ES3058038T3 - Agonistic cd40 antibodies - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanizados o a sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente al receptor CD40 humano e inducen la señalización de CD40 independientemente de la reticulación del receptor CD40 mediada por Fey. Los anticuerpos de la presente invención se unen a un epítopo de CD40 que se solapa con el epítopo del ligando CD40 y pueden activar las CPA humanas. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden dichos anticuerpos y sus usos en el tratamiento de pacientes con cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos anti-CD40 agonistas

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a anticuerpos agonistas monoclonales humanizados o a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al receptor CD40 humano y son capaces de inducir la señalización de CD40 independientemente de la reticulación del receptor CD40 mediada por Fcγ. La invención también se refiere a usos de dichos anticuerpos y a composiciones farmacéuticas que los comprenden. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0005] Antecedentes

[0006] Los recientes éxitos de la inmunoterapia contra el cáncer han reavivado la hipótesis de que el sistema inmunitario puede controlar muchos cánceres, si no la mayoría, en algunos casos produciendo respuestas duraderas de una forma que no se observa con muchos fármacos de molécula pequeña. Los anticuerpos monoclonales (AcM) anti-CD40 agonistas ofrecen una nueva opción terapéutica que tiene el potencial de generar inmunidad anticancerosa por diversos mecanismos.

[0007] CD40 es una molécula de la superficie celular y miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). Se expresa ampliamente en las células presentadoras de antígenos (APC), como las células dendríticas (DC), los linfocitos B y los monocitos, así como en muchas células no inmunitarias y en diversos tumores.

[0008] El ligando natural del CD40 es CD154, que se expresa principalmente en la superficie de los linfocitos T activados y proporciona un componente importante de la "ayuda" de los linfocitos T a las respuestas inmunitarias: la señalización a través de CD40 en las APC media, en gran parte, la capacidad de los linfocitos T colaboradores para licenciar las APC. El ligamiento de CD40 en las DC, por ejemplo, induce un aumento de la expresión superficial de moléculas coestimuladoras y del MHC, la producción de citocinas proinflamatorias y una mejor activación de linfocitos T. El ligamiento de CD40 en los linfocitos T quiescentes aumenta la función presentadora de antígenos y la proliferación. Las consecuencias de la señalización de CD40 son polifacéticas y dependen del tipo de célula que exprese CD40 y del microentorno en el que se produce la señalización de CD40. Al igual que otros miembros de la familia de receptores de TNF, la señalización de CD40 está mediada por moléculas adaptadoras más que por la actividad de transducción de señales intrínseca a la cola citoplasmática de CD40. Las cinasas posteriores se activan cuando se ensambla el receptor, se transloca un complejo de señalización multicomponente de CD40 al citosol y se activan varias vías de transducción de señales bien caracterizadas.

[0009] En la técnica anterior se conocen anticuerpos anti-CD40 antagonistas. Los anticuerpos antagonistas respectivos pueden ser variantes con silenciamiento de Fc, que muestran una menor reticulación con el receptor CD40 mediada por Fcγ. Las mutaciones respectivas de la región FC de IgG1 humana se describen, por ejemplo, en el documento US 2018/0118843.

[0010] En estrategias inmunomoduladoras recientemente diseñadas, se utilizan anticuerpos monoclonales (AcM) agonistas dirigidos a CD40 para potenciar la capacidad del sistema inmunitario para reconocer y destruir células cancerosas. Los respectivos estudios preclínicos han demostrado que los AcM anti-CD40 agonistas pueden activar las APC y promover respuestas de linfocitos T antitumorales y fomentar células mieloides citotóxicas con potencial para controlar el cáncer en ausencia de inmunidad de linfocitos T. Se divulgan anticuerpos anti-CD40 respectivos que presentan una activación potente de las células dendríticas con un agonismo independiente de la reticulación reducido, por ejemplo, en el documento US2017088624A1. Por lo tanto, los AcM anti-CD40 agonistas son fundamentalmente diferentes de los AcM que logran la activación inmunitaria bloqueando moléculas de punto de control negativas tales como CTLA-4 o PD-1.

[0011] CP-870,893 es el primer AcM IgG2 totalmente humano que actúa como agonista potente y selectivo de CD40. Curiosamente, la unión de CP-870,893 no compite con la unión de CD154 a CD40. En estudios preclínicos, se ha demostrado que CP-870,893 ejerce efectos dependientes e independientes del sistema inmunitario sobre la supervivencia de las células tumorales. En el primer estudio en seres humanos, se observó una prometedora actividad antitumoral, especialmente en pacientes con melanoma. Desde el punto de vista farmacodinámico, la administración de CP-870,893 conduce a una disminución transitoria de los linfocitos B de sangre periférica y a la regulación al alza de los marcadores de activación en las APC.

[0012] Por lo tanto, los AcM anti-CD40 agonistas representan una estrategia prometedora para nuevas terapias contra el cáncer. Sin embargo, también se ha expresado preocupación por sus posibles efectos secundarios citotóxicos. Los anticuerpos monoclonales anti-CD40 agonistas son susceptibles de desencadenar síndromes de liberación de citocinas, reacciones autoinmunitarias, síndromes tromboembólicos (debido a la expresión de CD40 por las plaquetas y las células endoteliales), hiperestimulación inmunitaria que conduce a la muerte o tolerancia celular inducida por la activación, y a la angiogénesis tumoral. Estos efectos pueden causar toxicidad adversa o favorecer el crecimiento de tumores. Desde un punto de vista mecanicista, la capacidad de los anticuerpos anti-CD40 agonistas y otros anticuerpos dirigidos contra la familia de receptores del TNF para interactuar con los receptores Fcγ se ha relacionado con la aparición de toxicidades en estudios con animales (Li y Ravetch 2012, Xuet al.2003, Byrneet al.2016) Para el agonista más fuerte probado, CP-870,893, el efecto secundario más común que se ha notificado es el síndrome de liberación de citocinas, que se manifiesta como escalofríos, fiebre, escalofríos violentos y otros síntomas poco después de la infusión. Además, se han observado varios casos de episodios tromboembólicos con CP-870,893. Con el dacetuzumab, se han observado trastornos oculares inflamatorios no infecciosos.

[0013] Por lo tanto, es necesario proporcionar AcM anti-CD40 agonistas, que presentan una toxicidad celular reducida, acompañada de menos efectos secundarios clínicos a la vez que mantiene su potencia y eficacia clínica. Los AcM anti-CD40 agonistas de la presente invención pueden satisfacer esta necesidad, permitiendo aprovechar todo el potencial inmunomodulador de los anticuerpos anti-CD40 agonistas.

[0014] El documento US 2006/062784 A1 divulga anticuerpos de dominio único capaces de unirse específicamente al ligando CD40, inhibiendo de este modo la señalización dependiente de CD40.

[0015] Sumario de la invención

[0016] La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales o un fragmento de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al receptor CD40 humano e inducen la señalización de CD40 independientemente de la reticulación del receptor CD40 mediada por Fcγ. Más específicamente, los anticuerpos de la presente invención se unen a un epítopo de CD40 que se solapa con el epítopo del ligando de CD40 y son capaces de activar las APC humanas. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden dichos anticuerpos y usos de los anticuerpos y composiciones en el tratamiento de una afección o enfermedad, en la que se desea estimular el sistema inmunitario, p. ej. en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer.

[0017] Definiciones

[0018] El término "anticuerpo" abarca las diversas formas de estructuras de anticuerpos que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren las propiedades de acuerdo con la invención.

[0019] Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (p. ej., scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0020] Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.

[0021] La expresión "anticuerpo humanizado" o "versión humanizada de un anticuerpo" se refiere a los anticuerpos cuyas cadenas pesadas y ligeras están humanizadas como resultado de la genomanipulación de los anticuerpos. Una cadena humanizada es normalmente una cadena en la que la secuencia de aminoácidos de la región V se ha modificado de forma que, analizada en su conjunto, es más parecida en homología a una secuencia de la línea germinal humana que a la secuencia de la estirpe germinal de la especie de origen. La evaluación de la humanización se basa en la secuencia de aminoácidos resultante y no en la metodología en sí.

[0022] Las expresiones "unión específica, contra la diana o anticuerpo antidiana", como se utilizan en el presente documento, se refieren a la unión del anticuerpo al antígeno (diana) respectivo o a la célula que expresa el antígeno, medida mediante ELISA, en donde dicho ELISA comprende preferentemente recubrir un soporte sólido con el antígeno respectivo, añadir dicho anticuerpo en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo con el antígeno o proteína respectivo, detectar dicho inmunocomplejo mediante la medición de los valores de densidad óptica (DO) utilizando un anticuerpo secundario que se une a un anticuerpo de acuerdo con la invención y utilizando un revelado del color mediado por peroxidasa.

[0023] El término "antígeno", de acuerdo con la invención, se refiere al antígeno utilizado para inmunización o a una proteína que comprende dicho antígeno como parte de su secuencia de proteína. Por ejemplo, se puede utilizar un fragmento del dominio extracelular de una proteína (por ejemplo, los primeros 20 aminoácidos) para inmunización y para detección/ensayo y similares se puede utilizar el dominio extracelular de la proteína o la proteína completa.

[0024] Las expresiones "unión específica" o "reconocido específicamente" en el presente documento significan que un anticuerpo presenta una afinidad apreciable por un antígeno, y, preferentemente, no presenta una reactividad cruzada significativa.

[0025] Un anticuerpo que "no presenta reactividad cruzada significativa" es aquel que no se une de forma apreciable a otra proteína no deseable. La unión específica se puede determinar de acuerdo con cualquiera de los medios reconocidos en la materia para determinar dicha unión, por ejemplo, mediante ensayos de unión competitiva tales como ELISA. Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un 50 % o más en un ensayo de competencia.

[0026] La "región (o dominio) variable de un anticuerpo de acuerdo con la invención" (región variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)), como se utiliza en el presente documento, indica cada uno de los pares de regiones de cadenas ligera y pesada que participan directamente en la unión del anticuerpo a al antígeno. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada región comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad, CDR.

[0027] La expresión "parte de unión a antígeno de un anticuerpo", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La parte de unión a antígeno de un anticuerpo comprende preferentemente restos de aminoácidos de las "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las secuencias CDR se definen de acuerdo con Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Mediante este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR de la región variable. Por ejemplo, una región variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de los restos según Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".

