ES3056399T3

ES3056399T3 - Probiotic preparation for treating gut inflammation

Info

Publication number: ES3056399T3
Application number: ES16703837T
Authority: ES
Inventors: Barry Smith; Robert Broadbent
Original assignee: Multigerm UK Enterprises Ltd
Current assignee: Multigerm UK Enterprises Ltd
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2026-02-20
Anticipated expiration: 2036-02-05
Also published as: EP3253395C0; EP3253395A1; GB201501938D0; EP3253395B1; PL3253395T3; WO2016124940A1; EP4696375A2

Abstract

Se proporciona una preparación probiótica no láctea que comprende bacterias probióticas viables y metabólicamente activas, por ejemplo bacterias probióticas de ácido láctico, para el tratamiento de trastornos enterocolíticos, por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Preparación probiótica para tratar la inflamación intestinal

[0003] Campo de la invención

[0004] La invención,que se define en las reivindicaciones 1-14, se refiere al tratamiento de trastornos inflamatorios intestinales mediante el uso de preparaciones probióticas que contienen bacterias probióticas viables y metabólicamente activas.

[0005] Antecedentes

[0006] La enterocolitis, también descrita como trastornos enterocolíticos, abarca una serie de afecciones caracterizadas por la inflamación del tracto gastrointestinal (GI). Por ejemplo, tales afecciones incluyen aquellas que implican enteritis (inflamación del intestino delgado) y/o colitis (inflamación del colon o intestino grueso). La inflamación enterocolítica en un paciente se indica por marcadores inflamatorios elevados, tales como una concentración de calprotectina fecal por encima de los niveles normales (el nivel normal es de aproximadamente 50 mg/kg).

[0007] La enterocolitis puede ser provocada por varios factores que incluyen, pero no se limitan, infección, efectos autoinmunitarios, o como consecuencia de tratamientos farmacológicos. Por ejemplo, la enterocolitis infecciosa puede ser provocada por bacterias tales comoSalmonella sp.,yCampylobacter sp.,virus tales como enterovirus y parásitos tales comoGiardia.Los trastornos enterocolíticos impulsados por autoinmunidad incluyen aquellos tales como colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn (denominados en conjunto enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)). La enterocolitis también puede ser provocada como consecuencia o efecto secundario de intervenciones farmacológicas. Por ejemplo, se observan niveles elevados de calprotectina fecal en pacientes tratados crónicamente con fármacos antiinflamatorios no esteroidales (AINE).

[0008] Los pacientes que padecen enterocolitis pueden exhibir una serie de síntomas, muchos de los cuales tienen un impacto significativo en la calidad de vida del paciente. Tales síntomas incluyen, pero no se limitan a, diarrea, vómitos, estreñimiento, incomodidad o dolor abdominal, hemorragia rectal, aumento de la urgencia y/o frecuencia de los movimientos intestinales, y anemia.

[0009] En el caso de los trastornos enterocolíticos de colitis ulcerativa (UC) y enfermedad de Crohn, la incidencia en el Reino Unido es de aproximadamente 10-20 y 5-10 por 100000, respectivamente, y ambas enfermedades se asocian con una morbilidad significativa y una reducción en la calidad de vida (QOL). La enfermedad de Crohn tiene una morbilidad particularmente significativa, con hasta el 15 % de los pacientes con Crohn que no pueden trabajar a tiempo completo 5-10 años después del diagnóstico.

[0010] Los tratamientos convencionales para la enterocolitis incluyen el uso de diversos medicamentos para controlar la infección y/o el proceso inflamatorio y, como resultado, reducir los síntomas. Sin embargo, estos no siempre son efectivos. Por ejemplo, en la IBD, la mayoría, si no la totalidad de los pacientes, continuarán con marcadores inflamatorios elevados y tendrán una calidad de vida (QOL) reducida secundaria a síntomas residuales a pesar del tratamiento. Además, los pacientes en remisión clínica asintomática con frecuencia continúan exhibiendo marcadores de inflamación elevados y, como resultado, tienen un mayor riesgo de recaída temprana.

[0011] Por ejemplo, en la IBD, los tratamientos convencionales incluyen esteroides (como prednisolona e hidrocortisona); los 5 amino-salicilatos antiinflamatorios (5-ASA) (tales como mesalazina); inmunosupresores (que incluyen metotrexato, azatioprina y ciclosporina); y anti-factores de necrosis tumoral (anti-TNF) (tales como infliximab y adalimumab).

[0012] Si bien la terapia médica actual ha reducido la morbilidad y la mortalidad en general, el 30 % de los pacientes con UC eventualmente requerirán colectomía y hasta el 70-80 % de los pacientes con enfermedad de Crohn se someterán a algún tipo de cirugía durante su vida.

[0013] Por lo tanto, está claro que se necesitan terapias alternativas o adicionales para tratar los trastornos enterocolíticos tales como la IBD (UC y enfermedad de Crohn).

[0014] El documento WO2006035218 describe una composición que comprende bacterias probióticas viables y metabólicamente activas en un sustrato líquido no lácteo, un sustrato de crecimiento que comprende una mezcla de carbohidratos complejos y simples.

[0015] El documento WO2007036230 describe cereales fermentados y microorganismos probióticos como efectores de tratamiento para la IBD y el IBS.

[0016] El documento WO2011078781 describe una composición no fermentada destinada a aumentar la formación de ácido butírico en el colon.

[0017] El documento WO2005060937 describe comprimidos que comprenden microorganismos probióticos viables. Resumen de la invención

[0018] El intestino humano soporta una población diversa de diferentes bacterias, y la relación simbiótica entre el huésped y esta microbiota es esencial para la salud y el funcionamiento intestinal normales. Sin embargo, la alteración de esta relación puede conducir al inicio de trastornos enterocolíticos. Por ejemplo, en la IBD el sistema inmunitario reacciona anómalamente a la microbiota intestinal normal, lo que eventualmente da como resultado la inflamación patológica característica de la enfermedad.

[0019] Un enfoque para tratar tales trastornos enterocolíticos es el uso de probióticos. Sin embargo, el papel y la eficacia de los probióticos en el tratamiento de los trastornos enterocolíticos tales como la IBD aún no se comprenden completamente, ya que los datos provenientes de ensayos clínicos hasta la fecha son limitados y conflictivos. La deficiente metodología, la falta de aleatorización o controles de placebo añaden más confusión. Por ejemplo, una revisión de Cochrane reciente concluyó que 'no hay pruebas suficientes para extraer ninguna conclusión sobre la eficacia de los probióticos para la inducción o la remisión en la enfermedad de Crohn' (Butterworth y otros, Cochrane Database of Systematic Reviews 2008, número 3. Artículo núm: CD006634). En general, la variabilidad en el diseño del estudio, las tasas de respuesta, los parámetros clínicos medidos y la heterogeneidad de los grupos de pacientes entre los estudios han impedido llegar a conclusiones firmes sobre la eficacia de los tratamientos probióticos para trastornos enterocolíticos tales como la IBD.

[0020] Sisson y otros (Aliment Pharmacol Ther. Julio de 2014;40(1): 51-62) informan el uso de la preparación probiótica multicepa ejemplificada en la presente descripción para el tratamiento del síndrome del intestino irritable (IBS). Tal objeto es también el objeto del documento WO2013/072654. Sin embargo, se señala que el IBS no es un trastorno enterocolítico.

[0021] El uso efectivo de la preparación probiótica ejemplificada en la presente descripción en el tratamiento del síndrome del intestino irritable (IBS) no da ninguna indicación de que la preparación sería útil en el tratamiento de la enterocolitis. El IBS es un trastorno funcional y se caracteriza, entre otros factores, por una ausencia de marcadores inflamatorios (por ejemplo, los pacientes con IBS presentan niveles normales de calprotectina fecal (es decir, menos de aproximadamente 50 mg/kg). Por lo tanto, mientras que la preparación descrita en Sisson y otros puede ser efectiva para tratar el IBS, el experto no tiene motivación para probar tal preparación probiótica en el tratamiento de trastornos enterocolíticos, y no tendría la expectativa de que sería eficaz. Como se describe en la presente descripción, se llevó a cabo un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo para evaluar la eficacia de una preparación probiótica a base de líquido no láctea caracterizada por la presencia de un alto recuento de bacterias probióticas viables y metabólicamente activas en el tratamiento de la enterocolitis, específicamente la UC y la enfermedad de Crohn. Los datos presentados en la presente descripción demuestran que después del tratamiento con la preparación probiótica, los pacientes exhibieron marcadores inflamatorios sustancialmente reducidos, indicativos de un tratamiento efectivo del trastorno enterocolítico subyacente.

[0022] Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una preparación probiótica que comprende una mezcla deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilusyLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosusen un sustrato líquido no lácteo, para su uso en el tratamiento de la enterocolitis en un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg.

[0023] En un segundo aspecto, la invención proporciona una preparación probiótica para su uso en el tratamiento de la enterocolitis, la preparación probiótica se obtiene mediante un método que comprende: someter el cereal malteado, opcionalmente cebada, a una etapa de maceración para obtener una mezcla de carbohidratos complejos, azúcares simples, proteínas y péptidos; separar la mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples, proteínas y péptidos del cereal malteado gastado para obtener un sustrato de crecimiento; inocular el sustrato de crecimiento con una mezcla deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilusyLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseipara formar un cultivo y hacer crecer dichas bacterias hasta que alcanzan una concentración de entre 1 x 10<6>y 1 x 10<9>unidades formadoras de colonias por mililitro; y enfriar el cultivo hasta 4 °C para obtener la preparación probiótica. En determinadas modalidades de acuerdo con todos los aspectos de la invención, el trastorno enterocolítico es enfermedad inflamatoria intestinal. En determinadas modalidades, el trastorno enterocolítico es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En determinadas modalidades, el paciente a tratar está en remisión clínica, preferentemente, en donde el paciente ha estado en remisión clínica durante al menos 3 meses antes del tratamiento.

[0024] En determinadas modalidades de acuerdo con todos los aspectos de la invención, la preparación probiótica comprende una mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples, en donde la relación del contenido total de carbohidratos con respecto al contenido de azúcares reductores de la preparación probiótica está en el intervalo de 8:1 a 2:1.

[0025] En todos los aspectos de la invención, la preparación probiótica comprende una mezcla deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosus.

[0026] En determinadas modalidades de acuerdo con todos los aspectos de la invención, el recuento total de al menos uno de, y con mayor preferencia cada uno deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso una combinación deLactobacillus caseiyLactobacillus rhamnosusen la preparación es al menos 1,0 x 10<6>células viables por mililitro, preferentemente, al menos 1,0 x 10<7>viables por mililitro. En determinadas modalidades, el recuento total de bacterias metabólicamente activas en la preparación está en el intervalo de 1,0 x 10<6>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro.

