ES3057272T3 - Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and their therapeutic use - Google Patents

Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and their therapeutic use

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ES3057272T3
ES3057272T3 ES17203533T ES17203533T ES3057272T3 ES 3057272 T3 ES3057272 T3 ES 3057272T3 ES 17203533 T ES17203533 T ES 17203533T ES 17203533 T ES17203533 T ES 17203533T ES 3057272 T3 ES3057272 T3 ES 3057272T3
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ox40l
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Frank Kamiel Delphina Verdonck
Sigrid Cornelis
Stephanie Staelens
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Ablynx NV
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Abstract

La presente invención se refiere a secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina dirigidas contra (tal como se define en el presente documento) OX40L, así como a compuestos o construcciones, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden o consisten esencialmente en una o más de dichas secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina. En particular, estas secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina pueden bloquear la unión de OX40L a OX40. Los dominios variables únicos de inmunoglobulina, compuestos y construcciones pueden utilizarse con fines profilácticos, terapéuticos o diagnósticos, como el tratamiento de enfermedades o trastornos inflamatorios como, por ejemplo, asma, asma alérgica, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal o artroesclerosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpos de dominio variable único de inmunoglobulina contra OX40L, construcciones y su uso terapéuticoCAMPO DE LA INVENCIÓN
[0003] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a OX40L, así como a compuestos o construcciones, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden o consisten esencialmente en uno o más de dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina (también denominados en el presente documento"secuencias de aminoácidos de la invención", "compuestos de la invención"y"polipéptidos de la invención", respectivamente). La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina y polipéptidos (también denominados en el presente documento"ácidos nucleicos de la invención"o"secuencias de nucleótidos de la invención");a métodos para preparar dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina y polipéptidos; a células hospedadoras que expresan o son capaces de expresar dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina o polipéptidos; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas, que comprenden dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina, polipéptidos, ácidos nucleicos y/o células hospedadoras; y a usos de dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina o polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras y/o composiciones, en particular con fines profilácticos, terapéuticos o diagnósticos, tales como los fines profilácticos, terapéuticos o diagnósticos mencionados en el presente documento.
[0004] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0005] Las enfermedades alérgicas han alcanzado proporciones epidémicas en todo el mundo y se acepta generalmente que están aumentando. Los síntomas de alergia se tratan eficientemente con fármacos baratos de moléculas pequeñas en la mayoría de los pacientes, pero ninguno es curativo. Sin embargo, existe una clara necesidad médica insatisfecha para los pacientes que padecen asma persistente. El tratamiento de referencia actual para enfermedades inflamatorias incluye medicamentos inmunosupresores o inmunomoduladores tales como (pero sin limitación) corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, antagonistas de TNF-alfa, agonistas o antagonistas de (receptores de) citocinas. El tratamiento de referencia actual para el asma alérgica incluye corticosteroides inhalados o administrados sistémicamente en combinación con agonistas Beta-2 inhalados (de acción larga o corta), posiblemente combinados con medicamentos tales como (pero sin limitación) antagonistas del receptor de leucotrieno, teofilina, cromolina, nedocromilo.
[0006] La introducción de anticuerpos monoclonales y receptores de citocinas solubles está revolucionando los enfoques para el tratamiento del asma y la alergia. La introducción exitosa de omalizumab (anti-IgE) para el asma alérgica grave ha estimulado un gran interés en este enfoque, pero incluso con este anticuerpo monoclonal humanizado, los análisis de rentabilidad están restringiendo su uso a pesar de que ha pasado el escrutinio por agentes tales como el National Institute of Health & Clinical Excellence en el Reino Unido. Además, porciones sustanciales de la población potencial de pacientes con asma tienen niveles de IgE superiores a los que se pueden neutralizar con éxito con la molécula actual. Se requiere un inhibidor más potente para estos, y se han hecho intentos para producir dicha molécula.
[0007] La comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad alérgica ha estimulado el desarrollo adicional de una serie de productos biológicos dirigidos hacia células y moléculas críticas. Debido a las funciones de centinela de las células Th2 y sus productos, las citocinas Th2, en orquestar la inflamación alérgica, ellas y sus receptores son dianas terapéuticas clave. Uno de estos es el miembro de la familia TNF "OX40L" (Revisión: Michael J. Gough et al., Therapeutic Targets of the TNF Superfamily, editado por Iqbal S. Grewal, 2007). OX40L y anticuerpos contra OX40L que son capaces de interrumpir la unión de OX40L a su receptor OX40 (y, por lo tanto, de inhibir la cascada de señalización relevante) se mencionan, por ejemplo, en los documentos de patente WO95/12673, WO95/21915, WO99/15200, WO2006/029879, WO2005/094879 y WO2007/133290.
[0008] El documento de patente WO 2006/030220 A1 describe polipéptidos de anticuerpo que se unen monovalentemente a CD40L.
[0009] El documento de patente WO 2006/029879 A2 describe el mAb LC001 que también se usa como comparador en la sección experimental de la presente solicitud. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otra referencia a aspectos o realizaciones de la invención que no entran dentro de su alcance es solo para fines ilustrativos.
[0010] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
[0011] SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0012] Los dominios variables únicos, tales como Nanobodies y dAb y fragmentos de unión al antígeno derivados de los mismos, se usan ampliamente para dirigirse específicamente a sus respectivos antígenos en la investigación y aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, los Nanobodies y dAb carecen de la parte Fc y no inducirán el agotamiento mediado por la función efectora de células que expresan OX40L y, por lo tanto, la toxicidad potencial asociada con el agotamiento mediado por la función efectora no es relevante. Sin embargo, con el fin de compensar el aumento de eficacia mediante la función efectora del anticuerpo monoclonal de longitud completa (que carece de los dominios variables únicos tales como los Nanobodies), entonces existe la necesidad de un Nanobody de unión OX40L ultrapotente o construcción del mismo. Además, el grupo de pacientes con asma alérgica persistente grave que permanecen sintomáticos a pesar del tratamiento de referencia optimizado, requieren un uso significativo de los servicios de salud y están en riesgo de exacerbaciones graves, incluida la morbilidad. Por lo tanto, deben desarrollarse nuevas terapias para abordar estas necesidades claras e insatisfechas.
[0013] La invención ha superado las desventajas del estado de la técnica y aborda las necesidades médicas no satisfechas.
[0014] En particular, la invención se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a OX40L representado por SEQ ID NO: 175, en el que:
[0015] CDR1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135;
[0016] y
[0017] CDR2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149;
[0018] y
[0019] CDR3 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163,
[0020] en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 181, en el que, a los efectos de determinar el grado de identidad aminoacídica, se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las secuencias de CDR; y en el que preferentemente uno o más de los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los siguientes residuos aminoacídicos:
[0021] • en la posición 11: L, S, V, M, W, F, T, Q E, A, R, G, K, Y, N, P, I, preferentemente L,
[0022] • en la posición 37: F, Y, V, L, A, H, S, I, W, C, N, G, D, T, P, preferentemente F o Y,
[0023] • en la posición 44: E, Q, G, D, A, K, R, L, P, S, V, H, T, N, W, M, I, preferentemente G, E o Q, de la forma más preferida G
[0024] • en la posición 45: L, R, P, H, F, G, Q, S, E, T, Y, C, I, D, V preferentemente L o R,
[0025] • en la posición 47: F, L o W, G, I, S, A, V, M, R, Y, E, P, T, C, H, K, Q, N, D, preferentemente W, L o F, • en la posición 83: R, K, T, E, Q, N, S, I, V, G, M, L, A, D, Y, H, preferentemente K o R; de la forma más preferida K
[0026] • en la posición 84: P, S, H, L, A, V, I, T, F, D, R, Y, N, Q, G, E, preferentemente P
[0027] • en la posición 103: W, R, G, S, K, A, M, Y, L, F, T, N, V, Q, P, E, C, preferentemente W
[0028] • en la posición 104: G, A, S, T, D, P, N, E, C, L, preferentemente G
[0029] • en la posición 108: Q, L, R, P, E, K, S,T,M, A, H, preferentemente Q o L.
[0030] La invención también se refiere a un polipéptido que comprende o consiste esencialmente en uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, la invención se refiere a un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable único de inmunoglobulina o un polipéptido como se define en las reivindicaciones adjuntas, así como a una composición que comprende al menos un dominio variable único de inmunoglobulina, polipéptido o ácido nucleico o secuencia de nucleótidos como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, la invención también proporciona un método para producir un dominio variable único de inmunoglobulina o un polipéptido como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, el dominio variable único de inmunoglobulina, polipéptido o composición es para uso como medicamento, opcionalmente, para uso en la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad inflamatoria y/o trastorno, asma, asma alérgica, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal y/o arteriosclerosis como se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0032] La siguiente descripción se considera útil para comprender la invención.
[0034] Los polipéptidos y composiciones de la presente descripción se pueden usar generalmente para modular, y en particular inhibir y/o prevenir, la unión de OX40L a OX40, y así modular, y en particular inhibir o prevenir, la señalización que está mediada por OX40L y/u OX40, para modular las vías biológicas en las que están implicadas OX40L y/o OX40, y/o para modular los mecanismos, respuestas y efectos biológicos asociados con dicha señalización o estas vías.
[0036] Por consiguiente, los polipéptidos y composiciones de la presente descripción se pueden usar para la prevención y el tratamiento (como se definen en el presente documento) de trastornos inflamatorios tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica. En general, "trastornos inflamatorios tales como, por ejemplo, asma" se pueden definir como enfermedades y trastornos que se pueden prevenir y/o tratar, respectivamente, administrando adecuadamente a un sujeto que lo necesite (es decir, que tiene la enfermedad o trastorno o al menos un síntoma del mismo y/o en riesgo de atraer o desarrollar la enfermedad o trastorno) de un polipéptido o composición de la descripción (y, en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo) y/o de un principio activo conocido contra OX40L o una vía o mecanismo biológico en el que OX40L está implicado (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo). Ejemplos de dichos trastornos inflamatorios, tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica, serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento, y, por ejemplo, incluyen las siguientes enfermedades y trastornos: artritis reumatoide, asma, asma alérgica que incluye asma de moderada a grave, tal como, por ejemplo, asma persistente grave cuyos síntomas no están adecuadamente controlados con corticosteroides inhalados.
[0038] En particular, los polipéptidos y composiciones de la presente descripción se pueden usar para la prevención y el tratamiento de trastornos inflamatorios tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica que se caracterizan por señalización excesiva y/o no deseada mediada por OX40L o por la vía o vías en las que está implicado OX40L. Ejemplos de dichos trastornos inflamatorios, tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica (Gough, arriba), colitis crónica, tal como enfermedad de Crohn (Tostuka et al., 2003, Am J Physiol Gastrointest. Liver Physiol.284, G595-G603), enfermedad inflamatoria intestinal (Souza H S et al., 1999, Gut, 45, 856-863) y/o aterosclerosis (Olofsson P.S., 2008, Circulation, 117, 1291-1301) volverán a ser evidentes para el experto. Sin ser limitantes, otras enfermedades y/o trastornos asociados con OX40L incluyen un trastorno inmunitario y/o un trastorno autoinmunitario (tal como asma, asma alérgica, dermatitis atópica, rinitis alérgica, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, enfermedad injerto contra huésped (EICH) y/o lupus eritematoso sistémico); un trastorno asociado con virus, bacterias u otro agente infeccioso, por ejemplo, imunopatología inducida por virus, por ejemplo, patología inducida por infección con gripe o VRS o virus relacionados, por ejemplo, en el pulmón; artritis (artritis reumatoide aguda y crónica que incluye artritis reumatoide de aparición juvenil y etapas tales como sinovitis reumatoide, gota o artritis gotosa, artritis inmunológica aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno de tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, enfermedad de Still, artritis vertebral, osteoartritis, artritis crónica progresiva, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, artritis menopáusica, artritis por agotamiento de estrógenos y espondilitis anquilosante/espondilitis reumatoide); enfermedad linfoproliferativa autoinmunitaria, enfermedades inflamatorias de la piel hiperproliferativas, psoriasis tal como psoriasis en placas, psoriasis en gotas, psoriasis pustular y psoriasis de las uñas, atopia que incluye enfermedades atópicas tales como la fiebre del heno y el síndrome de Job, dermatitis que incluye dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis exfoliativa, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, ronchas, dermatitis herpetiforme, dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no específica, dermatitis de contacto irritante primaria y dermatitis atópica, síndrome de IgM hiperinmunitaria ligada a X, enfermedades inflamatorias intraoculares alérgicas, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmunitaria crónica, miositis, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistémica), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) tal como EM espinoóptica, EM progresiva primaria (PPMS) y EM remitente recurrente (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica (NMO), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales autoinmunes, inflamación gastrointestinal, colitis tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrosante y colitis transmural, y enfermedad inflamatoria intestinal autoinmune), inflamación intestinal, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, síndrome de dificultad respiratoria, que incluye síndrome de dificultad respiratoria aguda o del adulto (ARDS), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmune, enfermedad injerto contra huésped, angioedema tal como angioedema hereditario, daño del nervio craneal como en meningitis, herpes gestacional, penfigoide gestacional, prurito escrotal, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, pérdida repentina de la audición debido a una afección autoinmunitaria, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como la encefalitis de Rasmussen y la encefalitis límbica y/o del tronco encefálico, uveítis tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN mediada por inmunidad, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN membranoproliferativa o proliferativa membranosa (MPGN), incluidos los tipos I yII, y GN rápidamente progresiva (GNPR), nefritis proliferativa, insuficiencia endocrina poliglandular autoinmune, balanitis, incluyendo balanitis circunscripta plasmocelular, balanopostitis, eritema anular centrífugo, eritema discrómico persistente, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nítido, liquen escleroso y atrófico, liquen simple crónico, liquen espinuloso, liquen plano, ictiosis laminar, hiperqueratosis epidermolítica, queratosis premaligna, pioderma gangrenoso, afecciones y respuestas alérgicas, alergias alimentarias, alergias a fármacos, alergias a insectos, trastornos alérgicos raros tales como mastocitosis, reacción alérgica, eccema incluyendo eccema alérgico o atópico, eccema asteatósico, eccema dishidrótico y eccema palmoplantar vesicular, asma tal como asma bronquial, asma autoinmune, asma alérgica y asma pediátrico, afecciones que implican infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunitarias contra antígenos extraños, tales como grupos sanguíneos A-B-O fetales durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión a leucocitos, lupus, incluyendo nefritis lúpica, lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extrarrenal, lupus discoide y lupus eritematoso discoide, alopecia por lupus, SLE, tal como SLE cutáneo o SLE cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE) y lupus eritematoso diseminado, diabetes mellitus de aparición juvenil (tipo I), incluyendo IDDM pediátrica, diabetes mellitus de aparición en adultos (diabetes de tipo II), diabetes autoinmune, diabetes insípida idiopática, retinopatía diabética, nefropatía diabética, colitis diabética, trastorno diabético de las arterias grandes, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis, vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (Takayasu)), vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa/periarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, inmunovasculitis, vasculitis del SNC, vasculitis cutánea, vasculitis por hipersensibilidad, vasculitis necrosante tal como vasculitis necrosante sistémica y vasculitis asociada a ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS) y vasculitis de pequeños vasos asociada a ANCA, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia de membrana de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmunitaria que incluye anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de glóbulos rojos pura (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia(s) autoinmune(s), citopenias tales como pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de lesión multiorgánica, como los secundarios a septicemia, traumatismos o hemorragias, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad anti-membrana basal glomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, motoneuritis, neuritis alérgica, enfermedad/síndrome de Behçet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjögren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide cutáneo, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo pénfigoide mucomembranoso y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, lesión térmica debida a una afección autoinmunitaria, preeclampsia, un trastorno del complejo inmunitario tal como nefritis del complejo inmunitario, nefritis mediada por anticuerpos, trastornos neuroinflamatorios, polineuropatías, neuropatía crónica tal como polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (tal como la desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombótica trombocitopénica (PTT), púrpura postransfusional (PPT), trombocitopenia inducida por heparina y trombocitopenia autoinmune o mediada por inmunidad que incluyen, por ejemplo, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) que incluyeITPcrónica o aguda, escleritis tal como cerato-escleritis idiopática, epiescleritis, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovarios, incluyendo orquitis autoinmunitaria y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes, incluyendo tiroiditis, tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunes, por ejemplo, tipo I (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluidos los síndromes paraneoplásicos neurológicos, tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndromes paraneoplásicos, incluidos síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome de hombre rígido o de la persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como la miastenia grave asociada al timoma, degeneración cerebelosa, neuromiotonía, opsoclono o síndrome de opsoclono-mioclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmunitaria, neumonitis tal como neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía IgA), nefropatía idiopática por IgA, dermatosis lineal por IgA, dermatosis neutrofílica febril aguda, dermatosis pustulosa subcorneal, dermatosis acantolítica transitoria, cirrosis tal como cirrosis biliar primaria y neumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca o celiaquía, esprúe celíaco (enteropatía por gluten), esprúe refractario, esprúe idiopático, crioglobulinemia tal como la crioglobulinemia mixta, esclerosis lateral amiotrófica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad autoinmune del oído tal como la enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida auditiva autoinmune, policondritis tal como la policondritis refractaria o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilítica, parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmune, dolor asociado al herpes zóster, amiloidosis, linfocitosis no cancerosa, linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis monoclonal de linfocitos B (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o focal segmentaria (FSGS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunes y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia total, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, por ejemplo, debido a anticuerpos antiespermatozoides, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, abortos recurrentes, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome poscardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón del criador de aves, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como la alveolitis alérgica y la alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción transfusional, lepra, malaria, enfermedades parasitarias tales como leishmaniasis, tripanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, mediastinitis fibrosante, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevado persistente, eritroblastosis fetal, facitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica) o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schönlein, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), SCID, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), infección por echovirus, sepsis (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica [SIRS]), endotoxemia, pancreatitis, tirotoxicosis, infección por parvovirus, infección por el virus de la rubéola, síndromes posvacunales, infección congénita por rubéola, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis posestreptocócica, tromboangitis orbitaria, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de células gigantes, neumonitis por hipersensibilidad crónica, conjuntivitis, tal como el catarro vernal, queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía por cambios mínimos, lesión familiar benigna e isquémico-reperfusional, reperfusión de órganos trasplantados, autoinmunidad retiniana, inflamación articular, bronquitis, enfermedad pulmonar/obstructiva crónica de las vías respiratorias, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos (insuficiencia vascular cerebral) como encefalopatía arteriosclerótica y retinopatía arteriosclerótica, aspermogenia, hemólisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida auditiva neurosensorial, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, timoma no maligno, timitis linfofolicular, vitiligo, síndrome del choque tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que implican infiltración de linfocitos T, deficiencia de adhesión leucocitaria, respuestas inmunitarias asociadas a hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por complejos antígenoanticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune, oftalmia simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, síndromes poliglandulares autoinmunes, incluido el síndrome poliglandular de tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio en la edad adulta (AOIH), miocardiopatía, tal como la miocardiopatía dilatada, epidermólisis bullosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, sinusitis alérgica, trastorno relacionado con los eosinófilos, como eosinofilia, eosinofilia con infiltración pulmonar, síndrome de eosinofiliamialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartropatías, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerótica, epiesclerótica, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedades del colágeno, reumatismo, tal como artroreumatismo crónico, linfadenitis, reducción de la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral y enfermedades que acompañan a la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, trastorno de reperfusión isquémica, lesión por reperfusión del miocardio u otros tejidos, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatorias, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, fallo multiorgánico, enfermedades ampollosas, necrosis cortical renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitarios, síndromes asociados a la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, narcolepsia, inflamación aguda grave, inflamación crónica intratable, pielitis, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis. Otros ejemplos, que en algunos casos abarcan los enumerados anteriormente, incluyen, pero sin limitación, trastornos reumatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren, esclerodermia, lupus tal como LES y nefritis por lupus, polimiositis/dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome de antifosfolípidos y artritis psoriásica), trastornos gastrointestinales y hepáticos autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedades inflamatorias intestinales (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y enfermedad celíaca), vasculitis (tal como, por ejemplo, vasculitis asociada a ANCA, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener y poliarteritis), trastornos neurológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome de mioclono opsoclono, miastenia grave, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y polineuropatías autoinmunes), trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger), trastornos dermatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, ronchas, pénfigo vulgar, pénfigoide ampolloso y lupus eritematoso cutáneo), trastornos hematológicos (tales como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusional, y anemia hemolítica autoinmune), aterosclerosis, uveítis, enfermedades auditivas autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedad del oído interno y pérdida auditiva), enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, trasplante de órganos, EICH y trastornos endocrinos autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes relacionadas con la diabetes, tales como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), enfermedad de Addison y enfermedad autoinmune de la tiroides (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)).
[0039] Por lo tanto, sin limitarse a las mismas, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden usarse, por ejemplo, para prevenir y/o tratar todas las enfermedades y trastornos que se están previniendo o tratando actualmente con principios activos que pueden modular la señalización mediada por OX40L, tales como los mencionados en el estado de la técnica citado anteriormente. También se prevé que los polipéptidos de la descripción puedan usarse para prevenir y/o tratar todas las enfermedades y trastornos para los que se está desarrollando actualmente un tratamiento con dichos principios activos, se ha propuesto o se propondrá o desarrollará en el futuro. Además, se prevé que, debido a sus propiedades favorables como se describen más adelante en el presente documento, los polipéptidos de la presente descripción puedan usarse para la prevención y el tratamiento de otras enfermedades y trastornos distintos de aquellos para los que se están usando o se propondrán o desarrollarán estos principios activos conocidos; y/o que los polipéptidos de la presente descripción puedan proporcionar nuevos métodos y regímenes para tratar las enfermedades y trastornos descritos en el presente documento.
[0040] Otras aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se volverán evidentes para el experto a partir de la divulgación adicional en el presente documento.
[0041] En general, es un objeto de la descripción proporcionar agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden los mismos, que se pueden usar en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de trastornos inflamatorios tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica y de las enfermedades y trastornos adicionales mencionados en el presente documento; y proporcionar métodos para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de dichas enfermedades y trastornos que implican la administración y/o el uso de dichos agentes y composiciones.
[0042] En particular, es un objeto de la descripción proporcionar dichos agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos que tienen ciertas ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o métodos que se usan actualmente y/o conocen en la técnica. Estas ventajas quedarán claras a partir de la descripción adicional a continuación.
[0043] Más en particular, es un objeto de la descripción proporcionar proteínas terapéuticas que se pueden usar como agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden las mismas, para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de trastornos inflamatorios tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica y de las enfermedades y trastornos adicionales mencionados en el presente documento; y proporcionar métodos para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de dichas enfermedades y trastornos que implican la administración y/o el uso de dichas proteínas y composiciones terapéuticas.
[0044] Por consiguiente, es un objeto específico de la presente descripción proporcionar secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra (como se define en el presente documento) OX40L, en particular contra OX40L de un animal de sangre caliente, más en particular contra OX40L de un mamífero tal como, por ejemplo, OX40L de macaco cangrejero SEQ ID NO: 176), y especialmente contra OX40L humano (SEQ ID NO: 175); y proporcionar proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en al menos una de dichas secuencias de aminoácidos. En particular, es un objeto específico de la presente descripción proporcionar dichas secuencias de aminoácidos y dichas proteínas y/o polipéptidos que sean adecuados para uso profiláctico, terapéutico y/o diagnóstico en un animal de sangre caliente, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano.
[0045] Más en particular, es un objeto específico de la presente descripción proporcionar dichas secuencias de aminoácidos y dichas proteínas y/o polipéptidos que se pueden usar para la prevención, el tratamiento, el alivio y/o el diagnóstico de una o más enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con OX40L y/o mediadas por OX40L (tales como las enfermedades, trastornos y afecciones mencionados en el presente documento) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano.
[0046] También es un objeto específico de la descripción proporcionar dichas secuencias de aminoácidos y dichas proteínas y/o polipéptidos que se pueden usar en la preparación de composiciones farmacéuticas o veterinarias para la prevención y/o el tratamiento de una o más enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con y/o mediadas por OX40L (tales como las enfermedades, trastornos y afecciones mencionadas en el presente documento) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano. En la descripción, generalmente, estos objetos se consiguen mediante el uso de las secuencias de aminoácidos, proteínas, polipéptidos y composiciones que se describen en el presente documento.
[0047] En general, la descripción proporciona secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra (como se define en el presente documento) y/o pueden unirse específicamente (como se define en el presente documento) a OX40L; así como compuestos y construcciones, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden al menos una de dichas secuencias de aminoácidos.
[0048] Más en particular, la descripción proporciona secuencias de aminoácidos que pueden unirse a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento; así como compuestos y construcciones, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden al menos una de dichas secuencias de aminoácidos.
[0049] En particular, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción son preferiblemente tales que:
[0050] • se unen a OX40L con una constante de disociación (K<D>) de 10<-5>a 10<-12>moles/litro o menos, y preferiblemente de 10<-7>a 10<-12>moles/litro o menos y más preferiblemente de 10<-8>a 10<-12>moles/litro (es decir, con una constante de asociación (K<A>) de 10<5>a 10<12>litros/moles o más, y preferiblemente 10<7>a 10<12>litros/moles o más y más preferiblemente 10<8>a 10<12>litros/moles);
[0051] y/o tales que:
[0052] • se unen a OX40L con una velocidad k<as>de entre 10<2>M<-1>s<-1>a aproximadamente 10<7>M<-1>s<-1>, preferiblemente entre 10<3>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, más preferiblemente entre 10<4>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, tal como entre 10<5>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>;
[0053] y/o tales que:
[0054] • se unen a OX40L con una velocidad k<dis>entre 1 s<-1>(t<1/2>= 0,69 s) y 10<-6>s<-1>(proporcionando un complejo casi irreversible con una t<1/2>de múltiples días), preferentemente entre 10<-2>s<-1>y 10<-6>s<-1>, más preferiblemente entre 10<-3>s<-1>y 10<-6>s<-1>, tal como entre 10<-4>s<-1>y 10<-6>s<-1>.
[0055] Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos monovalente de la descripción (o un polipéptido que contiene solo una secuencia de aminoácidos de la descripción) es preferiblemente tal que se unirá a OX40L con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM.
[0056] Algunos valores de CI50 preferidos para la unión de las secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la descripción a OX40L se volverán claros a partir de la descripción adicional y los ejemplos del presente documento.
[0057] Para la unión a OX40L, una secuencia de aminoácidos de la descripción normalmente contendrá dentro de su secuencia de aminoácidos uno o más residuos aminoacídicos o uno o más tramos de residuos aminoacídicos (es decir, comprendiendo cada "tramo" dos o residuos aminoacídicos que están adyacentes entre sí o en estrecha proximidad entre sí, es decir, en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoácidos) a través de la cual la secuencia de aminoácidos de la descripción puede unirse a OX40L, cuyos residuos aminoacídicos o tramos de residuos aminoacídicos forman así el "sitio" para la unión a OX40L (también denominado en el presente documento el"sitio de unión al antígeno").
[0058] Las secuencias de aminoácidos proporcionadas por la descripción están preferentemente en forma esencialmente aislada (como se define en el presente documento), o forman parte de una proteína o polipéptido de la descripción (como se define en el presente documento), que puede comprender o consistir esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos de la descripción y que opcionalmente pueden comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas unidas opcionalmente a través de uno o más conectores adecuados). Por ejemplo, y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos de la descripción pueden usarse como unidad de unión en dicha proteína o polipéptido, que opcionalmente pueden contener una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como unidad de unión (es decir, contra una o más dianas distintas de OX40L), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico de la descripción, respectivamente, todo como se describe en el presente documento. Dicha proteína o polipéptido también puede estar en forma esencialmente aislada (como se define en el presente documento).
[0059] Las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción como tales consisten preferentemente esencialmente en una única cadena de aminoácidos que no está unida a través de puentes disulfuro a ninguna otra secuencia o cadena de aminoácidos (pero que puede contener o no uno o más puentes disulfuro intramoleculares. Por ejemplo, se sabe que los Nanobodies, como se describe en el presente documento, a veces pueden contener un puente disulfuro entre CDR3 y CDR1 o FR2). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que una o más secuencias de aminoácidos de la descripción pueden estar unidas entre sí y/o a otras secuencias de aminoácidos (por ejemplo, a través de puentes disulfuro) para proporcionar construcciones peptídicas que también pueden ser útiles en la descripción (por ejemplo, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')<2>, construcciones scFv, "diacuerpos" y otras construcciones multiespecíficas. Se hace referencia, por ejemplo, a la revisión de Holliger y Hudson, Nat Biotechnol.2005 sep; 23(9):1126-36).
[0060] Generalmente, cuando una secuencia de aminoácidos de la descripción (o un compuesto, construcción o polipéptido que comprende la misma) está destinada a administración a un sujeto (por ejemplo, con fines terapéuticos y/o diagnósticos como se describe en el presente documento), es preferentemente una secuencia de aminoácidos que no se produce de forma natural en dicho sujeto; o, cuando ocurre de forma natural en dicho sujeto, en forma esencialmente aislada (como se define en el presente documento).
[0061] También será evidente para el experto que, para uso farmacéutico, las secuencias de aminoácidos de la descripción (así como los compuestos, construcciones y polipéptidos que comprenden las mismas) están preferentemente dirigidas contra OX40L humano; mientras que, para fines veterinarios, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción están preferentemente dirigidos contra OX40L de la especie a tratar, o al menos tienen reactividad cruzada con OX40L de la especie a tratar.
[0062] Además, una secuencia de aminoácidos de la descripción puede contener opcionalmente, y además del al menos un sitio de unión para unirse contra OX40L, uno o más sitios de unión adicionales para unirse contra otros antígenos, proteínas o dianas.
[0063] La eficacia de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción, y de las composiciones que los comprenden, se puede analizar usando cualquier ensayoin vitro, ensayo celular, ensayo in vivo y/o modelo animal adecuado conocido de por sí, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específico implicado. Los ensayos y modelos animales adecuados serán evidentes para el experto, y por ejemplo incluyen el modelo deAscaris suumpara el asma en mono, así como los ensayos y modelos animales usados en la parte experimental a continuación y en el estado de la técnica citado en el presente documento.
[0064] Además, según la descripción, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos que están dirigidos contra OX40L de una primera especie de animal de sangre caliente pueden mostrar o no reactividad cruzada con OX40L de una o más especies de animales de sangre caliente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra OX40L humano pueden mostrar o no reactividad cruzada con OX40L de una o más especies de primates (tales como, sin limitación, monos del géneroMacaca(tales como, y, en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuino (Papio ursinus)) y/o con OX40L de una o más especies de animales que se usan a menudo en modelos animales para enfermedades (por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo o perro), y en particular en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con OX40L (tales como las especies y modelos animales mencionados en el presente documento). A este respecto, será evidente para el experto que dicha reactividad cruzada, cuando esté presente, puede tener ventajas desde el punto de vista del desarrollo de fármacos, ya que permite que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra OX40L humano se prueben en dichos modelos de enfermedad.
[0065] Más generalmente, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción que tienen reactividad cruzada con OX40L de múltiples especies de mamífero normalmente serán ventajosos para su uso en aplicaciones veterinarias, ya que permitirá que la misma secuencia de aminoácidos o polipéptido se use en múltiples especies. Por lo tanto, también está comprendido dentro del alcance de la descripción que se pueden usar secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra OX40L de una especie de animal (tales como secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra OX40L humano) en el tratamiento de otra especie de animal, siempre que el uso de las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos proporcionen los efectos deseados en la especie a tratar. La presente descripción, en su sentido más amplio, tampoco está particularmente limitada o definida por un determinante antigénico específico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) de OX40L contra el que se dirigen las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos pueden o no estar dirigidos contra un "sitio de interacción" (como se define en el presente documento). Sin embargo, generalmente se supone y prefiere que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se dirijan preferentemente contra un sitio de interacción (como se define en el presente documento), y en particular contra uno o más epítopos de Nanobodies como se describe en el presente documento, por ejemplo, uno o más epítopos del Nanobody 01B11 (SEQ ID NO: 179), 18E09 (SEQ ID NO: 183) y 15B07 (SEQ ID NO: 182). Por lo tanto, en un aspecto preferido, pero no limitante, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se dirigen contra uno o más epítopos del Nanobody 01B11 (SEQ ID NO: 179), 18E09 (SEQ ID NO: 183) y 15B07 (SEQ ID NO: 182) y son como se definen adicionalmente en el presente documento.
[0067] Como se describe más adelante en el presente documento, un polipéptido de la descripción puede contener dos o más secuencias de aminoácidos de la descripción que están dirigidas contra OX40L. Generalmente, dichos polipéptidos se unirán a OX40L con una avidez aumentada en comparación con una secuencia de aminoácidos única de la descripción. Dicho polipéptido puede comprender, por ejemplo, dos secuencias de aminoácidos de la descripción que están dirigidas contra el mismo determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) de OX40L (que puede ser o no un sitio de interacción); o comprender al menos una "primera" secuencia de aminoácidos de la descripción que está dirigida contra un primer determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) de OX40L (que puede ser un sitio de interacción); y al menos una "segunda" secuencia de aminoácidos de la descripción que está dirigida contra un segundo determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) diferente de la primera (y que de nuevo puede ser o no un sitio de interacción). Preferiblemente, en dichos polipéptidos "biparatópicos" de la descripción, al menos una secuencia de aminoácidos de la descripción se dirige contra un sitio de interacción (como se define en el presente documento en la descripción.
[0069] Además, cuando la diana es parte de un par de unión (por ejemplo, un par de unión receptor-ligando), las secuencias de aminoácidos y polipéptidos pueden ser tales que compiten con el compañero de unión afín (por ejemplo, el ligando, receptor u otro compañero de unión, según corresponda) por la unión a la diana, y/o de modo que neutralicen (total o parcialmente) la unión del compañero de unión a la diana.
[0071] También está dentro del alcance de la descripción que, cuando proceda, una secuencia de aminoácidos de la descripción puede unirse a dos o más determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios, subunidades o conformaciones de OX40L. En tal caso, los determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios o subunidades de OX40L a los que se unen las secuencias de aminoácidos y/o polipéptidos de la descripción pueden ser esencialmente los mismos (por ejemplo, si OX40L contiene motivos estructurales repetidos o se produce en una forma multimérica) o pueden ser diferentes (y en este último caso, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden unirse a dichos determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios, subunidades de OX40L con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente). Además, por ejemplo, cuando OX40L existe en una conformación activada y en una conformación inactiva, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden unirse a cualquiera de estas conformaciones, o pueden unirse a ambas de estas conformaciones (es decir, con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente). Además, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden unirse a una conformación de OX40L en la que está unido a un ligando pertinente, pueden unirse a una conformación de OX40L en la que no se une a un ligando pertinente, o pueden unirse a ambas conformaciones de este tipo (de nuevo con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente).
[0073] También se espera que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se unan generalmente a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de origen natural o sintético de OX40L; o al menos a aquellos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de OX40L que contienen uno o más determinantes antigénicos o epítopos que son esencialmente los mismos que el o los determinantes antigénicos o epítopos a los que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se unen en OX40L (por ejemplo, en OX40L natural). Nuevamente, en tal caso, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden unirse a dichos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos con una afinidad y/o especificidad que son iguales o que son diferentes de (es decir, superiores o inferiores a) la afinidad y especificidad con la que las secuencias de aminoácidos de la descripción se unen a OX40L (natural). También se incluye dentro del alcance de la descripción que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se unen a algunos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de OX40L, pero no a otros.
[0075] Cuando OX40L existe en una forma monomérica y en una o más formas multiméricas, está dentro del alcance de la descripción que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción solo se unen a OX40L en forma monomérica, solo se unen a OX40L en forma multimérica, o se unen tanto a la forma monomérica como a la multimérica. De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden unirse a la forma monomérica con una afinidad y/o especificidad que son iguales o que son diferentes de (es decir, superiores o inferiores a) la afinidad y especificidad con que las secuencias de aminoácidos de la descripción se unen a la forma multimérica.
[0077] Además, cuando OX40L puede asociarse con otras proteínas o polipéptidos para formar complejos proteicos (por ejemplo, con múltiples subunidades), está dentro del alcance de la descripción que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se unen a OX40L en su estado no asociado, se unen a OX40L en su estado asociado, o se unen a ambos. En todos estos casos, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción pueden unirse a dichos multímeros o complejos proteicos asociados con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes de (es decir, superiores o inferiores a) la afinidad y/o especificidad con la que las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se unen a OX40L en su estado monomérico y no asociado.
[0078] Además, como será evidente para el experto, las proteínas o polipéptidos que contienen dos o más secuencias de aminoácidos dirigidas contra OX40L pueden unirse con mayor avidez a OX40L que la secuencia o secuencias de aminoácidos monoméricos correspondientes. Por ejemplo, y sin limitación, las proteínas o polipéptidos que contienen dos o más secuencias de aminoácidos dirigidas contra diferentes epítopos de OX40L pueden (y normalmente se unirán) con mayor avidez que cada uno de los diferentes monómeros, y las proteínas o polipéptidos que contienen dos o más secuencias de aminoácidos dirigidas contra OX40L pueden unirse (y normalmente se unirán) también con mayor avidez a un multímero de OX40L.
[0080] En general, las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción se unirán al menos a aquellas formas de OX40L (incluyendo formas monoméricas, multiméricas y asociadas) que son las más relevantes desde un punto de vista biológico y/o terapéutico, como será evidente para el experto.
[0082] También está dentro del alcance de la descripción usar partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de las secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción, y/o usar proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en una o más de dichas partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados, siempre que sean adecuados para los usos previstos en el presente documento. Partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, los alelos y/o derivados normalmente contendrán (al menos parte de) un sitio de unión al antígeno funcional para unirse a OX40L; y más preferentemente serán capaces de unirse específicamente a OX40L, e incluso más preferiblemente capaces de unirse a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento. Algunos ejemplos no limitantes de dichas partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados, proteínas y/o polipéptidos serán volverán evidentes a partir de la descripción de más adelante en el presente documento. También se pueden proporcionar fragmentos o polipéptidos adicionales de la descripción combinando adecuadamente (es decir, enlazando o fusión genética) una o más partes (más pequeñas) o fragmentos como se describe en el presente documento.
[0084] En un aspecto específico, pero no limitante de la descripción, que se describirá más adelante en el presente documento, dichos análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados tienen una mayor semivida en suero (como se describe más adelante en el presente documento) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que se han derivado. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la descripción puede enlazarse (químicamente o de otro modo) a uno o más grupos o restos que prolongan la semivida (tales como PEG), para proporcionar un derivado de una secuencia de aminoácidos de la descripción con una mayor semivida.
[0086] En un aspecto específico, pero no limitante, la secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende un pliegue de inmunoglobulina o puede ser una secuencia de aminoácidos que, en condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas) es capaz de formar un pliegue de inmunoglobulina (es decir, mediante plegamiento). Se hace referencia, entre otras cosas, a la revisión de Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71. Preferiblemente, cuando se pliega correctamente para formar un pliegue de inmunoglobulina, dicha secuencia de aminoácidos es capaz de unirse específicamente (como se define en el presente documento) a OX40L; y más preferiblemente capaz de unirse a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento. También, partes, fragmentos, análogos, mutantes, las variantes, alelos y/o derivados de dichas secuencias de aminoácidos son preferiblemente tales que comprenden un pliegue de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un pliegue de inmunoglobulina.
[0087] En particular, pero sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden ser secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente); o cualquier fragmento adecuado de dicha secuencia de aminoácidos (que entonces normalmente contendrá al menos algunos de los residuos aminoacídicos que forman al menos una de las CDR, como se describe más adelante en el presente documento).
[0088] Las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden ser, en particular, una secuencia de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma, y más en particular ser una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina, secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de las mismas, tal como una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V<L>) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<H>) o un fragmento adecuado de la misma. Cuando la secuencia de aminoácidos de la descripción es una secuencia de dominio variable de cadena pesada, puede ser una secuencia de dominio variable de cadena pesada que deriva de un anticuerpo convencional de cuatro cadenas (tal como, sin limitación, una secuencia V<H>que deriva de un anticuerpo humano) o ser una denominada secuencia V<HH>(como se define en el presente documento) que deriva de un denominado "anticuerpo de cadena pesada" (como se define en el presente documento).
[0090] Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la descripción no se limita al origen de la secuencia de aminoácidos de la descripción (o de la secuencia de nucleótidos de la descripción usada para expresarla), ni en cuanto a la forma en que la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de la descripción se genera u obtiene (o se ha generado u obtenido). Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden ser secuencias de aminoácidos de origen natural (de cualquier especie adecuada) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semisintéticas. En un aspecto específico pero no limitante de la descripción, la secuencia de aminoácidos es una secuencia de inmunoglobulina de origen natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semisintética, que incluye, pero sin limitación, secuencias de inmunoglobulina "humanizadas" (como se definen en el presente documento) (tales como secuencias de inmunoglobulina de ratón o conejo parcial o totalmente humanizadas, y, en particular, secuencias V<HH>o Nanobodies parciales o totalmente humanizadas), secuencias de inmunoglobulina "camelizadas" (como se definen en el presente documento), así como secuencias de inmunoglobulina que se han obtenido mediante técnicas tales como maduración por afinidad (por ejemplo, a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o de origen natural), injerto de CDR, rechapado, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulinas, ensamblaje por PCR usando cebadores de solapamiento, y técnicas similares para manipular las secuencias de inmunoglobulina bien conocidas por el experto; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales, así como a la descripción adicional y estado de la técnica mencionados en el presente documento.
[0092] Del mismo modo, las secuencias de nucleótidos de la descripción pueden ser secuencias de nucleótidos de origen natural o secuencias sintéticas o semisintéticas, y pueden ser, por ejemplo, secuencias que se aíslan mediante PCR a partir de un molde de origen natural adecuado (por ejemplo, ADN o ARN aislado de una célula), secuencias de nucleótidos que se han aislado de una biblioteca (y en particular, una biblioteca de expresión), secuencias de nucleótidos que se han preparado introduciendo mutaciones en una secuencia de nucleótidos de origen natural (usando cualquier técnica adecuada conocida de por sí, tal como PCR de desajuste), secuencias de nucleótidos que se han preparado mediante PCR usando cebadores solapados, o secuencias de nucleótidos que se han preparado usando técnicas para la síntesis de ADN conocidas de por sí.
