ES3057487A1

ES3057487A1 - Panel para inmunofenotipado y metodo para generar un perfil inmunofenotipico y funcional de un sujeto

Info

Publication number: ES3057487A1
Application number: ES202430688A
Authority: ES
Inventors: Lopez Yolanda María Pacheco; Pozo Balado María Del Mar Del
Original assignee: Servicio Andaluz de Salud
Current assignee: Servicio Andaluz de Salud
Priority date: 2024-08-29
Filing date: 2024-08-29
Publication date: 2026-03-02
Also published as: WO2026047269A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para generar un perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto, donde el método comprende detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas asociadas, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β , IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-γ, y TNF-α, y un marcador para determinar la viabilidad de las células. Además, la invención divulga un método para predecir la evolución de una respuesta inmunológica en un sujeto hacia una respuesta efectora o supresora, en función de la plasticidad celular determinada por el ambiente de citoquinas generadas tras la estimulación antigénica. La invención se refiere también a un panel para inmunofenotipado que comprende los marcadores CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-γ, y TNF-α y un marcador para determinar la viabilidad de las células.

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0004] PANEL PARA INMUNOFENOTIPADO Y MÉTODO PARA GENERAR

[0005] UN PERFIL INMUNOFENOTÍPICO Y FUNCIONAL DE UN SUJETO

[0007] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0009] La presente invención pertenece al campo técnico de los métodos para inmunofenotipado. Más concretamente, la invención se refiere a métodos basados en citometría de flujo para determinar un perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto.

[0011] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0013] La pandemia de COVID-19, originada por el coronavirus tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) fue declarada como una emergencia de salud pública a nivel mundial por la Organización Mundial de la Salud en enero de 2020. Hasta la fecha, la COVID-19 ha causado cientos de millones de infecciones y varios millones de muertes en todo el mundo. En la mayoría de los pacientes infectados, la infección cursa con signos leves de enfermedad, con síntomas similares a los de una gripe. Sin embargo, un 15% de pacientes desarrolla cuadros clínicos más severos.

[0015] La medida preventiva más eficaz para evitar una progresión severa de la COVID-19 es la vacunación, que contribuye a reducir la mortalidad, la frecuencia de enfermedad severa y la tasa de infecciones. Desde el inicio de la pandemia, se han desarrollado y utilizado múltiples tipos de vacunas contra el SARS-CoV-2. Además de las plataformas de vacunas previamente existentes en el mercado, como son las basadas en virus inactivados o vectores víricos, entre 2020 y 2021 se empezaron a desarrollar y a administrar masivamente diferentes vacunas de ARNm, usadas hasta esa fecha en modelos animales de investigación y en algunos ensayos clínicos. Las vacunas mRNA-1237 de Moderna y BNT162b2 de Pfizer-BioNTech, ambas basadas en esta novedosa tecnología, fueron las primeras vacunas ensayadas y aprobadas para su uso en humanos. Aunque ambas vacunas demostraron ser eficaces y seguras en los ensayos clínicos iniciales en población general (alrededor del 95%), su eficacia en los grupos más vulnerables, como personas de edad avanzada o receptores de trasplante de órgano sólido, que habían sido excluidos o poco representados en estos ensayos iniciales, se vio considerablemente reducida.

[0016] En general, las personas mayores tienden a tener sistemas inmunológicos más débiles, lo que puede reducir considerablemente la respuesta a las vacunas y, en este contexto, la inmunosenescencia y elinflammagingparecen ser claves. La inmunosenescencia se define como la desregulación del sistema inmunitario característica de la edad que se asocia a la involución del timo, órgano linfoide primario responsable de la producción de células T inmunocompetentes. A medida que se envejece, el timo involuciona y pierde funcionalidad, disminuyendo el aporte de linfocitos T naïve a periferia. Esto conduce a la expansión clonal y acumulación de linfocitos T de memoria senescentes y exhaustos, reduciendo así el repertorio de TCR necesario para enfrentarse a antígenos de novo. Por otra parte, estas células presentan un perfil de secreción asociado a senescencia, que contribuyen al aumento de citoquinas y proteínas inflamatorias en sangre, contribuyendo así a la inflamación crónica persistente de bajo grado oinflammaging, también asociado al envejecimiento.

[0018] Por otro lado, los pacientes que han recibido un trasplante de órgano sólido están sometidos a un régimen terapéutico de inmunosupresión postrasplante y presentan un mayor número de comorbilidades, lo que los hace un grupo vulnerable a tener complicaciones derivadas de la infección por el SARS-CoV2. Pese a que las vacunas administradas en este grupo han demostrado ser seguras, su eficacia es mucho menor que en población general, incluso tras la administración de las dosis de refuerzo. Se han descrito tasas de respuesta entre el 20 y 50% después de la primera y segunda dosis, respectivamente, y alrededor del 70% después de la tercera, por lo que dicha respuesta continúa siendo deficiente.

[0020] Dado el bajo nivel de respuesta a la vacuna en los grupos más vulnerables, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para mejorar el título de anticuerpos después de la vacunación contra el COVID-19 y la eficiencia de la vacunación en esta población. Una posible estrategia pasaría por entender el comportamiento de la respuesta inmunitaria y modificar adecuadamente las pautas de vacunación. Estrategias similares han funcionado en experiencias previas de vacunas administradas a receptores de trasplantes contra otros patógenos.

[0022] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0024] En vista de la necesidad detectada en el estado de la técnica, la presente invención se refiere a un método que permite evaluar la diferenciación y plasticidad de subpoblaciones inmunitarias en respuesta a antígenos (vacunales, alérgenos, patógenos o inmunomoduladores). El método se basa en la detección de marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg) y células efectoras T helper 17 (Th17) mediante citometría de flujo espectral, y en la identificación de las citoquinas producidas tras la estimulación antigénica específica, lo que permite predecir la evolución de la respuesta inmunológica hacia una respuesta efectora o supresora, y con ello el éxito o los posibles riesgos que puede entrañar la aplicación de determinadas vacunas o terapias inmunomoduladoras.

[0026] Así, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método para generar un perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto, donde el método comprende detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas asociadas, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, y un marcador para determinar la viabilidad de las células, o donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, IL-2, y un marcador para determinar la viabilidad de las células.

[0028] Este panel permite por lo tanto la caracterización de las células Th17 mediante dos fenotipos distintos: mediante la expresión de IL-17A tras la estimulación (células CD4+, IL-17A+) y mediante marcadores extracelulares CCR4 y CCR6 (CD4+, CCR4+, CCR6+). Al incluir todos los marcadores, el panel permite una caracterización más completa de esta población. Además, existen dos alternativas en el grupo de marcadores del panel de la presente invención: en un primer caso el panel evalúa FoxP3, mientras que en un segundo caso el panel evalúa CD127. Estas variaciones permiten la identificación alternativa de células T reguladoras. En un caso se identifican células T reguladoras (CD4+, CD25<hi>, FoxP3+, donde el superíndicehiindicahigh expression, o alta expresión del marcador), y en el caso alternativo se identifican células T reguladoras (CD4+, CD25<hi>, CD127<low>, donde el superíndicelowindicalow expression, o baja expresión del marcador). En determinados casos, es preferible el uso de FoxP3 en vez de CD127 porque hay evidencias que indican que CD127 tiene una expresión reducida en células activadas (tanto en subpoblaciones de células CD4+ como en subpoblaciones de células CD8+ tras la activación celular), por lo que no debe utilizarse en determinados contextos inmunológicos que incluyan hiperactivación inmune, como puede ser sujetos VIHnaïveo en enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide.

[0029] En el contexto de la invención, la expresión “perfil inmunofenotípico y funcional” se refiere a la información de los tipos de células inmunitarias que una persona tiene en una muestra biológica en un momento determinado y de los porcentajes relativos entre dichos tipos de células, así como del ambiente de citoquinas que expresan. Dicha información de perfil inmunofenotípico y funcional en un sujeto cambia con el tiempo y es posible usar esta información del sistema inmunitario para controlar el estado de salud de la persona y ayudar a diagnosticar más rápido infecciones, cáncer u otras afecciones, así como respuestas autoinmunes o reacciones atípicas a un estímulo vacunal.

[0031] Es necesario tener en cuenta que, en el curso temporal de una respuesta normal del sistema inmunitario, existe una primera etapa en la que se va a producir una respuesta efectora. Esta respuesta efectora es la que activa el sistema inmunitario para hacer frente al antígeno (una vacuna, un alérgeno, un patógeno o un estímulo inmunomodulador). La respuesta efectora va a estar seguida, en una segunda etapa, de una respuesta supresora, capaz de inhibir la respuesta del sistema inmunitario. Esta respuesta supresora previene que el sistema inmunitario esté continuamente activado. El balance entre ambas respuestas se puede evaluar, desde un punto de vista celular, mediante ratios de las concentraciones de células características de la respuesta efectora frente a las concentraciones de células características de la respuesta supresora. Así, se puede evaluar por ejemplo la ratio entre células efectoras Th17 frente a células reguladoras. En sujetos donde existen alteraciones en las etapas típicas de la respuesta inmune, estas ratios se van a ver modificadas en comparación con sujetos que presentan una respuesta normal del sistema inmunitario. Tanto la respuesta efectora como la respuesta supresora están caracterizadas además por la producción de determinadas citoquinas, que son necesarias para inducir la respuesta celular en una u otra dirección (es decir, hacia una respuesta efectora o hacia una respuesta supresora). Así, por ejemplo, las citoquinas IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ son citoquinas pro-inflamatorias que favorecen la respuesta efectora del sistema inmunitario, mientras que las citoquinas TGFβ-1, IL-10 son citoquinas anti-inflamatorias que contribuyen a la supresión de la respuesta inmune.

[0033] La detección conjunta de los marcadores de la invención permite obtener información muy completa de la situación de la respuesta inmunitaria de un sujeto ante un estímulo. En este sentido, la invención ofrece ventajas frente a la detección por separado de marcadores celulares (o de fenotipo) y de marcadores funcionales, para determinar si una respuesta de un sujeto es de tipo efector o de tipo supresor ya que, al evaluar todos los marcadores de manera conjunta se pueden observar matices en los tipos de respuesta. Es decir, determinados resultados pueden resultar no significativos para la respuesta celular pero sí significativos para la respuesta funcional, o viceversa (resultados significativos para la respuesta celular pero no significativos para la respuesta funcional). De esta manera, el método de la invención permite observar diferentes etapas de la respuesta y hacer predicciones fiables cuando ya se ha producido o se va a producir un tipo de respuesta u otro. Así, la evaluación conjunta de todos los marcadores permite matizar el resultado. Por lo tanto, en el método de la invención es siempre necesario observar tanto los marcadores celulares como los marcadores funcionales. En cualquier caso, la aplicación del método (los métodos) de la invención no resulta nunca en resultados contradictorios, donde la respuesta celular sea de un tipo mientras que la respuesta funcional sea del tipo contrario (es decir, respuesta de tipo efector y respuesta de tipo supresor). Al determinar el perfil inmunofenotípico de un sujeto, el método de la invención permite predecir la probabilidad de que dicho sujeto vaya a responder a una inmunoterapia o a una vacuna, de tal manera que se puedan prever alternativas en pacientes con riesgo de desarrollar tolerancia a la inmunoterapia o a la vacuna (es decir, sujetos no respondedores).

[0035] Como ventaja adicional, que se deriva del hecho de realizar de manera simultánea la determinación de marcadores celulares y de marcadores funcionales, el método permite ahorrar en materiales, particularmente en reactivos, y en cantidad de muestra necesaria. El ahorro en reactivos tiene una ventaja económica clara, ya que dichos reactivos suelen ser por lo general bastante caros. El ahorro en cantidad de muestra tiene una ventaja operativa, ya que facilita el trato con el paciente particularmente en pacientes donde no es siempre fácil o factible la obtención repetida de muestra (por ejemplo, pacientes pediátricos).

