ES3056700T3 - Compositions and methods for treating myelin disorders - Google Patents

Abstract

Un método para mejorar la migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) en un sujeto que lo necesita incluye administrar al sujeto un agente terapéutico que inhibe una o más de la actividad catalítica, la señalización y la función de PTPσ. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones y métodos para tratar trastornos de mielina

[0003] Solicitud relacionada

[0004] Esta solicitud reivindica la prioridad de las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.º 62/531251, presentada el 11 de julio de 2017.

[0005] Financiamiento del gobierno

[0006] La presente invención se ha realizado con el apoyo del gobierno en virtud de la subvención NS077942 concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos sobre la invención. Antecedentes

[0007] La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante mediada por autoinmunidad crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por una inflamación fuerte que conduce a una pérdida dramática de agrupaciones de oligodendrocitos (OL), desmielinización y discapacidad neurológica irreversible. Aunque la remielinización puede ocurrir espontáneamente durante las primeras fases de la EM, en última instancia, fracasa en las regiones que desarrollan placas similares a cicatrices cargadas de proteoglicanos. Sin embargo, el mecanismo subyacente del fracaso en la diferenciación, maduración y remielinización de los oligodendrocitos aún no se comprende bien. Estudios recientes han identificado los efectos reguladores de los proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) en la maduración y función de OPC.

[0008] Los CSPG son moléculas de matriz extracelular estructural (ECM) que consisten en cadenas de glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) unidos a una proteína central. La regulación por incremento drástica de los CSPG es un sello distintivo de la agresión al SNC, tal como lesión de la médula espinal (SCI), epilepsia, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular y EM. El impacto inhibidor de los CSPG en la regeneración axonal y su papel en la creación de bolas terminales distróficas atrapando las terminaciones axonales en regeneración después de una lesión de la médula espinal (SCI) se ha documentado bien.

[0009] En EM, CSPG reactivos producidos por astroglial, tales como agrecano y versicano, se han detectado en abundancia dentro de las lesiones desmielinizantes activas. Mientras que las lamininas permisivas promueven la propagación, supervivencia y maduración de los OL, estudios recientes han demostrado que los CSPG inhibidores pueden superar a estas proteínas de ECM de apoyo al crecimiento y son capaces de reducir fuertemente las OPC/OL de ratón o ser humano al provocar una reducción en la migración, extensión del proceso morfológico y capacidad disminuida para madurar. La inhibición de CSPG, sin embargo, podría aliviarse mediante la degradación enzimática a través de la condroitinasa ABC para mejorar la maduración de OL in vitro. In vivo, los CSPG aumentan temporalmente en las lesiones inducidas por lisolecitina (LPC) y también puede producirse una remielinización mejorada después de tratamientos dirigidos a CSPG, tales como inhibidores de la síntesis de proteoglicanos beta-d-xilósido o flurosamina. Li et al. SCIENTIFIC REORTS, vol.5, n.º 1, 14 de octubre de 2015 describe la regeneración mejorada y la recuperación funcional después de la avulsión de la raíz espinal mediante la manipulación del receptor de proteoglicano PTPσ. Motavaf et al. CELLULAR AND MOLECULAR NEUROBIOLOGY, Springer, Nueva York, EE.UU., vol. 37, n.º 8, 21 de febrero de 2017, pág. 1335-1348 describe intentos de superar el fallo de remielinización y tiene como objetivo abrir nuevas vías terapéuticas para la esclerosis múltiple.

[0010] Sumario

[0011] Las realizaciones descritas en el presente documento generalmente se refieren a agentes para su uso en métodos de potenciación de la migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) en sujetos que tienen o están en riesgo de un trastorno relacionado con la mielina.

[0012] El agente terapéutico incluye un péptido terapéutico. El péptido terapéutico tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 85 % o al menos aproximadamente un 95 % idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO: 33. Por ejemplo, el agente terapéutico, puede incluir un péptido terapéutico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-25, 32 y 33.

[0013] En realizaciones, el agente terapéutico puede incluir un péptido terapéutico que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % homólogo a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. El péptido terapéutico puede incluir, por ejemplo, una sustitución conservadora de un aminoácido de al menos uno, dos, tres o cuatro de residuo 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12 o 13 de SEQ ID NO: 32. En una de tales realizaciones, el residuo de aminoácido 4E está sustituido por D o Q, el residuo de aminoácido 5R está sustituido por H, L o K, el residuo de aminoácido 6L está sustituido por I, V o M, el residuo de aminoácido 7K está sustituido por R o H, el residuo de aminoácido 9N está sustituido por E o D, el residuo de aminoácido 10D está sustituido por E o N, el residuo de aminoácido 12L está sustituido por I, V o M, y/o el residuo de aminoácido 13K está sustituido por R o H.

[0015] En otras realizaciones, el agente terapéutico puede incluir un péptido terapéutico que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % homólogo a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. El péptido terapéutico puede incluir, por ejemplo, una sustitución conservadora de un aminoácido de al menos uno, dos, tres o cuatro de residuo 7, 8, 9, 10, 12 o 13 de SEQ ID NO: 33. En una de tales realizaciones, el residuo de aminoácido 7E está sustituido por D o Q, el residuo de aminoácido 8R está sustituido por H, L o K, el residuo de aminoácido 9L está sustituido por I, V o M, el residuo de aminoácido 10K está sustituido por R o H, el resto de aminoácido 12N está sustituido por E o D, y/o el resto de aminoácido 13D está sustituido por E o N.

[0017] En otras realizaciones, el agente terapéutico incluye un resto de transporte que está unido al péptido terapéutico y facilita la absorción de los péptidos terapéuticos por la OPC. Por ejemplo, el resto de transporte puede ser un resto de transporte Tat de VIH o un resto de transporte (PRR5). En una de tales realizaciones, el resto de transporte está unido al péptido terapéutico mediante un enlazador peptídico. En una realización, el agente terapéutico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34- 60.

[0019] En algunas realizaciones, el agente terapéutico se formula para la administración sistémica al sujeto que se está tratando.

[0021] En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con la mielina comprende al menos uno de un trastorno mielinoclástico, un trastorno leucodistrófico o una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso periférico. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con la mielina es esclerosis múltiple.

[0023] Breve descripción de los dibujos

[0025] Las figuras 1A-1J ilustran que ISP promueve la recuperación funcional e histológica en el modelo de ratón con EAE. Fig. 1A: Diagrama de la administración de ISP a ratones con EAE al comienzo o al pico de la enfermedad determinada por la puntuación clínica. Fig.1B: Puntuación clínica de la gravedad de la enfermedad en ratones con EAE inducida por MOG35-55 tratados con ISP o vehículo diariamente a partir del inicio o el pico de la enfermedad. Fig. 1C: Mejora media en la puntuación de enfermedad por animal de la cohorte de EAE en B. (n=9 (grupo de vehículo de EAE), 15 (grupo de inicio de ISP de EAE) y 12 (grupo de pico de ISP de EAE), ANOVA F(2,33)=20,96; prueba de comparación múltiple de Tukey, P<EAE+Veh frente a inicio de ISP de EAE><0,0001, P<EAE+Veh frente a pico de ISP de EAE>=0,0004). Figuras ID e IE: Inmunotinciones y gráficos, respectivamente, que muestran la tinción con Luxol fast blue (LFB) de mielina, demostrando una integridad de mielina normal en ratones con EAE tratados con ISP a los 48 días después de la inducción, en contraste con la marcada pérdida de mielina presente en la médula espinal del control tratado con vehículo. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. (n=5 ratones/grupo, P=0,0002, t=6,647, df=8; prueba de la t de Student bilateral) Fig.1F: Doble inmunotinción para MBP y neurofilamento-200 (NF200) en la médula espinal torácica de ratones con EAE tratados con vehículo e ISP a los 48 días después de la inducción. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. Fig. 1G: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de la expresión de MBP en tejido de médula espinal de ratones de control tratados con vehículo o ISP y ratones con EAE a los 48 días después de la inducción. Los datos se normalizan a la expresión de la proteína β-actina. (n=4 ratones/grupo, ANOVA F(3,12)=26,68; prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a EAE+Veh>= 0,0001, Peae+Veh frente a eae+isp = 0,0037). Fig.1H: Micrografías electrónicas de médulas espinales lumbares ventrales de ratones con EAE tratados con vehículo e ISP 107048 días después de la inducción. Barra de escala = 2 µm. Fig. 1E Número de axones mielinizados en las lesiones de la médula espinal de ratones con EAE tratados con vehículo e ISP1072. (n=3 ratones/grupo, P=0,0014, t=7,815, df=4; prueba de la t de Student bilateral). Fig. 1J: Cuantificación de las relaciones g (diámetro del axón/diámetro de la fibra) de las fibras mielinizadas en las médulas espinales lumbares ventrales de ratones con EAE tratados con vehículo e ISP. (Grupo de EAE+Veh, relación g = 0,8874± 0,001901; grupo de EAE+ISP, relación gl077= 0,8423 grupo ISP; n=134 axones remielinizados de 3 ratones/grupo; P<0,0001, 1078 t=14,31, df=266; prueba de la t de Student bilateral). Los datos se presentan como media±sem. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001.

[0027] Las Fig. 2A-2G ilustran que ISP promueve la remielinización en la médula espinal de ratones desmielinizados con lisolecitina (LPC). Fig. 2A; Secciones teñidas con LFB representativas de lesiones de LPC de las médulas espinales de ratones tratados con vehículo o ISP. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. Fig. 2B; Análisis cuantitativo del volumen de la médula espinal lesionada en ratones tratados con vehículo o ISP a 3, 7, 14 y 21 dpl. (n=4 ratones/grupo, ANOVA F(3,12)=16,41; prueba de comparación múltiple de Sidak, 14dpl: P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>= 0,0003; 21dpl: P<LPC+Veh frente a LPC+ISP><0,0001). Fig. 2C: Doble inmunotinción para MBP y DAPI en la médula espinal de ratones tratados con vehículo e ISP a 14 y 21 dpl. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barras de escala = 100 µm. Fig. 2D: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de la expresión de MBP en tejido de médula espinal de ratones tratados con vehículo o ISP a 14 dpl. Los datos se normalizan a la expresión de la proteína β-actina. (n=4 ratones/grupo, ANOVA F(3,12)=24,21; prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con>frente a LPC+Veh

< 0,0001, P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>= 0,0276). Fig. 2E: Imágenes de microscopía electrónica representativas de lesiones de LPC de la médula espinal de ratones tratados con vehículo o ISP a 14 dpl. Barra de escala = 5 µm. Fig. 2E: Número de axones mielinizados en lesiones inducidas por LPC de ratones tratados con vehículo o ISP1100 a 14 dpl. (n=3 ratones/grupo, P=0,0001, t=14,26, df=4; prueba de la t de Student bilateral). Fig.2G: La relación g de mielina en las lesiones de LPC de ratones tratados con vehículo o ISP a 14 dpl (grupo de LPC veh, relación g = 0,9103± 0,003583; grupo de LPC+ISP, relación g = 0,8741± 74103599; n=139 axones remielinizados de 3 ratones/grupo; P< 0,0001, t=7,142, df=276; prueba de la t de Student bilateral). Los datos se presentan como media±sem. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001.

[0029] Las Fig.3A-3C ilustran que ISP acelera la remielinización en cultivos de cerebelo organotípicos tratados con LPC. Fig. 3A: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas de MBP y neurofilamento-200 (NF200) muestran mielinización normal en secciones sin tratamiento previo (Con), desmielinización inducida por LPC en 1 día in vitro (div) y aumento de la remielinización después del tratamiento con ISP en cortes de cerebelo desmielinizados con LPC en 8div y 14div. Barra de escala = 100 µm. Fig. 3B: Inmunorreactividad relativa de MBP (es decir, co-localización de MBP y NF200) en cortes de cerebelo en comparación con ningún tratamiento (100 % como control). (n=9 cortes de 3 réplicas independientes por grupo, ANOVA F(5,48)=230,4, prueba de comparación múltiple de Tukey, 8dpl: P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>< 0,0001, 14 dpl: P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>< 0,0001). Fig. 3C: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de la expresión de MBP en cortes de cerebelo tratados con vehículo o ISP en 8div y 14div. Los datos se normalizan a la expresión de la proteína β-actina. (n= 3 réplicas independientes por grupo. 8div: ANOVA F(3,8)=58,89, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<Veh frente a LPC+Veh>< 0,0001, P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>= 0,0187; 14div: ANOVA F(3,8)=6,281, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<Veh frente a LPC+Veh>< 0,048, P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>= 0,025). Los datos se presentan como media±sem. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001.

[0031] Las Fig. 4A-4D ilustran que ISP reduce la carga de proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) en modelos de EAE y LPC. Fig 4A: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas de Iba1 y Cat301 (anticuerpo específico de agrecano) muestran una acumulación disminuida de CSPG y microglía/macrófagos en la médula espinal torácica de ratones con EAE tratados con ISP en comparación con ratones con EAE tratados con vehículo a los 41 días después de la inducción. Barra de escala = 100 µm. Fig 4B: Imágenes de inmunohistoquímica representativas de MBP, Cat301 y CS56 (anticuerpo específico de glicosaminoglicano) que muestran una acumulación disminuida de CSPG después del tratamiento con ISP en 14 dpl en ratones con desmielinización por LPC. Barra de escala = 100 µm. Fig. 4C: Imágenes de inmunohistoquímica representativas de Iba1, GFAP, MBP, Cat301 y CS56 que muestran una acumulación disminuida de CSPG después del tratamiento con ISP en 7 dpl en ratones con desmielinización por LPC. Barra de escala = 100 µm. Fig. 4D: Cuantificación relativa de la intensidad de inmunofluorescencia de Iba1, GFAP, MBP, Cat301 y CS56 en la médula espinal de ratones con LPC tratados con vehículo o ISP en 7 dpl. (n=3 ratones/grupo, Iba1: P=0,1848, t=1,6, df=4; Cat301: P=0,0092, t=4,719, df=4; GFAP: P=0,1111, t=2,039, df=4; CS56: P=0,0028, t=6,55, df=4; MBP: P> 0,9999, t=0, df=4; Versicano: P=0,0095, t=4,669, df=4; prueba de la t de Student bilateral). Los datos se presentan como media±sem. **P <0,01.

[0033] Las Fig. 5A-5I ilustran que ISP aumenta la actividad de proteasa de degradación de CSPG. Fig. 5A y 5B: El ensayo de cruce de gradiente de CSPG muestra que el tratamiento con ISP promueve el cruce de OPC PDGFRα+ o 04+ a través del gradiente de CSPG. Barra de escala = 100 µm. Fig. 5C: Cuantificación de inmunotinción para la cantidad de OPC PDGFRα+ o 04+ que cruzan la barrera de CSPG después del tratamiento con vehículo o ISP. (n=9 puntos de 3 réplicas independientes. PDGFRα: P< 0,0001, t=7,99, df=16; 04: P< 0,0001, t=9,419, df= 16, prueba de la t de Student bilateral). Los datos se presentan como media±sem. Fig. 5D: Imágenes de inmunotinción representativas de CS56 y OPC PDGFRα+ en la barrera de CSPG que representan la degradación de CSPG después del tratamiento con ISP a medida que cruzan la barrera para dejar "sombras" de CS56 (recuadro y flechas). Fig. 5E: Para investigar la actividad proteasa, los medios acondicionados (CM) de OPC se trataron con control de vehículo o ISP 2,5 uM o ISP aleatorizado (SISP) y se incubaron con agrecano (20 ug/ml) o laminina (10 ug/ml), luego se analizaron a través de inmunotransferencias tipo Western. Fig. 5F: La cuantificación del resto glicosaminoglicano a través de la inmunotransferencia de CS56 revela una degradación significativa de CS56 después del tratamiento con ISP (ANOVA unidireccional, prueba posthoc de Dunnett, P=0,0432, F(2,12) = 4,131, N= 5 inmunotransferencias tipo Western. Fig. 5G: La cuantificación de la inmunotransferencia de laminina no muestra cambios significativos (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,9024, F(2,15) = 0,1034), N= 6 inmunotransferencias tipo Western). Fig.5H: La caseína inactivada en el ensayo de actividad proteasa EnzChek emite fluorescencia una vez que se escinde. Fig. 51: La cuantificación del ensayo de actividad proteasa EnzChek revela una actividad proteasa significativa (prueba posthoc de Dunnett de ANOVA unidireccional, P=0,0015, F(2,18) = 9,534, N = 26 de 7 repeticiones) en CM de OPC tratado con ISP 2,5 μM sobre el control. Los gráficos indican representaciones de diagramas de dispersión de inmunotransferencias tipo Western o la media de cada réplica con medias de error estándar. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001. n.s., no significativo.

[0035] Las Fig. 6A-6I ilustran que ISP aumenta la secreción y actividad de MMP-2 para caracterizar adicionalmente la actividad de proteasa, en la Fig. 6A, las OPC cultivadas se trataron con control de vehículo o ISP o SISP 2,5 μM, concentrados, luego se cargaron en geles de gelatina SDS/PAGE para el análisis de zimografía. 25 ng de MMP-9 o MMP-2 recombinantes sirvieron como controles positivos. Fig. 6B: La cuantificación de los carriles de MMP-2 activo de la zimografía de gelatina revela una actividad significativa de MMP-2 después del tratamiento con ISP sobre el control (ANOVA unidireccional, prueba posthoc de Dunnett, P=0,0161, F(2,12) = 5,937, N=5 zimogramas). Fig.6C: La expresión mejorada de MMP-2 después del tratamiento con ISP se confirmó en inmunotransferencias tipo Western de medios acondicionados (CM) de OPC concentrados. Fig. 6D: La cuantificación de la inmotransferencia de MMP-2 se mejoró significativamente después del tratamiento con ISP sobre el control (ANOVA unidireccional, prueba posthoc de Dunnett, P=0,0150, F(2,15) = 5,63, N= 6 inmunotransferencias tipo Western). En cambio, en la Fig. 6E, la inmunotransferencia de MMP-10 no fue significativa entre los tratamientos (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,9619, F(2,15) = 0,03899, N= 6 inmunotransferencias tipo Western). Fig.6I: para explorar si ISP induce la secreción de proteasas para degradar los CSPG, las OPC cultivadas se trataron con los siguientes fármacos con o sin ISP 2,5 uM: inhibidor de exocitosis Exo1 (10 ug/ml), inhibidor de metaloproteasa general GM6001 (25 uM), o inhibidor de MMP-2 específico (OA-Hy, Calbiochem, 100 nM). El CM recogido se incubó con agrecano (20 ug/ml) y se sometió a inmunotransferencia con CS56. Fig. 6J: La cuantificación de CS56 revela una degradación significativa inducida por ISP de los CSPG sobre el control, Exol+ISP, GM6001+ISP y OA-Hy ISP (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0010, F(7,32)=4,749 N=5 inmunotransferencias tipo Western). Fig.6H; Inmunotinción de OPC 04+ (rojo) que muestran MMP-2 concentrada en soma y procesos de OPC. Los gráficos indican representaciones de diagramas de dispersión de inmunotransferencias tipo Western o la media de cada réplica con medias de error estándar. *P<0,05. n.s., no significativo.

[0037] Las Fig. 7A-7F ilustran que la actividad de MMP-2 inducida por ISP aumenta la migración de OPC y la remielinización a través de la desinhibición de CSPG. Para preguntar si la actividad proteasa inducida por ISP está implicada en la migración y remielinización de OPC, en la Fig. 7A, las OPC cultivadas se colocaron en placas en cubreobjetos con gradientes de punto de CSPG y se trataron con control de vehículo, ISP o SISP 2,5 μM, GM600125 uM /- ISP o SISP, o inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) 100 nM /- ISP o SISP. Se contó la cantidad de OPC 04+ que cruzan la barrera de CSPG y, en la Fig.7B, se cuantificó y se mostró gráficamente. El tratamiento con ISP (N = 37 puntos, 5 repeticiones) indujo significativamente una mayor migración de OPC 04+ más allá de la barrera de CSPG en comparación con tratamiento control (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0002, F(11,48) = 5,013), con GM6001+ISP (N=20 puntos) o con OA-Hy ISP (N=20 puntos). N(Puntos)=31 Control, 26 SISP, 18 GM6001, 20 GM6001+SISP, 18 OA-Hy, 19 OA-Hy+SISP) Fig.7C: Para probar si la remielinización se vio afectada por la inhibición de la proteasa, los cortes de cerebelo P7-9 se trataron con LPC durante 18 horas, luego se trataron con vehículo de control, ISP o SISP 2,5 μM, GM6001 25 uM /- ISP, u OA-Hy 100 nM /- ISP durante 9 días antes de la tinción para neurofilamento (NF200) o MBP. Fig. 7D: La remielinización se cuantificó a través de colocalización de MBP y neurofilamento. El tratamiento con ISP (N = 35 imágenes de 4 repeticiones con hasta 13 secciones en total) aumentó significativamente la colocalización de MBP-neurofilamento sobre el control (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0001, F (8,88) = 13,61), grupos GM6001 ISP (N=28) y OA-Hy ISP (N=23). N(imágenes)=17 Control, 22 SISP, 48 GM6001, 20 GM6001+SISP, 22 OA-Hy, 22 OA-Hy SISP. Los gráficos indican representaciones de diagrama de dispersión de la media de cada réplica con medias de error estándar. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001. Fig.7E y 7F: Los cultivos de cortes de cerebelo se trataron con construcciones lentivirales durante 48 horas antes del tratamiento de LPC. Tratamiento con vehículo o ISP (2,5 μM) seguido durante 6 días in vitro. A continuación, se cuantificó la inmunofluorescencia de MBP (verde) con NF20 (rojo). ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey. P=0,0005. F(3, 116) = 6,395. N = alrededor de 30 imágenes de 10 cortes). Los gráficos indican representaciones de diagrama de dispersión de la media de cada réplica con medias de error estándar.

