ES3056393T3

ES3056393T3 - Methods and compositions for treating non-erk mapk pathway inhibitor-resistant cancers

Info

Publication number: ES3056393T3
Application number: ES17800334T
Authority: ES
Inventors: Saurabh Saha; Dean Welsch; Gary Decrescenzo; Jeffrey James Roix
Original assignee: Biomed Valley Discoveries Inc
Current assignee: Biomed Valley Discoveries Inc
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2026-02-20
Anticipated expiration: 2037-05-22
Also published as: MX2022005473A; IL263108B; US20220117950A1; WO2015095842A3; AU2023204587A1; US20210038587A1; AU2023204587B2; US12599593B2; EP3458056B1; SG11201810287RA; US10881646B2; CL2018003282A1; ZA202007734B; CN109475541A; EP4653055A2; MX2018014231A; US20190201387A1; MX392121B; AU2017267804A1; EP3458056A4

Abstract

La presente invención proporciona, entre otros, métodos, composiciones farmacéuticas y kits para tratar o mitigar los efectos de un cáncer en un sujeto refractario o resistente a la terapia con inhibidores de la vía MAPK no ERK. También se proporcionan métodos para identificar a un sujeto con cáncer que se beneficiaría de la terapia con un inhibidor de ERK y métodos para inhibir la fosforilación de RSK en una célula cancerosa refractaria o resistente a un inhibidor de la vía MAPK no ERK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos y composiciones para tratar cánceres resistentes a inhibidores de la ruta de MAPK distinta de ERKCampo de invención

[0003] La presente invención proporciona BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de un melanoma positivo para mutación de BRAF600 tal como se expone en las reivindicaciones.

[0004] Antecedentes de la invención

[0005] Los inhibidores farmacológicos que seleccionan como diana componentes de la ruta de señalización de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK) muestran eficacia clínica en una variedad de cánceres, particularmente los que portan mutaciones en la proteína cinasa BRAF. Hay inhibidores tanto de RAF como de MEK aprobados para su uso como agente único en melanoma mutante para BRAF metastásico avanzado. Ya sea solos o en combinación, la actividad de inhibidores de BRAF y MEK es impredecible en otros cánceres, con eficacia prometedora en cáncer de pulmón y de tiroides mutante para BRAF, pero solo actividad marginal en cáncer colorrectal mutante para BRAF. Se ha notificado además que el inhibidor de ERK1/2, BVD-523, puede usarse para tratar los efectos de un cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK (documento WO 2015/095842) o para tratar un cáncer hematológico (documento WO 2015/095833).

[0006] Como con otras terapias dirigidas, los patrones de respuesta de la enfermedad a inhibidores de RAF y MEK parecen verse influidos por la heterogeneidad genética intrínseca presente en los cánceres en los que se usan los fármacos. Por ejemplo, se ha mostrado que ciertas alteraciones genéticas, incluyendo PTEN y otros cambios que activan la ruta de señalización de crecimiento celular PI3K, pueden predecir una mala respuesta inicial, y/o una progresión relativamente rápida, en melanoma mutante para BRAF tratado con el inhibidor de RAF vemurafenib. Asimismo, mutaciones directas en loci del gen de MEK parecen surgir en tumores que han progresado tras el tratamiento farmacológico de BRAF, MEK, o combinado. Varios ejemplos adicionales, a partir de mutaciones de corte y empalme y amplificación génica de RAS y RAF, sugieren que se produce resistencia farmacológica adquirida cuando la pleiotropía oncogénica se encuentra con la presión selectiva de tratamiento farmacológico dirigido.

[0007] El documento WO2015/095842 describe la eficacia de BVD-523 frente a células mutadas con respecto a BRAF(V600E).

[0008] A la vista de lo anterior, existe una necesidad de agentes dirigidos novedosos que inhiban idealmente diversos nodos de rutas oncogénicas, y también sean eficaces en combinaciones mediante inducción de una carga de presiones selectivas que supere la capacidad adaptativa de diversos genomas cancerosos. La presente solicitud se refiere a cubrir estas y otras necesidades.

[0009] Sumario de la invención

[0010] Por consiguiente, la presente invención se refiere a BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de un melanoma positivo para mutación de BRAF600 en un paciente humano, que ha progresado con tratamiento previo con vemurafenib y después con dabrafenib/trametinib, en el que dicho BVD-523 o sal farmacéuticamente aceptable del mismo debe administrarse la paciente humano a una dosis de 600 mg BID. Preferiblemente, dicha mutación es una mutación de BRAF<V600E>.

[0011] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto. El método comprende:

[0012] (a) identificar a un sujeto con cáncer que ha pasado a no responder o ser resistente a terapia con inhibidor de BRAF, terapia con inhibidor de MEK, o terapia con inhibidor de BRAF y MEK; y

[0013] (b) administrar al sujeto con dicho cáncer que no responde o resistente una cantidad eficaz de un inhibidor de ERK, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0014] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para tratar o mejorar los efectos de cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de BRAF, terapia con inhibidor de MEK, o ambas. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0015] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer que se beneficiará de una terapia con un inhibidor de ERK. El método comprende:

[0016] (a) obtener una muestra biológica del sujeto; y

[0017] (b) examinar la muestra para determinar si el sujeto tiene uno o más de los siguientes marcadores:

[0018] (i) un cambio entre isoformas de RAF,

[0019] (ii) regulación por incremento de señalización de tirosina cinasa receptora (RTK) o NRAS,

[0020] (iii) reactivación de señalización de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK),

[0021] (iv) la presencia de una mutación activante de MEK,

[0022] (v) amplificación de BRAF mutante,

[0023] (vi) regulación por incremento de STAT3,

[0024] (vii) mutaciones en la cavidad alostérica de MEK que bloquean directamente la unión de inhibidores a MEK o conducen a actividad MEK constitutiva,

[0025] en el que la presencia de uno o más de los marcadores confirma que el cáncer del sujeto no responde o es resistente a terapia con inhibidor de BRAF y/o MEK y que el sujeto se beneficiará de una terapia con un inhibidor de ERK, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0026] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, una composición farmacéutica para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia de la ruta de MAPK distinta de ERK. La composición comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0027] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un kit para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia de la ruta de MAPK distinta de ERK. El kit comprende cualquiera de las composiciones farmacéuticas según la presente divulgación envasadas junto con instrucciones para su uso. Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para inhibir la fosforilación de RSK en una célula cancerosa que no responde o es resistente a un inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK. El método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la fosforilación de RSK en la célula cancerosa.

[0028] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método de tratamiento de un sujeto que tiene un melanoma positivo para mutación de BRAF600 no resecable o metastásico que comprende administrar al sujeto 600 mg BID de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0029] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, una composición para tratar a un sujeto que tiene un melanoma positivo para mutación de BRAF600 no resecable o metastásico, comprendiendo la composición 600 mg de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y opcionalmente un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0030] Breve descripción de los dibujos

[0031] La figura 1A - figura 1C muestran el progreso de un estudio de aumento de la dosis en una línea celular de melanoma maligno humana (células A375) durante el mes 1. Diversos tratamientos (trametinib (un inhibidor de MEK de tipo 2), dabrafenib (un inhibidor de BRAF), y BVD-523 (un inhibidor de ERK1/2)) son tal como se indica.

[0032] La figura 2A - figura 2H muestran los resultados de un ensayo de proliferación que realiza el seguimiento de cambios en la sensibilidad al/a los agente(s) sometido(s) a aumento en el mes 1. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523, y pacitaxel) son tal como se indica en la parte superior del gráfico. La leyenda a la derecha del gráfico muestra los diversos tipos de células generadas a partir del estudio de aumento de la dosis. Por ejemplo, “dabrafenib” se refiere a las células que se han tratado con la dosis más alta de dabrafenib a partir del mes 1 del estudio de aumento de la dosis. Parental se refiere a las células de control que no se han tratado con fármacos. La figura 2A, la figura 2C y la figura 2G están normalizadas con respecto al control, mientras que la figura 2D, la figura 2F y la figura 2H muestran los datos sin procesar.

[0033] La figura 3A - figura 3D muestran el progreso de un estudio de aumento de la dosis en células A375 durante el mes 2. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, y BVD-523) son tal como se indica.

[0034] La figura 4A - figura 4H muestran los resultados de un ensayo de proliferación que realiza el seguimiento de cambios en la sensibilidad al/a los agente(s) sometido(s) a aumento en el mes 2. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523, y pacitaxel) son tal como se indica en la parte superior del gráfico. La leyenda a la derecha del gráfico muestra los diversos tipos de células generadas a partir del estudio de aumento de la dosis. Por ejemplo, “dabrafenib” se refiere a las células que se han tratado con la dosis más alta de dabrafenib a partir del mes 2 del estudio de aumento de la dosis. Parental se refiere a las células de control que no se han tratado con fármacos. La figura 4A, la figura 4C y la figura 4G están normalizadas con respecto al control, mientras que la figura 4D, la figura 4F y la figura 4H muestran los datos sin procesar.

[0035] La figura 5A - figura 5H solo muestran los datos de línea celular parental y con BVD-523 de la figura 4A - figura 4H. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523, y pacitaxel) son tal como se indica. La figura 5A, la figura 5C y la figura 5G están normalizadas con respecto al control, mientras que la figura 5D, la figura 5F y la figura 5H muestran los datos sin procesar.

[0036] La figura 6A - figura 6D muestran el progreso del estudio de aumento de la dosis en una línea celular maligna humana (células A375) a partir el mes 3. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, y BVD-523) son tal como se indica. La figura 7 es un histograma que muestra los resultados de un ensayo de proliferación tal como se aplica a células que se hacen crecer en los pocillos de control de DMSO a partir del ensayo de aumento de la dosis.

[0037] La figura 8A - figura 8D son un conjunto de gráficos de líneas que muestran ensayos de proliferación para el mes 3 del estudio. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523, y pacitaxel) son tal como se indica en la parte superior del gráfico. La leyenda a la derecha del gráfico muestra los diversos tipos de células generadas a partir del estudio de aumento de la dosis. Por ejemplo, “dabrafenib” se refiere a las células que se han tratado con la dosis más alta de dabrafenib a partir del mes 3 del estudio de aumento de la dosis. Parental se refiere a las células de control que no se han tratado con fármacos.

[0038] La figura 9A - figura 9D solo muestran los datos de línea celular parental, con dabrafenib, y con BVD-523 de la figura 8A- la figura 8D.

[0039] La figura 10A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue. La figura 10B es una matriz de dosis que muestra el exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/dabrafenib. La figura 10C y la figura 10D muestran el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos como agente único con dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue. La figura 10E muestra el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos de combinación con dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue.

[0040] La figura 11A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo. La figura 11B es una matriz de dosis que muestra el exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/dabrafenib. La figura 11C y la figura 11D muestran el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos como agente único con dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo. La figura 11E muestra el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos de combinación con dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo.

[0041] La figura 12A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de BVD-523/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue. La figura 12B es una matriz de dosis que muestra el exceso con respecto a Bliss para la combinación de BVD-523/dabrafenib. La figura 12C y la figura 12D muestran el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos como agente único con dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue. La figura 12E muestra el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos de combinación con dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue.

[0042] La figura 13A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de BVD-523/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 13B es una matriz de dosis que muestra el exceso con respecto a Bliss para la combinación de BVD-523/dabrafenib. La figura 13C y la figura 13D muestran el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos como agente único con dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo. La figura 13E muestra el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos de combinación con dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo.

[0043] La figura 14A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue. La figura 14B es una matriz de dosis que muestra el exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/BVD-523. La figura 14C y la figura 14D muestran el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos como agente único con BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue. La figura 14E muestra el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos de combinación con BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de Alamar Blue.

[0044] La figura 15A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo. La figura 15B es una matriz de dosis que muestra el exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/BVD-523. La figura 15C y la figura 15D muestran el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos como agente único con BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo. La figura 15E muestra el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO para tratamientos de combinación con BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular de CellTiter-Glo.

[0045] La figura 16A - figura 16D son un conjunto de imágenes que muestran análisis de inmunotransferencia de tipo Western de señalización de MAPK en células A375 después de un tratamiento de 4 horas con diversas concentraciones (en nM) de BVD-523, dabrafenib (Dab), y trametinib (Tram). Se cargaron 40 μg de proteína total en cada carril excepto donde se indique lo contrario. En este experimento, se recogieron muestras por duplicado. La figura 16A y la figura 16B muestran resultados de muestras duplicadas. De manera similar, la figura 16C y la figura 16D también muestran resultados de muestras duplicadas. En la figura 16A y la figura 16B, pRSK1 tenía una señal relativamente débil en células A375 en comparación con otros marcadores. Se sometió a prueba un anticuerpo frente a pRSK1-S380 diferente de Cell Signaling (n.º de cat.11989) pero no dio ninguna señal detectable (datos no mostrados). En la figura 16C y la figura 16D, pCRAF-338 dio una señal mínima.

[0046] La figura 17A - figura 17D son un conjunto de imágenes que muestran análisis de inmunotransferencia de tipo Western de señalización de MAPK en una línea celular de carcinoma colorrectal humana (células HCT116) después de un tratamiento de 4 horas con diversas concentraciones (en nM) de BVD-523, dabrafenib (Dab), y trametinib (Tram). Se cargaron 40 μg de proteína total en cada carril excepto donde se indique lo contrario. En este experimento, se recogieron muestras por duplicado. La figura 17A y la figura 17B muestran resultados de muestras duplicadas. De manera similar, la figura 17 C y la figura 17D también muestran resultados de muestras duplicadas. En la figura 17A y la figura 17B, los niveles de pRSK1 parecen ser muy bajos en células HCT116, y en la figura 17C y la figura 17D, la señal de pCRAF-338 también era muy débil.

[0047] La figura 18A - figura 18D son un conjunto de imágenes que muestran análisis de inmunotransferencia de tipo Western de señalización de apoptosis y ciclo celular en células de melanoma A375 después de un tratamiento de 24 horas con diversas concentraciones (en nM) de BVD-523 (“BVD-523”), trametinib (“tram”) y/o dabrafenib (“Dab”) según se indica. Se cargaron 50 μg de proteína total en cada carril excepto donde se indique lo contrario. En este experimento, se recogieron muestras por duplicado. La figura 18A y la figura 18B muestran resultados de muestras duplicadas. De manera similar, la figura 18C y la figura 18D también muestran resultados de muestras duplicadas. En la figura 18A y la figura 18B, no había ninguna banda evidente de un tamaño correspondiente a PARP escindida (89 kDa).

[0048] La figura 19 muestra que BVD-523 puede tratar la resistencia adquirida a fármacos dirigidosin vivo. Se aisló una línea derivada de paciente, ST052C, a partir de un paciente con melanoma BRAF<V600E>que experimentó progresión después de 10 meses de terapia con terapias dirigidas a la ruta de MAPK. Tratadaex vivo, ST052C mostró resistencia cruzada adquirida a dabrafenib a 50 mg/kg BID. Mientras tanto, BVD-523 fue eficaz en ST052C como agente único a 100 mg/kg BID.

[0049] La figura 20 es un diagrama de flujo que muestra el protocolo de aumento de la dosis usado en el presente documento. La figura 21 muestra un esquema de la ruta de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK).

[0050] La figura 22A - figura 22E muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único. Se muestran resultados de proliferación para el tratamiento con BVD-523 (figura 22A), SCH772984 (figura 22B), dabrafenib (figura 22C), trametinib (figura 22D), y placlitaxel (figura 22E).

[0051] La figura 23A - figura 23O muestran los resultados de la combinación de BVD-523 y dabrafenib. La figura 23A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO parentales. La figura 23B -figura 23C muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 23A. La figura 23D muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 23A y la figura 23E muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 23A. La figura 23F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO MEK1 (Q56P/+) - clon 1. La figura 23G - figura 23H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 23F. La figura 23I muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 23F y la figura 23J muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 23F. La figura 23K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO MEK1 (Q56P/+) - clon 2. La figura 23L - figura 23M muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 23K. La figura 23N muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 23K y la figura 23O muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 23K.

[0052] La figura 24A - figura 24O muestran los resultados de la combinación de SCH772984 y dabrafenib. La figura 24A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO parentales. La figura 24B - figura 24C muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 24A. La figura 24D muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 24A y la figura 24E muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 24A. La figura 24F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO MEK1 (Q56P/+) - clon 1. La figura 24G - figura 24H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 24F. La figura 24I muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 24F y la figura 24J muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 24F. La figura 24K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO MEK1 (Q56P/+) - clon 2. La figura 24L - figura 24M muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 24K. La figura 24N muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 24K y la figura 24O muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 24K.

[0053] La figura 25A - figura 25O muestran los resultados de la combinación de trametinib y dabrafenib. La figura 25A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO parentales. La figura 25B -figura 25C muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 25A. La figura 25D muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 25A y la figura 25E muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 25A. La figura 25F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO MEK1 (Q56P/+) - clon 1. La figura 25G - figura 25H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 25F. La figura 25I muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 25F y la figura 25J muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 25F. La figura 25K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células RKO MEK1 (Q56P/+) - clon 2. La figura 25L - figura 25M muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 25K. La figura 25N muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 25K y la figura 25O muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 25K.

[0054] La figura 26A muestra volúmenes de Loewe para las combinaciones sometidas a prueba. La figura 26B muestra Volúmenes de Bliss para las combinaciones sometidas a prueba. La figura 26C muestra puntuaciones de sinergia para las combinaciones sometidas a prueba.

[0055] La figura 27A - figura 27I muestran los cambios en la señalización de la ruta de efector y MAPK en resistencia adquirida de MEK. Se trataron células MEK1 (Q56P/+) y RKO parentales isogénicas con compuesto durante 4 o 24 h y después se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. Dabrafenib era el inhibidor de BRAF y trametinib era el inhibidor de MEK. La figura 27A muestra señalización aumentada en Células RKO MEK1 (Q56P/+). La figura 27B - figura 27C muestran los resultados de un tratamiento de 4 horas en el experimento 1 (véase el ejemplo 7) en células RKO parentales (27B) y RKO MEK1 (Q56P/+) (27C). La figura 27D - figura 27E muestran los resultados de un tratamiento de 4 horas en el experimento 2 (véase el ejemplo 7) en células RKO parentales (27D) y RKO MEK1 (Q56P/+) (27E). La figura 27F - figura 27G muestran los resultados de un tratamiento de 4 horas en el experimento 2 (véase el ejemplo 7) en células RKO parentales (27F) y RKO MEK1 (Q56P/+) (27G). La figura 27H - figura 27I muestran un resumen de resultados en células RKO parentales (27H) y RKO MEK1 (Q56P/+) (27I).

[0056] La figura 28A - figura 28E muestran los resultados de la combinación de BVD-523 y SCH772984. La figura 28A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A375. La figura 28B - figura 28C muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente único para la combinación en la figura 28A. La figura 28D muestra el exceso de Loewe para la combinación en la figura 28A y la figura 28E muestra el exceso de Bliss para la combinación en la figura 28A.

[0057] La figura 29A - figura 29F muestran el descubrimiento y la caracterización del inhibidor de ERK1/2 novedoso BVD-523 (ulixertinib). La figura 29A muestra que BVD-523 demuestra inhibición de una manera en competencia con ATP reversible. Esto se demuestra mediante un aumento lineal de los valores de CI<50>para la inhibición de ERK2 con concentración de ATP creciente tal como se muestra en la figura 29B. La figura 29C muestra un gráfico representativo de la curva de dosis-respuesta y la figura 29D muestra un gráfico de CI<50>a lo largo del tiempo. La figura 29E muestra la unión de BVD-523 a ERK2 y fosfo-ERK2 (pERK2), en comparación con proteína p38 de control negativo. La figura 29F muestra la unión de BVD-523 a ERK2 en comparación con los inhibidores de ERK SCH772984 y pirazolilpirrol.

[0058] La figura 30A - figura 30D muestran que BVD-523 inhibe la proliferación celular y potencia la actividad de caspasa 3 y caspasa 7in vitro. La figura 30A muestra que BVD-523 demuestra actividad preferida en células con mutaciones en la ruta de MAPK, tal como se define por la presencia de mutaciones en miembros de la familia de RAS y RAF. Además, tal como se muestra en la figura 30B, BVD-523 bloquea líneas celulares sensibles en la fase G1 del ciclo celular. La figura 30C muestra que BVD-523 indujo un aumento dependiente de la concentración y del tiempo en la actividad caspasa en las líneas de células cancerosas A375, WM266, y LS411N después de 72 horas de exposición. La figura 30D muestra que las proteínas efectoras y de la ruta de MAPK se modulan mediante tratamiento agudo (4 horas) y prolongado (24 horas) con BVD-523 en células A375 mutantes para BRAF<V600E>.

[0059] La figura 31A - figura 31C muestran actividad antitumoral de BVD-523in vivo. La monoterapia con BVD-523 inhibe el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de línea celular (figura 31A) A375 y (figura 31B) Colo205 (<a>P

<0,0001, en comparación con control de vehículo; CPT-11 administrado como dosis en el día 14 y día 18 únicamente). Abreviaturas: BID, dos veces al día; CMC, carboximetilcelulosa; QD, cada día; Q4D, cada 4 días. La figura 31C muestra que, en xenoinjertos de Colo205, la fosforilación de ERK1/2 aumentada se correlaciona con la concentración de BVD-523.

[0061] La figura 32A muestra efectos de señalización de inhibidores de ERK1/2. Usando RPPA, se miden efectos sobre proteínas en líneas celulares (A375, AN3Ca, Colo205, HCT116, HT29 y MIAPaca2) tras el tratamiento con inhibidores de ERK1/2 BVD-523 (BVD), Vx11e (Vx), GDC-0994 (GDC), o SCH722984 (SCH). La figura 32B muestra que los inhibidores de ERK BVD-523, GDC-0994, y Vx11e tienen efectos diferenciales sobre fosfo-ERK (ERK 1/2 T202 Y204) en comparación con SCH722984; fosfo-RSK (p90 RSK 380) y ciclina D1 se inhiben mediante los inhibidores de ERK sometidos a prueba. Abreviaturas: BRAFi, inhibidores de BRAF; MEKi, inhibidores de MEK. La figura 32C muestra un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western de fracciones celular y nuclear a partir de una línea celular RKO tras el tratamiento con BVD-523, trametinib, SCH722984, o dabrafenib. Se incluyeron histona H3 (proteína localizada nuclear) y HSP90 (proteína localizada citoplasmática) como controles positivos para confirmar que las fracciones nuclear y citoplasmáticas estaban enriquecidas de manera apropiada; las fracciones nucleares tienen un alto nivel de H3 y las fracciones citoplasmática tienen un nivel superior de HSP90.

[0063] La figura 33 muestra que los inhibidores de ERK BVD-523, Vx11, CDC-0994, y SCH772984 (SCH) demuestran cambios dependientes de la línea celular en los niveles de fosfo-ATK. Abreviatura: DMSO, dimetilsulfóxido.

[0065] La figura 34A - figura 34D muestran que BVD-523 demuestra actividad en modelos de resistencia a inhibición de BRAF/MEK. Se indica la aparición de resistencia a BVD-523, dabrafenib, o trametinib en células A375 BRAF<V600E>tras la exposición a concentraciones crecientes de fármaco. Se aplicó un conjunto estricto de “criterios” para determinar cuándo podía aumentarse la dosis con el fin de garantizar que la cinética de la adquisición de resistencia entre tratamientos era comparable. Véase el ejemplo 1. El tiempo se muestra frente a multiplicadores de CI<50>; cada punto en la línea representada gráficamente representa un cambio de medio o división celular. La figura 34A muestra que adaptar células a crecer en presencia de BVD-523 resultó más difícil que con cualquiera dabrafenib o trametinib. La figura 34B muestra que la sensibilidad a BVD-523 se conserva en células A375 cultivadas para adquirir resistencia a inhibición combinada de BRAF (dabrafenib) MEK (trametinib). En la figura 34C, se trataron células con compuesto durante 96 h y se evaluó la viabilidad usando CellTiter-Glo<®>. La actividad de BVD-523 se conserva en células RKO BRAF<V600E>con resistencia cruzada a inhibidores de BRAF (dabrafenib) y MEK (trametinib) debido a la inserción heterocigótica endógena de MEK1<Q56P>. La figura 34D muestra que la inhibición por BVD-523 de pRSK en la línea celular RKO mutante para BRAF<V600E>se mantiene en presencia de MEK1<Q56P>, que confiere resistencia a la inhibición de MEK y BRAF. La inserción de alelos mutantes de KRAS en líneas celulares SW48 reduce significativamente la sensibilidad a los inhibidores de MEK trametinib y selumetinib, al tiempo que se conserva comparativamente la sensibilidad a BVD-523.

[0067] La figura 35A muestra la actividad de BVD-523in vivoen xenoinjertos derivados de un paciente que presenta recidiva con vemurafenib. Se muestra el volumen tumoral medio (± EEM) para BVD-523100 mg/kg BID solo, dabrafenib 50 mg/kg BID solo, y BVD-523100 mg/kg BID más dabrafenib 50 mg/kg BID. Abreviaturas: BID, dos veces al día; EEM, error estándar de la media.

[0069] La figura 36A - figura 36D muestran el beneficio de la inhibición de BVD-523 y BRAF combinada. La figura 36A - figura 36B muestran que la combinación de BVD-523 más dabrafenib mostró una actividad antitumoral superior en comparación con el tratamiento con cualquier agente por sí solo en un modelo de xenoinjerto de línea celular de melanoma A375 mutante para BRAF<V600E>con un volumen tumoral inicial de 75-144 mm<3>. La figura 36C - figura 36D muestran datos similares a partir del mismo modelo con un volumen tumoral aumentado (700 -800 mm<3>) al inicio de la dosificación. Se presentan representaciones gráficas del crecimiento tumoral medio (paneles izquierdos) y supervivencia de Kaplan-Meier (paneles derechos) para cada estudio. Abreviaturas: BID, dos veces al día; QD, una vez al día.

[0071] La figura 37A muestra que, en células colorrectales SW48 modificadas por ingeniería con alelos de KRAS, la respuesta a paclitaxel no se vio alterada en comparación con el control. La figura 37B muestra interacciones de combinación entre BVD-523 y vemurafenib, que se evaluaron usando una matriz de concentraciones de 8 x 10 usando los modelos de aditividad de Loewe y de independencia de Bliss, y se analizaron con el software de bioinformática Chalice de Horizon. Chalice permite identificar posibles interacciones sinérgicas visualizando la inhibición en exceso calculada con respecto a la predicha como aditiva a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y notificando una “puntuación de sinergia” cuantitativa basándose en el modelo de Loewe. Los resultados sugieren que las interacciones entre BVD-523 y vemurafenib son al menos aditivas, y en algunos casos sinérgicas, en líneas celulares de melanoma que portan una mutación de BRAF<V600E>. La figura 37 C muestra que BVD-523 en combinación con dabrafenib retarda notablemente la aparición de resistencia adquirida en células de melanoma A375 BRAF<V600E>. Se evaluó la adquisición temporal de resistencia en respuesta a concentraciones crecientes de dabrafenib solo o en combinación con BVD-523 o trametinib. Se aplicaron criterios estrictos con respecto a cuándo podía aumentarse la dosis para garantizar que la cinética de adaptación era comparable entre tratamientos. Véase el ejemplo 1.

[0072] La figura 38 muestra que BVD-523 inhibeex vivola fosforilación de RSK1/2 estimulada por PMA en sangre completa humana. Los promedios del conjunto de datos de concentración de BVD-523 se indican mediante (-). n = 20 para cada concentración de BVD-523. Abreviaturas: PBMC, células mononucleares de sangre periférica; RSK, cinasa S6 ribosómica.

[0073] La figura 39A muestra la farmacocinética de BVD-523 en estado estacionario (ciclo 1, día 15). La línea roja discontinua indica una CE<50>de 200 ng/ml de HWB. Abreviaturas: AUC, área bajo la curva; BID, dos veces al día; C<máx>, concentración máxima; CE<50>, concentración eficaz máxima al 50%; HWB, sangre completa humana; DE, desviación estándar. La figura 39B muestra la inhibición farmacodinámica de fosforilación de ERK mediante BVD-523 en sangre completa humana. Abreviaturas: BID, dos veces al día; pRSK, fosfo-RSK; RSK, cinasa S6 ribosómica.

[0074] La figura 40A muestra la mejor respuesta radiográfica en pacientes tratados con BVD-523. Se incluyen todos los pacientes con enfermedad medida mediante RECIST v1.1 que recibieron ≥1 dosis de tratamiento de estudio y tuvieron > 1 evaluación del tumor con tratamiento (25/27; 2 no recibieron ambas exploraciones de lesiones diana). Se midió la respuesta como el cambio desde el nivel inicial en la suma del diámetro más largo de cada lesión diana. La dosis mostrada es la que estaba recibiendo el paciente en el momento de la respuesta. La línea discontinua indica el umbral para una respuesta parcial según RECIST v1.1. Abreviaturas: CRC, cáncer colorrectal; NET, tumores neuroendocrinos; NSCLC, cáncer de pulmón de células no pequeñas; NSGCT, tumores de células germinales no seminomatosos; PNET, NET pancreático; PTC, cáncer de tiroides papilar; RECIST v1.1, criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1; SLD, suma del diámetro más grande. La figura 40B muestra una exploración de tomografía computerizada de una respuesta parcial confirmada en un paciente de 61 años de edad con un melanoma mutante para BRAF tratado con BVD-523.

[0075] La figura 41 muestra la respuesta tumoral y progresión tumoral. Se muestra un gráfico de natación de la respuesta tumoral, progresión tumoral, y duración de tratamiento en pacientes con respuesta evaluable tratados con BVD-523. El origen del eje vertical corresponde a la fecha de aleatorización o fecha de inicio de referencia. Fecha de corte del análisis: 1 de diciembre de 2015. Abreviatura: BID, dos veces al día.

[0076] Descripción detallada de la invención

[0077] Para referencia, se da a conocer un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0078] Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratar”, “que trata”, “tratamiento” y variaciones gramaticales de los mismos significan someter a un sujeto individual a un protocolo, pauta, procedimiento o remedio, en el que se desea obtener una respuesta o desenlace fisiológico en ese sujeto, por ejemplo, un paciente. En particular, las composiciones de la presente invención y métodos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para ralentizar el desarrollo de síntomas de la enfermedad o retrasar la aparición de la enfermedad o estado, o detener la progresión del desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, dado que cada sujeto tratado puede no responder a un protocolo, pauta, procedimiento o remedio de tratamiento particular, el tratamiento no requiere que se logre la respuesta o desenlace fisiológico deseado en todos y cada uno de los sujetos o población de sujetos, por ejemplo, población de pacientes. Por consiguiente, un sujeto o población de sujetos dado, por ejemplo, población de pacientes, puede no lograr responder o responder de manera inadecuada al tratamiento.