[0037] En modos de realización de este primer aspecto de la invención, los marcadores comprenden además al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α. En un modo particular de la invención, los marcadores adicionales son CD24, CD38 y CD19. La incorporación de al menos uno, al menos dos, o los tres marcadores CD24, CD38 y CD19 permite la identificación de las células B y/o las células B reguladoras. Estas células pueden tener significación particular en situaciones concretas, como en linfomas o en la respuesta a tipos específicos de vacunas como las peptídicas, en las que la presentación antigénica se realiza principalmente a través de MHC de clase II. En un modo particular de la invención, los marcadores adicionales son IL-21, IFN-ɣ, y/o TNF-α. El análisis de IL-21 es interesante para la supervivencia de las células Th17. IFN-ɣ, y/o TNF-α son interesantes en el contexto de la invención, al ser citoquinas efectoras por excelencia. En un modo particular de la invención, los marcadores adicionales son CD24, CD38 y CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α. Así, en un modo de realización dentro de una de las alternativas del primer aspecto, la invención define un método para generar un perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto, donde el método comprende detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas asociadas, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α, y un marcador para determinar la viabilidad de las células en una muestra biológica del sujeto.

[0039] En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para predecir la evolución de una respuesta inmunológica en un sujeto hacia una respuesta efectora o supresora, donde el método comprende:

[0040] a) someter células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) del sujeto a una estimulación antigénica específica,

[0041] b) detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas dirigidas a la determinación de la plasticidad celular hacia células efectoras/ supresoras, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, y IL-2, o donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, y IL-2, y donde los marcadores comprenden además un marcador para determinar la viabilidad de las células, en las PBMCs del sujeto antes y después de la estimulación antigénica específica,

[0042] donde

[0043] − un aumento de la ratio entre células Th17 y células reguladoras es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

[0044] − una disminución de la ratio entre células Th17 y células reguladoras es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto,

[0045] y/o donde

[0046] − un aumento de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-1β, IL-6, y/o una disminución de al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

[0047] − una disminución de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-1β, IL-6, y/o un aumento de al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto.

[0049] En el método de la invención es necesaria la determinación conjunta de todos los marcadores.

[0051] En un modo de realización de la invención, la ratio entre células Th17 y células reguladoras es la ratio entre células Th17 determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CCR4+, CCR6+ y secreción de IL-17 y células CD4 Treg determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CD25<hi>, FoxP3+; o determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CD25<hi>, CD127<low>. En otro modo de realización de la invención, la ratio entre células Th17 y células reguladoras es la ratio entre células Th17 determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CCR4+, CCR6+ y secreción de IL-17 y células CD8 Treg determinadas de acuerdo con los marcadores CD8+, CD25<hi>, FoxP3+; o determinadas de acuerdo con los marcadores CD8+, CD25<hi>, CD127<low>. En otro modo alternativo de realización de la invención, la ratio entre células Th17 y células reguladoras es la ratio entre células Th17 determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CCR4+, CCR6+ y secreción de IL-17 y células CD4 Treg y CD8 Treg determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CD25<hi>, FoxP3+ (o determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CD25<hi>, CD127<low>) para CD4 Treg y con los marcadores CD8+, CD25<hi>, FoxP3+ (o con los marcadores CD8+, CD25<hi>, CD127<low>) para CD8 Treg.

[0053] En modos de realización del segundo aspecto de la invención, la etapa (b) del método comprende adicionalmente detectar al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α,

[0054] donde

[0055] − un aumento de la ratio entre células Th17 y células B reguladoras es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

[0056] − una disminución de la ratio entre células Th17 y células B reguladoras es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto,

[0057] y/o donde

[0058] − un aumento de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-21, TNF-α, IFN-γ es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

[0059] − una disminución de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-21, TNF-α, IFN-γ es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto.

[0061] En un modo de realización de la invención, la ratio entre células Th17 y células B reguladoras es la ratio entre células Th17 determinadas de acuerdo con los marcadores CD4+, CCR4+, CCR6+ y secreción de IL-17 y células Breg determinadas de acuerdo con los marcadores CD19+, CD24<hi>, CD38+.

[0063] En determinados modos de realización de este segundo aspecto de la invención, la ratio entre células Th17 y células reguladoras se puede sustituir por ratios alternativas tales como la ratio células B/ células Breg, la ratio células Th17/ células Breg, o incluso la ratio de células B+T/ Σ(CD8Treg+CD4Treg+Breg), de manera que se pueda determinar una reducción de cualquiera de las ratios si aumentan las subpoblaciones de células reguladoras (Breg, CD4Treg y/o CD8Treg). Además, al evaluar las subpoblaciones de células B hay que considerar que un aumento de producción de IL10 por parte de células Breg podría indicar una respuesta deficiente o incluso ausente. Así, los métodos de la invención permiten realizar múltiples análisis diferentes (incluyendo distintas ratios) sobre los datos que se generan. La relevancia de las distintas ratios va a depender del contexto clínico y de los estímulos a evaluar.

[0065] En vista de todo lo anterior, en un modo preferido de realización, la invención se refiere a un método para predecir la evolución de una respuesta inmunológica en un sujeto hacia una respuesta efectora o supresora, donde el método comprende:

[0066] a) someter células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) del sujeto a una estimulación antigénica específica,

[0067] b) detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas dirigidas a la determinación de la plasticidad celular hacia células efectoras/ supresoras, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α, y un marcador para determinar la viabilidad de las células, en las PBMCs del sujeto, antes y después de la estimulación antigénica específica, donde

[0068] − un aumento de la ratio entre células Th17 y células reguladoras es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

[0069] − una disminución de la ratio entre células Th17 y células reguladoras es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto,

[0070] y/o donde

[0071] − un aumento de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o una disminución de al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

[0072] − una disminución de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o un aumento de al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto.

[0074] Como resulta evidente para un experto en la materia, en el contexto de la presente invención, la predicción de una respuesta efectora no siempre quiere decir necesariamente que el 100% de los sujetos vaya a ser respondedores ante, por ejemplo, una inmunoterapia o un estímulo vacunal. Así, en modos de realización de la invención, la predicción de una respuesta efectora puede indicar que al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 99% de los sujetos vayan a ser respondedores ante, por ejemplo, una inmunoterapia o un estímulo vacunal. Es decir, se determina el riesgo de que el sujeto pueda o no desarrollar tolerancia frente a la inmunoterapia o estímulo vacunal, de manera que dicha inmunoterapia o estímulo vacunal puedan no ser efectivos o, incluso, perjudiciales.

[0076] En la presente invención, la comprobación del aumento y/o la disminución de la ratio entre células Th17 y células reguladoras se realiza comparando el valor de la ratio obtenido antes y después de someter a las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) del sujeto a una estimulación antigénica específica. El valor de la ratio antes de la estimulación antigénica específica se usa como valor de referencia. Una vez establecido este valor de referencia, se puede comparar el valor de la ratio entre células Th17 y células reguladoras con este valor de referencia, y así asignarle un nivel de "aumentado" o "disminuido" si se observan diferencias que puedan resultar significativas usando métodos estadísticos conocidos para el experto en la materia. En modos particulares de realización de la invención, un aumento en el valor de la ratio tras la estimulación antigénica específica por encima del valor de referencia de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más en comparación con el valor de referencia se considera una ratio con un valor "aumentado". Por otro lado, una disminución en el valor de la ratio tras la estimulación antigénica específica por debajo del valor de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos en comparación con el valor de referencia se considera un nivel de expresión "disminuido".

[0078] De manera similar, la comprobación del aumento y/o la disminución de la al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o de la al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 se realiza comparando el valor de dichas citoquinas obtenido antes y después de someter a las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) del sujeto a una estimulación antigénica específica. El valor de expresión de la al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o de la al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 antes de la estimulación antigénica específica se usa como valor de referencia. Una vez establecido este valor de referencia, se puede comparar el valor de expresión de la al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o de la al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 después de la estimulación antigénica específica con este valor de referencia, y así asignarle un nivel de "aumentado" o "disminuido" si se observan diferencias que puedan resultar significativas usando métodos estadísticos conocidos para el experto en la materia. En modos particulares de realización de la invención, un aumento en el valor de expresión de la al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o de la al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 tras la estimulación antigénica específica por encima del valor de referencia de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más en comparación con el valor de referencia se considera una ratio con un valor "aumentado". Por otro lado, una disminución en el valor de expresión de la al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-21, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ y/o de la al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 tras la estimulación antigénica específica por debajo del valor de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos en comparación con el valor de referencia se considera un nivel de expresión "disminuido".

[0079] Tal y como se usa en el presente documento, una “respuesta efectora” se relaciona con una respuesta inflamatoria del organismo de un sujeto, dirigida principalmente a la eliminación de un agente infeccioso, un alérgeno o un antígeno vacunal. En el contexto de la invención, se determina si un sujeto es “respondedor” mediante una titulación de anticuerpos frente al estímulo, o mediante cualquier método igualmente efectivo que sea conocido para el experto en la materia. Desde el punto de vista del método de la invención, un sujeto “respondedor” presenta una respuesta mayoritariamente efectora ante la presentación de un estímulo, donde al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, el menos el 80%, al menos el 90% o el 100% de los marcadores son indicativos de respuesta efectora. Por su parte, una “respuesta supresora” se relaciona con la tolerancia inmunológica, y con el control de la intensidad y la duración con que se producen las respuestas inflamatorias en el organismo. La respuesta supresora tiene como función evitar los daños colaterales que podría provocar el exceso de inflamación generado tras un encuentro antigénico. En el contexto de la invención, se determina si un sujeto es “no respondedor” mediante una titulación de anticuerpos frente al estímulo, o mediante cualquier método igualmente efectivo que sea conocido para el experto en la materia. Desde el punto de vista del método de la invención, un sujeto “no respondedor” presenta una respuesta mayoritariamente supresora ante la presentación de un estímulo, donde al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, el menos el 80%, al menos el 90% o el 100% de los marcadores son indicativos de respuesta supresora.

[0081] El experto en la materia entiende que la correspondencia entre un sujeto “respondedor” con una respuesta efectora y entre un sujeto “no respondedor” con una respuesta supresora puede ser diferente al 100% tal y como se indica en el párrafo anterior debido a la propia naturaleza temporal de la respuesta inmune, donde una primera etapa efectora está seguida de una segunda etapa supresora. Por lo tanto, los marcadores observados van a depender en parte del momento temporal en que se realice el análisis. Así, en sujetos “respondedores” se pueden observar indicios de una respuesta supresora si el análisis se realiza en fases tardías de la respuesta inmunitaria, mientras que, en sujetos “no respondedores” con alteraciones en el desarrollo temporal normal de la respuesta inmune, es posible detectar en fases tempranas de la respuesta inmunitaria una respuesta efectora débil en combinación con un ambiente de citoquinas que ya es indicativo de una diferenciación celular hacia linfocitos típicos de una respuesta supresora. En ambos casos, es posible comparar el perfil inmunofenotípico y funcional del sujeto de interés, y en particular la ratio Th17/ Treg, con el perfil inmunofenotípico y funcional de sujetos control, que se puede usar como valor de referencia. Tal y como se usa en el presente documento, el valor de referencia se refiere a valores de laboratorio usados como referencia frente a valores obtenidos por examen de las muestras de los sujetos de interés. El valor de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor con un límite superior y/o un límite inferior, un rango de valores, un valor promedio, un valor mediano, o un valor base. El valor de referencia puede basarse en un valor de un sujeto control individual o en un número elevado de muestras de sujetos control. Por ejemplo, poblaciones de sujetos en un grupo dentro de determinados rangos de edad. Se deben realizar diversas consideraciones a la hora de determinar el valor de referencia, como edad, peso, sexo, y estado físico general de los sujetos control para la obtención del valor de referencia. De esta manera, la comparación del perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto de interés, y en particular la ratio Th17/ Treg, con el perfil inmunofenotípico y funcional del valor de referencia puede evidenciar alteraciones significativas.