[0027] En determinadas modalidades de acuerdo con todos los aspectos de la invención, la preparación probiótica tiene un contenido total de carbohidratos en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y un contenido de azúcares reductores en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml. En determinadas modalidades, la preparación probiótica comprende proteínas y péptidos, en donde la cantidad total de proteínas y péptidos está en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml, y en donde la cantidad total de péptidos de alto peso molecular está en el intervalo de 100 µg/ml a 300 µg/ml. En determinadas modalidades, el pH de la preparación se mantiene en el intervalo de 3,8 a 4,5. En determinadas modalidades, la preparación probiótica comprende un antioxidante, por ejemplo, vitamina C. En determinadas modalidades, la preparación probiótica comprende un agente antifúngico, por ejemplo, sorbato de potasio esterilizado.

[0028] Descripción detallada de la invención

[0029] La invención proporciona un tratamiento efectivo de los trastornos enterocolíticos mediante el uso de una preparación probiótica que se demuestra que proporciona una reducción efectiva de la inflamación intestinal. La preparación probiótica usada en el tratamiento efectivo de la enterocolitis es un producto a base de líquido (y típicamente un producto a base de agua) que no es lácteo y no se liofiliza. La preparación probiótica contiene bacterias probióticas viables y metabólicamente activas en un sustrato líquido que es capaz de suministrar bacterias probióticas viables y metabólicamente activas al tracto intestinal, donde las bacterias probióticas comienzan rápidamente a establecerse y multiplicarse. Por lo tanto, las bacterias probióticas de la preparación están "vivas" y listas para funcionar inmediatamente después de que la preparación se ingiere.

[0030] Los productos probióticos de la técnica anterior están disponibles predominantemente en formatos lácteos o liofilizados, tales como polvos o cápsulas. Para que los probióticos funcionen eficazmente y en su punto óptimo, deben dirigirse a sitios específicos dentro del tracto intestinal sin desencadenar la digestión, así como también evitando los extremos. Si se activa la digestión, los ácidos del estómago pueden debilitar o destruir las bacterias probióticas. Para algunos probióticos, esto es un desafío, ya que están contenidos en bebidas de tipo yogur, que el estómago inicialmente 've' como alimento. Por otro lado, los probióticos liofilizados se han reducido a una temperatura de alrededor de menos 80 °C y la fimbria puede romperse durante el proceso de congelación. Los probióticos liofilizados tienen que rehidratarse antes de que puedan funcionar adecuadamente. Esto puede tardar varias horas. Encontrar un "sistema de suministro" efectivo para las bacterias probióticas es un objetivo clave para los fabricantes que producen suplementos probióticos o alimentos funcionales.

[0031] La preparación probiótica descrita en la presente descripción y que se muestra que es clínicamente efectiva en el tratamiento de la enterocolitis no sufre de estos inconvenientes, ya que las bacterias probióticas se transportan en un sustrato a base de líquido, típicamente un sustrato a base de agua, que protege y transporta las bacterias probióticas de manera segura a través del estómago (sin desencadenar la digestión) hasta los intestinos donde comienzan rápidamente a establecerse y multiplicarse. Sin desear limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la naturaleza viable de las bacterias probióticas en la preparación descrita en la presente descripción y que se ha demostrado que es clínicamente efectiva en el tratamiento de la enterocolitis, les permite establecerse rápidamente en el tracto gastrointestinal del paciente, quizás dentro de los 15 a 20 minutos después de la ingestión. Se cree que tal establecimiento rápido contribuye a la eficacia observada en el tratamiento clínico de la enterocolitis, lo que da como resultado una reducción significativa en los marcadores inflamatorios intestinales.

[0032] Definiciones

[0033] "Probiótico" - como se usa en la presente, el término "probiótico" debe interpretarse de acuerdo con el informe conjunto de la FAO/OMS y las directrices para el uso de probióticos, en el que los probióticos se definen como "microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud al huésped". El término "bacterias probióticas" se refiere a cualquier cepa bacteriana que cumpla con esta definición de un "probiótico".

[0034] "Bacterias del ácido láctico (LAB)" - como se usa en la presente, el término "bacterias del ácido láctico (LAB)" se refiere a un grupo de bacterias anaerobias grampositivas, catalasa negativas y no móviles que fermentan los carbohidratos a ácido láctico. Este grupo incluye los génerosLactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Bifidobacterium y Enterococcus.

[0035] "Bacterias del ácido láctico probióticas" - como se usa en la presente, el término "bacterias del ácido láctico probióticas" se refiere a bacterias del ácido láctico que también satisfacen la definición de un "probiótico" como se usa en la presente. Las bacterias del ácido láctico probióticas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de los génerosLactobacillusyEnterococcus.

[0036] "Enterocolitis" y "trastornos enterocolíticos" - como se usa en la presente, "trastornos enterocolíticos" y "enterocolitis" se usan indistintamente para referirse a trastornos inflamatorios del intestino - es decir, aquellos trastornos en los que el intestino delgado, el intestino grueso, o ambos, están inflamados. Estos trastornos incluyen trastornos de colitis (por ejemplo, colitis ulcerativa (UC), colitis isquémica, colitis infecciosa), enteritis y afecciones en las que se inflaman múltiples partes del tracto gastrointestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn (CD)). La enterocolitis (o trastornos enterocolíticos), como se usa en la presente, incluye la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). La enterocolitis (o trastornos enterocolíticos), como se usa en la presente, no abarca el trastorno funcional síndrome del intestino irritable (IBS). Un trastorno enterocolítico puede ser provocado por infección, autoinmunidad y/o acción farmacológica (por ejemplo, mediante el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroidales (AINE)).

[0037] La enterocolitis (o un "trastorno enterocolítico"), como se usa en la presente, se caracteriza por un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg. Los pacientes que tienen un trastorno enterocolítico pueden tener un nivel de calprotectina fecal superior a 100 mg/kg, superior a 150 mg/kg, preferentemente, superior a 250 mg/kg. "Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)" - la IBD, como se usa en la presente, abarca la colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn. La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa son cada una enfermedades inflamatorias crónicas recurrentes y remitentes caracterizadas por los síntomas que incluyen, pero no se limitan a, dolor o incomodidad abdominal, diarrea, pérdida de peso, hemorragia rectal y fatiga. La enfermedad de Crohn puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal (GI) y se caracteriza por una inflamación parcheada y transmural. En la UC, la inflamación es más superficial pero continua, que se extiende proximalmente desde el recto y generalmente se limita al colon. La IBD (que incluye tanto la UC como la enfermedad de Crohn) se caracteriza por un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg, superior a 100 mg/kg, superior a 150 mg/kg, preferentemente, superior a 250 mg/kg.

[0038] Los pacientes con IBD (enfermedad de Crohn o UC) pueden estar en un estado de remisión clínica o estar experimentando una recaída/episodio. Un paciente en remisión clínica se caracteriza por la ausencia de deterioro progresivo en la afección (histológico o en la gravedad de los síntomas) durante un período de al menos 1 mes. Un paciente en recaída (es decir, que experimenta un episodio) se caracteriza por el deterioro en los síntomas experimentados (es decir, que se vuelven más graves y/o más frecuentes) y el deterioro de la condición histológica.

[0039] "Nivel de calprotectina fecal" - como se usa en la presente, el nivel de calprotectina fecal se refiere a la concentración de calprotectina medida en una muestra de heces fecales de un sujeto. La concentración de calprotectina puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y familiares para el experto, tales como mediante ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA). La medición de la calprotectina puede realizarse mediante el uso de kits disponibles comercialmente tales como el kit EK-Cal de Buhlmann (Suiza) o el kit Calprest de Eurospital (Italia).

[0040] "Tratamiento de la enterocolitis" - como se usa en la presente, el "tratamiento de la enterocolitis" se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente. Una reducción en el nivel de calprotectina fecal se considera una disminución en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. El experto conoce cómo determinar la variación de fondo para cualquier ensayo dado. El tratamiento de la enterocolitis puede caracterizarse además por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento. El tratamiento de la enterocolitis puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente que padece el trastorno enterocolítico. Tal reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma sea menos frecuente, o menos grave, o ambos.

[0041] "Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal" - como se usa en la presente, el "tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal" se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente después del tratamiento en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido antes del tratamiento. Una reducción en el nivel de calprotectina fecal se considera una reducción en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. El tratamiento de la IBD puede caracterizarse además por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento.

[0042] El tratamiento de la IBD puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. Tal reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma sea menos frecuente, o menos grave, o ambos. Por ejemplo, el tratamiento de la IBD puede evidenciarse por episodios de dolor abdominal menos frecuentes, en donde esos episodios son además menos dolorosos (es decir, menos graves).

[0043] El tratamiento de la IBD puede caracterizarse además por períodos de tiempo más largos entre recaídas. Es decir, el tratamiento da como resultado un período de tiempo promedio más largo entre recaídas en comparación con el período de tiempo promedio para ese paciente antes del tratamiento.

[0044] "Tratamiento de la colitis ulcerativa" - como se usa en la presente, el "tratamiento de la colitis ulcerativa" se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente después del tratamiento en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido antes del tratamiento. Una reducción en el nivel de calprotectina fecal se considera una disminución en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. El tratamiento de la UC puede caracterizarse además por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento. El tratamiento de la UC puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. Tal reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma sea menos frecuente, o menos grave, o ambos.

[0045] El tratamiento de la UC puede caracterizarse además por períodos de tiempo más largos entre recaídas. Es decir, el tratamiento da como resultado un período de tiempo promedio más largo entre recaídas en comparación con el período de tiempo promedio para ese paciente antes del tratamiento.

[0046] "Tratamiento de la enfermedad de Crohn" - como se usa en la presente, el "tratamiento de la enfermedad de Crohn" se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente después del tratamiento en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido antes del tratamiento. Una reducción en el nivel de calprotectina fecal se considera una disminución en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. El tratamiento de la enfermedad de Crohn puede caracterizarse además por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento.

[0047] El tratamiento de la enfermedad de Crohn puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. Tal reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma sea menos frecuente, o menos grave, o ambos. Por ejemplo, el tratamiento de la enfermedad de Crohn puede evidenciarse por episodios de dolor abdominal menos frecuentes, en donde esos episodios son además menos dolorosos (es decir, menos graves).