[0079] Tal como se usan en el presente documento, los términos “mejorar”, “que mejora” y variaciones gramaticales de los mismos significan reducir la intensidad de los síntomas de una enfermedad en un sujeto.

[0080] Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un mamífero, preferiblemente, un ser humano. Además de seres humanos, las categorías de mamíferos incluyen, por ejemplo, animales de granja, animales domésticos, animales de laboratorio, etc. Algunos ejemplos de animales de granja incluyen vacas, cerdos, caballos, cabras, etc. Algunos ejemplos de animales domésticos incluyen perros, gatos, etc. Algunos ejemplos de animales de laboratorio incluyen primates, ratas, ratones, conejos, cobayas, etc.

[0081] En la presente invención, BVD-523 corresponde a un compuesto según la fórmula (I):

[0082]

[0085] y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. BVD-523 puede sintetizarse según los métodos dados a conocer, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 7.354.939. También se contemplan enantiómeros y mezclas racémicas de ambos enantiómeros de BVD-523 dentro del alcance de la presente invención. BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2 con un mecanismo de acción que se cree que es, por ejemplo, único y distinto de algunos otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984 y la estructure de pirimidina usada por Hatzivassiliouet al. (2012). Por ejemplo, otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984, inhiben la autofosforilación de ERK (Morriset al., 2013), mientras que BVD-523 permite la autofosforilación de ERK al tiempo que todavía inhibe ERK (véase, por ejemplo, la figura 18).

[0086] Tal como se usan en el presente documento, los términos “resistente” y “que no responde” se usan de manera intercambiable. Ser “resistente” a terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK tratamientos significa que los inhibidores de MAPK distintos de ERK tienen una eficacia reducida en el tratamiento de cáncer.

[0088] Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de MAPK distinto de ERK” significa cualquier sustancia que reduce la actividad, expresión o fosforilación de proteínas u otros miembros de la ruta de MAPK que da como resultado una reducción del crecimiento celular o un aumento de la muerte celular, con la excepción de inhibidores de ERK1/2. Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de ERK1/2” significa las sustancias que (i) interaccionan directamente con ERK1 y/o ERK2, por ejemplo, mediante unión a ERK1/2 y (ii) reducen la expresión o la actividad de proteínas cinasas ERK1 y/o ERK2. Por tanto, los inhibidores que actúan aguas arriba de ERK1/2, tales como los inhibidores de MEK y los inhibidores de RAF, no son inhibidores de ERK1/2 según la presente invención (pero son inhibidores de MAPK distintos de ERK). Los ejemplos no limitativos de inhibidores de ERK1/2 según la presente invención incluyen AEZS-131 (Aeterna Zentaris), AEZS-136 (Aeterna Zentaris), BVD-523 (BioMed Valley Discoveries, Inc.), SCH-722984 (Merck & Co.), SCH-772984 (Merck & Co.), SCH-900353 (MK-8353) (Merck & Co.), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

[0090] En la figura 21 se muestra un resumen de las cascadas de MAPK de mamífero. La ruta de MAPK se revisa, por ejemplo, en Akinleyeet al., 2013. En resumen, con respecto al módulo de ERK1/2 en la figura 21 (recuadro de color morado claro), la cascada de señalización de MAPK 1/2 se activa mediante unión de ligando a tirosina cinasas receptoras (RTK). Los receptores activados reclutan y fosforilan proteínas adaptadoras Grb2 y SOS, que entonces interaccionan con GTPasa Ras unida a membrana y provocan su activación. En su forma unida a GTP activada, Ras recluta y activa cinasas RAF (A-RAF, B-RAF, y C-RAF/RAF-1). Las cinasas RAF activadas activan MAPK 1/2 (MKK1/2), que a su vez catalizan la fosforilación de residuos de treonina y tirosina en la secuencia de activación Thr-Glu-Tyr de ERK1/2. Con respecto al módulo de JNK/p38 (recuadro amarillo en la figura 21), cinasas aguas arriba, MAP3K, tales como MEKK1/4, ASK1/2, y MLK1/2/3, activan MAP2K3/6 (MKK3/6), MAP2K4 (MKK4), y MAP2K7 (MKK7). Entonces, estas MAP2K activan proteínas cinasas JNK, incluyendo JNK1, JNK2, y JNK3, así como p38 α/β/γ/δ. Para llevar a cabo sus funciones, las JNK activan varios factores de transcripción, incluyendo c-Jun, ATF-2, NF-ATc1, HSF-1 y STAT3. Con respecto al módulo de ERK5 (recuadro azul en la figura 21), las cinasas aguas arriba de MAP2K5 (MKK5) son MEKK2 y MEKK3. La diana aguas abajo mejor caracterizada de MEK5 es ERK5, también conocida como MAP cinasa grande 1 (BMK1) porque tiene el doble de tamaño que otras MAPK.

[0092] Los ejemplos no limitativos de inhibidores de la ruta de MAPK distinta de ERK según la presente invención incluyen inhibidores de RAS, inhibidores de RAF (tales como, por ejemplo, inhibidores de A-RAF, B-RAF, C-RAF (RAF-1)), inhibidores de MEK, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, los inhibidores de la ruta de MAPK distinta de ERK son inhibidores de BRAF, inhibidores de MEK, y combinaciones de los mismos.

[0094] Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de RAS” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con RAS, por ejemplo, mediante unión a RAS y (ii) reducen la expresión o la actividad de RAS. Los inhibidores de RAS a modo de ejemplo no limitativos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de farnesil transferasa (tales como, por ejemplo, tipifarnib y lonafarnib), moléculas pequeñas que contienen grupo farnesilo (tales como, por ejemplo, salirasib y TLN-4601), DCAI, tal como se da a conocer por Maurer (Maureret al., 2012), Kobe0065 y Kobe2602, tal como se da a conocer por Shima (Shimaet al., 2013), HBS 3 (Patgiriet al., 2011), y AIK-4 (Allinky).

[0095] Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de RAF” significa las sustancias que (i) interaccionan directamente con RAF, por ejemplo, mediante unión a RAF y (ii) reducen la expresión o la actividad de RAF, tal como, por ejemplo, A-RAF, B-RAF, y C-RAF (RAF-1). Los inhibidores de RAF a modo de ejemplo no limitativos, incluyendo inhibidores de BRAF, incluyen:

[0097] Compuesto 7

[0099] Compuesto 9

[0101] Compuesto 10

[0102] Compuesto 13

[0103] Compuesto 14

[0104] Compuesto 15

[0105] Compuesto 16

[0106] Compuesto 18

[0107] Compuesto 19

[0108] Compuesto 20

[0109] Compuesto 21

[0110] Compuesto 22

[0111] Compuesto 23

[0112] Compuesto 24

[0113] Compuesto 25

[0114] Compuesto 26

[0115] Compuesto 27

[0116] Compuesto 28

[0117] Compuesto 30

[0118] Compuesto 31

[0119] Compuesto 32

[0120] Compuesto 33

[0121] Compuesto 34

[0122] Compuesto 35

[0123] Compuesto 36

[0124] Compuesto 37

[0125] Compuesto 38

[0127] Compuesto 39

[0129] Compuesto 40

[0130] AAL881 (Novartis); AB-024 (Ambit Biosciences), ARQ-736 (ArQuIe), ARQ-761 (ArQule), AZ628 (Axon Medchem BV), BeiGene-283 (BeiGene), BIIB-024 (MLN 2480) (Sunesis & Takeda), inhibidor de b-raf (Sareum), inhibidor de cinasa BRAF (Selexagen Therapeutics), ARNip de BRAF 313 (tacaccagcaagctagatgca) y 523 (cctatcgttagagtcttcctg) (Liuet al., 2007), CTT239065 (Institute of Cancer Research), dabrafenib (GSK2118436), DP-4978 (Deciphera Pharmaceuticals), HM-95573 (Hanmi), GDC-0879 (Genentech), GW-5074 (Sigma Aldrich), ISIS 5132 (Novartis), L779450 (Merck), LBT613 (Novartis), LErafAON (NeoPharm, Inc.), LGX-818 (Novartis), pazopanib (GlaxoSmithKline), PLX3202 (Plexxikon), PLX4720 (Plexxikon), PLX5568 (Plexxikon), RAF-265 (Novartis), RAF-365 (Novartis), regorafenib (Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Inc.), RO 5126766 (Hoffmann-La Roche), SB-590885 (GlaxoSmithKline), SB699393 (GlaxoSmithKline), sorafenib (Onyx Pharmaceuticals), TAK 632 (Takeda), TL-241 (Teligene), vemurafenib (RG7204 o PLX4032) (Daiichi Sankyo), XL-281 (Exelixis), ZM-336372 (AstraZeneca), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

[0131] Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de MEK” significa las sustancias que (i) interaccionan directamente con MEK, por ejemplo, mediante unión a MEK y (ii) reducen la expresión o la actividad de MEK. Por tanto, los inhibidores que actúan aguas arriba de MEK, tales como los inhibidores de RAS y los inhibidores de RAF, no son inhibidores de MEK según la presente invención. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de MEK incluyen toxina ántrax, antroquinonol (Golden Biotechnology), ARRY-142886 ((2-hidroxietoxi)-amida del ácido 6-(4-bromo-2-clorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico) (Array BioPharma), ARRY-438162 (Array BioPharma), AS-1940477 (Astellas), AS-703988 (Merck KGaA), bentamapimod (Merck KGaA), BI-847325 (Boehringer Ingelheim), E-6201 (Eisai), GDC-0623 (Hoffmann-La Roche), GDC0973 (cobimetinib) (Hoffmann-La Roche), L783277 (Merck), porción de factor letal de la toxina ántrax, MEK162 (Array BioPharma), PD 098059 (2-(2’-amino-3’metoxifenil) oxanaftalen-4-ona) (Pfizer), PD 184352 (Cl-1040) (Pfizer), PD-0325901 (Pfizer), pimasertib (Santhera Pharmaceuticals), RDEA119 (Ardea Biosciences/Bayer), refametinib (AstraZeneca), RG422 (Chugai Pharmaceutical Co.), R0092210 (Roche), R04987655 (Hoffmann-La Roche), R05126766 (Hoffmann-La Roche), selumetinib (AZD6244) (AstraZeneca), SL327 (Sigma), TAK733 (Takeda), trametinib (Japan Tobacco), U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis(2-aminofeniltio)butadieno) (Sigma), (Wilex), polipéptido YopJ (Mittalet al., 2010), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

[0132] Sustancialmente la totalidad de la fosforilación de la cinasa s6 ribosómica (RSK) puede inhibirse tras la administración de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Tal como se usa en el presente documento en el contexto de la fosforilación de RSK, “sustancialmente la totalidad” significa una reducción de más del 50%, preferiblemente una reducción de más del 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.

[0133] Además, el cáncer puede tener actividad MAPK. Tal como se usa en el presente documento, tener “actividad MAPK” significa que proteínas aguas abajo de ERK todavía están activas, aunque proteínas aguas arriba de ERK puedan no estar activas. Un cáncer de este tipo puede ser un cáncer de tumor sólido o un cáncer hematológico.

[0134] Los cánceres incluyen cánceres tanto sólidos como hematológicos. Los ejemplos no limitativos de cánceres sólidos incluyen carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de vejiga, cáncer de hueso (tal como osteosarcoma), cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer carcinoide, carcinoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de conducto biliar extrahepático, familia de cánceres de Ewing, cáncer de células germinales extracraneales, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hipofaringe, carcinoma de células del islote, cáncer de riñón, cáncer del intestino grueso, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de labio y de la cavidad bucal, tumor/cáncer de hígado, tumor/cáncer de pulmón, linfoma, mesotelioma maligno, carcinoma de células de Merkel, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer bucal, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer epitelial de ovarios, cáncer de células germinales de ovarios, cáncer pancreático, cáncer de seno paranasal y de la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer hipofisario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de célula de transición de la pelvis renal y del uréter, cáncer de las glándulas salivares, síndrome de Sezary, cánceres de piel (tales como linfoma cutáneo de células T, sarcoma de Kaposi, tumor de mastocitos y melanoma), cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, cáncer de estómago, cáncer de testículos, timoma, cáncer tiroideo, cáncer uretral, cáncer uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, y tumor de Wilms. Los ejemplos de cánceres hematológicos incluyen, pero no se limitan a, leucemias, tales como leucemia linfoblástica aguda de adultos/infantil, leucemia mieloide aguda de adultos/infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, y leucemia de célula pilosas, linfomas, tales como linfoma relacionado con el SIDA, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin de adultos/infantil, micosis fungoide, linfoma no Hodgkin de adultos/infantil, linfoma primario del sistema nervioso central, síndrome de Sézary, linfoma cutáneo de células T, y macroglobulinemia de Waldenstrom, así como otros trastornos proliferativos tales como trastornos mieloproliferativos crónicos, histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndromes mielodisplásicos, y neoplasias mielodisplásicas/mueloproliferativas.

[0135] Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un cáncer del intestino grueso, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de piel, y cánceres endometriales. En la presente invención, el cáncer es melanoma. El método puede comprender además administrar al sujeto al menos un agente terapéutico adicional eficaz para tratar o mejorar los efectos del cáncer. El agente terapéutico adicional puede seleccionarse del grupo que consiste de un anticuerpo o fragmento del mismo, un agente citotóxico, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente anti-angiogénesis, y combinaciones de los mismos.

[0136] Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” abarca inmunoglobulinas que se producen de manera natural así como inmunoglobulinas que no se producen de manera natural, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los fragmentos de anticuerpos incluyen los que se unen a antígeno, (por ejemplo, Fab’, F(ab’)<2>, Fab, Fv, y rlgG). Véase también, por ejemplo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3ª ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York (1998). El término anticuerpo también incluye moléculas bivalentes o biespecíficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. El término “anticuerpo” incluye además anticuerpos tanto policlonales como monoclonales.

[0137] Los ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen rituximab (Rituxan), cetuximab (Erbitux), bevacizumab (Avastin), e ibritumomab (Zevalin).

[0138] Los agentes citotóxicos incluyen agentes de daño del ADN, antimetabolitos, agentes antimicrotúbulos, agentes antibióticos, etc. Los agentes de daño del ADN incluyen agentes alquilantes, agentes basados en platino, agentes de intercalación, e inhibidores de la replicación del ADN. Los ejemplos no limitativos de agentes de alquilación del ADN incluyen ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalán, clorambucilo, ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina, busulfano, temozolomida, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de agentes basados en platino incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, satraplatino, tetranitrato de triplatino, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de agentes de intercalación incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, mitoxantrona, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de la replicación del ADN incluyen irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos. Los antimetabolitos incluyen antagonistas de folato tales como metotrexato y premetrexed, antagonistas de purina tales como 6-mercaptopurina, dacarbazina, y fludarabina, y antagonistas de pirimidina tales como 5-fluorouracilo, arabinosil-citosina, capecitabina, gemcitabina, decitabina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos. Los agentes anti-microtúbulos incluyen sin limitación alcaloides de la vinca, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), e ixabepilona (Ixempra®). Los agentes antibióticos incluyen sin limitación actinomicina, antraciclinas, valrubicina, epirubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos.

[0140] Los agentes citotóxicos también incluyen un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt. Los ejemplos no limitativos de un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt incluyen A-674563 (n.º CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand oaks, CA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-tiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.º CAS 857531-00-1), serie de bencimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.º CAS 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.º CAS 612847-09-3, n.º CAS 681281-88-9, n.º CAS 75747-14-7, n.º CAS 925681-41-0, n.º CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.º CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.º CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, R.U.), FPA 124 (n.º CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), CSK 690693 (n.º CAS 937174-76-0), H-89 (n.º CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPl-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, R.U.), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.º CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.º CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.º CAS 105637-50-1), clorhidrato de naitrindol, OXY-111A (Normoxis Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.º CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 cinasa delta, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 cinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 cinasa delta 2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 cinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-I (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K-delta/gamma, Intellikine-l (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K-delta/gamma, Intellikine-l (Intellikine Inc.), pictilisib (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (n.º CAS 67733812-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidro-curcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

[0142] En la presente divulgación, el término “toxina” significa una toxina antigénica o veneno de origen vegetal o animal. Un ejemplo es la toxina diftérica o porciones de la misma.

[0144] En la presente divulgación, el término “radionúclido” significa una sustancia radiactiva administrada al paciente, por ejemplo, por vía intravenosa u oral, tras lo cual penetra a través del metabolismo normal del paciente en el órgano o tejido diana, en el que suministra radiación local durante un breve tiempo. Los ejemplos de radionúclidos incluyen, pero no se limitan a, I-125, At-211, Lu-177, Cu-67, I-131, Sm-153, Re-186, P-32, Re-188, In-114m, e Y-90.

[0146] En la presente divulgación, el término “inmunomodulador” significa una sustancia que altera la respuesta inmunitaria aumentando o reduciendo la capacidad del sistema inmunitario para producir anticuerpos o células sensibilizadas que reconocen y reaccionan con el antígeno que inició su producción. Los inmunomoduladores pueden ser preparaciones recombinantes, sintéticas, o naturales e incluyen citocinas, corticosteroides, agentes citotóxicos, timosina, e inmunoglobulinas. Algunos inmunomoduladores están presentes de manera natural en el organismo, y algunos de los mismos están disponibles en preparaciones farmacológicas. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferones, imiquimod y fracciones de membrana celular de bacterias, IL-2, IL-7, IL-12, CCL3, CCL26, CXCL7, y citosina fosfato-guanosina (CpG) sintético.

[0147] En la presente divulgación, el término “agente terapéutico fotoactivo” significa compuestos y composiciones que se vuelven activos tras la exposición a luz. Determinados ejemplos de agentes terapéuticos fotoactivos se dan a conocer, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 2011/0152230 A1, “Photoactive Metal Nitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy”.

[0148] En la presente divulgación, el término “agente radiosensibilizante” significa un compuesto que hace que las células tumorales sean más sensibles a la terapia con radiación. Los ejemplos de agentes radiosensibilizantes incluyen misonidazol, metronidazol, tirapazamina, y trans-crocetinato de sodio.

[0149] En la presente divulgación, el término “hormona” significa una sustancia liberada por células en una parte de un organismo que afecta a células en otra parte del organismo. Los ejemplos de hormonas incluyen, pero no se limitan a, prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, amilina, hormona antimülleriana, adiponectina, hormona adrenocorticotrópica, angiotensinógeno, angiotensina, vasopresina, atriopeptina, péptido natriurético cerebral, calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, encefalina, endotelina, eritropoyetina, hormona estimulante del folículo, galanina, gastrina, ghrelina, glucagón, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, somatomedina, leptina, liptropina, hormona luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, motilina, orexina, oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, prolactina, hormona liberadora de prolactina, relaxina, renina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimulante del tiroides, testosterona, deshidroepiandrosterona, androstenodiona, dihidrotestosterona, aldosterona, estradiol, estrona, estriol, cortisol, progesterona, calcitriol, y calcidiol.

[0150] Algunos compuestos interfieren con la actividad de determinadas hormonas o detienen la producción de determinadas hormonas. Estos compuestos de interferencia con hormonas incluyen, pero no se limitan a, tamoxifeno (Nolvadex®), anastrozol (Arimidex®), letrozol (Femara®), y fulvestrant (Faslodex®). Tales compuestos también se encuentran dentro del significado de hormona en la presente divulgación.

[0151] Tal como se usa en el presente documento, un agente “anti-angiogénesis” significa una sustancia que reduce o inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, tal como, por ejemplo, un inhibidor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y un inhibidor de migración de células endoteliales. Los agentes anti-angiogénesis incluyen sin limitación 2-metoxiestradiol, angiostatina, bevacizumab, factor inhibidor de la angiogénesis derivado de cartílago, endostatina, IFN- α, IL-12, itraconazol, linomida, factor plaquetario 4, prolactina, SU5416, suramina, tasquinimod, tecogalano, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina, trombospondina, TNP-470, ziv-aflibercept, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos.

[0152] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto. El método comprende:

[0153] (a) identificar a un sujeto con cáncer que ha pasado a no responder o ser resistente a terapia con inhibidor de BRAF, terapia con inhibidor de MEK, o terapia con inhibidor de BRAF y MEK; y

[0154] (b) administrar al sujeto con dicho cáncer que no responde o resistente una cantidad eficaz de un inhibidor de ERK, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0155] Los sujetos adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. Los métodos pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente. El cáncer puede tener actividad MAPK.

[0156] Identificar a un sujeto con cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de BRAF y/o MEK puede comprender:

[0157] (a) obtener una muestra biológica del sujeto; y

[0158] (b) examinar la muestra para determinar si el sujeto se ha vuelto resistente a una terapia con inhibidor seleccionada del grupo que consiste de terapia con inhibidor de BRAF, terapia con inhibidor de MEK, y combinaciones de las mismas.

[0159] En la presente divulgación, las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, plasma, orina, piel, saliva, y biopsias. Las muestras biológicas se obtienen de un sujeto mediante procedimientos y métodos rutinarios que se conocen en la técnica.

[0160] Preferiblemente, la exploración para detectar un cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de BRAF puede comprender, por ejemplo, identificar (i) un cambio entre isoformas de RAF, (ii) regulación por incremento de señalización de RTK o NRAS, (iii) reactivación de señalización de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK), (iv) la presencia de una mutación activante de MEK, y combinaciones de los mismos.

[0161] Un cambio entre isoformas de RAF puede producirse en sujetos que tienen resistencia adquirida a terapia con inhibidor de BRAF. Para detectar un cambio de este tipo, pueden recuperarse células tumorales resistentes a inhibidor de BRAF a partir de un paciente y analizarse mediante inmunotransferencia de tipo Western para detectar niveles de ERK y fosfo-ERK en presencia de un inhibidor de BRAF. La comparación con células sensibles a inhibidor de BRAF tratadas con un inhibidor de BRAF puede revelar niveles superiores de fosfo-ERK en células tumorales resistentes a inhibidor de BRAF, implicando que ha tenido lugar un cambio en el que otra isoforma de RAF fosforila ERK en lugar de BRAF. La confirmación de qué isoforma de RAF ha tenido lugar puede implicar la desactivación mediada por ARNhc/ip de ARAF y CRAF de manera individual en células resistentes a inhibidor de BRAF expuestas a un inhibidor de BRAF, seguido por la posterior inmunotransferencia de tipo Western para detectar niveles de ERK y fosfo-ERK. Si, por ejemplo, la desactivación de ARAF en células resistentes a inhibidor de BRAF expuestas a un inhibidor de BRAF todavía da como resultado altos niveles de fosfo-ERK, esto indicará que CRAF se ha ocupado de la fosforilación de ERK. Asimismo, si se desactivó CRAF en células resistentes a inhibidor de BRAF expuestas a inhibidor de BRAF y ERK todavía estaba altamente fosforilado, esto indicará que ARAF se ha ocupado de la fosforilación de ERK. El cambio de isoforma de RAF también puede implicar la desactivación simultánea de ARAF y CRAF en células resistentes a inhibidor de BRAF en presencia de inhibidor de BRAF, bloqueando eficazmente toda la fosforilación mediada por RAF. Una reducción resultante de la fosforilación de ERK indicará que las células resistentes a inhibidor de BRAF tienen la capacidad de cambiar entre isoformas de RAF con el fin de fosforilar ERK (Villanueva,et al., 2010).

[0163] La regulación por incremento de señalización de RTK o NRAS también puede ser una causa de resistencia a inhibidor de BRAF. La detección puede implicar en primer lugar, por ejemplo, usar protocolos de inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos específicos para fosfo para analizar la activación de los efectores de RAF aguas abajo MEK1/2 y ERK1/2. Si las células resistentes a inhibidor de BRAF muestran altos niveles de activación de estas proteínas en presencia de un inhibidor de BRAF, la regulación por incremento de RTK o NRAS puede ser la causa. La determinación del perfil de expresión génica (u otros métodos relacionados) de células resistentes a inhibidor de BRAF en presencia de un inhibidor de BRAF puede revelar niveles de expresión superiores de las RTK KIT, MET, EGFR, y PDGFR en comparación con células sensibles a inhibidor de BRAF. Experimentos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, u otros procedimientos similares, que se centran en cualquiera de estos genes pueden confirmar niveles de expresión superiores mientras que matrices de fosfo-RTK (R&D Systems, Minneapolis, MN) pueden mostrar una fosforilación de tirosina asociada con la activación elevada. Alternativamente, la activación de NRAS puede detectarse mediante diversos protocolos de secuenciación génica. Las mutaciones activantes en NRAS, particularmente Q61K, pueden indicar que se ha evitado la señalización de B-RAF. En células de melanoma, NRAS activado usa C-RAF para señalizar a MEK-ERK. Por tanto, NRAS activado puede permitir una ruta de derivación similar en células resistentes a inhibidor de BRAF expuestas a inhibidor de BRAF. Una confirmación adicional de estos mecanismos en una muestra resistente a inhibidor de BRAF dada puede lograrse, por ejemplo, usando desactivación mediada por ARNhc/ip de RTK reguladas por incremento o NRAS activado en presencia de inhibidor de BRAF. Cualquier nivel significativo de inhibición del crecimiento puede indicar que la regulación por incremento de la señalización de RTK o NRAS es la causa de la inhibición de BRAF en esa muestra particular (Nazarian,et al.2010).

[0165] Detectar la reactivación de señalización de MAPK en células resistentes a inhibidor de BRAF puede indicar otro mecanismo de derivación para la resistencia a inhibidor de BRAF. Se ha mostrado que COT y C-RAF están regulados por incremento en un contexto de BRAF<V600E>expuesto a inhibidor de BRAF. La RT-PCR cuantitativa en tiempo real, por ejemplo, puede revelar una expresión de COT aumentada en células resistentes a inhibidor de BRAF en presencia de inhibidor de BRAF. Además, la desactivación mediada por ARNhc/ip de COT en células resistentes a inhibidor de BRAF en presencia de inhibidor de BRAF puede reducir la viabilidad de células resistentes a inhibidor de BRAF, indicando que estas células particulares pueden ser sensibles a tratamientos de inhibición de COT y/o de inhibidor de BRAF/inhibidor de MEK en combinación (Johannessen,et al., 2010).

[0167] La reactivación de señalización de MAPK también puede lograrse en un contexto resistente a inhibidor de BRAF mediante mutaciones activantes en MEK1. La secuenciación masiva en paralelo, dirigida, de ADN genómico a partir de un tumor resistente a inhibidor de BRAF puede revelar mutaciones activantes en MEK1, tales como C121S, G128D, N122D, e Y130, entre otras. Otras mutaciones no documentadas en MEK1 pueden analizarse, por ejemplo, expresando la mutación particular en una línea celular sensible a inhibidor de BRAF tal como A375. Determinar niveles de inhibición del crecimiento en estas células tras la exposición a inhibidor de BRAF puede indicar si la mutación de MEK1 está provocando resistencia a la terapia con inhibidor de BRAF. Para confirmar tal hallazgo, la inmunotransferencia de tipo Western para niveles elevados de fosfo-ERK1/2 en células que expresan de manera ectópica la mutación de MEK1 puede indicar que la mutación de MEK1 está permitiendo que el tumor resistente a inhibidor de BRAF evite BRAF y fomente la fosforilación de ERK a través de MEK1 (Wagle,et al., 2011).

[0169] Según la presente divulgación, la exploración para detectar un cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de MEK puede comprender, por ejemplo, identificar (i) amplificación de BRAF mutante, (ii) regulación por incremento de STAT3, (iii) mutaciones en la cavidad alostérica de MEK que bloquean directamente la unión de inhibidores a MEK o conducen a actividad MEK constitutiva, y combinaciones de los mismos.

[0171] La amplificación de BRAF mutante puede provocar resistencia a inhibidor de MEK. La resistencia a inhibidor de MEK está normalmente asociada con altos niveles de ERK y MEK fosforilados en presencia de un inhibidor de MEK, lo cual puede evaluarse, por ejemplo, mediante inmunotransferencia de tipo Western. La amplificación de BRAF mutante en líneas celulares resistentes a inhibidor de MEK puede detectarse, por ejemplo, mediante hibridaciónin situpor fluorescencia (FISH) o PCR cuantitativa a partir de ADN genómico de las líneas celulares resistentes. La confirmación de que la amplificación de BRAF es la causa primaria de resistencia a inhibidor de MEK puede conllevar usar ARNhc/ip dirigidos a BRAF en células resistentes. Si se observa una reducción significativa de la fosforilación de MEK o ERK, la amplificación de BRAF puede ser una diana adecuada para enfoques terapéuticos adicionales (Corcoran,et al., 2010).

[0172] Identificar regulación por incremento de STAT3 puede indicar que una muestra de tumor particular es resistente a terapia con inhibidor de MEK. La determinación del perfil de expresión de todo el genoma puede revelar que la ruta de STAT3 está regulada por incremento en un tumor. Otras técnicas, tales como inmunotransferencia de tipo Western para fosfo-STAT3 y qPCR en tiempo real para los genes asociados con la ruta de STAT JAK1 e IL6ST, pueden revelar STAT3 regulado por incremento. Una confirmación adicional de que la regulación por incremento de STAT3 provoca resistencia a inhibidor de MEK en una muestra particular puede comprender el uso de ARNhc/ip frente a STAT3 en la muestra seguido por inmunotransferencia de tipo Western apropiada para la activación de MEK y ERK así como fosfoSTAT3 y STAT3 total. Estudios de inhibición del crecimiento pueden mostrar que la desactivación de STAT3 sensibiliza frente a la inhibición de MEK a células previamente resistentes a inhibidor de MEK. Puede observarse un efecto similar si la muestra se expuso a un inhibidor de STAT3 tal como JSl-124. Confirmación adicional de que la regulación por incremento de STAT3 es la cause de resistencia a inhibidor de MEK en un tumor particular puede surgir de inmunotransferencia de tipo Western para detectar expresión de BIM, incluyendo BIM-EL, BIM-L, y BIM-SL. La expresión de BIM conduce a apoptosis inducida por inhibidor de MEK, por tanto la regulación por incremento de STAT3 puede reducir los niveles de BIM. Se sabe que STAT3 regula la expresión de miR 17-92, que suprime la expresión de BIM. STAT3 regulado por incremento puede conducir a niveles superiores de miR 17-92, lo cual reducirá los niveles de BIM y fomentará resistencia a la inhibición de MEK. Por tanto, la qPCR en tiempo real de los niveles de miR 17-92 también puede ayudar a evaluar si la regulación por incremento de STAT3 está provocando resistencia a la inhibición de MEK en una muestra particular (Dai,et al., 2011).

[0173] Mutaciones en la cavidad alostérica de MEK que pueden bloquear directamente la unión de inhibidores a MEK o conducir a actividad MEK constitutiva pueden detectarse mediante métodos dados a conocer a continuación. Tales mutaciones se han identificado anteriormente por Emery y colaboradores (Emery,et al., 2009) así como por Wang y colaboradores (Wanget al., 2011). Otras mutaciones pueden afectar a codones de MEK1 ubicados dentro o en contacto con la hélice reguladora negativa N-terminal, tales como P124L y Q56P (Id.).