[0083] En el contexto de la presente invención, el término “sujeto” o “paciente” se refiere a un humano, de cualquier edad o raza. En una realización preferida, el sujeto no está recibiendo o ha recibido un tratamiento inmunosupresor en el momento de llevar a cabo el método de la invención. En modos particulares de realización, el sujeto no ha recibido un trasplante de órgano sólido al menos un mes antes, al menos dos meses antes, al menos tres meses antes, o al menos seis meses antes de llevar a cabo el método de la invención.

[0085] Tal como se utiliza en el presente documento, "muestra" o "muestra biológica" significa material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para determinar los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, y IL-2, los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, y IL-2, y el al menos un marcador adicional CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α. Así, en un modo de realización la muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para determinar los marcadores CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α. En el contexto de la invención, la muestra es una muestra que contiene células inmunológicas. La muestra puede aislarse de cualquier tejido o fluido biológico adecuado como, por ejemplo, sangre, preferiblemente sangre periférica, más preferiblemente células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de sangre periférica.

[0086] Los marcadores CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3 (o CD127), IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α se pueden usar, en el contexto de la presente invención, para identificar linfocitos T CD4, T CD8 y células B, de manera que además se permite la identificación de subpoblaciones con función reguladora (T CD4 reguladoras, T CD8 reguladoras y B reguladoras) y células Thelper17 (Th17). Para una caracterización más detallada de estas subpoblaciones, el panel de marcadores incluye una selección de marcadores de activación y diferenciación, así como receptores de quimiocinas, y citoquinas tanto pro- como anti-inflamatorias, tal y como se muestra en la Tabla 1.

[0088] Tabla 1. Principales poblaciones e identificación de marcadores específicos y citoquinas

[0090]

[0092] El superíndice “hi” significahigh intensity, es decir, que se expresa con alta intensidad. El superíndice “low” significalow intensity, es decir, que se expresa con baja intensidad.

[0094] En vista de la identificación de las sub-poblaciones de acuerdo con los marcadores de la invención, en modos particulares de realización la ratio entre células Th17 y células reguladoras es la ratio Th17/ Treg CD4 o la ratio Th17/ Treg CD8.

[0096] La etapa de detección de los métodos de la invención se puede llevar a cabo mediante citometría de flujo. Así, en modos particulares de realización, la etapa de detección se realiza mediante citometría de flujo convencional o mediante citometría de flujo espectral. En un modo preferido de realización de la invención, la etapa de detección se realiza mediante citometría de flujo espectral. En un modo alternativo de realización, la invención se puede poner en práctica por otra técnica de citometría compleja, denominada CyTOF (citometría por tiempo de vuelo), que permite una amplia combinación de marcadores utilizando una tecnología similar. La invención se puede poner en práctica mediante cualquier técnica adecuada conocida para el experto en la materia. Así, podría utilizarse un análisis de secuenciación de ARN de célula única (single-cell RNAseq analysis), aunque al basarse en expresión de RNA no revelaría producción real de las proteínas. Lo mismo ocurriría con el Cite-RNAseq. Sin embargo, cualquier aproximación de secuenciación masiva por célula única (single-cell) sería menos válida para marcaje fenotípico, y sobre todo “funcional”, más costosa y mucho más compleja de realizar y de analizar que la citometría de flujo, particularmente la citometría de flujo espectral.

[0098] Los marcadores de la presente invención se pueden configurar como un panel para generar un perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto. Así, en otro aspecto la invención se refiere a un panel para inmunofenotipado que comprende los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, y IL-2, o que comprende los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, y IL-2. El panel el panel incluye además un marcador para determinar la viabilidad de las células. En modos de realización de la invención, los marcadores comprenden además al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α. En un modo de realización, la invención se refiere a un panel para inmunofenotipado que comprende los marcadores CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α.

[0100] El término “CD3”, también conocido comocluster of differentiation3, se refiere a un complejo proteico y correceptor de células T que participa en la activación tanto de las células T citotóxicas (células TnaiveCD8+) como de las células Thelper(células TnaiveCD4+). El complejo CD3 se compone de cuatro cadenas distintas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3γ, una cadena CD3δ y dos cadenas CD3ε. En humanos, la proteína CD3γ (T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain) tiene el número de referencia P09693 en la base de datos UniProt, la proteína CD3δ (T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain) tiene el número de referencia P04234 en la base de datos UniProt, y la proteína CD3ε (T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain) tiene el número de referencia P07766 en la base de datos UniProt. El término “CD4”, también conocido comocluster of differentiation4, se refiere a una glicoproteína que sirve de correceptor para el receptor de células T (TCR). En humanos, la proteína CD4 (T-cell surface glycoprotein CD4) tiene el número de referencia P01730 en la base de datos UniProt. El término “CD8”, también conocido comocluster of differentiation8, se refiere a una glicoproteína transmembrana que sirve como correceptor para el receptor de células T (TCR). De manera funcional, CD8 forma un dímero que consta de un par de cadenas CD8. La forma más común de CD8 está compuesta por una cadena CD8-α y CD8-β. En humanos, la proteína CD8a (T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain) tiene el número de referencia P01732 en la base de datos UniProt, y la proteína CD8b (T-cell surface glycoprotein CD8 beta chain) tiene el número de referencia P10966 en la base de datos UniProt. El término “CD24”, también conocido comocluster of differentiation24,Signal transducerCD24 oheat stable antigenCD24 (HSA) es una molécula de adhesión celular. En humanos, la proteína CD24 tiene el número de referencia P25063 en la base de datos UniProt. El término “CD38”, también conocido comocluster of differentiation38, o ADP hidrolasa ribosa cíclica, es una glicoproteína que se encuentra en la superficie de muchas células inmunitarias. En humanos, la proteína CD38 tiene el número de referencia P28907 en la base de datos UniProt. El término “CD19”, también conocido comocluster of differentiation19,B-Lymphocyte Surface AntigenB4,T-Cell Surface AntigenLeu-12 and CVID3 es una proteína transmembrana que se expresa en células B. En humanos, la proteína CD19 tiene el número de referencia P15391 en la base de datos UniProt. El término “CCR4”,C-C chemokine receptor type4, también conocido como “CD194”cluster of differentiation194, es una proteína que pertenece a la familia de los receptores acoplados a proteínas G. En humanos, la proteína CCR4 tiene el número de referencia P51679 en la base de datos UniProt. El término “CCR6”,C-C chemokine receptor type6, también conocido como “CD196”cluster of differentiation196, es una proteína que pertenece a la familia de los receptores acoplados a proteínas G. En humanos, la proteína CCR6 tiene el número de referencia P51684 en la base de datos UniProt. El término “CD25”,cluster of differentiation25, también conocido como IL2RA,Interleukin-2 receptor alpha chain, IDDM10, TCGFR, p55, o IMD41, es una proteína involucrada en el ensamblaje del receptor de interleucina-2 de alta afinidad, que consiste en las cadenas alfa (IL2RA), beta (IL2RB) y gamma (IL2RG). En humanos, la proteína CD25 tiene el número de referencia P01589 en la base de datos UniProt. El término “IL-17A”, interleucina 17A, se refiere a una citocina proinflamatoria producida por las células T activadas. En humanos, la proteína IL-17A tiene el número de referencia Q16552 en la base de datos UniProt. El término “IL-6”, interleucina 6, también conocida como BSF2, HGF, HSF, IFNB2, IL-6, BSF-2, CDF, o IFN-beta-2, se refiere a una proteína que puede funcionar como citocina proinflamatoria o como miocina antiinflamatoria. En humanos, la proteína IL-17A tiene el número de referencia P05231 en la base de datos UniProt. El término “IL-1β”, interleucina 1 beta, también conocida como pirógeno leucocitario, mediador endógeno leucocítico, factor de células mononucleares, o factor activador de linfocitos, se refiere a una citoquina que actúa cmo mediador de la respuesta inflamatoria. En humanos, la proteína IL-1 β tiene el número de referencia P01584 en la base de datos UniProt. El término “IL-21”, interleucina 21, también conocida como CVID11, IL-21, Za11, se refiere a una citocina con efecto regulatorio sobre células del sistema inmune, y que induce proliferación en sus células diana. En humanos, la proteína IL-21 tiene el número de referencia Q9HBE4 en la base de datos UniProt. El término “TGFβ-1”, factor de crecimiento transformante beta 1, o TGFB1, es una proteína perteneciente a la superfamilia de factores de crecimiento transformante beta de las citoquinas. En humanos, la proteína TGFβ-1 tiene el número de referencia P01137 en la base de datos UniProt. El término “FoxP3”,Forkhead box proteinP3, se refiere a un regulador transcripcional que es crucial para el desarrollo y la función inhibidora de las células T reguladoras (Treg). En humanos, la proteína FoxP3 tiene el número de referencia Q9BZS1 en la base de datos UniProt. El término “CD127”,cluster of differentiation 127, es también conocido como subunidad alfa del receptor de interleucina 7, subunidad alfa de IL-7R; IL-7R-alfa; o IL-7RA. En humanos, la proteína CD127 tiene el número de referencia P16871 en la base de datos UniProt. El término “IL-10”, interleucina-10, también conocida como factor de inhibición de la síntesis de citocinas (CSIF), es una citocina con propiedades antiinflamatorias capaz de inhibir la síntesis de citocinas proinflamatorias por los linfocitos T y los macrófagos. En humanos, la proteína IL-10 tiene el número de referencia P22301 en la base de datos UniProt. El término “IL-2”, interleucina 2, se refiere a una citocina producida por células T helper CD4+ activadas, que actúa como factor de crecimiento de los linfocitos T y que activa la proliferación de linfocitos B. En humanos, la proteína IL-2 tiene el número de referencia P60568 en la base de datos UniProt. El término “IFN-ɣ”, interferón gamma, también llamado interferón inmunitario o de tipo II, se refiere a un tipo de citocina producida por linfocitos T CD4+ y linfocitos de tiponatural killer(NK). En humanos, la proteína IFN-ɣ tiene el número de referencia P01579 en la base de datos UniProt. El término “TNF-α”, factor de necrosis tumoral alfa, se refiere a una citocina capaz de estimular la fase aguda de la reacción inflamatoria. En humanos, la proteína IFN-ɣ tiene el número de referencia P01375 en la base de datos UniProt.

[0102] El panel incluye además un marcador para determinar la viabilidad de las células y/o para determinar mortalidad celular. Marcadores para determinar la viabilidad de las células y/o para determinar mortalidad celular son conocidos para el experto en la materia. De modo no limitativo, marcadores adecuados para determinar la viabilidad de las células en los métodos de la presente invención son los tintes de viabilidad fijables para citometría de flujo “LIVE/DEAD™” de ThermoFisher, como por ejemplo “Live Dead Red”, excitable por el láser a longitud de onda 561nm y con un máximo de emisión a 615nm.

[0103] En modos de realización de la invención, cada marcador individual está unívocamente asociado con un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en:

[0104] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 633nm y con un máximo de emisión a 810nm, tal como APC Fire 810.

[0105] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 488nm y con un máximo de emisión a 540nm, tal como Spark-Blue 550.

[0106] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 786nm, tal como BV786.

[0107] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 488nm y con un máximo de emisión a 515nm, tal como BB515.

[0108] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 561nm y con un máximo de emisión a 695nm, tal como PE Cy5.5.

[0109] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 488nm y con un máximo de emisión a 780nm, tal como RB780.