[0048] El tratamiento de la enfermedad de Crohn puede caracterizarse además por períodos de tiempo más largos entre recaídas. Es decir, el tratamiento da como resultado un período de tiempo promedio más largo entre recaídas en comparación con el período de tiempo promedio para ese paciente antes del tratamiento.

[0049] "Tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a "X" mg/kg" - como se usa en la presente, el "tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a "X" mg/kg" se caracteriza por la reducción del nivel de calprotectina fecal en el paciente de más de X mg/kg antes del tratamiento, a menos de o igual a X mg/kg después del tratamiento. Es decir, cuando X=50, el tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg se caracteriza por reducir el nivel de calprotectina fecal en el paciente de más de 50 mg/kg antes del tratamiento, a menos de o igual a 50 mg/kg después del tratamiento. Cuando X=250, el tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 250 mg/kg se caracteriza por reducir el nivel de calprotectina fecal en el paciente de más de 250 mg/kg antes del tratamiento, a menos de o igual a 250 mg/kg después del tratamiento.

[0050] "Reducir la inflamación intestinal" - como se usa en la presente, una reducción en la inflamación intestinal en un paciente con enterocolitis se considera que significa que el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente después del tratamiento se reduce en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido inmediatamente antes del tratamiento.

[0051] "Carbohidratos complejos" - como se usa en la presente, el término "carbohidratos complejos" incluye tanto oligosacáridos como polisacáridos. Los "oligosacáridos" son polímeros de sacáridos que contienen de 3 a 10 unidades de sacáridos; mientras que el término "polisacáridos" incluye estructuras poliméricas más largas, tales como aquellas formadas a partir de unidades de sacáridos (o disacáridos) repetidas.

[0052] "Azúcares simples" - como se usa en la presente, el término "azúcares simples" se refiere tanto a monosacáridos como a disacáridos, a menos que se indique de cualquier otra manera.

[0053] "Azúcares reductores" - como se usa en la presente, el término "azúcares reductores" se refiere a azúcares que o bien tienen un grupo aldehído o son capaces de formar un grupo aldehído en solución a través de la isomerización. La presencia de azúcares reductores puede determinarse por medio del método de Nelson-Somogyi mediante el uso de la glucosa como el estándar de referencia (Somogyi, M. (1052) Journal of Biological Chemistry., Vol. 195., p.19; reproducido en muchos libros de texto estándar de química de carbohidratos). Aunque ciertos carbohidratos complejos (por ejemplo, almidones) pueden contener extremos reductores y, por lo tanto, cumplir con la definición de "azúcares reductores", una determinación del contenido de "azúcares reductores" en una muestra dada (por ejemplo, una muestra de preparación probiótica como se describe en la presente descripción) mediante el uso del método de Nelson-Somogyi, puede tomarse como una aproximación de la cantidad de azúcares simples en la muestra, ya que los azúcares simples contienen una mayor proporción de extremos reductores por masa unitaria que los carbohidratos complejos.

[0054] "Contenido total de carbohidratos" - como se usa en la presente, los términos "carbohidrato total" o "contenido total de carbohidratos" se refieren a la cantidad total de carbohidratos complejos y azúcares simples presentes en un producto dado (por ejemplo, una preparación probiótica como se describe en la presente descripción). El contenido total de carbohidratos puede medirse mediante el uso del ensayo de ácido fenol-sulfúrico, mediante el uso de la glucosa como estándar de referencia (Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. y Smith, F. (1956) Analytical Chemistry, vol.28., p.350).

[0055] Cuando en la presente descripción se hace referencia a la relación del contenido total de carbohidratos con respecto al contenido de azúcares reductores de un producto a base de líquido (por ejemplo, en una preparación probiótica), entonces esto debe determinarse mediante el cálculo de la relación del contenido total de carbohidratos del producto, medida mediante el método de ácido fenol-sulfúrico descrito en la presente descripción (resultado expresado en mg/ml), con respecto al contenido de azúcares reductores del producto, medido mediante el método de Nelson-Somogyi descrito en la presente descripción (resultado expresado en mg/ml).

[0056] "No lácteo" - como se usa en la presente, el término "no lácteos" se refiere a productos que no contienen y no se basan en leche de un mamífero, de acuerdo con la definición aceptada en la técnica. En consecuencia, los productos no lácteos no contienen y no se basan en leche, mantequilla, queso (que incluye queso vegetariano), yogur, crema, leche en polvo, suero, lactosa, lactoproteínas (que incluyen caseínas y caseinatos), grasa de leche anhidra o kéfir.

[0057] Tratamiento de la enterocolitis

[0058] Las preparaciones probióticas para su uso de acuerdo con las reivindicaciones proporcionan el tratamiento de la enterocolitis en un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg. En determinadas modalidades, el trastorno enterocolítico se selecciona de colitis isquémica, colitis infecciosa, enteritis e IBD (es decir, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa (UC)). En determinadas modalidades, la enterocolitis es provocada por una o más de infección, autoinmunidad o acción farmacológica (por ejemplo, mediante el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroidales (AINE)).

[0059] El tratamiento del trastorno enterocolítico se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente. En tales modalidades, una reducción en la concentración de calprotectina fecal es una reducción mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. En determinadas modalidades, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en la calprotectina fecal de al menos 10 mg/kg, opcionalmente al menos 20 mg/kg, opcionalmente al menos 30 mg/kg, opcionalmente al menos 50 mg/kg, opcionalmente al menos 100 mg/kg, opcionalmente al menos 150 mg/kg, opcionalmente al menos 200 mg/kg, opcionalmente al menos 250 mg/kg, opcionalmente al menos 300 mg/kg, en comparación con el nivel de calprotectina fecal antes del tratamiento.

[0060] En determinadas modalidades, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal de al menos 1 %, opcionalmente al menos 2 %, opcionalmente al menos 5 %, opcionalmente al menos 10 %, opcionalmente al menos 15 %, opcionalmente al menos 20 %, en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente inmediatamente antes del tratamiento. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en la concentración de calprotectina fecal de al menos 20 %.

[0061] En determinadas modalidades alternativas, el tratamiento de la enterocolitis se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento. El valor umbral puede ser 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg o 250 mg/kg de calprotectina fecal. En determinadas modalidades preferidas, el nivel de calprotectina fecal después del tratamiento es inferior a 50 mg/kg - es decir, se reduce a un nivel normal (es decir, saludable).

[0062] En determinadas modalidades preferidas, el trastorno enterocolítico es IBD. En determinadas modalidades preferidas de este tipo, el trastorno enterocolítico es la enfermedad de Crohn. En determinadas modalidades preferidas alternativas, el trastorno enterocolítico es colitis ulcerativa (UC). En determinadas modalidades de este tipo, el tratamiento de la IBD se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente. En tales modalidades, una reducción en el nivel de calprotectina fecal es una disminución en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento de la IBD se caracteriza por una reducción de la calprotectina fecal de al menos 10 mg/kg, opcionalmente al menos 20 mg/kg, opcionalmente al menos 30 mg/kg, opcionalmente al menos 50 mg/kg, opcionalmente al menos 100 mg/kg, opcionalmente al menos 150 mg/kg, opcionalmente al menos 200 mg/kg, opcionalmente al menos 250 mg/kg, opcionalmente al menos 300 mg/kg, en comparación con el nivel de calprotectina fecal antes del tratamiento.

[0063] En determinadas modalidades, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal de al menos 1 %, opcionalmente al menos 2 %, opcionalmente al menos 5 %, opcionalmente al menos 10 %, opcionalmente al menos 15 %, opcionalmente al menos 20 %, en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente inmediatamente antes del tratamiento. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en la concentración de calprotectina fecal de al menos 20 %.

[0064] En determinadas modalidades alternativas, el tratamiento de la IBD se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento. El valor umbral puede ser 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg o 250 mg/kg de calprotectina fecal. En determinadas modalidades preferidas, el nivel de calprotectina fecal después del tratamiento es inferior a 50 mg/kg - es decir, se reduce a un nivel normal (es decir, saludable).

[0065] En determinadas modalidades, el tratamiento de la IBD puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. En tales modalidades, el síntoma o síntomas exhibidos por el paciente pueden seleccionarse de dolor abdominal, incomodidad abdominal, diarrea, vómitos, estreñimiento, hemorragia rectal, frecuencia anómala de los movimientos intestinales, urgencia anómala de los movimientos intestinales, y anemia. En determinadas modalidades de este tipo, una reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma es menos frecuente, o menos grave, o ambos. Por ejemplo, el tratamiento de la IBD puede evidenciarse por episodios de dolor abdominal menos frecuentes, en donde esos episodios son además menos dolorosos (es decir, menos graves).

[0066] En determinadas modalidades, el tratamiento de la IBD puede caracterizarse además por períodos de tiempo más largos entre recaídas. Es decir, el tratamiento da como resultado un período de tiempo promedio más largo entre recaídas en comparación con el período de tiempo promedio para ese paciente antes del tratamiento.

[0067] Se apreciará que tales manifestaciones del tratamiento pueden producirse solas o en cualquier combinación. Por ejemplo, un paciente tratado con éxito puede exhibir una disminución en el nivel de calprotectina fecal de 50 mg/kg así como también un dolor abdominal menos frecuente y menos grave.

[0068] En determinadas modalidades preferidas, el trastorno enterocolítico es colitis ulcerativa (UC). En determinadas modalidades de este tipo, el tratamiento de la UC se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente. En tales modalidades, una reducción en el nivel de calprotectina fecal es una disminución en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento de la UC se caracteriza por una reducción de la calprotectina fecal de al menos 10 mg/kg, opcionalmente al menos 20 mg/kg, opcionalmente al menos 30 mg/kg, opcionalmente al menos 50 mg/kg, opcionalmente al menos 100 mg/kg, opcionalmente al menos 150 mg/kg, opcionalmente al menos 200 mg/kg, opcionalmente al menos 250 mg/kg, opcionalmente al menos 300 mg/kg, en comparación con el nivel de calprotectina fecal antes del tratamiento.

[0069] En determinadas modalidades, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal de al menos 1 %, opcionalmente al menos 2 %, opcionalmente al menos 5 %, opcionalmente al menos 10 %, opcionalmente al menos 15 %, opcionalmente al menos 20 %, en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente inmediatamente antes del tratamiento. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en la concentración de calprotectina fecal de al menos 20 %.

[0070] En determinadas modalidades alternativas, el tratamiento de la enterocolitis se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento. El valor umbral puede ser 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg o 250 mg/kg de calprotectina fecal. En determinadas modalidades preferidas, el nivel de calprotectina fecal después del tratamiento es inferior a 50 mg/kg - es decir, se reduce a un nivel normal (es decir, saludable).

