ES3056533T3 - Variant asparaginase polypeptides for medical use - Google Patents

Abstract

Se proporcionan diversas realizaciones relacionadas con polipéptidos de asparaginasa variantes con estabilidad mejorada, farmacodinamia y/o inmunogenicidad reducida. Los polipéptidos de asparaginasa variantes pueden usarse como agentes terapéuticos en mamíferos, incluyendo humanos, caninos, felinos y equinos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Variantes de polipéptidos de asparaginasa para uso médico

[0003] Solicitudes relacionadas

[0004] La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.º 62/660.189, presentada el 19/4/2018.

[0005] Listado de secuencias

[0006] La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado 2019-04-15_01157-0013-00PCT_Seq_List_ST25.txt creado el 15 de abril de 2019, que tiene un tamaño de 42 Kb.

[0007] Campo

[0008] La presente divulgación se refiere a variantes de polipéptidos de asparaginasa que tienen inmunogenicidad reducida y estabilidad y farmacocinética mejoradas, y a métodos para producir y usar los mismos, por ejemplo, para tratar la leucemia linfoblástica aguda en seres humanos y el linfoma en animales de compañía.

[0009] Antecedentes

[0010] En su forma natural, la L-asparaginasa (también denominada en el presente documento asparaginasa) es una enzima bacteriana compuesta por subunidades idénticas (de aproximadamente 35 kDa cada subunidad) que cataliza la conversión de L-asparagina en ácido aspártico y amoníaco. La asparaginasa de Escherichia coli o E. coli puede ser un homodímero o un homotetrámero y la asparaginasa de Erwinia chrysanthemi o E. chrysanthemi (también llamado Dickeya dadantii, D. dadantii, Dickeya chrysanthemi, D. chrysanthemi, etc.) es un tetrámero. La asparaginasa se usa para tratar pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) y para tratar perros y gatos con linfoma. Algunas células leucémicas no pueden sintetizar asparagina y dependen de la asparagina circulante para sobrevivir. Como tratamiento terapéutico, la asparaginasa puede privar a tales células de la asparagina circulante, lo que conduce a la muerte celular. Las células normales se ven menos afectadas por la asparaginasa porque son capaces de sintetizar asparagina.

[0011] Desafortunadamente, la hipersensibilidad a la asparaginasa es un acontecimiento adverso de notificación habitual y, a menudo, requiere la finalización del tratamiento con asparaginasa. La asparaginasa de E. coli nativa puede ser inmunogénica cuando se introduce en seres humanos en cantidades terapéuticas. Los anticuerpos contra la asparaginasa pueden aumentar la tasa de eliminación y los anticuerpos de neutralización, si están presentes, pueden limitar la eficacia de la enzima.

[0012] Sumario de la invención

[0013] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona una variante de polipéptido de asparaginasa que comprende al menos una sustitución de aminoácido en un resto de cisteína no emparejado de un polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje correspondiente, en donde la al menos una sustitución de aminoácido comprende cualquier aminoácido distinto de cisteína.

[0014] En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos una sustitución de cisteína en una posición de aminoácido. En otras realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos un par de sustituciones de cisteína en posiciones de aminoácidos en, o espacialmente cerca de, un sitio inmunogénico o antigénico del correspondiente polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje. En otras realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos una cisteína parcialmente incluida. En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa carece de una secuencia líder.

[0015] En algunas realizaciones, el sitio inmunogénico o antigénico en el polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje provoca una respuesta inmunitaria en un ser humano o una specie de animal de compañía. En algunas realizaciones, la especie de animal de compañía es una especie canina, felina o equina.

[0016] En algunas realizaciones, al menos una cisteína está entre el 5 % y el 25 %, entre el 5 % y el 20%, entre el 5 % y el 15 %, del 5 % al 10 %, entre el 10% y el 20%, entre el 20 % y el 30 % o entre el 10 % y el 30 %, expuesta en la superficie, según lo determinado por un software de modelado de proteínas estándar.

[0017] En algunas realizaciones, al menos una cisteína es o el al menos un par de cisteínas está a 35 Angstroms (Å) o menos (por ejemplo, 30 Å o menos, 25 Å o menos, 20 Å o menos, 15 Å o menos, 10 Å o menos o 5 Å o menos) del sitio inmunogénico o antigénico, según se determina mediante análisis de estructura de proteína tridimensional.

[0018] En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa comprende una secuencia de aminoácidos que es de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de asparaginasa de tipo salvaje, tal como la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, el polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje es un polipéptido de asparaginasa de E. coli de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje comprende las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14.

[0019] En algunas realizaciones, el sitio inmunogénico o antigénico corresponde a la posición de aminoácido 55, 56, 57, 58, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 252, 253, 254, 255, 256, 257 o 258 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, al menos una cisteína está ubicada en una posición que corresponde a una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas entre 51, 52, 118, 119, 196, 206, 285 y 311 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, cada una de las al menos un par de cisteínas se selecciona entre la o las sustituciones de cisteínas emparejadas C1-C2 enumeradas en la Tabla 5, opcionalmente en una posición correspondiente a las posiciones de aminoácidos 116 y 120, las posiciones de aminoácidos 196 y 200 o las posiciones de aminoácidos 225 y 252 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el resto de cisteína no emparejado se localiza en una posición de aminoácido 45, 67 y/o 242 de la SEQ ID NO:14.

[0020] En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12 o la SEQ ID NO:15.

[0021] En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa está en forma monomérica, dimérica o tetramérica.

[0022] En algunas realizaciones, se modifica la variante de polipéptido de asparaginasa, tal como se sialila o se pegila, opcionalmente se pegila con tiol o se pegila con amina.

[0023] También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican las variantes de polipéptidos de asparaginasa de la invención.

[0024] También se proporcionan vectores que codifican los ácidos nucleicos aislados de la invención.

[0025] También se proporcionan células hospedadoras que comprenden los vectores de la invención. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula procariota, tal como una célula E. chrysanthemi, una célula de E. coli o una célula de pseudomonas. En otras realizaciones, la célula es una célula eucariota, tal como una célula de levadura.

[0026] También se proporcionan métodos para producir una variante de polipéptido de asparaginasa que comprende cultivar la célula hospedadora. En alguna realización, el método de producción de una variante de polipéptido de asparaginasa comprende además aislar la variante.

[0027] También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una variante de polipéptido de asparaginasa de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0028] Las variantes de polipéptidos de asparaginasa o composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes de polipéptidos de asparaginasa de la invención pueden usarse en un método de tratamiento en donde el polipéptido o composición se administra a un sujeto. En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos de asparaginasa o composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes de polipéptidos de asparaginasa de la invención pueden usarse en un método de tratamiento de linfoma o una leucemia linfoblástica aguda (LLA).

[0029] En algunas realizaciones, el sujeto que necesita tratamiento es un ser humano o una especie de animal de compañía. En algunas realizaciones, la especie de animal de compañía es canina, felina o equina.

[0030] Breve descripción de los dibujos

[0031] La figura 1A es una tabla que enumera los tampones de lavado y elución utilizados en la purificación por intercambio catiónico de la variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5), como se describe en el Ejemplo 4.

[0032] La figura 1B es una SDS-PAGE no reductora teñida con Coomassie que muestra la variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) después de la expresión y purificación intracelular de E. coli.

[0033] La figura 2A muestra los resultados de cromatografía de exclusión por tamaño para una variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) y marcadores patrón de proteína.

[0034] La figura 2B enumera los tiempos de elución de la cromatografía de exclusión por tamaño de una variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) y marcadores patrón de proteína.

[0035] La figura 3 muestra una SDS-PAGE de una variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) no pegilada y pegilada con tiol a diferentes tiempos de reacción (5 minutos y 60 minutos) y diferentes temperaturas de reacción (temperatura ambiente y 37 °C) en condiciones reductoras (+DTT) y no reductoras (-DTT). Carril 1: sin pegilar, -DTT; Carril 2: sin pegilar, DTT; Carril 3: pegilada con tiol, tiempo de retención 5 minutos, RT, -DTT; Carril 4: pegilada con tiol, tiempo de retención 5 minutos, RT, DTT; Carril 5: pegilada con tiol, tiempo de retención 60 minutos, RT, -DTT; Carril 6: pegilada con tiol, tiempo de retención 60 minutos, RT, DTT; Carril 7: pegilada con tiol, tiempo de retención 60 minutos, 37 °C, -DTT; Carril 8: pegilada con tiol, tiempo de retención 60 minutos, 37 °C, DTT.