[0110] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 510nm, tal como BV510.

[0111] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 711nm, tal como BV711.

[0112] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 561nm y con un máximo de emisión a 667nm, tal como PE-Cy5.

[0113] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 603nm, tal como BV605.

[0114] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 561nm y con un máximo de emisión a 610nm, tal como PE-Dazzle 594.

[0115] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 633nm y con un máximo de emisión a 665nm, tal como AF647.

[0116] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 633nm y con un máximo de emisión a 660nm, tal como APC.

[0117] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 633nm y con un máximo de emisión a 775nm, tal como AF750.

[0118] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 561nm y con un máximo de emisión a 578nm, tal como PE.

[0119] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 450nm, tal como eFluor450.

[0120] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 421nm, tal como BV421.

[0121] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 488nm y con un máximo de emisión a 695nm, tal como BB700.

[0122] − Un fluoróforo excitable por el láser a longitud de onda 405nm y con un máximo de emisión a 645nm, tal como BV650.

[0123] Así, en el panel de la invención cada marcador individual está asociado con un único fluoróforo de acuerdo con los espectros de excitación y emisión indicados, de tal manera que se minimiza el solapamiento entre la señal de los diferentes fluoróforos y se permite la detección simultánea de todos los marcadores.

[0125] En modos de realización de la invención, cada marcador está unívocamente asociado con un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en APC Fire 810, Spark-Blue 550, BV786, BB515, PE Cy5.5, RB780, BV510, BV711, PE-Cy5, BV605, PE-Dazzle 594, AF647, APC, AF750, PE, eFluor450, BV421, BB700, y BV650. En un modo preferido de realización de la invención, cada marcador está unívocamente marcado con un fluoróforo específico de acuerdo con la siguiente tabla:

[0127]

[0128]

[0131] En un modo de realización alternativo, donde se evalúa CD127 en lugar de FoxP3, CD127 se marca con el fluoróforo PE.

[0133] En un aspecto adicional, la invención se refiere a kit para inmunofenotipado que comprende reactivos dirigidos a detectar los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, y IL-2, o que comprende reactivos dirigidos a detectar los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, y IL-2, donde el kit comprende además un reactivo dirigido a un marcador para determinar la viabilidad de las células y/o para determinar mortalidad celular. En modos de realización, el kit comprende además reactivos dirigidos a detectar al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α. En un modo particular de realización, la invención define un kit para inmunofenotipado que comprende reactivos dirigidos a detectar los marcadores CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α. En un modo particular de realización de la presente invención, a cada marcador le corresponde un único reactivo para su detección. En el kit de la invención cada reactivo dirigido a detectar su marcador específico está unido a un fluoróforo único y distintivo. En un modo de realización de la invención, cada reactivo dirigido a cada marcador se selecciona independientemente del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, una lectina, un aptámero, y combinaciones de los mismos.

[0135] En un modo particular de realización de la invención, el kit comprende además un reactivo dirigido a un marcador para determinar la viabilidad de las células y/o para determinar mortalidad celular. En un modo particular de realización de la invención, cada reactivo dirigido a un marcador está unívocamente marcado con un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en APC Fire 810, Spark-Blue 550, BV786, BB515, PE Cy5.5, RB780, BV510, BV711, PE-Cy5, Live Dead Red, BV605, PE-Dazzle 594, AF647, APC, AF750, PE, eFluor450, BV421, BB700, y BV650.

[0137] En modos de realización, los reactivos adecuados para detectar los marcadores CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL 21, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, TNF-α y viabilidad comprenden al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 55%, o al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, o al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% del total de reactivos presentes en el kit. El contexto de la presente invención el término kit se tiene que interpretar como dirigido a un producto o dispositivo que comprende los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención empaquetados de forma que se permita su almacenamiento y transporte.

[0139] Todos los términos y modos de realización descritos anteriormente son aplicables a cualquier aspecto y modo de realización de la invención. De acuerdo con la presente invención, el término en singular “el”, “la”, “un”, “uno”, “una”, se refiere igualmente a su correspondiente en plural “los”, “las”, “unos”, “unas”, salvo que se desprenda del contexto que claramente el término se refiere a una especie en el singular. El término “comprende” o “que comprende”, tal y como se usa en el presente documento, también describe “consiste en” o “que consiste en” de acuerdo con la práctica de patentes generalmente aceptada.

[0141] EJEMPLOS

[0143] La siguiente invención se describe por medio de los siguientes ejemplos, que deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

[0145] Ejemplo 1: Hipótesis y objetivos

[0147] El comportamiento de la respuesta inmunitaria depende de un correcto y estrecho balance entre inmunidad y supresión, que condiciona el desarrollo y persistencia de las respuestas inmunitarias frente a patógenos y a antígenos vacunales. Las alteraciones inmunológicas de este equilibrio, descritas en personas de edad avanzada y en pacientes receptores de órgano sólido, podría explicar su dificultad de responder a antígenos vacunales. Las células Th17 (inflamatorias) y las subpoblaciones de linfocitos reguladores (principalmente linfocitos T CD4+ y T CD8+ reguladores, y linfocitos B reguladores) juegan un papel fundamental en este contexto.

[0148] e enre esas po acones:

[0149] • Los linfocitos T reguladores (Treg) son un grupo de linfocitos T CD4 que presentan función supresora, es decir, controlan la intensidad y duración de las respuestas proinflamatorias que pretenden eliminar el agente infeccioso para evitar los daños colaterales que podría causar una inflamación excesiva. Para ejercer su función, producen citoquinas anti-inflamatorias tipo IL-10 y TGF-β, y requieren IL-2 para su estabilidad y supervivencia. Déficits en su generación y/o función antiinflamatoria, se asocian con diferentes enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

[0150] • Los linfocitos Th17 también constituyen una subpoblación de linfocitos T CD4, pero con un papel pro-inflamatorio dirigido a la eliminación del agente infeccioso y que producen principalmente IL-17, IL-21, IL-22 e IL-23. La IL-17 interviene en el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos, que induce la producción de citoquinas proinflamatorias por otros tipos celulares, como IL-6, que es responsable de síntomas de inflamación sistémica y fiebre, y TNF-α que aumenta la permeabilidad e infiltración vascular. La IL-22, junto a IL-17 y TNF-α inducen péptidos antimicrobianos en las mucosas y aumentan la expresión de mucinas, fibrinógeno y proteínas anti-apoptóticas, entre otras. Por todo lo anterior, aparte de su función pro-inflamatoria y efectora frente a patógenos, las alteraciones en los linfocitos Th17 también pueden dar lugar a enfermedades inflamatorias autoinmunes.

[0152] Como estas dos subpoblaciones celulares comparten la misma vía de diferenciación mediada por TGF-β a partir de células naïve, hay una enorme plasticidad entre Th17 y Treg (Figura 1A). En presencia de IL-6, los linfocitos naïve se diferencian en Th17 y se inhibe la diferenciación a Treg. En ambientes inflamatorios y en presencia de IL-1β, los Treg se pueden re-diferenciar a linfocitos Th17. Los Th17 a su vez, con la exposición a IL-12, pueden adquirir un fenotipo patogénico que aumenta considerablemente la hiperinflamación sistémica. Así, el ambiente de citoquinas generado tras una estimulación antigénica influye en la plasticidad Th17/Treg, es decir, en la capacidad de las células T reguladoras y Th17 de cambiar su fenotipo y función según las señales que reciben del entorno. Por tanto, el balance de citoquinas presente en el ambiente inmunitario puede determinar el destino y la función de las células Treg y Th17, modulando así la respuesta inmunitaria. En el caso concreto de sujetos que presentan una respuesta inmunitaria frente a patógenos y/o frente a antígenos vacunales (sujetos respondedores), el ambiente de citoquinas en fases tempranas de la respuesta inmune (por ejemplo, unas 18 horas tras la exposición al estímulo) favorece la diferenciación hacia células Th17, por lo que las ratios Th17/Treg CD4 y CD8 aumentan (Figura 1B). Por otro lado, en el caso de sujetos que presentan dificultad para responder a patógenos y/o antígenos vacunales (sujetos no respondedores), el ambiente de citoquinas en fases tempranas de la respuesta inmune (por ejemplo, unas 18 horas tras la exposición al estímulo) favorece la diferenciación hacia células Treg, por lo que, aunque la ratio Th17/ Treg CD4 aumenta, no lo hace tanto, y la ratio Th17/Treg CD8 no aumenta (Figura 1C).

[0154] El equilibrio entre estas subpoblaciones (Th17/Treg) es entonces esencial para el mantenimiento de la homeostasis inmunológica. Dicho equilibrio es de vital importancia en el desenlace de los procesos inflamatorios causados por agentes infecciosos, que va a depender del balance entre inmunidad y tolerancia. En el contexto de infección por COVID-19, el desbalance de la relación Th17/Treg está implicado en el proceso de hiperinflamación que causa los daños colaterales y la mayor severidad en poblaciones de riesgo. En el contexto vacunal, en sujetos de edad avanzada, que también presentan una expansión de Treg, la respuesta a la vacuna podría estar condicionada por la subpoblación que se expanda más en respuesta al antígeno vacunal y, por tanto, como quede desplazado el cociente Th17/Treg. En sujetos trasplantados y, por tanto, inmunosuprimidos, el cociente Th17/Treg está reducido, principalmente debido a un aumento de Treg. Por tanto, la hipótesis del presente trabajo es que el cociente Th17/Treg podría estar implicado en la respuesta vacunal frente a COVID-19 en poblaciones vulnerables que presentan alteraciones de esta relación, como son los ancianos o receptores de trasplante renal.

[0156] En vista de esta hipótesis, la presente invención refiere el diseño de un panel y puesta a punto de un protocolo para el análisis de inmunofenotipado por citometría de flujo espectral de muestras de PBMCs, de tal manera que el método permita evaluar la diferenciación y plasticidad de subpoblaciones inmunitarias en respuesta a antígenos (vacunales, alérgenos, patógenos o inmunomoduladores). El método se basa en la detección de marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg) y células T helper 17 (Th17) mediante citometría de flujo espectral, y en la identificación de las citoquinas producidas tras la estimulación antigénica específica, lo que permite predecir la evolución de la respuesta inmunológica hacia una respuesta efectora o supresora en función de su plasticidad, y con ello el éxito o los posibles riesgos que puede entrañar la aplicación de determinadas vacunas o terapias inmunomoduladoras.

[0158] Para demostrar la eficacia del panel y del protocolo de análisis de inmunofenotipado por citometría de flujo espectral de muestras de PBMCs con dicho panel, la presente invención muestra un análisis de la respuesta funcional de linfocitos tras la tercera dosis de la vacuna, en pacientes trasplantados renales, o tras la cuarta dosis, en sujetos de edad avanzada, en respuesta a péptidos solapantes de la proteína S del virus SARS-CoV-2 (antígeno vacunal) en presencia o ausencia de timosina-α1, mediante estudios funcionalesin vitroy citometría de flujo espectral, para ver cómo afecta a la relación Th17/Treg, y a otros parámetros relacionados.

[0160] El uso de la timosina-α1 se debe a que, en relación con los grupos vulnerables, se ha observado que mayores niveles de Tα1 en ancianos pueden aumentar la durabilidad de la respuesta a la vacuna, es decir, los títulos de anticuerpos (véase Pozo-Balado, M. del M., et al., (2023). Higher plasma levels of thymosin-α1 are associated with a lower waning of humoral response after COVID-19 vaccination: an eight-month follow-up study in a nursing home. Immunity & Ageing : I & A, 20(1), 9), mientras que, en pacientes con trasplante renal, la concentración plasmática de Tα1 y una mayor actividad tímica basal se han relacionado con una mayor respuesta humoral (véase Bulnes-Ramos, Á., et al., (2023). Factors associated with the humoral response after three doses of COVID19 vaccination in kidney transplant recipients. Frontiers in Immunology, 14).

