede realizarse a 37 ºC.
[0496] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 50% a un 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante aproximadamente de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 50% a un 95%, de un 60% a un 70%, o de un 75% a un 90% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 6,4 a 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante 2 o 3 horas. La formulación oral puede configurarse para liberar por lo menos un 60%, un 65%, un 70%, un 75%, un 80%, un 85% o un 90% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 6,4 a 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante 2 o 3 horas. En algunos casos, la exposición a la solución puede realizarse a 37 ºC.
[0497] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 20% a un 100% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante aproximadamente de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 20% a un 80%, o de un 20% a un 30%, de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de 5,9 a 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante 2 o 3 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar por lo menos un 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la carga útil terapéutica después de la exposición a una solución a un pH de 5,9 a 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante 2 o 3 horas. En algunos casos, la exposición a la solución puede realizarse a 37 ºC.
[0498] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 20% a un 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante aproximadamente de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 20% a un 80%, o de un 20% a un 30%, de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 5,9 a 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante 2 o 3 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar por lo menos un 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 5,9 a 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante 2 o 3 horas. En algunos casos, la exposición a la solución puede realizarse a 37 ºC.
[0499] [0107] La formulación oral puede ser un sólido. La formulación oral puede comprender una composición liofilizada o una composición secada por atomización. La composición liofilizada o la composición secada por atomización pueden comprender la proteína terapéutica y uno o más de los excipientes. La composición liofilizada o la composición secada por atomización pueden ser un polvo. La composición liofilizada o la composición secada por atomización pueden comprender micropartículas. Las micropartículas pueden tener un diámetro de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 500 µm, de aproximadamente 5 µm a aproximadamente 250 µm, de aproximadamente 5 µm a aproximadamente 100 µm, de aproximadamente 5 µm a aproximadamente 50 µm, o de aproximadamente 5 µm a aproximadamente 15 µm. La composición liofilizada o una composición secada por atomización puede comprender gránulos. La formulación oral sólida puede ser una cápsula. La cápsula puede encapsular la composición liofilizada. La formulación oral sólida puede ser un comprimido. La formulación oral puede presentarse en forma de dosis unitaria.
[0500] La formulación oral puede comprender de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 100 mg, o de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg de la proteína terapéutica. La formulación oral puede comprender aproximadamente 1 mg, 5 mg o 20 mg de proteína terapéutica. En algunas realizaciones, entre aproximadamente un 32% y aproximadamente un 42% (p/p) de la composición liofilizada es proteína terapéutica.
[0501] Uno o más de los excipientes pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en un surfactante, un osmolito, un agente de carga, una sal o una combinación de los mismos. El excipiente o excipientes pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en fosfato de potasio, glicina, sacarosa y poloxámero 188. El excipiente o excipientes pueden comprender además un excipiente de compactación.
[0502] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes pueden ser un osmolito. Los osmolitos pueden usarse en formulaciones farmacéuticas que comprenden proteínas para mejorar la estabilidad de las proteínas y disminuir la agregación de proteínas. El osmolito puede ser un aminoácido (por ejemplo, prolina o glicina), una metilamina (por ejemplo, betaína o N-óxido de trimetilamina) o un poliol o azúcar (por ejemplo, sorbitol o sacarosa). El osmolito puede ser sacarosa, trehalosa, glicina, manitol, histidina, dextrosa/dextrano, arginina, maltosa, sorbitol, taurina, glicina betaína, sarcosina, rafinosa, glicerol, prolina, fructano, L-glutamato, lactosa o una combinación de los mismos. El osmolito puede ser sacarosa. La formulación oral puede comprender una relación en peso entre el osmolito y la proteína terapéutica de aproximadamente 0,3:1 a aproximadamente 0,7:1, de aproximadamente 0,4:1 a aproximadamente 0,6:1, de aproximadamente 0,45:1 a aproximadamente 0,55:1, de aproximadamente 0,49:1 a aproximadamente 0,51:1, o más preferiblemente de aproximadamente 0,5:1. En algunas realizaciones, entre aproximadamente el 15% y aproximadamente el 21% (p/p) de la composición liofilizada es osmolito.
[0503] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes pueden incluir un surfactante. Los surfactantes pueden usarse en formulaciones orales sólidas que comprenden proteínas, como una cápsula o un comprimido, para mejorar la disgregación de la formulación oral sólida y aumentar la solubilidad de las proteínas. El surfactante puede ser polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero 188 o una combinación de los mismos. La formulación oral puede comprender una relación en peso entre el surfactante y la proteína terapéutica de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 0,19:1, de aproximadamente 0,12:1 a aproximadamente 0,18:1, de aproximadamente 0,14:1 a aproximadamente 0,16:1, o más preferiblemente de aproximadamente 0,15:1. En algunas realizaciones, el surfactante es entre aproximadamente el 4,5% y aproximadamente el 6,5% (p/p) de la composición liofilizada. El surfactante puede ser un copolímero no iónico. El copolímero no iónico puede comprender una cadena central de polioxipropileno flanqueada por dos cadenas de polioxietileno. El copolímero no iónico puede ser un poloxámero. El uso de un poloxámero como excipiente en las composiciones descritas en la presente puede promover o mantener la dimerización de la IL-10 o el constructo de administración de IL-10 con respecto al uso de otros surfactantes, como un polisorbato.
[0504] El poloxámero puede comprender una masa molecular de polioxipropileno de 1600 g/mol a 2000 g/mol. El poloxámero puede comprender de un 70% a un 90% de polioxietileno. El poloxámero puede ser poloxámero 188. En algunas realizaciones, el surfactante no es un polisorbato, como el polisorbato 80 (por ejemplo, Tween 80) o el polisorbato 20 (por ejemplo, Tween 20). Una composición de constructo de administración de IL-10 que comprende un poloxámero como excipiente puede tener una mayor cantidad de IL-10 en forma de dímero con respecto a una composición de constructo de administración de IL-10 que comprende un polisorbato como excipiente. Una composición de constructo de administración de IL-10 que comprende un poloxámero como excipiente puede tener una cantidad reducida de IL-10 en forma de agregado o monómero con respecto a una composición de constructo de administración de IL-10 que comprende un polisorbato como excipiente.
[0505] Uno o más de los excipientes pueden incluir una sal. La sal puede ser fosfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio o una combinación de los mismos. La sal puede ser fosfato de potasio. La formulación oral puede tener una relación en peso entre la sal y la proteína terapéutica de aproximadamente 0,03:1 a aproximadamente 0,1:1, de aproximadamente 0,05:1 a aproximadamente 0,09:1, de aproximadamente 0,06:1 a aproximadamente 0,08:1, o más preferiblemente de aproximadamente 0,07:1. En algunas realizaciones, entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 3% (p/p) de la composición liofilizada es sal.
[0506] Uno o más de los excipientes pueden incluir hidróxido de sodio. La formulación oral puede tener una relación en peso entre un hidróxido de sodio y la proteína terapéutica de aproximadamente 0,03:1 a aproximadamente 0,1:1, de aproximadamente 0,05:1 a aproximadamente 0,09:1, de aproximadamente 0,06:1 a aproximadamente 0,08:1, o más preferiblemente de aproximadamente 0,07:1. En algunas realizaciones, entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 3% (p/p) de la composición liofilizada es hidróxido de sodio.
[0507] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes pueden incluir un agente de carga. Los agentes de carga pueden usarse para aumentar el tamaño de una formulación oral para facilitar la fabricación. El agente de carga puede ser almidón, lactosa, dextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, rafinosa, trehalosa, glicina, manitol o una combinación de los mismos. El agente de carga puede ser glicina. La formulación oral puede comprender una relación en peso entre el agente de carga y la proteína terapéutica de aproximadamente 0,7:1 a aproximadamente 1,3:1, de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1, de aproximadamente 0,9:1 a aproximadamente 1,1:1, o más preferiblemente de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, entre aproximadamente el 32% y aproximadamente el 42% (p/p) de la composición liofilizada es agente de carga. En algunas realizaciones, el agente tampón es un osmolito.
[0509] La composición liofilizada puede almacenarse a entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC. La composición liofilizada puede almacenarse a entre aproximadamente -15 ºC y aproximadamente -25 ºC. La composición liofilizada puede ser estable a entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC con humedad relativa ambiental durante por lo menos 12 meses. En algunas realizaciones, cuando la proteína terapéutica se encuentra en forma de dímero, la composición liofilizada es estable si no hay más de un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20% o 25% de disminución en la cantidad de dímeros de proteína terapéutica después de un año de almacenamiento a una temperatura de aproximadamente 2 ºC a aproximadamente 8 ºC. En algunas realizaciones, cuando la proteína terapéutica se encuentra en forma de dímero, la composición liofilizada es estable si no hay una disminución de más de un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20% o 25% en la cantidad de dímeros de proteína terapéutica después de un año de almacenamiento a una temperatura de aproximadamente -15 ºC a aproximadamente -25 ºC. En algunas realizaciones, la composición liofilizada se compacta en un comprimido o se llena en una cápsula para producir la formulación oral descrita en la presente.
[0511] En ciertas realizaciones, en la presente se describen además composiciones líquidas que comprenden la proteína terapéutica y uno o más de los excipientes que pueden liofilizarse para producir la composición liofilizada descrita en la presente. La proteína terapéutica puede ser un constructo de administración de IL-10 como se describe en la presente. La composición líquida puede comprender un tampón de liofilización y el constructo de administración de IL-10. La composición líquida puede comprender de 15 mg/ml a 25 mg/ml del constructo de administración de IL-10, preferiblemente aproximadamente 20 mg/ml. La composición líquida puede comprender de 1,51 mg/ml a 1,91 mg/ml de fosfato de potasio, preferiblemente aproximadamente 1,71 mg/ml. La composición líquida puede comprender de 15 mg/ml a 25 mg/ml de glicina, preferiblemente aproximadamente 20 mg/ml. La composición líquida puede comprender de 8 mg/ml a 12 mg/ml de sacarosa, preferiblemente aproximadamente 10 mg/ml. La composición líquida puede comprender de 2,5 mg/ml a 3,5 mg/ml de poloxámero 188, preferiblemente aproximadamente 3 mg/ml. La composición líquida puede tener un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5, o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. La composición líquida puede tener un pH de aproximadamente 7,4 y aproximadamente 7,6.
[0513] La composición líquida puede ser estable entre aproximadamente -80 ºC y aproximadamente -60 ºC con humedad relativa ambiental durante por lo menos 12 meses. En algunas realizaciones, no hay más de un 2% de disminución en el porcentaje de la proteína terapéutica en la forma dimérica de la composición líquida después de 7 días a 4 ºC. La composición líquida puede congelarse para producir una composición de proteína terapéutica congelada. La composición líquida puede congelarse a una temperatura de aproximadamente -85 ºC a aproximadamente -15 ºC. En algunas realizaciones, la composición de proteína terapéutica congelada se descongela antes de la liofilización.
[0515] En algunas realizaciones, la composición liofilizada se encapsula en una cápsula. La cápsula puede tener un tamaño de 000, 00, 0, 1, 2, 3, 4 o 5. La cápsula puede ser una cápsula de dos piezas. La cápsula puede ser una cápsula de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), también denominada cápsula de hipromelosa.
[0517] Alternativamente, la composición liofilizada puede comprimirse bajo una fuerza de compresión para producir un comprimido. La fuerza de compresión puede variar de 1500 libras-fuerza (lbf) a 4000 lbf, o de 2000 lbf a 3500 lbf. La fuerza de compresión puede ser de 1500 lbf, 2000 lbf, 2500 lbf, 3000 lbf, 3500 lbf o 4000 lbf. El comprimido puede tener un peso de 150 mg a 1000 mg, de 150 mg a 500 mg, de 200 mg a 400 mg, de 150 mg a 250 mg, de 175 mg a 225 mg o de 190 mg a 210 mg. El comprimido puede tener un diámetro de 0,2'' a 0,4'', de 0,25'' a 0,35'' o de 0,3'' a 0,25''. El comprimido puede comprender de 1 mg a 5 mg, de 1 mg a 10 mg, de 1 mg a 20 mg, de 20 mg a 50 mg, de 20 mg a 100 mg, o de 50 mg a 100 mg del constructo de administración de IL-10. El comprimido puede comprender aproximadamente 1 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg o aproximadamente 30 mg del constructo de administración de IL-10. El comprimido puede comprender de 4,5 mg a 5,5 mg, de 9,5 mg a 10,5 mg, de 19 mg a 21 mg o de 29 mg a 31 mg de IL-10 o de constructo de administración de IL-10. El comprimido puede comprender de 3 mg a 9 mg, de 4 mg a 8 mg o de 5 mg a 7 mg de IL-10 o de constructo de administración de IL-10. El comprimido puede ser redondo, oblongo, ovalado, circular o tener cualquier otra forma adecuada.
[0519] Cuando la formulación oral es un comprimido, uno o más de los excipientes pueden incluir un excipiente de compactación. Uno o más de los excipientes pueden comprender 1, 2, 3, 4 o más de 4 excipientes de compactación.
[0520] El excipiente de compactación puede ser un disgregante, un agente aglutinante, un lubricante o una combinación de los mismos. La formulación oral puede comprender una relación en peso entre la composición liofilizada descrita anteriormente y el excipiente de compactación de aproximadamente 0,8:3 a aproximadamente 1,2:3, de aproximadamente 0,9:3 a aproximadamente 1,1:3, de aproximadamente 0,95:3 a aproximadamente 1,05:3, o más preferiblemente de aproximadamente 1:3. El constructo de administración de IL-10 puede comprender entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 15% (p/p) del comprimido. En algunas realizaciones, el excipiente de compactación no forma parte de la composición líquida. En algunas realizaciones, la composición liofilizada no incluye el excipiente de compactación.
[0522] Los excipientes de compactación pueden comprender un disgregante. Un disgregante puede facilitar la dispersión o la ruptura de una formulación oral. El disgregante puede comprender celulosa microcristalina (MCC), celulosa microcristalina silicificada (SMCC), almidón, glicolato de almidón sódico, veegum, bentonita, ácido algínico, alginato cálcico, croscarmelosa sódica (carboximetilcelulosa sódica reticulada), crospovidona (polivinilpirrolidona reticulada) o una combinación de los mismos.
[0524] Los excipientes de compactación pueden comprender un agente aglutinante. Un agente aglutinante puede mantener unidos los componentes de una formulación oral. El agente aglutinante puede comprender un disacárido, un polisacárido, una proteína o un polímero. El disacárido puede ser sacarosa o lactosa. La lactosa puede ser lactosa monohidrato. El polisacárido puede ser almidón, celulosa o un derivado de los mismos. La proteína puede ser gelatina. El polímero puede ser polivinilpirrolidona (PVP) o polietilenglicol (PEG).
[0526] Los excipientes de compactación pueden ser un lubricante. Un lubricante puede reducir la fricción y la cohesión entre partículas en una formulación oral. El lubricante puede comprender estearato de magnesio, behenato de glicerilo, dibehenato de glicerilo, fumarato de estearilo sódico, ácido esteárico, talco, sílice, estearato de calcio, carbonato de magnesio, aceite hidrogenado, aceite mineral, polietilenglicol (PEG), monoestearato de glicerilo o una combinación de los mismos. El lubricante puede ser un surfactante no iónico. El surfactante no iónico puede ser behenato de glicerilo. El behenato de glicerilo puede ser dibehenato de glicerilo. En algunas realizaciones, el lubricante no es un surfactante iónico, como estearato de magnesio, fumarato de estearilo sódico y lauril sulfato de sodio. En algunas realizaciones, el uso de un surfactante no iónico, como el behenato de glicerilo o el dibehenato de glicerilo, en la generación de un comprimido da como resultado un perfil de disolución mejorado del comprimido en comparación con si en la generación del comprimido se usa un surfactante iónico, como estearato de magnesio, fumarato de estearilo sódico o lauril sulfato de sodio,. Dicho de otro modo, el uso de un surfactante no iónico, como el behenato de glicerilo o el dibehenato de glicerilo, puede dar como resultado una formulación en la que una concentración más alta del constructo de administración de IL-10 permanece en forma de dímero durante un período de tiempo más largo en comparación con una formulación correspondiente que usa un surfactante iónico, como el estearato de magnesio, el fumarato de estearilo sódico o el lauril sulfato de sodio.
[0528] En algunas realizaciones, uno o más de los excipientes de compactación se combinan con la composición liofilizada descrita anteriormente antes de compactarla en un comprimido o llenar una cápsula. En algunas realizaciones, una composición para compactar puede comprender de aproximadamente un 6% a aproximadamente un 10% (p/p) de la composición liofilizada y de aproximadamente un 90% a aproximadamente un 94% (p/p) de uno o más excipientes de compactación. En algunas realizaciones, una composición para compactar puede comprender de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15% (p/p) de la composición liofilizada y de aproximadamente un 85% a aproximadamente un 95% (p/p) de uno o más excipientes de compactación. Uno o más de los excipientes de compactación pueden comprender por lo menos dos disgregantes.
[0530] En algunas realizaciones, los gránulos se forman durante el proceso de elaboración de una formulación oral. Por ejemplo, en algunos casos, en la producción de comprimidos hay dos fases que usan un proceso de granulación: una fase intragranular (IG) y una fase extragranular (EG). En la fase intragranular, la composición liofilizada y un primer subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación pueden homogeneizarse y granularse con un aglutinante para producir una composición homogeneizada que luego puede comprimirse (por ejemplo, mediante compactación con rodillos) y molerse en gránulos. En la fase extragranular, los gránulos secos pueden homogeneizarse con un segundo subconjunto de uno o más excipientes de compactación y comprimirse en una formulación oral, como un comprimido.
[0532] [0127] Los gránulos producidos en la fase intragranular pueden comprender una relación en peso entre un primer subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación y el polvo liofilizado que comprende el constructo de administración de IL-10 de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 11:1, de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 10:1, o de aproximadamente 8,5:1 a aproximadamente 9,5:1. En algunas realizaciones, el primer subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación puede comprender por lo menos dos disgregantes. En algunas realizaciones, el primer subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación puede comprender una relación en peso entre un primer disgregante y un segundo disgregante de aproximadamente 21:1 a aproximadamente 24:1, de aproximadamente 22:1 a aproximadamente 23,5:1, o de aproximadamente 22,3:1 a aproximadamente 23:1. El primer disgregante puede ser celulosa microcristalina silicificada (SMCC) o fosfato dicálcico/celulosa microcristalina (DCP/MCC). El segundo disgregante puede comprender crospovidona o croscarmelosa sódica. En algunas realizaciones, el primer subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación comprende un lubricante. La relación en peso entre los por lo menos dos disgregantes y el lubricante en el primer subconjunto de uno o más de los excipientes puede ser de aproximadamente 61:1 a aproximadamente 81:1, de aproximadamente 66:1 a aproximadamente 76:1, o de aproximadamente 71:1 a aproximadamente 73:1. El lubricante puede comprender dibehenato de glicerilo. El lubricante puede comprender behenato de glicerilo.
[0534] La fase extragranular puede comprender una relación en peso entre los gránulos producidos en la fase intragranular y el segundo subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 5:1, o de aproximadamente 3,5:1 a aproximadamente 4,5:1. En algunas realizaciones, el segundo subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación puede comprender por lo menos dos disgregantes. En algunas realizaciones, el segundo subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación puede comprender una relación en peso entre un primer disgregante y un segundo disgregante de aproximadamente 13,5:1 a aproximadamente 24:1, de aproximadamente 16:1 a aproximadamente 21,5:1, o de aproximadamente 17,5:1 a aproximadamente 19:1. El primer disgregante puede ser SMCC o DCP/MCC. El segundo disgregante puede comprender crospovidona o croscarmelosa sódica. En algunas realizaciones, el segundo subconjunto de uno o más de los excipientes de compactación comprende un lubricante. La relación en peso entre los por lo menos dos disgregantes y el lubricante, en el segundo subconjunto de uno o más de los excipientes, puede ser de aproximadamente 69:1 a aproximadamente 89:1, de aproximadamente 74:1 a aproximadamente 84:1, o de aproximadamente 77:1 a aproximadamente 81:1. El lubricante puede comprender behenato de glicerilo. El behenato de glicerilo puede comprender dibehenato de glicerilo. En algunas realizaciones, los excipientes de compactación pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en SMCC, crospovidona y behenato de glicerilo.
[0536] En algunas realizaciones, la formulación oral puede comprender una relación en peso de uno o más entre los excipientes de compactación y la composición liofilizada de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 14:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 13:1, o de aproximadamente 11:1 a aproximadamente 12:1. En algunas realizaciones, la formulación oral puede comprender una relación en peso entre un primer disgregante de uno o más de los excipientes de compactación y la composición liofilizada de aproximadamente 8,8:1 a aproximadamente 12,8:1, de aproximadamente 9,8:1 a aproximadamente 11,8:1, o de aproximadamente 10,4:1 a aproximadamente 11,2:1. En algunas realizaciones, la formulación oral puede comprender una relación en peso entre la composición liofilizada y un segundo disgregante de uno o más de los excipientes de compactación de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 2,5:1, de aproximadamente 1,75:1 a aproximadamente 2,25:1, o de aproximadamente 1,9:1 a aproximadamente 2,1:1.
[0538] En algunas realizaciones, la formulación oral puede comprender una relación en peso entre la composición liofilizada y un lubricante de uno o más de los excipientes de compactación de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8,1:1, de aproximadamente 5,5:1 a aproximadamente 8,1:1, o de aproximadamente 6,2:1 a aproximadamente 6,6:1.
[0540] La formulación oral puede comprender una primera capa que comprenda un primer copolímero, un segundo copolímero o una mezcla del primer copolímero y el segundo copolímero. La formulación oral puede comprender una primera capa de acetato succinato de hipromelosa (HPMCAS o HPMC-AS). La primera capa puede tener un espesor sustancialmente equivalente a de 20 mg a 200 mg, de 20 mg a 40 mg, de 50 mg a 70 mg, de 115 mg a 135 mg, o de 175 mg a 185 mg de la primera capa en una cápsula de tamaño 1. La primera capa puede tener un espesor sustancialmente equivalente a de 55 mg a 65 mg de la primera capa en una cápsula de tamaño 1. La primera capa puede tener un espesor sustancialmente equivalente a de 20 mg a 200 mg, de 20 mg a 40 mg, de 50 mg a 80 mg, de 115 mg a 135 mg, o de 175 mg a 185 mg de la primera capa en una cápsula de tamaño 0. La primera capa puede tener un espesor sustancialmente equivalente a entre 70 mg y 80 mg de la primera capa en una cápsula de tamaño 0. La primera capa puede tener una masa de 20 mg a 200 mg, de 20 mg a 40 mg, de 50 mg a 80 mg, de 115 mg a 135 mg, o de 175 mg a 185 mg.
[0542] El área superficial de una cápsula de tamaño 1 puede ser de aproximadamente 410 mm<2>. El área superficial de una cápsula de tamaño 0 puede ser de aproximadamente 500 mm<2>. Un espesor de recubrimiento de 0,15 mg/mm<2>puede ser equivalente a un peso de recubrimiento de 60 mg en una cápsula de tamaño 1 o a un peso de recubrimiento de 75 mg en una cápsula de tamaño 0. En algunas realizaciones, la cápsula tiene un espesor de recubrimiento de 0,1 mg/mm<2>a 0,2 mg/mm<2>, preferiblemente de 0,15 mg/mm<2>. En algunas realizaciones, el espesor del recubrimiento de una cápsula puede ser de 4 mg/cm<2>a 20 mg/cm<2>, de 4 mg/cm<2>a 6 mg/cm<2>, de 5 mg/cm<2>a 10 mg/cm<2>, o de 5 mg/cm<2>a 20 mg/cm<2>. El espesor del recubrimiento puede ser el espesor del primer recubrimiento.
[0544] En algunas realizaciones, el comprimido tiene un espesor de recubrimiento de 0,1 mg/mm<2>a 0,2 mg/mm<2>, de 0,1 mg/mm<2>a 0,5 mg/mm<2>, o de 0,1 mg/mm<2>a 1,0 mg/mm<2>, preferiblemente de 0,15 mg/mm<2>. En algunas realizaciones, el espesor del recubrimiento de un comprimido puede ser de 4 mg/cm<2>a 20 mg/cm<2>, de 4 mg/cm<2>a 6 mg/cm<2>, de 5 mg/cm<2>a 10 mg/cm<2>, o de 5 mg/cm<2>a 20 mg/cm<2>. El espesor del recubrimiento puede ser el espesor del primer recubrimiento.
[0545] El primer copolímero puede tener una disolución nominal individual de pH>5,5. El pH de disolución nominal indica el pH al que el copolímero se vuelve soluble. El primer copolímero puede comprender ácido metacrílico y acrilato de etilo. El primer polímero puede tener una masa molecular media en peso de 200.000 g/mol a 450.000 g/mol, o de 250.000 g/mol a 400.000 g/mol, o de 280.000 g/mol a 370.000 g/mol, o de 300.000 g/mol a 340.000 g/mol. El primer polímero puede comprender una relación entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster en el primer copolímero de 0,8:1 a 1,2:1. El primer copolímero puede comprender un polímero de fórmula I, en la que x, y y n son cada uno mayores o iguales a uno. El primer copolímero puede comprender Eudragit® L 30 D-55.
[0548]
[0551] El segundo copolímero puede tener una disolución nominal a pH > 7,0. El segundo copolímero puede comprender ácido metacrílico, metacrilato de metilo y acrilato de metilo. El segundo polímero puede tener una masa molecular media en peso de 160.000 g/mol a 400.000 g/mol o de 200.000 g/mol a 360.000 g/mol, o de 240.000 g/mol a 320.000 g/mol, o de 260.000 g/mol a 300.000 g/mol. El segundo polímero puede comprender una relación entre grupos carboxilo libres y grupos éster en el segundo copolímero de 0,8:1 a 1,2:1. El segundo polímero puede comprender un polímero de fórmula II, en la que x, y, z y n son cada uno mayores o iguales a uno. El segundo copolímero puede comprender Eudragit® FS 30 D.
[0554]
[0557] El segundo copolímero puede ser diferente del primer copolímero. El pH de disolución nominal de una mezcla del primer copolímero y el segundo copolímero puede ser diferente del pH de disolución nominal del primer copolímero o del segundo copolímero individualmente. Por ejemplo, el pH de disolución nominal de una mezcla del primer copolímero y el segundo copolímero puede ser una disolución nominal entre las disoluciones nominales del primer copolímero y el segundo copolímero. La primera capa puede comprender una cantidad igual del segundo copolímero con respecto a una cantidad del primer copolímero. La primera capa puede comprender una mayor cantidad del segundo copolímero con respecto a una cantidad del primer copolímero. La relación en peso entre un primer copolímero y el segundo copolímero puede ser aproximadamente o estar entre cualquiera de las siguientes: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 o 0:100. La relación en peso de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D puede ser de aproximadamente 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 o 0:100.
[0559] La relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa puede ser de 0:100 a 100:0. La relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa puede ser de 45:55 a 55:45, de 25:75 a 35:65, de 15:85 a 25:75 o de 15:85 a 0:100.
[0560] En algunas realizaciones, una relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa de 45:55 a 55:45 con un espesor de recubrimiento equivalente de 40 mg a 70 mg en una cápsula de tamaño 1 da como resultado la liberación de la carga útil terapéutica en el íleon terminal. En algunas realizaciones, una relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero de 50:50 con un espesor de recubrimiento de aproximadamente 0,15 mg/mm<2>da como resultado la liberación de la carga útil terapéutica en el íleon terminal.
[0561] En algunas realizaciones, una relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa de 15:85 a 25:75 con un espesor de recubrimiento equivalente de aproximadamente 118 mg a 138 mg en una cápsula de tamaño 1 da como resultado la liberación de la carga útil terapéutica en el colon distal.
[0562] En algunas realizaciones, una relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa de 15:85 a 25:75, con un espesor de recubrimiento equivalente de 40 mg a 70 mg en una cápsula de tamaño 1, da como resultado la liberación de la carga útil terapéutica en el colon proximal. En algunas realizaciones, una relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero de 20:80 con un espesor de recubrimiento de aproximadamente 0,15 mg/mm<2>da como resultado la liberación de la carga útil terapéutica en el colon proximal.
[0563] La primera capa puede comprender además un agente antiadherente, un plastificante, un surfactante o una combinación de los mismos. El agente antiadherente puede ser monoestearato de glicerol. El plastificante puede ser citrato de trietilo. El surfactante puede ser polisorbato 80.
[0564] En algunas realizaciones, de un 5% a un 15% (p/p) de la primera capa es una mezcla del agente antiadherente, el plastificante y el surfactante. En algunas realizaciones, de un 40% a un 50% (p/p) de la primera capa es primer copolímero. En algunas realizaciones, de un 40% a un 50% (p/p) de la primera capa es segundo copolímero. En algunas realizaciones, la relación en peso entre el primer copolímero y el segundo copolímero con respecto a la mezcla del agente antiadherente, el plastificante y el surfactante es de 8:1 a 10:1, de 8,5:1 a 9,5:1 o de 8,8:1 a 9,2:1.
[0565] En algunas realizaciones, de un 5% a un 15% (p/p) de la primera capa es una mezcla de monoestearato de glicerol, citrato de trietilo y polisorbato 80. En algunas realizaciones, de un 40% a un 50% (p/p) de la primera capa es un primer copolímero que comprende ácido metacrílico y acrilato de etilo. En algunas realizaciones, de un 40% a un 50% (p/p) de la primera capa es un segundo copolímero que comprende ácido metacrílico, metacrilato de metilo y acrilato de metilo.
[0566] Como se ha descrito con anterioridad, la formulación oral puede comprender una primera capa de acetato succinato de hipromelosa (HPMCAS o HPMC-AS). La primera capa de HPMCAS puede comprender una mezcla de un primer HPMCAS y un segundo HPMCAS. El primer HPMCAS puede volverse soluble a un pH de más de o igual a 6,8. El segundo HPMCAS puede volverse soluble a un pH de más de o igual a 6,0. El primer HPMCAS puede comprender HPMCAS-HF. El segundo HPMCAS puede comprender HPMCAS-MF. La relación entre el primer HPMCAS y el segundo HPMCAS puede ser de aproximadamente 40:60 a aproximadamente 60:40 o de aproximadamente 45:55 a aproximadamente 55:45.
[0567] En algunas realizaciones, la formulación oral puede ser una formulación oral tal como se representa en laFIG. 31A. La formulación oral3200puede comprender una cápsula o un comprimido, en la que la cápsula o el comprimido comprenden una región interior3201que comprende la proteína terapéutica y uno o más de los excipientes. La formulación oral3200puede comprender una primera capa3203.La primera capa3203puede comprender una mezcla del primer copolímero y el segundo copolímero. La primera capa3203puede comprender además un agente antiadherente, un plastificante y un surfactante. La formulación oral3200puede comprender además una segunda capa3202.La segunda capa3202puede comprender hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). La segunda capa puede sellar una costura de la cápsula. En algunas realizaciones, la cápsula es una cápsula de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). La formulación oral3200puede comprender una tercera capa3204.La tercera capa3204puede comprender HPMC. En algunas realizaciones, la primera capa3203,la segunda capa3202,la tercera capa o la combinación de las mismas se aplican a la cápsula o comprimido mediante recubrimiento por atomización. En algunas realizaciones, se recubre por atomización una solución de HPMC con una concentración de HPMC de un 6,5% a un 8,5% (p/p) sobre la cápsula o el comprimido para aplicar la segunda capa3202,la tercera capa o tanto la segunda capa3202como la tercera capa. En algunas realizaciones, la segunda capa3202comprende de 9 mg a 13 mg, de 10 mg a 12 mg, o de 10,5 mg a 11,5 mg de HPMC en una cápsula de tamaño 0. A otros tamaños de cápsulas se les pueden aplicar pesos de capa equivalentes de la segunda capa3202. En algunas realizaciones, la tercera capa3204comprende de 9 mg a 13 mg, de 10 mg a 12 mg, o de 10,5 mg a 11,5 mg de HPMC en una cápsula de tamaño 0. A otros tamaños de cápsulas se les pueden aplicar pesos de recubrimiento equivalentes de la tercera capa3204.
[0568] [0146] En algunas realizaciones, la formulación oral puede ser una formulación oral tal como se representa en laFIG. 31B.La formulación oral3205puede comprender una cápsula o un comprimido, en la que la cápsula o el comprimido comprenden una región interior 3201 que comprende la proteína terapéutica y uno o más de los excipientes. La formulación oral3200puede comprender una primera capa3203.La primera capa3203puede comprender una mezcla del primer copolímero y el segundo copolímero. La primera capa3203puede comprender además un agente antiadherente, un plastificante y un surfactante. En algunas realizaciones, la formulación oral3205no comprende una segunda capa ni una tercera capa.
[0569] La formulación oral puede tener una vida útil de por lo menos 3 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 12 meses, por lo menos 18 meses o por lo menos 24 meses. La vida útil puede evaluarse almacenando un comprimido durante el periodo de tiempo indicado, retirando el recubrimiento del comprimido, disolviendo el núcleo interno del comprimido y evaluando el porcentaje de dímeros como se describe en la presente.
[0570] La formulación oral puede configurarse para que libere de aproximadamente un 20% a un 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,0 durante un periodo de 2 a 8 horas a 37 ºC. La solución puede ser un tampón de citrato/fosfato con el pH adecuado. La solución puede ser un fluido digestivo. El fluido digestivo puede ser ácido estomacal, jugo intestinal (succus entericus)o una combinación de los mismos. El fluido digestivo puede contener enzimas digestivas. El fluido digestivo se encuentra en el estómago, el intestino delgado, el colon o una combinación de los mismos. La IL-10 puede presentarse en forma de un constructo de administración de IL-10.
[0571] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 80% a un 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente un pH de 7,0, durante un periodo de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 75% a un 100%, de un 75% a un 85%, o de un 85% a un 95% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, preferiblemente un pH de 7,0, durante 2 horas. La formulación oral puede configurarse para liberar por lo menos un 80%, 85%, 90% o 95% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de entre 6,9 y 7,1 aproximadamente, preferiblemente un pH de 7,0, durante 2 horas.
[0572] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 50% a un 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante aproximadamente de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 50% a un 95%, de un 60% a un 70%, o de un 75% a un 90% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 6,4 y aproximadamente 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante 2 o 3 horas. La formulación oral puede configurarse para liberar por lo menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 6,4 a 6,6, preferiblemente un pH de 6,5, durante 2 o 3 horas.
[0573] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada para liberar de un 20% a un 100% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante aproximadamente de 2 a 8 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar de un 20% a un 80%, o de un 20% a un 30%, de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 5,9 a 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante 2 o 3 horas. La formulación oral puede estar configurada para liberar por lo menos un 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la IL-10 después de la exposición a una solución a un pH de 5,9 a 6,1, preferiblemente un pH de 6,0, durante 2 o 3 horas.
[0574] En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada de tal manera que de un 20% a un 30% de la IL-10 liberada después de la exposición a la solución a un pH de aproximadamente 6,5 a 7,0 durante 2 horas se encuentra en forma de dímero. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada de tal manera que por lo menos un 15%, 20%, 25% o 30% de la IL-10 liberada después de la exposición a la solución a un pH de aproximadamente 6,5 a 7,0 durante 2 horas se encuentra en forma de dímero. En algunas realizaciones, la formulación oral está configurada de tal manera que no más de un 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la IL-10 liberada después de la exposición a la solución a un pH de aproximadamente 6,5 a 7,0 durante 2 horas se encuentra en forma de dímero. En algunas realizaciones, después de la inmersión de la formulación oral en una solución a un pH de 7,0, el porcentaje de IL-10 en forma de dímero es de por lo menos un 35%, 40%, 45% o 50%.
[0575] La formulación oral que comprende constructos de administración de IL-10 puede formularse de manera que por lo menos un 15% de los constructos de administración de IL-10 permanezcan en forma de dímero después de una incubación de cinco minutos con fluido intestinal simulado (SIF)/pancreatina. El ensayo de pancreatina comprende incubar la formulación oral que comprende la proteína terapéutica con pancreatina (10 µg) en PBS (100 µl) a 37 ºC.
[0576] La formulación oral puede comprender de 0,3 mg a 10 mg, de 0,3 mg a 5 mg, de 0,3 mg a 3 mg, de 1 mg a 3 mg, de 1 mg a 5 mg, de 1 mg a 10 mg, de 1 mg a 20 mg, de 20 mg a 50 mg, de 20 mg a 100 mg, o de 50 mg a 100 mg de los constructos de administración de IL-10. La formulación oral puede comprender 0,3 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg o 20 mg de los constructos de administración de IL-10.
[0577] [0155] La formulación oral que comprende un constructo de administración de IL-10 puede tener una vida útil de por lo menos 3 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 12 meses, por lo menos 18 meses o por lo menos 24 meses. La formulación oral que comprende un constructo de administración de IL-10 puede ser estable a una temperatura específica (por ejemplo, 2-8 ºC o temperatura ambiente) durante un período de tiempo específico (por ejemplo, durante por lo menos 1 mes, 3 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 12 meses, por lo menos 18 meses o por lo menos 24 meses). Por ejemplo, la formulación oral que comprende un constructo de administración de IL-10 puede tener una estabilidad suficiente para que el porcentaje de constructos de administración de IL-10 en forma de dímero no disminuya en más de un 1%, 2%, 3%, 4% o 5% cuando se almacena a una temperatura específica (por ejemplo, 2-8 ºC o temperatura ambiente) durante un período de tiempo específico (por ejemplo, durante por lo menos 1 mes, 3 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 12 meses, por lo menos 18 meses o por lo menos 24 meses). En algunas realizaciones, la formulación oral es lo suficientemente estable como para que el nivel de dímeros del constructo de administración de IL-10 en la formulación oral se mantenga por encima del 80%, por encima del 85% o por encima del 90% después de que haya transcurrido el periodo de tiempo.