[0036] La figura 4 ilustra una variante de polipéptido de asparaginasa de E. coli de SEQ ID NO: 12. Se identifica el par de cisteínas adicional.

[0037] Descripción de las secuencias

[0038] La Tabla 1 ro orciona un listado de ciertas secuencias a las ue se hace referencia en el resente documento.

[0040]

[0041] continuación

[0042]

[0043] continuación

[0044]

[0045] continuación

[0047]

[0049] Descripción de las realizaciones

[0050] La pegilación de biomoléculas puede prolongar el tiempo de circulación, proteger contra la inactivación por proteólisis, enmascarar los sitios inmunogénicos o antigénicos y/o reducir la inmunogenicidad. ONCOSPAR<®>(pegaspargasa, Shire) es una asparaginasa pegilada aprobada por la FDA derivada de E. coli. Conforme a la ficha técnica de ONCASPAR<®>, cada molécula de asparaginasa tiene un promedio de 69-82 moléculas de PEG unidas a lisina y es de aproximadamente 483-548 kDa. Sin embargo, la pegilación aleatoria puede dar como resultado un producto heterogéneo y la hipersensibilidad a la asparaginasa pegilada derivada de E. coli aún puede desarrollarse.

[0051] La asparaginasa aislada de E. chrysanthemi también se ha investigado. ERWINAZE<®>(Jazz Pharmaceuticals), una asparaginasa nativa derivada de E. chrysanthemi, está aprobado por la FDA como sustituto de pegaspargasa y asparaginasa nativa de E. coli para pacientes que han desarrollado hipersensibilidad a asparaginasa derivada de E. coli. Véase la ficha técnica de ERWINAZE<®>; Gervais, D. Validación de un proceso de 30 años para la fabricación de L-asparaginasa de Erwinia chrysanthemi. Bioprocess Biosyst Eng (2013) 36:453-60. ERWINAZE<®>según se indicado, ha tenido un suministro escaso. Véase ferozpharma.com/manufacturing/jazz-releases-some-erwinaze-children-sleukemia-drug-has-been-shortage, con fecha del 26 de febrero de 2018.

[0052] Se ja notificado asparaginasa de E. chrysanthemi pegilada recombinante usando pegilación de amina primaria aleatoria. El producto tenía una inmunogenicidad más baja y una eficacia mejorada. Chien, W., Pharmacology, immunogenicity, and efficacy of a novel pegylated recombinant Erwinia chrysanthemi-derived L-asparaginase. Invest New Drugs (2014) 32: 795-805. Sin embargo, la pegilación aleatoria puede conducir a un producto heterogéneo. Por lo tanto, la incorporación específica de sitio de aminoácidos conjugables con PEG en asparaginasas bacterianas es ventajosa, pero no sin problemas.

[0053] Se han identificado y mapeado epítopos antigénicos de asparaginasas de E. chrysanthemi y E. coli. Véase Moola, Z.B., et al. Epitope mapping and antigenic modification of L-asparaginase. Biochem J. (1994) 302: 921-927 y Werner A., et al. Mapping of B-cell epitopes in E. coli asparaginase II, an enzyme used in leukemia treatment. Biol. Chem. (2005) 386: 535-540. No obstante, la bibliografía parece estar desprovista de variantes de productos de asparaginasa bacteriana que tengan pegilación específica de sitio, en lugar de aleatoria, para proteger sitios inmunogénicos o antigénicos (por ejemplo, a través de sustituciones de cisteína específicas de sitio para la conjugación específica de tiol). La expresión recombinante de polipéptidos de asparaginasa variantes en el periplasma puede ser un desafío. Por ejemplo, aunque el entorno oxidativo del periplasma es importante para la formación de enlaces disulfuro entre restos de cisteína emparejados para el plegamiento adecuado de proteínas, los restos de cisteína no emparejados también se oxidan, lo que dificulta las técnicas de pegilación.

[0054] Debido a problemas de inmunogenicidad, la escasez de productos de asparaginasa clínica y métodos de producción ineficientes, existe la necesidad de productos de asparaginasa que tengan inmunogenicidad reducida, que derivan de fuentes alternativas y que se fabrican utilizando métodos de producción más eficientes. En el presente documento se describen polipéptidos de asparaginasa variantes y métodos que abordan estos problemas.

[0055] La presente divulgación se refiere a variantes de polipéptidos de asparaginasa que tienen inmunogenicidad reducida y estabilidad y farmacocinética mejoradas, y a métodos para producir y usar los mismos, por ejemplo, para tratar la leucemia linfoblástica aguda en seres humanos y el linfoma en animales de compañía. Para comodidad del lector, en el presente documento se proporcionan las siguientes definiciones de los términos.

[0056] Como se usa en el presente documento, "un" o "uno/a" significa "al menos uno" o "uno o más" a menos que se especifique lo contrario. Como se usa en el presente documento, el término "o" significa "y/o" a menos que se especifique lo contrario. En el contexto de una reivindicación dependiente múltiple, el uso de "o" cuando se hace referencia a otras reivindicaciones se refiere únicamente a esas reivindicaciones como alternativa.

[0057] Polipéptidos de asparaginasa de ejemplo

[0058] Se proporcionan polipéptidos de asparaginasa variantes, por ejemplo, polipéptidos de asparaginasa variantes que comprenden sustituciones de aminoácidos conjugables con PEG, tales como sustituciones de cisteína y lisina para una inmunogenicidad reducida.

[0059] "Secuencia de aminoácidos" significa una secuencia de restos de aminoácidos en un péptido o proteína. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos, y no se limitan a una longitud mínima. Dichos polímeros de restos de aminoácidos pueden contener restos de aminoácidos naturales o no naturales e incluyen, pero sin limitación, péptidos, oligopéptidos, dímeros, trímeros y multímeros de restos de aminoácidos. La definición abarca tanto proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. De manera adicional, a efectos de la presente divulgación, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), con respecto a la secuencia nativa (o salvaje), siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o puede ser accidental, tal como a través de mutaciones de hospedadores que producen las proteínas o errores debido a la amplificación por PCR.

[0060] Un "derivado de aminoácido" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado y/o análogo de aminoácido, que no es uno de los 20 aminoácidos naturales comunes que se encuentran en los seres humanos. Los derivados de aminoácidos ilustrativos incluyen aminoácidos naturales que no se encuentran en seres humanos (por ejemplo, seleno cisteína y pirrolisina, que pueden encontrarse en algunos microorganismos) y aminoácidos no naturales. Los derivados de aminoácidos a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, derivados de aminoácidos disponibles comercialmente a través de fabricantes y distribuidores de productos químicos (por ejemplo, sigmaaldrich.com/chemistry/chemistry-products.html?TablePage=16274965, consultada el 6 de mayo de 2017, que se incorpora en el presente documento por referencia). Uno o más derivados de aminoácidos pueden incorporarse en un polipéptido en una localización específica usando sistemas de traducción que utilizan células hospedadoras, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales derivadas de sintetasas eubacterianas, ARNt ortogonales y un derivado de aminoácido. Para descripciones adicionales, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.º 9,624,485.

[0061] "Asparaginasa" o "L-asparaginasa", como se usa en el presente documento, es un polipéptido que comprende la totalidad o un fragmento de asparaginasa, incluyendo una variante de polipéptido, un polipéptido precursor, un polipéptido maduro, un tetrámero, un dímero, un monómero o cualquier otra forma.