[0071] En determinadas modalidades, el tratamiento de la UC puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. En tales modalidades, el síntoma o síntomas exhibidos por el paciente pueden seleccionarse de dolor abdominal, incomodidad abdominal, diarrea, vómitos, estreñimiento, hemorragia rectal, frecuencia anómala de los movimientos intestinales, urgencia anómala de los movimientos intestinales, y anemia. En determinadas modalidades de este tipo, una reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma es menos frecuente, o menos grave, o ambos. Por ejemplo, el tratamiento de la UC puede evidenciarse por episodios de dolor abdominal menos frecuentes, en donde esos episodios son además menos dolorosos (es decir, menos graves).

[0072] En determinadas modalidades, el tratamiento de la UC puede caracterizarse además por períodos de tiempo más largos entre recaídas. Es decir, el tratamiento da como resultado un período de tiempo promedio más largo entre recaídas en comparación con el período de tiempo promedio para ese paciente antes del tratamiento.

[0073] Se apreciará que tales manifestaciones del tratamiento pueden producirse solas o en cualquier combinación. Por ejemplo, un paciente tratado con éxito puede exhibir una disminución en el nivel de calprotectina fecal de 50 mg/kg así como también un dolor abdominal menos frecuente y menos grave.

[0074] En determinadas modalidades preferidas de este tipo, el trastorno enterocolítico es la enfermedad de Crohn. En determinadas modalidades de este tipo, el tratamiento de la enfermedad de Crohn se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente. En tales modalidades, una reducción en el nivel de calprotectina fecal es una disminución en la concentración de calprotectina fecal mayor que la variación de fondo en el ensayo usado para determinar dicha concentración. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento de la enfermedad de Crohn se caracteriza por una reducción en la calprotectina fecal de al menos 10 mg/kg, opcionalmente al menos 20 mg/kg, opcionalmente al menos 30 mg/kg, opcionalmente al menos 50 mg/kg, opcionalmente al menos 100 mg/kg, opcionalmente al menos 150 mg/kg, opcionalmente al menos 200 mg/kg, opcionalmente al menos 250 mg/kg, opcionalmente al menos 300 mg/kg, en comparación con el nivel de calprotectina fecal antes del tratamiento.

[0075] En determinadas modalidades, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal de al menos 1 %, opcionalmente al menos 2 %, opcionalmente al menos 5 %, opcionalmente al menos 10 %, opcionalmente al menos 15 %, opcionalmente al menos 20 %, en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente inmediatamente antes del tratamiento. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en la concentración de calprotectina fecal de al menos 20 %.

[0076] En determinadas modalidades alternativas, el tratamiento de la enterocolitis se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de un valor umbral, donde el paciente tenía un nivel de calprotectina fecal igual o superior a este valor umbral antes del tratamiento. El valor umbral puede ser 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg o 250 mg/kg de calprotectina fecal. En determinadas modalidades preferidas, el nivel de calprotectina fecal después del tratamiento es inferior a 50 mg/kg - es decir, se reduce a un nivel normal (es decir, saludable).

[0077] En determinadas modalidades, el tratamiento de la enfermedad de Crohn puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. En tales modalidades, el síntoma o síntomas exhibidos por el paciente pueden seleccionarse de dolor abdominal, incomodidad abdominal, diarrea, vómitos, estreñimiento, hemorragia rectal, frecuencia anómala de los movimientos intestinales, urgencia anómala de los movimientos intestinales, y anemia. En determinadas modalidades de este tipo, una reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma es menos frecuente, o menos grave, o ambos. Por ejemplo, el tratamiento de la enfermedad de Crohn puede evidenciarse por episodios de dolor abdominal menos frecuentes, en donde esos episodios son además menos dolorosos (es decir, menos graves).

[0078] En determinadas modalidades, el tratamiento de la enfermedad de Crohn puede caracterizarse además por períodos de tiempo más largos entre recaídas. Es decir, el tratamiento da como resultado un período de tiempo promedio más largo entre recaídas en comparación con el período de tiempo promedio para ese paciente antes del tratamiento.

[0079] Se apreciará que tales manifestaciones del tratamiento pueden producirse solas o en cualquier combinación. Por ejemplo, un paciente tratado con éxito puede exhibir una disminución en el nivel de calprotectina fecal de 50 mg/kg así como también un dolor abdominal menos frecuente y menos grave.

[0080] En determinadas modalidades, los productos y métodos de la invención proporcionan tratamiento para un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg. En determinadas modalidades de este tipo, el tratamiento del paciente se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal por debajo de 50 mg/kg. En determinadas modalidades, el paciente tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 100 mg/kg, opcionalmente superior a 150 mg/kg, opcionalmente superior a 200 mg/kg.

[0081] En determinadas modalidades, el paciente tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 250 mg/kg. En tales modalidades, el tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 250 mg/kg se caracteriza por la reducción del nivel de calprotectina fecal en el paciente de más de 250 mg/kg antes del tratamiento, a menos de o igual a 250 mg/kg después del tratamiento. En determinadas modalidades, el paciente tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 700 mg/kg. En tales modalidades, el tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 700 mg/kg se caracteriza por la reducción del nivel de calprotectina fecal en el paciente de más de 700 mg/kg antes del tratamiento, a menos de o igual a 700 mg/kg después del tratamiento.

[0082] En determinadas modalidades, el tratamiento del paciente puede caracterizarse además por una reducción en uno o más síntomas exhibidos por el paciente. En tales modalidades, el síntoma o síntomas exhibidos por el paciente pueden seleccionarse de dolor abdominal, incomodidad abdominal, diarrea, vómitos, estreñimiento, hemorragia rectal, frecuencia anómala de los movimientos intestinales, urgencia anómala de los movimientos intestinales, y anemia. En determinadas modalidades de este tipo, una reducción en un síntoma puede caracterizarse porque el síntoma es menos frecuente, o menos grave, o ambos. Por ejemplo, el tratamiento de la enfermedad de Crohn puede evidenciarse por episodios de dolor abdominal menos frecuentes, en donde esos episodios son además menos dolorosos (es decir, menos graves).

[0083] Se apreciará que tales manifestaciones del tratamiento pueden producirse solas o en cualquier combinación. Por ejemplo, un paciente tratado con éxito puede exhibir una disminución en el nivel de calprotectina fecal por debajo del umbral indicado, así como también un dolor abdominal menos frecuente y menos grave.

[0084] Además, se proporcionan preparaciones y métodos probióticos como se definen en la presente descripción para su uso en la reducción de la inflamación intestinal en un paciente que tiene enterocolitis. En tales modalidades, la reducción de la inflamación intestinal se indica por una reducción en el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente después del tratamiento, en comparación con el nivel de calprotectina fecal antes del tratamiento. En determinadas modalidades de este tipo, la reducción en el nivel de calprotectina fecal es mayor que el nivel de fondo del ensayo usado para las mediciones. En determinadas modalidades, la reducción se caracteriza por una reducción en el nivel de calprotectina fecal de al menos 1 %, opcionalmente al menos 2 %, opcionalmente al menos 5 %, opcionalmente al menos 10 %, opcionalmente al menos 15 %, opcionalmente al menos 20 %, en comparación con el nivel de calprotectina fecal exhibido por el paciente inmediatamente antes del tratamiento. En determinadas modalidades preferidas, el tratamiento exitoso se caracteriza por una reducción en la concentración de calprotectina fecal de al menos 20 %.

[0085] En determinadas modalidades preferidas, la preparación o el método es para tratar a un paciente en remisión clínica, opcionalmente un paciente que ha estado en remisión clínica durante al menos 3 meses. En tales casos, la remisión clínica se define como se expone en la presente descripción. Es decir, un paciente que padece de enterocolitis (es decir, un trastorno enterocolítico tal como la IBD) está en remisión clínica si no ha habido un deterioro progresivo en el trastorno enterocolítico (por ejemplo, histológicamente y/o en la gravedad de los síntomas) durante un período de al menos 1 mes. Cuando un paciente ha estado en remisión clínica durante al menos 3 meses, el 1 mes de no deterioro requerido para la clasificación como en remisión clínica se incluye en el término de 3 meses.

[0086] En determinadas modalidades preferidas, la preparación se administra por vía oral. En determinadas modalidades preferidas, la preparación se administra a una dosis de 1 mg/kg del paciente, al menos una vez al día. En determinadas modalidades, la preparación se administra durante al menos 1 mes.

[0087] En determinadas modalidades, la preparación probiótica se proporciona junto con una terapia complementaria, por ejemplo, un 5-ASA, por ejemplo, mesalazina.

[0088] En determinadas modalidades preferidas, el paciente es un mamífero, preferentemente, un ser humano. Cepas bacterianas probióticas

[0089] En cada aspecto de la invención, las bacterias probióticas incluidas en la preparación probiótica son una combinación deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilusyLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosus.

[0090] La referencia aLactobacillus caseipretende incluir cualquier cepa bacteriana clasificada originalmente comoLactobacillus caseipero ahora reclasificada comoLactobacillus rhamnosus.En consecuencia, la referencia aLactobacillus rhamnosuspueden incluir cepas bacterianas que se han clasificado previamente comoLactobacillus casei.

[0091] El producto Symprove<™>(que contieneEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus caseiyLactobacillus acidophilus) se demostró que es particularmente efectivo para reducir la inflamación intestinal en el estudio clínico descrito en la presente descripción. La cepa deLactobacillus caseien Symprove<™>se caracterizó originalmente comoLactobacillus casei,pero ahora se ha reclasificado como el estrechamente relacionadoLactobacillus rhamnosus.

[0092] Un factor clave para lograr la eficacia terapéutica en el tratamiento de la enterocolitis, medida como una reducción en los niveles de calprotectina fecal, es la capacidad de suministrar un alto recuento de bacterias probióticas viables y metabólicamente activas al tracto gastrointestinal del paciente que se somete al tratamiento. Para lograr esto, en modalidades ilustrativas, la población total de bacterias metabólicamente activas en la preparación probiótica puede estar en el intervalo de 1,0 x 10<6>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, preferentemente, en el intervalo de 1,0 x 10<7>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro. Cada cepa individual de bacterias metabólicamente activas presentes en la preparación probiótica puede estar presente en el intervalo de 1,0 x 10<5>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, con mayor preferencia, en el intervalo de 1,0 x 10<7>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro.