[0162] Ejemplo 2. Panel para inmunofenotipado por citometría de flujo espectral

[0164] La citometría de flujo es una técnica que permite el análisis rápido de células o partículas individuales a medida que atraviesan uno o varios láseres. Cada partícula es sometida a un análisis que evalúa su dispersión de luz visible y uno o varios parámetros de fluorescencia. Es altamente eficiente con aplicaciones en diversas disciplinas, tales como inmunología, virología, biología molecular, biología del cáncer y vigilancia de enfermedades infecciosas. La citometría de flujo espectral, a diferencia de la citometría de flujo convencional, permite distinguir el espectro de emisión completo de cada fluoróforo en todos los láseres, en lugar de identificar solo el pico de emisión. Por lo tanto, los fluoróforos con un máximo de emisión similar pero distintas firmas espectrales se pueden incluir en el mismo panel, lo que permite una mayor flexibilidad en términos de diseño del panel y la detección de un mayor número de fluoróforos simultáneamente. Maximizar la cantidad de información que puede obtenerse de una sola muestra no sólo proporciona una caracterización más profunda, sino que también sirve para abordar el problema de la disponibilidad limitada de muestras.

[0166] En el contexto de la invención, se usó un citómetro Aurora de Cytek Biosciences, equipado con cuatro láseres (violeta 405 nm, azul 488 nm, amarillo-verde 561 nm y rojo 640 nm) y 48 canales de detección para fluorescencia. El análisis de datos se realizó con la versión 3.1 del software SpectroFlow (Cytek Biosciences).

[0168] 2.1 Diseño del panel

[0170] El panel para el análisis de inmunofenotipado por citometría de flujo espectral de muestras de PBMCs debe permitir identificar las poblaciones de estudio de manera precisa a través de marcadores específicos. Para diseñar el panel, se seleccionaron marcadores que permitiesen identificar linfocitos T CD4, T CD8 y células B, y se incluyeron marcadores específicos para la identificación de subpoblaciones con función reguladora (T CD4 reguladoras, T CD8 reguladoras y B reguladoras) y células Thelper17 (Th17). Para una caracterización más profunda de estas subpoblaciones, se incluyeron una selección de marcadores de activación y diferenciación, así como receptores de quimiocinas, y citoquinas tanto pro- como anti-inflamatorias (Tabla 2).

[0172] Tabla 2. Principales poblaciones e identificación de marcadores específicos y citoquinas

[0174]

[0176] El superíndice “hi” significahigh intensity, es decir, que se expresa con alta intensidad.

[0178] Los marcadores a incluir en el panel fueron, por lo tanto, antígenos de expresión tanto extracelular (9 marcadores: CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD19, CCR4, CCR6, CD25) como intracelular (7 citoquinas proinflamatorias: IL-1b, IL-2, IL-6, IL-17, IL-21, IFN-g, y TNF-a, 2 citoquinas antiinflamatorias: TGF-b e IL-10, y 1 factor de transcripción: FoxP3). Para la correcta identificación de marcadores, se incluyó además un marcador de viabilidad. Así, el número final de marcadores es 20, por lo que se necesitan 20 fluoróforos a asignar.

[0179] 2.2 Asignación de fluorocromos

[0181] El siguiente paso consistió en identificar la mejor combinación posible de fluorocromos para los 20 marcadores a estudiar, aplicando los siguientes criterios:

[0182] − Seleccionar fluorocromos con espectros únicos: Se analizaron los espectros de los más de 65 fluorocromos disponibles actualmente en el mercado, identificando tanto los fluorocromos con picos de emisión en canales diferentes, como aquéllos que, a pesar de compartir el mismo pico de emisión, tuviesen un espectro diferente. A continuación, se determinó la unicidad de la firma espectral de estos fluorocromos mediante la comparación del espectro completo en los 48 detectores, y se cuantificó mediante elÍndice de Similaridad.

[0183] − Analizar la compatibilidad global de la combinación de fluorocromos: Para esta evaluación se utiliza elÍndice de Complejidad, que mide la interferencia entre una combinación específica de fluorocromos y predice el impacto en la distribución de autofluorescencia del espectro.

[0185] Estos dos índices proporcionan conjuntamente una medida del grado de interferencias globales debidas a la dispersión entre fluorocromos. En base a estos criterios, se seleccionaron 20 fluorocromos (Figura 2), evitando la inclusión de pares de fluorocromos con mayoresÍndices de Similaridad, tratando de conseguir elÍndice de Complejidadmás bajo (Figura 3). La matriz de Índice de similaridad mide la similitud entre dos espectros. Un valor de "1" indica que prácticamente no hay diferencia entre 2 fluorocromos, mientras que un valor de "0" indica que dos fluorocromos son completamente únicos. El gráfico muestra el valor numérico de cada par de fluorocromos identificados para su uso en el panel. Los Índices de similaridad ≤ de 0.98 indican que los fluorocromos son lo suficientemente diferentes para utilizarse conjuntamente si se utilizan los controles de referencia adecuados. En la parte inferior de la matriz se muestra el índice de complejidad (en azul), una métrica para evaluar la complejidad de toda la combinación de fluorocromos. Cuanto menor sea el índice de complejidad, mayor será la probabilidad de que la combinación de fluorocromos funcione conjuntamente y proporcione datos de alta resolución gracias a una dispersión reducida.

[0187] Por último, se evalúa elSpillovero solapamiento de la fluorescencia emitida por los fluorocromos en canales secundarios mediante la construcción de una matriz de dispersión (Spillover Spread Matrix) (Figura 4). La matriz despilloverestá calculada para todos los fluorocromos del panel. Los valores de dispersión están codificados por colores de la siguiente manera: blanco: <3, rosa: 3-9, y rojo: >9. Son preferibles valores bajos, ya que indican que hay poca interferencia cruzada entre los canales. Esto es importante para minimizar el error de compensación. La evaluación de los índices de similaridad y complejidad, y la construcción de la matriz de dispersión (SSM) se realizó a través de la web https://cytekbio.com/pages/cytek-cloud y del software SpectroFlow, desarrollado por Cytek Biosciences.

[0189] A continuación, se siguieron los principios básicos para el diseño de paneles utilizados para la citometría convencional. Se clasificaron los antígenos en primarios, secundarios y terciarios en función de su nivel de expresión, y se evaluó su coexpresión investigando la expresión de cada marcador en los subconjuntos de interés. La asignación de fluorocromos se realizó en este orden:

[0190] 1. Asignación de fluorocromos con disponibilidad limitada: Se asignaron primero los fluorocromos con menor disponibilidad en el mercado para distintos marcadores. 2. Asignación de fluorocromos en función de la clasificación del antígeno según el brillo y coexpresión:

[0191] − Para minimizar la dispersión, se asignaron los fluorocromos más tenues a antígenos primarios de alta expresión y/o con un alto nivel de coexpresión con otros marcadores.

[0192] − Con la ayuda de información previamente publicada sobre clones y rendimiento de paneles, los fluorocromos más brillantes se asignaron a marcadores terciarios, intentando en la medida de lo posible escoger fluorocromos cuyas señales no se vieran gravemente afectadas por la dispersión de otros fluorocromos.

[0193] − Por último, para la asignación del resto de marcadores, principalmente marcadores de antígenos secundarios, se tuvieron en cuenta las posibles fuentes de dispersión que pudiesen afectar a la resolución.

[0195] El diseño del panel teórico final con la distribución de los fluorocromos finalmente seleccionados se resume en la Tabla 3.

[0197] Tabla 3. Panel de anticuerpos para la tinción y la citometría espectral

[0199]

[0200]

[0202] E. E.: Expresión extracelular; E. I.: Expresión intracelular; Canales de detección: V: Violet; B: Blue; YG: Yellow-Green; R: Red

[0204] 2.3 Prueba del panel

[0206] Una vez finalizado el diseño teórico se realizó la prueba del panel, siendo clave la preparación de las muestras, la titulación de anticuerpos y selección de controles de referencia y elunmixingespectral.

[0207] • Preparación de las muestras para la titulación: Se utilizaron pools de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de voluntarios sanos criopreservadas a viabilidad, recogidas para tal fin, dado el alto requerimiento de células para la puesta a punto de la técnica. La optimización de la titulación requiere seguir estrictamente del uso de los mismos protocolos tanto inicialmente para la optimización como posteriormente para el tratamiento de las muestras de estudio (estimulación y tinción general). La titulación de anticuerpos para marcadores cuya expresión no varía tras la estimulación se realizó en células sin estimular. La titulación de citoquinas y marcadores (tanto extra como intracelulares) de expresión variable tras la estimulación, se realizó en células estimuladas con PMA (forbol-12-miristato-13-acetato)-ionomicina, que es la condición de máxima estimulación. • Titulación de anticuerpos: La titulación de anticuerpos es crítica para la optimización de los paneles de citometría espectral, ya que permite conocer la concentración óptima de anticuerpos para cada tipo de muestra, a la vez que reduce la cantidad de anticuerpos necesaria. Cuando la concentración de anticuerpos no es saturante, hay una tinción insuficiente. Pero cuando la concentración es súper-saturante, puede dar lugar a una unión inespecífica y una mala resolución de los resultados. Por ello, utilizar la concentración óptima de anticuerpos reduce la señal de fondo, permitiendo comparar muestras de forma precisa (Figura 5). Se realizaron individualmente cinco diluciones seriadas de cada anticuerpo (dilución 1/2) partiendo del volumen recomendado por el vendedor o de 1000 ng en el caso de que la concentración recomendada viniese dada en μg/ml (Tabla 4). Además de las muestras de tinción única osingle stained(SS) con las diluciones seriadas de anticuerpos, se utilizaron dos controles negativos sin teñir ounstained,uno con células estimuladas y otro con células sin estimular.

[0208] •Stain Index: ElStain Indexpermite identificar la concentración óptima de cada anticuerpo para tipos de muestras concretos. Para calcularlo, el primer paso es escoger la población positiva (teñida) y la negativa (sin teñir) (seleccionando los linfocitos y singletes). ElStain Index,se calculó en base a la siguiente fórmula (Ecuación 1) con la herramientaStatisticsdel software SpectroFlow® para todas las diluciones de cada fluorocromo individual.

[0211]

[0213] (Ecuación 1): Fórmula para el cálculo delStain Index. MFIpos: mediana del índice de fluorescencia positivo; MFIneg: mediana del índice de fluorescencia negativo; rSD: desviación estándar robusta.

[0214] En teoría, la concentración óptima de anticuerpos es la que cuenta con un mayorStain Index. Sin embargo, el título seleccionado finalmente no fue necesariamente el título óptimo (Tabla 4).

[0216] Tabla 4. Diluciones de los anticuerpos para la titulación y concentraciones seleccionadas

[0218]

[0220] La titulación se realizó en células estimuladas en marcadores que se internalizan tras la estimulación. *Concentraciones con mayorStain Index**Durante las pruebas de panel se optimizó la concentración de anticuerpos, por lo que la concentración finalmente utilizada no siempre coincide con un mayorStain Index.

[0222] Finalmente, se prepararon los controles de referencia y se evaluó el panel en su conjunto para poder asegurar la correcta separación de la contribución de cada fluoróforo en una muestra multicolor, medianteunmixingespectral:

[0223] • Controles de referencia: Los controles de referencia corresponden a las muestras SS (single stained) para cada anticuerpo con su concentración óptima, usando células estimuladas o sin estimular según el marcador. Para preparar los controles de referencia y al igual que para la titulación, se utilizaron pools de PBMCs de voluntarios sanos, siguiendo estrictamente el mismo protocolo de estimulación y tinción generales descritos anteriormente. Sin embargo, para los marcadores de menor expresión cuyo número de eventos usando células resultó insuficiente, se recurrió al uso de beads (FoxP3, CCR4, IL-1β, IL-6, IL-21, TGFβ-1 e IL-10). Como controles negativos se usaron PBMCs sin teñir (estimuladas para las muestras SS con estimulación y sin estimular para las muestras SS sin estimulación), o beads sin teñir. En el caso del marcador de viabilidad se utilizó una mezcla de células muertas (10 minutos a 65º y posterior choque térmico en hielo) teñidas y sin teñir.