[0062] Por ejemplo, "asparaginasa" se refiere a un polipéptido de asparaginasa de cualquier fuente, a menos que se indique otra cosa, incluyendo plantas, mamíferos (por ejemplo, cerdos y roedores) y bacterias (por ejemplo, E. coli, E. chrysanthemi, Aerobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, A. liquefaciens, A. salmonicida, A. sinuosa, Bacillus megaterium, B. subtilis, Erwinia amylovora, E. araoideae, E. carotovora, E. dissolvens, E. freundii, Hydrogenomonas eutropha, H. pantotropha, Photobacterium fischeri, Proteus americanus, P. mirabilis, P. morganii, P. paramericanus, P. psudovaleriei, P. shingides, P. vulgaris, Psudomonas acidovorans, P. ammoniagenes, P. asplenii, P. aureofaciens, P. caviae, P. convexa, P. dacunhae, P. fluorescens, P. geniculata, P. lemonnieri, P. pavonacea, P. putida, P. reptilivora, Pseudomonas, P. stutzeri, P. synxantha, P. taetrolens, Serratia marcescens, Xanthomonas campestrils, etc.; Véase Peterson RE y Ciegler A, L-asparaginase production by various bacteria. Applied Microbiol (1969) 17:929-930. En algunas realizaciones, la asparaginasa comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.

[0063] "Tipo salvaje" se refiere a una versión no mutada de un polipéptido que se produce en la naturaleza o a un fragmento del mismo. Un polipéptido de tipo salvaje puede producirse de forma recombinante o en la naturaleza. Un polipéptido de tipo salvaje que se produce en la naturaleza también se denomina polipéptido nativo.

[0064] Una "variante" significa un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia de tipo salvaje (o nativo) después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde uno o más restos de aminoácidos se han añadido, delecionado, en el extremo N o C del polipéptido.

[0065] En algunas realizaciones, una variante tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente un 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia de tipo salvaje (o nativo).

[0066] Una entidad "biológicamente activa", o una entidad que tiene "actividad biológica", es una entidad que tiene cualquier función relacionada con o asociada con un proceso metabólico o fisiológico, y/o que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de una molécula de origen natural. Un polipéptido biológicamente activo o fragmento del mismo incluye uno que puede participar en una reacción biológica, incluyendo, pero sin limitación, una reacción enzimática, una interacción ligando-receptor o unión antígeno-anticuerpo. La actividad biológica puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad disminuida no deseada. Una entidad puede demostrar actividad biológica cuando participa en una interacción molecular con otra molécula, cuando tiene valor terapéutico para aliviar una afección patológica, cuando tiene valor profiláctico para inducir una respuesta inmunitaria, cuando tiene valor de diagnóstico y/o pronóstico para determinar la presencia de una molécula.

[0067] Como se usa en el presente documento, "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y "homología" con respecto a la secuencia de un péptido, polipéptido o anticuerpo se definen como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica o peptídica específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que se encuentran dentro de las capacidades del experto en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, CLUSTAL OMEGA, ALIGN o MEGALIGN<™>(DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier parámetro necesario para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando.

[0068] Como se usa en el presente documento, "sitio que corresponde a la posición de aminoácido n" o "posición que corresponde a la posición de aminoácido n", en donde n es cualquier número o intervalo de números, se refiere a una posición o posiciones de aminoácidos de un polipéptido objeto que se alinea con la posición n de un polipéptido de referencia después de alinear la secuencia de aminoácidos y los polipéptidos objeto y de referencia e introducir huecos. La alineación con el fin de determinar si una posición de un polipéptido objeto se corresponde con la posición n de un polipéptido de referencia se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, CLUSTAL OMEGA, ALIGN o MEGALIGN<™>(DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de dos secuencias que se estén comparando. En algunas realizaciones, el polipéptido objeto y el polipéptido de referencia son de diferentes longitudes.

[0069] Una sustitución de aminoácidos puede incluir, aunque sin limitación, la sustitución de un aminoácido en un polipéptido por otro aminoácido. En la Tabla 2 se muestran sustituciones ilustrativas. En una proteína de interés pueden introducirse sustituciones de aminoácidos y los productos pueden cribarse para determinar una actividad deseada, por ejemplo, retención/mejora de la unión al antígeno o disminución de la inmunogenicidad.

[0070] Tabla 2

[0073]

[0074] Los aminoácidos pueden agruparse según las propiedades comunes de la cadena lateral:

[0075] (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

[0076] (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

[0077] (3) ácidos: Asp, Glu;

[0078] (4) básicos: His, Lys, Arg;

[0079] (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

[0080] (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0081] Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15.

[0082] Un aminoácido "conjugable con PEG" se refiere a un aminoácido o un derivado de aminoácido que es capaz de asociarse con o unirse covalente o no covalentemente al menos a una molécula de PEG.

[0083] En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos una sustitución de aminoácido conjugable con PEG. En algunas realizaciones, un aminoácido conjugable con PEG comprende una lisina, una cisteína, una histidina, un arginina, un ácido aspártico, una glutamina, una serina, una treonina, una tirosina o un derivado de aminoácido de cualquiera de esos aminoácidos.

[0084] "PEG", como se usa en el presente documento, se refiere a una fracción de polietilenglicol.

[0085] "Pegilado" como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una o más fracciones de PEG asociadas o unidas de forma covalente o no covalente.

[0086] "Sialilado", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una o más fracciones de ácido siálico unidas covalentemente.

[0087] Se ha desarrollado una diversidad de enfoques para producir proteínas glicosiladas y sialiladas. Véase, por ejemplo, Savinova, et al. Applied Biochem & Microbiol. (2015) 51(8): 827-833.

[0088] En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa está pegilado y/o sialilado. En algunas realizaciones, la variante de polipéptido de asparaginasa está pegilado y/o sialilado en una cisteína, una lisina, una histidina, un arginina, un ácido aspártico, una glutamina, una serina, una treonina, una tirosina o un derivado de aminoácido de cualquiera de esos aminoácidos, tal como un derivado de aminoácidos de una cisteína, una lisina, una histidina, un arginina, un ácido aspártico, una glutamina, una serina, una treonina, una tirosina.

[0089] Un "aminoácido expuesto en la superficie" se refiere a un resto de aminoácido que tiene el 30 % o más de su superficie accesible a un disolvente, según se determina usando cualquier software de modelado de proteínas estándar conocido en la técnica, por ejemplo, Swiss-Model, MOE (Molecular Operating Environment), Rosetta y Modeller.

[0090] En algunas realizaciones, un aminoácido expuesto en la superficie incluye un aminoácido que tiene una exposición en la superficie del 30 % o más (o el 30 % o más de su superficie es accesible a un disolvente), según lo determinado por un software de modelado de proteínas estándar. En algunas realizaciones, un aminoácido expuesto en la superficie incluye un aminoácido que tiene un 30 % o más, 35% o mayor, 40 % o mayor, 45% o mayor, 50% o mayor, 55% o mayor, 60% o mayor, 65% o mayor, 70% o mayor, 75% o mayor, 80% o mayor, 85% o mayor, 90% o mayor, 95 % o más de exposición en la superficie.

[0091] Un "aminoácido incluido parcialmente" se refiere a un resto de aminoácido que tiene entre el 5 % y el 30 % de su superficie no accesible a un disolvente, según se determina usando cualquier software de modelado de proteínas estándar conocido en la técnica, por ejemplo, Swiss-Model, MOE (Molecular Operating Environment), Rosetta y Modeller.

[0092] En algunas realizaciones, un aminoácido incluido parcialmente incluye un aminoácido que tiene entre el 5 % y el 30 % de exposición en la superficie (o entre el 5 % y el 30 % de su superficie es accesible a un disolvente), según lo determinado por un software de modelado de proteínas estándar. En algunas realizaciones, un aminoácido expuesto en la superficie incluye un aminoácido que tiene entre el 5 % y el 25 %, entre el 5 % y el 20%, entre el 5 % y el 15 %, del 5 % al 10 %, entre el 10% y el 20%, entre el 20 % y el 30 % o entre el 10 % y el 30 % expuesto en la superficie. "Sitio inmunogénico o antigénico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier aminoácido o cualquier grupo de aminoácidos dentro de un polipéptido que está implicado en provocar una reacción inmunitaria.

[0093] En algunas realizaciones, un sitio inmunogénico o antigénico es cualquier aminoácido dentro de un epítopo. En algunas realizaciones, un sitio inmunogénico o antigénico es menos inmunogénico o menos antigénico cuando el sitio inmunogénico o antigénico, o un aminoácido que está espacialmente cerca del sitio inmunogénico o antigénico, está conjugado a PEG.