[0093] Las preparaciones probióticas para su uso de acuerdo con las reivindicaciones comprenden una combinación deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosus,y se prefiere que al menos una y preferentemente cada una de estas cepas esté presente en la preparación en el intervalo de 1,0 x 10<6>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, preferentemente, en el intervalo de 1,0 x 10<7>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro. Las preparaciones probióticas para su uso de acuerdo con las reivindicaciones comprenden ademásLactobacillus acidophilus,y la población deL.acidophiluspuede ser menor que 1,0 x 10<5>células viables por mililitro.

[0094] En una modalidad ilustrativa, la preparación puede comprender una combinación deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosus,en donde el recuento bacteriano para cada una de estas cepas bacterianas está en el intervalo de 1,0 x 10<5>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, con mayor preferencia en el intervalo de 1,0 x 10<7>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro.

[0095] Las preparaciones probióticas para su uso de acuerdo con las reivindicaciones contienen ademásLactobacillus acidophilus.La población deL. acidophiluspuede ser menor que 1,0 x 10<5>células viables por mililitro.

[0096] Aunque el recuento bacteriano total en la preparación descrita en la presente puede parecer menor que el de las preparaciones probióticas liofilizadas típicas, es importante señalar que las bacterias son viables. Como se señala en otra parte en la presente descripción, se cree que la naturaleza viable de las bacterias en la preparación probiótica descrita en la presente descripción les permite establecerse más rápidamente en el tracto gastrointestinal de un paciente, quizás dentro de 15 a 20 minutos después de la ingestión. Se cree que tal establecimiento rápido contribuye a los efectos beneficiosos de la preparación en el tratamiento de la enterocolitis, por ejemplo, la IBD.

[0097] Otra ventaja clave de la preparación probiótica descrita en la presente descripción, y que se ha demostrado que es útil en el tratamiento de la enterocolitis, es que las cepas probióticas son significativamente más estables a pH 3 que los productos probióticos patentados a base de leche o liofilizados, y por lo tanto es más probable que sean capaces de tolerar las duras condiciones que se encuentran en el tracto GI humano. En particular, se ha demostrado que las bacterias probióticas en la preparación descrita en la presente descripción son estables tanto a pH 6 como a pH 3. En modalidades ilustrativas, las bacterias probióticas en la preparación probiótica son estables cuando se mantienen en cultivo a pH 3 durante un período de al menos 6 horas. En este contexto, "estable" puede entenderse que significa que cuando las bacterias se cultivan a pH 3, 37 °C, en medio de cultivo estándar (por ejemplo, caldo MRS), entonces durante un período de al menos 6 horas, el recuento bacteriano (cfu/ml) no cae en más de 0,5 unidades log<10>por debajo del recuento bacteriano (cfu/ml) en el tiempo cero. En modalidades específicas, el recuento bacteriano debe permanecer por encima de 10<6>cfu/ml durante al menos 6 horas cuando se cultivan a pH 3, 37 °C, en caldo MRS estándar. De hecho, se puede observar que el recuento bacteriano aumenta cuando se cultivan en estas condiciones.

[0098] Composición de la preparación probiótica

[0099] La preparación probiótica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones y que se muestra en la presente descripción para proporcionar un tratamiento efectivo de la enterocolitis (por ejemplo, IBD) comprende una mezcla deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilusyLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosusen un sustrato líquido no lácteo. La función del sustrato es soportar y mantener la viabilidad de las bacterias probióticas, particularmente durante el almacenamiento de la preparación, de manera que las bacterias probióticas puedan mantenerse y después suministrarse al paciente, en una forma viable y metabólicamente activa. Para lograr este objetivo, el sustrato líquido contiene típicamente una mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples. En particular, el sustrato puede comprender una mezcla de polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos. En determinadas modalidades, la preparación probiótica puede caracterizarse por la relación del contenido total de carbohidratos con respecto al contenido de azúcares reductores de la preparación, lo que refleja la mezcla compleja de polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos presentes. En modalidades ilustrativas, la relación del contenido total de carbohidratos con respecto al contenido de azúcar reductores de la preparación está en el intervalo de 8:1 a 2:1, más típicamente en el intervalo de 5:1 a 2,5:1, o en el intervalo de 4:1 a 3:1. Los medios para medir el contenido total de carbohidratos y el contenido de azúcares reductores, y calcular la relación entre ellos, son como se definieron anteriormente.

[0100] En otras modalidades ilustrativas de la preparación probiótica, el contenido total de carbohidratos de la preparación puede estar en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml, o en el intervalo de 20 mg/ml a 30 mg/ml y el contenido total de azúcares reductores puede estar en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml, o en el intervalo de 5 mg/ml a 10 mg/ml.

[0101] La preparación probiótica comprende además preferentemente componentes proteicos y peptídicos. Típicamente, la cantidad total de proteínas y péptidos presentes en la preparación probiótica está en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml, y la cantidad total de péptidos de alto peso molecular (peso molecular mayor que 5000 Daltons) está en el intervalo de 100 µg/ml a 300 µg/ml. En una modalidad específica, la concentración de proteínas y péptidos puede ser de aproximadamente 2 mg/ml, y la concentración de péptidos de alto peso molecular puede ser de aproximadamente 250 μg/ml.

[0102] La preparación probiótica puede contener componentes adicionales tales como, por ejemplo, celulosa, almidón, β-glucanos, pentosanos, polifenoles, ácidos ribonucleicos, lípidos, fosfatos, flavonoides, aminoácidos, vitaminas (B<1>, B<2>, C y E), silicatos y oligoelementos.

[0103] La preparación probiótica puede comprender un extracto de cebada germinada que contiene las cepas bacterianas probióticas deseadas.

[0104] Una preparación probiótica descrita en la presente descripción comprende extracto de cebada germinada y una combinación deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosus,en donde el recuento bacteriano para cada una de estas cepas bacterianas está en el intervalo de 1,0 x 10<5>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, con mayor preferencia, en el intervalo de 1,0 x 10<7>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, y contieneLactobacillus acidophilus.

[0105] Una preparación probiótica descrita en la presente descripción para su uso en el tratamiento de la enterocolitis es una preparación probiótica que puede obtenerse mediante el método descrito en la presente descripción más abajo. En determinadas modalidades, tal preparación comprende una combinación deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosus,en donde el recuento bacteriano para cada una de estas cepas bacterianas está en el intervalo de 1,0 x 10<5>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, con mayor preferencia en el intervalo de 1,0 x 10<7>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro, y contieneLactobacillus acidophilus.

[0106] Pueden añadirse componentes adicionales a la preparación probiótica, tales como saborizantes y/o colorantes, para mejorar la palatabilidad para los pacientes humanos.

[0107] El pH de la preparación puede controlarse convenientemente mediante la adición de un tampón adecuado o una combinación de agentes tampones. Los tampones preferidos incluyen, por ejemplo, tampones de citrato o fosfato de trisodio. El pH de la preparación a base de líquido descrita en la presente descripción se mantiene típicamente en el intervalo de 3,8 a 4,5, y en particular a aproximadamente pH 4,0, durante el almacenamiento a largo plazo. La preparación probiótica puede almacenarse a cualquier temperatura de 4 °C hasta temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C). El producto Symprove<™>descrito en la presente descripción ha demostrado permanecer estable (en términos de recuento bacteriano) durante un período de al menos 6 meses cuando se almacena a aproximadamente 4 °C, y durante al menos 4 meses cuando se almacena a 25 °C.

[0108] La preparación puede comprender adicionalmente un agente antifúngico tal como, por ejemplo, sorbato de potasio esterilizado y/o un antioxidante, tal como vitamina C.

[0109] En una modalidad preferida, el sustrato de crecimiento puede contener materia en partículas, por ejemplo, partículas que no exceden 1 mm de diámetro.

[0110] La modalidad más preferida de la preparación probiótica, que se muestra en la presente descripción que es efectiva en el tratamiento de la enterocolitis medida por una reducción en la concentración de calprotectina fecal es el producto denominado Symprove<™>, que contiene células viables metabólicamente activas deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus caseiyLactobacillus acidophilus,que pueden prepararse de acuerdo con los ejemplos proporcionados en la presente descripción. La cepa deLactobacillus caseien Symprove<™>se caracterizó originalmente comoLactobacillus casei,pero ahora se ha reclasificado como el estrechamente relacionadoLactobacillus rhamnosus.

[0111] El producto Symprove<™>es a base de agua, con un contenido de agua típico de aproximadamente 95 % (v/v). Este alto contenido de agua es ventajoso ya que puede dar como resultado que el producto sea percibido por el sistema GI humano como una bebida en lugar de "alimento", evitando así activar la digestión.

[0112] La preparación probiótica puede estar además libre de lactosa, ya que no es a base de leche, y libre de gluten. En particular, el producto Symprove<™>demuestra cumplir con los criterios aceptados para la clasificación como "sin gluten" en base al ELISA de la gliadina. Los lotes del producto contienen típicamente menos de 10 ppm de gluten cuando se miden mediante el ELISA de la gliadina.

[0113] Fabricación de la preparación probiótica

[0114] La preparación probiótica para su uso en el tratamiento de la enterocolitis (por ejemplo, IBD) como se describe en la presente descripción, puede prepararse mediante el cultivo de una o más cepas bacterianas probióticas en un sustrato de crecimiento líquido, tal como, por ejemplo, un extracto de cebada germinada. El sustrato de crecimiento puede prepararse en sí mismo a partir de la semilla o cebada de muestra de malteado mediante el uso del proceso de fabricación descrito en la presente descripción más abajo. Este método es sustancialmente como se describe en el documento WO 2006/035218.

[0115] El sustrato de crecimiento puede prepararse de acuerdo con un método que comprende:

[0116] (i) someter el cereal malteado a una etapa de maceración en la que el cereal malteado se mezcla con líquido acuoso y se somete a condiciones de tiempo y temperatura que limitan el grado de conversión de carbohidratos complejos a azúcares simples de manera que se obtiene una mezcla de carbohidratos complejos, azúcares simples, proteínas y péptidos; y

[0117] (ii) separar la mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples, proteínas y péptidos del cereal malteado gastado para obtener un sustrato de crecimiento.

[0118] Los términos "cereal malteado" o "malta", como se usan en la presente, se refieren al producto de un proceso de malteado aplicado a los granos de cereal. El malteado es un proceso bien conocido en la técnica de la elaboración de cerveza.