[0224] •Unmixingespectral: La citometría de flujo de espectro completo permite detectar incluso mínimas diferencias en la emisión de los fluorocromos, por lo que la calidad de los controles de referencia y su capacidad para representar con precisión sus espectros en la tinción multicolor son críticos. Una vez determinadas las concentraciones óptimas para cada anticuerpo, el espectro de emisión completo de cada muestra SS se puede utilizar como control de referencia para determinar la contribución o señal de cada fluoróforo en una muestra multicolor (MC) mediante elunmixing. Elunmixingse realizó utilizando el software SpectroFlow v3.1 que aplica un algoritmo de mínimos cuadrados ordinarios. Para comprobar que elunmixingdel tubo MC era preciso, se limpiaron los datos (singletes, células vivas,scatter gatey exclusión de agregados) y se seleccionaron permutaciones deplotsNxN. Aunque para la mayoría de los marcadores elunmixingfue muy preciso, hubo que ajustar la concentración de algunos anticuerpos (viabilidad, IFN-γ, CD25 y CD38) para minimizar su dispersión en otros canales (Tabla 3).

[0226] 2.4 Análisis estadístico

[0228] Las variables continuas se representan como medianas y rangos intercuartílicos y las variables categóricas como números y porcentajes. Las comparaciones longitudinales entre variables emparejadas continuas se realizaron mediante la prueba no paramétrica de Wilcoxon y para múltiples variables el test de Friedman. Las comparaciones transversales entre grupos se realizaron mediante el test U de Mann-Whitney. Las correlaciones entre variables cuantitativas independientes se exploraron utilizando la prueba del coeficiente de correlación de Spearman. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS (versión 26.0, Chicago, IL), y los gráficos fueron generados empleando el software Prism (versión 8.4.2. de GraphPad Software).

[0230] Ejemplo 3. Estudio de respuesta inmunológica en pacientes vulnerables

[0232] El panel para inmunofenotipado de la presente invención se usó para realizar un estudio longitudinal, colaborativo y multicéntrico, enmarcado dentro del proyecto FIS (PI21/00357) “Estudio de la respuesta inmunológica en la inmunización frente al SARS-CoV-2 en dos escenarios distintos: en la infección y en la vacunación”.

[0234] 3.1 Diseño del estudio y participantes

[0236] La inclusión de sujetos comenzó en enero de 2021, con la administración de las primeras dosis de las vacunas frente a COVID-19, y se siguieron a lo largo del tiempo, recogiéndose muestras antes y después de la administración de las sucesivas dosis de vacuna. Este trabajo estudia la respuesta inmunológica (tanto humoral como celular) a la vacuna frente a la COVID-19 en grupos vulnerables, concretamente en la respuesta a la cuarta dosis en una cohorte de personas mayores (cohorte Caridad) y en la respuesta a la tercera dosis de una cohorte de pacientes trasplantados renales (cohorte Trasplante Renal):

[0237] • Cohorte Caridad: Formada por 43 hombres residentes del Hospital Residencia Hogar de la Santa Caridad de Sevilla con muestras disponibles antes y un mes después de recibir la cuarta dosis de la vacuna de Pfizer-BioNTech (BNT162b2) que no estuviesen en tratamiento inmunosupresor en el momento de la inclusión.

[0238] • Cohorte Trasplante Renal: Formada por 54 pacientes receptores de trasplante renal, que recibiesen el trasplante al menos seis meses antes de recibir la primera dosis de la vacuna de Moderna (mRNA-1273), reclutados en la unidad de trasplantes del Servicio de Nefrología del Hospital Universitario Virgen del Rocío, con muestras disponibles antes y un mes después de haber recibido la tercera dosis de la vacuna.

[0240] Las principales características de las cohortes se detallan en la Tabla 5.

[0242] Tabla 5. Parámetros demográficos, actividad tímica y títulos de anticuerpos totales de cada cohorte antes y después de la cuarta dosis (Cohorte Caridad) y tercera dosis (Cohorte Trasplante).

[0244]

[0245]

[0247] Se indican las medianas y [rangos intercuartílicos] de las variables continuas, mientras que las variables categóricas se expresan como n y frecuencia (%). Los títulos de anticuerpos se expresan como log10. Las ganancias representan cuantas veces se han aumentado el log del título de anticuerpos totales después de la dosis con respecto a los niveles predosis (log títulos post/log títulos pre). *En estas variables solo se incluyen a los sujetos respondedores (>33.8 BAU/ml). La comparación longitudinal de los títulos de anticuerpos se realizó mediante la prueba no paramétrica de Wilcoxon y los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (≠p < 0,001).

[0249] El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación de los Hospitales Universitarios Virgen del Rocío y Virgen Macarena. Todos los participantes incluidos fueron informados y firmaron el consentimiento de participación. Todos los procedimientos de este estudio se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial.

[0251] 3.2 Toma y almacenaje de muestras

[0253] El protocolo de vacunación y toma de muestras de sangre de cada cohorte se detalla en la Figura 6. La recogida de muestras se realizó durante los 2-3 días previos a la inoculación de la cuarta dosis de la vacuna de BNT162b2 en la cohorte Caridad y durante los 7-10 días previos a la administración de la tercera dosis de la vacuna mRNA-1237 en el caso de la cohorte de Trasplante Renal. Para ambas cohortes, las muestras post-vacuna se recogieron un mes después de la administración.

[0254] Se aislaron las células mononucleares de sangre de periférica (PBMCs) mediante gradiente de densidad (Ficoll-Paque) en el caso de los pacientes de trasplante renal, y a partir de Vacutainer CPT® en el caso de la cohorte Caridad, en muestras pre y post-vacuna, y se criopreservaron a viabilidad en nitrógeno líquido hasta su uso. Los sueros y plasmas de ambos puntos de estudio fueron separados y criopreservados a -80ºC.

[0256] 3.3 Cuantificaciones preliminares

[0258] Previamente al análisis de fenotipado mediante el panel de la invención, se procede a la cuantificación de anticuerpos totales frente a SARS-CoV-2 y de la concentración de timosina-α1:

[0259] • Cuantificación de los títulos de anticuerpos totales: Los anticuerpos IgG específicos frente a la conformación trimérica de la proteína S del SARS-CoV-2 se cuantificaron en muestras de suero (pre- y post- dosis vacunal) mediante quimioluminiscencia (LIAISON SARS-CoV-2 TrimericS IgG, Diasorin S.p.A, Saluggia, Italy) mediante la plataforma DiaSorin LIAISON XL (DiaSorin, Stillwater, USA). Aunque el autoanalizador calcula la concentración de anticuerpos en Unidades Arbitrarias (AU), el resultado lo expresa automáticamente en Unidades de Unión Arbitrarias (BAU/ml) (factor de conversión AU/ml*2,6=BAU/ml), considerándose como resultados positivos los títulos ≥33,8 BAU/ml.

[0260] • Cuantificación de timosina-α1: La Tα1 se cuantificó en muestras de plasma (pre-dosis vacunal) mediante el kit comercialHuman Thymosin-α1 competitive ELISA kit (MyBiosurce®)siguiendo las instrucciones del fabricante El límite de detección de la técnica fue de 1 ng/ml. La absorbancia se midió en un lector de microplacas CLARIOstar® (BMG labtech, Ortenberg, Germany) a 450 nm.

[0262] Los resultados de las cuantificaciones de los títulos de anticuerpos y de los niveles de Tα1 se incluyen en la Tabla 5. Todos los participantes de la Cohorte Caridad respondieron a la cuarta dosis de la vacuna, evidenciando un aumento significativo en los títulos de anticuerpos totales (Figura 7A). Sin embargo, aunque el incremento de anticuerpos totales también es significativo (p<0,001) en la Cohorte Trasplante Renal (Figura 7B), 19 pacientes (35,2%) de este grupo seguían sin responder a la tercera dosis de la vacuna.

[0264] Aunque todos los sujetos de la Cohorte Caridad seroconvirtieron tras las dos primeras dosis (protocolo de vacunación completo para esta población), y aun habiendo recibido la tercera dosis, el 58,1% contrajo COVID-19 entre la tercera y cuarta dosis de la vacuna. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre los títulos de anticuerpos de los sujetos que habían pasado la infección, ni en pre-dosis (p=0,115) ni en post-dosis (p=0,672), pero si en la ganancia, obteniendo mayores títulos los previamente infectados (p=0,017).

[0266] Por otro lado, los títulos de anticuerpos totales post-vacuna correlacionaron positivamente con los niveles de Tα1 previos a la vacuna, pero solo en la Cohorte Trasplante Renal (r=0,369, p=0,041), sugiriendo que podría tener un potencial efecto positivo en la respuesta vacunal.

[0268] 3.2. Inmunofenotipado celular en el contexto vacunal

[0270] Para esta parte del estudio se utilizaron PBMCs criopreservadas de 13 sujetos de Caridad y 11 pacientes de la cohorte Trasplante, 6 respondedores (>33.8 BAU/ml) y 5 no respondedores (≤33.8 BAU/ml), y, todos ellos sin infección previa por COVID-19.

[0272] Las PBMCs criopreservadas a viabilidad, se descongelaron, se lavaron y se resuspendieron en medio R10 frío (medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 1,7 mM de glutamina, 100 μl/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.)), al que se había añadido 10U/ml de DNasa I (Sigma Aldrich, EEUU), y se incubaron durante 1 hora en un incubador estándar (37 °C, humidificada y atmósfera de CO<2>al 5%). Tras el pretratamiento con DNAasa I, se contó el número de células viables (Trypan Blue) y se ajustó el volumen de medio R10 para resuspenderlas a una concentración final de 5 × 106 PBMCs/ml. Las PBMCs se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en U, a una concentración de 1 × 106 PBMCs por pocillo (200 μl) y se dejaron en reposo en el incubador 3 horas más. Transcurrido el tiempo de incubación, se estudió la respuesta celular específica frente a la proteína S del SARS-CoV-2 y el efecto de la Tα1 en dicha respuesta, bajo tres condiciones distintas de estimulación: i) 10μg/mL de un pool de péptidos solapantes de la glicoproteínaSpikedel SARS-CoV-2, consistente en un conjunto de secuencias de 15 aminoácidos con 11 de ellos solapados que cubrían los dominios de secuencias inmunodominantes de la glicoproteínaSpikede la cepa clásica de Wuhan del SARS-CoV-2 (cedidas por el NIH), junto con 1μg/mL de las secuencias de péptidos de las regiones mutantes de las variantes ómicron B1.1.529 y BA.5 (Pep Trivator® SARS-CoV-2 Prot S B.1.1.529/BA.5 Mutation Pool, Miltenyi Biotec); ii) 50 ng/mL de Tα1 (MyBioSource, EEUU) y iii) Péptidos del SARS-CoV-2 y Tα1 a las concentraciones indicadas anteriormente.