[0174] Métodos para identificar mutaciones en ácidos nucleicos, tales como los genes de MEK anteriormente identificados, también se conocen en la técnica. Pueden obtenerse ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas. En la presente invención, las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, plasma, orina, piel, saliva, y biopsias. Se obtienen muestras biológicas de un sujeto mediante procedimientos y métodos rutinarios que se conocen en la técnica. Los ejemplos no limitativos de métodos para identificar mutaciones incluyen PCR, secuenciación, captura de híbridos, capture en disolución, sondas de inversión molecular, ensayos de hibridaciónin situpor fluorescencia (FISH), y combinaciones de los mismos.

[0175] En la técnica se conocen diversos métodos de secuenciación. Estos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de Sanger (también denominada secuenciación de didesoxilo) y diversos métodos de secuenciación mediante síntesis (SBS) tal como se da a conocer, por ejemplo, en Metzker 2005, secuenciación mediante hibridación, mediante ligación (por ejemplo, WO 2005021786), mediante degradación (por ejemplo, patentes estadounidenses n.<os>5.622.824 y 6.140.053) y secuenciación mediante nanoporos (que está comercialmente disponible de Oxford Nanopore Technologies, R.U.). En técnicas de secuenciación profunda, un nucleótido dado en la secuencia se lee más de una vez durante el procedimiento de secuenciación. Técnicas de secuenciación profunda se dan a conocer, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense n.º 20120264632 y la publicación de patente internacional n.º WO2012125848.

[0176] En la técnica se conocen métodos basados en PCR para detectar mutaciones y emplean amplificación por PCR, en la que cada secuencia diana en la muestra tiene un par correspondiente de cebadores únicos específicos de secuencia. Por ejemplo, el método de reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (PCR-RFLP) permite una rápida detección de mutaciones tras amplificarse las secuencias genómicas mediante PCR. La mutación se distingue mediante digestión con endonucleasas de restricción específicas y se identifica mediante electroforesis. Véase, por ejemplo, Otaet al., 2007. También pueden detectarse mutaciones usando PCR en tiempo real. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.º WO2012046981.

[0177] En la técnica se conocen métodos de captura de híbridos y se dan a conocer, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense n.º 20130203632 y las patentes estadounidenses n.<os>8.389.219 y 8.288.520. Estos métodos se basan en la hibridación selectiva de las regiones genómicas diana a oligonucleótidos diseñados por el usuario. La hibridación puede ser a oligonucleótidos inmovilizados en matrices de alta o baja densidad (captura en matriz), o hibridación en fase en disolución a oligonucleótidos modificados con un ligando (por ejemplo, biotina) que pueden inmovilizarse posteriormente a una superficie sólida, tal como una perla (captura en disolución).

[0178] En la técnica se conocen técnicas de sondas de inversión molecular (MIP) y se dan a conocer, por ejemplo, en Absalanet al., 2008. Este método usa moléculas de MIP, que son sondas de “candado” especiales (Nilssonet al, 1994) para genotipado. Una molécula de MIP es un oligonucleótido lineal que contiene regiones específicas, secuencias universales, sitios de restricción y una secuencia Tag (índice) (16-22 pb). Un MIP se hibrida directamente alrededor del marcador genético/SNP de interés. El método de MIP también puede usar varios conjuntos de sondas de “candado” que se hibridan a ADN genómico en paralelo (Hardenbolet al., 2003). En el caso de una coincidencia perfecta, regiones de homología genómicas se ligan experimentando una inversión de configuración (tal como sugiere el nombre de la técnica) y creando una molécula circular. Tras la primera restricción, todas las moléculas se amplifican con cebadores universales. Los amplicones vuelven a restringirse para garantizar fragmentos cortos para su hibridación en una micromatriz. Los fragmentos cortos generados se etiquetan y, mediante una secuencia Tag, se hibridan a cTag (cadena complementaria para el índice) en una matriz. Tras la formación del dúplex Tag-cTag, se detecta una señal.

[0179] Las siguientes tablas 1, 2, y 3 muestran las SEQ ID NO de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos representativas de BRAF, N-RAS, y MEK1 de tipo natural de diversos animales en la lista de secuencias. Estas secuencias pueden usarse en métodos para identificar a sujetos con genotipos mutantes para BRAF, N-RAS, y MEK1.

[0180] Tabla 1 - Secuencias de BRAF

[0183]

[0184] Tabla 2 - Secuencias de N-RAS

[0187]

[0189] Tabla 3 - Secuencias de MEK1

[0192]

[0194] El método puede comprender además administrar al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

[0195] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para tratar o mejorar los efectos de cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de BRAF, terapia con inhibidor de MEK, o ambas. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0196] Los sujetos adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. Los métodos pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo los cánceres con los contextos de mutación, perfiles de resistencia, y actividad MAPK identificados anteriormente. Los métodos de identificación de tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente.

[0197] El método puede comprender además administrar al sujeto al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

[0198] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para identificar a un sujeto que tiene cáncer que se beneficiará de una terapia con un inhibidor de ERK. El método comprende:

[0199] (a) obtener una muestra biológica del sujeto; y

[0200] (b) examinar la muestra para determinar si el sujeto tiene uno o más de los siguientes marcadores:

[0201] (i) un cambio entre isoformas de RAF,

[0202] (ii) regulación por incremento de señalización de RTK o NRAS,

[0203] (iii) reactivación de señalización de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK),

[0204] (iv) la presencia de una mutación activante de MEK,

[0205] (v) amplificación de BRAF mutante,

[0206] (vi) regulación por incremento de STAT3,

[0207] (vii) mutaciones en la cavidad alostérica de MEK que bloquean directamente la unión de inhibidores a MEK o conducen a actividad MEK constitutiva,

[0208] en el que la presencia de uno o más de los marcadores confirma que el cáncer del sujeto no responde o es resistente a terapia con inhibidor de BRAF y/o MEK y que el sujeto se beneficiará de terapia con un inhibidor de ERK, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0209] Los sujetos adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. Los métodos pueden usarse para identificar a un sujeto que tiene cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo los cánceres con contextos de mutación, perfiles de resistencia, y actividad MAPK identificados anteriormente. Los métodos de identificación de tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente.

[0210] El método puede comprender además administrar BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a un sujeto que tiene uno o más de los marcadores. Preferiblemente, el método comprende adicionalmente administrar al sujeto que tiene uno o más de los marcadores al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

[0211] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, una composición farmacéutica para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia de la ruta de MAPK distinta de ERK. La composición comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0212] Los sujetos y tipos de terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. La composición farmacéutica puede usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo los cánceres con los contextos de mutación, perfiles de resistencia, y actividad MAPK identificados anteriormente. Los métodos de identificación de tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente.

[0213] La composición farmacéutica puede comprender además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

[0214] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un kit para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto, cáncer que no responde o es resistente a terapia de la ruta de MAPK distinta de ERK. Este kit comprende cualquier composición farmacéutica según la presente divulgación envasada junto con instrucciones para su uso.

[0215] Los kits también pueden incluir recipientes de almacenamiento adecuados, por ejemplo, ampollas, viales, tubos, etc., para cada composición farmacéutica y otros reactivos, por ejemplo, tampones, soluciones salinas equilibradas, etc., para su uso en la administración de las composiciones farmacéuticas a sujetos. Las composiciones farmacéuticas y otros reactivos pueden estar presentes en los kits en cualquier forma conveniente, tal como, por ejemplo, en una disolución o en forma de polvo. Los kits pueden incluir además un recipiente de envasado, que tiene opcionalmente una o más divisiones para alojar la composición farmacéutica y otros reactivos opcionales.

[0216] Los sujetos y tipos de terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. El kit puede usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo los cánceres con los contextos de mutación, perfiles de resistencia, y actividad MAPK identificados en el presente documento. Los métodos de identificación de tales mutaciones son tal como se expusieron anteriormente.

[0217] El kit puede comprender además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

[0218] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método para inhibir la fosforilación de RSK en una célula cancerosa que no responde o es resistente a un inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK. El método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la fosforilación de RSK en la célula cancerosa. En este caso, “poner en contacto” significa poner BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales en estrecha proximidad a las células cancerosas. Esto puede lograrse usando técnicas convencionales de administración de fármacos a mamíferos, o en la situaciónin vitro, por ejemplo, proporcionando BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y opcionalmente otros agentes terapéuticos a unos medios de cultivo en los que están ubicadas las células cancerosas. En la situaciónex vivo, la puesta en contacto puede llevarse a cabo, por ejemplo, proporcionando BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y opcionalmente otros agentes terapéuticos a un tejido canceroso.

[0219] Los tipos de inhibidores de la ruta de MAPK distinta de ERK adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. La provocación de la muerte de células cancerosas puede lograrse en células cancerosas que tienen diversos contextos de mutación, perfiles de resistencia, y actividad MAPK tal como se dio a conocer anteriormente. Los métodos de identificación de tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente. Estos métodos, que pueden llevarse a caboin vitro,ex vivo, oin vivo, pueden usarse para provocar la muerte de células cancerosas, por ejemplo, destruyendo células cancerosas, en células de los tipos de cáncer dados a conocer en el presente documento.

[0220] Puede inhibirse más del 50% de la fosforilación de RSK. Además, puede inhibirse más del 75% de la fosforilación de RSK. Además, puede inhibirse más del 90% de la fosforilación de RSK. Además, puede inhibirse más del 95% de la fosforilación de RSK. Además, puede inhibirse más del 99% de la fosforilación de RSK. Además, puede inhibirse el 100% de la fosforilación de RSK.

[0221] La célula cancerosa puede ser una célula cancerosa de mamífero. Preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero se obtiene de un mamífero seleccionado del grupo que consiste de seres humanos, primates, animales de granja, y animales domésticos. Más preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero es una célula cancerosa humana. La etapa de puesta en contacto puede comprender administrar BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable a un sujeto del que se obtuvo la célula cancerosa.

[0222] En la presente divulgación, una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un compuesto o composición dado a conocer en el presente documento es una cantidad de tal compuesto o composición que es suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados tal como se describe en el presente documento cuando se administra a un sujeto. Las formas de dosificación eficaces, modos de administración, y cantidades de dosificación pueden determinarse empíricamente, y realizar tales determinaciones se encuentra dentro de las habilidades de la técnica. Los expertos en la técnica entienden que la cantidad de dosificación variará con la vía de administración, la tasa de excreción, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otro fármacos que esté administrándose, la edad, tamaño, y especie de mamífero, por ejemplo, paciente humano, y factores similares bien conocidos en la técnica de la medicina y la medicina veterinaria. En general, una dosis adecuada de un compuesto o composición según la divulgación será aquella cantidad de la composición que sea la dosis más baja eficaz para producir el efecto deseado. La dosis eficaz de un compuesto o composición de la presente divulgación puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

[0223] Un ejemplo adecuado, no limitativo, de una dosificación de BVD-523 y otros agentes anticancerosos dados a conocer en el presente documento para referencia es de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 2400 mg/kg al día, tal como desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1200 mg/kg al día, de 75 mg/kg al día a aproximadamente 300 mg/kg al día, incluyendo desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg al día. Otras dosificaciones representativas de tales agentes incluyen aproximadamente 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, 2000 mg/kg, 2100 mg/kg, 2200 mg/kg, y 2300 mg/kg al día. La dosis eficaz de BVD-523 y otros agentes anticancerosos dados a conocer en el presente documento puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

[0224] BVD-523, otros inhibidores, y varios otros agentes anticancerosos dados a conocer en el presente documento, o una composición farmacéutica de la presente divulgación, pueden administrarse de cualquier manera deseada y eficaz: para ingestión oral, o como pomada o colirio para administración local a los ojos, o para administración parenteral u otra de cualquier manera apropiada tal como intraperitoneal, subcutánea, tópica, intradérmica, inhalación, intrapulmonar, rectal, vaginal, sublingual, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal o intralinfática. Además, BVD-523, otros inhibidores, y varios otros agentes anticancerosos dados a conocer en el presente documento, o una composición farmacéutica dada a conocer en el presente documento, pueden administrarse junto con otros tratamientos. BVD-523, otros inhibidores, y varios otros agentes anticancerosos dados a conocer en el presente documento, o una composición farmacéutica dada a conocer en el presente documento, pueden encapsularse o protegerse de otro modo frente a secreciones gástricas u otras, si se desea.

[0226] Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento comprenden uno o más principios activos en mezcla con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros compuestos, fármacos, componentes y/o materiales. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los agentes/compuestos de la presente invención se formulan para dar formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21ª edición, Lippincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA).

[0228] Los diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptable se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21ª edición, Lippincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA) y The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.)) e incluyen azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol, y sorbitol), almidones, preparaciones de celulosa, fosfatos de calcio (por ejemplo, fosfato de dicalcio, fosfato de tricalcio e hidrogenofosfato de calcio), citrato de sodio, agua, disoluciones acuosas (por ejemplo, solución salina, cloruro de sodio para inyección, disolución para inyección de Ringer, dextrosa para inyección, dextrosa y cloruro de sodio para inyección, disolución para inyección de Ringer con lactato), alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol propílico, y alcohol bencílico), polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol), ésteres orgánicos (por ejemplo, oleato de etilo y triglicéridos), polímeros biodegradables (por ejemplo, polilactida-poliglicolida, poli(ortoésteres), y poli(anhídridos)), matrices elastoméricas, liposomas, microesferas, aceites (por ejemplo, de maíz, germen, oliva, ricino, sésamo, semilla de algodón, y cacahuete), manteca de cacao, ceras (por ejemplo, ceras para supositorios), parafinas, siliconas, talco, silicilato, etc. Cada diluyente o portador farmacéuticamente aceptable usado en una composición farmacéutica de la invención debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con otros componentes en la formulación y no ser perjudicial para el sujeto. Los diluyentes o portadores adecuados para una forma de dosificación seleccionada y vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y los diluyentes o portadores aceptables para una forma de dosificación y método de administración elegidos pueden usarse usando habilidad habitual en la técnica.

[0230] Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden contener, opcionalmente, componentes y/o materiales adicionales habitualmente usados en composiciones farmacéuticas. Estos componentes y materiales se conocen bien en la técnica e incluyen (1) cargas o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, glicolato sódico de almidón, carboximetilcelulosa de sodio reticulada y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, y laurilsulfato de sodio; (10) agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y goma tragacanto; (11) agentes tamponantes; (12) excipientes, tales como lactosa, azúcares de la leche, polietilenglicoles, grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, manteca de cacao, almidones, goma tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, salicilato, óxido de cinc, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio, y polvo de poliamida; (13) diluyentes inertes, tales como agua u otros disolventes; (14) conservantes; (15) agentes tensioactivos; (16) agentes dispersantes; (17) agentes de liberación controlada o de retardo de la absorción, tales como hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, polímeros biodegradables, liposomas, microesferas, monoestearato de aluminio, gelatina, y ceras; (18) agentes opacificantes; (19) adyuvantes; (20) agentes humectantes; (21) agentes de emulsionamiento y suspensión; (22), agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano; (23) propelentes, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volátiles, tales como butano y propano; (24) antioxidantes; (25) agentes que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, tales como azúcares y cloruro de sodio; (26) agentes espesantes; (27) materiales de recubrimiento, tales como lecitina; y (28) agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Cada componente o material de este tipo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la formulación y no ser perjudicial para el sujeto. Los componentes y materiales adecuados para una forma de dosificación seleccionada y vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y los componentes y materiales aceptables para una forma de dosificación y método de administración elegidos pueden determinarse usando habilidad habitual en la técnica.

[0231] Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, obleas, píldora, comprimidos, polvos, gránulos, una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, un elixir o jarabe, una pastilla, un bolo, un electuario o una pasta. Estas formulaciones pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos de recubrimiento en bombo, mezclado, granulación o liofilización convencionales.

[0232] Las formas de dosificación sólidas para administración orla (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares) pueden prepararse, por ejemplo, mezclando el/los principio(s) activo(s) con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, una o más cargas, extendedores, aglutinantes, humectantes, agentes disgregantes, agentes retardantes de la disolución, aceleradores de la absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes, y/o agentes colorantes. Composiciones sólidas de un tipo similar pueden emplearse como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando un excipiente adecuado. Un comprimido puede realizarse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes auxiliares. Pueden prepararse comprimidos sometidos a compresión usando un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante, tensioactivo o agente de dispersión adecuados. Pueden prepararse comprimidos moldeados mediante moldeo en una máquina adecuada. Los comprimidos, y otras formas de dosificación sólidas, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden opcionalmente ranurarse o prepararse con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También pueden formularse para proporcionar liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos. Pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden tener una composición de tal manera que liberan el principio activo tan solo, o de manera preferible, en una determinada porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada.

[0233] Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes adecuados habitualmente usados en la técnica. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes de emulsionamiento y suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones pueden contener agentes de suspensión.

[0234] Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más principios activos con uno o más diluyentes o portadores adecuados no irritantes que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por tanto, se fundirán en el recto o la cavidad vaginal y liberarán el compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento que son adecuadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverización que contienen diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables tal como se conoce en la técnica que son apropiados.

[0235] Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches, gotas y productos inhalatorios. El/los agente(s)/compuesto(s) activo(s) puede(n) mezclarse en condiciones estériles con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener excipientes. Los polvos y pulverizaciones pueden contener excipientes y propelentes.

[0236] Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento adecuadas para administraciones parenterales pueden comprender uno o más agentes/compuestos en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse para dar disoluciones o dispersiones inyectable estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, o agentes de suspensión o espesamiento adecuados. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener adyuvantes adecuados, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción.

[0237] En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco (por ejemplo, formulación farmacéutica), es deseable ralentizar su absorción a partir de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene escasa solubilidad en agua.

[0238] La tasa de absorción del agente activo/fármaco depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un agente/fármaco administrado por vía parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo el agente activo/fármaco en un vehículo aceitoso. Pueden prepararse formas de depósito inyectables formando matrices de microencapsulación del principio activo en polímeros biodegradables. Dependiendo de la razón del principio activo con respecto a polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación de principio activo. También se preparan formulaciones inyectables de depósito atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejido corporal. Los materiales inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias.

[0239] Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada que solo requiere la adición del diluyente o portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.

[0240] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, el tratamiento de cáncer que no responde o es resistente a terapia con inhibidor de la ruta de MAPK distinta de ERK y combinaciones que se muestra que potencian los efectos de inhibidores de ERK. En el presente documento, los solicitantes también han mostrado que la combinación de diferentes inhibidores de ERK también es sinérgica. Por tanto, se contempla que los efectos de las combinaciones descritas en el presente documento pueden mejorarse adicionalmente mediante el uso uno o más inhibidores de ERK adicionales. Por consiguiente, pueden incluirse uno o más inhibidores de ERK adicionales.

[0241] Se da a conocer adicionalmente, para referencia, un método de tratamiento de un sujeto que tiene un melanoma positivo para mutación de BRAF600 no resecable o metastásico que comprende administrar al sujeto 600 mg BID de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0242] En algunas realizaciones de la invención, la mutación es una mutación de BRAF<V600E>.

[0243] Se da a conocer adicionalmente una composición para tratar a un sujeto que tiene un melanoma positivo para mutación de BRAF600 no resecable o metastásico, comprendiendo la composición 600 mg de BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y opcionalmente un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0244] Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención de ninguna manera.

[0245] Ejemplos

[0246] Ejemplo 1

[0247] Materiales y métodos

[0248] Se mantuvieron líneas celulares de cáncer en cultivo celular en condiciones de suero y medios convencionales. Para estudios de aumento de la dosis, se dividieron células A375, se hicieron crecer hasta aproximadamente el 40-60% de confluencia, y después se trataron con la dosis inicial del fármaco especificado. La tabla 4 muestra un resumen de tratamientos con fármacos que se sometieron a aumento.

[0249] Tabla 4 - Resumen de tratamientos que se someten a aumento

[0252]

[0254] Se realizaron aumentos de la dosis como agente único basándose en Littleet al., 2011 y se exponen en la figura 20. Después se dejaron crecer las células hasta el 70-90% de confluencia y se dividieron. Se mantuvieron las razones de división lo más “normales” posible y de manera razonablemente constante entre tratamientos (por ejemplo, un mínimo del 50% de la razón de división normal de las parentales). Se renovó el medio cada 3-4 días. Cuando las células volvieron a alcanzar aproximadamente el 40-60% de confluencia, se aumentó la dosis. En el caso en el que no se detectó el intervalo del 40-60%, volvieron a dividirse las células y se les administró dosis una vez que alcanzaron el 40-60% de confluencia. De nuevo, se renovó el medio cada 3-4 días. Se repitió el procedimiento según se requirió (figura 20).

[0255] Para tratamientos como agente único, las concentraciones iniciales y los aumentos de la dosis se llevaron a cabo empezando con la CI<50>aproximada, aumentando en pequeños incrementos, o suavemente, durante las 4-5 dosis iniciales, duplicando la dosis, aumentando con el mismo incremento durante las 4 dosis siguientes, después pasando a aumentos de concentración de 1,5 veces para dosis posteriores.

[0256] Para tratamientos de combinación, las concentraciones iniciales y los aumentos de dosis se llevaron a cabo empezando con la mitad de la CI<50>aproximada de cada compuesto (el ensayo de combinación sugiere que esto dará como resultado un intervalo de aproximadamente el 40-70% de inhibición), aumentando según los agentes únicos (es decir, realizando una duplicación inicial y después aumentando con el mismo incremento durante las 4 dosis siguientes, después pasando a aumentos de concentración de 1,5 veces). La tabla 5 muestra los aumentos de dosis previstos usando estos esquemas.

[0257] Tabla 5 - Aumentos de dosis previstos - Mes 1

[0260]

[0262] Se derivaron poblaciones de células resistentes clonales a partir de combinaciones de células resistentes mediante dilución limitante.

[0263] Se usaron ensayos de proliferación para realizar un seguimiento de cambios en la sensibilidad al/a los agente(s) sometido(s) a aumento a intervalos de tiempo apropiados (por ejemplo, cada mes, aunque el momento depende de que estén disponibles números de células adecuados). Para ensayos de proliferación, se sembraron células en placas de 96 pocillos a 3000 células por pocillo en medio DMEM libre de fármaco que contenía FBS al 10% y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de compuesto o control de vehículo. Se prepararon compuestos a partir de disoluciones madre en DMSO para dar un intervalo de concentración final tal como se muestra en la figura 2A -figura 2H. La concentración de DMSO final fue constante al 0,1%. Se incubaron compuestos de prueba con las células durante 96 horas a 37ºC y el 5% de CO<2>en una atmósfera humidificada. Después se añadió Alamar Blue al 10% (v/v) y se incubó durante 4 horas y se detectó producto fluorescente usando un lector de placas BMG FLUOstar. Se dedujo el valor de fondo solo con medio promedio y se analizaron los datos usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism. Se usó paclitaxel como control positivo.

[0264] Los ensayos de proliferación durante el mes 1 se iniciaron en el día 28 usando células que crecieron en las concentraciones de cada agente indicadas en la tabla 6.

[0265] Tabla 6 - Concentraciones iniciales de fármacos usados en ensayos de proliferación - Mes 1

[0268]

[0269]

[0271] Los ensayos de proliferación durante el mes 2 se iniciaron en el día 56 usando células que crecieron en las concentraciones de cada agente indicadas en la tabla 7.

[0272] Tabla 7 - Concentraciones iniciales de fármacos usados en ensayos de proliferación - Mes 2

[0275]

[0277] Al final del periodo de aumento de 3 meses, se mantuvieron los cultivos a la concentración máxima durante 2 semanas antes de la ronda final de ensayos de proliferación y posible clonación de células individuales. Dado que los ensayos de proliferación/clonación de células individuales requerían células en proliferación activa, para tratamientos en los que células estaban proliferando muy lentamente a la concentración máxima o que solo se habían sometido a aumento recientemente, también se mantuvo un cultivo de reserva a una concentración inferior (tabla 8). Para el tratamiento con BVD-523, en el que las células parecían haber dejado casi completamente de crecer y parecían particularmente frágiles a la concentración máxima (1,8 μM), se mantuvieron cultivos a una concentración inferior durante el periodo de 2 semanas.

[0278] Tabla 8 - Detalles de tratamientos que se cultivan a una concentración fija durante 2 semanas

[0281]

[0283] Los ensayos de proliferación durante el mes 3 usaron células que crecían en las concentraciones de cada agente indicadas en la tabla 9.

[0284] Tabla 9 - Concentraciones iniciales de fármacos usados en ensayos de proliferación - Mes 3

[0287]

[0289] Para estudios de combinación, se sembraron células A375 (ATCC) en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad celular de 3000 células/pocillo en DMEM más FBS al 10% y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de compuesto de prueba o control de vehículo. Se sometieron a prueba combinaciones usando una matriz de dosis de 10x8 con una concentración de DMSO final del 0,2%. Siguió un periodo de incubación de ensayo de 96 horas, con posterior adición de Alamar Blue al 10% (v/v) y 4 horas de incubación antes de la lectura en un lector de placas de fluorescencia. Tras leer Alamar Blue, se desactivó la mezcla de medio/Alamar Blue y se añadieron 100 μl de CellTiter-Glo/PBS (1:1) y se procesaron las placas según las instrucciones del fabricante (Promega). Se restaron valores de fondo solo con medio antes de analizarse los datos. Después se aplicó el modelo de aditividad de Bliss. En resumen, se calcularon valores de inhibición fraccionada predichos para la inhibición combinada usando la ecuación C<bliss>= A B - (A x B), donde A y B son las inhibiciones fraccionales obtenidas por el fármaco A solo o el fármaco B solo a concentraciones específicas. C<bliss>es la inhibición fraccional que se esperaría si la combinación de los dos fármacos fuera exactamente aditiva. Los valores de C<bliss>se restan a partir de los valores de inhibición fraccional observados de manera experimental para dar un valor de “exceso sobre Bliss”. Los valores de exceso sobre Bliss mayores de 0 indican sinergia, mientras que los valores menores de 0 indican antagonismo. Los valores de exceso sobre Bliss se representan gráficamente como mapas de calor ± DE.

[0291] Los datos únicos y de combinación también se presentan como curvas de dosis-respuesta generadas en GraphPad Prism (representados gráficamente usando el % de viabilidad con respecto a controles tratados únicamente con DMSO).

[0293] Para estudios de combinación enfocados, se realizaron los ensayos de viabilidad de Alamar Blue tal como se describió anteriormente para estudios de combinación. Adicionalmente, se realizaron ensayos de caspasa-Glo 3/7. En resumen, se sembraron células HCT116 por triplicado en placas de 96 pocillos blancas a una densidad celular de 5000 células/pocillo en medio 5A de McCoy más 10% FBS. Se sembraron células A375 a una densidad de 5000 células/pocillo en DMEM más el 10% FBS. Se dejaron adherir las células durante la noche antes de la adición de compuesto de prueba o control de vehículo. La concentración final de DMSO era del 0,2%, y se incluyó estaurosporina 800 nM como control positivo. Se usaron periodos de incubación de ensayo de 24 y 48 horas. Después, se añadió Caspasa-Glo® 3/7 al 50% (v/v), se mezclaron las placas durante 5 minutos en un agitador orbital y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de leer en un lector de placas luminiscente. Se restaron los valores de fondo solo con medio antes de analizarse los datos.

[0295] Para fluorimetría diferencial de barrido, se diluyó (1:1.000) SYPRO orange (dilución de 5.000 x, Invitrogen) en disolución de tampón (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Las proteínas marcadas con HisX6 incluyeron ERK2 inactiva, ERK2 activa (ppERK2), o p38α a una concentración final de 1 μM. La disolución de proteína/colorante y los compuestos en DMSO al 100% se añadieron a pocillos (concentración de DMSO final del 2% v/v) para lograr las concentraciones finales deseadas, se mezclaron, y se colocaron en un instrumento de RT-PCR. A continuación, se realizó una curva de fusión desde 25-95ºC a una tasa de 1ºC por minuto y se determinó la temperatura de fusión (Tf) para cada proteína en ausencia o presencia de compuestos. Se presenta el cambio de Tf ( ΔTf) en presencia de diversas concentraciones de fármaco.

[0297] Para la determinación de Ki de ERK1, se incubó ERK1 activada (10 nM) con diversas concentraciones de los compuestos en DMSO al 2,5% (v/v) durante 10 minutos a 30ºC en tampón HEPES 0,1 M (pH 7,5), MgCl<2>10 mM, fosfoenolpiruvato 2,5 mM, dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) 200 μM, piruvato cinasa 150 μg/ml, lactato deshidrogenasa 50 μg/ml, y péptido Erktide 200 μM. Se inició la reacción mediante la adición de 65 μM de ATP. Se monitorizó la tasa de absorbancia reducida (340 nm) y se determinó la CI<50>en función de la concentración de inhibidor.

[0298] Para la determinación de Ki de ERK2, se determinó la actividad inhibidora de BVD-523 frente a ERK2 usando un ensayo radiométrico, siendo la concentración final de los componentes de HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl<2>10 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, ERK20,12 nM, proteína básica de mielina (MBP) 10 μM, y<33>P- γ-ATP 50 μM. Se mezclaron previamente todos los componentes de reacción, con la excepción de ATP y MBP, y se transfirieron alícuotas (33 μl) a una placa de 96 pocillos. Se usó una disolución madre de compuesto en DMSO para preparar diluciones de hasta 500 veces; se añadió una alícuota de 1,5 μl de DMSO o inhibidor en DMSO a cada pocillo. Se inició la reacción añadiendo los sustratos<33>P- γ-ATP y MBP (33 μl). Después de 20 minutos, se extinguió la reacción con ácido tricloroacético (TCA) al 20% (p/v) (55 μl) que contenía ATP 4 mM, se transfirió a las placas de filtro de GF/B, y se lavó 3 veces con TCA al 5% (p/v). Tras la adición de agente de centelleo Ultimate Gold<TM>(50 μl), se contaron las muestras en un dispositivo Packard TopCount. A partir de la curva de valoración de actividad frente a concentración, se determinó el valor de Ki ajustando los datos a una ecuación para cinética de inhibición de la unión estrecha competitiva usando el software Prism, versión 3.0.