[0119] En un proceso de malteado típico, los granos de cereales (por ejemplo, semilla o cebada de muestra de malteado) se germinan para inducir la movilización de nutrientes de almacenamiento. Las semillas en germinación producen una serie de enzimas para movilizar proteínas y carbohidratos de almacenamiento, que incluyen las α-amilasas que hidrolizan el almidón en maltosa. Un cereal ilustrativo es la cebada, pero pueden usarse también otros cereales, tales como arroz, trigo, maíz y avena o incluso mezclas de estos. El proceso de germinación se conoce bien generalmente. Se apreciará que el método puede llevarse a cabo al proporcionar granos malteados o un sustrato sintético que comprende una mezcla de carbohidratos, proteínas y enzimas. Típicamente, los granos malteados se trituran antes del procesamiento adicional. La ruptura de los granos mediante laminado facilita el acceso al agua y la extracción de nutrientes durante la etapa de maceración, mientras que evitar la fragmentación de los granos ayuda en la separación posterior del sustrato de crecimiento de los granos malteados gastados.

[0120] La malta preparada se somete a una etapa de maceración que se asemeja a la etapa de maceración usada en los métodos de elaboración de cerveza (ver, por ejemplo, Kunze, W. Technology Brewing and Malting (1996)). El término "maceración" se conoce bien en el campo de la elaboración de cerveza y se refiere a un proceso en donde los granos malteados se agitan en presencia de agua calentada a temperaturas definidas para preparar un mosto. Durante la etapa de maceración, los carbohidratos complejos en los granos malteados se descomponen en maltosa.

[0121] El método descrito en la presente descripción implica además una etapa de maceración en la que los granos de cereales malteados se mezclan con un líquido acuoso (típicamente agua) y la mezcla se calienta a diversas temperaturas definidas. Sin embargo, esta etapa de maceración no se ajusta a un proceso típico de maceración de cervecería. Los cerveceros pretenden convertir la mayor cantidad de carbohidratos en azúcares simples como sea posible, para la posterior fermentación en alcohol. Por el contrario, las condiciones de la etapa de maceración descritas en la presente descripción se eligen específicamente para limitar el grado de conversión a azúcares simples, lo que deja cantidades significativas de carbohidratos en formas oligoméricas y poliméricas más complejas.

[0122] El grado de conversión del carbohidrato puede limitarse, de manera que la cantidad de azúcares reductores presentes en el sustrato de crecimiento resultante, expresada como un porcentaje (p/p) del contenido total de carbohidratos, esté en el intervalo de 10 % (p/p) a 50 % (p/p). Como se indicó anteriormente, el contenido de azúcares reductores medido por el método de Nelson-Somogyi es una buena aproximación de la cantidad total de azúcares simples presentes.

[0123] La conversión limitada deseada de azúcares complejos a simples puede lograrse mediante el aumento de la temperatura en la etapa de maceración durante un corto período de tiempo, típicamente 30 minutos, sin permitir que la mezcla de granos malteados/agua repose a temperaturas intermedias. Los procesos de elaboración de cerveza tradicionales incluyen reposos a 60-65 °C y 70-74 °C, ya que esto permite que las enzimas produzcan altas concentraciones de azúcares simples (principalmente maltosa). En consecuencia, la etapa de maceración descrita en la presente descripción no comprende reposos a temperaturas en el intervalo de 60 °C a 65 °C y/o a temperaturas en el intervalo de 70 °C a 74 °C.

[0124] La etapa de maceración puede comprender mezclar el cereal malteado con agua a una temperatura en el intervalo de 30 °C a 45 °C, reposar la mezcla durante 1 a 2 horas, aumentar la temperatura a una temperatura en el intervalo de 75 °C a 85 °C durante un período de tiempo en el intervalo de 20 a 60 minutos, preferentemente, 30 minutos, y después reposar la mezcla a una temperatura en el intervalo de 75 °C a 85 °C durante un período de tiempo en el intervalo de 30 a 90 minutos. A la temperatura más alta, cualquier enzima presente en la mezcla se inactiva y se pueden extraer los nutrientes. Generalmente, se prefieren temperaturas más altas en el intervalo de 76 °C a 80 °C y específicamente 78 °C. La temperatura en esta etapa debe ser suficientemente alta durante suficiente tiempo para inactivar todas las enzimas presentes en la preparación. Se apreciará que la temperatura y los tiempos precisos usados pueden variar algo de acuerdo con el tipo de cereal usado.

[0125] El proceso descrito aquí limita específicamente la cantidad de conversión de azúcares complejos a azúcares simples. Además, el reposo inicial a una temperatura en el intervalo de 30 °C a 45 °C proporciona una ventaja adicional ya que maximiza la liberación de aminoácidos y péptidos. Se prefieren generalmente las temperaturas hacia el extremo superior de este intervalo, es decir, de 40 °C a 45 °C o específicamente aproximadamente 45 °C. El propósito de esta etapa es hidrolizar las proteínas de almacenamiento presentes en los granos de cereales en aminoácidos y péptidos disponibles. La combinación óptima de tiempo y temperatura para lograr la hidrólisis deseada puede variar algo en dependencia de los tipos de granos usados.

[0126] La presencia de altas concentraciones de proteínas, péptidos y aminoácidos es conveniente en un sustrato de crecimiento que se usará para soportar el crecimiento de microorganismos, ya que proporciona una fuente útil de nitrógeno. Los procesos de maceración típicos usados en la elaboración de cerveza tradicional generalmente no incluirían un reposo a una temperatura en este intervalo, ya que los cerveceros normalmente no buscan lograr un alto contenido de proteínas o aminoácidos en un mosto destinado a la fermentación para producir alcohol.

[0127] Cuando se completa la etapa de maceración, por ejemplo, todos los nutrientes deseados se han extraído de los granos malteados ahora "gastados", la mezcla resultante que comprende carbohidratos complejos y azúcares simples, proteínas y péptidos puede separarse de los granos gastados para obtener un sustrato de crecimiento mediante el uso de cualquier medio adecuado. Típicamente, esto implicará una filtración gruesa, por ejemplo, mediante el uso de un filtro de 1 mm tal como una canasta de alambre en cuña, que produce una solución que contiene partículas gruesas. Es una característica del proceso descrito en la presente descripción que el sustrato de crecimientonoestá clarificado, como sería generalmente el caso con un mosto preparado durante la elaboración de cerveza estándar. En la elaboración de cerveza tradicional, el mosto generalmente se clarifica para eliminar todas las partículas gruesas, de esta manera se produce un líquido transparente. La presencia de algunas materias en partículas en un sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con el proceso descrito en la presente descripción es ventajosa con respecto al uso posterior en el soporte del crecimiento de bacterias, ya que proporciona nutrientes de liberación lenta y superficies de partículas para la adhesión de cultivos bacterianos.

[0128] Si es necesario, el sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con el proceso descrito en la presente descripción puede esterilizarse antes de su uso posterior. Como se apreciará, esto puede llevarse a cabo al hervir durante aproximadamente una hora o mediante autoclaveado a 120 °C durante aproximadamente 20 minutos.

[0129] Puede añadirse un tampón o varios componentes tampones al sustrato de crecimiento si es necesario. Los tampones preferidos son tampones de citrato o fosfato de trisodio. Si el sustrato de crecimiento va a esterilizarse, el(los) tampón(es) puede(n) añadirse antes, durante o después de la esterilización, según convenga.

[0130] El sustrato de crecimiento preparado se inocula a continuación con las cepas bacterianas probióticas deseadas y se cultivan hasta que alcanzan el recuento bacteriano deseado requerido en la preparación probiótica. En una modalidad específica, las bacterias probióticas se cultivan en el sustrato de crecimiento hasta que alcanzan una concentración de entre 1 x 10<6>y 1 x 10<9>unidades formadoras de colonias por mililitro. En este punto, el cultivo (o fermentación) puede enfriarse hasta aproximadamente 4 °C y la combinación de temperatura, pH, fase de crecimiento y composición residual del sustrato proporciona condiciones de equilibrio que permiten mantener un estado de crecimiento cercano al equilibrio durante el almacenamiento a largo plazo. En este estado cercano al equilibrio, que puede mantenerse durante un período de al menos 5-6 meses, se mantiene la población de bacterias probióticas metabólicamente activas, típicamente en el intervalo de 10<6>a 10<9>células viables por mililitro. Se apreciará que la cantidad precisa de células viables en el estado cercano al equilibrio puede variar algo en dependencia de la especie de bacterias probióticas usadas. Típicamente, el recuento bacteriano (cfu/ml) es "estable", lo que significa que no varía en más de 1 unidad log<10>, o con mayor preferencia en más de 0,5 unidades log<10>, cuando el producto se almacena a 4 °C durante 5 meses y/o cuando se almacena a 25 °C durante 4 meses.

[0131] Este método de fabricación implica una etapa de crecimiento en la que las bacterias probióticas se cultivan en un sustrato de crecimiento hasta que alcanzan una concentración que permite que se logre la condición cercana al equilibrio durante el almacenamiento posterior. Es una característica importante del método que el sustrato de crecimiento usado proporciona un suministro de nutrientes equilibrado que contiene una mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples, en donde una alta proporción del contenido de carbohidratos tiene forma de carbohidratos complejos que pueden usarse como fuente de energía por las bacterias probióticas. Esta mezcla ayuda a limitar inmediatamente la energía disponible durante la etapa de crecimiento. La composición y las características preferidas del sustrato de crecimiento es/son preferentemente como se describió anteriormente. El sustrato de crecimiento se prepara preferentemente a partir de granos de cereal malteados mediante el uso del método de fabricación descrito en la presente descripción, y es típicamente un extracto de cebada germinada. Se apreciará, sin embargo, que no es estrictamente necesario usar un sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con este método. Se pueden lograr resultados similares mediante el uso de un sustrato de crecimiento preparado sintéticamente mediante la mezcla de las proporciones requeridas de carbohidratos complejos y azúcares simples, proteínas y péptidos.

[0132] La etapa de crecimiento debe llevarse a cabo de manera que se tenga cuidado de no hacer crecer las bacterias probióticas durante demasiado tiempo, para evitar producir condiciones ácidas que de cualquier otra manera inhibirían el crecimiento adicional, así como también limitar el período de almacenamiento de la preparación resultante. Por otro lado, si la etapa de crecimiento se termina prematuramente, esto limitará la producción de biomasa. El pH de la preparación durante el crecimiento de las bacterias probióticas puede usarse como indicador del estado cercano al equilibrio. En una modalidad típica, los cultivos de bacterias del ácido láctico pueden crecer hasta que se alcance un pH de 4,5 /- 0,3 unidades.