[0028] Los "dominios constantes (partes constantes)" no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero también presentan, por ejemplo, funciones efectoras. El fragmento génico de la región constante de cadena pesada que corresponde a la IgG1 humana se denomina cadena γ1. El fragmento génico de la región constante de cadena pesada que corresponde a la IgG3 humana se denomina cadena γ3. Las cadenas pesadas constantes γ humanas están descritas en detalle por Kabat, E. A.et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y por Brueggemann, M.,et al., J. Exp. Med.166 (1987) 1351-1361; Love, T. W.,et al., Methods Enzymol.178 (1989) 515-527.

[0029] La expresión "región Fc" se usa en el presente documento para definir una región en el extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes.

[0030] Salvo que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o en la región constante es de acuerdo con el sistema de numeración de EU, también denominado el índice de EU, como se describe en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[0031] Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia "natural" o "de tipo silvestre" en virtud de al menos una "modificación de aminoácidos" como se define en el presente documento.

[0032] La expresión "variante de Fc", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende una modificación en el dominio Fc. La modificación puede ser una adición, eliminación o sustitución. Las sustituciones pueden incluir aminoácidos de origen natural y aminoácidos de origen no natural. Las variantes pueden comprender aminoácidos no naturales.

[0033] La expresión "polipéptido que contiene la región Fc" se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo, que comprende una región Fc.

[0034] La expresión "receptor de Fc" o el término "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Un FcR que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un "receptor activador") y FcγRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor a base de tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor a base de tirosina (ITIM, del inglésimmunoreceptor tyrosine-based inhibition) en su dominio citoplasmático, (véase la revisión en Daeron, M., Annu. Rev. Immunol.15 (1997) 203-234). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capelet al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; y de Haas,et al., J. Lab. Clin. Med.126 (1995) 330-41. Otros FcR, incluidos los que se identifiquen en el futuro, se incluyen en el término "FcR" del presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al.J. Immunol.

[0035] 117 (1976) 587 y Kim,et al., J. Immunol.24 (1994) 249).

[0037] Por "ligando Fc de IgG", como se utiliza en el presente documento, se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo IgG para formar un complejo Fc/ligando Fc. Los ligandos Fc incluyen, pero sin limitación, FcγR, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica y FcγR vírico. Los ligandos Fc también incluyen homólogos del receptor Fc (FcRH), que son una familia de receptores de Fc homólogos a los FcγR (Daviset al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136, Los ligandos Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc. Los ligandos Fc de IgG en particular son los receptores FcRn y Fc gamma. Por "ligando Fc", como se utiliza en el presente documento, se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc/ligando Fc.

[0039] Por "receptor de Fc gamma", "FcγR" o "FcgammaR", como se utiliza en el presente documento, se entiende cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificado por un genFcγR. En los seres humanos, esta familia incluye, pero sin limitación, FcγRI (CD64), incluidas las isoformas FcγRIa, FcγRIB y FcγRIC; FcγRII (CD32), incluidas las isoformas FcγRIlA (incluidos los alotipos H131 y R131), FcγRIIB (incluidos FcγRIIB-I y FcγRIIB-2), y FcγRllc; y FcγRIII (CD 16), incluidas las isoformas FcγRIIIA (incluidos los alotipos V158 y F158) y FcγRlllb (incluidos los alotipos FcγRIIB-NAI y FcγRIIB-NA2) (Jefferis,et al., Immunol Lett 82(2002)), así como cualquier FcγR humano o isoformas o alotipos de FcγR no descubiertos. Un FcγR puede ser de cualquier organismo, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los FcγR de ratón incluyen, pero sin limitación, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) y FCYRIII-2 (CD 16-2), así como cualquier FcγR o isoformas o alotipos de FcγR de ratón no descubiertos.

[0041] Por "FcRn" o "receptor de Fc neonatal", como se utiliza en el presente documento, se entiende una proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificada al menos en parte por un genFcRn. El FcRn puede ser de cualquier organismo, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Como se conoce en la materia, la proteína funcional FcRn comprende dos polipéptidos, a menudo denominados cadena pesada y cadena ligera. La cadena ligera es la beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el genFcRn. A menos que se indique otra cosa en el presente documento, FcRn o una proteína FcRn se refiere al complejo de la cadena pesada de FcRn con beta-2-microglobulina.

[0043] "Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia peptídica o polipeptídica se define como el porcentaje de restos de aminoácidos de una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos de la secuencia peptídica o polipeptídica específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente, tales como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR).

[0045] La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" (del inglésantibody-dependent cellmediated cytotoxicity) se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan FcR (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan únicamente FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492.

[0047] La expresión "fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" y el término "ADCP" (del inglésantibody-dependent cellular phagocytosis) se refieren a un proceso mediante el cual se internalizan células recubiertas de anticuerpos, en su totalidad o en parte, mediante células inmunitarias fagocíticas (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas) que se unen a una región Fc de inmunoglobulina.

[0049] La expresión "función(es) efectora(s) de anticuerpos" o "función efectora", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una función aportada por un dominio(s) efector Fc de una IgG (por ejemplo, la región Fc de una inmunoglobulina). Dicha función puede efectuarse mediante, por ejemplo, la unión de un dominio o dominios efectores Fc a un receptor Fc en una célula inmunitaria con actividad fagocítica o lítica o mediante la unión de un dominio o dominios efectores Fc a componentes del sistema del complemento. Las funciones efectoras normales son ADCC, ADCP y CDC.

[0050] "C1q" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q, junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forma el complejo C1, el primer componente de la ruta de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0051] La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que tiene su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden subdividirse, además, en subclases (isotipos), p. ej., IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan α, δ, ε, γ y µ, respectivamente.

[0052] Una "cantidad eficaz" de un agente, p. ej., una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

[0053] El término "cáncer", como se utiliza en el presente documento, puede ser, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células broncoalveolares, cáncer óseo, cáncer de páncreas, carcinoma pancreático avanzado, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas epidermoides, adenoma hipofisario, linfoma, leucemia linfocítica, incluidas versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

[0054] Descripción detallada de la invención

[0055] La presente invención responde a la necesidad de proporcionar AcM anti-CD40 agonistas que presenten una toxicidad celular reducida, lo que conlleva menos efectos secundarios clínicos, al tiempo que se mantiene al menos su potencia de señalización y su eficacia clínica, si no se aumenta, en comparación con los anticuerpos anti-CD40 agonistas de la técnica anterior.

[0056] Los anticuerpos o un fragmento de unión a antígeno de la presente invención, proporcionan estas propiedades ventajosas, ya que son capaces de unirse específicamente al receptor CD40 humano y de inducir la señalización de CD40 independientemente de la reticulación del receptor CD40 mediada por Fcγ.

[0057] En realizaciones preferidas, los anticuerpos de acuerdo con la invención son anticuerpos IgG1LALA humanizados, anticuerpos humanizados de tipo IgG1, que tiene al menos dos aminoácidos de alanina en las posiciones 234 y 235 de la región Fc1 humana. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, un IgG1LALA comprende la mutación L234A y L235A de la región Fc1 humana.

[0058] Se prefiere además que los anticuerpos de acuerdo con la invención sean moléculas recombinantes.

[0059] Se proporciona por la presente invención que un anticuerpo monoclonal agonista, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es capaz de unirse al receptor CD40 humano e inducir la señalización de CD40 independientemente de la reticulación del receptor CD40 mediada por Fcγ (véase también el ejemplo 5, la Fig. 6 y el texto más adelante). Asimismo, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede presentar una capacidad de señalización reducida o agotada a través del receptor de Fcγ humano en comparación con la señalización del receptor de Fcγ de IgG de tipo silvestre o con la señalización de Fcγ de anticuerpos de la técnica anterior.

[0060] En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales anti-CD40 agonistas de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden presentar una afinidad reducida o disminuida a los receptores Fcγ humanos en comparación con Fcγ de IgG de tipo silvestre. De acuerdo con una realización preferida, los anticuerpos de la invención no se unen a los receptores Fcγ; por consiguiente, los anticuerpos de la invención no desencadenan el entrecruzamiento del receptor CD40 mediado por Fcγ.

[0061] En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención comprenden al menos sustituciones de aminoácidos en L234A y L235A de la región Fc de IgG1 humana o S228P y L235E de la región Fc de IgG4 humana. Además, para la presente invención se prefiere que los anticuerpos se unan a un epítopo de CD40 que se solapa con el sitio de unión a CD40L. Las figuras 3 y 16 demuestran este solapamiento de epítopos para los anticuerpos humanizados anti-CD40 IgG1-LALA analizados. También se prefiere que los anticuerpos anti-CD40 compitan con CD40L por la unión al receptor CD40. En ensayos de competencia epitópica, los anticuerpos de la invención compiten por tanto con CD40L. Dichos ensayos se describen en los ejemplos 3 y 11 y los resultados de los experimentos con anticuerpos de la invención se representan en las figuras 3 y 16. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida adicional, los anticuerpos de la invención inhiben la unión de CD40L al receptor CD40. La figura 19 demuestra que los anticuerpos de la invención no compiten con CP-870,893 por la unión a CD40.

[0062] Los anticuerpos de acuerdo con la invención poseen una actividad de unión al receptor CD40 muy elevada. Por lo tanto, en un ensayo de unión celular como el descrito en el ejemplo 1, los anticuerpos de acuerdo con la invención presentan una actividad de unión con una CE50 de como máximo 49,5 ng/ml. Preferentemente, la CE50 es inferior a 25 ng/ml, más preferentemente inferior a 15 ng/ml, inferior a 9 ng/ml, 7 ng/ml, 6 ng/ml, 5 ng/ml, 4 ng/ml. Lo más preferentemente, la CE50 es de 3 ng/ml en un ensayo de unión celular como se describe en el ejemplo 1 y como se describe en la figura 1.

[0063] Los anticuerpos anti-CD40 agonistas humanizados de acuerdo con la invención pueden caracterizarse por afinidades bioquímicas por la proteína trimérica CD40 soluble humana o de macaco cangrejero (véase el ejemplo 13; figura 18). Los anticuerpos de la invención pueden mostrar valores de KD iguales o inferiores a 15,7 nM para CD40 humano. Los anticuerpos de la invención pueden tener reactividad cruzada con la proteína CD40 de macaco cangrejero con un valor KD igual o igual a 10,3 nM.