[0094] La secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser, en particular, una secuencia de dominio variable único de inmunoglobulina tal como un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como anticuerpo de dominio), un anticuerpo de dominio único (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como anticuerpo de dominio único), un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como un dAb) o un Nanobody (como se define en el presente documento, e incluyendo, pero sin limitación, una secuencia V<HH>); otros dominios variables individuales, o cualquier fragmento adecuado de uno cualquiera de los mismos. Para una descripción general de anticuerpos de dominio (único), también se hace referencia al estado de la técnica citado anteriormente, así como al documento de patente EP 0368684. Para el término "dAb" se hace referencia, por ejemplo, a Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6), a Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11) :484-490; así como, por ejemplo, a los documentos de patente WO 06/030220, WO 06/003388 y a otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. También debe tenerse en cuenta que, aunque menos preferidos en el contexto de la presente descripción debido a que no son de origen mamífero, los anticuerpos de dominio (único) o dominios variables únicos pueden derivar de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados "dominios de IgNAR", véase, por ejemplo, el documento de patente WO 05/18629).
[0095] En particular, la secuencia de aminoácidos de la divulgación puede ser un Nanobody® (como se define en el presente documento) o un fragmento adecuado del mismo.[Nota: Nanobody®, Nanobodies® y Nanoclon® son marcas comerciales registradas de Ablynx N.V.]Dichos Nanobodies dirigidos contra OX40L también se denominarán en el presente documento"Nanobodies de la descripción".
[0097] Para una descripción general de Nanobodies, se hace referencia a la descripción adicional a continuación, así como al estado de la técnica citado en el presente documento. A este respecto, debe tenerse en cuenta, sin embargo, que esta descripción y el estado de la técnica describieron principalmente Nanobodies de la denominada "clase V<H>3" (es decir, Nanobodies con un alto grado de homología de secuencia con secuencias de la línea germinal humana de la clase V<H>3, tales como DP-47, DP-51 o DP-29), formando dichos Nanobodies un aspecto preferido de esta descripción. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la descripción en su sentido más amplio abarca en general cualquier tipo de Nanobody dirigido contra OX40L y, por ejemplo, también abarca los Nanobodies que pertenecen a la denominada "clase V<H>4" (es decir, Nanobodies con un alto grado de homología de secuencia con secuencias de línea germinal humana de la clase V<H>4, tales como DP-78), como se describe, por ejemplo, en el documento de patente WO 07/118670.
[0099] En general, los Nanobodies (en particular, las secuencias V<HH>y Nanobodies parcialmente humanizados) pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o más "residuos distintivos" (como se describen en el presente documento) en una o más de las secuencias estructurales (de nuevo, como se describe más adelante en el presente documento).
[0100] Por lo tanto, en general, un Nanobody se puede definir como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
[0101] FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0102] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que uno o más de los residuos distintivos son como se definen más adelante en el presente documento.
[0103] En particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
[0104] FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0105] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que las secuencias estructurales son como se definen más adelante en el presente documento.
[0106] Más en particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
[0107] FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0108] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0109] i) preferiblemente uno o más de los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2, a continuación;
[0110] y en la que:
[0111] ii) dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 22, en las que, a efectos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las secuencias de CDR (indicados con X en las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 22).
[0112] En estos Nanobodies, las secuencias de CDR son generalmente como se definen más adelante en el presente documento.
[0113] Por lo tanto, la descripción también se refiere a dichos Nanobodies que pueden unirse (como se definen en el presente documento) y/o están dirigidos contra OX40L, a fragmentos adecuados del mismo, así como a polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más de dichos Nanobodies y/o fragmentos adecuados.
[0114] SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1) proporcionan las secuencias de aminoácidos de varias secuencias V<HH>que se han producido contra OX40L.
[0115] En particular, la descripción en algunos aspectos específicos proporciona:
[0116] • secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra (como se define en el presente documento) OX40L y que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 85 %, tal como un 90 % o un 95 % o más de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Estas secuencias de aminoácidos pueden ser, además, tales que neutralizan la unión del ligando afín o receptor a OX40L; y/o compiten con el ligando afín o receptor por unirse a OX40L; y/o están dirigidas contra un sitio de interacción (como se define en el presente documento) en OX40L (tal como el ligando o el sitio de unión al receptor);
[0117] • secuencias de aminoácidos que bloquean de forma cruzada (como se define en el presente documento) la unión de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1) a OX40L y/o que compiten con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1) por unirse a OX40L. De nuevo, estas secuencias de aminoácidos pueden ser, además, tales que neutralizan la unión del ligando afín o receptor a OX40L; y/o compiten con el ligando afín o receptor por unirse a OX40L; y/o están dirigidas contra un sitio de interacción (como se define en el presente documento) en OX40L (tal como el ligando o el sitio de unión al receptor);
[0118] pudiendo ser dichas secuencias de aminoácidos como se describe más adelante en el presente documento (y pueden ser, por ejemplo, Nanobodies); así como polipéptidos de la descripción que comprenden una o más de dichas secuencias de aminoácidos (que pueden ser como se describe adicionalmente en el presente documento, y pueden ser, por ejemplo, polipéptidos biespecíficos y/o biparatópicos como se describe en el presente documento), y secuencias de ácido nucleico que codifican dichas secuencias de aminoácidos y polipéptidos. Dichas secuencias de aminoácidos y polipéptidos no incluyen ligandos de origen naturales.
[0119] En algunos otros aspectos específicos, la descripción proporciona:
[0120] • secuencias de aminoácidos de la descripción que son específicas para OX40L en comparación con otros miembros de la familia TNF;
[0121] pudiendo ser dichas secuencias de aminoácidos de la descripción como se describe más adelante en el presente documento (y pueden ser, por ejemplo, Nanobodies); así como polipéptidos de la descripción que comprenden una o más de dichas secuencias de aminoácidos (que pueden ser como se describe adicionalmente en el presente documento, y pueden ser, por ejemplo, polipéptidos biespecíficos y/o biparatópicos como se describe en el presente documento), y secuencias de ácido nucleico que codifican dichas secuencias de aminoácidos y polipéptidos. Dichas secuencias de aminoácidos y polipéptidos no incluyen ligandos de origen naturales.
[0122] Por consiguiente, algunos Nanobodies particularmente preferidos de la descripción son Nanobodies que pueden unirse (como se define más adelante en el presente documento) a y/o están dirigidos contra OX40L y que:
[0123] i) tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), en las que, a efectos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las secuencias de CDR. A este respecto, también se hace referencia a la Tabla B-1, que enumera las secuencias estructurales 1 (SEQ ID NO: 126 a 132), secuencias estructurales 2 (SEQ ID NO: 140 a 146), secuencias estructurales 3 (SEQ ID NO: 154 a 160) y secuencias estructurales 4 (SEQ ID NO: 168 a 174) de los Nanobodies de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1) (con respecto a los residuos aminoacídicos en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 de las secuencias estructurales 1, también se hace referencia a los comentarios realizados a continuación. Por lo tanto, para determinar el grado de identidad de aminoácidos, estos residuos se ignoran preferentemente);
[0124] y en la que:
[0125] ii) preferiblemente uno o más de los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2, a continuación.
[0126] En estos Nanobodies, las secuencias de CDR son generalmente como se definen más adelante en el presente documento.
[0127] De nuevo, dichos Nanobodies pueden derivar de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada, y pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>de origen natural (es decir, de una especie adecuada de camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semisintéticas, que incluyen, pero sin limitación, Nanobodies "humanizados" (como se definen en el presente documento), secuencias de inmunoglobulina "camelizadas" (como se definen en el presente documento) (y, en particular, secuencias de dominio variable de la cadena pesada camelizada), así como Nanobodies que se han obtenido mediante técnicas tales como maduración por afinidad (por ejemplo, a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o de origen natural), injerto de CDR, rechapado, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores solapados y técnicas similares para la manipulación de secuencias de inmunoglobulina bien conocidas por el experto; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de lo anterior como se describe más adelante en el presente documento. Además, cuando un Nanobody comprende una secuencia V<HH>, dicho Nanobody puede humanizarse adecuadamente, como se describe más adelante en el presente documento, para proporcionar uno o más Nanobodies (parcial o totalmente) humanizados adicionales de la descripción. Del mismo modo, cuando un Nanobody comprende una secuencia sintética o semisintética (tal como una secuencia parcialmente humanizada), dicho Nanobody puede humanizarse opcionalmente de manera adicional, de nuevo como se describe en el presente documento, de nuevo para proporcionar uno o más Nanobodies parcial o totalmente) humanizados de manera adicional de la descripción.
[0128] En particular, los Nanobodies humanizados pueden ser secuencias de aminoácidos que son como se definen generalmente para Nanobodies en los párrafos anteriores, pero en las que está presente al menos un residuo aminoacídico (y en particular, en al menos uno de los residuos estructurales) que es y/o que corresponde a una sustitución humanizante (como se define en el presente documento). Algunas sustituciones humanizantes preferidas, pero no limitantes (y combinaciones adecuadas de las mismas) se volverán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento. Además, o alternativamente, se pueden determinar otras sustituciones humanizantes potencialmente útiles comparando la secuencia de las regiones estructurales de una secuencia V<HH>de origen natural con la secuencia estructural correspondiente de una o más secuencias V<H>humanas estrechamente relacionadas, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) así determinadas pueden introducirse en dicha secuencia V<HH>(de cualquier manera conocida de por sí, como se describe más adelante en el presente documento) y las secuencias V<HH>humanizadas resultantes pueden probarse para determinar la afinidad por la diana, para la estabilidad, para la facilidad y el nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas. De esta manera, mediante un grado limitado de ensayo y error, el experto puede determinar otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) basándose en la divulgación en el presente documento. Además, basándose en lo anterior, (las regiones estructurales de) un Nanobody pueden humanizarse parcialmente o humanizarse completamente.
[0130] Algunos Nanobodies humanizados particularmente preferidos de la descripción son variantes humanizadas de los Nanobodies de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), de las cuales las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 a 226 (véase la Tabla A-2) son algunos ejemplos especialmente preferidos.
[0132] Según otro aspecto específico de la descripción, la descripción proporciona una serie de tramos de residuos aminoacídicos (es decir, péptidos pequeños) que son particularmente adecuados para unirse a OX40L. Estos tramos de residuos aminoacídicos pueden estar presentes en, y/o pueden incorporarse en, una secuencia de aminoácidos de la descripción, en particular de tal manera que forman (parte de) el sitio de unión al antígeno de una secuencia de aminoácidos de la descripción. Como estos tramos de residuos aminoacídicos se generaron primero como secuencias de CDR de anticuerpos de cadena pesada o secuencias V<HH>que se produjeron contra OX40L (o pueden basarse en y/o derivarse de dichas secuencias de CDR, como se describe más adelante en el presente documento), también se denominarán generalmente en el presente documento"secuencias de CDR"(es decir, secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y secuencias de CDR3, respectivamente). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la descripción en su sentido más amplio no se limita a una función o función estructural específica que estos tramos de residuos aminoacídicos puedan tener en una secuencia de aminoácidos de la descripción, siempre que estos tramos de residuos aminoacídicos permitan que la secuencia de aminoácidos de la descripción se una a OX40L. Por lo tanto, en general, la descripción en su sentido más amplio comprende cualquier secuencia de aminoácidos que sea capaz de unirse a OX40L y que comprenda una o más secuencias de CDR como se describe en el presente documento, y en particular una combinación adecuada de dos o más de dichas secuencias de CDR, que están convenientemente unidas entre sí a través de una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de modo que la secuencia completa de aminoácidos forma un dominio de unión y/o unidad de unión que es capaz de unirse a OX40L. Sin embargo, también debe tenerse en cuenta que la presencia de una sola de dichas secuencias de CDR en una secuencia de aminoácidos de la descripción puede ya ser suficiente por sí sola para proporcionar una secuencia de aminoácidos de la descripción que sea capaz de unirse a OX40L; por ejemplo, se hace referencia de nuevo a los denominados "fragmentos de aceleración" descritos en los documentos de patente WO 03/050531 o WO2009/127691.
[0134] Por lo tanto, en otro aspecto específico, pero no limitante, la secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y secuencias de CDR3 que se describen en el presente documento (o cualquier combinación adecuada de las mismas). En particular, una secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un sitio de unión al antígeno, en donde dicho sitio de unión al antígeno comprende al menos una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y secuencias de CDR3 que se describen en el presente documento (o cualquier combinación adecuada de las mismas).
[0136] Generalmente, en este aspecto de la descripción, la secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprende al menos un tramo de residuos aminoacídicos, en cuyo dicho tramo de residuos aminoacídicos tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de al menos una de las secuencias de CDR descritas en el presente documento. Dicha secuencia de aminoácidos puede comprender o no un pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, y sin limitación, dicha secuencia de aminoácidos puede ser un fragmento adecuado de una secuencia de inmunoglobulina que comprende al menos dicha secuencia de CDR, pero que no es lo suficientemente grande como para formar un pliegue (completo) de inmunoglobulina (se hace referencia, por ejemplo, de nuevo a los "fragmentos de aceleración" descritos en los documentos de patente WO03/050531 o WO2009/127691). Alternativamente, dicha secuencia de aminoácidos puede ser un "armazón proteico" adecuado que comprende al menos un tramo de residuos aminoacídicos que corresponde a dicha secuencia de CDR (es decir, como parte de su sitio de unión al antígeno). Los armazones adecuados para presentar secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto y, por ejemplo, comprenden, sin limitación, armazones de unión basados en o derivados de inmunoglobulinas (es decir, distintas de las secuencias de inmunoglobulina ya descritas en el presente documento), armazones de proteína A derivados de dominios de proteína A (tales como Affibodies<™>), tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de linfocitos T, repeticiones de anquirina diseñadas, avímeros y dominios PDZ (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257), y restos de unión basados en ADN o ARN que incluyen, pero sin limitación, aptámeros de ADN o ARN (Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 20069(8):619-32).
[0137] De nuevo, cualquier secuencia de aminoácidos de la descripción que comprende una o más de estas secuencias de CDR es preferentemente tal que puede unirse específicamente (como se define en el presente documento) a OX40L, y más en particular, tal que puede unirse a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento), que es como se define en el presente documento.
[0138] Más en particular, las secuencias de aminoácidos según con este aspecto de la descripción pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos que comprende al menos un sitio de unión al antígeno, en donde dicho sitio de unión al antígeno comprende al menos dos secuencias de aminoácidos que se eligen del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento, las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento y las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento. de modo que (i) cuando la primera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento o de las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento; (ii) cuando la primera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento o de las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento; o (iii) cuando la primera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento o de las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento.
[0139] Incluso más en particular, las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden ser secuencias de aminoácidos que comprenden al menos un sitio de unión al antígeno, en donde dicho sitio de unión al antígeno comprende al menos tres secuencias de aminoácidos que se eligen del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento, las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento y las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento, de modo que la primera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR1 descritas en el presente documento, la segunda secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR2 descritas en el presente documento, y la tercera secuencia de aminoácidos se elige de las secuencias de CDR3 descritas en el presente documento. Las combinaciones preferidas de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento. Como será evidente para el experto, dicha secuencia de aminoácidos es preferiblemente una secuencia de inmunoglobulina (como se describe más adelante en el presente documento), pero también puede ser, por ejemplo, cualquier otra secuencia de aminoácidos que comprende un armazón adecuado para presentar dichas secuencias de CDR.
[0140] Por lo tanto, en un aspecto específico, pero no limitante, la descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra OX40L, que comprende uno o más tramos de residuos aminoacídicos elegidos del grupo que consiste en:
[0141] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0142] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0143] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0144] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0145] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0146] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0147] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0148] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0149] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0150] o cualquier combinación adecuada de los mismos.
[0151] Cuando una secuencia de aminoácidos de la descripción contiene una o más secuencias de aminoácidos según b) y/o c):
[0152] i) cualquier sustitución de aminoácidos en dicha secuencia de aminoácidos según b) y/o c) es preferentemente, y en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según a), una sustitución de aminoácidos conservadora, (como se define en el presente documento);
[0153] y/o
[0154] ii) la secuencia de aminoácidos según b) y/o c) contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según a);
[0155] y/o
[0156] iii) la secuencia de aminoácidos según b) y/o c) puede ser una secuencia de aminoácidos que deriva de una secuencia de aminoácidos según a) mediante maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas de por sí.
[0157] Del mismo modo, cuando una secuencia de aminoácidos de la descripción contiene una o más secuencias de aminoácidos según e) y/o f):
[0158] i) cualquier sustitución de aminoácidos en dicha secuencia de aminoácidos según e) y/o f) es preferentemente, y en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según d), una sustitución de aminoácidos conservadora, (como se define en el presente documento);
[0159] y/o
[0160] ii) la secuencia de aminoácidos e) y/o f) contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según d);
[0161] y/o
[0162] iii) la secuencia de aminoácidos según e) y/o f) puede ser una secuencia de aminoácidos que deriva de una secuencia de aminoácidos según d) mediante maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas de por sí.
[0163] También, del mismo modo, cuando una secuencia de aminoácidos de la descripción contiene una o más secuencias de aminoácidos según h) y/o i):
[0164] i) cualquier sustitución de aminoácidos en dicha secuencia de aminoácidos según h) y/o i) es preferentemente, y en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según g), una sustitución de aminoácidos conservadora, (como se define en el presente documento);
[0165] y/o
[0166] ii) la secuencia de aminoácidos según h) y/o i) contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según g);
[0167] y/o
[0168] iii) la secuencia de aminoácidos según h) y/o i) puede ser una secuencia de aminoácidos que deriva de una secuencia de aminoácidos según g) mediante maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas de por sí.
[0169] Debe entenderse que los últimos párrafos anteriores también se aplican generalmente a cualquier secuencia de aminoácidos de la descripción que comprende una o más secuencias de aminoácidos según b), c), e), f), h) o i), respectivamente.
[0170] En este aspecto específico, la secuencia de aminoácidos comprende preferentemente uno o más tramos de residuos aminoacídicos elegidos del grupo que consiste en:
[0171] i) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0172] ii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153; y
[0173] iii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0174] o cualquier combinación adecuada de los mismos.
[0175] Además, preferiblemente, en dicha secuencia de aminoácidos, al menos uno de dichos tramos de residuos aminoacídicos forma parte del sitio de unión al antígeno para unirse a OX40L.
[0176] En un aspecto más específico, pero de nuevo no limitante, la descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra OX40L, que comprende dos o más tramos de residuos aminoacídicos elegidos del grupo que consiste en:
[0177] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0178] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0179] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0180] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0181] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0182] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0183] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0184] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0185] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0186] de modo que (i) cuando el primer tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos según a), b) o c), el segundo tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos según d), e), f), g), h) o i); (ii) cuando el primer tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos según d), e) o f), el segundo tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos según a), b), c), g), h) o i); o (iii) cuando el primer tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos según g), h) o i), el segundo tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos según a), b), c), d), e) o f).
[0187] En este aspecto específico, la secuencia de aminoácidos comprende preferentemente dos o más tramos de residuos aminoacídicos elegidos del grupo que consiste en:
[0188] i) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0189] ii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153; y
[0190] iii) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0191] de modo que, (i) cuando el primer tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139, el segundo tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 y 153 o de SEQ ID NO: 161 a 167; (ii) cuando el primer tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153, el segundo tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139 o de SEQ ID NO: 161 a 167; o (iii) cuando el primer tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167, el segundo tramo de residuos aminoacídicos corresponde a una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139 o de SEQ ID NO: 147 a 153. Además, en dicha secuencia de aminoácidos, los al menos dos tramos de residuos aminoacídicos nuevamente forman preferiblemente parte del sitio de unión al antígeno para unirse a OX40L.
[0192] En un aspecto aún más específico, pero no limitante, la descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos dirigida contra OX40L, que comprende tres o más tramos de residuos aminoacídicos, en los que el primer tramo de residuos aminoacídicos se elige del grupo que consiste en:
[0193] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0194] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0195] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0196] el segundo tramo de residuos aminoacídicos se elige del grupo que consiste en:
[0197] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0198] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0199] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0200] y el tercer tramo de residuos aminoacídicos se elige del grupo que consiste en:
[0201] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0202] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0203] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167.
[0204] Preferiblemente, en este aspecto específico, el primer tramo de residuos aminoacídicos se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139; el segundo tramo de residuos aminoacídicos se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153; y el tercer tramo de residuos aminoacídicos se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167.
[0205] De nuevo, preferiblemente, en dicha secuencia de aminoácidos, los al menos tres tramos de residuos aminoacídicos forman parte del sitio de unión al antígeno para unirse contra OX40L.
[0206] Las combinaciones preferidas de dichos tramos de secuencias de aminoácidos se volverán evidentes a partir de la divulgación adicional en el presente documento.
[0207] Preferiblemente, en dichas secuencias de aminoácidos, las secuencias de CDR tienen al menos un 70 % de identidad de aminoácidos, preferiblemente al menos un 80 % de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad de aminoácidos, tal como un 95 % de identidad de aminoácidos o más o incluso esencialmente un 100 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Este grado de identidad de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicha secuencia de aminoácidos y una o más de las secuencias de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), en la que se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las regiones estructurales. Además, dichas secuencias de aminoácidos de la descripción pueden ser como se describe más adelante en el presente documento.
[0208] Además, dichas secuencias de aminoácidos son preferiblemente tales que pueden unirse específicamente (como se define en el presente documento) a OX40L; y más en particular, se unen a OX40L con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento.
[0209] Cuando la secuencia de aminoácidos de la descripción consiste esencialmente en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), la secuencia de aminoácidos de la descripción es preferentemente tal que:
[0210] • CDR1 se elige del grupo que consiste en:
[0211] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0212] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0213] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0214] y/o
[0215] • CDR2 se elige del grupo que consiste en:
[0216] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0217] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0218] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0219] y/o
[0220] • CDR3 se elige del grupo que consiste en:
[0221] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0222] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0223] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167.
[0224] En particular, dicha secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser tal que CDR1 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139; y/o CDR2 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153; y/o CDR3 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167.
[0225] En particular, cuando la secuencia de aminoácidos de la descripción consiste esencialmente en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), la secuencia de aminoácidos de la descripción es preferentemente tal que:
[0226] • CDR1 se elige del grupo que consiste en:
[0227] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0228] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0229] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0230] y
[0231] • CDR2 se elige del grupo que consiste en:
[0232] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0233] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0234] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0235] y
[0236] • CDR3 se elige del grupo que consiste en:
[0237] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0238] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0239] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167; o cualquier fragmento adecuado de dicha secuencia de aminoácidos. En particular, dicha secuencia de aminoácidos de la descripción puede ser tal que CDR1 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139; y CDR2 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153; y CDR3 se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167.
[0240] De nuevo, las combinaciones preferidas de secuencias de CDR se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0241] Además, dichas secuencias de aminoácidos son preferiblemente tales que pueden unirse específicamente (como se define en el presente documento) a OX40L; y más en particular, se unen a OX40L con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento.
[0242] En un aspecto preferido, pero no limitante, la descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en las que las secuencias de CDR de dicha secuencia de aminoácidos tienen al menos un 70 % de identidad de aminoácidos, preferiblemente al menos un 80 % de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad de aminoácidos, tal como un 95 % de identidad de aminoácidos o más o incluso esencialmente 100 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Este grado de identidad de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicha secuencia de aminoácidos y una o más de las secuencias de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), en la que se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las regiones estructurales. Dichas secuencias de aminoácidos de la descripción pueden ser como se describe más adelante en el presente documento.
[0243] En dicha secuencia de aminoácidos de la descripción, las secuencias estructurales pueden ser cualquier secuencia estructural adecuada, y los ejemplos de secuencias estructurales adecuadas serán evidentes para el experto, por ejemplo, basándose en los manuales estándar y la divulgación adicional y el estado de la técnica mencionados en el presente documento.
[0244] Las secuencias estructurales son preferiblemente (una combinación adecuada de) secuencias estructurales de inmunoglobulina o secuencias estructurales que han derivado de secuencias estructurales de inmunoglobulina (por ejemplo, mediante humanización o camelización). Por ejemplo, las secuencias estructurales pueden ser secuencias estructurales derivadas de un dominio variable de la cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V<L>) y/o de un dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<H>). En un aspecto particularmente preferido, las secuencias estructurales son secuencias estructurales que han derivado de una secuencia V<HH>(en la que dichas secuencias estructurales pueden haberse humanizado parcial o totalmente opcionalmente) o son secuencias V<H>convencionales que se han camelizado (como se define en el presente documento).
[0245] Las secuencias estructurales son preferiblemente tales que la secuencia de aminoácidos de la descripción es un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como anticuerpo de dominio); es un anticuerpo de dominio único (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como anticuerpo de dominio único); es un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para uso como dAb); o es un Nanobody (que incluye, pero sin limitación, la secuencia V<HH>). De nuevo, las secuencias estructurales adecuadas serán evidentes para el experto, por ejemplo, basándose en los manuales convencionales y la divulgación adicional y el estado de la técnica mencionados en el presente documento.
[0246] En particular, las secuencias estructurales presentes en las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden contener uno o más de residuos distintivos (como se definen en el presente documento), de modo que la secuencia de aminoácidos de la descripción es un Nanobody. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de (combinaciones adecuadas de) dichas secuencias estructurales se volverán evidentes a partir de la divulgación adicional en el presente documento.
[0247] De nuevo, como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoácidos de la descripción, también es posible usar fragmentos adecuados (o combinaciones de fragmentos) de cualquiera de los anteriores, tales como fragmentos que contienen una o más secuencias de CDR, adecuadamente flanqueadas y/o unidas a través de una o más secuencias estructurales (por ejemplo, en el mismo orden que estas secuencias de CDR y estructurales pueden ocurrir en la secuencia de inmunoglobulina de tamaño completo de la que ha derivado el fragmento). Dichos fragmentos también pueden ser de nuevo tales que comprenden o pueden formar un pliegue de inmunoglobulina, o alternativamente ser tales que no comprenden o no pueden formar un pliegue de inmunoglobulina.
[0249] En un aspecto específico, dicho fragmento comprende una única secuencia de CDR como se describe en el presente documento (y en particular una secuencia de CDR3), que está flanqueada a cada lado por (parte de) una secuencia estructural (y en particular, parte de la secuencia o secuencias estructurales que, en la secuencia de inmunoglobulina de la que deriva el fragmento, son adyacentes a dicha secuencia de CDR. Por ejemplo, una secuencia de CDR3 puede estar precedida por (parte de) una secuencia de FR3 y seguida por (parte de) una secuencia de FR4). Dicho fragmento también puede contener un puente disulfuro, y en particular un puente disulfuro que une las dos regiones estructurales que preceden y siguen la secuencia de CDR, respectivamente (con el fin de formar dicho puente disulfuro, se pueden usar residuos de cisteína que se producen naturalmente en dichas regiones estructurales, o alternativamente, se pueden añadir sintéticamente residuos de cisteína a o introducir en dichas regiones estructurales). Para una descripción adicional de estos "fragmentos de aceleración", se hace referencia de nuevo al documento de patente WO 03/050531, así como a la solicitud provisional de EE.UU. de Ablynx N.V. titulada"Peptides capable of binding to serum proteins"de Ablynx N.V. (inventores: Revets, Hilde Adi Pierrette; Kolkman, Joost Alexander; y Hoogenboom, Hendricus Renerus Jacobus Mattheus) presentada el 5 de diciembre de 2006 (véase también el documento de patente WO2008/068280).
[0251] En otro aspecto, la descripción se refiere a un compuesto o construcción, y en particular una proteína o polipéptido (también denominado en el presente documento un"compuesto de la descripción"o"polipéptido de la descripción",respectivamente) que comprende o consiste esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos de la descripción (o fragmentos adecuados de la misma), y opcionalmente comprende además uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión. Como será evidente para el experto a partir de la divulgación adicional en el presente documento, dichos grupos, residuos, restos, unidades de unión o secuencias de aminoácidos adicionales pueden proporcionar o no funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos de la descripción (y/o al compuesto o construcción en que está presente) y pueden modificar o no las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la descripción.
[0253] Por ejemplo, dichos grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales pueden ser una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de modo que el compuesto o construcción sea una proteína (de fusión) o polipéptido (de fusión). En un aspecto preferido, pero no limitante, dichos, uno o más, grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes son secuencias de inmunoglobulina. Incluso más preferiblemente, dicho uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, "dAb", secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb o Nanobodies.
[0255] Como alternativa, dichos grupos, residuos, restos o unidades de unión pueden ser, por ejemplo, grupos químicos, residuos, restos, que pueden o ser no por sí mismos biológicamente y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, dichos grupos pueden enlazarse a una o más secuencias de aminoácidos de la descripción para proporcionar un "derivado" de una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la descripción, como se describe más adelante en el presente documento.
[0257] También dentro del alcance de la presente descripción se encuentran compuestos o construcciones que comprenden o consisten esencialmente en uno o más derivados como se describen en el presente documento, y opcionalmente comprenden además uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes, opcionalmente enlazados mediante uno o más conectores. Preferiblemente, dicho uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes son secuencias de aminoácidos.
[0259] En los compuestos o construcciones descritos anteriormente, la una o más secuencias de aminoácidos de la descripción y el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión pueden estar enlazados directamente entre sí y/o mediante uno o más conectores o espaciadores adecuados. Por ejemplo, cuando el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de aminoácidos, los conectores también pueden ser secuencias de aminoácidos, de modo que el compuesto o construcción resultante sea una proteína (de fusión) o un polipéptido (de fusión).
[0261] Como será evidente a partir de la descripción adicional anterior y en el presente documento, esto significa que las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden usarse como "elementos constituyentes" para formar polipéptidos de la descripción, es decir, combinándolos adecuadamente con otros grupos, residuos, restos o unidades de unión, con el fin de formar compuestos o construcciones como se describe en el presente documento (tal como, sin limitaciones, los polipéptidos biparatópicos, bi/multivalentes y bi/multiespecíficos de la descripción descrita en el presente documento) que combinan en una sola molécula una o más propiedades o funciones biológicas deseadas.
[0263] Los compuestos o polipéptidos de la descripción pueden prepararse en general mediante un método que comprende al menos una etapa de enlazar adecuadamente las una o más secuencias de aminoácidos de la descripción con el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales, opcionalmente mediante uno o más conectores adecuados, para proporcionar el compuesto o polipéptido de la descripción. Los polipéptidos de la descripción también pueden prepararse mediante un método que comprende generalmente al menos las etapas de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la descripción, expresar dicho ácido nucleico de una manera adecuada y recuperar el polipéptido expresado de la descripción. Dichos métodos pueden realizarse de una manera conocida de por sí, que será evidente para el experto, por ejemplo, basándose en los métodos y técnicas descritos más adelante en el presente documento.
[0265] El proceso de diseño/selección y/o preparación de un compuesto o polipéptido de la descripción, a partir de una secuencia de aminoácidos de la descripción, también se denomina en el presente documento"formatear"dicha secuencia de aminoácidos de la descripción; y se dice que un aminoácido de la descripción que forma parte de un compuesto o polipéptido de la descripción está"formateado"o está"en el formato de"dicho compuesto o polipéptido de la descripción. Ejemplos de maneras en que una secuencia de aminoácidos de la descripción se puede formatear y ejemplos de dichos formatos serán evidentes para el experto basándose en la divulgación del presente documento; y dichas secuencias de aminoácidos formateadas forman un aspecto adicional de la descripción.
[0267] En un aspecto específico de la descripción, un compuesto de la descripción o un polipéptido de la descripción puede tener una semivida prolongada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos compuestos y polipéptidos serán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional proporcionada en el presente documento y, por ejemplo, comprenderán secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la descripción que se han modificado químicamente para prolongar la semivida de los mismos (por ejemplo, mediante pegilación); secuencias de aminoácidos de la descripción que comprenden al menos un sitio de unión adicional para unirse a una proteína sérica (tal como albúmina sérica); o polipéptidos de la descripción que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de la descripción que está enlazada a al menos un resto (y, en particular, al menos una secuencia de aminoácidos) que prolonga la semivida de la secuencia de aminoácidos de la descripción. Ejemplos de polipéptidos de la descripción que comprenden dichos restos de semivida o secuencias de aminoácidos que prolongan la semivida se volverán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional en el presente documento; y, por ejemplo, incluyen, sin limitación, polipéptidos en los que la una o más secuencias de aminoácidos de la descripción están convenientemente enlazadas a una o más proteínas séricas o fragmentos de las mismas (tales como albúmina sérica (humana) o fragmentos adecuados de las mismas) o a una o más unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, por ejemplo, anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de dominio único, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio único, secuencias de "dAb", secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies que pueden unirse a proteínas séricas tales como albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana), inmunoglobulinas séricas tales como IgG o transferrina; se hace referencia a la descripción adicional y referencias mencionadas en el presente documento); polipéptidos en los que una secuencia de aminoácidos de la descripción está unida a una porción Fc (tal como un Fc humano) o una parte o fragmento adecuado de la misma; o polipéptidos en los que la una o más secuencias de aminoácidos de la descripción están enlazas de forma adecuada a una o más proteínas pequeñas o péptidos que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en los documentos de patente WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y a la solicitud provisional de EE. UU. de Ablynx N.V. Titulada"Peptides capable of binding to serum proteins"de Ablynx N.V. presentada el 5 de diciembre de 2006 (véase también el documento de patente WO2008/068280).
[0269] En general, los compuestos o polipéptidos de la descripción con semivida prolongada preferentemente tienen una semivida que es al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo, al menos 10 veces o más de 20 veces, superior a la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción de por sí. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la descripción con semivida prolongada pueden tener una semivida que está prolongada en más de 1 hora, preferentemente más de 2 horas, más preferentemente 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción de por sí.
[0271] En un aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción, dichos compuestos o polipéptidos de la descripción tienen una semivida en suero que está prolongada en más de 1 hora, preferentemente más de 2 horas, más preferentemente 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción de por sí.
[0272] En otro aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción, dichos compuestos o polipéptidos de la descripción presentan una semivida en suero en seres humanos de al menos aproximadamente 12 horas, preferentemente al menos 24 horas, más preferentemente al menos 48 horas, incluso más preferentemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la descripción pueden tener una semivida de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferentemente de al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferentemente de al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferentemente de al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más) o más de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
[0273] En otro aspecto, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la descripción o un polipéptido de la descripción (o un fragmento adecuado del mismo). Dicho ácido nucleico también se denominará en el presente documento un"ácido nucleico de la descripción"y puede estar, por ejemplo, en forma de una construcción genética, como se describe más adelante en el presente documento.
[0274] En otro aspecto, la descripción se refiere a un hospedador o célula hospedadora que expresa (o que, en circunstancias adecuadas, puede expresar) una secuencia de aminoácidos de la descripción y/o un polipéptido de la descripción; y/o que contiene un ácido nucleico de la descripción. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos hospedadores o células hospedadoras se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0275] La descripción se refiere además a un producto o composición que contiene o comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la descripción, al menos un polipéptido de la descripción (o un fragmento adecuado del mismo) y/o al menos un ácido nucleico de la descripción, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de dichas composiciones conocidas de por sí, es decir, dependiendo del uso previsto de la composición. Dicho producto o composición puede ser, por ejemplo, una composición farmacéutica (como se describe en el presente documento), una composición veterinaria o un producto o composición para uso diagnóstico (como también se describe en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos productos o composiciones se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0276] La descripción también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción, o de una composición que comprende la misma, en (métodos o composiciones para) la modulación de OX40L, ya sea in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo, en un organismo unicelular o multicelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo de padecer o padece un trastorno inflamatorio tal como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica).
[0277] La descripción también se refiere a métodos de modulación de OX40L, ya sea in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo, en una célula única u organismo multicelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo de padecer o padece un trastorno inflamatorio tal como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica), comprendiendo dicho método al menos la etapa de poner en contacto OX40L con al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción, o con una composición que comprende el mismo, de una manera y en una cantidad adecuada para modular OX40L con al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción.
[0278] La descripción también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción en la preparación de una composición (tal como, sin limitación, una composición o preparación farmacéutica como se describe más adelante en el presente documento) para modular OX40L, ya sea in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o in vivo (por ejemplo, en un organismo unicelular o multicelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que está en riesgo de padecer o padece un trastorno inflamatorio tal como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica).
[0279] En el contexto de la presente descripción, "que modula" o "para modular" generalmente significa reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de OX40L, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tal como los mencionados en el presente documento). En particular, "que modula" o "para modular" puede significar reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de OX40L, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tal como los mencionados en el presente documento), en al menos un 1 %, preferentemente al menos al menos un 5 %, tal como al menos un 10 % o al menos un 25 %, por ejemplo en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o 90 % o más, en comparación con la actividad de OX40L en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción.
[0280] Como será evidente para el experto, "modular" también puede implicar efectuar un cambio (que puede ser un aumento o una disminución) en la afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de OX40L para una o más de sus dianas, ligandos o sustratos; y/o efectuar un cambio (que puede ser un aumento o una disminución) en la sensibilidad de OX40L para una o más condiciones en el medio o alrededores en los que OX40L está presente (tal como pH, fuerza iónica, presencia de cofactores, etc.), en comparación con las mismas condiciones, pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción. Como será evidente para el experto, esto puede determinarse de nuevo de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido de por sí, tal como los ensayos descritos en el presente documento o en el estado de la técnica citado en el presente documento.
[0281] "Modular" también puede significar efectuar un cambio (es decir, una actividad como agonista o como antagonista, respectivamente) con respecto a uno o más mecanismos biológicos o fisiológicos, efectos, respuestas, funciones, vías o actividades en las que está implicado OX40L (o en las que su sustrato, ligando o vías están implicados, tal como su vía de señalización o vía metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados). De nuevo, como será evidente para el experto, dicha acción como un agonista o un antagonista puede determinarse de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (in vitro y normalmente celular o en ensayo) conocido de por sí, tal como los ensayos descritos en el presente documento o en el estado de la técnica citado en el presente documento. En particular, una acción como agonista o antagonista puede ser tal que una actividad biológica o fisiológica prevista aumente o disminuya, respectivamente, en al menos un 1 %, preferiblemente al menos un 5 %, tal como al menos un 10 % o al menos un 25 %, por ejemplo, en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o un 90 % o más, en comparación con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción.
[0282] La modulación puede implicar, por ejemplo, reducir o inhibir la unión de OX40L a uno de sus sustratos o ligandos y/o competir con un ligando natural, sustrato para unirse a OX40L. La modulación también puede implicar la activación de OX40L o el mecanismo o vía en la que está implicado. La modulación puede ser reversible o irreversible, pero para fines farmacéuticos y farmacológicos normalmente será de una manera reversible.
[0283] La descripción se refiere además a métodos para preparar o generar las secuencias de aminoácidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos métodos se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0284] Generalmente, estos métodos pueden comprender las etapas de:
[0285] a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos; y
[0286] b) cribar dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos para detectar secuencias de aminoácidos que puedan unirse y/o tener afinidad por OX40L;
[0287] y
[0288] c) aislar la secuencia o secuencias de aminoácidos que pueden unirse y/o tener afinidad por OX40L.
[0289] En dicho método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser cualquier conjunto, colección o biblioteca adecuado de secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de inmunoglobulina (como se describe en el presente documento), tal como un conjunto, colección o biblioteca intacto de secuencias de inmunoglobulina; un conjunto, colección o biblioteca sintético o semisintético de secuencias de inmunoglobulina; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de inmunoglobulina que se han sometido a maduración por afinidad.
[0290] Además, en dicho método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de dominios variables de la cadena pesada (tales como los dominios V<H>o los dominios V<HH>) o de dominios variables de la cadena ligera. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca de anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio único, o puede ser un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos que son capaces de funcionar como un anticuerpo de dominio o anticuerpo de dominio único.
[0291] En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de inmunoglobulina, por ejemplo, derivadas de un mamífero que ha sido inmunizado adecuadamente con OX40L o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte antigénica, fragmento, región, dominio, bucle u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, dicho determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, bucle u otro epítopo o epítopos extracelulares.
[0292] En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos se pueden visualizar en un fago, fagémido, ribosoma o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la selección. Los métodos, técnicas y organismos hospedadores adecuados para mostrar y cribar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto en la técnica, por ejemplo, basándose en la divulgación adicional en el presente documento. También se hace referencia a la revisión de Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005).
[0293] En otro aspecto, el método de generación de secuencias de aminoácidos comprende al menos las etapas de: a) proporcionar una colección o muestra de células que expresan secuencias de aminoácidos;
[0294] b) cribar dicha recogida o muestra de células en busca de células que expresan una secuencia de aminoácidos que puede unirse a y/o tiene afinidad por OX40L;
[0295] y
[0296] c) o (i) aislar dicha secuencia de aminoácidos; o (ii) aislar de dicha célula una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos, seguido de expresar dicha secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos deseada es una secuencia de inmunoglobulina, la colección o muestra de células puede ser, por ejemplo, una colección o muestra de linfocitos B. Además, en este método, la muestra de células puede derivar de un mamífero que se ha inmunizado adecuadamente con OX40L o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte antigénica, fragmento, región, dominio, bucle u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, dicho determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, bucle u otro epítopo o epítopos extracelulares.
[0297] El método anterior puede realizarse de cualquier manera adecuada, como será evidente para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos de patente EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 y WO 04/106377. El cribado de la etapa b) se realiza preferentemente usando una técnica de citometría de flujo tal como FACS. Para esto, se hace referencia, por ejemplo, a Lieby et al., Blood, Vol.97, n.º 12, 3820 (2001).
[0298] En otro aspecto, el método de generación de una secuencia de aminoácidos dirigida contra OX40L puede comprender al menos las etapas de:
[0299] a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos;
[0300] b) cribar dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico para detectar secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que puede unirse y/o tener afinidad por OX40L;
[0301] y
[0302] c) aislar dicha secuencia de ácido nucleico, seguido de expresar dicha secuencia de aminoácidos.
[0303] En dicho método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos puede ser, por ejemplo, un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca intacta de secuencias de inmunoglobulina; un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca sintética o semisintética de secuencias de inmunoglobulina; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de inmunoglobulina que han sido sometidas a maduración por afinidad.
[0304] Además, en dicho método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de dominios variables de la cadena pesada (tales como los dominios V<H>o los dominios V<HH>) o de dominios variables de la cadena ligera. Por ejemplo, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de anticuerpos de dominio o anticuerpos de dominio único, o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de aminoácidos que son capaces de funcionar como un anticuerpo de dominio o anticuerpo de dominio único.
[0305] En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, derivadas de un mamífero que ha sido inmunizado adecuadamente con OX40L o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte antigénica, fragmento, región, dominio, bucle u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, dicho determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, bucle u otro epítopo o epítopos extracelulares.
[0306] El conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede, por ejemplo, codificar un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de dominios variables de la cadena pesada o de dominios variables de la cadena ligera. En un aspecto específico, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de nucleótidos puede codificar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias V<HH>.
[0307] En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de nucleótidos se pueden visualizar en un fago, fagémido, ribosoma o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la selección. Los métodos, técnicas y organismos hospedadores adecuados para mostrar y cribar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto en la técnica, por ejemplo, basándose en la divulgación adicional en el presente documento. También se hace referencia a la revisión de Hoogenboom en Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005).