[0133] Se apreciará que el pH del sustrato de crecimiento puede variar algo en dependencia del intervalo de pH óptimo para las bacterias probióticas usadas. En una modalidad típica (adecuada para las bacterias del ácido láctico) el pH debe mantenerse en el intervalo de 3,8 a 4,5 durante el almacenamiento. Preferentemente, se añaden tampones, tales como citratos o fosfatos de trisodio, al sustrato de crecimiento para controlar el pH durante el crecimiento de las bacterias probióticas y el almacenamiento posterior.

[0134] Se apreciará que el momento exacto de la etapa de crecimiento de las bacterias probióticas hasta un estado cercano al equilibrio depende de la especie usada. El crecimiento de las bacterias probióticas puede llevarse a cabo en cualquier aparato de cultivo adecuado. En modalidades específicas, la etapa de crecimiento puede llevarse a cabo por medio de fermentación en un recipiente de fermentación.

[0135] Si las especies de los génerosEnterococcusyLactobacillusse fueran a cultivar mediante el uso de medios de crecimiento "convencionales" que consisten en gran parte de azúcares simples fermentables, el exceso de suministro de energía conduciría a una producción excesiva de ácido por parte de las bacterias del ácido láctico, lo que limitaría la producción de biomasa y la vida útil del cultivo resultante. Por el contrario, la mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples presentes en el sustrato de crecimiento usado en el método de fabricación descrito en la presente descripción, suministra energía para el crecimiento en la etapa de crecimiento inicial y también para el mantenimiento durante el almacenamiento del producto.

[0136] La etapa de crecimiento puede llevarse a cabo mediante el uso de una sola especie de bacterias probióticas, y dos o más especies bacterianas diferentes pueden cultivarse independientemente en medios de crecimiento separados y a continuación mezclarse antes o después de la etapa de enfriamiento. Los sustratos de crecimiento usados para el cultivo independiente de dos o más especies bacterianas diferentes pueden ser los mismos o de composición diferente. Por lo tanto, es posible optimizar las condiciones de crecimiento para cultivos de especies bacterianas individuales y después combinar los cultivos para su almacenamiento en condiciones que permitan el mantenimiento del crecimiento en equilibrio para cada una de las especies individuales en el cultivo.

[0137] En otros métodos de fabricación, dos o más especies bacterianas diferentes pueden cultivarse juntas en un solo cultivo en el mismo sustrato de crecimiento, siempre y cuando sus tasas de crecimiento sean comparables de manera que una especie no domine la población.

[0138] Después de la etapa de crecimiento, la preparación probiótica puede analizarse mediante métodos estándar para determinar la pureza microbiológica y la enumeración de las bacterias probióticas. También es posible cultivar dos o más combinaciones diferentes de bacterias probióticas juntas en sustratos de crecimiento separados y después combinar los cultivos juntos en una preparación probiótica final. Un cultivo de combinación podría mezclarse de manera similar con un cultivo de una sola especie bacteriana.

[0139] Las cultivos iniciadores para la etapa de crecimiento del método incluyen, por ejemplo, bacterias liofilizadas o cultivos líquidos.

[0140] Se apreciará que la preparación probiótica puede usarse inmediatamente, pero más típicamente la preparación se almacenará antes de su uso. La temperatura óptima para el almacenamiento con el fin de mantener el estado de crecimiento cercano al equilibrio en el cultivo es de aproximadamente 4 °C, pero el lector experto apreciará que la temperatura de almacenamiento podría variar un poco. Como se indicó anteriormente, la preparación probiótica es estable durante al menos 4 meses incluso cuando se almacena a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C). Por conveniencia, alícuotas de la preparación probiótica producida mediante el método pueden dispensarse en empaque estéril adecuado antes del almacenamiento a largo plazo. Una ventaja clave de la preparación probiótica descrita en la presente descripción es que el producto mantiene la viabilidad e integridad [de las bacterias probióticas] cuando se almacena durante períodos prolongados, típicamente durante al menos 5 o 6 meses. Sin embargo, se apreciará que no es esencial para el método que la preparación probiótica debarealmentealmacenarse durante 5-6 meses antes de su uso.

[0141] Para evitar el crecimiento de hongos o levaduras, se puede añadir un agente antifúngico, tal como sorbato de potasio estéril, antes del almacenamiento de la preparación probiótica. Los agentes antifúngicos son principalmente para evitar el deterioro por levaduras o hongos durante el uso por los usuarios finales, una vez que se ha abierto un contenedor del producto. Además, puede añadirse un antioxidante, por ejemplo, vitamina C, para ayudar a prevenir el deterioro del producto durante el almacenamiento. Se apreciará que también pueden usarse otros agentes bien conocidos en la técnica como agentes antifúngicos o antioxidantes.

[0142] Un método alternativo para producir la preparación probiótica que no requiere una etapa de crecimiento activa implica simplemente inocular el sustrato de crecimiento (por ejemplo, el extracto de cebada germinada preparado como se describe en la presente descripción) con cultivos iniciadores de bacterias probióticas. Las cultivos iniciadores para el método incluyen, por ejemplo, bacterias liofilizadas o cultivos líquidos. El sustrato de crecimiento puede inocularse con más de una especie bacteriana. Preferentemente, la concentración de las células viables en el cultivo iniciador es superior a 10<6>células viables por mililitro.

[0143] La invención se entenderá aún más con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes: Ejemplo 1: Producción de un sustrato de crecimiento, mediante el uso de un medio a base de cebada.

[0144] (A) Germinación (malteado)

[0145] Día 1

[0146] La cebada (semillas o granos de muestra de malteado) se remojó en agua durante 2 a 24 horas, en dependencia del lote de grano. Puede incluirse hipoclorito sódico (lejía) al 0,1 % (p/v) en el agua para inhibir el crecimiento de contaminantes durante la fase de germinación. Después de 4 horas, se drenó el agua de los granos y los granos se dejaron reposar a temperatura ambiente de 10 a 30 °C durante aproximadamente 1 día. Día 2

[0147] Los granos se sumergieron en agua limpia durante otro período de 4 horas. Puede añadirse peróxido de hidrógeno (0,1 % p/v) al agua para este y remojos posteriores. El peróxido de hidrógeno proporciona oxígeno para los granos en germinación, y actúa como desinfectante. Alternativamente, puede usarse hipoclorito sódico. Después de 4 horas, se drenó el agua de los granos y los granos se dejaron reposar durante aproximadamente 1 día. La agitación ocasional (por ejemplo, cada 4 horas) de los granos puede mejorar la germinación al aumentar el intercambio gaseoso, proporcionar oxígeno y eliminar el dióxido de carbono.

[0148] Día 3 en adelante

[0149] El ciclo de remojo, drenaje y reposo se continuó hasta que los brotes de raíz emergentes en los granos en germinación tenían de 2 a 4 mm de largo. Este estado de crecimiento indicó que los granos habían producido enzimas para la movilización de nutrientes almacenados. Estas enzimas son fundamentales para la producción posterior del medio de crecimiento, durante el 'macerado'. Podría permitirse una modificación más extensa de los granos, dejando la fase de germinación hasta que los brotes de raíz tengan varios milímetros de largo. Sin embargo, un crecimiento excesivo convertirá simplemente los nutrientes en raíces y brotes de plantas, que no pueden usarse en la fermentación.

[0150] (B) Laminado

[0151] Cuando los granos habían germinado lo suficiente, se molieron a continuación con un molino de rodillos. El molino se ajustó de manera que los granos se agrietaron pero no se fragmentaron o se aplanaron completamente. La ruptura de los granos permite el acceso al agua y la extracción de nutrientes durante la maceración, mientras que evitar la fragmentación de los granos ayuda en las etapas de filtración.

[0152] (C) Preparación de un sustrato de crecimiento.

[0153] Los granos germinados y molidos se mezclaron con suficiente agua para cubrirlos, a 45 °C, y la mezcla se mantuvo a 45 °C durante 1 hora.

[0154] Después de 1 hora a 45 °C, la temperatura se aumentó a 78 °C durante un período de 30 minutos.

[0155] La mezcla se dejó reposar a 78 °C durante 1 hora. Después del reposo a 78 °C, los granos gastados se separaron por filtración. Se usó un filtro relativamente grueso (por ejemplo, una cesta de alambre en cuña de 1 mm de hueco) que produjo una solución que contenía cantidades significativas de sólidos suspendidos. Los granos gastados se descartaron y el líquido se trató a continuación térmicamente para pasteurizarlo o esterilizarlo. En este experimento en particular, el líquido se hirvió durante 45 minutos. Después se añadió un tampón (citrato de trisodio al 0,5 % (p/v)) y la mezcla se hirvió durante 15 minutos más para producir el sustrato de crecimiento final.

[0156] Ejemplo 2: Análisis del sustrato de crecimiento

[0157] (a) Análisis de carbohidratos:

[0158] El contenido total de carbohidratos se determinó mediante el uso del ensayo de fenol-ácido sulfúrico, con la glucosa como estándar de referencia. (Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. y Smith, F. (1956) Analytical Chemistry, vol.28., p.350).

[0159] Los azúcares reductores se determinaron mediante el uso del método de Nelson-Somogyi, nuevamente con la glucosa como estándar de referencia. (Somogyi, M. (1952) Journal of Biological Chemistry., vol.195., p.19). Tanto los azúcares complejos como los simples tienen extremos reductores, pero los azúcares simples tienen un mayor número de extremos reductores por masa unitaria. Por lo tanto, aunque el método de Nelson-Somogyi sí detecta azúcares complejos, la señal es tan baja que es insignificante. Por lo tanto, el método de Nelson-Somogyi da una buena aproximación del nivel de azúcares simples en una muestra.

[0160] Resultados:

[0161] Los azúcares totales en el sustrato están en el intervalo de 20 a 40 mg/ml (miligramos por mililitro)

[0162] Los azúcares reductores están en el intervalo de 5 a 20 mg/ml.

[0163] (b) Análisis de proteínas y péptidos:

[0164] La proteína total se determinó mediante el uso de dos ensayos, con la albúmina sérica bovina como estándar de referencia:

[0165] (i) El reactivo de Biuret (Itzhaki, R. F y Gill, D. M. (1964) Analytical Biochemistry, Vol.9., p.401-410. (ii) El método de Lowry, como lo modificaron Ohnishi y Barr. (Ohnishi, S. T. y Barr, J. K. (1978) Journal of Biological Chemistry, Vol.193, p.265).

[0166] Los péptidos de peso molecular superior a 5000 daltons se determinaron mediante el uso del reactivo de Bradford (Bradford, M. M. (1976) Analytical Biochemistry, Vol.72, p.248-254).

