ES3057882T3 - Probe for nucleic acid enrichment and capture, and design method thereof - Google Patents
Probe for nucleic acid enrichment and capture, and design method thereofInfo
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Abstract
Se describe una sonda para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos, así como su método de diseño. La sonda consta de una sonda de cadena sentido y una sonda de cadena antisentido, donde ambas son sondas sin diseño superpuesto, con una longitud de 30-89 bases. El extremo 3' o 5' de la sonda está marcado con biotina y puede unirse a la avidina de las microesferas magnéticas. La sonda bidireccional puede aumentar la especificidad de la captura (es decir, reducir la captura de ADN genómico en sitios no diana), aumentar significativamente la captura del ADN mutante de la muestra y aumentar el número de copias originales del ácido nucleico de la muestra capturado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Sonda para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos y método de diseño de la mismaCampo técnico
[0003] La invención se refiere al campo de la secuenciación génica, en particular, a un tipo de sondas para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos y a un método de diseño de las mismas.
[0004] Antecedentes de la técnica
[0005] Las secuencias del genoma humano son demasiado grandes, por lo que es necesario enriquecer el gen diana para estudiar la mutación de bases en una ubicación específica en el gen diana. El enriquecimiento por PCR y el enriquecimiento por hibridación son los métodos de enriquecimiento más comunes. El enriquecimiento por PCR incluye principalmente PCR múltiplex y PCR digital. La PCR tiene algunas limitaciones tales como sesgo de amplificación, interacción de cebadores en amplificación múltiplex e incapacidad para detectar secuencias desconocidas (tales como reordenamiento génico). El enriquecimiento por hibridación incluye principalmente hibridación con chip e hibridación en solución. La hibridación no es adecuada para el enriquecimiento de áreas pequeñas, y requiere más muestras. La hibridación con chip es una tecnología temprana que promueve la reacción de hibridación aumentando el tamaño de la muestra, la hibridación en solución promueve la reacción de hibridación aumentando la cantidad de las sondas, reduciendo la cantidad de muestra. Mediante hibridación, se diseñaron sondas específicas para genes diana, y los genes diana se capturaron mediante hibridación entre sondas y genomas. Después del enriquecimiento, la mutación de los genes diana puede analizarse mediante secuenciación de alto rendimiento.
[0006] Las principales compañías para capturar el diseño y la síntesis de sondas son Roche Sequencing, Inc., Agilent Technologies, Inc., e IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.). El diseño de sondas se diseña para cadenas individuales en el área diana y se diseña para que sean de diferentes longitudes (29-39 pb como se describe en la patente US 7636637). Referencia > 60 pb, https://lifescience.roche.com/wcsstore/RASCatalogAssetStore/Articles/BIOCHEMICA_3_09_p13-14.pdf; >100 pb, como se describe en la patente de Agilent US20110184161; sondas de 120 pb con diferentes solapamientos (por ejemplo, enlosado 1x, 1,5x, 2x o 4x) descritas en la bibliografía PMID 19182786, PMID 19835619. El diseño unidireccional de las sondas hace imposible capturar bibliotecas de ácidos nucleicos de cadenas complementarias durante el proceso de captura, dando como resultado la pérdida del número de copias de captura. Además, las sondas se diseñaron según las secuencias normales del genoma, y se capturan preferentemente las secuencias normales del genoma en lugar de las secuencias mutantes, dando como resultado la desviación de la frecuencia de mutación en los resultados de secuenciación.
[0007] Un documento de patente anterior de la técnica anterior que se mencionará en el presente documento es el documento US 2004/229269 (HASHMI, G.et al.), que también busca detectar mutaciones genéticas conocidas. Al igual que en la invención subyacente, esta técnica anterior proporciona sondas de cadena sentido y sondas de cadena antisentido y busca minimizar la interacción entre ambas. Esto se logra distribuyendo sondas sentido y cadenas antisentido de amplicones complementarios en más de un recipiente diferente para realizar reacciones de hibridación separadas en diferentes recipientes, siendo dicho número de recipientes lo más pequeño posible.
[0008] Sumario de la invención
[0009] El objeto de la presente invención es proporcionar un tipo de sondas para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos, que pueden mejorar la especificidad de captura y aumentar el número de copias originales del ácido nucleico capturado de la muestra.