[0064] Asimismo, los anticuerpos de la presente invención son capaces de inducir la señalización celular de NF-κB con gran potencia. En la figura 2 se muestra un resumen de los experimentos (véase el ejemplo 2), que muestran valores de CE50 de unión que van de 1127 a 6243 ng/ml. Los valores de CE50 demuestran la gran potencia de los anticuerpos para inducir la señalización de NF-kB.

[0065] Se apreciará también que los anticuerpos de la invención pueden unirse a CD40 de macaco cangrejero. La actividad de unión de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA a macaco cangrejero (Macaca fascicularis) se muestra en experimentos ELISA utilizando proteína recombinante CD40 de macaco cangrejero (véase el ejemplo 4). Los valores de CE50 mostrados en la Fig.4 indican una unión potente de los anticuerpos.

[0066] Otra característica de los anticuerpos de la presente invención es que pueden activar las APC humanas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden activar células seleccionadas del grupo que comprende células dendríticas (CD), linfocitos B, monocitos y células mieloides. Preferentemente, los anticuerpos activan las DC.

[0067] Esta potente actividad agonista de CD40 en la activación de las APC no se debe a la reticulación de las proteínas CD40 mediada por el receptor Fcγ (véanse los resultados de los experimentos mostrados en las Fig.5, 6 y 7 y descritos en el ejemplo 5).

[0068] Por tanto, en una realización, los anticuerpos de la presente invención inducen la liberación de IL-12p40 en un ensayo de maduración de células dendríticas como se describe en el ejemplo 5. Los resultados de los experimentos realizados con los anticuerpos de la presente invención en dicho ensayo se muestran en las figuras 5 a 7.

[0069] De acuerdo con una realización preferida adicional, los anticuerpos de la invención inducen la maduración de las células presentadoras de antígenos, tal como se determina por la liberación de IL12p70 que es al menos igual a la liberación que se induce tras la estimulación con el anticuerpo CP-870,893-IgG2 y con un valor de CE50 igual o inferior a 208 ng/ml (Fig. 12 y 14). Asimismo, los anticuerpos de la invención inducen la maduración de las células presentadoras de antígenos, determinada por la inducción de CD86 en al menos 7,5 veces y con una CE50 igual o inferior a 148 ng/ml (Fig.11 y 13).

[0070] Preferentemente, los anticuerpos de la invención inducen una liberación de IL12p40 a partir de DC derivadas de monocitos que es al menos igual a la liberación que se induce tras la estimulación con el anticuerpo CP-870,893-IgG2 (véase la Fig.6). Como ya se ha indicado anteriormente, este potencial para inducir la maduración de las DC no se debe a la señalización a través de los receptores Fc. Los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA de la invención inducen potentemente la activación de células dendríticas derivadas de monocitos de forma independiente del receptor Fcγ (véanse el ejemplo 5 y la figura 6). La figura 6 demuestra que los niveles de liberación de IL12p40 inducidos por las variantes CP-870,893 se correlacionan con la capacidad de las variantes para unirse a receptores Fc (IgG1-LALA < IgG2 < IgG1 < IgG1-V11). Sorprendentemente, la estimulación mediante anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA de la invención dio lugar a niveles de secreción de IL12p40 independientes de Fc que cubrieron e incluso superaron el intervalo obtenido con las variantes CP-870,893. Por lo tanto, los anticuerpos anti-CD40 de la invención proporcionan una potente actividad agonista en células dendríticas primarias derivadas de monocitos sin reticulación de proteínas CD40 mediada por receptores Fcγ.

[0071] Asimismo, los anticuerpos de la presente invención son muy específicos en su activación. No inducen una liberación general de citocinas inflamatorias, tales como TNF-alfa (véanse el ejemplo 6 y la Fig.8).

[0072] Otra característica de los anticuerpos de la presente invención es la menor eliminación de anticuerpos de la superficie celular. Se sabe que CP-870,893 se internaliza tras unirse al receptor CD40 de las células. Los estudios clínicos demostraron que CP-870,893 se elimina de la circulación en los pacientes rápidamente con una semivida estimada de menos de 6 horas, lo que refleja un gran sumidero de receptores CD40 en los pacientes que puede deberse a la internalización celular (Rüter et al 2010).

[0073] Los anticuerpos de la invención se retienen en la superficie celular en condiciones que permiten la endocitosis y la internalización (véanse el ejemplo 7 y la Fig.9). En cambio, las variantes CP-870,893 no se retienen en la superficie celular en condiciones que permitan la endocitosis y la internalización (Fig.9).

[0074] Se apreciará que los anticuerpos de acuerdo con la invención tienen un efecto indirecto (inmunomediado) sobre la muerte de las células tumorales. Por lo tanto, los anticuerpos presentan un efecto citotóxico indirecto mediado por células inmunitarias sobre las células tumorales.

[0075] En una realización específica, los anticuerpos de acuerdo con la invención no provocan el agotamiento de las células inmunitarias que expresan CD40 por mecanismos de ADCC, ADCP o CDC.

[0076] Por lo tanto, en resumen, los anticuerpos de la invención pueden caracterizarse también por que

[0077] (a) no se unen al receptor Fcγ;

[0078] (b) tienen una afinidad de unión celular a CD40 con un valor de CE50 igual o inferior a aproximadamente 49,5 ng/ml; (c) tienen valores de KD iguales o inferiores a aproximadamente 15,7 nM;

[0079] (d) tienen reactividad cruzada con CD40 de macaco cangrejero con un valor de KD igual o inferior a aproximadamente 10,3 nM;

[0080] (e) inhiben CD40L uniéndose a CD40;

[0081] (f) impiden los efectos sinérgicos y aditivos de las funciones mediadas por CD40L;

[0082] (g) inducen la maduración de las células presentadoras de antígenos, determinada por la liberación de IL12p70, que es al menos igual a la liberación que se induce tras la estimulación con el anticuerpo CP-870,893-IgG2 y con un valor de CE50 igual o inferior a aproximadamente 208 ng/ml

[0083] y/o determinada por la inducción de CD86 en células dendríticas en al menos 7,5 veces y con una CE50 igual o inferior a aproximadamente 148 ng/ml; y/o

[0084] (h) reducen el nivel de CD40 en la superficie celular en menor medida que CP-870,893.

[0085] Los anticuerpos de la invención se caracterizan por que tienen al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o todas las propiedades anteriores (a a h).

[0086] Debido a las propiedades favorables de los anticuerpos de la invención, son capaces de inhibir el crecimiento de tumores humanos.

[0087] El anticuerpo según la invención comprende una región VH seleccionada del grupo de regiones VH que comprende las regiones CDR seleccionadas del grupo que comprende una región CDR1H de SEQ ID NO: 33, una región CDR2H de SEQ ID NO: 47 y una región CDR3H de SEQ ID NO: 61, y una región VL seleccionada del grupo de regiones VL que comprende regiones CDR seleccionadas del grupo que comprende una región CDR1L de SEQ ID NO: 75, una región CDR2L de SEQ ID NO: 89 y una región CDR3L de SEQ ID NO: 103.

[0088] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de acuerdo con la invención comprenden una región variable de cadena pesada (VH) que es al menos un 85 % idéntica a una VH de SEQ ID NO: 5.

[0089] Preferentemente, dichos anticuerpos comprenden una secuencia de región variable (VH) de cadena pesada que tiene al menos un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias VH de SEQ ID NO: 5.

[0090] En determinadas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o supresiones con respecto a la secuencia de referencia, de modo que el anticuerpo conserva la capacidad de unirse específicamente de acuerdo con la invención al antígeno respectivo.

[0091] La presente invención comprende también un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0092] Preferentemente, la secuencia de la región variable (VH) de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 5.

[0093] La presente invención también se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera (VL) que es al menos un 85 % idéntica a una región VL de SEQ ID NO: 19.

[0094] Preferentemente, dichos anticuerpos comprenden una secuencia VL que tiene al menos un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[0095] En determinadas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad, contiene sustituciones (p. ej., sustituciones conservadoras), inserciones o supresiones con respecto a la secuencia de referencia, de modo que el anticuerpo conserva la capacidad de unirse específicamente de acuerdo con la invención al antígeno respectivo.

[0096] La presente invención comprende también un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[0097] Preferentemente, la secuencia de región variable (VL) de cadena ligera es la SEQ ID NO:19.

[0098] En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o suprimido en dichas secuencias VL. En otras realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o suprimido en dichas secuencias VH. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o suprimido en cada una de dichas secuencias VH o VL. Dichas sustituciones, inserciones o supresiones pueden producirse fuera de las CDR (es decir, las FR).

[0099] La invención comprende también anticuerpos madurados por afinidad que pueden producirse según métodos conocidos en la técnica. Markset al.Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por el reordenamiento de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los restos de CDR y/o marco se describe por: Barbaset al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schieret al., Gene 169: 147-155 (1995); Yeltonet al., J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jacksonet al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); y Hawkinset al., J. Mol. Biol.

[0100] 226:889-896 (1992) y el documento WO2010/108127.

[0101] En el presente documento se divulgan también anticuerpos que comprenden una región VH y una región VL que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 respectivas de un anticuerpo seleccionado entre el grupo que comprende los anticuerpos enumerados en la Fig.10, es decir, que comprende los anticuerpos MAB-16-0283, MAB-16-0377, MAB-16-0267, MAB-16-0386, MAB-16-0451, MAB-16-0346, MAB-16-0325, MAB-16-0388, MAB-16-0464, MAB-16-0262, MAB-16-0406, MAB-16-0484, MAB-16-0400, MAB-16-0489.

[0102] En el presente documento se divulgan anticuerpos que comprenden la SEQ ID NO: 1 y 15, o la SEQ ID NO: 2 y 16. Un anticuerpo también puede comprender la SEQ ID NO: 3 y 17, o la SEQ ID NO: 4 y 18, o la SEQ ID NO: 5 y 19, o la SEQ ID NO: 6 y 20, o la SEQ ID NO: 7 y 21, o la SEQ ID NO: 8 y 22, o la SEQ ID NO: 9 y 23, o la SEQ ID NO: 10 y 24, o la SEQ ID NO: 11 y 25, o la SEQ ID NO: 12 y 26, o la SEQ ID NO.: 13 y 27, o la SEQ ID NO: 14 y 28.