[0308] En otro aspecto, el método de generación de una secuencia de aminoácidos dirigida contra OX40L puede comprender al menos las etapas de:
[0309] a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos;
[0310] b) cribar dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico para detectar secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que puede unirse y/o tener afinidad por OX40L y que está bloqueado de forma cruzada o está bloqueando de forma cruzada un Nanobody de la descripción, por ejemplo, uno de SEQ ID NO: 179 a 185 (Tabla A-1), o un Nanobody humanizado u optimizado en secuencia de la descripción, tal como, por ejemplo, uno de SEQ ID NO: 199 a 226 (Tabla A-2), o un polipéptido o construcción de la descripción, por ejemplo, uno de SEQ ID NO: 186 a 198 y 227 a 234 (véanse la Tabla A-3 y la Tabla A-4); y
[0311] c) aislar dicha secuencia de ácido nucleico, seguido de expresar dicha secuencia de aminoácidos.
[0312] La descripción también se refiere a secuencias de aminoácidos que se obtienen mediante los métodos anteriores, o alternativamente mediante un método que comprende el uno de los métodos anteriores y, además, al menos las etapas de determinar la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de inmunoglobulina; y de expresar o sintetizar dicha secuencia de aminoácidos de una manera conocida de por sí, tal como por expresión en una célula hospedadora u organismo hospedador adecuado o por síntesis química.
[0313] Además, siguiendo las etapas anteriores, una o más secuencias de aminoácidos de la descripción pueden humanizarse adecuadamente (o alternativamente camelizarse); y/o la o las secuencias de aminoácidos así obtenidas pueden unirse entre sí o a una o más secuencias de aminoácidos adecuadas (opcionalmente a través de uno o más conectores adecuados) para proporcionar un polipéptido de la descripción. Además, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la descripción puede humanizarse adecuadamente (o camelizarse alternativamente) y expresarse adecuadamente; y/o una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos de la descripción pueden unirse entre sí o a una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican otras secuencias de aminoácidos adecuadas (opcionalmente a través de secuencias de nucleótidos que codifican uno o más conectores adecuados), después de lo cual la secuencia de nucleótidos así obtenida puede expresarse adecuadamente para proporcionar un polipéptido de la descripción.
[0314] La descripción se refiere además a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, compuestos, construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento, así como a métodos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con OX40L. Algunas aplicaciones y usos preferidos, pero no limitantes, se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0315] La descripción también se refiere a las secuencias de aminoácidos, compuestos, construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento para su uso en terapia.
[0316] En particular, la descripción también se refiere a las secuencias de aminoácidos, compuestos, construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento para su uso en la terapia de una enfermedad o trastorno que puede prevenirse o tratarse administrando, a un sujeto que lo necesite, (una cantidad farmacéuticamente eficaz de) una secuencia de aminoácidos, compuesto, construcción o polipéptido como se describe en el presente documento.
[0317] Más en particular, la descripción se refiere a las secuencias de aminoácidos, compuestos, construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento para su uso en terapia de trastornos inflamatorios tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica. Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la descripción también se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento, en la que la descripción se describirá y discutirá con más detalle con referencia a los Nanobodies de la descripción y polipéptidos de la descripción que comprenden los mismos, que forman algunos de los aspectos preferidos de la descripción.
[0318] Como se volverá evidente a partir de la descripción adicional en el presente documento, los Nanobodies generalmente ofrecen ciertas ventajas (descritas en el presente documento) en comparación con anticuerpos de "dAb" o de dominio similar (único) o secuencias de inmunoglobulina, cuyas ventajas también son proporcionadas por los Nanobodies de la descripción. Sin embargo, será evidente para el experto que los aspectos más generales de la enseñanza a continuación también se pueden aplicar (ya sea directa o análogamente) a otras secuencias de aminoácidos de la descripción.
[0319] DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0320] Figura 1:Especificidad de OX40L que bloquea el Nanobody OX40L01E07. La unión del OX40L01E07 a hOX40L capturado en neutravidina solo se inhibió mediante hOX40L añadido exógenamente (o, línea discontinua) y no se vio afectada por la adición de los otros miembros de la superfamilia del TNF, es decir, hRANKL (■), hCD30L (▲), hCD40L (▼), hTRAIL (¨) o hTNFa (·).
[0321] Figura 2:Inhibición de la activación de linfocitos T efectores mediada por OX40L mediante Nanobodies anti-OX40L biespecíficos monovalentes y trivalentes. Se incubaron 2×10<5>linfocitos T de memoria efectores CD45RA-CCR7-, 1×10<4>células CHO que expresaban hOX40L y series de dilución de Nanobodies anti-OX40L o referencia anti-OX40L durante 3 días a 37 °C. La producción de IL-4 se midió en ELISA. Todos los Nanobodies monovalentes y el Fab de referencia se muestran con líneas de puntos y símbolos abiertos: OX40L01E07 (□), OX40L18E09 (∘) y OX40L19D08 (-) en la Fig2A; OX40L01E10 (□), OX40L15B07 (∘), OX40L01B11 (-) en la Fig2B, Fab de referencia (r). Todos los Nanobodies biespecíficos trivalentes y la IgG de referencia se muestran con líneas y símbolos sólidos: OX40L003 (■), OX40L004 (·) y OX40L005 (◆) en la Fig2A; OX40L006 (■), OX40L007 (·) y OX40L009 (¨) en la Fig2B, IgG de referencia (▲).
[0322] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DESCRIPCIÓN
[0323] En la presente descripción, ejemplos y reivindicaciones:
[0324] a) A menos que se indique lo contrario o se definan de otro modo, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que serán evidentes para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales mencionados en el párrafo a) en la página 46 del documento WO 08/020079. b) A menos que se indique lo contrario, los términos "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia", "secuencia de nucleótidos" y "ácido nucleico" son como se describen en el párrafo b) en la página 46 del documento de patente WO 08/020079.
[0325] c) A menos que se indique de otro modo, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera en sí conocida, como será evidente para el experto. Por ejemplo, se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales y a los antecedentes generales de la técnica mencionados en el presente documento y a las referencias adicionales citadas en los mismos; así como a, por ejemplo, las siguientes reseñas Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin y Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Supl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, que describen técnicas para la modificación genética de proteínas, tales como la maduración por afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de proteínas tales como inmunoglobulinas.
[0326] e) Los residuos aminoacídicos se indicarán según el código convencional de aminoácidos de tres letras o de una letra. Se hace referencia, por ejemplo, a la Tabla A-2 en la página 48 de la solicitud internacional WO 08/020079 de Ablynx N.V. titulada"Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6 mediated signalling".e) Con el propósito de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de"identidad de secuencia"entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo e) en la página 49 del documento de patente WO 08/020079, tal como dividiendo [el número de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de nucleótidos] por [el número total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos] y multiplicando por [100 %], en la que cada eliminación, inserción, sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótidos, en comparación con la primera secuencia de nucleótidos, se considera una diferencia en un solo nucleótido (posición); o usando un algoritmo informático o técnica adecuada, de nuevo como se describe en el párrafo e) en la página 49 del documento de patente WO 08/020079.
[0327] f) Con el propósito de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de"identidad de secuencia"entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos (también denominada en el presente documento"identidad de aminoácidos") puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento de patente WO 08/020079, tal como dividiendo [el número de residuos aminoacídicos en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos aminoacídicos de las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoácidos] por [el número total de residuos aminoacídicos en la primera secuencia de aminoácidos] y multiplicando por [100 %], en la que cada eliminación, inserción, sustitución o adición de un residuo aminoacídico en la segunda secuencia de aminoácidos, en comparación con la primera secuencia de aminoácidos, se considera una diferencia en un solo residuo aminoacídico (posición), es decir, una "diferencia de aminoácidos" como se define en el presente documento; o usando un algoritmo informático o técnica adecuada, de nuevo como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento de patente WO 08/020079.
[0328] Además, al determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, el experto puede tener en cuenta las denominadas sustituciones "conservadoras" de aminoácidos, tal como se describe en la página 50 del documento de patente WO 08/020079.
[0329] Cualquier sustitución de aminoácidos aplicada a los polipéptidos descritos en el presente documento también puede basarse en el análisis de las frecuencias de variaciones aminoacídicas entre proteínas homólogas de diferentes especies, desarrollado por Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, sobre los análisis de los potenciales de formación de estructuras desarrollados por Chou y Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol.47: 45-149, 1978, y sobre el análisis de patrones de hidrofobia en proteínas desarrollado por Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte y Doolittle; J Molec. Biol.157: 105-132, 1981, y Goldman et al., Ann. Rev. Biophys.Chem.15: 321-353, 1986. Se proporciona información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de Nanobodies en la descripción del presente documento y en los antecedentes técnicos generales citados anteriormente. También, para este propósito, la estructura cristalina de un dominio V<HH>de una llama se proporciona, por ejemplo, por Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, Vol.7, 4, 361 (1999). En la técnica anterior citada anteriormente se puede encontrar información adicional sobre algunos de los residuos aminoacídicos que, en dominios V<H>convencionales, forman la interfaz V<H>/V<L>, y posibles sustituciones de camelizado en estas posiciones.
[0330] g) Se dice que las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico son"exactamente iguales" si tienen una identidad de secuencia del 100% (como se define en el presente documento) a lo largo de toda su longitud. h) Al comparar dos secuencias de aminoácidos, la expresión "diferencia de aminoácidos" se refiere a una inserción, deleción o sustitución de un solo residuo aminoacídico en una posición de la primera secuencia, en comparación con la segunda secuencia; entendiéndose que dos secuencias de aminoácidos pueden contener una, dos o más de dichas diferencias de aminoácidos.
[0331] i) Cuando se dice que una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos "comprende" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, o que "consiste esencialmente en" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, esto tiene el significado dado en el párrafo i) en las páginas 51-52 del documento de patente WO 08/020079.
[0332] j) La expresión "en forma esencialmente aislada" tiene el significado dado en el párrafo j) en las páginas 52 y 53 del documento de patente WO 08/020079.
[0333] k) Los términos "dominio" y "dominio de unión" tienen los significados dados en el párrafo k) en la página 53 del documento de patente WO 08/020079.
[0334] I) El término "dominio variable" se refiere a la parte o dominio de una molécula o anticuerpo de inmunoglobulina que es parcial o totalmente responsable de la unión al antígeno.
[0335] m) La expresión "dominio variable único" o "dominio variable único de inmunoglobulina" define moléculas en donde el sitio de unión al antígeno está presente en, y se forma por, un único dominio de inmunoglobulina. Esto diferencia los dominios variables únicos de las inmunoglobulinas "convencionales" o sus fragmentos, en donde dos dominios de inmunoglobulina, en particular dos dominios variables, interactúan para formar un sitio de unión al antígeno. Normalmente, en inmunoglobulinas convencionales, un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) interactúan para formar un sitio de unión al antígeno. En este caso, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) tanto de VH como de VL contribuirán al sitio de unión al antígeno, es decir, un total de 6 CDR estarán implicadas en la formación del sitio de unión al antígeno.
[0336] Por el contrario, el sitio de unión de un dominio variable único de inmunoglobulina se forma mediante un único dominio VH o VL. Por tanto, el sitio de unión al antígeno de un dominio variable único de inmunoglobulina se forma mediante no más de tres CDR. La expresión "dominio variable único de inmunoglobulina" comprende fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en donde el sitio de unión al antígeno está formado por un dominio variable único.
[0338] Generalmente, los dominios variables únicos serán secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente); o cualquier fragmento adecuado de dicha secuencia de aminoácidos (que entonces normalmente contendrá al menos algunos de los residuos aminoacídicos que forman al menos una de las CDR). Dichos dominios variables únicos de inmunoglobulina y fragmentos son lo más preferentemente de modo que comprenden un pliegue de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un pliegue de inmunoglobulina. Como tal, el dominio variable único de inmunoglobulina puede comprender, por ejemplo, una secuencia de dominio variable de la cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V<L>) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<H>o secuencia V<HH>) o un fragmento adecuado de la misma; siempre que sea capaz de formar una única unidad de unión al antígeno (es decir, una unidad de unión al antígeno funcional que consiste esencialmente en el dominio variable único de inmunoglobulina, de modo que el dominio de unión al antígeno único no necesita interactuar con otro dominio variable para formar una unidad de unión al antígeno funcional, como es, por ejemplo, el caso de los dominios variables que están presentes en, por ejemplo, anticuerpos convencionales y fragmentos scFv que necesitan interactuar con otro dominio variable, por ejemplo, a través de una interacción V<H>/V<L>para formar un dominio de unión al antígeno funcional).
[0340] En un aspecto de la descripción, los dominios variables únicos de inmunoglobulina son secuencias del dominio variable de la cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V<L>) o secuencias del dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<H>); más específicamente, los dominios variables únicos pueden ser secuencias del dominio variable de la cadena pesada que derivan de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o secuencias del dominio variable de la cadena pesada que derivan de un anticuerpo de cadena pesada.
[0342] El dominio variable único de inmunoglobulina puede ser un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para su uso como anticuerpo de dominio), un anticuerpo de dominio único (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para su uso como un anticuerpo de dominio único), un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que es adecuada para su uso como un dAb) o un Nanobody<®>(como se define en el presente documento, e incluyendo, pero sin limitación, una secuencia V<HH>)[Nota: Nanobody® y Nanobodies® son marcas comerciales registradas de Ablynx N.V.]; otros dominios variables únicos, o cualquier fragmento adecuado de uno cualquiera de los mismos. Para una descripción general de anticuerpos de dominio (único), también se hace referencia al estado de la técnica citado en el presente documento, así como al documento de patente EP 0368 684. Para el término "dAb" se hace referencia, por ejemplo, a Ward et al.1989 (Nature 341: 544-546), a Holt et al.
[0343] 2003 (Trends Biotechnol.21: 484-490), así como, por ejemplo, a los documentos de patente WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. También debe tenerse en cuenta que, aunque menos preferidos en el contexto de la presente descripción debido a que no son de origen mamífero, dominios variables únicos de inmunoglobulina pueden derivar de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados "dominios de IgNAR", véase, por ejemplo, el documento de patente WO 05/18629).
[0344] m) Los términos "determinante antigénico" y "epítopo", que también pueden usarse indistintamente en el presente documento, tienen los significados dados en el párrafo l) en la página 53 del documento de patente WO 08/020079.
[0345] o) Como se describe adicionalmente en el párrafo m) en la página 53 del documento de patente WO 08/020079, una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanobody, un polipéptido de la descripción o, en general, una proteína o polipéptido de unión al antígeno o un fragmento de la misma) que puede unirse (específicamente) a, que tenga afinidad por, y/o que tenga especificidad por, un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítopo del mismo) específico se dice que está "contra" o está "dirigido contra" dicho determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.
[0347] p) El término"especificidad"tiene el significado que se le da en el párrafo n) en las páginas 53-56 del documento de patente WO 08/020079; y como se menciona en el mismo se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que una molécula de unión al antígeno o proteína de unión al antígeno particular (tal como un Nanobody o un polipéptido de la descripción) puede unirse. La especificidad de una proteína de unión al antígeno puede determinarse basándose en la afinidad y/o avidez, como se describe en las páginas 53-56 del documento de patente WO 08/020079, que también describe algunas técnicas preferidas para medir la unión entre una molécula de unión al antígeno (tal como un Nanobody o polipéptido de la descripción) y el antígeno pertinente. Normalmente, las proteínas de unión al antígeno (tales como las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y/o polipéptidos de la descripción) se unen a su antígeno con una constante de disociación (K<D>) de 10<-5>a 10<-12>moles/litro o menos, y preferiblemente de 10<-7>a 10<-12>moles/litro o menos y más preferiblemente de 10<-8>a 10<-12>moles/litro (es decir, con una constante de asociación (K<A>) de 10<5>a 10<12>litros/moles o más, y preferiblemente 10<7>a 10<12>litros/moles o más y más preferiblemente 10<8>a 10<12>litros/moles). En general, se considera que cualquier valor de K<D>mayor de 10<4>mol/litro (o cualquier valor de K<A>menor de 10<4>M<-1>) litros/mol indica unión no específica. Preferentemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la descripción se unirá al antígeno deseado con una afinidad inferior a 500 nM, preferentemente inferior a 200 nM, más preferentemente inferior a 10 nM, como inferior a 500 pM. La unión de una proteína de unión al antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida de por sí, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competencia de tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas de por sí en la técnica; así como las otras técnicas mencionadas en el presente documento. Como será evidente para el experto, y como se describe en las páginas 53-56 del documento de patente WO 08/020079, la constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente. Los métodos de determinación de la constante de disociación serán evidentes para el experto y, por ejemplo, incluyen las técnicas mencionadas en las páginas 53-56 del documento de patente WO 08/020079.
[0349] q) La semivida de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la descripción puede definirse en general como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079 y como se menciona en el mismo se refiere al tiempo que tarda la concentración sérica de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido en reducirse en un 50 %in vivo, por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o a la eliminación o secuestro de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales. La semivida in vivo de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la descripción se puede determinar de cualquier modo en sí conocido, tal como por análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas serán evidentes para el experto en la técnica, y pueden ser, por ejemplo, en general, como se describen en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079. Como también se menciona en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079, la semivida se puede expresar usando parámetros tales como la t1/2-alfa, t1/2-beta y el área bajo la curva (ABC). Se hace referencia, por ejemplo, a la parte experimental, a continuación, así como a los manuales convencionales, tales como Kenneth, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2.ª edición rev. (1982). Los términos "prolongación en la semivida" o "semivida prolongada" también son tal como se definen en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 08/020079 y se refieren en particular a un aumento en la t1/2-beta, con o sin un aumento en la t1/2-alfa y/o el ABC o ambos.
[0351] r) En el contexto de la presente descripción, "que modula" o "para modular" generalmente significa reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de, una diana o antígeno, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado. En particular, "que modula" o "para modular" puede significar reducir o inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar una actividad biológica (relevante o prevista) de, una diana o antígeno, como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (que normalmente dependerá de la diana o antígeno implicado), en al menos un 1 %, preferentemente al menos un 5 %, tal como al menos un 10 % o al menos un 25 %, por ejemplo en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o 90 % o más, en comparación con la actividad de la diana o antígeno en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de la descripción.
[0353] Como será evidente para el experto, "modular" también puede implicar efectuar un cambio (que puede ser un aumento o una disminución) en la afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de una diana o antígeno para uno o más de sus ligandos, compañeros de unión, compañeros para asociación en una forma homomultimérica o heteromultimérica, o sustratos; y/o efectuar un cambio (que puede ser un aumento o una disminución) en la sensibilidad de la diana o antígeno para una o más condiciones en el medio o alrededores en los que la diana o antígeno está presente (tal como pH, fuerza iónica, presencia de cofactores, etc.), en comparación con las mismas condiciones, pero sin la presencia de la construcción de la descripción. Como será evidente para el experto, esto puede determinarse de nuevo de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido de por sí, dependiendo de la diana o antígeno implicado.
[0355] "Modular" también puede significar efectuar un cambio (es decir, una actividad como agonista, como antagonista o como agonista inverso, respectivamente, dependiendo de la diana o antígeno y el efecto biológico o fisiológico deseado) con respecto a uno o más mecanismos biológicos o fisiológicos, efectos, respuestas, funciones, vías o actividades en las que está implicado la diana o antígeno (o en las que su sustrato, ligando o vías están implicados, tal como su vía de señalización o vía metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados). De nuevo, como será evidente para el experto, dicha acción como un agonista o un antagonista puede determinarse de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (in vitro y normalmente celular o en ensayo) conocido de por sí, dependiendo de la diana o antígeno implicado. En particular, una acción como agonista o antagonista puede ser tal que una actividad biológica o fisiológica prevista aumente o disminuya, respectivamente, en al menos un 1 %, preferiblemente al menos un 5 %, tal como al menos un 10 % o al menos un 25 %, por ejemplo, en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o un 90 % o más, en comparación con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia de la construcción de la descripción.
[0357] La modulación también puede implicar, por ejemplo, la modulación alostérica de la diana o antígeno; y/o reducir o inhibir la unión de la diana o antígeno a uno de sus sustratos o ligandos y/o competir con un ligando natural, sustrato para unirse a la diana o antígeno. La modulación también puede implicar la activación de la diana o antígeno o el mecanismo o vía en la que está implicado. La modulación también puede implicar, por ejemplo, efectuar un cambio con respecto al plegamiento o conformación de la diana o antígeno, o con respecto a la capacidad de la diana o antígeno para plegarse, para cambiar su conformación (por ejemplo, tras la unión de un ligando), para asociarse con otras (sub)unidades o para disociarse. La modulación también puede implicar, por ejemplo, efectuar un cambio en la capacidad de la diana o antígeno para transportar otros compuestos o para servir como canal para otros compuestos (tales como iones).
[0359] La modulación puede ser reversible o irreversible, pero para fines farmacéuticos y farmacológicos normalmente será de una manera reversible.
[0361] s) Con respecto a una diana o antígeno, el término "sitio de interacción" en la diana o antígeno significa un sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos aminoacídicos en la diana o antígeno que es un sitio de unión a un ligando, receptor u otro compañero de unión, un sitio catalítico, un sitio de escisión, un sitio para interacción alostérica, un sitio implicado en multimerización (tal como homomerización o heterodimerización) de la diana o antígeno; o cualquier otro sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos aminoacídicos en la diana o antígeno que esté implicado en una acción o mecanismo biológico de la diana o antígeno. Más en general, un "sitio de interacción" puede ser cualquier sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos aminoacídicos en la diana o antígeno al que una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la descripción puede unirse de tal manera que se module la diana o antígeno (y/o cualquier vía, interacción, señalización, mecanismo biológico o efecto biológico en que esté implicada la diana o el antígeno) (como se define en el presente documento).
[0363] t) Se dice que una secuencia de aminoácidos o polipéptido es "específico para" una primera diana o antígeno en comparación con una segunda diana o antígeno cuando se une al primer antígeno con una afinidad (como se ha descrito anteriormente, y se expresa adecuadamente como un valor de K<D>, valor de K<A>, velocidad K<dis>y/o velocidad K<as>) que es al menos 10 veces, tal como al menos 100 veces y preferentemente al menos 1000 veces, y hasta 10.000 veces o más, mejor que la afinidad con que dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se une a la segunda diana o polipéptido. Por ejemplo, el primer antígeno puede unirse a la diana o antígeno con un valor de K<D>que es al menos 10 veces inferior, tal como al menos 100 veces inferior y preferentemente al menos 1000 veces inferior, tal como 10.000 veces menos o incluso menos que esto, que la K<D>con que dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se une a la segunda diana o polipéptido. Preferentemente, cuando una secuencia de aminoácidos o polipéptido es "específico para" una primera diana o antígeno en comparación con una segunda diana o antígeno, está dirigida contra (como se define en el presente documento) dicha primera diana o antígeno, pero no está dirigida contra dicha segunda diana o antígeno.
[0365] u) los términos"bloquear de forma cruzada", "bloqueado de forma cruzada"y"bloqueo cruzado"se usan indistintamente en el presente documento para significar la capacidad de una secuencia de aminoácidos u otros agentes de unión (tales como un Nanobody, polipéptido o compuesto o construcción de la descripción) para interferir con la unión de otras secuencias de aminoácidos o agentes de unión de la descripción a una diana dada. La medida en que una secuencia de aminoácidos u otros agentes de unión de la descripción es capaz de interferir con la unión de otro compuesto a la diana y, por lo tanto, si puede decirse que se bloquea de forma cruzada según la descripción, puede determinarse usando ensayos de unión por competencia. Un ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo particularmente adecuado usa una máquina Biacore que puede medir el alcance de las interacciones usando tecnología de resonancia de plasmones superficiales. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en ELISA para medir la competencia entre secuencias de aminoácidos u otros agentes de unión en términos de su unión a la diana.
[0367] Lo siguiente describe generalmente un ensayo de Biacore adecuado para determinar si una secuencia de aminoácidos u otro agente de unión bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de forma cruzada según la descripción. Se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de las secuencias de aminoácidos u otros agentes de unión descritos en el presente documento. La máquina Biacore (por ejemplo, Biacore 3000) funciona según las recomendaciones del fabricante. Por lo tanto, en un ensayo de bloqueo cruzado, la proteína diana se acopla a un chip CM5 Biacore usando la química de acoplamiento de amina estándar para generar una superficie que está recubierta con la diana. Normalmente, 200-800 unidades de resonancia de la diana estarían acopladas al chip (una cantidad que da niveles de unión fácilmente medibles, pero que es fácilmente saturable por las concentraciones del reactivo de prueba que se está usando). Dos secuencias de aminoácidos de ensayo (denominadas A* y B*) que se van a evaluar en cuanto a su capacidad para bloquearse de forma cruzada se mezclan en una relación molar de uno a uno de sitios de unión en un tampón adecuado para crear la mezcla de prueba. Al calcular las concentraciones en un sitio de unión, se asume que el peso molecular de una secuencia de aminoácidos es el peso molecular total de la secuencia de aminoácidos dividido por el número de sitios de unión diana en esa secuencia de aminoácidos. La concentración de cada secuencia de aminoácidos en la mezcla de ensayo debe ser lo suficientemente alta como para saturar fácilmente los sitios de unión para esa secuencia de aminoácidos en las moléculas diana capturadas en el chip Biacore. Las secuencias de aminoácidos en la mezcla están a la misma concentración molar (sobre una base de unión) y esa concentración normalmente estaría entre 1,00 y 1,5 micromolar (sobre una base de sitio de unión). También se preparan disoluciones separadas que contienen A* sola y B* sola. A* y B* en estas disoluciones deben estar en el mismo tampón y a la misma concentración que en la mezcla de ensayo. La mezcla de ensayo se pasa por el chip Biacore recubierto con diana y se registra la cantidad total de unión. A continuación, el chip se trata de tal manera que elimine las secuencias de aminoácidos unidas sin dañar la diana unida al chip. Normalmente, esto se hace tratando el chip con HCl 30 mM durante 60 segundos. A continuación, la disolución de A* sola se pasa sobre la superficie recubierta con diana y se registra la cantidad de unión. El chip se trata de nuevo para eliminar todas las secuencias de aminoácidos unidas sin dañar la diana unida al chip. A continuación, la disolución de B* sola se pasa sobre la superficie recubierta con diana y se registra la cantidad de unión. A continuación se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de A* y B*, y es la suma de la unión de cada secuencia de aminoácidos cuando se pasa sola sobre la superficie diana. Si la unión real registrada de la mezcla es menor que este máximo teórico, entonces las dos secuencias de aminoácidos se bloquean de forma cruzada entre sí. Por lo tanto, en general, una secuencia de aminoácidos de bloqueo cruzado u otro agente de unión según la descripción es uno que se unirá a la diana en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore anterior de modo que, durante el ensayo y en presencia de una segunda secuencia de aminoácidos u otro agente de unión de la descripción, la unión registrada está entre un 80 % y un 0,1 % (por ejemplo, 75 % a 4 %) de la unión teórica máxima, específicamente entre un 75 % y un 0,1 % (por ejemplo, 80 % a 4 %) de la unión teórica máxima, y más específicamente entre un 70 % y un 0,1 % (por ejemplo, 70 % a 4 %) de la unión teórica máxima (como se ha definido anteriormente) de las dos secuencias de aminoácidos o agentes de unión en combinación. El ensayo de Biacore descrito anteriormente es un ensayo principal usado para determinar si las secuencias de aminoácidos u otros agentes de unión se bloquean de forma cruzada entre sí según la descripción. En raras ocasiones, las secuencias de aminoácidos particulares u otros agentes de unión pueden no unirse a la diana acoplada mediante química de amina a un chip Biacore CM5 (esto ocurre normalmente cuando el sitio de unión relevante en la diana está enmascarado o destruido por el acoplamiento al chip). En dichos casos, el bloqueo cruzado se puede determinar usando una versión marcada de la diana, por ejemplo, una versión marcada con His aminoterminal. En este formato particular, una secuencia de aminoácidos anti-His se acoplaría al chip Biacore y después la diana marcada con His se pasaría por la superficie del chip y se capturaría por la secuencia de aminoácidos anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se describe anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración de chip, la nueva diana marcada con His se cargaría de nuevo en la superficie recubierta de secuencia de aminoácidos anti-His. Además del ejemplo dado usando diana marcada con His aminoterminal, alternativamente podría usarse diana marcada con His carboxiterminal. Además, podrían usarse varias otras etiquetas y combinaciones de proteínas de unión de etiqueta conocidas en la técnica para dicho análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo, etiqueta HA con anticuerpos anti-HA; etiqueta FLAG con anticuerpos anti-FLAG; etiqueta de biotina con estreptavidina).
[0369] Lo siguiente describe generalmente un ensayo de ELISA para determinar si una secuencia de aminoácidos u otro agente de unión dirigido contra una bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de forma cruzada como se define en el presente documento. Se apreciará que el ensayo se puede usar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos (u otros agentes de unión tales como polipéptidos de la descripción) descritos en el presente documento. El principio general del ensayo es tener una secuencia de aminoácidos o agente de unión que se dirige contra la diana recubierta en los pocillos de una placa de ELISA. Se añade una cantidad en exceso de una segunda secuencia de aminoácidos anti-diana, potencialmente de bloqueo cruzado, en disolución (es decir, no unida a la placa de ELISA). A continuación, se añade una cantidad limitada de la diana a los pocillos. La secuencia de aminoácidos recubierta y la secuencia de aminoácidos en disolución compiten por la unión del número limitado de moléculas diana. La placa se lava para eliminar el exceso de diana que no se ha unido a la secuencia de aminoácidos recubierta y también para eliminar la segunda secuencia de aminoácidos de fase de disolución, así como cualquier complejo formado entre la segunda secuencia de aminoácidos de fase de disolución y la diana. A continuación, la cantidad de diana unida se mide usando un reactivo que es apropiado para detectar la diana. Una secuencia de aminoácidos en disolución que es capaz de bloquear de forma cruzada la secuencia de aminoácidos recubierta será capaz de provocar una disminución en el número de moléculas diana a la que la secuencia de aminoácidos recubierta puede unirse con respecto al número de moléculas diana a la que la secuencia de aminoácidos recubierta puede unirse en ausencia de la segunda secuencia de aminoácidos de fase de disolución. En el caso en que la primera secuencia de aminoácidos, por ejemplo, un Ab-X, se elige para ser la secuencia de aminoácidos inmovilizada, se recubre sobre los pocillos de la placa de ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una disolución de bloqueo adecuada para minimizar la unión no específica de los reactivos que se añaden posteriormente. A continuación, se añade una cantidad en exceso de la segunda secuencia de aminoácidos, es decir, Ab-Y, a la placa de ELISA de modo que los moles de los sitios de unión a la diana de Ab-Y por pocillo son al menos 10 veces mayores que los moles de los sitios de unión a la diana de Ab-X que se usaron, por pocillo, durante el recubrimiento de la placa de ELISA. A continuación, la diana se añade de modo que los moles de la diana añadidos por pocillo son al menos 25 veces menores que los moles de los sitios de unión de la diana de Ab-X que se usaron para recubrir cada pocillo. Después de un periodo de incubación adecuado, la placa de ELISA se lava y se añade un reactivo para detectar la diana para medir la cantidad de diana unida específicamente por la secuencia de aminoácidos anti-diana recubierta (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con la secuencia de aminoácidos recubiertos (en este caso Ab-X), la segunda secuencia de aminoácidos de fase de disolución (en este caso Ab-Y), tampón diana únicamente (es decir, sin diana) y reactivos de detección de diana. La señal de control positiva para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con la secuencia de aminoácidos recubiertos (en este caso Ab-X), tampón de segunda secuencia de aminoácidos de fase de disolución solamente (es decir, sin la segunda secuencia de aminoácidos de fase de disolución), diana y reactivos de detección diana. El ensayo de ELISA puede ejecutarse de tal manera que la señal de control positiva sea al menos 6 veces la señal de fondo. Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para la diana) que resulte de la elección de qué secuencia de aminoácidos usar como secuencia de aminoácidos de recubrimiento y cuál usar como segunda secuencia de aminoácidos (competidor), el ensayo de bloqueo cruzado puede ejecutarse en dos formatos: 1) el formato 1 es donde Ab-X es la secuencia de aminoácidos que está recubierta sobre la placa de ELISA y Ab-Y es la secuencia de aminoácidos competidora que está en disolución y 2) el formato 2 es donde Ab-Y es la secuencia de aminoácidos que está recubierta sobre la placa de ELISA y Ab-X es la secuencia de aminoácidos competidora que está en disolución. Ab-X y Ab-Y se definen como bloqueo cruzado si, ya sea en el formato 1 o en el formato 2, la secuencia de aminoácidos anti-diana de la fase de disolución es capaz de provocar una reducción de entre un 60 % y un 100 %, específicamente entre un 70 % y un 100 %, y más específicamente entre un 80 % y un 100 %, de la señal de detección de la diana (es decir, la cantidad de diana unida por la secuencia de aminoácidos recubierta) en comparación con la señal de detección de la diana obtenida en ausencia de la secuencia de aminoácidos antidiana en fase de disolución (es decir, los pocillos de control positivo).
[0371] v) Se dice que una secuencia de aminoácidos es "reactiva de forma cruzada" para dos antígenos o determinantes antigénicos diferentes (tales como albúmina sérica de dos especies diferentes de mamífero, tales como albúmina sérica humana y albúmina sérica de macaco cangrejero) si es específica para (como se define en el presente documento) estos dos antígenos o determinantes antigénicos diferentes.
[0373] w) Por unión que es"esencialmente independiente del pH"se entiende generalmente en el presente documento que la constante de asociación (K<A>) de la secuencia de aminoácidos con respecto a la proteína sérica (tal como albúmina sérica) al valor o valores de pH que se producen en una célula de un cuerpo animal o humano (como se describe más adelante en el presente documento) es al menos un 5 %, tal como al menos un 10 %, preferentemente al menos un 25 %, más preferentemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos el 60 %, tal como incluso más preferiblemente al menos un 70 %, tal como al menos un 80 % o un 90 % o más (o incluso más del 100 %, tal como más del 110 %, más del 120 % o incluso el 130 % o más, o incluso más del 150 %, o incluso más del 200 %) de la constante de asociación (K<A>) de la secuencia de aminoácidos con respecto a la misma proteína sérica al valor o valores de pH que se producen fuera de dicha célula. Alternativamente, por unión que es"esencialmente independiente del pH"se entiende generalmente en el presente documento que la velocidad k<dis>(medida por Biacore) de la secuencia de aminoácidos con respecto a la proteína sérica (tal como albúmina sérica) al valor o valores de pH que se producen en una célula de un cuerpo animal o humano (como, por ejemplo, se describe más adelante en el presente documento, por ejemplo, pH alrededor de 5,5, por ejemplo, de 5,3 a 5,7) es al menos un 5 %, tal como al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 25 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos un 60 %, tal como incluso más preferiblemente al menos un 70 %, tal como al menos un 80 % o 90 % o más (o incluso más del 100 %, tal como más del 110 %, más del 120 % o incluso 130 % o más, o incluso más del 150 %, o incluso más del 200 %) de la velocidad k<as>de la secuencia de aminoácidos con respecto a la misma proteína sérica al valor o valores de pH que se producen fuera de dicha célula, por ejemplo, pH 7,2 a 7,4. Por"el valor o valores de pH que se producen en una célula de un animal o cuerpo humano"se entiende el valor o valores de pH que pueden ocurrir dentro de una célula, y en particular dentro de una célula que está implicada en el reciclaje de la proteína sérica. En particular, por"el valor o valores de pH que se producen en una célula de un animal o cuerpo humano"se entiende el valor o valores de pH que pueden ocurrir dentro de un compartimiento (sub)celular o vesícula que está implicada en el reciclaje de la proteína sérica (por ejemplo, como resultado de pinocitosis, endocitosis, transcitosis, exocitosis y fagocitosis o un mecanismo similar de captación o internalización en dicha célula), tal como un endosoma, lisosoma o pinosoma.
[0375] x) Como se describe además en el presente documento, el número total de residuos aminoacídicos en un Nanobody puede estar en la región de 110-120, es preferiblemente 112-115, y es más preferiblemente 113. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describen con más detalle en el presente documento) de un Nanobody no están particularmente limitados en cuanto a su longitud y/o tamaño, siempre que dichas partes, fragmentos, análogos o derivados cumplan los requisitos adicionales expuestos brevemente en el presente documento y también sean preferiblemente adecuados para los fines descritos en el presente documento.
[0377] y) Como se describe con más detalle en el párrafo q) en las páginas 58 y 59 del documento de patente WO 08/020079, los residuos aminoacídicos de un Nanobody se numeran según la numeración general para dominios V<H>dada por Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", Servicios de Salud Pública de Estados Unidos, NIH Bethesda, MD, publicación n.º 91), tal como se aplica a los dominios V<HH>de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods, 23 de junio del 2000; 240 (1-2): 185-195 (véase, por ejemplo, la Figura 2 de esta publicación), y en consecuencia FR1 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 95-102 y FR4 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 103-113.
[0378] z) Las Figuras, el Listado de Secuencias y la Parte Experimental/Ejemplos solo se dan para ilustrar adicionalmente la invención.
[0379] Para una descripción general de anticuerpos de cadena pesada y sus dominios variables, se hace referencia, entre otras cosas, al estado de la técnica citado en el presente documento, así como al estado de la técnica mencionado en la página 59 del documento de patente WO 08/020079 y a la lista de referencias mencionada en las páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153.
[0380] Según la terminología usada en la técnica (véanse las referencias anteriores), los dominios variables presentes en los anticuerpos de cadena pesada de origen natural también se denominarán"dominios VHH",con el fin de distinguirlos de los dominios variables de la cadena pesada que están presentes en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominarán a continuación"dominios VH") y a partir de los dominios variables de la cadena ligera que están presentes en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominarán a continuación"dominios VL").
[0381] Como se mencionó en el estado de la técnica mencionado anteriormente, los dominios V<HH>tienen una serie de características estructurales y propiedades funcionales únicas que hacen que los dominios V<HH>aislados (así como los Nanobodies basados en los mismos, que comparten estas características estructurales y propiedades funcionales con los dominios V<HH>de origen natural) y proteínas que contienen los mismos sean altamente ventajosos para su uso como dominios o proteínas de unión al antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a los mismos, los dominios V<HH>(que han sido "diseñados" por naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin la presencia de, y sin ninguna interacción con, un dominio variable de la cadena ligera) y los Nanobodies pueden funcionar como una unidad estructural, dominio o proteína de unión al antígeno única, relativamente pequeña y funcional. Esto distingue los dominios V<HH>de los dominios V<H>y V<L>de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, que por sí mismos generalmente no son adecuados para aplicación práctica como proteínas o dominios de unión a antígeno individuales, pero necesitan combinarse de alguna forma u otra para proporcionar una unidad de unión al antígeno funcional (como en, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos convencionales tales como fragmentos Fab; en fragmentos scFv, que consisten en un dominio V<H>unido covalentemente a un dominio V<L>).
[0382] Debido a estas propiedades únicas, el uso de dominios V<HH>y Nanobodies como proteínas de unión al antígeno individuales o como dominios de unión a antígeno (es decir, como parte de una proteína o polipéptido más grande) ofrece una serie de ventajas significativas sobre el uso de dominios V<H>y V<L>convencionales, scFv o fragmentos de anticuerpos convencionales (tales como fragmentos Fab- o F(ab')<2>), incluyendo las ventajas que se enumeran en las páginas 60 y 61 del documento de patente WO 08/020079.
[0383] En un aspecto específico y preferido, la descripción proporciona Nanobodies contra OX40L, y en particular Nanobodies contra OX40L de un animal de sangre caliente, y más en particular Nanobodies contra OX40L de un mamífero, y especialmente Nanobodies contra OX40L humano; así como proteínas y/o polipéptidos que comprenden al menos uno de dichos Nanobodies.
[0384] En particular, la descripción proporciona Nanobodies contra OX40L, y proteínas y/o polipéptidos que comprenden los mismos, que tienen propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas (tales como, por ejemplo, facilidad mejorada de preparación y/o costes reducidos de los bienes), en comparación con anticuerpos convencionales contra OX40L o fragmentos del mismo, en comparación con construcciones que podrían basarse en anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpos (tales como fragmentos Fab', fragmentos F(ab')<2>, construcciones de scFv, "diacuerpos" y otras construcciones multiespecíficas (véase, por ejemplo, la revisión por Holliger y Hudson Nat Biotechnol. 2005 sep;23(9):1126-36)), y también en comparación con los denominados "dAb" o anticuerpos de dominio similar (único) que pueden derivar de dominios variables de anticuerpos convencionales. Estas propiedades mejoradas y ventajosas se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento, y por ejemplo incluyen, sin limitación, una o más de:
[0385] • aumento de la afinidad y/o la avidez por OX40L, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación);
[0386] • mejor idoneidad para formatear en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente); • mejor idoneidad para formatear en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación);
[0387] • idoneidad o susceptibilidad mejorada para sustituciones "humanizantes" (como se definen en el presente documento);
[0388] • menos inmunogenicidad, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación);
[0389] • mayor estabilidad, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación);
[0390] • mayor especificidad hacia OX40L, ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación);
[0391] • disminución o, cuando se desee, aumento de la reactividad cruzada con OX40L de diferentes especies; y/o
[0392] • una o más propiedades mejoradas deseables para uso farmacéutico (incluyendo uso profiláctico y/o uso terapéutico) y/o para uso diagnóstico (incluyendo, pero sin limitación, uso con fines de obtención de imágenes), ya sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación).
[0393] Como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoácidos de la descripción, los Nanobodies de la descripción están preferentemente en forma esencialmente aislada (como se define en el presente documento), o forman parte de una proteína o polipéptido de la descripción (como se define en el presente documento), que puede comprender o consistir esencialmente en uno o más Nanobodies de la descripción y que opcionalmente pueden comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas unidas opcionalmente a través de uno o más conectores adecuados). Por ejemplo, y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos de la descripción pueden usarse como unidad de unión en dicha proteína o polipéptido, que opcionalmente pueden contener una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como unidad de unión (es decir, contra una o más dianas distintas de OX40L), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico de la descripción, respectivamente, todo como se describe en el presente documento. En particular, dicha proteína o polipéptido puede comprender o consistir esencialmente en uno o más Nanobodies de la descripción y opcionalmente uno o más (otros) Nanobodies (es decir, dirigidos contra otras dianas distintas de OX40L), todos unidos opcionalmente a través de uno o más conectores adecuados, para proporcionar una construcción de Nanobody monovalente, multivalente o multiespecífica, respectivamente, como se describe más adelante en el presente documento. Dichas proteínas o polipéptidos también pueden estar en forma esencialmente aislada (como se define en el presente documento).