[0095] Un aminoácido que está "espacialmente cerca" de otro(s) aminoácido(s) se refiere a la proximidad tridimensional entre ellos, según lo determinado por el modelado tridimensional de proteínas. Un aminoácido puede estar espacialmente cerca de otro aminoácido si la distancia entre los dos aminoácidos es de 35 Angstroms (Å) o menos, 30 Å o menos, 25 Å o menos, 20 Å o menos, 15 Å o menos, 10 Å o menos o 5 Å o menos.

[0097] Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a un sitio en una molécula objetivo (por ejemplo, un antígeno, tal como una proteína, ácido nucleico, carbohidrato o lípido) al que se une una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de armazón que contiene regiones de unión de anticuerpo). Los epítopos a menudo incluyen un agrupamiento de superficie químicamente activo de moléculas, tales como aminoácidos, polipéptidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos se pueden formar tanto a partir de restos contiguos como no contiguos yuxtapuestos (por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, azúcares, restos lipídicos) de la molécula objetivo. Los epítopos formados a partir de restos contiguos (por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, azúcares, restos lipídicos) normalmente se conservan al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo puede incluir, pero sin limitación, al menos 3, al menos 5 u 8-10 restos (por ejemplo, aminoácidos o nucleótidos). En algunos ejemplos, un epítopo tiene menos de 20 restos (por ejemplo, aminoácidos o nucleótidos) de longitud, menos de 15 restos o menos de 12 restos. Dos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo dentro de un antígeno si muestran una unión competitiva para el antígeno. En algunas realizaciones, un epítopo puede identificarse por una cierta distancia mínima a un resto de CDR en la molécula de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un epítopo puede identificarse por la distancia anterior y limitarse adicionalmente a aquellos restos implicados en un enlace (por ejemplo, un enlace de hidrógeno) entre un resto de anticuerpo y un resto de antígeno. Un epítopo también puede identificarse mediante varias exploraciones, por ejemplo, una exploración de alanina o arginina puede indicar uno o más restos con los que puede interactuar la molécula de unión a antígeno. A menos que se excluyan explícitamente, un conjunto de restos como un epítopo no excluye que otros restos sean parte del epítopo para un anticuerpo particular. Más bien, la presencia de un conjunto de este tipo designa una serie mínima (o conjunto de especies) de epítopos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un conjunto de restos identificados como un epítopo designa un epítopo mínimo de relevancia para el antígeno, en lugar de una lista exclusiva de restos para un epítopo en un antígeno.

[0099] En algunas realizaciones, un sitio inmunogénico o antigénico puede determinarse mediante métodos de exploración de epítopos conocidos en la técnica. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en Moola, ZB, Erwinia chrysanthemi L-asparaginase: epitope mapping and production of antigenically modified enzymes. Biochem J. (1994) 921-927.

[0101] En algunas realizaciones, un sitio inmunogénico o antigénico es un epítopo que corresponde a las posiciones de aminoácidos 37 a 40 o de 205 a 212 de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, un sitio inmunogénico o antigénico corresponde a la posición de aminoácido 37, 38, 39, 40, 41, 72, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 265 o 288 de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, un sitio inmunogénico o antigénico corresponde a la posición de aminoácido 55, 56, 57, 58, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 252, 253, 254, 255, 256, 257 o 258 de la SEQ ID NO: 11.

[0103] En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos una sustitución de aminoácidos conjugable con PEG o al menos una sustitución de cisteína en al menos una posición correspondiente a una posición seleccionada entre la posición 3, 4, 17, 26, 37, 38, 41, 42, 44, 45, 47, 48, 51, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 68, 72, 79, 82, 83, 84, 85, 87, 110, 112, 123, 124, 125, 127, 180, 190, 191, 192, 198, 202, 205, 206, 208, 210, 212, 213, 215, 216, 219, 231, 239, 240, 241, 243, 257, 260, 261, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 280, 286, 287, 288, 289, 312, 313, 315, 316, 317, 318 y 322 de la SEQ ID NO: 2.

[0105] En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos una sustitución de aminoácidos conjugable con PEG o al menos una sustitución de lisina en al menos una posición correspondiente a una posición seleccionada entre la posición 4, 17, 26, 37, 38, 41, 42, 44, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 68, 79, 82, 83, 84, 85, 87, 112, 123, 124, 125, 127, 180, 190, 191, 192, 198, 202, 205, 206, 208, 210, 212, 213, 215, 216, 231, 239, 240, 241, 257, 260, 261, 264, 267, 268, 270, 280, 286, 287, 288, 289, 312, 313, 315, 316, 317 y 322 de la SEQ ID NO: 2.

[0107] En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos una cisteína ubicada en al menos una posición correspondiente a una posición seleccionada entre 51, 52, 118, 119, 196, 206, 285 y 311 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa comprende al menos un par de cisteínas seleccionadas de una cualquiera o combinación de sustitución o sustituciones de cisteínas emparejadas C1-C2 enumeradas en la Tabla 5. Por ejemplo, una variante de polipéptido de asparaginasa puede comprender uno o más pares de cisteínas ubicadas en una posición correspondiente a las posiciones de aminoácidos 116 y 120, las posiciones de aminoácidos 196 y 200 o las posiciones de aminoácidos 225 y 252 de la SEQ ID NO: 11.

[0108] El término "afinidad" significa la intensidad de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede representarse generalmente por su constante de disociación (K<D>). La afinidad puede medirse mediante métodos habituales conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, inmunotransferencia, ELISA KD, KinEx A, interferometría de biocapa (BLI) o dispositivos de resonancia de plasmón superficial.

[0109] Los términos "K<D>", "K<d>", "Kd" o "valor de Kd" como se usa de forma intercambiable para hacer referencia a la constante de disociación en el equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno. En algunas realizaciones, la K<d>del anticuerpo se mide usando ensayos de interferometría de biocapa usando un biosensor, tal como un Octet<®>System (Pall ForteBio LLC, Fremont, CA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Brevemente, el antígeno biotinilado se une a la punta del sensor y la asociación del anticuerpo se monitoriza durante noventa segundos y la disociación se monitoriza durante 600 segundos. El tampón para diluciones y etapas de unión es fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2. Se resta una curva en blanco solo de tampón para corregir cualquier desviación. Los datos se ajustan a un modelo de unión 2:1 usando el software de análisis de datos ForteBio para determinar la constante de la tasa de asociación (k<asociación>), la constante de la tasa de disociación (k<disociación>) y la K<d>. La constante de disociación en equilibrio (K<d>) se calcula como la relación de k<disociación>/k<asociación>. El término "k<asociación>" se refiere a la constante de la tasa para la asociación de un anticuerpo a un antígeno y el término "k<disociación>" se refiere a la constante de la tasa para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

[0110] "Resonancia de plasmón superficial" se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore<™>(BIAcore International AB, una empresa de GE Healthcare, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, véase Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin.51: 19-26.

[0111] "Interferometría de biocapa" se refiere a una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz reflejada desde una capa de proteína inmovilizada en una punta de biosensor y una capa de referencia interna. Los cambios en el número de moléculas unidas a la punta del biosensor provocan cambios en el patrón de interferencia que se pueden medir en tiempo real. Un dispositivo de ejemplo no limitante para la interferometría de biocapa es un sistema Octet<®>(Pall ForteBio LLC). Véase, por ejemplo, Abdiche et al., 2008, Anal. Biochem. 377: 209-277.

[0112] "Reducir" o "inhibir" significa disminuir, reducir o detener una actividad, función o cantidad en comparación con una referencia. En algunas realizaciones, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad para causar una disminución global de un 20 % o más. En algunas realizaciones, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad para causar una disminución global de un 50% o más. En algunas realizaciones, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad para causar una disminución global de un 75 %, 85%, 90 %, un 95 % o más. En algunas realizaciones, la cantidad indicada anteriormente se inhibe o disminuye durante un período de tiempo, en relación con una dosis de control (tal como un placebo) durante el mismo período de tiempo. Una "referencia", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra, patrón o nivel que se usa con una finalidad comparativa. Se puede obtener una referencia de una muestra sana o no enferma. En algunos ejemplos, se obtiene una referencia de una muestra no enferma o no tratada de un animal de compañía. En algunos ejemplos, se obtiene una referencia de uno o más animales sanos de una especie particular, que no son el animal que se está probando o tratando.