[0300] Para la determinación de CI<50>de ERK2, se sometió la actividad a ensayo mediante un ensayo de enzima acoplada convencional. Las concentraciones finales fueron las siguientes: HEPES 0,1 M (pH 7,5), MgCl<2>10 mM, DTT 1 mM, fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 200 μM, piruvato cinasa 50 μg/ml, lactato deshidrogenasa 10 μg/ml, ATP 65 μM, y péptido (ATGPLSPGPFGRR) 800 μM. Se mezclaron previamente todos los componentes de reacción excepto ATP con ERK y se transfirieron alícuotas a pocillos de placas de ensayo. Se introdujo BVD-523 en DMSO en cada pocillo, manteniendo la concentración de DMSO por pocillo constante. Las concentraciones de BVD-523 abarcaban un intervalo de 500 veces para cada valoración. Se incubó la placa de ensayo a 30ºC durante 10 minutos en el compartimento del lector de placas del espectrofotómetro (Molecular Devices) antes de iniciar la reacción añadiendo ATP. Se monitorizó el cambio de absorbancia a 340 nm en función del tiempo; la pendiente inicial corresponde a la velocidad de la reacción. La velocidad frente a la concentración de la curva de valoración de BVD-523 se ajustó o bien a una ecuación para cinética de inhibición de la unión estrecha competitiva para determinar un valor para Ki o bien a un ajuste de 3 parámetros para determinar la CI<50>usando el software Prism, versión 3.0.

[0302] Para ensayos de apoptosis, se sembraron células en placas a 2 x 10<4>células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejaron unirse durante la noche o crecer hasta el 50% de confluencia. Se trataron las células con una dilución en serie de BVD-523 en medios (volumen final de 200 μl, intervalos de concentración de 4-0,25 μM) y se incubaron durante 48 horas en una incubadora de CO<2>a 37ºC. Se lavaron las células con 100 μl de PBS, y se añadieron 60 μl de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-40 al 1,0% [p/v], desoxicolato de sodio al 0,5% [p/v], SDS al 1% [p/v]), después se incubaron durante 10 minutos a 4ºC para someter las células a lisis. Se añadió una alícuota de lisado de 30 μl a 100 μl de tampón de ensayo de caspasa (HEPES 120 mM, EDTA 12 mM, ditiotreitol 20 mM, sustrato de caspasa AC-DEVD-AMC 12,5 μg/ml) y se incubó a TA desde 4 horas hasta durante la noche. Se leyó la placa en un fluorímetro (longitud de onda de excitación de 360 nm, longitud de onda de emisión de 460 mm). Se analizaron los 30 μl restantes de lisado para determinar el contenido en proteína total usando el kit de ensayo de proteína BioRad (razón de muestra con respecto a reactivo de trabajo de 1:8). Se derivó la actividad caspasa normalizada final como unidades de fluorescencia por μg de proteína y se convirtió en un aumento en veces de actividad caspasa en comparación con controles de DMSO.

[0304] Para la medición de la actividad antitumoral en xenoinjertos de A375, se iniciaron xenoinjertos con células A375 mantenidas mediante trasplante subcutáneo en serie en ratones desnudos atímicos hembra. Cada ratón de prueba recibió un fragmento de tumor A375 (1 mm<3>) implantado por vía subcutánea en el costado derecho. Una vez que los tumores alcanzaron el tamaño objetivo (80-120 mm<3>), se aleatorizaron los animales a grupos de tratamiento y de control, y se inició el tratamiento con fármaco.

[0306] Para evaluar la monoterapia con BVD-523, se administró BVD-523 en carboximetilcelulosa (CMC) al 1% (p/v) por vía oral,per os(v.o.), BID a dosis de 5, 25, 50, 100 o 150 mg/kg. Se administró temozolomida oral como compuesto de referencia positivo a 75 o 175 mg/kg una vez al día (QD) durante un total de cinco tratamientos (QDx5).

[0308] La eficacia de BVD-523 en combinación con dabrafenib se evaluó en ratones aleatorizados en 9 grupos de 15 y 1 grupo de 10 (grupo 10). Dabrafenib se administró v.o. a 50 o 100 mg/kg QD y BVD-523 se administró v.o. a 50 o 100 mg/kg BID, solos y en combinación, hasta el final del estudio; también se incluyeron grupos de control tratado con vehículo y tratado con temozolomida (150 mg/kg QD x 5). La dosificación de combinación se detuvo en el día 20 para monitorizar para detectar nuevo crecimiento tumoral. Se monitorizaron los animales individualmente y se sacrificaron cuando cada tumor alcanzó un volumen de punto final de 2000 mm<3>, o el día final (día 45), lo que se produjera primero, y se calculó la mediana del tiempo hasta el punto final (TTE). También se evaluó la combinación en un modelo de A375 en estadio superior en el que se evaluaron tumores más grandes en el intervalo de 228-1008 mm<3>. En este caso, se aleatorizaron ratones a 1 grupo (grupo 1) de 14 y 4 grupos (grupos 2-5) de 20. Se inició la dosificación en el día 1 con dabrafenib más BVD-523 (dabrafenib 25 mg/kg BVD-52350 mg/kg o dabrafenib 50 mg/kg BVD-523 100 mg/kg), administrándose cada agente v.o. BID hasta el final del estudio. El estudio incluyó grupos de monoterapia con dabrafenib 50 mg/kg y BVD-523100 mg/kg así como un grupo de control tratado con vehículo. Se midieron los tumores dos veces por semana. La dosificación de combinación se detuvo en el día 42 para monitorizar para detectar nuevo crecimiento tumoral hasta el final del estudio (día 60). El desenlace del tratamiento se determinó a partir del % de TGD, definido como el aumento en porcentaje de la mediana de TTE para ratones tratados frente a control, analizándose las diferencias entre grupos mediante análisis de supervivencia de rangos logarítmicos. Para el análisis de TGI, se calcularon valores de % de TGI y se notifican para cada grupo de tratamiento (T) frente al control (C) usando las medidas de tumor inicial (i) y final (f) basándose en la siguiente fórmula: % de TGI = 1 - Tf - Ti / Cf - C. También se monitorizaron los ratones para detectar respuestas CR y PR. Los animales con una CR al final del estudio se clasificaron adicionalmente como TFS.

[0310] Para la medición de la actividad de BVD-523 en xenoinjertos de Colo205, se cultivaron células Colo205 humanas en RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v), penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 μg/ml (Invitrogen), y L-glutamina 2 mM. Se cultivaron las células durante menos de cuatro pases antes de la implantación. A ratones desnudos atímicos hembra (19-23 g) se les inyectaron por vía subcutánea 2 x 10<6>células Colo205 en la región axilar dorsal derecha en el día 0.

[0312] Se aleatorizaron ratones con un volumen tumoral aproximado de 200 mm<3>a 6 grupos experimentales. El control de vehículo, CMC al 1% (p/v), se preparó cada semana. Se suspendió BVD-523 en CMC al 1% (p/v) a la concentración deseada y se homogeneizó sobre hielo a 6.500 rpm durante 50 minutos. Se prepararon suspensiones de BVD-523 cada semana y se administraron v.o. BID a dosis diarias totales de 50, 100, 150 y 200 mg/kg (n = 12/grupo) en un calendario de dosificación de 8 o 16 horas durante 13 días. El control de vehículo (n = 12) se administró usando la misma pauta de dosificación. Se administró CPT-11 como compuesto de referencia positivo (n = 12). Cada 1 ml de inyección de CPT-11 contenía 20 mg de irinotecán, 45 mg de sorbitol, y 0,9 mg de ácido láctico. CPT-11 se administró a 100 mg/kg/día por vía intraperitoneal cada 4 días durante 2 dosis consecutivas.

[0314] Para la medición de espectrometría de masas de patrón interno marcado con isótopo (ITIS) de ERK1/2 en xenoinjertos de Colo205, se sometieron tumores congelados a lisis en 10 volúmenes de tampón de lisis helado (TRIS-HCI 10 mM, pH 8,0, MgCl<2>10 mM, Triton X-100 al 1% (v/v), cóctel de inhibidores de proteasa Complete<TM>[Roche, n.º de cat.

[0315] 1836170], cóctel de inhibidores de fosfatasa I [Sigma, n.º de cat. P-2850], cóctel de inhibidores de fosfatasa Il [Sigma n.º de cat.5726], y benzonasa [Novagen, n.º de cat.70664]). Se aclararon los lisados mediante centrifugación (100.000 x g durante 60 minutos a 4ºC) y se ajustaron los sobrenadantes a 2 mg/ml con tampón de lisis. Se sometió ERK1 a inmunoprecipitación usando anticuerpos acoplados a agarosa y pan-anti-ERK1 (Santa Cruz Biotechnology, n.º de cat.

[0316] sc-93ac). Se resolvieron las proteínas inmunoprecipitadas mediante SDS-PAGE y se tiñeron con SYPRO Ruby (Invitrogen), y se escindieron las bandas de ERK mediante cuchilla. Se lavaron los segmentos de gel en 300 μl de NH<4>HCO<3>20 mM, se cortaron en fragmentos pequeños, y se colocaron en un dispositivo Page Eraser Tip (The Nest Group, n.º de cat. SEM0007). Se redujeron los fragmentos de gel y se alquilaron antes de la digestión con tripsina. Se aislaron fragmentos trípticos en 75 μl de acetonitrilo al 50% (v/v), ácido trifluoroacético al 0,2% (v/v) y se concentró la muestra resultante hasta 0-10 μl en un dispositivo SpeedVac.

[0318] Para análisis de ITIS, se añadieron a muestras digeridas patrones de péptidos marcados con átomos pesados y se cuantificó la fosforilación fraccional mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (EM) en tándem. Se realizó cromatografía nanocapilar usando una bomba binaria Rheos 2000 de Flux Instruments suministrando un flujo a escala nanométrica después de una división 1:750, una nano-precolumna LC Packings Inertsil (C 18, 5 mm, 100 Å, 30 mm de DI x 1 mm), y una columna de resolución New Objective PicoFrit AQUASIL (C18, 5 mm, 75/15 mm de DI x 10 cm), que también sirvió como emisor de ionización por electropulverización (ESI). Se usó un espectrómetro de masas Applied Biosystem API 3000 acoplado con una fuente de nano-ESI para el análisis de EM. Se usó una boquilla de gas producida de manera interna conectada a una fuente de gas de nebulización para ayudar a una pulverización de nanoflujo constante. Se adquirieron datos en un modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM): gas de nebulización a 3; gas de cortina a 7; gas de colisión a 5; tensión de pulverización iónica a 2150 voltios, potencial de salida a 10 voltios; resolución Q1/Q3 baja/unidad; y tiempo de permanencia de 65 ms para todos los canales de MRM. Todos los datos de EM sin procesar se procesaron usando una combinación del paquete de software Analyst de Applied Biosystem y herramientas personalizadas.

[0320] Para la evaluación de sensibilidad a fármaco en modelos de línea celular de resistencia adquirida, se evaluó la sensibilidad a fármaco de células A375 sometidas a aumento de dosis y células RKO isogénicas en ensayos de proliferación de 96 horas. Se sembraron células RKO isogénicas (medio 5A de McCoy que contenía FBS al 10% [v/v]) o células A375 sometidas a aumento de dosis (DMEM que contenía FBS al 10%) en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de compuesto o control de vehículo. Obsérvese que las células A375 sometidas a aumento de dosis se sembraron en ausencia de inhibidor. Se prepararon compuestos a partir de disoluciones madre en DMSO al 0,1% (v/v) para dar una concentración final tal como se indica. Se incubaron compuestos de prueba con las células durante 96 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con el 5% de CO<2>. Para las células RKO, se añadió reactivo CellTiter-Glo® (Promega) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando un lector de placas BMG FLUOstar. Para los ensayos de A375, se añadió Alamar Blue (ThermoFisher) al 10% (v/v) y se incubó durante 4 h, y después se detectó producto fluorescente usando un dispositivo BMG FLUOstar. Se dedujo el valor de fondo solo con medio promedio y se analizaron los datos usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism.

[0322] La determinación de CI<50>de ERK1 se midió en un volumen de reacción final de 25 μl. Se incubó ERK1 (humana) (5-10 mU) con Tris 25 mM (pH 7,5), ácido etilenglicoltetracético 0,02 mM, péptido 250 μM, acetato de Mg 10 mM, y γ-<33>P-ATP (actividad específica de aproximadamente 500 cpm/pmol, concentración según se requiera). Añadir Mg-ATP inició la reacción. Tras la incubación durante 40 minutos a temperatura ambiente (TA), se detuvo la reacción mediante adición de 5 μl de una disolución de ácido fosfórico al 3% (p/v). Después, se colocaron 10 μl de la reacción en puntos sobre una estera de filtro P30, y se lavaron 3 veces durante 5 minutos en 75 mM de ácido fosfórico, después una vez en metanol antes de secarse y someterse a conteo de centelleo.

[0324] Se produjeron células isogénicas RKO MEK1<Q56P>por Horizon Discovery (Cambridge, R.U.; n.º HD 106-019) usando una estrategia de direccionamiento génico mediada por VAA recombinante. En resumen, se generó virus rAAV tras la transfección del vector de direccionamiento apropiado y vectores cooperadores en células HEK293T, se purificó usando un kit de purificación de VAA (Virapur, San Diego, EE.UU.) y se tituló usando qPCR. Después se infectaron células RKO homocigóticas parentales (tipo natural homocigótico para MEK1) con virus rAAV y se identificaron clones que habían integrado el casete de selección mediante selección de G418 y se expandieron. Los clones correctamente seleccionados como diana que eran heterocigóticos para inserción de la mutación puntual MEK1<Q56P>en un único alelo se identificaron mediante PCR y se secuenciaron.

[0326] Se obtuvieron líneas celulares SW48 isogénicas para la inserción de KRAS mutante (De Roocket al2010, JAMA, 304, 1812-1820) a partir de Horizon Discovery (números de catálogo; HD 103-002, HD 103-006 HD 103-007, HD 103-009, HD 103-010, HD 103-011, HD 103-013). Para el ensayo de proliferación, se sembraron células en placas de 96 pocillos en medio 5A de McCoy complementado con FBS al 10% y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de compuesto o control de vehículo. Se incubaron compuestos de prueba con las células durante 96 horas a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO<2>. Después se evaluó la viabilidad usando Alamar Blue.

[0328] Se llevó a cabo el ensayo KinaseProfiler patentado en Upstate Discovery y empleó detección radiométrica similar a la empleada por Davieset al, y se usó para determinar el perfil de la selectividad de BVD-523 frente a un panel de 70 cinasas.

[0330] Se llevó a cabo un análisis de sensibilidad a fármaco como parte del proyecto Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (genómica de sensibilidad a fármaco en cáncer) usando exploración de alto rendimiento, tal como se describió anteriormente (Yanget al.2013).

[0331] Para análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se sembraron células A375 en placas de 10 cm en medio de Eagle modificado por Dulbecco más FBS al 10% (v/v). Se dejaron adherir las células durante la noche antes de la adición de compuesto de prueba o vehículo. Para experimentos con células RKO, se sembraron estas células en placas de 6 pocillos o placas de 10 cm con medio 5A de McCoy FBS al 10% (v/v). Después se trataron las células a la concentración y duración deseadas. Se recogieron las células mediante tripsinización, se sedimentaron, y se congelaron rápidamente. Se prepararon lisados con tampón de RIPA complementado con cócteles de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche), se aclararon mediante centrifugación a 11.000 rpm durante 10 minutos, y se cuantificaron mediante ensayo de ácido bicinconínico. Se resolvieron las muestras mediante SDS-PAGE, se transfirieron sobre membranas de poli(difluoruro de vinilideno), y se analizaron con sonda usando anticuerpos (es decir, pRB [Ser780], n.º de cat.9307; CCND1, n.º de cat. ab6152; BCL-xL, n.º de cat.2762; PARP, n.º de cat.9542; DUSP6, n.º de cat.3058S) dirigidos contra las dianas indicadas.

[0332] Para el análisis de proteínas en fase inversa (RPPA), se sembraron en placa células A375, MIAPaCa-2, HCT116, Colo205, HT-29, y AN3Ca (ATCC) al 80% de confluencia, se dejaron recuperar durante la noche (las células MIAPaCa-2 se sembraron al 30% de confluencia y se dejaron recuperar durante 3 días), después se trataron con 10 μM de cada compuesto (es decir, BVD-523, SCH722984, CDC-0994, o Vx-11e) durante 6 horas a 37ºC. Se trataron pocillos de control con DMSO al 0,1% (v/v) durante 6 horas antes de la generación de lisados celulares. Después se analizaron muestras usando tecnología de micromatriz de proteínas en fase inversa (Theranostics Health).

[0333] Para el análisis de pERK IHC en xenoinjertos de Colo205, se procesaron tumores de xenoinjerto durante la noche en etanoles graduados del 70% al 100%, se aclararon en dos cambios de xileno, se infiltraron con parafina, y se incorporaron en bloques de parafina. Después, se cortaron secciones de 5 μm y se colocaron sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente y se hornearon durante al menos 30 minutos, pero no más de 1 hora, a 60ºC. Se analizó con sonda una única sección de cada animal y grupo de dosis con anticuerpo anti-fosfo-p42/p44 MAPK (pERK [1:100], CST; n.º de cat. 9101; n.º de lote 16), se sometió a contratinción con hematoxilina, y después se analizó microscópicamente usando un microscopio Zeiss Axioplan 2. Se usó un control de isotipo (conejo, Zymed laboratories, n.º de catálogo 08-6199, n.º de lote 40186458) como control negativo.

[0334] Para el análisis de FACS, se rasparon las células y se sedimentaron a 1.500 rpm durante 5 minutos, después volvieron a suspenderse en 1 ml de tampón y se congelaron a -70ºC. Se descongelaron las células congeladas y se centrifugaron de nuevo, seguido por 10 minutos de nueva suspensión en 0,25 ml de tampón A (tampón de detergente e tripsina en tetraclorhidrato de espermina) para desagregar los grumos de células y digerir las membranas y los citoesqueletos celulares. Se añadió tampón B (inhibidor de tripsina y ribonucleasa I en tampón, 0,2 ml) durante 10 minutos en la oscuridad. Se filtraron los núcleos con ADN teñido resultantes y se analizaron mediante FACS. Se analizaron los histogramas para establecer la proporción de células en las fases G1, S, y G2/M del ciclo celular basándose en la presencia de contenido de ADN n y 2n (o superior).

[0335] Para la medición de la actividad de combinaciónin vitro, se sembraron cinco mil células G-361 en placas de 96 pocillos por triplicado que contenían medio 5A de McCoy con FBS al 10% (v/v) y se dejaron adherir durante la noche. Se sometió a prueba la combinación de vemurafenib/BVD-523 usando una matriz de dosis de 10x8. Se incubaron los compuestos con las células durante 72 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con el 5% de CO<2>. Se añadió reactivo CellTiter-Glo según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando un lector de placas MBG FLUOstar. Se determinaron las interacciones a través de la matriz de dosis mediante los modelos de aditividad de Loewe y de independencia de Bliss usando el software de análisis de combinación Chalice de Horizon.

[0336] Para generar resistencia a compuestoin vitromediante aumento de la dosis, se hicieron crecer células A375 parentales (ATCC CRL-1619) hasta ~40-60% de confluencia en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con FBS inactivado por calor al 10% y penicilina/estreptomicina, después se trataron con dosis iniciales de BVD-523, trametinib, o dabrafenib o bien solos o bien en combinación a o ligeramente por debajo de la CI<50>de cada compuesto; para estudios de combinación, la dosificación inicial fue la mitad de la CI<50>de cada compuesto. Se dejaron crecer las células hasta ~70-90% de confluencia y se dividieron; se renovó el medio cada 3- 4 días. Cuando las células alcanzaron de nuevo ~40-60% de confluencia, se aumentó la dosis mediante el mismo incremento (equivalente a la concentración inicial) y después se pasó a aumentos de concentración de 1,5 veces seguido por pasar adicionalmente a aumentos de 2 veces si las células seguían adaptándose rápidamente (por ejemplo, las seis primeras dosis del aumento de dabrafenib fueron: 5, 10, 15, 20, 25, y 37,5 nM). Se repitió este procedimiento según se requirió.

[0337] Se realizaron ensayos de viabilidad celular para la figura 30A mediante un ensayo metabólico de resazurina (Alamar Blue) después de 5 días en fármaco en suero completo en condiciones de alto contenido en glucosa. Se sembraron las células en microplacas de 384 pocillos a ~15%-50% de confluencia en medio con FBS al 10% y penicilina/estreptavidina más alto contenido en glucosa (18-25 mM). Se determinó el número óptimo de células para cada línea celular para optimizar el crecimiento durante la administración de fármaco. Para líneas celulares adherentes, tras la incubación durante la noche se trataron las células con 9 concentraciones de cada compuesto (serie de diluciones de 2 veces) usando robótica de manipulación de líquidos, y se devolvieron a la incubadora para el ensayo en el punto de tiempo de 96 h. Para líneas celulares en suspensión, se trataron las células con compuesto inmediatamente después de sembrarse en placa y se devolvieron a la incubadora para un punto de tiempo de 96 h. Después se tiñeron las células con resazurina 55 μg/ml (Sigma) preparada en medios libres de glutatión durante 4 horas. Se realizó la cuantificación de intensidad de señal de fluorescencia usando un lector de placas de fluorescencia a las longitudes de onda de excitación y de emisión de 535/595 nm para resazurina. Todas las placas de exploración se sometieron a rigurosas medidas de control de calidad. Se midieron efectos sobre la viabilidad celular y se aplicó un algoritmo de ajuste de curva al conjunto de datos sin procesar para derivar una descripción de múltiples parámetros de respuesta a fármaco, incluyendo la concentración inhibidora semimáxima (CI<50>). CI<50>se expresa en log natural de la CI<50>en μM (LN_CI<50>; EXP devuelve CI<50>en μM). Se permitió la extrapolación de la CI<50>cuando producía valores muy altos. Si se deseaba, se restringieron los datos al intervalo de concentración sometido a prueba limitando los valores de CI<50>a la concentración máxima sometida a prueba (y la concentración mínima sometida a prueba para valores bajos).

[0339] Para pruebas de eficacia de BVD-523 en un xenoinjerto derivado de paciente (AT052C) que representa melanoma a partir de un paciente con BRAF<V600E>que había pasado a no responder clínicamente a vemurafenib. Se extrajeron fragmentos de tumor a partir de animales huésped y se implantaron en ratones inmunodeficientes. Se inició el estudio a un volumen tumoral medio de aproximadamente 170 mm<3>, momento en el cual los animales se aleatorizaron en cuatro grupos incluyendo un control (CMC al 1% [v/v] v.o., BIDx31) y tres grupos de tratamiento (BVD-523 [100 mg/kg], dabrafenib [50 mg/kg], o BVD-523/dabrafenib [100/50 mg/kg], n = 10/grupo); todos los fármacos de tratamiento se administraron v.o. en un calendario BIDx31.

[0341] Para la determinación de CI<50>para la inhibición de la fosforilación de RSK1 estimulada por PMA mediante BVD-523 en muestras de sangre completa humana, se determinaron valores de CI<50>para la inhibición de la fosforilación de RSK1 estimulada por PMA mediante BVD-523 para 10 donantes sanos (22-61 años de edad) usando una curva de concentración de 8 puntos que oscilaba desde 10 μM hasta 5 nM de BVD-523. Los controles consistieron en 3 muestras sin estimular y 3 muestras estimuladas por PMA para cada donante. Se determinaron los niveles tanto de fosfo-RSK (pRSK) como de RSK total y se calcularon datos usando niveles de pRSK/RSK para cada muestra.

[0342] Se extrajeron treinta mililitros de sangre a partir de cada donante a tubos Vacutainer con heparina sódica. Se añadió un ml de sangre completa a cada uno de veintidós microtubos de 2 ml por donante. Se marcaron los microtubos con el número de donante (de 1 a 10) y la siguiente designación de tratamiento: “A” para únicamente estimulación por PMA (máximo), “B” para muestras que contienen BVD-523 que recibieron estimulación por PMA; y “C” para las muestras sin estimular (mínimo). Se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) a todos los tubos en los grupos A y C hasta una concentración final del 0,1%. Después se balancearon suavemente las muestras a temperatura ambiente.

[0344] Se diluyó en serie BVD-523 (10 mM en DMSO al 100%) con diluciones de 3 veces en DMSO al 100%. Después, estas muestras de BVD-523 diluidas en serie en DMSO al 100% se diluyeron 10 veces en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina/glutamina, y se añadieron 10 μl de cada una de estas disoluciones de trabajo per ml de sangre para cada concentración de BVD-523 designada. Cada concentración de BVD-523 se usó por duplicado, dos muestras de 1 ml de sangre cada una, proporcionando 16 muestras en total para la curva de concentración de 8 puntos completa. Después se balancearon suavemente las muestras a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 horas pero no más de 3 horas.

[0346] Se estimularon las muestras de sangre completa humana en los grupos A y B para todos los donantes con PMA a una concentración final de 100 nM durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras en el grupo C no se trataron con PMA pero se balancearon y se manipularon como todas las demás muestras.

[0348] Tras completarse el tratamiento con PMA para cada muestra, se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de la sangre completa humana. Se recubrió suavemente un ml de sangre a partir de cada muestra sobre 0,75 ml de Histopaque 1077 a temperatura ambiente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Se centrifugaron las muestras durante 2 minutos a 16.000 x g en una microcentrífuga Eppendorf. Se retiraron la interfase y las fases superiores y se añadieron a tubos que contenían 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) fría. Después se centrifugaron estas muestras durante 30 segundos a 16.000 x g para sedimentar las células. Se retiró el sobrenadante de tampón mediante aspiración y volvieron a suspenderse los sedimentos en 1 ml de DPBS fría. Después volvieron a suspenderse los sedimentos de cada muestra como anteriormente. Se retiró el tampón mediante aspiración y se sometieron los sedimentos a lisis tal como se indica a continuación.

[0350] El tampón de lisis completo consistía en tampón de lisis Tris de Meso Scale Discovery, 1X cóctel de inhibidores de proteasa Halt, 1X cóctel de inhibidores de fosfatasa 2, 1X cóctel de inhibidores de fosfatasa 3, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 2 mM, y dodecilsulfato de sodio al 0,1%. Se mantuvo tampón de lisis en hielo y se preparó reciente para cada grupo de muestras. Se sometieron los sedimentos celulares finales a lisis mediante la adición de 120 μl de tampón de lisis completo. Se agitaron las muestras con vórtex hasta que desapareció el sedimento celular y después se congelaron rápidamente sobre hielo seco. Se almacenaron las muestras a -20ºC antes de la medición de pRSK y RSK total mediante ELISA.

[0351] Para el ELISA de pRSK (PathScan), se combinaron lisados descongelados 1:1 con diluyente de muestra (proporcionado en el kit de ELISA): 120 μl de lisado añadidos a 120 μl de diluyente de muestra en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Después se transfirió esta combinación a los micropocillos de pRSK a 100 μl por pocillo. Para el ELISA de RSK total (PathScan), 20 μl del lisado ya diluido 1:1 en diluyente de muestra se diluyeron adicionalmente en 200 μl de diluyente de muestra en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Después se transfirió esta combinación a los micropocillos de RSK total a 100 μl por pocillo. Se sellaron las placas con un sello de placa y se incubaron de 16 a 18 horas a 4ºC, un tiempo que se mostró que proporciona la mejor detección de la proteína diana. Ambos ELISA se revelaron según las instrucciones del kit.

[0353] Pacientes de ≥18 años de edad eran elegible para su participación si tenían tumores malignos en estadio avanzado o metastásicos confirmados mediante histología, no curables; un estado funcional de ECOG de 0 o 1; función renal, hepática, de médula ósea y cardíaca adecuadas; y una esperanza de vida de ≥3 meses. Los pacientes pueden haber recibido hasta 2 líneas previas de quimioterapia para su enfermedad metastásica. Los criterios de exclusión eran metástasis cerebrales no controladas conocidas; estados gastrointestinales que pueden alterar la absorción de medicamento del estudio; antecedentes o evidencia/riesgo actual de oclusión de vena retiniana o retinopatía serosa central; y terapia concurrente con fármacos que se sabe que son fuertes inhibidores de CYPIA2, CYP2D6, y CYP3A4 o fuertes inductores de CYP3A4. Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado antes del inicio de cualquier procedimiento del estudio.

[0355] Los pacientes que recibieron al menos una dosis de BVD-523 se incluyeron en el análisis usando el software SAS (versión 9.3). El punto de corte de los datos fue el 1 de diciembre de 2016. Este estudio está registrado en ClinicalTrials.gov, número NCT01781429.

[0357] La presente invención presenta datos de un estudio de fase I multicéntrico, abierto, para evaluar la seguridad, farmacocinética, y farmacodinamia de dosis crecientes de BVD-523 en pacientes con tumores malignos avanzados. La pauta de dosificación combinó tanto valoración acelerada como esquema de aumento de la dosis de 3+3 de cohorte convencional, que se usaron conjuntamente para identificar la MTD y RP2D de BVD-523 en pacientes con tumores sólidos avanzados. De uno a 6 pacientes por cohorte de tratamiento se asignaron a recibir dosis orales secuencialmente superiores de BVD-523 en un calendario BID (intervalos de 12 horas) en ciclos de 21 días, empezando a una dosis de 10 mg BID. BVD-523 se administró BID de manera continua en ciclos de 21 días a las siguientes dosis: 10 mg (n = 1); 20 mg (n = 1); 40 mg (n = 1); 75 mg (n = 1); 150 mg (n = 1); 300 mg (n = 4); 600 mg (n = 7); 750 mg (n = 4); y 900 mg (n = 7).

[0359] Los pacientes recibieron dosis orales BID hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable, o una observación clínica que satisficiera otro criterio de retirada. Se produjeron aumentos de la dosis en incrementos de hasta el 100% en cohortes de pacientes individuales hasta que 1 paciente experimentó una toxicidad de grado ≥2 (excluyendo alopecia o diarrea). Después se expandieron las cohortes hasta al menos 3 pacientes cada una y se redujeron los incrementos de aumento de la dosis posteriores desde hasta el 100% hasta un máximo del 50%. Cuando al menos 1 paciente en una cohorte de 3 pacientes experimentó una DLT, se trataron hasta 3 pacientes adicionales a este nivel de dosis. Cuando se produjo más de 1 DLT en ≤6 pacientes, se definió este nivel de dosis como la dosis no tolerada y se detuvo el aumento de la dosis. Se permitió el aumento de la dosis dentro de un paciente, siempre que los pacientes que recibieron la dosis actual más alta se hubieran sometido a observación durante al menos 3 semanas y se notificaran efectos secundarios limitantes de la dosis en menos de 2 de los 6 pacientes asignados a una dosis dada. En los pacientes que experimentaron DLT o toxicidad inaceptable se interrumpió el tratamiento hasta que la toxicidad volvió al ≤grado 1. Después se inició la reanudación de tratamiento con BVD-523 al siguiente nivel de dosis inferior sometido a prueba o a un aumento de la dosis del el 20% al 30%, alineándose con la dosificación de cápsula.