[0394] En un Nanobody de la descripción, el sitio de unión para la unión contra OX40L está formado preferentemente por las secuencias de CDR. Opcionalmente, un Nanobody de la descripción también puede contener, y además del al menos un sitio de unión para unirse contra OX40L, uno o más sitios de unión adicionales para unirse contra otros antígenos, proteínas o dianas. Para métodos y posiciones para introducir dichos segundos sitios de unión, se hace referencia, por ejemplo, a Keck y Huston, Biophysical Journal, 71, octubre de 1996, 2002-2011; documentos de patente EP 0640130; y WO 06/07260.
[0395] Como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoácidos de la descripción, cuando un Nanobody de la descripción (o un polipéptido de la descripción que comprende el mismo) está destinado a administración a un sujeto (por ejemplo, para fines terapéuticos y/o diagnósticos como se describe en el presente documento), está dirigido preferentemente contra OX40L humano; mientras que para fines veterinarios, está dirigido preferentemente contra OX40L de la especie a tratar. Además, al igual que con las secuencias de aminoácidos de la descripción, un Nanobody de la descripción puede tener o no reactividad cruzada (es decir, dirigirse contra OX40L de dos o más especies de mamífero, tales como contra OX40L humano y OX40L de al menos una de las especies de mamífero mencionadas en el presente documento).
[0396] Además, de nuevo, como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoácidos de la descripción, los Nanobodies de la descripción generalmente pueden dirigirse contra cualquier determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) de OX40L.
[0397] Como ya se ha descrito en el presente documento, puede considerarse que la secuencia de aminoácidos y la estructura de un Nanobody comprenden, sin, sin embargo, limitarse a ello, cuatro regiones estructurales o "FR" (o algunas veces también denominadas "FW") que se denominan en la técnica y en el presente documento "región estructural 1" o "FR1"; "región estructural 2" o "FR2"; "región estructural 3" o "FR3"; y "región estructural 4" o "FR4", respectivamente; que son regiones estructurales interrumpidas por tres regiones determinantes de la complementariedad o "CDR", que se denominan en la técnica "región determinante de la complementariedad 1" o "CDR1"; "región determinante de la complementariedad 2" o "CDR2"; y "región determinante de la complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Algunas secuencias estructurales preferidas y CDR (y combinaciones de las mismas) que están presentes en los Nanobodies de la descripción son como se describe en el presente documento. Se pueden obtener otras secuencias de CDR adecuadas mediante los métodos descritos en el presente documento.
[0398] Según un aspecto no limitante pero preferido de la descripción, (las secuencias de CDR presentes en) los Nanobodies de la descripción son tales que:
[0399] • los Nanobodies pueden unirse a OX40L con una constante de disociación (K<D>) de 10<-5>a 10<-12>moles/litro o menos, y preferiblemente de 10<-7>a 10<-12>moles/litro o menos y más preferiblemente de 10<-8>a 10<-12>moles/litro (es decir, con una constante de asociación (K<A>) de 10<5>a 10<12>litros/moles o más, y preferiblemente 10<7>a 10<12>litros/moles o más y más preferiblemente 10<8>a 10<12>litros/moles);
[0400] y/o tales que:
[0401] • los Nanobodies pueden unirse a OX40L con una velocidad k<as>de entre 10<2>M<-1>s<-1>a aproximadamente 10<7>M<-1>s<-1>, preferiblemente entre 10<3>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, más preferiblemente entre 10<4>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, tal como entre 10<5>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>;
[0402] y/o tales que:
[0403] • los Nanobodies pueden unirse a OX40L con una velocidad k<dis>entre 1 s<-1>(t<1/2>= 0,69 s) y 10<-6>s<-1>(proporcionando un complejo casi irreversible con una t<1/2>de múltiples días), preferentemente entre 10<-2>s<-1>y 10<-6>s<-1>, más preferiblemente entre 10<-3>s<-1>y 10<-6>s<-1>, tal como entre 10<-4>s<-1>y 10<-6>s<-1>.
[0404] Preferiblemente, (las secuencias de CDR presentes en) los Nanobodies de la descripción son tales que: un Nanobody monovalente de la descripción (o un polipéptido que contiene solo un Nanobody de la descripción) es preferiblemente tal que se unirá a OX40L con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM.
[0405] La afinidad del Nanobody de la descripción contra OX40L se puede determinar de una manera conocida de por sí, por ejemplo usando las técnicas generales para medir K<D>. K<A>, k<dis>o k<as>mencionados en el presente documento, así como algunos de los ensayos específicos descritos en el presente documento.
[0406] Algunos valores de CI50 preferidos para la unión de los Nanobodies de la descripción (y de polipéptidos que comprenden los mismos) a OX40L se volverán evidentes a partir de la descripción adicional y ejemplos en el presente documento.
[0407] En un aspecto preferido pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody (como se define en el presente documento) contra OX40L, que consiste en 4 regiones marco (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en las que:
[0408] • CDR1 se elige del grupo que consiste en:
[0409] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0410] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0411] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0412] y/o
[0413] • CDR2 se elige del grupo que consiste en:
[0414] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0415] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0416] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0417] y/o
[0418] • CDR3 se elige del grupo que consiste en:
[0419] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0420] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0421] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0422] o cualquier fragmento adecuado de dicha secuencia de aminoácidos.
[0423] En particular, según este aspecto preferido pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody (como se define en el presente documento) contra OX40L, que consiste en 4 regiones marco (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en las que:
[0424] • CDR1 se elige del grupo que consiste en:
[0425] a) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0426] b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0427] c) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 a 139;
[0428] y
[0429] • CDR2 se elige del grupo que consiste en:
[0430] d) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0431] e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0432] f) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 a 153;
[0433] y
[0434] • CDR3 se elige del grupo que consiste en:
[0435] g) secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0436] h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0437] i) secuencias de aminoácidos que tienen una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 a 167;
[0438] o cualquier fragmento adecuado de dichas secuencias de aminoácidos.
[0439] Como se menciona generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoácidos de la descripción, cuando un Nanobody de la descripción contiene una o más secuencias de CDR1 según b) y/o c):
[0440] i) cualquier sustitución de aminoácidos en una CDR de este tipo según b) y/o c) es preferentemente, y en comparación con la CDR correspondiente según a), una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en el presente documento);
[0441] y/o
[0442] ii) la CDR según b) y/o c) contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la CDR correspondiente según a);
[0443] y/o
[0444] iii) la CDR según b) y/o c) puede ser una CDR que deriva de una CDR según a) mediante maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas de por sí.
[0445] Del mismo modo, cuando un Nanobody de la descripción contiene una o más secuencias de CDR2 según e) y/o f):
[0446] i) cualquier sustitución de aminoácidos en dicha CDR e) y/o f) es preferentemente, y en comparación con la CDR correspondiente según d), una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en el presente documento);
[0447] y/o
[0448] ii) la CDR según e) y/o f) contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la CDR correspondiente según d);
[0449] y/o
[0450] iii) la CDR según e) y/o f) puede ser una CDR que deriva de una CDR según d) mediante maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas de por sí.
[0451] También, de manera similar, cuando un Nanobody de la descripción contiene una o más secuencias de CDR3 según h) y/o i):
[0452] i) cualquier sustitución de aminoácidos en dicha CDR según h) y/o i) es preferentemente, y en comparación con la CDR correspondiente según g), una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en el presente documento);
[0453] y/o
[0454] ii) la CDR según h) y/o i) contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la CDR correspondiente según g);
[0455] y/o
[0456] iii) la CDR según h) y/o i) puede ser una CDR que deriva de una CDR según g) mediante maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas de por sí.
[0457] Debe entenderse que los últimos tres párrafos se aplican generalmente a cualquier Nanobody de la descripción que comprende una o más secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y/o secuencias de CDR3 según b), c), e), f), h) o i), respectivamente.
[0458] De los Nanobodies de la descripción, se prefieren particularmente Nanobodies que comprenden uno o más de las CDR enumeradas explícitamente anteriormente; se prefieren más particularmente Nanobodies que comprenden dos o más de las CDR enumeradas explícitamente anteriormente; y se prefieren de la manera más particularmente preferida Nanobodies que comprenden tres de las CDR enumeradas explícitamente anteriormente.
[0459] Algunas combinaciones particularmente preferidas, pero no limitantes de secuencias de CDR, así como combinaciones preferidas de secuencias de CDR y secuencias estructurales, se mencionan en la Tabla B-1 a continuación, que enumera las secuencias de CDR y secuencias estructurales que están presentes en varios Nanobodies preferidos (pero no limitantes) de la descripción. Como será evidente para el experto, normalmente se preferirá una combinación de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que ocurren en el mismo clon (es decir, secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que se mencionan en la misma línea en la Tabla B-1) (aunque la descripción en su sentido más amplio no se limita a la misma, y también comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias de CDR mencionadas en la Tabla B-1). Además, normalmente se preferirá una combinación de secuencias de CDR y secuencias estructurales que ocurren en el mismo clon (es decir, secuencias de CDR y secuencias estructurales que se mencionan en la misma línea en la Tabla B-1) (aunque la descripción en su sentido más amplio no se limita a las mismas, y también comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias de CDR y secuencias estructurales mencionadas en la tabla B-1, así como combinaciones de dichas secuencias de CDR y otras secuencias estructurales adecuadas, por ejemplo, como se describe más adelante en el presente documento).
[0460] Además, en los Nanobodies de la descripción que comprenden las combinaciones de CDR mencionadas en la Tabla B-1, cada CDR puede reemplazarse por una CDR elegida del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, incluso más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia (como se define en el presente documento) con las CDR mencionadas; en las que:
[0461] i) cualquier sustitución de aminoácidos en dicha CDR es preferentemente, y en comparación con la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la Tabla B-1, una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en el presente documento);
[0462] y/o
[0463] ii) cualquier secuencia de CDR de este tipo contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la Tabla B-1;
[0464] y/o
[0465] iii) cualquier secuencia de CDR de este tipo es una CDR que se deriva mediante una técnica de maduración por afinidad conocida de por sí, y en particular a partir de la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la Tabla B-1.
[0466] Sin embargo, como será evidente para el experto, las (combinaciones de) secuencias de CDR, así como (las combinaciones de) secuencias de CDR y secuencias estructurales mencionadas en la Tabla B-1 serán generalmente preferidas.
[0467] Tabla B-1: Combinaciones preferidas de secuencias de CDR, combinaciones preferidas de secuencias estructurales y combinaciones preferidas de secuencias estructurales y CDR.("ID" se refiere a la SEQ ID NO como se usa en este documento)
[0469]
[0470]
[0473] Por lo tanto, en los Nanobodies de la descripción, al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; o del grupo de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de "identidad de secuencia" (como se define en el presente documento) con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia(s) de aminoácidos" (como se define en el presente documento) con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0475] En este contexto, por "elegida adecuadamente" se entiende que, según proceda, una secuencia de CDR1 se elige de secuencias de CDR1 adecuadas (es decir, como se define en el presente documento), una secuencia de CDR2 se elige de secuencias de CDR2 adecuadas (es decir, como se define en el presente documento) y una secuencia de CDR3 se elige de secuencia de CDR3 adecuada (es decir, como se define en el presente documento), respectivamente. Más en particular, las secuencias de CDR se eligen preferiblemente de modo que los Nanobodies de la descripción se unan a OX40L con una afinidad (medida y/o expresada adecuadamente como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento.
[0477] En particular, en los Nanobodies de la descripción, al menos la secuencia de CDR3 presente se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1 o del grupo de secuencias de CDR3 que tienen al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, incluso más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con al menos una de las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1.
[0479] Preferiblemente, en los Nanobodies de la descripción, al menos dos de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1 o del grupo que consiste en secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia(s) de aminoácidos" con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0481] En particular, en los Nanobodies de la descripción, al menos la secuencia de CDR3 presente se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1 o del grupo de secuencias de CDR3 que tienen al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, incluso más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1, respectivamente; y al menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2 presentes se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1 o del grupo de secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con al menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0483] Lo más preferible, en los Nanobodies de la descripción, las tres secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1 o del grupo de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia(s) de aminoácidos" con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0485] Incluso más preferiblemente, en los Nanobodies de la descripción, al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, al menos una o preferiblemente ambas de las otras dos secuencias de CDR presentes se eligen adecuadamente de secuencias de CDR que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR correspondientes, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con al menos una de las secuencias correspondientes, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0487] En particular, en los Nanobodies de la descripción, al menos la secuencia de CDR3 presente se elige adecuadamente del grupo que consiste en la CDR3 enumerada en la Tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, al menos una y preferiblemente ambas de las secuencias de CDR1 y CDR2 presentes se eligen adecuadamente de los grupos de secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con al menos una de las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0489] Incluso más preferiblemente, en los Nanobodies de la descripción, al menos dos de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, la secuencia de CDR restante presente se elige adecuadamente del grupo de secuencias de CDR que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR correspondientes enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con al menos una de las secuencias correspondientes enumeradas en la Tabla B-1.
[0491] En particular, en los Nanobodies de la descripción, al menos la secuencia de CDR3 se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1, y la secuencia de CDR1 o la secuencia de CDR2 se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1. Preferiblemente, en este aspecto, la secuencia de CDR restante presente se elige adecuadamente del grupo de secuencias de CDR que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias de CDR correspondientes enumeradas en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con las secuencias de CDR correspondientes enumeradas en la Tabla B-1.
[0493] Incluso más preferiblemente, en los Nanobodies de la descripción, las tres secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0495] Además, en general, se prefieren las combinaciones de CDR enumeradas en la Tabla B-1 (es decir, las mencionadas en la misma línea en la Tabla B-1). Por lo tanto, en general se prefiere que, cuando una CDR en un Nanobody de la descripción es una secuencia de CDR mencionada en la Tabla B-1 o se elija adecuadamente del grupo de secuencias de CDR que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de CDR enumerada en la Tabla B-1; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con una secuencia de CDR enumerada en la Tabla B-1, que al menos una y preferentemente ambas de las otras CDR se eligen adecuadamente de las secuencias de CDR que pertenecen a la misma combinación en la Tabla B-1 (es decir, se mencionan en la misma línea en la Tabla B-1) o se eligen adecuadamente del grupo de secuencias de CDR que tienen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, incluso más preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia o secuencias de CDR pertenecientes a la misma combinación y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia(s) de aminoácidos con la secuencia o secuencias de CDR que pertenecen a la misma combinación. Las otras preferencias indicadas en los párrafos anteriores también se aplican a las combinaciones de CDR mencionadas en la Tabla B-1.
[0496] Por lo tanto, mediante ejemplos no limitantes, un Nanobody de la descripción puede comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR1 que tiene más del 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la Tabla B-1, una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácidos con una de las secuencias de CDR2 mencionadas en la Tabla B-1 (pero que pertenecen a una combinación diferente) y una secuencia de CDR3.
[0497] Algunos Nanobodies preferidos de la descripción pueden comprender, por ejemplo: (1) una secuencia de CDR1 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la Tabla B-1; una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácidos con una de las secuencias de CDR2 mencionadas en la Tabla B-1 (pero que pertenecen a una combinación diferente); y una secuencia de CDR3 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de CDR3 mencionadas en la Tabla B-1 (pero que pertenecen a una combinación diferente); o (2) una secuencia de CDR1 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la Tabla B-1; una secuencia de CDR2 y una de las secuencias de CDR3 enumeradas en la Tabla B-1; o (3) una secuencia de CDR1; una secuencia de CDR2 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con una de la secuencia de CDR2 enumerada en la Tabla B-1; y una secuencia de CDR3 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácidos con la secuencia de CDR3 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación que la secuencia de CDR2.
[0498] Algunos Nanobodies particularmente preferidos de la descripción pueden comprender, por ejemplo: (1) una secuencia de CDR1 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la Tabla B-1; una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácidos con la secuencia de CDR2 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación; y una secuencia de CDR3 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de CDR3 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación; (2) una secuencia de CDR1; una CDR2 enumerada en la Tabla B-1 y una secuencia de CDR3 enumerada en la Tabla B-1 (en la que la secuencia de CDR2 y la secuencia de CDR3 pueden pertenecer a diferentes combinaciones).
[0499] Algunos Nanobodies incluso más preferidos de la descripción pueden comprender, por ejemplo: (1) una secuencia de CDR1 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de CDR1 mencionadas en la Tabla B-1; la secuencia de CDR2 enumerada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación; y una secuencia de CDR3 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a una combinación diferente; o (2) una secuencia de CDR1 mencionada en la Tabla B-1; una secuencia de CDR2 que tiene 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácidos con la secuencia de CDR2 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación; y una secuencia de CDR3 que tiene más del 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de CDR3 enumerada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación o a una combinación diferente.
[0500] Los Nanobodies particularmente preferidos de la descripción pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de CDR1 mencionada en la Tabla B-1, una secuencia de CDR2 que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de CDR2 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación; y la secuencia de CDR3 mencionada en la Tabla B-1 que pertenece a la misma combinación.
[0501] En los Nanobodies más preferidos de la descripción, las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente de una de las combinaciones de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, enumeradas en la Tabla B-1.
[0502] Según otro aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción (a) CDR1 tiene una longitud de entre 1 y 12 residuos aminoacídicos, y normalmente entre 2 y 9 residuos aminoacídicos, tal como 5, 6 o 7 residuos aminoacídicos; y/o (b) CDR2 tiene una longitud de entre 13 y 24 residuos aminoacídicos, y normalmente entre 15 y 21 residuos aminoacídicos, tal como 16 y 17 residuos aminoacídicos; y/o (c) CDR3 tiene una longitud de entre 2 y 35 residuos aminoacídicos, y normalmente entre 3 y 30 residuos aminoacídicos, tal como entre 6 y 23 residuos aminoacídicos.
[0503] En otro aspecto preferido, pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody en el que las secuencias de CDR (como se definen en el presente documento) tienen más de un 80 %, preferiblemente más de un 90 %, más preferiblemente más de un 95 %, tal como un 99 % o más de identidad de secuencia (como se define en el presente documento) con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1).
[0504] En general, los Nanobodies con las secuencias de CDR anteriores pueden ser como se describe más adelante en el presente documento, y preferiblemente tienen secuencias estructurales que también son como se describe más adelante en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo y como se menciona en el presente documento, dichos Nanobodies pueden ser Nanobodies de origen natural (de cualquier especie adecuada), secuencias V<HH>de origen natural (es decir, de una especie adecuada de camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semisintéticas o Nanobodies, que incluyen, pero sin limitación, Nanobodies parcialmente humanizados o secuencias V<HH>, Nanobodies completamente humanizados o secuencias V<HH>, secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas, así como Nanobodies que se han obtenido mediante las técnicas mencionadas en el presente documento.
[0506] Por lo tanto, en un aspecto específico, pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody humanizado, que consiste en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que CDR1 a CDR3 son como se define en el presente documento y en el que dicho Nanobody humanizado comprende al menos una sustitución humanizante (como se define en el presente documento), y en al menos una sustitución humanizante en al menos una de al menos una de sus secuencias estructurales (como se define en el presente documento).
[0508] En otro aspecto preferido, pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody en el que las secuencias de CDR tienen al menos un 70 % de identidad de aminoácidos, preferiblemente al menos un 80 % de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad de aminoácidos, tal como un 95 % de identidad de aminoácidos o más o incluso esencialmente un 100 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Este grado de identidad de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicho Nanobody y una o más de las secuencias de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), en la que se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las regiones estructurales. Dichos Nanobodies pueden ser como se describe más adelante en el presente documento.
[0510] En otro aspecto preferido, pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1) o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen más de un 80 %, preferiblemente más de un 90 %, más preferiblemente más de un 95 %, tal como un 99 % o más de identidad de secuencia (como se define en el presente documento) con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1).
[0511] Otro aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción se refiere a variantes humanizadas y/u optimizadas en secuencia de los Nanobodies de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), que comprenden, en comparación con la secuencia V<HH>nativa correspondiente, al menos una sustitución humanizante y/u optimizadora de secuencias (como se define en el presente documento), y en particular al menos una sustitución humanizante y/u optimizadora de secuencias en al menos una de sus secuencias estructurales (como se define en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichas variantes humanizadas y/o optimizadas en secuencia son los Nanobodies humanizados y/o optimizados en secuencia de SEQ ID NO: 199 a 226 (véase la Tabla A-2). Por lo tanto, la descripción también se refiere a un Nanobody humanizado y/u optimizado en secuencia con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 199 a 226 (véase la Tabla A-2) o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen más de un 80 %, preferiblemente más de un 90 %, más preferiblemente más de un 95 %, tal como un 99 % o más de identidad de secuencia (como se define en el presente documento) con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 a 226 (véase la Tabla A-2) (en el que las secuencias de aminoácidos que se eligen del último grupo de secuencias de aminoácidos pueden contener un número mayor o un número menor de sustituciones humanizantes y/u optimizadoras de secuencias en comparación con la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 199 a 226 (véase la Tabla A-2), siempre que conserven al menos una de las sustituciones humanizantes y/u optimizadoras de secuencias presentes en la secuencia correspondiente de SEQ ID NO: 199 a 226 (véase la Tabla A-2)).
[0513] Los polipéptidos de la descripción comprenden o consisten esencialmente en al menos un Nanobody de la descripción. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de polipéptidos de la descripción se proporcionan en SEQ ID NO: 186 a 198 (véase la Tabla A-3) y SEQ ID NO: 227 a 234 (véase la Tabla A-4).
[0515] Será evidente para el experto que los Nanobodies que se mencionan en el presente documento como "preferidos" (o "más preferidos", "incluso más preferidos", etc.) también son preferidos (o más preferidos, o incluso más preferidos, etc.) para su uso en los polipéptidos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en general se preferirán polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más Nanobodies "preferidos" de la descripción, y los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más Nanobodies "más preferidos" de la descripción en general serán más preferidos, etc.
[0517] En general, las proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en un solo Nanobody (tal como un único Nanobody de la descripción) se denominarán en el presente documento proteínas o polipéptidos "monovalentes" o "construcciones monovalentes". Las proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en dos o más Nanobodies (tales como al menos dos Nanobodies de la descripción o al menos un Nanobody de la descripción y al menos otro Nanobody) se denominarán en el presente documento proteínas o polipéptidos "multivalentes" o "construcciones multivalentes", y estas pueden proporcionar ciertas ventajas en comparación con los Nanobodies monovalentes correspondientes de la descripción. Algunos ejemplos no limitantes de dichas construcciones multivalentes serán evidentes a partir de la descripción adicional proporcionada en el presente documento.
[0519] según un aspecto específico, pero no limitante, un polipéptido de la descripción comprende o consiste esencialmente en al menos dos Nanobodies de la descripción, tales como dos o tres Nanobodies de la descripción. Como se describe más adelante en el presente documento, dichas construcciones multivalentes pueden proporcionar ciertas ventajas en comparación con una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en un único Nanobody de la descripción, tal como una avidez mucho mayor por OX40L. Dichas construcciones multivalentes serán claras para el experto basándose en la divulgación en el presente documento; algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichas construcciones de Nanobody multivalentes son las construcciones de SEQ ID NO: 186 a 198 y 227 a 234, más preferentemente las construcciones de SEQ ID NO: 186, 187, 189, 190, 227, 228, 229, 230, 231, 233; lo más preferido la construcción de SEQ ID NO: 190, 227, 228, 231 y 233.
[0521] Según otro aspecto específico, pero no limitante, un polipéptido de la descripción comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody de la descripción y al menos otra unidad de unión (es decir, dirigida contra otro epítopo, antígeno, diana, proteína o polipéptido), que es preferentemente también un Nanobody. Dichas proteínas o polipéptidos también se denominan en el presente documento proteínas o polipéptidos "multiespecíficos" o "construcciones multiespecíficas", y estos pueden proporcionar ciertas ventajas en comparación con los Nanobodies monovalentes correspondientes de la descripción (como se volverá evidente a partir de la discusión adicional en el presente documento de algunas construcciones multiespecíficas preferidas, pero no limitantes). Dichas construcciones multiespecíficas serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento; algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichas construcciones de Nanobody multiespecíficas son las construcciones de SEQ ID NO: 186 a 198 y 227 a 234, más preferentemente las construcciones de SEQ ID NO: 186, 187, 189, 190, 227, 228, 229, 230, 231, 233; lo más preferido la construcción de SEQ ID NO: 190, 227, 228, 231 y 233.
[0523] Según otro aspecto específico, pero no limitante, un polipéptido de la descripción comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody de la descripción, opcionalmente uno o más Nanobodies adicionales, y al menos otra secuencia de aminoácidos (tal como una proteína o polipéptido) que confiere al menos una propiedad deseada al Nanobody de la descripción y/o a la proteína de fusión resultante. De nuevo, dichas proteínas de fusión pueden proporcionar ciertas ventajas en comparación con los Nanobodies monovalentes correspondientes de la descripción. Algunos ejemplos no limitantes de dichas secuencias de aminoácidos y de dichas construcciones de fusión se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0525] También es posible combinar dos o más de los aspectos anteriores, por ejemplo, para proporcionar una construcción biespecífica trivalente que comprende dos Nanobodies de la descripción y otro Nanobody, y opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos. Otros ejemplos no limitantes de dichas construcciones, así como algunas construcciones que son particularmente preferidas en el contexto de la presente descripción, se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0527] En las construcciones anteriores, el uno o más Nanobodies y/u otras secuencias de aminoácidos pueden estar directamente unidas entre sí y/o adecuadamente unidas entre sí a través de una o más secuencias conectoras. Algunos ejemplos adecuados, pero no limitantes, de dichos conectores se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0529] En un aspecto específico de la descripción, un Nanobody de la descripción o un compuesto, construcción o polipéptido de la descripción que comprende al menos un Nanobody de la descripción puede tener una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos Nanobodies, compuestos y polipéptidos serán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional proporcionada en el presente documento y, por ejemplo, comprenden secuencias de Nanobodies o polipéptidos de la descripción que se han modificado químicamente para prolongar la semivida de los mismos (por ejemplo, mediante pegilación); secuencias de aminoácidos de la descripción que comprenden al menos un sitio de unión adicional para unirse a una proteína sérica (tal como albúmina sérica, véase, por ejemplo, el documento de patente EP 0368684 B1, página 4); o polipéptidos de la descripción que comprenden al menos un Nanobody de la descripción que está enlazada a al menos un resto (y, en particular, al menos una secuencia de aminoácidos) que prolonga la semivida del Nanobody de la descripción. Los ejemplos de polipéptidos de la descripción que comprenden dichos restos que prolongan la semivida o secuencias de aminoácidos se volverán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional en el presente documento; y, por ejemplo, incluyen, sin limitación, polipéptidos en los que el uno o más Nanobodies de la descripción están unidos adecuadamente a una o más proteínas séricas o fragmentos de las mismas (tales como albúmina sérica o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, por ejemplo, Nanobodies o anticuerpos de dominio (único) que pueden unirse a proteínas séricas tales como albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas tales como IgG o transferrina); polipéptidos en los que un Nanobody de la descripción está unido a una porción Fc (tal como un Fc humano) o una parte o fragmento adecuado de la misma; o polipéptidos en los que el uno o más Nanobodies de la descripción está unidos adecuadamente a una o más proteínas pequeñas o péptidos que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en los documentos de patente WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y a la solicitud provisional de EE. UU. de Ablynx N.V. titulada"Peptides capable of binding to serum proteins"de Ablynx N.V. presentada el 5 de diciembre de 2006 (véase también el documento de patente WO2008/068280).
[0530] De nuevo, como será evidente para el experto, dichos Nanobodies, compuestos, construcciones o polipéptidos pueden contener uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales, tales como una o más secuencias de aminoácidos adicionales y en particular uno o más Nanobodies adicionales (es decir, no dirigidos contra OX40L), para proporcionar una construcción de Nanobody tri- o multiespecífica.
[0531] En general, los Nanobodies de la descripción (o compuestos, construcciones o polipéptidos que comprenden los mismos) con semivida prolongada tienen preferentemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo, al menos 10 veces o más de 20 veces, superior a la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción de por sí. Por ejemplo, los Nanobodies, compuestos, construcciones o polipéptidos de la descripción con semivida prolongada pueden tener una semivida que está prolongada en más de 1 hora, preferentemente más de 2 horas, más preferentemente 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la descripción de por sí.
[0532] En un aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción, dichos Nanobodies, compuestos, construcciones o polipéptidos de la descripción presentan una semivida en suero en seres humanos de al menos aproximadamente 12 horas, preferentemente al menos 24 horas, más preferentemente al menos 48 horas, incluso más preferentemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la descripción pueden tener una semivida de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferentemente de al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferentemente de al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferentemente de al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más) o más de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
[0533] En otro aspecto de la descripción, un polipéptido de la descripción comprende uno o más (tal como dos o preferiblemente uno) Nanobodies de la descripción unidos (opcionalmente a través de una o más secuencias conectoras adecuadas) a una o más (tales como dos y preferiblemente una) secuencias de aminoácidos que permiten que el polipéptido resultante de la descripción atraviese la barrera hematoencefálica. En particular, dicha una o más secuencias de aminoácidos que permiten que los polipéptidos resultantes de la descripción atraviesen la barrera hematoencefálica pueden ser uno o más (tal como dos y preferiblemente uno) Nanobodies, tales como los Nanobodies descritos en el documento de patente WO 02/057445, de los cuales FC44 (SEQ ID NO: 189 del documento de patente WO 06/040153) y FC5 (SEQ ID NO: 190 del documento de patente WO 06/040154) son ejemplos preferidos.
[0534] En particular, los polipéptidos que comprenden uno o más Nanobodies de la descripción son preferiblemente tales que:
[0535] • se unen a OX40L con una constante de disociación (K<D>) de 10<-5>a 10<-12>moles/litro o menos, y preferiblemente de 10<-7>a 10<-12>moles/litro o menos y más preferiblemente de 10<-8>a 10<-12>moles/litro (es decir, con una constante de asociación (K<A>) de 10<5>a 10<12>litros/moles o más, y preferiblemente 10<7>a 10<12>litros/moles o más y más preferiblemente 10<8>a 10<12>litros/moles);
[0536] y/o tales que:
[0537] • se unen a OX40L con una velocidad k<as>de entre 10<2>M<-1>s<-1>a aproximadamente 10<7>M<-1>s<-1>, preferiblemente entre 10<3>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, más preferiblemente entre 10<4>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, tal como entre 10<5>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>;
[0538] y/o tales que:
[0539] • se unen a OX40L con una velocidad k<dis>entre 1 s<-1>(t<1/2>= 0,69 s) y 10<-6>s<-1>(proporcionando un complejo casi irreversible con una t<1/2>de múltiples días), preferentemente entre 10<-2>s<-1>y 10<-6>s<-1>, más preferiblemente entre 10<-3>s<-1>y 10<-6>s<-1>, tal como entre 10<-4>s<-1>y 10<-6>s<-1>.
[0540] Preferiblemente, un polipéptido que contiene solo una secuencia de aminoácidos de la descripción es preferiblemente tal que se unirá a OX40L con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM. A este respecto, será evidente para el experto que un polipéptido que contiene dos o más Nanobodies de la descripción puede unirse a OX40L con una avidez aumentada, en comparación con un polipéptido que contiene solo una secuencia de aminoácidos de la descripción.
[0541] Algunos valores de CI<50>preferidos para la unión de las secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la descripción a OX40L se volverán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos del presente documento.
[0542] Otros polipéptidos según este aspecto preferido de la descripción pueden elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen más de un 80 %, preferiblemente más de un 90 %, más preferiblemente más de un 95 %, tal como un 99 % o más de "identidad de secuencia" (como se define en el presente documento) con una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 186 a 198 (véase la Tabla A-3) y SEQ ID NO: 227 a 234 (Tabla A-4), en los que los Nanobodies comprendidos dentro de dichas secuencias de aminoácidos son preferiblemente como se definen más adelante en el presente documento.
[0543] Otro aspecto de esta descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la descripción (tal como un Nanobody de la descripción) o un polipéptido de la descripción que comprende el mismo. De nuevo, como se describe generalmente en el presente documento para los ácidos nucleicos de la descripción, dicho ácido nucleico puede estar en forma de una construcción genética, como se define en el presente documento. En otro aspecto, la descripción se refiere a un hospedador o célula hospedadora que expresa o que es capaz de expresar una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanobody) de la descripción y/o un polipéptido de la descripción que comprende la misma; y/o que contiene un ácido nucleico de la descripción. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos hospedadores o células hospedadoras se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0544] Otro aspecto de la descripción se refiere a un producto o composición que contiene o comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la descripción, al menos un polipéptido de la descripción y/o al menos un ácido nucleico de la descripción, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de dichas composiciones conocidos de por sí, es decir, dependiendo del uso previsto de la composición. Dicho producto o composición puede ser, por ejemplo, una composición farmacéutica (como se describe en el presente documento), una composición veterinaria o un producto o composición para uso diagnóstico (como también se describe en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos productos o composiciones se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0545] La descripción se refiere además a métodos para preparar o generar las secuencias de aminoácidos, compuestos, construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos métodos se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0546] La descripción se refiere además a aplicaciones y usos de las secuencias de aminoácidos, compuestos, construcciones, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en el presente documento, así como a métodos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con OX40L. Algunas aplicaciones y usos preferidos, pero no limitantes, se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
[0547] Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la descripción también se volverán evidentes a partir de la descripción adicional a continuación.
[0548] En general, debe tenerse en cuenta que el término Nanobody, como se usa en el presente documento en su sentido más amplio, no se limita a una fuente biológica específica o a un método específico de preparación. Por ejemplo, como se analizará con más detalle a continuación, los Nanobodies de la descripción generalmente pueden obtenerse mediante cualquiera de las técnicas (1) a (8) mencionadas en las páginas 61 y 62 del documento de patente WO 08/020079, o cualquier otra técnica adecuada conocida de por sí. Una clase preferida de Nanobodies corresponde a los dominios V<HH>de anticuerpos de cadena pesada de origen natural dirigidos contra OX40L. Como se describe más adelante en el presente documento, dichas secuencias V<HH>generalmente pueden generarse u obtenerse inmunizando adecuadamente una especie de camélido con OX40L (es decir, para provocar una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra OX40L), obteniendo una muestra biológica adecuada de dicho camélido (tal como una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de linfocitos B), y generando secuencias V<HH>dirigidas contra OX40L, a partir de dicha muestra, usando cualquier técnica adecuada conocida de por sí. Dichas técnicas serán evidentes para el experto y/o se describen más adelante en el presente documento.
[0549] Alternativamente, dichos dominios V<HH>de origen natural contra OX40L se pueden obtener a partir de bibliotecas intactas de secuencias V<HH>de camélidos, por ejemplo, cribando dicha biblioteca usando OX40L, o al menos una parte, fragmento, determinante antigénico o epítopo del mismo usando una o más técnicas de cribado conocidas de por sí. Dichas bibliotecas y técnicas se describen, por ejemplo, en los documentos de patente WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 y WO 03/035694. Alternativamente, se pueden utilizar bibliotecas sintéticas o semisintéticas mejoradas derivadas de bibliotecas de V<HH>intactas, tales como bibliotecas de V<HH>obtenidas de bibliotecas de V<HH>intactas mediante técnicas tales como mutagénesis aleatoria y/o barajado de CDR, como, por ejemplo, se describe en el documento de patente WO 00/43507.
[0550] Por lo tanto, en otro aspecto, la descripción se refiere a un método para generar Nanobodies que están dirigidos contra OX40L. En un aspecto, dicho método comprende al menos las etapas de:
[0551] a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanobody; y
[0552] b) cribar dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanobody en busca de secuencias de Nanobody que puedan unirse y/o tener afinidad por OX40L;
[0553] y
[0554] c) aislar el Nanobody o Nanobodies que pueden unirse y/o tener afinidad por OX40L.
[0555] En dicho método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanobody puede ser un conjunto, colección o biblioteca intacta de secuencias de Nanobody; un conjunto, colección o biblioteca sintético o semisintético de secuencias de Nanobody; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanobody que han sido sometidas a maduración por afinidad.
[0556] En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanobody puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de Nanobody, y en particular un conjunto, colección o biblioteca inmune de secuencias de V<HH>, que han derivado de una especie de camélido que se ha inmunizado adecuadamente con OX40L o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, bucle u otro epítopo antigénico del mismo. En un aspecto particular, dicho determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, bucle u otro epítopo o epítopos extracelulares. En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de Nanobody o secuencias de V<HH>se pueden visualizar en un fago, fagémido, ribosoma o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la selección. Los métodos, técnicas y organismos hospedadores adecuados para mostrar y cribar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de Nanobody serán evidentes para el experto en la técnica, por ejemplo, basándose en la divulgación adicional en el presente documento. También se hace referencia al documento de patente WO 03/054016 y a la revisión de Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005).
[0557] En otro aspecto, el método de generación de secuencias de Nanobody comprende al menos las etapas de: a) proporcionar una colección o muestra de células derivadas de una especie de camélido que expresan secuencias de inmunoglobulina;
[0558] b) cribar dicha colección o muestra de células para (i) células que expresan una secuencia de inmunoglobulina que puede unirse a y/o tener afinidad por OX40L; y (ii) células que expresan anticuerpos de cadena pesada, en el que las subetapas (i) y (ii) se pueden realizar esencialmente como una única etapa de selección o en cualquier orden adecuado como dos etapas de selección separadas, para proporcionar al menos una célula que expresa un anticuerpo de cadena pesada que puede unirse a y/o tiene afinidad por OX40L;
[0559] y
[0560] c) o (i) aislar de dicha célula la secuencia V<HH>presente en dicho anticuerpo de cadena pesada; o (ii) aislar de dicha célula una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia V<HH>presente en dicho anticuerpo de cadena pesada, seguido de expresar dicho dominio V<HH>.
[0561] En el método según este aspecto, la colección o muestra de células puede ser, por ejemplo, una colección o muestra de linfocitos B. Además, en este método, la muestra de células puede derivar de un camélido que se ha inmunizado adecuadamente con OX40L o un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte antigénica, fragmento, región, dominio, bucle u otro epítopo del mismo. En un aspecto particular, dicho determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, bucle u otro epítopo o epítopos extracelulares.
[0562] El método anterior puede realizarse de cualquier manera adecuada, como será evidente para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos de patente EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 y WO 04/106377. El cribado de la etapa b) se realiza preferentemente usando una técnica de citometría de flujo tal como FACS. Para esto, se hace referencia, por ejemplo, a Lieby et al., Blood, Vol. 97, n.º 12, 3820. Se hace particular referencia a la denominada técnica "Nanoclone<™>" descrita en la solicitud internacional WO 06/079372 por Ablynx N.V.
[0563] En otro aspecto, el método de generación de una secuencia de aminoácidos dirigida contra OX40L puede comprender al menos las etapas de:
[0564] a) proporcionar un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias de Nanobody;
[0565] b) cribar dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico en busca de secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de cadena pesada o una secuencia de Nanobody que puede unirse a y/o tiene afinidad por OX40L;
[0566] y
[0567] c) aislar dicha secuencia de ácido nucleico, seguido de expresar la secuencia V<HH>presente en dicho anticuerpo de cadena pesada o expresando dicha secuencia de Nanobody, respectivamente.
[0568] En dicho método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias de Nanobody puede ser, por ejemplo, un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca intacta de anticuerpos de cadena pesada o secuencias V<HH>; un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca sintética o semisintética de secuencias de Nanobody; y/o un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican un conjunto, colección o biblioteca de secuencias de Nanobody que han sido sometidas a maduración por afinidad.
[0569] En un aspecto preferido de este método, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico puede ser un conjunto, colección o biblioteca inmunitaria de secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos de cadena pesada o secuencias V<HH>derivadas de un camélido que ha sido inmunizado adecuadamente con OX40L o con un determinante antigénico adecuado basado en el mismo o derivado del mismo, tal como una parte, fragmento, región, dominio, bucle u otro epítopo antigénico del mismo. En un aspecto particular, dicho determinante antigénico puede ser una parte, región, dominio, bucle u otro epítopo o epítopos extracelulares.
[0570] En los métodos anteriores, el conjunto, colección o biblioteca de secuencias de nucleótidos se pueden visualizar en un fago, fagémido, ribosoma o microorganismo adecuado (tal como levadura), tal como para facilitar la selección. Los métodos, técnicas y organismos hospedadores adecuados para mostrar y cribar (un conjunto, colección o biblioteca de) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto en la técnica, por ejemplo, basándose en la divulgación adicional en el presente documento. También se hace referencia al documento de patente WO 03/054016 y a la revisión de Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005).
[0571] Como será evidente para el experto, la etapa de cribado de los métodos descritos en el presente documento también se puede realizar como una etapa de selección. Por consiguiente, el término "cribado", como se usa en la presente descripción, puede comprender selección, cribado o cualquier combinación adecuada de técnicas de selección y/o cribado. Además, cuando se usa un conjunto, colección o biblioteca de secuencias, puede contener cualquier número adecuado de secuencias, tal como 1, 2, 3 o aproximadamente 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>o más secuencias.
[0572] Además, una o más o todas las secuencias en el conjunto, colección o biblioteca anterior de secuencias de aminoácidos pueden obtenerse o definirse mediante enfoques racionales o semiempíricos, tales como técnicas de modelado por ordenador o técnicas bioestadísticas o de minería de datos.
[0573] Además, dicho conjunto, colección o biblioteca puede comprender una, dos o más secuencias que son variantes entre sí (por ejemplo, con mutaciones puntuales diseñadas o con posiciones aleatorizadas), comprometer múltiples secuencias derivadas de un conjunto diverso de secuencias naturalmente diversificadas (por ejemplo, una biblioteca inmunitaria)), o cualquier otra fuente de secuencias diversas (como se describe, por ejemplo, en Hoogenboom et al, Nat Biotechnol 23:1105, 2005 y Binz et al, Nat Biotechnol 2005, 23:1247). Dicho conjunto, colección o biblioteca de secuencias se puede presentar en la superficie de una partícula de fago, un ribosoma, una bacteria, una célula de levadura, una célula de mamífero, y ligado a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos dentro de estos portadores. Esto hace que dicho conjunto, colección o biblioteca sea susceptible a procedimientos de selección para aislar las secuencias de aminoácidos deseadas de la descripción. Más generalmente, cuando una secuencia se presenta en un hospedador o célula hospedadora adecuada, también es posible (y habitual) aislar primero de dicho hospedador o célula hospedadora una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia deseada, y luego obtener la secuencia deseada expresando adecuadamente dicha secuencia de nucleótidos en un organismo hospedador adecuado. De nuevo, esto se puede realizar de cualquier manera adecuada conocida de por sí, como será evidente para el experto.