[0103] En otro aspecto, los anticuerpos de la invención son para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer. Dicho cáncer puede ser uno o más de los tipos de cáncer seleccionados del grupo que comprende cáncer de páncreas, carcinoma pancreático avanzado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células broncoalveolares, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de riñón, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de glándulas salivales o cáncer de útero.

[0104] En determinadas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido.

[0105] También es posible en algunas realizaciones, que el cáncer sea un cáncer que expresa CD40. Sin embargo, esto no es necesario para el funcionamiento eficaz de los anticuerpos de la invención.

[0106] Se apreciará además que el anticuerpo de la invención puede usarse como tratamiento único para el cáncer en un paciente o como parte de un tratamiento combinado (cuyo tratamiento adicional puede ser un agente farmacéutico citotóxico o citostático, radioterapia, terapia dirigida y/o cirugía).

[0107] Por lo tanto, el paciente puede recibir también uno o más tratamientos adicionales contra el cáncer, por ejemplo agentes farmacéuticos (tales como agentes citotóxicos o citostáticos, terapia dirigida), radioterapia y/o cirugía.

[0108] Por lo tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo de acuerdo con la invención se usa en el tratamiento del cáncer junto con agentes citotóxicos o citostáticos, radioterapia, terapia dirigida y/o inmunoterapia.

[0109] Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en el tratamiento de pacientes con respuesta insuficiente y/o resistentes a agentes citotóxicos o citostáticos, radioterapia, terapia dirigida y/o inmunoterapia.

[0110] Dicha radioterapia puede seleccionarse entre el grupo que comprende radioterapia de haz externo, braquiterapia de rayos x de contacto, braquiterapia, terapia sistémica con radioisótopos o radioterapia intraoperatoria.

[0111] Los agentes anticancerígenos citotóxicos o citostáticos de acuerdo con la invención pueden ser del grupo que comprende taxanos, antraciclinas, agentes alquilantes, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de cinasas, análogos de nucleótidos, antibióticos peptídicos y agentes a base de platino. Preferentemente, los agentes anticancerígenos dirigidos se usan en terapia dirigida y se seleccionan entre uno de los siguientes, o combinaciones de los mismos: compuestos anti-EGFR tales como cetuximab, gefitinib, erlotinib, lapatinib, panitumumab, compuestos anti-HER2 tales como trastuzumab, ado-trastuzumab emtansina, pertuzumab, compuestos dirigidos contra el VEGF, tales como bevacizumab, aflibercept y pegaptanib e inhibidores de tirosina cinasa, tales como sunitinib, pazopanib, axitinib, vandetanib, cabozantinib y regorafinib.

[0112] En caso de que los pacientes estén recibiendo inmunoterapia, puede ser la inhibición de puntos de control inmunitarios y pueden usarse uno o más inhibidores de puntos de control inmunitarios. Los uno o más inhibidores de puntos de control inmunitarios pueden seleccionarse del grupo que comprende anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti-CD137, anti-LAG-3, anti-TIM-3, anti-OX40 y anti-GITR.

[0113] El anticuerpo de acuerdo con la invención también puede usarse junto con un anticuerpo que se una específicamente a PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, CD137, OX40, GITR humanos y/o junto con el fármaco nivolumab, pembrolizumab, urelumab, utomilumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, tremelimumab, ipilimumab.

[0114] En algunas realizaciones de acuerdo con la invención, el anticuerpo se utiliza en el tratamiento del cáncer en dosis semanales o mensuales.

[0115] Una de las ventajas especiales de esta invención es que, debido a sus mutaciones en la región Fc, los anticuerpos presentan menos toxicidades limitantes de la dosis o el tratamiento, en comparación con los anticuerpos de la técnica anterior. Los anticuerpos provocan los efectos secundarios típicos de los anticuerpos anti-CD40, si acaso, solo hasta cierto punto. Dichos efectos secundarios son afecciones seleccionadas del grupo que comprende síndrome de liberación de citocinas, trombosis, embolia cerebral, aumento de las transaminasas, linfopenia, cansancio, neuropatía periférica, alopecia, estreñimiento, náuseas y neutrocitopenia.

[0116] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede usarse en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer. Dicho cáncer puede ser un tumor sólido. El cáncer también puede seleccionarse del grupo que comprende cáncer de páncreas, carcinoma pancreático avanzado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células broncoalveolares, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de riñón, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de glándulas salivales o cáncer de útero.

[0117] La composición también puede usarse en el tratamiento del cáncer junto con quimioterapia, radioterapia, terapia dirigida y/o inmunoterapia. Dicha inmunoterapia puede ser la inhibición de puntos de control inmunitarios.

[0118] Los pacientes tratados con dicha composición pueden responder insuficientemente y/o ser resistentes a la quimioterapia, radioterapia, terapia dirigida y/o inmunoterapia.

[0119] La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede usarse en el tratamiento del cáncer junto con uno o más compuestos citotóxicos, citostáticos o dirigidos contra el cáncer.

[0120] Puede usarse en el tratamiento del cáncer junto con uno o más inhibidores de puntos de control inmunitarios, en donde dichos inhibidores de puntos de control inmunitarios pueden seleccionarse del grupo que comprende anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti-CD137, anti-LAG-3, anti-TIM-3, anti-OX40 y anti-GITR.

[0121] La composición también puede usarse junto con un anticuerpo que se une específicamente a PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, CD137, OX40, GITR humanos y/o junto con el fármaco nivolumab, pembrolizumab, urelumab, utomilumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, tremelimumab, ipilimumab.

[0122] También puede usarse en el tratamiento del cáncer en dosis semanales o mensuales.

[0123] Los pacientes apreciarán particularmente que el anticuerpo y la composición de acuerdo con la invención presenten cualquier toxicidad limitante de la dosis o el tratamiento, si acaso, solo hasta cierto punto, y de forma importante, en menor medida que los anticuerpos y composiciones de la técnica anterior.

[0124] En otro aspecto, la presente divulgación también se refiere a métodos de tratamiento, que comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo de acuerdo con la invención a individuos que lo necesiten. Dichos individuos pueden ser pacientes que padecen cáncer. Por lo tanto, la presente divulgación se refiere también a métodos de tratamiento del cáncer, en donde el cáncer puede ser un tumor sólido.

[0125] La etapa de administración a un individuo que lo necesite puede comprender la administración local, por ejemplo, administración local a un tumor en un paciente (por ejemplo, intratumoral o peritumoral).

[0126] Dado que los agentes basados en anticuerpos de la invención son adecuados para su uso en el tratamiento de cualquier tipo de cáncer para el que la activación de CD40 pueda proporcionar un beneficio terapéutico, los métodos que comprenden la administración de dichos anticuerpos también son adecuados para el tratamiento de cualquier tipo de cáncer para el que la activación de CD40 pueda proporcionar un beneficio terapéutico.

[0127] Por ejemplo, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en: cáncer de próstata; cáncer de mama; cáncer colorrectal; cáncer pancreático; cáncer de ovario; cáncer de pulmón; cáncer cervicouterino; rabdomiosarcoma; neuroblastoma; mieloma múltiple; leucemia, leucemia linfoblástica aguda, melanoma, cáncer de vejiga y glioblastoma. Se apreciará además que los métodos de tratamiento de acuerdo con la divulgación pueden comprender la administración única de los agentes a base de anticuerpos de la invención a un paciente o como parte de un tratamiento combinado (pudiendo ser dicho tratamiento adicional un agente farmacéutico citotóxico o citostático, radioterapia, terapia dirigida y/o cirugía).

[0128] De hecho, todas las características y propiedades favorables de los anticuerpos de la invención detalladas anteriormente, también se reflejan y comprenden en los métodos de tratamiento y usos de los anticuerpos de acuerdo con la divulgación.

[0129] Ejemplos

[0130] Los siguientes ejemplos se utilizan junto con las figuras y tablas para ilustrar la invención.

[0131] Ejemplo 1: Unión celular de anticuerpos anti-CD40

[0132] Para determinar la potencia de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA en la unión a CD40 expresado en células, se sembraron células HEK-Blue-CD40L<™>(InvivoGen) en 25 µl de DMEM que contenía un 10 % de FBS a una densidad celular de 1000 células/pocillo en una placa de 384 pocillos de fondo transparente tratada para cultivo celular. Los anticuerpos se añadieron a concentraciones finales en el intervalo de 1,25 µg/ml a 0,01 ng/ml en 5 µl de medio. Después de 24 h, las células se lavaron tres veces con 25 µl de tampón de lavado (PBS, Tween al 0,05 %) antes de añadir anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con Alexa-Fluor-488 (Jackson Laboratories) a una concentración de 0,8 µg/ml en 20 µl de medio. Cuatro horas más tarde, se añadieron 5 µl de colorante Hoechst en el medio hasta una concentración final de 5 µg/ml. Las señales fluorescentes de unión celular se midieron con un generador de imágenes automatizado de alto contenido CellInsight (Thermo Fisher Scientific). Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizando Excel (Microsoft) y XLfit (IDBS). La figura 1 resume los valores de CE<50>de unión en el intervalo de 3 a 49,5 ng/ml.

[0133] Ejemplo 2: Inducción de la señalización celular de NF-κB por anticuerpos agonistas anti-CD40

[0134] La actividad agonista de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA se comprobó estimulando células HEK-Blue-CD40L<™>(InvivoGen) que portan una construcción génica de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) inducible por NF-κB. Se sembraron 25000 células/pocillo en 20 µl de DMEM con un 10 % de FBS en una placa de 384 pocillos de fondo transparente tratada para cultivo celular y se cultivaron durante una noche. A continuación, se añadieron anticuerpos en un volumen de 5 µl de medio hasta alcanzar concentraciones finales en el intervalo de 20 a 0,013 µg/ml. Tras 6 horas de incubación a 37 °C y CO<2>al 5 %, se transfirieron 5 µl del sobrenadante del medio de cada pocillo a una placa de 384 pocillos blanca de fondo transparente que contenía 20 µl de reactivo QUANTI-Blue<™>2x (InvivoGen). Tras incubar durante una hora a 37 °C y CO<2>al 5 %, se midió la densidad óptica a una longitud de onda de 620 nm, lo que refleja la activación dependiente de NF-κB de la secreción de fosfatasa. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizando Excel (Microsoft) y XLfit (IDBS). Los valores de CE<50>de la figura 2 indican la potencia de los anticuerpos anti-CD40 para inducir la señalización de NF-κB en las células indicadoras HEK- Blue-CD40L<™>.