[0010] Para lograr los objetos anteriores, la presente invención proporciona un tipo de sondas para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos. Las sondas son sondas bidireccionales, incluyendo sondas de cadena sentido y sondas de cadena antisentido. No hay solapamiento en sondas de cadena sentido o en sondas antisentido, la longitud de las sondas es de 30-89 bases. El extremo 3' o 5' de las sondas tiene una etiqueta de biotina que puede unirse a la avidina en perlas magnéticas.
[0011] Además, el método de diseño de secuencias de las sondas bidireccionales es el siguiente:
[0012] (1) se selecciona la siguiente longitud de secuencias de referencia según el punto de mutación génica en la posición correspondiente del genoma de referencia:
[0013] si son mutaciones puntuales, mutaciones de inserción o mutaciones de deleción en exones, debe seleccionarse la longitud del exón;
[0014] si son las mutaciones de fusión, debe seleccionarse la longitud de los intrones y exones en el punto de fusión; (2) las secuencias de referencia, concretamente el molde de cadena sentido, se toman para diseñar sondas de cadena sentido de igual longitud sin solapamiento;
[0015] (3) las secuencias complementarias inversas de las secuencias de referencia, concretamente, el molde de cadena antisentido, se toman para diseñar sondas de cadena antisentido de igual longitud sin solapamiento; las sondas de cadena antisentido sin solapamiento tienen la misma longitud que las sondas de cadena sentido sin solapamiento, y están dislocadas con las sondas de cadena sentido sin solapamiento: La longitud de las sondas de cadena antisentido sin solapamiento es n, si n es impar, la dislocación más adecuada es (n+1)/2; si n es par, la dislocación más adecuada es n/2;
[0016] (4) a través de análisis de software, se eliminan las sondas que contienen secuencias repetidas; el análisis de software incluye un análisis de secuencias de sondas y un análisis de secuencias diana, el análisis de software puede adoptar software de reconocimiento de secuencias repetidas;
[0017] (5) según los resultados de secuenciación de alto rendimiento de las muestras de ADN capturadas por las sondas, los fragmentos no específicos capturados se comparan con todas las sondas, y las sondas con resultados coincidentes se eliminan;
[0018] (6) se obtienen las sondas de captura que son en última instancia aplicables a las secuencias de referencia. Además, con el fin de capturar secuencias tanto de tipo silvestre como de tipo mutante, se añaden sondas específicas, las secuencias de las sondas específicas son las siguientes: secuencias coincidentes aguas arriba del sitio de mutación, grupos espaciadores libres de bases y secuencias coincidentes aguas abajo del sitio de mutación; la longitud de las secuencias de sondas específicas es n, y si n es impar, la longitud de las secuencias coincidentes aguas arriba o las secuencias coincidentes aguas abajo es (n+1)/2; si n es par, la longitud de las secuencias coincidentes aguas arriba o las secuencias coincidentes aguas abajo es n/2.
[0019] Además, para el punto de mutación de las secuencias de tipo mutación, las bases de mutación en el punto de mutación se reemplazan por grupos libres de bases en el diseño de las sondas específicas.
[0020] Con el fin de capturar mejor las secuencias diana del genoma bicatenario, se diseñan sondas bidireccionales (sondas de cadena sentido y sondas de cadena antisentido diseñadas, respectivamente) basadas en las secuencias diana del genoma requeridas para la captura. Las sondas de cadena sentido son sondas sin diseño solapante, y las sondas de cadena antisentido también son sondas sin diseño solapante. Con el fin de reducir el apareamiento complementario entre las sondas de cadena sentido y de cadena antisentido, las sondas de cadena sentido y las correspondientes sondas de cadena antisentido se diseñan para que estén dislocadas, es decir, cada sonda de cadena sentido y las correspondientes sondas de cadena antisentido tienen una parte complementaria de la mitad de la longitud de las sondas, lo que no solo garantiza la captura de la doble cadena molde, sino que también minimiza la interacción entre las sondas de cadena sentido y las sondas de cadena antisentido.
[0021] La longitud de las sondas es de 30-89 bases. El extremo 3' o 5' de las sondas tiene una etiqueta de biotina que puede unirse a la avidina en perlas magnéticas con el fin de capturar secuencias diana en entornos magnéticos posteriores.