[0039] Las Fig. 8A-8F ilustran que ISP promueve la reparación de la mielina a través del aumento de la expresión de MMP-2 en el modelo de desmielinización inducida por LPC de ratones. Fig. 8A: Las imágenes representativas de inmunohistoquímica de MMP-2 y DAPI muestran niveles aumentados de MMP-2 en la médula espinal de ratones tratados con ISP a los 7 días posteriores a la inyección de LPC (dpl) en comparación con médulas de control de vehículo de LPC o sin tratamiento previo. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. Fig. 8B: Cuantificación relativa de la intensidad de inmunofluorescencia de MMP-2 en la médula espinal de ratones tratados con ISP en 7 dpl (n = 3 ratones/grupo, ANOVA F(2,6)=48,12, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a IPC>= 0,0075, P<LPC frente a LPC+ISP>= 0,0056). Fig.8C: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de la expresión de MMP-2 en tejido de la médula espinal de ratones sin tratamiento previo, tratados con vehículo o con ISP en 7 dpl. Datos normalizados a la expresión de la proteína β-actina. (n=3 ratones/grupo, ANOVA F(2,6)=33,14; prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a IPC>= 0,0168, P<LPC frente a LPC+ISP>= 0,0143). Fig. 8D: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas muestran que OPC Olig2+ expresan MMP-2 en la médula espinal de ratones tratados con ISP en 14 dpl. Las flechas blancas indican la colocalización de MMP-2 y Olig2. Fig.8E: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas muestran que las células Iba1+ (microglía/macrófago) expresan MMP-2 en la médula espinal de ratones tratados con ISP en 14 dpl. Las flechas blancas indican la colocalización de MMP-2 y Iba1. Barra de escala = 100 µm. Fig. 8F: Tinción de eriocromo cianina (mielina) representativa de lesiones de LPC de las médulas espinales de ratones sin tratamiento previo, tratados con vehículo, ISP, inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) o ARNhp de MMP-2. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. Fig. 8G: Análisis cuantitativo del volumen de médula espinal lesionada en ratones tratados con vehículo, ISP, inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) o ARNhp de MMP-2 en 18 dpl. (n=4 ratones/grupo, ANOVA F(5,18)=169,7; prueba de comparación múltiple de Tukey, P<LPC frente a LPC+ISP>< 0,0001; P<LPC+ISP frente a LPC+ISP+OA-Hy><0,0001; P<LPC+ISP frente a LPC+ISP+ARNhp de MMP-2><0,0001; P<LPC frente a LPC+OA-Hy>=0,0279). Los datos se presentan como media÷ sem. *P <0,05, *** p < 0,001.

[0041] Las Fig. 9A-9D ilustran esa carga de CSPG aumentada en modelos de ratón de EM. Fig. 9A y 9B: Las secciones teñidas con LFB representativas y las imágenes de inmunohistoquímica de Cat301 y CS56 muestran la acumulación de CSPG en la médula espinal torácica de ratones con EAE en los 28 y 48 días después de la inducción. Barra de escala = 100 µm. Cuantificación de intensidades de píxel de Cat301 (CSPG de agrecano) y CS56 (restos de glicosaminoglicano de CSPG) representados. (Cat301: n=3 ratones/grupo, ANOVA F(2,6)=163,9, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a EAE D28>= 0,0007, P<EAE d28 frente a EAE d41>= 0,0001; CS56: n=3 ratones/grupo, ANOVA F(2,6)=168,7, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a EAE D28>=0,0052, P<EAE D28 frente a EAE D41>< 0,0001). Fig. 9C y 9D: Las secciones teñidas con LFB representativas y las imágenes de inmunohistoquímica de Cat301 y CS56 muestran la acumulación de CSPG en el sitio de la lesión después de la desmielinización de LPC en 7 dpl y 14 dpl. Barra de escala = 100 µm. Cuantificación de las intensidades de píxel de Cat301 y CS56 representadas (Cat301: n=3 ratones/grupo, ANOVA F(2,6)=269,7, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a 7 dpl>< 0,0001, P<7 dpl frente a 14 dpl>< 0,0001; CS56: n=3 ratones/grupo, ANOVA F(2,6)=105, prueba de comparación múltiple de Tukey, Pcon frente a 7 dpl < 0,0001, P<7 dpl frente a 14 dpl>= 0,0011).

[0043] Las Fig. 10A-10E ilustran que la expresión de PTPσ se potencia después de EAE y LPC. Fig. 10A: Las imágenes de inmunocitoquímica representativas de PTPσ y Olig2 muestran la expresión de PTPσ en células progenitoras de oligodendrocitos cultivadas in vitro. Fig.10B: Representación gráfica de niveles de ARNm de PTPRD (PTPδ), PTPRS (PTPσ), PTPRF (LAR) y RTN4R (Nogo) específicos de célula obtenidos de una base de datos de transcriptoma de secuenciación de ARN disponible públicamente (web.stanford.edu/group/barres_lab/). FPKM representa fragmentos por kilobase de secuencia de transcripción por millón de fragmentos mapeados. Fig. 10C: Imágenes de inmunohistoquímica representativas de PTPσ, CC1 y MBP muestran expresión de PTPσ en células CC1+ o MBP+ en cultivo de OPC in vitro. Fig.10D: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de la expresión de PTPσ en la médula espinal torácica de ratones con desmielinización inducida por EAE o LPC. Los datos se normalizan a la expresión de la proteína β-actina (n = 4 ratones por grupo. P<con frente a EAE>=0,012, t=3,558, df=6; P<con frente a IPC>= 0,0012, t=5,775, df=6; prueba de la t de Student bilateral). Fig. 10E: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas de PTPσ y Olig2 muestran una expresión aumentada de PTPσ en células Olig2+ en la médula espinal de ratones con EAE en 28 días después de la inducción. Barra de escala = 50 µm. Los datos se presentan como media±sem. *P <0,05, **P <0,01.

[0044] Las Fig.11A y 11B ilustran que ISP aumenta la eliminación de CSPG a medida que se produce la remielinización. Fig. 11A: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas de MBP y Cat301 muestran una abundancia reducida de CSPG después del tratamiento con ISP en cortes de cerebelo desmielinizados con LPC en 8 dpl y 14 dpl. Barra de escala = 100 µm. Fig. 11B: Cuantificación relativa de la intensidad de inmunofluorescencia de Cat301 después del tratamiento con vehículo o ISP en cortes de cerebelo desmielinizados con LPC en 4 dpl, 8dpl y 14dpl (n=9 cortes de 3 réplicas independientes por grupo, ANOVA bidireccional F(2,6)=30,78, prueba de comparación múltiple de Sidak, 8dpl: P<LPC+Veh frente a LPC+ISP><0,0001, 14dpl: P<LPC+Veh frente a LPC+ISP>= 0,0325). ). *P <0,05, *** p < 0,001, n.s.: no significativo.

[0046] Las Fig. 12A-12F ilustran que ISP modula la inflamación en modelos de EAE de ratones. Fig. 12A: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas de Iba1 y GFAP muestran una activación disminuida de microglía y astrocitos respectivamente en la médula espinal de ratones tratados con ISP en el día 41 después de la inducción de EAE. Barra de escala = 100 µm. Fig. 12B: Cuantificación relativa de la intensidad de inmunofluorescencia de Iba1 y GFAP en la médula espinal de ratones tratados con ISP en el día 41 (n= 3 ratones/grupo, Iba1: P=0,0016, t=7,608, df=4; GFAP: P=0,0113, t=4,448, df=4. prueba de la t de Student bilateral). Fig. 12C: Las imágenes de inmunohistoquímica representativas de iNOS (marcador de microglía Ml) y Arginasa-1 (marcador de microglía M2) muestran un aumento de microglía M2 y una disminución de microglía Ml en la médula espinal de ratones tratados con ISP en el día 28. Barra de escala = 100 µm. Fig. 12D: Cuantificación de la inmunofluorescencia relativa de iNOS y Arginasa-1 en la médula espinal de ratones tratados con ISP en el día 41 (n= 3 ratones/grupo, NOS: P=0,0008, t=9,114, df=4; Arginasa-1: P=0,0014, t=7,824, df=4. prueba de la t de Student bilateral). Fig.12E: Las imágenes representativas de tinción con Luxol fast blue no muestran diferencias en el área de desmielinización de los ratones tratados con vehículo o ISP en el día 18. Fig. 12F: La cuantificación del área de desmielinización en la médula espinal de ratones tratados con Vehículo o ISP en el día 18 indica niveles similares de desmielinización en el modelo de EAE (n = 3 ratones/grupo, P=0,8559, t=0,1936, df= 4, prueba de la t de Student bilateral). *P <0,05, *** p < 0,001, n.s.: no significativo.

[0048] Las Fig. 13A-13F ilustran que el ISP promueve el reclutamiento y la supervivencia de OPC en los CSPG. Fig. 13A: Imágenes representativas de inmunotinción de Ki67 que muestran OPC proliferantes (Olig2+) en la médula espinal de ratones tratados con vehículo e ISP en 7dpl. Las flechas blancas muestran células Olig2+/Ki67+. Barra de escala = 100 µm. Fig. 13B: Cuantificación de inmunotinción que muestra células Olig2+/mm2, células Ki67+/mm2 y células Olig2+/Ki67+/mm2 en la médula espinal de ratones tratados con vehículo e ISP en 7dpl. (n=3 ratones/grupo, Olig2: P=0,0012, t=1,6, df=4; Ki67: P=0,0449, t=2,883, df=4; Olig2+/Ki67+: P=0,056, t=2,666, df=4. prueba de la t de Student bilateral). Los datos se presentan como media±sem. Fig.13C: Animales tratados con vehículo o ISP para 7div después de inyecciones de LPC en la médula espinal. Las secciones se tiñeron con Olig2, Ki67 y DAPI B) Cuantificación de Olig2, Ki67 y Olig2 y Ki67 colocalizados en secciones de LPC. C) Las OPC se cultivaron en cubreobjetos recubiertos previamente con agrecano/laminina, tratados con control de vehículo, ISP o SISP 2,5 μM, y se tiñeron con 04 y Ki67. Fig. 13D: Ki67 no cambió significativamente entre los grupos (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,8998, F(2,9) = 0,1068, N=12 imágenes cada una con 4 repeticiones y 3 repeticiones cada una). Fig. 13E: Las OPC se cultivaron en agrecano/laminina y se trataron con control o ISP 2,5 μM durante 2div antes de la incubación con vehículo o LPC (1 μg/ml) durante 2 horas antes de la tinción con DAPI y TUNEL. Fig. 13F: La cuantificación de las células TUNEL+ sobre DAPI+ revela una supervivencia significativa de las OPC tratadas con ISP (N = 40 imágenes, 4 repeticiones) sobre el control (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0021, F(3,36) = 5,96). El tratamiento con ISP mejoró la supervivencia de las células tratadas con LPC. (N(imágenes)=36 control, 28 de cada grupo tratado con LPC). Los gráficos indican representaciones de diagrama de dispersión de la media de cada réplica con medias de error estándar. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001.

[0050] Las Fig. 14A-14G que el ISP mejora el crecimiento y la maduración del proceso de OPC. Fig. 14A: Imágenes de inmunohistoquímica representativas de Olig2 y CC1 en la médula espinal torácica de ratones con EAE tratados con vehículo o ISP en los 41 días después de la inducción. Barra de escala = 50 µm. Fig. 14b: Cuantificación de inmunotinción para células Olig2+/mm2 y células CC1+/mm2 en la médula espinal torácica de ratones con EAE tratados con vehículo o ISP en los 41 días después de la inducción. (n=3 ratones/grupo, Olig2: P=0,0189, t=3,811, df=4; CC1: P=0,0019, t=7,259, df=4. prueba de la t de Student bilateral). Fig. 14c: Imágenes inmunohistoquímicas representativas de DAPI y CC1 en la médula espinal de ratones con LPC tratados con vehículo o ISP en 14 dpl. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. Fig. 14d: Cuantificación de la inmunotinción para la densidad de oligodendrocitos CC1+ normalizada en 14 dpl. (n=3 ratones/grupo, P=0,0044, t=5,789, df=4. prueba de la t de Student bilateral). Fig. 14e: Imágenes inmunohistoquímicas representativas de la maduración de las OPC después de sembrar en placas sobre poli-l-lisina o CSPG en presencia de ISP o vehículo. Barra de escala = 100 µm. Fig. 14f: Cuantificación de la proporción relativa de OL en maduración después de la siembra en placas de las OPC en poli-l-lisina (control) o CSPG en presencia de ISP o vehículo. (N=3 replicas independientes, 04: ANOVA F(2,6)=1,321, P=0,3347; MBP: ANOVA F(2,6)=30,99, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a CSPG Veh>= 0,0005, P<CSPG+Veh frente a CSPG+ISP>= 0,0175). Fig.14g: Comparación del tamaño de las huellas de MBP+ después de la colocación en placas de las OPC en poli-1 lisina (control) o CSPG en presencia de ISP o vehículo en los 6 días. (N=3 replicas independientes, ANOVA F(2,6)=40,96, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<con frente a CSPG Veh>= 0,0003, P<CSPG+Veh frente a CSPGS+ISP>=0,0052). Los datos se presentan como media±sem. *P <0,05, **P<0,01, *** p < 0,001. n.s., no significativo.

[0052] La Fig. 15 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de proteasa. Para comenzar a examinar qué proteasas pueden regularse por incremento mediante el tratamiento con ISP, las OPC cultivadas se trataron con control de vehículo o ISP 2,5 μM durante 4 días in vitro. A continuación, los medios acondicionados se incubaron con matriz de proteasa cualitativa (R & D Systems) y se desarrollaron. A continuación, se calculó el % de cambio en las intensidades de píxel de CM de OPC tratado con ISP frente a control.

[0054] Las Fig.16A-16H ilustran que ISP mejora la degradación de CS56 de una manera dependiente de la dosis. El CM de OPC tratado con ISP es capaz de degradar los puntos de CS56. Fig. 16A: Se incubaron OPC tratadas con control de vehículo, ISP o SISP 2,5 μM durante 2 días in vitro antes de que se recogiera CM y se incubara con puntos de agrecano/laminina. Se incubó un subconjunto adicional de puntos durante la misma duración solo con medios. Los puntos se inmunotiñeron con CS56 o laminina y se registraron las intensidades de píxel del borde de punto. Fig. 16B: Imágenes representativas de puntos teñidos con CS56 con una región amarilla de interés que indica la porción medida del punto. Fig. 16C: La cuantificación del punto inmunoteñido con CS56 indica que el CM de OPC tratado con ISP degrada significativamente los CSPG sobre el control (ANOVA unidireccional, prueba posthoc de Dunnett, P=0,0001, F(5,72) = 45,19). N(imágenes, 5 repeticiones)=69 Control, 104 ISP, 95 ISP, 31 sólo medios) Fig. 16D: Imágenes representativas de puntos teñidos con laminina. Fig. 16E: La cuantificación de los puntos teñidos con laminina no indica cambios significativos entre grupos (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0818, F(3,85) = 2,312), N(imágenes, 5 repeticiones)=133 Control, 134 ISP, 114 SISP, 34 sólo medios) Fig. 16F: Para confirmar la degradación de CS56, las OPC se trataron con dosis variables de ISP o control de vehículo y se incubaron con una concentración fijada de agrecano (20 μg/ml) durante 2 horas antes del análisis de inmunotransferencia tipo Western. Fig.16G: El análisis de inmunotransferencia tipo Western de CS56 y la cuantificación posterior (Fig.16H) de la banda de CS56 indican una degradación significativa de CS56 tratada con ISP sobre el control a dosis de 2,5 y 5 μM (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0049, F(5,12) = 6,112, N= 3 inmunotransferencias tipo Western). Los gráficos indican representaciones de diagramas de dispersión de inmunotransferencias tipo Western o la media de cada réplica con medias de error estándar.

[0056] Las Fig. 17A-17G ilustran que los inhibidores de proteasa atenúan la degradación de CSPG inducida por ISP y la posterior desinhibición de CSPG-OPC. Para evaluar los efectos funcionales de inhibidores de proteasa sobre OPC, las Fig. 17A y 17B ilustran los resultados de un ensayo donde se incubaron puntos inmunoteñidos con CS56 con CM de OPC de control de vehículo, tratado con ISP 2,5 μM o GM600125 μM /- ISP. La inmunorreactividad de CS56 cuantificada revela una degradación significativa de CS56 inducida por ISP sobre el control y GM6001 ISP (One54 Way ANOVA, prueba posthoc de Tukey, P=0,0001, F(3,37) = 21,43, N(imágenes, 3 repeticiones)=24 Control, 17 ISP, 19 GM6001, 20 GM6001+ISP). De manera similar, Las Fig.17C y 17D ilustran puntos de agrecano tratados con control de vehículo, ISP 2,5 μM, o inhibidor de MMP-2100 nM (OA-Hy) /- ISP, revelaron degradación inducida por ISP sobre el control del vehículo e inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) ISP (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,001, F(3, 44) = 31,50). N=24 imágenes cada una). Fig. 17E: Para evaluar si el inhibidor de MMP-2 afectó a la apoptosis, las OPC cultivadas en cubreobjetos recubiertos previamente con agrecano/laminina se trataron con ISP, inhibidor de MMP-2 100 nM (OA-Hy) /- ISP durante 2 días in vitro. Un subconjunto de OPC tratadas se expuso adicionalmente a la incubación con LPC ug/ml durante 2 horas antes de la tinción de TUNEL/DAPI. El inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) no aumentó significativamente las células TUNEL+/células totales. Sin embargo, el inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) incluso con el tratamiento con ISP aumentó la apoptosis después del tratamiento con LPC sobre el tratamiento con LPC-ISP (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0001, F(7,21) = 29,66), N=2 repeticiones, 2 pocillos cada una). Fig.17F: El tratamiento con inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) 100 nM de OPC cultivadas en agrecano/laminina redujo adicionalmente la huella de MBP significativamente sobre el tratamiento con ISP solo (ANOVA unidireccional, P=0,0001, F(3,112)=228,3), N (células, 5 repeticiones en total) = 128 Control, 126 ISP, 191 OA-Hy, 222 OA-Hy+ISP). Los gráficos indican representaciones de diagrama de dispersión de la media de cada réplica con medias de error estándar.

[0057] Las Fig. 18A-17E ilustran que la atenuación de ARNhp de MMP-2 disminuye la maduración y migración de OPC en CSPG para limitar la remielinización en cortes de cerebelo. Fig. 18A: Cultivos de OPC infectados con ARNhp aleatorizado lentiviral de control o partículas lentivirales que expresan construcción de ARNhp dirigida a MMP-2 durante 48 horas antes de la inmunotransferencia tipo Western para evaluar la atenuación de MMP-2 en comparación con GAPDH. Fig.18B y 18C: Las OPC aleatorizadas o infectadas por lentivirus de ARNhp dirigido a MMP-2 cultivadas en laminina y baja concentración de agrecano (1 μg/ml) se inmunotiñeron con MBP después del tratamiento con vehículo o ISP (2,5 μM) durante 48 horas. Se cuantificó el área de MBP. (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,013, F(3, 158) = 6,677, N=100 células de 2 repeticiones). Fig.18D y 18E: Las OPC (04, rojo) se infectaron con construcciones lentivirales 48 horas antes de sembrar en placas en ensayos de puntos para evaluar la migración a través del agrecano (verde) con o sin ISP (2,5 μM). Se contó el número de OPC que cruzan el punto de agrecano (ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Tukey, P=0,0015, F(3, 44) = 6,056. N=40 puntos de 2 repeticiones). Las Fig. 19A-19D ilustran que MMP-2 media la remielinización inducida por ISP en el modelo de ratón desmielinizado con LPC. Fig. 19A: Imágenes representativas de inmunohistoquímica de CS56 y DAPI de las médulas espinales de ratones tratados con vehículo, ISP o inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) muestran una degradación de CS56 mediada por MMP-2 en los 14 días después de la inyección de LPC. Las líneas discontinuas demarcan la sustancia blanca dorsal de la médula espinal. Barra de escala = 100 µm. Fig. 19B: Cuantificación relativa de la intensidad de inmunofluorescencia de CS56 en la médula espinal de ratones tratados con vehículo, ISOP o inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) en 14 dpl (n = 3 ratones/grupo, ANOVA F(3,8)=76,08, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<LPC frente a LPC+ISP>< 0,0001, P<LPC+ISP frente a LPC+ISP+OA-Hy>= 0,0079, P<LPC frente a LPC+OA-Hy>= 0,0026). Fig. 19C: Imágenes representativas de inmunohistoquímica de Olig2 y DAPI de las médulas espinales de ratones tratados con vehículo, ISP o inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) muestran migración de OPC mediada por MMP-2 en los 14 días después de la inyección de LPC. Las líneas discontinuas delimitan las áreas de lesión. Barra de escala = 100 µm. Fig. 19D: Cuantificación del número de células Olig2+ en la médula espinal de ratones tratados con vehículo, ISOP o inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) en 14 dpl (n = 3 ratones/grupo, ANOVA F(3,8)=21,58, prueba de comparación múltiple de Tukey, P<LPC frente a LPC+ISP>= 0,0074, P<LPC+ISP frente a LPC+ISP+OA-Hy>= 0,0088, P<LPC frente a LPC+OA-Hy>=0,0385).

[0058] Descripción detallada

[0059] A menos que se defina otra cosa, los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tendrán los significados que entienden normalmente los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán el plural y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química de proteínas y oligo o polinucleótidos y de hibridación descritas en el presente documento son las ya conocidas y usadas comúnmente en la técnica.

[0060] Por conveniencia, algunos términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen aquí. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta solicitud.