[0574] Otra técnica más para obtener secuencias V<HH>o secuencias de Nanobody dirigidas contra OX40L implica inmunizar adecuadamente un mamífero transgénico que es capaz de expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir, para aumentar una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra OX40L), obtener una muestra biológica adecuada de dicho mamífero transgénico que contiene (secuencias de ácido nucleico que codifican) dichas secuencias V<HH>o secuencias de Nanobody (tales como una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de linfocitos B), y luego generar V<HH>dirigidas contra OX40L, comenzando a partir de dicha muestra, usando cualquier técnica adecuada conocida de por sí (tal como cualquiera de los métodos descritos en el presente documento o una técnica de hibridoma). Por ejemplo, para este propósito, se pueden usar ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada y los métodos y técnicas adicionales descritos en los documentos de patente WO 02/085945, WO 04/049794 y WO 06/008548 y Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2006 oct 10; 103(41): 15130-5. Por ejemplo, dichos ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada pueden expresar anticuerpos de cadena pesada con cualquier dominio variable (único) adecuado, tales como dominios variables (individuales) de fuentes naturales (por ejemplo, dominios variables humanos (únicos), dominios variables de camélido (únicos) o dominios variables de tiburón (únicos)), así como, por ejemplo, dominios variables sintéticos o semisintéticos (únicos).
[0575] La descripción también se refiere a las secuencias V<HH>o secuencias de Nanobody que se obtienen mediante los métodos anteriores, o alternativamente mediante un método que comprende uno de los métodos anteriores y, además, al menos las etapas de determinar la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de dicha secuencia V<HH>o secuencia de Nanobody; y de expresar o sintetizar dicha secuencia V<HH>o secuencia de Nanobody de una manera conocida de por sí, tal como por expresión en una célula hospedadora u organismo hospedador adecuado o por síntesis química.
[0576] Como se menciona en el presente documento, una clase particularmente preferida de Nanobodies de la descripción comprende Nanobodies con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio V<HH>de origen natural, pero que se ha "humanizado", es decir, por reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de V<HH>de origen natural (y, en particular, en las secuencias estructurales) por uno o más de los residuos aminoacídicos que se producen en la posición o posiciones correspondientes de un dominio V<H>de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicado anteriormente), como se describe más adelante, y usando las técnicas mencionadas en la página 63 del documento de patente WO 08/020079. Otra clase particularmente preferida de Nanobodies de la descripción comprende Nanobodies con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio V<H>de origen natural, pero que se ha "camelizado", es decir, por reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de un dominio V<H>de origen natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o más de los residuos aminoacídicos que se encuentran en la posición o posiciones correspondientes de un dominio V<HH>de un anticuerpo de cadena pesada, como se describe más adelante, y usando las técnicas mencionadas en la página 63 del documento de patente WO 08/020079.
[0577] Otros métodos y técnicas adecuados para obtener los Nanobodies de la descripción y/o ácidos nucleicos que codifican los mismos, comenzando por secuencias V<H>de origen natural o preferentemente secuencias V<HH>, serán evidentes para el experto, y pueden incluir, por ejemplo, las técnicas que se mencionan en la página 64 del documento de patente WO 08/00279. Como se menciona en el presente documento, los Nanobodies pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o más"residuos distintivos"(como se describe en el presente documento) en una o más de las secuencias estructurales.
[0578] Por lo tanto, según un aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción, un Nanobody en su sentido más amplio puede definirse generalmente como un polipéptido que comprende:
[0579] a) una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0580] y/o:
[0581] b) una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es un aminoácido cargado (como se define en el presente documento) o un residuo de cisteína, y la posición 44 es preferentemente una E;
[0582] y/o:
[0583] c) una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste en R y S.
[0584] Por lo tanto, en un primer aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura
[0585] FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0586] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que
[0587] a) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0588] y/o en la que:
[0589] b) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es un aminoácido cargado o una cisteína y el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat es preferentemente E; y/o en la que:
[0590] c) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste en R y S;
[0591] y en la que:
[0592] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0593] En particular, un Nanobody en su sentido más amplio puede definirse generalmente como un polipéptido que comprende:
[0594] a) una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0595] y/o:
[0596] b) una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat es E y en las que el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es una R;
[0597] y/o:
[0598] c) una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste en R y S.
[0599] Por lo tanto, según un aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0600] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que
[0601] a) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0602] y/o en la que:
[0603] b) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat es E y en el que el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es una R;
[0604] y/o en la que:
[0605] c) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste en R y S;
[0606] y en la que:
[0607] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0608] En particular, un Nanobody contra OX40L según la descripción puede tener la estructura:
[0609] FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0610] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que
[0611] a) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0612] y/o en la que:
[0613] b) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat es E y en el que el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es una R;
[0614] y/o en la que:
[0615] c) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S, y se elige en particular del grupo que consiste en R y S;
[0616] y en la que:
[0617] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0618] En particular, según un aspecto preferido, pero no limitante de la descripción, un Nanobody puede definirse generalmente como un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que;
[0619] a-1) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, G, Q, R, S, L; y se elige preferentemente del grupo que consiste en G, E o Q; y
[0620] a-2) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R o C; y se elige preferentemente del grupo que consiste en L o R; y
[0621] a-3) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R o S; y es preferentemente W o R, y es más preferentemente W;
[0622] a-4) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0623] o en las que:
[0624] b-1) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en E y Q; y
[0625] b-2) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es R; y
[0626] b-3) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R y S; y es preferentemente W;
[0627] b-4) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; y es preferentemente Q;
[0628] o en las que:
[0629] c-1) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, Q, R, S y L; y se elige preferentemente del grupo que consiste en G, E y Q; y
[0630] c-2) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R y C; y se elige preferentemente del grupo que consiste en L y R; y
[0631] c-3) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S; y se elige en particular del grupo que consiste en R y S; y
[0632] c-4) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; es preferentemente Q;
[0633] y en que
[0634] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0635] Por lo tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitantes, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0636] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0637] a-1) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, G, Q, R, S, L; elige preferentemente del grupo que consiste en G, E o Q;
[0638] y en la que:
[0639] a-2) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R o C; y se elige preferentemente del grupo que consiste en L o R;
[0640] y en la que:
[0641] a-3) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R o S; y es preferentemente W o R, y es más preferentemente W;
[0642] y en que
[0643] a-4) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat es Q;
[0644] y en la que:
[0645] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0646] En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura
[0647] FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0648] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0649] b-1) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en E y Q;
[0650] y en la que:
[0651] b-2) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es R;
[0652] y en la que:
[0653] b-3) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R y S; y es preferentemente W;
[0654] y en la que:
[0655] b-4) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; y es preferentemente Q;
[0656] y en la que:
[0657] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0658] En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura
[0659] FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0660] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0661] c-1) el residuo aminoacídico en la posición 44 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en A, G, E, D, Q, R, S y L; elige preferentemente del grupo que consiste en G, E y Q;
[0662] y en la que:
[0663] c-2) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R y C; y se elige preferentemente del grupo que consiste en L y R;
[0664] y en la que:
[0665] c-3) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en P, R y S; elige en particular del grupo que consiste en R y S;
[0666] y en la que:
[0667] c-4) el residuo aminoacídico en la posición 108 según la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; es preferentemente Q;
[0668] y en la que:
[0669] d) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0670] Dos grupos particularmente preferidos, pero no limitantes, de los Nanobodies de la descripción son aquellos según a) anterior; según (a-1) a (a-4) anterior; según b) anterior; según (b-1) a (b-4) anterior; según (c) anterior; y/o según (c-1) a (c-4) anterior, en los que:
[0671] i) los residuos aminoacídicos en las posiciones 44-47 según la numeración de Kabat forman la secuencia GLEW (o una secuencia similar a GLEW como se describe en el presente documento) y el residuo aminoacídico en la posición 108 es Q;
[0672] o en las que:
[0673] ii) los residuos aminoacídicos en las posiciones 43-46 según la numeración de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia similar a KERE como se describe) y el residuo aminoacídico en la posición 108 es Q o L, y es preferentemente Q.
[0674] Por lo tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitantes, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0675] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0676] i) los residuos aminoacídicos en las posiciones 44-47 según la numeración de Kabat forman la secuencia GLEW (o una secuencia similar a GLEW como se define en el presente documento) y el residuo aminoacídico en la posición 108 es Q;
[0677] y en la que:
[0678] ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0679] En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede tener la estructura
[0680] FR1- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0681] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0682] i) los residuos aminoacídicos en las posiciones 43-46 según la numeración de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia similar a KERE) y el residuo aminoacídico en la posición 108 es Q o L, y es preferentemente Q;
[0683] y en la que:
[0684] ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0685] En los Nanobodies de la descripción en los que los residuos aminoacídicos en las posiciones 43-46 según la numeración de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE, el residuo aminoacídico en la posición 37 es lo más preferentemente F. En los Nanobodies de la descripción en los que los residuos aminoacídicos en las posiciones 44-47 según la numeración de Kabat forman la secuencia GLEW, el residuo aminoacídico en la posición 37 se elige del grupo que consiste en Y, H, I, L, L, L, V o F, y es lo más preferiblemente V.
[0686] Por lo tanto, sin limitarse a este documento de ninguna manera, basándose en los residuos aminoacídicos presentes en las posiciones mencionadas anteriormente, los Nanobodies de la descripción pueden clasificarse generalmente basándose en los tres grupos siguientes:
[0687] i) el"grupo GLEW": Nanobodies con la secuencia de aminoácidos GLEW en las posiciones 44-47 según la numeración de Kabat y Q en la posición 108 según la numeración de Kabat. Como se describe más adelante en el presente documento, los Nanobodies dentro de este grupo normalmente tienen una V en la posición 37, y pueden tener una W, P, R o S en la posición 103, y preferentemente tener una W en la posición 103. El grupo GLEW también comprende algunas secuencias similares a GLEW, tales como las mencionadas en la Tabla B-2 a continuación. Más generalmente, y sin limitación, los Nanobodies que pertenecen al grupo GLEW se pueden definir como Nanobodies con una G en la posición 44 y/o con una W en la posición 47, en la que la posición 46 es normalmente E y en la que preferentemente la posición 45 no es un residuo aminoacídico cargado y no cisteína;
[0688] ii) el"grupo KERE": Nanobodies con la secuencia de aminoácidos KERE o KQRE (u otra secuencia similar a KERE) en las posiciones 43-46 según la numeración de Kabat y Q o L en la posición 108 según la numeración de Kabat. Como se describe adicionalmente en el presente documento, los Nanobodies dentro de este grupo normalmente tienen una F en la posición 37, una L o F en la posición 47; y pueden tener una W, P, R o S en la posición 103, y preferentemente tener una W en la posición 103. Más generalmente, y sin limitación, los Nanobodies que pertenecen al grupo KERE se pueden definir como Nanobodies con una K, Q o R en la posición 44 (normalmente K) en la que la posición 45 es un residuo aminoacídico cargado o cisteína, y la posición 47 es como se define más adelante en el presente documento;
[0689] iii) el"grupo 103 P, R, S": Nanobodies con P, R o S en la posición 103. Estos Nanobodies pueden tener la secuencia de aminoácidos GLEW en las posiciones 44-47 según la numeración de Kabat o la secuencia de aminoácidos KERE o KQRE en las posiciones 43-46 según la numeración de Kabat, esta última más preferentemente en combinación con una F en la posición 37 y una L o una F en la posición 47 (como se define para el grupo KERE); y pueden tener Q o L en la posición 108 según la numeración de Kabat, y preferentemente tener Q.
[0690] Además, cuando proceda, los Nanobodies pueden pertenecer a (es decir, tener características de) dos o más de estas clases. Por ejemplo, un grupo específicamente preferido de Nanobodies tiene GLEW o una secuencia similar a GLEW en las posiciones 44-47; P,R o S (y en particular R) en la posición 103; y Q en la posición 108 (que puede humanizarse a L).
[0691] Más generalmente, debe tenerse en cuenta que las definiciones a las que se ha hecho referencia anteriormente describen y se aplican a Nanobodies en forma de una secuencia V<HH>nativa (es decir, no humanizada), y que las variantes humanizadas de estos Nanobodies pueden contener otros residuos aminoacídicos distintos a los indicados anteriormente (es decir, una o más sustituciones humanizantes como se definen en el presente documento). Por ejemplo, y sin limitación, en algunos Nanobodies humanizados del grupo GLEW o el grupo 103 P, R, S, Q en la posición 108 pueden humanizarse a 108 L. Como ya se ha mencionado en el presente documento, otras sustituciones humanizantes (y combinaciones adecuadas de las mismas) se volverán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento. Además, o alternativamente, se pueden determinar otras sustituciones humanizantes potencialmente útiles comparando la secuencia de las regiones estructurales de una secuencia V<HH>de origen natural con la secuencia estructural correspondiente de una o más secuencias V<H>humanas estrechamente relacionadas, después de lo cual una o más de las sustituciones humanizantes potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) así determinadas pueden introducirse en dicha secuencia V<HH>(de cualquier manera conocida de por sí, como se describe más adelante en el presente documento) y las secuencias V<HH>humanizadas resultantes pueden probarse para determinar la afinidad por la diana, para la estabilidad, para la facilidad y el nivel de expresión, y/o para otras propiedades deseadas. De esta manera, mediante un grado limitado de ensayo y error, el experto puede determinar otras sustituciones humanizantes adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) basándose en la divulgación en el presente documento. Además, basándose en lo anterior, (las regiones estructurales de) un Nanobody pueden humanizarse parcialmente o humanizarse completamente.
[0692] Por lo tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede ser un Nanobody que pertenece al grupo GLEW (como se define en el presente documento), y en el que CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferentemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0693] En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede ser un Nanobody que pertenece al grupo KERE (como se define en el presente documento), y CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0694] Por lo tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede ser un Nanobody que pertenece al grupo 103 P, R, S (como se define en el presente documento), y en el que CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferentemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0695] Además, de manera más general y además de los residuos 108Q, 43E/44R y 103 P,R,S mencionados anteriormente, los Nanobodies de la descripción pueden contener, en una o más posiciones que en un dominio V<H>convencional formarían (parte de) la interfase V<H>/V<L>, uno o más residuos aminoacídicos que están más cargados que los residuos aminoacídicos que se producen naturalmente en la misma posición o posiciones en la secuencia V<H>de origen natural correspondiente, y en particular uno o más residuos aminoacídicos cargados (como se menciona en la Tabla A-2 en la página 48 de la solicitud internacional WO 08/020079). Dichas sustituciones incluyen, pero no se limitan a, las secuencias similares a GLEW mencionadas en la Tabla B-2 a continuación; así como las sustituciones que se describen en la solicitud internacional WO 00/29004 para los denominados "microcuerpos", por ejemplo, para obtener un Nanobody con Q en la posición 108 en combinación con KLEW en las posiciones 44-47. Otras posibles sustituciones en estas posiciones serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento.
[0696] En un aspecto de los Nanobodies de la descripción, el residuo aminoacídico en la posición 83 se elige del grupo que consiste en L, M, S, V y W; y es preferentemente L.
[0697] Además, en un aspecto de los Nanobodies de la descripción, el residuo aminoacídico en la posición 83 se elige del grupo que consiste en R, K, N, E, G, I, T y Q; y es lo más preferiblemente K o E (para Nanobodies correspondientes a dominios V<HH>de origen natural) o R (para Nanobodies "humanizados", como se describe en el presente documento). El residuo aminoacídico en la posición 84 se elige del grupo que consiste en P, A, R, S, D T y V en un aspecto, y es lo más preferiblemente P (para Nanobodies correspondientes a dominios V<HH>de origen natural) o R (para Nanobodies "humanizados", como se describe en el presente documento).
[0698] Además, en un aspecto de los Nanobodies de la descripción, el residuo aminoacídico en la posición 104 se elige del grupo que consiste en G y D; y es más preferentemente G.
[0699] Colectivamente, los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108, que en los Nanobodies son como se mencionó anteriormente, también se denominarán en el presente documento los "residuos distintivos". Los residuos distintivos y los residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes del dominio V<H>humano más estrechamente relacionado, V<H>3, se resumen en la Tabla B-2.
[0700] Algunas combinaciones especialmente preferidas, pero no limitantes, de estos residuos distintivos que se producen en dominios V<HH>de origen natural se mencionan en la Tabla B-3. Para la comparación, los residuos aminoacídicos correspondientes del V<H>3 humano denominado DP-47 se han indicado en cursiva.
[0702] Tabla B-2: Residuos distintivos en Nanobodies
[0704]
[0707] Tabla B-3: Algunas combinaciones preferidas pero no limitantes de residuos distintivos en Nanobodies de origen natural.
[0710]
[0711]
[0714] En los Nanobodies, cada residuo aminoacídico en cualquier otra posición que los residuos distintivos puede ser cualquier residuo aminoacídico que se produzca de forma natural en la posición correspondiente (según la numeración de Kabat) de un dominio V<HH>de origen natural.
[0716] Dichos residuos aminoacídicos serán evidentes para el experto. Las Tablas B-4 a B-7 mencionan algunos residuos no limitantes que pueden estar presentes en cada posición (según la numeración de Kabat) de los dominios FR1, FR2, FR3 y FR4 de V<HH>de origen natural. Para cada posición, el residuo aminoacídico que se produce con más frecuencia en cada posición de un dominio V<HH>de origen natural (y que es el residuo aminoacídico más preferido para dicha posición en un Nanobody) se indica en negrita; y se han subrayado otros residuos aminoacídicos preferidos para cada posición (nota: el número de residuos aminoacídicos que se encuentran en las posiciones 26-30 de dominios V<HH>de origen natural apoya la hipótesis subyacente a la numeración por Chothia (arriba) de que los residuos en estas posiciones ya forman parte de CDR1).
[0718] En las Tablas B-4 - B-7, también se han mencionado algunos de los residuos no limitantes que pueden estar presentes en cada posición de un dominio V<H>3 humano. De nuevo, para cada posición, se indica en negrita el residuo aminoacídico que se produce con más frecuencia en cada posición de un dominio V<H>3 humano de origen natural; y se han subrayado otros residuos aminoacídicos preferidos.
[0720] Como referencia solamente, las Tablas B-4-B-7 también contienen datos sobre la entropía V<HH>("Ent. VHH") y V<HH>variabilidad ("Var. VHH") en cada posición de aminoácidos para una muestra representativa de 7732 secuencias V<HH>(incluyendo, entre otros, datos proporcionados amablemente por David Lutje Hulsing y el Prof. Theo Verrips de la Universidad de Utrecht). Los valores para la entropía de V<HH>y la variabilidad de V<HH>proporcionan una medida para la variabilidad y el grado de conservación de residuos aminoacídicos entre las 7732 secuencias V<HH>analizadas: valores bajos (es decir, <1, tal como <0,5) indican que un residuo aminoacídico está altamente conservado entre las secuencias V<HH>(es decir, poca variabilidad). Por ejemplo, la G en la posición 9 y la W en la posición 36 tienen valores para la entropía V<HH>de 0,01 y 0, respectivamente, lo que indica que estos residuos están altamente conservados y tienen poca variabilidad (y en el caso de la posición 36 es W en las 7732 secuencias analizadas), mientras que para los residuos que forman parte de las CDR generalmente se encuentran valores de 1,5 o más (datos no mostrados). Obsérvese que los datos representados a continuación apoyan la hipótesis de que los residuos aminoacídicos en las posiciones 27-30 y tal vez incluso también en las posiciones 93 y 94 ya forman parte de las CDR (aunque la descripción no se limita a ninguna hipótesis o explicación específica, y como se mencionó anteriormente, en el presente documento se usa la numeración según Kabat). Para una explicación general de la entropía de secuencia, la variabilidad de secuencia y la metodología para determinar la misma, véase Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52: 544-552 (2003).
[0722] Tabla B-4: Ejemplos no limitantes de residuos aminoacídicos en FR1 (para las notas a pie de página, véanse las notas a pie de página de la Tabla B-2)
[0725]
[0726]
[0728] Tabla B-5: Ejemplos no limitantes de residuos aminoacídicos en FR2 (para las notas a pie de página, véanse las notas a pie de página de la Tabla B-2)
[0729]
[0730]
[0732] Tabla B-6: Ejemplos no limitantes de residuos aminoacídicos en FR3 (para las notas a pie de página, véanse las notas a pie de página de la Tabla B-2)
[0733]
[0734]
[0736] Tabla B-7: Ejemplos no limitantes de residuos aminoacídicos en FR4 (para las notas a pie de página, véanse las notas a pie de página de la Tabla B-2)
[0738]
[0740] Por lo tanto, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanobody de la descripción puede definirse como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
[0741] FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0742] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0743] i) uno o más de los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2; y en la que:
[0744] ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0745] Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobody anteriores son secuencias V<HH>, pueden humanizarse adecuadamente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, opcionalmente pueden humanizarse más adecuadamente, de nuevo como se describe en el presente documento.
[0746] En particular, un Nanobody de la descripción puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0747] en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
[0748] i) (preferiblemente) uno o más de los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la Tabla B-2 (entendiéndose que las secuencias V<HH>contendrán uno o más residuos distintivos; y que los Nanobodies parcialmente humanizados normalmente contendrán, y preferiblemente, [todavía] uno o más residuos distintivos [aunque también está dentro del alcance de la descripción proporcionar - cuando sea adecuado según la descripción - Nanobodies parcialmente humanizados en los que se hayan humanizado todos los residuos distintivos, pero no uno o más de los otros residuos aminoacídicos]; y que en Nanobodies completamente humanizados, cuando sea adecuado según la descripción, todos los residuos aminoacídicos en las posiciones de los residuos distintivos serán residuos aminoacídicos que se producen en una secuencia de V<H>3 humana. Como será evidente para el experto basándose en la divulgación en el presente documento que tales secuencias V<HH>, tales Nanobodies parcialmente humanizados con al menos un residuo distintivo, tales Nanobodies parcialmente humanizados sin residuos distintivos y tales Nanobodies totalmente humanizados forman todos los aspectos de esta descripción);
[0749] y en la que:
[0750] ii) dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 22, en las que, a efectos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las secuencias de CDR (indicados con X en las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 22);
[0751] y en la que:
[0752] iii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0753] Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobody anteriores son secuencias V<HH>, pueden humanizarse adecuadamente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, opcionalmente pueden humanizarse más adecuadamente, de nuevo como se describe en el presente documento.
[0754] Tabla B-8: Secuencias de aminoácidos representativas para Nanobodies del grupo KERE, GLEW y P,R,S 103.
[0756]
[0757]
[0758]
[0760] En particular, un Nanobody de la descripción del grupo KERE puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
[0761] FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0762] en el que:
[0763] i) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es un aminoácido cargado (como se define en el presente documento) o un residuo de cisteína, y la posición 44 es preferentemente una E; y en la que:
[0764] ii) FR1 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0765] Tabla B-9: Secuencias FW1 representativas para Nanobodies del grupo KERE.
[0768]
[0770] y en la que:
[0771] iii) FR2 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0772] Tabla B-10: Secuencias FW2 representativas para Nanobodies del grupo KERE.
[0775]
[0777] y en la que:
[0778] iv) FR3 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0779] Tabla B-11: Secuencias FW3 representativas para Nanobodies del grupo KERE.
[0782]
[0783]
[0785] y en la que:
[0786] v) FR4 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0787] Tabla B-12: Secuencias FW4 representativas para Nanobodies del grupo KERE.
[0790]
[0792] y en la que:
[0793] vi) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0794] En los Nanobodies anteriores, uno o más de los restos distintivos adicionales son preferentemente como se describe en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias V<HH>o Nanobodies parcialmente humanizados).
[0795] Además, los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobody anteriores son secuencias V<HH>, pueden humanizarse adecuadamente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, opcionalmente pueden humanizarse más adecuadamente, de nuevo como se describe en el presente documento.
[0796] Con respecto al marco 1, será evidente para el experto que, cuando una secuencia de aminoácidos como se describe anteriormente se genera mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos, las primeras cuatro secuencias de aminoácidos (es decir, residuos aminoacídicos 1-4 según la numeración de Kabat) a menudo pueden determinarse por el cebador o cebadores que se han usado para generar dicho ácido nucleico. Por lo tanto, para determinar el grado de identidad de aminoácidos, preferiblemente se ignoran los primeros cuatro residuos aminoacídicos.
[0797] Además, con respecto al marco 1, y aunque las posiciones de aminoácidos 27 a 30 están según la numeración de Kabat considerada parte de las regiones estructurales (y no las CDR), se ha encontrado mediante el análisis de una base de datos de más de 1000 secuencias V<HH>que las posiciones 27 a 30 tienen una variabilidad (expresado en términos de entropía V<HH>y variabilidad V<HH>- véanse las Tablas B-4 a B-7) que es mucho mayor que la variabilidad en las posiciones 1 a 26. Debido a esto, para determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos aminoacídicos en las posiciones 27 a 30 también se ignoran preferiblemente.
[0798] En vista de esto, un Nanobody de la clase KERE puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que:
[0799] i) el residuo aminoacídico en la posición 45 según la numeración de Kabat es un aminoácido cargado (como se define en el presente documento) o un residuo de cisteína, y la posición 44 es preferentemente una E; y en la que:
[0800] ii) FR1 es una secuencia de aminoácidos que, en las posiciones 5 a 26 de la numeración de Kabat, tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:Tabla B-13: Secuencias FW1 representativas (residuos aminoacídicos 5 a 26) para Nanobodies del grupo KERE.
[0803]
[0805] y en la que:
[0806] iii) FR2, FR3 y FR4 son como se mencionan en el presente documento para FR2, FR3 y FR4 de Nanobodies de la clase KERE;
[0807] y en la que:
[0808] iv) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0809] Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobody anteriores son secuencias V<HH>, pueden humanizarse adecuadamente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, opcionalmente pueden humanizarse más adecuadamente, de nuevo como se describe en el presente documento.
[0810] Un Nanobody de la clase GLEW puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que
[0811] i) preferiblemente, cuando el Nanobody de la clase GLEW es un Nanobody no humanizado, el residuo aminoacídico en la posición 108 es Q;
[0812] ii) FR1 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0813] Tabla B-14: Secuencias FW1 representativas para Nanobodies del grupo GLEW.
[0816]
[0818] y en la que:
[0819] iii) FR2 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0820] Tabla B-15: Secuencias FW2 representativas para Nanobodies del grupo GLEW.
[0821] Secuencia de GLEW FW2 n.º 1 SEQ ID NO:72 WVRQAPGKVLEWVS
[0822]
[0824] y en la que:
[0825] iv) FR3 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0826] Tabla B-16: Secuencias FW3 representativas para Nanobodies del grupo GLEW.
[0829]
[0831] y en la que:
[0832] v) FR4 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0833] Tabla B-17: Secuencias FW4 representativas para Nanobodies del grupo GLEW.
[0836]
[0838] y en la que:
[0839] vi) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0840] En los Nanobodies anteriores, uno o más de los restos distintivos adicionales son preferentemente como se describe en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias V<HH>o Nanobodies parcialmente humanizados).
[0841] Con respecto al marco 1, volverá a ser evidente para el experto que, para determinar el grado de identidad aminoacídica, los residuos aminoacídicos en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 se ignoran preferentemente.
[0842] En vista de esto, un Nanobody de la clase GLEW puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que:
[0843] i) preferiblemente, cuando el Nanobody de la clase GLEW es un Nanobody no humanizado, el residuo aminoacídico en la posición 108 es Q;
[0844] y en la que:
[0845] ii) FR1 es una secuencia de aminoácidos que, en las posiciones 5 a 26 de la numeración de Kabat, tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0846] Tabla B-18: Secuencias FW1 representativas (residuos aminoacídicos 5 a 26) para Nanobodies del grupo KERE.
[0849]
[0851] y en la que:
[0852] iii) FR2, FR3 y FR4 son como se mencionan en el presente documento para FR2, FR3 y FR4 de Nanobodies de la clase GLEW;
[0853] y en la que:
[0854] iv) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0855] Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobody anteriores son secuencias V<HH>, pueden humanizarse adecuadamente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, opcionalmente pueden humanizarse más adecuadamente, de nuevo como se describe en el presente documento. En los Nanobodies anteriores, uno o más de los restos distintivos adicionales son preferentemente como se describe en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias V<HH>o Nanobodies parcialmente humanizados).
[0856] Un Nanobody de la clase P, R, S 103 puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que
[0857] i) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat es diferente de W;
[0858] y en la que:
[0859] ii) preferentemente el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat es P, R o S, y más preferentemente, R;
[0860] y en la que:
[0861] iii) FR1 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0862] Tabla B-19: Secuencias FW1 representativas para Nanobodies del grupo P,R,S 103.
[0865]
[0866] Secuencia de P,R,S 103 FW1 n.º 8 SEQ ID NO:99 EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS
[0867] y en que
[0868] iv) FR2 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0869] Tabla B-20: Secuencias FW2 representativas para Nanobodies del grupo P,R,S 103.
[0872]
[0874] y en la que:
[0875] v) FR3 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0876] Tabla B-21: Secuencias FW3 representativas para Nanobodies del grupo P,R,S 103.
[0879]
[0881] y en la que:
[0882] vi) FR4 es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0883] Tabla B-22: Secuencias FW4 representativas para Nanobodies del grupo P,R,S 103.
[0886]
[0888] y en la que:
[0889] vii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0890] En los Nanobodies anteriores, uno o más de los restos distintivos adicionales son preferentemente como se describe en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias V<HH>o Nanobodies parcialmente humanizados).
[0891] Con respecto al marco 1, volverá a ser evidente para el experto que, para determinar el grado de identidad aminoacídica, los residuos aminoacídicos en las posiciones 1 a 4 y 27 a 30 se ignoran preferentemente.
[0892] En vista de esto, un Nanobody de la clase P,R,S 103 puede ser una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones/secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones/secuencias determinantes de la complementariedad, en las que:
[0893] i) el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat es diferente de W;
[0894] y en la que:
[0895] ii) preferentemente el residuo aminoacídico en la posición 103 según la numeración de Kabat es P, R o S, y más preferentemente, R;
[0896] y en la que:
[0897] iii) FR1 es una secuencia de aminoácidos que, en las posiciones 5 a 26 de la numeración de Kabat, tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0898] Tabla B-23: Secuencias FW1 representativas (residuos aminoacídicos 5 a 26) para Nanobodies del grupo P,R,S 103.
[0901]
[0903] y en la que:
[0904] iv) FR2, FR3 y FR4 son como se mencionan en el presente documento para FR2, FR3 y FR4 de Nanobodies de la clase P,R,S 103;
[0905] y en la que:
[0906] v) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definen en el presente documento, y son preferiblemente como se definen según uno de los aspectos preferidos en el presente documento, y son más preferiblemente como se definen según uno de los aspectos más preferidos en el presente documento.
[0907] Los Nanobodies anteriores pueden ser, por ejemplo, secuencias V<HH>o pueden ser Nanobodies humanizados. Cuando las secuencias de Nanobody anteriores son secuencias V<HH>, pueden humanizarse adecuadamente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Cuando los Nanobodies son Nanobodies parcialmente humanizados, opcionalmente pueden humanizarse más adecuadamente, de nuevo como se describe en el presente documento.
[0908] En los Nanobodies anteriores, uno o más de los restos distintivos adicionales son preferentemente como se describe en el presente documento (por ejemplo, cuando son secuencias V<HH>o Nanobodies parcialmente humanizados).
[0909] En otro aspecto preferido, pero no limitante, la descripción se refiere a un Nanobody se ha descrito anteriormente, en el que las secuencias de CDR tienen al menos un 70 % de identidad de aminoácidos, preferiblemente al menos un 80 % de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad de aminoácidos, tal como un 95 % de identidad de aminoácidos o más o incluso esencialmente un 100 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Este grado de identidad de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, determinando el grado de identidad de aminoácidos (de una manera descrita en el presente documento) entre dicho Nanobody y una o más de las secuencias de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), en la que se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las regiones estructurales. Dichos Nanobodies pueden ser como se describe más adelante en el presente documento.
[0910] Como ya se ha mencionado en el presente documento, otro aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción se refiere a un Nanobody con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1) o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen más de un 80 %, preferiblemente más de un 90 %, más preferiblemente más de un 95 %, tal como un 99 % o más de identidad de secuencia (como se define en el presente documento) con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1).
[0911] Además, en los Nanobodies anteriores:
[0912] i) cualquier sustitución de aminoácidos (cuando no es una sustitución humanizante como se define en el presente documento) es preferentemente, y en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1), una sustitución de aminoácidos conservadora (como se define en el presente documento);
[0913] y/o:
[0914] ii) su secuencia de aminoácidos contiene preferiblemente solo sustituciones de aminoácidos, o de otro modo preferiblemente no más de 5, preferiblemente no más de 3, y más preferiblemente solo 1 o 2 deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1);
[0915] y/o
[0916] iii) las CDR pueden ser CDR que se derivan por medio de la maduración por afinidad, por ejemplo, comenzando desde las CDR de hasta la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1).
[0917] Preferiblemente, las secuencias de CDR y secuencias de FR en los Nanobodies de la descripción son tales que los Nanobodies de la descripción (y polipéptidos de la descripción que comprenden los mismos):
[0918] • se unen a OX40L con una constante de disociación (K<D>) de 10<-5>a 10<-12>moles/litro o menos, y preferiblemente de 10<-7>a 10<-12>moles/litro o menos y más preferiblemente de 10<-8>a 10<-12>moles/litro (es decir, con una constante de asociación (K<A>) de 10<5>a 10<12>litros/moles o más, y preferiblemente 10<7>a 10<12>litros/moles o más y más preferiblemente 10<8>a 10<12>litros/moles);
[0919] y/o tales que:
[0920] • se unen a OX40L con una velocidad k<as>de entre 10<2>M<-1>s<-1>a aproximadamente 10<7>M<-1>s<-1>, preferiblemente entre 10<3>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, más preferiblemente entre 10<4>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>, tal como entre 10<5>M<-1>s<-1>y 10<7>M<-1>s<-1>;
[0921] y/o tales que:
[0922] • se unen a OX40L con una velocidad k<dis>entre 1 s<-1>(t<1/2>= 0,69 s) y 10<-6>s<-1>(proporcionando un complejo casi irreversible con una t<1/2>de múltiples días), preferentemente entre 10<-2>s<-1>y 10<-6>s<-1>, más preferiblemente entre 10<-3>s<-1>y 10<-6>s<-1>, tal como entre 10<-4>s<-1>y 10<-6>s<-1>.
[0923] Preferiblemente, las secuencias de CDR y las secuencias de FR presentes en los Nanobodies de la descripción son tales que los Nanobodies de la descripción se unirán a OX40L con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM.
[0924] Según un aspecto no limitante de la descripción, un Nanobody puede ser como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos "una diferencia de aminoácidos" (como se define en el presente documento) en al menos una de las regiones estructurales en comparación con la región estructural correspondiente de un dominio V<H>humano de origen natural, y en particular en comparación con la región estructural correspondiente de DP-47. Más específicamente, según un aspecto no limitante de la descripción, un Nanobody puede ser como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos "una diferencia de aminoácidos" (como se define en el presente documento) al menos uno de los residuos distintivos (incluidos en las posiciones 108, 103 y/o 45) en comparación con la región marco correspondiente de un dominio V<H>humano de origen natural, y en particular en comparación con la región estructural correspondiente de DP-47. Normalmente, un Nanobody tendrá al menos dicha diferencia de aminoácidos con un dominio V<H>de origen natural en al menos uno de FR2 y/o FR4, y en particular al menos uno de los residuos distintos en FR2 y/o FR4 (de nuevo, incluidos en las posiciones 108, 103 y/o 45).
[0925] Además, un Nanobody humanizado de la descripción puede ser como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos "una diferencia de aminoácidos" (como se define en el presente documento) en al menos una de las regiones estructurales en comparación con la región estructural correspondiente de un dominio V<HH>de origen natural. Más específicamente, según un aspecto no limitante de la descripción, un Nanobody humanizado puede ser como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos "una diferencia de aminoácidos" (como se define en el presente documento) al menos uno de los residuos distintivos (incluidos en las posiciones 108, 103 y/o 45) en comparación con la región marco correspondiente de un dominio V<HH>de origen natural. Normalmente, un Nanobody humanizado tendrá al menos dicha diferencia de aminoácidos con un dominio V<HH>origen natural en al menos uno de FR2 y/o FR4, y en particular al menos uno de los residuos distintos en FR2 y/o FR4 (de nuevo, incluidos en las posiciones 108, 103 y/o 45).
[0926] Como será evidente a partir de la divulgación en el presente documento, también está dentro del alcance de la descripción usar análogos, mutantes, variantes, alelos, homólogos y ortólogos naturales o sintéticos (denominados colectivamente en el presente documento"análogos") de los Nanobodies de la descripción como se definen en el presente documento, y en particular análogos de los Nanobodies de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Por lo tanto, según un aspecto de la descripción, el término "Nanobody de la descripción" en su sentido más amplio también cubre dichos análogos.
[0927] Generalmente, en dichos análogos, uno o más residuos aminoacídicos pueden haberse reemplazado, eliminado y/o añadido, en comparación con los Nanobodies de la descripción como se definen en el presente documento. Dichas sustituciones, inserciones o deleciones pueden hacerse en una o más de las regiones estructurales y/o en una o más de las CDR. Cuando dichas sustituciones, inserciones o deleciones se realizan en una o más de las regiones estructurales, pueden realizarse en uno o más de los residuos distintivos y/o en una o más de las otras posiciones en los residuos estructurales, aunque las sustituciones, inserciones o deleciones en los residuos distintivos son generalmente menos preferidas (a menos que estas sean sustituciones humanizantes adecuadas como se describe en el presente documento).
[0928] Por medio de ejemplos no limitativos, una sustitución puede ser, por ejemplo, una sustitución conservadora (como se describe en el presente documento) y/o un residuo aminoacídico puede reemplazarse por otro residuo aminoacídico que se produce naturalmente en la misma posición en otro dominio V<HH>(véanse las Tablas B-4 a B-7 para algunos ejemplos no limitantes de dichas sustituciones), aunque la descripción generalmente no se limita a las mismas. Por lo tanto, se incluyen dentro del alcance de la descripción una o más sustituciones, deleciones o inserciones, o cualquier combinación de las mismas, que mejoran las propiedades del Nanobody de la descripción o que al menos no restan demasiado de las propiedades deseadas o del equilibrio o combinación de propiedades deseadas del Nanobody de la descripción (es decir, en la medida en que el Nanobody ya no sea adecuado para su uso previsto). Un experto será generalmente capaz de determinar y seleccionar sustituciones, deleciones o inserciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, basándose en la divulgación en el presente documento y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación rutinaria, que puede implicar, por ejemplo, introducir un número limitado de sustituciones posibles y determinar su influencia en las propiedades de los Nanobodies así obtenidos.
[0929] Por ejemplo, y dependiendo del organismo hospedador usado para expresar el Nanobody o polipéptido de la descripción, dichas deleciones y/o sustituciones pueden diseñarse de tal manera que se eliminen uno o más sitios para la modificación postraduccional (tal como uno o más sitios de glicosilación), como estará dentro de la capacidad del experto en la técnica. Alternativamente, las sustituciones o inserciones pueden diseñarse de modo que introduzcan uno o más sitios para la unión de grupos funcionales (como se describe en el presente documento), por ejemplo, para permitir la pegilación específica del sitio (de nuevo como se describe en el presente documento). Como se puede ver a partir de los datos sobre la entropía de V<HH>y la variabilidad de V<HH>dados en las Tablas B-4 a B-7 anteriores, algunos residuos aminoacídicos en las regiones estructurales están más conservados que otros. En general, aunque la descripción en su sentido más amplio no se limita a la misma, cualquier sustitución, deleción o inserción se realiza preferentemente en posiciones que están menos conservadas. Además, en general, se prefieren sustituciones de aminoácidos sobre deleciones o inserciones de aminoácidos.
[0930] Los análogos son preferiblemente tales que pueden unirse a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento para los Nanobodies de la descripción.
[0931] Los análogos son preferiblemente también aquellos que conservan las propiedades favorables de los Nanobodies, como se describe en el presente documento.
[0932] Además, según un aspecto preferido, los análogos tienen un grado de identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % o un 99 % o más; y/o preferiblemente tienen al menos 20, preferiblemente como máximo 10, incluso más preferiblemente como máximo 5, tal como 4, 3, 2 o solo 1 diferencia de aminoácidos (como se define en el presente documento), con uno de los Nanobodies de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1).
[0933] Además, las secuencias estructurales y CDR de los análogos son preferiblemente de modo que estén según los aspectos preferidos definidos en el presente documento. Más generalmente, como se describe en el presente documento, los análogos tendrán (a) una Q en la posición 108; y/o (b) un aminoácido cargado o un residuo de cisteína en la posición 45 y preferiblemente una E en la posición 44, y más preferiblemente E en la posición 44 y R en la posición 45; y/o (c) P, R o S en la posición 103.
[0934] Una clase preferida de análogos de los Nanobodies de la descripción comprende Nanobodies que se han humanizado (es decir, en comparación con la secuencia de un Nanobody de origen natural de la descripción). Como se menciona en los antecedentes de la técnica citados en el presente documento, dicha humanización implica generalmente reemplazar uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de un V<HH>de origen natural con los residuos aminoacídicos que se producen en la misma posición en un dominio V<H>humano, tal como un dominio V<H>3 humano. Los ejemplos de posibles sustituciones humanizantes o combinaciones de sustituciones humanizantes serán evidentes para el experto, por ejemplo, a partir de las tablas del presente documento, de las posibles sustituciones humanizantes mencionadas en los antecedentes de la técnica citados en el presente documento, y/o de una comparación entre la secuencia de un Nanobody y la secuencia de un dominio V<H>humano de origen natural.
[0935] Las sustituciones humanizantes deben elegirse de modo que los Nanobodies humanizados resultantes aún conserven las propiedades favorables de los Nanobodies como se definen en el presente documento, y más preferentemente de modo que sean como se describe para análogos en los párrafos anteriores. Un experto en general será capaz de determinar y seleccionar sustituciones humanizantes adecuadas o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes, basándose en la divulgación en el presente documento y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación rutinaria, que puede implicar, por ejemplo, introducir un número limitado de posibles sustituciones humanizantes y determinar su influencia en las propiedades de los Nanobodies así obtenidos.
[0936] Generalmente, como resultado de la humanización, los Nanobodies de la descripción pueden volverse más "similares a los humanos", mientras que todavía conservan las propiedades favorables de los Nanobodies de la descripción como se describe en el presente documento. Como resultado, dichos Nanobodies humanizados pueden tener varias ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, en comparación con los dominios V<HH>de origen natural correspondientes. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación rutinaria, el experto podrá seleccionar sustituciones humanizantes o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes que optimicen o logren un equilibrio deseado o adecuado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones humanizantes, por un lado, y las propiedades favorables de los dominios V<HH>de origen natural, por otro.