[0579] En ciertas realizaciones, se describen en la presente kits que comprenden por lo menos una forma de dosificación unitaria de la formulación oral descrita en la presente. Las formas farmacéuticas unitarias pueden presentarse en un envase, un dispositivo dispensador o un frasco. El envase puede comprender una lámina de metal o plástico. Un ejemplo de envase puede incluir, pero no se limita a, un envase blíster. El frasco puede ser de polietileno de alta densidad (HDPE). El frasco puede comprender además un sello de inducción. Las formas farmacéuticas unitarias pueden envasarse dentro del kit por separado (por ejemplo, en diferentes unidades de un envase blíster) o juntas (por ejemplo, combinadas en un único recipiente, como un frasco). El kit puede comprender además instrucciones para utilizar las formas farmacéuticas unitarias para el tratamiento de un trastorno que provoca inflamación. El kit puede comprender un aviso asociado al recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos. La agencia gubernamental puede ser la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. El aviso puede ser un prospecto aprobado del producto.
[0581] Tratamiento
[0583] En ciertas realizaciones, en la presente se describen métodos para tratar una enfermedad o afección en un individuo que lo necesite. El individuo puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un primate. El primate puede ser un ser humano. El individuo puede ser un individuo al que se le ha diagnosticado, o se sospecha que tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección. La enfermedad o afección puede ser una enfermedad o afección que provoque inflamación de un tejido de un individuo, también denominada trastorno inflamatorio. La enfermedad o afección que provoca la inflamación puede ser una enfermedad o afección caracterizada por una deficiencia en la expresión de IL-10. El tratamiento de la enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) puede comprender la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-10 o un constructo de administración de IL-10 a un individuo que padezca o se sospeche que padezca, o que esté en recaída de la enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio).
[0585] El término "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente, puede significar que la cantidad, por ejemplo, de IL-10 o de un constructo de administración de IL-10, contenida en una composición, por ejemplo, una formulación o una formulación oral descrita en la presente, administrada es suficiente para lograr el propósito pretendido como, por ejemplo, tratar una enfermedad o afección, por ejemplo, una enfermedad o afección que provoque inflamación. En algunas realizaciones, la administración de una formulación a un individuo comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación al individuo.
[0587] El individuo que lo necesite puede ser un individuo refractario o resistente a por lo menos un agente antiinflamatorio. El agente antiinflamatorio puede ser un aminosalicilato. El aminosalicilato puede ser ácido 5-aminosalicílico (5-ASA; mesalazina), ácido 4-aminosalicílico (4-ASA), balsalazida, olsalazina, sulfasalazina o una combinación de los mismos. El agente antiinflamatorio puede ser un corticosteroide. El corticosteroide puede ser un corticosteroide administrado por vía oral o un corticosteroide administrado por vía intravenosa (IV). El corticosteroide puede ser prednisona. El agente antiinflamatorio puede ser un agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser azatioprina, 6-mercaptopurina o una combinación de los mismos. El agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de TNFα. El inhibidor de TNFα puede ser adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab o una combinación de los mismos. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de la Janus quinasas (JAK). El inhibidor de la JAK puede ser filgotinib, upadacitinib, peficitinib, tofacitinib o una combinación de los mismos. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un antagonista del receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P). El antagonista del receptor de S1P puede ser ozanimod, amiselimod, etrasimod o una combinación de los mismos. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un bloqueador de integrina. El bloqueador de integrina puede ser etrolizumab, natalizumab, vedolizumab, abrilumab, carotegrast metilo o una combinación de los mismos. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de IL-23. El inhibidor de IL-23 puede ser ustekinumab, mirikizumab, brazikumab, guselkumab, risankizumab o una combinación de los mismos. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4). El por lo menos un inhibidor de la PDE4 puede ser apremilast, cilomilast, roflumilast, tetomilast, rolipram o una combinación de los mismos. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser laquinimod.
[0589] En algunos casos, el individuo que lo necesite puede ser un individuo que no ha sido tratado con un agente antiinflamatorio. En algunos casos, el individuo que lo necesite puede ser un individuo que no ha sido tratado con 5ASA. En algunos casos, el individuo que lo necesite puede ser un individuo que ha respondido parcial o sustancialmente al 5-ASA. En algunos casos, el individuo que lo necesite puede ser tratado con un constructo de administración de IL-10 y 5-ASA.
[0591] En algunas realizaciones, las formulaciones orales que comprenden un constructo de administración de IL-10 descrito en la presente se administran por vía oral a una persona que lo necesite. En algunas realizaciones, las formulaciones que comprenden un constructo de administración de IL-10 descrito en la presente se administran por vía rectal a una persona que lo necesite. Las formulaciones que comprenden el constructo de administración de IL-10 pueden administrarse al individuo durante por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días. La formulación puede administrarse una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. La persona que lo necesite puede ser un humano. Una persona que lo necesite puede ser una persona a la que se le ha diagnosticado, se sospecha o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección que provoque inflamación. La enfermedad o afección que provoca inflamación puede ser una enfermedad o afección caracterizada por una deficiencia en la expresión de IL-10. La enfermedad o afección que provoca inflamación puede ser colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad celíaca, proctitis, pouchitis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), artritis reumatoide, artritis psoriásica o psoriasis. La colitis ulcerosa puede ser colitis ulcerosa de leve a moderada o colitis ulcerosa de moderada a grave. La enfermedad de Crohn puede ser enfermedad de Crohn fistulizante. En algunas realizaciones, la formulación oral se usa en el tratamiento del trastorno que provoca la inflamación. La formulación oral puede usarse para tratar el trastorno que provoca la inflamación. El método puede comprender administrar a un individuo una dosis de una formulación oral que comprende IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. La administración de la dosis de la formulación oral al individuo puede dar como resultado una respuesta inmunomoduladora.
[0593] La respuesta inmunomoduladora puede comprender una disminución de la concentración de calprotectina fecal (FCP) con respecto a un valor inicial de FCP. La calprotectina fecal es un biomarcador de la inflamación intestinal. La concentración de FCP puede determinarse a partir de una muestra fecal o a partir de una biopsia de colon. La concentración de FCP puede determinarse mediante un inmunoensayo. El inmunoensayo puede ser un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). En algunas realizaciones, la concentración de FCP se expresa en mg de calprotectina por kilogramo de heces o en µg de calprotectina por gramo de heces. La disminución de la concentración de FCP puede ser una disminución de por lo menos un 20%, 30%, 40% o 50% con respecto al valor inicial de FCP. La disminución de la concentración de FCP puede ser una disminución de aproximadamente un 50% y aproximadamente un 80% con respecto al valor inicial de FCP. En algunas realizaciones, la concentración de FCP se reduce a 50 µg/g o menos. En algunas realizaciones, la disminución de la concentración de FCP indica una disminución de la inflamación gastrointestinal.
[0595] El valor inicial del FCP puede ser una concentración inicial de FCP en un individuo o población antes de la administración. La concentración inicial de FCP puede ser indicativa de la presencia de una enfermedad. Una concentración inicial de FCP indicativa de una enfermedad puede ser una concentración de FCP de más de 150 µg/g. En algunas realizaciones, una concentración de FCP de más de 150 µg/g es indicativa de colitis ulcerosa (CU). En algunas realizaciones, la concentración de FCP se reduce por lo menos un 50% con respecto a la concentración inicial de FCP y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3 mg.
[0597] El valor inicial de FCP puede ser una valor inicial de FCP ajustado al placebo. El valor inicial de FCP ajustado al placebo puede ser un cambio porcentual de la concentración de FCP después de la administración de un placebo a un individuo o población con respecto a la concentración inicial de FCP antes de la administración. En algunas realizaciones, la concentración de FCP en un individuo o población tratados con un constructo de administración de IL-10 se reduce por lo menos en un 20% con respecto al valor inicial de FCP ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral del constructo de administración de IL-10 es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3 mg.
[0599] En un ejemplo ilustrativo, un individuo o población al que se le administra un placebo comienza con una concentración de FCP de 200 µg/g y aumenta a 250 µg/g después de la administración del placebo (lo que representa un aumento del 25%) y un individuo o población al que se le administra un constructo de administración de IL-10 comienza con una concentración de FCP de 200 µg/g y disminuye a 100 µg/g después de la administración de un constructo de administración de IL-10 (lo que representa una disminución del 50%). En este ejemplo, se puede decir que la concentración de FCP del constructo de administración de IL-10 administrado al individuo o población: (i) tiene una reducción del 50% en la concentración de FCP cuando el valor inicial de FCP es una concentración inicial de FCP en el constructo de administración de IL-10 administrado individualmente o a la población antes de la administración, o (ii) tiene una reducción del 75% (50% 25%) en la concentración de FCP cuando el valor inicial de FCP es el valor inicial de FCP ajustado al placebo.
[0601] [0166] En otro ejemplo ilustrativo, un individuo o población al que se le administra un placebo comienza con una concentración de FCP de 200 µg/g y disminuye a 150 µg/g después de la administración de un placebo (lo que representa una disminución del 25%) y un individuo o población al que se le administra un constructo de administración de IL-10 comienza con una concentración de FCP de 200 µg/g y disminuye a 100 µg/g después de la administración de un constructo de administración de IL-10 (lo que representa una disminución del 50%). En este ejemplo, se puede decir que la concentración de FCP del individuo o población al que se le administra el constructo de administración de IL-10: (i) tiene una reducción del 50% en la concentración de FCP cuando el valor inicial de FCP es una concentración inicial de FCP en el constructo de administración de IL-10 administrado al individuo o a la población antes de la administración, o (ii) tiene una reducción del 25% (50% - 25%) en la concentración de FCP cuando el valor inicial de FCP es el valor inicial de FCP ajustado al placebo.
[0603] La respuesta inmunomoduladora puede comprender una disminución de la concentración de proteína C reactiva (CRP) con respecto a un valor inicial de CRP. La proteína C reactiva (CRP) es un biomarcador de inflamación sistémica. La concentración de CRP puede determinarse a partir de una muestra de sangre. La concentración de CRP puede ser una concentración sérica de CRP. La concentración de CRP puede determinarse mediante un inmunoensayo o un ensayo nefelométrico. El inmunoensayo puede ser un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). La disminución de la concentración de CRP puede ser una disminución de por lo menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% con respecto al valor inicial de CRP. La disminución de la concentración de CRP puede ser de aproximadamente un 5% a un aproximadamente 60%, de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50%, de aproximadamente un 30% a aproximadamente un 90%, o de aproximadamente un 40% a aproximadamente un 80% con respecto al valor inicial de CRP. En algunas realizaciones, la concentración de CRP se reduce a menos de 5 mg/l. En algunas realizaciones, la disminución de la concentración de CRP indica una disminución de la inflamación sistémica o gastrointestinal.
[0605] El valor inicial de CRP puede ser una concentración inicial de CRP en un individuo o población antes de la administración. La concentración inicial de CRP puede ser indicativa de la presencia de una enfermedad. Una concentración inicial de CRP indicativa de una enfermedad puede ser una concentración de CRP de más de 5 mg/l. En algunas realizaciones, una concentración de CRP de más de 5 mg/l es indicativa de enfermedad intestinal irritable (EII). En algunas realizaciones, la concentración de CRP se reduce por lo menos un 40% con respecto a la concentración inicial de CRP y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3 mg.
[0607] El valor inicial de CRP puede ser una valor inicial de CRP ajustado al placebo. El valor inicial de CRP ajustado al placebo puede ser un cambio porcentual de la concentración de CRP después de la administración de un placebo a un individuo o población a los que se les ha administrado placebo con respecto a la concentración inicial de CRP antes de la administración. En algunas realizaciones, la concentración de CRP en un individuo o población tratados con un constructo de administración de IL-10 se reduce por lo menos un 10% con respecto al valor inicial de CRP ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral del constructo de administración de IL-10 es de aproximadamente 3 mg. En algunas realizaciones, la concentración de CRP en un individuo o población tratados con un constructo de administración de IL-10 se reduce por lo menos un 40% con respecto al valor inicial de CRP ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral del constructo de administración de IL-10 es de aproximadamente 1 mg.
[0609] En un ejemplo ilustrativo, un individuo o población a la que se le ha administrado un placebo comienza con una concentración de CRP de 8 mg/l y aumenta a 10 mg/l después de la administración del placebo (lo que representa un aumento del 25%), y un individuo o población a la que se le ha administrado un constructo de administración de IL-10 comienza con una concentración de CRP de 8 mg/l y disminuye a 4 mg/l después de la administración del constructo de administración de IL-10 (lo que representa una disminución del 50%). En este ejemplo, se puede decir que la concentración de CRP del individuo o población a la que se le ha administrado el constructo de administración de IL-10: (i) tiene una reducción del 50% en la concentración de CRP cuando el valor inicial de CRP es una concentración inicial de CRP en el individuo o población a la que se les ha administrado el constructo de administración de IL-10 antes de la administración, o (ii) tiene una reducción del 75% (50% 25%) en la concentración de CRP cuando el valor inicial de CRP es el valor inicial de CRP ajustado al placebo.
[0611] En otro ejemplo ilustrativo, un individuo o población a la que se les ha administrado un placebo comienza con una concentración de CRP de 8 mg/l y disminuye a 6 mg/l después de la administración del placebo (lo que representa una disminución del 25%), y un individuo o población a la que se le ha administrado un constructo de administración de IL-10 comienza con una concentración de CRP de 8 mg/l y disminuye a 4 mg/l después de la administración del constructo de administración de IL-10 (lo que representa una disminución del 50%). En este ejemplo, se puede decir que la concentración de CRP del individuo o población a la que se le ha administrado el constructo de administración de IL-10: (i) tiene una reducción del 50% en la concentración de CRP cuando el valor inicial de CRP es una concentración inicial de CRP en el individuo o población a la que se le ha administrado el constructo de administración de IL-10 antes de la administración, o (ii) tiene una reducción del 25% (50% - 25%) en la concentración de CRP cuando el valor inicial de CRP es el valor inicial de CRP ajustada al placebo.
[0613] [0172] La respuesta inmunomoduladora puede comprender una disminución del índice de Geboes con respecto al índice de Geboes de referencia. El sistema de índice de Geboes es una medida estándar de la respuesta histológica (Geboes et al. Gut. Septiembre de 2000; 47(3):404-9). Tal como se usa en la presente, un índice de Geboes puede ser un sistema de puntuación histológica de 0 a 22 puntos en el que las puntuaciones más altas representan una enfermedad más grave. El valor inicial del índice de Geboes puede ser un índice de Geboes inicial de un individuo o una población antes de la administración. El valor inicial del índice de Geboes puede ser un valor inicial del índice de Geboes ajustado al placebo. El valor inicial del índice de Geboes ajustado al placebo puede ser la diferencia entre el índice de Geboes después de la administración de un placebo a un individuo o población y el índice de Geboes inicial antes de la administración del placebo. En algunas realizaciones, el índice de Geboes se reduce por lo menos 2 unidades con respecto al valor inicial del índice de Geboes ajustado al placebo y la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg.
[0614] En un ejemplo ilustrativo, un individuo o población a la que se le ha administrado un placebo comienza con una índice de Geboes de 10, que aumenta a 12 después de la administración del placebo (lo que representa un aumento de 2 unidades o del 20%), y un individuo o población a la que se le administra un constructo de administración de IL-10 comienza con un índice de Geboes de 10, que disminuye a 5 después de la administración del constructo de administración de IL-10 (lo que representa una disminución de 5 unidades o del 50%). En este ejemplo, se puede decir que el índice de Geboes del individuo al que se le ha administrado el constructo de administración de IL-10: (i) tiene una disminución de 5 unidades o del 50% cuando el valor inicial del índice de Geboes es el índice de Geboes inicial del individuo al que se le ha administrado el constructo de administración de IL-10, o (ii) tiene una disminución de 7 unidades o del 70% (50% 20%) cuando el valor inicial del índice de Geboes es el índice de Geboes de referencia ajustado al placebo.
[0615] En otro ejemplo ilustrativo, un individuo o población a la que se le ha administrado un placebo comienza con un índice de Geboes de 10, que disminuye a 8 después de la administración del placebo (lo que representa una disminución de 2 unidades o del 20%), y un individuo o población a la que se le ha administrado un constructo de administración de IL-10 comienza con un índice de Geboes de 10, que disminuye a 5 después de la administración del constructo de administración de IL-10 (lo que representa una disminución de 5 unidades o del 50%). En este ejemplo, se puede decir que el índice de Geboes del individuo enfermo: (i) tiene una disminución de 5 unidades o del 50% cuando el valor inicial del índice de Geboes es el índice de Geboes inicial del individuo al que se le ha administrado el constructo de administración de IL-10, o (ii) tiene una disminución de 3 unidades o del 30% (50% - 20%) cuando el valor inicial del índice de Geboes es el valor inicial del índice de Geboes ajustado al placebo.
[0616] En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende una disminución de la concentración de FCP con respecto a un valor inicial de FCP y una disminución de la concentración de CRP con respecto a un valor inicial de CRP. En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende una disminución de la concentración de FCP con respecto a un valor inicial de FCP y una disminución del índice de Geboes con respecto a un valor inicial de índice de Geboes. En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende una disminución en la concentración de CRP con respecto a un valor inicial de CRP y una disminución en el índice de Geboes con respecto a un valor inicial del índice de Geboes. En algunas realizaciones, la respuesta inmunomoduladora comprende una disminución en la concentración de FCP con respecto a un valor inicial de FCP, una disminución en la concentración de CRP con respecto a un valor inicial de CRP y una disminución en el índice de Geboes con respecto a un valor inicial del índice de Geboes.
[0617] El tejido colónico de un individuo con un trastorno inflamatorio gastrointestinal puede mostrar infiltración de lalámina propiapor células mononucleares, eosinófilos e histiocitos, o una combinación de los mismos, además de infiltración neutrofílica en el epitelio asociada con la destrucción de la arquitectura de las criptas, erosiones y ulceraciones. La administración de un constructo de administración de IL-10 a un individuo puede dar como resultado una reducción de la infiltración de lalámina propiapor células mononucleares, eosinófilos e histiocitos, o una combinación de los mismos, además de la infiltración neutrofílica en el epitelio asociada con la destrucción de la arquitectura de las criptas, erosiones y ulceraciones.
[0618] En algunas realizaciones, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2% o menos del 1% de la IL-10 del constructo de administración de IL-10 entra en el torrente sanguíneo.
[0619] En algunas realizaciones, las formulaciones orales que comprenden un constructo de administración de IL-10 descrito en la presente se administran por vía oral a un individuo que lo necesite. Las formulaciones que comprenden el constructo de administración de IL-10 pueden administrarse al individuo durante por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días. La formulación puede administrarse una vez al día.
[0620] [0179] La administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una formulación oral de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 60 mg a un individuo puede dar como resultado un aumento de más del 20% en la concentración plasmática de IL-1Ra en el individuo con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra. En algunas realizaciones, la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es la concentración plasmática de IL-1Ra del individuo antes de la administración. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg y el aumento en la concentración plasmática de IL-1Ra con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es de más del 30%. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg y el aumento en la concentración plasmática de IL-1Ra con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es del 30% al 45%. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 10 mg y el aumento en la concentración plasmática de IL-1Ra con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es del 30% al 35%. En algunas realizaciones, la dosis de la formulación oral es de aproximadamente 30 mg y el aumento de la concentración plasmática de IL-1Ra con respecto a la concentración plasmática de referencia de IL-1Ra es del 40% al 43%. La dosis de la formulación oral puede referirse a la cantidad de IL-10 o a un constructo de administración de IL-10 en la formulación oral.
[0621] La administración de la dosis de la formulación oral al individuo puede dar como resultado una concentración plasmática de IL-10 en el individuo que no exceda de 1500 pg/ml, 1000 pg/ml, 900 pg/ml, 800 pg/ml, 700 pg/ml, 600 pg/ml, 500 pg/ml, 400 pg/ml, 300 pg/ml, 200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml o 10 pg/ml. La administración de la dosis de la formulación oral al individuo puede dar como resultado una concentración plasmática de IL-10 en el individuo que no exceda de 1500 pg/ml. La administración de la dosis de la formulación oral al individuo puede dar como resultado una concentración plasmática de IL-10 en el individuo que no exceda de 1000 pg/ml. La administración de la dosis de la formulación oral al individuo puede dar como resultado una concentración plasmática de IL-10 en el individuo que no exceda de 500 pg/ml. La administración de la dosis de la formulación oral al individuo puede dar como resultado una concentración plasmática de IL-10 en el individuo que no exceda de 100 pg/ml.
[0622] La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo puede dar como resultado un aumento de la concentración de IL-1Ra en el plasma del individuo de por lo menos 5000 pg/ml con respecto al nivel de referencia de IL-1Ra. El nivel de referencia de IL-1Ra puede ser una concentración típica de IL-1Ra en el plasma del individuo antes de la administración. La concentración de IL-1Ra puede alcanzar un máximo de por lo menos 5000 pg/ml, 6000 pg/ml, 7000 pg/ml, 8000 pg/ml, 9000 pg/ml, 10.000 pg/ml, 11.000 pg/ml, 12.000 pg/ml, 15.000 pg/ml, 20.000 pg/ml o 25.000 pg/ml. La concentración de IL-1Ra puede alcanzar un máximo de entre 1000 pg/ml y 10000 pg/ml, entre 8000 pg/ml y 12.000 pg/ml, o entre 25.000 pg/ml y 28.000 pg/ml. La concentración máxima de IL-1Ra puede alcanzarse después de por lo menos 1, 2, 3 o 4 horas. La concentración máxima de IL-1Ra puede alcanzarse entre 2 y 4 horas, entre 2 y 3 horas o entre 3 y 4 horas después de la administración. En un ejemplo, la concentración de IL-1Ra puede alcanzar un máximo de entre 25.000 pg/ml y 28.000 pg/ml entre 2,5 y 3,5 horas después de la administración. En otro ejemplo, la concentración de IL-1Ra puede alcanzar un máximo de entre 8000 pg/ml y 12.000 pg/ml entre 3,5 y 4,5 horas después de la administración.
[0623] La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo con una enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) puede dar como resultado por lo menos uno de los siguientes resultados: (1) una concentración máxima de IL-10 de menos de 50 pg/ml en el plasma del individuo y (2) la colocalización de la IL-10 con una célula que expresa CD3 en lalámina propiadel individuo. La concentración máxima de IL-10 puede ser de menos de 50 pg/ml, 40 pg/ml, 30 pg/ml, 20 pg/ml, 10 pg/ml, 2,5 pg/ml, 2,0 pg/ml, 1,5 pg/ml o 1,0 pg/ml. La concentración máxima de IL-10 puede alcanzarse entre 1 y 5 horas, entre 1 y 3 horas, entre 2 y 3 horas o entre 3 y 5 horas después de la administración. La célula que expresa CD3 puede ser un linfocito. El linfocito puede ser una célula T.
[0624] La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo con una enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) puede dar como resultado un aumento de la relación de la expresión entre IL-Ra y la interleucina 1 beta (IL-1β) (IL-1Ra:IL-1β) en el tejido colónico del individuo. La relación entre IL-1Ra y IL-1β puede ser de por lo menos 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1 o 3:1. La relación entre de IL-1Ra y IL-1β puede ser de 2:1 a 3:1.
[0625] La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo con una enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) puede dar como resultado que no se produzca un aumento significativo de la concentración de por lo menos una citoquina proinflamatoria en el plasma del individuo. La por lo menos una citoquina proinflamatoria puede ser interferón gamma (IFN-γ), IL-1β, interleucina 2 (IL-2), interleucina 8 (IL-8) o una combinación de las mismas. La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo con una enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) puede dar como resultado un aumento de la concentración de IL-1Ra en el plasma del individuo. La concentración de IL-1Ra puede alcanzar un máximo de entre 25.000 pg/ml y 28.000 pg/ml entre 2,5 y 3,5 horas después de la administración.
[0626] La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo con una enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) puede dar como resultado: (a) un aumento de la expresión del agonista del receptor de la interleucina 1 (IL-1Ra) en el tejido colónico del individuo; (b) una disminución de la expresión de por lo menos un gen proinflamatorio en el tejido colónico; (c) un aumento en la expresión de por lo menos un gen antiinflamatorio en el tejido colónico del individuo; (d) un aumento en la expresión de por lo menos un gen de reparación tisular en el tejido colónico del individuo; (e) un aumento en la expresión de por lo menos un gen antimicrobiano en el tejido colónico del individuo; o (f) una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación que comprende IL-10 a un individuo con una enfermedad o afección (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) da como resultado un aumento en la relación de la expresión entre Il-1Ra y la interleucina 1 beta (IL-1R: IL-1β) en el tejido colónico del individuo. La proporción entre IL-1R y IL-1β puede ser mayor de 1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1 o 3:1.
[0627] [0186] El por lo menos un gen proinflamatorio puede ser MHC-II, HPGDS, FCER1A, PLA2G2D, CCL13, FUT3, CCL28, UGT1A1, CCL20, NLRP1, TPH o una combinación de los mismos. El por lo menos un gen antiinflamatorio puede ser CD163, SCNN1G, STC1, HGF, SGK1, miR-24-2, SCNN1B, PTGDR, MTNR1A, ACE2, NOX2, BEST2, VNN2, LTB4R2, B2GALT5 o una combinación de los mismos. El por lo menos un gen de reparación tisular puede ser SCNN1G, STC1, TIMP1, SCNN1B, BEST2, B3GALT5 o una combinación de los mismos. El por lo menos un gen antimicrobiano puede ser PI15, PI3, BDKRB1, CCI28, SERPINE2 o una combinación de los mismos.
[0628] En ciertas realizaciones, se describen además en la presente métodos para prevenir la recurrencia de un trastorno inflamatorio en un individuo en remisión por el trastorno inflamatorio, que comprenden administrar al individuo de una formulación que comprende IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El individuo puede haber estado en remisión del trastorno inflamatorio durante por lo menos un mes, 6 meses, 8 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o 5 años.
[0629] En ciertas realizaciones, se describen en la presente, métodos para tratar un trastorno inflamatorio en un individuo refractario o resistente por lo menos a un agente antiinflamatorio, el método comprendiendo administrar una formulación que comprende IL-10 al individuo. El agente antiinflamatorio puede ser un aminosalicilato. En algunas realizaciones, el aminosalicilato se selecciona del grupo que consiste en ácido 5-aminosalicílico (5-ASA; mesalazina), ácido 4-aminosalicílico (4-ASA), balsalazida, olsalazina y sulfasalazina. El agente antiinflamatorio puede ser un corticosteroide. En algunas realizaciones, el corticosteroide es prednisona. En algunas realizaciones, el corticosteroide es un corticosteroide administrado por vía oral o un corticosteroide administrado por vía intravenosa (IV). El agente antiinflamatorio puede ser un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, el agente inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en azatioprina, 6-mercaptopurina y una combinación de las mismas. El agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de TNFα. En algunas realizaciones, el inhibidor de TNFα se selecciona del grupo que consiste en adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab e infliximab. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de Janus quinasas (JAK). En algunas realizaciones, el inhibidor de JAK se selecciona del grupo que consiste en filgotinib, upadacitinib, peficitinib y tofacitinib. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un antagonista del receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P). En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de S1P se selecciona del grupo que consiste en ozanimod, amiselimod y etrasimod. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un bloqueador de la integrina. En algunas realizaciones, el bloqueador de la integrina se selecciona del grupo que consiste en etrolizumab, natalizumab, vedolizumab, abrilumab y carotegrast metilo. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de la IL-23. En algunas realizaciones, el inhibidor de la IL-23 se selecciona del grupo que consiste en ustekinumab, mirikizumab, brazikumab, guselkumab y risankizumab. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4). En algunas realizaciones, el por lo menos un inhibidor de la PDE4 se selecciona del grupo que consiste en apremilast, cilomilast, roflumilast, tetomilast y rolipram. El por lo menos un agente antiinflamatorio puede ser laquinimod. En algunas realizaciones, se administra al individuo la formulación diariamente durante por lo menos 5, 7, 10, 12 o 14 días.
[0630] Terapias combinadas
[0631] En la presente se proporcionan métodos para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar un agente terapéutico de IL-10 en combinación con un inmunosupresor no de IL-10. En algunos casos, el agente terapéutico de IL-10 es un tratamiento oral. En algunos casos, el tratamiento con el inmunosupresor no de IL-10 se inicia antes del tratamiento con el agente terapéutico de IL-10 oral. En algunos casos, el tratamiento con el inmunosupresor no de IL-10 se inicia concomitantemente con el tratamiento con el agente terapéutico de IL-10 oral. En algunos casos, el sujeto ha sido tratado previamente con un inmunosupresor no de IL-10 y ha tenido una respuesta inadecuada. En algunos casos, se prevé que el sujeto responda de manera inadecuada a un inmunosupresor no de IL-10 sobre la base del historial médico, los antecedentes familiares, la genética o la expresión de biomarcadores. En algunos casos, el inmunosupresor no de IL-10 no es una interleucina.
[0632] En algunos casos, el inmunosupresor no de IL-10 es una terapia antiintegrina, por ejemplo, vedolizumab. En algunos casos, el inmunosupresor no de IL-10 es un inhibidor de Janus quinasas (inhibidor de JAK). En algunos casos, el inmunosupresor no de IL-10 es un antagonista de la IL-23 y/o un antagonista de la IL-12/IL-23. En algunos casos, el inmunosupresor no de IL-10 es un modulador de la esfingosina-1-fosfato (S1P) o un modulador del receptor de la esfingosina-1-fosfato. En otros casos, el inmunosupresor no de IL-10 es IL-22 o un agonista de IL-22.
[0633] En algunos casos, el inmunosupresor no de IL-10 es un inhibidor de TNF alfa. En algunos casos, el tratamiento con el inhibidor de TNF alfa se inicia antes del tratamiento con el agente terapéutico de IL-10. En algunos casos, el tratamiento con el inhibidor de TNF alfa se inicia concomitantemente con el tratamiento con el agente terapéutico de IL-10. En algunos casos, el sujeto ha sido tratado previamente con un inhibidor de TNF alfa y ha tenido una respuesta inadecuada. En algunos casos, se prevé que el sujeto responda de manera inadecuada a un inhibidor de TNF alfa sobre la base del historial médico, los antecedentes familiares, la genética o la expresión de biomarcadores.
[0634] [0192] Además ,se proporcionan métodos para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en los que el sujeto ha tenido una respuesta inadecuada al tratamiento con un inhibidor de TNF alfa, el método comprende administrar un agente terapéutico de IL-10. En algunos casos, el tratamiento con el inhibidor del TNF alfa se continúa concomitantemente con el agente terapéutico de IL-10.
[0635] En algunos casos, la enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad de los intestinos o del tracto digestivo. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria puede manifestarse o presentarse en un tejido distal o a una distancia remota del tracto digestivo. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria puede seleccionarse del grupo que comprende: enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, psoriasis en placas, hidradenitis supurativa, artritis psoriásica, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, espondilitis anquilosante, sepsis bacteriana, enfermedad de Crohn, enfermedad de Crohn fistulizante, colitis ulcerosa de moderada a grave, colitis ulcerosa leve a moderada, colitis ulcerosa, colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por derivación, síndrome de Behçet, colitis indeterminada, artritis reumatoide, pancreatitis, inflamación hepática, pouchitis, proctitis, uveítis, enfermedad de injerto contra huésped y lesión de células epiteliales. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa. En algunos casos, la enfermedad inflamatoria intestinal es enfermedad de Crohn.
[0636] En algunos casos, puede administrarse localmente un agente terapéutico de IL-10 en el sitio de la enfermedad. Por ejemplo, puede administrarse un agente terapéutico de IL-10 por vía oral para tratar una enfermedad del tracto digestivo, como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn. En algunos casos, el agente terapéutico de IL-10 puede administrarse por vía oral para alcanzar una dosis sistémica que pueda tratar una enfermedad distal al tracto digestivo. Por ejemplo, puede administrarse un agente terapéutico de IL-10 por vía oral para tratar la artritis reumatoide o la psoriasis.
[0637] Una respuesta inadecuada a un agente terapéutico puede comprender una respuesta parcial o una falta de respuesta. En algunos casos, una respuesta inadecuada es una respuesta distinta de la curación completa o la remisión completa de una enfermedad. Un sujeto que ha tenido una respuesta inadecuada a un agente terapéutico puede presentar menos síntomas o presentar síntomas menos graves durante o después del tratamiento en comparación con los que presentaba antes del tratamiento. En otros casos, un sujeto que ha tenido una respuesta inadecuada a una enfermedad puede tener la misma cantidad de síntomas o los mismos síntomas que antes del tratamiento. En algunos casos, un sujeto que ha tenido una respuesta inadecuada a un agente terapéutico puede tener más síntomas o síntomas más graves después del tratamiento en comparación con antes del tratamiento.
[0638] En algunos casos, un sujeto con artritis reumatoide que ha tenido una respuesta inadecuada a un agente terapéutico puede seguir presentando uno o más síntomas de artritis después del tratamiento con el agente terapéutico (por ejemplo, un inhibidor anti-TNF alfa solo). Por ejemplo, el sujeto puede tener una o más articulaciones con enfermedad activa. La enfermedad activa puede identificarse mediante imagenología óptica fluorescente o imagenología por resonancia magnética. El sujeto con una respuesta inadecuada a un tratamiento para la artritis reumatoide puede tener una o más articulaciones sensibles y/o una o más articulaciones inflamadas. Otros síntomas que pueden presentarse incluyen rigidez o debilidad de las articulaciones, enrojecimiento de la piel sobre las articulaciones, bultos sobre las articulaciones, brotes, sequedad de boca, deformidad física o sensación de hormigueo.
[0639] En algunos casos, un sujeto con colitis ulcerosa que ha tenido una respuesta inadecuada a un agente terapéutico puede seguir presentando uno o más síntomas de colitis ulcerosa después del tratamiento con el agente terapéutico (por ejemplo, un inhibidor anti-TNF alfa solo). El sujeto con una respuesta inadecuada a un tratamiento para la colitis ulcerosa puede tener una puntuación modificada de la Clínica Mayo (MMS) de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 9 puntos. El sujeto puede tener una subpuntuación endoscópica de MCS leída centralmente de grado 2 o mayor. En algunos casos, el sujeto puede tener una subpuntuación de MMS de sangrado rectal de 1 punto o más. En algunos casos, el sujeto puede tener una enfermedad que se extiende 15 cm o más desde el borde anal. Otros síntomas de la colitis ulcerosa incluyen dolor/malestar abdominal, sangre o pus en las heces, fiebre, pérdida de peso, diarrea recurrente frecuente, fatiga, disminución del apetito y tenesmo.
[0640] En algunos casos, un sujeto puede haber tenido una respuesta inadecuada después del tratamiento con un inhibidor del TNF alfa. En algunos casos, el sujeto puede haber tenido una respuesta inadecuada al inhibidor del TNF alfa después de por lo menos 6 o por lo menos 12 semanas de tratamiento con el inhibidor del TNF alfa.
[0641] El inhibidor del TNF alfa puede ser un anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de terapias anti-TNF alfa incluyen el infliximab (Remicade), el adalimumab (Humira) y el golimumab (Simponi). En algunos casos, el inhibidor del TNF alfa es el etanercept. En otros casos, el inhibidor del TNF alfa no es el etanercept.
[0642] [0200] El inhibidor del TNF alfa puede administrarse mediante inyección subcutánea o mediante cualquier otro método adecuado. Por ejemplo, el adalimumab puede administrarse mediante inyección subcutánea. En algunos casos, el adalimumab puede administrarse a una dosis de 40 mg cada dos semanas. En algunos casos, una o más dosis iniciales pueden ser más altas que una dosis de mantenimiento. Por ejemplo, un régimen terapéutico con adalimumab puede comprender una primera dosis de 160 mg, seguida de una segunda dosis de 80 mg aproximadamente dos semanas después, seguida dos semanas después de dosis de mantenimiento de 40 mg cada dos semanas. En algunos casos, una dosis inicial de adalimumab puede ser de 80 mg, seguida dos semanas después de dosis de mantenimiento de 40 mg cada dos semanas.
[0643] El inhibidor del TNF alfa puede administrarse por infusión intravenosa. Por ejemplo, el infliximab puede administrarse por infusión intravenosa. En algunos casos, el inhibidor del TNF alfa puede administrarse por infusión intravenosa durante un período de tiempo de por lo menos dos horas. En algunos casos, el infliximab puede administrarse a una dosis de 5 mg/kg. En otros casos, el infliximab puede administrarse a una dosis de 3 mg/kg o a una dosis de 10 mg/kg. En algunos casos, un régimen de tratamiento puede comprender dosis iniciales más frecuentes, seguidas de dosis de mantenimiento. En algunos casos, un régimen de tratamiento puede comprender administrar el inhibidor del TNF alfa a las 0, 2 y 6 semanas, y luego cada 8 semanas.
[0644] El inhibidor del TNF alfa puede ser administrado por un profesional médico o puede proporcionarse a un paciente para que se lo administre él mismo. En algunos casos, el inhibidor del TNF alfa puede proporcionarse en una jeringuilla precargada de dosis única o en un inyector automático de dosis única. Por ejemplo, el adalimumab puede proporcionarse en una pluma HUMIRA de dosis única.
[0645] En algunos casos, un agente terapéutico de IL-10 puede administrarse por vía oral. En algunos casos, un agente terapéutico de IL-10 puede administrarse aproximadamente simultáneamente con un inhibidor del TNF alfa. Por ejemplo, un agente terapéutico de IL-10 puede administrarse inmediatamente antes o inmediatamente después de un inhibidor del TNF alfa. En algunos casos, un agente terapéutico de IL-10 puede administrarse el mismo día que un inhibidor del TNF alfa, o el día anterior o posterior a la administración de un inhibidor del TNF alfa. Por ejemplo, un agente terapéutico de IL-10 y un inhibidor del TNF alfa pueden administrarse a las 0, 2 y 6 semanas, y luego posteriormente cada 8 semanas. En otro ejemplo, un agente terapéutico de IL-10 y un inhibidor del TNF alfa pueden administrarse cada dos semanas.