[0061] En el presente documento, los artículos "un", "uno y "una" se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

[0062] Los términos "comprender", "que comprende/n", "incluir", "que incluye/n", "tener", y "que tiene/n" se usan en el sentido inclusivo, abierto, lo que significa que pueden incluirse elementos adicionales. Los términos "tal como", "p. ej.", como se usan en el presente documento no son limitativos y son solo para fines ilustrativos. "Que incluye" y "que incluye pero sin limitaciones" se utilizan de manera indistinta.

[0063] El término "o" como se usa en el presente documento debe entenderse que significa "y/o", a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

[0064] Como se usa en el presente documento, la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como un 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una realización, la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ± 15 %, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 % o ± 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

[0065] Como se usa en el presente documento, "uno o más de a, b y c" significa a, b, c, ab, ac, bc o abc. El uso de "o" en el presente documento es el inclusivo o.

[0066] El término "administrar" a un paciente incluye dispensar, administrar o aplicar un compuesto activo en una formulación farmacéutica a un sujeto por cualquier vía adecuada para la administración del compuesto activo a la ubicación deseada en el sujeto (por ejemplo, para así entrar en contacto con una célula deseada tal como una neurona deseada), incluyendo la administración en el líquido cefalorraquídeo o a través de la barrera hematoencefálica, la administración por vía parenteral u oral, inyección intramuscular, inyección subcutánea o intradérmica, inyección intravenosa, administración bucal, administración transdérmica y administración por vía rectal, de colon, vaginal, vía intranasal o del tracto respiratorio. Los agentes pueden, por ejemplo, administrarse a un sujeto en coma, anestesiado o paralizado mediante una inyección intravenosa o puede administrarse por vía intravenosa a un sujeto embarazado para estimular el crecimiento axonal en un feto. Las rutas específicas de administración pueden incluir la aplicación tópica (tal como gotas para los ojos, cremas o formulaciones erosionables para colocarse debajo del párpado, inyección intraocular en el humor acuoso o vítreo, inyección en las capas externas del ojo, tal como mediante inyección subconjuntival o inyección subtenoniana, administración parenteral o por vía oral.

[0067] El término "anticuerpo", incluye mAbs humanos y animales, y preparaciones de anticuerpos policlonales, anticuerpos sintéticos, incluyendo anticuerpos recombinantes (antisueros), anticuerpos quiméricos, que incluye anticuerpos humanizados, anticuerpos anti-idiopáticos y derivados de los mismos. Una porción o fragmento de un anticuerpo se refiere a una región de un anticuerpo que retiene al menos parte de su capacidad (especificidad y afinidad de unión) para unirse a un epítopo especificado. El término "epítopo"·o "determinante antigénico" se refiere a un lugar sobre un antígeno al que se el parátopo del anticuerpo. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, al menos 5 u 8 a 10, o aproximadamente 13 a 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional.

[0068] Los términos "proteína quimérica" o "proteína de fusión" se refieren a una fusión de una primera secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido con una segunda secuencia de aminoácidos que define un dominio (por ejemplo, porción polipeptídica) extraña y no sustancialmente homóloga con el dominio del primer polipéptido. Una proteína quimérica puede presentar un dominio extraño, que se encuentra (aunque en una proteína diferente) en un organismo, que también expresa la primera proteína, o puede ser una fusión "interespecie", "intergénica", etc. de estructuras proteicas expresadas por diferentes tipos de organismos.

[0069] Una "cantidad eficaz" de un agente o péptido terapéutico es una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico o farmacológico deseado, tal como una cantidad que sea capaz de activar el crecimiento de las neuronas. Una cantidad eficaz de un agente como se define en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad y el peso del sujeto y la capacidad del agente para desencadenar una respuesta deseada en el sujeto. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del compuesto activo se ve superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

[0070] El término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual el ácido nucleico se traduce en péptidos o se transcribe en ARN, que, por ejemplo, se puede traducir en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona una célula hospedadora u organismo eucariota apropiado, incluir el empalme del ARNm. Para ácido nucleico heterólogo que va a expresarse en una célula hospedadora, inicialmente debe administrarse en la célula y luego, una vez en la célula, debe residir finalmente en el núcleo.

[0071] El término "terapia genética" y variantes gramaticales del mismo (por ejemplo, "terapia génica"), implica la transferencia de ADN heterólogo a células de un mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afecciones para las que se busca terapia o diagnóstico. El ADN se introduce en las células diana seleccionadas de tal manera que se expresa el ADN heterólogo y se produce de este modo un producto terapéutico codificado. Como alternativa, el ADN heterólogo puede mediar de alguna manera la expresión de ADN que codifica el producto terapéutico; puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de alguna manera media, directa o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. La terapia genética también se puede usar para administrar ácido nucleico que codifica un producto génico para reemplazar un gen defectuoso o complementar un producto génico producido por el mamífero o la célula en la que se introduce. El ADN heterólogo que codifica el producto terapéutico puede modificarse antes de la introducción en las células del hospedador afectado para potenciar o alterar de otro modo el producto o la expresión del mismo.

[0072] El término "gen" o "gen recombinante" se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido, incluyendo secuencias tanto de exón como (opcionalmente) de intrón.

[0073] La expresión "secuencia de ácido nucleico heteróloga" es normalmente ADN que codifica ARN y proteínas que normalmente no se producen in vivo por la célula en la que se expresa o que media o codifica mediadores que alteran la expresión de ADN endógeno al afectar la transcripción, traducción u otros procesos bioquímicos regulables. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga también puede denominarse ADN extraño. Cualquier ADN que un experto en la materia reconocería o consideraría como heterólogo o extraño a la célula en la que se expresa está englobado en el presente documento por ADN heterólogo. Los ejemplos de ADN heterólogo incluyen, pero sin limitación, ADN que codifica proteínas marcadoras trazables, tal como una proteína que confiere resistencia a fármacos, ADN que codifica sustancias terapéuticamente eficaces, tales como agentes antineoplásicos, enzimas y hormonas, y ADN que codifica otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los anticuerpos que están codificados por ADN heterólogo pueden secretarse o expresarse en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ADN heterólogo.

[0074] Los términos "homología" e "identidad" se utilizan como sinónimos a lo largo del texto y se refieren a la similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede determinarse mediante la comparación de una posición en cada secuencia, que puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son homólogas o idénticas en esa posición. El grado de homología o identidad entre secuencias depende del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias.

[0075] El término "células progenitoras de oligodendrocitos" u "OPC" como se usa en el presente documento se refiere a una célula progenitora neural capaz de generar nuevas células de oligodendrocitos. Las OPC pueden identificarse mediante la expresión de varios antígenos de superficie. Por ejemplo, los antígenos de superficie conocidos como subunidad del receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα), proteoglicano de sulfato de condroitina NG2 y gangliósido GD3, se usan habitualmente para identificar OPC.

[0076] Las OPC inmaduras se generan en áreas ventrales del cerebro en desarrollo a partir de un progenitor glial común. Las células inmaduras migran activamente, proliferan y pueblan el sistema nervioso central (SNC) para finalmente diferenciarse en oligodendrocitos premielinizantes (O4+). La diferenciación y maduración de OPC se caracteriza por una extensión de múltiples procesos, aumento en el tamaño del cuerpo celular y formación de mielina.

[0077] Las expresiones "administración parenteral" y "administrado/a por vía parenteral", como se usan en el presente documento, se refieren a modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, por lo general mediante inyección e infusión, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.

[0078] Las expresiones "administración sistémica", "administrado/a por vía sistémica", "administración periférica" y "administrado/a por vía periférica", tal como se usa en el presente documento, significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material distinto de directamente en un tejido diana, de manera que entra en el sistema del animal y, por tanto, se somete al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea. El término "paciente" o "sujeto" o "animal" u "hospedador" se refiere a cualquier mamífero. El sujeto puede ser un ser humano, pero también puede ser un mamífero que necesite tratamiento veterinario, por ejemplo, animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, aves de corral, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).

[0079] La expresión "neuronas del sistema nervioso periférico (SNP)" incluye las neuronas que residen o se extienden fuera del SNC. El SNP pretende incluir las neuronas comúnmente entendidas como clasificadas en el sistema nervioso periférico, incluyendo neuronas sensoriales y neuronas motoras.

[0080] Las expresiones "secuencia de polinucléotidos" y "secuencia de nucleótidos" se usan indistintamente en el presente documento.

[0081] El término "péptido" o "polipéptido" como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a compuestos que consisten en aproximadamente 2 a aproximadamente 90 residuos de aminoácidos, ambos inclusive, en donde el grupo amino de un aminoácido está ligado al grupo carboxilo de otro aminoácido mediante un enlace peptídico. Un péptido, por ejemplo, puede derivarse o retirarse de una proteína nativa por escisión enzimática o química, o puede prepararse usando técnicas convencionales de síntesis de péptidos (p. ej., síntesis en fase sólida) o técnicas de biología molecular (véase Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989)). Un "péptido" puede comprender cualquier L- y/o D-aminoácido adecuado, por ejemplo, a-aminoácidos comunes (por ejemplo, alanina, glicina, valina), no a-aminoácidos (por ejemplo, P-alanina, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, sarcosina, estatina) y aminoácidos inusuales (por ejemplo, citrulina, homocitrulina, homoserina, norleucina, norvalina, ornitina). Los grupos amino, carboxilo y/u otros grupos funcionales en un péptido pueden estar libres (por ejemplo, sin modificar) o protegidos con un grupo protector adecuado. En la técnica se conocen grupos protectores adecuados para grupos amino y carboxilo, y medios para añadir o eliminar grupos protectores. Véase, por ejemplo, Green & Wuts, PROTECTING GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (John Wiley & Sons, 1991). Los grupos funcionales de un péptido también se pueden derivatizar (por ejemplo, alquilarse) usando métodos conocidos en la técnica.

[0082] Los péptidos se pueden sintetizar y ensamblar en bibliotecas que comprenden unas pocas especies moleculares discretas de más. Tales bibliotecas pueden prepararse usando métodos bien conocidos de química combinatoria, y pueden examinarse como se describe en el presente documento o usando otros métodos adecuados para determinar si la biblioteca comprende péptidos que pueden antagonizar la interacción CSPG-PTPσ. Dichos antagonistas peptídicos pueden aislarse a continuación por medios adecuados.

[0083] El término "peptidomimético", se refiere a una molécula similar a proteína para mimetizar un péptido. Los peptidomiméticos surgen normalmente de la modificación de un péptido existente o por diseño de sistemas similares que mimetizan péptidos, tales como peptoides y β-péptidos. Independientemente del enfoque, la estructura química alterada está diseñada para ajustar ventajosamente las propiedades moleculares tales como la estabilidad o la actividad biológica. Estas modificaciones implican cambios en el péptido que no se producen de forma natural (tales como esqueletos alterados y la incorporación de aminoácidos no naturales).

[0084] Los términos "prevenir" o "que previene" se refieren a reducir la frecuencia o gravedad de una enfermedad o afección. El término no requiere una exclusión absoluta de la enfermedad o afección. Más bien, este término incluye disminuir la posibilidad de aparición de enfermedades. Por ejemplo, se divulgan, pero no se reivindican, métodos para reducir la aparición y/o gravedad de una lesión por avulsión radicular en un sujeto, que comprende administrar a la lesión por avulsión radicular del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un agente terapéutico.

[0085] Una secuencia de polinucleótidos (ADN, ARN) está "unida operativamente" a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótidos. La expresión "unido operativamente" incluye tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) delante de la secuencia de polinucleótidos que ha de expresarse y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótidos bajo el control de la secuencia de control de la expresión y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótidos.

[0086] El término "recombinante", como se usa en el presente documento, significa que una proteína se deriva de un sistema de expresión procariota o eucariota.

[0087] La expresión "terapéuticamente eficaz" significa que la cantidad de la composición que se usa es de una cantidad suficiente para mejorar una o más causas, síntomas o secuelas de una enfermedad o trastorno. Dicha mejora solo requiere una reducción o alteración, no necesariamente la eliminación, de las causas, síntomas o secuelas de una enfermedad o trastorno.

[0088] La expresión "promotor específico de tejido" significa una secuencia de ácido nucleico que sirve como promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada operativamente unida al promotor, y que afecta a la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionada en células específicas de un tejido, tal como células de células epiteliales. El término también cubre los llamado promotores "con fugas", que regulan la expresión de un ácido nucleico seleccionado principalmente en un tejido, pero causan expresión en otros tejidos también. El término "transfección" se usa para referirse a la captación de ADN extraño por una célula. Una célula se ha "transfectado" cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana celular. Se conocen generalmente en la técnica numerosas técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al., Virology 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Chu et al., Gene 13:197 (1981). Se pueden usar dichas técnicas para introducir uno o más restos de ADN exógenos, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácidos nucleicos, en células hospedadoras adecuadas. El término captura procedimientos de transfección química, eléctrica y mediada por virus.

[0089] La expresión "secuencia reguladora de la transcripción" es una expresión genérica usada en la memoria descriptiva para referirse a secuencias de ácido nucleico, tales como señales de iniciación, potenciadores y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias codificantes de proteínas con las que están unidas operativamente. En algunos ejemplos, la transcripción de un gen recombinante está bajo el control de una secuencia promotora (u otra secuencia reguladora transcripcional), que controla la expresión del gen recombinante en un tipo de célula en el que se pretende la expresión. También se entenderá que el gen recombinante puede estar bajo el control de secuencias reguladoras transcripcionales que son las mismas o que son diferentes de esas secuencias, que controlan la transcripción de la forma natural de una proteína.

[0090] El término "tratamiento" se refiere al manejo médico de un paciente con la intención de curar, mejorar, estabilizar, o prevenir una enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, tratamiento dirigido específicamente hacia la mejora de una enfermedad, afección patológica, o trastorno, y también incluye a tratamiento causal, es decir, tratamiento dirigido hacia la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, tratamiento designado para el alivio de los síntomas más que para la cura de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado; tratamiento preventivo, es decir, tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado; y tratamiento de soporte, es decir, tratamiento que se emplea para complementar otra terapia específica que está dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado.

[0091] El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Los vectores preferidos son aquellos capaces de uno o más de, la replicación autónoma y/o la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente se denominan, en el presente documento,"vectores de expresión".

[0092] La expresión "tipo natural" (o "WT") se refiere a la secuencia polinucleotídica de origen natural, que codifica una proteína, o una porción de la misma, o secuencia de proteína, o porción de la misma, respectivamente, como normalmente existe in vivo. Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando proceda, el ácido ribonucleico (ARN). También debe entenderse que la expresión incluye, como equivalentes, análogos de ARN o ADN elaborados a partir de análogos de nucleótidos, y, según sea aplicable a la realización que se está describiendo, polinucleótidos monocatenarios (tal como de sentido o antisentido) y bicatenarios.

[0093] Los agentes para uso descritos en el presente documento se consideran purificados y/o aislados antes de su uso. Los materiales purificados son normalmente "sustancialmente puros", lo que significa que un ácido nucleico, polipéptido o fragmento del mismo, u otra molécula se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Normalmente, el polipéptido es sustancialmente puro cuando está al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso un 99 %, en peso, libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas con las que se asocia naturalmente. Por ejemplo, se puede obtener un polipéptido sustancialmente puro mediante extracción a partir de una fuente natural, por expresión de un ácido nucleico recombinante en una célula que normalmente no expresa esa proteína, o por síntesis química. Los "materiales aislados" se han eliminado de su ubicación y entorno naturales. En el caso de un dominio o fragmento de proteína aislado o purificado, el dominio o fragmento está sustancialmente libre de secuencias de aminoácidos que flanquean la proteína en la secuencia natural. La expresión "ADN aislado" significa que el ADN se ha liberado sustancialmente de los genes que flanquean el ADN dado en el genoma natural. Por tanto, la expresión "ADN aislado" abarca, por ejemplo, ADNc, ADN genómico y ADN sintético.

[0094] Los términos "porción", "fragmento", "variante", "derivado" y "analógico", cuando se hace referencia a un polipéptido incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos alguna actividad biológica a la que se hace referencia en el presente documento (por ejemplo, inhibición de una interacción tal como la unión). Los polipéptidos como se describen en el presente documento pueden incluir una porción, fragmento, variante o moléculas derivadas sin limitación, siempre que el polipéptido siga cumpliendo su función. Los polipéptidos o porciones de los mismos de la presente invención pueden incluir fragmentos proteolíticos, fragmentos de deleción y, en particular, o fragmentos que alcanzan más fácilmente el sitio de acción cuando se administran a un animal.

[0095] Las realizaciones descritas en el presente documento generalmente se refieren a agentes para su uso en métodos para inducir, promover y/o modular la migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) en sujetos que tienen o están en riesgo de un trastorno relacionado con la mielina.

[0096] Encontramos que ciertos tipos de proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) liberados en la matriz extracelular durante la formación de cicatrización glial en respuesta a una lesión del sistema nervioso central (SNC) pueden reducir la generación de mielina a través de la unión con la proteína receptora afín tirosina fosfatasa σ (PTPσ) en las OPC. En una variedad de modelos in vitro, in situ y in vivo de esclerosis múltiple (EM), la deposición de proteoglicanos durante la formación de cicatriz asociada a la lesión inhibió potencialmente la migración, diferenciación de OPC y la reformación de la mielina. Se encontró que un tratamiento de péptido sistémico que inhibía la actividad catalítica, señalización y/o función de PTPσ mejoró notablemente la tasa de remielinización en lesiones inducidas por LPS y estimularon la regeneración robusta de mielina y la recuperación funcional después de la desmielinización crónica. Además, la inhibición de la actividad catalítica, la señalización y/o la función de PTPσ pueden mejorar la regulación por incremento de la proteasa MMP-2 secretada por las OPC que, a su vez, permite una digestión robusta de CSPG que puede detener o ralentizar la progresión de la EM.

[0097] En consecuencia, un agente terapéutico que suprime, inhibe y/o bloquea una o más de la actividad catalítica, la señalización y/o la función de PTPσ es para su uso en un método que puede implicar la administración a un sujeto que tiene o está en riesgo de un trastorno relacionado con la mielina para inducir, promover y/o modular la migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de las OPC.

[0098] La actividad, la señalización y/o la función de PTPσ pueden suprimirse, inhibirse y/o bloquearse de varias maneras, incluyendo: inhibición directa de la actividad del dominio intracelular del PTPσ (por ejemplo, mediante el uso de moléculas pequeñas, peptidomiméticos, anticuerpos, intracuerpos o polipéptidos negativos dominantes); activación de genes y/o proteínas que inhiben uno o más de, la actividad, señalización y/o función del dominio intracelular de PTPσ (por ejemplo, aumentando la expresión o actividad de los genes y/o proteínas); inhibición de genes y/o proteínas que son mediadores posteriores del PTPσ (por ejemplo, bloqueando la expresión y/o actividad de los genes y/o proteínas mediadores); introducción de genes y/o proteínas que regulan negativamente uno o más de, actividad, señalización y/o función de PTPσ (por ejemplo, mediante el uso de vectores de expresión génica recombinantes, vectores virales recombinantes o polipéptidos recombinantes); o reemplazo de genes con, por ejemplo, un mutante hipomórfico de PTPσ (por ejemplo, por recombinación homóloga, sobreexpresión usando expresión génica recombinante o vectores virales, o mutagénesis).

[0099] El agente terapéutico que inhibe o reduce una o más de la actividad, señalización y/o función de PTPσ puede incluir un agente que disminuye y/o suprime la actividad, señalización y/o función de PTPσ. Dichos agentes pueden administrarse intracelularmente y, una vez administrados intracelularmente, promover la migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de OPC y potenciar la mielinización o remielinización.

[0100] El agente terapéutico que inhibe o reduce una o más de la actividad, señalización y/o función de PTPσ, incluye un péptido terapéutico que se une y/o forma complejos con el dominio intracelular de PTPσ, en particular, el dominio intracelular en forma de cuña, para inhibir la actividad, señalización y/o función de PTPσ. En consecuencia, los péptidos terapéuticos que se unen a y/o forman complejos con el dominio intracelular de PTPσ de OL y/u OPC (OL/OPC) pueden usarse para promover el crecimiento celular, la motilidad, la supervivencia y/o las plasticidad de estas células.

[0101] El agente terapéutico es un péptido mimético del dominio en forma de cuña (es decir, dominio de cuña) del dominio catalítico intracelular de PTPσ, tal y como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2013/155103A1. Péptidos miméticos del dominio de cuña del PTPσ cuando se expresan en células (por ejemplo, OL/OPC) o conjugados a un resto de transporte intracelular pueden unirse al dominio de cuña y usarse para abolir la señalización de PTPσ en OL/OPC activadas con CSPG para promover el crecimiento celular, la motilidad y supervivencia. La unión de estos péptidos terapéuticos al dominio de cuña intacto de PTPσ puede potencialmente: (i) interferir con la capacidad de PTPσ para interactuar con proteínas diana, tales como dianas de fosfatasa; (ii) interferir con la actividad que promueve interacciones intermoleculares entre PTPσ y otro dominio contenido en PTPσ, tal como el segundo dominio de fosfatasa catalíticamente inactivo D2; (iii) evitar el acceso de proteínas al sitio de fosfatasa activa; (iv) superar a los interaccionadores normales del dominio de cuña; y/o (v) inhibir estéricamente la actividad fosfatasa.

[0102] El péptido mimético (es decir, péptido terapéutico) tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 65 % de identidad con la secuencia de aminoácidos 15 de SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33, puede incluir, consistir esencialmente y/o consistir en de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos y tener una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o aproximadamente un 100 % homóloga o idéntica a una porción de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos del dominio de cuña de PTPσ. En algunas realizaciones, la porción de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos incluye aminoácidos consecutivos de hélice alfa N-terminal y giro de 4 aminoácidos del dominio de cuña.