[0361] El objetivo primario del estudio de fase I era definir la seguridad y tolerabilidad de BVD-523 determinando las toxicidades limitantes de la dosis, la MTD, y la RP2D. Los objetivos secundarios incluyeron la determinación del perfil farmacocinético de BVD-523 en pacientes con tumores malignos avanzados y la investigación de cualquier efecto clínico preliminar sobre la respuesta tumoral, tal como se evalúa mediante examen físico o radiológico usando RECIST v1.1. Los objetivos exploratorios incluyeron evaluación de medidas de marcadores (biomarcadores) farmacodinámicos e investigación de efectos clínicos preliminares sobre la respuesta tumoral evaluados mediante<18>F-FDG-PET tal como se indica.

[0363] Para la determinación de MTD, DLT, y RP2D, se definió MTD como la cohorte de dosis más alta a la que ≤33% de los pacientes experimentaron DLT relacionadas con BVD-523 en los primeros 21 días de tratamiento. DLT se definió como toxicidad relacionada con BVD en los primeros 21 días de tratamiento que dio como resultado toxicidad hematológica de grado ≥4 durante >1 día; toxicidad hematológica de grado 3 con complicaciones (por ejemplo, trombocitopenia con hemorragia); toxicidad no hematológica de grado ≥3, excepto náuseas no tratadas, vómitos, estreñimiento, dolor, y exantema (estos pasaron a ser DLT si el AA persistió a pesar de un tratamiento adecuado); o una interrupción del tratamiento que superó 3 días en el ciclo 1 (o la incapacidad de comenzar el ciclo 2 durante >7 días) debido a toxicidad relacionada con BVD-523.

[0364] La RP2D podía ser tan alta como la MTD y se determinó en discusión con los investigadores clínicos, el monitor médico, y el promotor. Observaciones relacionadas con la farmacocinética, farmacodinamia, y cualquier toxicidad acumulativa observada tras múltiples ciclos se incluyeron en el fundamento que respaldaba la RP2D.

[0365] Con respecto a las evaluaciones de seguridad, los AA se definieron como cualquier aparición médica desfavorable en un paciente al que se le administró un producto médico que no tiene necesariamente una relación causal con BVD-523, y se codificó usando el diccionario de codificación MedDRA. Un AAG fue cualquier aparición médica desfavorable que se produjo a cualquier dosis que dio como resultado la muerte, fue potencialmente mortal, requirió hospitalización del paciente o prolongación de hospitalización existente, o dio como resultado discapacidad/incapacidad persistente o significativa o una anomalía congénita/defecto de nacimiento. La intensidad de los AA se clasificó según los criterios de terminología comunes del Instituto Nacional del Cáncer para acontecimientos adversos, escala de clasificación, versión 4.

[0366] Se llevaron a cabo evaluaciones de seguridad en el nivel inicial, en los días 8, 15, 22, 29, 36 y 43, y, en pacientes que continuaron con el tratamiento, cada 3 semanas o si estaba clínicamente indicado después de eso. Cada evaluación incluyó una exploración física y estudios de laboratorio clínico. Se repitieron electrocardiogramas si eran clínicamente significativos y a criterio del investigador. Los investigadores evaluaron si los AA estaban o no relacionados con el fármaco del estudio y realizaron un seguimiento hasta la resolución o estabilización, o se consideró que el AA ya no era clínicamente significativo.

[0367] Para análisis farmacocinéticos, la población farmacocinética consistió en pacientes que recibieron al menos una dosis de BVD-523 y tenían datos farmacocinéticos evaluables para plasma y/u orina. Se recogieron muestras de sangre antes de la dosificación, y después a 0,5 (± 5 min), 1 (± 5 min), 2 (± 10 min), 4 (± 10 min), 6 (± 10 min), 8 (± 10 min), y 12 (± 2 h) horas en el día 1 (visita 2; nivel inicial/inicio del tratamiento) y día 15 (visita 4; en estado estacionario) tras la dosis de la mañana. En el día 22, antes de la administración de la dosis, se recogió una muestra de sangre final para análisis farmacocinéticos. Se recogieron muestras de orina antes de la dosis y a los intervalos de 1 a 6 horas y de 6 a 12 ± 2 horas tras la dosis en los días 1 y 15. Se analizaron muestras de plasma y de orina para detectar BVD-523 y metabolitos usando métodos de CL/EM/EM validados. Se obtuvieron parámetros farmacocinéticos convencionales usando Phoenix WinNonlin (Pharsight) con un método no compartimental. Se calculó la relación entre la dosis y la exposición usando análisis de regresión de mínimos cuadrados convencional.

[0368] Para la confirmación farmacodinámica de la inhibición de la diana mediante BVD-523, se determinó la inhibición de ERK dirigida mediante BVD-523 examinando pRSK como biomarcador diana en muestras de sangre completa humana obtenidas a partir de pacientes con tumores sólidos avanzados (N = 27) que habían recibido diferentes dosis de BVD-523 (10-900 mg BID) durante el estudio de fase I. La actividad de BVD-523 a partir de 4 puntos de tiempo (nivel inicial antes de la dosis, nivel inicial 4 horas tras la dosis, día 15 antes de la dosis, y día 154 horas tras la dosis) se expresó como actividad en porcentaje (pRSK) de sangre estimulada por PMA incubada con BVD-523.

[0369] Para la medición de la respuesta antitumoral, se realizaron mediciones de tumor basadas en exploración física en el nivel inicial y en el primer día de cada ciclo de tratamiento. Se realizaron evaluaciones de CT y otras evaluaciones cada 2 a 3 ciclos. Se evaluaron los hallazgos según RECIST v1.1: CR se definió como desaparición de todas las lesiones diana; PR se definió como una reducción de ≥30% en la suma de los diámetros más largos de las lesiones diana, tomando medidas de nivel inicial como referencia; enfermedad estable se definió como no tener ni contracción suficiente como para cualificarse para PR ni aumento suficiente como para cualificarse para enfermedad progresiva, tomando como referencia la medida de nivel inicial. Se evaluó la respuesta metabólica visualizando la captación tumoral de<18>F-glucosa mediante exploración de<18>F-FDG-PET antes de recibir la primera dosis de BVD-523 y en el día 15 (visita 4).

[0370] Ejemplo 2

[0371] Aumento de la dosis y ensayos de proliferación - Mes 1

[0372] Progreso de aumento de la dosis - Mes 1

[0373] Se sometieron células A375 a aumento de la dosis usando BVD-523, dabrafenib, y trametinib o bien como agentes únicos o bien en combinación. Se aumentaron las dosis en pequeños incrementos durante el primer mes. Aparte de una notable reducción de la tasa de crecimiento, las células toleraron generalmente bien los aumentos y se planificó que las dosis se aumentaran de manera más agresiva usando incrementos más grandes en el mes 2. La figura 1A-figura 1C muestran el progreso del mes 1 para los estudios de aumento de la dosis.

[0374] Resultados del ensayo de proliferación - Mes 1

[0375] Se realizaron ensayos de proliferación para evaluar la respuesta de las líneas celulares sometidas a aumento frente a la línea celular parental, a tratamientos con BVD-523, dabrafenib, y trametinib.

[0376] La figura 2A - figura 2H muestran resultados del ensayo de proliferación normalizados y sin procesar a partir del mes 1 de los estudios. Obsérvese que las diferencias en las señales máximas en controles de DMSO entre diferentes tratamientos (figura 2D, figura 2F, y figura 2H) sugieren tasas de crecimiento diferenciales entre tratamientos. Estas diferencias pueden influir en las respuestas de líneas a inhibidores en los ensayos de proliferación.

[0377] La tabla 10 muestra datos de CI<50>durante el mes 1 de los estudios.

[0378] Tabla 10 - Datos de CI<50>- Mes 1

[0381]

[0383] *Par = Línea celular parental

[0384] Hubo indicios tempranos de que células que se hacen crecer en presencia de dosis crecientes de dabrafenib o trametinib, o bien como agentes únicos o bien en combinaciones, mostraban respuestas reducidas a estos dos agentes en ensayos de proliferación.

[0385] En las fases iniciales del mes 2, la tasa de crecimiento de células en el tratamiento solo con dabrafenib aumentaron notablemente con respecto a las fases iniciales del mes 1. Esto permitió una tasa de progresión aumentada y sugirió que la resistencia estaba volviéndose evidente.

[0386] Ejemplo 3

[0387] Aumento de la dosis y ensayos de proliferación - Mes 2

[0388] Progreso de aumento de la dosis - Mes 2

[0389] En el segundo mes de estudios la mayoría de los tratamientos pasaron a una fase en la que se aumentaron las dosis en incrementos mayores (1,5 veces) en comparación con la fase de aumento suave inicial. El aumento como agente único de dabrafenib y trametinib fue el más rápido, creciendo las células en concentraciones equivalentes a 100 x CI<50>de células parentales (figura 3A y figura 3B). El aumento como agente único de BVD-523 avanzó más lentamente en comparación con dabrafenib y trametinib (figura 3C). Véase la figura 3D para una comparación de los aumentos como agentes únicos. Las células sometidas a aumento de BVD-523 tenían un aspecto más “frágil” y había un mayor número de células flotantes en comparación con las poblaciones sometidas a aumento con dabrafenib y trametinib.

[0390] Los aumentos como agentes combinados avanzaron más lentamente que los tratamientos como agente único. La combinación de BVD-523/trametinib fue particularmente eficaz para prevenir que progresaran las células.

[0391] Resultados del ensayo de proliferación - Mes 2

[0392] Los ensayos de proliferación con poblaciones de células con dabrafenib y trametinib sometidos a aumento como agentes únicos revelaron desplazamientos moderados en las curvas de dosis-respuesta, sugiriendo que un periodo adicional de aumento sería beneficioso para enriquecer adicionalmente células resistentes. De manera interesante, en el ensayo de proliferaciones, había evidencias que sugerían que células expuestas a BVD-523 crecían peor tras la retirada de inhibidor, indicando quizás un nivel de adicción.

[0393] La figura 4A - figura 4H muestran resultados del ensayo de proliferación normalizados y sin procesar a partir del mes 2 de los estudios. Obsérvese que las diferencias en las señales máximas en controles de DMSO entre diferentes tratamientos (figura 4D, figura 4F, y figura 4H) sugieren tasas de crecimiento diferenciales entre tratamientos. Estas diferencias pueden influir en las respuestas de líneas a inhibidores en los ensayos de proliferación.

[0394] La figura 5A - figura 5H muestran resultados del ensayo de proliferación normalizados y sin procesar a partir del mes 2 de los estudios centrándose únicamente en datos de líneas parental y BVD-523.

[0395] La tabla 11 muestra datos de CI<50>para el mes 2 de los estudios. Se determinaron CI<50>relativas a partir de ajustes de curva de 4 parámetros en Prism.

[0396] Tabla 11 - Datos de CI<50>- Mes 2

[0399]

[0400]

[0402] *Par = Línea celular parental

[0403] Ejemplo 4

[0404] Aumento de la dosis y ensayos de proliferación - Mes 3

[0405] Progreso de aumento de la dosis - Mes 3

[0406] La figura 6A - figura 6C muestran aumento como agente único y en combinación para el mes 3 de los estudios. La figura 6D muestra una comparación de aumentos como agente único.

[0407] Resultados del ensayo de proliferación - Mes 3

[0408] La figura 7 muestra una evaluación del crecimiento durante el ensayo de proliferación en pocillos de control de DMSO. La figura 8A - figura 8D muestran resultados a partir del mes 3 de los estudios. La figura 9A - figura 9D muestran resultados a partir del mes 3 de los estudios centrándose en líneas celulares con tratamiento individual.

[0409] La tabla 12 muestra datos de CI<50>para el mes 3 de los estudios. Se determinaron CI<50>relativas a partir de ajustes de curva de 4 parámetros en Prism. No se determinaron valores de CI<50>para la línea celular sometida a aumento con trametinib debido a falta de crecimiento durante el ensayo (ND: no realizado).

[0410] Tabla 12 - Datos de CI<50>- Mes 3

[0413]

[0415] *Par = Línea celular parental

[0416] La figura 19 muestra el aumento como agente único y en combinación para el mes 3 de los estudios. Se obtuvieron variantes de línea celular que podían crecer en presencia de dabrafenib o trametinib a concentraciones de más de 100 veces la CI<50>de estos agentes en células A375 parentales. En comparación, las líneas celulares resistentes a BVD-523 solo podían mantenerse en menos de 10X la concentración CI<50>parental. Las pruebas de sensibilidad sugirieron que las líneas celulares resistentes a dabrafenib y trametinib seguían siendo relativamente sensibles a BVD-523; el “desplazamiento” de CI<50>aumentado para BVD-523 en líneas celulares resistentes era más moderado que los aumentos de CI<50>correspondientes tras el tratamiento con dabrafenib o trametinib. Asimismo, en comparación con el tratamiento con dabrafenib o trametinib, se observó una inhibición más completa del crecimiento celular cuando se trataron líneas celulares resistentes con BVD-523 a concentraciones 10 veces por encima de su CI<50>en la línea A375 parental. En total, los patrones de resistencia y sensibilidad cruzada sugieren que BVD-523 puede seguir siendo eficaz en contextos de resistencia adquirida.

[0417] Ejemplo 5

[0418] Resultados del estudio de combinación

[0419] Tal como se esperaba, las células A375, que portan una mutación de BRAF (V600E), eran sensibles a dabrafenib. Generalmente los valores de CI<50>como agente único calculados usando Alamar Blue (figura 10A - figura 10E, figura 12A - figura 12E, y figura 14A - figura 14E) fueron ligeramente inferiores para dabrafenib y BVD-523 en comparación con los derivados usando CellTiter-Glo (figura 11A - figura 11E, figura 13A - figura 13E, y figura 15A - figura 15E). Los valores de CI<50>publicados para dabrafenib y trametinib en un ensayo de CellTiter-Glo de 72 horas eran de 28 ± 16 nM y 5 ± 3 nM, respectivamente (Gregeret al., 2012; Kinget al., 2013), los resultados como agente único notificados en este caso son compatibles con estos valores. Había algunas evidencias de un intervalo de sinergia en todos los tratamientos. La variación entre triplicados era baja, sin embargo, había algunas evidencias de efectos de borde que probablemente expliquen el aparente crecimiento potenciado observado en algunos tratamientos frente al control sin fármaco (por ejemplo, particularmente evidente en la combinación de trametinib/BVD-523). Esto hace que la interpretación del análisis de Bliss sea más difícil dado que, en algunos tratamientos, puede haber dado como resultado la potenciación como artefacto del nivel de sinergia.

[0420] Los ensayos de combinación se repitieron para células A375. Las potencias de BVD-523, trametinib y dabrafenib como agente único eran compatibles con las notificadas en los estudios anteriores dados a conocer en el presente documento.

[0421] En resumen, tomados en conjunto los datos muestran que las células resistentes a MEK y BRAF pueden superarse mediante tratamiento con el inhibidor de ERK, BVD-523.

[0422] Ejemplo 6

[0423] Marcadores alterados por BVD-523 de actividad MAPK cinasa y función efectora

[0424] Para estudios de inmunotransferencia de tipo Western, se sembraron células HCT116 (5 x 10<6>) en placas de 10 cm en medio 5A de McCoy más FBS al 10%. Se sembraron células A375 (2,5 x 10<6>) en placas de 10 cm en DMEM más FBS al 10%. Se dejaron adherir las células durante la noche antes de la adición de la cantidad indicada de compuesto de prueba (BVD-523) o control de vehículo. Se trataron las células durante o bien 4 o bien 24 horas antes del aislamiento de lisados de proteínas de células completas, tal como se especifica a continuación. Se recogieron las células mediante tripsinisación, se sedimentaron y se congelaron rápidamente. Se prepararon lisados con tampón de RIPA (ensayo de radio-inmunoprecipitación), se aclararon mediante centrifugación y se cuantificaron mediante ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Se resolvieron 20-50 μg de proteína mediante electroforesis en SDS-PAGE, se transfirieron sobre membrana de PVDF y se analizaron con sonda usando los anticuerpos detallados en la tabla 13 (para el tratamiento de 4 horas) y la tabla 14 (para el tratamiento de 24 horas) a continuación.

[0425] Tabla 13 - Detalles de anticuerpos

[0428]

[0430] Tabla 14 - Detalles de anticuerpos

[0433]

[0434]

[0437] La figura 16A - figura 16D, la figura 17A - figura 17D, y la figura 18A - figura 18D muestran análisis de inmunotransferencia de tipo Western de células tratadas con BVD-523 a diversas concentraciones para detectar lo siguiente: 1) componentes de señalización de MAPK en células A375 después de 4 horas; 2) señalización de apoptosis y ciclo celular en A375 con tratamiento de 24 horas con diversas cantidades de BVD-523; y 3) señalización de MAPK en células HCT-116 tratadas durante 4 horas. Los resultados muestran que el tratamiento agudo y prolongado con BVD-523 en células cancerosas mutantes para RAF y RASin vitroafecta tanto a la fosforilación de sustrato como a dianas efectoras de cinasas ERK. Las concentraciones de BVD-523 requeridas para inducir estos cambios están normalmente en el intervalo micromolar bajo.

[0439] Los cambios en varios marcadores de actividad específicos son notables. En primer lugar, la abundancia de isoformas de migración lenta de cinasa ERK aumentan tras el tratamiento con BVD-523; pueden observarse cambios moderados de manera aguda, y aumentan tras un tratamiento prolongado. Aunque esto puede indicar un aumento de formas fosforiladas, enzimáticamente activas, de ERK, sigue siendo notable que múltiples proteínas sometidas a regulación tanto directa como indirecta mediante ERK permanecen “desactivadas” tras el tratamiento con BVD-523. En primer lugar, las proteínas RSK1/2 muestran una fosforilación reducida en residuos que dependen estrictamente de ERK para la modificación de proteína (T359/S363). En segundo lugar, el tratamiento con BVD-523 induce cambios complejos en la fosfatasa de realimentación de MAPK, DUSP6: las isoformas de proteína de migración lenta se reducen tras un tratamiento agudo, mientras que los niveles de proteína total se reducen en gran medida tras un tratamiento con BVD-523 prolongado. Ambos de estos hallazgos son compatibles con una actividad reducida de cinasas ERK, que controlan la función de DUSP6 mediante mecanismos tanto postraduccionales como transcripcionales. En conjunto, a pesar de aumentos de formas celulares de ERK que normalmente se piensa que son activas, parece probable que la actividad enzimática de ERK celular se inhiba completamente tras un tratamiento ya sea agudo o prolongado con BVD-523.

[0440] De manera compatible con estas observaciones, los genes efectores que requieren señalización de la ruta de MAPK están alterados tras el tratamiento con BVD-523. El aparato del ciclo celular G1/S está regulado a niveles tanto postraduccional como transcripcional mediante señalización de MAPK, y los niveles de proteína de ciclina D1 están reducidos en gran medida tras un tratamiento con BVD-523 prolongado. De manera similar, la expresión génica y abundancia de proteína de efectores de apoptosis con frecuencia requieren señalización de MAPK intacta, y los niveles totales de Bim-EL aumentan tras un tratamiento con BVD-523 prolongado. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, la escisión de proteína de PARP y el aumento de la apoptosis no se observaron en el contexto de células A375; esto sugiere que factores adicionales pueden influir en si cambios en la señalización de efector dependiente de BVD-523/ERK se traducen en acontecimientos definitivos tales como muerte celular y parada del ciclo celular.

[0442] De manera compatible con la actividad celular de BVD-523, el análisis de marcador sugiere que la inhibición de ERK altera una variedad de acontecimientos de señalización molecular en células cancerosas, haciendo que sean propensas tanto a supervivencia como a proliferación celular reducidas.

[0443] En resumen, la figura 16A - figura 16D, la figura 17A - figura 17D, y la figura 18A - figura 18D muestran que BVD-523 inhibe la ruta de señalización de MAPK y puede ser más favorable en comparación con la inhibición de RAF o MEK en este contexto.

[0444] Finalmente, propiedades de BVD-523 pueden hacer que sea un agente preferido para su uso como inhibidor de ERK, en comparación con otros agentes con una actividad similar. Se sabe que los fármacos inhibidores de cinasas presentan interacciones únicas y específicas con sus dianas enzimáticas, y que la eficacia del fármaco se ve fuertemente influida tanto por el modo de inhibición directa, así como por la propensión a cambios adaptativos que se producen tras el tratamiento. Por ejemplo, los inhibidores de cinasas ABL, KIT, EGFR y ALK solo son eficaces cuando su diana relacionada se encuentra en configuraciones activa o inactiva. Asimismo, algunos de estos inhibidores son sensibles de manera única a mutación genética secundaria, o cambios adaptativos postraduccionales, de la diana proteica. Finalmente, los inhibidores de RAF muestran potencia diferencial frente a cinasas RAF presentes en determinados complejos de proteínas y/o localizaciones subcelular. En resumen, dado que se sabe de manera similar que las cinasas ERK existen en estados bioquímicos diversos, variables, y complejos, parece probable que BVD-523 puede interaccionar con, e inhibir, estas dianas de una manera que es distinta y altamente preferible con respecto a otros agentes.

[0445] Ejemplo 7

[0446] Efectos de BVD-523 e inhibidores de ERK BRAF y MEK de referencia sobre la viabilidad y señalización de MAPK

[0447] Ensayo de proliferación de agente único

[0448] Se sembraron células en placas de 96 pocillos a las densidades indicadas en la tabla 15 en medio 5A de McCoy que contenía FBS al 10% y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de compuesto o control de vehículo. Se prepararon compuestos a partir de disoluciones madre en DMSO para dar las concentraciones finales deseadas. La concentración de DMSO final fue constante al 0,1%. Se incubaron compuestos de prueba con las células durante 96 h a 37ºC, el 5% de CO<2>en una atmósfera humidificada. Se añadió reactivo CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Se dedujo el valor de fondo solo con medio promedio y se analizaron los datos usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

[0449] Ensayo de proliferación de combinación

[0450] Se sembraron células en placas de 96 pocillos por triplicado a las densidades indicadas en la tabla 15 en medio 5A de McCoy que contenía FBS al 10% y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de test compuesto o control de vehículo. Se sometieron a prueba combinaciones usando una matriz de dosis de 10x8. La concentración de DMSO final fue constante al 0,2%.

[0451] Se incubaron compuestos de prueba con las células durante 96 h a 37ºC, el 5% de CO<2>en una atmósfera humidificada. Se tiñeron las células con tinción de Hoechst y se detectó la fluorescencia tal como se describió anteriormente. Se dedujo el valor de fondo solo con medio promedio y se analizaron los datos.

[0452] Se determinaron interacciones de combinaciones a través de la matriz de dosis mediante los modelos de aditividad de Loewe e independencia de Bliss usando el software de análisis de combinación Chalice<TM>(Horizon Discovery Group, Cambridge, MA) tal como se expone en el manual de usuario (disponible en chalice.horizondiscovery.com/chalice-portal/documentation/analyzer/home.jsp). La sinergia se determina comparando el nivel de inhibición observado de manera experimental en cada punto de combinación con el valor esperado para la aditividad, que se deriva a partir de las respuestas de agentes únicos a lo largo de los bordes de la matriz. Se identificaron posibles interacciones sinérgicas visualizando la inhibición en exceso calculada con respecto a la predicha como aditiva a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y notificando una “puntuación de sinergia” cuantitativa basándose en el modelo de Loewe. Los datos de agentes únicos a partir de las placas de ensayo de combinación se presentaron como curvas de dosis-respuesta generadas en Chalice<TM>.

[0453] Tabla 15 - Densidad de siembra de línea celular

[0456]

[0457] Inmunotransferencia de tipo Western

[0458] Se sembraron células en placas de 6 pocillos (experimento 1) o placas de 10 cm (experimento 2) a las densidades indicadas en la tabla 15 en medio 5A de McCoy que contenía FBS al 10% y se dejaron adherir durante la noche antes de la adición de compuesto o control de vehículo. Se añadieron compuestos de prueba y se incubaron con las células durante 4 o 24 h a 37ºC, el 5% de CO<2>en una atmósfera humidificada. Se recogieron las células mediante tripsinisación, se sedimentaron mediante centrifugación y se congelaron rápidamente en hielo seco.

[0459] Se prepararon lisados usando tampón de RIPA (clorhidrato de Tris 50 mM, pH 8,0; cloruro de sodio 150 mM; lgepal CA-630 (NP-40) al 1,0%; desoxicolato de sodio al 0,5%; dodecilsulfato de sodio al 0,1%; 1x cóctel de inhibidores de proteasa libre de EDTA completo (Roche, Nutley, NJ; cat. 05892791001); 1x cóctel de inhibidores de fosfatasa phosSTOP (Roche Nutley, NJ; cat.04906837001)) y se aclararon mediante centrifugación a 11.000 rpm durante 10 min en una centrífuga de sobremesa.

[0460] Se cuantificó la proteína total en los lisados mediante ensayo de BCA según las instrucciones del fabricante (kit de ensayo de proteínas de BCA Pierce<TM>; Thermo Scientific, Waltham, MA; cat.23225), se hirvió en tampón de muestra (tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat. NP0007)) y se almacenó a -80ºC.

[0461] Se resolvieron cantidades iguales de proteína (40 μg) en geles NuPAGE de Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat. WG1402BOX) y se transfirieron sobre membranas de PVDF usando pilas de transferencia de gel iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat. IB4010-01) en un dispositivo de transferencia de gel iBlot (Invitrogen Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.

[0462] Se analizaron transferencias con sonda usando los anticuerpos y condiciones de bloqueo detallados en la tabla 16. Se desarrollaron inmunotransferencias de tipo Western usando sustrato de inmunotransferencia de tipo Western ECL2 Pierce<TM>(Thermo Scientific, Waltham, MA; cat.80196) y se obtuvieron imágenes usando un dispositivo de obtención de imágenes de inmunotransferencia de tipo Western FluorChem M (ProteinSimple, San Jose, CA).

[0463] Tabla 16 - Anticuerpos y condiciones de inmunotransferencia de tipo Western

[0466]

[0468] La mutación de MEK1 (Q56P) muestra a modo de ejemplo una clase de mutaciones activantes de MEK1/2 clínicamente relevantes que se sabe que regulan por incremento la ruta de MAPK e impulsan la resistencia adquirida frente a inhibidores de BRAF o MEK.

[0469] Este estudio usó un par de líneas celulares RKO BRAF(V600E) que son isogénicas para la presencia o ausencia de una mutación activante de MEK1 (Q56P), para evaluar el efecto que tienen mutaciones activantes de MEK en respuesta al inhibidor de ERK novedoso BVD-523 frente a otros inhibidores de MAPK de referencia.

[0470] Se evaluaron los efectos sobre la viabilidad celular cuantificando los niveles de ATP celulares usando CellTiter-Glo® después de 96 h. Ensayos de agentes únicos demostraron que las células mutantes dobles BRAF(V600E)::MEK1(Q56P) presentaban una sensibilidad notablemente reducida a inhibición con inhibidores clínicos de referencia de BRAF (mostrado a modo de ejemplo por dabrafenib) o MEK (mostrado a modo de ejemplo por trametinib) con respecto a las células BRAF(V600E) parentales, lo cual demuestra la idoneidad de este modelo isogénico para reproducir la resistencia adquirida que se sabe que está asociada con esta clase de mutación en la clínica (tabla 17).

[0471] Tabla 17 - Valores de CI<50>de agentes únicos

[0474]

[0476] n.d. - no determinado, solo se logró una respuesta a la dosis parcial

[0477] En cambio, la respuesta a BVD-523 fue idéntica tanto en las células parentales como mutantes dobles, indicando que BVD-523 no es sensible a este mecanismo de resistencia adquirida.

[0478] Estos resultados fueron idénticos en dos clones de línea celular mutante doble BRAF(V600E)::MEK1(Q56P) derivados de manera independiente confirmando que estas diferencias en la respuesta frente a las células parentales estaban específicamente relacionadas con la presencia de la mutación de MEK1 en vez de un artefacto clonal no relacionado (figura 22A - figura 22E). También se observaron resultados similares con un segundo inhibidor de ERK de referencia mecanísticamente distinto (SCH772984), lo cual respalda la noción de que estas observaciones están específicamente relacionadas con la inhibición de ERK y no se deben a un efecto inespecífico.

[0479] El efecto de combinar BVD-523 con un inhibidor de BRAF (mostrado a modo de ejemplo por dabrafenib) también se evaluó en estas líneas celulares a través de una matriz de concentraciones usando los modelos de aditividad de Loewe o independencia de Bliss con el software de análisis de combinación Chalice<TM>de Horizon (figura 23 - figura 23O y figura 24A - figura 24O). Después se evaluó la presencia de interacciones posiblemente sinérgicas visualizando la inhibición en exceso calculada con respecto a la predicha como aditiva a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y calculando una “puntuación de volumen” que muestra si la respuesta global a una combinación es sinérgica (valores positivos), antagonista (valores negativos) o aditiva (~0).

[0480] Los resultados sugieren que la combinación de BVD-523::dabrafenib era principalmente aditiva en la línea celular parental y mutante. En cambio, la combinación de un inhibidor de MEK (trametinib) más dabrafenib, aunque era principalmente aditiva en la línea celular parental, mostró una fuerte sinergia en la línea celular mutante doble BRAF(V600E)::MEK1(Q56P) (figura 25A - figura 25O). En las tablas 18 - 20 se muestran volúmenes de Loewe, volúmenes de Bliss y puntuaciones de sinergia para las combinaciones sometidas a prueba, respectivamente y se muestran representadas en gráficos en la figura 26A - figura 26C.

[0481] Tabla 18 - Volúmenes de Loewe

[0484]

[0486] Tabla 19 - Volúmenes de Bliss

[0489]

[0491] Tabla 20 - Puntuaciones de sinergia

[0492]

[0494] Se evaluaron los efectos sobre la ruta de MAPK mediante inmunotransferencia de tipo Western. Los niveles de fosforilación de ERK basal (muestras de DMSO) estaban notablemente regulados por incremento en la línea que expresaba MEK1 (Q56P) en comparación con la parental, confirmando adicionalmente que este modelo isogénico reproduce fielmente el fenotipo esperado para la expresión de mutaciones de resistencia adquirida de activación de MEK.

[0495] En las células RKO BRAF(V600E) parentales, se observa un nivel reducido de fosforilación de RSK1/2 tras el tratamiento agudo con inhibidores de cinasas RAF, MEK y ERK a concentraciones farmacológicamente activas. En cambio, las células isogénicas, mutantes dobles BRAFV600E::MEK1Q56P no muestran una fosforilación de RSK reducida tras el tratamiento con inhibidor de BRAF o MEK, mientras que BVD-523 sigue siendo eficaz a concentraciones similares (figura 27A - figura 27I). Las líneas discontinuas indican que las muestras tratadas con trametinib (más control de DMSO coincidente) y las transferencias se derivan de un experimento independiente de las muestras tratadas con BRAFi y BVD-523.