[0937] Los Nanobodies de la descripción pueden humanizarse adecuadamente en cualquier residuo o residuos estructurales, tal como en uno o más residuos distintivos (como se definen en el presente documento) o en uno o más restos estructurales (es decir, restos no distintivos) o cualquier combinación adecuada de los mismos. Una sustitución humanizante preferida para Nanobodies del "grupo P,R,S-103" o el "grupo KERE" es Q108 en L108. Los Nanobodies de la "clase GLEW" también pueden humanizarse mediante una sustitución Q108 en L108, siempre que al menos uno de los otros residuos distintivos contenga una sustitución de camélido (camelizante) (como se define en el presente documento). Por ejemplo, como se mencionó anteriormente, una clase particularmente preferida de Nanobodies humanizados tiene GLEW o una secuencia similar a GLEW en las posiciones 44-47; P, R o S (y en particular R) en la posición 103, y una L en la posición 108.
[0938] Los análogos humanizados y otros, y las secuencias de ácido nucleico que codifican los mismos, pueden proporcionarse de cualquier manera conocida de por sí, por ejemplo, usando una o más de las técnicas mencionadas en las páginas 103 y 104 del documento de patente WO 08/020079.
[0939] Por lo tanto, además de humanizar sustituciones como se describen en el presente documento, las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden contener una o más de otras sustituciones/sustituciones adicionales. De nuevo, algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichas otras sustituciones/sustituciones adicionales se volverán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento, y, por ejemplo, pueden incluir (y preferiblemente consistir esencialmente en) una o más de las siguientes sustituciones:
[0940] (a) una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos; y/o
[0941] (B) una o más sustituciones en las que un residuo aminoacídico de "camélido" en una posición determinada es reemplazado por un residuo aminoacídico de "camélido" diferente que se produce en dicha posición, para las que se hace referencia, por ejemplo, a las Tablas A-6 a A-9 del documento de patente PCT/EP2008/066365 (publicado el 4 de junio de 2009 como el documento de patente WO 09/068627), que mencionan los diversos residuos de camélido que se producen como cada posición de aminoácido en VHH natural. Dichas sustituciones pueden comprender incluso sustituciones adecuadas de un residuo aminoacídico que se produce en una posición distintiva con otro residuo aminoacídico que se produce en una posición distintiva en un VHH natural (para lo que se hace referencia, por ejemplo, a las Tablas A-6 a A-9 del documento de patente PCT/EP2008/066365); y/o
[0942] (c) una o más sustituciones que mejoran las (otras) propiedades de la proteína, tales como sustituciones que mejoran la estabilidad a largo plazo y/o propiedades en almacenamiento de la proteína. Estas pueden ser, por ejemplo y sin limitación, sustituciones que previenen o reducen los eventos de oxidación (por ejemplo, de residuos de metionina); que previenen o reducen la formación de piroglutamato; y/o que previenen o reducen la isomerización o desamidación de ácidos aspárticos o asparaginas (por ejemplo, de motivos DG, DS, NG o NS). Para dichas sustituciones, se hace referencia, por ejemplo, a la solicitud internacional WO 09/095235, que se dirige generalmente a métodos de estabilización de dominios variables únicos de inmunoglobulina mediante dichas sustituciones, y también da algún ejemplo específico de sustituciones adecuadas (véanse, por ejemplo, las páginas 4 y 5 y las páginas 10 a 15). Un ejemplo de dicha sustitución puede ser reemplazar un motivo NS en las posiciones 82a y 82b con un motivo NN.
[0943] Como se menciona allí, también será evidente para el experto que los Nanobodies de la descripción (incluidos sus análogos) pueden diseñarse y/o prepararse a partir de secuencias de V<H>humanas (es decir, secuencias de aminoácidos o las secuencias de nucleótidos correspondientes), tales como, por ejemplo, a partir de secuencias de V<H>3 humanas tales como DP-47, DP-51 o DP-29, es decir, introduciendo una o más sustituciones de camelizantes (es decir, cambiar uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de dicho dominio V<H>humano en los residuos aminoacídicos que se producen en la posición correspondiente en un dominio V<HH>), para proporcionar la secuencia de un Nanobody de la descripción y/o para conferir las propiedades favorables de un Nanobody a la secuencia así obtenida. De nuevo, esto generalmente se puede realizar usando los diversos métodos y técnicas a los que se hace referencia en el párrafo anterior, usando una secuencia de aminoácidos y/o secuencia de nucleótidos para un dominio V<H>humano como punto de partida.
[0944] Algunas sustituciones camelizantes preferidas, pero no limitantes, pueden derivarse de las Tablas B-4 - B-7. También estará claro que las sustituciones de camelización en uno o más de los residuos distintivos generalmente tendrán una mayor influencia en las propiedades deseadas que las sustituciones en una o más de las otras posiciones de aminoácidos, aunque ambas y cualquier combinación adecuada de los mismos se incluyen dentro del alcance de la descripción. Por ejemplo, es posible introducir una o más sustituciones camelizantes que ya confieren al menos algunas de las propiedades deseadas, y luego introducir sustituciones camelizantes adicionales que mejoren aún más dichas propiedades y/o confieran propiedades favorables adicionales. De nuevo, el experto en general será capaz de determinar y seleccionar sustituciones camelizantes adecuadas o combinaciones adecuadas de sustituciones camelizantes, basándose en la divulgación en el presente documento y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación rutinaria, que puede implicar, por ejemplo, introducir un número limitado de posibles sustituciones camelizantes y determinar si se obtienen o mejoran las propiedades favorables de Nanobodies (es decir, en comparación con el dominio V<H>original).
[0945] En general, sin embargo, dichas sustituciones camelizantes son preferiblemente tales que la secuencia de aminoácidos resultante contenga al menos (a) una Q en la posición 108; y/o (b) un aminoácido cargado o un residuo de cisteína en la posición 45 y preferiblemente también una E en la posición 44, y más preferiblemente E en la posición 44 y R en la posición 45; y/o (c) P, R o S en la posición 103; y opcionalmente una o más sustituciones de camelización adicionales. Más preferiblemente, las sustituciones de camelización son tales que dan como resultado un Nanobody de la descripción y/o en un análogo del mismo (como se define en el presente documento), tal como en un análogo humanizado y/o preferiblemente en un análogo que es como se define en los párrafos anteriores.
[0946] Los Nanobodies también pueden derivar de dominios V<H>mediante la incorporación de sustituciones que son raras en la naturaleza, pero no obstante, estructuralmente compatibles con el pliegue del dominio VH. Por ejemplo, pero sin ser limitantes, estas sustituciones pueden incluir en o más de las siguientes: Gly en la posición 35, Ser, Val o Thr en la posición 37, Ser, Thr, Arg, Lys, His, Asp o Glu en la posición 39, Glu o His en la posición 45, Trp, Leu, Val, Ala, Thr, o Glu en la posición 47, S o R en la posición 50. (Barthelemy et al. J Biol Chem. 8 de febrero de 2008; 283(6):3639-54. Publicación electrónica 28 de noviembre de 2007)
[0947] Como también será evidente a partir de la divulgación en el presente documento, también está dentro del alcance de la descripción usar partes o fragmentos, o combinaciones de dos o más partes o fragmentos, de los Nanobodies de la descripción como se definen en el presente documento, y en particular partes o fragmentos de los Nanobodies de SEQ ID NO: 179 a 185 (véase la Tabla A-1). Por lo tanto, según un aspecto de la descripción, el término "Nanobody de la descripción" en su sentido más amplio también cubre dichas partes o fragmentos.
[0948] Generalmente, dichas partes o fragmentos de los Nanobodies de la descripción (incluidos análogos de los mismos) tienen secuencias de aminoácidos en las que, en comparación con la secuencia de aminoácidos del Nanobody de longitud completa correspondiente de la descripción (o análogo del mismo), uno o más de los residuos aminoacídicos en el extremo aminoterminal, uno o más residuos aminoacídicos en el extremo carboxiterminal, uno o más residuos aminoacídicos internos contiguos, o cualquier combinación de los mismos, se han delecionado y/o eliminado.
[0949] Las partes o fragmentos son preferiblemente tales que pueden unirse a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento para los Nanobodies de la descripción.
[0950] Cualquier parte o fragmento es preferiblemente tal que comprende al menos 10 residuos aminoacídicos contiguos, preferiblemente al menos 20 residuos aminoacídicos contiguos, más preferiblemente al menos 30 residuos aminoacídicos contiguos, tales como al menos 40 residuos aminoacídicos contiguos, de la secuencia de aminoácidos del Nanobody de longitud completa correspondiente de la descripción.
[0951] Además, cualquier parte o fragmento es tal preferentemente que comprende al menos una de CDR1, CDR2 y/o CDR3 o al menos parte de la misma (y en particular al menos CDR3 o al menos parte de la misma). Más preferiblemente, cualquier parte o fragmento es tal que comprende al menos una de las CDR (y preferiblemente al menos CDR3 o parte de las mismas) y al menos otra CDR (es decir, CDR1 o CDR2) o al menos parte de las mismas, preferiblemente conectadas por secuencia o secuencias estructurales adecuadas o al menos parte de las mismas. Más preferiblemente, cualquier parte o fragmento es tal que comprende al menos una de las CDR (y preferiblemente al menos una CDR3 o parte de la misma) y al menos parte de las dos CDR restantes, de nuevo preferiblemente conectadas por secuencia o secuencias estructurales adecuadas o al menos parte de las mismas. Según otro aspecto particularmente preferido, pero no limitante, dicha parte o fragmento comprende al menos una CDR3, tal como FR3, CDR3 y FR4 del Nanobody de longitud completa correspondiente de la descripción, es decir, por ejemplo, como se describe en la solicitud Internacional WO 03/050531 (Lasters et al.).
[0952] Como ya se mencionó anteriormente, también es posible combinar dos o más de dichas partes o fragmentos (es decir, del mismo Nanobody o diferente de la descripción), es decir, proporcionar un análogo (como se define en el presente documento) y/o proporcionar partes o fragmentos adicionales (como se define en el presente documento) de un Nanobody de la descripción. Por ejemplo, también es posible combinar una o más partes o fragmentos de un Nanobody de la descripción con una o más partes o fragmentos de un dominio V<H>humano.
[0953] Según un aspecto preferido, las partes o fragmentos tienen un grado de identidad de secuencia de al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 60 %, más preferiblemente al menos un 70 %, incluso más preferiblemente al menos un 80 %, tal como al menos un 90 %, 95 % o 99 % o más con uno de los Nanobodies de SEQ ID NO 179 a 185 (véase la Tabla A-1).
[0954] Las partes y fragmentos, y las secuencias de ácido nucleico que codifican las mismas, se pueden proporcionar y opcionalmente combinar de cualquier manera conocida de por sí. Por ejemplo, dichas partes o fragmentos se pueden obtener insertando un codón de parada en un ácido nucleico que codifica un Nanobody de tamaño completo de la descripción, y luego expresando el ácido nucleico así obtenido de una manera de por sí conocida (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican dichas partes o fragmentos pueden obtenerse restringiendo adecuadamente un ácido nucleico que codifica un Nanobody de tamaño completo de la descripción o sintetizando dicho ácido nucleico de una manera conocida de por sí. También se pueden proporcionar partes o fragmentos usando técnicas para la síntesis peptídica conocidas de por sí.
[0955] La descripción en su sentido más amplio también comprende derivados de los Nanobodies de la descripción. Dichos derivados pueden obtenerse generalmente mediante modificación, y en particular mediante modificación química y/o biológica (por ejemplo enzimática), de los Nanobodies de la descripción y/o de uno o más de los residuos aminoacídicos que forman los Nanobodies de la descripción.
[0956] Ejemplos de dichas modificaciones, así como ejemplos de residuos aminoacídicos dentro de la secuencia de Nanobody que pueden modificarse de tal manera (es decir, ya sea en la cadena principal de la proteína, pero preferentemente en una cadena lateral), los métodos y las técnicas que se pueden usar para introducir dichas modificaciones y los posibles usos y ventajas de dichas modificaciones serán evidentes para el experto.
[0957] Por ejemplo, dicha modificación puede implicar la introducción (por ejemplo, mediante unión covalente o de otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, residuos o restos en o sobre el Nanobody de la descripción, y en particular de uno o más grupos funcionales, residuos o restos que confieren una o más propiedades o funcionalidades deseadas al Nanobody de la descripción. Un ejemplo de dichos grupos funcionales será evidente para el experto.
[0958] Por ejemplo, dicha modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, mediante unión covalente o de cualquier otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales que aumentan la semivida, la solubilidad y/o la absorción del Nanobody de la descripción, que reducen la inmunogenicidad y/o la toxicidad del Nanobody de la descripción, que eliminan o atenúan cualquier efecto secundario no deseable del Nanobody de la descripción, y/o que confieren otras propiedades ventajosas a y/o reducen las propiedades no deseadas de los Nanobodies y/o polipéptidos de la descripción; o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. Los ejemplos de dichos grupos funcionales y de las técnicas para introducirlos serán evidentes para el experto, y en general pueden comprender todos los grupos funcionales y técnicas mencionados en los antecedentes de la técnica generales citados anteriormente, así como los grupos funcionales y técnicas conocidas de por sí para la modificación de proteínas farmacéuticas, y, en particular, para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incluidos scFv y anticuerpos de dominio único), para los que se hace referencia, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Dichos grupos funcionales pueden, por ejemplo, estar ligados directamente (por ejemplo, covalentemente) a un Nanobody de la descripción, u opcionalmente a través de un conector o espaciador adecuado, como volverá a ser evidente para el experto.
[0959] Una de las técnicas más ampliamente usadas para aumentar la semivida y/o reducir la inmunogenicidad de proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tales como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). En general, se puede usar cualquier forma adecuada de pegilación, tal como la pegilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos de dominio (único) y scFv); se hace referencia, por ejemplo, a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); por Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev.54, 453-456 (2003), por Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en el documento de patente WO 04/060965. También están disponibles en el mercado diversos reactivos para la pegilación de proteínas, por ejemplo, de Nektar Therapeutics, EE. UU.
[0960] Preferiblemente, se usa pegilación dirigida al sitio, en particular a través de un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, para este propósito, el PEG puede unirse a un residuo de cisteína que se produce naturalmente en un Nanobody de la descripción, un Nanobody de la descripción puede modificarse para introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para la unión del PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG puede fusionarse al extremo N y/o C de un Nanobody de la descripción, todo usando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas de por sí por el experto.
[0961] Preferiblemente, para los Nanobodies y proteínas de la descripción, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como más de 10.000 y menos de 200.000, tal como menos de 100.000; por ejemplo, en el intervalo de 20.000-80.000.
[0962] Otra modificación, normalmente menos preferida, comprende la glicosilación ligada a N o ligada a O, normalmente como parte de la modificación cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la célula hospedadora usada para expresar el Nanobody o polipéptido de la descripción.
[0963] Otra modificación más puede comprender la introducción de una o más etiquetas detectables u otros grupos o restos generadores de señales, dependiendo del uso previsto del Nanobody marcado. Las etiquetas y técnicas adecuadas para unirlas, usarlas y detectarlas serán evidentes para el experto e incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, las etiquetas fluorescentes, las etiquetas fosforescentes, las etiquetas quimioluminiscentes, las etiquetas bioluminiscentes, las etiquetas bioluminiscentes, radioisótopos, metales, quelatos metálicos, cationes metálicos, cromóforos y enzimas, tales como los mencionados en la página 109 del documento de patente WO 08/020079. Otras etiquetas adecuadas serán evidentes para el experto, y, por ejemplo, incluyen restos que pueden detectarse usando espectroscopia RMN o ESR.
[0964] Dichos Nanobodies y polipéptidos marcados de la descripción se pueden usar, por ejemplo, para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluidos inmunoensayos conocidos de por sí, tales como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos sándwich", etc.), así como para fines de diagnóstico y obtención de imágenes in vivo, dependiendo de la elección de la etiqueta específica.
[0965] Como será evidente para el experto, otra modificación puede implicar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo, para quelar uno de los metales o cationes metálicos a los que se hace referencia anteriormente. Los grupos quelantes adecuados, por ejemplo, incluyen, sin limitación, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
[0966] Otra modificación más puede comprender la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de unión específico, tal como el par de unión a biotina-(estrept)avidina. Dicho grupo funcional puede usarse para enlazar el Nanobody de la descripción a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que se une a la otra mitad del par de unión, es decir, a través de la formación del par de unión. Por ejemplo, un Nanobody de la descripción puede conjugarse con biotina y unirse a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugado con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, dicho Nanobody conjugado puede usarse como indicador, por ejemplo, en un sistema de diagnóstico donde un agente productor de señales detectable se conjuga con avidina o estreptavidina. Dichos pares de unión también pueden usarse, por ejemplo, para unir el Nanobody de la descripción a un portador, incluidos los portadores adecuados para fines farmacéuticos. Un ejemplo no limitante son las formulaciones liposomales descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Target, 8, 4, 257 (2000). Dichos pares de unión también pueden usarse para unir un agente terapéuticamente activo al Nanobody de la descripción.
[0968] Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las que se pretende destruir una célula que expresa la diana contra la que se dirigen los Nanobodies de la descripción (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer), o para reducir o ralentizar el crecimiento y/o la proliferación de dicha célula, los Nanobodies de la descripción también pueden estar unidos a una toxina o a un residuo o resto tóxico. Ejemplos de restos, compuestos o residuos tóxicos que se pueden unir a un Nanobody de la descripción para proporcionar, por ejemplo, un compuesto citotóxico serán evidentes para el experto y se pueden encontrar, por ejemplo, en el estado de la técnica citado anteriormente y/o en la descripción adicional en el presente documento. Un ejemplo es la denominada tecnología ADEPT<™>descrita en el documento de patente WO 03/055527.
[0970] Otras posibles modificaciones químicas y enzimáticas serán evidentes para el experto. Dichas modificaciones también pueden introducirse con fines de investigación (por ejemplo, para estudiar relaciones función-actividad). Se hace referencia, por ejemplo, a Lundblad y Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).
[0972] Preferiblemente, los derivados son tales que se unen a OX40L con una afinidad (adecuadamente medida y/o expresada como un valor de K<D>(real o aparente), un valor de K<A>(real o aparente), una velocidad k<as>y/o una velocidad k<dis>, o alternativamente como un valor de CI<50>, como se describe más adelante en el presente documento) que es como se define en el presente documento para los Nanobodies de la descripción.
[0974] Como se mencionó anteriormente, la descripción también se refiere a proteínas o polipéptidos que consisten esencialmente en o comprenden al menos un Nanobody de la descripción. Por "consisten esencialmente en" se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la descripción es exactamente la misma que la secuencia de aminoácidos de un Nanobody de la descripción o corresponde a la secuencia de aminoácidos de un Nanobody de la descripción que tiene un número limitado de residuos aminoacídicos, tal como 1-20 residuos aminoacídicos, por ejemplo 1-10 residuos aminoacídicos y preferentemente 1-6 residuos aminoacídicos, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos aminoacídicos, añadidos en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal, o tanto en el extremo aminoterminal como en el extremo carboxiterminal de la secuencia de aminoácidos del Nanobody.
[0976] Dichos residuos aminoacídicos pueden o no cambiar, alterar o influir de otro modo en las propiedades (biológicas) del Nanobody y pueden añadir o no funcionalidad adicional al Nanobody. Por ejemplo, dichos residuos aminoacídicos:
[0978] • Pueden comprender un residuo Met aminoterminal, por ejemplo, como resultado de la expresión en una célula hospedadora heteróloga u organismo hospedador.
[0980] • Pueden formar una secuencia señalizadora o secuencia conductora que dirige la secreción del Nanobody de una célula hospedadora tras la síntesis. Los péptidos conductores secretores adecuados serán evidentes para el experto, y pueden ser como se describe más adelante en el presente documento. Normalmente, una secuencia conductora de este tipo se unirá al extremo amino del Nanobody, aunque la descripción en su sentido más amplio no se limita a esto;
[0982] • Puede formar una secuencia o señal que permita que el Nanobody se dirija hacia y/o penetre o entre en órganos, tejidos, células o partes o compartimentos específicos de células, y/o que permita que el Nanobody penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor que incluye tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto e incluyen los mencionados en el párrafo c) en la página 112 del documento de patente WO 08/020079.
[0984] • Puede formar una "etiqueta", por ejemplo, una secuencia de aminoácidos o residuo que permite o facilita la purificación del Nanobody, por ejemplo, usando técnicas de afinidad dirigidas contra dicha secuencia o residuo. A partir de entonces, dicha secuencia o residuo puede eliminarse (por ejemplo, mediante escisión química o enzimática) para proporcionar la secuencia de Nanobody (para este propósito, la etiqueta puede unirse opcionalmente a la secuencia de Nanobody a través de una secuencia conectora escindible o contener un motivo escindible). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de dichos residuos son múltiples residuos de histidina, residuos de glutatión y una etiqueta myc (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO:31 del documento de patente WO 06/12282).
[0986] • Puede ser uno o más residuos aminoacídicos que se han funcionalizado y/o que pueden servir como un sitio para la unión de grupos funcionales. Los residuos aminoacídicos y grupos funcionales adecuados serán evidentes para el experto e incluyen, pero sin limitación, los residuos aminoacídicos y grupos funcionales mencionados en el presente documento para los derivados de los Nanobodies de la descripción.
[0987] Según otro aspecto, un polipéptido de la descripción comprende un Nanobody de la descripción, que se fusiona en su extremo aminoterminal, en su extremo carboxiterminal, o tanto en su extremo aminoterminal como en su extremo carboxiterminal, con al menos una secuencia de aminoácidos adicional, es decir, para proporcionar una proteína de fusión que comprende dicho Nanobody de la descripción y la una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Dicha fusión también se denominará en el presente documento una "fusión de Nanobody".
[0989] La una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos adecuada y/o deseada. Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no cambiar, alterar o influir de otro modo en las propiedades (biológicas) del Nanobody, y pueden o no añadir funcionalidad adicional al Nanobody o el polipéptido de la descripción. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos adicional es tal que confiere una o más propiedades o funcionalidades deseadas al Nanobody o al polipéptido de la descripción.
[0991] Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos adicional también puede proporcionar un segundo sitio de unión, cuyo sitio de unión puede estar dirigido contra cualquier proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo deseado (que incluye, pero sin limitación, la misma proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo contra el que se dirige el Nanobody de la descripción, o una proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo diferente).
[0993] El ejemplo de dichas secuencias de aminoácidos será evidente para el experto, y generalmente puede comprender todas las secuencias de aminoácidos que se usan en fusiones peptídicas basadas en anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos (incluyendo, pero sin limitación, scFv y anticuerpos de dominio único). Se hace referencia, por ejemplo, a la revisión de Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005).
[0995] Por ejemplo, dicha secuencia de aminoácidos puede ser una secuencia de aminoácidos que aumenta la semivida, la solubilidad o la absorción, reduce la inmunogenicidad o la toxicidad, elimina o atenúa los efectos secundarios indeseables y/o confiere otras propiedades ventajosas a y/o reduce las propiedades no deseadas de los polipéptidos de la descripción, en comparación con el Nanobody de la descripción en sí. Algunos ejemplos no limitantes de dichas secuencias de aminoácidos son proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 00/27435) o moléculas hapténicas (por ejemplo, haptenos que se reconocen mediante anticuerpos circulantes, véase, por ejemplo, el documento de patente WO 98/22141).
[0997] En particular, se ha descrito en la técnica que se pueden usar fragmentos de unión de inmunoglobulinas (tales como dominios V<H>) a albúmina sérica o a fragmentos de la misma para aumentar la semivida. Se hace referencia a los documentos de patente WO 00/27435 y WO 01/077137). Según la descripción, el Nanobody de la descripción está preferentemente ligado directamente a albúmina sérica (o a un fragmento adecuado de la misma) o a través de un conector adecuado, y en particular a través de un péptido adecuado unido de modo que el polipéptido de la descripción pueda expresarse como una fusión genética (proteína). Según un aspecto específico, el Nanobody de la descripción puede estar unido a un fragmento de albúmina sérica que comprende al menos el dominio III de albúmina sérica o parte del mismo. Se hace referencia, por ejemplo, al documento de patente WO 07/112940 de Ablynx N.V.
[0999] Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional puede proporcionar un segundo sitio de unión o unidad de unión que está dirigida contra una proteína sérica (tal como, por ejemplo, albúmina sérica humana u otra proteína sérica tal como IgG), para proporcionar una semivida elevada en suero. Dichas secuencias de aminoácidos incluyen, por ejemplo, los Nanobodies descritos a continuación, así como los péptidos pequeños y las proteínas de unión descritos en los documentos de patente WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 y los dAb descritos en los documentos de patente WO 03/002609 y WO 04/003019. También se hace referencia a Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005, así como al documento de patente EP 0368684, así como al documento WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 por Ablynx N.V. y la solicitud provisional de EE. UU. de Ablynx N.V. Titulada"Peptides capable of binding to serum proteins"presentada el 5 de diciembre de 2006 ((véase también el documento de patente PCT/EP2007/063348).
[1001] Dichas secuencias de aminoácidos pueden dirigirse en particular contra la albúmina sérica (y más en particular la albúmina sérica humana) y/o contra IgG (y más en particular la IgG humana). Por ejemplo, dichas secuencias de aminoácidos pueden ser secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra la albúmina sérica (humana) y secuencias de aminoácidos que pueden unirse a residuos aminoacídicos en albúmina sérica (humana) que no están implicadas en la unión de albúmina sérica a FcRn (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 06/0122787) y/o secuencias de aminoácidos que son capaces de unirse a residuos aminoacídicos en albúmina sérica que no forman parte del dominio III de albúmina sérica (véase de nuevo, por ejemplo, el documento de patente WO 06/0122787); secuencias de aminoácidos que tienen o pueden proporcionar una semivida aumentada (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/028977 de Ablynx N.V.); secuencias de aminoácidos contra albúmina sérica humana que tienen reactividad cruzada con albúmina sérica de al menos una especie de mamífero, y en particular con al menos una especie de primate (tal como, sin limitación, monos del géneroMacaca(tal como, y, en particular, monos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuino (Papio ursinus), se hace referencia de nuevo al documento de patente WO 08/028977; secuencias de aminoácidos que pueden unirse a albúmina sérica de una manera independiente del pH (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/043821 de Ablynx N.V. titulado"Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof") y/o secuencias de aminoácidos que son ligantes condicionales (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/043822 de Ablynx N.V. titulado"Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner").
[1003] Según otro aspecto, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpos convencionales de 4 cadenas (y en particular anticuerpos humanos) y/o de anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, aunque normalmente es menos preferido, un Nanobody de la descripción puede estar unido a un dominio V<H>o V<L>convencional (preferentemente humano) o a un análogo natural o sintético de un dominio V<H>o V<L>, de nuevo opcionalmente a través de una secuencia conectora (que incluye, pero sin limitación, otros anticuerpos de dominio (único), tales como los dAb descritos por Ward et al.).
[1005] El al menos un Nanobody también puede estar unido a uno o más dominios C<H>1, C<H>2 y/o C<H>3 (preferentemente humanos), opcionalmente a través de una secuencia conectora. Por ejemplo, un Nanobody unido a un dominio C<H>1 adecuado podría usarse, junto con cadenas ligeras adecuadas, para generar fragmentos/estructuras de anticuerpos análogos a fragmentos Fab convencionales o fragmentos F(ab')<2>, pero en los que uno o (en el caso de un fragmento F(ab')<2>) uno o ambos de los dominios V<H>convencionales han sido reemplazados por un Nanobody de la descripción. Además, dos Nanobodies podrían unirse a un dominio C<H>3 (opcionalmente a través de un conector) para proporcionar una construcción con semivida aumentada in vivo.
[1007] Según un aspecto específico de un polipéptido de la descripción, uno o más Nanobodies de la descripción pueden unirse (opcionalmente a través de un conector o región bisagra adecuada) a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que pueden usarse como parte de/para formar una porción Fc), a una porción Fc y/o a una o más partes de anticuerpos, fragmentos o dominios que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la descripción y/o pueden conferir la capacidad de unirse a uno o más receptores de Fc. Por ejemplo, para este propósito, y sin limitarse a los mismos, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios C<H>2 y/o C<H>3 de un anticuerpo, tal como a partir de un anticuerpo de cadena pesada (como se describe en el presente documento) y más preferentemente a partir de un anticuerpo humano convencional de 4 cadenas; y/o puede formar (parte de) una región Fc, por ejemplo, de IgG (por ejemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), de IgE o de otra Ig humana tal como IgA, IgD o IgM. Por ejemplo, el documento de patente WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio V<HH>de camélido o un derivado humanizado del mismo (es decir, un Nanobody), en los que el dominio C<H>2 y/o C<H>3 de Camelidae han sido reemplazados dominios C<H>2 y C<H>3 humanos, con el fin de proporcionar una inmunoglobulina que consiste en 2 cadenas pesadas que comprenden cada una un Nanobody y dominios C<H>2 y C<H>3 humanos (pero ningún dominio C<H>1), cuya inmunoglobulina tiene la función efectora proporcionada por los dominios C<H>2 y C<H>3 y cuya inmunoglobulina puede funcionar sin la presencia de ninguna cadena ligera. Otras secuencias de aminoácidos que pueden unirse adecuadamente a los Nanobodies de la descripción para proporcionar una función efectora serán evidentes para el experto, y pueden elegirse basándose en la función o funciones efectoras deseadas. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos de patente WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 y WO 05/017148, así como a la revisión de Holliger y Hudson, arriba; y a la solicitud provisional de EE. UU. no prepublicada de Ablynx N.V. Titulada"Constructs comprising single variable domains and an Fc portion derived from IgE", que tiene una fecha de presentación del 4 de diciembre de 2007 (documento de patente US2011/0189203). El acoplamiento de un Nanobody de la descripción a una porción Fc también puede conducir a una semivida aumentada, en comparación con el Nanobody correspondiente de la descripción. Para algunas aplicaciones, el uso de una porción Fc y/o de dominios constantes (es decir, dominios C<H>2 y/o C<H>3) que confieren semivida aumentada sin ninguna función efectora biológicamente significativa también puede ser adecuado o incluso preferido. Otras construcciones adecuadas que comprenden uno o más Nanobodies y uno o más dominios constantes con semivida aumentada in vivo serán evidentes para el experto, y pueden comprender, por ejemplo, dos Nanobodies unidos a un dominio C<H>3, opcionalmente a través de una secuencia conectora. Generalmente, cualquier proteína de fusión o derivados con semivida aumentada tendrá preferentemente un peso molecular de más de 50 kD, el valor de corte para la absorción renal.
[1009] En otro aspecto específico, pero no limitante, con el fin de formar un polipéptido de la descripción, una o más secuencias de aminoácidos de la descripción pueden unirse (opcionalmente a través de un conector o región bisagra adecuada) a dominios constantes sintéticos o semisintéticos de origen natural (o análogos, variantes, mutantes, partes o fragmentos de los mismos) que tienen una tendencia reducida (o esencialmente nula) a autoasociarse en dímeros (es decir, en comparación con dominios constantes que se producen de forma natural en anticuerpos de 4 cadenas convencionales). Dichas variantes monoméricas (es decir, no autoasociadas) de la cadena de Fc, o fragmentos de las mismas, serán evidentes para el experto. Por ejemplo, Helm et al., J Biol Chem 19962717494, describen variantes monoméricas de la cadena de Fc
[1011] que pueden usarse en las cadenas polipeptídicas de la descripción.
[1012] Además, dichas variantes monoméricas de la cadena de Fc son preferiblemente tales que todavía son capaces de unirse al complemento o al receptor o receptores de Fc relevantes (dependiendo de la porción Fc de la que derivan), y/o tales que todavía tienen algunas o todas las funciones efectoras de la porción Fc de la que derivan (o a un nivel reducido todavía adecuado para el uso previsto). Alternativamente, en dicha cadena polipeptídica de la descripción, la cadena Fc monomérica puede usarse para conferir semivida aumentada a la cadena polipeptídica, en cuyo caso la cadena Fc monomérica también puede no tener o esencialmente no tener ninguna función efectora.
[1014] Los polipéptidos bivalentes/multivalentes, biespecíficos/multiespecíficos o biparatópicos/multiparatópicos de la descripción también pueden unirse a porciones Fc, con el fin de proporcionar construcciones polipeptídicas del tipo que se describe en la solicitud provisional de EE. UU. no publicada US 61/0189203, titulada "Immunoglobulin Constructs", presentada el 4 de diciembre de 2007 (documento de patente US2011/005.331).
[1016] Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia señalizadora o secuencia conductora que dirige la secreción del Nanobody o el polipéptido de la descripción de una célula hospedadora tras la síntesis (por ejemplo, para proporcionar una forma pre, pro o prepro del polipéptido de la descripción, dependiendo de la célula hospedadora usada para expresar el polipéptido de la descripción).
[1018] La secuencia de aminoácidos adicional también puede formar una secuencia o señal que permita que el Nanobody o polipéptido de la descripción se dirija hacia y/o penetre o entre en órganos, tejidos, células o partes o compartimentos específicos de células, y/o que permita que el Nanobody o polipéptido de la descripción penetre o atraviese una barrera biológica, tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor que incluye tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos adecuados de dichas secuencias de aminoácidos serán evidentes para el experto y, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, los mencionados en la página 118 del documento de patente WO 08/020079. Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las que se pretende destruir una célula que expresa la diana contra la que se dirigen los Nanobodies de la descripción (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer), o para reducir o ralentizar el crecimiento y/o la proliferación de dicha célula, los Nanobodies de la descripción también pueden estar unidos a una toxina o a un polipéptido (cito)tóxico. Ejemplos de dichas proteínas y polipéptidos tóxicos que pueden unirse a un Nanobody de la descripción para proporcionar, por ejemplo, un polipéptido citotóxico de la descripción serán evidentes para el experto y pueden encontrarse, por ejemplo, en el estado de la técnica citado anteriormente y/o en la descripción adicional en el presente documento. Un ejemplo es la denominada tecnología ADEPT<™>descrita en el documento de patente WO 03/055527.
[1020] Según un aspecto preferido, pero no limitante, dicha una o más secuencias de aminoácidos adicionales comprenden al menos un Nanobody adicional, con el fin de proporcionar un polipéptido de la descripción que comprende al menos dos, tales como tres, cuatro, cinco o más Nanobodies, en los que dichos Nanobodies pueden unirse opcionalmente a través de una o más secuencias conectoras (como se definen el presente documento). Como se describe en las páginas 119 y 120 del documento de patente WO 08/020079, los polipéptidos de la descripción que comprenden dos o más Nanobodies, de los cuales al menos uno es un Nanobody de la descripción, también se denominarán en el presente documento polipéptidos "multivalentes" de la descripción, y los Nanobodies presentes en dichos polipéptidos también se denominarán en el presente documento en un "formato multivalente". Por ejemplo, los polipéptidos "bivalentes" y "trivalentes" de la descripción pueden ser como se describen adicionalmente en las páginas 119 y 120 del documento de patente WO 08/020079.
[1022] Los polipéptidos de la descripción que contienen al menos dos Nanobodies, en los que al menos un Nanobody está dirigido contra un primer antígeno (es decir, contra OX40L) y al menos un Nanobody está dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de OX40L), también se denominarán polipéptidos "multiespecíficos" de la descripción, y los Nanobodies presentes en dichos polipéptidos también se denominarán en el presente documento en un "formato multiespecífico". Por lo tanto, por ejemplo, un polipéptido "biespecífico" de la descripción es un polipéptido que comprende al menos un Nanobody dirigido contra un primer antígeno (es decir, OX40L) y al menos un Nanobody adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de OX40L), mientras que un polipéptido "triespecífico" de la descripción es un polipéptido que comprende al menos un Nanobody dirigido contra un primer antígeno (es decir, OX40L), al menos un Nanobody adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de OX40L) y al menos un Nanobody adicional dirigido contra un tercer antígeno (es decir, diferente tanto de OX40L como del segundo antígeno); etc.
[1024] Por consiguiente, en su forma más simple, un polipéptido biespecífico de la descripción es un polipéptido bivalente de la descripción (como se define en el presente documento), que comprende un primer Nanobody dirigido contra OX40L y un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno, en el que dicho primer y segundo Nanobody pueden unirse opcionalmente a través de una secuencia conectora (como se define en el presente documento); mientras que un polipéptido triespecífico de la descripción en su forma más simple es un polipéptido trivalente de la descripción (como se define en el presente documento), que comprende un primer Nanobody dirigido contra OX40L, un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno y un tercer Nanobody dirigido contra un tercer antígeno, en el que dicho primer, segundo y tercer Nanobody puede unirse opcionalmente a través de una o más, y en particular una y más, en particular dos, secuencias conectoras.
[1025] Sin embargo, como será evidente a partir de la descripción anterior, la descripción no se limita a la misma, en el sentido de que un polipéptido multiespecífico de la descripción puede comprender al menos un Nanobody contra OX40L, y cualquier número de Nanobodies dirigidos contra uno o más antígenos diferentes de OX40L.
[1026] Además, aunque está abarcado dentro del alcance de la descripción que el orden o disposición específicos de los diversos Nanobodies en los polipéptidos de la descripción puede tener alguna influencia en las propiedades del polipéptido final de la descripción (incluyendo, pero sin limitación, la afinidad, especificidad o avidez por OX40L, o contra el uno o más antígenos), dicho orden o disposición normalmente no es crítico y puede ser elegido adecuadamente por el experto, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados basados en la divulgación en el presente documento. Por lo tanto, cuando se hace referencia a un polipéptido multivalente específico o multiespecífico de la descripción, debe tenerse en cuenta que esto abarca cualquier orden o disposición de los Nanobodies relevantes, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
[1027] Finalmente, también está dentro del alcance de la descripción que los polipéptidos de la descripción contienen dos o más Nanobodies y una o más secuencias de aminoácidos adicionales (como se menciona en el presente documento).
[1028] Para polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios V<HH>y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; así como, por ejemplo, a los documentos de patente WO 96/34103 y WO 99/23221. Algunos ejemplos diferentes de algunos polipéptidos multiespecíficos y/o multivalentes específicos de la descripción pueden encontrarse en las solicitudes de Ablynx N. V. mencionadas en el presente documento. Un ejemplo preferido, pero no limitante, de un polipéptido multiespecífico de la descripción comprende al menos un Nanobody de la descripción y al menos un Nanobody que proporciona una semivida aumentada. Dichos Nanobodies pueden ser, por ejemplo, Nanobodies que están dirigidos contra una proteína sérica, y en particular una proteína sérica humana, tal como albúmina sérica humana, proteína de unión a tiroxina, transferrina (humana), fibrinógeno, una inmunoglobulina tal como IgG, IgE o IgM, o contra una de las proteínas séricas enumeradas en el documento de patente WO 04/003019. De estos, se prefieren particularmente Nanobodies que pueden unirse a albúmina sérica (y en particular albúmina sérica humana) o a IgG (y en particular IgG humana, véase, por ejemplo, el VH-1 de Nanobody descrito en la revisión por Muyldermans, arriba) (aunque, por ejemplo, para experimentos en ratones o primates, se pueden usar Nanobodies contra o que reaccionan de forma cruzada con albúmina sérica de ratón (MSA) o albúmina sérica de dicho primate, respectivamente. Sin embargo, para uso farmacéutico, normalmente se preferirán Nanobodies contra albúmina sérica humana o IgG humana). Los Nanobodies que proporcionan una semivida aumentada y que se pueden usar en los polipéptidos de la descripción incluyen los Nanobodies dirigidos contra albúmina sérica que se describen en el documento de patente WO 04/041865, en el documento de patente WO 06/122787 y en las solicitudes de patente adicionales por Ablynx N.V., tales como las mencionadas anteriormente.
[1029] Por ejemplo, los algunos Nanobodies preferidos que proporcionan una semivida aumentada para su uso en la presente descripción incluyen Nanobodies que pueden unirse a residuos aminoacídicos en albúmina sérica (humana) que no están implicados en la unión de albúmina sérica a FcRn (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 06/0122787); Nanobodies que son capaces de unirse a residuos aminoacídicos en albúmina sérica que no forman parte del dominio III de albúmina sérica (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 06/0122787); Nanobodies que tienen o pueden proporcionar una semivida aumentada (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/028977 de Ablynx N.V mencionado en el presente documento); Nanobodies contra albúmina sérica humana que tienen reactividad cruzada con albúmina sérica de al menos una especie de mamífero, y en particular con al menos una especie de primate (tal como, sin limitación, monos del géneroMacaca(tal como, y, en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus)) (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/028977 de Ablynx N.V)); Nanobodies que pueden unirse a albúmina sérica de una manera independiente del pH (véase, por ejemplo, el documento de patente WO2008/043821 de Ablynx N.V. mencionado en el presente documento) y/o Nanobodies que son ligantes condicionales (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/043822 de Ablynx N.V.).
[1030] Algunos Nanobodies particularmente preferidos que proporcionan una semivida aumentada y que se pueden usarse en los polipéptidos de la descripción incluyen los Nanobodies ALB-1 a ALB-10 divulgados en el documento de patente WO 06/122787 (véanse las Tablas II y III), de los cuales ALB-8 (SEQ ID NO: 62 en el documento de patente WO 06/122787) se prefiere particularmente.
[1031] Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de polipéptidos de la descripción que comprenden al menos un Nanobody de la descripción y al menos un Nanobody que proporciona una semivida aumentada se dan en SEQ ID NO 186 a 198 y 227 a 234.
[1032] según un aspecto específico, pero no limitante, de la descripción, los polipéptidos de la descripción contienen, además del uno o más Nanobodies de la descripción, al menos un Nanobody contra albúmina sérica humana.
[1033] Generalmente, cualquier polipéptido de la descripción con semivida aumentada que contenga uno o más Nanobodies de la descripción, y cualquier derivado de Nanobodies de la descripción o de dichos polipéptidos que tengan una semivida aumentada, preferentemente tienen una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida del Nanobody correspondiente de la descripción de por sí. Por ejemplo, dichos derivados o polipéptidos con semivida aumentada pueden tener una semivida que está prolongada en más de 1 hora, preferentemente más de 2 horas, más preferentemente 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con el Nanobody correspondiente de la descripción de por sí.
[1034] En a aspecto preferido, pero no limitante, de la descripción, dichos derivados o polipéptidos pueden presentar una semivida en suero en seres humanos de al menos aproximadamente 12 horas, preferentemente al menos 24 horas, más preferentemente al menos 48 horas, incluso más preferentemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, dichos derivados o polipéptidos de la descripción pueden tener una semivida de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferentemente de al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferentemente de al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferentemente de al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más) o más de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
[1035] Según un aspecto de la descripción, los polipéptidos son capaces de unirse a una o más moléculas que pueden aumentar la semivida del polipéptido in vivo.
[1036] Los polipéptidos de la descripción se estabilizan in vivo y su semivida aumenta uniéndose a moléculas que resisten la degradación y/o la eliminación o secuestro. Normalmente, dichas moléculas son proteínas de origen natural que a su vez tienen una semivida larga in vivo.