[0022] Al mismo tiempo, para capturar secuencias tanto de tipo silvestre como de tipo mutante al mismo tiempo, se añaden sondas especiales basándose en las sondas bidireccionales. Los sitios mutantes en las sondas específicas se sustituyen por grupos espaciadores libres de bases (dSpacer, Spacer 9 o Spacer 18, etc.), y el tipo mutante y el tipo silvestre comparten las mismas secuencias flanqueantes que están en ambos lados de los grupos modificados con espaciadores libres de bases.
[0023] El principio de diseño de las sondas se muestra en la Fig. 1. Según los sitios correspondientes de los puntos de mutación génica en el genoma de referencia humano (por ejemplo,Homo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13)), las secuencias de referencia de longitud correspondientes se seleccionan para el diseño de sondas. Según las dobles cadenas complementarias del genoma, se diseñan respectivamente las sondas sin solapamiento en la cadena sentido y las sondas sin solapamiento en la cadena antisentido. Cada sonda de cadena sentido es complementaria a las sondas de cadena antisentido en la posición correspondiente con la mitad de la longitud de las sondas, y cada sonda de cadena antisentido es complementaria a las sondas de cadena sentido en la posición correspondiente con la mitad de la longitud de las sondas; y según las mutaciones del genoma detectadas deseadas, se diseñan sondas libres de sesgo en la ubicación correspondiente. La captura por hibridación de las sondas diseñadas con el ADN de muestra se muestra en la Fig.2A, Fig.2B, Fig.2C.
[0024] Las etapas de diseño de las sondas:
[0025] 1. Según la posición correspondiente del punto de mutación génica en el genoma de referencia humano (tal comoHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13)), se selecciona la longitud de las secuencias de referencia de longitud correspondientes, si son la mutación puntual, mutación de inserción o mutación de deleción en el exón, se selecciona la longitud del exón; si son la mutación de fusión, debe seleccionarse la longitud de intrones y exones en el punto de fusión. Si se observa la mutación puntual T790M del gen EGFR, se selecciona el exón 20 del gen EGFR; si se observa la mutación de deleción E746_A750del del gen EGFR, se selecciona el exón 19 del gen EGFR; si la fusión se produce en el intrón 19 del gen ALK, se seleccionan el exón 19, el intrón 19 y el exón 20 del gen ALK.
[0026] 2, Las secuencias de referencia (molde de cadena sentido) se toman para diseñar la misma longitud de las sondas de cadena sentido sin solapamiento, usando software (tal como Array Designer) o manualmente. 3. Las secuencias complementarias inversas (molde de cadena antisentido) de las secuencias de referencia, se toman para diseñar la misma longitud de las sondas de cadena antisentido sin solapamiento. Las sondas de cadena antisentido tienen la misma longitud que las sondas de cadena sentido, y están dislocadas con las sondas de cadena sentido. El diseño de las sondas es mediante software (tal como Array Designer) o manualmente. Si la longitud de la sonda es n, la posibilidad de dislocación es 1 ~ (n-1). Si n es impar, la dislocación más adecuada es (n+1)/2; si n es par, la dislocación más adecuada es n/2. Esta dislocación minimizará la interacción entre las sondas de cadena sentido sin solapamiento y las sondas de cadena antisentido sin solapamiento.
[0027] 4. A través del análisis de software o (y) los resultados de la prueba, se eliminan las sondas que contienen secuencias repetidas. El análisis de software incluye análisis de secuencias de sondas y análisis de secuencias diana, el análisis de software puede adoptar un software de reconocimiento de secuencias repetidas, tal como el software en línea RepeatMasker, software local Blast y BWA. El resultado de la prueba, según los resultados de secuenciación de alto rendimiento de muestras de ADN capturadas por sondas, los fragmentos no específicos capturados se comparan con todas las sondas (tal como el software local), y las sondas con resultados coincidentes se eliminan;
[0028] 5. Se determinan las sondas de captura que son finalmente aplicables a secuencias de referencia.