[0103] Un péptido (por ejemplo, péptido terapéutico) correspondiente o sustancialmente homólogo al dominio de cuña de PTPσ con un portador citosólico fue capaz de aliviar la inhibición mediada por CSPG, mejorar la tasa de remielinización en lesiones inducidas por LPS, estimular la regeneración robusta de mielina y la recuperación funcional después de la desmielinización crónica, y mejorar la regulación por incremento de la proteasa MMP-2 secretada por las OPC que, a su vez, permite una digestión robusta de los CSPG. Este péptido se puede administrar sistémicamente a un sujeto para promover la mielinización o remielinización.

[0104] Como se muestra en la Tabla 1, la secuencia de dominio de cuña de PTPσ está altamente conservada entre los mamíferos superiores, con solo un único cambio de aminoácido en seres humanos a ratón y ratas (treonina a metionina en la posición 6) evitando el 100 % de homología.

[0106] TABLA 1

[0108]

[0109] continuación

[0111]

[0113] Como se muestra en la Tabla 1, la primera hélice alfa del dominio de cuña de PTPσ incluye los aminoácidos 1-10, la región de giro incluye los aminoácidos 11-14, y la segunda hélice alfa incluye los aminoácidos 15-24. Por ejemplo, la primera hélice alfa del dominio de cuña de PTPσ humano tiene la secuencia de aminoácidos de DMAEHTERLK (SEQ ID NO: 29), el giro tiene la secuencia de aminoácidos de ANDS (SEQ ID NO: 30), y la segunda hélice alfa tiene la secuencia de aminoácidos de LKLSQEYESI (SEQ ID NO: 31).

[0114] El dominio de cuña también comparte homología de secuencia con los otros miembros de la familia LAR, LAR y PTPσ. Es probable que estos aminoácidos sean necesarios para la estructura general del dominio de cuña. Los aminoácidos conservados incluyen una alanina en la posición 13, que marca el final de la primera hélice alfa y el inicio del giro, por lo que es probable que sea necesario para el tamaño y la estructura generales de la cuña.

[0115] Dado que las estructuras secundarias y terciarias generales del dominio de cuña permanecen consistentes a través de la mayoría de los PTP de receptor, se pueden realizar varias sustituciones conservadoras en un péptido terapéutico dirigido al dominio de cuña de PTPσ para obtener resultados similares. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo), tales como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.

[0116] Estas sustituciones conservadoras pueden ocurrir en los dominios no únicos en la hélice alfa o en el giro, específicamente las posiciones 1-3 y 7-10 en la primera hélice alfa; 12 y 13 en el giro; y 15, 16, 18-24 en la segunda hélice alfa. Estos aminoácidos pueden ser necesarios para la estructura general del dominio de cuña, pero no es necesario para la especificidad de la unión de la cuña a PTPσ.

[0117] Los aminoácidos únicos para PTPσ, particularmente los aminoácidos expresados diferencialmente en PTPσ frente a LAR, se encontró que eran necesarios para la especificidad de la unión al dominio de cuña. Estos incluyen un dominio EH en la primera posición de hélice alfa 4 y 5 seguido de una treonina o una metionina (sustitución de rata y ratón) en la posición 6. A su vez, hay una serina única en la posición 14 en todos los mamíferos superiores. Finalmente, hay una leucina única en la posición 17 en la segunda hélice alfa. Las funciones potenciales de estos aminoácidos únicos se analizarán a continuación.

[0118] El residuo de serina en el giro en la posición 14 es de particular interés debido a su ubicación en el dominio de cuña. Este aminoácido, ubicado en el giro entre hélices alfa, se extiende ligeramente desde la estructura secundaria y terciaria general de PTPσ, haciéndolo disponible para interacciones de unión. Además, serina, debido a su grupo hidroxilo y la polaridad que contiene, se sabe que facilita varios eventos de unión homófilos y heterófilos, tal como la unión de hidrógeno entre serinas adyacentes. También se sabe que las serinas experimentan diversas modificaciones, tal como fosforilación, haciendo que la probabilidad de su necesidad de especificidad sea alta. Es posible que los péptidos más pequeños que se centran en el giro en el dominio de cuña e incluyen la serina conservada puedan ofrecer una mayor estabilidad con una función similar. Dichos péptidos se pueden sintetizar como bucles, con cisteínas en cada extremo para crear enlaces disulfuro.

[0119] Los aminoácidos únicos en la primera hélice alfa incluyen ácido glutámico en la posición 4, histidina en la posición 5 y treonina o metionina en la posición 6. Aunque la histidina está implicada en el dominio de cuña de consenso, no se encuentra en LAR, PTPσ, PTPμ o CD45. Como estos tres aminoácidos están cargados o son polares, es probable que esta secuencia o uno de sus componentes sea necesario para la especificidad de cuña de PTPσ.

[0120] Adicionalmente, la segunda hélice alfa contiene una leucina única en la posición 17. Las leucinas se han implicado como las moléculas adhesivas críticas para la estructura tridimensional de las cremalleras de leucina. En estas moléculas, que son estructuralmente similares a los dominios de cuña, las leucinas de hélices alfa opuestas, ubicadas a aproximadamente 7 intervalos, interactúan con regiones hidrófobas de la hélice alfa opuesta. Como también hay una leucina en la primera hélice alfa, ubicada en la posición 9, se cree que esta leucina única es necesaria para la integridad estructural tridimensional general de la cuña de PTPσ.

[0121] En consecuencia, en algunas realizaciones, el péptido terapéutico puede incluir, consistir esencialmente en, o consistir en aproximadamente 14 a aproximadamente 20 aminoácidos e incluir la secuencia de aminoácidos EHX<1>ERLKANDSLKL (SEQ ID NO: 32), en donde X<1>es T o M. Un péptido terapéutico que incluye SEQ ID NO: 32 puede incluir al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco sustituciones conservadoras de modo que el péptido terapéutico tenga una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % homóloga a SEQ ID NO: 32.

[0122] En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras pueden ser de residuos de aminoácido 4E, 5R, 6L, 7K, 9N, 10D, 12L o 13K de SEQ ID NO: 32. A modo de ejemplo, el residuo de aminoácido 4E puede sustituirse por D o Q, el residuo de aminoácido 5R puede sustituirse por H, L o K, el residuo de aminoácido 6L puede sustituirse por I, V o M, el residuo de aminoácido 7K puede sustituirse por R o H, el residuo de aminoácido 9N puede sustituirse por E o D, el resto de aminoácido 10 D puede sustituirse por E o N, el residuo de aminoácido 12L puede sustituirse por I, V o M, y/o el residuo de aminoácido 13K puede sustituirse por R o H.

[0123] En otras realizaciones, el péptido terapéutico puede incluir, consistir esencialmente en, o consistir en aproximadamente 14 a aproximadamente 20 aminoácidos e incluir la secuencia de aminoácidos DMAEHX<1>RLKANDS (SEQ ID NO: 33), en donde X<1>es T o M. Un péptido terapéutico que incluye SEQ ID NO: 33 puede incluir al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco sustituciones conservadoras de modo que el péptido terapéutico tenga una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % homóloga a SEQ ID NO: 33.

[0124] En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras pueden ser de residuos de aminoácido 7E, 8R, 9L, 10K, 12N o 13D de SEQ ID NO: 33. A modo de ejemplo, el residuo de aminoácido 7E puede sustituirse por D o Q, el residuo de aminoácido 8R puede sustituirse por H, L o K, el residuo de aminoácido 9L puede sustituirse por I, V o M, el residuo de aminoácido 10K puede sustituirse por R o H, el residuo de aminoácido 12N puede sustituirse por E o D, y el residuo de aminoácido 13 D puede sustituirse por E o N.

[0125] Los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento pueden estar sujetos a otros diversos cambios, sustituciones, inserciones y deleciones donde tales cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. En este sentido, los péptidos terapéuticos que se unen a y/o forman complejos con un dominio de cuña de PTPσ pueden corresponder a o ser sustancialmente homólogos con, en lugar de ser idéntico a, la secuencia de un polipéptido mencionado donde se realizan uno o más cambios y conserva la capacidad de inhibir o reducir una o más de la actividad, señalización y/o función de la función PTPσ.

[0126] El polipéptido terapéutico puede estar en cualquiera de una variedad de formas de derivados polipeptídicos que incluyen amidas, conjugados con proteínas, polipéptidos ciclados, polipéptidos polimerizados, análogos, fragmentos, polipéptidos modificados químicamente y derivados similares.

[0127] Se apreciará que la sustitución conservadora también puede incluir el uso de un residuo derivatizado químicamente en lugar de un residuo no derivatizado siempre que tal péptido muestre la actividad de unión requerida.

[0128] "Derivado químico" se refiere a un péptido objeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados mediante la reacción de un grupo lateral funcional. Dichas moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moléculas en las que los grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo o de O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. También se incluyen como derivados químicos aquellos polipéptidos, que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede ser sustituida con serina; y la ornitina puede ser sustituida con lisina. Los polipéptidos descritos en el presente documento también pueden incluir cualquier polipéptido que tenga una o más adiciones y/o deleciones o residuos en relación con la secuencia de un polipéptido cuya secuencia se muestra en el presente documento, siempre que se mantenga la actividad requerida.

[0129] Uno o más de los péptidos de los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento también pueden modificarse mediante procesos naturales, tal como procesamiento postraduccional y/o mediante técnicas de modificación química, que se conocen en la técnica. Pueden producirse modificaciones en el péptido, incluida la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxi. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un péptido dado. Las modificaciones comprenden, por ejemplo, sin limitación, acetilación, acilación, adición del grupo acetomidometilo (Acm), ADP-ribosilación, amidación, unión covalente a flavina, unión covalente a un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, γ-carboxilación, glucosilación, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación (por referencia véase, Protein-structure and molecular properties, 2.ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva - York, 1993).

[0130] Los péptidos y/o proteínas descritos en el presente documento también pueden incluir, por ejemplo, mutantes biológicamente activos, variantes, fragmentos, quimeras y análogos; los fragmentos abarcan secuencias de aminoácidos que tienen truncamientos de uno o más aminoácidos, en donde el truncamiento puede originarse desde el extremo amino (extremo N), extremo carboxi (extremo C), o desde el interior de la proteína. Los análogos de la invención implican una inserción o una sustitución de uno o más aminoácidos. Las variantes, mutantes, fragmentos, quimeras y análogos pueden funcionar como inhibidores de las fosfatasas de la familia LAR (sin limitarse a los presentes ejemplos).

[0131] Los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento se pueden preparar mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. Los péptidos y/o proteínas pueden prepararse usando ADN recombinante. Por ejemplo, una preparación puede incluir cultivar una célula hospedadora (bacteriana o eucariota) en condiciones, que proporcionan la expresión de péptidos y/o proteínas dentro de la célula.

[0132] La purificación de los polipéptidos puede realizarse mediante métodos de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, hidrofobicidad u otra técnica de purificación normalmente usada para la purificación de proteínas. La etapa de purificación puede realizarse en condiciones no desnaturalizantes. Por otro lado, si se requiere una etapa de desnaturalización, la proteína puede renaturalizarse utilizando técnicas conocidas en la técnica.

[0133] En algunas realizaciones, los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento pueden incluir residuos adicionales que pueden añadirse en cualquiera de los extremos de un polipéptido con el fin de proporcionar un "enlazador" mediante el cual los polipéptidos pueden unirse y/o fijarse convenientemente a otros polipéptidos, proteínas, restos detectables, etiquetas, matrices sólidas o portadores.

[0134] Los enlazadores de residuos de aminoácidos suelen ser al menos un residuo y pueden tener 40 o más residuos, más a menudo de 1 a 10 residuos. Los residuos de aminoácidos típicos usados para la unión son glicina, tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico y ácido aspártico o similares. Además, un polipéptido objeto puede diferir por la secuencia que se modifica por acilación de NH<2>terminal, por ejemplo, acetilación o amidación del ácido tioglicólico, por carboxilamidación terminal, por ejemplo, con amoníaco, metilamina y modificaciones terminales similares. Las modificaciones terminales son útiles, como es bien sabido, para reducir la susceptibilidad por digestión con proteinasa y, por lo tanto, servir para prolongar la vida media de los polipéptidos en soluciones, particularmente fluidos biológicos donde pueden estar presentes proteasas. En este sentido, la ciclación de polipéptidos también es una modificación terminal útil, y también se prefiere particularmente debido a las estructuras estables formadas por la ciclación y en vista de las actividades biológicas observadas para tales péptidos cíclicos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el enlazador puede ser un enlazador peptídico flexible que une el péptido terapéutico a otros polipéptidos, proteínas y/o moléculas, tales como restos detectables, etiquetas, matrices sólidas o portadores. Un enlazador peptídico flexible puede tener una longitud de aproximadamente 20 o menos aminoácidos. Por ejemplo, un enlazador peptídico puede contener aproximadamente 12 o menos residuos de aminoácidos, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12. En algunos casos, un enlazador peptídico comprende dos o más de los siguientes aminoácidos: glicina, serina, alanina y treonina.

[0135] En algunas realizaciones, un agente terapéutico que comprende los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento se puede proporcionar en forma de una proteína conjugada o una construcción de administración de fármacos que incluye al menos un subdominio(s) o resto(s) de transporte (es decir, restos de transporte) que está(n) unido(s) al péptido terapéutico. Los restos de transporte pueden facilitar la absorción de los polipéptidos terapéuticos en un mamífero (es decir, ser humano o animal) tejido o célula (por ejemplo, célula neural). Los restos de transporte pueden unirse covalentemente a los polipéptidos terapéuticos. El enlace covalente puede incluir un enlace peptídico o un enlace lábil (por ejemplo, un enlace fácilmente escindible o sujeto a cambios químicos en el entorno interior de la célula objetivo). Adicionalmente, los restos de transporte pueden reticularse (por ejemplo, reticularse químicamente, reticularse por UV) al polipéptido terapéutico. Los restos de transporte también pueden unirse al polipéptido terapéutico con el polipéptido de unión descrito en el presente documento.

[0136] Los restos de transporte pueden repetirse más de una vez en el agente terapéutico. La repetición de un resto de transporte puede afectar (por ejemplo, aumentar) la captación de los péptidos y/o proteínas por una célula deseada. El resto de transporte también puede ubicarse en la región amino-terminal del péptido terapéutico o en su región carboxi-terminal o en ambas regiones.

[0137] En una realización, el resto de transporte puede incluir al menos una secuencia de péptido de transporte que permite que el polipéptido terapéutico, una vez unido al resto de transporte, penetre en la célula mediante un mecanismo independiente del receptor. En un ejemplo, el péptido de transporte es un péptido sintético que contiene una secuencia de administración de proteína mediada por Tat y al menos una de SEQ ID NO: 1-25, 32 y 33. Estos péptidos pueden tener, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34-60.

[0138] Otros ejemplos de restos de transporte conocidos, subdominios y similares se describen en, por ejemplo, el documento de patente canadiense n.º 2.301.157 (conjugados que contienen homeodominio de antennapedia) así como en las patentes de EE.UU.5.652.122, 5.670.617, 5.674.980, 5.747.641 y 5.804.604, (conjugados que contienen aminoácidos de la proteína Tat del VIH; proteína de unión a ADN del virus del herpes simple 1 VP22, una etiqueta de histidina que varía en longitud de 4 a 30 repeticiones de histidina, o una variación derivada u homóloga de la misma capaz de facilitar la absorción del residuo de carga activa por un proceso independiente del receptor.

[0139] También se ha demostrado que una región de 16 aminoácidos de la tercera hélice alfa del homeodominio de antennapedia permite que las proteínas (hechas como proteínas de fusión) atraviesen las membranas celulares (publicación internacional PCT número WO 99/11809 y solicitud canadiense n.º 2.301.157. De manera similar, se demostró que la proteína Tat de VIH es capaz de atravesar membranas celulares.

[0140] Además, el (los) resto(s) de transporte puede(n) incluir polipéptidos que tienen una región rica en aminoácidos básicos unida covalentemente a un resto de agente activo (por ejemplo, péptido inhibidor de fragmentos que contienen dominio intracelular). Como se usa en el presente documento, la expresión "región rica en aminoácidos básicos" se refiere a una región de una proteína con un alto contenido de aminoácidos básicos como arginina, histidina, asparagina, glutamina, lisina. Una "región rica en aminoácidos básicos" puede tener, por ejemplo un 15 % o más de aminoácidos básicos. En algún caso, una "región rica en aminoácidos básicos" puede tener menos del 15 % de aminoácidos básicos y seguir funcionando como una región de agente de transporte. En otros casos, una región de aminoácidos básicos tendrá un 30 % o más de aminoácidos básicos.

[0141] El (los) resto(s) de transporte pueden incluir adicionalmente una región rica en prolina. Como se usa en el presente documento, el término región rica en prolina se refiere a una región de un polipéptido con un 5 % o más (hasta 100 %) de prolina en su secuencia. En algún caso, una región rica en prolina puede tener entre el 5 % y el 15 % de prolinas. Adicionalmente, una región rica en prolina se refiere a una región, de un polipéptido que contiene más prolinas de lo que generalmente se observa en las proteínas naturales (por ejemplo, proteínas codificadas por el genoma humano). Las regiones ricas en prolina de esta solicitud pueden funcionar como una región de agente de transporte.

[0142] En una realización, el péptido terapéutico descrito en el presente documento puede unirse de forma no covalente a un agente de transducción. Un ejemplo de un agente de transducción de polipéptido unido no covalentemente es el sistema de administración de proteínas Chariot (véase la patente de Estados Unidos n.º 6.841.535; J Biol Chem 274(3 5):24941-24946; y Nature Biotec.19:1173-1176).

[0143] En otras realizaciones, los péptidos terapéuticos pueden expresarse en células que se tratan usando terapia génica para inhibir la señalización de la familia LAR o la señalización de PTPσ. La terapia génica puede usar un vector que incluye un nucleótido que codifica los péptidos terapéuticos. Un "vector" (a veces denominado como "vehículo" de administración de genes o transferencia de genes) se refiere a una macromolécula o complejo de moléculas que comprende un polinucleótido que se va a administrar a la célula. El polinucleótido a administrar puede comprender una secuencia codificante de interés en terapia génica. Los vectores incluyen, por ejemplo, vectores víricos (tales como adenovirus (Ad), virus adenoasociados (VAA) y retrovirus), liposomas y otros complejos que contienen lípidos, y otros complejos macromoleculares capaces de actuar como mediadores en el suministro de un polinucleótido a una célula diana.

[0144] Los vectores también pueden comprender otros componentes o funcionalidades que modulen adicionalmente el suministro de genes y/o la expresión génica, o que proporcionen de otro modo propiedades beneficiosas a las células diana. Tales otros componentes incluyen, por ejemplo, componentes que influyen en la unión o en el direccionamiento a las células (incluyendo los componentes que median en la unión específica de tipo celular o de tejido); componentes que influyen en la captación del ácido nucleico del vector por la célula; componentes que influyen en la localización del polinucleótido dentro de la célula después de su captación (tales como agentes que median en la localización nuclear); y componentes que influyen en la expresión del polinucleótido (tal como una o más secuencias reguladoras de la transcripción). Dichos componentes también pueden incluir marcadores, tales como marcadores detectables y/o seleccionables que pueden usarse para detectar o seleccionar las células que han captado y que expresan el ácido nucleico suministrado por el vector. Dichos componentes pueden proporcionarse como una característica natural del vector (tal como el uso de determinados vectores víricos que tienen componentes o funcionalidades que median la unión y la captación) o los vectores pueden modificarse para proporcionar dichas funcionalidades.

[0145] Los marcadores seleccionables pueden ser positivos, negativos o bifuncionales. Los marcadores seleccionables positivos permiten la selección de células que portan el marcador, mientras que los marcadores seleccionables negativos permiten que las células que portan el marcador se eliminen selectivamente. Se han descrito diversos genes marcadores de este tipo, incluyendo marcadores bifuncionales (es decir, positivos/negativos) (véase, por ejemplo, Lupton, S. documento 92/08796, publicado el 29 de mayo de 1992; y Lupton, S., WO 94/28143, publicado el 8 de diciembre de 1994). Dichos genes marcadores pueden proporcionar una medida adicional de control que puede ser ventajosa en contextos de terapia génica. Se conoce en la técnica una gran diversidad de dichos vectores y están generalmente disponibles.

[0146] Los vectores para su uso en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, incluyen vectores virales, vectores basados en lípidos y otros vectores no virales que son capaces de administrar un nucleótido que codifica los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento a las células diana. El vector puede ser un vector dirigido, especialmente un vector dirigido que se une preferentemente a las neuronas y. Los vectores virales para su uso en la solicitud, pero que no forman parte de la invención reivindicada, pueden incluir aquellos que muestran baja toxicidad para una célula diana e inducen la producción de cantidades terapéuticamente útiles del péptido terapéutico de una manera específica de célula.

[0147] Ejemplos de vectores virales son los derivados de adenovirus (Ad) o virus adenoasociados (VAA). Se pueden usar vectores virales tanto humanos como no humanos y el vector viral recombinante puede ser defectuoso en la replicación en seres humanos. Cuando el vector es un adenovirus, el vector puede comprender un polinucleótido que tiene un promotor unido operativamente a un gen que codifica los péptidos terapéuticos y es defectuoso en la replicación en seres humanos.

[0148] Otros vectores virales que pueden usarse en el presente documento pero que no forman parte de la invención reivindicada incluyen vectores basados en el virus del herpes simple (HSV). Los vectores de HSV delecionados de uno o más genes tempranos inmediatos (IE) son ventajosos porque generalmente no son citotóxicos, persisten en un estado similar a la latencia en la célula diana y permiten una transducción eficiente de la célula diana. Los vectores de HSV recombinantes pueden incorporar aproximadamente 30 kb de ácido nucleico heterólogo.