[0135] Ejemplo 3: Competencia con la unión de CD40L

[0136] Se comprobó la competencia de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA con la unión de CD40L a CD40 mediante un ensayo ELISA. Se recubrió la superficie de una placa Nunc<™>MaxiSorp<™>de 384 pocillos con CD40L en un volumen de 25 µl de PBS y a una concentración de 1 µg/ml durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se preincubaron a una concentración de 5 µg/ml con proteína CD40 recombinante a una concentración de 1,7 µg/ml en un volumen total de 40 µl durante 1,5 horas a temperatura ambiente en tampón de ELISA (PBS, BSA al 0,5 %, Tween al 0,05 %). La placa Nunc<™>MaxiSorp<™>se lavó tres veces con tampón de lavado (PBS, Tween al 0,1 %) y se bloqueó durante una hora a temperatura ambiente con PBS, BSA al 2 %, Tween al 0,05 %. Después de tres lavados en tampón de lavado, se añadieron 25 µl del complejo anticuerpo-CD40 a los pocillos de la placa Nunc<™>MaxiSorp<™>y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en tampón de lavado, los pocillos se incubaron con 25 µl de una dilución 1:2000 de fragmento F(ab)<2>de cabra específico de especie ligado a peroxidasa anti-humano (AbD Serotec) en tampón ELISA durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron seis veces con tampón de lavado y se añadieron 30 µl/pocillo de solución de sustrato TMB (Invitrogen). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 30 µl de solución de parada (HCl 1 M) por pocillo y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 y 620 nm utilizando un lector de microplacas Tecan M1000. La señal ELISA para las muestras incubadas con CP-870,893 indica la falta de competencia con CD40L, mientras que los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA de acuerdo con la invención compiten con la unión de CD40L a CD40 (véase la figura 3).

[0138] Ejemplo 4: Actividad de unión a CD40 de macaco cangrejero

[0140] La unión de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA a la proteína CD40 del macaco cangrejero se probó en un ELISA bioquímico. La proteína recombinante CD40 de macaco (Acro Biosystems) se incubó en una placa Nunc<™>MaxiSorp<™>de 384 pocillos a una concentración de 0,5 µg/ml en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de lavado (PBS, Tween al 0,1 %), las placas se bloquearon con PBS, BSA al 2 %, Tween al 0,05 % durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado y anticuerpos a concentraciones en el intervalo de 500 a 0,03 ng/ml en PBS, BSA al 0,5 %, Tween al 0,05 % y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en tampón de lavado, los pocillos se incubaron con 12,5 µl de una dilución 1:3000 de fragmento F(ab)<2>de cabra específico de especie ligado a peroxidasa anti-humano (AbD Serotec) en tampón ELISA durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron seis veces con tampón de lavado y se añadieron 15 µl/pocillo de solución de sustrato TMB (Invitrogen). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 15 µl de solución de parada (HCI 1 M) por pocillo y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 y 620 nm con un lector de microplacas Tecan M1000. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizando Excel

[0141] (Microsoft) y XLfit (IDBS). Como se muestra en la figura 4, la mayoría de los anticuerpos se unen a CD40 de macaco con valores de CE<50>entre 8 y 31,8 ng/ml.

[0143] Ejemplo 5: Inducción de la maduración de células dendríticas

[0145] a. Se generaron células dendríticas derivadas de monocitos para probar la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA para estimular la maduración de las células dendríticas medida por la secreción de la citocina IL12p40. Se utilizaron preparaciones de capa leucocitaria humana de diferentes donantes para diferenciar células dendríticas de monocitosin vitro.La capa leucocitaria recibida de la Cruz Roja de Bavaria se diluyó a 1:4 con DPBS y se dispuso en capas sobre gradientes de densidad de Ficoll-Paque (GE Healthcare). Después de la centrifugación, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en interfase se lavaron tres veces con DPBS y se aislaron los monocitos utilizando microesferas magnéticas de CD14 (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los monocitos se cultivaron en RPMI-1640 con un 10 % de FCS, Pen/estrep 1x, L-glutamina 1x, 50 ng/ml de GM-CSF humano recombinante (R&D Systems) y 10 ng/ml de IL-4 humana recombinante (R&D Systems) a una densidad celular de 1,2x10<6>células/ml en matraces de cultivo celular T-175. Cada 48 horas, el 90 % del medio se sustituyó por medio fresco que contenía citocinas. Al quinto día, se recogieron las células dendríticas inmaduras (iDC) diferenciadasin vitroy se distribuyeron a una placa de cultivo de 96 pocillos a una densidad celular de 10<6>células/ml en 100 µl del mismo medio.

[0147] b. En un experimento, se estimularon las iDC añadiendo anticuerpos anti-CD40 a una concentración de 5 µg/ml.

[0148] 48 h después de la estimulación, se cuantificó la citocina IL12p40 secretada en el sobrenadante del medio utilizando un kit ELISA comercial (R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La figura 5 muestra que los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA estimularon la liberación de IL12p40 por las células dendríticas derivadas de monocitos en distinta medida, en un intervalo de menos de 1 ng/ml a más de 24 ng/ml, mientras que un anticuerpo IgG1-LALA de control sin unión a CD40 no condujo a la estimulación de niveles detectables de IL12p40.

[0150] c. Los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA de la invención no son capaces de unirse a receptores Fcγ que se expresan en células dendríticas derivadas de monocitos. Con el fin de comparar estos anticuerpos con anticuerpos que albergan diferentes actividades de unión al receptor Fcγ, los presentes inventores construyeron anticuerpos anti-CD40 de referencia CP-870,893 que contienen partes de Fc de IgG1 humana, IgG1-LALA, IgG2 e IgG1-V11 y se estimularon células dendríticas derivadas de monocitos con diferentes concentraciones de estos anticuerpos. La forma IgG1-V11 porta cuatro mutaciones (G237D, H268D, P271G, A330R) en la parte Fc de la cadena pesada. Se ha descrito que estas mutaciones aumentan selectivamente la afinidad al receptor de Fcγ RIIB (Mimotoet al.2013). La figura 6 demuestra que las variantes de CP-870,893 estimulan la liberación de IL12p40 de forma dependiente de Fc (IgG1-LALA < IgG2 < IgG1 < IgG1-V11). Sorprendentemente, la estimulación mediante anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA de la invención dio lugar a niveles de secreción de IL12p40 independientes de Fc que cubrieron e incluso superaron el intervalo obtenido con las variantes CP-870,893. Por tanto, los anticuerpos anti-CD40 de la invención proporcionan una potente actividad agonista en células dendríticas primarias derivadas de monocitos sin reticulación de proteínas CD40 mediada por receptores Fcγ.

[0151] d. En otro experimento, se determinó la potencia de los anticuerpos monoclonales anti-CD40 IgG1-LALA para inducir la secreción de IL12p40 por células dendríticas derivadas de monocitos mediante estimulación con concentraciones de anticuerpos en el intervalo de 0,005 a 10 µg/ml. La figura 7 muestra que los valores de CE<50>para diferentes anticuerpos se encontraban en el intervalo de 380 a 743 ng/ml.

[0152] Ejemplo 6: Liberación de TNF-alfa en un ensayo de PBMC de alta densidad

[0153] Para determinar si los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA inducen la liberación general de citocinas en las células sanguíneas, se estimularon PBMC con los anticuerpos de acuerdo con el protocolo de Römeret al.2011. Las PBMC se aislaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron en RPMI-1640 con un 10 % de suero AB humano y aminoácidos no esenciales (NEAA) 1x a una densidad celular de 1x10<7>células/ml en un matraz de cultivo celular T175. Después de dos días, se recogieron las células y se sembraron a una densidad de 1x10<6>células/ml por triplicado en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos a una concentración de 10 µg/ml y se incubaron con PBMC durante tres días a 37 °C, CO<2>al 5 % y 95 % de humedad. Como control positivo, se incluyó en los experimentos un anticuerpo OKT-3 (Abcam). La liberación de TNF-alfa se cuantificó en el sobrenadante del cultivo celular utilizando un kit ELISA para TNF-alfa humano (R&D Systems) comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La figura 8 muestra que los anticuerpos anti-CD40 de la invención y un anticuerpo de control IgG1-LALA sin unión a CD40 no estimularon la liberación significativa de TNF-alfa por las PBMC, a diferencia del anticuerpo OKT-3.

[0154] Ejemplo 7: Ensayo celular de pulso-caza

[0155] La dinámica de unión e internalización celular de los anticuerpos anti-CD40 se analizó en un ensayo de pulso-caza utilizando células HEK-Blue-CD40L<™>(InvivoGen). Se sembraron 2000 células/pocillo en dos placas negras de 384 pocillos con fondo transparente en medio DMEM con un 10 % de FCS. Después de cultivar durante una noche, los anticuerpos anti-CD40 de la invención y los anticuerpos variantes de Fc CP-870,893 como se ha descrito anteriormente se añadieron a una placa a una concentración de 0,8 µg/ml y se incubaron durante 15 min a 37 °C y CO<2>al 5 %. Posteriormente, ambas placas se lavaron tres veces con tampón de lavado celular (PBS, Tween al 0,05 %) y se incubaron durante una hora en medio de cultivo. Durante los últimos 15 minutos, se añadieron anticuerpos a la placa 2 a una concentración de 0,8 µg/ml. A continuación, ambas placas se lavaron tres veces con tampón de lavado celular, se colocaron sobre hielo y se incubaron con 0,8 µg/ml de anticuerpo secundario antihumano acoplado a Alexa-Fluor-488 (Jackson Laboratories) y 5 µg/ml de tinción Hoechst (Invitrogen) durante 30 minutos sobre hielo. Las señales de fluorescencia de la superficie celular se cuantificaron utilizando un generador de imágenes de alto contenido Celllnsight (Thermo Fisher Scientific). La figura 9 muestra que los anticuerpos de la variante CP-870,893 tienen señales de la superficie celular fuertemente reducidas tras una hora de incubación en condiciones que permiten la internalización. En cambio, la incubación de muchos de los anticuerpos anti-CD40 de acuerdo con la invención en las mismas condiciones solo da lugar a una reducción menor de las señales de la superficie celular, lo que indica tasas de internalización limitadas.