[0029] El principio de usar las sondas para hibridar y capturar el ADN de la muestra se muestra en la Fig.2A, Fig.2B, Fig.2C. El molde de cadena sentido de tipo silvestre, el molde de cadena antisentido de tipo silvestre, el molde de cadena sentido de tipo mutante y el molde de cadena antisentido de tipo mutante se encuentran en las muestras de ADN. Las sondas contienen sondas de cadena sentido de tipo silvestre, sondas de cadena antisentido de tipo silvestre, sondas de cadena sentido no sesgadas y sondas de cadena antisentido no sesgadas. En ciertas condiciones, sondas de cadena antisentido de tipo silvestre pueden hibridarse con y capturar moldes de cadena sentido de tipo silvestre, sondas de cadena sentido de tipo silvestre pueden hibridarse con y capturar moldes de cadena antisentido de tipo silvestre, sondas de cadena antisentido de tipo silvestre y sondas de cadena antisentido no sesgadas pueden hibridarse con y capturar moldes de cadena sentido mutante, sondas de cadena sentido de tipo silvestre y sondas de cadena sentido no sesgadas pueden hibridarse con y capturar moldes de cadena antisentido de tipo mutante.
[0030] Las sondas bidireccionales de la invención pueden mejorar la especificidad de captura (es decir, reducir la captura del ADN genómico en ubicaciones no diana) y aumentar el número de copias originales del ácido nucleico capturado de la muestra. Las sondas bidireccionales y las sondas no sesgadas que contienen los grupos espaciadores libres de bases de la invención también pueden mejorar significativamente la captura del ADN de tipo mutante de la muestra.
[0031] Descripción de las figuras
[0032] La Fig.1 es un diagrama esquemático del principio de diseño de las sondas de la invención.
[0033] La Fig.2 es un diagrama esquemático del principio de hibridar y capturar ADN de muestra usando las sondas de la invención.
[0034] Descripción detallada
[0035] A continuación se describen realizaciones de la presente invención en detalle, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos en los que etiquetas idénticas o similares de principio a fin denotan elementos idénticos o similares o elementos que tienen las mismas o similares funciones. Las realizaciones descritas a continuación con referencia a los dibujos adjuntos son ilustrativas y están destinadas a usarse para interpretar la presente invención, no para interpretarse como limitaciones a la misma. Si la tecnología o condición específica no se especifica en la realización, se llevará a cabo según la tecnología o condición descrita en la bibliografía en la
técnica o según la especificación del producto. Todos los reactivos o instrumentos que no se indican por el fabricante son productos regulares que pueden adquirirse en el mercado.
[0037] Realización 1 Efecto de las sondas bidireccionales sobre la tasa en la diana de diferentes fragmentos con contenido de GC
[0039] Se toman 6 segmentos genómicos (chr2:29446476-chr2:29446775; chr2:29447226-chr2:29447525; chr2:29448065-chr2:29448364; chr6:117642641-chr6:117642940; chr6:117645323-chr6:117645622; chr6:117641038-chr6:117641337 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13)) para diseñar las sondas: sondas unidireccionales con cobertura 3 veces solapante, o cobertura de desalineación de sondas bidireccionales; la longitud de las sondas es de 59 pb, y el extremo 3' de las sondas está modificado con biotina. Hay muchas secuencias de sondas específicas, el segmento chr2:29446476-chr2:29446775 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13) se toma como ejemplo, cinco sondas unidireccionales se enumeran como SEQ ID NO: 1-5; cinco sondas bidireccionales se enumeran como SEQ ID NO: 6-10. Se toman 30 ng de ADN leucocitario para construir la biblioteca con el kit KAPA, usando reactivos de hibridación, se realiza una captura de hibridación de 2 h y 24 h, usando el kit de hibridación y lavado SeqCap EZ de Roche según las instrucciones del kit. Los resultados de la secuenciación se muestran en la tabla 1.
[0041]
[0044] Tabla 1 Influencia de las sondas bidireccionales sobre la tasa en la diana de diferentes fragmentos con contenido de GC
[0046] Con referencia a la tabla 1, el rendimiento de la cobertura de dislocación de sondas bidireccionales (rendimiento de biblioteca amplificada después de la captura) es significativamente mayor que el de la cobertura de solapamiento unidireccional, y la tasa en la diana de captura de hibridación también aumenta significativamente, y el efecto del grupo de hibridación de 24 horas es más obvio que el del grupo de hibridación de 2 horas. La cobertura es constante en cada grupo. La uniformidad de las sondas bidireccionales es baja. Debido a la cantidad limitada de datos de secuenciación, el UID de la cobertura de dislocación de sondas bidireccionales aumenta con el aumento de la tasa en la diana. El valor de uniformidad de las sondas bidireccionales es menor que las sondas solapantes unidireccionales, principalmente porque las diferentes secuencias de cada sonda determinan la desviación de la eficiencia de captura, de modo que aumentar la frecuencia de la cobertura de las sondas puede reducir eficazmente las diferencias de capacidad de captura de las sondas en diferentes posiciones de la base, de modo que la uniformidad es mejor. El diseño unidireccional de las sondas no puede capturar bibliotecas de ácidos nucleicos bicatenarios, lo que da como resultado la pérdida del número de copias de captura, mientras que las sondas bidireccionales llenan la pérdida correspondiente, de modo que la profundidad y el UID mejoran enormemente. Los datos de secuenciación son a veces mayores que un único elemento, a veces menores que un único elemento, porque, mientras se realiza una secuenciación de alto rendimiento, la calidad de la muestra se convierte según la cantidad esperada de datos, se mezclan y secuencian múltiples muestras, de modo que puede haber desviaciones en el proceso de muestreo y mezclado, no puede garantizarse una precisión absoluta, además, cuando la muestra está en el instrumento de secuenciación que necesita un proceso de amplificación por PCR, no puede garantizarse que la eficacia de amplificación de cada muestra sea exactamente la misma.