[0149] Los retrovirus, tales como retrovirus de tipo C y lentivirus, también pueden usarse en la solicitud, pero no forman parte de la invención reivindicada. Por ejemplo, los vectores retrovirales pueden basarse en el virus la leucemia murina (VLM). Véase, por ejemplo, Hu y Pathak, Pharmacol. Rev.52:493-511, 2000 y Fong et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:1-60, 2000. Los vectores basados en VLM pueden contener hasta 8 kb de ADN heterólogo (terapéutico) en lugar de los genes virales. El ADN heterólogo puede incluir un promotor específico de tejido y un ácido nucleico que codifica el péptido terapéutico. En los métodos de administración a células neurales, también puede codificar un ligando para un receptor específico de tejido.

[0150] Los vectores retrovirales adicionales que podrían usarse pero que no forman parte de la invención reivindicada son vectores basados en lentivirus de replicación defectuosa, incluyendo vectores basados en inmunodeficiencia humana (VIH). Véase, por ejemplo, Vigna y Naldini, J. Gene Med. 5:308-316, 2000 y Miyoshi et al., J. Virol. 72:8150-8157, 1998. Los vectores lentivirales son ventajosos porque son capaces de infectar tanto células que se dividen activamente como células que no se dividen.

[0151] Los vectores lentivirales para su uso en la solicitud, pero que no forman parte de la invención reivindicada, pueden derivarse de lentivirus humanos y no humanos (incluyendo SIV). Los ejemplos de vectores lentivirales incluyen secuencias de ácido nucleico requeridas para la propagación del vector, así como un promotor específico de tejido unido operativamente a un péptido terapéutico que codifica un ácido nucleico. Estos primeros pueden incluir los LTR virales, un sitio de unión de cebadores, un tramo de polipurina, sitios att y un sitio de encapsidación.

[0152] En algunos aspectos, puede emplearse un vector lentiviral. Los lentivirus han demostrado ser capaces de transducir diferentes tipos de neuronas del SNC (Azzouz et al., (2002) J. Neurosci. 22: 10302-12) y pueden usarse en algunas realizaciones debido a su gran capacidad de clonación.

[0153] Un vector lentiviral puede empaquetarse en cualquier cápside lentiviral. La sustitución de una proteína de partícula con otra de un virus diferente se denomina "pseudotipificación". La cápside del vector puede contener proteínas de envoltura viral de otros virus, incluyendo el virus de la leucemia murina (VLM) o el virus de la estomatitis vesicular (VEV). El uso de la proteína G de VEV produce un título de vector alto y da como resultado una mayor estabilidad de las partículas de virus de vector.

[0154] Los vectores basados en alfavirus, tales como los elaborados a partir del virus del bosque semliki (SFV) y el virus sindbis (SIN) también podrían usarse en la solicitud, pero no forman parte de la invención reivindicada. El uso de alfavirus se describe en Lundstrom, K., Intervirology 43:247-257, 2000 y Perri et al., Journal of Virology 74:9802-9807, 2000.

[0155] Recombinante, los vectores de alfavirus con replicación defectuosa son ventajosos porque son capaces de expresión génica heteróloga (terapéutica) de alto nivel y pueden infectar un amplio intervalo de células diana. Los replicones de alfavirus pueden dirigirse a tipos de células específicos mostrando en su superficie de virión un ligando heterólogo funcional o dominio de unión que permitiría la unión selectiva a células diana que expresan una pareja de unión afín. Los replicones de alfavirus pueden establecer latencia y, por lo tanto, expresión de ácido nucleico heterólogo a largo plazo en una célula diana. Los replicones también pueden exhibir expresión transitoria de ácido nucleico heterólogo en la célula diana.

[0156] En muchos de los vectores virales compatibles con métodos en los que se usa el agente terapéutico de la solicitud, se puede incluir más de un promotor en el vector para permitir que el vector exprese más de un gen heterólogo. Además, el vector puede comprender una secuencia, que codifica un péptido señal u otro resto, lo que facilita la expresión del péptido terapéutico de la célula diana.

[0157] Para combinar propiedades ventajosas de dos sistemas de vector viral, los vectores virales híbridos pueden usarse para administrar un ácido nucleico que codifica un péptido terapéutico a una neurona, célula o tejido diana. Técnicas convencionales para la construcción de vectores híbridos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales técnicas se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook, et al., En Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. o cualquier número de manuales de laboratorio que analizan la tecnología de ADN recombinante. Pueden usarse genomas de VAA de doble cadena en cápsidas adenovirales que contienen una combinación de VAA e ITR adenovirales para transducir células. En otra variación, un vector de VAA puede colocarse en un vector adenoviral "gutless", "dependiente de ayudante" o "de alta capacidad". Los vectores híbridos de adenovirus/VAA se analizan en Lieber et al., J. Virol. 73:9314-9324, 1999. Los vectores híbridos de retrovirus/adenovirus se analizan en Zheng et al., Nature Biotechnol. 18:176-186, 2000. Los genomas retrovirales contenidos dentro de un adenovirus pueden integrarse dentro del genoma de la célula diana y efectuar una expresión génica estable.

[0158] Otros elementos de secuencias de nucleótidos, que facilitan la expresión del péptido terapéutico y la clonación del vector se contemplan adicionalmente. Por ejemplo, la presencia de potenciadores anteriormente al promotor o terminadores poasteriormente a la región de codificación, por ejemplo, puede facilitar la expresión.

[0159] De acuerdo con otra realización no reivindicada, un promotor específico de tejido puede fusionarse a nucleótidos que codifican los péptidos terapéuticos descritos en el presente documento. Al fusionar dicho promotor específico de tejido dentro de la construcción adenoviral, la expresión del transgén se limita a un tejido particular. Se puede determinar la eficacia de la expresión génica y el grado de especificidad proporcionado por los promotores específicos de tejido, usando el sistema adenoviral recombinante de la presente solicitud. Los promotores específicos de neuronas, tales como el promotor y los vectores de la cadena β del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-β), se conocen bien en la técnica.

[0160] Además de los métodos a base de vectores virales, también se pueden usar métodos no virales para introducir un ácido nucleico que codifica un péptido terapéutico en una célula diana. Se proporciona una revisión de los métodos no virales de administración de genes en Nishikawa y Huang, Human Gene Ther. 12:861-870, 2001. Un ejemplo de un método de administración de genes no viral de acuerdo con la solicitud emplea ADN de plásmido para introducir un ácido nucleico que codifica un péptido terapéutico en una célula. Los métodos de administración de genes basados en plásmidos se conocen generalmente en la técnica.

[0161] Las moléculas de transferencia génica sintéticas pueden diseñarse para formar agregados multimoleculares con ADN plasmídico. Estos agregados pueden diseñarse para unirse a una célula diana. Los anfífilos catiónicos, que incluyen lipopoliaminas y lípidos catiónicos, pueden usarse para proporcionar una transferencia de ácido nucleico independiente del receptor a las células diana.

[0162] Además, los liposomas catiónicos preformados o los lípidos catiónicos pueden mezclarse con ADN plasmídico para generar complejos de transfección celular. Los métodos que implican formulaciones de lípidos catiónicos se revisan en Felgner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:126-139, 1995 y Lasic y Templeton, Adv. Drug Delivery Rev. 20:221-266, 1996. Para la administración de genes, el ADN también puede acoplarse a un péptido catiónico anfipático (Fominaya et al., J. Gene Med.2:455-464, 2000).

[0163] Los métodos que implican tanto componentes basados en virus como no virales pueden usarse de acuerdo con la solicitud, pero no forman parte de la invención reivindicada. Por ejemplo, un plásmido basado en el virus de Epstein Barr (VEB) para la administración de genes terapéuticos se describe en Cui et al., Gene Therapy 8:1508-1513, 2001. Adicionalmente, un método que implica un complemento de ADN/ligando/policatiónico acoplado a un adenovirus se describe en Curiel, D. T., Nat. Inmun. 13:141-164, 1994.

[0164] Adicionalmente, el ácido nucleico que codifica los péptidos terapéuticos puede introducirse en la célula diana transfectando las células diana usando técnicas de electroporación. Las técnicas de electroporación son bien conocidas y pueden usarse para facilitar la transfección de células usando ADN plasmídico.

[0165] Los vectores que codifican la expresión de los péptidos terapéuticos pueden administrarse en vivo a la célula diana en forma de una preparación inyectable que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, según sea necesario. También se pueden utilizar otros portadores farmacéuticos, formulaciones y dosis de acuerdo con la presente solicitud.

[0166] Cuando la célula diana incluye una OL/OPC que se está tratando, el vector puede administrarse mediante inyección directa en o alrededor de la periferia de la OL/OPC en una cantidad suficiente para que el péptido terapéutico se exprese en un grado, lo que permite una terapia altamente eficaz. Al inyectar el vector directamente en o alrededor de la periferia de la OL/OPC, es posible orientar la transfección del vector de manera bastante eficaz y minimizar la pérdida de los vectores recombinantes. Este tipo de inyección permite la transfección local de un número deseado de células, especialmente en el lugar de la lesión, maximizando así la eficacia terapéutica de la transferencia génica y minimizando la posibilidad de una respuesta inflamatoria a las proteínas virales. Se pueden usar otros métodos de administración del vector a las células diana y dependerán del vector específico empleado.

[0167] El péptido terapéutico se puede expresar durante cualquier período de tiempo adecuado dentro de la célula diana, incluyendo expresión transitoria y estable, expresión a largo plazo. En un aspecto no reivindicado de la solicitud, el ácido nucleico que codifica el péptido terapéutico se expresará en cantidades terapéuticas durante un período de tiempo definido eficaz para inducir la actividad y el crecimiento de las células transfectadas. En otro aspecto no reivindicado de la solicitud, el ácido nucleico que codifica el péptido terapéutico se expresará en cantidades terapéuticas durante un período de tiempo definido efectivo para aumentar la tasa de supervivencia de OL/OPC, mejorar la migración, proliferación y/o maduración de OPC, y/o potenciar la mielinización o remielinización.

[0168] Los agentes terapéuticos descritos en el presente documento pueden modificarse (por ejemplo, modificarse químicamente). Dicha modificación puede diseñarse para facilitar la manipulación o purificación de la molécula, para aumentar la solubilidad de la molécula, para facilitar la administración, dirigiéndose a la ubicación deseada, para aumentar o reducir la semivida. En el ámbito técnico se conocen varias modificaciones de este tipo, que pueden ser aplicadas por un profesional cualificado.

[0169] En los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico al sujeto para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la mielina o la desmielinización (por ejemplo, EM). En una realización, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, una formulación que incluye el agente terapéutico se puede administrar al sujeto en el período desde el momento de, por ejemplo, la detección o el inicio de la enfermedad o trastorno relacionado con la mielina o la desmielinización (por ejemplo, EM), hasta días, semanas, meses y/o años después de la detección o el inicio de la enfermedad o trastorno relacionado con la mielina o la desmielinización (por ejemplo, EM).

[0170] Los agentes terapéuticos pueden administrarse a un sujeto por cualquier vía adecuada, incluyendo, por ejemplo, la administración local y/o sistémica. La administración sistémica puede incluir, por ejemplo, la administración parenteral, tal como administración intramuscular, intravenosa, intraarticular, intraarterial, intratecal, subcutánea o intraperitoneal. El agente también se puede administrar por vía oral, por vía transdérmica, por vía tópica, por inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal, oral o gotas intranasales) o por vía rectal. En algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico se puede administrar al sujeto mediante administración intravenosa usando una bomba de infusión para administrar diariamente, semanalmente, o dosis del agente terapéutico.

[0171] Las características deseables de la administración local incluyen lograr concentraciones locales eficaces del agente terapéutico, así como evitar efectos secundarios adversos de la administración sistémica del agente terapéutico. En una realización, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico se puede introducir directamente en el cerebro del sujeto.

[0172] Las formulaciones farmacéuticamente aceptables del agente terapéutico pueden suspenderse en vehículos acuosos e introducirse a través de agujas hipodérmicas convencionales o usando bombas de infusión.

[0173] Para inyección, el agente terapéutico puede formularse en soluciones líquidas, normalmente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, el agente terapéutico puede formularse en forma sólida y se vuelve a disolver o suspender inmediatamente antes de su uso. También se incluyen formas liofilizadas. La inyección puede ser, por ejemplo, en forma de inyección en bolo o infusión continua (tal como utilizando bombas de infusión) del agente terapéutico.

[0174] Se apreciará que la cantidad, volumen, concentración y/o dosificación del agente terapéutico que se administra a cualquier animal o ser humano depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del sujeto, área superficial del cuerpo, la edad, la composición particular a administrar, el sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. Las variaciones específicas de las cantidades indicadas anteriormente, volúmenes, las concentraciones y/o las dosis del agente terapéutico pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia usando los métodos experimentales descritos a continuación.

[0175] En algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, un agente terapéutico, tal como un péptido terapéutico descrito en el presente documento, puede administrarse local y/o sistémicamente a un sujeto que lo necesite a una dosis o cantidad de aproximadamente 0,1 μmol, aproximadamente 1 μmol, aproximadamente 5 μmol, aproximadamente 10 μmol o más; o aproximadamente 0,0001 mg/kg, aproximadamente 0,001 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg o 10 mg/kg del sujeto que se está tratando. El agente terapéutico puede administrarse diariamente, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o con menos frecuencia hasta que haya una remielinización máxima de la región de CSPG.

[0176] En otra realización, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico se puede administrar a un sujeto sistémicamente mediante inyección intravenosa o localmente en el sitio de la lesión, normalmente en un plazo de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 100 horas, o aproximadamente 200 horas o más de cuando se produce una lesión (por ejemplo, en un plazo de aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas o 24 horas, ambos inclusive, del momento de la lesión).

[0177] En otras realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, también se puede formular una formulación farmacéuticamente aceptable utilizada para administrar el (los) agente(s) terapéutico(s) para proporcionar un suministro sostenido del compuesto activo a un sujeto. Por ejemplo, la formulación puede administrar el compuesto activo durante al menos una, dos, tres o cuatro semanas, ambos inclusive, después de la administración inicial al sujeto. Por ejemplo, un sujeto a tratar de acuerdo con el método descrito en el presente documento en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado puede tratarse con el agente terapéutico durante al menos 30 días (ya sea mediante administración repetida o mediante el uso de un sistema de administración sostenida, o ambos). Los enfoques para la administración sostenida incluyen el uso de una cápsula polimérica, una minibomba para administrar la formulación, un implante biodegradable o células autólogas transgénicas implantadas (véase la patente de Estados Unidos n.º 6.214.622). Los sistemas de bomba de infusión implantables (por ejemplo, bombas INFUSAID (Towanda, PA)); véase Zierski et al., 1988; Kanoff, 1994) y las bombas osmóticas (vendidas por Alza Corporation) están disponibles comercialmente y son conocidos en la técnica. Otro modo de administración es a través de una bomba de infusión implantable, programable externamente. Los sistemas de bomba de infusión y los sistemas de depósito también se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 5.368.562 y 4.731.058.

[0178] Los vectores que codifican los péptidos terapéuticos a menudo se pueden administrar con menos frecuencia que otros tipos de agentes terapéuticos. Por ejemplo, una cantidad eficaz de dicho vector puede oscilar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 5 o 10 mg/kg, ambos inclusive; administrada diariamente, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o con menor frecuencia.

[0179] La capacidad de administrar o expresar los péptidos terapéuticos permite la modulación de la actividad celular en un número de diferentes tipos de células. Los péptidos terapéuticos se pueden expresar, por ejemplo, en una OL/OPC a través de promotores específicos.

[0180] Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a cualquier sujeto que pueda experimentar los efectos beneficiosos de la migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de OPC. Los más destacados entre tales animales son los seres humanos, aunque la presente invención no pretende estar limitada a estos.

[0181] El agente terapéutico se puede usar en un método para tratar a un sujeto mediante migración, diferenciación, proliferación y/o maduración de OPC en el sujeto. El método puede incluir administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico descrito en el presente documento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede incluir una cantidad (dosis) eficaz en el tratamiento de un sujeto, que tiene, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, esclerosis múltiple).

[0182] En algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento pueden administrarse en una cantidad eficaz para promover la supervivencia de las OL/OPC en un sujeto mediante un aumento en el número de OL/OPC supervivientes de al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 850 %, 900 %, 950 % o el 1000 % en comparación con el número de OL/OPC supervivientes en una OL/OPC o sujeto no tratados.

[0183] En algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico descrito en el presente documento puede administrarse en una cantidad efectiva que mejore la generación de OL en el sistema nervioso central del sujeto mediante un aumento en la cantidad de generación de OL de al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 850 %, 900 %, 950 % o el 1000 % en comparación con la cantidad de generación de OL en OPC o sujetos no tratados.

[0185] En algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico descrito en el presente documento puede administrarse en una cantidad eficaz para inducir la diferenciación de OPC en el sistema nervioso central del sujeto mediante un aumento en la cantidad de diferenciación de OPC de al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 850 %, 900 %, 950 % o el 1000 % en comparación con la cantidad de diferenciación de OPC en OPC o sujetos no tratados.

[0187] En algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, los agentes terapéuticos pueden administrarse a un sujeto para tratar un trastorno neurodegenerativo relacionado con la mielina. Los trastornos relacionados con la mielina pueden incluir cualquier enfermedad, afección o trastorno relacionado con la desmielinización, mielinización insuficiente y remielinización, o desmielinización en un sujeto. Un trastorno relacionado con la mielina puede surgir de un trastorno relacionado con la mielinización o desmielinización resultante de una diversidad de agresiones neurotóxicas. "Desmielinización" como se usa en el presente documento, se refiere al acto de desmielinización, o la pérdida de la vaina de mielina que aísla los nervios, y es el sello distintivo de algunas enfermedades autoinmunes neurodegenerativas, incluyendo esclerosis múltiple, mielitis transversa, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucodistrofias y síndrome de Guillain-Barré. Las leucodistrofias son causadas por deficiencias enzimáticas heredadas, que causan una formación anómala, destrucción y/o renovación anómala de las vainas de mielina dentro de la sustancia blanca del SNC. Tanto los trastornos de mielina adquiridos como los hereditarios comparten un mal pronóstico que conduce a una discapacidad importante. Por tanto, algunas realizaciones pueden incluir un agente terapéutico para su uso en métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes neurodegenerativas en un sujeto.

[0189] Las enfermedades o trastornos relacionados con la mielina que pueden tratarse o mejorarse mediante los métodos descritos en el presente documento en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado pueden incluir enfermedades, trastornos o lesiones que se refieren a desmielinización o desmielinización en el SNC o sistema nervioso periférico de un sujeto. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedades y trastornos en los que la mielina que rodea la neurona está ausente, incompleta, no se ha formado correctamente o se está deteriorando. Tales enfermedades incluyen, pero sin limitación, trastornos mielinoclásticos, tal como esclerosis múltiple (EM), la enfermedad de Devic y las enfermedades inflamatorias desmielinizantes, trastornos leucodistróficos, tales como leucoencefalopatías, leucodistrofias, por ejemplo, adrenomieloneuropatía, xantomatosis cerebrotendinosa, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Alexander y enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMD) y las enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso periférico, tales como el síndrome de Guillian-Barre y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

[0191] En algunas realizaciones, las enfermedades o trastornos relacionados con la mielina que pueden tratarse o mejorarse mediante los métodos descritos en el presente documento en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado incluyen las leucodistrofias. Las leucodistrofias son un grupo de enfermedades progresivas, metabólicas, genéticas que afectan al cerebro, la médula espinal y, a menudo, los nervios periféricos. Cada tipo de leucodistrofia está causado por una anomalía genética específica que conduce a un desarrollo anómalo o destrucción de la vaina de mielina del cerebro. Cada tipo de leucodistrofia afecta a una parte diferente de la vaina de mielina, dando lugar a una serie de problemas neurológicos. Ejemplos de leucodistrofias, que pueden tratarse o mejorarse mediante los métodos descritos en el presente documento en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado incluyen la leucodistrofia autosómica dominante de inicio en adultos (ADLD), síndrome de Aicardi-Goutières, enfermedad de Alexander, CADASIL, enfermedad de Canavan, CARASIL, xantomatosis cerebrotendinosa, ataxia infantil y polimielinización cerebral (CACH)/enfermedad de la sustancia blanca que desaparece (VWMD), enfermedad de Fabry, fucosidosis, gangliosidosis GM1, enfermedad de Krabbe, aciduria L-2-hidroxiglutárica, leucoencefalopatía megalencefálica con quistes subcorticales, leucodistrofia metacromática, deficiencia de sulfatasa múltiple, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD), leucodistrofias relacionadas con Pol III, enfermedad de Refsum, enfermedad de Salla (enfermedad de depósito de ácido siálico libre), síndrome de Sjogren-Larsso, adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X y trastornos del espectro del síndrome de Zellweger.

[0193] Las enfermedades o trastornos relacionados con la mielina que pueden tratarse o mejorarse mediante los métodos descritos en el presente documento en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado pueden incluir una enfermedad o trastorno caracterizado por una deficiencia de mielina. La mielinización insuficiente en el sistema nervioso central se ha implicado en una amplia serie de trastornos neurológicos. Entre estos se encuentran formas de parálisis cerebral en las que un déficit congénito en la mielinización del prosencéfalo en niños con leucomalacia periventricular, contribuye a la morbilidad neurológica (Goldman et al., 2008) Goldman, S. A., Schanz, S. y Windrem, M. S. (2008). Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin. Hum Mol Genet. 17, R76-83. En el otro extremo del espectro de edades, la pérdida de mielina y la reparación ineficaz pueden contribuir a la disminución de la función cognitiva asociada con la senescencia (Kohama et al., 2011) Kohama, S. G., Rosene, D. L. y Sherman, L. S. (2011) Age (Dordr). Age-related changes in human and non-human primate white matter: from myelination disturbances to cognitive decline. Por lo tanto, se contempla que los agentes y métodos eficaces para potenciar la mielinización y/o la remielinización pueden tener beneficios terapéuticos sustanciales para detener la progresión de la enfermedad y restaurar la función en la EM y en una amplia serie de trastornos neurológicos.