[0156] Ejemplo 8: Correlación de la inducción de genes indicadores y la actividad de maduración de células dendríticas de anticuerpos humanizados anti-CD40

[0157] a. Se realizaron ensayos de gen indicador celular (HEK-Blue-CD40L<™>) y de maduración de células dendríticas (DC) como se describe en los ejemplos 2 y 5, respectivamente. Los anticuerpos se utilizaron a 5 µg/ml para el ensayo de DC y a concentraciones en el intervalo de 13 a 20000 ng/ml en el ensayo del gen indicador HEK-Blue-CDA40L<™>. La figura 10 compara la inducción máxima observada en el ensayo del gen indicador con la liberación de la citocina IL12p40 por las DC tras la estimulación con 5 µg/ml de los anticuerpos. Mientras que los 88 anticuerpos humanizados anti-CD40-IgG1-LALA inducen la expresión de genes indicadores en grados similares, algunos anticuerpos muestran una estimulación muy elevada de la liberación de IL12p40 por las DC. Las células HEK-Blue-CD40L<™>no expresan receptores Fcγ. El ensayo consiste en capturar las actividades agonistas básicas de los anticuerpos anti-CD40 independientemente de la unión al receptor Fcγ. Las DC expresan receptores Fcγ y las actividades agonistas de los anticuerpos anti-CD40, tales como CP-870,893, dependen de la unión al receptor Fcγ (ejemplo 5). No obstante, mientras que la mayoría de los 88 anticuerpos IgG1-LALA carecen de una fuerte activación de las DC, una fracción menor puede inducir una activación muy fuerte de las DC sin reticulación mediada por receptores Fcγ. Por lo tanto, un anticuerpo anti-CD40 altamente agonista, cuya actividad sobre las células dendríticas primarias es independiente de la reticulación del receptor Fcγ, es un caso raro y la identificación requiere cribar un gran número de anticuerpos candidatos con actividades agonistas básicas.

[0158] Ejemplo 9: Estimulación de receptores coestimuladores y liberación de citocinas en células dendríticas por anticuerpos agonistas anti-CD40

[0159] a. Para probar la actividad de los anticuerpos agonistas humanizados anti-CD40 IgG1-LALA a la hora de estimular la expresión de receptores coestimuladores y la liberación de citocinas inflamatorias por las DC, se generaron DC inmaduras derivadas de monocitos (iDC) a partir de tres donantes independientes, como se describe en el ejemplo 5. Las iDC se trataron con los anticuerpos a una concentración de 2 µg/ml o CD40L (R&D Systems 6245-CL-050) a 20 µg/ml durante 48 h. Se recogieron las DC maduras estimuladas, se tiñeron utilizando anticuerpos marcados con fluoróforo contra HLA-DR, CD86, CD80, CD83, CD54 y CD95 (todos de Miltenyi Biotech) y se analizaron por citometría de flujo en un dispositivo BD FACSVerse. La figura 11 muestra la estimulación de la expresión del receptor como múltiplo de inducción sobre el tratamiento con anticuerpos de control de isotipo. Los datos demuestran una fuerte inducción de los receptores coestimuladores, en particular CD86. CP-870,893 muestra una actividad global inferior en comparación con los anticuerpos MAB-16-0262, MAB-16-0451, MAB-16-0464 y MAB-16-0406 de la invención. Se observa una reducción adicional de la actividad cuando se utiliza una variante CP-870,893 que contiene una parte constante IgG1-LALA, lo que confirma la dependencia de la unión al receptor Fcγ de este anticuerpo.

[0161] b. La figura 12 muestra los resultados de las mediciones de citocinas en los sobrenadantes de los cultivos de DC utilizando un kit de matriz de microesferas citométricas inflamatorias humanas de BD (BD n.º 551811) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos MAB-16-0262, MAB-16-0451, MAB-16-0464 y MAB-16-0406 de la invención muestran niveles muy altos de liberación de IL-12-p40 e IL-12p70, mientras que otras citocinas, p. ej., TNF-α, IL-1β, IL-10 e IL-6 se producen y secretan en mucha menor medida. La liberación de IL-12p40 e IL12p70 de las DC tratadas con las variantes CP-870,893 IgG2 e IgG1 es significativamente inferior en comparación con la liberación observada con los anticuerpos de la invención. En experimentos similaresin vitrose trataron iDC diferenciadas de tres donantes independientes con anticuerpos agonistas anti-CD40 durante 48 horas a concentraciones en el intervalo de 10000 a 5 ng/ml. La expresión de receptores y la liberación de citocinas se analizaron como se ha descrito anteriormente. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizando Excel (Microsoft) y XLfit (IDBS). Los datos presentados en las figuras 13 y 14 ilustran los efectos dependientes de la dosis observados en un donante. Los resultados de otros dos donantes mostraron efectos cualitativamente similares. En resumen, la potencia de los anticuerpos humanizados anti-CD40 de la invención, determinada por los valores de CE<50>, es similar a la de CP-870,893, mientras que el efecto inducido máximo, en particular sobre la liberación de citocinas IL-12 y la expresión de correceptores, es significativamente mayor que la de CP-870,893.

[0163] Ejemplo 10: Estimulación de receptores coestimuladores en linfocitos B por anticuerpos agonistas anti-CD40

[0164] a. La estimulación de los receptores coestimuladores por anticuerpos humanizados anti-CD40 IgG1-LALA también se probó en linfocitos B. Las PBMC de tres donantes diferentes se aislaron de la capa leucocitaria humana mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll y los linfocitos B intactos se purificaron mediante enriquecimiento magnético negativo utilizando un kit de aislamiento de linfocitos B II (Miltenyi Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estimularon 2x10<5>células B en 100 µl de RPMI-1640 10 % de Suero AB Humano con una concentración de anticuerpos en el intervalo de 500 a 0,2 ng/ml durante 48 h. Se recogieron los linfocitos B estimulados, se tiñeron utilizando anticuerpos marcados con fluoróforo contra HLA-DR, CD86 y CD80 (todos de Miltenyi Biotech) y se analizaron por citometría de flujo en un dispositivo BD FACSVerse. La figura 15 muestra la estimulación dependiente de la dosis de la expresión del receptor en linfocitos B de un donante como múltiplo de inducción sobre el tratamiento con anticuerpos de control de isotipo. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizando Excel (Microsoft) y XLfit (IDBS). Los resultados demuestran que los anticuerpos de la invención también estimulan los receptores coestimuladores en los linfocitos B, sin embargo, el nivel de regulación es inferior al observado en las DC.

[0165] Ejemplo 11: Competencia de CD40L con el anticuerpo anti-CD40 que se une a CD40 en las células

[0167] a. Se ensayó la unión de anticuerpos anti CD40 de la invención a células HEK-Blue-CD40L<™>en presencia de CD40L para verificar si los anticuerpos se unen al sitio de unión de CD40L de CD40 de la superficie celular. Las células HEK-Blue-CD40L<™>se preincubaron con anticuerpos a su concentración de unión CE<90>durante 30 minutos a 40 °C. Se añadió CD40L que contenía un marcador Fc de lgG2a de ratón (AB Biosciences) a una concentración en el intervalo 10000 a 9,8 ng/ml y las células se incubaron durante 60 minutos a 4 °C. Los anticuerpos anti-CD40 y el CD40L unido al CD40 expresado por las células se detectaron utilizando IgG secundaria anti-ratón conjugada con DyLight 405 e IgG antihumano conjugada con Alexa Fluor 488 (Jackson Laboratories) y se analizaron utilizando el instrumento FACSVerse (BD). La figura 16A muestra una unión estable de las concentraciones de anti-CD40 excepto para CP-870,893, cuya señal de unión del anticuerpo disminuye ligeramente a concentraciones más altas de CD40L. CD40L se une a las células de una manera dependiente de la dosis y CP-870,893 no interfiere significativamente con la unión de CD40L (figura 16B). En cambio, los anticuerpos de la invención impiden fuertemente la unión de CD40L a CD40 expresado por las células, lo que indica que estos anticuerpos se unen al sitio de unión de CD40L a CD40 y bloquean la unión de CD40L a CD40 (figura 16B).

[0169] Ejemplo 12: Inducción de la expresión del receptor de muerte FasR (CD95) por anticuerpos anti-CD40 agonistas junto con CD40L

[0170] a. Para comprobar la interferencia de CD40L con los efectos mediados por anticuerpos anti-CD40 en las células, se trataron células Ramos con CD40L solo o junto con anticuerpos agonistas anti-CD40. Se sembraron las células Ramos en placas de 96 pocillos en RPMI con un 10 % de FCS a una densidad celular de 1,25 x 10<6>células/ml. Se añadieron anticuerpos a los pocillos a una concentración de 10 µg/ml y se incubó la placa durante 10 minutos a 37 °C, CO<2>al 5 %, 95 % de humedad. A continuación, se añadió CD40L (R&D Systems) a algunos pocillos hasta una concentración final de 10 µg/ml y se incubó la placa durante una noche a 37 °C, CO<2>al 5 % y 95 % de humedad. Las células se lavaron con DPBS y se tiñeron con un anticuerpo marcado con FITC contra CD95 (Miltenyi Biotech). La figura 17 muestra que la inducción de CD95 por CP-870,893 se incrementa fuertemente por la adición de CD40L, mientras que el cotratamiento de todos los anticuerpos anti-CD40 probados de la invención reducen el efecto de CD40L. Los datos indican que los anticuerpos agonistas anti-CD40 de la invención que se unen a la unión de CD40L sobre CD40, impiden los efectos sinérgicos y aditivos de CD40L y, por tanto, posibilitan una farmacología controlada y segura.