[0048] Realización 2 Efectos de las sondas bidireccionales sobre la tasa en la diana de diferentes cromosomas
[0049] Se toman 5 segmentos genómicos, chr2:29446201-29448364, chr7:55241635-55241748, chr7:55242396-55242539, chr7:57249029-57249107, chr7:55259462-55259576 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13), para diseñar las sondas como sigue; sondas unidireccionales sin cobertura de solapamiento y cobertura de dislocación de sondas bidireccionales. La longitud de las sondas es de 35-80 pb y la Tm de las sondas es de 72-78 °C, y el extremo 3' de las sondas está modificado con biotina. Hay muchas sondas específicas. chr2:29446201-29448364 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13) se toma como ejemplo, se enumeran cinco sondas unidireccionales como SEQ ID NO: 11-15. Se enumeran 5 sondas bidireccionales como SEQ ID NO: 16-20, se muestran en la tabla 2. Se toman 30 ng de ADN leucocitario para construir el kit de biblioteca KAPA, usando reactivos de hibridación, se realiza una captura de hibridación de 2 h, usando el kit de hibridación y lavado SeqCap EZ de Roche según las instrucciones del kit. Los resultados de la secuenciación se muestran en la tabla 2.
[0050] Tabla 2 Influencia de las sondas bidireccionales sobre la tasa en la diana de diferentes cromosomas
[0053]
[0055] Con referencia a la tabla 2, el rendimiento de la cobertura de dislocación de sondas bidireccionales (rendimiento de biblioteca amplificada después de la captura) es significativamente mayor que el de la cobertura unidireccional sin solapamiento, y la tasa de captura de hibridación en la diana también aumenta significativamente; la cobertura y la uniformidad son similares en todos los grupos. Debido a la cantidad limitada de datos de secuenciación, el UID de la cobertura de dislocación de sondas bidireccionales aumenta con el aumento de la tasa en la diana.
[0056] Realización 3 Influencia de las sondas bidireccionales sobre el UID
[0057] Se seleccionan varios segmentos genómicos para el diseño de sondas, incluyendo el exón 31, el intrón 31 y el exón 32 del gen ROS1 y el exón 19 del gen EGFR, el diseño de sondas se realiza de la siguiente manera: sondas unidireccionales con cobertura 3 veces solapante, cobertura de dislocación de sondas bidireccionales, la longitud de las sondas es de 59 pb, el extremo 3' de las sondas está modificado con biotina. Las sondas que contienen secuencias repetidas se eliminan mediante análisis de software y resultados experimentales. Las secuencias de sondas específicas son más, tomando el exón 19 del gen EGFR como ejemplo, chr7:55242415-55242513 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13), se enumeran cinco sondas unidireccionales, SEQ ID NO: 21-25, que son finalmente aplicables a las secuencias de referencia. Se enumeran cuatro sondas bidireccionales, SEQ ID NO: 26-29, que son finalmente aplicables a las secuencias de referencia. Tomando el exón 31, el intrón 31 y el exón 32 del gen ROS1 como ejemplos, chr6:117650492-117658503 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13). Se enumeran cinco sondas unidireccionales, SEQ ID NO: 30-34, que son finalmente adecuadas para secuencias de referencia. Se enumeran cinco sondas bidireccionales, SEQ ID NO: 35-39, que son finalmente adecuadas para secuencias de referencia. Se enumeran cinco sondas bidireccionales que contienen secuencias repetidas, SEQ ID NO: 40-44, que se eliminan mediante software. Se enumeran cinco sondas bidireccionales que contienen secuencias repetidas, SEQ ID NO: 45-49, que se eliminaron de los resultados de prueba, que se muestran en la tabla adjunta. Al mismo tiempo, se diseñan sondas no sesgadas que contienen grupos espaciadores libres de bases para el tipo de mutación NM_005228:exon 19:c.2235_2249del:p.745_750del del EGFR con el exón 19 eliminado para aumentar la captura del molde mutante. Las sondas no sesgadas se reemplazan por los grupos espaciadores libres de bases Spacer 18, cuyas secuencias son SEQ ID NO: 50-Spacer 18-SEQ ID NO: 51-3'-biotina.