[0113] La expresión "sustancialmente reducido", como se usa en el presente documento, denota un grado de reducción suficientemente elevado entre un valor numérico y un valor numérico de referencia de forma que un experto en la materia podría considerar que la diferencia entre los dos valores tendría una significación estadística en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores. En algunas realizaciones, los valores numéricos sustancialmente reducidos se reducen en más de aproximadamente uno cualquiera del 10 %, 15 %, 20 %, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 % o 100 % en comparación con el valor de referencia.

[0114] Expresión y producción de ejemplo

[0115] Se proporcionan secuencias de polinucleótidos que codifican todo o parte de un polipéptido de asparaginasa con o sin una secuencia líder. Si no se usa una secuencia líder homóloga (es decir, una secuencia líder de una asparaginasa de tipo salvaje) en la construcción de la molécula de ácido nucleico, se puede usar otra secuencia líder bacteriana. Normalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, tal como un polipéptido de asparaginasa descrito en el presente documento, se inserta en un vector de expresión, adecuado para la expresión en una célula hospedadora seleccionada.

[0116] El término "vector" se usa para describir un polinucleótido que puede modificarse por ingeniería genética para que contenga uno o más polinucleótidos clonados que pueden propagarse en una célula hospedadora. Un vector puede incluir uno o más de los siguientes elementos: un origen de replicación, una o más secuencias reguladoras (tales como, por ejemplo, promotores o potenciadores) que regulan la expresión del polipéptido de interés o uno o más genes marcadores de selección (tales como, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y genes que pueden usarse en ensayos colorimétricos, por ejemplo, β-galactosidasa). La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que se usa para expresar un polipéptido de interés en una célula hospedadora.

[0117] Una "célula hospedadora" se refiere a una célula que puede ser o ha sido receptora de un vector o un polinucleótido aislado. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas o células eucariotas. Las células procariotas de ejemplo incluyen E. coli, bacillus y pseudomonas. Las células eucariotas de ejemplo incluyen células de mamífero, tales como células de primate o de animales no primates; células fúngicas, tales como levaduras; células vegetales; y células de insecto. Las células de mamífero ilustrativas no limitantes incluyen, pero sin limitación, células NS0, células PER.C6® (Crucell), células 293 y células CHO, y sus derivados, tales como células 293-6E, DG44, CHO-S y CHO-K. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una sola célula hospedadora, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula parental original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula hospedadora incluye células transfectadas in vivo con uno o más polinucleótidos que codifican una o más secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento.

[0118] El término "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se ha separado de al menos parte de los componentes con los que normalmente se encuentra o produce en la naturaleza. Por ejemplo, se indica que un polipéptido está "aislado" cuando se separa de al menos algunos de los componentes de la célula en la que se produjo. Cuando un polipéptido se secreta por una célula tras su expresión, se considera "aislar" el polipéptido la separación física del sobrenadante que contiene el polipéptido de la célula que lo produjo. De forma similar, se denomina que un polipéptido está "aislado" cuando no forma parte del polinucleótido de mayor tamaño (tal como, por ejemplo, del ADN genómico o del ADN mitocondrial, en el caso de un polinucleótido de ADN) en el que se encuentra típicamente en la naturaleza o se separa de al menos algunos de los componentes de la célula en la que se produjo, por ejemplo, en el caso de un polinucleótido de ARN. Por lo tanto, un polinucleótido de ADN que está contenido en un vector dentro de una célula hospedadora puede considerarse "aislado". En algunas realizaciones, la asparaginasa se purifica mediante cromatografía, tal como cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía CHT o cromatografía de modo mixto.

[0119] Composiciones farmacéuticas de ejemplo

[0120] Las expresiones "formulación farmacéutica" y "composición farmacéutica" se refieren a una preparación que se encuentra en una forma que permite que sea eficaz la actividad biológica del o los principios activos y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un sólido no tóxico, semisólido o carga líquida, diluyente, material de encapsulación, auxiliar de formulación o vehículo convencional en la técnica para su uso con un agente terapéutico que juntos comprenden una "composición farmacéutica" para administración a un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es no tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para la formulación empleada. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen alúmina; estearato de aluminio; lecitina; proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, albúmina canina o de otro animal; tampones, tales como fosfato, citrato, tampones tales como tampones HEPES; glicina; ácido sórbico; sorbato de potasio; mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados; agua; sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal o trisilicato de magnesio; polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa; polietilenglicol; sacarosa; manitol; o aminoácidos que incluyen, pero sin limitación, arginina.

[0121] La composición farmacéutica puede almacenarse en forma liofilizada. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el proceso de preparación incluye una etapa de liofilización. Posteriormente, la composición liofilizada se puede reformular, normalmente como una composición acuosa adecuada para administración parenteral, antes de la administración al sujeto. En otras realizaciones, particularmente cuando el polipéptido es altamente estable a la desnaturalización térmica y oxidativa, la composición farmacéutica puede almacenarse como un líquido, es decir, como una composición acuosa, que puede administrarse directamente o con una dilución apropiada, al sujeto. Una composición liofilizada se puede reconstituir con agua estéril para inyectables (WFI). Se pueden incluir reactivos bacteriostáticos, tales como alcohol bencílico. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas en forma sólida o líquida.

[0122] El pH de la composición farmacéutica puede estar dentro del intervalo de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 8, cuando se administran. Las composiciones de la invención son estériles si se van a usar con fines terapéuticos. La esterilidad se puede lograr por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo por filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 µm). La esterilidad puede mantenerse con o sin agentes antibacterianos.

[0123] Usos de ejemplo de variantes de polipéptidos de asparaginasa

[0124] Las variantes de polipéptidos de asparaginasa o composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes de polipéptidos de asparaginasa de la invención pueden ser útiles para el tratamiento de diversas afecciones patológicas, incluyendo cánceres tales como linfomas o leucemias. En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos de asparaginasa o composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes de polipéptidos de asparaginasa de la invención pueden usarse en el tratamiento de la LLA en seres humanos o linfomas en especies de animales de compañía.

[0126] La expresión "especie de animal de compañía" se refiere a un animal adecuado para ser un compañero del ser humano. En algunas realizaciones, una especie de animal de compañía es un pequeño mamífero, tal como un cánido, felino, perro, gato, caballo, conejo, hurón, cobaya, roedor, etc. En algunas realizaciones, una especie de animal de compañía es un animal de granja, tal como un caballo, vaca, cerdo, etc.

[0128] Como se usa en el presente documento, "tratamiento" es una estrategia para obtener beneficio o resultados clínicos deseados. "Tratamiento" como se usa en el presente documento, abarca cualquier administración o aplicación de un agente terapéutico para la enfermedad en un mamífero, incluyendo un animal de compañía. Para los fines de la presente divulgación, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, una cualquiera o más de: alivio de uno o más síntomas, disminución del grado de la enfermedad, prevención o retraso de la diseminación de la enfermedad, prevención o retraso de la recidiva de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora del estado patológico, inhibición de la enfermedad o la progresión de la enfermedad, inhibición o ralentización de la enfermedad o su progresión, detención de su desarrollo y remisión (ya sea parcial o total). También se incluye en "tratamiento" una reducción de las consecuencias patológicas de una enfermedad proliferativa. Los métodos proporcionados en el presente documento contemplan uno cualquiera o más de estos aspectos de tratamiento. En línea con lo anterior, el término tratamiento no requiere la eliminación al cien por cien de todos los aspectos del trastorno.

[0130] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el tipo de enfermedad que se va a tratar, el estado patológico, la gravedad y la evolución de la enfermedad, el tipo de fin terapéutico, cualquier terapia anterior, el historial clínico, la respuesta al tratamiento previo, la discreción del veterinario responsable del tratamiento, la edad, el sexo y el peso del animal y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para provocar una respuesta deseada en el animal. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula, agonista o antagonista se compensan con los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

[0132] En algunas realizaciones, una variante de polipéptidos de asparaginasa o composición farmacéutica que comprende una variante de polipéptido de asparaginasa, como se describen en el presente documento, si se administra por vía parental, mediante administración subcutánea, infusión intravenosa o inyección intramuscular. En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa o composición farmacéutica se administra como una inyección en bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo. En algunas realizaciones, una variante de polipéptido de asparaginasa o una composición farmacéutica se administra por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarterial, intrasinovial, intratecal o por inhalación.