[0172] Ejemplo 13: Afinidades de anticuerpos agonistas humanizados anti-CD40 IgG1-LALA

[0174] a. Las afinidades bioquímicas de los anticuerpos de la invención se determinaron mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial. Los anticuerpos se inmovilizaron de forma reversible en la superficie de un chip sensor CM5 mediante un anticuerpo Fc anti-humano. La cinética de la interacción de los anticuerpos inmovilizados con la proteína monomérica CD40 soluble humana o de macaco cangrejero (Acro Biosystems) se analizó en un instrumento SPR Biacore T200. Los datos cinéticos se determinaron utilizando un modelo de unión 1:1 de Langmuir. La figura 18 demuestra que los anticuerpos MAB-16-0451 y MAB-16-0464 tienen una K<D>de 1,2 y 2,6, mientras que MAB-16-0262 y CP-870,893 muestran valores de K<D>de 15,7 u 8,9, respectivamente. Los valores de K<D>generados utilizando la proteína CD40 de macaco cangrejero demuestran afinidades similares.

[0176] Ejemplo 14: Unión competitiva de anticuerpos anti-CD40 a CD40

[0178] a. Para comprobar si los anticuerpos agonistas humanizados anti-CD40 de la invención se unen a regiones solapadas en la molécula de CD40, se realizó un ELISA de unión competitiva. Los anticuerpos se recubrieron en placas Maxisorp de 384 pocillos a una concentración de 625 ng/ml en PBS durante 60 minutos, seguido de un paso de bloqueo con PBS, BSA al 2 %, Tween al 0,05 % durante 70 minutos. Todos los anticuerpos se incubaron por separado a una concentración de 10 µg/ml en tubos junto con 330 ng/ml de proteína CD40 recombinante marcada con HIS (Acro Biosystems) y 4 µg/ml de anticuerpo de detección anti-HIS acoplado a peroxidasa (Sigma-Aldrich) durante 60 minutos en tampón de ELISA (PBS, BSA al 0,5 %, Tween al 0,05 %). La placa se lavó tres veces con PBS, Tween al 0,1 % antes de añadir las mezclas de anticuerpo/HIS-CD40/anti-HIS-peroxidasa a los pocillos de la placa. La placa se incubó durante 60 minutos. Los pocillos se lavaron seis veces con PBS, Tween al 0,1 % y se añadieron 15 µl/pocillo de solución de sustrato TMB (Invitrogen). La reacción se detuvo con 15 µl/pocillo de solución de parada (HCl 1 M) y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 y 620 nm utilizando un lector de microplacas Tecan M1000. La figura 19 demuestra que los anticuerpos de la invención no compiten con CP-870,893 por la unión a CD40. Cada anticuerpo, sin embargo, compite con cualquier otro anticuerpo de la invención, lo que demuestra que estos anticuerpos se unen a la misma región de CD40. Cabe destacar que, dado que las actividades agonistas de los anticuerpos de la invención cubren un amplio intervalo (ejemplos 9 y 10), esto demuestra que los parátopos de los anticuerpos anti-CD40 agonistas determinan principalmente la actividad agonista de los anticuerpos anti-CD40.

[0180] Ejemplo 15: Función efectora mediada por anticuerpos anti-CD40 IgG1-LALA

[0182] a. Para probar la potencia de una mutación LALA en la parte constante de un anticuerpo IgG1 para disminuir la función efectora mediada por anticuerpos, por ejemplo, la ADCC, se ha aplicado un ensayo basado en una línea celular indicadora de células efectoras Jurkat (Promega ADCC Bioassay, n.º G701A) según las instrucciones del fabricante y utilizando células HEK-Blue-CD40L<™>como células diana. Se sembraron 5000 células HEK-Blue-CDA40L<™>por pocillo en una placa de ensayo blanca de fondo plano de 384 pocillos en 25 µl de DMEM 10 % de FCS y se incubaron 20 h a 37 °C, CO<2>al 5 %. El medio se sustituyó por 8 µl de medio RPMI con un 4 % de FCS con bajo contenido en IgG antes de añadir 4000 células efectoras por pocillo en 8 µl del mismo medio. Finalmente, los anticuerpos anti-CD40 CP-870,893, que contenían una parte Fc IgG1 o IgG1-LALA, se añadieron en 8 µl de medio a concentraciones en el intervalo de 10000 a 0,002 ng/ml. La placa se incubó durante 6 h a 37 °C. CO<2>al 5 %. La actividad de la luciferasa de las células efectoras se midió utilizando reactivos para ensayos de luciferasa BioGlo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando un lector de microplacas Tecan M1000. El múltiplo de inducción se calculó con la fórmula URL (tratamiento con anticuerpos - fondo) / URL (vehículo - fondo). Las curvas de ajuste se obtuvieron utilizando Excel (Microsoft) y XLfit (IDBS). La figura 20 demuestra que la mutación LALA en IgG1 anula la señalización mediada por el receptor Fc en las células efectoras.

[0184] Ejemplo 16: Seguridad del tratamiento con anticuerpos agonistas anti-CD40 en un modelo de ratón humanizado

[0185] a. Para evaluar la seguridad, se utilizó un modelo de ratón humanizado con células madre. Los ratones Nod/Scid/gamma(c)(null) FcRg -/- carecen de receptores Fc activadores de ratón. Por lo tanto, la unión de anticuerpos terapéuticos al receptor Fc por parte de células inmunitarias humanas no se ve comprometida por la unión al receptor Fc de ratón en este modelo. Se irradió a los ratones con 1,4 Gy en las primeras 24 horas después del nacimiento. Después de 4-6 horas, se injertó en los ratones por vía i.v. 20000 - 50000 células madre hematopoyéticas humanas aisladas de sangre de cordón umbilical.12 semanas después del injerto, se validó la presencia de células inmunitarias humanas mediante citometría de flujo de células de sangre periférica. A los ratones humanizados con éxito se les inyectó una vez por vía i.v.3 µg/g de CP-870,893, MAB-16-0451 o anticuerpo de control de isotipo. Se midieron el peso corporal y la temperatura antes del tratamiento y en diferentes momentos tras la inyección de anticuerpos (figura 21). Los datos muestran una reducción significativa de la temperatura corporal en 3 de los 6 ratones tratados con CP-870,893 y se tuvo que sacrificar a estos ratones debido a un deterioro grave de las condiciones corporales. En cambio, los ratones tratados con MAB-16-0451 no mostraron efectos significativos sobre la temperatura corporal, ni había ningún otro signo evidente de deterioro del estado corporal. Esto indica que los anticuerpos anti-CD40-IgG1-LALA altamente agonistas que carecen de actividad de unión al receptor Fc, pueden aplicarse terapéuticamente sin signos evidentes de toxicidad, mientras que los efectos tóxicos de los menos activos, el anticuerpo agonista CP-870,893-IgG2, pudo demostrarsein vivoen este modelo.

[0186] Leyendas de las figuras

[0187] Fig.1: Unión celular

[0188] Se comprobó la unión de los anticuerpos monoclonales anti-CD40 IgG1-LALA al antígeno CD40 expresado en células HEK-Blue-CD40L<™>(InvivoGen). Los valores de CE<50>demuestran la potente unión de los anticuerpos ensayados.Fig.2: Determinación de la CE50 de HEK-Blue en análisis de 8 puntos

[0189] La actividad agonista de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA se probó en un ensayo celular de gen indicador NF-kB. Las células HEK-Blue-CD40L<™>(InvivoGen) se incubaron durante 24 horas con diferentes concentraciones de los anticuerpos. Los valores de CE<50>demuestran la potencia de los anticuerpos para inducir la señalización de NF-kB.

[0190] Fig.3: Competencia de epítopo del ligando de CD40

[0191] Para comprobar si los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA se unen a un epítopo que solapa con el sitio de unión a CD40L, se realizó un ELISA de competición de CD40L. Se preincubaron diferentes concentraciones de anticuerpos anti-CD40 con la proteína recombinante CD40 para formar un complejo de unión. Posteriormente, el complejo se añadió a placas de microtitulación recubiertas con CD40L recombinante. Después de lavar, los complejos CD40-anti-CD40 unidos se detectaron utilizando un anticuerpo anti-F(ab)2 humano ligado a peroxidasa. Las señales ELISA como para el anticuerpo de referencia CP-870,893 indican que no hay competencia con CD40L y, por lo tanto, se une a un epítopo distinto del sitio de unión de CD40L. Los datos demuestran que los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA probados se unen a un epítopo que se solapa con el sitio de unión de CD40L.

[0192] Fig.4: Actividad de unión a CD40 de macaco cangrejero

[0193] La actividad de unión de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA a macaco cangrejero (Macaca fascicularis) se probó en un ELISA utilizando proteína CD40 recombinante de macaco cangrejero (Acro Biosystems). Los valores de CE<50>indican una unión potente de los anticuerpos. n.d. = no detectable en el intervalo de concentración analizado

[0194] Fig.5 a) b): Inducción de la maduración de células dendríticas

[0195] Para probar la actividad agonista de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA en células diana primarias, se analizó la maduración de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos. Las células dendríticas inmaduras, que se diferenciaronin vitroa partir de monocitos, se incubaron durante 48 h con anticuerpos agonistas anti-C40 a una concentración de 5 µg/ml. Posteriormente, se cuantificó la IL12p40 secretada procedente de células dendríticas en el sobrenadante del medio mediante ELISA bioquímico.

[0196] Fig.6: Maduración de células dendríticas

[0197] Se determinó la actividad de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA para estimular la secreción de IL12p40 por las células dendríticas a diferentes concentraciones de anticuerpo y se comparó la actividad con la de los anticuerpos CP-870,893 que portaban diferentes partes Fc (IgG1, IgG1-LALA, IgG2 e IgG1-V11). Los anticuerpos se incubaron durante 48 h con células dendríticas inmaduras diferenciadasin vitro. La liberación de IL12p40 se midió mediante ELISA.

[0198] Fig.7: Determinación de la CE50 de anticuerpos anti-CD40 en la maduración de células dendríticas

[0199] Los valores de CE<50>de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA en la secreción de IL12p40 mediada por células dendríticas se determinaron probando concentraciones de anticuerpos que estaban en el intervalo de 10 - 0,005 µg/ml. Los anticuerpos se incubaron durante 48 h con células dendríticas inmaduras diferenciadasin vitro. La liberación de IL12p40 se midió mediante ELISA.