[0058] en donde TGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA es SEQ ID NO: 50;
[0059] CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA es SEQ ID NO: 51.
[0060] Específicamente es:
[0061] TGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA-Spacer18-CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA-3'-biotina. Se toman 30 ng de ADN leucocitario humano o ADN plasmático para construir la biblioteca con el kit KAPA, usando reactivos de hibridación, se realiza una captura de doble hibridación de 24 h 24 h, usando el kit de hibridación y lavado SeqCap EZ de Roche, según las instrucciones del kit. Los resultados de la secuenciación se muestran en la tabla 3.
[0062] Tabla 3 Influencia de las sondas bidireccionales sobre el UID
[0064]
[0065] Con referencia a la tabla 3, el rendimiento de la cobertura de dislocación de sondas bidireccionales (el rendimiento de la biblioteca amplificada después de la captura) es significativamente mayor que el de los grupos de sondas unidireccionales, y la tasa de captura de hibridación en la diana aumentó ligeramente. La cobertura y uniformidad son similares en todos los grupos. El UID del ADN leucocitario y el ADN plasmático aumentan en un 6,8 % y un 12,9 % respectivamente, cuando el grupo de cobertura de dislocación de sondas bidireccionales se compara con el grupo de cobertura de sondas unidireccionales con la condición de que en la diana y la cantidad de datos sean similares. La profundidad de las sondas bidireccionales es mayor que la de las sondas unidireccionales. Se concluye que las sondas bidireccionales tienen una mejor capacidad de captura de hibridación que las sondas unidireccionales con una cobertura de 1, 2 o 3 veces.
[0066] Las sondas bidireccionales aumentan la frecuencia de cobertura de las sondas con respecto a la base diana, de modo que se introduce una comparación para mostrar que las sondas bidireccionales son superiores a las sondas unidireccionales en el diseño.
[0067] Realización 4 Efectos de las sondas bidireccionales sobre la detección de mutaciones
[0068] Se seleccionaron varios segmentos genómicos para el diseño de sondas, incluyendo el exón 31, el intrón 31 y el exón 32 del gen ROS1 y el exón 19 del gen EGFR, el diseño de sondas se realiza de la siguiente manera: cobertura de dislocación de sondas bidireccionales, la longitud de las sondas fue de 59 pb, el extremo 3' de las sondas está modificado con biotina. Las sondas que contienen secuencias repetidas se eliminan mediante análisis de software y resultados experimentales. Hay muchas secuencias de sondas específicas. Tomando el exón 19 del gen EGFR como ejemplo, chr7:552415-55242513 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13), se enumeran cuatro sondas bidireccionales, SEQ ID NO: 26-29. Tomando el exón 31, el intrón 31 y el exón 32 del gen ROS1 como ejemplos, chr6:117650492-117658503 deHomo sapiens, versión 19 (GRCh37.p13), se enumeran cinco sondas bidireccionales, SEQ ID NO: 35-39. Se enumeran cinco sondas bidireccionales eliminadas por software que contienen secuencias repetidas, SEQ ID NO: 40-44. Se enumeran cinco sondas bidireccionales con secuencias repetidas eliminadas por los resultados de la prueba, SEQ ID NO: 45-49, que se muestran en la tabla adjunta. Al mismo tiempo, se diseñan sondas no sesgadas que contienen grupos espaciadores libres de bases para el tipo de mutación NM_005228:exon 19:c.2235_2249del:p.745_750del en el EGFR con el exón 19 eliminado para aumentar la captura del molde mutante. Las sondas no sesgadas se reemplazan por los grupos espaciadores libres de bases Spacer 18, que es SEQ ID NO: 50-Spacer 18-SEQ ID NO: 51-3’-biotina.