[0134] En algunas realizaciones, la dosis se administra una vez a la semana durante al menos dos o tres semanas consecutivas y, en algunas realizaciones, este ciclo de tratamiento se repite dos o más veces, opcionalmente intercalado con una o más semanas sin tratamiento. En otras realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz se administra una vez al día durante de dos a cinco días consecutivos y, en algunas realizaciones, este ciclo de tratamiento se repite dos o más veces, opcionalmente intercalado con uno o más días o semanas sin tratamiento.

[0135] La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva o secuencial en cualquier orden. El término "concurrentemente" se utiliza en el presente documento para hacer referencia a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde al menos parte de la administración se superpone en el tiempo o donde la administración de un agente terapéutico cae dentro de un corto período de tiempo en relación con la administración del otro agente terapéutico. Por ejemplo, los dos o más agentes terapéuticos se administran con una separación de tiempo de no más de aproximadamente un número especificado de minutos. El término "secuencialmente" se usa en el presente documento para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos donde la administración de uno o más agentes continúa después de interrumpir la administración de uno o más otros agentes o en donde la administración de uno o más agentes comienza antes de la administración de uno o más de otros agentes. Por ejemplo, la administración de los dos o más agentes terapéuticos se administra con una separación de tiempo de más de aproximadamente un número especificado de minutos. Como se usa en el presente documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al animal.

[0136] Los siguientes ejemplos ilustran aspectos particulares de la divulgación y no pretenden de ninguna manera limitar la divulgación.

[0137] Ejemplos

[0138] Ejemplo 1

[0139] Expresión de asparaginasa de E. chrysanthemi en E. coli

[0140] La asparaginasa nativa de E. chrysanthemi expresada en su célula hospedadora nativa se procesa típicamente y se secreta en el espacio o medio periplásmico. Se investigó la expresión de asparaginasa de E. chrysanthemi en células de E. coli. La secuencia de nucleótidos que codifica la asparaginasa nativa de E. chrysanthemi que contiene una secuencia líder (SEQ ID NO: 1) se clonó entre los sitios Xba1 y HindIII de pET28a(+) (Novagen), un vector de expresión de E. coli que tiene un promotor T7 y un gen de resistencia a la kanamicina. Después de transformar el plásmido resultante en células BL21 de E. coli (DE3), las células se incubaron a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó aproximadamente 1. A continuación, se añadió IPTG 1 mM al medio de cultivo y las células se incubaron a 37 °C durante 2 horas para inducir la expresión de la proteína asparaginasa de E. chrysanthemi.

[0141] Las células se sometieron a choque osmótico para liberar proteínas del periplasma. Las células se centrifugaron y se aisló el sobrenadante (también llamado fracción osmótica). El sedimento celular se resuspendió y se sometió a ultrasonidos para lisar las células. Las células se centrifugaron y el lisado (también denominado fracción soluble) se separó del sedimento (también denominado fracción insoluble). Las tres fracciones (fracciones osmótica, soluble e insoluble) se separaron por SDS-PAGE y se visualizaron usando tinción de Coomassie.

[0142] Basándose en la intensidad de la banda y la diferencia en el peso molecular, la fracción osmótica parecía contener rendimientos muy bajos de asparaginasa procesada, mientras que una gran mayoría del producto de asparaginasa de longitud completa se observó en el sedimento celular (fracción insoluble). Se observó una cantidad baja de producto de asparagina sin procesar en la fracción de lisado (fracción soluble). Estos resultados sugieren que la expresión periplásmica de asparaginasa de E. chrysanthemi en E. coli fue ineficaz y la mayor parte del producto de asparaginasa sin procesar quedó atrapada dentro de las células en una forma insoluble (por ejemplo, agregados, cuerpos de inclusión, etcétera), posiblemente debido a un procesamiento fallido de la secuencia líder.

[0143] Ejemplo 2

[0144] Expresión intracelular de asparaginasa de E. chrysanthemi

[0145] También se investigó la expresión de asparaginasa de E. chrysanthemi sin una secuencia líder en células de E. coli. La secuencia de nucleótidos que codifica asparaginasa nativa de E. chrysanthemi que carece de su secuencia líder (SEQ ID NO: 3) se clonó entre los sitios Xba1 y HindIII de pET28a(+) (Novagen), se transformó en células BL21(DE3) de E. coli y se cultivó en presencia de IPTG 1 mM como se describe en el Ejemplo 1. Las células se lisaron con ultrasonidos, se centrifugaron y el lisado (fracción soluble) y el sedimento (fracción insoluble) se separaron por SDS-PAGE y se visualizaron usando tinción de Coomassie. De manera sorprendente, se observó en el lisado un mayor rendimiento de la asparaginasa soluble expresada intracelularmente.

[0146] Ejemplo 3

[0147] Variante de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemipara la conjugación de tiol dirigida al sitio

[0148] Las proteínas secretadas de bacterias gramnegativas contienen típicamente enlaces disulfuro que se catalizan en restos de cisteína por tiol-disulfuro oxidorreductasas en el periplasma. Por ejemplo, la asparaginasa nativa de E. coli tiene un enlace disulfuro entre los únicos dos restos de cisteína de las proteínas. Sin embargo, la inspección de la secuencia de aminoácidos primaria de la asparaginasa de E. chrysanthemi reveló que la proteína carece de restos de cisteína. Esta observación sugiere que la asparaginasa nativa de E. chrysanthemi carece de enlaces disulfuro y que el entorno oxidativo del espacio periplásmico puede no ser necesario para el plegamiento de esta proteína.

[0149] Las proteínas bacterianas son altamente inmunogénicas para los seres humanos. La pegilación de proteínas bacterianas puede proteger las localizaciones inmunogénicas y reducir la inmunogenicidad. Además, la pegilación puede prolongar la semivida in vivo de la proteína. Para ONCASPAR<®>(pegasparagasa, Shire), la asparaginasa derivada de E. coli se pegila en aminas primarias expuestas en la superficie (por ejemplo, restos de lisina). Desafortunadamente, dicha pegilación no específica puede conducir a un producto heterogéneo. La pegilación en sitios inmunogénicos específicos en lugar de en toda la proteína puede ser ventajosa.

[0150] Dado que la asparaginasa nativa de E. chrysanthemi no incluye restos de cisteína, las variantes que comprenden una o más sustituciones de cisteína pueden pegilarse específicamente en esas localizaciones. Se investigó la introducción de uno o más restos de cisteína en o cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos de la asparaginasa de E.

[0151] chrysanthemi. Se usó un análisis de estructura de proteína tridimensional de la asparaginasa E. chrysanthemi tetramérica para identificar localizaciones de aminoácidos expuestos en la superficie en o espacialmente cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales en los que la pegilación puede proteger el sitio sin afectar a su sitio o sitios activos. Los sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales incluyen las posiciones de aminoácidos 37 a 41, 72, 205 a 212, 265 y 288 de la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 2). La Tabla 2 enumera las localizaciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 en las que se puede introducir un resto de cisteína para la pegilación específica del sitio para una inmunogenicidad reducida.

[0152] Tabla 2.

[0154]

[0156] Las variantes de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi se puede preparar introduciendo uno o más restos de cisteína en una cualquiera o cualquier combinación de localización o localizaciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 2. Por ejemplo, se pueden introducir 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de cisteína en la asparaginasa de E. chrysanthemi.

[0157] A modo de ejemplo, se puede preparar la variante precursora de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi que tienen tres sustituciones de aminoácidos de cisteína en las posiciones 41, 72 y 265 (SEQ ID NO: 4) o que tienen cuatro sustituciones de aminoácidos de cisteína en las posiciones 41, 72, 265 y 288 (SEQ ID NO: 7) de la secuencia de aminoácidos madura.