[0646] En algunos casos, un agente terapéutico de IL-10 puede ser un constructo de administración de IL-10.
[0647] EJEMPLOS
[0648] Ejemplo 1: Diseño de un constructo de administración de IL-10
[0649] La IL-10 es una citoquina inmunomoduladora que suprime la activación y la función efectora de múltiples células inmunitarias innatas y adaptativas. Se diseñó un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Este constructo era una proteína de fusión homodimérica recombinante en la que cada monómero consistía en una metionina N-terminal, un dominio de cholix<386>(SEQ ID NO: 4) y un dominio de IL-10 humana recombinante (rhIL-10) (SEQ ID NO: 2) conectados por un espaciador polipeptídico de aminoácidos de residuos de glicina y serina (polyGlySer) (SEQ ID NO: 6). El dominio de cholix<386>era una forma truncada de una variante de cholix, un mutante no tóxico derivado deVibrio choleraque contenía 386 aminoácidos. El constructo tenía un peso molecular de 125.796 Da y un punto isoeléctrico (pI) de 5,49.
[0650] El dominio de cholix<386>facilita el transporte activo del constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO: 5 a través de las células epiteliales mediante transcitosis vesicular al tejido submucoso gastrointestinal local. La administración dirigida de rhIL-10 directamente a lalámina propiapor vía oral puede evitar uno o más de los inconvenientes que se experimentan con la administración sistémica y traducirse en concentraciones mucosas más altas y reducciones clínicamente significativas de la inflamación y la enfermedad.
[0651] Tal como se usa en los ejemplos de la presente, el término "sustancia farmacéutica" (DS) se usa para referirse al polvo liofilizado y el término "producto farmacéutica" (DP) se usa para referirse a la forma de cápsula o comprimido.
[0652] Ejemplo 2: Expresión del constructo diana
[0653] Se construyeron plásmidos que contenían la secuencia codificante (SEQ ID NO: 10) del constructo diana (SEQ ID NO: 5) mediante clonación en los sitios Nde I y EcoR I de una cadena principal de pET26(b). La secuencia codificada por SEQ ID NO: 10 es una secuencia mejorada en codones para su expresión en células bacterianas. El plásmido contenía el promotor T7 y confería resistencia a la kanamicina. Se transfectaron células BL21 de E. colicon el plásmido del constructo diana usando un método de transformación por choque térmico de la siguiente manera: las células BL21 y el plásmido del constructo diana se dividieron en alícuotas en un tubo y se incubaron en hielo durante 30 minutos. A continuación, los tubos se sometieron a un choque térmico durante 30 a 45 segundos a 42 ºC ± 2 ºC en un baño de agua. Inmediatamente después del choque térmico, los tubos se colocaron en hielo durante 2 a 5 minutos. Se añadió medio a cada tubo y los tubos se incubaron durante 60 minutos a 37 ºC. Las células transformadas se sembraron en placas de agar LB/Kan y se incubaron durante la noche a 37 ºC. A continuación, se seleccionó una sola colonia de la placa de agar, se inoculó en 4 ml de medio LB y se cultivó durante la noche en un matraz agitador. Se añadió un stock de glicerol (80%) al cultivo, que luego se vertió en crioviales y se almacenó a -80 ± 10 ºC. A continuación, el pre-RCB (banco de células de investigación; el cultivo stock de glicerol) se procesó para producir el banco de células maestro (MCB).
[0654] Para producir el MCB, las células del RCB se expandieron en matraces agitadores hasta que se hubo acumulado una masa celular suficiente, se recuperaron por centrifugación, se volvieron suspender en medio de crioconservación, se dividieron en 300 crioviales y se enfriaron hasta su congelación. El MCB se almacenó a -80 ± 5 ºC en una instalación GMP de acceso controlado. El MCB se fabricó y se mantiene de acuerdo con los procedimientos cGMP y las directrices Q5B y Q5D de la ICH.
[0655] Después de la expansión en un matraz agitador, las células se transfirieron a un biorreactor de producción. La fermentación se realizó en un biorreactor de 1500 L en presencia de kanamicina para ejercer presión selectiva. La fermentación de producción consiste en una fase de crecimiento celular seguida de una fase de expresión usando isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) como inductor, donde la proteína se expresó intracelularmente como cuerpos de inclusión insolubles. El reactor de producción se controló a un pH, una temperatura y un nivel de oxígeno disuelto determinados, tal como se especifica en el procedimiento de fabricación: el pH se controló mediante la adición de ácido fosfórico e hidróxido de amonio; el oxígeno disuelto se controló mediante flujos de aire y oxígeno gaseoso. Todos los gases se hicieron pasar a través de filtros de membrana con un tamaño de poro de 0,22 µm o menos. El reactor de producción contenía un medio de crecimiento bacteriano con componentes definidos. Antes de la inoculación, estos ingredientes se esterilizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar escritos. La fase de producción fue un proceso por lotes alimentados, en el que se añaden medios de alimentación a base de glucosa para mantener el crecimiento celular y la viabilidad del cultivo.
[0656] Al final de la producción, las células se recogieron por centrifugación y la pasta celular se procesó adicionalmente o se congeló para su procesamiento en una fecha posterior. Para liberar los cuerpos de inclusión que contenían el producto se usó homogeneización a alta presión. A continuación, los cuerpos de inclusión se volvieron a suspender, se lavaron y se separaron de otros componentes celulares mediante centrifugación. Los cuerpos de inclusión se procesaron inmediatamente o se congelaron para su uso posterior. La pasta celular y/o la suspensión de cuerpos de inclusión se almacenaron a -20 ± 5 ºC antes de su uso posterior.
[0657] Ejemplo 3: Optimización del replegamiento
[0658] La solubilización de los cuerpos de inclusión (IB) se llevó a cabo usando una alta concentración de clorhidrato de guanidina, un caotrópico fuerte. Después de la solubilización, un primer intento usando un enfoque de replegamiento tradicional, reduciendo con DTT y diluyendo luego en un cóctel redox, generó un bajo rendimiento de dímeros correctamente plegados (<5% de dímeros). un segundo enfoque utilizando sulfitólisis generó una mayor recuperación y se implementó. El péptido se redujo primero con sulfito de sodio y, a continuación, los sulfhidrilos libres se taparon con tetrationato de potasio. Después de la diafiltración para eliminar los reactivos de sulfitólisis residuales, la proteína se diluyó en un cóctel redox, lo que permitió que la proteína se replegara y se oxidara. Utilizando este enfoque, el rendimiento fue ~2 veces más alto (~10% de dímeros), pero todavía menor que el deseado. Se investigó más a fondo el efecto del replegamiento en presencia de osmolitos, como la sacarosa, así como otros agentes modificadores del agua, como el glicerol.
[0659] Se evaluó la eficiencia del replegamiento después de variar la concentración de arginina y la concentración del constructo diana (proteína) de la solución de replegamiento (TABLA 5; FIGS. 25A-25B). La eficiencia de replegamiento que se muestra en las tablas y figuras de este ejemplo es equivalente al porcentaje de dímeros de los constructos diana replegados resultantes y se evaluó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión por tamaño (SE-HPLC). En laFIG.28se muestra un ejemplo de cromatograma que muestra el porcentaje de dímeros a partir del uso de cuatro soluciones de replegamiento diferentes.Las eficiencias de replegamiento de las cuatro soluciones de replegamiento ilustradas en el cromatograma de laFIG.28se muestran en laFIG.29.
[0660] TABLA 5:Concentraciones de los componentes en nueve soluciones de replegamiento que varían en ar inina M en las concentraciones del constructo diana m /ml
[0663]
[0664] continuación
[0667]
[0669] Se evaluó la eficiencia de replegamiento después de variar el pH y la concentración de glicerol de la solución de replegamiento (TABLA 6;FIGS.26A-26B).
[0670] TABLA 6: Concentraciones de los componentes en nueve soluciones de replegamiento que varían en concentración de licerol mM en H.
[0673]
[0675] Se evaluó la eficiencia de replegamiento después de variar la concentración de sacarosa y la concentración de PEG de la solución de replegamiento (TABLA 7;FIGS.27A-27B).
[0676] TABLA 7: Concentraciones de los componentes en nueve soluciones de replegamiento que varían en % de PEG concentraciones de sacarosa M
[0679]
[0681] Se evaluó la eficiencia de replegamiento después de variar la concentración de sacarosa, glicerol y PEG de la solución de replegamiento (TABLA 8).
[0683] TABLA 8: Concentraciones de los componentes en diez soluciones de replegamiento y eficiencia de re le amiento resultante % de dímeros
[0686]
[0687] continuación
[0690]
[0692] Ejemplo 4: Purificación de constructos replegados
[0693] Durante el desarrollo del proceso se evaluaron varios modos de cromatografía. El intercambio catiónico (CEX) no tuvo éxito a un pH relativamente bajo, ya que la proteína precipitaba a un pH por debajo del pI del constructo diana (pH 5,5). La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) tampoco tuvo éxito, ya que la proteína parecía ser inestable en la alta concentración de sal necesaria para la unión.
[0694] El intercambio aniónico (AEX) funcionó bien, ya que la proteína se mantuvo estable a un pH más alto y se unió con una capacidad razonable. Se evaluaron varios soportes de AEX de distintos proveedores, y el Capto™ Q ImpRes proporcionó el mejor rendimiento general, particularmente en lo que respecta a la separación de las especies diméricas activas de las dos principales impurezas relacionadas con el producto, el monómero residual y las especies agregadas. Como paso de pulido, se implementó hidroxiapatita cerámica (CHT) como paso ortogonal de modo mixto para reducir aún más las impurezas relacionadas con el producto y el proceso.
[0695] Los constructos diana replegados se sometieron a cromatografía AEX seguida de cromatografía CHT. En ambos pasos de cromatografía se utilizaron eluciones en gradiente para la campaña clínica inicial, con la oportunidad de desarrollar eluciones por pasos optimizadas que se evaluarán a medida que avance el desarrollo clínico. Durante la elución, se recogieron fracciones y cada una de ellas se analizó mediante SE-HPLC para determinar el contenido de dímeros del constructo diana. Las fracciones que contenían un umbral específico (por ejemplo, el 75%) se agruparon para alcanzar el porcentaje de contenido de dímeros deseado. Después del paso de CHT, el volumen final se concentró y se diafiltró usando UF/DF en el tampón de formulación. En laFIG.30se muestra el análisis por SDS-PAGE de los principales productos intermedios del proceso, que demostró un aumento de la pureza de los dímeros durante el procesamiento posterior.
[0696] Ejemplo 5: Liofilización del producto intermedio líquido
[0697] Con el fin de generar una cápsula oral que contuviese el constructo de administración de IL-10, se transformó el producto intermedio líquido purificado producido siguiendo el protocolo de purificación descrito en el ejemplo 4 en un polvo seco. Se determinó que la liofilización era una forma adecuada de producir el polvo minimizando la formación de agregados.
[0698] El desarrollo de la formulación para establecer el tampón de liofilización se realizó cribando inicialmente la estabilidad del líquido inducida por congelación-descongelación y cizallamiento del constructo diana después de la diálisis en combinaciones de varios componentes que se indican a continuación:
[0699] 1) Surfactantes: polisorbato 80, 20 y poloxámero 188
[0700] 2) Intervalo de pH de 5 a 8
[0701] 3) Osmolito: 5% de sacarosa
[0702] 4) Sales: cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de magnesio (MgCl<2>), sulfato de amonio (NH<4>SO<4>) y sulfato de sodio (Na<2>SO<4>).
[0703] Sobre la base de los datos obtenidos en el cribado inicial de formulaciones líquidas, se determinó que el poloxámero 188 reducía la agregación del constructo diana bajo tensión de cizallamiento, y que la solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el NaCl a 150-200 mM también mostraban una mayor estabilidad.
[0704] [0223] Después de realizar más pruebas basándose en los resultados del cribado inicial de formulaciones líquidas, se realizaron estudios iniciales de viabilidad de la liofilización usando las condiciones de laTABLA 9. A este cribado se añadieron glicina y manitol, conocidos por su utilidad en la liofilización de proteínas como agentes de volumen amorfos, histidina a pH 7,0 para proporcionar una evaluación más granular del efecto del pH en el intervalo de 7,0-7,5, y trehalosa como opción a la sacarosa como osmolito. LasFIGS.21y22muestran el porcentaje de los constructos diana en forma de dímero antes y después de la incubación a 25 ºC durante 3 días(FIG.21)y antes y después de 5 ciclos de congelación/descongelación(FIG.22).
[0706] TABLA 9:Resumen de las condiciones usadas en los estudios iniciales de viabilidad de la liofilización
[0709]
[0712] Este estudio inicial de viabilidad de la liofilización demostró que el constructo diana era más estable a un pH de 7,5 con sacarosa y glicina en lo que respecta a la reducción de la agregación. Sobre la base en los resultados de este estudio inicial, se llevó a cabo un segundo cribado de liofilización usando las formulaciones enumeradas en laTABLA 10.
[0714] TABLA 10: Resumen del cribado secundario de tam ones de formulación
[0716]
[0717] continuación
[0719]
[0721] A partir de este cribado, las dos formulaciones que demostraron la mejor estabilidad fueron:
[0722] 1) 10 mM de fosfato de potasio, 2% de glicina, 1% de sacarosa o 1% de trehalosa, 0,3% de poloxámero 188 a pH 7,5
[0723] 2) 10 mM de histidina, 2% de glicina, 1% de sacarosa o 1% de trehalosa, 0,3% de poloxámero a pH 7,0.
[0724] Usando estas dos formulaciones, con el fin de garantizar que el paso de UF/DF funcionase según lo previsto y que la congelación al comienzo del proceso de liofilización fuese aceptable, se llevó a cabo un cribado de congelación/descongelación de la formulación líquida final y un estudio de estabilidad a corto plazo con concentraciones de proteína más altas, tal y como se describe en laTABLA 11a continuación.
[0725] TABLA11:Formulaciones ara el cribado de con elación/descon elación
[0728]
[0730] El constructo diana a una concentración de 20 mg/ml no mostró ningún aumento significativo en la agregación durante la congelación/descongelación ni tras una semana a 4 ºC en ninguna de las condiciones probadas. Se determinó que el tampón de formulación que consistía en 10 mM de fosfato de potasio, 2% de glicina, 1% de sacarosa y 0,3% de poloxámero 188 a un pH de 7,5 tenía la mejor estabilidad general a 2-8 ºC y 25 ºC durante una semana (véanse los datos de laFIG.24Cy laFIG.24D,el recuadro y las flechas resaltan la mejor formulación). Se recomendó esta formulación como el tampón que se usaría en el paso de formulación de UF/DF antes de la liofilización. En laFIG.23Ay laFIG.23Bse muestran los datos de los experimentos de congelación/descongelación. En lasFIGS.24A-24Dse muestran los datos de un estudio de estabilidad a corto plazo.
[0731] La liofilización a granel se llevó a cabo descongelando y dispensando el producto intermedio líquido en bandejas que se cargaron en un liofilizador. Los parámetros de control durante el ciclo de liofilización, como la temperatura y la presión de vacío, se ejecutaron sobre la base del tiempo. Se tomaron muestras durante el proceso después de la finalización del ciclo. El polvo liofilizado se agrupó y se mezcló en un revestimiento primario de polietileno de baja densidad (LDPE) que se colocó dentro de un revestimiento secundario de LDPE. El segundo revestimiento se selló térmicamente y luego se colocó en una bolsa de mylar, que también se selló térmicamente. Cuando se liofilizó, el constructo objetivo dio como resultado un polvo de color blanco a blanquecino. El polvo liofilizado combinado es la sustancia farmacéutica (DS) del constructo diana.
[0732] Ejemplo 6: Evaluación in vitro de formulaciones de recubrimiento
[0733] Para facilitar la administración dirigida de un ingrediente farmacéutico activo (API) en su sitio de acción deseado y para proteger al API contra ciertas condiciones fisiológicas presentes en el tracto gastrointestinal que podrían afectar a su estabilidad pueden usarse diferentes tipos de formulaciones. Después de su ingestión, el API entra en contacto con el pH gástrico bajo y la pepsina proteolítica del estómago, lo que podría influir en su estabilidad. Tras pasar por el estómago, el API entra en el intestino delgado, que se caracteriza por valores de pH más altos. La secreción de sales biliares y las enzimas pancreáticas proteolíticas pueden tener un gran impacto sobre la estabilidad del API. Además, el pH gástrico y las concentraciones de enzimas proteolíticas varían considerablemente de un estado alimentado y el ayuno. Por lo tanto, el objetivo de este ejemplo era investigar la disgregación de cinco formulaciones diferentes y su posterior administración dirigida de cafeína durante el paso por todo el tracto gastrointestinal.
[0734] [0230] La configuración del reactor usada en este experimento se adaptó del Simulador del Ecosistema Microbiano Intestinal Humano (SHIME®), que representa el tracto gastrointestinal (GI) del humano adulto, tal como describen Molly et al. (Appl Microbiol Biotechnol 39:254-258(1993)). En este sistema, los dos primeros reactores simulaban diferentes pasos de la ingesta y digestión de los alimentos, con bombas peristálticas que añadían una cantidad definida de alimento y líquido pancreático y biliar, respectivamente, al compartimento del estómago y del intestino delgado, y vaciaban los reactores respectivos después de intervalos específicos. Los tres últimos compartimentos, reactores agitados continuamente con control constante del volumen y el pH, simulaban el colon ascendente, transverso y descendente. El tiempo de retención y el pH de los diferentes recipientes se eligen para que se asemejen a las condicionesin vivoen las diferentes partes del tracto gastrointestinal.
[0735] En este experimento se usó un sistema SHIME® adaptado que representaba las condiciones fisiológicas del estómago y el intestino delgado dentro del mismo reactor a lo largo del tiempo (FIG.3). Para imitar las condiciones de alimentación o de ayuno, al reactor se le añadió una suspensión gástrica. Después de esto, se añadió una enzima estandarizada y líquido biliar para simular las condiciones del intestino delgado. Las condiciones de incubación (perfiles de pH, tiempos de incubación) se optimizaron para que se asemejaran a las condicionesin vivoen las diferentes regiones del tracto gastrointestinal en condiciones de ayuno o alimentación.
[0736] Protocolo para la simulación del estómago y el intestino delgado
[0737] Durante el estudio, se probó la disolución de las cápsulas durante su paso por el estómago y el intestino delgado en condiciones de ayuno.
[0738] En la fase gástrica, la incubación se realizó durante 45 minutos a 37 ºC, mientras se mezclaba mediante agitación, a un pH de 2,0 (FIG. 3). Se añadieron niveles de pepsina y fosfatidilcolina cuatro veces menores con respecto a las condiciones de alimentación. Como medio de fondo, solo se suministraron sales y mucinas. Muestreo y puntuación visual a t=0 y 45 minutos de incubación estomacal.
[0739] En la fase del intestino delgado, mientras se mezclaba mediante agitación, el pH aumentó inicialmente de forma automática de 2,0 a 5,5 en un periodo de 5 minutos, después de lo cual el pH del medio aumentó de 5,5 a 6,5 durante la primera hora, de 6,5 a 7,0 durante la segunda hora, y se mantuvo constante en un valor de 7,0 durante la tercera hora de incubación en el intestino delgado (FIG.5). La temperatura se controló a 37 ºC. En lo referente a las enzimas pancreáticas, se usó tanto un extracto pancreático animal sin procesar (pancreatina) que contenía todas las enzimas relevantes en una proporción específica como proporciones definidas de las diferentes enzimas. En condiciones de ayuno, se añadieron niveles 5 veces menores de enzimas pancreáticas en comparación con los experimentos realizados en condiciones de alimentación. En lo referente a las sales biliares, se suplementó generalmente con 3,3 mM de extracto de bilis bovina, ya que la bilis bovina se asemeja más a la humana que la porcina en términos de taurocolato y glicocolato.
[0740] Protocolo para la simulación del colon
[0741] Durante este estudio, como fuente de microbiota colónica para su uso durante todas las incubaciones en el colon que siguieron al paso por el tracto gastrointestinal superior se recogió una muestra fecal de un donante y se almacenó a -80 ºC hasta su uso posterior. El uso de la misma microbiota colónica permitió, por tanto, la comparación de los resultados obtenidos durante los diferentes experimentos. Después de la donación de la muestra fecal en una caja de muestreo, se añadió una bolsa Anaerogen y la caja se selló inmediatamente. El polvo de la bolsa Anaerogen eliminó inmediatamente todo el oxígeno de la caja de muestreo. Posteriormente, se añadió PBS anaeróbico a la muestra fecal y se preparó una suspensión fecal mediante homogeneización en un stomacher. La suspensión concentrada fecal se centrifugó brevemente para eliminar las partículas grandes. Posteriormente, se añadió un volumen igual de solución crioprotectora al sobrenadante fecal. Después de la homogeneización, la suspensión fecal crioprotegida se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ºC.
[0742] Antes de comenzar los experimentos colónicos reales dichos, la muestra fecal crioconservada se preincubó en biorreactores con el fin de obtener una microbiota colónica de fondo completamente metabólicamente activa, que se usó para inocular las incubaciones en el colon. Brevemente, se inoculó un 2,5% (vol/vol) de suspensión concentrada fecal en un medio colónico rico que contenía sustratos derivados tanto del huésped como de la dieta. Los recipientes se hicieron anaeróbicos mediante lavado con gas nitrógeno y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC. De este modo, se obtuvo una microbiota colónica completamente establecida y metabólicamente activa después de 24 horas de incubación.
[0743] Después de tomar el SIend (extremo del intestino delgado o íleon) al final de los experimentos con el estómago/intestino delgado, se iniciaron las incubaciones en el colon. Esto se hizo añadiendo 200 ml de medio colónico fresco, que contenía sustratos derivados del huésped y de la dieta, a los 200 ml de suspensión de estómago/intestino delgado. La simulación de una microbiota colónica luminal metabólicamente activa se obtuvo añadiendo 300 ml del material fecal preincubado a los biorreactores. Los recipientes se hicieron anaeróbicos mediante lavado con gas nitrógeno y posteriormente se incubaron durante 18 h a 37 ºC. La evaluación visual de las cápsulas y el muestreo de los reactores se realizaron después de 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 h y 18 h de incubación en el colon.
[0744] Disgregación de las cápsulas
[0745] Durante el tránsito por el tracto gastrointestinal simulado, se realizó una inspección visual de las cápsulas de acuerdo con la siguiente puntuación: 1: cápsula intacta; 2: cápsula dañada, pero casi todo el producto sigue dentro de la cápsula; 3: cápsula dañada y todo el producto liberado; 4: cápsula destruida.
[0746] Se implementó un método HPLC-UV/Vis que permitió cuantificar la concentración de cafeína en las muestras tomadas de los reactores. Brevemente, las muestras se analizaron usando un método de separación isocrática (25% de metanol: 75% de agua) en una columna C18. La temperatura de la columna se controló a 25 ºC. El tiempo total de ejecución por muestra fue de 7 minutos. El volumen de inyección fue de 10 µl y el detector UV/Vis funcionó a 272 nm. La cuantificación de la cafeína se realizó usando estándares externos. Antes de la inyección en la columna, las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a 9000 rpm. Posteriormente, el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 µm en viales de HPLC.
[0747] Durante los experimentos en ayunas se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre la concentración de cafeína en cada punto de muestreo y el anterior para demostrar los cambios en función del tiempo. En términos estadísticos, las diferencias para todos los datos analizados e indicados por "'p < 0,05" o "*" fueron significativas con un intervalo de confianza del 95%, como se demostró mediante la prueba t de Student.
[0748] Se investigó la disgregación de cinco tipos diferentes de formulaciones durante su paso por el tracto gastrointestinal (TABLA 12). Junto a los experimentos con las cinco formulaciones, se realizó un experimento de control para determinar la concentración de cafeína en el fondo. Se añadió una cápsula a cada reactor y las cápsulas se montaron en un sumergidor de cápsulas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado biológico.
[0749] TABLA 12 - Formulaciones robadas
[0752]
[0754] La determinación de la concentración de cafeína presente en los diferentes puntos de muestreo durante los experimentos de control reveló que este compuesto no estaba presente en la fase del estómago, el intestino delgado y colónica de los experimentos de paso por el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, los medios de fondo usados durante los experimentos con las cinco formulaciones no pudieron generar interferencias con la detección de la cafeína liberada de las cápsulas.
[0755] La cápsula 1, que tiene un espesor de recubrimiento de 60 mg en una cápsula de tamaño 1 y una relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 50:50, permaneció completamente intacta durante su paso por el estómago en ayunas simulado, protegiendo de este modo el API contra las condiciones de pH bajo presentes durante la fase de incubación en el estómago. Las cápsulas permanecieron visualmente intactas durante la primera hora de incubación en el intestino delgado, durante la cual el pH del medio aumentó de un valor de 5,5 a 6,5. Las cápsulas se dañaron durante la segunda hora de incubación en el intestino delgado, durante la cual el pH aumenta de un valor de 6,5 hasta un valor de 7,0. LaFIG.5Ailustra la liberación de cafeína de la cápsula 1.
[0756] [0244] A pesar del daño visual de la cápsula, la mayor parte del polvo permaneció en las cápsulas, como lo demostraron las bajas cantidades de cafeína medidas después de 2 horas de incubación en el intestino delgado. Las cápsulas se dañaron aún más durante la tercera hora de incubación en el intestino delgado (pH estable de 7,0), lo que provocó la liberación de la mayor parte del polvo del interior de las cápsulas, como se evidenció mediante la cuantificación de cafeína en este punto de muestreo. Durante las incubaciones en el colon, la cantidad de cafeína se mantuvo bastante constante. Se observó un pequeño aumento, debido principalmente a la liberación incompleta de cafeína de la cápsula durante los experimentos de la réplica 2. Las cápsulas no se destruyeron completamente al final de la fase de incubación en el colon y la inspección visual de las cápsulas reveló que una pequeña parte del polvo aún estaba presente en el interior de las cápsulas. Esto explica la razón por la cual la dosis total de 10 mg de cafeína, que estaba presente en las cápsulas, se liberó casi por completo al final de la incubación en el colon. Por lo tanto, puede concluirse que la cápsula 1 facilita la administración dirigida de un API en las etapas finales de la fase de incubación en el intestino delgado, que corresponde al íleon terminal del tracto gastrointestinal (TGI).
[0757] La cápsula 2, que tiene un espesor de recubrimiento de 128 mg en una cápsula de tamaño 1 y una relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 50:50, permaneció completamente intacta durante su paso por el estómago en ayunas(FIG.5B).
[0758] Además, en comparación con la cápsula 1 (misma relación de Eudragit®), el mayor espesor del recubrimiento de la cápsula 2 evitó que la cápsula se dañara durante su paso por la fase de incubación en el intestino delgado, donde el pH del medio aumenta de un valor de 5,5 a 7,0.
[0759] La entrada de la cápsula en el colon provocó daños visibles en las cápsulas después de 1,5 horas de incubación, lo que dio como resultado una pequeña liberación de cafeína después de 4 horas de incubación en el colon. La incubación en el colon prolongada indujo daños adicionales a las cápsulas, lo que provocó la liberación de grandes cantidades de cafeína en la luz del colon después de 18 horas de incubación en el colon. A lo largo de la fase de incubación en el colon, el pH del medio se mantuvo por encima de un valor de 5,8. Por lo tanto, puede concluirse que el aumento en el espesor del recubrimiento de la cápsula 2 provocó un retraso en la liberación de cafeína en comparación con la cápsula 1. Las cápsulas no se destruyeron completamente tras su paso por el tracto gastrointestinal, lo que indica que uno de los polímeros de las cápsulas no se disolvió a los valores de pH presentes durante el paso por el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, puede concluirse que la cápsula 2 facilita la administración dirigida de un API en las etapas finales de la fase de incubación en el colon, que corresponde al colon distal del tracto gastrointestinal.
[0760] La cápsula 3, que tiene un espesor de recubrimiento de 60 mg en una cápsula de tamaño 1 y una relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 20:80, permaneció completamente intacta durante el paso por el estómago en ayunas(FIG. 5C). Si bien las cápsulas no sufrieron daños visibles durante su paso por el intestino delgado, se detectaron pequeñas cantidades de cafeína después de 3 horas de incubación en el intestino delgado, lo que indica la presencia de daños microscópicos indetectables en las cápsulas. Las cápsulas sufrieron daños visibles después de 0,5 horas de incubación en el colon, lo que provocó un aumento de las cantidades de cafeína liberadas por las cápsulas después de 4 horas de incubación en el colon. La cantidad de cafeína detectada en el medio colónico aumentó aún más entre las 4 y las 18 horas de incubación en el colon. Las cápsulas no se destruyeron por completo al final del paso por todo el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, la comparación de los datos obtenidos durante los experimentos con las cápsulas 1 y 3 indicó que el aumento del porcentaje de FS30D a costa de L30D55 dio como resultado una administración dirigida del API al inicio de la fase de incubación en el colon, que corresponde al colon proximal del tracto gastrointestinal.
[0761] La cápsula 4, que tiene un espesor de recubrimiento de 120 mg en una cápsula de tamaño 1 y una relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 20:80, permaneció visualmente intacta durante todo el paso por el tracto gastrointestinal completo(FIG. 5D). Solo durante los experimentos de las réplicas 2 y 3 se detectó una pequeña cantidad de cafeína. Por lo tanto, aumentar el espesor del recubrimiento y de la relación de FS30D a costa de L30D55 evitó la liberación del API en el tracto gastrointestinal superior y el colon proximal. Podría plantearse la hipótesis de que el contenido solo se liberaría hacia el colon distal tras tiempos de incubación más largos a un pH creciente.
[0762] La cápsula 5, que tiene un espesor de recubrimiento de 60 mg en una cápsula de tamaño 1 y una relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 0:100, se dañó visualmente después de 3 horas de incubación en el intestino delgado cuando el pH de la suspensión del intestino delgado era igual a 7(FIG.5E). Sin embargo, casi todo el polvo permaneció atrapado dentro de la cápsula, como lo demostró la ausencia de cantidades medibles de cafeína al final de la fase de incubación en el intestino delgado. Tras entrar en el colon, las cápsulas no sufrieron más daños visibles. Solo durante la réplica 3 del experimento se detectó cafeína en una cantidad adecuada después de 18 horas de incubación en el colon. Por lo tanto, puede concluirse que la omisión de L30D55 en la mezcla de polímeros de la cápsula dio como resultado la ausencia de una administración dirigida del API durante el paso por el tracto gastrointestinal superior y el colon proximal. Podría plantearse la hipótesis de que el contenido solo se liberaría hacia el colon distal tras tiempos de incubación más largos a un pH creciente.
[0763] Conclusión
[0764] Durante el presente estudio, se evaluó la disgregación de cinco formulaciones diferentes durante su paso por el estómago, el intestino delgado y el colon. Se estudió la disolución de las cápsulas mediante una puntuación visual en puntos temporales específicos y mediante la determinación de la cantidad de cafeína liberada por las cápsulas durante su paso por el tracto gastrointestinal (TGI).
[0765] [0252] Las cinco formulaciones mostraron diferentes características de disolución, que se determinaron por su espesor del recubrimiento y la relación de Eudragit® L30D55:FS30D. Las cápsulas del presente estudio con un espesor de recubrimiento de 60 mg facilitaron una administración dirigida del API al final de la incubación en el intestino delgado o al comienzo de la incubación en el colon cuando su relación de Eudragit® L30D55:FS30D era de 50:50 o 20:80, respectivamente. Aumentar el espesor del recubrimiento de las cápsulas con una relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 50:50 de 60 mg a 128 mg dio como resultado la administración dirigida del API en las etapas finales de las incubaciones en el colon proximales. Mientras que las cápsulas 1, 2 y 3 fueron capaces de proporcionar una administración dirigida del API, estas cápsulas no se disolvieron completamente al final del paso por el tracto gastrointestinal, lo que dio como resultado la presencia de material de la cápsula en las etapas finales de las incubaciones en el colon. Las cápsulas 4 (espesor del recubrimiento 120, relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 20:80) y la cápsula 5 (espesor del recubrimiento de 60 mg y relación de Eudragit® L30D55:FS30D de 0: 100) no se disgregaron durante el paso por el tracto gastrointestinal superior y el colon proximal, lo que provocó la ausencia de la administración dirigida del API durante el experimento actual. Podría plantearse la hipótesis de que el contenido solo se liberaría hacia el colon distal tras tiempos de incubación más largos a un pH creciente.
[0766] Ejemplo 7: Evaluación del recubrimiento entérico
[0767] La composición del recubrimiento entérico se seleccionó basándose en experimentos realizados con lotes de investigación de cápsulas con recubrimiento entérico. La composición de estos lotes de investigación se resume en laTABLA 13. Para todos los lotes se usaron cápsulas HPMC de tamaño 1. El peso de llenado de rHSA (albúmina sérica humana recombinante) o del polvo de la sustancia fue de aproximadamente 30 mg, ya que el contenido de proteína de cada uno era aproximadamente un tercio del peso del polvo. Las composiciones de recubrimiento comprendían mezclas de Eudragit® L30D55 con un pH de disolución nominal >5,5 y Eudragit® FS30D con un pH de disolución nominal > 7 (información del producto de Evonik GmbH). Se deseaba una liberación de la cápsula a un valor de pH de aproximadamente 6,5 para proporcionar una protección entérica adecuada y permitir a la vez que se permitía la liberación del constructo diana en el intestino.
[0768] TABLA 13:Composición de las cápsulas para el desarrollo de la formulación. Todos los lotes se llenaron en cá sulas HPMC de tamaño 1.
[0771]
[0773] La evaluación del recubrimiento se realizó en dos estudios de investigación con múltiples lotes de cápsulas recubiertas.
[0774] Para el primer estudio, se prepararon doce lotes de cápsulas que contenían cafeína y albúmina sérica humana recombinante (rHSA), que comprendían permutaciones de cuatro composiciones de recubrimiento diferentes y tres espesores de recubrimiento diferentes. Las composiciones de recubrimiento comprendían relaciones entre Eudragit® L30D55 y Eudragit® FS30D, entre 50:50 y 0:100 en peso.
[0775] La cafeína se incluyó en este estudio como un marcador fácilmente detectable para la liberación de la cápsula. Se consideró que la rHSA era una proteína sustituta adecuada para el constructo diana en este estudio, ya que se preparaba como una composición liofilizada usando el mismo tampón de liofilización que se usó para la sustancia farmacéutica del constructo diana, con aproximadamente el mismo contenido de proteína que la sustancia farmacéutica del constructo diana, y la forma física de la composición liofilizada es comparable.
[0776] Para el segundo estudio, se prepararon tres lotes de cápsulas que contenían cafeína y el constructo diana, que comprendían tres espesores diferentes de recubrimiento de una formulación de recubrimiento que contenía cantidades iguales de Eudragit® L30D55 y Eudragit® FS30D.
[0777] Las cápsulas de cada lote de investigación se colocaron en una solución agitada de HCl 0,1 N durante por lo menos 60 minutos, seguido de transferencia a soluciones tampón a valores de pH especificados más altos. Estas condiciones tenían por objeto simular la exposición al entorno ácido del estómago, seguido de un pH aproximadamente neutro al pasar a los intestinos. En cada experimento, se tomaron muestras periódicas del sobrenadante y se analizaron para determinar la concentración del contenido de las cápsulas que se había liberado de la cápsula a la solución.
[0778] A continuación se resumen los resultados de estos experimentos. En ningún caso ninguna cápsula con recubrimiento entérico liberó su contenido durante la fase de incubación de 1 h en HCl 0,1 N. Por tanto, los datos presentados en las tablas representan únicamente la liberación durante la fase de incubación en tampón. Como se esperaba, todos los recubrimientos evaluados demostraron protección entérica frente al entorno ácido.
[0779] Primer estudio: selección de la composición del recubrimiento
[0780] La composición del recubrimiento entérico se seleccionó a partir de un estudio inicial en el que se usaron cápsulas que contenían cafeína como marcador de liberación y rHSA como sustituto de proteína para el constructo diana. La relación entre el Eudragit® L30D55 y el Eudragit® FS30D varió entre 50:50 y 0:100 para explorar el efecto de la composición del recubrimiento sobre la liberación de la cápsula en función del pH de la solución.
[0781] Las TABLAS 14-17muestran el comportamiento de 12 conjuntos de cápsulas recubiertas que contienen cafeína y rHSA en un tampón de pH 7,0. Los valores de cafeína y rHSA se normalizaron al 100% para las cápsulas que alcanzaron la liberación máxima; en los demás casos, los datos no se ajustaron. La cinética de liberación de la cafeína y la rHSA varió sobre la base del peso y la composición del recubrimiento de la cápsula, aunque la liberación de ambos compuestos fue comparable para cada lote de cápsulas individual. Así, la cafeína (una molécula pequeña) y la rHSA (una proteína) proporcionaron información similar sobre la liberación de la cápsula en estas condiciones.
[0782] TABLA 14: Porcentaje de liberación de cafeína y rHSA de cápsulas recubiertas con una relación 50:50 de Eudra it® L30D55 Eudra it® FS30D tam ón H 70
[0783]
[0785] TABLA 15: Porcentaje de liberación de cafeína y rHSA de cápsulas recubiertas con una relación 30:70 de Eudra it® L30D55 Eudra it® FS30D tam ón H 70.
[0786]
[0788] TABLA 16: Porcentaje de liberación de cafeína y rHSA de cápsulas recubiertas con una relación 20:80 de Eudra it®L30D55 Eudra it®FS30D tam ón H 70.
[0789]
[0791] TABLA 17: Porcentaje de liberación de cafeína y rHSA de cápsulas recubiertas con una relación 0:100 de Eudra it®L30D55 Eudra it®FS30D tam ón H 70.