[0496] Se observan cambios en la señalización de gen efector con patrones de inhibición del crecimiento celular tras el tratamiento con inhibidor prolongado. En líneas RKO parentales, se observa un nivel reducido de pRB fosforilado tras un tratamiento con inhibidor de MEK y ERK prolongado. Al nivel de la modulación de pRB, las líneas mutantes de MEK1 parecen insensibles a tratamiento con inhibidor de MEK a baja concentración, mientras que concentraciones superiores siguen siendo eficaces. De manera crítica, la potencia de BVD-523 frente a la actividad de pRB no parece verse fuertemente afectada por la mutación de MEK. Sorprendentemente, el tratamiento con inhibidor de RAF no afecta al estado de pRB, a pesar de una potente inhibición de señalización aguas arriba, en contexto tanto parental como mutante de MEK.

[0497] En resumen, estos resultados muestran que BVD-523 no es sensible a resistencia adquirida impulsada por mutaciones activantes de MEK tales como MEK1 (Q56P). Además sugieren que, en combinación, las interacciones entre BVD-523 y BRAFi (mostrado a modo de ejemplo por dabrafenib) son aditivas independientemente de la presencia de una mutación activante de MEK.

[0498] Ejemplo 8

[0499] Interacciones de combinación entre inhibidores de ERK

[0500] Se cultivaron células A375 de la línea celular de melanoma mutante para en DMEM con FBS al 10% y se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad inicial de 2000 células por pocillo. Se analizaron interacciones de combinación entre inhibidores de ERK BVD-523 y SCH772984 después de 72 horas tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Se determinó la viabilidad usando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).

[0501] La visualización de los mapas de calor de “inhibición en exceso” de Loewe y Bliss sugirió que la combinación de BVD-523 y SCH772984 era principalmente aditiva con intervalos de posible sinergia en dosis en el intervalo medio (figura 28A - figura 28E).

[0502] En resumen, estos resultados sugieren que las interacciones entre BVD-523 y SCH772984 son al menos aditivas, y en algunos casos sinérgicas.

[0503] Ejemplo 9

[0504] Selección como diana de la ruta de señalización de MAPK en cáncer: actividad prometedora con el inhibidor de ERK1/2 selectivo novedoso BVD-523 (ulixertinib)

[0505] Las estrategias de tratamiento para cáncer han evolucionado desde enfoques clásicos basados en citotoxicidad hasta agentes que contrarrestan los efectos de lesiones genéticas que impulsan señalización aberrante esencial para la proliferación y supervivencia del tumor. Por ejemplo, el módulo de ERK de la cascada de señalización de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) (RAS-RAF-MEK-ERK) (Cargnello y Rouxx 2011) puede implicarse por varias tirosina cinasas receptoras (por ejemplo, EGFR y ErbB-2) además de mutaciones activadas de manera constitutiva de componentes de la ruta tales como RAS y BRAF (Gollobet al.2006). Mediante activación aberrante de señalización de ERK, alteraciones genéticas en RAS o BRAF dan como resultado un rápido crecimiento tumoral, supervivencia celular aumentada, y resistencia a la apoptosis (Poulikakoset al.2011, Corcoranet al.2010, Nazarianet al.2010, Shiet al. 2014, Wagleet al. 2011). Se encuentran mutaciones activantes de miembros de la familia de RAS, KRAS y NRAS, en ~30% de todos los cánceres humanos, con incidencia particularmente alta en cáncer pancreático (Kandaet al. 2012) y colorrectal (Arringtonet al. 2014). Se han observado mutaciones activantes constitutiva en el gen de BRAF que normalmente codifica para valina en el aminoácido 600 en melanoma, carcinoma de tiroides, cáncer colorrectal, y cáncer de pulmón de células no pequeñas (Hallet al.2014). También se han notificado cánceres que portan mutaciones genéticas que dan como resultado cambios de los componentes aguas abajo ERK y MEK (Ojesinaet al. 2014, Arcilaet al. 2015). Alteraciones que activan la ruta de MAPK también son comunes en el contexto de resistencia a terapias dirigidas (Groenendijket al. 2014). Por tanto, seleccionar como diana las cinasas maestras terminales de la ruta de MAPK (ERK1/2) es una estrategia prometedora para tumores que albergan tales alteraciones de activación de la ruta (por ejemplo, BRAF, NRAS, y KRAS).

[0507] Se han aprobado tres fármacos dirigidos a la ruta de MAPK por la Food and Drug Administration (FDA) de los EE. UU. para tratamiento como agentes únicos de melanoma cutáneo no resecable o metastásico con mutaciones BRAF<V600>: los inhibidores de BRAF vemurafenib y dabrafenib y el inhibidor de MEK trametinib. Además, la combinación de dabrafenib y trametinib también está aprobada en esta indicación (Queiroloet al. 2015 y Masseyet al. 2015). Un inhibidor de MEK adicional, cobimetinib, está aprobado en esta indicación como parte de una pauta de combinación con inhibidores de BRAF. La experiencia clínica con estos fármacos valida la ruta de MAPK como diana terapéutica. En ensayos de fase Ill de pacientes con melanoma mutante para BRAF<V600>, los agentes únicos vemurafenib y dabrafenib demostraron tasas de respuesta (aproximadamente el 50% frente al 5-19%) y mediana de supervivencia libre de progresión (PFS, 5,1-5,3 meses frente a 1,6-2,7 meses) superiores con respecto a quimioterapia citotóxica (dacarbazina) (Chapmanet al.2011 y Hauschildet al.2012). Además, el uso clínico de terapias dirigidas a BRAF más MEK concomitantes ha demostrado que la selección como diana simultánea de diferentes nodos en la ruta de MAPK puede potenciar la magnitud y duración de la respuesta. El uso en primera línea de agentes dirigidos a BRAF más MEK (dabrafenib/trametinib o cobimetinib/vemurafenib) mejoró adicionalmente la mediana de la supervivencia global en comparación con la inhibición de BRAF con agentes únicos (Robertet al.2015, Longet al.2015, Larkinet al.2014). Por tanto, la terapia dirigida a BRAF/MEK combinada es una opción de tratamiento valiosa para pacientes con melanoma metastásico con mutaciones BRAF<V600>.

[0509] A pesar de mejoras en los desenlaces clínicos observados con terapias de combinación con inhibidores de BRAF/MEK, el beneficio duradero está limitado por el desarrollo final de resistencia adquirida y posterior progresión de la enfermedad, con una mediana de PFS que oscila desde aproximadamente 9 hasta 11 meses (Robertet al.2015, Longet al.2015, Larkinet al.2014, y Flahertyet al.2012). Se han estudiado intensamente mecanismos genéticos de resistencia adquirida frente a la inhibición de BRAF con agentes únicos, y la identificación de mecanismos de resistencia incluye variantes de corte y empalme de BRAF (Poulikakoset al. 2011), amplificación de BRAF<V600E>(Corcoranet al.2010), mutaciones de MEK (Wagleet al.2014), mutaciones de NRAS, y activación de RTK (Nazarianet al.2010 y Shiet al.2014). Están comenzando a surgir mecanismos de resistencia en el contexto de la terapia de combinación con inhibidores de BRAF/MEK y reflejan el de resistencia a agentes únicos contra BRAF (Wagleet al.

[0510] 2014 y Longet al.2014). Todos estos acontecimientos genéticos comparten en común la capacidad de reactivar la señalización de ERK. De hecho, la señalización de la ruta de MAPK reactivada tal como se mide mediante dianas transcripcionales de ERK es común en biopsias de tumor a partir de pacientes resistentes a inhibidores de BRAF (Rizoset al. 2014). Además, se ha observado reactivación de ERK1/2 en ausencia de un mecanismo genético de resistencia (Carlinoet al.2015). Por tanto, la búsqueda para lograr un beneficio clínico duradero ha conducido a los investigadores a centrarse en evaluar agentes adicionales que seleccionan como diana los componentes de MPAK aguas abajo ERK1/2. Inhibir ERK puede proporcionar un beneficio clínico importante para pacientes con resistencia adquirida a la inhibición de BRAF/MEK. Las cinasas de la familia de ERK han mostrado ser prometedoras como dianas terapéuticas en modelos de cáncer preclínicos, incluyendo los cánceres resistentes a inhibidores de BRAF o MEK (Morriset al.2013 y Hatzivassiliouet al.2012). Sin embargo, el posible uso de tales inhibidores de ERK1/2 se expande más allá de la resistencia adquirida en melanoma.

[0512] Seleccionar ERK1/2 como diana es una estrategia racional en cualquier tipo de tumor que alberga factores de impulsión conocidos de MAPK, no solo pacientes con recidiva tras la terapia contra BRAF/MEK. Dado que ERK1 y ERK2 residen aguas abajo en la ruta, representan una estrategia de tratamiento particularmente atractiva dentro de la cascada de MAPK que puede evitar mecanismos de resistencia aguas arriba. En este caso, se notifica caracterización preclínica de BVD-523 (ulixertinib) en modelos de cánceres dependientes de la ruta de MAPK, incluyendo modelos con resistencia adquirida a terapia contra BRAF/MEK y que no han recibido fármaco. Se incluyen resultados de un estudio de búsqueda de la dosis de fase I de BVD-523 como publicación asociada en esta revista. Véanse los ejemplos 17-24.

[0514] En la presente invención, se mostró que BVD-523 era un inhibidor de ERK1/2 potente, altamente selectivo, reversible, competitivo con ATP de molécula pequeña con actividad anticancerosain vitroein vivo.

[0516] Se identificó BVD-523 (ulixertinib) y se caracterizó como inhibidor de ERK1/2 novedoso, reversible, competitivo con ATP con alta potencia y selectividad de ERK1/2. BVD-523 provocó una proliferación reducida y actividad caspasa potenciada, lo más notablemente en células que albergaban mutaciones en la ruta de MAPK (RAS-RAF-MEK). En estudios de xenoinjertos BRAF<V600E>in vivo

, BVD-523 mostró regresiones tumorales e inhibición del crecimiento dependientes de la dosis. De manera interesante, BVD-523 inhibió la fosforilación de sustratos diana a pesar de la fosforilación aumentada de ERK1 /2. BVD-523 también demostró actividad antitumoral en modelos de resistencia adquirida frente a terapia dirigida a BRAF/MEK en combinación y como agente único. También se demostraron efectos antiproliferativos sinérgicos en un modelo de xenoinjerto de línea celular de melanoma mutante para BRAF<V600E>cuando se usó BVD-523 en combinación con inhibición de BRAF. Estos estudios sugieren que BVD-523 es prometedor como tratamiento para cánceres dependientes de ERK, incluyendo aquellos cuyos tumores tienen resistencia adquirida a otros tratamientos dirigidos a nodos aguas arriba de la ruta e MAPK.

[0517] Ejemplo 10

[0518] Descubrimiento y caracterización inicial de un inhibidor de ERK1/2 novedoso, BVD-523 (ulixertinib)Tras una extensa optimización de compuestos iniciales originalmente identificados usando exploración de moléculas pequeñas de alto rendimiento (Aronovet al. 2009), se identificó un inhibidor de ERK1/2 novedoso competitivo con trifosfato de adenosina (ATP), BVD-523 (ulixertinib) (figura 29 A). BVD-523 es un potente inhibidor de ERK con una Ki de 0,04 ± 0,02 nM frente a ERK2. Se mostró que era un inhibidor competitivo de ATP, reversible, dado que los valores de CI<50>para la inhibición de ERK2 aumentaron linealmente con una concentración de ATP creciente (figura 29B y figura 29C). La CI<50>permaneció casi constante durante tiempos de incubación ≥10 minutos, sugiriendo un rápido equilibrio y unión de BVD-523 con ERK2 (figura 29D). BVD-523 también es un inhibidor de unión estrecha de ERK1 recombinante (Rudolphet al.2015), mostrando una Kde <0,3 nM.

[0519] La unión de BVD-523 a ERK2 se demostró usando estudios calorimétricos y se comparó con datos generados usando los inhibidores de ERK SCH772984 y pirazolilpirrol (Arovovet al. 2007). Todos los compuestos se unieron a, y estabilizaron, ERK2 inactiva con concentración creciente, tal como se indica mediante valores de ΔTf positivos (figura 29E). El cambio de 10 a 15 grados en la ΔTf observado con BVD-523 y SCH-772984 es compatible con compuestos que tienen afinidades de unión nanomolares bajas (Fedorovet al.2012). BVD-523 demostró una fuerte afinidad de unión tanto a ERK2 activa fosforilada (pERK2) como a ERK2 inactiva (figura 29F). Se observó una afinidad más fuerte a pERK2 en comparación con ERK2 inactiva. BVD-523 no interaccionó con la proteína de control negativo p38 α MAP cinasa (figura 29F).

[0520] BVD-523 demostró una excelente selectividad de cinasa ERK1/2 basándose en exploraciones bioquímicas inversas frente a 75 cinasas además de ERK1 y ERK2. Las concentraciones de ATP fueron aproximadamente iguales a la Km en todos los ensayos. Las cinasas inhibidas en más del 50% mediante BVD-5232 μM volvieron a someterse a prueba para generar valores de Ki (o Ki aparente; tabla 21). Doce de las 14 cinasas tenían una Kde <1 μM. La selectividad de BVD-523 para ERK2 era >7000 veces para todas las cinasas sometidas a prueba excepto por ERK1, que se inhibió con una Ki de <0,3 nM (10 veces). Por tanto, BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2 altamente potente y selectivo. Tabla 21 - BVD-523 presenta selectividad para cinasas ERK1 y ERK2.

[0523]

[0525] Ejemplo 11

[0526] BVD-523 inhibe de manera preferible la proliferación celular y potencia la actividad caspasa 3/7 in vitro en líneas de células cancerosas con mutaciones activantes de la ruta de MAPK

[0527] Se evaluó la actividad celular de BVD-523 en un panel de aproximadamente 1.000 líneas de células cancerosas de diversos linajes y contextos genéticos (figura 30A y tabla 22). Se clasificaron las líneas celulares como de tipo natural (wt) o mutantes para MAPK dependiendo de la ausencia o presencia de mutaciones en miembros de la familia de RAS y BRAF. Aunque algunas líneas celulares wt para MAPK eran sensibles a BVD-523, generalmente BVD-523 inhibió la proliferación de manera preferible en células con alteraciones en la ruta de MAPK.

[0528] A continuación, se caracterizó el impacto sobre el crecimiento y la supervivencia del tratamiento con BVD-523 sobre células sensibles. Se realizó un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con línea celular de melanoma mutante para BRAF<V600E>, UACC-62, tras el tratamiento con BVD-523 a 500 nM o 2000 nM durante 24 horas. Se detuvieron las células tratadas en la fase G1 del ciclo celular de una manera dependiente de la concentración (figura 30B).

[0529] Además, se analizó la actividad caspasa 3/7 como medida de apoptosis en múltiples líneas de células cancerosas humanas. Se observó un aumento dependiente de la concentración y de la línea celular en la caspasa 3/7 tras el tratamiento con BVD-523 durante 72 horas (figura 30C). El tratamiento con BVD-523 dio como resultado una inducción de caspasa 3/7 pronunciada en un subconjunto de líneas celulares activadas por MAPK que albergaban una mutación de BRAF<V600>(A375, WM266, y LS411N). Esto es compatible con observaciones anteriores de inhibición preferible de la proliferación mediante BVD-523 en líneas de células cancerosas mutantes para la ruta de MAPK (figura 30A). Para caracterizar adicionalmente el mecanismo de acción y efectos sobre la señalización provocados por BVD-523, se evaluaron los niveles de diversas proteínas efectoras y relacionadas con MAPK en células de melanoma A375 mutantes para BRAF<V600E>tratadas con BVD-523 (figura 30D). Los niveles de fosfo-ERK1/2 aumentaron de una manera dependiente de la concentración después de 4 y 24 horas de tratamiento con BVD-523. A pesar de aumentos prominentes dependientes de la concentración en pERK1/2 observados con el tratamiento con BVD-523 2 μM, la fosforilación de la diana de ERK1/2, RSK1/2, se redujo tanto a las 4 como a las 24 horas, lo cual es compatible con una inhibición sostenida. Los niveles de proteína total de DUSP6, un marcador distal de actividad de ERK1/2, también se atenuaron a las 4 y 24 horas. Tras 24 horas de tratamiento con BVD-523, el marcador apoptótico BIM-EL aumentó de una manera dependiente de la dosis, mientras que la ciclina D-1 y pRB se atenuaron a 2 μM. Todos los efectos son compatibles con la inhibición de ERK1/2 específica.

[0530] Ejemplo 12

[0531] BVD-523 demuestra actividad antitumoral in vivo en modelos de xenoinjerto de línea de células cancerosas mutantes para BRAFV600E

[0532] Basándose en los presentes hallazgosin vitrode que BVD-523 reducía la proliferación e inducía la apoptosis de una manera dependiente de la concentración, se administraron dosis de BVD-523 mediante sonda nasogástrica para demostrar su actividad antitumoralin vivoen modelos con dependencia de la ruta de MAPK/ERK. Se usaron modelos de xenoinjerto de melanoma (línea celular A375) y cáncer colorrectal (línea celular Colo205), ambos de los cuales albergan una mutación de BRAF<V600E>.

[0533] En los xenoinjertos de línea celular A375, se comparó la eficacia de BVD-523 con el agente alquilante citotóxico de control, temozolomida, tras 14 días de tratamiento. BVD-523 demostró actividad antitumoral dependiente de la dosis significativa empezando a 50 mg/kg dos veces al día (BID) (figura 31A). Las dosis de 50 y 100 mg/kg BID atenuaron significativamente el crecimiento tumoral, con una inhibición del crecimiento tumoral (TGI) del 71% (P=0,004) y el 99% (P<0,001), respectivamente. Se observaron siete regresiones parciales (PR) en el grupo de 100 mg/kg BID; no se observó ninguna respuesta de regresión en ningún otro grupo. La eficacia observada se comparó de manera favorable con la de temozolomida, que, cuando se administró a 75 y 175 mg/kg, dio como resultado una TGI dependiente de la dosis moderada del 34% (P>0,05) y el 78% (P=0,005), respectivamente.

[0534] Adicionalmente, BVD-523 demostró eficacia antitumoral en un modelo de xenoinjerto de línea celular de cáncer colorrectal humana Colo205 (figura 31B). BVD-523 mostró de nuevo regresiones tumorales dependientes de la dosis significativas a dosis de 50, 75, y 100 mg/kg BID, proporcionando regresiones tumorales medias T/T(T = fin del tratamiento, T= inicio del tratamiento) de -48,2%, -77,2%, y -92,3%, respectivamente (todos P<0,0001). No se observó regresión a la dosis más baja de BVD-523 (25 mg/kg BID); sin embargo, se observó una inhibición del crecimiento tumoral significativa, con T/C (T = tratamiento, C = control) del 25,2% (P<0,0001). Aunque no se toleró bien, el agente quimioterápico de control positivo irinotecán (CPT-11) mostró actividad antitumoral significativa, inhibiendo el crecimiento tumoral de Colo205 con un T/C del 6,4% (P<0,0001). Sin embargo, incluso a su máxima dosis tolerada en ratones, CPT-11 no fue tan eficaz como BVD-523 a dosis de 50, 75 o 100 mg/kg BID.

[0535] Para establecer la relación entre farmacocinética y farmacodinamia, se compararon las concentraciones en plasma de BVD-523 con los niveles de pERK1/2 medidos en el tumor mediante inmunohistoquímica y espectrometría de masas de patrón interno marcado con isótopo a lo largo de un periodo de 24 horas tras una única dosis oral de 100 mg/kg de BVD-523 (figura 31C). La fosforilación de ERK1/2 fue baja en tumores no tratados (0 horas). Tras el tratamiento con BVD-523, la fosforilación de ERK1/2 aumentó de manera constante desde 1 hora tras la dosis hasta niveles máximos a las 8 horas tras la dosis, después volvió a niveles previos a la dosis a las 24 horas. Este aumento de pERK1/2 se correlacionó con concentraciones en plasma de fármaco BVD-523. La observaciónin vivode pERK1/2 aumentado con el tratamiento con BVD-523 es compatible con hallazgos anterioresin vitro(figura 30D).

[0536] Ejemplo 13

[0537] BVD-523 da como resultado inhibición de sustrato ERK1/2 a pesar de un aumento de fosforilación de ERK1/2Para examinar los efectos de BVD-523 sobre la señalización con respecto a otros inhibidores de ERK1/2 conocidos (SCH772984, GDC-0994, y Vx-11e) (Morriset al.2013 y Liuet al.2015), se empleó una matriz de proteínas de fase inversa (RPPA) a gran escala de aproximadamente 40 proteínas en una variedad de líneas celulares con sensibilidad a la inhibición de ERK. Se sometieron a ensayo líneas celulares con alteraciones comunes en BRAF y RAS: líneas mutantes para BRAF<V600E>A375, Colo205, y HT29; línea celular mutante para KRAS<G12C>MIAPACa-2; línea celular mutante para KRAS<G13D_>HCT116; y AN3Ca con mutación HRAS<F82L>atípica. Los cambios en los niveles de proteínas se muestran como un cambio en porcentaje con respecto al control parental tratado con dimetilsulfóxido (DMSO) (figura 32A y tabla 23). Todos los inhibidores de ERK provocaron efectos de proteínas cuantitativamente similares, con la excepción de la fosforilación de ERK1/2 (pERK1/2 [ERK1/2 -T202, -Y204]); SCH7722984 inhibió pERK1/2 en todas las líneas celulares, mientras que BVD-523, CDC-0994, y Vx-11e aumentaron de manera notable pERK1/2. Fosfo-p90 RSK (pRSK1) y ciclina D1, que son dianas proximal y distal de pERK1/2, respectivamente, se inhibieron de manera similar por todos los inhibidores sometidos a prueba independientemente del grado de fosforilación de ERK1/2 (figura 32B). Estos hallazgos independientes para BVD-523 son compatibles con estudios que muestran que la fosforilación de sustratos de ERK1/2, RSK1/2, permaneció sin inhibir a pesar de pERK1/2 drásticamente elevada mediante inmunotransferencias de tipo Western en células A375 (figura 32D), además de estudios de unión a proteína que demostraron la unión a BVD-523 y estabilización de pERK1/2 y ERK1/2 inactiva (figura 29E y figura 29F). Por tanto, puede considerarse que medir niveles de pERK1/2 aumentados es un biomarcador farmacodinámico clínico para BVD-523, mientras que cuantificar la inhibición de dianas de ERK1/2 tales como pRSK1 y DUSP6 también puede servir para un propósito similar.

[0538] Cambios de proteínas adicionales son notables en este conjunto de datos de RPPA (figura 32A). Proteína ribosómica pS6 reducida parece ser otro marcador farmacodinámico de la inhibición de ERK1/2, tal como se demuestra en todas las líneas celulares con todos los compuestos (figura 32B). Además, la inducción prominente de pAKT parece ser una observación dependiente de línea celular, en la que cada inhibidor de ERK1/2 indujo PAKT en líneas celulares A375 y células AN3CA (figura 33). De manera interesante, el grado de inhibición del marcador de supervivencia pBAD parece diferir entre compuestos, con tan solo una inhibición moderada de pBAD por GDC-0994 en comparación con los otros inhibidores de ERK1/2 sometidos a prueba (figura 32A).

[0539] A continuación, se investigó cómo BVD-523 afecta a la localización celular de ERK1/2 y la diana aguas abajo pRSK en una línea celular colorrectal RKO mutante para BRAF<V600E>(figura 32C). En células en reposo, ERK1/2 se localiza en el citoplasma, y una vez estimulado pERK1/2 migra a orgánulos diana, particularmente al núcleo en el que se activan dianas transcripcionales (Wainsteinet al. 2016). En células de control tratadas con DMSO, pERK1/2 resulta evidente en fracciones tanto nuclear como citoplasmática, lo cual refleja probablemente la actividad de la ruta de MAPK debido a la presencia de BRAF<V600E>en esta línea celular. El tratamiento con BVD-523 dio como resultado pERK1/2 elevada en el núcleo y el citoplasma así como un aumento moderado de la ERK1/2 total nuclear en comparación con células tratadas con DMSO, lo que sugiere que la estabilización inducida por compuesto de pERK1/2 estimula algo de translocación nuclear. A pesar de la pERK1/2 aumentada en ambos compartimentos, los niveles de pRSK son inferiores en los compartimentos citoplasmático y nuclear en comparación con el control de DMSO. Los inhibidores de la señalización de MAPK de comparación (es decir, trametinib, SCH7722984, dabrafenib) inhibieron la fosforilación de ERK1/2 y RSK, tal como se refleja mediante niveles inferiores en los compartimentos nuclear y citoplasmático. Estos datos sugieren de nuevo que los aumentos de pERK1/2 asociados con BVD-523 son evidentes tanto en el citoplasma como en el núcleo; sin embargo, esto no se traduce en una activación de sustratos diana. Esto es compatible con datos presentados en la figura 30D y la figura 32A.

[0540] Ejemplo 14

[0541] BVD-523 mostró actividad en modelos in vitro de resistencia frente a inhibidores de BRAF y MEK

[0542] La aparición de resistencia frente a inhibidores de BRAF y MEK limita su eficacia clínica. En este caso, los experimentos buscaron modelizar y comparar el desarrollo de resistencia a la inhibición de BRAF (dabrafenib), MEK (trametinib), y ERK1/2 (BVD-523)in vitro. A lo largo de varios meses, se cultivaron células A375 mutantes para BRAF<V600E>en concentraciones progresivamente crecientes de cada inhibidor. Ya se obtuvieron líneas celulares A375 resistentes a fármaco tras el crecimiento en altas concentraciones de trametinib o dabrafenib, mientras que desarrollar líneas celulares con resistencia a BVD-523 resultó ser difícil (figura 34A). En conjunto, estos datosin vitrosugieren que, a concentraciones que proporcionan una inhibición de diana similar, la resistencia a BVD-523 se retarda en comparación con dabrafenib o trametinib, y puede traducirse en respuestas duraderas en la clínica.

[0543] La reactivación y dependencia de la señalización de ERK1/2 es una característica común de la resistencia adquirida a la inhibición de BRAF/MEK (Morriset al.2013 y Hatzivassiliouet al.2012); por tanto, se evaluó la actividad de BVD523 en modelosin vitrode resistencia adquirida. En primer lugar, se obtuvo una población A375 resistente a la combinación de dabrafenib y trametinib usando el método de concentración aumentada descrito. La CI<50>y el cambio en veces de CI<50>con respecto a A375 parental para dabrafenib, trametinib, y BVD-523 en la población resistente a la combinación de BRAF/MEK se muestran en la tabla 24. La CI<50>de BVD-523 se desplazó de manera moderada (2,5 veces), mientras que dabrafenib y trametinib se desplazaron más significativamente (8,5 veces y 13,5 veces, respectivamente) (tabla 24). Se sometió a prueba el agente citotóxico paclitaxel como control observándose tan solo un desplazamiento moderado de la potencia. Estos datos respaldan la investigación de BVD-523 en el contexto de resistencia a la terapia contra BRAF/MEK, aunque queda por caracterizar el mecanismo de resistencia en esta población celular.

[0545] Tabla 24 - Actividad de BVD-523 en modelos de inhibición de BRAF/MEK

[0548]

[0551] Para investigar adicionalmente la trazabilidad de la inhibición de ERK1/2 en un modelo con un mecanismo conocido de resistencia a inhibidor de BRAF, se usó direccionamiento génico mediado por VAA para generar un par de líneas celulares RKO mutantes para BRAF<V600E>isogénicas para la presencia o ausencia de una inserción heterocigótica diseñada por ingeniería de mutación de activante MEK1<Q56P>(Trunzeret al.2013 y Emeryet al.2009). Las mutaciones de MEK1/2, incluyendo MEK1<Q56P_>, se han implicado en resistencia adquirida a terapia tanto contra BRAF de agente único como contra BRAF/MEK de combinación en pacientes (Wagleet al.2011, Wagleet al.2014, Emeryet al.2009 y Johnsonet al.2015). Ensayos de agentes únicos demostraron que, con respecto a las células BRAF<V600E>::MEK1<wt>parentales, las células mutantes dobles BRAF<V600E>::MEK1<Q56P>presentaron una sensibilidad notablemente reducida a los inhibidores de BRAF vemurafenib y dabrafenib y al inhibidor de MEK trametinib (figura 34B). En cambio, la respuesta a BVD-523 fue esencialmente idéntica en las células tanto parentales como mutantes para MEK<Q56P>, indicando que BVD-523 no es sensible a este mecanismo de resistencia adquirida. Estos resultados se confirmaron en 2 clones de línea celular mutante doble BRAF<V600E>::MEK1<Q56P>derivados de manera independiente, validando por tanto que los resultados estaban específicamente relacionados con la presencia de la mutación MEK1<Q56P>en vez de un artefacto clonal no relacionado (datos no mostrados). También se observaron resultados similares con un segundo inhibidor mecanísticamente distinto de ERK1/2 (SCH772984), respaldando la expectativa de que estas observaciones están específicamente relacionadas con la inhibición mecanística de ERK1/2 y no se deben a un efecto de compuesto inespecífico.

[0553] Para caracterizar adicionalmente los efectos mecanísticos de BVD-523 sobre la señalización de la ruta de MAPK en líneas celulares BRAF<V600E>::MEK1<Q56P>, se evaluaron los niveles de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 34C). En las células RKO BRAF<V600E>parentales, se observó un nivel reducido de pRSK1/2 tras un tratamiento de 4 horas con inhibidores de BRAF (vemurafenib), MEK (trametinib), o ERK1/2 (BVD-523) a concentraciones farmacológicamente activas. En cambio, las células mutantes dobles BRAF<V600E>::MEK1<Q56P>isogénicas no mostraron una fosforilación de RSK reducida tras el tratamiento con inhibidor de BRAF o MEK, mientras que BVD-523 siguió siendo eficaz en la inhibición de pRSK1/2 hasta un nivel comparable con RKO parentales. De manera similar, se reduce pRB, indicando parada de G0/G1, mediante 24 horas de tratamiento con BVD-523 tanto en RKO parentales como en BRAF<V600E>::MEK1<Q56P>.

[0555] Las mutaciones de KRAS adquiridas también son factores de impulsión conocidos de resistencia a inhibidores de la ruta de MAPK. Para entender la sensibilidad de BVD-523 a este mecanismo de resistencia, se usó un panel isogénico de mutaciones de KRAS clínicamente relevantes en la línea celular colorrectal SW48. Se comparó la sensibilidad a BVD-523 con los inhibidores de MEK selumetinib y trametinib (figura 34D). La sensibilidad a paclitaxel no se vio alterada (figura 37A). Aunque varios alelos de KRAS mutantes confirieron niveles de robustos a intermedios de resistencia a la inhibición de MEK, la sensibilidad a BVD-523 no se vio alterada por la mayoría de los alelos, y cuando se observó un desplazamiento en la sensibilidad, no llegó hasta el grado observado con trametinib o selumetinib. En conjunto, estos datos sugieren que BVD-523 es más eficaz en este contexto que los inhibidores de MEK.