[1037] Otro ejemplo preferido, pero no limitante, de un polipéptido multiespecífico de la descripción comprende al menos un Nanobody de la descripción y al menos un Nanobody que dirige el polipéptido de la descripción hacia, y/o que permite que el polipéptido de la descripción penetre o entre en órganos, tejidos, células o partes o compartimentos de células, y/o que permite que el Nanobody penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor que incluye tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Ejemplos de dichos Nanobodies incluyen Nanobodies que se dirigen hacia proteínas específicas de la superficie celular, marcadores o epítopos del órgano, tejido o célula deseado (por ejemplo, marcadores de la superficie celular asociados con células tumorales), y los fragmentos de anticuerpos de dominio único que dirigen al cerebro descritos en los documentos de patente WO 02/057445 y WO 06/040153, de los cuales FC44 (SEQ ID NO: 189 del documento de patente WO 06/040153) y FC5 (SEQ ID NO: 190 del documento de patente WO 06/040154) son ejemplos preferidos.
[1038] En los polipéptidos de la descripción, el uno o más Nanobodies y el uno o más polipéptidos pueden estar directamente unidos entre sí (como, por ejemplo, se describe en el documento de patente WO 99/23221) y/o pueden estar unidos entre sí a través de uno o más espaciadores o conectores adecuados, o cualquier combinación de los mismos.
[1039] Los espaciadores o conectores adecuados para su uso en polipéptidos multivalentes y multiespecíficos serán evidentes para el experto, y en general pueden ser cualquier conector o espaciador usado en la técnica para enlazar secuencias de aminoácidos. Preferentemente, dicho conector o espaciador es adecuado para su uso en la construcción de proteínas o polipéptidos que están destinados a uso farmacéutico.
[1040] Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y conectores que se usan en la técnica para enlazar fragmentos de anticuerpo o dominios de anticuerpo. Estos incluyen los conectores mencionados en los antecedentes de la técnica generales citados anteriormente, así como, por ejemplo, conectores que se usan en la técnica para construir diacuerpos o fragmentos scFv (a este respecto, sin embargo, cabe señalar que, mientras que en los diacuerpos y en los fragmentos scFv la secuencia conectora usada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permitan que los dominios V<H>y V<L>pertinentes se unan para formar el sitio de unión al antígeno completo, no hay limitación particular en la longitud o la flexibilidad del conector usado en el polipéptido de la descripción, ya que cada Nanobody por sí mismo forma un sitio de unión al antígeno completo).
[1041] Por ejemplo, un conector puede ser una secuencia de aminoácidos adecuada y, en particular, secuencias de aminoácidos de entre 1 y 50, preferentemente de entre 1 y 30, tal como de entre 1 y 10 residuos aminoacídicos. Algunos ejemplos preferidos de dichas secuencias de aminoácidos incluyen conectores de gly-ser, por ejemplo, del tipo (gly<x>ser<y>)<z>, tal como (por ejemplo, (gly<4>ser)<3>o (gly<3>ser<2>)<3>, tal como se describe en el documento de patente WO 99/42077 y los conectores GS30, GS15, GS9 y GS7 descritos en las solicitudes de Ablynx mencionadas en el presente documento (véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 06/040153 y WO 06/122825), así como regiones de tipo bisagra, tales como las regiones de tipo bisagra de anticuerpos de cadena pesada de origen natural o secuencias similares (tales como las descritas en el documento de patente WO 94/04678).
[1042] Algunos otros conectores particularmente preferidos son polialanina (tal como AAA), así como los conectores GS30 (SEQ ID NO: 85 en el documento de patente WO 06/122825) y GS9 (SEQ ID NO: 84 en el documento de patente WO 06/122825).
[1043] Otros conectores adecuados comprenden en general compuestos orgánicos o polímeros, en particular los adecuados para su uso en proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, se han usado restos de poli(etilenglicol) para enlazar dominios de anticuerpo, véase, por ejemplo, el documento de patente WO 04/081026.
[1044] Dentro del alcance de la descripción se engloba que la longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades del conector o conectores usados (aunque no es crucial, como suele ser para conectores usados en fragmentos scFv) pueden tener cierta influencia sobre las propiedades del polipéptido final de la descripción, incluyendo, aunque sin limitación, la afinidad, especificidad o avidez por OX40L, o por uno o más de los otros antígenos. Basándose en la divulgación del presente documento, el experto será capaz de determinar el conector o conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la descripción, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
[1045] Por ejemplo, en polipéptidos multivalentes de la descripción que comprenden Nanobodies dirigidos contra un antígeno multimérico (tal como un receptor multimérico u otra proteína), la longitud y flexibilidad del conector son preferentemente de tal manera que permite que cada Nanobody de la descripción presente en el polipéptido se una al determinante antigénico en cada una de las subunidades del multímero. Del mismo modo, en un polipéptido multiespecífico de la descripción que comprende Nanobodies dirigidos contra dos o más determinantes antigénicos diferentes en el mismo antígeno (por ejemplo, contra diferentes epítopos de un antígeno y/o contra diferentes subunidades de un receptor, canal o proteína multimérico), la longitud y flexibilidad del conector son preferentemente tales que permite que cada Nanobody se una a su determinante antigénico previsto. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar el conector o conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la descripción, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
[1046] También está dentro del alcance de la descripción que el o los conectores usados confieran una o más propiedades favorables o funcionalidad a los polipéptidos de la descripción, y/o proporcionen uno o más sitios para la formación de derivados y/o para la unión de grupos funcionales (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento para los derivados de los Nanobodies de la descripción). Por ejemplo, los conectores que contienen uno o más residuos aminoacídicos cargados (véase la Tabla A-2 en la página 48 de la solicitud internacional WO 08/020079) pueden proporcionar propiedades hidrófilas mejoradas, mientras que los conectores que forman o contienen epítopos o marcas pequeñas pueden usarse con fines de detección, identificación y/o purificación. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar los conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la descripción, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
[1047] Finalmente, cuando se usan dos o más conectores en los polipéptidos de la descripción, estos conectores pueden ser iguales o diferentes. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar los conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la descripción, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
[1048] Habitualmente, para facilitar la expresión y la producción, un polipéptido de la descripción será un polipéptido lineal. Sin embargo, la descripción en su sentido más amplio no se limita al mismo. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la descripción comprende tres o más Nanobodies, es posible enlazarlos mediante el uso de un conector con tres o más "brazos", estando cada "brazo" enlazado a un Nanobody, para proporcionar una construcción "en forma de estrella". También es posible, aunque habitualmente es menos preferido, usar construcciones circulares. La descripción también comprende derivados de los polipéptidos de la descripción, que pueden ser esencialmente análogos a los derivados de los Nanobodies de la descripción, es decir, como se describe en el presente documento. La descripción también comprende proteínas o polipéptidos que "consisten esencialmente" en un polipéptido de la descripción (en el que la expresión "consisten esencialmente en" tiene esencialmente el mismo significado que se indica anteriormente).
[1049] Según un aspecto de la descripción, el polipéptido de la descripción está en forma esencialmente aislada, como se define en el presente documento.
[1050] Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y ácidos nucleicos de la descripción pueden prepararse de una manera conocida de por sí, como será evidente para el experto a partir de la descripción adicional en el presente documento. Por ejemplo, los Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden prepararse de cualquier manera conocida de por sí para la preparación de anticuerpos y, en particular, para la preparación de fragmentos de anticuerpo (incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos de dominio (único) y fragmentos scFv). Algunos métodos preferidos, pero no limitantes, para preparar las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos y ácidos nucleicos incluyen los métodos y técnicas descritos en el presente documento.
[1051] Como será evidente para el experto, un método particularmente útil para preparar una secuencia de aminoácidos, Nanobody y/o un polipéptido de la descripción comprende generalmente las etapas de:
[1052] i) la expresión, en una célula hospedadora u organismo hospedador adecuado (también denominado en el presente documento "hospedador de la descripción") o en otro sistema de expresión adecuado de un ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción (también denominado en el presente documento"ácido nucleico de la descripción"), opcionalmente seguida de:
[1053] ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción así obtenido. En particular, dicho método puede comprender las etapas de:
[1054] - cultivar y/o mantener un hospedador de la descripción en condiciones que sean tales que dicho hospedador de la descripción exprese y/o produzca al menos una secuencia de aminoácidos, Nanobody y/o polipéptido de la descripción, opcionalmente seguido de:
[1055] ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción así obtenido. Un ácido nucleico de la descripción puede estar en forma de ADN o ARN monocatenario o bicatenario, y está preferiblemente en forma de ADN bicatenario. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la descripción pueden ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula hospedadora u organismo hospedador previsto).
[1056] Según un aspecto de la descripción, el ácido nucleico de la descripción está en forma esencialmente aislada, como se define en el presente documento.
[1057] El ácido nucleico de la descripción también puede estar en forma de, estar presente y/o formar parte de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC, que de nuevo puede estar en forma esencialmente aislada. Los ácidos nucleicos de la descripción pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida de por sí, basándose en la información sobre las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la descripción dada en el presente documento, y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada. Para proporcionar análogos, las secuencias de nucleótidos que codifican dominios V<HH>de origen natural pueden someterse, por ejemplo, a mutagénesis dirigida al sitio, para proporcionar un ácido nucleico de la descripción que codifica dicho análogo. Además, como será evidente para el experto, para preparar un ácido nucleico de la descripción, también varias secuencias de nucleótidos, tales como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un Nanobody y, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican uno o más conectores, se pueden ligar entre sí de una manera adecuada.
[1058] Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la descripción serán evidentes para el experto en la materia y pueden incluir, por ejemplo, aunque sin limitación, síntesis automatizada de ADN; mutagénesis dirigida al sitio; combinación de dos o más secuencias de origen natural y/o sintéticas (o dos o más partes de las mismas), introducción de mutaciones que dan lugar a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que se puedan digerir y/o ligar fácilmente usando enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción de PCR usando uno o más cebadores "desapareados" usando, por ejemplo, una secuencia de una forma de origen natural de OX40L como plantilla. Estas y otras técnicas serán evidentes para el experto, y se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados en este documento, así como los Ejemplos a continuación.
[1059] El ácido nucleico de la descripción también puede estar en forma de, estar presente en y/o formar parte de una construcción genética, como será evidente para el experto en la materia y como se describe en las páginas 131-134 del documento de patente WO 08/020079. Dichas construcciones genéticas comprenden generalmente al menos un ácido nucleico de la descripción que está opcionalmente ligado a uno o más elementos de construcciones genéticas conocidas de por sí, tales como, por ejemplo, uno o más elementos reguladores adecuados (tales como un promotor(es), potenciador(es), terminador(es), etc. adecuados) y los elementos adicionales de construcciones genéticas a los que se hace referencia en el presente documento. Dichas construcciones genéticas que comprenden al menos un ácido nucleico de la descripción también se denominarán en el presente documento "construcciones genéticas de la descripción".
[1060] Las construcciones genéticas de la descripción pueden ser ADN o ARN, y son preferiblemente ADN bicatenario. Las construcciones genéticas de la descripción también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula hospedadora u organismo hospedador previsto, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula hospedadora prevista o en una forma adecuada para la replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedador previsto. Por ejemplo, las construcciones genéticas de la descripción pueden estar en forma de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido, YAC, un vector vírico o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula hospedadora, organismo hospedador y/o sistema de expresión adecuado).
[1061] En un aspecto preferido, pero no limitante, una construcción genética de la descripción comprende
[1062] i) al menos un ácido nucleico de la descripción; conectado operativamente a
[1063] ii) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también
[1064] iii) uno o más elementos adicionales de construcciones genéticas conocidos de por sí;
[1065] en el que los términos "conectado operativamente" y "unido operativamente" tienen el significado dado en las páginas 131-134 del documento de patente WO 08/020079; y en el que los "elementos reguladores", "promotor", "terminador" y "elementos adicionales" son como se describe en las páginas 131-134 del documento de patente WO 08/020079; y en el que las construcciones genéticas pueden ser además como se describe en las páginas 131-134 del documento de patente WO 08/020079.
[1066] Los ácidos nucleicos de la descripción y/o las construcciones genéticas de la descripción pueden usarse para transformar una célula hospedadora u organismo hospedador, es decir, para la expresión y/o producción de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción. Los hospedadores o células hospedadoras adecuadas serán evidentes para el experto, y pueden ser, por ejemplo, cualquier célula o línea celular fúngica, procariota o eucariota adecuada o cualquier organismo fúngico, procariota o eucariota adecuado, por ejemplo, los descritos en las páginas 134 y 135 del documento de patente WO 08/020079; así como todos los demás hospedadores o células hospedadoras conocidas de por sí para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos de dominio (único) y fragmentos scFv), que serán evidentes para el experto. También se hace referencia a los antecedentes de la técnica generales citados anteriormente, así como, por ejemplo, a los documentos de patente WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), arriba; Riechmann y Muyldermans, (1999), arriba; van der Linden, (2000), arriba; Thomassen et al., (2002), arriba; Joosten et al., (2003), arriba; Joosten et al., (2005), arriba; y las referencias adicionales citadas en el presente documento.
[1067] Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción también pueden introducirse y expresarse en una o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo, con fines profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como terapia génica), como se describe adicionalmente en las páginas 135 y 136 del documento de patente WO 08/020079 y en las referencias adicionales citadas en el documento de patente WO 08/020079.
[1068] Para la expresión de los Nanobodies en una célula, también pueden expresarse como los denominados "intracuerpos", como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618 y US-A-7004940; WO 03/014960; en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag); y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.
[1069] Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción también pueden producirse, por ejemplo, en la leche de mamíferos transgénicos, por ejemplo, en la leche de conejos, vacas, cabras u ovejas (véanse, por ejemplo, los documentos de patente US-A-6.741.957, US-A-6.304.489 y US-A-6.849.992 para técnicas generales para introducir transgenes en mamíferos), en plantas o partes de plantas que incluyen, pero sin limitación, sus hojas, flores, frutos, semillas, raíces o tubérculos (por ejemplo, en tabaco, maíz, soja o alfalfa). o en, por ejemplo, pupas del gusano de la sedaBombix mori.
[1070] Además, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción también pueden expresarse y/o producirse en sistemas de expresión libres de células, y los ejemplos adecuados de dichos sistemas serán evidentes para el experto. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, incluyen la expresión en el sistema de germen de trigo; en lisados de reticulocitos de conejo; o en el sistema Zubay deE. coli.
[1071] Como se mencionó anteriormente, una de las ventajas del uso de Nanobodies es que los polipéptidos basados en los mismos pueden prepararse mediante la expresión en un sistema bacteriano adecuado, y sistemas de expresión bacteriana, vectores, células hospedadoras, elementos reguladores, etc. adecuados, serán evidentes para el experto, por ejemplo, a partir de las referencias citadas anteriormente. Sin embargo, cabe señalar que la descripción en su sentido más amplio no se limita a la expresión en sistemas bacterianos.
[1072] Preferiblemente, en la descripción, se usa un sistema de expresión (in vivo o in vitro), tal como un sistema de expresión bacteriano, que proporciona los polipéptidos de la descripción en una forma que es adecuada para uso farmacéutico, y dichos sistemas de expresión volverán a ser evidentes para el experto. Como también será evidente para el experto, los polipéptidos de la descripción adecuados para uso farmacéutico pueden prepararse usando técnicas para la síntesis peptídica.
[1073] Para la producción a escala industrial, los hospedadores heterólogos preferidos para la producción (industrial) de Nanobodies o terapéuticos proteicos que contienen Nanobody incluyen cepas deE. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiaeque son adecuadas para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación farmacéutica (es decir, calidad GMP). Los ejemplos adecuados de dichas cepas serán evidentes para el experto. Dichas cepas y sistemas de producción/expresión también están disponibles por empresas tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia).
[1074] Alternativamente, se pueden usar líneas celulares de mamífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO), para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. De nuevo, dichos sistemas de expresión/producción también están disponibles por algunas de las empresas mencionadas anteriormente. La elección del sistema de expresión específico dependería en parte del requisito de ciertas modificaciones postraduccionales, más específicamente la glucosilación. La producción de una proteína recombinante que contiene Nanobody para la que se desea o requiere glucosilación requeriría el uso de hospedadores de expresión de mamíferos que tienen la capacidad de glucosilar la proteína expresada. A este respecto, será evidente para el experto que el patrón de glucosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de los residuos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se use para la expresión. Preferiblemente, se usa una célula o línea celular humana (es decir, que conduce a una proteína que esencialmente tiene un patrón de glucosilación humana) o se usa otra línea celular de mamífero que puede proporcionar un patrón de glucosilación que es esencialmente y/o funcionalmente el mismo que la glucosilación humana o al menos imita la glucosilación humana. Generalmente, los hospedadores procariotas, tales comoE. coli, no tienen la capacidad de glucosilar proteínas, y el uso de eucariotas inferiores, tales como levadura, normalmente conduce a un patrón de glucosilación que difiere de la glucosilación humana. Sin embargo, debe entenderse que todas las células hospedadoras anteriores y sistemas de expresión pueden usarse en la descripción, dependiendo de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido deseado que se vaya a obtener.
[1075] Por lo tanto, según un aspecto no limitante de la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción está glucosilada. Según otro aspecto no limitante de la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción no está glucosilada.
[1076] Según una realización preferida, pero no limitante, de la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como células de las cepas mencionadas anteriormente.
[1077] Según otra realización preferida, pero no limitante, de la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como células de las especies mencionadas anteriormente. Según otro aspecto preferido más, pero no limitante, e la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana, y más en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana que es adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como las líneas celulares mencionadas anteriormente en este documento.
[1078] Como se describe adicionalmente en las páginas 138 y 139 del documento de patente WO 08/020079, cuando la expresión en una célula hospedadora se usa para producir las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y los polipéptidos de la descripción, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden producirse intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y luego aislarse de las células hospedadoras y opcionalmente purificarse adicionalmente; o puede producirse extracelularmente (por ejemplo, en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras) y luego aislarse del medio de cultivo y opcionalmente purificarse adicionalmente. Por lo tanto, según un aspecto no limitante de la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción es una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido que se ha producido intracelularmente y que se ha aislado de la célula hospedadora, y en particular de una célula bacteriana o de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. Según otro aspecto no limitante de la descripción, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción es una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido que se ha producido extracelularmente y que se ha aislado del medio en el que se cultiva la célula hospedadora.
[1079] Algunos promotores preferidos, pero no limitantes, para uso con estas células hospedadoras incluyen los mencionados en las páginas 139 y 140 del documento de patente WO 08/020079.
[1080] Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitantes, para uso con estas células hospedadoras incluyen las mencionadas en la página 140 del documento de patente WO 08/020079.
[1081] Las técnicas adecuadas para transformar un hospedador o célula hospedadora de la descripción serán evidentes para el experto y pueden depender de la célula hospedadora/organismo hospedador previsto y de la construcción genética a usar. Se hace referencia de nuevo a los manuales y solicitudes de patente mencionados anteriormente. Después de la transformación, se puede realizar una etapa para detectar y seleccionar aquellas células hospedadoras u organismos hospedadores que se han transformado con éxito con la secuencia de nucleótidos/construcción genética de la descripción. Esto puede ser, por ejemplo, una etapa de selección basada en un marcador de selección presente en la construcción genética de la descripción o una etapa que implica la detección de la secuencia de aminoácidos de la descripción, por ejemplo, usando anticuerpos específicos.
[1082] La célula hospedadora transformada (que puede estar en forma de una línea celular estable) u organismos hospedadores (que pueden estar en forma de una línea o cepa mutante estable) forman aspectos adicionales de la presente descripción.
[1083] Preferiblemente, estas células hospedadoras u organismos hospedadores son tales que expresan, o (al menos) son capaces de expresar (por ejemplo, en condiciones adecuadas), una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción (y, en el caso de un organismo hospedador: en al menos una célula, parte, tejido u órgano del mismo). La descripción también incluye generaciones adicionales, prole y/o descendientes de la célula hospedadora u organismo hospedador de la descripción, que pueden obtenerse, por ejemplo, por división celular o por reproducción sexual o asexual.
[1084] Para producir/obtener la expresión de las secuencias de aminoácidos de la descripción, la célula hospedadora transformada u organismo hospedador transformado en general puede conservarse, mantenerse y/o cultivarse en condiciones tales que se exprese/produzca la secuencia de aminoácidos (deseada), Nanobody o polipéptido de la descripción. Las condiciones adecuadas serán evidentes para el experto y habitualmente dependerán de la célula hospedadora/organismo hospedador usado, así como de los elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la descripción. De nuevo, se hace referencia a los manuales y solicitudes de patente mencionados anteriormente en los párrafos sobre las construcciones genéticas de la descripción. En general, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada y, opcionalmente la presencia de un factor o compuesto inductor adecuado (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleótidos de la descripción están bajo el control de un promotor inducible); todos ellos pueden seleccionarse por el experto. De nuevo, en dichas condiciones, las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden expresarse de una manera constitutiva, de una manera transitoria o solo cuando se inducen adecuadamente.
[1085] También es evidente para el experto que la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción puede (en primer lugar) generarse en una forma inmadura (como se menciona anteriormente), que luego puede someterse a modificación postraduccional, dependiendo de la célula hospedadora/organismo hospedador usado. Además, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción puede glucosilarse, de nuevo dependiendo de la célula hospedadora/organismo hospedador usado.
[1086] La secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción puede entonces aislarse de la célula hospedadora/organismo hospedador y/o del medio en que se cultivó dicha célula hospedadora u organismo hospedador, usando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteínas conocidas de por sí, tales como técnicas de cromatografía (preparativa) y/o electroforesis, técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoácidos escindible específica fusionada con la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, usando anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos a aislar).
[1087] Generalmente, para uso farmacéutico, los polipéptidos de la descripción pueden formularse como una preparación o composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido de la descripción y al menos un vehículo, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Mediante ejemplos no limitativos, dicha formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para administración tópica, para administración por inhalación, mediante un parche cutáneo, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Dichas formas de administración adecuadas, que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, dependiendo de la forma de administración, así como métodos y vehículos para uso en la preparación de las mismas, serán evidentes para el experto y se describen más adelante en el presente documento.
[1088] Por lo tanto, en un aspecto adicional, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que contiene al menos un aminoácido de la descripción, al menos un Nanobody de la descripción o al menos un polipéptido de la descripción y al menos un vehículo, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico) y opcionalmente uno o más principios activos adicionales.
[1090] En general, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden formularse y administrarse de cualquier manera adecuada conocida de por sí, para lo que se hace referencia, por ejemplo, a los antecedentes de la técnica generales citados anteriormente (y en particular a los documentos de patente WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079), así como a los manuales convencionales, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.ª Ed., Mack Publishing Company, EE. UU. (1990), Remington, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21.ª edición, Lippincott Williams and Wilkins (2005); o The Handbook of Therapeutic Antibody (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (véanse, por ejemplo, las páginas 252-255).
[1092] Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden formularse y administrarse de cualquier manera conocida de por sí para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos convencionales (incluyendo scFv y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Dichas formulaciones y métodos de preparación de las mismas serán evidentes para el experto, y, por ejemplo, incluyen preparados adecuados para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intrarterial o intratecal) o para administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica).
[1094] Los preparados para administración parenteral pueden ser, por ejemplo, disoluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que sean adecuadas para infusión o inyección. Los vehículos o diluyentes adecuados para dichas preparaciones incluyen, por ejemplo, sin limitación, los mencionados en la página 143 del documento de patente WO 08/020079. Normalmente, se preferirán disoluciones acuosas o suspensiones.
[1096] Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción también se pueden administrar usando métodos de administración de terapia génica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5.399.346. Usando un método de administración de terapia génica, las células primarias transfectadas con el gen que codifica una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción pueden transfectarse adicionalmente con promotores específicos de tejido para dirigirse a órganos, tejido, injertos, tumores o células específicos y pueden transfectarse adicionalmente con secuencias señalizadoras y de estabilización para una expresión localizada subcelularmente.
[1098] Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina dura o blanda, pueden comprimirse en comprimidos o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparados deben contener al menos un 0,1 % de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción. Su porcentaje en las composiciones y preparados puede variar, por supuesto, y puede estar convenientemente entre aproximadamente un 2 y aproximadamente un 60 % del peso de una forma farmacéutica unitaria dada. La cantidad de la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de administración eficaz.
[1100] Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes y agentes edulcorantes o aromatizantes, por ejemplo los mencionados en las páginas 143-144 del documento de patente WO 08/020079. Cuando la forma posológica unitaria es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros diversos materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma posológica unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma posológica unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden incorporarse en preparados y dispositivos de liberación sostenida.
[1102] Los preparados y formulaciones para administración oral también pueden proporcionarse con un recubrimiento entérico que permita que las construcciones de la descripción resistan el entorno gástrico y pasen a los intestinos. Más generalmente, los preparados y formulaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para su administración en cualquier parte deseada del tubo gastrointestinal. Además, se pueden usar supositorios adecuados para la administración en el tubo gastrointestinal.
[1103] Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción también pueden administrarse por vía intravenosa o intraperitoneal mediante infusión o inyección, como se describe adicionalmente en las páginas 144 y 145 del documento de patente WO 08/020079.
[1104] Para administración tópica, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente será deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido, como se describe más adelante en la página 145 del documento de patente WO 08/020079.
[1105] Generalmente, la concentración de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente un 0,1-25 % en peso, preferiblemente de aproximadamente un 0,5-10 % en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida, tal como un gel o un polvo, será de aproximadamente 0,1-5 % en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,5-2,5 % en peso.
[1106] La cantidad de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción requerida para su uso en el tratamiento variará no solo con la secuencia de aminoácidos particular, Nanobody o polipéptido seleccionado, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección que se está tratando y la edad y afección del paciente, y será en última instancia a criterio del médico o profesional clínico. También la dosis de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción varía dependiendo de la célula, tumor, tejido, injerto u órgano diana.
[1107] La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una sola dosis o como dosis divididas administradas en intervalos apropiados, por ejemplo, tales como dos, tres, cuatro o más subdosis por día. La subdosis en sí puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en una serie de administraciones discretas distanciadas; tales como múltiples inhalaciones de un insuflador o mediante la aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
[1108] Una pauta de administración podría incluir tratamiento diario a largo plazo. Por "largo plazo" se entiende al menos dos semanas y preferentemente varias semanas, meses o años de duración. Un experto en la técnica puede determinar modificaciones necesarias en este intervalo de dosis usando únicamente experimentación rutinaria dadas las enseñanzas del presente documento. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.
[1109] 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. El médico individual también puede ajustar la dosis en caso de cualquier complicación.
[1110] En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno inflamatorio, tal como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
[1111] En el contexto de la presente descripción, el término "prevención y/o tratamiento" no solo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino que comprende también generalmente prevenir la aparición de la enfermedad, ralentizar o revertir la evolución de la enfermedad, prevenir o ralentizar la aparición de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con esta y/o prevenir un mayor aumento de la gravedad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con esta, prevenir, reducir o revertir cualquier daño fisiológico causado por la enfermedad y, en general, cualquier acción farmacológica que sea beneficiosa para el paciente que se está tratando.
[1112] El sujeto que se va a tratar puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será evidente para el experto, el sujeto que se va a tratar será, en particular, una persona que padezca, o en riesgo de padecer, las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento.
[1113] La descripción se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno que está asociado con OX40L, con su actividad biológica o farmacológica, y/o con las vías biológicas o señalización en las que está implicado OX40L, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesite, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos. En particular, la descripción se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando OX40L, su actividad biológica o farmacológica, y/o las vías biológicas o señalización en las que está implicado OX40L, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos. En particular, dicha cantidad farmacéuticamente eficaz puede ser una cantidad que es suficiente para modular OX40L, su actividad biológica o farmacológica, y/o las vías biológicas o señalización en las que está implicado OX40L; y/o una cantidad que proporciona un nivel de la secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción en la circulación que es suficiente para modular OX40L, su actividad biológica o farmacológica, y/o las vías biológicas o señalización en las que está implicado OX40L.
[1115] La descripción se refiere además a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno que puede prevenirse y/o tratarse administrando una secuencia de aminoácidos de la descripción, un Nanobody de la descripción o un polipéptido de la descripción a un paciente, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
[1117] Más en particular, la descripción se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno elegido del grupo que consiste en las enfermedades y trastornos enumerados en el presente documento, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
[1119] En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para inmunoterapia y, en particular, para inmunoterapia pasiva, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que padece o corre el riesgo de padecer las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, una cantidad farmacéuticamente activa de una secuencia de aminoácidos de la descripción, de un Nanobody de la descripción, de un polipéptido de la descripción y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
[1121] En los procedimientos anteriores, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y/o polipéptidos de la descripción y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse de cualquier modo adecuado, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica que se va a usar. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, y/o polipéptidos de la descripción y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral, intraperitoneal (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, o mediante cualquier otra vía de administración que evite el tubo gastrointestinal), intranasal, transdérmica, tópica, mediante un supositorio, por inhalación, de nuevo dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica que se va a usar. El profesional clínico podrá seleccionar una vía adecuada de administración y una formulación o composición farmacéutica adecuada para su uso en dicha administración, dependiendo de la enfermedad o trastorno que se va a prevenir o tratar y otros factores bien conocidos por el profesional clínico.
[1123] Las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y/o polipéptidos de la descripción y/o las composiciones que comprenden los mismos se administran según un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o trastorno que se ha de prevenir o tratar. El profesional clínico será normalmente capaz de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o trastorno que se vaya a prevenir o tratar, la gravedad de la enfermedad que se vaya a tratar y/o la gravedad de los síntomas de esta, la secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido específico de la descripción que se va a usar, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica que se va a usar, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos por el profesional clínico.
[1125] En general, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies y/o polipéptidos de la descripción, o de una o más composiciones que comprenden los mismos, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente eficaces. El profesional clínico puede determinar la o las cantidades o dosis específicas que se administrarán, de nuevo basándose en los factores citados anteriormente.
[1126] Generalmente, para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento y dependiendo de la enfermedad o trastorno específico a tratar, la potencia de la secuencia de aminoácidos, Nanobody y polipéptido de la descripción a usar, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica específica usada, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción se administrarán generalmente en una cantidad entre 1 gramo y 0,01 microgramos por kg de peso corporal al día, preferentemente entre 0,1 gramos y 0,1 microgramos por kg de peso corporal al día, tal como aproximadamente 1, 10, 100 o 1000 microgramos por kg de peso corporal al día, ya sea de forma continua (por ejemplo, por infusión), como una dosis diaria única o como múltiples dosis divididas durante el día. El profesional clínico será generalmente capaz de determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en el presente documento. También será evidente que, en casos específicos, el profesional clínico puede elegir desviarse de estas cantidades, por ejemplo, basándose en los factores citados anteriormente y su criterio experto. Generalmente, puede obtenerse alguna orientación sobre las cantidades que se van a administrar a partir de las cantidades habitualmente administradas para anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpos comparables contra la misma diana administrados a través de esencialmente la misma vía, teniendo en cuenta, sin embargo, diferencias en la afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, semivida y factores similares bien conocidos por el experto.
[1127] Habitualmente, en el método anterior, se usará una única secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción. Sin embargo, está dentro del alcance del método usar dos o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies, y/o polipéptidos de la descripción en combinación.
[1128] Los Nanobodies, secuencias de aminoácidos y polipéptidos de la descripción también pueden usarse en combinación con uno o más compuestos o principios activos farmacéuticos adicionales, es decir, como un régimen de tratamiento combinado, que puede dar lugar o no a un efecto sinérgico. De nuevo, el profesional clínico podrá seleccionar dichos compuestos o principios adicionales, así como un régimen de tratamiento combinado adecuada, basándose en los factores citados anteriormente y su criterio de experto.
[1129] En particular, las secuencias de aminoácidos, Nanobodies y polipéptidos de la descripción pueden usarse en combinación con otros compuestos o principios activos farmacéuticos que se usan o pueden usarse para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y trastornos citados en el presente documento, como resultado de lo cual puede obtenerse o no un efecto sinérgico. Ejemplos de dichos compuestos y principios, así como vías, procedimientos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlos serán evidentes para el profesional clínico.
[1130] Cuando se van a usar dos o más sustancias o principios como parte de un régimen de tratamiento combinado, pueden administrarse por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración, esencialmente al mismo tiempo o en diferentes puntos temporales (por ejemplo, esencialmente de forma simultánea, consecutivamente o según un régimen alterno). Cuando las sustancias o principios van a administrarse simultáneamente por la misma vía de administración, pueden administrarse como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como será evidente para el experto.
[1131] Además, cuando se van a usar dos o más sustancias o principios activos como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios puede administrarse en la misma cantidad y según el mismo régimen que se usa cuando el compuesto o principio se usa por sí solo, y dicho uso combinado puede conducir o no a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias o principios activos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de una, más o todas las sustancias o principios que se van a administrar, mientras se sigue logrando la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil, por ejemplo, para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario no deseado que esté asociado con el uso de una o más de las sustancias o principios cuando se usan en sus cantidades habituales, al tiempo que se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
[1132] La eficacia del régimen de tratamiento usado según la descripción puede determinarse y/o seguirse de cualquier manera conocida de por sí para la enfermedad o trastorno involucrados, como será evidente para el profesional clínico. El profesional clínico también podrá, cuando proceda y caso por caso, cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, a fin de lograr el efecto terapéutico deseado, evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados y/o lograr un equilibrio adecuado entre lograr el efecto terapéutico deseado por una parte y evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados por otra parte.
[1133] Generalmente, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que se consiga el efecto terapéutico deseado y/o mientras se deba mantener el efecto terapéutico deseado. Una vez más, esto lo puede determinar el médico. En otro aspecto, la descripción se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad inflamatoria y/o trastorno, tal como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica; y/o para su uso en uno o más de los métodos de tratamiento mencionados en el presente documento.
[1134] El sujeto que se va a tratar puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será evidente para el experto, el sujeto que se va a tratar será, en particular, una persona que padezca, o en riesgo de, las enfermedades y/o trastornos mencionados en el presente documento. La descripción también se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno que se puede prevenir y/o tratar administrando una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción a un paciente.
[1135] Más en particular, la descripción se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido de la descripción en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de una o más enfermedades y/o trastornos inflamatorios, tales como, por ejemplo, asma y/o asma alérgica, y en particular para la prevención y el tratamiento de una o más de las enfermedades y/o trastornos enumerados en el presente documento.
[1136] De nuevo, en dicha composición farmacéutica, la una o más secuencias de aminoácidos, Nanobodies o polipéptidos de la descripción también pueden combinarse adecuadamente con uno o más de otros principios activos, tales como los mencionados en el presente documento.
[1137] Finalmente, aunque el uso de los Nanobodies de la descripción (como se definen en el presente documento) y de los polipéptidos de la descripción es muy preferido, será evidente que, basándose en la descripción en el presente documento, el experto también será capaz de diseñar y/o generar, de manera análoga, otras secuencias de aminoácidos y, en particular, anticuerpos de dominio (único) contra OX40L, así como polipéptidos que comprenden dichos anticuerpos de dominio (único).
[1138] Por ejemplo, también será evidente para el experto que puede ser posible "injertar" una o más de las CDR mencionadas anteriormente para los Nanobodies de la descripción en dichos anticuerpos de dominio (único) u otros armazones proteicos, incluyendo, pero sin limitación, armazones humanos o armazones no de inmunoglobulina. Los armazones y técnicas adecuadas para dicho injerto de CDR serán evidentes para el experto y son bien conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, los mencionados en el documento de patente WO 08/020079. Por ejemplo, las técnicas conocidas de por sí para injertar CDR de ratón o rata en marcos y armazones humanos se pueden usar de una manera análoga para proporcionar proteínas quiméricas que comprenden una o más de las CDR de los Nanobodies de la descripción y una o más regiones o secuencias estructurales humanas. También cabe señalar que, cuando los Nanobodies de las descripciones contienen una o más secuencias de CDR distintas de las secuencias de CDR preferidas mencionadas anteriormente, estas secuencias de CDR pueden obtenerse de cualquier manera conocida de por sí, por ejemplo, usando una o más de las técnicas descritas en el documento de patente WO 08/020079.
[1139] Los usos adicionales de las secuencias de aminoácidos, Nanobodies, polipéptidos, ácidos nucleicos, construcciones genéticas y hospedadores y células hospedadoras de la descripción serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento. Por ejemplo, y sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la descripción pueden unirse a un vehículo o soporte sólido adecuado para proporcionar un medio que se puede usar de una manera conocida de por sí para purificar OX40L de composiciones y preparados que comprenden el mismo. Los derivados de las secuencias de aminoácidos de la descripción que comprenden una etiqueta detectable adecuada también se pueden usar como marcadores para determinar (cualitativa o cuantitativamente) la presencia de OX40L en una composición o preparado o como marcador para detectar selectivamente la presencia de OX40L en la superficie de una célula o tejido (por ejemplo, en combinación con técnicas de clasificación celular adecuadas).
[1140] La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras:
[1141] Ejemplos
[1142] Ejemplo 1: Identificación de Nanobodies que bloquean OX40L
[1143] 1.1 Inmunizaciones
[1144] Se inmunizaron tres llamas (n.º 285, 286 y 287), según protocolos convencionales, con 4 inyecciones intramusculares en el cuello (100 o 50 µg/dosis a intervalos quincenales) de OX40L humano (h) (dominio extracelular expresado en células de mieloma de ratón NS0; R&D Systems, Mineápolis, MN, EE. UU.), formulado en adyuvante completo de Freund (día 0) o adyuvante incompleto de Freund (después de inmunizaciones) (Difco, BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). Otras tres llamas (n.º 181b, 185b y 189b) se inmunizaron, según protocolos convencionales, con 4 inyecciones subcutáneas en el arco (2×10<7>células/dosis a intervalos quincenales) de células CAKI que sobreexpresaban hOX40L, formuladas en PBS. Las células CAKI (riñón de camello) (Nguyen, Desmyter, Muyldermans, (2001) Adv. Immunol. 79: 261-296) se transfectaron de forma estable con un vector de expresión para OX40L humano de longitud completa (SEQ ID NO: 175) usando el kit V Cell Line Nucleofector<®>(Amaxa VCA-1003; Lonza, Colonia, Alemania). Las células que expresaban los niveles más altos de hOX40L en su membrana se clasificaron con el clasificador de células FACSAria<™>(BD Biosciences) usando anti-hOX40L de ratón conjugado con PE (ficoeritrina) (BD Bioscience) y posteriormente se cultivaron en RPMI 1640 suero bovino fetal al 10 % penicilina/estreptomicina al 1 % 300 µg/ml de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.).
[1145] El día 46 o el día 50 se recogió suero de llamas inmunizadas con proteína o células recombinantes, respectivamente, para definir los títulos de anticuerpos contra hOX40L mediante ELISA y FACS. En ELISA, las placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) se recubrieron con hOX40L. Después de bloquear y añadir muestras de suero diluidas, se demostró la presencia de anticuerpos anti-OX40L usando antisueros de ratón anti-IgG1, 2 y 3 de llama (producidos en casa) e IgG de conejo anti-ratón conjugada con HRP (peroxidasa de rábano picante) (Dako, Glostrup, Dinamarca) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3',5,5'-tetramentilbencidina) (Promega, Madison, WI, EE. UU.). En FACS, se investigó la unión de anticuerpos presentes en sueros de llamas inmunizadas a células de ovario de hámster chino (CHO) que sobreexpresaban hOX40L. Las células CHO K1 (ATCC) se transfectaron de forma estable como se describe. Las células que expresan niveles medios y altos de hOX40L en su membrana se clasificaron como se describe y se cultivaron en RPMI 1640 suero bovino fetal al 10 % penicilina/estreptomicina al 1 % 1 mg/ml de G418. Las células se resuspendieron en muestras de suero diluidas. Después del lavado, se demostró la presencia de anticuerpos anti-OX40L en FACSArray<™>(BD Biosciences) usando IgG de cabra anti-llama (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EE. UU.) e IgG de burro anti-cabra conjugada con PE (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EE. UU.). Tanto en ELISA como en FACS se detectaron altos títulos de suero de anticuerpos contra hOX40L para todas las llamas.
[1146] 1.2 Construcción de bibliotecas
[1147] Se prepararon células mononucleares de sangre periférica a partir de muestras de suero de los días 46 y 50 o de los días 21, 45 y 50 para llamas inmunizadas con proteína o células recombinantes, respectivamente, usando Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Excepto las llamas 181b y 185b, también se tomó una biopsia LN (ganglio linfático) el día 45 o 46. A continuación, se extrajo ARN total de las células mononucleares de la sangre periférica y del LN usando el kit Rneasy Midi (Qiagen, Venlo, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante y se usó como material de partida para RT-PCR para amplificar fragmentos de genes que codifican Nanobodies. Estos fragmentos se clonaron en un vector de fagémido fabricado en casa, permitiendo la producción de partículas de fago recombinantes, después de la infección con fago auxiliar, que muestran los Nanobodies como proteínas de fusión genelll en la superficie de las partículas de fago. El fago se preparó según métodos convencionales y se almacenó después de la esterilización del filtro a 4 °C para su uso posterior.
[1148] 1.3 Selecciones
[1149] Se usaron bibliotecas de fagos obtenidas de las llamas n.º 285, 286 y 287 para diferentes estrategias de selección. En una primera y segunda ronda de selección, hOX40L biotinilado [R&D Systems; biotinilado internamente según las instrucciones del fabricante usando Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.)] en 100, 10, 1, 0,1, 0,01 nM se incubó con las bibliotecas de fagos y posteriormente se capturó en Streptavidin Dynabeads (Invitrogen). Después de un lavado extenso, los fagos unidos se eluyeron con 1 mg/ml de tripsina o 1 µm de quimera hOX40/Fc (dominio extracelular de hOX40 fusionado con Fc de IgG humana, expresado en células de mieloma de ratón NSO; R&D Systems).
[1150] En otra primera selección, se incubaron células CHO o CAKI que expresaban hOX40L (la generación celular se describe anteriormente) con las bibliotecas de fagos. Después de un lavado extenso, los fagos unidos se eluyeron de las células mediante resuspensión en 1 mg/ml de tripsina. En una segunda selección posterior, se incubaron bibliotecas de fagos con células CAKI que expresaban hOX40L (la generación de células se describe anteriormente). Después de un lavado extenso, se eluyeron fagos unidos como en la primera ronda de selección. Se usaron bibliotecas de fagos obtenidas de las llamas n.º 181b, 185b y 189b para una primera y segunda ronda de selección en células CHO que expresan hOX40L como se describe anteriormente.
[1151] En todas las selecciones, se observó enriquecimiento. El resultado de las selecciones se rescató en células TG1 deE. coli. Las colonias se recogieron y cultivaron en placas de 96 pocillos profundos (1 ml de volumen) y se indujeron añadiendo IPTG para la expresión de Nanobodies solubles que contenían una marca carboxiterminal cmyc e His<6>. Se prepararon extractos periplásmicos (volumen: ~ 100 µl) según métodos convencionales.