[0158] Ejemplo 4

[0159] Expresión intracelular de variantes de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi

[0160] Mientras que el entorno oxidativo del periplasma cataliza el enlace disulfuro entre los restos de cisteína, los grupos tiol de cisteína están protegidos de la oxidación en el entorno reductor del citoplasma. La expresión intracelular de una variante del polipéptido de asparaginasa de E. chrysanthemi que comprende sustituciones de cisteína en sitios inmunogénicos o antigénicos se exploró en células de E. coli. La secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la asparaginasa deE. chrysanthemi que tiene un marcador de poli-His en el extremo N en lugar de la secuencia líder y que tiene tres sustituciones de aminoácidos de cisteína en las posiciones 41, 72 y 265 de la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 5) se clonó en pET28a(+ ) (Novagen). Después de transformar el plásmido resultante en células BL21 de E. coli (DE3), las células se incubaron a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó aproximadamente 1. A continuación, se añadió IPTG 1 mM al medio de cultivo y las células se incubaron a 37 °C durante 2 horas para inducir la expresión de la proteína asparaginasa variante de E. chrysanthemi.

[0161] Las células se lisaron con ultrasonidos, se centrifugaron y la variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) se purificó a partir del lisado por cromatografía de afinidad usando resina de purificación de proteínas marcadas con histidina Ni Sepharose excel (GE Healthcare, número de catálogo 17371201) seguida de cromatografía de intercambio catiónico usando cromatografía de intercambio catiónico Sulfphopropyl Sepharose Fast Flow (SP FF) (GE Healthcare, número de catálogo 17072901). La columna SP FF se lavó con fosfato de sodio 0,1 M a pH 6 seguido de pH 7 y la proteína se eluyó con una solución de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7) y cloruro de sodio 1 M. Véase la Figura 1A. La proteína purificada se separó usando SDS-PAGE no reductora y se visualizó usando tinción de Coomassie (Figura 1B).

[0162] Además, se usó la cromatografía de exclusión por tamaño para comparar el radio hidrodinámico de la variante purificada de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) a la de los marcadores estándar de proteína preteñida de Novex Sharp (ThermoFisher, número de catálogo LC5800), y para confirmar que la proteína purificada estaba en forma tetramérica. La proteína purificada se cargó en una columna Shodex KW803 (8 mm x 300 mm) con una precolumna KW-G usando el sistema de cromatografía 1100 de Agilent a un caudal constante de 0,5 ml por minuto y un tampón de carrera de fosfato de sodio 0,1 M a pH 6,6 y cloruro de sodio 1 M. El material eluido se controló mediante absorbancia a una longitud de onda de 214 nm. La variante del producto de asparaginasa de E. chrysanthemi(SEQ ID NO: 5) eluyó a los 16,5 minutos, consistente con el peso molecular previsto para la forma tetramérica de la proteína en solución (~117,4 kDa). Véanse la figura 2A y la figura 2B.

[0163] Ejemplo 5

[0164] Pegilación dirigida al sitio de la variante de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi

[0165] Se realizó la conjugación de la variante purificada de la asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) usando (1) pegilación aleatoria de amina con α-succinimidiloxiglutaril-ω-metoxi, polioxietileno (p.m. 5 kD; SUNBRIGHT<®>ME-050GS; NOF Corporation), (2) pegilación específica de tiol con α-[3-(3-Maleimido-1-oxopropil)amino]propil-ω-metoxi, polioxietileno (p.m. 10 kD; SUNBRIGHT<®>ME-100MA; NOF Corporation) o (3) ambos métodos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0166] Para la pegilación específica de tiol, se probaron diferentes tiempos de reacción (5 y 60 minutos) y diferentes temperaturas de reacción (temperatura ambiente y 37 °C). Las proteínas pegiladas se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras (con DTT) y no reductoras (sin DTT) y se visualizaron usando tinción de Coomassie (Figura 3). La proteína sin pegilar corrió a aproximadamente 35 kDa en condiciones reductoras (figura 3, carril 2) y no reductoras (figura 3, carril 3), lo que sugiere que no había enlaces disulfuro presentes en la variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5). Las muestras pegiladas (figura 3, carriles 4-9) corrieron a un peso molecular más alto consistente con la pegilación de la proteína.

[0167] La actividad de la variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) conjugada mediante pegilación aleatoria de amina y/o pegilación específica de tiol, como se ha descrito anteriormente, se midió usando un kit de ensayo de actividad de asparaginasa (BioVision; número de catálogo K754-100) por duplicado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados del ensayo se proporcionan en la Tabla 3, a continuación. Los resultados muestran que la variante de asparaginasa de E. chrysanthemi (SEQ ID NO: 5) mantenía la actividad enzimática después de la pegilación.

[0168] Tabla 3

[0170]

[0172] Ejemplo 6

[0173] Variante de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemipara la conjugación de amina dirigida al sitio

[0174] Las aminas primarias expuestas en la superficie (por ejemplo, lisina) se pueden conjugar con derivados de PEG reactivos con amina. Es probable que la pegilación sea menos específica y el producto puede ser heterogéneo. La introducción de uno o más restos de lisina adicionales en localizaciones expuestas en la superficie puede proporcionar sitios adicionales para la pegilación reactiva con amina. Por ejemplo, las variantes de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi se pueden preparar sustituyendo uno o más restos de lisina en o cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales, tales como las posiciones de aminoácidos 41, 72, 265 y 288 de la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 2). La Tabla 4 enumera localizaciones de aminoácidos expuestas en la superficie de ejemplo de asparaginasa de E. chrysanthemi en o espacialmente cerca de las posiciones de aminoácidos 41, 72, 265 y 288 de la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 2), en la que se puede introducir un resto de lisina para la pegilación específica del sitio.

[0175] Tabla 4.

[0177]

[0179] Las variantes de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi se puede preparar introduciendo uno o más restos de lisina en una cualquiera o cualquier combinación de localización o localizaciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 4. Por ejemplo, se pueden introducir 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de lisina en la asparaginasa de E. chrysanthemi. A modo de ejemplo, se puede preparar la variante precursora de polipéptidos de asparaginasa de E. chrysanthemi que tiene una sustitución de aminoácidos de lisina en la posición 41 (SEQ ID NO: 8) o en las posiciones 41 y 288 (SEQ ID NO: 9) de la secuencia de aminoácidos madura.

[0180] Ejemplo 7

[0181] Variante de polipéptidos de asparaginasa de E. coli para la conjugación de amina dirigida al sitio

[0182] La L-asparaginasa II de E. coli (SEQ ID NO: 10) está actualmente aprobada para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda. Desafortunadamente, las reacciones inmunológicas son un efecto secundario adverso significativo. La pegilación específica del sitio sería ventajosa para reducir los efectos secundarios inmunológicos. La proteína asparaginasa nativa de E. coli tiene una secuencia líder y dos restos de cisteína, que forman un solo enlace disulfuro. Se cree que la proteína se procesa y secreta en el espacio periplásmico para formar el enlace disulfuro. A diferencia de la asparaginasa de E. chrysanthemi, la asparaginasa de E. coli puede no ser adecuada para la expresión intracelular porque el enlace disulfuro en el periplasma puede ser necesario para el plegamiento adecuado de la proteína. Se investigaron diferentes enfoques para la pegilación específica del sitio de la asparaginasa de E. coli. Un enfoque para introducir sitios de pegilación específicos en la asparaginasa de E. coli implica sustituir cisteínas no emparejadas en localizaciones que están incluidas parcialmente en o cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales. El grupo tiol de cisteínas no emparejadas en sitios parcialmente incluidos puede protegerse de la oxidación en el periplasma, pero estar lo suficientemente expuesto para las reacciones de conjugación, tal como pegilación. Se usó un análisis de estructura de proteína tridimensional de la L-asparaginasa tetramérica de E. coli para identificar localizaciones de aminoácidos incluidos parcialmente en o espacialmente cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales en los que la pegilación puede proteger el sitio sin afectar a su sitio o sitios activos. Por ejemplo, uno o más restos de cisteína no emparejados pueden sustituirse en sitios parcialmente incluidos en o espacialmente cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos, tales como las posiciones de aminoácidos 55-58, 114-119, 201-207 y 252-258 de la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 11). A modo de ejemplo, las variantes de polipéptidos de asparaginasa de E. coli se pueden preparar sustituyendo uno o más restos de cisteína no emparejados en una cualquiera o más de las siguientes localizaciones de aminoácidos basándose en la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 11): E51C, Q52C, S118C, T119C, K196C, S206C, D285C y T311C.