[0557] Ejemplo 15

[0559] BVD-523 demuestra actividad in vivo en un modelo de xenoinjerto de melanoma derivado de paciente resistente a inhibidor de BRAF

[0561] Para confirmar y extender los efectos antitumorales de BVD-523 observados en modelosin vitrode resistencia adquirida de BRAF/MEK, se usó un modelo de xenoinjerto resistente a BRAF derivado de un paciente con resistencia a vemurafenib. Se administró BVD-523 mediante sonda nasogástrica a 100 mg/kg BID durante 28 días, tanto solo como en combinación con dabrafenib a 50 mg/kg BID (figura 35). Tal como se esperaba, se demostró una actividad antitumoral mínima para dabrafenib como agente único (22% de TGI). La actividad de BVD-523 fue significativa en comparación con control de vehículo (P≤0,05), con una TGI del 78%. En este modelo, combinar BVD-523 con dabrafenib dio como resultado una TGI del 76% (P≤0,05); por tanto, no se obtuvo un beneficio adicional para la combinación en comparación con BVD-523 como agente único en este modelo de resistencia adquirida de BRAF.

[0562] Ejemplo 16

[0563] La terapia de combinación con BVD-523 y un inhibidor de BRAF proporciona actividad antitumoral prometedora

[0564] Los pacientes con cáncer mutante para BRAF pueden adquirir resistencia a la terapia contra BRAF/MEK combinada (Wagleet al.2014), justificando la consideración de otros enfoques de combinación dentro de la ruta de MAPK. Se evaluaron los efectos anti-proliferativos de combinar BVD-523 con el inhibidor de BRAF vemurafenib en la línea celular de melanoma G-361 mutante para BRAF<V600E>. Tal como se preveía, los agentes únicos BVD-523 y vemurafenib fueron ambos activos, y se observó una sinergia moderada cuando se combinaron (figura 37B). Esto indica que BVD-523 en combinación con inhibidores de BRAF son al menos aditivos y posiblemente sinérgicos en líneas celulares de melanoma que portan una mutación de BRAF<V600E>. Además, generar resistencia adquiridain vitrotras el cultivo continuo de línea celular mutante para BRAF<V600E>(A375) en inhibidor de BRAF más BVD-523 resultó difícil. En cambio, la generación de resistencia a dabrafenib solo se produjo de manera relativamente rápida (figura 37C). Incluso la resistencia a dabrafenib y trametinib combinados surgió antes que dabrafenib más trametinib.

[0565] El beneficio de la inhibición de BRAF y ERK combinada puede no obtenerse completamente en estudios de combinaciónin vitroen los que las concentraciones no están limitadas por la tolerabilidad. Para entender el beneficio de la combinación, se evaluó la eficaciain vivousando xenoinjertos de la línea celular de melanoma humano A375 mutante para BRAF<V600E>. Debido a la respuesta notable al tratamiento de combinación, la dosificación en los grupos de combinación se detuvo en el día 20 para monitorizar el nuevo crecimiento tumor, y se reinició en el día 42 (figura 36A). Se midieron los tumores dos veces por semana hasta que se terminó el estudio en el día 45. La mediana del tiempo hasta el punto final (TTE) para controles fue de 9,2 días, y el retardo de crecimiento tumoral (TGD) máximo posible de 35,8 días se definió como el 100%. El tratamiento con temozolomida dio como resultado un TGD de 1,3 días (4%) y sin regresiones. Las monoterapias con dabrafenib 50 y 100 mg/kg produjeron TGD de 6,9 días (19%) y 19,3 días (54%), respectivamente, un beneficio de supervivencia significativo (P<0,001), y 1 PR en el grupo de 100 mg/kg. La monoterapia con BVD-523 100 mg/kg dio como resultado un a TGD de 9,3 días (26%), un beneficio de supervivencia significativo (P<0,001), y 2 respuestas completas duraderas. Las combinaciones de dabrafenib con BVD-523 produjeron, cada una, el máximo posible del 100% de TGD con respuestas de regresión notables, y supervivencia global estadísticamente superior en comparación con sus monoterapias correspondientes (P<0,001). La combinación de dosis más baja produjo de manera notable 7/15 supervivientes libres de tumor (TFS), y las 3 combinaciones de dosificación superior produjeron un total de 43/44 TFS, de manera compatible con actividad curativa o casi curativa (figura 36B). En resumen, la combinación de dabrafenib con BVD-523 produjo un mayor número de TFS y una eficacia superior a cualquier agente único.

[0566] Basándose en la actividad de BVD-523 más dabrafenib en modelos de xenoinjerto A375 con un volumen tumoral inicial de aproximadamente 75-144 mm<3>, se llevó a cabo un experimento de seguimiento para determinar la eficacia de la terapia de combinación en xenoinjertos A375 “en estadio superior” (volumen tumoral inicial promedio, 700-800 mm<3>) (figura 36C). La mediana de TTE para controles fue de 6,2 días, estableciendo un TGD máximo posible de 53,8 días, lo cual se definió como el 100% de TGD para el estudio de 60 días. La monoterapia con BVD-523100 mg/kg produjo un TGD despreciable (0,7 días, 1%) y ninguna diferencia de supervivencia significativa con respecto a controles (P>0,05). La distribución de TTE y 2 PR sugirieron que puede haber habido un subconjunto de respondedores al tratamiento con BVD-523 solo. La monoterapia con dabrafenib 50 mg/kg fue eficaz, proporcionó un TGD de 46,2 días (86%) y un beneficio de supervivencia significativo en comparación con controles (P<0,001). Este grupo tuvo 5 PR y 5 CR, incluyendo 3 TFS, entre los 11 ratones evaluables (figura 36D). Ambas combinaciones de dabrafenib con BVD-523 produjeron el máximo del 100% de TGD y un beneficio de supervivencia significativo en comparación con controles (P<0,001). Cada combinación produjo el 100% de respuestas de regresión entre ratones evaluables, aunque hubo distinciones en cuanto a la actividad de regresión. La combinación de dabrafenib 25 mg/kg y BVD-52350 mg/kg tuvo 2 PR y 8 CR, con 6/10 TFS, mientras que la combinación de dabrafenib 50 mg/kg y BVD-523100 mg/kg tuvo 11/11 TFS en el día 60 (figura 36D). En conjunto, estos datos respaldan el fundamento para la combinación de primera línea de BVD-523 con terapia dirigida contra BRAF en melanoma mutante para BRAF<V600>, y es probable que esto se extienda a otros tipos de tumor que albergan esta alteración.

[0567] Discusión

[0568] BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2 potente, altamente selectivo, reversible, competitivo con ATP de molécula pequeña con actividad en modelos de cáncerin vivoein vitro.In vitro, BVD-523 demostró inhibición frente a varias líneas celulares de tumor humanas, particularmente las que albergan mutaciones activantes en la ruta de señalización de MAPK, de manera compatible con su mecanismo de acción. BVD-523 provocó cambios en proteínas diana y efectoras aguas abajo, incluyendo inhibición de niveles de sustrato directo de ERK1/2, pRSK, y de proteína DUSP6 total. Estos hallazgos concuerdan con los de estudios anteriores de otros inhibidores de ERK1/2, que demostraron supresión eficaz de pRSK con inhibición de ERK1/2 (Morriset al. 2013 y Hatzivassiliouet al. 2012). De manera interesante, el tratamiento con BVD-523 dio como resultado un aumento notable de la fosforilación de ERK1/2in vitroein vivo. De manera similar a los presentes hallazgos, se ha notificado un aumento de pERK1/2 con el inhibidor de ERK1/2 Vx11e; a la inversa, se produce inhibición de pERK1/2 con SCH772984 (Morriset al. 2013). Aunque se observaron diferencias en los niveles de pERK1/2 entre los diversos inhibidores de ERK1/2 sometidos a prueba, los efectores aguas abajo (es decir, pRSK1 y DUSP6 total) se inhibieron de manera similar. Estos hallazgos sugieren que cuantificar sustratos diana de ERK1/2, tales como pRSK1, puede servir como biomarcadores farmacodinámicos fiables para la inhibición mediada por BVD-523 de la actividad de ERK1/2.

[0570] Aunque los inhibidores de BRAF (dabrafenib, vemurafenib) y MEK (trametinib, cobimetinib) validan la ruta de MAPK como diana terapéutica, particularmente en pacientes con mutaciones BRAF<V600>, la respuesta antitumoral está limitada por la aparición de resistencia adquirida y posterior progresión de la enfermedad. Se ha atribuido la resistencia a la regulación por incremento y activación de moléculas de señalización compensatorias (Nazarianet al.2010, Villanuevaet al.2010, Johannessenet al.2010 y Wanget al.2011), amplificación de los genes diana (Corcoranet al.2010), y mutaciones activantes de componentes de la ruta (por ejemplo, RAS, MEK) (Wagleet al.2011, Emeryet al.2009 y Wanget al.2011). La reactivación de la ruta de ERK1/2 es una consecuencia común del mecanismo de resistencia adquirida. Cuando se introdujo en la línea celular de melanoma A375 mutante para BRAF<V600E>, MEK<Q56P>confirió resistencia a la inhibición de MEK y BRAF (Wagleet al.2011). En cambio, BVD-523 conservó su potente actividad inhibidora en la línea celular MEK<Q56P>modificada por ingeniería, indicando que la inhibición de ERK1/2 es eficaz en el contexto de alteraciones activantes aguas arriba que pueden surgir en respuesta al tratamiento contra BRAF/MEK. Como evidencia adicional de una función para BVD-523 en el contexto de resistencia adquirida, la eficacia de BVD-523 resultó evidente en un modelo de xenoinjerto derivado a partir de una muestra de tumor de un paciente cuya enfermedad progresó con vemurafenib; el inhibidor de BRAF dabrafenib no fue eficaz en este modelo. Estos datos respaldan una función para seleccionar como diana ERK1/2 en el contexto de resistencia de BRAF/MEK, y complementan hallazgos anteriormente publicados (Morriset al.2013 y Hatzivassiliouet al.2012). Para caracterizar adicionalmente la resistencia a inhibidores de la ruta de MAPK, se investigó la propia aparición de resistencia a BVD-523. Se encontró que el tratamiento como agente único de células cancerosas con BVD-523 era duradero y era más difícil que desarrollara resistencia en comparación con otros agentes que seleccionan como diana componentes de señalización de MAPK aguas arriba (es decir, dabrafenib, trametinib). Esto puede sugerir que adquirir resistencia a agentes de direccionamiento a ERK1/2 es más difícil que adquirir resistencia a la terapia contra BRAF o MEK, posiblemente debido al hecho de que BVD-523 selecciona de manera preferible como diana la conformación activa más conservada del sitio de unión a ATP. Sin embargo, estudiosin vitrocon otros inhibidores de ERK1/2 han identificado mutantes específicos en ERK1/2 que impulsan la resistencia (Jhaet al.2016 y Goetzet al.2014); estas mutaciones específicas aún no se han identificado en muestras clínicas de pacientes con recidiva tras inhibidor de ERK1/2.

[0572] El posible beneficio clínico de la inhibición de ERK1/2 con BVD-523 se extiende más allá del contexto de pacientes resistentes a terapia contra BRAF/MEK. Dado que ERK1/2 es un nodo maestro aguas abajo dentro de esta ruta de MAPK, su inhibición resulta atractiva en numerosos contextos de cáncer en los que el crecimiento tumoral depende de la señalización de MAPK. Aproximadamente el 30% de todos los cánceres albergan mutaciones de RAS; por tanto, seleccionar como diana ERK1/2 aguas abajo con BVD-523 es un enfoque de tratamiento racional para estos cánceres. Además, resultados de un estudio de Hayeset al. indican que la inhibición de ERK1/2 prolongada en cáncer pancreático mutante para KRAS está asociada con supresión del crecimiento de tipo senescente (Hayeset al.2016). Sin embargo, puede requerirse un enfoque de combinación para una atenuación máxima y duradera de la señalización de MAPK en el contexto de mutaciones de RAS. Por ejemplo, la inhibición de MEK en célula de cáncer colorrectal mutante para KRAS da como resultado una respuesta adaptativa de activación de la familia de ErbB, lo cual amortigua la respuesta a la inhibición de MEK (Sunet al. 2014). Pueden producirse respuestas adaptativas específicas de contexto similar tras la inhibición de ERK1/2 con BVD-523. Las combinaciones de tratamiento óptimas para diversos perfiles genéticos e histologías de cáncer son objeto de investigación en curso. Además de mutaciones de BRAF<V600>y RAS, están surgiendo otras alteraciones que impulsan MAPK. Por ejemplo, fusiones de RAF novedosas y mutaciones de BRAF distintas de V600 atípicas que fomentan la dimerización de RAF activan la ruta de MAPK (Yaoet al. 2015). Se ha mostrado que inhibidores de BRAF tales como vemurafenib y dabrafenib que inhiben proteínas monoméricas mutantes para BRAF<V600>son inactivos en alteraciones de RAF atípicas que impulsan la señalización de MAPK de una manera dependiente de la dimerización (Yaoet al.2015). Sin embargo, el tratamiento con BVD-523 para seleccionar como diana ERK1/2 aguas abajo en estos tumores puede ser un enfoque novedoso para abordar esta necesidad médica no cubierta.

[0574] En el contexto de tumores de melanoma mutantes para BRAF<V600>, la inhibición de BRAF y MEK combinada muestra a modo de ejemplo cómo agentes que seleccionan como diana diferentes nodos de la misma ruta pueden mejorar la duración y respuesta al tratamiento. Los presentes estudios de combinación en xenoinjertos mutantes para BRAF<V600E>de línea celular de melanoma humano A375 proporcionan soporte para la terapia de combinación con BVD-523 e inhibidores de BRAF. La combinación demostró un beneficio superior con respecto a tratamientos como agentes únicos, incluyendo resultados compatibles con respuestas curativas. Queda por determinar la eficacia clínica y tolerabilidad de terapia de BRAF/BVD-523 combinada. Sería razonable esperar que una combinación de BRAF/ERK1/2 tenga una eficacia al menos comparable a una combinación de BRAF/MEK dirigida. Además, la observaciónin vitrode que la resistencia adquirida a BVD-523 es más difícil de lograr en comparación con otros inhibidores de la ruta de MAPK sugiere que la combinación de inhibidores de BRAF/BVD-523 tiene potencial para proporcionar una respuesta más duradera.

[0575] También se ha realizado un avance significativo usando inmunoterapia para melanoma. La FDA de los EE. UU. ha aprobado diversos inhibidores de punto de control inmunitario para el tratamiento de melanoma avanzado, incluyendo el agente dirigido a antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos, ipilimumab, y los inhibidores de muerte programada 1, pembrolizumab y nivolumab. Combinar BVD-523 con tales inmunoterapias es una opción terapéutica atractiva; está justificada una investigación adicional para explorar calendarios de dosificación y evaluar si puede lograrse una respuesta sinérgica.

[0576] Basándose en los datos preclínicos, BVD-523 puede resultar prometedor para el tratamiento de pacientes con tumores malignos dependientes de la señalización de MAPK, incluyendo los tumores que tienen resistencia adquirida a otros tratamientos. A continuación se describe el desarrollo clínico de BVD-523. Véanse los ejemplos 17-24.

[0577] Ejemplo 17

[0578] Estudio de aumento de la dosis de fase I del inhibidor de cinasa ERK1/2 oral novedoso, primero en su clase, BVD-523 (ulixertinib) en pacientes con tumores sólidos avanzados

[0579] La presente invención describe el primer estudio de aumento de la dosis en seres humanos de un inhibidor de ERK1/2 para el tratamiento de pacientes con tumores sólidos avanzados. BVD-523 tiene un perfil de seguridad aceptable con farmacocinética favorable y evidencias tempranas de actividad clínica.

[0580] La señalización de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) mediante la cascada de RAS-RAF-MEK-ERK desempeña una función crítica en la oncogénesis; atrayendo por tanto interés significativo como diana terapéutica. Esta ruta ubicua está compuesta por RAS aguas arriba de una cascada de las proteínas cinasas RAF, MEK1/2, y ERK1/2. RAS se activa mediante unión a GTP, lo que a su vez da como resultado la activación de cada proteína cinasa de manera secuencial. Aunque parecen ser los únicos sustratos fisiológicos para MEK1/2, ERK1/2 tienen muchas dianas en el citoplasma y el núcleo, incluyendo los factores de transcripción Elk1, c-Fos, p53, Ets1/2, y c-Jun (Shaulet al. 2007). La activación de ERK1/2 y la actividad cinasa influye en la proliferación celular, diferenciación y supervivencia mediante una variedad de mecanismos (Rasolaet al.2010), incluyendo la activación de los miembros de la familia de la cinasa S6 ribosómica (RSK) (Romeoet al.2012).

[0581] La activación constitutiva, aberrante, de la ruta de señalización de RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2 se ha identificado e implicado en el desarrollo o mantenimiento de muchos cánceres (Schubbertet al. 2007 y Gollobet al. 2006). Mutaciones en genes de la familia de RAS, tales como KRAS, NRAS, y HRAS, son los más comunes, produciéndose mutaciones de RAS activantes en ≈30% de los cánceres humanos (Schubbertet al.2007). Las mutaciones de KRAS son prevalentes en cánceres pancreático (>90%) (Kandaet al.2012), del tracto biliar (3%-50%) (Hezelet al. 2014), colorrectal (30%-50%) (Arringtonet al. 2012), de pulmón (27%) (Pennycuicket al. 2012), de ovarios (15%-39%) (Dobrzyckaet al. 2009), y endometrial endometrioide (18%) (O’Hara y Bell 2012); las mutaciones de NRAS son prevalentes en melanoma (20%) (Khattaket al.2013) y leucemia mieloide (8%-13%) (Yohe 2015); y las mutaciones de HRAS son prevalentes en cáncer de vejiga (12%) (Fernández-Medarde y Santos 2011). Las mutaciones en genes de la familia de RAF, lo más notablemente BRAF, son frecuentes, particularmente en melanoma. Se han identificado mutaciones de BRAF en el 66% de los melanomas malignos y en ~7% de una amplia gama de otros cánceres (Davieset al.2002), mientras que las mutaciones de MEK son menos frecuentes, produciéndose con una frecuencia global del 8% en melanomas (Nikolaevet al.2012). En cambio, mutaciones de ERK que dan como resultado tumorigénesis solo se han notificado con poca frecuencia hasta la fecha (Deschenes-Simardet al.2014).

[0582] La Food and Drug Administration (FDA) de los EE. UU. ha aprobado dos inhibidores de BRAF selectivos, vemurafenib y dabrafenib, como monoterapias para pacientes con melanoma metastásico mutante para BRAF<V600>(Taflinar [prospecto] y Zelboraf [prospecto]). Aunque las tasas de respuesta para estas terapias dirigidas pueden ser de hasta el 50% en pacientes con mutaciones BRAF<V600>, con frecuencia la duración de respuesta se mide en meses, no años (Hauschildet al. 2012 y McArthuret al. 2014). El inhibidor de MEK1/2 trametinib también está aprobado como monoterapia en este contexto (Mekinist [prospecto]), pero se usa más habitualmente en combinación con el inhibidor de BRAF dabrafenib. El uso de primera línea de trametinib administrado en combinación con dabrafenib ofrece una mejora incluso mayor en la supervivencia global en comparación con la monoterapia con vemurafenib sin aumento de toxicidad global (Robertet al. 2015), destacando la posible utilidad de seleccionar simultáneamente como diana múltiples proteínas de esta ruta de señalización de MAPK. Esta combinación terapéutica también estaba asociada con una incidencia menor de exantema asociado con inhibidor de MEK y lesiones cutáneas hiperproliferativas inducidas por inhibidor de BRAF en comparación con cada agente único por sí solo (Flahertyet al. 2012). Recientemente, un ensayo de fase Ill también demostró mejoras significativas en la supervivencia global (25,1 frente a 18,7 meses, razón de riesgos [HR] de 0,71, P=0,0107), supervivencia libre de progresión (PFS) (11,0 frente a 8,8 meses, HR de 0,67, P=0,0004), y respuesta global (el 69% frente al 53%; P=0,0014) con dabrafenib más trametinib frente a dabrafenib solo en pacientes con melanoma positivo para mutación de BRAF<V600E/K>(Longet al.2015). De manera similar, se han demostrado mejoras significativas en la PFS (9,9 frente a 6,2 meses, HR de 0,51, P<0,001) y la tasa de respuesta completa (CR) o respuesta parcial (PR) (el 68% frente al 45%; P<0,001) con la combinación de cobimetinib más vemurafenib en comparación con vemurafenib solo (Larkinet al. 2014). Para ello, recientemente se concedió la aprobación de la FDA para la combinación de vemurafenib y cobemetinib para melanoma con mutación de BRAF<V600E/K>. Basándose en estos hallazgos y otros relacionados, la combinación de un inhibidor de BRAF más un inhibidor de MEK se ha convertido en una opción de tratamiento dirigido convencional para pacientes con melanoma metastásico que contiene mutaciones BRAF<V600E/K>.

[0583] Aunque se ha demostrado que la terapia de combinación dirigida a BRAF/MEK proporciona beneficio adicional significativo más allá de opciones como agentes únicos, la mayoría de los pacientes finalmente desarrollan resistencia y progresión de la enfermedad después de ~12 meses (Robertet al.2015, Flahertyet al.2012 y Longet al.2015). Se han identificado varios mecanismos de resistencia adquirida tras terapias o bien de agente único o bien de combinación, incluyendo la generación de variantes de corte y empalme de BRAF, amplificación de BRAF, desarrollo de mutaciones de NRAS o MEK, y regulación por incremento de rutas de derivación (Poulikakoset al.2011, Corcoranet al. 2010, Nazarianet al. 2010, Shiet al. 2014, Johannessenet al. 2010, Wagleet al. 2011, Wagleet al.2014 y Ahronianet al. 2015). Resulta fundamental para muchos de estos mecanismos de resistencia la reactivación de la señalización de ERK, lo cual permite la rápida recuperación de la señalización de la ruta de MAPK y el escape de células tumorales de terapias con inhibidores de BRAF como agentes únicos o de BRAF/MEK en combinación (Paraisoet al. 2010). La inhibición de ERK puede proporcionar la oportunidad de evitar o superar la resistencia a partir de mecanismos aguas arriba, dado que es la cinasa maestra más distal de esta ruta de señalización de MAPK. Esto está respaldado por evidencias preclínicas de que la inhibición de ERK por inhibidores de molécula pequeña actuaba tanto para inhibir la aparición de resistencia como para superar la resistencia adquirida a inhibidores de BRAF y MEK (Morriset al.2013 y Hatzivassiliouet al.2012).

[0584] BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2 altamente potente, selectivo, reversible, competitivo con ATP, que se ha mostrado que reduce el crecimiento tumoral e induce la regresión tumoral en modelos de xenoinjerto mutante para BRAF y RAS. Además, BVD-523 como agente único inhibió modelos de xenoinjerto humano que presentaban resistencia cruzada a inhibidores tanto de BRAF como de MEK. Véanse los ejemplos 9-16. Por tanto, se emprendió un primer estudio en seres humanos abierto (identificador de Clinicaltrials.gov, NCT01781429) de BVD-523 oral para identificar tanto la dosis máxima tolerada como la dosis recomendada para su estudio adicional. El presente estudio también tenía como objetivo evaluar propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas así como eficacia preliminar en pacientes con cánceres avanzados.

[0585] Ejemplo 18

[0586] Características de pacientes

[0587] Se incluyó un total de 27 pacientes y recibieron al menos una dosis de fármaco del estudio desde el 4 de abril de 2013 hasta el 1 de diciembre de 2015. En la tabla 25 se muestran datos demográficos y características de enfermedad de nivel inicial. La mediana de la edad de pacientes era de 61 años (intervalo, 33-86 años). El cincuenta y dos por ciento (14/27) de los pacientes eran hombres y el 63% (17/27) tenían un estado funcional del Grupo Oncológico Cooperativo de la Costa Este (ECOG) de 1. El melanoma fue el cáncer más común (30%; mutación de BRAF presente en 7/8 de estos pacientes). Los pacientes restantes tenían cáncer colorrectal (19%; 5/27), de tiroides papilar (15%; 4/27), o de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (7%; 2/27), y el 8 (30%) se clasificaron como que tenían otros cánceres (2 pancreático, 1 apendicular, 1 de células germinales no seminomatosas, 1 de ovarios y 3 con tumor primario desconocido). La mayoría de los pacientes habían recibido 2 o más líneas previas de terapia sistémica, recibiendo el 41% (11/27) de 2 a 3 y recibiendo el 48% (13/27) >3 líneas previas de terapia sistémica.

[0588] Tabla 25 - Datos demográficos y características clínicas de nivel inicial de los pacientes

[0591]

[0592] Otra<d>7 (26)

[0593] Desconocida 4 (15)

[0594] Número de pautas anticancerosas sistémicas previas, n (%)

[0596] 0 1 4

[0599]

[0601] <a>Siete eran mutantes para BRAF y 1 era desconocido.

[0603] Dos pancreáticos, 1 apendicular, 1 de células germinales no seminomatosas, 1 de ovarios, 3 de tumor primario desconocido.

[0605] <c>Los pacientes pueden tener más de 1 anomalía molecular.

[0607] <d>Otras anomalías moleculares incluyeron ERCC1, RRM1, timidilato sintetasa, GNAS, MEK1, TP53, CREBBP, ROS1, PTEN, AKT3, y PIK3CA.

[0609] <e>Algunos pacientes se trataron con más de un inhibidor de BRAF.

[0610] Abreviatura: ECOG, Grupo Oncológico Cooperativo de la Costa Este.

[0611] Ejemplo 19

[0612] Efectos ex vivo de BVD-523 sobre la fosforilación de RSK1/2

[0613] Se desarrolló un ensayo de biomarcadorex vivoque podía usarse para respaldar estudios clínicos para demostrar los efectos inhibidores de BVD-523 sobre la actividad de ERK. El ensayo extiende datos celulares preclínicos en los que se ha mostrado que inhibidores de señalización de MAPK, tales como BVD-523, dabrafenib, trametinib, y vemurafenib, inhiben la fosforilación de RSK en función de la concentración de inhibidor en líneas de células cancerosas mutantes para BRAF. Véanse los ejemplos 9-16. Específicamente, la inhibición dependiente de inhibidor de ERK de la fosforilación estimulada por 12-miristato y 13-acetato de forbol (PMA) del sustrato de ERK, RSK1, en sangre completa se usó como marcador diana. Cuando se añadió BVD-523 directamente a sangre completa de voluntarios sanos, la fosforilación de RSK estimulada por PMA disminuyó con concentraciones crecientes de BVD-523 (figura 38). La CI<50>media para los datos acumulativos fue de 461 ± 20 nM para BVD-523, con una inhibición máxima del 75,8 ± 2,7% con BVD-52310 μM. La inhibición máxima se definió como la fosforilación de RSK medida en presencia de BVD-52310 μM. Muestras de sangre completa derivadas de pacientes, extraídas justo antes de la dosificación o en puntos de tiempo definidos tras la dosificación con BVD-523, se trataron de manera similar y se cuantificaron los niveles de fosforilación de RSK.

[0614] Ejemplo 20

[0615] Aumento de la dosis, toxicidades limitantes de la dosis (DLT), dosis máxima tolerada (MTD), y dosis de fase II recomendada (RP2D)

[0616] Según el protocolo, 5 cohortes de pacientes individuales (desde 10 hasta 150 mg dos veces al día [BID]) procedieron sin evidencias de DLT. La cohorte de 300 mg BID se expandió para caracterizar más completamente las exposiciones a BVD-523. Uno de 6 pacientes a los que se les administraron 600 mg BID experimentó una DLT de exantema de grado 3. La dosis de 900 mg BID superó la MTD, experimentando un paciente prurito de grado 3 y aspartato aminotransferasa (AST) elevada y experimentando otro paciente diarrea de grado 3, vómitos, deshidratación y creatinina elevada (tabla 26). La siguiente dosis intermedia de 750 mg BID también superó la MTD, con DLT de exantema de grado 3 y diarrea de grado 2 en 1 paciente e hipotensión de grado 2, creatinina elevada, y anemia en otro paciente. Por tanto, se determinó que la MTD y la RP2D eran de 600 mg BID.

[0617] Tabla 26 - Toxicidades limitantes de la dosis en el ciclo 1 (21 días)

[0620]

[0621]

[0623] <a>Dosis intermedia.

[0624] Abreviaturas: AST, aspartato transaminasa, BID, dos veces al día; DLT, toxicidad limitante de la dosis; N/A, no aplicable.

[0625] Ejemplo 21

[0626] Acontecimientos adversos (AA)

[0627] Se observaron AA relacionados con el tratamiento evaluados por el investigador de cualquier grado en 26 de 27 pacientes (96%). Los AA relacionados con el tratamiento más comunes (>30%) fueron exantema (predominantemente acneiforme) (70%), fatiga (59%), diarrea (52%) y náuseas (52%) (tabla 27). Ningún paciente experimentó un AA relacionado con el tratamiento de grado 4 o 5 ni interrumpió el tratamiento debido a un AA relacionado con el tratamiento. La mayoría de los acontecimientos fueron de grado 1 a 2, observándose acontecimientos de grado 3 relacionados con el tratamiento en 13 de 27 pacientes (48%). Los únicos acontecimientos relacionados con el tratamiento de grado 3 presentes en ≥10% de los pacientes fueron diarrea (15%) y pruebas de función hepática aumentada (11%), todos los cuales se produjeron por encima de la dosis de 600 mg BID.

[0628] Tabla 27 - Acontecimientos adversos posible/definitivamente relacionados con BVD-523 en ≥10% de los pacientes

[0631]

[0633] <a>Ningún paciente experimentó AA de grado 4 o 5 que estuvieran posible o definitivamente relacionados con el tratamiento con BVD-523.

[0634] Exantema acneiforme y maculo-papular.

[0635] <c>Un acontecimiento de grado 1 de retinopatía serosa central relacionada.

[0636] Fecha de corte del análisis: 1 de diciembre de 2015.

[0637] Abreviaturas: AA, acontecimientos adversos; ALT, alanina transaminasa; AST, aspartato transaminasa; LFT, pruebas de función hepática.

[0638] Catorce pacientes experimentaron un total de 28 AA graves (AAG). Nueve de ellos se consideró que estaban relacionados o posiblemente relacionados con BVD-523 por el investigador, los cuales incluyeron deshidratación, diarrea, o creatinina elevada (2 pacientes cada uno), vómitos, náuseas, y fiebre (1 paciente cada uno). Todos los demás AAG se consideró que no estaban relacionados con el tratamiento con BVD-523. Se produjeron reducciones de la dosis resultantes de los AA en 3 pacientes durante el estudio: 1 paciente redujo desde 600 mg BID hasta 300 mg BID y 2 pacientes redujeron desde 900 mg BID hasta 600 mg BID.