[0792]
[0793] Para estos lotes de cápsulas, un mayor peso total del recubrimiento entérico se correlacionó con un inicio más lento de la liberación de cafeína y rHSA en tampón de pH 7,0, y un tiempo más prolongado para lograr la liberación completa. Se observó una correlación menos significativa entre la liberación en tampón de pH 7,0 y la composición del recubrimiento. Casi todas las cápsulas liberaron su contenido completamente en tampón de pH 7,0 durante el transcurso de las pruebas, con la excepción de que las cápsulas recubiertas con una relación de 100:0 entre FS30D y L30D55 mostraron un inicio de liberación retardado y una liberación incompleta para pesos de recubrimiento mayores.
[0794] LasTABLAS 18-19resumen el comportamiento de las mismas cápsulas en tampones de pH 6,5 y pH 6,0. Solo se presentan los valores de rHSA, ya que la cinética de liberación de cafeína y rHSA fue de nuevo comparable para cada cápsula. Los valores de rHSA se normalizaron al 100% para las cápsulas que alcanzaron la liberación máxima; de lo contrario, los datos no se ajustaron. El peso del recubrimiento mostrado en lasTABLAS 18-19era el peso objetivo del recubrimiento, pero el peso real del recubrimiento varió en no más de 5 mg con respecto al peso de recubrimiento objetivo.
[0795] TABLA 18: Liberación de rHSA de cápsulas recubiertas con diferentes relaciones de Eudragit® L30D55 y Eudra it® FS30D tam ón H 65
[0798]
[0800] TABLA 19 - Liberación de rHSA de cápsulas recubiertas con diferentes relaciones de Eudragit® L30D55 y Eudra it® FS30D tam ón H 60
[0803]
[0805] En cualquier condición de tampón, se observó una clara tendencia en la cinética de liberación con respecto al peso del recubrimiento, por lo que el aumento del peso total del recubrimiento entérico se correlacionó con un inicio más lento de la liberación de rHSA y un tiempo más prolongado para lograr la liberación completa. A pH 6,5 y pH 6,0, también fue evidente una tendencia en la composición del recubrimiento. Los recubrimientos que contenían una mayor relación de Eudragit®FS30D mostraron un inicio de liberación retardado con un pH del tampón más bajo, y en estos casos se observó una liberación incompleta o nula para pesos de recubrimiento mayores. No se observó liberación para ninguna cápsula recubierta con una relación de 100:0 entre FS30D y L30D55 en estas condiciones a pH 6,5 o 6,0.
[0806] Por lo tanto, la liberación de rHSA dependía tanto del peso como de la composición del recubrimiento entérico. Un peso de recubrimiento de 60 mg con una composición 50:50 de Eudragit® L30D55 y Eudragit® FS30D proporcionó la liberación más rápida de las cápsulas probadas en estas condiciones.
[0807] Segundo estudio: selección del peso del recubrimiento
[0808] La evaluación del peso del recubrimiento continuó en un segundo estudio con cápsulas que contenían constructos diana.
[0809] LasTABLAS 20-22muestran el comportamiento de tres lotes de cápsulas que contenían cafeína y constructos diana, con diferentes pesos de recubrimiento de polímeros Eudragit® L30D55 y FS30D 50:50. Se examinó la liberación de cafeína y constructos diana en tampones a pH 7,0, pH 6,5 y pH 6,0. Estas cápsulas se sometieron a una incubación previa en HCl 0,1 N durante 1 h, y no se detectó liberación de cafeína ni de los constructos diana en ningún caso. Los valores de cafeína y constructos diana se normalizaron al 100% para las cápsulas que alcanzaron la liberación máxima; de lo contrario, los datos no se ajustaron. ND indica que no se pudo determinar el punto de datos debido a la pérdida de la muestra.
[0810] TABLA 20: Liberación de cafeína y constructos diana de cápsulas recubiertas con una relación 50:50 de Eudra it® L30D55 Eudra it® FS30D tam ón H 70
[0812]
[0814] TABLA 21: Liberación de cafeína y constructos diana de cápsulas recubiertas con una relación 50:50 de Eudra it®L30D55 Eudra it®FS30D tam ón H 65.
[0816]
[0818] TABLA 22: Liberación de cafeína y constructos diana de cápsulas recubiertas con una relación 50:50 de Eudra it®L30D55 Eudra it®FS30D tam ón H 60.
[0820]
[0822] El tiempo hasta el inicio de la liberación de la cafeína y los constructos diana fue comparable para cada cápsula. Como se observó anteriormente para las cápsulas de rHSA, se observó una clara tendencia en la cinética de liberación con respecto al peso del recubrimiento, por lo que el aumento del peso total del recubrimiento entérico se correlaciona con un inicio más tardío de la liberación de cafeína y constructos diana, y un tiempo más largo para lograr la liberación completa. En general, la liberación de las constructos diana alcanzó concentraciones que eran menores que las calculadas sobre la base del peso de llenado de la cápsula. En general, se lograron concentraciones más altas de los constructos diana en las cápsulas con un momento de inicio de la liberación más temprano. La razón de la liberación menor que la esperada de los constructos diana se investigará en futuros estudios. En esta etapa temprana del desarrollo, se seleccionaron composiciones de recubrimiento de liberación rápida para minimizar la pérdida potencial de los constructos diana durante la liberación de la cápsula.
[0823] Selección del recubrimiento entérico
[0824] [0269] Sobre la base de los estudios de cápsulas de investigación, se seleccionó una composición de recubrimiento que comprendía una mezcla 50:50 de polímeros Eudragit®L30D55 y FS30D para la presentación clínica de la cápsula. Se seleccionó un peso de recubrimiento objetivo de 60 mg en una cápsula de tamaño 1 para proporcionar protección entérica contra el ácido estomacal, pero liberar el contenido de la cápsula al alcanzar un entorno de pH neutro. El peso de recubrimiento de 60 mg en una cápsula de tamaño 1 proporciona un espesor de recubrimiento equivalente al recubrimiento de 75 mg para una cápsula de tamaño 0 seleccionada para la presentación clínica.
[0825] Ejemplo 8: Datos de disolución in vitro
[0826] Se probaron ocho formulaciones de recubrimiento de cápsulas (formulaciones A-H en laTABLA 23) para determinar las velocidades de disoluciónin vitroa diferentes pH. La primera hora fue una fase de ácido en la que la cápsula se expuso a un medio de disolución que contenía ácido clorhídrico 0,1 M a un pH de 1,0. Las horas restantes se dedicaron a una fase de tampón en la que la cápsula se expuso a un medio de disolución que contenía un tampón de citrato/fosfato a un pH de 7,0, 6,5 o 6,0. Cada cápsula se retiró usando una espátula de plástico mientras se cambiaba el medio. Las cápsulas se colocaron dentro de un vaso de precipitados de 150 ml con una barra agitadora agitando a 100 rpm y un calentador ajustado a 37 ºC. El porcentaje de liberación de cafeína se determinó midiendo la absorbancia UV. El porcentaje de liberación del constructo de administración de IL-10 se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (TABLA 24)y la forma dimérica se detectó como un pico único. Los valores registrados se determinaron a partir de una curva estándar del analito respectivo. Durante la SE-HPLC, se usa detección de dispersión de luz multiángulo (MALS) en combinación con la absorbancia UV y la detección del índice de refracción (RI) para determinar la masa molecular de los picos eluidos. La detección se realizó mediante absorbancia a 280 nm.
[0827] Las cápsulas recubiertas con Eudragit se sometieron a 1 hora de disolución en fase de ácido y, a continuación, a disolución en fase de tampón. Las cápsulas sin un recubrimiento de Eudragit (solo recubrimiento de HPMC) se probaron únicamente en fase de tampón. El medio de disolución se agitó a 100 rpm durante toda la duración del ensayo. Se recogieron alícuotas de 500 µl de muestras al final de la fase de ácido, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h y 24 h de la fase de tampón en filtros de tubo de centrífuga Spin-X de acetato de celulosa de 0,22 µm (Costar Nº de Cat 8161). La centrifugación se realizó a 15.000 x g durante 2 minutos. A continuación, se transfirieron alícuotas de 150 µl de las muestras a viales de HPLC y se analizaron primero mediante SEC y luego mediante cromatografía RP.
[0828] TABLA 23: Formulación de las cápsulas examinadas para la disolución in vitro del contenido de las cá sulas
[0831]
[0833] TABLA 24 - Método SE-HPLC
[0836]
[0837] continuación
[0840]
[0842] Se midió el porcentaje de cafeína liberada a pH 7,0 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.6A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.6B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.6C).Se midió el porcentaje de cafeína liberada a pH 6,5 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.7A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.7B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.7C).Se midió el porcentaje de cafeína liberada a pH 6,0 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.8A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.8B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.8C).
[0843] Se midió el porcentaje de constructo diana liberado a pH 7,0 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG. 9A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG. 9B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG. 9C).Se midió el porcentaje de constructo diana liberado a pH 6,5 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG. 10A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG. 10B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG. 10C).Se midió el porcentaje de constructo diana liberado a pH 6,0 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.11A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.11B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.11C).
[0844] También se determinó el porcentaje de los constructos diana liberados en forma de dímero. Se midió el porcentaje de constructo diana liberado en forma de dímero a pH 7,0 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.12A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.12B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.12C).Se midió el porcentaje de constructos diana liberados en forma de dímero a pH 6,5 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.13A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.13B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.13C).Se midió el porcentaje de constructos diana liberados en forma de dímero a pH 6,0 para cada una de las formulaciones de cápsulas A-B(FIG.14A),formulaciones de cápsulas C-F(FIG.14B)y formulaciones de cápsulas G-H(FIG.14C).
[0845] Ejemplo 9: Estudio de recubrimiento de cápsulas en monos cynomolgus
[0846] Se probaron ocho formulaciones de recubrimiento de cápsulas (formulaciones A-H en laTABLA 25)en monos cynomolgus macho. Las cápsulas se administraron en una sola dosis, con 2 cápsulas por animal, y se administraron por vía oral con una pistola para píldoras. Se recogieron muestras de plasma 8 horas después de la administración de las cápsulas y se analizaron para determinar los niveles de IL-10 (FIGS.15A, 16Ay17A), cafeína (FIGS.15B, 16By17B) y antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1RA) (FIGS.15C, 16Cy17C).
[0847] TABLA 25: Formulación de las cá sulas administradas a los macacos c nomol us
[0850]
[0851] Una señal de cafeína robusta indicó el comportamiento de apertura de la cápsula. El tiempo y la cinética de apertura de la cápsula (a partir de la cafeína) se correlacionaron bien con los datos de disoluciónin vitro. Las capas más finas mostraron la apertura más rápida (capa de 30 mg de Eudragit® L30D55/FS30D 50/50 y Eudragit® L30D55/FS30D 30/70). En algunas formulaciones se elevaron los niveles sistémicos de Il-10 e IL-1RA. La evolución temporal de las señales farmacocinéticas y de los biomarcadores se correlacionó bien con los datos de la evolución temporal de la liberación de cafeína. Las capas más finas mostraron la elevación más significativa de IL-10 e IL-1RA sistémicos (capa de 30 mg de Eudragit® L30D55/FS30D 50/50 y Eudragit® L30D55/FS30D 30/70).
[0852] Ejemplo 10: Desarrollo de un polvo con características mejoradas
[0853] Las composiciones liofilizadas de baja densidad pueden tener malas características de flujo. El objetivo era desarrollar una formulación de composición liofilizada con mayor densidad y propiedades de flujo mejoradas. La composición liofilizada se mezcló homogéneamente con excipientes para mejorar el llenado de las cápsulas o permitir la formulación de comprimidos.
[0854] Para el llenado se usó albúmina sérica humana recombinante (rHSA) como proteína sustituta. La rHSA liofilizada (lio-rHSA) se elaboró con el mismo proceso, composición y densidad que los constructos diana liofilizados, con un objetivo de 20 mg de API por cápsula (equivalente a 56 mg de composición liofilizada).
[0855] Se usó el sistema de llenado de cápsulas Profill para generar siete mezclas homogéneas diferentes(TABLA26), incluyendo una sustancia farmacéutica liofilizada (que contenía solo rHSA liofilizada), así como la sustancia farmacéutica liofilizada junto con otros excipientes, como glicina y sacarosa.
[0856] TABLA 26 - Mezclas homo éneas Profill
[0859]
[0861] En conclusión, ProFill era un sistema viable para llenar cápsulas con un polvo, como el constructo de administración de IL-10 liofilizado. También se podía concluir que no era necesario añadir excipientes para lograr el llenado con polvo mediante ProFill. Además, el polvo de las cápsulas que no cumplen los objetivos de peso puede recuperarse y reciclarse.
[0862] Ejemplo 11: Cribado de compatibilidad del constructo diana y los excipientes de compactación
[0863] Se evaluó la compatibilidad de varios excipientes de comprimidos con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en estado seco (polvo).
[0864] [0282] Se mezcló el constructo de administración de IL-10 en estado seco (sustancia farmacéutica del constructo de administración de IL-10, o DS, desarrollado usando el tampón de formulación que se había determinado con anterioridad que tenía la mejor estabilidad general (10 mM de fosfato de potasio, 2% de glicina, 1% de sacarosa, 0,3% de poloxámero 188 a un pH de 7,5, tal como se describe en el ejemplo 5) con cada excipiente individual y se incubó a 40 ºC durante 72 h antes del análisis. En laTABLA 27se describen la composición y el resumen analítico de cada muestra. El constructo de administración de IL-10 DS y el excipiente (igual peso de cada uno, relación 1:3 de API: excipiente) se colocaron en un vial de vidrio borosilicato de 4 ml tapado y se homogeneizaron usando el sistema TURBULA® durante 2 minutos, luego las muestras se incubaron en reposo a 40 ºC durante 72 h en un vial de vidrio borosilicato de 4 ml tapado. A continuación, la mezcla de polvo se reconstituyó con PBS hasta obtener una solución de 0,5 mg/ml del constructo de administración de IL-10. Luego ls muestras se pasaron a través de un filtro de 0,2 µm antes del análisis SEC(FIG. 18).No se observó ninguna incompatibilidad con los constructos diana en estado de polvo.
[0866] TABLA 27: Composición y análisis SEC de polvos de constructo de administración de IL-10/excipientes mezclados homo éneamente en seco
[0869]
[0872] Para la fabricación de comprimidos, el material se sometió a procesos de compactación y compresión. Para un fármaco proteico con una estructura terciaria y cuaternaria potencialmente sensible, estas tensiones mecánicas requieren una investigación para garantizar la integridad de la proteína.
[0874] Se evaluó la compatibilidad del constructo de administración de IL-10 para los pasos iniciales de la formación de comprimidos. Se llevaron a cabo procesos de homogeneización y compactación. Se realizaron tanto la compactación con rodillos como precompresión, con la molienda posterior a gránulos en cada caso. En laTABLA 28se muestra la composición de cada formulación.Con el fin de explorar la funcionalidad y la compatibilidad de los excipientes, en las tres formulaciones se incluyeron diferentes excipientes.
[0876] TABLA 28: Composiciones de las formulaciones iniciales para la compactación/granulación; IG=composición intragranular; EG = composición extragranular. Los valores porcentuales son p/p y son valores nominales sin corre ir or el contenido de roteínas
[0879]
[0881] En laTABLA 29se muestran los resultados de dos formulaciones premezcladas (F1 y F2).La compactación con rodillos se llevó a cabo con dos fuerzas, y las cintas resultantes se granularon individualmente. Los materiales se reconstituyeron en PBS a 0,65 mg/ml SEQ ID NO: 5 y se filtraron con un filtro de 0,2 um (Advantec) antes del análisis SEC. Las muestras también se incubaron a 40 ºC durante dos semanas antes de la reconstitución y el análisis.
[0882] TABLA 29: Pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) durante el proceso de granulación para las formulaciones F1 y F2; compactación con rodillos a 2 fuerzas en un aparato a e ueña escala. Granulación a través de un tamiz de 12 m.
[0885]
[0887] Los datos de pureza del dímero de los productos intermedios F1 y F2 indicaron poca diferencia como resultado de estos pasos de procesamiento, y los valores después de la incubación a 40 ºC fueron similares a los de las muestras iniciales. No obstante, cada producto intermedio del proceso mostró una pureza del dímero algo reducida en comparación con el principio activo.
[0888] Para los productos intermedios generados en el proceso de precompresión/granulación se realizó el mismo análisis(TABLA 30).Además del diferente método de compactación, el lote de precompresión/granulación difería en la composición del aglutinante y el lubricante. La pureza del dímero de la muestra mostró poca o ninguna diferencia entre las muestras en el proceso, y solo una ligera disminución de la pureza del dímero en comparación con el principio activo. Esto sugirió que la composición y el proceso de las muestras de precompresión/granulación mantuvieron la integridad del constructo de administración de IL-10.
[0889] TABLA 30: Pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) durante el proceso de ranulación ara formulaciones de recom resión/ ranulación
[0892]
[0894] Se sometieron muestras seleccionadas de productos intermedios del proceso a una evaluación de estabilidad después de su reconstitución en PBS(FIG.95).La solución del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se mantuvo estable a temperatura ambiente durante el transcurso del experimento, pero mostró una degradación significativa cuando se almacenó a 37 ºC. La mayoría de las muestras mostraron una estabilidad de la solución comparable a la del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) DS, pero tanto la mezcla homogénea F1 como la F2 mostraron una degradación más rápida en comparación con las muestras del proceso de precompresión/granulación.
[0895] Estos resultados sugirieron que los componentes de las formulaciones F1 y F2 eran menos compatibles con la SEQ ID NO: 5, o que el proceso de compactación podía estar afectando al constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[0896] Para identificar si había componentes perjudiciales en la composición F1/F2, se evaluó la compatibilidad de los excipientes individuales con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en solución. Se suspendieron DS y un solo excipiente en PBS a 0,3 mg/ml de constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Las muestras se incubaron a 37 ºC con agitación durante 5 h, retirándolas periódicamente para su análisis por SEC. Los resultados se muestran en laFIG.96.
[0897] La mayoría de las muestras mostraron una degradación comparable a la de la DS del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), pero la presencia de estearato de magnesio, usado como lubricante en las composiciones F1/F2, provocó un aumento significativo de la velocidad de degradación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Cabe destacar que el dibehenato de glicerilo no mostró efectos adversos sobre la pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[0898] El estearato de magnesio tiene propiedades similares a las de los surfactantes iónicos, mientras que el behenato de glicerilo es un surfactante no iónico. Para caracterizar aún más la compatibilidad de los lubricantes, se evaluó una serie de lubricantes candidatos adicionales. Los resultados se muestran en laFIG.97.
[0899] El fumarato de estearilo sódico, una sal de ácido graso relacionada con el estearato de magnesio, provocó una degradación ligeramente acelerada del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). El lauril sulfato sódico, con el grupo sulfato fuertemente aniónico, degradó el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) inmediatamente después del mezclado.
[0900] Ejemplo 12: Cribado de fuerzas de compresión para el desarrollo de comprimidos
[0901] Se usaron varias fuerzas de compresión para crear los comprimidos F1(TABLA 31)y los comprimidos F2(TABLA 32).También se examinó la pureza del dímero del constructo diana después de la compactación en un comprimido. La proteína del constructo diana era resistente a la compactación y la granulación, aunque se observó cierta agregación en la forma final del comprimido(FIG.19). También se evaluó la recuperación del dímero después de la disolución de varios comprimidos a pH 7,0 (FIGS.20A-20D).
[0902] TABLA 31 - Pro iedades del com rimidos F1
[0905]
[0907] TABLA 32 - Pro iedades del com rimido F2
[0910]
[0912] Se creó un comprimido adicional (F3), similar al comprimido F1, pero con dibehenato de glicerilo en lugar de estearato de magnesio(TABLA 33).Esta sustitución se realizó debido a la incompatibilidad del estearato de magnesio en la disolución de los constructos diana en solución.
[0913] TABLA 33 - Com osición del com rimido F3
[0916]
[0917] continuación
[0920]
[0922] Ejemplo 13: Evaluación del rendimiento in vivo de formulaciones de recubrimiento de cápsulas orales en sujetos sanos
[0923] os objetivos principales del estudio son: evaluar el rendimiento in vivo de dosis orales únicas de formulaciones de recubrimiento de cápsulas usando métodos de gammagrafía y comparar el rendimiento in vivo de dosis orales únicas de una formulación de recubrimiento de cápsulas seleccionada en estado alimentado y en ayunas usando métodos de gammagrafía. El objetivo secundario del estudio es proporcionar información sobre la seguridad de las formulaciones de recubrimiento de cápsulas después de la administración oral. El objetivo exploratorio del estudio es recopilar los perfiles de pH, temperatura y presión en ayunas de cada sujeto del estudio mientras transita por el intestino una SmartPill®.
[0924] Diseño del estudio
[0925] Se trató de un estudio de imagenología de gammagrafía, en un único centro, abierto, no aleatorizado, secuencial, de dosis única y cuatro períodos con sujetos sanos. Se inscribió una única cohorte de 12 sujetos. Cada sujeto recibió los regímenes indicados en laTABLA 34. En laTABLA 35se describen las formulaciones de recubrimiento de cápsulas aplicadas a cápsulas de tamaño 0,y se predijo que la liberación del constructo de administración de IL-10 se produciría en el íleon, el colon proximal (más tarde 1) o el colon distal (más tarde 2). Las formulaciones de recubrimiento de cápsulas orales se suministraron como cápsulas de tamaño 0 con recubrimiento entérico destinadas a la administración oral. Este estudio examinó las formulaciones de recubrimiento de cápsulas y no un constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO: 5. La cápsula de este estudio no contenía ningún ingrediente activo. Hubo un período de reposo farmacológico mínimo de 3 días entre dosis. Después del período 3, hubo un período de análisis provisional y revisión de los datos de seguridad y gammagrafía de los períodos anteriores para determinar qué formulación de recubrimiento de cápsulas debía seleccionarse para administrar en estado alimentado en el período 4.
[0926] TABLA 34: Ré imen administrado a acientes sanos
[0929]
[0931] TABLA 35 - Formulaciones de recubrimiento ara el estudio de amma rafía
[0934]
[0936] [0298] Se evaluó a los sujetos para determinar su idoneidad para participar en el estudio hasta 28 días antes de la administración de la dosis en el Periodo 1. Para cada periodo de tratamiento, los sujetos idóneos se admitieron en la unidad clínica la tarde del día anterior a la administración de la dosis (día 1). Los sujetos recibieron las formulaciones en la mañana del día 1, después de un ayuno nocturno de por lo menos 10 horas (regímenes A, B y C) o tras un desayuno rico en grasas (régimen D). La administración se realizó el día 1, con un intervalo adecuado entre sujetos sobre la base de los requisitos de imagenología por gammagrafía (por ejemplo, aproximadamente 10 minutos). La hora de inicio se determinó sobre la base de la logística. Los sujetos permanecieron ingresados en la unidad clínica hasta 24 horas después de la dosis. Durante cada régimen en ayunas, 4 sujetos recibieron una cápsula SmartPill® inmediatamente después de la administración de la cápsula oral. Cada sujeto recibió la SmartPill en un solo régimen; los Sujetos 001 a 004 recibieron la SmartPill® en el Régimen A, los Sujetos 005 a 008 recibieron la SmartPill® en el Régimen B y los Sujetos 009 a 012 recibieron la SmartPill® en el Régimen C. Si aún se estaban recopilando datos de una SmartPill® que estaba in situ, no se administró la dosis al sujeto en la siguiente ocasión de administración de la dosis. Entre cada administración del producto hubo un período mínimo de reposo farmacológico de 3 días. En todos los períodos, se administró una bebida de 99mTc-DTPA con cada producto de prueba radiomarcado (TP) para proporcionar un esquema del tracto gastrointestinal con el fin de permitir el análisis de gammagrafía. Se realizó una llamada telefónica de seguimiento entre 5 y 7 días después de la dosis final para garantizar el bienestar continuo de los sujetos.
[0937] Gammagrafía
[0938] Para todos los regímenes, se recopilaron imágenes isotópicas duales anteriores de aproximadamente 50 segundos de duración a intervalos regulares hasta 24 horas después de la administración de la dosis. Las imágenes de la bebida radiomarcada con 99mTc-DTPA se usaron únicamente para proporcionar un esquema del tracto gastrointestinal y no se analizaron. Se realizó un análisis cualitativo de los datos de gammagrafía con el fin de determinar los siguientes parámetros: momento y localización anatómica de la liberación inicial del radiomarcador de la cápsula y momento y localización anatómica de la liberación completa del radiomarcador de la cápsula. La localización anatómica de la liberación del radiomarcador se definió a partir de lo siguiente: estómago, intestino delgado proximal, intestino delgado distal, colon ascendente (incluyendo la flexura hepática), colon transverso (incluyendo la flexura esplénica) y colon descendente (incluyendo el colon sigmoide y el recto). Antes de la liberación completa del radiomarcador, se realizó una evaluación de gammagrafía cualitativa del tránsito de la cápsula a través del tracto gastrointestinal analizando los siguientes parámetros: tiempo de vaciado gástrico y tiempo de llegada al colon. Después de la liberación completa del radiomarcador, no se evaluaron más parámetros de tránsito.
[0939] Cápsulas de telemetría de pH
[0940] Durante cada régimen en ayunas, cuatro sujetos recibieron una cápsula SmartPill® inmediatamente después de la administración del TP. Cada sujeto recibió la SmartPill® en un solo régimen. La cápsula SmartPill® es una cápsula ingerible de un solo uso comercializada para su uso por médicos con propósitos de diagnóstico. Los sensores incorporados en la cápsula ingerible miden el pH, la temperatura y la presión a medida que la cápsula se desplaza por el tracto gastrointestinal. Las mediciones se transmitían desde la cápsula dentro del tracto gastrointestinal a través de una señal de radiofrecuencia modulada por desplazamiento de amplitud a 434 MHz a un receptor de datos que llevaba el sujeto y, posteriormente, se descargaban en un ordenador portátil para su análisis y revisión una vez que la cápsula había sido expulsada. El software MotiliGI™ realizaba automáticamente el análisis de los datos y proporcionaba al médico un informe imprimible que contenía el tiempo de vaciado gástrico y el índice de motilidad. La cápsula SmartPill® se expulsaba típicamente en unos pocos días.
[0941] La forma, el tamaño y el peso de la cápsula de placebo recubierta y de SmartPill® no eran los mismos, por lo que es posible que las dos cápsulas no transitasen por el tracto gastrointestinal exactamente al mismo tiempo. Sin embargo, SmartPill® proporcionó datos que permitieron caracterizar la información sobre el pH, la presión y la temperatura de diferentes regiones del intestino.
[0942] Resultados
[0943] Después de la administración de la formulación de recubrimiento de la cápsula 1, se observó una liberación inicial del radiomarcador con un valor medio de 2,675 h después de la dosis (TABLAS 36, 37; FIG.32A).La liberación completa del radiomarcador se logró aproximadamente 1,1 h más tarde, con un tiempo medio de 3,758 h después de la dosis (TABLAS 36, 37; FIG. 32B).Se observó que las localizaciones anatómicas de la disgregación eran muy variables, desde el estómago hasta el colon ascendente (CA) para la liberación inicial(FIG. 33A),y hasta el colon descendente (CD) para la liberación completa(FIG.33B).
[0944] Después de la administración de la formulación 2 del recubrimiento de la cápsula, se observó una liberación inicial del radiomarcador con un valor medio de 4,903 h después de la dosis(TABLAS 36, 38; FIG.32A).De manera similar a la formulación de recubrimiento de cápsulas 1, la liberación completa del radiomarcador se produjo aproximadamente 1,3 h más tarde, con un tiempo medio de 6,176 h después de la administración (TABLAS 36, 38; FIG.32B).Las localizaciones anatómicas de la disgregación inicial(FIG.33A)y completa(FIG.33B)mostraron menos variación, toda la liberación del radiomarcador produciéndose entre el intestino delgado distal (DSB) y el AC.
[0945] [0304] Después de la administración con la formulación de recubrimiento de cápsulas 3, la liberación inicial del radiomarcador se produjo en un momento ligeramente anterior al de la formulación de recubrimiento de cápsulas 2, a las 4,082 h después de la dosis(TABLAS 36, 39; FIG.32A).De manera similar a las formulaciones de recubrimiento de cápsulas 1 y 2, se observó que la liberación completa del radiomarcador se produjo aproximadamente 1,2 h más tarde, con un tiempo medio de 5,308 h después de la dosis (TABLAS 36, 39; FIG.32B).Las localizaciones anatómicas de la disgregación fueron menos variables que las de la formulación de recubrimiento de cápsulas 1, aunque más variables que las observadas para la formulación de recubrimiento de cápsulas 2. La liberación inicial varió del intestino delgado proximal (PSB) al AC(FIG.33A), mientras que la liberación completa varió del DSB al colon transverso (TC)(FIG.33B).
[0947] TABLA 36: Parámetros de gammagrafía cualitativos del momento y la localización de la liberación inicial y completa del radiomarcador en voluntarios sanos después de la administración de formulaciones recubiertas de cá sulas orales.
[0950]
[0953] TABLA 37: Parámetros de gammagrafía cualitativos en voluntarios sanos después de la administración de la formulación 1 de recubrimiento de cá sulas orales ré imen A
[0956]
[0957] continuación
[0958]
[0960] TABLA 38: Parámetros de gammagrafía cualitativos en voluntarios sanos después de la administración de la formulación 2 de recubrimiento de cá sulas orales ré imen B
[0961]
[0962] continuación
[0965]
[0968] TABLA 39: Parámetros de gammagrafía cualitativos en voluntarios sanos después de la administración de la formulación 3 de recubrimiento de cá sulas orales ré imen C
[0971]
[0973] Ejemplo 14: Evaluación de la eficacia de un constructo de administración de IL-10 en un modelo de ratón de colitis ulcerosa Th2 inducida por oxazolona
[0975] Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), son trastornos crónicos recurrentes caracterizados por la inflamación del tracto gastrointestinal (GI). Los pacientes con EII padecen síntomas progresivos y debilitantes que son el resultado de una compleja interacción entre la contribución genética, los factores ambientales y una respuesta inflamatoria inadecuada del huésped a los antígenos luminales, provocada por el sistema inmunitario de la mucosa.
[0977] [0306] Las citoquinas controlan numerosos aspectos de la respuesta inmunitaria implicada en el establecimiento y/o mantenimiento de una tendencia proinflamatoria o antiinflamatoria que controla muchos aspectos de la salud y la enfermedad. A lo largo del tracto gastrointestinal (GI), las células inmunomoduladoras responden a una amplia variedad de estímulos ambientales y son responsables de iniciar una cascada de señales proinflamatorias en respuesta a antígenos patológicos. Las células epiteliales y las células localizadas en lalámina propiasubyacente del tracto gastrointestinal responden a una miríada de citoquinas que controlan el estado inflamatorio de este tejido. En el caso de la EII relacionada con el tracto gastrointestinal, incluyendo la CU y la EC, la activación de las vías proinflamatorias parece producirse con demasiada facilidad y la resolución de estos eventos, para mantener la homeostasis gastrointestinal, es insuficiente. Por lo tanto, la aparición, la progresión y la resolución de las EII están reguladas por el equilibrio entre las citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias. Mediante la manipulación de las citoquinas proinflamatorias asociadas al tracto gastrointestinal a través de la acción de agresiones ambientales, es posible establecer modelos animales preclínicos que recrean muchos aspectos fisiopatológicos observados en pacientes con EII.
[0978] La colitis murina inducida por oxazolona representa un sistema fiable para evaluar posibles tratamientos para la EII, en el que se usa una lesión ambiental para provocar una afección inflamatoria aguda. Se caracteriza por una infiltración mixta de neutrófilos y linfocitos limitada a la capa superficial de la mucosa, que está asociada con ulceración. En este modelo, la presensibilización periférica va seguida de la instilación rectal del agente haptenizante, la oxazolona. Este protocolo de sensibilización/activación lleva a una respuesta inmunitaria mediada por Th2 que se caracteriza por un aumento de la secreción de interleucina (IL)-4 e IL-5 en los tejidos, lo que refleja las características moleculares distintivas de la CU. De manera importante, la exposición a la oxazolona también aumenta otras citoquinas tisulares que desempeñan una función en la inflamación, incluyendo las quimiocinas proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-1, proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1β, factor de crecimiento estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y las citoquinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral (TNF)-α e IL-1α. Las concentraciones sistémicas de quimiocinas y citoquinas proinflamatorias también están generalmente elevadas en los pacientes con EII; concretamente, la secreción de TNF-α puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad. Por tanto, el muestreo de citoquinas plasmáticas puede reflejar la inflamación intestinal y la eficacia de los fármacos, además de ayudar a dilucidar el mecanismo de acción de un fármaco.
[0979] Los objetivos de este estudio eran: (1) evaluar la capacidad de una solución de constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), administrada por sonda oral, para prevenir la colitis inducida por oxazolona en ratones evaluando múltiples parámetros de la enfermedad a lo largo de la vida (pérdida de peso corporal, consistencia de las heces, hemoccult), la supervivencia, la morfología del colon después de la necropsia (peso y longitud) y la histopatología del colon al final del estudio; (2) evaluar la eficacia antiinflamatoria y el mecanismo del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en tejido intestinal aislado mediante tinción inmunohistoquímica de TNF-α, NFκB, IL-4, CD4 y Foxp3 en el colon; y (3) evaluar las acciones antiinflamatorias del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) midiendo las concentraciones plasmáticas de citoquinas y quimiocinas usando las plataformas Luminex y Meso Scale Discovery (MSD).
[0980] Métodos
[0981] Se obtuvieron ratones SJL/J hembra de The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine 04609, EE. UU. Al inicio del estudio, los ratones tenían entre 7 y 8 semanas de edad y pesaban entre 18 y 22 g. Los ratones se mantuvieron en un entorno controlado con una temperatura de 70 a 72 ºF, una humedad del 30-70% y un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. A los ratones se les proporcionó una dieta TEKLAD 2018-Global al 18% y agua potable Arrowhead a voluntad. Los ratones se aclimataron durante un periodo de siete días.
[0982] La inducción y el tratamiento de la colitis en ratones fueron realizados por Invitek Inc. (Hayward, CA). Los ratones se presensibilizaron con un 3% de oxazolona (Sigma Aldrich, EE. UU.; Nº de catálogo: E0753) en etanol al 100% en un parche de la piel dorsal el día -5 y se expusieron por vía intrarectal con oxazolona al 1% en etanol al 40% el día 0. Los ratones de control (sin tratamiento previo) fueron tratados con etanol al 100% (día -5) y al 40% (día 0). Los ratones se trataron q.d. (una vez al día) por sonda oral (10 ml/kg) con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO:5) (8,45 mg/kg), aminosalicilato (5-ASA, 100 mg/kg, disuelto en agua; Sigma Aldrich, EE. UU.; Nº de catálogo: A3537) o control con vehículo para el constructo de administración de IL-10 desde el día -5 hasta el día 6. El diseño experimental y el número de grupos se resumen enla TABLA 40.Se registraron el peso corporal diario y los parámetros de la enfermedad (consistencia fecal, positividad en la prueba hemoccult) para generar un índice de actividad de la enfermedad (DAI). Al finalizar el estudio, el día 7, se recogieron muestras de plasma y tejido del colon. Se midieron el peso y la longitud del colon antes de la fijación.
[0983] TABLA 40 - Diseño ex erimental
[0986]
[0987] continuación
[0990]
[0992] La tinción con hematoxilina y eosina de secciones transversales fijadas en formalina e incluidas en parafina de aproximadamente el colon proximal, medio y distal, así como su puntuación histopatológica fueron realizadas por IDEXX Reference Laboratories, Inc. La presencia de colitis y la puntuación de gravedad se evaluaron de acuerdo con la presencia de inflamación, infiltración leucocitaria, densidad vascular, espesor de la pared del colon, abscesos en las criptas y la presencia de células caliciformes y ulceración.
[0993] Las secciones transversales fijadas en formalina e incluidas en parafina de las regiones proximal, media y distal del colon (2 secciones cada una) de los ratones tratados se procesaron para la tinción IHC de NF-kB p65, TNF-α, IL-4, CD4 y Foxp3 de ratón por HistoTox (Boulder, CO). El análisis de imágenes se realizó en las imágenes digitales de los portaobjetos usando el software Visiopharm, siguiendo el procedimiento siguiente. Los tejidos se procesaron usando filtros de imagenología para separar la tinción positiva de la contratinción, y luego las imágenes procesadas se clasificaron usando un método de umbral, en el que se establece un umbral sobre la base de los valores de píxeles asociados a los tejidos teñidos positivamente. La cuantificación de la cantidad de tinción positiva se determinó analizando la imagen etiquetada; el porcentaje de positividad se calculó dividiendo el área de tejido positivo por el área total de tejido para proporcionar una métrica de positividad.
[0994] Las citoquinas plasmáticas se cuantificaron usando el kit para ratón V-plex Proinflammatory Panel 1. La IL-1Ra plasmática se cuantificó mediante un inmunoensayo tipo sándwich usando un par de anticuerpos del Mouse IL-1Ra/IL-1F3 DuoSet ELISA (R&D Systems Nº DY480), marcado con estreptavidina SULFO-TAG (MSD Nº R32AD-1), Paquete de placas Multi-Array de 96 pocillos, Placa SECTOR MSD Nº L15XA-3 y Read Buffer T (4x) (MSD Nº R92TC-2). Las muestras se leyeron en el lector de placas QuickPlex SQ 120 (Meso Scale Discovery, Rockville, MD).
[0995] El ensayo Luminex se realizó en el Centro de Monitorización Inmunológica Humana de la Universidad de Stanford. Se adquirieron kits Mouse 38 plex de eBiosciences/Affymetrix y se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con las modificaciones descritas en la presente. Se añadieron perlas a una placa de 96 pocillos y se lavaron en una lavadora Biotek ELx405. Las muestras se añadieron a la placa que contenía las perlas mezcladas enlazadas a anticuerpos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de una incubación durante toda la noche a 4 ºC con agitación. Los pasos de incubación en frío y a temperatura ambiente se realizaron en un agitador orbital a 500-600 rpm. Después de la incubación durante toda la noche, las placas se lavaron en una lavadora Biotek ELx405 y, a continuación, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado durante 75 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente y se añadió estreptavidina-PE. Después de una incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se realizó el lavado como se ha descrito anteriormente y se añadió tampón de lectura a los pocillos. Cada muestra se midió por duplicado. Las placas se leyeron usando un instrumento Luminex 200 con un límite inferior de 50 perlas por muestra por citoquina. A todos los pocillos se añadieron perlas de control de ensayo personalizadas de Radix Biosolutions.