[0069] en donde TGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA es SEQ ID NO: 50;
[0070] CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA es SEQ ID NO: 51.
[0071] Específicamente es,
[0074]
[0076] Tomar 20 ng de la línea celular H1650 (NM_005228:exón 19:c.2235_2249del:P.745_750del, la línea celular puede adquirirse de ATCC) y la biblioteca se construye con el kit KAPA.
[0077] Usando reactivos de hibridación, se realiza una captura de hibridación de 24 h 24 h, usando el kit de hibridación y lavado SeqCap EZ de Roche, según las instrucciones del kit. Los resultados de la secuenciación son los siguientes. El control de captura se realiza usando un kit de captura comercial personalizado (producto personalizado del sistema SeqCap EZ de Roche).
[0078] Tabla 4 Efecto de las sondas bidireccionales sobre la detección de mutaciones
[0081]
[0083] Puede observarse a partir de la tabla anterior que la tasa de mutación de la cobertura de dislocación de sondas bidireccionales es significativamente mayor que la del kit comercial. Según los resultados del método de PCR digital, el contenido de mutación de H1650 es de aproximadamente el 62 %. Se dice que estos datos muestran que la invención puede hibridarse con y capturar mejor fragmentos de ADN mutado, capturar eficazmente copias de mutaciones, de modo que la tasa de detección de mutaciones es más alta.
Claims (4)
1. REIVINDICACIONES
1. Un método para obtener un conjunto de sondas para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos, en donde la longitud de las sondas es de 30-89 bases, el extremo 3' o 5' de las sondas tiene etiquetas de biotina y puede unirse a avidina en perlas magnéticas, que comprende las etapas de:
(1) seleccionar la siguiente longitud de secuencias de referencia que contienen el punto de mutación génica en la posición correspondiente de un genoma de referencia:
si la mutación es una mutación puntual, una mutación de inserción o una mutación de deleción en exones, se selecciona la longitud del exón;
si la mutación es una mutación de fusión, se selecciona la longitud de los intrones y exones en el punto de fusión;
(2) tomar las secuencias de referencia, concretamente el molde de cadena sentido, para diseñar sondas de cadena sentido de igual longitud sin solapamiento entre las sondas de cadena sentido;
(3) tomar el molde de cadena antisentido como las secuencias complementarias inversas de las secuencias de referencia para diseñar sondas de cadena antisentido de igual longitud sin solapamiento, en donde las sondas de cadena antisentido sin solapamiento tienen la misma longitud que las sondas de cadena sentido sin solapamiento, y están dislocadas con las sondas de cadena sentido sin solapamiento, por lo que esta dislocación comprende que cada sonda de cadena sentido y las correspondientes sondas de cadena antisentido tengan una parte complementaria de la mitad de la longitud de las sondas, en donde la longitud de las sondas de cadena antisentido sin solapamiento es n, en donde
- si n es impar, la dislocación es (n+1)/2; y
- si n es par, la dislocación es n/2;
(4) eliminar las sondas que contienen secuencias repetitivas;
(5) según los resultados de secuenciación de alto rendimiento del ADN de muestra capturado por las sondas, los fragmentos no específicos capturados se comparan con todas las sondas, y las sondas con resultados coincidentes con los fragmentos no específicos se eliminan; por lo que
(6) se obtienen las sondas de captura que son aplicables a las secuencias de referencia.
2. El método según la reivindicación 1, en donde las secuencias de sondas son: secuencias coincidentes aguas arriba del sitio de mutación, grupos espaciadores libres de bases y secuencias coincidentes aguas abajo del sitio de mutación;
en donde la longitud de las secuencias de sondas es n, y
si n es impar, la longitud de las secuencias coincidentes aguas arriba o las secuencias coincidentes aguas abajo es (n+1)/2; y
si n es par, la longitud de las secuencias coincidentes aguas arriba o de las secuencias coincidentes aguas abajo es n/2.
3. El método según la reivindicación 2, en donde, para el punto de mutación, las bases de mutación en el punto de mutación se reemplazan por grupos libres de bases en el diseño de las sondas.
4. Uso de un conjunto de sondas para el enriquecimiento y la captura de ácidos nucleicos seleccionadas en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 26, 27, 28, 29, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51.
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