[0639] Ejemplo 22

[0640] Farmacocinética

[0641] La farmacocinética de una única dosis y en estado estacionario de BVD-523 se resumen en la figura 39A y la tabla 28. Generalmente, BVD-523 administrado por vía oral se absorbió lentamente en pacientes con tumores malignos avanzados. Tras alcanzar la concentración máxima (C<máx>), los niveles de BVD-523 en plasma permanecieron sostenidos durante aproximadamente de 2 a 4 horas. Posteriormente, las concentraciones de fármaco en plasma disminuyeron lentamente. Dado que las concentraciones de fármaco en plasma se midieron únicamente hasta 12 horas tras la dosis de la mañana, no fue posible calcular una tasa de eliminación de fase terminal o efectiva. La farmacocinética de BVD-523 fue lineal y proporcional a la dosis tanto en cuanto a la C<máx>como en cuanto al área bajo la curva (AUC) cuando se administró hasta 600 mg BID. No se observó un aumento adicional de la exposición a medida que la dosis aumentó desde 600 hasta 900 mg BID. La C<máx>alcanzó el nivel de la CE<50>basándose en el ensayo de sangre completaex vivo(≈200 ng/ml) para todas las dosis por encima de 20 mg BID. Adicionalmente, las exposiciones en estado estacionario permanecieron a o por encima de la CE<50>objetivo para niveles de dosis de ≥150 mg BID a lo largo de todo el periodo de dosificación. Se observó una acumulación en plasma mínima de BVD-523 y sus metabolitos en el día 15 a los niveles de dosis inferiores (<75 mg BID), mientras que la acumulación osciló desde aproximadamente 1,3 hasta 4,0 veces para los niveles de dosis superiores. Las concentraciones antes de la dosis en el día 22 fueron generalmente similares a las del día 15, indicando que el estado estacionario ya se había alcanzado en el día 15 (datos no mostrados). El grado de variabilidad entre pacientes en la exposición en plasma a BVD-523 y sus metabolitos se consideró moderado y no problemático.

[0642] Tabla 28 - Farmacocinética de BVD-523 en estado estacionario (ciclo 1, día 15)

[0645]

[0648] <a>Nivel de dosis administrado dos veces al día;n=3 en el día 15;<c>El número de sujetos para el día 15 al nivel de dosis de 600 mg incluye dos sujetos que empezaron en el día 1 administrando dosis a 900 mg y después redujeron hasta 600 mg;<d>n=8 en el día 15;<e>n=4 en el día 15;<f>un sujeto empezó en el día 1 administrando dosis a 750 mg y después redujo hasta 450 mg. Los parámetros del día 15 para este sujeto reflejan al menos 10 dosis consecutivas a 450 mg/dosis. Los parámetros del día 15 individuales fueron de 1300 ng/ml para C<máx>y 10700 ng·h/ml para AUC<0-12>;<g>n=3;<h>n=5.

[0649] La excreción urinaria tras la primera dosis y en el estado estacionario de BVD-523 fue despreciable (<0,2% de la dosis) a todos los niveles de dosis dentro del plazo de 12 horas tras la dosis, y no estuvo relacionada con la dosis dentro de este intervalo de porcentaje muy bajo. El aclaramiento renal pareció ser independiente de la dosis. Los valores de aclaramiento renal individuales oscilaron desde 0,128 hasta 0,0895 l/h (cuando n = 1 por nivel de dosis) y los valores medios oscilaron desde 0,0149 hasta 0,0300 l/h (cuando n≥3).

[0650] Ejemplo 23

[0651] Confirmación farmacodinámica de la inhibición de la diana por BVD-523

[0652] Para confirmar la inhibición inespecífica y de la ruta mediante BVD-523, se examinó la fosforilación de RSK-1 como biomarcador diana en muestras de sangre completa humana de pacientes con tumores sólidos que recibieron BVD-523. Muestras de sangre completa en estado estacionario extraídas justo antes de la dosificación del día 15 a partir de pacientes tratados con BVD-523 presentaron inhibición dependiente de la concentración de la actividad de ERK estimulada por PMA (figura 39B), oscilando desde el 0% de inhibición de ERK con dosificación de BVD-523 a 10 mg BID hasta el 93 ± 8% de inhibición de ERK con dosificación a 900 mg BID. Las concentraciones en plasma de BVD-523 que produjeron el 50% de inhibición de la fosforilación de ERK fueron similares tanto si se añadió BVD-523 directamente al plasma del voluntario sano como si estaba presente tras una dosificación oral de pacientes.

[0653] Ejemplo 24

[0654] Efectos antitumorales

[0655] Se evaluó la respuesta tumoral frente a BVD-523 en 25 pacientes evaluables usando criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (RECIST v1.1); 2 pacientes no recibieron ambas exploraciones de lesiones diana y, por tanto, no se evaluaron usando RECIST v1.1. Ningún paciente alcanzó una respuesta completa, pero 3 pacientes (todos pacientes con melanoma con mutaciones BRAF<V600>) alcanzaron una respuesta parcial (129 días [no sometido a tratamiento con inhibidor de BRAF/MEK], 294 días en curso [no responde a inhibidores de BRAF/MEK previos], 313 días en curso en la fecha corte de los datos [intolerante a otros inhibidores de BRAF/MEK]) (figura 40A). De manera interesante, los 3 pacientes con respuesta parcial tenían melanoma mutante para BRAF. Un paciente con respuesta parcial, que estaba recibiendo BVD-523 a una dosis de 450 mg BID, tuvo una reducción aproximada del 70% en la suma de lesiones diana con respecto al nivel inicial, mientras que los otros pacientes con respuesta parcial mostraron reducciones del 47,0% y el 33,6%. Se demostró enfermedad estable en 18 pacientes, presentando 6 una enfermedad estable durante más de 6 meses, y presentando 6 pacientes adicionales una enfermedad estable durante más de 3 meses. En este estudio, 4 pacientes presentaron enfermedad progresiva en la primera evaluación.

[0656] La figura 40B muestra exploraciones de tomografía computerizada (TC) de 1 de los 3 pacientes con respuesta parcial (RECIST v1.1) que había progresado con tratamiento previo con vemurafenib y después con dabrafenib/trametinib; se observó una respuesta parcial duradera tras la dosificación de BVD-523600 mg BID durante >300 días. BVD-523 se asoció con una respuesta metabólica usando tomografía de emisión positiva para fluorodesoxiglucosa (<18>F-FDG-PET) en 5 de 16 pacientes evaluables.

[0657] La figura 41 representa el tiempo hasta la respuesta y la duración de la respuesta en la población del estudio. Los dos pacientes que demostraron respuestas frente a BVD-523 permanecieron en el estudio y continuaron con el tratamiento con BVD-523 en la fecha de corte del estudio (>500 días); adicionalmente, un paciente con NSCLC broncoalveolar (sin suficiente tejido para determinación de perfil molecular) había estado recibiendo tratamiento durante >700 días con enfermedad estable. Veinticuatro de los 27 pacientes (90%) interrumpieron el tratamiento debido a enfermedad progresiva (22/27, el 82%) u otros motivos (2/27, el 7%). La duración media de tratamiento con BVD-523 antes de la interrupción fue de 4,7 meses.

[0658] Discusión

[0659] La presente invención presenta resultados de un primer estudio en seres humanos que evaluó la seguridad, farmacocinética, farmacodinamia, y eficacia preliminar de BVD-523 en 27 pacientes con tumores sólidos avanzados. En este estudio de aumento de la dosis, el tratamiento oral con BVD-523 dio como resultado tanto respuestas radiográficas mediante RECIST v1.1 (3 respuestas parciales) como estabilización de la enfermedad prolongada en algunos pacientes, la mayoría de los cuales se habían tratado con ≥2 terapias sistémicas previas. Se estableció evidencia de inhibición dependiente de BVD-523 de la respuesta metabólica en tumores en un subconjunto de pacientes mediante obtención de imágenes de la captación tumoral de<18>F-glucosa. Las exposiciones a fármaco aumentaron linealmente con dosis crecientes hasta 600 mg BID, proporcionando las exposiciones a 600 mg BID una inhibición casi completa 24/7 de la fosforilación de sustrato dependiente de ERK (RSK-1) en un ensayo de sangre completaex vivo. Además, la tolerabilidad frente a BVD-523 era razonable cuando se administró hasta su MTD y RP2D, que se determinó que eran de 600 mg BID.

[0660] BVD-523 se toleró generalmente bien, con toxicidad razonable y reversible. Los AA más comunes fueron exantema (habitualmente acneiforme), fatiga, y efectos secundarios gastrointestinales, incluyendo náuseas, vómitos, y diarrea. El perfil de seguridad de BVD-523 es compatible con su inhibición selectiva de la ruta de MAPK; el perfil de AA muestra un solapamiento considerable con la experiencia con inhibidores de MEK. Sin embargo, toxicidades asociadas con cualquier terapia dirigida pueden incluir dependencia tanto del mecanismo específico como del grado de inhibición de diana así como cualquier efecto inespecífico (Zelboraf [prospecto] y Hauschildet al.2012). Investigaciones en curso y futuras extenderán el perfil tanto de eficacia como de seguridad demostrado en este estudio de aumento de la dosis, y orientarán sobre cómo puede usarse el perfil único del inhibidor de ERK BVD-523 como agente único o en combinación con otros agentes.

[0661] Las respuestas duraderas mediante inhibidores de RAF y de MEK están con frecuencia limitadas por resistencia adquirida intrínseca y final, con una característica común que con frecuencia implica la reactivación de la ruta de ERK (Poulikakoset al.2011, Corcoranet al.2010, Nazarianet al.2010, Shiet al.2014, Johannessenet al.2010, Wagleet al.2011, Wagleet al.2014, Ahronianet al.2015 y Paraisoet al.2010). Por tanto, la inhibición de ERK con BVD-523 solo o en combinación con otros inhibidores de la ruta de señalización de MAPK puede tener el potencial de retardar el desarrollo de resistencia a terapias existentes y beneficiar a una población de paciente más amplia. El hecho de que inhibidores de ERK, incluyendo BVD-523, conservan su potencia en líneas celulares resistentes a BRAF y MEK proporciona evidencias preclínicas para el uso de inhibidores de ERK en pacientes con resistencia adquirida al tratamiento de referencia (terapia de combinación contra BRAF/MEK). Véanse, por ejemplo, los ejemplos 9-16. De manera importante, en este estudio, un paciente cuyo cáncer había progresado tras experimentar enfermedad estable cuando se trató inicialmente con un inhibidor de BRAF (vemurafenib) y posteriormente con una combinación de inhibidores de BRAF y MEK (dabrafenib/trametinib) tuvo una respuesta parcial cuando recibió BVD-523 como agente único. Este paciente ha permanecido en el estudio durante un total de 708 días, en la fecha de corte del estudio notificada en el presente documento. Basándose en parte en los efectos antitumorales observados en este paciente, la FDA ha designado como programa de desarrollo acelerado la investigación de BVD-523 para el tratamiento de pacientes con melanoma positivo para mutación de BRAF<V600>no resecable o metastásico que no responde o ha progresado tras el tratamiento con un(os) inhibidor(es) de BRAF y/o MEK. La definición precisa de exactamente cómo BVD-523 puede dar mejor soporte al cuidado de los pacientes (por ejemplo, como agente único o en diversas combinaciones) requiere estudios clínicos adicionales.

[0662] En resumen, los presentes ejemplos presentan datos a partir de unos datos iniciales a partir de la porción de aumento de la dosis de un estudio de fase I que evalúa BVD-523, un inhibidor de ERK novedoso, primero en su clase, como tratamiento para pacientes con cánceres avanzados. El tratamiento oral, dos veces al día, continuo, con BVD-523 dio como resultado efectos antitumorales en varios pacientes, incluyendo pacientes que o bien no habían recibido previamente, o bien habían progresado con, terapias dirigidas a la ruta de MAPK disponibles. BVD-523 se toleró generalmente bien en esta población de pacientes con cáncer avanzado y las toxicidades fueron razonables; la MTD y RP2D fueron de 600 mg BID. Las exposiciones a BVD-523 aumentaron linealmente hasta la RP2D y efectos farmacodinámicos robustos fueron evidentes a este nivel de dosis. Actualmente está llevándose a cabo una expansión de este estudio clínico de fase I para confirmar y extender las observaciones realizadas en la fase de aumento de la dosis. Específicamente, están reclutándose pacientes en cohortes de expansión clasificadas molecularmente (por ejemplo, alteraciones de NRAS, BRAF, MEK o ERK) a lo largo de diversas histologías tumorales. Además, cohortes de expansión están evaluando el uso de BVD-523 en pacientes con cáncer que o bien no han recibido previamente terapias contra la ruta de MAPK disponibles o bien cuya enfermedad ha progresado con tales tratamientos.

[0663] Documentos

[0664] ABSALAN, Farnaz, Mostafa Ronaghi (2008). Molecular Inversion Probe Assay. Methods in Molecular Biology 396. Humana Press. págs.315-330.

[0665] AHRONIAN LG, Sennott EM, Van Allen EM, Wagle N, Kwak EL, Faris JE,et al.Clinical acquired resistance to RAF inhibitor combinations in BRAF-mutant colorectal cancer through MAPK pathway alterations. Cancer Discov 2015; 5: 358-67.

[0666] ARCILA ME, Drilon A, Sylvester BE, Lovly CM, Borsu L, Reva B,et al.MAP2K1 (MEK1) mutations define a distinct subset of lung adenocarcinoma associated with smoking. Clin Cancer Res 2015; 21: 1935-43.

[0667] ARONOV AM, Baker C, Bemis GW, Cao J, Chen G, Ford PJ,et al.Flipped out: structure-guided design of selective pyrazolylpyrrole ERK inhibitors. J Med Chem 2007; 50: 1280-7.

[0668] ARONOV AM, Tang Q, Martinez-Botella G, Bemis GW, Cao J, Chen G,et al.Structure-guided design of potent and selective pyrimidylpyrrole inhibitors of extracellular signal-regulated kinase (ERK) using conformational control. J Med Chem 2009; 52: 6362-8.

[0669] ARRINGTON AK, Heinrich EL, Lee W, Duldulao M, Patel S, Sanchez J,et al.Prognostic and predictive roles of KRAS mutation in colorectal cancer. Int J Mol Sci 2012; 13: 12153-68.

[0670] CARGNELLO M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev 2011; 75: 50-83.

[0671] CARLINO MS, Fung C, Shahheydari H, Todd JR, Boyd SC, Irvine M,et al.Preexisting MEK1 P 124 mutations diminish response to BRAF inhibitors in metastatic melanoma patients. Clin Cancer Res 2015; 21: 98-105.

[0672] CHAPMAN PB, Hauschild A, Robert C, Haanen JB, Ascierto P, Larkin J,et al.Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011; 364: 2507-16.

[0673] CORCORAN, R.B.,et al.BRAF gene amplification can promote acquired resistance to MEK inhibitors in cancer cells harboring the BRAF V600E mutation. Sci Signal (2010); 3(149): ra84.

[0674] DAI, B.,et al.STAT3 mediates resistance to MEK inhibitor through microRNA miR-17. Cancer Res (2011); 71: 3658-3668.

[0675] DAVIES H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S,et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002; 417: 949-54.

[0676] DESCHENES-SIMARD X, Kottakis F, Meloche S, Ferbeyre G. ERKs in cancer: friends or foes? Cancer Res 2014; 74: 412-9.

[0677] DOBRZYCKA B, Teriikowski SJ, Kowalczuk O, Nikiinska W, Chyczewski L, Kulikowski M. Mutations in the KRAS gene in ovarian tumors. Folia Histochem Cytobiol 2009; 47: 221-4.

[0678] EMERY, C.M.,et al.MEK1 mutations confer resistance to MEK and B-RAF inhibition. PNAS (2009); 106(48): 20411-6.

[0679] FEDOROV O, Niesen FH, Knapp S. Kinase inhibitor selectivity profiling using differential scanning fluorimetry. Methods Mol Biol 2012; 795: 109-18.

[0680] FERNÁNDEZ-MEDARDE A, Santos E. Ras in cancer and developmental diseases. Genes Cancer 2011; 2: 344-58. FLAHERTY KT, Infante JR, Daud A, Gonzalez R, Kefford RF, Sosman J,et al.Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations. N Engl J Med 2012; 367: 1694-703.

[0681] GOETZ EM, Ghandi M, Treacy DJ, Wagle N, Garraway LA. ERK mutations confer resistance to mitogen-activated protein kinase pathway inhibitors. Cancer Res 2014; 74: 7079-89.

[0682] GOLLOB JA, Wilhelm S, Carter C, Kelley SL. Role of Raf kinase in cancer: therapeutic potential of targeting the Raf/MEK/ERK signal transduction pathway. Semin Oncol 2006; 33: 392-406.

[0683] GREGER, James G.,et al.“Combinations of BRAF, MEK, and PI3K/mTOR inhibitors overcome acquired resistance to the BRAF inhibitor GSK2118436 dabrafenib, mediated by NRAS or MEK mutations.” Molecular cancer therapeutics 11.4 (2012): 909-920.

[0684] GROENENDIJK FH, Bernards R. Drug resistance to targeted therapies: deja vu all over again. Mol Oncol 2014; 8: 1067-83.

[0685] HALL RD, Kudchadkar RR. BRAF mutations: signaling, epidemiology, and clinical experience in multiple malignancies. Cancer Control 2014; 21: 221-30.

[0686] HARDENBOL, P.,et al.Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes. Nat. Biotechnol.

[0687] 2003, n.º 21, págs.673-678.

[0688] HATZIVASSILIOU, Georgia,et al.“RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.” Nature 464.7287 (2010): 431-435.

[0689] HATZIVASSILIOU G, Liu B, O’Brien C, Spoerke JM, Hoeflich KP, Haverty PM,et al.ERK inhibition overcomes acquired resistance to MEK inhibitors. Mol Cancer Ther 2012; 11: 1143-54.

[0690] HAUSCHILD A, Grob J-J, Demidov LV, Jouary T, Gutzmer R, Millward M,et al.Dabrafenib in BRAF-mutated metastatic melanoma: a multicentre, open-label, phase 3 randomised controlled trial. Lancet 2012; 380: 358-65.

[0691] HAYES TK, Neel NF, Hu C, Gautam P, Chenard M, Long B,et al.Long-Term ERK Inhibition in KRAS-Mutant Pancreatic Cancer Is Associated with MYC Degradation and Senescence-like Growth Suppression. Cancer Cell 2016; 29: 75-89. HEZEL AF, Noel MS, Allen JN, Abrams TA, Yurgelun M, Faris JE,et al.Phase Il study of gemcitabine, oxaliplatin in combination with panitumumab in KRAS wild-type unresectable or metastatic biliary tract and gallbladder cancer. Br J Cancer 2014; 111: 430-6.

[0692] JHA S, Morris EJ, Hruza A, Mansueto MS, Schroeder G, Arbanas J,et al.Dissecting therapeutic resistance to ERK inhibition. Mol Cancer Ther 2016; 15: 548-59.

[0693] JOHANNESSEN, C.M.,et al.COT/MAP3K8 drives resistance to RAF inhibition through MAP kinase pathway reactivation. Nature (2010); 468(7326): 968-972.

[0694] JOHNSON DB, Menzies AM, Zimmer L, Eroglu Z, Ye F, Zhao S,et al.Acquired BRAF inhibitor resistance: A multicenter meta-analysis of the spectrum and frequencies, clinical behaviour, and phenotypic associations of resistance mechanisms. Eur J Cancer 2015; 519792-9.

[0695] KANDA M, Matthaei H, Wu J, Hong SM, Yu J, Borges M,et al.Presence of somatic Mutations in most early-stage pancreatic intraepithelial neoplasia. Gastroenterology 2012; 142: 730-733.

[0696] KHATTAK M, Fisher R, Turajlic S, Larkin J. Targeted therapy and immunotherapy in advanced melanoma: an evolving paradigm. Ther Adv Med Oncol 2013; 5: 105-18.

[0697] KING, Alastair J.,et al.“Dabrafenib; preclinical characterization, increased efficacy when combined with trametinib, while BRAF/MEK tool combination reduced skin lesions.” Plos one 8.7 (2013): e67583.

[0698] LARKIN J, Ascierto PA, Dréno B, Atkinson V, Liszkay G, Maio M,et al.Combined vemurafenib and cobimetinib in BRAF-mutated melanoma. N Engl J Med 2014; 371: 1867-76.

[0699] LITTLE, A.S.,et al., Amplification of the Driving Oncogene, KRAS or BRAF, Underpins Acquired Resistance to MEK1/2 Inhibitors in Colorectal Cancer Cells. Sci. Signal.4, ra17 (2011).

[0700] LIU, Dingxie,et al.“BRAF V600E maintains proliferation, transformation, and tumorigenicity of BRAF-mutant papillary thyroid cancer cells.” Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 92.6 (2007): 2264-2271.

[0701] LIU B, Fu L, Zhang C, Zhang L, Zhang Y, Ouyang L,et al.Computational design, chemical synthesis, and biological evaluation of a novel ERK inhibitor (BL-EI001) with apoptosis-inducing mechanisms in breast cancer. Oncotarget 2015; 6: 6762-75.

[0702] LONG GV, Fung C, Menzies AM, Pupo GM, Carlino MS, Hyman J,et al.Increased MAPK reactivation in early resistance to dabrafenib/trametinib combination therapy of BRAF-mutant metastatic melanoma. Nat Commun 2014; 5: 5694.

[0703] LONG GV, Stroyakovskiy D, Gogas H, Levchenko E, de Braud F, Larkin J,et al.Dabrafenib and trametinib versus dabrafenib and placebo for Va1600 BRAFmutant melanoma: a multicentre, double-blind, phase 3 randomised controlled trial. Lancet 2015; 386: 444-51.

[0704] MANANDHAR sp, Hildebrandt ER, Schmidt WK. Small-molecule inhibitors of the Rcelp CaaX protease. J Biomol Screen.2007; 12(7): 983-993.

[0705] MASSEY PR, Prasad V, Figg WD, Fojo T. Multiplying therapies and reducing toxicity in metastatic melanoma. Cancer Biol Ther 2015; 16: 1014-8.

[0706] MAURER, T, Garrenton, LS, Oh, A, Pitts, K, Anderson, DJ, Skelton, NJ, Fauber, BP, Pan, B, Malek, S, Stokoe, D, Ludlam, MJC, Bowman, KK, Wu, J, Giannetti, AM, Starovasnik, MA, Mellman, l, Jackson, PK, Rudolph, J, Wang, W, Fang, G. Small-molecule ligands bind to a distinct pocket in Ras and inhibit SOS-mediated nucleotide exchange activity. PNAS.2012; 109(14): 5299-304.

[0707] MCARTHUR GA, Chapman PB, Robert C, Larkin J, Haanen JB, Dummer R,et al.Safety and efficacy of vemurafenib in BRAFv600E and BRAFv600K mutationpositive melanoma (BRIM-3): extended follow-up of a phase 3, randomised, open-label study. Lancet Oncol 2014; 15: 323-32.

[0708] MEKINIST [prospecto]. Research Triangle Park, NC: GlaxoSmithKline; 2014.

[0709] METZKER, Emerging technologies in DNA sequencing Genome Res.2005.15: 1767-1776.

[0710] MITTAL, Rohitet al.“The acetyltransferase activity of the bacterial toxin YopJ of Yersinia is activated by eukaryotic host cell inositol hexakisphosphate.” Journal of Biological Chemistry 285.26 (2010): 19927-19934.

[0711] MORRIS EJ, Jha S, Restaino CR, Dayananth P, Zhu H, Cooper A,et al.Discovery of a novel ERK inhibitor with activity in models of acquired resistance to BRAF and MEK inhibitors. Cancer Discov 2013; 3: 742-50.

[0712] NAZARIAN, R.,et al.Melanomas acquire resistance to B-RAF (V600E) inhibition by RTK or N-RAS upregulation. Nature.2010; 468(7326): 973-977.

[0713] NIKOLAEV Sl, Rimoldi D, Iseli C, Valsesia A, Robyr D, Gehrig C,et al.Exome sequencing identifies recurrent somatic MAP2K1 and MAP2K2 mutations in melanoma. Nat Genet 2012; 44: 133-9.

[0714] NILSSON, M.,et al.Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science.1994, n.º 265, págs.2085-2088.

[0715] O’HARA AJ, Bell DW. The genomics and genetics of endometrial cancer. Adv Genomics Genet 2012; 2012: 33-47. OJESINA Al, Lichtenstein L, Freeman SS, Pedamallu CS, Imaz-Rosshandler l, Pugh TJ,et al.Landscape of genomic alterations in cervical carcinomas. Nature 2014; 506: 371-5.

[0716] OTAet al., Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism. Nat Protoc.2007; 2(11): 2857-64.

[0717] PARAISO KHT, Fedorenko IV, Cantini LP, Munko AC, Hall M, Sondak VK,et al.Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. Br J Cancer 2010; 102: 1724-30.

[0718] PATGIRI A, Yadav, KK, Arora, PS, Bar-Sagi, D. An orthosteric inhibitor of the Rassos interaction. Nat Chem Biol.2011; 7: 585-587.

[0719] PENNYCUICK A, Simpson T, Crawley D, Lai R, Santis G, Cane P,et al.Routine EGFR and KRAS mutation analysis using COLD-PCR in non-small cell lung cancer. Int J Clin Pract 2012; 66: 748-52.

[0720] PORTER SB, Hildebrandt ER, Breevoort SR, Mokry DZ, Dore TM, Schmidt WK. Inhibition of the CaaX proteases Rce1p and Ste24p by peptidyl (acyloxy)methyl ketones. Biochim Biophys Acta.2007; 1773(6): 853-862.

[0721] POULIKAKOS PI, Persaud Y, Janakiraman M, Kong X, Ng C, Moriceau G,et al.RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature 2011; 480: 387-90.

[0722] QUEIROLO P, Picasso V, Spagnolo F. Combined BRAF and MEK inhibition for the treatment of BRAF-mutated metastatic melanoma. Cancer Treat Rev 2015; 41: 519-26.

[0723] RASOLA A, Sciacovelli M, Chiara F, Pantic B, Brusilow WS, Bernardi P. Activation of mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability transition. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107: 726-31. RIZOS H, Menzies AM, Pupo GM, Carlino MS, Fung C, Hyman J,et al.BRAF inhibitor resistance mechanisms in metastatic melanoma: spectrum and clinical impact. Clin Cancer Res 2014; 20: 1965-77.

[0724] ROBERT C, Karaszewska B, Schachter J, Rutkowski P, Mackiewicz A, Stroiakovski D,et al.Improved overall survival in melanoma with combined dabrafenib and trametinib. N Engl J Med 2015; 372: 30-9.

[0725] ROMEO Y, Zhang X, Roux PP. Regulation and function of the RSK family of protein kinases. Biochem J 2012; 441: 553-69.

[0726] RUDOLPH J, Xiao Y, Pardi A, Ahn NG. Slow inhibition and conformation selective properties of extracellular signalregulated kinase 1 and 2 inhibitors. Biochemistry 2015; 54: 22-31.

[0727] SHAUL YD, Seger R. The MEK/ERK cascade: from signaling specificity to diverse functions. Biochim Biophys Acta 2007; 1773: 1213-26.

[0728] SHI H, Hugo W, Kong X, Hong A, Koya RC, Moriceau G,et al.Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discov 2014; 4: 80-93.

[0729] SHIMA, F, Yoshikawa, Y, Ye, M, Araki, M, Matsumoto, S, Liao, J, Hu, L, Sugimoto, T, Ijiri, Y, Takeda, A, Nishiyama, Y, Sato, C, Muraoka, S, Tamura, A, Osoda, T, Tsuda, K-I, Miyakawa, T, Fukunishi, H, Shimada, J, Kumasaka, Yamamoto, M, Kataoka, T. In silico discovery of small-molecule Ras inhibitors that display antitumor activity by blocking the Raseffector interaction. PNAS.2013; 110(20): 8182-7.

[0730] SCHUBBERT S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer 2007; 7: 295-308.

[0731] SUN C, Hobor S, Bertotti A, Zecchin D, Huang S, Galimi F,et al.Intrinsic resistance to MEK inhibition in KRAS mutant lung and colon cancer through transcriptional induction of ERBB3. Cell Rep 2014;7: 86-93.

[0732] TAFLINAR [prospecto]. Research Triangle Park, NC: GlaxoSmithKline; 2015.

[0733] TRUNZER K, Pavlick AC, Schuchter L, Gonzalez R, McArthur GA, Hutson TE,et al.Pharmacodynamic effects and mechanisms of resistance to vemurafenib in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 2013; 31: 1767-74. VILLANUEVA, J.,et al.Acquired resistance to BRAF inhibitors mediated by a RAF kinase switch in melanoma can be overcome by cotargeting MEK and IGF-1R/PI3K. Cancer Cell.2010; 18: 683-695.

[0734] WAGLE, N.,et al.Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. Journal of Clinical Oncology 2011; 29(22): 3085-3096.

[0735] WAGLE N, Van Allen EM, Treacy DJ, Frederick DT, Cooper ZA, Taylor-Weiner A,et al.MAP kinase pathway alterations in BRAF-mutant melanoma patients with acquired resistance to combined RAF/MEK inhibition. Cancer Discov 2014; 4: 61-8.

[0736] Wainstein E, Seger R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr Opin Cell Biol 2016; 39: 15-20.

[0737] WANG, H.,et al.Identification of the MEK1 (F129L) activating mutation as a potential mechanism of acquired resistance to MEK inhibition in human cancers carrying the B-RAF V600E mutation. Cancer Res (2011); 71(16): 5535-45. YANG W, Soares J, Greninger P, Edelman EJ, Lightfoot H, Forbes S,et al.Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC): a resource for therapeutic biomarker discovery in cancer cells. Nucleic Acids Res 2013; 41: D955-D961. YAO Z, Torres NM, Tao A, Gao Y, Luo L, Li Q,et al.BRAF Mutants Evade ERK-Dependent Feedback by Different Mechanisms that Determine Their Sensitivity to Pharmacologic Inhibition. Cancer Cell 2015; 28: 370-83.

[0738] YOHE S. Molecular genetic markers in acute myeloid leukemia. J Clin Med 2015; 4: 460-78.

[0739] ZELBORAF [prospecto]. South San Francisco, CA: Genentech USA, Inc.; 2015.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de un melanoma positivo para mutación de BRAF600 en un paciente humano, que ha progresado con tratamiento previo con vemurafenib y después con dabrafenib/trametinib, en el que dicho BVD-523 o sal farmacéuticamente aceptable del mismo debe administrarse al paciente humano a una dosis de 600 mg BID.

2. BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 1, en el que dicha mutación es una mutación de BRAF<V600E>.