[0996] Los análisis estadísticos se realizaron usando Prism 5.0 (datos de Invitek) o Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc.). Los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional o ANOVA bidireccional, seguido de pruebas post hoc de Bonferroni, Tukey o Dunnett. Se consideraron significativos los valores de p < 0,05.
[0997] Resultados
[0998] La inflamación colónica inducida por oxazolona se asoció con una reducción significativa del peso corporal y una reducción de la supervivencia (grupos de control con vehículo frente a grupos de control sin tratamiento previo;
[0999] FIG.35yFIG.36).Se descubrió que esta disminución del peso corporal se atenuaba con el tratamiento con 5-ASA (p < 0,05 en los días 4-7); sin embargo, no se detectaron diferencias estadísticas en los ratones que recibieron el constructo de administración de IL-10(FIG.35). El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 mejoró la supervivencia con respecto al vehículo (aumento del 3%), mientras que el tratamiento con 5-ASA llevó a una mejora más pronunciada de la supervivencia (10%),(FIG.36). No se detectaron diferencias en la consistencia de las heces ni en la positividad de Hemoccult (presencia de sangre en las heces) entre ninguno de los grupos (datos no mostrados). El tratamiento con oxazolona indujo inflamación colónica en los ratones tratados con el vehículo, como lo indica la puntuación de gravedad histopatológica, que se atenuó con el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (p < 0,05; vehículo frente a constructo de administración de IL-10), pero no con el tratamiento con 5-ASA(FIG.37). El tratamiento con oxazolona también aumentó significativamente el peso del colon en el grupo del vehículo, lo que se mejoró con la presencia tanto del constructo de administración de IL-10 como del 5-ASA (p < 0,01 y p < 0,001 respectivamente)(FIG.38A). En comparación con los animales tratados con vehículo, se observaron mejoras con el tratamiento con el constructo de administración en cuanto a la positividad en la prueba de hemoccult(FIG. 38B), la consistencia de las heces(FIG.38C)y el índice de actividad de la enfermedad(FIG.38D). Se observó una supresión mediada por el tratamiento del aumento de los niveles séricos de factor estimulante de colonias de macrófagos 1 (MCSF,FIG.38E), proteína IL12 p70(FIG.38F)e IL-3(FIG.38G).
[1000] NFκB es un factor de transcripción que desempeña una función fundamental en la inflamación; la señalización a través de NFκB regula las citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α. Para comprender el efecto local del constructo de administración de IL-10, se analizó la expresión proteica de TNF-α, NF-kB, IL-4, CD4 y Foxp3 en secciones de colon mediante IHC (FIGS.39A-39E).La inflamación inducida por oxazolona (representada por el grupo de tratamiento con vehículo) llevó a una tendencia hacia un aumento del número de células en el colon que expresaban CD4. Estos datos indicaron la presencia de un mayor número de células T CD4+ activadas, que pueden incluir células efectoras Th2, el principal impulsor de la inflamación en este modelo. También se observó un aumento de la expresión de Foxp3 en el grupo de vehículo (356%, con respecto a los animales sin tratamiento previo). Sin embargo, al igual que el 5-ASA, el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 no provocó ningún efecto significativo en la expresión de ninguna de las proteínas investigadas.
[1001] Para evaluar aún más la eficacia del constructo de administración de IL-10 y comprender sus mecanismos de acción, se determinaron las concentraciones circulantes de 38 quimiocinas, factores de crecimiento, citoquinas antiinflamatorias y citoquinas proinflamatorias usando la matriz Luminex. La colitis inducida por oxazolona (grupo Vehículo) no provocó cambios estadísticamente significativos en los niveles plasmáticos de estas moléculas en comparación con los animales no expuestos a oxazolona (grupo sin tratamiento previo). Sin embargo, en animales con colitis inducida por oxazolona se observó una tendencia al aumento de los niveles plasmáticos de las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-23 (FIGS.40A-40B) en comparación con el grupo sin tratamiento previo; en la EII los niveles plasmáticos de estas citoquinas están elevados.
[1002] Se observó una supresión de la tendencia a la inducción de oxazolona de las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-23 con el tratamiento con 5-ASA y el constructo de administración de IL-10 (FIGS.40A-40B). En comparación con los controles del vehículo, el tratamiento profiláctico con el constructo de administración de IL-10 dio como resultado una reducción de las concentraciones plasmáticas de IL-23 e IL-6 del 73% a un 33%, respectivamente.
[1003] Se determinó la concentración plasmática de 10 citoquinas y quimiocinas que desempeñan funciones efectoras o reguladoras clave en la inflamación usando la alta sensibilidad del inmunoensayo de electroquimioluminiscencia MSD(FIGS.41A-41J) La inducción de colitis con oxazolona dio como resultado tendencias de aumento de los niveles de todas las citoquinas, excepto la IL-5, aunque no se alcanzó significación estadística para ninguna (probablemente debido a la alta variabilidad observada en los grupos de control con vehículo). Con respecto a los controles del vehículo, el constructo de administración de IL-10 redujo significativamente la expresión de IL-1β e IL-2 (p < 0,05) y reveló una tendencia a suprimir la inducción de IL-4 (62%), IL-6 (61%), IL-12p70 (65%) y el quimioatrayente de neutrófilos KC/GRO (51%).
[1004] Análisis
[1005] Este estudio de eficacia in vivo evaluó la capacidad de 8,45 mg/kg del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) administrado por sonda oral de prevenir (modo profiláctico de tratamiento) el desarrollo de colitis inducida químicamente provocada por el hapteno oxazolona. El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 mostró eficacia en este modelo, como lo demuestran los efectos beneficiosos sobre el peso del colon y la puntuación de gravedad histopatológica, que son índices patológicos relevantes establecidos previamente con este modelo de colitis inducida en ratones. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, es probable que estas observaciones sean atribuibles a un efecto directo del constructo de administración de IL-10 sobre lalámina propia.
[1006] A nivel molecular, la oxazolona aumentó el número de células T que expresan CD4 y Foxp3 en el colon. Sin embargo, este modelo de inflamación colónica inducida por oxazolona no inició la cascada significativa de quimiocinas y citoquinas generalmente asociadas con la respuesta inmunitaria en la CU. La ausencia de una respuesta robusta puede deberse a la presencia de una alta variabilidad dentro de los grupos de tratamiento.
[1007] Conclusión
[1008] En conclusión, los resultados demostraron colectivamente que el tratamiento profiláctico con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), administrado como una solución de dosificación oral de 8,45 mg/kg (mpk), tenía la capacidad de suprimir la colitis inducida por oxazolona en ratones, según se evaluó mediante los signos clínicos de la CU. Aunque la administración oral del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) no tuvo un efecto claro sobre el perfil de expresión inmunológica en el colon, la dosificación subcrónica provocó una supresión significativa y tendencial de las citoquinas proinflamatorias sistémicas asociadas con la inflamación intestinal.
[1009] Ejemplo 15: Eficacia de respuesta a la dosis de un constructo de administración de IL-10 en modelos murinos de colitis ulcerosa inducida por oxazolona y por sulfato de dextrano sódico (DSS)
[1010] El modelo experimental de colitis inducida por DSS en ratones emplea la administración de un colitógeno químico con propiedades anticoagulantes en el agua potable. La lesión provoca daños en la monocapa epitelial del intestino grueso y la dispersión del contenido intestinal proinflamatorio en el tejido subyacente. La popularidad de este modelo en la investigación de la EII se debe a su rapidez y reproducibilidad, y el modelo puede manipularse para provocar modelos agudos, crónicos y recurrentes de EII dependiendo de la concentración de DSS y la frecuencia de administración.
[1011] El ejemplo 13 demostró el potencial terapéutico del constructo de administración de IL-10 cuando se administra de forma profiláctica; una solución de dosificación oral de 8,45 mg/kg del constructo de administración de IL-10 mostró una eficacia moderada para prevenir el desarrollo de colitis, según se midió mediante múltiples parámetros de la enfermedad.
[1012] En este ejemplo, para evaluar la eficacia de respuesta a la dosis del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se usaron modelos de colitis inducida tanto por oxazolona como por DSS. En el estudio se incluyó el agente antiinflamatorio 5-ASA como control positivo para la supresión de la inflamación inducida por oxazolona. El 5-ASA se ha usado ampliamente en la práctica clínica para tratar la CU de leve a moderada debido a su relativa eficacia, seguridad y alta tolerabilidad. En el estudio con DSS se usó el inmunosupresor ciclosporina (CsA) como control positivo; este tratamiento se usa con frecuencia en la práctica clínica para el tratamiento de la enfermedad de Crohn (EC).
[1013] Para evaluar la interacción con la diana de nuestra solución de dosificación, se evaluó el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra) como candidato a biomarcador farmacodinámico del constructo de administración de IL-10. Segregado por las células epiteliales, inmunitarias y los adipocitos, el IL-1Ra se une al receptor de IL-1, pero no induce la señalización, por lo que antagoniza la inflamación mediada por IL-1. La eficacia del tratamiento profiláctico con el constructo de administración de IL-10 se evaluó mediante la evaluación de una serie de parámetros de la enfermedad in vivo. Además, también se evaluó el efecto del constructo de administración de IL-10 sobre las concentraciones circulantes de citoquinas y quimiocinas que se alteran con la inflamación intestinal.
[1014] Los objetivos de este estudio eran: (1) evaluar la respuesta a la dosis del constructo de administración de IL-10 (0,3, 1, 3 y 9 mg/kg) en la colitis murina inducida por oxazolona mediante la evaluación de múltiples parámetros de la enfermedad en vida (pérdida de peso corporal, consistencia de las heces, hemoccult), la supervivencia, la morfología del colon tras la necropsia (peso y longitud) y la histopatología del colon; (2) evaluar la respuesta a la dosis del constructo de administración de IL-10 (0,3, 3, 10, 30 mg/kg) en el modelo de colitis DSS mediante la evaluación de los parámetros de la enfermedad en vida y en la necropsia y la histología; (3) evaluar la eficacia antiinflamatoria y el mecanismo del constructo de administración de IL-10 midiendo las concentraciones plasmáticas de citoquinas y quimiocinas usando las plataformas Luminex y MSD; y (4) evaluar los posibles biomarcadores farmacodinámicos inducidos por el constructo de administración de IL-10 determinando la expresión génica en los tejidos y las concentraciones plasmáticas de IL-1Ra y la concentración tisular de pSTAT3.
[1015] Métodos
[1016] Los ratones se mantuvieron en un entorno controlado con una temperatura de 70-72 ºF, una humedad del 30-70% y un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. A los ratones se les proporcionó una dieta TEKLAD 2018-Global al 18% y agua potable Arrowhead a voluntad. Los ratones se aclimataron durante un periodo de siete días.
[1017] Se indujo colitis mediante oxazolona y se llevó a cabo un tratamiento profiláctico en ratones. Se sensibilizó previamente a ratones SJL/J hembra de entre 7 y 8 semanas de edad con una solución al 3% de oxazolona en etanol al 100% (Sigma Aldrich, EE. UU.; Nº de catálogo: E0753) en un parche de la piel dorsal el día -5 y se les administró por vía intrarectal una solución al 1% de oxazolona en etanol al 40% el día 0. Los animales fueron tratados por vía oral q.d. con soluciones de dosificación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) (0,3, 1, 3 y 9 mg/kg), aminosalicilato (5-ASA, 100 mg/kg; Sigma Aldrich, EE. UU.; Nº de catálogo: A3537) o control con vehículo (10 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja en 200 mM de bicarbonato sódico; tampón de formulación del constructo de administración de IL-10) desde el día -5 hasta el día 6. Se sensibilizó previamente a ratones sin tratamiento previo y se expusieron solo a etanol. El peso corporal y los parámetros de la enfermedad (consistencia fecal, positividad en la prueba de sangre oculta) se registraron diariamente para generar un índice de actividad de la enfermedad (DAI). Al finalizar el estudio, el día 7, se recogieron muestras de plasma y tejido colónico. Este estudio se realizó en condiciones no GLP y se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo INVITEK y los procedimientos operativos estándar de INVITEK. El diseño experimental y el número de grupos para el tratamiento con oxazolona se resumen en laTABLA 41.
[1018] [0331] La inducción de colitis murina con DSS fue realizada por Bolder BioPATH, Inc. (CO, EE. UU.). A ratones C57BL6/J hembra (de 8 a 10 semanas de edad) se les administró a voluntad sulfato de dextrano sódico al 2,5% (p/v) (Spectrum, lote Nº 2DC0020) en el agua de bebida desde el día 0 hasta el día 7. El día 7, el DSS se sustituyó por agua y los animales se mantuvieron hasta el día 10. A los ratones se les administró por vía oral (q.d.) el constructo de administración de IL-10 (0,3, 3,0, 10 o 30 mg/kg), el control del vehículo (10 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja en 200 mM de bicarbonato sódico; tampón de formulación para el constructo de administración de IL-10) o un control positivo de ciclosporina A (Teva, lote Nº 4R506001) que se preparó en Kolliphor EL (Sigma, C5135, lote Nº BCPB4773V) y carboximetilcelulosa al 1% (CMC: BBP, lote Nº 2017, lote Nº 3) a 75 mg/kg desde el día 0 hasta el día 10, cuando se sacrificaron para la recogida de plasma y tejido 4 horas después de la dosis. En laTABLA 42se resumen el diseño experimental y los números de grupo para el tratamiento con DSS.
[1020] TABLA 41: Información sobre el ru o de oxazolona el tratamiento
[1023]
[1026] TABLA 42 - Información sobre el ru o DSS el tratamiento
[1029]
[1032] Tanto para los estudios de colitis por oxazolona como por DSS, la tinción con hematoxilina y eosina de secciones transversales fijadas en formalina e incluidas en parafina de las partes proximal, media y distal del colon fue realizada por Bolder BioPath (Boulder, Colorado). Para cada región, se cortaron dos piezas equidistantes y se incluyeron en parafina. Cada pieza se evaluó individualmente y se calculó la media de los valores por separado para el colon proximal, medio, distal y total. La histopatología se evaluó de forma ciega mediante la presencia de edema, inflamación, pérdida de glándulas, erosión, espesor de la mucosa e hiperplasia para proporcionar una puntuación total. También se determinó la presencia de infiltrados de células inflamatorias y el recuento y el diámetro de los agregados linfoides.
[1034] [0333] El ensayo Luminex se realizó en el Centro de Monitorización Inmunológica Humana de la Universidad de Stanford. Se adquirieron kits Mouse 38 plex de eBiosciences/Affymetrix y se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con las modificaciones descritas en la presente. Se añadieron perlas a una placa de 96 pocillos y se lavaron en una lavadora Biotek ELx405. Las muestras se añadieron a la placa que contenía las perlas enlazadas con anticuerpos mezcladas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de una incubación durante la noche a 4 ºC con agitación. Los pasos de incubación en frío y a temperatura ambiente se realizaron en un agitador orbital a 500-600 rpm. Después de la incubación durante la noche, las placas se lavaron en una lavadora Biotek ELx405 y, a continuación, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado durante 75 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente y se añadió estreptavidina-PE. Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se realizó el lavado como antes y a los pocillos se les añadió tampón de lectura. Cada muestra se midió por duplicado. Las placas se leyeron usando un instrumento Luminex 200 con un límite inferior de 50 perlas por muestra por citoquina. A todos los pocillos se añadieron perlas de control de ensayo personalizadas de Radix Biosolutions.
[1036] Se extrajo ARN de los segmentos casi distales del colon (entre 1 y 2 cm del recto) de ratones con inflamación por oxazolona y tratados. La pureza del ARN se confirmó con relaciones de absorbancia a 260/280 de 1,9-2,15 y 260/230 > 1,7. Las muestras de ARN se transcribieron inversamente a ADNc usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Nº 74106) y el kit de síntesis de ADN c iScript™ (Bio-Rad, Nº 1708891BUN). El análisis RT-PCR de IL-IRa, IL-1β y GAPDH de ratón se realizó en duplicados técnicos usando la mezcla maestra Applied Biosystems PowerUp SYBR Green (Thermo Fisher Scientific, Nº A25777). Las secuencias de los cebadores se enumeran en laTABLA 43.La expresión de los transcritos se normalizó con respecto a la de un control interno, GAPDH, y el cambio relativo se calcularon usando el método ΔΔ-CT.
[1038] TABLA 43: Secuencias de cebadores de RT-PCR
[1041]
[1044] Las citoquinas plasmáticas se cuantificaron usando el kit V-plex Proinflammatory Panel 1 Mouset. La IL-Ra plasmática se cuantificó mediante un inmunoensayo tipo sándwich usando un par de anticuerpos del Mouse IL-1Ra/IL-1F3 DuoSet ELISA (R&D Systems Nº DY480), marcado con estreptavidina SULFO-TAG (MSD Nº R32AD-1), Paquete de placas Multi-Array de 96 pocillos, Placa SECTOR MSD Nº L15XA-3 y Read Buffer T (4x) (MSD Nº R92TC-2). Las muestras se leyeron en el lector de placas QuickPlex SQ 120 (Meso Scale Discovery, Rockville, MD).
[1046] Se usó el kit Human IL-10 Base (MSD Nº K151AOA-4) para medir la rhIL-10 en plasma. El par de anticuerpos de captura y detección anti-IL-10 humana de este inmunoensayo no reaccionó con la IL-10 de ratón, pero sí lo hizo con la IL-10 humana. Se incubó la placa MSD Small Spot IL-10 con diluyente 41 (25 µl/pocillo) durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación antes de su uso. Los controles y las muestras se diluyeron dos veces con plasma de ratón CD-1 agrupado (BioIVT, pedido personalizado), y los estándares de calibración también se prepararon en plasma de ratón. Se añadieron los estándares, las muestras diluidas y los controles (25 µl/pocillo), y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato y Tween-20 (PBST) y a la placa se añadieron 25 µl/pocillo de anticuerpo anti-IL-10 humana SULFO TAG 1X (preparado en diluyente 45). La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Tras un paso de lavado, se añadieron 150 µl/pocillo de tampón de lectura MSD 2X y se leyó la placa en el lector de placas MSD Sector Imager 600.
[1048] Los análisis estadísticos se realizaron usando Prism 5.0 (datos de Invitek) o Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc.). Para el estudio con oxazolona, los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional o ANOVA bidireccional, seguido de pruebas post hoc de Bonferroni, Dunnett o Tukey. Los datos de DSS se analizaron usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett para datos paramétricos o la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba post hoc de Dunn para datos no paramétricos. Se consideraron significativos los valores p < 0,05.
[1050] Resultados: Colitis inducida por oxazolona
[1052] La inflamación colónica inducida por oxazolona provocó una pérdida de peso corporal pronunciada (de hasta un 15%) y una reducción de la supervivencia(FIG. 42yFIG. 43).El agente antiinflamatorio 5-ASA atenuó significativamente la disminución del peso corporal inducida por oxazolona a partir de los 6 días después de la lesión (p < 0,05). El constructo de administración de IL-10 a las concentraciones más altas (1, 3 y 9 mg/kg) produjo una tendencia a la mejora en la pérdida de peso corporal. No se detectaron efectos significativos sobre el DAI, lo que refleja la consistencia fecal y la positividad en la prueba de hemoccult, entre los grupos de tratamiento(FIG.44).
[1053] Además, la oxazolona indujo una reducción de la longitud del colon y un aumento de su peso, como se refleja en el aumento de la relación peso/longitud del colon(FIG.45).Este aumento se atenuó con el tratamiento con 5-ASA; sin embargo, el constructo de administración de IL-10 no tuvo ningún efecto estadísticamente significativo sobre el peso o la longitud del colon en ninguna de las dosis probadas.
[1055] Se puntuaron siete parámetros inflamatorios (inflamación de la mucosa/submucosa, erosión, pérdida glandular, hiperplasia, edema, inflamación transmural, inflamación de la serosa) en una escala de 1 a 4 (1 = mínima, 2 = leve, 3 = moderada, 4 = marcada) para evaluar la histopatología del colon proximal, medio y distal. Basándose en la puntuación total (puntuación histológica) de estos siete parámetros, se observó que en todos los grupos de tratamiento la histopatología era más pronunciada en el colon distal y menos en el colon proximal(FIG. 46).El constructo de administración de IL-10, en todas las dosis probadas, no indujo ningún cambio en la puntuación histológica en el colon proximal, medio o distal, en comparación con el control del vehículo.
[1057] Además de los parámetros generales de la enfermedad, también se evaluó la eficacia del constructo de administración de IL-10 mediante la evaluación de las concentraciones circulantes de 38 factores de crecimiento, quimiocinas y citoquinas(FIGS. 47A-47LL).El tratamiento con oxazolona indujo un aumento en la concentración plasmática del factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF, también conocido como factor estimulante de colonias 3 o CSF3;FIG.47A)y una tendencia a un aumento del quimioatrayente de macrófagos MIP1α(FIG.47L)y de los factores de crecimiento factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF;FIG.47B)y factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF;FIG.47C),que movilizan respectivamente la liberación y diferenciación de neutrófilos y macrófagos. El pretratamiento profiláctico con el control positivo, 5-ASA, o el constructo de administración de IL-10 atenuó el aumento inducido por oxazolona de GCSF/CSF3. El MSCF también se redujo a la dosis más alta del constructo de administración de IL-10. También se observó una tendencia a la reducción en el caso de MIP1α(FIG.47L).Los cambios en los niveles de quimiocina CXC inducible por LPS (LIX,FIG.47I), factor inhibidor de la leucemia (LIF,FIG.47E)e IP10 (CXCL10,FIG.47H)inducidos por Oxa se mitigaron con el tratamiento con el constructo de administración de IL-10.
[1059] Además de afectar a las células inmunitarias innatas, las citoquinas también controlan las funciones de las células T efectoras. En consonancia con un efecto antiinflamatorio, el pretratamiento con el constructo de administración de IL-10 (dosis de 9,0 mg/kg) impidió la producción de IL-12 e IL-17, efectores clave de las células Th1 y Th17, respectivamente. El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 llevó a una reducción de las concentraciones de IL-3 (dosis de 9,0 mg/kg;FIG.47S),IL-4 (9,0 mg/kg;FIG.47T),IL-28 (3,0 y 9,0 mg/kg;FIG.47EE)e IL-31 (0,3 mg/kg;FIG.47FF)hasta niveles cercanos a los de referencias. Las concentraciones plasmáticas de IL-13(FIG. 47Y)e IL-15(FIG. 47Z)revelaron una tendencia hacia una disminución mediada por el constructo de administración de IL-10, en comparación con el control del vehículo. Más allá de las citoquinas proinflamatorias, la oxazolona (tratamiento con vehículo solo) indicó una tendencia hacia el aumento de la secreción de IL-10 endógena (FIG.47JJ)y la citoquina inmunosupresora TGF-β (FIG.47LL).Esta aparente respuesta contraria a la inflamación es congruente con el aumento observado de TGF-β en el tejido colónico de la CU. El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (3,0 mg/kg) redujo el TGF-β con respecto al vehículo y mejoró esta tendencia hacia el aumento de la secreción de IL-10 endógena. En muchas de las citoquinas analizadas, la concentración plasmática no se indujo de forma significativa después del tratamiento con oxazolona. Además, cuando se observó un aumento inducido por la oxazolona, el 5-ASA no devolvió eficazmente la expresión de la citoquina a los niveles de referencia (sin tratamiento previo) en muchos de los parámetros analizados.
[1061] Las concentraciones sistémicas de citoquinas en ratones expuestos a colitis inducida por oxazolona y tratamiento profiláctico con el constructo de administración de IL-10 se evaluaron adicionalmente usando el panel proinflamatorio MSD 10-plex. En los ratones tratados con vehículo con colitis inducida por oxazolona se redujeron el IFN-γ y la IL-5 plasmáticos en comparación con los controles sin tratamiento previo, pero no hubo diferencias significativas entre estos grupos con respecto a las otras citoquinas medidas (FIGS.48A-48J).En respuesta a la lesión de la oxazolona se observó una tendencia al aumento de la expresión de IL-1β e IL-6. Sin embargo, esta respuesta no se atenuó con la administración del control positivo, 5-ASA, ni con el constructo de administración de IL-10. Debido a la ausencia de una respuesta inflamatoria sustancial inducida por oxazolona, el efecto del tratamiento con el constructo de administración de IL-10 no fue fácil de descifrar; sin embargo, no se detectaron diferencias significativas de un tratamiento con vehículo y el constructo de administración de IL-10 para ninguna de las citoquinas analizadas.
[1063] La eficacia del constructo de administración de IL-10 en la circulación sistémica y el tejido colónico se evaluó analizando la expresión de IL-1Ra, un antagonista de IL-1β que es potenciado por la IL-10. Los niveles circulantes de IL-1Ra no se alteraron significativamente después de una lesión con oxazolona o el tratamiento con 5-ASA o el constructo de administración de IL-10(FIG. 49A), probablemente debido a la variabilidad de los datos y a la baja potencia estadística. Sin embargo, el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 indujo una tendencia dependiente de la dosis hacia el aumento de IL-1Ra. En el tejido colónico casi distal, el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 a la dosis más alta de 9 mg/kg reveló una tendencia hacia el aumento de la expresión del ARNm de IL-1Ra(FIG.49B). Este resultado también se reflejó en un aumento de la relación IL-1Ra/IL-1β(FIG.49D).
[1064] Resultados: Colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS)
[1065] Este ejemplo examina la capacidad del constructo de administración de IL-10 para suprimir la colitis multifocal de leve a moderada inducida por el sulfato de dextrano sódico (DSS), caracterizada por inflamación, edema y necrosis de la mucosa cuando este agente de unión a ácidos grasos de cadena media se presenta en el agua potable. Se administró a los ratones por vía oral una vez al día durante 10 días vehículo (como control negativo) o el constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO: 5 (0,3-30 mg/kg) desde la inducción de la colitis inducida por DSS(FIG.
[1066] 50A). Se usaron ratones a los que se les administraron diariamente 75 mg/kg de ciclosporina A (CsA) como control positivo para el modelo y no como comparador terapéutico. El constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 redujo significativamente la pérdida de peso inducida por DSS durante la parte del estudio en vida(FIG.50B). La lesión con DSS provocó una pérdida de peso de aproximadamente el 10% en el grupo Vehículo (o una diferencia del -17% con respecto al grupo sin tratamiento previo, que ganó peso)(FIG.50C). El tratamiento con CsA atenuó parcialmente la pérdida de peso corporal inducida por el DSS (p < 0,05), tal como se observó con el constructo de administración de IL-10, en la dosis más alta probada (30 mg/kg). No se produjo mortalidad en ninguno de los grupos de tratamiento. También se sumaron las puntuaciones individuales de pérdida de peso, consistencia de las heces y hemoccult en las heces (puntuadas de 0 a 3) para obtener un DAI (intervalo de 0 a 9). Con respecto a la puntuación total de 3,8 del grupo Vehículo en el día 7 (y 0 del grupo sin tratamiento previo), las puntuaciones de los grupos tratados con el constructo de administración de IL-10 oscilaron entre 4,0 y 4,3 sin correlación con la dosis, por lo que no respaldan la mejora del índice de actividad de la enfermedad (DAI) por parte del constructo de administración de IL-10 (no se disponía de puntuaciones para el día 10),(FIG.51). La mejora significativa en la longitud del colon con las dos dosis más altas del constructo de administración de IL-10 (10 y 30 mg/kg; p < 0,05 en comparación con el vehículo) indica la presencia de efectos terapéuticos dependientes del constructo de administración de IL-10(FIG.52).
[1068] La histología del colon se puntuó sobre la base de la inflamación, la pérdida glandular, la erosión y la hiperplasia (máximo de 5 en cada caso), y estos parámetros se sumaron en la puntuación global. Los cuatro parámetros aumentaron significativamente después de una lesión con DSS en el colon medio y distal (p < 0,05 frente a sin tratamiento previo). El tratamiento con CsA alivió la puntuación global de los cuatro parámetros medidos, pero el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 no reveló ninguna mejora significativa(FIG.53). También se cuantificaron cinco parámetros adicionales (edema, infiltración de neutrófilos, espesor de la mucosa, agregado linfoide y tamaño del agregado linfoide). En consonancia con la propagación de la enfermedad desde el colon distal al proximal, la histopatología fue más grave en el colon distal e insignificante en el colon proximal con el tratamiento con vehículo para varios parámetros. Con respecto al vehículo, el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (30 mg/kg) mejoró significativamente la anchura del edema(FIG.54), el espesor de la mucosa(FIG.55)y la hiperplasia(FIG.56)en la región media. La CsA no mostró ningún efecto terapéutico claro después de una lesión con DSS, con la excepción de una mejora en la puntuación de neutrófilos (p < 0,05 frente al vehículo). Por lo tanto, estos resultados histológicos indican un grado leve de eficacia local del fármaco.
[1070] En el estudio con DSS, 4 horas después de la dosis final se detectó el constructo de administración de IL-10 en concentraciones variables en la circulación. En animales tratados con el constructo de administración de IL-10 en dosis de 0,3 y 3 mg/kg, los niveles de rhIL-10 (detectados por el anticuerpo de captura anti-rhIL-10) variaron entre 10 y 300 veces por encima de las concentraciones de fondo del tratamiento con vehículo(FIG.57A); sin embargo, este efecto se pierde con dosis más altas del constructo de administración de IL-10. Además, a dosis bajas del constructo de administración de IL-10, las concentraciones más altas de rhIL-10 que del constructo de administración de IL-10 (determinadas con el anticuerpo de captura anti-cholix) indican la presencia de productos de escisión del constructo de administración de IL-10, lo que sería coherente con las actividades de proteasa prevalentes en el entorno gastrointestinal. El tratamiento profiláctico con el constructo de administración de IL-10 no pareció influir en las concentraciones plasmáticas de IL-1Ra en ninguna de las dosis probadas(FIG.57B).
[1072] Análisis
[1074] En estos estudios se evaluó la eficacia de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) para prevenir el desarrollo de colitis inflamatoria en los modelos de oxazolona y DSS. En ambos estudios se observaron tendencias de mejora en varios parámetros en vida y en la necropsia. La mejora en la longitud del colon con las dos dosis más altas del constructo de administración de IL-10 (10 y 30 mg/kg) después de una lesión con DSS proporcionó pruebas de los efectos terapéuticos dependientes del constructo de administración de IL-10. En el estudio con DSS no se observó mortalidad, mientras que después del tratamiento con oxazolona la supervivencia se redujo hasta un 30%, lo que sugiere que el protocolo con oxazolona indujo un modelo de colitis mucho más grave.
[1076] Una característica notable del modelo DSS fue que la histopatología era más consistente entre las réplicas biológicas; la variabilidad intragrupal parecía reducirse en el modelo de DSS en comparación con el modelo de oxazolona. En el modelo de DSS, el constructo de administración de IL-10 en la dosis más alta (30 mg/kg) redujo eficazmente tres parámetros histológicos, concretamente, la anchura del edema, el espesor de la mucosa y la hiperplasia, en el colon medio, pero no en el distal.
[1078] [0350] En el estudio de respuesta a la dosis con oxazolona presentado, la eficacia se demostró mediante cambios en las concentraciones de citoquinas circulantes mediadas por el constructo de administración de IL-10. La concentración plasmática de GCSF (o CSF3) aumentó en respuesta a la lesión de la oxazolona, y esta respuesta se mitigó con el tratamiento profiláctico previo con 5-ASA o el constructo de administración de IL-10. El tratamiento previo con el constructo de administración de IL-10 (dosis de 9,0 mg/kg) también impidió la producción de IL-12 e IL-17, efectores clave de las células Th1 y Th17. Además, el constructo de administración de IL-10 llevó a una reducción de las concentraciones de MCSF (dosis de 9,0 mg/kg), IL-3 (9,0 mg/kg), IL-4 (9,0 mg/kg), IL-28 (3,0 mg/kg y 9,0 mg/kg) e IL-31 (0,3 mg/kg) a niveles casi de referencias (sin tratamiento previo). Después del tratamiento con oxazolona no se alteró significativamente la concentración plasmática de muchas de las citoquinas analizadas. Cuando se produjo un aumento inducido por oxazolona, el control positivo 5-ASA no devolvió eficazmente la expresión de la citoquina a los niveles de referencia en muchos de los parámetros analizados. Por lo tanto, en ausencia de una atenuación robusta de las citoquinas inflamatorias por parte de 5-ASA, puede cuestionarse la idoneidad de este agente como tratamiento de control. Además, es posible que este modelo de inflamación inducida por oxazolona no sea suficiente para desencadenar una respuesta sistémica sustancial de citoquinas en estos ratones.
[1079] El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 a la dosis más alta de 9 mg/kg reveló una tendencia hacia el aumento de la expresión del ARNm de IL-1Ra y una tendencia hacia el aumento de la relación IL-IRa/IL-1β en el tejido colónico. Datos clínicos previos han demostrado que la relación IL-IRa/IL-1β se correlaciona inversamente con la gravedad de la EII y que la IL-10 puede restaurar la relación IL-1Ra/IL-1β. Estos resultados proporcionan evidencia de la eficacia del tratamiento con el constructo de administración de IL-10 en este modelo.Conclusión
[1080] En conclusión, en el contexto de la colitis inflamatoria inducida tanto por oxazolona como por DSS, los datos presentados en este informe indicaron que el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) demostró eficacia terapéutica, como se mide por las mejoras en los parámetros inflamatoriosin vivo.En el estudio con oxazolona, las concentraciones circulantes de IL-12, IL-17 e IL-28 fueron atenuadas por el tratamiento con el constructo de administración de IL-10, que fue acompañado por una tendencia al aumento de la relación ente IL-1Ra y IL-1β en el tejido colónico.
[1081] Ejemplo 16: Administración oral de una dosis única del constructo de administración de IL-10 en Macaca fascicularis
[1082] Como sistema modelo para evaluar la eficacia preclínica, la actividad farmacológica y la farmacocinética de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se seleccionó el primate no humano (NHP)Macaca fascicularis. Debido a la significativa similitud genética entre los humanos y los NHP,como elMacaca fascicularis,los NHP representan generalmente un modelo más adecuado para los seres humanos que los ratones, ya que los NHP imitan más fielmente la biología y la inmunología humanas. En este estudio, para investigar la apertura de las cápsulas se utilizó la adición de 10 mg de cafeína a las cápsulas del constructo de administración de IL-10.
[1083] Los objetivos de este estudio eran: (1) evaluar el impacto de una administración de dosis única en múltiples niveles (1, 4, 20,5 y 82 mg) mediante cápsulas orales en el perfil farmacocinético del constructo de administración de IL-10 (medido por la IL-10 total y el biomarcador establecido IL-1Ra) enMacaca fascicularis; (2) evaluar la respuesta de las citoquinas proinflamatorias IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 y TNFα a una dosis oral única en múltiples niveles (1, 4, 20,5 y 82 mg) del constructo de administración de IL-10 mediante cápsula enMacaca fascicularis;y (3) investigar el rendimiento de la cápsula mediante la monitorización de los niveles plasmáticos de cafeína enMacaca fascicularisa los que se les habían administrados las dosis, tal como se incluye en las cápsulas administradas por vía oral mencionadas anteriormente.
[1084] Métodos
[1085] Los constructos de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y la cafeína se cargaron por peso en cápsulas Capsugel V-Cap de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) de tamaño 1, para su administración oral. A continuación, las cápsulas se recubrieron sucesivamente en una recubridora por atomización con tres capas de polímeros. La primera y la tercera capa eran recubrimientos finos de HPMC, la primera para sellar el pliegue donde se unen las cubiertas de las cápsulas y la tercera para minimizar la adherencia de las cápsulas entre sí. La segunda capa de recubrimiento estaba compuesta por una mezcla 50:50 de polímeros acrílicos entéricos Eudragit® (Evonik Industries AG) FS 30 D y L 30 D-55, diseñados para disolverse y permitir que la cápsula se abra a un pH de 6,5. En laTABLA 44se presenta un resumen de los artículos de prueba descritos y sus correspondientes números de lote.
[1086] TABLA 44 - Resumen de los artículos de rueba
[1089]
[1090] continuación
[1093]
[1096] Antes de su uso la placa MSD Small Spot IL-10 se lavó tres veces con PBST. Los estándares se prepararon en diluyente 2 (MSD Nº de Cat R51BB) y las muestras se diluyeron dos veces en diluyente 2. Los estándares y las muestras diluidas se añadieron a la placa de ensayo y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó tres veces con PBST y 1X SULFO TAG anti-huIL-10. A la placa se le añadió anticuerpo antes de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de un paso de lavado, a los pocillos de la placa se les añadió tampón de lectura 2X MSD y la placa se leyó en el lector de placas MSD Sector Imager 600. El límite inferior de detección de cada analito se define como 2,5 desviaciones estándar por encima del fondo.
[1098] El propósito del ensayo de IL-1Ra era medir la IL-1Ra endógena en plasma de NHP. El par de anticuerpos de este inmunoensayo tipo sándwich reaccionó tanto con la IL-1Ra humana como con la de NHP. Las muestras se cuantificaron usando una curva estándar de 8 puntos preparada a partir de un calibrador de IL-1Ra humana (que varía de 5,5 a 4021 pg/ml, más 0 pg/ml). Se añadió anticuerpo de captura anti-IL-1Ra de HNP biotinilado a una placa de estreptavidina MSD Small Spot con estreptavidina y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Se prepararon controles que representaban concentraciones bajas (16 mg/ml), medias (160 mg/ml) y altas (3245 pg/ml) en plasma agrupado, se prepararon estándares (mezcla homogénea calibradora 9) en diluyente 43 (MSD Nº de Cat. R50AG) y se diluyeron las muestras 10 veces en diluyente 43. Los estándares, los controles y las muestras diluidas se añadieron a la placa de ensayo, y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó 3 veces con PBST y a la placa se le añadió anticuerpo 1X SULFO TAG anti-IL-1Ra. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de un paso de lavado, a los pocillos de la placa se añadió tampón de lectura 2X MSD y la placa se leyó con el lector de placas MSD Sector Imager 600. El límite inferior de detección de cada analito se define como 2,5 desviaciones estándar por encima del fondo.