[0183] Un segundo método para introducir sitios de pegilación específicos en la asparaginasa de E. coli implica introducir uno o más restos de cisteína emparejados en o espacialmente cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales. En lugar de que el grupo tiol de los pares de cisteínas sustituidos se oxide en el periplasma, el par o pares deben formar enlace o enlaces disulfuro. Los enlaces disulfuro (incluido el enlace original) pueden reducirse usando un agente reductor, tal como DTT, para permitir la conjugación. La pegilación o el marcaje se pueden lograr volviendo a unir las cisteínas emparejadas usando diversos procesos químicos, tales como la reacción de acoplamiento de tiolina. Véase Griebenow N., et al., Site-specific conjugation of peptides and proteins via rebridging of disulfide bonds using the thiol-yne coupling reaction. Bioconjug Chem (2016) 4: 911-917.

[0184] Se usó un análisis de estructura de proteína tridimensional de la L-asparaginasa II tetramérica de E. coli para identificar localizaciones para introducir restos de cisteína emparejados en o espacialmente cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales en los que la pegilación puede proteger el sitio sin afectar a su sitio o sitios activos. Las cisteínas emparejadas pueden introducirse dentro del mismo dominio o entre dominios de la proteína tetramérica. Por ejemplo, la Tabla 5 proporciona una lista de combinaciones de restos de cisteína emparejadas (C1 y C2) que pueden introducirse en la asparaginasa tetramérica de E. coli dentro del mismo dominio o entre dominios. A modo de ejemplo, la figura 4 muestra la estructura tridimensional hipotética de una variante de polipéptido de asparaginasa de E. coli que tiene un par de cisteínas introducidas en la posición 8 y 32 de la SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 12). El par de cisteínas adicionales se identifica en la figura.

[0186] Tabla 5.

[0188]

[0189] nin i n

[0190]

[0191] nin i n

[0192]

[0193] n in i n

[0195]

[0198] Un tercer enfoque para introducir sitios de pegilación específicos en la asparaginasa de E. coli implica introducir uno o más restos de lisina adicionales localizaciones expuestas en la superficie en o espacialmente cerca de sitios inmunogénicos o antigénicos potenciales, tal como en o espacialmente cerca de las posiciones de aminoácidos 55 58, 114-119, 201-207 y 252-258 de la secuencia de aminoácidos madura (SEQ ID NO: 11). Por ejemplo, se pueden preparar variantes de polipéptidos de asparaginasa de E. coli que tienen una o más de las siguientes sustituciones de lisina: S58K, R116K y/o D240K.

[0200] Ejemplo 8

[0202] La variante de polipéptidos de asparaginasa K-12 de E. coli ELSPAR<®>, es una L-asparaginasa de E. coli indicada para el tratamiento de la LLA y ha sido prescrita por veterinarios para el tratamiento del linfoma en perros y gatos. ELSPAR<®>deriva de la cepa K-12 de E. coli y tiene cinco restos de cisteína. La secuencia de aminoácidos precursora se proporciona como SEQ ID NO: 13 y la secuencia madura se proporciona con la SEQ ID NO: 14. Análisis de estructura de proteína tridimensional de ELSPAR<®>tetramérica se usó para identificar que las dos cisteínas en las posiciones 67 y 200 de la SEC ID NO: 14 probablemente forman un enlace disulfuro y las tres cisteínas restantes en las posiciones 45, 67 y 242 de la SEC ID NO: 14 probablemente no estén emparejadas. Para reducir la probabilidad de agregación de proteínas y/o la reactividad a otras moléculas, una, dos o las tres cisteínas no emparejadas pueden sustituirse con otros aminoácidos, tal como serina. Por ejemplo, se puede preparar una variante de la asparaginasa de E. coli que tiene una serina en lugar de las tres cisteínas no emparejadas en las posiciones de aminoácido 45, 67 y 242 de la SEC ID NO: 14 (SEC ID NO: 15). Los polipéptidos de asparaginasa que tienen uno o más restos de cisteína no emparejados (por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 14, o que tienen solo uno o dos restos de cisteína de la SEC ID NO: 14 sustituidos) pueden usarse para la conjugación.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

1. Una variante del polipéptido de asparaginasa que comprende al menos una sustitución de aminoácido en un resto de cisteína no emparejado de un polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje correspondiente, en donde la al menos una sustitución de aminoácido comprende cualquier aminoácido distinto de cisteína.

2. La variante del polipéptido de asparaginasa de la reivindicación 1, que comprende al menos una sustitución de cisteína en una posición de aminoácido o al menos un par de sustituciones de cisteína en las posiciones de aminoácidos en o espacialmente cerca de un sitio inmunogénico o antigénico del correspondiente polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje.

3. La variante del polipéptido de asparaginasa de la reivindicación 2, en donde la al menos una cisteína está incluida parcialmente.

4. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante del polipéptido de asparaginasa carece de una secuencia líder.

5. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sitio inmunogénico o antigénico en el polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje provoca una respuesta inmunitaria en un ser humano o en una especie de animal de compañía, opcionalmente en donde la especie de animal de compañía es una especie canina, felina o equina.

6. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde entre el 5 % y el 25 %, entre el 5 % y el 20 %, entre el 5 % y el 15 %, del 5 % al 10 %, entre el 10% y el 20%, entre el 20 % y el 30 %, o entre el 10 % y el 30 % de la al menos una cisteína está expuesta en la superficie, según lo determinado por un software de modelado de proteínas estándar.

7. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la al menos una cisteína está o el al menos un par de cisteínas están a 35 angstroms (Å) o menos del sitio inmunogénico o antigénico, según se determina mediante análisis de estructura de proteína tridimensional, opcionalmente 30 Å o menos, 25 Å o menos, 20 Å o menos, 15 Å o menos, 10 Å o menos o 5 Å o menos.

8. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de asparaginasa de tipo salvaje, tal como la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, opcionalmente

en donde el polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje es un polipéptido de asparaginasa E. coli de tipo salvaje, opcionalmente en donde el polipéptido de asparaginasa de tipo salvaje comprende las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14.

9. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde (a) el sitio inmunogénico o antigénico corresponde a la posición de aminoácido 55, 56, 57, 58, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 252, 253, 254, 255, 256, 257 o 258 de la SEQ ID NO: 11; y/o (b) la al menos una cisteína está ubicada en una posición que corresponde a una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas entre 51, 52, 118, 119, 196, 206, 285 y 311 de SEQ ID NO: 11; y/o (c) cada una de las al menos un par de cisteínas se selecciona entre una o más sustituciones de cisteínas emparejadas C1-C2 enumeradas en la Tabla 5, opcionalmente en una posición correspondiente a las posiciones de aminoácidos 116 y 120, las posiciones de aminoácidos 196 y 200 o las posiciones de aminoácidos 225 y 252 de la SEQ ID NO: 11; y/o (d) en donde el resto de cisteína no emparejado se localiza en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 45, 67 y/o 242 de SEQ ID NO: 14.

10. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 15.

11. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en forma monomérica, dimérica o tetramérica.

12. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la variante del polipéptido de asparaginasa se modifica, tal como se sialila o se pegila, opcionalmente se pegila con tiol o se pegila con amina.

13. Un ácido nucleico aislado que codifica la variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13.

15. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 14, opcionalmente

en donde la célula es una célula procariota, tal como una célula E. chrysanthemi, una célula de E. coli o una célula de pseudomonas; opcionalmente la célula es una célula eucariota, tal como una célula de levadura.

16. Un método para producir una variante del polipéptido de asparaginasa, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 15 y, opcionalmente, aislar la variante.

17. Una composición farmacéutica que comprende la variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. La variante del polipéptido de asparaginasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 para su uso en un método de tratamiento, en donde el método comprende administrar el polipéptido o la composición a un sujeto.

19. La variante del polipéptido de asparaginasa para su uso o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, para su uso en un método para tratar el linfoma o una leucemia linfoblástica aguda.

20. La variante del polipéptido de asparaginasa para su uso o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 18 o 19, en donde el sujeto es un ser humano o una especie de animal de compañía.

21. La variante del polipéptido de asparaginasa para su uso o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la especie de animal de compañía es una especie canina, felina o equina.