[0194] Un aspecto particular contempla un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple en un sujeto. El método en el que se utiliza el agente terapéutico reivindicado incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico descrito en el presente documento. La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad desmielinizante más común. En la esclerosis múltiple, se cree que la falla del cuerpo para reparar la mielina conduce a daño nervioso, provocando síntomas asociados con la esclerosis múltiple y aumentando la discapacidad. La desmielinización observada en la EM no siempre es permanente y la remielinización se ha documentado en etapas tempranas de la enfermedad. Se contempla que los métodos descritos en el presente documento en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado pueden promover la diferenciación de OPC en un sujeto, lo que conduce a la remielinización endógena.

[0195] Otro aspecto particular contempla un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de un trastorno genético de la mielina que resulta de la pérdida de mielina (desmielinización) en un sujeto. El método en el que se utiliza el agente terapéutico reivindicado incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, el trastorno genético de la mielina es una leucodistrofia tal como, pero sin limitación a la enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMD)

[0196] Otra estrategia para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno neurodegenerativo es administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico descrito en el presente documento junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de agente(s) inductor(es) de diferenciación y/o proliferación de oligodendrocitos adicionales y/o agente contra las enfermedades neurodegenerativas. Los ejemplos de agentes contra las enfermedades neurodegenerativas incluyen L-dopa, inhibidores de la colinesterasa, anticolinérgicos, agonistas de la dopamina, esteroides e inmunomoduladores, incluidos los interferones, anticuerpos monoclonales y acetato de glatirámero. Por lo tanto, en algunas realizaciones, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico descrito en el presente documento puede administrarse como parte de una terapia de combinación con terapias complementarias para tratar trastornos neurodegenerativos y relacionados con la mielina.

[0197] La expresión "terapia de combinación" abarca la administración del agente terapéutico, que inhibe o reduce una o más de la actividad, señalización y/o función de PTPσ, y un agente terapéutico adicional como parte de un régimen de tratamiento específico destinado a proporcionar un efecto beneficioso a partir de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos. Cuando se administran como una combinación, el agente terapéutico, que inhibe o reduce una o más de la actividad, señalización y/o función de PTPσ, y el agente terapéutico adicional pueden formularse como composiciones separadas. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación se realiza normalmente durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada).

[0198] La "terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos o de al menos dos de los agentes terapéuticos, de manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una sola cápsula con una proporción fija de cada agente terapéutico, o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede efectuar por cualquier vía apropiada incluyendo, pero sin limitación, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa, mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Como alternativa, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por inyección intravenosa. La secuencia en la que se administran los agentes terapéuticos no es estrictamente crítica. La "terapia de combinación" también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos descritos anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos (tales como, pero sin limitación, un segundo y diferente agente terapéutico) y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía).

[0199] En otra realización, en el método en el que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, el agente terapéutico adicional administrado en una terapia combinada con el agente terapéutico, que inhibe o reduce una o más de la actividad, señalización y/o función de PTPσ, descritos en el presente documento, puede incluir al menos un agente anti-neurodegenerativo tal como, pero sin limitación, un agente inmunoterápico.

[0200] Un agente inmunoterápico para su uso en los métodos en los que se utiliza el agente terapéutico reivindicado puede incluir terapias que se dirigen al componente inmunitario de la enfermedad y/o la respuesta inflamatoria aguda evidenciada durante un ataque agudo en la esclerosis múltiple remitente-recidivante. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a inmunomoduladores tales como interferón beta-la y beta-lb (Avonex y Betaseron, respectivamente), natalizumab (Copaxone) natalizumab (Tysabri), acetato de glatiramer (Copaxone) o mitoxantrona. En otras realizaciones, en los métodos en los que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, los agentes terapéuticos pueden administrarse a un sujeto que no tiene, y/o no se sospecha que tenga, un trastorno relacionado con la mielina para potenciar o promover un proceso dependiente de la mielina. En algunas realizaciones, en los métodos en los que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento pueden administrarse a un sujeto para promover la mielinización de las neuronas del SNC con el fin de potenciar la cognición, que se sabe que es un proceso dependiente de la mielina, en sujetos cognitivamente sanos. En determinadas realizaciones, en los métodos en los que se va a usar el agente terapéutico reivindicado, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con agentes potenciadores cognitivos (nootrópicos). Los ejemplos de agentes incluyen cualquier fármaco, suplemento u otras sustancias que mejoran la función cognitiva, particularmente funciones ejecutivas, la memoria, la creatividad o motivación, en individuos sanos. Los ejemplos no limitativos incluyen racemantos (por ejemplo, piracetam, oxiracetam y aniracetam), nutracéuticos (por ejemplo, bacopa monnieri, ginseng panax, ginkgo biloba y GABA), estimulantes (por ejemplo, productos farmacéuticos de anfetamina, metilfenidato, eugeroicos, xantinas y nicotina), L- teanina, tolcapona, levodopa, atomoxetina y desipramina.

[0201] A continuación se describe una realización específica e ilustrativa de la presente divulgación. En esta discusión se muestra que el tratamiento con péptido sigma intracelular (ISP) promueve la recuperación funcional en una variedad de modelos desmielinizantes. El tratamiento con ISP supera la barrera de CSPG para promover la remielinización y la recuperación funcional, lo que revela el papel crítico de las proteínas receptoras tirosina fosfatasas (RPTP) en la patobiología de la esclerosis múltiple (EM). También mostramos un mecanismo novedoso por el que la modulación de ISP de PTPσ aumenta drásticamente la actividad proteasa en las propias OPC. A su vez, la liberación de enzimas mejorada degrada selectivamente los CSPG, lo que ayuda aún más a aumentar su migración y diferenciación dentro de territorios previamente cicatrizados.

[0202] Ejemplo

[0203] Materiales y métodos

[0204] Animales

[0205] Todo el cuidado de los animales y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Case Western Reserve. Se compraron ratones C5 7BL/6 de tipo natural en el Laboratorio Jackson (N.º de catálogo 000664) y se alojaron en el Centro de Investigación Animal de la Universidad Case Western Reserve, los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad. En este estudio se incluyeron tanto ratones machos como hembras.

[0206] Modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE)

[0207] Para la inducción de EAE, se inmunizaron ratones hembra C57BL6/J a las 10 semanas de edad con MOG<35-55>junto con emulsión de adyuvante completo de Freund (Hooke Laboratories, kit de inducción de EAE con MOG<35-55>, EK-2110) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso del kit de inducción de EAE da como resultado una inducción de enfermedad satisfactoria del 98 %. Todos los animales con EAE se monitorizaron diariamente y se puntuaron usando una escala clínica de 0 a 5 (0: sin anomalías; 1: cola flácida; 2: cola flácida y debilidad de las patas traseras; 3: cola flácida y parálisis completa de las patas traseras; 4, parálisis de las patas traseras y parálisis parcial de las patas delanteras; 5: moribundo. Una vez que los ratones con EAE obtuvieron una puntuación de 1 o 3, fueron reclutados aleatoriamente en el grupo de tratamiento y el grupo de control. Para el grupo de tratamiento, 5-7 ratones recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de ISP (20 μg/día), o DMSO al 5 % en solución salina, 100 μl) para el grupo de vehículo. Los experimentos se cegaron y los animales se puntuaron diariamente. Para inicio de ISP: el tratamiento de ISP se administró al inicio de la enfermedad puntuado por escala clínica. Para pico de ISP: el tratamiento de ISP se administró en el pico de enfermedad puntuado por escala clínica

[0208] Desmielinización focal inducida por lisolecitina (LPC) en ratones

[0209] Se anestesiaron ratones macho C57BL/6 de 12 semanas de edad usando isoflurano y se realizó una laminectomía. Se infundieron 1,5 μl de LPC al 1 % en la columna dorsal entre T1 y T12 de la médula espinal a una velocidad de 0,25 μl/min. La aguja se retiró después de un retraso de 5 min para minimizar el reflujo y la lesión se cerró. Comenzó a las 24 h después de la cirugía, los ratones se trataron diariamente con ISP (20 μg/día) o vehículo (DMSO al 5 % en solución salina, 100 μl) mediante inyección subcutánea cerca del sitio de la lesión. Los ratones se sacrificaron en los días 7, 14 y 21 después de la laminectomía por separado. Se diseccionaron las médulas espinales para realizar análisis adicionales mediante inmunotransferencia tipo Western, histología y ultraestructura. Los animales de control recibieron una inyección equivalente de solución salina y los tejidos se recogieron de acuerdo con el mismo paradigma. Para la segunda inyección del inhibidor de MMP-2 OA-Hy (10 μg/1,5 μl, 444244, Calbiochem), partículas lentivirales que expresan ARNhp dirigido a MMP-2 de ratón (1 μl, LPP-MSH027657-LVRU6GP, GeneCopoeia) o solución salina al 0,9 %, los animales se anestesiaron en 1 d (para partículas lentivirales) o 4 d (para OA-Hy) después de la lesión de LPC y OA-Hy o partículas lentivirales se administraron en la misma área usando el paradigma anterior. Se permitió que los animales se recuperaran y se sacrificaron a los 14 días después de la lesión (dpl) o 18 dpl. Los tamaños de las lesiones se determinaron mediante tinción de secciones en serie con tinción de cianina eriocromo.

[0210] Desmielinización inducida por LPC en cultivos de cortes de cerebelo de ratón

[0211] Se llevó a cabo el método de cultivo de cortes de cerebelo como se describió anteriormente (Zhang, H., et al. Central nervous system remyelination in culture — A tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology 230, 138-148 (2011)). Brevemente, se cortaron cortes de cerebelo de 300 μm de espesor del cerebelo de ratón P10-12 usando un microtomo vibratorio Leica (Leica, VT1000S) y se cultivaron en medio que contenía un 50 % de medio basal de medio eagle, 25 % de suero de caballo inactivado por calor, 25 % de solución de Hank, 2,5 % de glucosa, 1 % de glutamina y penicilina estreptomicina. Después de 4 días in vitro (DIV), se añadieron 0,5 mg/ml de LPC durante 17-18 h para inducir la desmielinización. A continuación, los cortes se incubaron con ISP 2,5 μM durante 8 días. Para experimentos con GM6001, GM600125 μM (Tocris) y/o ISP o SISP 2,5 μM se incubó durante 9 días. La remielinización se examinó mediante inmunotransferencia tipo Western semicuantitativa de MBP y tinción de inmunofluorescencia de MBP y NeuF200.

[0212] Inmunotinción de cortes cultivados

[0213] Se fijaron cortes con PFA al 4 %, se deslipidaron y lavaron tres veces en PBS, se bloquearon en PBS que contiene Triton X-100 al 0,1 % y suero de cabra normal al 5 % y se incubaron con anticuerpos anti-MBP (SMI-99P, Covance, 1:300) y anti-NeuF200 (N4142, Sigma, 1:250) durante la noche a 4 °C. A continuación, los cortes se lavaron en PBS y se incubaron en anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (1:500, invitrogen) durante 2 h. Los cortes se montaron en medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Laboratories) y se analizaron usando un microscopio de fluorescencia Leica DFC500.

[0214] Cultivos de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) de ratón purificadas

[0215] Las OPC se prepararon a partir de ratones C57BL/6 recién nacidos como se ha descrito anteriormente (Luo, F., et al. The Activators of Cyclin-Dependent Kinase 5 p35 and p39 Are Essential for Oligodendrocyte Maturation, Process Formation, and Myelination. J. Neurosci. 36, 3024-3037 (2016). Las placas de cultivo celular se recubrieron previamente con IgM (10 μg/ml, Millipore) en Tris-HCl 50 mM y a continuación con el anticuerpo primario de ratón A2B5. Las células disociadas se incubaron en las placas de cultivo pre-recubiertas durante 30 min a 37 °C y luego las células no adherentes se retiraron suavemente. Las OPC A2B5+ se liberaron con tripsina al 0,05 % en DMEM con una pureza de ≈96 %. Las células OPC purificadas se expandieron en medio DMEM/F12 suplementado con N2, PDGF 20 ng/ml, FGF 20 ng/ml, NT-35 ng/ml, CNTF 10 ng/ml, glutamina (200 mM).

[0216] Ensayo de actividad proteasa de medios acondicionados (CM)

[0217] Alrededor de 1x10<6>OPC se sembraron por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con PLL, laminina 1 μg/ml y agrecano 2 μg/ml y se trataron con vehículo, ISP o SISP 2,5 μM durante 2 días a 37 °C. Se recogió CM, se filtraron las células y se colocaron en hielo hasta que se analizó. Se uso el kit de ensayo de proteasa ThermoFisher (E66383, EnzChek, ThermoFisher) se usó para someter a ensayo la actividad proteasa, 1x de la mezcla de EnzChek se mezcló 1:1 con el CM de cada grupo y se incubó a TA durante la noche con agitación suave. Se realizaron 3 réplicas para cada muestra. Las muestras se analizaron usando un espectrofotómetro a 502/528 nm de excitación y emisión para evaluar la caseína escindida y fluorescente. Las unidades de fluorescencia notificadas se han dejado en blanco con EnzChek y una mezcla de medios de cultivo celular.

[0218] Ensayo de cruce de gradiente de CSPG y cuantificación de gradiente

[0219] Los gradientes de CSPG se prepararon como se ha descrito anteriormente (Tom, V. J., et al. Studies on the Development and Behavior of the Dystrophic Growth Cone, the Hallmark of Regeneration Failure, in an In vitro Model of the Glial Scar and after Spinal Cord Injury.). El cubreobjetos de vidrio de 24 pocillos se recubrió con poli-L-lisina y nitrocelulosa, y una mezcla de agrecano 700 μg/ml (A1960 Sigma) y laminina 10 μg/ml (11243217001 Sigma) se colocó en puntos en el cubreobjetos recubierto. Después del secado, a continuación, los cubreobjetos recubiertos se incubaron con laminina a 37 °C durante 3 h. Las OPC purificadas se sembraron en placas a una densidad de 10.000/cubreobjeto y se cultivaron en medio DMEM/F12 que contenía N2, PDGF (20 ng/ml), FGF (20 ng/ml), NT-3 (5 ng/ml), CNTF (10 ng/ml), glutamina (200 mM). Los cubreobjetos se tiñeron con anticuerpos frente a CS-56 (C8035, Sigma, 1:500) y 04 (Hybridoma Core Cleveland Clinic, 1:10). Se contaron las células positivas para 04 que cruzaban el borde de agrecano para cada punto. Para la cuantificación de gradiente de CSPG, se colocaron en placa 1x10<6>OPC por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con PLL, laminina 1 μg/ml y agrecano 2 μg/ml. Las OPC se trataron con vehículo, ISP 2,5 μM o SISP 2,5 μM durante 2 días a 37 °C. CM se recogió y se incubó con puntos recién hechos. Los puntos se incubaron con CM durante 2 días a 37 °C y luego se tiñeron con anticuerpos frente a CS-56 y laminina (L9393, Sigma, 1:1000) y se obtuvieron imágenes de manera consistente. Usando el software ImageJ (NIH), las intensidades de píxel de los bordes del punto de CS-56 o de laminina se cuantificaron usando el mismo ROI. Para el explante de médula espinal cultivada, las médulas espinales cervicales y torácicas de las crías de ratón P1 se cortaron en trozos de tejido de 1-2 mm y se transfirieron al cubreobjetos. Se cultivaron explantes en medio DMEM/F12 con un 15 % de FBS (Hyclone), PDF 10 ng/ml (Sigma) y suplemento de N2 (Invitrogen). Para el tratamiento con ISP, se añadió ISP 2,5 uM al medio en el momento de la colocación en placa. Se usó GM6001 25 µM (2983, Tocris), inhibidor de MMP-2100 nM (444244, Calbiochem) y/o ISP o SISP 2,5 μM.

[0220] Secuencias peptídicas

[0221] Los péptidos se compraron de GenScript o CS-Bio en cantidades liofilizadas de 1 mg que se diluyeron hasta 2,5 mM en dH<2>O y se tomaron alicuotas a -20 °C cuando estaba listo para su uso como se ha descrito anteriormente (Lang, B. T. et al. Modulation of the proteoglycan receptor PTPsigma promotes recovery after spinal cord injury. Nature 518, 404-408 (2015)).

[0222] Péptido Sigma Intracelular (ISP):

[0223] GRKKRRQRRRCDMAEHMERLKANDSLKLSQEYESI (SEQ ID NO: 61)

[0224] ISP aleatorizado (SISP):

[0225] GRI<I<RRQRRRCIREDDSLMLYALAQEI<I<ESNMHES (SEQ ID NO: 62)

[0226] Análisis de inmunotransferencia tipo Western de agrecano y laminina

[0227] CM se recogió de 1x10<6>OPC incubadas en placas de 6 pocillos recubiertas con PLL, laminina 1 μg/ml y agrecano y 2 μg/ml. Las OPC se trataron con vehículo, ISP 2,5 μM, o SISP 2,5 μM junto con Exo110 μg/ml (abl20292, Abcam), o GM6001 25 μM (364205, Calbiochem) durante 2 días a 37 °C. Se incubaron 100 μl de CM de cada grupo de células filtradas con 20 μg/ml de agrecano y/o 10 μg/ml de laminina durante 2 horas en tubos Eppendorf de 1 ml a 37 °C. Como control positivo, se incubó medio de OPC con agrecano y se incubó de la misma manera. A continuación, se realizaron inmunotransferencias tipo Western como se describe a continuación con incubación contra anticuerpos frente a CS-56 y/o laminina.

[0228] Análisis de inmunotransferencia tipo Western de lisado de OPC o CM

[0229] Para evaluar MMP-2 o 10 en CM de OPC o lisados, las OPC se incubaron en PLL recubierto previamente, agrecano y laminina, tal y como se ha descrito anteriormente. Las OPC se trataron con vehículo, ISP o SISP 2,5 μM durante 2 días a 37 °C. A continuación, se recogió CM y se concentró usando unidades de filtro centrífugo Milipore Ultracel YM-C a velocidad máxima (Eppendorf Centrifuge 5415D) durante 30 minutos a 4 °C. Se cargaron 50 μg de CM concentrado en cada carril. Los lisados de OPC se evaluaron usando técnicas de inmunotransferencia tipo Western descritas a continuación con 20 μg de proteína cargada de cada grupo.

[0230] Análisis de inmunotransferencia tipo Western

[0231] Las muestras de tejido o los cortes de cerebelo o las células OPC purificadas se homogeneizaron con tampón de lisis RIPA y la concentración de proteína se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA de acuerdo con las instrucciones de fabricación (Thermo Fisher). Posteriormente, se cargaron cantidades iguales de proteína en geles de SDS-PAGE al 15 % y se transfirieron electroforéticamente a membranas de PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon en tampón de TPBS al 0,1 % con leche desnatada al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente y se sondaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 °C y seguido de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: MBP (SMI-99P, Covance, 1:1000), CS-56 (C8035, Sigma, 1:1000), Laminina (L93 93, Sigma, 1:1000), GAPDH (AF5 718, R and D Systems, 1:1000), MMP-2 (AF1488, R and D Systems, 1:1000), MMP-10 (MAB910, R and D Systems, 1:1000) y βactina (sc-47778, Santa Cruz, 1:1000). La quimioluminiscencia mejorada se realizó con un kit West Pico (Thermo Fisher) y se detectó mediante el sistema FluorChem E (ProteinSimple, EE. UU.). La densidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ (NIH).

[0232] Zimografía de gelatina

[0233] CM se recogió de 1x10<6>OPC incubadas en placas de 6 pocillos recubiertas con PLL, laminina 1 μg/ml y agrecano y 2 μg/ml. Las OPC se trataron con vehículo, ISP o SISP 2,5 μM durante 2 días a 37 °C. CM se concentró usando unidades de filtro centrífugo Milipore Ultracel YM-3 como se describió anteriormente. Se cargaron 40 μg de proteína no desnaturalizada de CM concentrado o 25 ng de MMP-2 recombinante (PF023, Milipore) y MMP-9 (PF140, Milipore) con tampón lx laemmli (1610747, Bio-Rad) en zimogramas de gelatina al 10 % (1611167, Bio-Rad) y se ejecutaron a 100 mV durante 1,5 horas en hielo. A continuación, los zimogramas se agitaron suavemente con tampón de renaturalización 1x (1610765, Bio-Rad) durante 30 minutos a TA y luego se incubaron con tampón de desarrollo 1x (1610766, Bio-Rad) durante la noche a 37 °C. Los zimogramas desarrollados se lavaron suavemente con dH<2>O y se incubaron durante la noche con colorante azul de Coomassie al 0,1 % (27816, Sigma). Después de los lavados con tampón de decoloración (40 % de MeOH, 10 % de ácido acético), se tomaron imágenes de zimogramas y se evaluó la cantidad de degradación de gelatina usando Imaged en un método descrito en la sección de inmunotransferencia tipo Western.

[0234] Selección de matriz de proteasas

[0235] Las OPC se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 4div con control de vehículo o tratamiento con ISP 2,5 μM. Se recogieron medios acondicionados de cada grupo y se filtraron las células antes de la incubación con la matriz de transferencia proporcionada en el kit de matriz de proteasas de R & D Systems (ARY025). Se siguieron las instrucciones del kit con una incubación durante la noche de los medios recogidos a 4 °C. Las inmunotransferencias de control e ISP se desarrollaron junto con el mismo tiempo de exposición y las intensidades de píxeles de la matriz se evaluaron utilizando Imaged (NIH).