[0273] Las placas con las PBMCs estimuladas específicamente se incubaron durante 18 horas en el incubador. Además, para cada muestra de estudio se realizó un control negativo sin estimulación, y un control positivo consistente en PBMCs estimuladas de forma inespecífica con 20 ng/ml de forbol-12-miristato 13-acetato (PMA) y 1 μg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich, EE.UU.) e incubadas durante 5 horas. Las últimas 5 últimas horas de incubación de todos los pocillos, incluidos los controles positivos y negativos, se llevaron a cabo en presencia de 10 μg/ml de Brefeldina A (eBioscience), que inhibe el transporte de vesículas en el Retículo Endoplasmático y permite la acumulación de citoquinas (Tabla 6). Transcurrido el tiempo de estimulación, se transfirieron a placas de 96 pocillos con fondo en V para su caracterización fenotípica mediante citometría de flujo espectral.

[0275] Tabla 6. Condiciones de estimulación de los cultivos de PBMCs

[0277]

[0279] * 10 μg/ml de péptidos S originales 1 μg/ml de péptidos S mutantes.

[0281] Las PBMCs de la placa de estimulación fueron transferidas a placas de 96 pocillos con fondo en V, lavadas conStain Buffer(PBS libre de Ca y Mg y suero fetal bovino al 2%) y teñidas extracelularmente con los marcadores de superficie enumerados en la Tabla 3 durante 30 minutos en frío y oscuridad. Tras dos lavados, se fijaron y se permeabilizaron utilizando el Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience™) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez fijadas y permeabilizadas, fueron teñidas intracelularmente utilizando anticuerpos dirigidos tanto a marcadores intracelulares (citoquinas y factores de transcripción), como a aquéllos que se internalizan durante la estimulación (CD3 y CD4). Tras dos lavados conStain Buffer, las PBMCs se transfirieron a tubos de citometría adquiriéndose inmediatamente en un citómetro espectral Cytek Aurora.

[0282] Tras la optimización del panel y adquisición de las muestras de estudio, se diseñó una estrategia de gateo que permitiese la identificación precisa de las subpoblaciones de interés, tal como se detalla en las Figuras 8-10. Estas figuras muestran una representación de la estrategia de gateo (“gating”) manual para la identificación de las subpoblaciones descritas, donde las flechas indican las relaciones entre los distintos tipos celulares. Una vez excluidos los dobletes y las células muertas, los linfocitos se separaron en función de las propiedades FSC-A/SSC-A. En las Figuras 8 y 9, los linfocitos T CD4+ y T CD8+, se identificaron mediante la coexpresión de CD3+, y se identificaron las células productoras de citoquinas en ambas subpoblaciones de forma individual (IL-17A, IL-6, IL-1 β, IL-21, TGFβ-1, IL-10, IL-2, IFN-ɣ, y TNF-α). Las células Treg se caracterizaron mediante la coexpresión de CD25 y FoxP3 a partir de linfocitos T CD4+ (CD4 Treg) y T CD8+ (CD8 Treg), y su funcionalidad se determinó mediante la cuantificación de la capacidad de producción de IL-10 y/o TGFβ-1. Las células CD4 Treg de memoria se clasificaron en memoria/ efectoras en función de la expresión de CCR4/CCR6. La cuantificación de células Th17 se realizó en linfocitos T CD4+ en función tanto de la coexpresión de CCR4 y CCR6 (CD4+, CCR4+, CCR6+), como por su capacidad de producción de IL-17 (CD4+IL-17A+). En la Figura 10, tras la exclusión de dobletes y células muertas, y de la caracterización de linfocitos en función del FSC-A/SSC-A, se identificaron las células B (CD3-, CD19+), analizándose su capacidad de producción de citoquinas de forma individual. La cuantificación de células Breg se realizó a partir de células B, mediante la expresión de CD24 y CD38 (CD3-, CD19+, CD24hi, CD38+), y se determinó su funcionalidad mediante la expresión de IL-10 y/o TGFβ-1.

[0284] Ejemplo 4. Resultados de inmunofenotipado para la Cohorte Caridad

[0286] Las principales poblaciones de linfocitos T CD4 y CD8 y linfocitos B, no se vieron prácticamente afectadas por las diferentes condiciones del estudio. Se produjo un aumento significativo del porcentaje de CD4 como consecuencia de la estimulación con los péptidos vacunales (p=0.046) (Figura 11A). No se observó ninguna diferencia en cuanto a los linfocitos T CD8 (datos no mostrados). Por otro lado, el efecto conjunto de los péptidos con la Tα1 redujo significativamente la frecuencia de linfocitos B (p=0.033) (Figura 11B).

[0288] En las principales poblaciones celulares productoras de citoquinas se observaron pocas diferencias. La Tα1 causó una disminución significativa en el porcentaje de linfocitos CD4 productores de TNF-α (p=0,039) (Figura 12A) e IFN-γ (p=0,041) (Figura 12B). Los péptidos junto a la Tα1 disminuyeron significativamente los linfocitos CD4 productores de IL-21 (p=0,046) (Figura 12C), una citoquina inflamatoria y responsable de la diferenciación y supervivencia de las células Th17, con respecto a los péptidos solos. Conjuntamente, ambos estímulos también mostraron tendencia a aumentar el porcentaje linfocitos CD4 productores de IL-6 (p=0,101) (Figura 12D) y los linfocitos CD8 productores de IL-6 (p=0,039) (Figura 12E), también encargada de la diferenciación hacia Th17.

[0290] Con la administración de los péptidos solos, se observó una tendencia a incrementar la frecuencia de linfocitos CD8 productores de IL-6 (p=0,087), lo que, en este caso, podría contribuir a un ambiente que favorecería la diferenciación a una respuesta efectora Th17.

[0292] En cuanto a las diferentes subpoblaciones de Treg, los péptidos solos redujeron significativamente el número de Treg CD4 totales (p=0,042) (Figura 13), sin cambios significativos en la producción de citoquinas.

[0294] Pese a no producir diferencias en la frecuencia de Treg CD8, la producción de citoquinas en este tipo celular se vio afectada de tal modo que los péptidos redujeron el porcentaje de Treg CD8 productores de IL-10 TGF-β (p=0,093) (Figura 9A) y TGF-β (p=0,017) (Figura 14B), que se podría traducir en un aumento de la respuesta efectora debido a la menor actividad inhibidora de la IL-10 y TGF-β. La estimulación con Tα1 sola disminuyó significativamente la frecuencia de Treg CD8 productoras de IL-10 (p=0,038) (Figura 14C), y la Tα1 junto a los péptidos redujeron el porcentaje de Treg CD8 que producen IL-10 (p=0,018), TGF-β (p=0,050) e IL-10 TGF-β (p=0,093). En resumen, los péptidos afectan principalmente a la producción de citoquinas por parte de las Treg CD8 y, en conjunto con Tα1, reduce su capacidad de producción de IL-10, lo que es importante ya que se trata de la principal citoquina inhibidora.

[0296] La relación IL-17/Treg CD8 sí que aumentó significativamente con la estimulación con péptidos (p=0,012) y con péptidos Tα1 (p=0,010) (Figura 15), sugiriendo una mayor respuesta efectora. Aun así, los linfocitos Th17 no presentaron variaciones con respecto a las diferentes condiciones de estimulación (p=0,861).

[0298] Ejemplo 5. Resultados de inmunofenotipado para la Cohorte Trasplante Renal

[0300] Las principales poblaciones celulares no presentaron ninguna diferencia significativa entre los subgrupos (respondedor -R- y no respondedor -NR-) o entre las diferentes condiciones de estimulación.

[0301] Dentro de las citoquinas de tipo efector nos encontramos con que, en los pacientes R, los péptidos redujeron significativamente la frecuencia de linfocitos T CD8 productores de IL-2 (p=0,046) (Figura 16A), necesaria para la supervivencia y diferenciación a Treg, pero aumentó los linfocitos T CD8 productores de IFN-γ (p=0,068) (Figura 16B). En relación a la Tα1, cuando se administró con los péptidos, tuvo un efecto positivo en la frecuencia de linfocitos T CD4 productores de IFN-γ (p=0,080) (Figura 16C) y linfocitos T CD8 productores de IL-2 (p=0,042) en los NR, lo que podría mejorar la respuesta efectora, y la Tα1 sola disminuyó significativamente el porcentaje de linfocitos T CD8 productores de IL-2 (p=0,043) en pacientes R. Aun así, el sumatorio de citoquinas efectoras no confirmó que los péptidos ni la Tα1 tuvieran una tendencia a aumentar la respuesta general de tipo efector.

[0303] En los pacientes R, los péptidos aumentaron significativamente el porcentaje de linfocitos T CD4 productores de TGF-β (p=0,046) (Figura 17A) y péptidos Tα1 redujeron los linfocitos T CD8 productores de TGF-β (p=0,046) (Figura 17B), siendo TGF-β necesaria para la diferenciación de las células naïve hacia respuesta efectora o supresora. En los NR podemos observar una mayor frecuencia de linfocitos T CD8 productores de IL-10 causada por los péptidos (p=0,043) y por péptidos Tα1 (p=0,043) (Figura 17C), que podría tener un impacto desfavorable en la respuesta efectora. Además, péptidos Tα1 tendieron a reducir los linfocitos T CD4 productores de IL-10 (p=0,068) (Figura 17D).

[0305] Si nos centramos en las citoquinas que favorecen la diferenciación hacia una respuesta efectora Th17, nos encontramos con que, en el grupo de los R, los péptidos aumentaron significativamente la frecuencia de linfocitos T CD4 productores de IL-1β (p=0,018) (Figura 18A) y de IL-6 (p=0,028) (Figura 18B), así como de linfocitos T CD8 generadores de IL-6 (p=0,028) (Figura 18C), pero redujo los linfocitos T CD4 productores de IL-21 (p=0,028) (Figura 18D). Péptidos y Tα1 conjuntamente favorecieron una mayor expansión de linfocitos T CD4 productores de IL-6 (p=0,028) y de linfocitos T CD8 productores de IL-1β (p=0,027) (Figura 18E) y de IL-6 (p=0,028). Mientras que, en el grupo de los NR, los linfocitos T CD4 productores de IL-6 aumentaron con los péptidos (p=0,080), y con péptidos Tα1 tendieron a aumentar los linfocitos T CD4 productores de IL-1β (p=0,080) y de IL-6 (p=0,080), y los linfocitos T CD8 productores de IL-6 (p=0,080).

[0307] Esta cohorte presentó resultados interesantes en cuanto a las células Treg. Los dos subgrupos de estudio partieron de una frecuencia similar de Treg CD4 (p=1,000) (Figura 19A) y los péptidos produjeron una disminución significativa de esta subpoblación en los pacientes R (p=0,028) y mostraron una tendencia a reducirlos en los NR (p=0,080). Péptidos Tα1 también produjeron una reducción significativa del porcentaje de Treg CD4 en los R (p=0,018). Los Treg CD8 (Figura 19B) presentaron una dinámica similar en respuesta a los péptidos, que disminuyeron su frecuencia de manera significativa en los dos subgrupos (p=0,043 y p=0,042), mientras que péptidos Tα1 redujeron su frecuencia en los NR, aunque en menor medida que los péptidos solos. También es interesante que los péptidos aumentaron significativamente el porcentaje de los linfocitos Treg de memoria en el subgrupo NR (p=0,043) (Figura 19C), expandiendo así más memoria del tipo supresor a través de la repetición de dosis, lo que podría dificultar aún más la respuesta en aquellos pacientes no respondedores a las dosis previas.

[0309] Si profundizamos más en las Treg CD4 y CD8 productoras de citoquinas, que son las que presentaron más diferencias, nos encontramos con que, en los NR, los Treg CD8 productores de IL-10 se expandieron en presencia de los péptidos (p=0,003) (Figura 20A). Esto explicaría una menor respuesta efectora en los NR ya que se vería inhibida por IL-10. Mientras que los R, presentaron un incremento significativo de Treg CD4 productores de TGF-β con los péptidos (p=0,043) (Figura 20B). Los péptidos Tα1 tuvieron efectos contrarios sobre los Treg CD4 productores de IL-10 entre los subgrupos (Figura 20C), mientras que en los NR tendieron a aumentarlos (p=0,080), en los R los disminuyeron significativamente (p=0,046).