[1100] Para cuantificar los niveles de cafeína en plasma, se empleó un sistema de detección LC-MS/MS. Se fortificó una alícuota de matriz de 25 µl con 25 µl de solución de trabajo de estándar interno de cafeína-trimetil-<13>C<3>a 2,00 µg/ml. Los analitos se aislaron mediante extracción líquida soportada (SLE). Se transfirió una parte del eluido y se evaporó bajo una corriente de nitrógeno a aproximadamente 45 ºC, y el residuo restante se reconstituyó con 500 µl de agua/acetonitrilo (95:5, v/v). El extracto final se analizó mediante HPLC con detección MS/MS usando ionización por electrospray positiva y cromatografía de fase inversa. La concentración de cafeína se determinó usando controles de calibración ejecutados de manera similar.
[1102] El panel de citoquinas (IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-6 e IL-8) se evaluó usando un kit multiplex disponible de MSD. Los ensayos de este panel fueron inmunoensayos tipo sándwich. La placa MSD venía recubierta previamente con anticuerpos de captura en puntos independientes y predefinidos, y las muestras se cuantificaron frente a una curva estándar de 8 puntos preparada usando una mezcla de las citoquinas (Mezcla de calibradores para el Panel 1 proinflamatorio (humano)) de MSD. Los estándares incluían 0 pg/ml y estos intervalos de concentración: IFNγ (0,37-1500 pg/ml), IL-1β (0,14-589 pg/ml), IL-2 (0,36-1490 pg/ml), IL-6 (0,18-721 pg/ml) e IL-8 (0,14-553 pg/ml).
[1104] La placa MSD (previamente recubierta con anticuerpos de captura) se lavó tres veces con PBST antes de su uso. Los estándares se prepararon en diluyente 2 (MSD Nº de Cat R51BB) y las muestras de ensayo se diluyeron dos veces en diluyente 2. Los estándares y las muestras diluidas se añadieron a la placa de ensayo, y la placa se incubó durante dos horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó tres veces con PBST y a la placa se le añadió una mezcla de anticuerpos de detección SULFO TAG 1X. La placa se incubó durante dos horas a temperatura ambiente con agitación. Después de un paso de lavado, a los pocillos de la placa se les añadió tampón de lectura MSD 2X y la placa se leyó con el lector de placas MSD Sector Imager 600. El límite inferior de detección de cada analito se definió como 2,5 desviaciones estándar por encima del fondo.
[1106] El propósito del inmunoensayo de TNFα era cuantificar la concentración de TNFα en plasma de primates no humanos. El par de anticuerpos de este inmunoensayo reaccionó tanto con el TNFα humano como con el de primates no humanos. Las muestras se cuantificaron usando una curva estándar de 8 puntos preparada a partir de un calibrador de TNFα humano con una concentración que varía de 5,6 a 4052 pg/ml e incluye 0 pg/ml.
[1108] [0362] El anticuerpo de captura anti-TNFα de NHP biotinilado se añadió a una placa MSD Small Spot con estreptavidina y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Los controles se prepararon en plasma agrupado, los estándares en diluyente 43 (MSD Nº de Cat R50AG) y las muestras de prueba se diluyeron 2 veces en diluyente 43. Los estándares, los controles y las muestras diluidas se añadieron a la placa de ensayo, y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó 3 veces con PBST y a la placa se le añadió anticuerpo 1X SULFO TAG anti-huTNFα. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de un paso de lavado, a los pocillos de la placa se les añadió tampón de lectura 2X MSD y la placa se leyó con el lector de placas MSD Sector Imager 600. El límite inferior de detección de cada analito se definió como 2,5 desviaciones estándar por encima del fondo.
[1109] Se analizaron muestras de plasma para determinar el contenido total de IL-10, IL-1Ra y cafeína, así como un panel de citoquinas proinflamatorias. Los límites inferiores de cuantificación (LLOQ) de los ensayos fueron: IL-10 total = 0,3 pg/ml; IL-1Ra = 78 pg/ml; y cafeína = 25 ng/ml. La concentración plasmática de IL-10 puede referirse a la concentración plasmática tanto de la IL-10 natural como de la IL-10 unida a un portador (por ejemplo, la IL-10 en un constructo de administración de IL-10 descrita en la presente).
[1110] La administración del constructo de administración de IL-10 a múltiples dosis fijas enMacaca fascicularismachos adultos tratados previamente fue realizada por Valley Biosystems (West Sacramento, CA). Se trató a NHP adultos por vía oral con cápsulas que contenían una dosis fija del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y 10 mg de cafeína (1, 4, 20,5 y 82 mg). Los grupos de dosificación se describen en laTABLA 45.
[1111] TABLA 45: Resumen de los ru os de dosis
[1114]
[1117] Los animales permanecieron en ayunas hasta después de la recogida de muestras de sangre a las 3 horas, momento en el que se les proporcionó alimento. Para la administración de las dosis, se sujetó manualmente a los animales y se les colocó un bloqueador de mordida entre las mandíbulas. Se insertó en la parte posterior de la cavidad oral una pistola para píldoras que contenía la cápsula de dosificación y se liberó la cápsula. Se administraron hasta 4 cápsulas consecutivamente y se proporcionó una pequeña cantidad de agua para inducir la deglución. Una vez confirmada la administración de la dosis, se retiró el bloqueador de mordida y se liberó la cabeza.
[1118] Se recogieron muestras de sangre de cada animal en tubos K<2>EDTA antes de la administración de la dosis y a las 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 24 horas después de la administración. Los animales fueron devueltos a sus jaulas después de la recogida de muestras a las 2 horas. Después de la inmovilización física, se recogieron muestras de sangre mediante punción venosa directa en la vena cefálica, femoral o safena, que se procesaron para obtener plasma y se almacenaron congeladas a -60 ºC hasta su envío.
[1119] Resultados
[1120] En laFIG.58se presentan los perfiles de concentración-tiempo de la IL-10 total en plasma para todos los grupos de dosificación. Después de la administración oral del constructo de administración de IL-10 en cápsulas a 82 mg (4 cápsulas de 20,5 mg), la concentración plasmática de IL-10 total alcanzó una Cmax de 1,34 pg/ml a una Tmax de 2 horas después de la dosis. La administración de 20,5 mg (1 cápsula de 20,5 mg) del constructo de administración de IL-10 también dio como resultado un Tmax de 2 horas después de la dosis, con una Cmax significativamente menor (0,45 pg/ml) que la dosis de 82 mg. El Tmax para las dosis de 1 mg (1 cápsula de 1 mg) y 4 mg (4 cápsulas de 1 mg) fue posterior al de las dosis más altas (4 horas y 3 horas, respectivamente) y, en particular, la Cmax para la dosis de 1 mg fue de más de la de la dosis de 4 mg (0,39 frente a 0,27 pg/ml, respectivamente). Seis horas después de la dosis, la concentración plasmática de IL-10 total había vuelto al nivel de referencia.
[1121] E laFIG.59se presentan los perfiles de concentración-tiempo de IL-1Ra en plasma para todos los grupos de dosificación.Después de la administración oral de 82 mg del constructo de administración de IL-10, la concentración plasmática de IL-1Ra en NHP alcanzó una Cmax de 26.367 pg/ml a las 3 horas después de la dosis. En los niveles de dosis más bajos (1, 4 y 20,5 mg) no se observó ninguna relación de respuesta a la dosis para la Cmax. En todos los grupos de dosis, la concentración plasmática de IL-1Ra volvió a los niveles de referencia 24 horas después de la administración.
[1122] [0369] En laFIG.60se presenta la concentración plasmática de cafeína en NHP después de una única dosis con el constructo de administración de IL-10/cápsulas de cafeína, tal como se especifica en laTABLA 45. Dee señalarse que los animales de los grupos de dosificación de 1 mg (1 cápsula de 1 mg) y 20,5 mg (1 cápsula de 20,5 mg) recibieron cada uno una dosis de 1 x 10 mg de cafeína, mientras que los animales a los que se administraron dosis de 4 mg (4 cápsulas de 1 mg) y 82 mg (4 cápsulas de 20,5 mg) recibieron cada uno una dosis de 4 x 10 mg de cafeína. Esto explica la C<max>significativamente más alta de cafeína observada en los grupos de dosificación de 4 y 82 mg (6117 ng/ml y 3793 ng/ml, respectivamente) que en los grupos de dosificación de 1 y 20,5 mg (1352 ng/ml y 800 ng/ml, respectivamente). La absorción de cafeína era observable entre 2 y 3 horas después de la dosis (lo que demuestra la apertura de las cápsulas) y el Tmax para todas las dosis fue de 4 horas después de la dosis.
[1123] La administración de cápsulas del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) no se asoció con ninguna tendencia consistente en los niveles plasmáticos de IFNγ(FIG.61A),IL-1β(FIG.61B),IL-2(FIG.61C),IL-8(FIG. 61D)o IL-6(FIG. 61E)en plasma,aunque se observó una alta variabilidad y una marcada influencia de los valores atípicos en los valores medios para puntos temporales individuales para el IFNγ, IL-2, IL-6 e IL-8 en plasma. Una cuantificación similar del TNFα no mostró inducción, ya que las señales de todas las muestras estaban por debajo del límite de detección (datos no mostrados).
[1124] Además, se evaluaron los niveles plasmáticos de IL-10, IL-1Ra e IFN-γ después de la administración de cápsulas del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y se compararon con la administración intravenosa del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)(FIGS.104A-104C).La administración oral del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en primates no humanos mediante cápsulas con recubrimiento entérico aumentó la IL-1Ra sin inducción significativa de IFN-γ.
[1125] Análisis y conclusiones
[1126] La concentración sistémica del constructo de administración de IL-10 (medida por la IL-10 total) aumentó significativamente por encima de los niveles de referencia en todos los niveles de dosis (1, 4, 20,5 y 82 mg) y volvió a los niveles de referencia en el plazo de las seis horas siguientes a la administración de la dosis. No pareció haber una relación clara con la dosis en cuanto a la exposición total a la IL-10, aunque la dosis más alta del constructo de administración de IL-10 (82 mg) dio como resultado la C<max>más alta<.>La IL-1Ra fue inducida por la administración del constructo de administración de IL-10 en todos los grupos de dosificación sin una relación clara con la dosis, aunque, al igual que en el caso de la IL-10 total, la dosis más alta del constructo de administración de IL-10 (82 mg) dio como resultado la C<max>más alta<.>
[1127] La concentración plasmática de cafeína se usó como marcador de la apertura y el rendimiento de las cápsulas. La absorción de cafeína fue observable entre 2 y 3 horas después de la dosis (lo que demostró la apertura de las cápsulas) y el Tmax para todas las dosis fue de 4 horas después de la dosis.
[1128] La administración de las cápsulas del constructo de administración de IL-10 no se asoció con ninguna tendencia consistente en los niveles plasmáticos de IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-6 o IL-8.
[1129] Ejemplo 17: Direccionamiento de las células en la lámina propia
[1130] Para realizar estudios in vivo en los que se examinó la orientación celular en lalámina propiade un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se usaron ratas Wistar adultas macho (de 7-8 semanas de edad) con un peso medio de aproximadamente 250 g. A las ratas se les anestesió usaron isoflurano inhalado y se sacrificaron con CO<2>inhalado.
[1131] Los experimentos se iniciaron realizando una incisión abdominal de aproximadamente 4 cm para acceder a la región media del yeyuno del intestino delgado. Después de realizar la incisión, se inyectaron 50 µl de una solución preparada del constructo de administración de IL-10 (normalmente a aproximadamente 1 mg/ml) en la luz intestinal de una zona sin alimentos mediante una aguja de calibre 27 usando una jeringuilla de 1 ml. El mesenterio adyacente al sitio de la inyección se marcó con un marcador y el intestino se devolvió a la cavidad abdominal, la incisión cerrándose con pinzas.
[1132] En momentos específicos, se recuperó el intestino inyectado, se aisló quirúrgicamente y se lavó con PBS isotónico a 4 ºC. Las muestras lavadas y extirpadas se fijaron (paraformaldehído al 4% en PBS) durante la noche a 4 ºC antes de la deshidratación mediante una serie graduada de soluciones de etanol/agua y la incubación durante la noche en cloroformo.
[1133] [0378] Los tejidos deshidratados se sumergieron en cera, se seccionaron y se montaron en portaobjetos de polilisina y se procesaron para la recuperación de antígenos usando citrato de sodio. Después, las secciones se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,2% en PBS antes de lavarlas tres veces en PBS y bloquearlas con BSA al 2% suero al 2% del animal del que se habían obtenido los anticuerpos secundarios. Los anticuerpos primarios se diluyeron en BSA al 1%, Triton-X100 al 0,1% en PBS y se incubaron durante toda la noche a 4 ºC en aire humidificado. Los anticuerpos secundarios fluorescentes se diluyeron en BSA al 1%, Triton-X100 al 0,1% en PBS y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente antes de procesarlos para microscopía confocal. En ocasiones, se recogió una sección de aproximadamente 1 cm del intestino en el sitio de la inyección para realizar estudios bioquímicos.
[1134] Las proteínas para tipos celulares específicos se examinaron mediante inmunofluorescencia usando microscopía confocal. Los componentes del constructo de administración de IL-10 (el portador, también denominado en la presente "cholix", y la IL-10) se siguieron por separado con un anticuerpo policlonal (pAb) o un anticuerpo monoclonal (mAb) contra la IL-10, o con un pAb o mAb contra el dominio portador, para permitir la colocalización con los pAb o mAb disponibles (TABLA 46).
[1135] TABLA 46: Resumen de Ab mAb
[1138]
[1140] El constructo de administración de IL-10 mostró poca o ninguna colocalización con lisosomas positivos para LAMP1 en enterocitos, pero se acumuló dentro de las células de lalámina propia, lo que es congruente con su consumo final, donde esta proteína se dirigió a los lisosomas(FIG.62).Se realizó un pulso de 1 minuto, seguido de un estudio del curso temporal que verificó que, en 15 minutos, una gran cantidad del constructo de administración de IL-10 alcanzóla lámina propiay se introdujo en las células a las que se dirigía el componente portador de este constructo.
[1141] El antígeno CD11c marcó un conjunto disperso de células (por ejemplo, células dendríticas) dentro de lalámina propiadel yeyuno de la rata. El constructo de administración de IL-10 no se colocalizó con el antígeno CD11c en ninguna medida notable(FIG. 63).Curiosamente, las vesículas cercanas a la superficie apical de los enterocitos se marcaron conjuntamente para CD11c e IL-10, lo que sugiere una interacción entre la proteína portadora y un compartimento vesicular que albergaba este antígeno.
[1142] El constructo de administración de IL-10 no se colocalizó con las pocas células positivas para CD19 (por ejemplo, linfocitos B) dentro de lalámina propia(FIG.64).
[1143] El constructo de administración de IL-10 no se colocalizó con las pocas células positivas para CD34 (por ejemplo, endoteliales) dentro de lalámina propia(FIG.65).
[1144] El constructo de administración de IL-10 mostró una notable colocalización con el antígeno CD3, lo que sugiere un importante direccionamiento de la proteína portadora hacia los linfocitos T dentro de lalámina propia(FIG.
[1145] 66).Además, las células compatibles con los linfocitos intraepiteliales también fueron un sitio de colocalización.
[1146] Las células dentro de lalámina propiadel yeyuno de ratón mostraron algunos de los mismos resultados de direccionamiento que los observados en la rata. Sin embargo, la complicación de estos estudios es la capacidad de la IL-10 humana para ser reconocida por el receptor de IL-10 del ratón, lo que en algunos casos lleva a dos posibles destinos celulares.
[1147] En conclusión, el portador en el constructo de administración de IL-10 usado para facilitar la transcitosis de la IL-10 humana a través de los enterocitos parece acceder a una población selecta de células dentro de lalámina propia.El destino del portador dentro de estas células diana parece cruzarse con un compartimento positivo para LAMP1 que muy probablemente sea el lisosoma, lo que sugiere su aparente destrucción local dentro de lalámina propia.Los linfocitos T parecen ser el tipo de célula más grande presente dentro de lalámina propiaque fue objetivo del portador usado en el constructo de administración de IL-10.
[1148] Ejemplo 18: comparación entre comprimidos y cápsulas
[1149] Para evaluar la liberación del fármaco de las cápsulas del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y comparar su rendimiento con el de los comprimidos, se obtuvieron cápsulas del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) con varias condiciones de recubrimiento, desde el recubrimiento con HPMC hasta el recubrimiento con Eudragit con diferentes aumentos de peso.
[1150] Las cápsulas con recubrimiento solo de HPMC mostraron una pureza y concentración del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) significativamente mayores en comparación con las que tenían recubrimiento entérico. Aunque, como era de esperar, la presencia del recubrimiento de Eudragit provocó un retraso en la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), el impacto sobre la pureza del dímero y la cantidad de fármaco activo liberado contrasta con los resultados obtenidos para los comprimidos recubiertos con HPMC en las mismas condiciones de disolución(FIG.68).
[1151] Se examinó la disolución de cápsulas de HPMC de tamaño 1 que contenían 20 mg del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y estaban recubiertas con cantidades variables (de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 35 mg) de una relación en peso del recubrimiento de 50:50 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D. El recubrimiento de Eudragit retrasó la liberación del constructo de administración de IL-10 de la cápsula, pero tuvo un efecto negativo sobre la pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (% de dímero)(FIG.68). La disolución se midió en un aparato de disolución de Tipo 4, en modo de flujo continuo, en un tampón de disolución de pH 7,0 a 37 ºC. La prueba de disoluciónin vitroque se usa para estas determinaciones es una de las varias que son estándar en la técnica, en particular para comprimidos de liberación prolongada,véase, por ejemplo, USP <711> Disolución o Ph. Eur.2.9.3. Las pruebas para el constructo de administración de IL-10 se realizan en el aparato USP 4 (un aparato de célula de flujo continuo, en modo abierto, en tampón de disolución de pH 7,0 a 37 ºC). En el aparato se colocan comprimidos individuales y se toman muestras en los momentos especificados (por ejemplo, 10, 20, 30 y 60 minutos). El muestreo se realizó recogiendo la solución de flujo a través de la solución de los tubos que llevan a la botella de residuos. La solución de muestra se mantuvo en viales sobre hielo antes del análisis SEC HPLC. En cada punto temporal, se determina la concentración del constructo de administración de IL-10 en la muestra de fluido (por ejemplo, mediante un método HPLC validado), lo que permite calcular la cantidad que se ha liberado de un comprimido.
[1152] Por el contrario, en el caso de los comprimidos, el recubrimiento de Eudragit retrasó la liberación del constructo de administración de IL-10 del comprimido sin afectar a la pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (% de dímero)(FIG.69).Los comprimidos eran de la formulación de comprimidos F3, con una concentración del constructo de administración de IL-10 de 6 mg, recubiertos por atomización con HPMC y, a continuación, se les aplicó una relación de recubrimiento de 50:50 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D. Se examinaron dos pesos diferentes de recubrimiento de Eudragit (8 mg y 20 mg). La disolución se midió en un aparato de disolución de Tipo 4, en modo de flujo continuo, en un tampón de disolución de pH 7,0 a 37 ºC.
[1153] Se calculó la cantidad de constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) liberada para comprimidos y cápsulas con diferentes cantidades de recubrimiento(FIG.70).Las impurezas relacionadas (agregados de HMW (alto peso molecular) y monómeros de LMW (bajo peso molecular)) se cuantificaron mediante SEC. La suma del principio activo (dímero) y las impurezas proporcionó la cantidad total de materiales relacionados con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) liberados de la formulación. Los resultados obtenidos indicaron además la diferencia de rendimiento entre los comprimidos y las cápsulas con respecto a la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[1154] En general, los comprimidos recubiertos mostraron una liberación comparable del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a la de los comprimidos no recubiertos. La cantidad total de sustancias relacionadas con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) liberadas de los comprimidos fue, en general, cercana a la cantidad de constructo de administración de IL-10 en el comprimido, aunque se observó cierta pérdida de proteína a niveles de recubrimiento más altos. Además, la pureza relativa del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) cuando se consideró para todo el material a lo largo del estudio de disolución fue aproximadamente el 50% del material total liberado para todos los comprimidos. Las cápsulas recubiertas con Eudragit mostraron una proporción y cantidad relativamente bajas de liberación del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), y la mayor parte de la proteína se identificó como agregados de HMW. La proteína total liberada también se redujo, presumiblemente como resultado de la formación de especies insolubles en la agregación avanzada.
[1155] En este modelo también puede determinarse el grado de componentes inactivos, como los agregados de alto peso molecular y el monómero,. En el grupo de disolución de comprimidos que se muestra en la parte izquierda de laFIG.70, se usó un comprimido sin recubrimiento como referencia, y la composición del recubrimiento varió de 50:50 (FS a L30D) a 80:20 (FS a L30D) con un aumento del peso del recubrimiento de 8 mg, 13 mg y 20 mg.
[1156] El rendimiento mejorado de los comprimidos con respecto a las cápsulas puede deberse a la forma del API dentro de cada formulación, la naturaleza del proceso de disolución y/o la cantidad relativa de Eudragit.
[1157] [0395] El peso del recubrimiento en los comprimidos con recubrimiento entérico puede ser significativamente menor que en las cápsulas, debido a la menor área superficial para un peso determinado de API (comprimido prensado frente a relleno de polvo en cápsula), y también a la geometría de la superficie del comprimido, sin la unión entre la tapa y el cuerpo de la cápsula, lo que facilita conseguir un recubrimiento uniforme del comprimido para un peso dado. Los comprimidos pueden usar un recubrimiento de menor espesor. Por tanto, debido a un área superficial menor y/o un espesor menor, los comprimidos pueden tener menos polímero (por ejemplo, Eudragit) por cantidad de constructo de administración de IL-10 en comparación con una cápsula.
[1158] Además, la naturaleza de la disolución de la cápsula puede ser perjudicial para la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). El constructo de administración de IL-10 encapsulado puede estar dispuesto de manera relativamente suelta dentro de un polvo desde el interior del cuerpo de la cápsula. Tras el acceso inicial del fluido a través de la cápsula en disolución, puede humedecerse una cantidad sustancial (por ejemplo, la totalidad) de la proteína. Esta humectación rápida puede llevar a la agregación o alterar de otro modo la estructura del dímero. Por el contrario, en un comprimido, el constructo de administración de IL-10 puede homogenizarse y comprimirse en una matriz insoluble que no se humedece inmediatamente en su totalidad tras entrar en contacto inicial con el fluido, sino que se disgrega y se disuelve durante un período más largo a medida que se disuelve la cápsula. Esto puede reducir la propensión a la agregación durante la disolución del comprimido y aumentar la probabilidad de mantener el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en la forma de dímero activo.
[1159] Ejemplo 19: Comparación de comprimidos recubiertos frente a comprimidos no recubiertos en un dispositivo de disolución de Tipo 4
[1160] Se planteó la hipótesis de que la menor pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) observada en la disolución de los comprimidos recubiertos en comparación con los comprimidos sin recubrimiento podría reflejar la presencia simultánea en la solución de polímeros Eudragit disueltos y del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), ya que se había demostrado don anterioridad que esta combinación provocaba la pérdida del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Sin embargo, esto puede que no refleje la situación in vivo de la disolución de los comprimidos, ya que el material de recubrimiento puede tener un contacto más limitado con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en el tracto gastrointestinal después de la administración oral. En cambio, a medida que el comprimido se desplaza por el intestino, el material de recubrimiento podría eliminarse gradualmente del núcleo del comprimido antes de la liberación completa del fármaco, separando así los materiales de recubrimiento de la proteína.
[1161] Para predecir mejor la liberación del fármaco en el tracto gastrointestinal se implementó un método de flujo in vitro con un aparato de disolución USP de Tipo 4(FIG.98). En comparación con el aparato de Tipo 2 (disolución realizada en una cámara agitada sin flujo activo), el instrumento de Tipo 4 puede funcionar en "modo abierto", por lo que se suministra un flujo constante de medio de disolución para mantener condiciones de sumidero infinito (es decir, sin acumulación local de proteínas o componentes del comprimido).
[1162] Se evaluaron comprimidos recubiertos y no recubiertos del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) mediante disolución in vitro usando el aparato de Tipo 4 en modo abierto (flujo continuo)(FIG.69).Como era de esperar, se retrasó la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en función del aumento del peso del recubrimiento, pero el perfil de liberación (contenido de dímeros) no se vio afectado por el recubrimiento, mostrando una pureza inicial de dímeros y una tasa de degradación comparables para cada comprimido(FIG.69).
[1163] Los comprimidos recubiertos también mostraron una liberación retardada, pero el contenido de dímeros del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se redujo sustancialmente en comparación con los comprimidos no recubiertos, presumiblemente debido a la incompatibilidad del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) y los polímeros Eudragit. Se espera que el instrumento de Tipo 4 proporcione un entorno más representativo del comportamiento de un comprimido recubierto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, simule mejor el rendimiento in vivo.
[1164] Además de monitorizar la pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), durante la disolución de Tipo 4(FIG. 98)se obtuvo la cantidad de fármaco liberado en cada punto temporal. Cada comprimido mostró una duración similar de la liberación del fármaco, y el aumento de las cantidades de recubrimiento retrasó la disolución del fármaco. Estos datos sugirieron que, una vez se hubo iniciado la disgregación del comprimido, el proceso de liberación progresó de manera similar, y el núcleo del comprimido recubierto experimentó el mismo proceso de hidratación superficial y disgregación una vez eliminado el material de recubrimiento, independientemente del espesor del recubrimiento. Por lo tanto, la característica de liberación retardada que proporciona el recubrimiento entérico tuvo poco o ningún impacto sobre la calidad del fármaco en el núcleo del comprimido.
[1165] Un segundo conjunto de comprimidos recubiertos con una formulación diferente de Eudragit mostró un comportamiento de disolución similar(FIG.99),lo que respalda aún más que en estas condiciones la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) no se vio afectada significativamente por el recubrimiento en el aparato de Tipo 4.
[1166] Ejemplo 20: recubrimiento con HPMC-AS de comprimidos
[1167] [0403] También se evaluaron alternativas a los recubrimientos de Eudragit. Se seleccionó acetato succinato de hipromelosa (HPMCAS) AQOAT® (Shin-Etsu) por sus propiedades similares de respuesta al pH y por su característica estructura iónica débil. Estas características contrastan con la fuerte estructura iónica de los Eudragits y podrían llevar a una mejor compatibilidad con la integridad estructural del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) durante los procesos de recubrimiento de los comprimidos y liberación del fármaco. Se realizó un cribado preliminar de compatibilidad. Se compararon Eudragit L30D-55 y FS 30D con los productos AQOAT® AS-HF y AS-MF, que, según se informa, se vuelven solubles a un pH de 6,8 y 6,0, respectivamente. En laTABLA 47se muestra la pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) incubado con varios agentes de recubrimiento en PBS, medida por el contenido de dímeros. La incubación con AS-HF y AS-MF mostró poca o ninguna degradación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), lo que indica una mejora significativa de la compatibilidad del fármaco por tales derivados de HPMC-AS.
[1169] TABLA 47: Compatibilidad de los materiales de recubrimiento con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5); 2 h de incubación con la proteína del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en PBS la inte ridad de la estructura se analizó mediante el método SEC.
[1172]
[1175] Se evaluaron comprimidos de constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) recubiertos con 50:50 de AS-HF y AS-MF mediante disolución en un dispositivo de tipo 4(FIG.100, FIG.101). Se descubrió que la pureza inicial del dímero del material liberado era esencialmente idéntica a la del principio activo (constructo de administración de IL10 liofilizado), lo que indica que el recubrimiento de HPMCAS tiene poco impacto sobre la pureza del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). El retraso en la liberación se correlacionó con el espesor del recubrimiento del comprimido, mostrando una velocidad de liberación comparable después del retraso inicial y similar a la de los comprimidos sin recubrimiento, lo que indicaba además que los materiales de recubrimiento no tenían ningún efecto negativo durante la disgregación del comprimido.
[1177] Los comprimidos recubiertos con HPMC-AS mostraron perfiles de liberación esencialmente equivalentes o mejorados en comparación con los comprimidos del constructo de administración de IL-10 recubiertos con Eudragit (SEQ ID NO: 5), según se caracterizó por la pureza del fármaco, la velocidad de degradación y la exposición al fármaco (AUC de la concentración de dímeros) in vitro. Esto se ilustró además mediante pruebas de disolución en un aparato de tipo 2(FIG.102, FIG.103). Con respecto a las pruebas realizadas en un aparato de disolución de Tipo 4, el impacto de la incompatibilidad de un recubrimiento y el constructo de administración de IL-10 se hizo más visible en este entorno. Es probable que la liberación in vivo real sea más análoga a las condiciones empleadas con un aparato de disolución de Tipo 4. No obstante, en ambos casos, los recubrimientos de HPMC-AS mostraron perfiles de estabilidad del fármaco más ventajosos que los recubrimientos de Eudragit.
[1179] Se representó gráficamente la pureza del dímero y la concentración de la liberación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en función del tiempo de disolución. En un aparato de disolución de tipo 2, los comprimidos con mayor peso de recubrimiento se correlacionaron con un mayor retraso en la liberación. La concentración del fármaco alcanzó la concentración acumulativa máxima en 20-30 minutos después de la disgregación inicial, lo que se correlaciona con lo observado en la disolución en el dispositivo de tipo 4, en el que la disgregación se completó en un intervalo de tiempo similar después de que se rompiera inicialmente el recubrimiento.
[1181] En resumen, los materiales de recubrimiento de HPMCAS demostraron una compatibilidad química superior con el dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en comparación con los Eudragit. Los comprimidos del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) recubiertos con HPMCAS mostraron perfiles de liberación esencialmente equivalentes o mejorados en términos de pureza del dímero y exposición en dos modelos de disolución in vitro de uso común. La disolución en dos etapas en el modelo de flujo continuo confirmó que el recubrimiento era sensible al pH, ya que era estable a un pH más bajo y se volvía lábil a un pH alto para la liberación del fármaco. Se descubrió que el recubrimiento de HPMCAS proporcionaba protección al constructo de administración de IL-10 a un pH bajo. La protección del fármaco mediante el recubrimiento a un pH bajo resultó eficaz, ya que la exposición al fármaco en la prueba de disolución se mantuvo igual con o sin tratamiento ácido.
[1183] Ejemplo 21: Evaluación de la farmacocinética y la farmacodinámica de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) mediante administración pancolónica a través de sigmoidoscopia en primates no humanos
[1184] [0408] Este estudio no GLP se realizó para investigar la PK y la PD en monos cynomolgus macho (n = 3/grupo) a los que se administró una dosis única de 1, 3 o 10 mg del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) mediante la administración pancolónica a través de sigmoidoscopia. La solución del constructo de administración de IL-10 (en concentraciones de 0,1, 0,3 y 1,0 mg/ml para los grupos de dosis baja, media y alta, respectivamente) se administró por vía rectal mediante sigmoidoscopia y una jeringuilla conectada a una boquilla pulverizadora con un patrón de pulverización de 360º. Se recogieron muestras de biopsia en serie mediante sigmoidoscopia (antes de la dosis, 0,25, 0,5, 0,75, 8 y 24-28 horas después de la dosis). Se recogieron muestras de plasma en serie desde 0 minutos antes de la dosis hasta entre 24 y 28 horas después de la dosis para analizar el constructo de administración de IL-10.
[1185] Concentración plasmática de IL-10 total y constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)
[1186] La exposición, determinada por la concentración total de IL-10, resultante de una dosis única del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) administrada directamente al colon mediante sigmoidoscopio, se detectó en el plasma en el plazo de los 15 minutos siguientes a la administración(FIG. 71A). La exposición a la IL-10 total aumentó con la dosis y el t<max>se produjo en el plazo de una hora después de la administración en los tres grupos de dosis (1, 3 y 10 mg)(FIG.71A). Además del análisis de la IL-10 total, se determinó la concentración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) mediante un anticuerpo de captura anti-cholix<386>, junto con un anticuerpo de detección anti-IL-10 humana. La concentración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)(FIG.71B)fue 10 veces menor que la de la IL-10 en dosis de 3 mg y 10 mg(FIG. 71A). Entre los grupos no se observó una respuesta dependiente de la dosis en el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Las concentraciones plasmáticas más bajas del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), en comparación con la IL-10 total, implican que el constructo de administración de IL-10 circulante (SEQ ID NO: 5) puede estar compuesto por versiones escindidas o procesadas de otro modo del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), en las que el dominio de cholix<386>(SEQ ID NO: 4) ya no estaba conjugado con rhIL-10.
[1187] Concentración plasmática de IL-1Ra después de la administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)
[1188] En las tres dosis (1, 3 y 10 mg) se observó una inducción de la concentración plasmática de IL-1Ra. A concentraciones más altas se detectó IL-1Ra en respuesta a las dosis de 3 y 10 mg, en comparación con 1 mg(FIG.
[1189] 71C); sin embargo, se detectó una alta variabilidad intragrupal y no se observó una respuesta clara dependiente de la dosis. La ausencia de un efecto dependiente de la dosis a las concentraciones más altas del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sugirió que la inducción de IL-1Ra por IL-10 se saturó a la dosis de 10 mg. La IL-10 total alcanzó su máximo aproximadamente a las 0,5-1 h(FIG.71A), y la concentración plasmática máxima de IL-1Ra se produjo a las 3-4 h(FIG.71C). A pesar de las considerables variaciones en la exposición y la producción de IL-1Ra entre los animales, la cinética relativa de la detección de IL-10 total e IL-1Ra sugirió que la inducción de IL-1Ra puede estar mediada por el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5).
[1190] Concentración plasmática de citoquinas proinflamatorias después de la administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)
[1191] La administración colónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) no llevó a un aumento de las concentraciones sistémicas de las citoquinas proinflamatorias IFN-γ, IL-1β, IL-2 o IL-8, pero se indujo moderadamente la IL-6 en los grupos de 3 y 10 mg(FIG.72).
[1192] Se detectó en el tejido colónico(FIG.105C)y en la circulación sistémica(FIG.105A)la exposición, evaluada por la concentración total de IL-10, a partir de una dosis única del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) administrado directamente en el colon mediante sigmoidoscopio. La exposición también se evaluó mediante la concentración de IL-1Ra en la circulación sistémica (FIG.105B). Se detectó un aumento dependiente de la dosis de IL-10 total en el tejido, que alcanzó su máximo en el primer punto de muestreo de 15 minutos. Además del análisis de IL-10 total, se determinó la concentración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en el tejido colónico. Las concentraciones del constructo de administración de IL-10 en el tejido (SEQ ID NO: 5) no revelaron una clara dependencia de la dosis entre los grupos(FIG.105D).La concentración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) aumentó 15 minutos después de las dosis de 1 y 10 mg, con una alta variabilidad detectada dentro de los grupos.
[1193] Concentración de IL-1Ra en el tejido colónico después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)
[1195] Se evaluó la concentración de IL-1Ra en el tejido colónico de NHP después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a dosis de 1, 3 y 10 mg. En los lisados de tejido colónico se detectaron altas concentraciones de IL-1Ra endógena en el valor inicial y la concentración de IL-IRa no aumentó adicionalmente en respuesta al constructo de administración de IL-10(FIG.73).
[1196] Fosforilación de STAT3 en el tejido después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)
[1197] La fosforilación de STAT3 es un evento temprano posterior a la activación del receptor de IL-10. Se investigó la fosforilación de STAT3 en muestras de tejido colónico de varios puntos temporales (15, 30 y 45 minutos, 8 horas y 24 horas) después de la administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). En el tejido colónico se observaron relaciones más elevadas de pSTAT3/STAT3, indicativas de la activación de STAT3 en el colon, después del tratamiento con el constructo de administración de IL-10 en todas las dosis probadas(FIG.74).
[1198] Análisis de las concentraciones de citoquinas proinflamatorias en lisados de tejido colónico después de la administración pancolónica del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)
[1199] No se observó inducción de citoquinas proinflamatorias en el tejido colónico; sin embargo, hubo evidencia de un aumento en las concentraciones plasmáticas de IL-6 con el tratamiento con el constructo de administración de IL-10(FIG.75).
[1200] Se analizaron biopsias de colon en cada punto temporal del tejido para determinar la concentración local del constructo de administración de IL-10, la IL-10 total, la IL-1Ra, las citoquinas solubles, la activación de STAT3 y la expresión génica después de la administración del constructo de administración de IL-10. El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 reguló al alza una serie de genes antiinflamatorios, que incluyen notablemente CD163, miR24-2 y NOX1, que desempeñan funciones en la diferenciación o la función de los macrófagos M2 tolerogénicos. Además, STC1, MTNR1A y VNN2 codifican proteínas que suprimen la vía de señalización de NFkβ, una vía a través de la cual se regulan las citoquinas proinflamatorias clave. El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 reguló a la baja la expresión de la enzima metabolizadora de fármacos CYP1A1; sin embargo, el ayuno de 12 horas previo al tratamiento podría haber influido en la expresión de CYP1A1(FIG. 76). La administración del constructo de administración de IL-10 disminuyó una serie de genes proinflamatorios, incluyendo MHCII y PLA2G2D, que son expresados por las células dendríticas y los macrófagos. Esto es congruente con la capacidad de la IL-10 para suprimir la activación o diferenciación de estas células hacia un fenotipo inmunitario proinflamatorio. Además, el constructo de administración de IL-10 reguló a la baja CCL20 y CCL13, quimioatrayentes que reclutan macrófagos y células inmunitarias innatas, respectivamente(FIG. 77). Con el tratamiento con el constructo de administración de IL-10, también se regularon al alza una serie de genes proinflamatorios, que incluyen las metaloproteinasas de matriz: MMP1, MMP3 y MMP19(FIG. 78). De manera importante, en consonancia con la función reguladora de la IL-10, el constructo de administración de IL-10 también aumentó un inhibidor de las metaloproteinasas de la matriz, el TIMP1, así como otros genes de reparación de tejidos(FIG.79)y antimicrobianos(FIG.80).