[0236] Tinción de mielina con Luxol Fast Blue (LFB) y cuantificación

[0237] La tinción con LFB se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante(# 26681, Electron Microscopy Sciences). Para las secciones de médula espinal, se incubaron secciones coronales de 20 μm en solución de LFB a 56 °C durante la noche y luego se enjuagaron secuencialmente con alcohol al 95 % y agua destilada. Las secciones estaban entonces en una solución de carbonato de litio al 0,1 % y a continuación se deshidrataron con una serie de etanol graduado, se aclararon con Histoclear y se montaron. Se tomó imágenes y se analizó un conjunto de secciones coincidentes en serie. Las imágenes (5 a 6 secciones/animal) se capturaron bajo microscopio óptico. Las áreas desmielinizadas (falta de tinción de LFB) se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Para secciones con EAE, las áreas desmielinizadas se midieron y representaron como un porcentaje del área total de la médula espinal. Para secciones del modelo de LPC, los volúmenes de lesión se calcularon por el área de lesión a partir de secciones en serie a lo largo de toda la lesión basándose en la ecuación para el volumen del cilindro (V = área de lesión x longitud de lesión).

[0238] Inmunocitoquímica

[0239] Para la tinción de MMP-2/04, las OPC se colocaron en placa en cubreobjetos de 24 pocillos que se recubrieron previamente con PLL, laminia 1 μg/ml y agrecano 2 μg/ml y se incubaron con vehículo o ISP 2,5 μM durante 2 días a 37 °C. Las células OPC u OL cultivadas se fijaron en PFA al 4 % y se siguieron bloqueando en solución de PBST (suero de cabra normal al 10 % y Triton-X100 al 0,2 % en PBS). Los anticuerpos primarios diluidos se incubaron con muestras durante la noche a 4 °C y se siguieron con el anticuerpo secundario apropiado IgM o IgG anti-ratón o anticonejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 o 594 (1:500, Invitrogen). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: PDGFRα(XX), 04 (Hybridoma Core, Cleveland Clinic), MBP (SMI- 99P, Covance, 1:300), MMP-2 (R and D Systems, 1:500), y CS-56 (C8035, Sigma, 1:250). Las células se montaron con medio de montaje Vecta Shield con DAPI (Vector Laboratories).

[0240] Inmunocitoquímica de TUNEL, Ki-67 y cuantificación

[0241] Para evaluar la proliferación, las OPC se colocaron en placa en cubreobjetos de 24 pocillos que se recubrieron previamente con PLL, laminina 1 μg/ml y agrecano 2 μg/ml. Las OPC se trataron con vehículo, ISP o SISP 2,5 μM inmediatamente después de la siembra durante 2 días a 37 °C. Los cubreobjetos se fijaron y tiñeron usando el mismo método descrito en la sección de inmunocitoquímica con Ki-67 (550609, BD Pharmingen, 1:500) y 04 (1:10). Se tomaron imágenes de los cubreobjetos y se contaron. Para evaluar la apoptosis, las OPC se cultivaron de la misma manera y se incubaron con vehículo o LPC 1 μg/ml durante 2 horas en los 2 días posteriores a la incubación con vehículo, con ISP o SISP 2,5 μM. A continuación, los cubreobjetos se fijaron con PFA y metanol y luego se tiñeron con el kit de ensayo APO-BrdU TUNEL (A23210, ThermoFisher) y las pautas con una incubación durante la noche del anticuerpo primario a TA. Los cubreobjetos se cotiñeron adicionalmente con DAPI (D9542, Sigma, 1:10.000) luego se tomaron imágenes y se contaron.

[0242] Inmunohistoquímica

[0243] Los ratones se anestesiaron con avertina y perfusión con PBS y paraformaldehído al 4 % (PFA). El cerebro o la médula espinal se diseccionaron y se fijaron posteriormente en PFA al 4 % durante la noche a 4 °C y se equilibraron en sacarosa al 20 %. Se pretrataron secciones de 20 μm de espesor con la solución Reveal Decloaker (RV1000M, Biocare Medical) para la recuperación de antígenos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del bloqueo, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C y se siguieron con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con la fluorescencia de Alexa 488 o 594. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: MBP (SMI-99P, Covance, 1:300), NeuF200 (N4142, Sigma, 1:250), CS-56 (C8035, Sigma, 1:250), CAT301 (MAB5284, Millipore, 1:250), versicano (AB 1032, Millipore, 1:250), Iba1 (019-19741, WAKO, 1:250), GFAP (MAB360, Millipore, 1:250), Olig2 (AB9610, Millipore, 1:250), CC1 (OP80, Millipore, 1:250). Para cada tinción, se examinaron al menos 3 animales individuales/grupo y se capturaron imágenes con un microscopio de fluorescencia Leica DFC500. La tinción se cuantificó usando el software Image J (US National Instisutes of Health, EE. UU.). La intensidad de fluorescencia se calculó como porcentajes del valor medio de los controles sin tratamiento previo.

[0244] Preparación de tejido para análisis de microscopía electrónica (EM)

[0245] Para análisis ultraestructurales de mielinización, los animales anestesiados se perfundieron con glutaraldehído al 2 %/paraformaldehído al 4 % en tampón de carcodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4 (Electron Microscopy Sciences). Las áreas lesionadas de las médulas espinales inducidas por LPC o EAE de animales tratados con ISP o de control se diseccionaron y se fijaron posteriormente en OsO4 al 1% durante 2 horas. Se prepararon secciones coronales (500 μm) de médula espinal o cerebro que contenían cuerpo calloso (Leica, Vibratome), se deshidrataron, se tiñeron con acetato de uranilo saturado y se incrustaron en una resina Poly/Bed812 (Polysciences Inc.). Las secciones de 1 μm de espesor se cortaron y se tiñeron con azul de toluidina, y se seleccionaron áreas coincidentes para el análisis EM. Para el análisis ultraestructural, se cortaron secciones ultrafinas (0,1 μm) y se visualizaron usando un microscopio electrónico (JEOL100CX) a 80 kV. Las relaciones G se calcularon a partir de al menos 50-100 axones mielinizados seleccionados aleatoriamente midiendo el espesor de mielina del diámetro interno y externo de la vaina de mielina. Atenuación ARNhp de MMP-2

[0246] La atenuación de MMP-2 fue mediada a través de partículas lentivirales que expresan ARNhp dirigido a MMP2 de ratón impulsada por el promotor U6 (LPP-MSH027657-LVRU6GP, GeneCopoeia). Se usaron partículas lentirales para construcciones aleatorizadas de ARNhp (LPP-CSHCTR001-LVRU6GP-100-C, GeneCopoeia) como los controles correspondientes. Los cultivos de OPC se infectaron durante al menos 48 horas antes de los experimentos a la multiplicidad de infección (MOI) de 1. Las construcciones se validaron usando análisis de inmunotransferencias tipo Western de cultivos de OPC infectados para MMP-2 (AB191677, Sigma, 1:500).

[0247] Análisis estadístico

[0248] Todos los análisis de datos se realizaron en GraphPad Prism 6,00. Los datos se muestran como la media ± SEM. p<0,05 se considera estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó mediante las pruebas t de Student de dos colas, ANOVA unidireccional o bidireccional con análisis post-hoc mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey, la prueba de comparación múltiple de Dunnett o la prueba de comparación múltiple de Sidak. Las cuantificaciones se realizaron de forma ciega. No se utilizaron pruebas estadísticas para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los generalmente empleados en el campo. Se supuso que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de manera independiente.

[0249] Resultados

[0250] Aumento de la expresión de CSPG y receptor PTPσ en lesiones de modelos de ratón con EM desmielinizante de EAE y LPC

[0251] Caracterizamos la expresión de CSPG en lesiones desmielinizantes de EAE progresiva crónica inducida por MOG<35-55>y desmielinización focal aguda inducida por LPC. Las lesiones de EAE y LPC desmielinizadas en la sustancia blanca de la médula espinal se visualizaron con tinción de mielina con Luxol Fast Blue (LFB) (Fig. 9A-9D). Como era de esperar, La tinción con LFB disminuyó en las lesiones de ambos modelos. La inmunotinción de secciones de tejido de la médula espinal reveló una expresión de CSPG regulada por incremento en lesiones desmielinizantes de animales afectados por EAE y LPC en comparación con los controles de vehículo (Fig. 9A-9D). Además, la regulación por incremento de CSPG aumentó progresivamente en la médula espinal lesionada por EAE de 28 a 41 días después de la inmunización (Fig. 9A). Las secciones de tejido recogidas de animales en los 7 y 14 días después de la inyección de LPC en la médula espinal dorsal (Fig. 9C y 9D) mostraron de manera similar una mayor producción de CSPG en lesiones desmielinizantes. El aumento de CSPG en áreas focalmente desmielinizadas nos llevó a plantear la hipótesis de que los CSPG influyen negativamente en las OPC en los sitios de lesión a través de la señalización de PTPσ, lo que en última instancia puede afectar su capacidad para remielinizar la médula.

[0252] Se sabe que los CSPG emiten señales a través de los receptores PTPσ, LAR y los receptores Nogo 1 y 3. Utilizamos una base de datos de transcriptoma de secuenciación de ARN publicada anteriormente de la corteza cerebral de ratón para buscar las expresiones génicas de PTPRS (PTPσ), PTPRF (LAR), PTPRD (PTPδ) y RTN4R (receptores Nogo) durante el desarrollo de las OPC. Los transcritos del gen PTPRS (FPKM) fueron el tipo más abundante de receptores de CSPG en las OPC en desarrollo (Fig. 10B). Las células OPC/OL inmunoteñidas derivadas de cerebros de crías de ratón de tipo natural (día 1-2 postnatal) revelaron que PTPσ se expresó en los somas y procesos de células Olig2<+>inmaduras y CC1<+>maduras o proteína básica de mielina (MBP)<+>(Fig.10A y 10C). Los análisis de inmunotransferencia tipo Western también indicaron una regulación por incremento de PTPσ en la médula espinal lesionada de los modelos de desmielinización inducidos por EAE o LPC en el día 28 (EAE) y el día 7 (LPC) después de las inyecciones (Fig. 10D). En animales inducidos por EAE, también se realizó inmunotinción doble con anticuerpos contra PTPσ y el marcador de OPC, Olig2, para revelar un aumento de PTPσ co-marcado con OPC Olig2<+>en lesiones desmielinizantes (Fig. 10E). Estos hallazgos sugieren que PTPσ se expresa y se regula por incremento en células de linajes de oligodendrocitos después de enfermedad inducida por EAE o LPC, y que este receptor presenta una diana manejable para estudiar los efectos de CSPG y/o manipulaciones de receptor en modelos de EM.

[0253] La modulación de PTPσ con ISP promueve la recuperación funcional y la remielinización en un modelo animal de EAE A continuación, probamos el péptido sigma intracelular (ISP) en un modelo de ratón de EAE, que recapitula los procesos de enfermedad de desmielinización progresiva crónica. Siguiendo la inmunización con MOG<35-55>, los animales recibieron inyecciones de ISP intraperitoneales (20 μg/ratón, diariamente) durante 41 días al principio (inicio de ISP de EAE) o el pico de enfermedad (pico de ISP de EAE) determinado por puntuación clínica (Fig. 1A). Al grupo de control se le inyectó un vehículo de DMSO al 5 % en paralelo. La recuperación funcional se observó inicialmente en el grupo de inicio después de ~10-12 días de la administración de ISP (es decir, el día 23 después de la inmunización). ISP mejoró las puntuaciones clínicas de 3,5-4 (parálisis grave) a 2-1,5 (cola flácida y debilidad de extremidades traseras). Después de 20-22 días de tratamiento con ISP (~33 días después de la inmunización), varios animales en el grupo de inicio se recuperaron con puntuaciones clínicas que mejoraron a 0,5-1 (cola flácida) (Fig. 1B y 1C). En cambio, los animales de control permanecieron gravemente paralizados con puntuaciones que permanecieron alrededor de 3,5-4. Los animales con pico de ISP de EAE también mejoraron significativamente con el tratamiento con ISP; sin embargo, el ISP administrado al inicio de la enfermedad permitió una mejor recuperación de las patas traseras (Fig. 1B y 1C). Estas mejoras también se correlacionaron estrechamente con mejoras histológicas. Los tamaños de las lesiones se redujeron especialmente en los animales tratados al inicio como se indica mediante la tinción de mielina con LFB (Fig. ID e IE). Por el contrario, la inmunotinción de MBP fue más densa en animales tratados con ISP durante 41 días en comparación con animales con EAE de control (Fig. 1F). La inmunotransferencia tipo Western de las isoformas de la proteína MBP también mostró la restauración de la expresión de MBP en ratones tratados con ISP (Fig.1G). Los análisis ultraestructurales revelaron un aumento de axones mielinizados/remielinizados en la médula espinal lesionada con EAE en los ratones tratados con ISP en comparación con los controles (Fig. 1H). El análisis cuantitativo confirmó un aumento de axones mielinizados/remielinizados en el grupo tratado con ISP (Fig. 1I) y la relación G, que indica el espesor de mielinización normalizando el diámetro de mielinización por el diámetro del axón, fue menor en el grupo tratado con ISP en comparación con el grupo tratado con vehículo (Fig.1J). De manera importante, nuestros resultados sugieren que ISP actuó para potenciar la regeneración de mielina en lugar de prevenir la desmielinización, especialmente dado que las líneas de base de desmielinización (LFB) a los 18 días después de la inducción de EAE no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos en esta etapa temprana de progresión de la enfermedad (Fig.12E y 12F).

[0255] El tratamiento con ISP se asocia con una reducción de la expresión de CSPG en lesiones desmielinizadas a lo largo del tiempo, así como una respuesta inflamatoria alterada en EAE

[0257] Además de las observaciones de que los CSPG disminuyeron notablemente después del tratamiento con ISP de animales inducidos por EAE (Fig. 4A, Cat301), también encontramos dinámicas de macrófagos alteradas en los mismos animales. Para empezar, los macrófagos (Iba1) parecían colocalizarse con agrecano (Cat301) especialmente en la sustancia blanca (Fig. 4A), lo que puede deberse a que los macrófagos activados depositan o, más probablemente, fagocitan agrecano, que no se sabe que produzcan. Adicionalmente, observamos una disminución de la inmunotinción de Iba1, así como una disminución de las cantidades de agrecano dentro de macrófagos Iba1<+>en animales con EAE tratados con ISP en comparación con los controles (Fig. 4A). Realizamos una cuantificación adicional de Iba1 y GFAP a los 41 días después de la inducción de EAE y observamos disminuciones significativas tanto en microglía/macrófagos como en astrocitos reactivos respectivamente después del tratamiento con ISP (Fig. 4A y 4B). Un informe reciente de que la modulación de las fosfatasas de receptor de la familia LAR con péptidos sintéticos, incluyendo ISP, sesgaba microglía/macrófagos hacia una polarización M2 después de una lesión de la médula espinal. De hecho, la inmunotinción para marcadores que identifican la polarización de macrófagos M1 (iNOS) y M2 (Arginasa-1) reveló evidencia de apoyo de que el tratamiento con ISP modula el entorno inflamatorio en animales con EAE (Fig. 4C y 4D). Cabe destacar que, mientras que la microglía/macrófagos parecen producir PTPσ después de la lesión, los astrocitos reactivos no lo hacen.

[0259] ISP mejora la tasa de reparación de mielina en la desmielinización inducida por LPC

[0261] A continuación, preguntamos si la modulación de ISP de las interacciones PTPσ-CSPG tiene efectos similares en la desmielinización focal aguda inducida por LPC inyectada en la sustancia blanca de la columna dorsal de ratones C57BL6/J adultos jóvenes tratados con ISP (20 μg/día, subcutáneo) o vehículo de control que comienza 1 día después de la inyección de LPC. Después del tratamiento de ISP, Los volúmenes de lesión inducida por LPC se redujeron significativamente en los 14 y 21 días después de la lesión (dpl) en comparación con los animales tratados con vehículo como se muestra mediante la tinción de mielina con LFB (Fig.2A y 2B). Como se indica en las Fig.2A-2G, los animales tratados con vehículo tenían un volumen de lesión promedio de 1,508±0,069 mm<3>, 1,035±0,06 mm<3>y 0,738±0,027 mm<3>después de 7, 14 o 21 dpl, respectivamente. En cambio, los animales tratados con ISP mostraron un volumen de lesión reducido de un promedio de 1,535±0,058 mm<3>a 7 dpl a 0,613±0,043 mm<3>a 14 dpl (Fig. 2B). En 21 dpl, encontramos una reparación extensa de lesiones y volúmenes de lesiones reducidos en ratones tratados con ISP (1,535±0,058 mm<3>a 0,2±0,041 mm<3>) (Fig. 2B). La inmunotinción indicó consistentemente una mayor expresión de MBP en lesiones de LPC de ratones tratados con ISP en comparación con ratones tratados con vehículo después de 14 y 21 dpl (Fig. 2C). El análisis de inmunotransferencia tipo Western cuantitativo confirmó una mayor expresión de MBP en animales lesionados por LPC después del tratamiento con ISP en 14 dpl (Fig. 2D). Finalmente, el análisis ultraestructural confirmó el número de axones remielinizados en ratones tratados con ISP en 14 dpl en comparación con los controles (Fig. 2E y 2F). De acuerdo con estos resultados, los análisis cuantitativos de la relación G entre los ratones tratados con ISP y los tratados con vehículo revelaron un mayor grosor de las vainas de mielina en los ratones tratados con ISP en 14 dpl (Fig. 2G). Estos experimentos mostraron que el tratamiento con ISP aceleró la tasa de reparación de mielina in vivo.

[0262] Para visualizar mejor la capacidad de ISP para impactar en las OPC y la remielinización posterior, utilizamos un modelo ex vivo bien establecido de cultivo de cortes de cerebelo de ratón mielinizante derivado de crías de 8-10 días postnatales tratados con LPC al 0,1 % durante 17-18 horas para inducir la desmielinización. Encontramos que los cultivos de cortes sin tratamiento previo desarrollaron abundantes axones mielinizados como se muestra por la colocalización de MBP y neurofilamento (NF200) (Fig. 3 A, Con). El tratamiento de LPC, sin embargo, provocó una desmielinización profusa con la producción de mielina punteada y desorganizada (Fig.3 A, 1 día in vitro (div)). Después de 8 div, el fenotipo desmielinizado aún era prominente y la remielinización se retrasó en los cortes de LPC tratados en comparación con el vehículo (Fig. 3A, LPC+Veh, 8 div). En cambio, los cortes desmielinizados con LPC tratados con ISP durante 8 div mostraron una mayor remielinización (Fig. 3A, LPC+ISP, 8 div) en comparación con el tratamiento con vehículo. Aunque se observó un aumento de la expresión de MBP en cortes tratados con vehículo en 14 div después del tratamiento con LPC, la expresión de MBP aún estaba desorganizada y no se colocalizaba bien con los axones (Fig. 3A, LPC+Veh, 14 div). Sin embargo, el tratamiento con ISP durante 14 div dio como resultado abundantes axones remielinizados (Fig. 3A y 3B, LPC+ISP, 14 div), lo que se confirmó con análisis de inmunotransferencia tipo Western y cuantificación (Fig. 3C). Estos experimentos de cultivo de cortes confirman que después del tratamiento con LPC, ISP mejora la tasa de remielinización tal vez influyendo directamente en las OPC o posiblemente también en la microglía/macrófagos.

[0264] Curiosamente, esta tasa de remielinización potenciada por ISP se correlacionó con una disminución de la presencia de agrecano (Cat301) en 8 div en nuestros cultivos de cortes de cerebelo (Fig. 11A y 11B), aunque la expresión de agrecano fue similar entre los grupos de ISP y vehículo a 4 div (Fig.11A y 11B). En 14 div, observamos remielinización simultánea a través de la tinción de MBP y una disminución de la expresión de CSPG en ambos grupos, aunque los cortes tratados con ISP habían mejorado la expresión de MBP y una mayor disminución de CSPG.

[0266] Para investigar adicionalmente si los CSPG se ven afectados por el tratamiento con ISP, se realizó doble inmunotinción para MBP y CSPG en animales inyectados con LPC. Los animales de control lesionados por LPC mostraron niveles regulados por incremento de GAG-CSPG (CS56) y agrecano (Cat301) que se correlacionó inversamente con una expresión disminuida de MBP en 14 dpl (Fig.4B). En cambio, los animales tratados con ISP mostraron una reducción más rápida de los CSPG (CS56 y Cat301) y una expresión de mielina potenciada en comparación con los controles (Fig. 4B y 4D). Es importante tener en cuenta que, si bien la reparación de mielina normalmente ocurre en animales lesionados por LPC, la degradación de CSPG es mucho más lenta que la que se produce después del tratamiento con péptido (Supp. Fig. 3A y 3B). Por tanto, encontramos que el tratamiento con ISP no solo mejoró la tasa de reparación de mielina, sino que se asoció con una expresión de CSPG más rápidamente reducida a lo largo del tiempo.