[0311] Como en la otra cohorte, tampoco hubo diferencias significativas en cuanto a los linfocitos Th17. Sin embargo, con los péptidos se observó un aumento significativo en la relación Th17/Treg CD4 en los dos subgrupos (p=0,028 y p=0,043) (Figura 21A), igual que en la relación Th17/Treg CD8 (p=0,048 y p=0,043) (Figura 21B), seguramente debido a la disminución del porcentaje de Treg CD4 y CD8 descrita anteriormente. Y no se vio ningún efecto beneficioso de la Tα1 porque, aunque al administrarse conjuntamente con los péptidos, consiguió aumentar la relación Th17/Treg CD4 y CD8 en R y NR, lo hizo en menor grado que los péptidos solos. En resumen, en toda esta cohorte se estaría promoviendo una mayor respuesta efectora con la administración de los péptidos vacunales.

[0313] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0315] Figura 1: Representación de la plasticidad celular entre Th17 y Treg (A), donde se indica la ruta de diferenciación predominante en el caso de sujetos respondedores (B) frente a sujetos no respondedores (C).

[0316] Figura 2: Firma espectral de los 20 fluorocromos seleccionados visualizados con Cytek Spectral Viewer.

[0318] Figura 3: Resultados de la matriz de Índice de similaridad. Un valor de "1" indica que prácticamente no hay diferencia entre 2 fluorocromos, mientras que un valor de "0" indica que dos fluorocromos son completamente únicos. En la parte inferior de la matriz se muestra el índice de complejidad (en azul).

[0320] Figura 4: Matriz despillovercalculada para todos los fluorocromos del panel. Los valores de dispersión están codificados por colores de la siguiente manera: blanco: <3, rosa: 3-9, y rojo: >9.

[0322] Figura 5: Representación de la relación entre la concentración de anticuerpo y elStain Index.

[0324] Figura 6: Diseño del estudio, incluyendo la pauta de vacunación de cada cohorte y la toma de las muestras que han sido utilizadas para el desarrollo de este trabajo.

[0326] Figura 7: Dinámica longitudinal de los títulos de anticuerpos totales en (A) Cohorte Caridad y (B) Cohorte Trasplante Renal. Los títulos de anticuerpos se expresan como log10.

[0328] Figura 8: Estrategia de gateo para clasificación de linfocitos T CD4 y producción de citoquinas, así como la identificación de células Th17, CD4 Treg y capacidad funcional, y la identificación de CD4 Treg memoria basada en la expresión de CCR4.

[0330] Figura 9: Estrategia de gateo para la clasificación de linfocitos T CD8 y producción de citoquinas, así como la identificación de CD8 Treg y su capacidad funcional.

[0332] Figura 10: Estrategia de gateo para identificación de linfocitos B y su producción de citoquinas, así como identificación y funcionalidad de células Breg.

[0334] Figura 11: Porcentajes de las principales poblaciones celulares en las diferentes condiciones de estimulación. (A) Linfocitos T CD4 (CD4+, CD3+) (B) Linfocitos B (CD19+) **p≤0,05 Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1.

[0335] Figura 12: Porcentajes de las poblaciones principales productoras de citoquinas en las diferentes condiciones de estimulación. (A) TNF-α CD4 (CD3+, CD4+, TNF-α+) (B) IFN-γ CD4 (CD3+, CD4+, IFN-γ+) (C) IL-21 CD4 (CD3+, CD4+, IL-21+) (D) IL-6 CD4 (CD3+, CD4+, IL-6+) (E) IL-6 CD8 (CD3+, CD8+, IL-6+) *p≤0,15, **p≤0,05, Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1.

[0337] Figura 13: Linfocitos Treg CD4 totales (CD4+, CD25+, FoxP3+) *p≤0,100, **p≤0,05, Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1.

[0339] Figura 14: Porcentajes de las poblaciones Treg CD8 productoras de citoquinas en las diferentes condiciones de estimulación. (A) IL-10 TGF-β Treg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+, TGF-β+, IL-10+) (B) TGF-β Treg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+, TGF-β+) (C) IL-10 Treg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+, IL-10+), *p≤0,100 **p≤0,05, Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1

[0341] Figura 15: Relación IL-17/Treg CD8. IL-17 (CD4+, IL-17), Treg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+) *p≤0,100, **p≤0,05, Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1

[0343] Figura 16: Porcentajes de las poblaciones principales productoras de citoquinas efectoras en las diferentes condiciones de estimulación. (A) IL-2 CD8 (CD3+, CD8+, IL-6+) (B) IFN-γ CD8 (CD3+, CD8+, IFN-γ+) (C) IFN-γ CD4 (CD3+, CD4+, IFN-γ+) *p≤0,100 **p≤0,05, R: respondedores; NR: no respondedores; Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosinaα1; las líneas continuas son para las comparaciones pareadas de los R y las líneas discontinuas para las comparaciones pareadas de los NR.

[0345] Figura 17: Porcentajes de las poblaciones principales productoras de citoquinas antinflamatorias en las diferentes condiciones de estimulación. (A) TGF-β CD4 (CD3+, CD4+, TGF-β+) (B) TGF-β CD8 (CD3+, CD8+, TGF-β+) (C) IL-10 CD8 (CD3+, CD8+, IL-10+) (D) IL-10 CD4 (CD3+, CD4+, IL-10+) *p≤0,100 **p≤0,05. R: respondedores, NR: no respondedores; Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1; las líneas continuas son para las comparaciones pareadas de los R y las líneas discontinuas para las comparaciones pareadas de los NR.

[0347] Figura 18: Porcentajes de poblaciones principales productoras de citoquinas en las diferentes condiciones de estimulación. (A) IL-1β CD4 (CD3+, CD4+, IL-1β+) (B) IL-6 CD4 (CD3+, CD4+, IL-6+) (C) IL-6 CD8 (CD3+, CD8+, IL-6+) (D) IL-21 CD4 (CD3+, CD4+, IL 21+) (E) IL-1β CD8 (CD3+, CD8+, IL-1β+) *p≤0,100 **p≤0,05, R: respondedores, NR: no respondedores; Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1; las líneas continuas son para las comparaciones pareadas de los R y las líneas discontinuas para las comparaciones pareadas de los NR

[0349] Figura 19: Porcentajes de las subpoblaciones Treg en las diferentes condiciones de estimulación. (A) Linfocitos Treg CD4 (CD4+, CD25+, FoxP3+) (B) LinfocitosTreg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+) (C) Linfocitos Treg Memoria CD4 (CD4+, CD25+, FoxP3+, CCR4+) *p≤0,100 **p≤0,05, R: respondedores, NR: no respondedores; Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1; las líneas continuas son para las comparaciones pareadas de los R y las líneas discontinuas para las comparaciones pareadas de los NR.

[0351] Figura 20: Porcentajes de las poblaciones Treg productoras de citoquinas en las diferentes condiciones de estimulación. (A) IL-10 Treg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+, IL-10+) (B) TGF-β Treg CD4 (CD4+, CD25+, FoxP3+, TGF-β+) (C) IL-10 Treg CD4 (CD4+, CD25+, FoxP3+, IL-10+) *p≤0,100 **p≤0,05, R: respondedores, NR: no respondedores; Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1; las líneas continuas son para las comparaciones pareadas de los R y las líneas discontinuas para las comparaciones pareadas de los NR

[0353] Figura 21: Relaciones Th17/Treg CD4 (A); Th17 (CD4+, IL-17+), Treg CD4 (CD4+, CD25+, FoxP3+) (B) Th17/Treg CD8; Th17 (CD4+, IL-17+), Treg CD8 (CD8+, CD25+, FoxP3+) *p≤0,100 **p≤0,05, R: respondedores, NR: no respondedores; Unst: Sin estimulación; P: péptidos; Tα1: timosina-α1; las líneas continuas son para las comparaciones pareadas de los R y las líneas discontinuas para las comparaciones pareadas de los NR.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para generar un perfil inmunofenotípico y funcional de un sujeto, donde el método comprende detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas asociadas, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, y un marcador para determinar la viabilidad de las células, o donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, IL-2, y un marcador para determinar la viabilidad de las células.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde los marcadores comprenden además al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α.

3. Un método para predecir la evolución de una respuesta inmunológica en un sujeto hacia una respuesta efectora o supresora, donde el método comprende:

a) someter células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) del sujeto a una estimulación antigénica específica,

b) detectar marcadores específicos de células reguladoras (CD4 Treg, CD8 Treg y Breg), marcadores específicos de células T helper 17 (Th17), y marcadores específicos de citoquinas dirigidas a la determinación de la plasticidad celular hacia células efectoras/ supresoras, donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, y IL-2, o donde los marcadores comprenden CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, y IL-2, y donde los marcadores comprenden además un marcador para determinar la viabilidad de las células, en las PBMCs del sujeto antes y después de la estimulación antigénica específica,

donde

− un aumento de la ratio entre células Th17 y células reguladoras es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

− una disminución de la ratio entre células Th17 y células reguladoras es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto,

y/o donde

− un aumento de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-1β, IL-6, y/o una disminución de al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

− una disminución de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-17A, IL-1β, IL-6, y/o un aumento de al menos una citoquina anti-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en TGFβ-1, IL-10 es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde la etapa (b) del método comprende adicionalmente detectar al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α,

donde

− un aumento de la ratio entre células Th17 y células B reguladoras es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

− una disminución de la ratio entre células Th17 y células B reguladoras es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto,

y/o donde

− un aumento de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-21, TNF-α, IFN-γ es indicativo de una respuesta efectora en el sujeto, y donde

− una disminución de al menos una citoquina pro-inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-21, TNF-α, IFN-γ es indicativo de una respuesta supresora en el sujeto.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la etapa de detección se realiza mediante citometría de flujo espectral.

6. Un panel para inmunofenotipado que comprende los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, IL-2, o que comprende los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, IL-2, donde el panel incluye además un marcador para determinar la viabilidad de las células.

7. El panel de acuerdo con la reivindicación 6, donde los marcadores comprenden además al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α.

8. El panel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, donde cada marcador está unívocamente asociado con un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en APC Fire 810, Spark-Blue 550, BV786, BB515, PE Cy5.5, RB780, BV510, BV711, PE-Cy5, Live Dead Red, BV605, PE-Dazzle 594, AF647, APC, AF750, PE, eFluor450, BV421, BB700, y BV650.

9. El panel de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde cada marcador está unívocamente marcado con un fluoróforo específico de acuerdo con la siguiente tabla:

10. Un kit para inmunofenotipado que comprende reactivos dirigidos a detectar los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, FoxP3, IL-10, y IL-2, o que comprende reactivos dirigidos a detectar los marcadores CD3, CD4, CD8, CCR4 (CD194), CCR6 (CD196), CD25, IL-17A, IL-6, IL-1 β, TGFβ-1, CD127, IL-10, y IL-2, donde el kit comprende además un reactivo dirigido a un marcador para determinar la viabilidad de las células y/o para determinar mortalidad celular.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, donde el kit comprende además reactivos dirigidos a detectar al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en CD24, CD38, CD19, IL-21, IFN-ɣ, y TNF-α.

12. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde los reactivos dirigidos a los marcadores se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, una lectina, un aptámero, y combinaciones de los mismos

13. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde cada reactivo dirigido a un marcador está unívocamente marcado con un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en APC Fire 810, Spark-Blue 550, BV786, BB515, PE Cy5.5, RB780, BV510, BV711, PE-Cy5, Live Dead Red, BV605, PE-Dazzle 594, AF647, APC, AF750, PE, eFluor450, BV421, BB700, y BV650.