[1152] 1.4 Cribado para Nanobodies que bloquean OX40L en el ensayo AlphaScreen
[1153] Los extractos periplásmicos se cribaron en un ensayo de AlphaScreen para evaluar la capacidad de bloqueo de los Nanobodies expresados. Este ensayo se basa en el uso de perlas donadoras y aceptoras que pueden conjugarse con moléculas biológicas. Cuando una interacción biológica entre moléculas pone las perlas en proximidad, las moléculas de oxígeno singlete excitadas que se producen tras la excitación láser a 680 nm por un fotosensibilizador en la perla donante difunden a través para reaccionar con un quimioluminiscente en la perla aceptora que activa adicionalmente fluoróforos que posteriormente emiten luz a 520-620 nm. Si el Nanobody inhibe la unión de OX40L a OX40, la salida fluorescente disminuirá.
[1154] Las perlas aceptoras (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.) se conjugaron con Nanobodies Fc anti-humanos (preparados internamente) según las instrucciones del fabricante. Para evaluar la capacidad neutralizante de Nanobodies anti-hOX40L, los extractos periplásmicos se preincubaron con hOX40L biotinilado a 0,37 nM durante 15 min a temperatura ambiente. A esta mezcla, primero se añadieron las perlas aceptoras conjugadas de Fc antihumano y hOX40/Fc (concentración final de 0,2 nM) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. En segundo lugar, se añadieron perlas donadoras de estreptavidina (Perkin Elmer) y se incubaron durante 1 hora adicional. La fluorescencia se midió leyendo placas en el lector de placas EnVision Multilabel (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. La disminución en la señal de fluorescencia indica que la unión de OX40L biotinilado al receptor de OX40 está bloqueada por el Nanobody expresado en el extracto periplasmático.
[1155] A partir de esta selección, se seleccionaron y secuenciaron Nanobodies inhibidores. El análisis de secuenciación reveló 29 familias de Nanobodies, de las cuales 7 se aislaron de llamas inmunizadas con proteína recombinante y 22 familias, de las cuales 11 contienen solo un miembro, se aislaron de llamas inmunizadas con células CAKI.
[1156] 1.5 La unión de Nanobodies que bloquean OX40L a OX40L expresado en células
[1157] La unión de los Nanobodies de bloqueo de OX40L a hOX40L expresados en la membrana de las células se determinó en un ensayo FACS de unión. Las células CHO que expresaban hOX40L de longitud completa (véase arriba) o células CHO K1 naturales se resuspendieron en extracto periplasmático diluido y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Después de lavar, se detectaron Nanobodies unidos en FACSArray<™>usando anti-c-myc de ratón (Serotec, Düsseldorf, Alemania) e IgG de cabra anti-ratón conjugada con PE (Jackson Immuno Research). Se mostraron señales de unión fuertes y específicas en células CHO que expresan hOX40L para todos los miembros de 6 familias obtenidas de llamas inmunizadas con proteína recombinante y 14 familias obtenidas de llamas inmunizadas con células. Se obtuvo una señal de unión relativamente débil para todos los Nanobodies que bloquean OX40L de las familias restantes.
[1158] Ejemplo 2: Caracterización de Nanobodies que bloquean OX40L en AlphaScreen, FACS de competencia y ensayo de activación de linfocitos T
[1159] 2.1 Expresión y purificación de Nanobody
[1160] 7 Nanobodies inhibitorios (3 obtenidos de inmunizaciones con proteínas recombinantes y 4 de inmunizaciones celulares) seleccionados de la selección descrita en el Ejemplo 1 se purificaron y caracterizaron adicionalmente (SEQ ID NO: 179 a 185, véase también la Tabla A-1). Los Nanobodies seleccionados se expresaron enE. colicomo c-myc, proteínas marcadas con His<6>en un volumen de cultivo de 250 ml. La expresión se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y se dejó continuar durante 4 horas a 37 °C. Después de centrifugar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplásmicos mediante congelación-descongelación de los gránulos y resuspensión en PBS. Estos extractos se usaron como material de partida para la cromatografía de afinidad iónica inmovilizada (IMAC) usando una columna en bruto HisTrap<™>(GE Healthcare). Los Nanobodies se eluyeron de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol de 20 mM a 250 mM. En una siguiente etapa, los Nanobodies se desalaron usando columnas de desalación HiPrep<™>26/10 (GE Healthcare) en D-PBS (Invitrogen). Finalmente, los lipopolisacáridos (LPS) se eliminaron mediante incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con octil-β-D-glucopiranósido 50 mM (OGP; Sigma, Bornem, Bélgica) y filtración en gel en columna Superdex 7510/300GL (GE Healthcare).
[1161] 2.2 Generación de anticuerpos de referencia que bloquean OX40L
[1162] En todos los ensayos para la caracterización de Nanobodies que bloquean OX40L descritos a continuación, la potencia se comparó con un mAb de bloqueo OX40L de referencia (anticuerpo monoclonal) (IgG de referencia (SEQ ID NO: 177 (cadena pesada) SEQ ID NO: 178 (cadena ligera)). Se construyó un vector de expresión de mamífero pEE que contenía ADN que codificaba el anticuerpo de referencia clonando primero el ADN que codificaba la cadena pesada y la cadena ligera en pEE6.4 y pEE12.4 respectivamente (Lonza, Basilea, Suiza) y después construyendo un vector de doble gen. Se cultivaron células renales embrionarias humanas (HEK293T; DSMZ, Braunschweig, Alemania) en medio DMEM+GlutamaxI (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con el plásmido que expresaba la cadena pesada y ligera del mAb de referencia anti-OX40L usando polietilenimina (Polysciences, Eppelheim, Alemania) y medio DMEM+Glutamaxl según las instrucciones del fabricante, y el medio condicionado se recogió después de 5 días de incubación a 37 °C en una estufa de incubación con CO<2>. El medio se centrifugó y el sobrenadante se purificó en la columna Mabselect Sure (GE Healthcare), se eluyó con citrato de Na<3>50 mM a pH 3,0, se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 1 M pH 9 y se dializó contra PBS.
[1163] El fragmento Fab de la referencia se preparó mediante digestión de papaína de la IgG de referencia (SEQ ID NO: 177 (cadena pesada) SEQ ID NO: 178 (cadena ligera)). Brevemente, la IgG se incubó durante 4 horas a 37 °C en tampón de digestión (Na<2>HPO<4>0,1 M; KH<2>PO<4>0,1 M; pH: 7,3) que contenía cisteína 15 mM, EDTA 2 mM y papaína (1/100 de IgG de cantidad total). La IgG y el fragmento Fc no digeridos se retiraron inmediatamente en una columna Mabselect Sure y el flujo a través se purificó adicionalmente mediante exclusión por tamaño en una columna Superdex 75 10/300GL y posteriormente mediante cromatografía de afinidad usando una matriz CaptureSelect Fab kappa (BAC, Naarden, Países Bajos). Los fragmentos Fab se eluyeron con glicina 100 mM pH 2,5, se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,5 y se dializaron contra PBS.
[1164] 2.3 Los Nanobodies bloquean la unión de OX40L a su receptor afín OX40 en AlphaScreenLos Nanobodies purificados se caracterizaron en un ensayo AlphaScreen para evaluar su capacidad de bloqueo y compararla con un anticuerpo de bloqueo OX40L de referencia.
[1165] Las perlas aceptoras se conjugaron con Nanobodies Fc anti-humanos y hOX40L se biotiniló como se describe en el Ejemplo 1. Se preincubó una serie de dilución de Nanobodies anti-OX40L o Fab de referencia anti-OX40L a partir de 250 nM hasta 0,9 pM con hOX40L biotinilado 120 pM durante 15 minutos a TA. A esta mezcla, primero se añadieron las perlas aceptoras conjugadas de Fc anti-humano y hOX40/Fc (concentración final de 0,2 nM) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron perlas donadoras de estreptavidina y se incubaron durante 1 hora adicional. La fluorescencia se midió leyendo placas en el lector de placas EnVision Multilabel usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. La preincubación de todos los Nanobodies con hOX40L biotinilado redujo la intensidad de fluorescencia a 520 nm, lo que demuestra que los Nanobodies pueden inhibir eficazmente la unión de OX40L a OX40 de una manera dependiente de la dosis. Los valores de CI50 calculados se muestran en la Tabla C-1, y varían de 112 pM para OX40L18E09 hasta 540 pM para OX40L19A07.
[1166] 2.4 Los Nanobodies bloquean la unión de OX40 a células CHO que expresan OX40L en FACS
[1167] Los Nanobodies purificados se caracterizaron en un ensayo FACS de competencia para evaluar su capacidad de bloqueo usando OX40L nativo expresado en células.
[1168] Se preincubó una serie de dilución de Nanobodies anti-OX40L o Fab de referencia anti-OX40L a partir de 1,2 µM hasta 6,8 pM con hOX40/Fc 3,1 nM y 2×10<5>células que expresaban hOX40L durante 30 min a 4 °C. Después del lavado, se detectó hOX40/Fc unido en FACSArray<™>usando IgG anti-humana conjugada con PE (Jackson Immuno Research).
[1169] Todos los Nanobodies redujeron la intensidad de fluorescencia, lo que demuestra que los Nanobodies pueden inhibir eficazmente la unión de OX40 a OX40L expresado en membrana nativa de una manera dependiente de la dosis. Los valores de CI50 calculados se muestran en la Tabla C-1, y varían de 1,61 nM para OX40L15B07 hasta 16,55 nM para OX40L19A07.
[1170] 2.5 Los Nanobodies bloquean la activación de linfocitos T de memoria efectores mediada por OX40LLos Nanobodies purificados se caracterizaron en un ensayo de activación de linfocitos T para evaluar su capacidad de bloquear la activación mediada por OX40L de linfocitos T de memoria efectores.
[1171] Se aislaron linfocitos T de memoria efectores CD45RA- CCR7- de capas leucoplaquetarias (Cruz Roja, Gante, Bélgica) de donantes sanos en dos etapas. En primer lugar, la población total de linfocitos T se aisló usando el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos RosetteSep (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) y Ficoll-Paque<™>PLUS (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. En una segunda etapa, se realizó una selección negativa para células CD45RA- CCR7- tiñendo células CD45RA+ CCR7+ con CD45RA-biotina antihumano de ratón (BD Biosciences) y CCR7-biotina anti-humana de rata (BS Biosciences) e incubación con Dynabeads Biotin Binder (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
[1172] Los pocillos de una placa de microtitulación (Greiner, Frickenhausen, Alemania) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 31,25 ng/ml de mAb anti-CD3 OKT-3 (eBioscience, San Diego, EE. UU.). Después de lavar la placa, 2×10<5>linfocitos T de memoria efectores CD45RA- CCR7- , 1×10<4>células CHO que expresan hOX40L o células CHO naturales (irradiadas con centelleador gamma a 3000 RAD; UZ Gent, Bélgica) y series de dilución de Nanobodies anti-OX40L o Fab de referencia anti-OX40L a partir de 2 µM en medio (RPMI suero bovino fetal al 10 % penicilina/estreptomicina al 1 %) se añadieron simultáneamente y se incubaron durante 3 días a 37 °C en una estufa de incubación con CO<2>.
[1173] La producción de IL4 por linfocitos T de memoria efectores CD45RA- CCR7- se midió en ELISA. Los pocillos de una placa Maxisorp (Nunc, Langenselbold, Alemania) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 2 µg/ml de IL4 anti-humana (ELISA Capture) (BD Biosciences). Después del lavado y bloqueo de los pocillos recubiertos, se añadió una dilución a la mitad de sobrenadante celular junto con 1 µg/ml de IL4 anti-humana biotinilada (BD Biosciences) y se incubó durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Como patrón, se incluyeron diluciones en serie a la mitad de IL4 humana recombinante (BD Biosciences) a partir de 625 pg/ml. La detección se realizó usando estreptavidina conjugada con HRP (Dako) y disolución TMB One (Promega). La reacción se detuvo con H<2>SO<4>y la DO se leyó a 450 nm.
[1174] Todos los Nanobodies inhiben eficazmente la activación de linfocitos T de memoria efectores CD45RA- CCR7-mediada por OX40L. Los valores de CI50 calculados se muestran en la Tabla C-2 para 4 donantes humanos y varían de 36-49 nM para OX40L18E09 hasta 596-618 nM para OX40L19A07.
[1175] Ejemplo 3: Especificidad de unión de Nanobodies que bloquean OX40L
[1176] 3.1 Nanobodies que bloquean OX40L se unen específicamente a OX40L humano y de macaco cangrejero expresado en membrana celular
[1177] Se expresó OX40L de humano (hOX40L) y macaco cangrejero (cangOX40L) en células CHO como proteína unida a membrana de longitud completa. La transfección de CHO K1 con el respectivo ADN del plásmido de expresión y la selección de clones con altos niveles de expresión se realizó como se describe en el Ejemplo 1. La unión de los Nanobodies a la superficie celular expresada con OX40L se evaluó mediante análisis FACS de células como se describe a continuación.
[1178] Se preincubó una serie de dilución de Nanobodies anti-OX40L o Fab de referencia anti-OX40L a partir de 200 nM con 2×10<5>células CHO que expresaban hOX40L o cangOX40L durante 30 min a 4 °C. Después de lavar, los Nanobodies unidos se detectaron en FACSArray<™>usando IgG anti-c-myc de ratón y de cabra anti-ratón conjugada con PE.
[1179] Todos los Nanobodies mostraron unión dependiente de la dosis tanto a hOX40L como a cangOX40L expresado en células CHO (Tabla C-3).
[1180] 3.2 Los Nanobodies que bloquean OX40L no se unen a los miembros de la familia TNF TNF-alfa, CD40L, CD30L, RANKL o TRAIL
[1181] La unión de Nanobodies que bloquean OX40L a otros miembros de la familia de TNF se probó en un ELISA de competencia.
[1182] Se capturó hOX40L biotinilado en una placa Maxisorp recubierta con 2 µg/ml de neutravidina. Se preincubó una concentración fija de Nanobody [concentración CE50 como se determina en ELISA de unión a hOX40L capturado con neutravidina (datos no mostrados): que variaba de 1,3 nM a 4,7 nM] durante 1 hora a temperatura ambiente con una serie de concentraciones, comenzando a partir de 100 veces en exceso molar de hTNF-alfa (producido internamente), hCD40L (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU.), hCD30L (R&D Systems), activador del receptor humano para ligando de factor κ B nuclear (hRANKL; PeproTech), ligando inductor de apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral humano (hTRAIL; R&D Systems) o hOX40L como control positivo, antes de añadirlos a la placa. Se detectó la unión de los Nanobodies a hOX40L capturado con neutravidina con antisuero policlonal de conejo anti-VHH (producido internamente) e IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP (Dako). La detección se realizó usando sTMB (reactivos SDT, Baesweiler, Alemania), la reacción se detuvo con HCl 1 M y la absorbancia se determinó a 450 nM.
[1183] La unión de los Nanobodies a hOX40L capturado en neutravidina solo se inhibió mediante hOX40L añadida exógenamente y no se vio afectada por la adición de los otros ligandos. Los resultados obtenidos para OX40L01E07 se muestran en la Figura 1 y son representativos de los 7 Nanobodies testados.
[1184] Ejemplo 4: Caracterización de Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes en AlphaScreen, FACS de competencia y ensayo de activación de linfocitos T
[1185] 4.1 Construcción y expresión de Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes
[1186] OX40L01B11, OX40L01E07, OX40L01E10, OX40L15B07, OX40L18E09, los OX40L19D08 y OX40L19A07 se formatearon como Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes. Las moléculas trivalentes comprenden dos componentes principales de Nanobody anti-OX40L idénticos y un Nanobody anti-albúmina sérica humana (HSA), ALB11, para la extensión de la semivida. ALB11 se colocó en el centro o en el extremo C de las construcciones trivalentes, y el conector entre los componentes principales era 9GS (Gly<4>SerGly<3>Ser) o 35GS ((Gly<4>Ser)<5>). Las secuencias de los Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes se muestran en la Tabla A-3 (SEQ ID NO: 186 a 198). Estas construcciones se expresaron enPichia pastoris X-33.Se incubó un precultivo de 40 ml en medio YPD (peptona al 20 %, extracto de levadura al 10 % y dextrosa al 2 %) durante 8 horas a 28 °C a 250 rpm. Se inoculó medio fresco (500 ml de BGCM; peptona al 2 %, extracto de levadura al 1 %, fosfato de K 0,2 M pH 6, glicerol al 1 %, base nitrogenada de levadura al 1,3 % (Invitrogen), biotina 0,2 mg] hasta una DO<600nm>de 0,08 y se incubó durante la noche a 28 °C a 200 rpm. Las células se centrifugaron cuando 20<DO<600nm><25 y el sedimento se resuspendió en medio 160 ml de BMCM (peptona al 2,3 %, extracto de levadura al 1,2 %, fosfato de K 0,2 M pH 6, base nitrogenada de levadura al 1,3 %, biotina 0,06 mg, metanol al 0,5 %). El cultivo se incubó durante 48 horas a 28 °C, 200 rpm y durante ese tiempo se añadió metanol 4 veces. El cultivo se centrifugó y el sobrenadante se usó como material de partida para IMAC usando una columna en bruto HisTrap<™>(GE Healthcare) en el caso cuando una marca c-myc, His<6>estuviera presente en el extremo C. En el caso en que no hubiera marcas presentes, los Nanobodies se purificaron usando resina MEP Hypercell (Pall) o MabSelectSure (GE Healthcare). Si fuera necesario, los lipopolisacáridos se eliminaron mediante incubación con OGP y purificación mediante SEC usando la columna HiLoad_16/60_Superdex75 (GE Healthcare).
[1187] 4.2 Inhibición de la unión de OX40L a OX40 mediante Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes en AlphaScreen
[1188] Los Nanobodies trivalentes (OX40L003, OX40L004, OX40L005, OX40L006, OX40L007, OX40L008, OX40L009, OX40L033, OX40L034, OX40L035, OX40L036, OX40L037, OX40L038) se compararon con sus homólogos monovalentes en el ensayo AlphaScreen para evaluar si también podían bloquear la unión de OX40L a su receptor afín.
[1189] AlphaScreen se realizó como se describe en el Ejemplo 2, usando hOX40L biotinilado 31 pM y OX40/Fc 80 pM. Todos los Nanobodies trivalentes bloquearon la unión de OX40L al receptor OX40 de una manera dependiente de la dosis con una potencia aumentada en comparación con las moléculas monovalentes correspondientes (véase la Tabla C-4). Los valores de CI50 calculados para los Nanobodies trivalentes variaron de 11 pM para OX40L038 hasta 95 pM para OX40L008.
[1190] Además, también se determinó la potencia de los Nanobodies trivalentes en presencia de HSA. Los Nanobodies se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con HSA 5 µM (Sigma, Bornem, Bélgica) antes de la adición de perlas y hOX40/Fc. La concentración final de HSA en el ensayo fue 1 µM. Como se muestra en la Tabla C-4, la potencia de todos los Nanobodies trivalentes para bloquear la interacción con OX40LOX40 no se vio afectada significativamente en presencia de HSA.
[1191] 4.3 Inhibición de la unión de OX40 a OX40L expresado en membranas de células CHO mediante Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes en FACS
[1192] Los Nanobodies trivalentes (OX40L003, OX40L004, OX40L005, OX40L006, OX40L007, OX40L008, OX40L009) se compararon con sus homólogos monovalentes en un ensayo FACS de competencia para evaluar si también podían bloquear la unión de OX40 a OX40L expresada en la membrana de células CHO.
[1193] El ensayo FACS de competencia se realizó como se describe en el Ejemplo 2. Todos los Nanobodies trivalentes inhibieron eficazmente la unión de OX40 a OX40L expresado en membrana nativa de una manera dependiente de la dosis con potencias comparables con las moléculas monovalentes correspondientes (véase la Tabla C-4). Esto podría explicarse por la baja sensibilidad del ensayo debido al alto nivel de expresión de hOX40L en las células CHO.
[1194] 4.4 Unión a HSA
[1195] La afinidad de los Nanobodies trivalentes (OX40L003, OX40L004, OX40L005, OX40L006, OX40L007, OX40L008, OX40L009, OX40L034) para HSA se midió en el instrumento Biacore T100. HSA se inmovilizó mediante acoplamiento de amina en un chip sensor CM-5 a 626 UR. Se inyectaron diferentes concentraciones de Nanobodies, que oscilaban entre 2 nM y 400 nM, a 45 µl/min durante 2 min, incluyendo un tiempo de disociación de 10 min y regeneración de la superficie con glicina-HCl 10 mM pH 1,5. El ajuste se realizó usando el modelo de unión 1:1 y los parámetros cinéticos se enumeran en la Tabla C-5. La afinidad de todos los Nanobodies trivalentes por HSA es comparable.
[1196] 4.5 Inhibición de la activación de linfocitos T efectores mediada por OX40L mediante Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes
[1197] Los Nanobodies trivalentes (OX40L003, OX40L004, OX40L005, OX40L006, OX40L007, OX40L008, OX40L009, OX40L033, OX40L034, OX40L035, OX40L036, OX40L037, OX40L038) se compararon con sus homólogos monovalentes en un ensayo de activación de linfocitos T para evaluar su capacidad de bloquear la activación mediada por OX40L de linfocitos T de memoria efectores.
[1198] El ensayo de activación de linfocitos T se realizó como se describe en el Ejemplo 2, usando cuatro donantes humanos diferentes (donante 1-4). Para investigar la influencia de la unión a HSA sobre la potencia de los Nanobodies anti-OX40L trivalentes, se realizó la misma activación de linfocitos T en 4 donantes adicionales (donante 5-8) en presencia de suero humano (HS) al 10 %. Los valores de CI50 calculados se muestran en la Tabla C-6. Las curvas de inhibición obtenidas para el donante 3 se muestran en la Figura 2 y son representativas para todos los donantes probados.
[1199] Todos los Nanobodies trivalentes inhiben eficazmente la activación de linfocitos T de memoria efectores CD45RA-CCR7- mediada por OX40L con potencias aumentadas en comparación con los Nanobodies monovalentes. Para los Nanobodies trivalentes que contenían el componente principal OX40L01E07, la potencia en presencia de HSA aumentó cuando ALB11 estaba en la posición carboxiterminal. Además, se prefirió un conector 35GS entre el último componente principal anti-OX40L y ALB11 (OX40L034) a un conector 9GS (OX40L033). También para OX40L01E10, los formatos con ALB11 en el carboxiterminal tuvieron una potencia más alta en presencia de HSA, pero no hubo una diferencia clara entre OX40L035 y OX40L036. Finalmente, para los Nanobodies trivalentes que contenían OX40L15B07, todos los formatos tenían una potencia similar en presencia de HSA, independientemente de la posición de ALB11 y la longitud del conector.
[1200] Ejemplo 5: Agrupación de epítopos de Nanobodies anti-OX40L
[1201] La agrupación de epítopos de los 7 Nanobodies se determinó usando resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore T100. El experimento se realizó en tampón de migración HBS-EP+ a 25 °C. Se inmovilizó hOX40L recombinante (R&D Systems) en un Sensorchip CM5 mediante acoplamiento de amina a un nivel de aprox.
[1202] 1200 UR. Se realizó una primera inyección a 10 µl/min durante 2 min con 500 nM del Nanobody. Después de una disociación de 10 s, se realizó una inyección dual a 10 µl/min durante 2 min, comenzando con 1 µM del mismo Nanobody para garantizar la saturación de la superficie, seguida de una mezcla de 1 µM del Nanobody y 500 nM del Fab de referencia anti-OX40L. Después de 10 min de disociación, la regeneración de la superficie se realizó mediante inyección de NaOH 50 mM durante 5-25 s a 100 µl/. Basándose en los datos mostrados en la Tabla C-7, se concluyó que OX40L01B11 y el Fab de referencia anti-OX40L reconocen el mismo epítopo o solapado en hOX40L o se están obstaculizando estéricamente entre sí ya que no podían unirse simultáneamente a hOX40L. Los datos también indican que el epítopo de los otros Nanobodies no se solapa completamente con el epítopo del Fab de referencia anti-OX40L y/o, en mayor o menor medida, está presente, un impedimento estérico dependiente del Nanobody inyectado.
[1203] Además, se investigó hasta qué punto los 7 Nanobodies anti-OX40L tienen un epítopo diferente o idéntico o solapado. Las condiciones estándar fueron como se describieron anteriormente. Se inmovilizó hOX40L recombinante en un Sensorchip CM5 mediante acoplamiento de amina a un nivel de aprox. 1300 UR. Se realizó una inyección dual a 10 µl/min durante 2 min, comenzando con 500 nM del primer Nanobody, seguido de 500 nM del segundo Nanobody. Después de 10 min de disociación, la regeneración de la superficie se realizó mediante inyección de NaOH 50 mM durante 5-20 s a 100 µl/min. Como se muestra en la Tabla C-8, se obtuvieron respuestas de unión significativas inyectando OX40L19D08, OX40L19A07 y OX40L01E07 después de una primera inyección con OX40L01B11. Además, OX40L15B07 y OX40L18E09 no se pueden unir simultáneamente a hOX40L.
[1204] Ejemplo 6: Optimización de secuencia de Nanobodies anti-OX40L
[1205] En general, durante la optimización de la secuencia del Nanobody, las secuencias de Nanobody<®>naturales parentales se mutan para producir secuencias de Nanobody<®>que son más idénticas a las secuencias consenso de la línea germinal de VH3-JH humana. Los aminoácidos específicos en las regiones estructurales que difieren entre el consenso de Nanobody<®>y la línea germinal de VH3-JH humana se alteran con respecto al homólogo humano de tal manera que la estructura, actividad y estabilidad de la proteína se mantienen intactas. Para investigar esto, se compararon todas las variantes de optimización de secuencias con el Nanobody parental en cuatro ensayos diferentes: (i) determinación de la temperatura de fusión (Tm) en un ensayo de cambio térmico (TSA), (ii) análisis de la potenciain vitroen AlphaScreen de competencia de hOX40L/hOX40 en condiciones nativas, así como después de calentamiento durante 1 min a Tm+10 °C, (iii) análisis de la potenciain vitroen ensayo de activación de linfocitos T y (iv) análisis analítico de exclusión de tamaño (SEC).
[1206] En el ensayo de TSA, los Nanobodies se diluyeron hasta una concentración de 0,2 mg/ml y la temperatura de fusión (Tm) se determinó a diferentes pH mediante aumento escalonado de la temperatura en presencia de Sypro Orange, un colorante que se une a los residuos de TRP que se exponen al desplegarse la proteína, usando el LightCycler (Roche) para la detección. Se realizó exactamente AlphaScreen de OX40L/hOX40 como se describe en el Ejemplo 2. El ensayo de activación de linfocitos T se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, pero se usó hOX40L rec. 5 nM en lugar de hOX40L que expresaba células CHO y se usaron 2 µg/ml de mAb anti-CD3 OKT-3. En el análisis por SEC, los Nanobodies se analizaron en una matriz de Phenomenex para permitir la detección de multímeros, agregados o ‘pegajosidad’.
[1207] 6.1 Optimización de secuencia de OX40L15B07
[1208] Para la optimización de la secuencia de OX40L15B07, se investigaron las siguientes mutaciones: E1D, A14P, H39Q, R40A, T41P, E43K, G60A, F62S, I71R, A74S, N82bS, K83R y Q108L. Partiendo de una variante básica, es decir, OX40L15B07(A14P, K83R, Q108L), se construyó una biblioteca que incluía 7 mutaciones adicionales (residuo parental o humano) repartidas en 7 posiciones individuales: H39Q, R40A, T41P, E43K, I71R, A74S y N82bS. La biblioteca se clonó en un vector de expresión deE. coliinterno y se cribaron extractos periplásmicos que contenían Nanobodies solubles de 400 clones en un AlphaScreen de competencia hOX40L/hOX40, como se describe en el Ejemplo 1. El análisis de secuencia reveló que solo la mutación H39Q dio como resultado una pérdida dramática de potencia, mientras que todas las demás mutaciones no afectaron a la potencia en este AlphaScreen. Además, se realizó un análisis de la velocidad de desactivación de BIAcore en BIAcore T100. Para esto, HOX40L rec. se inmovilizó en un chip sensor CM-5. Se inyectaron extractos periplásmicos (10 veces diluidos) a 45 µl/min durante 120 s, seguido de una fase de disociación de 600 s. El chip se regeneró con NaOH 50 mM. Se demostró un aumento de ~2 veces en la velocidad de disociación para las mutaciones R40A, T41P y E43K. Todas las demás mutaciones investigadas no afectaron a la velocidad de disociación.
[1209] A continuación, diferentes variantes de optimización de secuencias (OX40L030, OX40L040-50, OX40L053, OX40L054, OX40L055, OX40L056, OX40L069, OX40L070, OX40L071, OX40L082 y OX40L083; SEQ ID NO: 206-226; Tabla A-2) se construyeron y produjeron como se describe en el Ejemplo 2. Como se resume en la Tabla C-11, las mutaciones E1D, A14P, A74S, K83R y Q108L no tuvieron un efecto claro sobre la potencia o estabilidad térmica. Por el contrario, se observó una disminución de ~6 veces en la potencia (ensayo de células T) y una disminución de 5 °C en Tm para R40A. T41P y E43K dieron como resultado una disminución de ~2 y ~3 veces en la potencia y una disminución de 1,5-3 °C y 1-4 °C en Tm, respectivamente. Las mutaciones G60A y F62S no afectaron a la Tm, pero G60A dio como resultado una disminución de ~3,5 veces en la potencia. Finalmente, I71R y N82bS dieron como resultado una disminución en Tm de 5 °C y 2 °C respectivamente, pero no afectaron a la potencia. Independientemente de la disminución observada en Tm, la potencia de muestras nativas y tratadas térmicamente medidas en AlphaScreen fue similar para cada variante.
[1210] Además, el comportamiento de OX40L030, OX40L082 y OX40L083 en SEC analítica en matriz de Phenomenex fue similar al de OX40L15B07. No se observó agregación o adherencia significativas, aunque para OX40L082 se observó un prepico muy pequeño, que podría deberse a dimerización (datos no mostrados).
[1211] 6.2 Optimización de secuencia de OX40L01B11
[1212] Para la optimización de la secuencia de OX40L01B11, se investigaron las siguientes mutaciones: E1D, A14P, V23A, A74S, K83R y Q108L (posición de aminoácidos que se refiere al esquema de numeración de Kabat). Una variante de OX40L01B11 que contiene todas las mutaciones (OX40L075; SEQ ID NO: 199; Tabla A-2) se construyó y produjo como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Tabla C-9, las mutaciones no tuvieron efecto sobre la potencia en un AlphaScreen de competencia de hOX40L/hOX40, pero se observó una pequeña disminución en Tm de 2 °C en comparación con OX40L01B11 parental, y una consiguiente disminución de 6 veces en la potencia después del tratamiento térmico de OX40L075. El comportamiento de OX40L075 en SEC analítica en la matriz de Phenomenex fue similar al de OX40L01B11; no se observó agregación o pegajosidad (datos no mostrados).
[1213] 6.3 Optimización de secuencia de OX40L01E07
[1214] Para la optimización de la secuencia de OX40L01E07, se investigaron las siguientes mutaciones: E1D, A14P, A74S, K83R, L105Q y Q108L. Se construyeron seis variantes de OX40L01E07 (OX40L024, OX40L025, OX40L026, OX40L027, OX40L028 y OX40L039; SEQ ID NO's: 200-205; Tabla A-2) y se produjeron como se describe en el Ejemplo 2. Todas las mutaciones fueron permisivas para la potenciain vitrotanto en condiciones nativas como después del tratamiento térmico. No se observó efecto negativo significativo sobre la estabilidad física (Tabla C-10). El comportamiento de todas las variantes en la SEC analítica en la matriz de Phenomenex fue similar al de OX40L01E07; no se observó agregación ni pegajosidad (datos no mostrados).
[1215] Ejemplo 7: Caracterización de Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada en AlphaScreen y ensayo de activación de linfocitos T
[1216] 7.1 Construcción y expresión de Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes de secuencia optimizadaLas variantes de secuencia optimizada de OX40L01B11, OX40L01E07 y OX40L15B07 se formatearon como Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada. Las moléculas trivalentes comprendieron dos componentes principales de Nanobody anti-OX40L idénticos y un Nanobody anti-HSA, ALB11, para la extensión de la semivida. ALB11 se colocó en el centro o en el extremo C de las construcciones trivalentes, y el conector entre los bloques de construcción era 9GS o 35GS. Las secuencias de los Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada se muestran en la Tabla A-4 (SEQ ID NO: 227-234).
[1217] 7.2 Inhibición de la activación de linfocitos T de memoria efectores mediada por OX40L mediante Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada
[1218] La potenciain vitrode los Nanobodies anti-OX40L biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada (OX40L032, OX40L051, OX40L079, OX40L080, OX40L084, OX40L085 y OX40L086) se comparó con la potencia de los Nanobodies formateados naturales correspondientes y la referencia anti-OX40L en el ensayo de activación de linfocitos T. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 4, en presencia de suero bovino fetal al 10 % o suero humano al 10 %. Los datos obtenidos con cinco donantes humanos diferentes (donante 9-13) se muestran en la Tabla C-12. Los Nanobodies OX40L079 y OX40L080 biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada tuvieron potencias similares en comparación con las de OX40L003 natural en ausencia de HSA. Para ambos Nanobodies hubo un cambio en la potencia en presencia de HSA, que fue ligeramente más pronunciado cuando el componente principal ALB11 estaba en la posición central (OX40L080) en comparación con cuando estaba en el extremo C (OX40L079). Sin embargo, cuando se compara OX40L003 con OX40L080, parece que los conectores 35GS en lugar de 9GS entre los respectivos componentes principales anti-OX40L, por un lado, y ALB11, por otro lado, disminuyeron el 'efecto HSA'.
[1219] Los Nanobodies OX40L032, OX40L051 y OX40L086 biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada tuvieron una potencia similar en comparación con OX40L009 natural, tanto en presencia como en ausencia de HSA. Además, la mutación E1D incluida en OX40L086 no afectó a la potencia.
[1220] Aunque se observó una disminución de ~2 veces en la potencia en AlphaScreen para la variante OX40L082 de secuencia optimizada en comparación con el Nanobody parental OX40L15B07 (véase el Ejemplo 6), al formatear (OX40L084), la potencia fue similar en comparación con OX40L007 natural. Para otra variante de secuencia optimizada, OX40L083, se observó una disminución de ~6 veces en la potencia en AlphaScreen (véase el Ejemplo 6), que se tradujo en una disminución de 15 a 20 veces en la potencia en el ensayo de linfocitos T para OX40L085 trivalente en comparación con OX40L007 natural. Ni para OX40L084 ni OX40L085 se vio afectada la potencia en presencia de HSA.
[1221] 7.3 Unión a HSA
[1222] La afinidad de los Nanobodies biespecíficos trivalentes de secuencia optimizada (OX40L032, OX40L051, OX40L079, OX40L080, OX40L084 y OX40L085) por HSA se midió en el instrumento BIAcore T100. HSA se inmovilizó mediante acoplamiento de amina en un chip sensor CM-5 a 626 UR. Se inyectaron diferentes concentraciones de Nanobodies, que oscilaban entre 2 nM y 400 nM, a 45 µl/min durante 2 min, incluyendo un tiempo de disociación de 10 min y regeneración de la superficie con glicina-HCl 10 mM pH 1,5. El ajuste se realizó usando el modelo de unión 1:1 y los parámetros cinéticos se enumeran en la Tabla C-13. La afinidad de todos los Nanobodies trivalentes por HSA fue comparable y la posición de ALB11 no pareció tener influencia en la afinidad por HSA.
[1223] TABLAS
[1224] Tabla A-1: Secuencias VHH preferidas o secuencias de Nanobody(también denominadas en el presente documento secuencia con un nombre particular o SEQ ID NO: X, en donde X es un número que se refiere a la secuencia de aminoácidos relevante):
[1227]
[1228]
[1230] Tabla A-2: Secuencias de Nanobody de secuencia optimizada
[1232]
[1233]
[1234]
[1235]
[1236] Tabla A-3: Secuencias de polipéptidos o compuestos preferidas(también denominadas en el presente documento secuencia con un nombre particular o SEQ ID NO: X, en donde X es un número que se refiere a la secuencia de aminoácidos relevante):
[1238]
[1239]
[1240]
[1242] Tabla A-4: Secuencias de polipéptidos o compuestos de secuencia optimizada preferidas
[1243]
[1245] Tabla A-5: Secuencias adicionales
[1246]
[1247]
[1249] Tabla C-1: Capacidad de bloqueo de Nanobodies en AlphaScreen y FACS
[1251]
[1253] Tabla C-2: Valores de CI50 para Nanobodies en ensayo de activación de linfocitos T mediado por OX40L
[1254]
[1256] Tabla C-3: Unión de Nanobodies a OX40L expresado en células
[1258]
[1260] Tabla C-4: Potencia de Nanobodies trivalentes en AlphaScreen y FACS
[1262]
[1263]
[1265] Tabla C-5: Unión de Nanobodies trivalentes a albúmina sérica humana
[1268]
[1270] Tabla C-6: Valores de CI50 para Nanobodies trivalentes en ensayo de activación de linfocitos T mediado por OX40L
[1272]
[1274] Tabla C-7: Competencia de Nanobodies con el Fab de referencia anti-OX40L
[1275]
[1277] Tabla C-8: Competencia de Nanobodies entre sí
[1278]
[1279]
[1281] Tabla C-9: Potencia y temperatura de fusión de la variante OX40L01B11
[1283]
[1285] Tabla C-10: Potencia y temperatura de fusión de variantes OX40L01E07
[1286]
[1287]
[1289] Tabla C-11: Potencia y temperatura de fusión de variantes OX40L15B07
[1290]
[1292] Tabla C-12: Valores de CI50 obtenidos para Nanobodies trivalentes de secuencia optimizada en ensayo de activación de linfocitos T mediado por OX40L
[1293]
[1295] Tabla C-13: Unión de Nanobodies trivalentes de secuencia optimizada a albúmina sérica humana
[1296]

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un dominio variable único de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a OX40L representado por SEQ ID NO: 175, en el que:
CDR1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135;
y
CDR2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149;
y
CDR3 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163,
en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 181, en el que, a los efectos de determinar el grado de identidad aminoacídica, se ignoran los residuos aminoacídicos que forman las secuencias de CDR; y en el que preferentemente uno o más de los residuos aminoacídicos en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los siguientes residuos aminoacídicos:
- en la posición 11: L, S, V, M, W, F, T, Q E, A, R, G, K, Y, N, P, I, preferentemente L,
- en la posición 37: F, Y, V, L, A, H, S, I, W, C, N, G, D, T, P, preferentemente F o Y,
- en la posición 44: E, Q, G, D, A, K, R, L, P, S, V, H, T, N, W, M, I, preferentemente G, E o Q, de la forma más preferida G
- en la posición 45: L, R, P, H, F, G, Q, S, E, T, Y, C, I, D, V preferentemente L o R,
- en la posición 47: F, L o W, G, I, S, A, V, M, R, Y, E, P, T, C, H, K, Q, N, D, preferentemente W , L o F,
- en la posición 83: R, K, T, E, Q, N, S, I, V, G, M, L, A, D, Y, H, preferentemente K o R; de la forma más preferida K
- en la posición 84: P, S, H, L, A, V, I, T, F, D, R, Y, N, Q, G, E, preferentemente P
- en la posición 103: W, R, G, S, K, A, M, Y, L, F, T, N, V, Q, P, E, C, preferentemente W
- en la posición 104: G, A, S, T, D, P, N, E, C, L, preferentemente G
- en la posición 108: Q, L, R, P, E, K, S, T, M, A, H, preferentemente Q o L.
2. Dominio variable único de inmunoglobulina según la reivindicación 1, que consiste esencialmente en una secuencia V<HH>.
3. Dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina se elige del grupo que consiste en
- SEQ ID NO: 200 a 205;
- SEQ ID NO: 181.
4. Polipéptido que comprende o consiste esencialmente en uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y opcionalmente comprende además uno o más residuos o unidades de unión, opcionalmente unidos a través de uno o más conectores peptídicos.
5. Polipéptido según la reivindicación 4, en donde dicho polipéptido es un polipéptido biespecífico que comprende o consiste esencialmente en un dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y otra unidad de unión que es una secuencia V<HH>, una secuencia V<HH>humanizada o una secuencia V<HH>parcialmente humanizada dirigida a un antígeno que es diferente de OX40L, opcionalmente unida a través de uno o más conectores peptídicos.
6. Polipéptido según la reivindicación 4, en el que dicho uno o más residuos o unidades de unión se eligen del grupo que consiste en secuencias de inmunoglobulina, secuencias V<HH>, secuencias V<HH>humanizadas o secuencias V<HH>parcialmente humanizadas.
7. Polipéptido según la reivindicación 4 o 6, que es una construcción multivalente, una construcción multiespecífica, una construcción multiparatópica, y/o tiene una semivida aumentada, en comparación con el dominio variable único de inmunoglobulina correspondiente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de por sí.
8. Polipéptido según la reivindicación 7, en el que dicha una o más unidades de unión proporcionan al polipéptido una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de por sí.
9. Polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicha una o más unidades de unión que proporcionan al polipéptido una semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en unidades de unión que pueden unirse a albúmina sérica, albúmina sérica humana, una inmunoglobulina sérica o IgG.
10. Ácido nucleico o secuencia de nucleótidos, que codifica un dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9.
11. Una célula hospedadora que expresa, o que en circunstancias adecuadas es capaz de expresar, un dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un polipéptido según cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 9 y/o que comprende un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos según la reivindicación 10, en donde dicha célula hospedadora es una célula fúngica, una célula procariota o una línea celular eucariota.
12. Composición que comprende al menos un dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, o ácido nucleico o secuencia de nucleótidos según la reivindicación 10.
13. Método de producción de un dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9,
- comprendiendo dicho método al menos la etapa de: expresar, en una célula hospedadora adecuada o un sistema de expresiónin vitroadecuado, un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos según la reivindicación 10, en donde dicha célula hospedadora es una célula fúngica, una célula procariota o una línea celular eucariota; opcionalmente seguido de aislar y/o purificar el dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9; o
- comprendiendo dicho método al menos la etapa de: cultivar y/o mantener una célula hospedadora según la reivindicación 11 en condiciones que sean tales que dicha célula hospedadora exprese y/o produzca al menos un dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9; opcionalmente seguido de aislar y/o purificar el dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o dicho polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9.
14. Dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, o una composición según la reivindicación 12 para uso como medicamento.
15. Dominio variable único de inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 o composición según la reivindicación 12 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad y/o trastorno inflamatorio, asma, asma alérgica, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal y/o aterosclerosis.
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