[0268] En animales inyectados con LPC, la inmunotinción con versicano fue más fuerte en la penumbra de la lesión donde se hallaban los astrocitos reactivos (GFAP<+>) (Fig. 4C). Este patrón de deposición de CSPG confirma los hallazgos recientemente informados de una mayor secreción de versicano por los astrocitos reactivos. También examinamos células inflamatorias y astrocitos en lesiones por LPC localmente desmielinizadas y alteramos el momento del tratamiento con ISP para comenzar nuestra investigación del mecanismo o mecanismos subyacentes a la disminución de la expresión de CSPG después del tratamiento con ISP. Inmediatamente (en lugar de un retraso de 1 día) tras la inyección de LPC, los ratones recibieron ISP (20 μg día/ratón, subcutáneo) durante 7 días. La tinción del epicentro de la lesión no reveló cambios en la cantidad de microglía activada (Iba1), astrocitos reactivos (GFAP) o expresión de proteína de mielina MBP entre animales tratados con ISP y grupos de control en esta etapa temprana (Fig. 4C y 4D). Esto sugiere que la extensión de la lesión inducida por LPC fue inicialmente similar entre los grupos de ISP y de control. De nuevo, la tinción con agrecano se colocalizó con macrófagos Iba1<+>(Fig.4C). Sin embargo, la expresión de CSPG (CS56, Cat301) se redujo significativamente después del tratamiento con ISP, lo que sugiere que ISP puede estar involucrado en la degradación potenciada de CSPG en lesiones desmielinizantes.

[0270] La reducción de CSPG por ISP mejora la supervivencia, la diferenciación y la migración de las de OPC

[0272] La desinhibición de CSPG inducida por ISP podría dar como resultado una remielinización mejorada al regular la proliferación, supervivencia, diferenciación o migración de las OPC. Para distinguir entre estas posibilidades, comenzamos con la cuantificación de las OPC en proliferación mediante inmunotinción con anticuerpos Olig2 y Ki67 en la lesión de LPC en 7 dpl. Encontramos que el porcentaje de OPC Olig2<+>aumentaron significativamente en las lesiones de los ratones tratados con ISP en comparación con los ratones tratados con vehículo (Fig. 13A y 13B), pero no encontramos diferencias en células Olig2<+>/Ki67<+>entre los grupos (Fig. 13B). Para examinar adicionalmente los efectos sobre la proliferación de OPC por ISP, tratamos con péptido las OPC cultivadas durante 2 div en una concentración baja de laminina (1 μg/ml) y agrecano (2 μg/ml) y no encontramos diferencias significativas en las tasas de proliferación entre los grupos tratados y de control (Fig. 13C y 13D). Para investigar si la apoptosis de las OPC se vio afectada por los CSPG, realizamos tinción TUNEL de OPC también cultivadas en bajas concentraciones de laminina y agrecano y encontramos que el tratamiento con ISP disminuyó el porcentaje de células apoptóticas (Fig. 13E y 13F). ISP también disminuyó la muerte de OPC cuando las OPC cultivadas de manera similar se expusieron a LPC (1 μg/ml, 2 horas) (Fig. 13E y 13F).

[0274] Para examinar los efectos del tratamiento con ISP en la diferenciación de las OPC, cuantificamos el número de oligodendrocitos CC1<+>diferenciados tanto en animales con EAE tratados con ISP (41 dpl) como en animales inyectados con LPC (14 dpl). El porcentaje de oligodendrocitos CC1<+>se potenciaron significativamente en las lesiones de los ratones tratados con ISP en comparación con los controles (Fig.14A-14D). También se confirmó la maduración de OPC mejorada por ISP in vitro con OPC inmunopurificadas (ratones P1-2 TN) cultivadas en cubreobjetos recubiertos previamente con agrecano y laminina. La inmunotinción de las OPC tempranas (O4<+>) y OL maduros (MBP<+>) mostraron que los CSPG redujeron la maduración progresiva de las OPC como se observa a través de longitudes de proceso reducidas de células que expresan 04 y MBP cultivadas en CSPG en comparación con OPC cultivadas en sustratos de control que no son CSPG (Fig. 14E y 14F). El crecimiento del proceso y la maduración de las OPC cultivadas en CSPG se rescataron en gran medida con el tratamiento con ISP (cuantificado analizando huellas MBP<+>de células cultivadas en CSPG con o sin tratamiento con ISP) (Fig. 14E y 14G). Estos hallazgos indican que ISP puede estar mejorando la supervivencia y la diferenciación, en lugar de la proliferación, de OPC en lesiones desmielinizadas.

[0275] ISP también puede estar promoviendo la migración de OPC al sitio de lesión donde pueden sobrevivir y posteriormente diferenciarse en sus formas mielinizantes. Para explorar los efectos de CSPG/receptor en la migración de OPC, utilizamos explantes de médula espinal derivados de crías P2 TN cultivados en nuestro ensayo de punto de gradiente de CSPG que se ha utilizado previamente como un posible modelo in vitro de la distribución de gradiente inhibitorio de los CSPG que se encuentran en las cicatrices gliales. Las OPC tempranas tratadas con ISP (PDGFRα<+>) y premaduras (O4<+>) derivadas del explante pudieron cruzar el borde externo enriquecido con CSPG del punto de gradiente. En los explantes de control, pocas células pudieron migrar a través de este territorio inhibidor (Fig.5A-5C). Por tanto, además de aliviar la apoptosis relacionada con CSPG y los defectos de maduración, ISP también puede estar promoviendo la migración de OPC al sitio de lesión donde pueden sobrevivir y posteriormente diferenciarse en sus formas mielinizantes maduras. Estas observaciones, tomadas junto con la reducción de los CSPG tanto en el cultivo de cortes (Fig. 11A y 11B) como modelos in vivo de EM (Fig. 4A-4D) después del tratamiento con ISP nos llevan a plantear la hipótesis de que dirigirse a PTPσ a través de ISP induce una mayor secreción o activación de proteasas endógenas.

[0277] El tratamiento con ISP mejora la digestión enzimática dependiente de proteasa de los CSPG

[0279] Además de las observaciones de expresión reducida de CSPG en modelos de desmielinización ex vivo e in vivo tratados con ISP, notamos que las OPC PDGFRα<+>tratadas con ISP dejaron "sombras" de áreas de GAG-CSPG posiblemente digeridas donde se infiltraron en el borde de agrecano de nuestros ensayos de puntos (Fig.5D, flechas). Todo el borde de proteoglicanos externo también se redujo en diámetro en presencia de ISP (Fig. 5D, comparar anchuras de borde). Para comenzar a investigar si se estaba produciendo actividad proteasa, volvimos a nuestro ensayo de puntos para caracterizar mejor la supuesta degradación de agrecano. Los medios acondicionados (CM) se recogieron de OPC inmunopurificadas tratadas con vehículo, ISP o SISP (ISP aleatorizado) y se depositaron en puntos recién hechos. El CM de OPC tratadas con ISP redujo significativamente la expresión de CS56 en comparación con los controles de vehículo o de péptido aleatorizado, así como con un control sin células (Fig.16A-16C). Curiosamente, la porción de laminina del punto se salvó por completo como se visualiza mediante inmunotinción (Fig. 16D y 16E). También confirmamos estos resultados con análisis de inmunotransferencia tipo Western de CM de OPC incubados con agrecano (20 μg/ml) y laminina (10 μg/ml) recogidos de OPC tratadas con vehículo, ISP o SISP presente (Fig.5E-5G).

[0281] Para caracterizar independientemente la inducción por ISP de la actividad proteasa de las OPC, realizamos un ensayo de actividad enzimática general (kit EnzChek) basado en la fluorescencia de caseína extinguida y descubrimos que el tratamiento con ISP de las OPC, de hecho, aumentó la actividad proteasa (U.A. de fluorescencia) en comparación con controles de vehículo y SISP (Fig. 5H y 5I). Además, ISP aumentó la digestión de agrecano de una manera dependiente de la dosis como se visualiza a través de análisis de inmunotransferencia tipo Western del tratamiento con ISP de CM de OPC incubado con agrecano (Fig. 16G y 16H).

[0283] ISP aumenta la actividad proteasa y en particular la secreción de MMP-2 para mejorar la migración y remielinización de OPC

[0285] Para comenzar a identificar qué proteasas críticas puede estar regulando ISP, incubamos vehículo o CM de OPC tratado con ISP con una transferencia de matriz de proteasa. Encontramos una señal aumentada para diversas enzimas que pertenecen a varias clases de proteasas (por ejemplo, AD AMTS, calicreínas, catepsinas, MMP) en el grupo de tratamiento con ISP que son potencialmente (si se producen en cantidades suficientes) capaces de digerir los CSPG (Fig. 15). Curiosamente, se redujeron tres proteasas degradantes de laminina, tales como las catepsinas L y V y MMP-10, lo que sugiere cierto nivel de especificidad en la regulación de la cascada enzimática que está vinculada con la modulación de PTPσ. Este resultado puede ayudar a explicar por qué hemos observado la expresión de laminina sin cambios en nuestros ensayos in vitro tratados con ISP (Fig. 5E, 5G, 16D y 16E). Para confirmar los resultados de nuestra matriz de proteasas, realizamos análisis de inmunotransferencia tipo Western de múltiples proteasas reguladas por incremento, incluidas MMP-2, 9 y catepsina B en CM de OPC tratadas con ISP o de control y encontramos que MMP-2 era fácilmente detectable y claramente mejorado después del tratamiento con ISP (Fig. 6C y 6D). La tinción de OPC cultivadas mostró que MMP-2 se expresa en OPC O4<+>dentro de sus procesos y parece intensificarse después del tratamiento con péptido (Fig. 6H).

[0287] Para confirmar que la actividad de MMP-2 derivada de CM de OPC se potencia mediante el tratamiento con ISP, realizamos zimografía de gelatina y descubrimos que la actividad de degradación de gelatina de MMP-2 aumentó significativamente tras el tratamiento con ISP sobre los controles (Fig. 6A y 6B). La actividad de MMP-9 fue apenas visible por zimografía de gelatina (Fig.6A) y no se detectó por análisis de inmunotransferencia tipo Western (datos no mostrados). También se sometió a inmunotransferencia para MMP-10, una proteasa que degrada la fibronectina, laminina y elastina, y se descubrió que se secreta en cantidades mucho más bajas que la MMP-2 (Fig.6C). Los cultivos de OPC tratadas con vehículo, ISP y SISP parecen secretar MMP-10 en cantidades igualmente bajas (Fig. 6C y 6E), lo que sugiere que la secreción de MMP-2 potenciada por ISP puede ser específica de la modulación de PTPσ. Además del CM de OPC tratado con ISP, los lisados de OPC también se analizaron mediante inmunotransferencia tipo Western y mostraron una disminución de la expresión de MMP-2 normalizada con respecto al control de carga de GAPDH, lo que sugiere que la secreción de MMP-2 puede potenciarse por ISP (Fig.6F). Para probar esto, incubamos agrecano con CM de OPC tratado con un inhibidor de exocitosis, Exol (10 μg/ml), junto con ISP. A concentraciones suficientes, se ha observado que Exo1 inhibe reversiblemente la exocitosis a través de su inhibición de la Arf GTPasa. Encontramos que Exo1 rescató parcialmente la digestión con GAG de agrecano (Fig. 6I y 6J). También realizamos el mismo experimento con un inhibidor de MMP amplio, GM6001 (25 μM) y un inhibidor específico de MMP-2 (OA-Hy, Calbiochem, 100 nM) con ISP y encontramos que la digestión con GAG se rescató parcialmente en ambos casos, lo que indica que la degradación de CSPG inducida por ISP puede muy bien ser perpetrada por la familia de metaloproteasas y MMP-2 predominantemente (Fig. 6I y 6J). GM6001 y un inhibidor de MMP-2 rescataron adicionalmente la degradación de puntos de CS56 (Fig.17A-17D).

[0289] Volvimos al ensayo de puntos para probar si la inhibición de MMP disminuye la migración de las OPC a través del borde de CSPG. El tratamiento de las OPC con GM6001 (25 μM) y el inhibidor específico de MMP-2 (OA-Hy, 100 nM) detuvo eficazmente la entrada de OPC en el área rica en CSPG incluso en presencia de ISP (Fig. 7A y 7B). Esto sugiere que la inducción con ISP de la migración de OPC potenciada puede depender de las MMP. Finalmente, para probar la necesidad funcional de las MMP en la remielinización, tratamos cortes de cerebelo desmielinizados con LPC con GM6001 o el inhibidor específico de MMP-2 junto con ISP. La colocalización de MBP y axones neurofilamento<+>se redujo, de hecho, con GM6001 y el tratamiento con inhibidor de MMP-2 a pesar de la presencia de ISP (Fig. 7C y 7D). Además, la inhibición 2 div de MMP-2 en OPC expuestas a LPC (1 μg/ml, 2 horas) cultivadas en bajas concentraciones de agrecano y laminina eliminó los efectos de promoción de la supervivencia de ISP según se evaluó a través de la tinción TUNEL (Fig. 17E). El inhibidor de MMP-2, sin embargo, no pareció aumentar la apoptosis en comparación con el control de vehículo con agrecano/laminina solo (Fig. 17E). La inhibición específica de MMP-2 anuló adicionalmente las ganancias en huellas de MBP de oligodendrocitos maduros cultivados en bajas concentraciones de agrecano/laminina (Fig. 17F y 17G).

[0291] Para aclarar aún más la necesidad de la actividad de MMP-2 después del tratamiento con ISP para mejorar la remielinización, utilizamos una construcción de ARNhp suministrado por partículas lentivirales. En primer lugar, validamos este enfoque de ARNhp usando administración lentiviral, así como análisis tipo Western para atenuar MMP-2 en cultivos de OPC infectados durante 48 horas (Fig.18A). La atenuación de ARNhp de MMP-2 fue capaz de reducir el área de procesos MBP<+>extendidos de OL cultivados en agrecano in vitro (Fig. 18B y 18C) y la capacidad de las OPC para migrar más allá de una barrera de alto contenido de agrecano (Fig. 18D y 18E) a pesar del tratamiento con ISP. Como era de esperar, la atenuación ARNhp de MMP-2 también atenuó la remielinización inducida por ISP en cultivos de cortes de cerebelo (Fig. 7E y 7F).

[0293] A continuación, caracterizamos la expresión de MMP-2 in vivo usando inmunohistoquímica y encontramos que mientras la columna dorsal de la médula espinal sin tratamiento previo expresaba una línea de referencia de alguna proteína MMP-2, la inyección de LPC en la misma área aumentó algo la expresión de MMP-2 en 14 dpl (Fig.8A y 8B). Sin embargo, el tratamiento con ISP mejoró notablemente la expresión de MMP-2 en el sitio inyectado con LPC, que también se confirmó con análisis de inmunotransferencia tipo Western de las áreas de la médula espinal afectadas (Fig.8C). La inmunotinción de médulas desmielinizadas con LPC tratadas con ISP mostró que MMP-2 se colocalizaba con OPC identificadas con Olig2 (Fig. 8D), pero también con células inmunitarias marcadas con Iba1 (Fig. 8E). Para explorar adicionalmente la necesidad de la actividad de MMP-2 en la remielinización potenciada por ISP, volvimos al modelo de LPC y analizamos el volumen de la lesión después de la tinción de mielina en 18 dpl (Fig.8F y 8G) con un inhibidor de MMP-2 (OA-Hy) o una construcción de ARNhp dirigida a MMP-2 administrada con partículas lentivirales. Curiosamente, la inhibición farmacológica de MMP-2 aumentó el volumen de la lesión con respecto al control de vehículo, lo que sugiere que los niveles de referencia de MMP-2 pueden estar facilitando la remielinización lenta en este modelo. La adición de inhibición farmacológica de MMP-2 o atenuación mediada por ARNhp de MMP-2 atenuó los efectos remielinizantes potenciados de ISP que se correlacionaron con un aumento concomitante en la inmunorreactividad de CS56 (Fig. 19A y 19B) y disminuyó la acumulación de las OPC Olig2<+>en el epicentro de la lesión (Fig. 19C y 19D). En conjunto, estos resultados indican la importancia de la secreción de MMP-2 regulada por PTPσ por las OPC, pero también posiblemente microglia, para ayudarlas en su migración y capacidad de remielinización a pesar de la alta deposición de CSPG después de una lesión desmielinizante focal.

[0295] Análisis

[0297] Hemos aclarado un papel crítico para el receptor PTPσ de CSPG después de su modulación en la restauración de la homeostasis de las OPC en una variedad de modelos de EM donde la deposición de proteoglicanos durante la formación de cicatriz asociada a la lesión inhibe potencialmente la migración, diferenciación y remielinización de las OPC. Como se describe en el presente documento, dirigirse a PTPσ con un péptido administrado sistémicamente mejora la tasa de reparación de mielina en lesiones inducidas por LPC y estimula la regeneración robusta de mielina y la recuperación funcional después de la EAE desmielinizante crónica. Estos datos muestran un enlace novedoso entre la modulación de PTPσ con polarización inmunitaria alterada y la actividad proteasa potenciada. Esto subraya el papel importante que desempeñan los CSPG después de las enfermedades desmielinizantes del SNC e identifica una estrategia que puede dirigirse a las lesiones de EM ampliamente en todo el neuroeje para aliviar la inhibición mediada por CSPG.

[0299] Los mecanismos posteriores que siguen a la modulación peptídica del receptor PTPσ que permiten que las células superen la inhibición de CSPG son en gran parte desconocidos. La actividad proteasa está fuertemente regulada en varios niveles, incluida la transcripción, traducción, secreción, localización, activación e inhibición para evitar sin restricciones, la actividad potencialmente dañina. Dejadas sin control, las proteasas pueden degradar una amplia gama de proteínas con resultados potencialmente desastrosos como se observa en las "tormentas de proteasas" después de una variedad de lesiones del SNC. En la fase recidivante de la EM, la regulación por incremento de proteasa no específica asociada con inflamación rampante y degeneración de mielina se ha caracterizado bien. Sin embargo, los efectos beneficiosos de la secreción de proteasa finamente regulada después de una lesión para promover la reparación tisular son cada vez más apreciados. En este caso, presentamos un hallazgo novedoso que vincula la modulación de PTPσ con la actividad proteasa de MMP-2 mejorada por las OPC, que ayuda en su digestión a través de la placa desmielinizada cargada de CSPG que envuelve la lesión similar a la EM. A través de ensayos in vitro, ex vivo e in vivo, hemos identificado (en parte) la necesidad de la actividad de MMP-2 a través de la modulación de PTPσ no solo para la migración de las OPC sino también para mejorar la supervivencia, maduración y remielinización de las OPC. La regulación por incremento de MMP-2 se ha identificado previamente para permitir que las células madre invadan las regiones que contienen CSPG de la cicatriz glial y mejoren la remielinización de los axones periféricos por las células de Schwann en cultivo. Observamos el ahorro de laminina y la degradación concomitante de CSPG con el tratamiento con ISP, que puede ser un mecanismo por el cual las OPC pueden infiltrarse y sobrevivir a lesiones desmielinizadas densas en CSPG. Esto destaca la regulación precisa de las proteasas por las OPC y, posiblemente, las células inmunitarias, a través de PTPσ para promover la degradación controlada de CSPG.

[0301] Además, nuestro estudio confirma esta modulación de macrófagos en un modelo de EAE tratado con péptido de EM donde observamos disminuciones en la carga de CSPG, así como el marcador de fenotipo de macrófagos Ml destructivo iNOS y aumentos en la Arginasa-1 asociada a M2.

[0303] Nuestro estudio sugiere que ISP puede mejorar notablemente la capacidad fagocítica microglial. Al modular el receptor afín de los CSPG, las OPC y la microglía pueden estar trabajando juntas para eliminar más rápidamente los CSPG inhibidores y otros restos celulares. Por tanto, al alterar el entorno proinflamatorio hacia un estado M2 e inducir actividad proteasa focal por células selectivas, ISP puede proporcionar desinhibición de CSPG adicional, culminando en la regeneración de la mielina.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Un agente terapéutico para su uso en un método para potenciar la migración, la diferenciación, la proliferación y/o la maduración de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el agente terapéutico un péptido terapéutico, teniendo el péptido terapéutico una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 65 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33, en donde el sujeto tiene o está en riesgo de un trastorno relacionado con la mielina.

2. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33.

3. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 2, en donde el péptido terapéutico comprende una sustitución conservadora de al menos uno de un residuo 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12 o 13 de SEQ ID NO: 32.

4. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 3, en donde el residuo de aminoácido 4E está sustituido por D o Q, el residuo de aminoácido 5R está sustituido por H, L o K, el residuo de aminoácido 6L está sustituido por I, V o M, el residuo de aminoácido 7K está sustituido por R o H, el residuo de aminoácido 9N está sustituido por E o D, el residuo de aminoácido 10D está sustituido por E o N, el residuo de aminoácido 12L está sustituido por I, V o M, y/o el residuo de aminoácido 13K está sustituido por R o H.

5. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 2, en donde el péptido terapéutico comprende una sustitución conservadora de al menos uno de un residuo 7, 8, 9, 10, 12 o 13 de SEQ ID NO:33.

6. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 5, en donde el residuo de aminoácido 7E está sustituido por D o Q, el residuo de aminoácido 8R está sustituido por H, L o K, el residuo de aminoácido 9L está sustituido por I, V o M, el residuo de aminoácido 10K está sustituido por R o H, el resto de aminoácido 12N está sustituido por E o D, y/o el resto de aminoácido 13D está sustituido por E o N.

7. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 1, comprendiendo el péptido terapéutico una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-25, 32 y 33.

8. El agente terapéutico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el agente terapéutico comprende un resto de transporte que está unido al péptido terapéutico y facilita la absorción del péptido terapéutico por la OPC.

9. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 8, en donde el resto de transporte es un resto de transporte Tat de VIH.

10. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el resto de transporte está unido al péptido terapéutico mediante un enlazador peptídico.

11. El agente terapéutico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el agente terapéutico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34-60.

12. El agente terapéutico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el agente terapéutico se formula para la administración sistémica al sujeto que se está tratando.

13. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 1, en donde el trastorno relacionado con la mielina comprende al menos uno de los trastornos mielinoclásticos, trastornos leucodistróficos o enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso periférico.

14. El agente terapéutico para su uso de la reivindicación 13, en donde el trastorno relacionado con la mielina es esclerosis múltiple.