[1201] Ejemplo 22: evaluación de los efectos de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en un modelo de ratón de colitis ulcerosa
[1202] Este estudio se llevó a cabo para investigar la eficacia del tratamiento oral con un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en un modelo murino de colitis ulcerosa inducida por oxazolona. La colitis inducida por oxazolona en ratones constituye un modelo animal de CU con similitudes con las características histopatológicas y la distribución de la inflamación descritas en la colitis ulcerosa humana y puede usarse para seleccionar posibles agentes terapéuticos.
[1203] Se presensibilizó a ratones SJL/J hembra jóvenes sanas con 200 µl de una solución al 3% (p/v) de oxazolona (4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolina-5-ona) en etanol al 100%, aplicada por vía tópica. Cinco días después de la presensibilización, se expuso a los ratones por vía intrarectal con 150 µl de oxazolona al 1% en etanol al 40%. Los ratones de control se presensibilizaron con etanol al 100% el día -5, seguido de la administración intrarrectal de 150 µl de etanol al 40% (sin oxazolona). A los ratones se les administraron dosis mediante sonda oral una vez al día (q.d.) con el constructo de administración de IL-10, 5-ASA (100 mg/kg, 15 ratones) o vehículo desde el día -5 hasta el día 6, para un total de 12 dosis. El constructo de administración de IL-10 se proporcionó en cuatro dosis diferentes: 9 mg/kg, 3 mk/kg, 1 mg/kg y 0,3 mg/kg. En cada grupo de tratamiento había 15 ratones, 10 ratones en el grupo tratado con vehículo y 5 ratones en el grupo de control sin tratamiento previo.
[1204] Se recogieron muestras de sangre en tubos Microtainer (BD 365974) que contenían EDTA y se centrifugaron a 500 RCF a temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se transfirieron a un tubo limpio y se volvieron a centrifugar a 13.000 RCF TA durante 10 minutos. Las muestras de plasma se dividieron en dos alícuotas de 80-100 µl de tamaño y se almacenaron a -80 ºC. Se extrajeron el yeyuno y el íleon de cada ratón superviviente y se limpiaron de todo el contenido fecal con PBS frío, y se congeló al instante aproximadamente 1 cm de cada sección. Se extrajo el colon (sin el ciego) de cada uno de los ratones supervivientes y se limpió de toda la materia fecal con PBS frío. Se registraron la longitud y el peso del colon. Se cortaron muestras del colon en diferentes puntos a lo largo de su longitud (región 1 proximal, región 2 media, región 3 entre las regiones 2 y 4, y región 4 distal) y se conservaron en tampón de formalina neutra al 10% durante 24 horas. A continuación, se transfirieron a EtOH al 70%. Estas muestras se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina o con inmunofluorescencia. Se congeló al instante la región 3 de los mismos colones.
[1205] [0420] El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) dio como resultado una mejora de la histopatología colónica. LaFIG. 81Amuestra la tinción con hematoxilina y eosina de un colon sin tratamiento previo, mientras que laFIG.81Bmuestra una sección de colon de un ratón que fue tratado con oxazolona para inducir un estado de enfermedad, pero que recibió vehículo en la fase de tratamiento. La histopatología del colon mejora en laFIG. 81C,que muestra una sección de un ratón representativo inducido con oxazolona tratado con un constructo de administración de IL-10 (8,5 mg/kg).
[1206] El tratamiento con un constructo de administración oral de IL-10 (SEQ ID NO: 5) disminuyó la expresión de los marcadores inflamatorios IL-4(FIG.82A),IL-6(FIG.82B),IL-1β(FIG.82C),IL-17A(FIG.82D),IL-10(FIG.82E),MIP1α(FIG.82F)y GCSF/CSF3(FIG.82G).El análisis estadístico se realizó mediante un ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey.
[1207] El tratamiento con el constructo de administración oral de IL-10 (SEQ ID NO: 5) indujo una regulación al alza de los biomarcadores tisulares y circulantes. LaFIG. 84muestra que la expresión sistémica de IL-1Ra aumentó de manera dependiente de la dosis después del tratamiento con el constructo de administración de IL-10 (las dosis se muestran en el eje x en mg/kg). El tratamiento con 9 mg/kg del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) aumentó la expresión de IL-1Ra en el colon en comparación con el vehículo(FIG.85A),disminuyó la expresión de IL-1β en el colon en comparación con el vehículo(FIG. 85B)y aumentó la relación entre IL-1Ra e IL-1β en aproximadamente 2,5 veces(FIG. 85C).El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 aumentó la relación entre STAT3 fosforilada (pSTAT3) y STAT3 total aproximadamente 2 veces en el tejido del intestino delgado y aproximadamente 3 veces en el tejido del colon(FIG.86).
[1208] Ejemplo 23: evaluación de los efectos de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre STAT3 en el tejido del colon en ratones sin inflamación.
[1209] Para evaluar el efecto de un constructo de administración oral de IL-10 sobre STAT3 en tejido de colon no inflamado, a los ratones se les administró vehículo, un constructo de administración de IL-10 (1 mg/kg) o IL-10 humana recombinante (rhIL-10, 0,9 mg/kg, una dosis equimolar a la del constructo de administración de IL-10). Se analizaron el STAT3 total y el STAT3 fosforilado (pSTAT3) mediante ELISA MSD. LaFIG.83Amuestra que el tratamiento con el constructo de administración de IL-10 dio como resultado un aumento de aproximadamente el 50% en la relación entre pSTAT3 y STAT3 total, mientras que el tratamiento con rhIL-10 no alteró significativamente la relación entre pSTAT3 y STAT3 total.
[1210] Para evaluar el efecto de un constructo de administración oral de IL-10 sobre la IL-1Ra en tejido colónico no inflamado, a los ratones se le administró vehículo, un constructo de administración de IL-10 (10 mg/kg) o IL-10 humana recombinante (rhIL-10, 3 mg/kg, una dosis equimolar a la del constructo de administración de IL-10. La IL-1Ra sistémica se analizó mediante ELISA MSD. LaFIG. 83Bmuestra que el nivel de IL-1Ra sistémica se incrementó aproximadamente 3 veces en los ratones tratados con el constructo de administración de IL-10, mientras que el tratamiento con rhIL-10 no incrementó significativamente los niveles de IL-1Ra sistémica.
[1211] Ejemplo 24: evaluación de los efectos de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) sobre la homeostasis inmunitaria y la curación de heridas en primates no humanos.
[1212] Para evaluar el efecto de un constructo de administración de IL-10 sobre los marcadores proinflamatorios y antiinflamatorios, se administró el constructo de administración de IL-10 a monosMacaca fascicularismacho (de entre 5 y 8 kg aproximadamente) mediante sigmoidoscopia colónica con una boquilla pulverizadora. El constructo de administración de IL-10 se administró a dosis de 1 mg, 3 mg y 10 mg formuladas en albúmina. El tratamiento con el constructo de administración de IL-10 disminuyó la expresión de marcadores proinflamatorios(FIG.87),aumentó la expresión de marcadores antiinflamatorios(FIG. 88)y aumentó la expresión de biomarcadores asociados con la reparación de tejidos y la curación de heridas(FIG.89).
[1213] Ejemplo 25: Evaluación de la farmacocinética y la farmacodinámica de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en primates no humanos
[1214] Para comparar diferentes vías de administración, se administró un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a monosMacaca fasciularispor vía oral a 1 mg (N = 6) o 5 mg (N = 6), por vía subcutánea a 0,2 mg/kg (N = 3) o por vía intravenosa a 0,05 mg/kg (N = 3). Para la administración oral, el constructo de administración de IL-10 se formuló en cápsulas con recubrimiento entérico de tamaño 0. Para la administración intravenosa o subcutánea, se formuló como un líquido en formulación DS liofilizada. El tratamiento oral con el constructo de administración de IL-10 dio como resultado niveles sistémicos mínimos de IL-10 en comparación con la administración subcutánea o intravenosa(FIG. 90A).Los niveles sistémicos de IL-1Ra se muestran en laFIG. 90B.El tratamiento oral con el constructo de administración de IL-10 aumentó la relación IL-1Ra/IL-10 a aproximadamente 15.000:1 con 1 mg, y a más de 20.000:1 con la dosis de 3 mg, mientras que con la administración subcutánea o intravenosa(FIG. 91)se observó un efecto mínimo.
[1215] Ejemplo 26: evaluación de surfactantes
[1216] Se investigó el efecto de los surfactantes sobre la dimerización de un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), antes y después de ser sometido a esfuerzo cortante. Más particularmente, a soluciones que comprendían el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se añadieron varios surfactantes, y las soluciones resultantes se analizaron antes de someterlas a esfuerzo cortante y después de agitarlas en vórtice a 800 rpm continuamente durante 4 horas. Se consideraron los siguientes surfactantes: (1) control (1X PBS, sin surfactante), (2) polisorbato 80 (PS80), 0,1% en 1X PBS, (3) polisorbato 20 (PS20), 0,1% en 1X PBS, y poloxámero 188 (F68), 0,3% en 1X PBS.
[1217] Después de la agitación en vórtice, se inspeccionó visualmente la solución. La muestra sin surfactante estaba ligeramente turbia, mientras que las muestras con surfactante estaban claras después de la agitación en vórtice. Se evaluó la turbidez (340-360 nm) de la solución después de la agitación en vórtice. Sin surfactante, la absorbancia aumentó en el intervalo de 340-360 nm(FIG.92),y también se observó un aumento de la absorbancia con PS20 al 0,1%.
[1218] En las formulaciones del constructo de administración de IL-10 se llevó a cabo un SEC-HPLC antes(FIG.93)y después(FIG.94)de la agitación en vórtice(TABLA 48).Estos resultados no mostraron cambios significativos antes y después de la agitación en vórtice para todas las muestras del constructo de administración de IL-10. Sin embargo, el polisorbato 80 mostró un aumento de los monómeros y los agregados de HMW (del constructo de administración de IL-10) antes de la agitación, lo que indica un cierto efecto desestabilizador sobre el constructo de administración de IL-10. Además, el polisorbato 20 mostró la mayor cantidad de monómero antes de la agitación en vórtice, lo que indica la aparición de cierta disociación del constructo de administración de IL-10. En conclusión, el surfactante F68 (poloxámero 188) al 0,3% pareció estabilizar el constructo de administración de IL-10 en PBS 1X bajo esfuerzo cortante.
[1219] TABLA 48: Porcentaje de constructo de administración de IL-10 en forma de monómero, dímero y agregado HMW evaluado mediante SEC-HPLC antes des ués de la a itación
[1222]
[1224] Ejemplo 27: evaluación in vivo de pSTAT3
[1225] Se realizaron estudiosin vivoen ratones en los que se evaluó la actividad biológica de la IL-10 humana después de la transcitosis para determinar su capacidad de estimular el receptor de IL-10 del ratón y aumentar la fosforilación de STAT3 (pSTAT3) en las células de lalámina propia.Estos estudios demostraron que un constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) (y no la IL-10 sola sin la molécula portadora) transportaba selectivamente a través de las células epiteliales y era capaz de aumentar la fosforilación de STAT3 en las células de lalámina propiadespués del transporte a través de las células epiteliales. Además, aumentó la exposición al constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en los tejidos intestinales y se minimizó la exposición sistémica.
[1226] La inyección intraluminal del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) aumentó la fosforilación de STAT3 en las células de lalámina propia.E el yeyuno de ratones Balb/C se detectó la localización tisular de rhIL-10 y pSTAT3 mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia aproximadamente 10 minutos después de la inyección intraluminal del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)(FIG.107).Se transportó una gran cantidad de rhIL-10 (SEQ ID NO: 5) a través de los enterocitos. Además, en la superficie basolateral de los enterocitos y dentro dela lámina propiahabía una población de células similares a los linfocitos que eran positivas para pSTAT3. En laFIG.108se muestran los aumentos en la fosforilación de pSTAT3 a lo largo del tiempo.
[1227] El tráfico del constructo de administración de IL-10 a través del epitelio intestinal se validó en diferentes modelos murinos, como se muestra mediante microscopía confocal(FIG.109).
[1228] Se aislaron intestinos completos de ratones y se procesaron como un "rollo suizo", y la localización de pSTAT3 se detectó mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia(FIG.110).Se demostró la actividad de la IL-10 a lo largo del intestino (en todos los segmentos intestinales, incluyendo el colon) después de la administración oral por sonda mediante la detección de la fosforilación de STAT3 a lo largo dela lámina propia,lo que indica la activación de la vía de señalización inmunológica.
[1229] Ejemplo 28: inyecciones intraluminales de la SEQ ID NO: 5 en el modelo de transferencia de células T de la enfermedad inflamatoria intestinal
[1230] Este estudio se llevó a cabo para examinar el potencial de la proteína portadora para transportar rhIL-10 desde la luz intestinal hacia la región submucosa en tejido intestinal inflamado. Se usó el modelo de transferencia de linfocitos T (células T), ya que es un modelo bien establecido de colitis crónica inducida en ratones y presenta muchas de las características distintivas inmunológicas esenciales observadas en pacientes con EII. Se administraron 20 µl del artículo de prueba mediante inyección intraluminal en el íleon distal y el colon proximal, medio y distal a nueve ratones BALB/c y doce ratones SCID, que incluían nueve con el modelo de inflamación similar a la colitis. Se administraron 159 pmoles de constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) a ratones BALB/c sanos y ratones SCID con colitis inducida, se administraron 159 pmoles de rhIL-10 a ratones BALB/c sanos y ratones SCID con colitis inducida, y se administró vehículo PBS a ratones BALB/c sanos y a ratones SCID sanos y con colitis inducida (n = 3/grupo). En cada grupo, se sacrificaron dos ratones 10 minutos después de las inyecciones intraluminales y uno se sacrificó 40 minutos después de las inyecciones intraluminales. Se recogieron tejido intestinal y suero. El tejido recogido se fijó, se incluyó, se seccionó y se tiñó con H&E para la evaluación histológica del estado inflamatorio. Se realizó un análisis ELISA para medir la rhIL 10 en lisados preparados a partir de tejido intestinal y suero(FIGS.106A-106D).
[1231] La evaluación histopatológica del tejido confirmó la inflamación en todos los ratones SCID con transferencia de células T en todos los niveles del colon.
[1232] La medición por ELISA de rhIL-10 en el punto temporal de exposición de 10 minutos fue sustancialmente más alta en los ratones a los que se les inyecto el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en comparación con los ratones inyectados solo con rhIL-10 (FIGS. 106A-106B). Además, el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se transportó a los tejidos inflamados de manera más eficiente que a los tejidos no inflamados. En los tejidos intestinales normales, la captación del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) fue de dos a cinco veces más alta en comparación con los ratones a los que solo se les inyecto rhIL-10. En el tejido inflamado, los niveles de rhIL-10 medidos después de la inyección del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) fueron aproximadamente 10 veces superiores a los medidos después de la administración de rhIL-10 sola(FIG. 106B). La IL-10 humana recombinante detectada después de la administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se detectó 40 minutos después del tiempo de exposición en la mayoría de los tejidos, pero parecía ser más estable en los tejidos sanos que en los inflamados(FIGS.106C-106D).
[1233] El constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5), pero no la administración de rhIL-10, dio como resultado la detección de niveles moderadamente altos de rhIL-10 en el suero de animales sanos, de manera dependiente del tiempo. En animales inflamados, se detectaron cantidades mínimas de rhIL-10 en el suero, tanto del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) como de las inyecciones intraluminales de rhIL-10, lo que indica una fuga leve no específica en los tejidos intestinales inflamados.
[1234] La diferencia en la exposición sistémica en ratones sanos frente a ratones enfermos puede atribuirse a un "efecto sumidero" intestinal, que describe la mayor cantidad de células inmunitarias infiltradas en el estado de enfermedad al que puede dirigirse el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5). Los numerosos leucocitos infiltrados, observados mediante histopatología en la mucosa y submucosa intestinal, restringen el constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5)/rhIL-10 a lalámina propia, a la vez que limitan la exposición sistémica. La administración del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) dio como resultado una mayor captación intestinal de rhIL-10 en los tejidos colónicos, lo que demuestra que cholix<386>facilita la transcitosis de rhIL-10 a través del epitelio.
[1235] Ejemplo 29: estudio clínico de Fase 1a
[1236] El constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se diseñó para evaluar la seguridad y la tolerabilidad, la farmacocinética y la farmacodinámica de dosis orales únicas crecientes del constructo de administración de IL-10 en sujetos varones sanos (parte A). En la parte B del estudio, se recopilaron datos preliminares sobre la seguridad y tolerabilidad, farmacocinética, farmacodinámica y respuesta clínica temprana después de la administración de dosis múltiples ascendentes del constructo de administración de IL-10 en pacientes con colitis ulcerosa (CU) (Parte B).
[1237] El objetivo principal era evaluar la seguridad y la tolerabilidad de dosis únicas y múltiples ascendentes del constructo de administración de IL-10 en voluntarios adultos sanos y pacientes con CU activa. Otros objetivos del estudio eran evaluar: la farmacocinética (PK) y la farmacodinámica (PD) del constructo de administración de IL-10, evaluar la incidencia de anticuerpos anti-fármaco contra el constructo de administración de IL-10, evaluar los posibles biomarcadores de PD del constructo de administración de IL-10 en plasma y tejido (solo en la Parte B), evaluar la administración del constructo de administración de IL-10 al tejido colónico sobre la base de la respuesta PD y evaluar la actividad clínica del constructo de administración de IL-10 después de dos semanas de tratamiento en pacientes con CU activa.
[1238] Diseño del ensayo de Fase 1a
[1239] La parte A consistió en un escalado de dosis única ascendente (SAD) en voluntarios varones sanos. Se realizaron seis cohortes que consistían en dosis únicas ascendentes administradas por vía oral. En cada nivel de dosis, se inscribieron 6 sujetos, aleatorizados 2:4 para recibir una dosis única de placebo o el constructo de administración de IL-10 el día 1. Las dosis seleccionadas fueron 1 mg, 3 mg, 10 mg, 30 mg, 60 mg y 120 mg.
[1240] Datos preliminares de la Fase 1a
[1241] Los resultados de la Parte A confirman que el constructo de administración de IL-10 es seguro y bien tolerado. Se produjeron un total de 3 acontecimientos adversos, 1 en 12 pacientes que recibieron placebo y 2 en un total de 24 pacientes que recibieron el constructo de administración de IL-10. Todos los acontecimientos fueron acontecimientos adversos leves y autolimitados. Los resultados de los análisis farmacocinéticos de todas las dosis (1-120 mg) confirmaron que el constructo de administración de IL-10 era selectivo para el intestino, ya que no se detectó ningún fármaco en la sangre.
[1242] Los modelos preclínicos han identificado la producción periférica de IL-1Ra como un marcador de la unión de IL-10 a IL-10R en los linfocitos de la mucosa. Para determinar si el constructo de administración de IL-10 se transportaba activamente a través del revestimiento de células epiteliales hacia la lámina propia y era capaz de interactuar con los linfocitos, se evaluaron los niveles de inducción de IL-1Ra.
[1243] Los resultados confirmaron que el constructo de administración de IL-10 era capaz de inducir la expresión de IL-1Ra(FIG.111). La pérdida de actividad inmunomoduladora (inducción de IL-1Ra) a 60 y 120 mg es congruente con la biología de la IL10.
[1244] Ejemplo 30: estudio clínico de Fase 1b
[1245] Se recopilaron datos sobre la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética, la farmacodinámica y la respuesta clínica inicial después de una dosis ascendente múltiple (MAD) del constructo de administración de IL-10 en pacientes adultos con CU activa durante 14 días de tratamiento. Se añadió una composición liofilizada del constructo de administración de IL-10 y excipientes (glicina, sacarosa, poloxámero 188 y fosfato de potasio) a cápsulas HPMC de tamaño 0 para preparar tres lotes diferentes con una concentración de 1 mg, 5 mg y 20 mg. Se aplicó un recubrimiento con una relación en peso de 50:50 de Eudragit® L30D55: Eudragit® FS30D con un espesor de 14,8 a 16,0 mg/cm<2>y un peso de aproximadamente 76 mg a cada cápsula. Se generaron cápsulas de placebo usando cápsulas vacías recubiertas de manera similar.
[1246] Diseño del ensayo de Fase 1b
[1247] Como se muestra en laFIG.112, el ensayo de Fase 1b consistió en un escalado MAD en pacientes adultos con CU activa. A un total de cuatro cohortes se les administraron 1 mg, 3 mg, 10 mg o 30 mg del constructo de administración de IL-10, aleatorizadas en una proporción de 3:1 para recibir el constructo de administración de IL-10 o un placebo administrado una vez al día durante catorce días. El objetivo del ensayo era evaluar la seguridad del constructo de administración de IL-10 y cualquier cambio en la actividad de la CU, mediante endoscopia, histología, biomarcadores y muestras de suero. Se obtuvieron muestras de heces y biopsias de colon al inicio del estudio y en el día 14 del tratamiento para evaluar la calprotectina fecal, así como la histología basada en la lectura centralizada ciega del sistema de índice de Geboes. La calprotectina fecal es un marcador objetivo de la respuesta clínica en los estudios sobre la CU y el sistema de índice de Geboes es una medida de la respuesta histológica. El sistema de índice de Geboes de este ejemplo usó un sistema de puntuación histológica de 0 a 22 puntos, en el que las puntuaciones más altas representan una enfermedad más grave.
[1248] Los datos preliminares de la Fase 1b han demostrado que el constructo de administración oral de IL-10 es bien tolerado[0447] Los resultados del ensayo de Fase 1b demostraron que el constructo de administración oral de IL-10 fue bien tolerado por los pacientes con CU. LaTABLA 49muestra que se observaron un total de 23 TEAE, incluyendo tres en los cuatro pacientes que recibieron placebo y 20 en los 12 pacientes que recibieron el constructo de administración activa de IL-10. Los acontecimientos adversos del ensayo de Fase 1b incluyeron nasofaringitis y acontecimientos adversos asociados con los síntomas subyacentes de la CU, como dolor abdominal, diarrea y náuseas. Todos los acontecimientos adversos fueron autolimitados y de leves a moderados, sin que se produjeran acontecimientos adversos que justificaran la interrupción prematura del tratamiento. Es importante destacar que, a diferencia de la IL-10 administrada por vía sistémica en estudios anteriores, no se observaron acontecimientos adversos emergentes del tratamiento como anemia o trombocitopenia.
[1249] TABLA 49: Acontecimientos adversos emergentes del tratamiento (TEAE) observados entre los sujetos activos el lacebo
[1252]
[1254] Resultados preliminares de la respuesta clínica
[1255] La calprotectina fecal (FCP) es un marcador clínico de la actividad de la enfermedad en pacientes con CU. Los valores de FCP mayores de 150 µg/g se correlacionan con inflamación activa. Como puede verse en laFIG.113,la administración de 1 mg y 3 mg del constructo de administración de IL-10 llevó a reducciones medias ajustadas al placebo de la FCP del 44% a un 27% después de solo 14 días de administración. Estudios clínicos previos con IL-10 administrada de manera sistémica mostraron una disminución de la actividad a dosis más altas, lo que también se observa con las dosis de 10 mg y 30 mg del constructo de administración de IL-10.
[1256] La proteína C reactiva (CRP) es un biomarcador de la inflamación sistémica. Con 1 y 3 mg, se observaron mayores reducciones en los niveles de CRP en pacientes con CU con una CRP de referencia mayor de 5 mg/l en comparación con el placebo(FIG. 114). Por su diseño, el constructo de administración de IL-10 es una proteína selectiva del tracto gastrointestinal y no se detectó en la circulación sistémica. Sin embargo, la reducción de los niveles de CRP sugiere que el tratamiento de pacientes con CU con el constructo de administración de IL-10 selectivo del tracto gastrointestinal por vía oral dio como resultado una actividad inmunomoduladora local intestinal y sistémica, lo que ayuda a permitir el tratamiento de indicaciones inflamatorias periféricas.
[1257] El sistema de índice histológico de Geboes es un sistema que incorpora la infiltración de células inmunitarias (linfocitos y neutrófilos) en la lámina propia y el epitelio, así como la arquitectura y destrucción de las criptas, y la presencia de ulceraciones y erosiones. Cuando se añade cada componente, la puntuación total puede variar de0 (normal) a 22 (inflamación grave y destrucción de tejidos). Para evaluar la actividad del constructo de administración de IL-10 en la mucosa gastrointestinal, se obtuvieron biopsias de colon al inicio del estudio y después de 14 días de administración, y un patólogo gastrointestinal ciego evaluó las puntuaciones de Geboes. El constructo de administración de IL-10 redujo los índices de Geboes en el 60% (6/10) de los pacientes con constructo de administración de IL-10 activo, en comparación con el 0% (2/10) de los pacientes con placebo(FIG.115).
[1258] LaFIG.116muestra imágenes histológicas previas a la dosis y posteriores al tratamiento de un paciente con CU en el ensayo de Fase 1b al que se le administraron 10 mg del constructo de administración de IL-10, en el que el índice de Geboes mejoró de 15 a 3 en una escala de 22 puntos, en la que las puntuaciones más altas indican una actividad más grave de la enfermedad. La imagen previa a la administración reveló que el paciente con CU presentaba destrucción de criptas y un infiltrado celular inflamatorio en el colon al inicio del estudio, que se resolvieron en la imagen posterior al tratamiento después de 14 días de tratamiento con el constructo de administración de IL-10.Ejemplo 31: Comparación de la purificación de un constructo de administración de IL-10 con y sin sulfitólisis.
[1259] El constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se purificó a partir de cuerpos de inclusión usando un proceso que incluía un paso de sulfitólisis, tal como se describe en laFIG.2A, o un proceso análogo descrito en laFIG.2B,pero que no incluía los pasos de sulfitólisis y filtración de flujo tangencial entre los pasos de clarificación y replegamiento. El replegamiento en ambos procesos se llevó a cabo a 4 ºC. La solución de replegamiento usada en ambos procesos contenía 1 mM de glutatión reducido, 0,5 mM de glutatión oxidado, 1 M de arginina-HCl, 250 mM de sacarosa, 100 mM de Tris pH 8,5 a 4 ºC y 2 mM de EDTA. El contenido de dímeros del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se caracterizó mediante SEC-HPLC después del paso de ultrafiltración/diafiltración después del replegamiento, pero antes de la cromatografía AEX, usando un TSKgel SW3000 4 µm, 4,6/300 de Tosoh Biosciences (TABLA 50)y se caracterizó adicionalmente después de la cromatografía AEX mediante el cromatograma Capto Q ImpRes® (GE)(TABLAS 51-52).
[1260] TABLA 50: Porcentaje del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en varias formas a re ados de alto eso molecular dímeros monómeros
[1262]
[1263] TABLA 51: Rendimiento del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) después de la cromato rafía Ca to Q
[1266]
[1268] TABLA 52 - Recuperación del dímero del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) después de la cromato rafía Ca to Q
[1270]
[1272] Ejemplo 32: Comparación de la purificación de un constructo de administración de IL-10 con y sin sulfitólisis[0453] Este ejemplo demuestra la transcitosisin vivodel constructo de administración que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 a través de células epiteliales intestinales polarizadas intactas en ratas Wistar. Los datos demuestran que el constructo de administración transportó de manera rápida y eficaz la carga útil de IL-10 a través de las células epiteliales intestinales polarizadas hasta lalámina propia.
[1273] La transcitosis invivose probó usando ratas Wistar macho. Las ratas Wistar macho se alojaron de 3 a 5 por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h y pesaban entre 225 y 275 g (aproximadamente entre 6 y 8 semanas de edad) cuando se incluyeron en el estudio. Los experimentos se realizaron durante la fase de luz usando un protocolo sin recuperación que emplea anestesia continua con isoflurano. Se realizó una incisión abdominal de 4-5 cm en la línea media que exponía las regiones del yeyuno medio. Se prepararon soluciones madre a 3,86x10<-5>M del constructo de administración en solución salina tamponada con fosfato (PBS), administrando 50 µl (por cada 250 g de rata) mediante inyección intraluminal (ILI) usando una aguja de calibre 29. A continuación, se marcó el mesenterio del lugar de la inyección con un rotulador permanente. Al finalizar el estudio, se aisló una región de 3-5 mm que capturó el segmento del intestino marcado y se procesó para su evaluación microscópica. Los experimentosin vivose realizaron de conformidad con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 y la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 1986 (86/609/CEE).
[1274] En lasFIGS. 117A-117Cse muestran los resultados de la actividad de transcitosis del constructo de administración con la SEQ ID NO: 5. Los datos muestran imágenes microscópicas que demuestran el transporte de la carga útil de IL-10 a través de células epiteliales intestinales polarizadas en ratas Wistar en varios puntos temporales después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de la rata. El constructo de administración (SEQ ID NO: 5) incluía el portador cholix con la SEQ ID NO: 4 (y que además incluía una metionina N-terminal) acoplado a la carga útil IL-10 que tenía un aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 2 a través de un espaciador que tenía un aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 6. La fluorescencia verde indica la presencia de IL-10 (mediante tinción con un anticuerpo anti-IL-10). La fluorescencia azul indica la tinción con DAPI, que marca el ADN, y la fluorescencia roja indica la presencia de CK-8 (citoqueratina-8) con la que un portador derivado de cholix puede colocalizarse (por ejemplo, en una región supranuclear de una célula epitelial) durante la transcitosis. Las flechas blancas Nº 1 resaltan la membrana apical de las células epiteliales, y las flechas blancas Nº 2 resaltan la membrana basal de las células epiteliales.
[1275] LaFIG.117Amuestra el alcance de la transcitosis de IL-10 un minuto después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de rata. Los datos muestran que el transporte de la carga útil de IL-10 desde el sitio apical al basal y hacia lalámina propiase produjo tan pronto como 1 minuto después de la aplicación del constructo de administración. La flecha blanca Nº 3 indica la presencia de IL-10 en lalámina propia.
[1276] [0457] LaFIG.117Bmuestra el alcance de la transcitosis de IL-10 cinco minutos después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de rata. Los datos muestran un aumento de la cantidad de carga útil de IL-10 transportada que estaba presente en lalámina propia(véanse, por ejemplo, las flechas blancas Nº 3) 5 minutos después de la aplicación luminal del constructo de administración.
[1278] LaFIG. 117Cmuestra el grado de transcitosis de IL-10 diez minutos después de la aplicación luminal del constructo de administración con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 al yeyuno de rata. Los datos muestran una cantidad incluso mayor de carga útil de IL-10 transportada que estaba presente en lalámina propia(véanse, por ejemplo, las flechas blancas Nº 3) 10 minutos después de la aplicación luminal del constructo de administración.
[1280] Estos datos demuestran que el portador derivado de cholix con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 (y que incluye además una metionina N-terminal) es capaz de transportar de manera rápida y eficaz la carga útil de IL-10 (SEQ ID NO: 2) a través de células epiteliales intestinales polarizadas intactasin vivo, como lo demuestra la presencia de la carga útil de IL-10 en lalámina propiatan pronto como 1 minuto después de la aplicación luminal del constructo de administración (SEQ ID NO: 5). A lo largo de este experimento, se detectó una cantidad creciente de IL-10 transportada en lalámina propia.
[1282] Ejemplo 33: Los elementos del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 son funcionalmente activos in vitro.
[1284] Este ejemplo proporciona una evaluación funcional de la capacidad del portador derivado de cholix (SEQ ID NO: 4) para transportar la carga útil IL-10 (SEQ ID NO: 2) a través del epitelio intestinal, lo que se verificó usando monocapas polarizadas y confluentes de células del intestino delgado humano cultivadas in vitro en membranas semipermeables(FIG. 118). A pesar de su masa molecular mucho mayor, el constructo de administración (SEQ ID NO: 5) se transportó a través de estas monocapas en mayor medida que la IL-10 humana recombinante (rhIL-10), lo que demuestra que el portador derivado de cholix de la SEQ ID NO: 5 conserva su capacidad para experimentar transcitosis apical a basal (A→B). A continuación, se probóin vitroel constructo de administración (SEQ ID NO: 5) para garantizar que el elemento IL-10 de la proteína de fusión fuera biológicamente activo. Se usó una línea celular de osteosarcoma U2OS manipulada para que expresase los dos receptores implicados en la transducción de señales de IL-10 (IL-10RA e IL-10RB) y que presenta un evento de luminiscencia como resultado de la dimerización del receptor inducida por el ligando para probar dosis crecientes del constructo de administración, el portador derivado de cholix solo y la rhIL-10 sola. El constructo de administración tenía una EC50 de 971,4 pM en comparación con 91,53 pM para la rhIL-10(FIG.119), mientras que el portador derivado de cholix solo no indujo la dimerización de IL-10R. Para evaluar la potencia descendente, se examinó el potencial del constructo de administración, de la rhIL-10 o del portador derivado de cholix para inducir la fosforilación de la transducción de señales y el activador del factor de transcripción 3 (STAT3) usando células de macrófagos de ratón J774.2. En este ensayo el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 demostró una EC50 de 263,6 pM en comparación con 40,98 pM para una preparación comercial de hIL-10(FIG. 120). Particularmente, el constructo de administración tiene una amplitud reducida de pSTAT3/STAT3 total de ~1,47% en comparación con hIL-10 al 2,19%. Por último, el pretratamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 dio como resultado una reducción dependiente de la dosis del factor de necrosis tumoral alfa segregado (TNFα,FIG.
[1285] 121)y de la expresión superficial de HLA-DR(FIG. 122), pero no de la IL-6 segregada(FIG. 123), normalmente inducida por el tratamiento con endotoxinas (lipopolisacáridos). En conjunto, estos datos muestran que la unión de hIL-10 al portador derivado de cholix de la SEQ ID NO: 4 a través de un espaciador de secuencia polipeptídica GS produjo una quimera que conservaba las propiedades necesarias para alcanzar las células dentro de la lámina propia intestinal y activar las vías de señalización del receptor de IL-10 en ese compartimento.
[1287] Ejemplo 34: El constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 transcita por transcitosis in vivo
[1289] [0461] Este ejemplo proporciona una evaluación de si el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 puede experimentar una transcitosis eficiente in vivo mediante el examen de la inducción de pSTAT3 usando tejido intestinal de rata aislado 40 minutos después de la administración por sonda oral con PBS, rhIL-10 o el constructo de administración. La microscopía de inmunofluorescencia de los tejidos de los animales tratados con PBS no mostró la presencia de ninguna inmunorreactividad para la inducción de hIL-10 o pSTAT3 ni en la lámina propia ni en el epitelio intestinal(FIG. 124). En algunos casos, los animales tratados con rhIL-10 presentaron inducción de pSTAT3 en los enterocitos, pero no en las células dentro de la lámina propia; no se detectó hIL-10 en el tejido(FIG. 125). Esta observación concuerda con los descubrimientos en ratones de que las células epiteliales intestinales pueden expresar receptores de IL-10 en su superficie apical en ciertas condiciones asociadas con el desarrollo y el mantenimiento de la función de barrera. Los tejidos aislados de animales tratados con el constructo de administración de IL-10 de la SEQ ID NO: 5 mostraron cantidades extensas de hIL-10 y un gran número de células que eran positivas para pSTAT3 dentro de la lámina propia(FIG. 126). Para cuantificar cómo los artículos de prueba afectaban a las vías de transducción de señales de IL-10 intestinales, se realizó un análisis de imágenes: se recopilaron lotes de imágenes de alto rendimiento, se segmentaron por localización epitelial frente a localización en la lámina propia y, a continuación, por características celulares. Los patrones de segmentación resultantes permitieron crear mapas binarios que se aplicaron a los datos de los componentes, lo que dio como resultado una puntuación de las vellosidades intestinales de las células nucleares pSTAT3+(FIG.127). Los tejidos tratados con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 mostraron una inducción de pSTAT3 en las células tanto de la lámina propia como de los enterocitos mayor que la observada en los tejidos intestinales recogidos de animales tratados con PBS o rhIL-10.
[1291] Este ejemplo también evaluó si el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 podía transportarse a través del tejido intestinal inflamado. Se usó un modelo de ratón de colitis inducida por transferencia de células T CD4+ CD45RBalta en un formato ILI en el que se administraron ~160 pmoles de un constructo de administración de IL-10 o rhIL-10 en el íleon distal o en las regiones proximal, media o distal del colon en PBS(FIG. 128). La evaluación histopatológica microscópica de los tejidos intestinales confirmó la inflamación en todos los niveles del colon, pero no en el íleon. A los 10 minutos después de la ILI, los tejidos del íleon distal contenían niveles aproximadamente 5 veces más altos de hIL-10 para el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 en comparación con el tratamiento con rhIL-10; en el tejido inflamado, los niveles de hIL-10 medidos después de la ILI del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 fueron aproximadamente 10 veces más altos en comparación con el tratamiento con rhIL-10(FIG.128). Los niveles tisulares más altos de hIL-10 observados en el colon inflamado con respecto al íleon distal no inflamado se debieron probablemente a diferencias en las propiedades de barrera de estos tejidos. Los tejidos examinados 40 minutos después de la ILI sugirieron que la hIL-10 administrada a través del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 reflejaba los datos obtenidos a los 10 minutos, observándose una mayor captación relativa en el íleon distal no inflamado (datos no mostrados). De manera importante, no se observó hIL-10 en la circulación sistémica(FIG.
[1292] 128).