[0167] Resultados:

[0168] La proteína total y los péptidos están en el intervalo de 1 a 2 miligramos por mililitro.

[0169] Los péptidos de alto peso molecular (mayores de 5000 daltons) están en el intervalo de 100 a 300 microgramos por mililitro.

[0170] Ejemplo 3: Producción de un cultivo de bacterias metabólicamente activas

[0171] (A) Fermentación

[0172] El sustrato de crecimiento preparado de acuerdo con el ejemplo 1 se enfrió hasta 37 °C y se añadieron los cultivos bacterianos. Los ejemplos de un inóculo adecuado son bacterias liofilizadas o cultivos iniciadores líquidos (típicamente 1 % (v/v) de un cultivo durante la noche en caldo nutritivo).

[0173] En este ejemplo, las siguientes bacterias se cultivaron en dos recipientes:

[0174] (i)Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum;

[0175] (ii) Una cepa deLactobacillus caseique ahora se ha reclasificado comoLactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus

[0176] La fermentación se llevó a cabo durante 16-20 horas, hasta que el pH alcanzó 4,5 /- 0,3 unidades. Después, la mezcla de fermentación se enfrió hasta 4 °C y se sometió a técnicas estándar para evaluar la calidad (para determinar la pureza microbiológica y la enumeración de bacterias).

[0177] En este punto, se puede añadir sorbato de potasio estéril (0,005 % p/v de concentración final) al caldo fermentado. Esto actúa para inhibir el crecimiento de cualquier hongo o levadura que pueda surgir debido a la contaminación durante la manipulación por el usuario final.

[0178] También puede añadirse vitamina C (0,01 % p/v de concentración final) como antioxidante.

[0179] Después de las pruebas de garantía de calidad, pueden mezclarse diferentes lotes para dar productos con mezclas complejas de especies bacterianas, si es necesario.

[0180] En el ejemplo presentado aquí, la mezcla de los dos lotes de bacterias produjo un producto final que contenía las bacteriasEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilusy la cepa deLactobacillus caseique ahora se ha reclasificado comoLactobacillus rhamnosus.

[0181] Los lotes de este producto final contienen típicamente 2,3 g de carbohidratos por 100 ml, de los cuales 0,7 g son azúcares y 1,6 g son almidón. El recuento bacteriano en el producto final es típicamente menor que 1,0 x 10<5>paraL. acidophilusy típicamente al menos 1,0 x 10<7>para cada uno de,L. plantarum, E. faeciumy la cepa deLactobacillus caseique ahora se ha reclasificado comoLactobacillus rhamnosus.

[0182] Lotes del producto final se probaron para determinar la presencia de gluten mediante el uso de la prueba ELISA de gliadina y se determinó que contenían menos de 15 ppm de gluten, y más típicamente menos de 10 ppm de gluten, lo que satisface la definición del Codex Alimentarius de libre de gluten.

[0183] El producto Symprove<™>descrito en la presente descripción está disponible comercialmente de Multigerm UK Enterprises Ltd.

[0184] Ejemplo 4: Tratamiento efectivo de la enterocolitis, medido por calprotectina fecal

[0185] Se realizó un ensayo aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo para evaluar si el probiótico Symprove<™>(un probiótico a base de agua de múltiples cepas que contieneL. rhamnosus, E. faecium, L. acidophilus,yL. plantarum,preparado de acuerdo con el método descrito en la presente descripción y disponible comercialmente en Multigerm UK Enterprises Ltd) tomado durante 1 mes redujo la inflamación intestinal (según lo evaluado por una prueba de calprotectina fecal) en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn) en remisión clínica con solo síntomas leves.

[0186] Se reclutaron ochenta pacientes con UC y 63 con CD. Los pacientes incluidos tenían entre 18-64 años de edad, tenían un diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal leve a moderada (enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa) que se confirmó tanto endoscópicamente (ileocolonoscopía) como histológicamente (biopsia ileal o colónica). La duración de la IBD debe haber sido de al menos 6 meses con 3 meses en 'remisión clínica estable' antes de la inclusión. "Remisión clínica estable" se definió como "pacientes cuyos síntomas son relativamente leves y no muestran deterioro progresivo y en quienes no se indica ningún cambio en el tratamiento actual". Se excluyeron a los pacientes que tenían una enfermedad de moderada a grave; que recibían tratamientos con biológicos actualmente; que tenían comorbilidades significativas que incluían afecciones psiquiátricas, resección intestinal complicada previa; alergia o intolerancia documentada a probióticos; que estaban embarazadas o que buscaban activamente el embarazo; que tenían antecedentes de dependencia de fármacos o alcohol. Los pacientes que recibían terapia inmunosupresora (azatioprina o 6 mercaptopurina) no se excluyeron si habían estado estables con el tratamiento sin efectos secundarios importantes o eventos adversos durante un mínimo de 12 semanas.

[0187] La calprotectina fecal se evaluó antes y después de ser aleatorizados (aleatorización por ordenador en 2 etapas mediante el uso del algoritmo de Mersenne) para recibir el probiótico o un placebo coincidente (1 ml/kg de peso corporal diariamente durante un mes).

[0188] Los pacientes tomaron 1 mg/kg de probiótico o placebo (sin actividad probiótica) por vía oral cada mañana con el estómago vacío, sin alimentos ni bebidas durante 20 minutos después de la dosis.

[0189] El manejo de muestras de heces (cada una de 200 mg o más) y la medición de calprotectina se realizó mediante ELISA mediante el uso del kit Calprest disponible comercialmente. Este ensayo tiene una variación intraensayo del 2 % y una variación interensayo de <15 %, siendo los valores normales (es decir, saludables) de <50 mg/kg. Resultados: En pacientes con UC y enfermedad de Crohn que se trataron con el probiótico, la concentración media de calprotectina fecal disminuyó significativamente en comparación con el placebo (Tabla 1):

[0190] Tabla 1

[0193]

[0195] La "reducción media" es la reducción promedio en la concentración de calprotectina fecal por paciente como resultado de la intervención indicada. Un valor negativo indica un aumento medio en la concentración como resultado de la intervención.

[0196] Además, cuando la reducción en la concentración de calprotectina fecal se midió como un porcentaje de la concentración de calprotectina fecal de cada paciente antes del tratamiento, los pacientes con colitis ulcerativa que recibieron el probiótico exhibieron una reducción porcentual media en el nivel de calprotectina del 21 % en comparación con una reducción porcentual media de -101 % (es decir, un aumento de aproximadamente 2x el nivel de calprotectina antes del tratamiento) en pacientes con UC que recibieron placebo.

[0197] Estos datos muestran que la preparación probiótica que comprende bacterias probióticas viables y metabólicamente activas en un sustrato líquido no lácteo como se describe en la presente descripción proporciona un tratamiento efectivo de los trastornos enterocolíticos tales como la IBD (UC y enfermedad de Crohn) mediante la reducción de los niveles de inflamación en el intestino, como lo indica una reducción absoluta y relativa en la concentración de calprotectina fecal. Como resultado del grupo de control de placebo, los efectos terapéuticos observados pueden atribuirse de manera confiable a la preparación probiótica. De hecho, los cambios observados en la concentración de calprotectina en los grupos de placebo indican que podría esperarse un aumento en la concentración de calprotectina si el probiótico no tuviera ningún efecto. Sin embargo, el tratamiento con la preparación probiótica da como resultado una reducción en el nivel de calprotectina fecal, lo que indica claramente un efecto terapéutico sobre el trastorno enterocolítico subyacente. Se espera que la preparación probiótica tendría los mismos o similares efectos terapéuticos en otros trastornos enterocolíticos caracterizados por niveles aumentados de calprotectina fecal.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una preparación probiótica que comprende una mezcla deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosusen un sustrato líquido no lácteo, para su uso en el tratamiento de la enterocolitis en un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg.

2. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), opcionalmente para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.

3. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el paciente está en remisión clínica, opcionalmente en donde el paciente ha estado en remisión clínica durante al menos 3 meses.

4. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 250 mg/kg, opcionalmente superior a 700 mg/kg.

5. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la preparación probiótica comprende una mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples, en donde la relación de contenido total de carbohidratos con respecto al contenido de azúcares reductores de la preparación probiótica está en el intervalo de 8:1 a 2:1.

6. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la preparación probiótica tiene un contenido total de carbohidratos en el intervalo de 20 mg/ml a 40 mg/ml y un contenido de azúcares reductores en el intervalo de 5 mg/ml a 20 mg/ml.

7. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende adicionalmente proteínas y péptidos, en donde la cantidad total de proteínas y péptidos está en el intervalo de 1 mg/ml a 2 mg/ml y en donde la cantidad total de péptidos de alto peso molecular está en el intervalo de 100 µg/ml a 300 µg/ml.

8. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la preparación probiótica se prepara al cultivar la(s) cepa(s) bacteriana(s) probiótica(s) en un extracto de cebada germinada.

9. Una preparación probiótica para su uso en el tratamiento de la enterocolitis en un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 50 mg/kg, la preparación probiótica se puede obtener mediante un método que comprende:

someter el cereal malteado, opcionalmente cebada, a una etapa de maceración para obtener una mezcla de carbohidratos complejos, azúcares simples, proteínas y péptidos;

separar la mezcla de carbohidratos complejos y azúcares simples, proteínas y péptidos del cereal malteado gastado para obtener un sustrato de crecimiento;

inocular el sustrato de crecimiento con una mezcla deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilusyLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso tantoLactobacillus caseicomoLactobacillus rhamnosuspara formar un cultivo y hacer crecer dichas bacterias hasta que alcanzan una concentración de entre 1 x 10<6>y 1 x 10<9>unidades formadoras de colonias por mililitro;

enfriar el cultivo hasta 4 °C para obtener la preparación probiótica.

10. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), opcionalmente para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.

11. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el paciente está en remisión clínica, opcionalmente en donde el paciente ha estado en remisión clínica durante al menos 3 meses.

12. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene un nivel de calprotectina fecal superior a 250 mg/kg, opcionalmente superior a 700 mg/kg.

13. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el recuento total de al menos una de, y con mayor preferencia cada una deEnterococcus faecium, Lactobacillus plantarum,yLactobacillus caseioLactobacillus rhamnosuso una combinación deLactobacillus caseiyLactobacillus rhamnosusen la preparación es al menos 1,0 x 10<6>células viables por mililitro, preferentemente, al menos 1,0 x 10<7>células viables por mililitro.

14. La preparación probiótica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el recuento total de bacterias metabólicamente activas en la preparación está en el intervalo de 1,0 x 10<6>a 1,0 x 10<9>células viables por mililitro.