[1294] Se realizaron ensayos para garantizar que la construcción genética del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 conservase las propiedades de transcitosis A-B que debía conferir el portador derivado de cholix, que implicaba la captación mediada por receptores y el tráfico vesicular sin dirigirse a la vía de degradación lisosomal en enterocitos polarizados. El portador derivado de cholix y los elementos hIL-10 de la proteína de fusión del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 permanecieron juntos durante la transcitosis A-B y dentro de la lámina propia, permitiendo la localización de hIL-10 para describir con precisión la distribución del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5(FIG. 129). Mientras que había vesículas Rab7+ (que definen los endosomas tardíos) tanto en los compartimentos vesiculares apicales como en los basales de los enterocitos, la colocalización con el constructo de administración se produjo predominantemente en el compartimento vesicular apical(FIG.130). Las vesículas Rab11+ (que definen los endosomas de reciclaje) también se observaron tanto en los compartimentos apicales como en los basales de los enterocitos, pero, a diferencia de Rab7, las colocalizaciones se produjeron principalmente en el compartimento vesicular basal(FIG.131). El constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 se colocalizó con Rab11 en mayor medida en comparación con Rab7 dentro de las células de la lámina propia(FIGS.130y131).
[1296] Se ha demostrado que la proteína MAN1 (lectina, de unión a manosa 1), que reside en el compartimento intermedio del retículo endoplásmico-Golgi (ERGIC) y que se sabe que está implicada en la clasificación o el reciclaje de proteínas y lípidos, interviene en la transcitosis de cholix. El constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 también se colocalizó con la redistribución de LMAN1 durante la transcitosis A-B(FIG.132): al minuto 1, cuando el constructo de administración acababa de entrar en la membrana luminal, LMAN1 se localizó en el compartimento apical; a los 5 minutos, LMAN1 y parte del constructo de administración internalizada de la SEQ ID NO: 5 estaban presentes en la región supranuclear asociada con la distribución ERGIC; a los 10 minutos, el constructo de entrega de la SEQ ID NO: 5 y LMAN1 estaban ampliamente colocalizadas en el compartimento basal; y a los 15 minutos, se maximizó el alcance de la redistribución de LMAN1 y la colocalización con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 en todo el enterocito. El momento de la redistribución de LMAN1 al compartimento basal coincide con la presencia de hIL-10 detectada finalmente en células no polarizadas dentro de la lámina propia, donde no estaba asociada con LMAN1. Esta redistribución de LMAN1 asociada con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 A-B transcitosis es idéntica a la observada previamente para cholix.
[1298] Se ha demostrado que la vía de transcitosis A-B a la que accede cholix se cruza con las vesículas Rab7+ y LAMP1+; aunque estas son marcadores tanto de los endosomas tardíos como de los lisosomas, cholix no parece transportarse a estructuras similares a los lisosomas dentro de los enterocitos. Para examinar este punto en el caso del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5, se realizó un estudio temporal de la colocalización de LAMP 1 y el constructo de administración(FIG. 133). En enterocitos polarizados 1 minuto después de la ILI se observaron colocalizaciones limitadas de LAMP1/constructo de administración, sin que su extensión aumentara durante el curso temporal de 15 minutos necesario para completar la transcitosis A-B del constructo de administración. Las estructuras LAMP1+ en células no polarizadas dentro de la lámina propia no mostraron colocalización con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 al de 1 minuto y a los 5 minutos después de la ILI. Sin embargo, se observaron colocalizaciones extensas de LAMP1/constructo de administración en células no polarizadas dentro de la lámina propia a los 10 y 15 minutos después de la ILI. En conjunto, estos datos sugieren que la transcitosis A-B del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 se completó en un intervalo de tiempo de 10-15 minutos e implicó vesículas Rab7+ del compartimento apical, vesículas Rab11+ del compartimento basal, redistribución de LMAN1 y evitación del destino lisosomal en enterocitos, de manera similar a lo observado anteriormente para la transcitosis A-B de cholix. Finalmente, el constructo de administración se administra a estructuras similares a lisosomas dentro de una gran fracción de células dentro de la lámina propia, un resultado que limitaría su distribución sistémica tras la transcitosis A-B.
[1300] Ejemplo 35: Los macrófagos de la lámina propia se activan mediante el constructo de administración de laSEQ ID NO: 5
[1302] Después de determinar que el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 era biológicamente activo in vivo, se investigó la diana celular del constructo de administración mediante microscopía de inmunofluorescencia. Se mostró una demostración de la administración de hIL-10 a la lámina propia en muestras de tejido del yeyuno de ratón, junto con la inducción de pSTAT3 y el marcado de células inmunitarias(FIG.67). En este punto temporal de 40 minutos después de la administración oral, se observó hIL-10 en la región basal de los enterocitos y en organizaciones lineales dentro de la lámina propia que eran consistentes con los lacteales y/o los vasos vasculares. Las áreas adyacentes a la hIL-10 detectada mostraron una fuerte expresión de pSTAT3 en muchas células dentro de la lámina propia y, en niveles mucho más bajos, en algunos núcleos de enterocitos polarizados. Se observó que una proporción moderada de células CD3+ dentro de la lámina propia se colocalizaba con pSTAT3: muchas células CD3+ presentes en este compartimento no eran positivas para pSTAT3 y había muchas células pSTAT3+ que no eran positivas para CD3(FIG.
[1303] 134). Sin embargo, usando el marcador específico de macrófagos F4/80, observamos una amplia colocalización con pSTAT3(FIGS.135 y 136). Se destacan ejemplos adicionales de marcado con F4/80 y pSTAT3 en muestras de tejido obtenidas del intestino delgado(FIG.137)y del colon(FIG.138)después de la administración por sonda gástrica del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 en ratones, lo que era congruente con una activación extensa de IL-10 de las poblaciones de células macrófagas dentro de la lámina propia. Los resultados sugieren que el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 se dirigió en última instancia a los linfocitos T CD3+ después de la transcitosis A→B, posiblemente a través de interacciones impulsadas por su elemento portador derivado de cholix, mientras que los macrófagos fueron ampliamente atacados por el elemento hIL-10.
[1305] Ejemplo 36: Aumento de la IL-1Ra circulante y la hIL-10 sistémica en respuesta a la administración mediante sonda oral del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 en ratones
[1307] Las acciones inflamatorias de la IL-1β están moduladas por la presencia de un antagonista específico del receptor conocido como IL-1Ra. El aumento de los niveles séricos de IL-1Ra puede ser inducido por la IL-10, lo que puede producirse en ausencia de un estado proinflamatorio. Teniendo en cuenta las incertidumbres asociadas a la cantidad y el momento en que el constructo de administración biológicamente activo se libera del estómago para llegar al intestino delgado, así como el momento de su absorción y sus acciones dentro de la lámina propia después de la administración oral, examinamos la IL-1Ra para que funcionase en ratones no inflamados como biomarcador de las acciones del constructo de administración de IL-10.
[1309] La administración mediante sonda oral 10 mg/kg del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 dio como resultado la detección de ~50 pM de hIL-10 en la circulación sistémica tan pronto como a la 1 h, que aumentó a ~700 pM a las 4 h(FIG.139). La detección de hIL-10 en los tejidos del intestino delgado distal(FIG.140)y del colon(FIG.141)no se elevó significativamente por encima del valor inicial al de 1 y al de 2,5 h, pero mostró ligeros aumentos con una alta variabilidad al de 4 h; la hIL-10 en los lisados del intestino delgado fue ~10 veces mayor que en los lisados del colon. Los niveles séricos de IL-1Ra aumentaron significativamente al de 4 h(FIG. 142). Estos resultados demostraron que el inicio de la inducción de IL-1Ra se produce entre 2,5 y 4 h después de la administración oral, aproximadamente al mismo tiempo que se observó un aumento detectable de los niveles tisulares de hIL-10 en los tejidos del intestino delgado distal y el colon. Este resultado sugiere que o se produjo una inducción casi inmediata de IL-1Ra después de la absorción del constructo de administración en los tejidos del intestino delgado distal y el colon, o que esta inducción se produjo varias horas después de la absorción casi rápida del constructo de administración en el intestino delgado superior después de la administración oral. Para comprobar esta hipótesis, el constructo de administración se depositó directamente en la superficie luminal de la mucosa intestinal del colon en un modelo de primates no humanos.
[1311] Ejemplo 37: Inducción de IL-1Ra después de la pulverización intracolónica con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 en primates no humanos (NHP)
[1313] Se usó un método de pulverización tópica para administrar 1, 3 o 10 mg (dosis total) del constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 en la superficie luminal de la mucosa colónica (proximal, media y distal) de primates no humanos (monos cynomolgus) sanos en ayunas. Esto se logró usando un colonoscopio con una boquilla pulverizadora asociada. De esta manera, pudo obtenerse información más precisa sobre el inicio y la duración de la inducción de IL-1Ra en dosis locales específicas. Los niveles circulantes de IL-1Ra aumentaron entre 2 y 3 horas después de la pulverización colónica, de una manera que sugería una saturación casi total de esta respuesta en la dosis más baja probada(FIG.147). El análisis de la inducción de pSTAT3 en biopsias de tejidos del colon mostró el curso temporal previsto de aparición y recuperación hasta el valor inicial para este evento, que se correlacionó con ~15 min para que el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 alcanzase la lámina propia después de la aplicación luminal(FIG.148). En este modelo in vivo la variabilidad de pSTAT3/STAT3 total detectada fue congruente con los retos de captura y estabilidad de los tejidos. La medición de los niveles del constructo de administración en los tejidos presentó problemas similares de captura y estabilidad, mostrando cantidades bajas y variables en las muestras de tejido recogidas(FIG.143). De manera importante, aunque el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5 pudo detectarse en el tejido colónico, los niveles séricos del constructo de administración estaban por debajo del límite de detección del ensayo(FIG.145), lo que concuerda con la retención de este material en la lámina propia intestinal.
[1314] Como la IL-10 puede inducir a las células a producir más IL-10, también buscamos la IL-10 inducida. En los 15 minutos siguientes a la pulverización intracolónica con el constructo de administración de la SEQ ID NO: 5, se observaron aumentos transitorios y dependientes de la dosis en los niveles de IL-10 en los tejidos(FIG.144). Los niveles séricos de IL-10 también aumentaron de manera dependiente de la dosis hasta la cantidad del constructo de administración administrada mediante pulverización colónica(FIG.146); estos niveles séricos aumentados, aunque se mantuvieron en el intervalo picomolar, fueron más duraderos que los observados en el tejido colónico. Es importante señalar que, debido a la similitud entre la IL-10 humana y la de los primates no humanos, los valores de ELISA mostrados también podrían incluir hIL-10 que se ha separado de alguna manera del dominio portador de la molécula del constructo de administración. Aunque esto no puede descartarse, ningún otro dato respalda este resultado y parece probable que la mayor parte, si no la totalidad, de la IL-10 tisular y sérica medida provenga de primates no humanos.
[1316] Ejemplo 38: Cribado de sales para la estabilidad del dímero durante el procesamiento
[1318] Se llevó a cabo un cribado de varias sales y concentraciones de sales para evaluar la estabilidad de la molécula de transporte de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en varios medios líquidos. Se prepararon formulaciones con la molécula de transporte a 20 g/L en fosfato sódico 10 mM a pH 7,0 con las sales y concentraciones de sal indicadas en la tabla 53. El porcentaje del constructo de administración de IL-10 presente en forma de dímero, forma de monómero y agregados de alto peso molecular (HMW Agg) se evaluó mediante HPLC de exclusión por tamaño, como se ha indicado anteriormente. La tabla 53 muestra los resultados inmediatamente después de la formulación y después de una incubación de 2 días a 25 ºC. La tabla 54 muestra los resultados para concentraciones de sal adicionales en el momento inicial. De las formulaciones evaluadas, 1X PBS, 150 mM y 200 mM de NaCl mostraron la mayor estabilidad. Se consideraron concentraciones más altas para Na<2>SO<4>y NH<4>SO<4>(datos no mostrados). Sin embargo, se observó que el constructo de administración de IL-10 precipitaba durante el intercambio de tampón.
[1320] TABLA 53: Porcentaje de dímeros del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en diferentes formulaciones salinas
[1323]
[1326] TABLA 54: Porcentaje de dímeros del constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) en diferentes formulaciones salinas
[1329]
[1330] continuación
[1333]
[1336] Ejemplo 39: Comparación de diferentes condiciones de purificación con columnas de intercambio catiónico S-650F para un constructo de administración de IL-10
[1338] El constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se purificó a partir de cuerpos de inclusión usando un proceso análogo al descrito en laFIG.2B. El replegamiento se llevó a cabo a 4 ºC en una solución de replegamiento que contenía 1 mM de glutatión reducido, 0,5 mM de glutatión oxidado, 1 M de arginina-HCl, 250 mM de sacarosa, 100 mM de Tris pH 8,5 a 4 ºC y 2 mM de EDTA. El constructo de administración de IL-10 (SEQ ID NO: 5) se purificó usando cada uno de los tres procesos descritos en las Tablas 55-57. El tampón A para el paso de unión/elución de CHT de la Tabla 56 también puede comprender 25 mM de Tris, pH 7,5, 300 mM de NaCl, 5,0 mM de NaPi y 0,5 mM de CaCl2. Las columnas usadas se describen en la Tabla 58.
[1340] Tabla 55: Tren de roceso 1
[1343]
[1346] Tabla 56: Tren de roceso 2
[1349]
[1352] Tabla 57: Tren de roceso 3
[1355]
[1356] continuación
[1359]
[1361] Tabla 58: Columnas
[1364]
[1366] El rendimiento, la recuperación y la pureza del constructo de administración de IL-10 se evaluaron después de cada paso y después de cada tren de proceso. La Tabla 59 muestra una comparación de un tren de proceso 2 y un proceso de control.
[1367] Tabla 59: com aración entre el tren de roceso 2 PT2 el control
[1370]
[1372] Tabla 60: com aración de diferentes trenes de roceso
[1375]
[1377] [0473] La Tabla 60 muestra una comparación de los tres trenes de proceso diferentes y un tren de proceso de control sin columna S-650F. Las tres líneas de proceso con purificaciones mediante columna de intercambio catiónico S-650F dieron como resultado una mayor pureza del constructo de administración de IL-10. Los trenes de proceso 2 y 3 dieron como resultado niveles más bajos de endotoxinas que el proceso de control. Fue sorprendente que una resina de intercambio catiónico fuera útil en la purificación del constructo de administración de IL-10, ya que las resinas de intercambio catiónico tienen carga negativa y, por lo tanto, se unen a proteínas con carga positiva. En este caso, el constructo de administración de IL-10 tiene un punto isoeléctrico (pI) calculado de 5,49, por lo que se prevé que tenga una carga negativa en las condiciones que se usan tradicionalmente en la cromatografía de intercambio catiónico. Sin embargo, sorprendentemente, el constructo de administración de IL-10 se unió a la resina de intercambio catiónico.
[1378] Una posible explicación para la unión del constructo de administración de IL-10 a la resina Sulfate-650F es que, aunque el pI calculado para el constructo de administración de IL-10 es 5,49, cada dominio (cholix e IL-10) mantiene sus propias propiedades únicas y tiene un pI local que difiere significativamente del pI del constructo global. Por ejemplo, el pI calculado de la IL-10 es 8,1 y, en condiciones de trabajo (por ejemplo, pH 7), el constructo de administración de IL-10 tendría un dominio IL-10 con carga positiva que se uniría a la resina de intercambio catiónico.
[1379] EJEMPLO 40: Ensayo médico exploratorio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en adultos con artritis reumatoide activa que han demostrado una respuesta inadecuada (parcial) al tratamiento anti-TNF.
[1380] La IL-10 se considera un regulador maestro del sistema inmunitario innato y adaptativo, ya que inhibe no solo el inflamasoma, sino también muchos eventos inflamatorios que se ha descubierto que están asociados con la AR, comenzando por la activación de los macrófagos y la secreción de IL-1, IL-6, TNF alfa y MMP-1/2, a la vez que reduce los signos sistémicos de inflamación y el desarrollo de células T reguladoras.
[1381] La administración oral de un constructo de administración de IL-10 proporciona una administración local de IL-10 al sistema inmunitario de la mucosa gastrointestinal, mientras que evita niveles sistémicos elevados del fármaco. La provisión de administración local de IL-10 a la mucosa gastrointestinal también puede efectuar una inmunorregulación sistémica. La modulación de la actividad de las células inmunitarias a medida que transitan por la mucosa gastrointestinal puede dar como resultado una inmunorregulación sistémica eficaz, ya que dichas células se desplazan por todo el organismo. Por tanto, la administración dirigida de IL-10 al sistema inmunitario de la mucosa gastrointestinal podría provocar una inmunorregulación eficaz para el tratamiento, por ejemplo, de pacientes con artritis reumatoide, con una mayor seguridad.
[1382] El presente estudio evalúa la seguridad y la tolerabilidad de una administración oral diaria de IL-10 durante 12 semanas a través de un constructo de administración de IL-10 en sujetos con artritis reumatoide activa que han mostrado solamente una respuesta parcial a los inhibidores del TNF. El estudio también evalúa la actividad biológica de 12 semanas de tratamiento oral diario con un constructo de administración de IL-10 mediante los cambios en la Puntuación de Actividad de Enfermedad 28 (DAS-28) (CRF), el Índice Simplificado de Actividad de la Enfermedad (SDAI) y el Índice Clínico de Actividad de la Enfermedad (CDAI). Además, el estudio examina los efectos farmacocinéticos y farmacodinámicos del constructo de administración de IL-10 y examina la inmunogenicidad del constructo de administración de IL-10. El estudio también evalúa la calidad de vida (QOL) con el Cuestionario de Evaluación de la Salud sin Índice de Discapacidad (HAQ-DI) después de 12 semanas de administración oral diaria de IL-10 a través del constructo de administración de IL-10.
[1383] Se trata de un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en aproximadamente 18 sujetos con artritis reumatoide activa que tuvieron una respuesta inadecuada (parcial) al tratamiento anti-TNF. Los sujetos se asignaron aleatoriamente en una proporción de 2:1 para recibir o el constructo de administración de IL-10 o un placebo durante 12 semanas. La población del estudio está compuesta por sujetos adultos con artritis reumatoide activa que tuvieron una respuesta inadecuada (parcial) al tratamiento anti-TNF.
[1384] Los sujetos se incluyen en el estudio si cumplen los siguientes criterios de inclusión. Los sujetos tienen una edad ≥18 y <75 años en el momento del consentimiento informado. Los sujetos tienen un diagnóstico de artritis reumatoide (AR) según los criterios del Colegio Americano de Reumatología (ACR) de 1987 o del ACR/Liga Europea contra el Reumatismo (EULAR) de 2010. Los sujetos han recibido tratamiento biológico anti-TNF en la dosificación y administración aprobadas durante ≥12 semanas, pero solo han tenido una respuesta parcial. El historial de tratamiento con productos biológicos deben limitarse a 1 o 2 agentes anti-TNF entre adalimumab, infliximab, golimumab, etanercept (incluyendo los biosimilares). Los sujetos presentan por lo menos una articulación que muestra enfermedad activa por MRI/FOI y dos o más articulaciones sensibles (de un total de 28 articulaciones) y dos o más articulaciones inflamadas en la Fase de cribado. Los sujetos deben poder continuar con un régimen de dosis estable de anti-TNF hasta la finalización o hasta la interrupción del estudio. Los sujetos tienen un nivel de proteína C reactiva (CRP) de ≥0,6 mg/decilitro (dl) o una velocidad de sedimentación globular (VSG) ≥28 milímetros por hora (mm/h) en la Fase de cribado. Los sujetos tienen un peso de ≥30 kilogramos (kg) y de ≤100 kg. Para participar en este estudio los sujetos deben dar su consentimiento voluntario, por escrito. Todos los sujetos reciben información detallada sobre las condiciones de participación en el estudio, son capaces de comprenderlas y deben estar dispuestos y ser capaces de cumplir con todos los aspectos del protocolo.
[1385] A los sujetos se les excluye del estudio si tienen antecedentes médicos que puedan sugerir un mayor riesgo o posibles factores de confusión. A los sujetos se les excluye del estudio si padecen un trastorno artrítico inflamatorio distinto de la artritis reumatoide o el síndrome de Sjögren, o si han sido diagnosticados con artritis reumatoide de clase IV (según los criterios revisados de 1991 del ACR para la clasificación del estado funcional global). A los sujetos también se les excluye si han recibido recientemente una preparación de inmunoglobulina, hemoderivados o una vacuna viva. A los sujetos también se les excluye si tienen antecedentes de alergia grave (shock o síntomas anafilácticos). También se excluyen a los sujetos si tienen historial o padecen actualmente cáncer o inmunodeficiencia.
[1386] También puede excluirse a los sujetos con historial o que padezcan actualmente una enfermedad infecciosa. Los sujetos no deben estar embarazadas ni en período de lactancia, y deben aceptar usar un método anticonceptivo altamente eficaz durante la duración del ensayo y durante algún tiempo después del mismo. Se excluirá de este estudio a los sujetos que tengan cualquier historial de una afección médica o una afección médica concomitante que, en opinión del investigador o del subinvestigador, comprometa la capacidad del participante de completar el estudio con seguridad.
[1387] Medidas de resultado
[1388] A los sujetos se les monitoriza clínicamente, incluyendo mediante exámenes físicos, hematológicos, químicos, electrocardiogramas y análisis de orina. La eficacia clínica se evalúa mediante varias medidas diferentes. La puntuación de actividad de la enfermedad 28 (DAS-28) es un criterio de valoración compuesto, continuo y calculado matemáticamente, con una ponderación diferencial dada para cada uno de los siguientes componentes: recuento de articulaciones sensibles (28 articulaciones), recuento de articulaciones inflamadas (28 articulaciones), reactantes en fase aguda y evaluación global del paciente de la artritis. El índice simplificado de actividad de la enfermedad (SDAI) mide la cantidad de articulaciones inflamadas y sensibles (hombro, codo, muñeca, articulaciones metacarpofalángicas y articulaciones falángicas proximales de la mano), las evaluaciones globales del paciente y del médico sobre la actividad de la enfermedad y la CRP. El CDAI es igual que el SDAI, pero omite el valor de la CRP. El HAQ-DI evalúa el grado de dificultad que ha experimentado un paciente durante la última semana en ocho ámbitos de las actividades de la vida diaria: vestirse y asearse, levantarse, comer, caminar, higiene, alcance, agarre y otras actividades. El DAS28 (formulario de informe del caso), el SDAI y el CDAI se evalúan todos al inicio del estudio, en las semanas 2, 4, 8 y 12; el Cuestionario de Evaluación de la Salud-Índice de Discapacidad (HAQ-DI) para evaluar los cambios en la función física se evaluará al inicio del estudio y en las semanas 4, 8, 12 y 16 (4 semanas después de la última dosis).
[1389] Los niveles séricos del constructo de administración de IL-10 y de IL-10 se evalúan al inicio del estudio y el día 1 a las 4, 8 y 24 horas después de la dosis, y en las semanas 2, 4, 8, 12 y 16.
[1390] Los marcadores farmacodinámicos que se evalúan incluyen la expresión de HLA-DR en monocitos; IL-1Ra sérica, CRP, amiloide A sérica, VCAM-1, IL-1, IL-6, TNF alfa, MMP1/2, ESR, EGF y VEGF-alfa: obtenidos al inicio del estudio y el día 1, a las 24 horas y en las semanas 2, 4, 8, 12 y 16. El total/título de los niveles del constructo de administración de anti-IL-10 se evalúa en las semanas 12 y 16.
[1391] Se monitorizará la seguridad de los sujetos y se les retirará del estudio si experimentan acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves, o cambios clínicamente significativos en los análisis de laboratorio.
[1392] La eficacia del tratamiento se considera tanto en términos de cambio a lo largo del tiempo como al finalizar la terapia y 4 semanas después de su finalización en:
[1393] 1. DAS-28 (formulario de informe de casos), SDAI y CDAI;
[1394] 2. Proporción de sujetos con DAS-28 de menos de 2,6;
[1395] 3. HAQ-DI en comparación con el valor inicial; y
[1396] 4. Cambio en los reactantes de fase aguda (CRF, ESR).
[1398] Se representan gráficamente y se tienen en cuenta los cambios en el constructo de administración de IL-10 y los niveles séricos de IL-10 en comparación con el valor inicial: días 1-8 y 24 horas, y semanas 2, 4, 8 y 12. Se comparan los cambios en los biomarcadores con el valor inicial para la expresión de HLA-DR en monocitos, IL-1Ra sérica, amiloide A sérica, VCAM-1, IL-1, IL-6, TNF alfa, MMP1/2, EGF y VEGF-alfa: valor inicial y día 1, a las 8 y 24 horas y en las semanas 2, 4, 8 y 12. La incidencia de anticuerpos antifármacos en las semanas 12 y 16 se compara con el valor inicial. Un resultado positivo puede ser un beneficio incremental en cualquiera de los parámetros mencionados anteriormente con la terapia combinada en comparación con el inhibidor del TNF alfa solo.
[1399] EJEMPLO 41: Ensayo médico exploratorio - respondedores parciales al TNF con colitis ulcerosa
[1400] Este estudio está dirigido a evaluar la eficacia y la seguridad de un constructo de administración de IL-10 en pacientes con colitis ulcerosa activa de moderada a grave que responden parcialmente a los tratamientos con anticuerpos contra el factor de necrosis tumoral α.
[1401] Este estudio evalúa la seguridad y la tolerabilidad de 12 semanas de IL-10 diaria a través de un constructo de administración oral de IL-10 en sujetos con colitis ulcerosa de moderada a grave que han demostrado solo una respuesta parcial a los inhibidores de anticuerpos monoclonales del TNF. El estudio también evalúa la actividad clínica de 12 semanas de IL-10 diaria a través de un constructo de administración oral de IL-10 mediante cambios en la puntuación Mayo modificada, las subescalas MMS y la histopatología. Este estudio examina los efectos farmacocinéticos y farmacodinámicos del constructo de administración de IL-10, así como su inmunogenicidad.
[1402] Se trata de un estudio abierto en aproximadamente 12 sujetos con colitis ulcerosa de moderada a grave que tuvieron una respuesta inadecuada (parcial) al tratamiento anti-TNF. Los sujetos reciben un constructo de administración de IL-10 correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 durante 12 semanas, mientras continúan con su dosis estable de tratamiento anti-TNF, y se les realiza un seguimiento de seguridad durante 4 semanas adicionales.
[1403] La población del estudio se selecciona entre sujetos adultos con colitis ulcerosa activa de moderada a grave (puntuación de Mayo modificada de 4-9, excluyendo GPA, y con una subpuntuación endoscópica de Mayo de 2 o 3) que tuvieron una respuesta inadecuada (parcial) al tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-TNF.
[1404] Los posibles sujetos se evalúan según los siguientes criterios de elegibilidad. Para su inclusión, todos los pacientes deben proporcionar su consentimiento informado por escrito y tener entre 18 y 75 años.
[1405] A los sujetos se les ha diagnosticado CU de acuerdo con las directrices del Colegio Americano de Gastroenterología. En el momento del cribado los sujetos tienen CU activa de moderada a grave, definida como: puntuación modificada de la Clínica Mayo (MMS) de entre 4 y 9 puntos Y una subpuntuación endoscópica MCS leída de forma centralizada de grado 2 o superior, Y una subpuntuación MMS de sangrado rectal de 1 punto o superior, Y una enfermedad que se extiende 15 cm o más desde el borde anal. Las dosis estables de los medicamentos concomitantes permitidos incluyen: corticosteroides orales estables (es decir, ≤ 20 mg/día de prednisona, ≤ 9 mg/día de budesonida) ≥ 2 semanas antes de la dosis D1; durante el estudio se permite la reducción gradual de los corticosteroides orales a discreción del investigador; dosis oral estable de ácido 5-aminosalicílico ≥ 2 semanas antes de la administración de la dosis D1; dosis estables de probióticos ≥ 2 semanas antes de la administración de la dosis D1; y antidiarreicos estables ≥ 2 semanas antes de la administración de la dosis D1. Los pacientes deben estar recibiendo terapia con factor de necrosis tumoral alfa para la CU y haber demostrado una respuesta inadecuada (parcial) antes de la administración de la dosis D1 o no haber recibido terapia anti-TNF antes de la selección; los anti-TNF permitidos incluyen infliximab (Remicade), adalimumab (Humira) y golimumab (Simponi), pero se excluye el etanercept
[1406] Los pacientes tratados previamente con ciclosporina o tacrolimus deben haber interrumpido el tratamiento ≥ 4 semanas antes de la administración de la dosis D1. Los corticosteroides tópicos y los preparados tópicos de ácido 5-aminosalicílico deben haberse retirado ≥ 2 semanas antes de la administración de la dosis D1. Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) deben haberse suspendido ≥ 4 semanas antes de la administración de la dosis D1. El tofacitinib u otros inhibidores de la Janus quinasa (JAK) deben haberse suspendido ≥ 2 semanas antes de la administración de la dosis D1. Las mujeres en edad fértil deben tener un resultado negativo en la prueba de embarazo antes de la inscripción. Los hombres y las mujeres con potencial reproductivo deben estar dispuestos a usar un método anticonceptivo altamente eficaz desde el inicio del estudio hasta ≥ 3 meses después de la dosis final del fármaco del estudio. Se define como método anticonceptivo altamente eficaz aquel que tiene una baja tasa de fallo (menos del 1% al año).
[1407] Se excluye de este estudio a los sujetos que cumplan alguno de los siguientes criterios de exclusión relacionados con el tracto gastrointestinal: colitis indeterminada (EII-U) o sospecha de enfermedad de Crohn, antecedentes de colectomía, presencia de ileostomía o colostomía, antecedentes o evidencia de displasia de la mucosa colónica o síndrome del intestino corto.
[1408] Se excluye de este estudio a los sujetos si cumplen alguno de los siguientes criterios de exclusión relacionados con la salud general: embarazo o lactancia, incapacidad para cumplir el protocolo del estudio en opinión del investigador, antecedentes de displasia o neoplasia maligna en los últimos 5 años, excepto carcinoma basocelular o carcinoma espinocelular de la piel completamente extirpado o carcinoma in situ del cuello uterino, cirrosis o abuso activo de alcohol según el criterio del investigador, diabetes mal controlada (HbA1c > 8,0%), anomalías significativas en el ECG de cribado o insuficiencia renal. Se excluyen de este estudio los sujetos con evidencia de enfermedad clínicamente significativa actual o anterior, afección médica o hallazgo en el examen médico que, en opinión del investigador, comprometa la seguridad del paciente o la calidad de los datos.
[1409] Se monitoriza a los sujetos clínicamente, incluyendo exámenes físicos, hematológicos, químicos, electrocardiogramas y análisis de orina. La eficacia clínica se evalúa mediante varias medidas diferentes. Se evalúa la proporción de pacientes con remisión clínica en la semana 12. La remisión clínica se define como una subpuntuación endoscópica de 0/1, una subpuntuación de sangrado rectal de 0 y una subpuntuación de frecuencia de las deposiciones de 0 o 1, con una reducción de por lo menos 1 punto con respecto al valor inicial. La remisión clínica también puede definirse como: frecuencia de las deposiciones = 0; sangrado en las deposiciones = 0; puntuación endoscópica de 0 o 1. La subpuntuación de la frecuencia de las deposiciones también puede ser de una disminución de por lo menos 1 punto en la subpuntuación de la frecuencia de las deposiciones con respecto al valor inicial (inicio del ensayo) para alcanzar una subpuntuación de la frecuencia de las deposiciones = 0 o 1.
[1410] [0497] Se evalúa la proporción de pacientes con respuesta endoscópica. La respuesta endoscópica se define como una puntuación en la subescala endoscópica de la puntuación clínica de Mayo modificada de 0 o 1. Se evaluarán los cambios en el grado de actividad histológica con respecto al valor inicial utilizando el sistema de índice histopatológico de Geboes o Robarts. La curación histológica se define como grado histológico = 0.
[1411] Los niveles séricos del constructo de administración de IL-10 y de IL-10 se evalúan al inicio del estudio y en los días 1, 2, 4, 8 y 12.
[1412] Los criterios de valoración farmacodinámicos que se evalúan incluyen la expresión de HLA-DR en monocitos; los cambios en los niveles séricos de IL-1Ra, CRP, ESR, calprotectina fecal, IL-1, IL-6, TNF alfa, MMP1/2 e IFNg obtenidos al inicio del estudio y en el día 1 y en las semanas 2, 4, 8, 12 y 16.
[1413] El total/título de los niveles del constructo de administración de anti-IL-10 se evalúa al inicio del estudio y en las semanas 8, 12 y 16. Las biopsias de colon al inicio del estudio y al final de la fase de tratamiento se examinan mediante microscopía óptica, inmunohistoquímica, citometría de flujo y matrices genéticas.
[1414] Se monitoriza la seguridad de los sujetos, y estos son retirados del estudio si experimentan acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves, o cambios clínicamente significativos en los análisis de laboratorio.
[1415] La eficacia del tratamiento se considera tanto en términos de cambio a lo largo del tiempo como a las 4, 8 y 12 semanas y 4 semanas después de la finalización en:
[1416] 1. Cambio en la puntuación Mayo modificada;
[1417] 2. Cambio en la subescala de sangrado en las heces;
[1418] 3. Cambio en la subescala de frecuencia de las deposiciones;
[1419] 4. Cambio en la subescala de endoscopia;
[1420] 5. Cambio en los reactantes de fase aguda (CRF, ESR); y
[1421] 6. Cambio en la puntuación histopatológica (Geboes o Robarts).
[1423] Se representan y se tienen en cuenta los cambios en el constructo de administración de IL-10 y los niveles séricos de IL-10 en comparación con los valores iniciales: días 1 a 8 y 24 horas, y semanas 2, 4, 8 y 12. Se consideran los cambios en los biomarcadores en comparación con el valor inicial para: expresión de HLA-DR en monocitos, IL-1Ra sérica, IL-1, IL-6, TNF alfa, MMP1/2, EGF y VEGF-alfa en el valor inicial y en el día 1, a las 8 y 24 horas y en las semanas 2, 4, 8 y 12. Se compara la incidencia de anticuerpos antifármacos en las semanas 12 y 16 con el valor inicial. Para visualizar las células inflamatorias infiltradas y la expresión de HLA-DR en el epitelio colónico se usarán tinciones específicas mediante inmunoquímica y/o citometría de flujo y matriz génica. Un resultado positivo puede ser un beneficio incremental en cualquiera de los parámetros mencionados anteriormente con la terapia combinada en comparación con el inhibidor de TNF alfa solo.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES
1. Una formulación oral sólida que comprende:
a) un constructo de administración que consiste en una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 13, en la que el constructo de administración comprende un portador que promueve la transcitosis del constructo de administración a través de una célula epitelial intestinal polarizada;
b) uno o más excipientes; en la que uno o más de los excipientes comprenden un lubricante no iónico; y c) una primera capa que comprende dos o más copolímeros que tienen cada uno un pH de disolución nominal diferente, en la que la formulación oral está configurada para no liberar prácticamente nada del constructo de administración de IL-10 después de 1 h de exposición a una solución a un pH de 1,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto, en la que el primer copolímero comprende un polímero de fórmula I:
en la que x, y y n de la fórmula I son cada uno mayores o iguales a uno; y en la que el segundo copolímero comprende un polímero de fórmula II:
en la que x, y, z y n de la fórmula II son cada uno mayores o iguales a uno.
2. La formulación oral sólida de la reivindicación 1, en la que:
(a) la solución que tiene un pH de 1,0 es un medio de disolución que contiene 0,1 M de ácido clorhídrico; y/o (b) la formulación está configurada para liberar por lo menos el 40% del constructo de administración después de 2 horas de exposición a una solución que tiene un pH de 7,0 en un aparato de disolución de Tipo 4 en modo abierto, en la que la solución que tiene un pH de 7,0 es un tampón de citrato/fosfato, opcionalmente en la que por lo menos el 5%, por lo menos el 10%, por lo menos el 20% o por lo menos el 25% del constructo de administración liberado después de 2 horas de exposición a la solución con un pH de 7,0 se encuentra en forma de dímero.
3. La formulación oral sólida de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que:
(a) una relación entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster en el primer copolímero es de 0,8:1 a 1,2:1, y en la que la relación entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster en el segundo copolímero es de 0,8:1 a 1,2:1; y/o
(b) el primer copolímero comprende ácido metacrílico y acrilato de etilo; y/o
(c) el segundo copolímero comprende ácido metacrílico, metacrilato de metilo y acrilato de metilo; y/o
(d) una relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero en la primera capa es de 15:85 a 55:45;
opcionalmente, la relación entre el primer copolímero y el segundo copolímero es de 20:80, 30:70, 40:60 o 50:50; y/o
(e) la primera capa comprende además un agente antiadherente, un plastificante, un surfactante o una combinación de los mismos.
4. La formulación oral sólida de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la formulación oral comprende además una segunda capa situada interior a la primera capa y exterior a la IL-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, en la que la segunda capa comprende hidroxipropilmetilcelulosa.
5. La formulación oral sólida de la reivindicación 4, que comprende además una tercera capa interior a la primera capa y exterior a los constructos de administración de IL-10 y uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables, en la que, opcionalmente, la tercera capa comprende HPMC.
6. La formulación oral sólida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que:
(a) los constructos de administración de IL-10 están presentes en la formulación en una cantidad de 1 mg a 20 mg; y/o
(b) uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden un surfactante, opcionalmente en la que el surfactante es un poloxámero, y opcionalmente en la que el poloxámero es un poloxámero 188.
7. La formulación oral sólida de la reivindicación 1, en la que:
(a) el lubricante no iónico es behenato de glicerilo; y/o
(b) la formulación carece de estearato de magnesio.
8. La formulación oral sólida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que:
(a) la formulación está liofilizada o secada por atomización; y/o
(b) la formulación se presenta en forma de comprimido o cápsula.
9. La formulación oral sólida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, opcionalmente en la que la enfermedad inflamatoria es colitis ulcerosa, proctitis, pouchitis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), artritis reumatoide, artritis psoriásica o psoriasis.
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