[0200] Fig.8: Ensayo de liberación de citocinas

[0201] Los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA se probaron en ensayos de liberación de citocinas en PBMC de alta densidad a 10 µg/ml para determinar la inducción general de citocinas inflamatorias, tales como TNF-alfa. Los datos indican que, a diferencia del anticuerpo anti-CD3 (OKT3), los anticuerpos anti-CD40 no inducen una secreción significativa de TNF-alfa.

[0202] Fig.9: Ensayo celular de pulso-caza de anticuerpos

[0203] La dinámica de unión e internalización del anticuerpo se comprobó en un ensayo celular de pulso-caza. Los anticuerpos se incubaron con cultivos celulares HEK-Blue-CD40L<™>durante 15 min a una concentración de 0,8 µg/ml. Después de lavar, se dejó que los anticuerpos se internalizasen durante 60 min antes de lavar de nuevo las células y el anticuerpo anti-CD0 localizado en la superficie celular se detectó mediante un anticuerpo secundario marcado con Alexa-488. En condiciones que no permitían la internalización, las células se trataron de forma similar, pero los anticuerpos se incubaron solo durante 15 min, seguido de lavado e incubación con anticuerpos secundarios. Los datos muestran que en condiciones que permiten la internalización, las señales de los anticuerpos localizados en superficie se reducen en distinta medida para los anticuerpos monoclonales humanizados anti-CD40 IgG1-LALA probados. Se observa una fuerte reducción de la señal para todas las isoformas del anticuerpo CP-870,893.

[0204] Fig.10: Correlación de la inducción de genes indicadores y la actividad de maduración de células dendríticas de anticuerpos humanizados anti-CD40

[0205] Se comprobó la actividad de 88 anticuerpos humanizados anti-CD40 IgG1-LALA en un gen indicador HEK-Blue y en un ensayo de maduración de células dendríticas. La actividad del gen indicador HEK-Blue se cuantifica mediante la DO a 655 nm en correlación con la secreción inducida de SEAP, la maduración de las células dendríticas se cuantifica mediante la liberación de IL12p40 (ELISA).

[0206] Fig. 11: Estimulación de receptores coestimuladores en células dendríticas por anticuerpos agonistas anti-CD40

[0207] Las iDC inmaduras diferenciadasin vitrose estimularon con anticuerpos agonistas anti-CD40, anticuerpos de control de isotipo o CD40L durante 48 horas. La expresión de moléculas receptoras coestimuladoras se midió mediante citometría de flujo. Las intensidades medias de fluorescencia se normalizaron con respecto a los tratamientos de control de isotipo o, en el caso de CD40L a las muestras no tratadas. La inducción de la expresión se expresa como múltiplo de inducción (MI) sobre el tratamiento de control.

[0208] Fig.12: Liberación de citocinas por células dendríticas tratadas con anti-CD40

[0209] Las iDC inmaduras diferenciadasin vitrose estimularon con anticuerpos agonistas anti-CD40, anticuerpos de control de isotipo o CD40L durante 48 horas. La liberación de citocinas se midió mediante ELISA (IL-12p40) o mediante citometría de flujo utilizando una matriz de microesferas citométricas de BD.

[0210] Fig. 13: Estimulación dependiente de la dosis de receptores coestimuladores en células dendríticas por anticuerpos agonistas anti-CD40

[0211] Se estimularon iDC inmaduras diferenciadasin vitrocon anticuerpos anti-CD40 agonistas o anticuerpos de control de isotipo durante 48 horas a concentraciones en el intervalo de 10000 a 5 ng/ml. La expresión de moléculas receptoras coestimuladoras se midió mediante citometría de flujo. Las intensidades medias de fluorescencia se normalizaron con respecto a los tratamientos de control de isotipo. La inducción de la expresión se expresa como múltiplo de inducción (MI) sobre el tratamiento de control. Los valores de CE50calculados se presentan en la tabla.

[0212] Fig.14: Liberación de citocinas dependiente de la dosis por células dendríticas tratadas con anti-CD40Las iDC inmaduras diferenciadasin vitrose estimularon con anticuerpos agonistas anti-CD40 y anticuerpos de control de isotipo durante 48 horas. La liberación de citocinas se midió mediante citometría de flujo utilizando una matriz de microesferas citométricas BD.

[0213] Fig.15: Estimulación dependiente de la dosis de receptores coestimuladores en linfocitos B por anticuerpos agonistas anti-CD40

[0214] Los linfocitos B se estimularon con anticuerpos agonistas anti-CD40 o anticuerpos de control de isotipo durante 48 horas a concentraciones en el intervalo de 500 a 0,2 ng/ml. La expresión de moléculas receptoras coestimuladoras se midió mediante citometría de flujo. Las intensidades medias de fluorescencia se normalizaron con respecto a los tratamientos de control de isotipo. La inducción de la expresión se expresa como múltiplo de inducción (MI) sobre el tratamiento de control. Los valores de CE50 calculados se presentan en la tabla.

[0215] Fig.16: Competencia de los anticuerpos anti-CD40 con la unión de CD40L a CD40 expresado por célulasLas células HEK-Blue-CD40L<™>se preincubaron con anticuerpos anti-CD40-IgG1-LALA a concentraciones CE<90>antes de añadir CD40L en concentraciones en el intervalo de 10000 a 9,8 ng/ml. Los anticuerpos anti-CD40 y la unión de CD40L a CD40 expresada en la superficie celular se detectaron utilizando diferentes anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos.

[0216] Fig.17: Inducción de la expresión del receptor de muerte FasR (CD95) por anticuerpos anti-CD40 agonistasjunto con CD40L

[0217] Las células de linfoma B Ramos se estimularon durante una noche con CD40L solo o junto con anticuerpos agonistas anti-CD40 o anticuerpos de control de isotipo. La expresión de CD95 se cuantificó mediante citometría de flujo, el aumento de la expresión se expresa como múltiplo de inducción (MI) respecto al tratamiento de control.

[0218] Fig.18: Afinidades de anticuerpos agonistas humanizados anti-CD40 IgG1-LALA

[0219] Las afinidades bioquímicas se midieron mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento SPR Biacore T200. Los datos cinéticos se determinaron utilizando un modelo de unión 1:1 de Langmuir.

[0220] Fig.19: Competencia de anticuerpos en la unión de CD40

[0221] Unión de una mezcla preincubada de proteína CD40 marcada con HIS y diferentes anticuerpos anti-CD40 a placas recubiertas con diferentes anticuerpos anti-CD40. La unión consecutiva de ambos anticuerpos anti-CD40 se detecta mediante anticuerpos anti-HIS marcados con POD.

[0222] Fig.20: Función efectora mediada por anticuerpos anti-CD40 IgG1-LALA

[0223] Se analizó la función efectora mediada por anticuerpos anti-CD40 utilizando una línea celular efectora Jurkat con gen indicador de luciferasa y HEK-Blue-CD40L<™>como células diana. Los anticuerpos IgG1-LALA o IgG1 anti-CD40 se incubaron en dosis en el intervalo de 10000 a 0,002 ng/ml con células diana y efectoras durante 6 h. El múltiplo de inducción de la actividad de luciferasa medida indica la activación de células efectoras mediada por anticuerpos anti-CD40.

[0224] Fig.21: Seguridad del tratamiento con anticuerpos agonistas anti-CD40 en un modelo de ratón humanizadoA los ratones Nod/Scid/gamma(c)(null) FcRg -/- se les inyectaron 3 µg/g de anticuerpos MAB-16-0451 o CP-870,893 anti-CD40 el día 0. Se midió la temperatura antes de la inyección y en diferentes momentos después de la misma. Tres ratones tratados con CP-870,893 que mostraron una reducción llamativa de la temperatura corporal tuvieron que ser sacrificados al cabo de 3 días.

[0225] Fig.22: Secuencias (aminoácidos en código de una letra)

[0226] Secuencias completas de regiones variables (VR):

[0228] Cadena pesada: VH completa: SEQ ID NO: 1-14

[0229] Cadena ligera: VL completa: SEQ ID NO: 15-28

[0231] Regiones determinantes de la complementariedad (CDR):

[0233] Cadena pesada: CDR-H1: SEQ ID NO: 29-42

[0235] CDR-H2: SEQ ID NO: 43-56

[0237] CDR-H3: SEQ ID NO: 57-70

[0238] Cadena ligera: CDR-L1: SEQ ID NO: 71-84

[0240] CDR-L2: SEQ ID NO: 85-98

[0242] CDR-L3: SEQ ID NO: 99-112

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal agonista, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor CD40 humano y es capaz de inducir la señalización de CD40 independientemente de la reticulación del receptor CD40 mediada por Fcγ, en donde el anticuerpo comprende

una región variable de cadena pesada (VH) que es al menos un 85 % idéntica a una región VH de SEQ ID NO: 5 y comprende una región CDR1H de SEQ ID NO: 33, una región CDR2H de SEQ ID NO: 47 y una región CDR3H de SEQ ID NO: 61; y

una región variable de cadena ligera (VL) que es al menos un 85 % idéntica a una región VL de SEQ ID NO: 19 y comprende una región CDR1L de SEQ ID NO: 75, una región CDR2L de SEQ ID NO: 89 y una región CDR3L de SEQ ID NO: 103.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es una IgG1LALA humanizada que comprende al menos sustituciones de aminoácidos en L234A y L235A de la región Fc de IgG1 humana, en donde la numeración es de acuerdo con el sistema de numeración de EU.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende al menos sustituciones de aminoácidos en S228P y L235E de la región Fc de IgG4 humana, en donde la numeración es de acuerdo con el sistema de numeración de EU.

4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que se solapa con el sitio de unión de CD40L.

5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo activa las APC humanas.

6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo activa células seleccionadas del grupo que comprende células dendríticas (DC), linfocitos B, monocitos, células mieloides y células tumorales.

7. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo tiene un efecto citotóxico indirecto mediado por células inmunitarias en las células tumorales.

8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene al menos una de las características adicionales:

(a) no se une al receptor Fcγ;

(b) tiene una afinidad de unión celular a CD40 con un valor de CE50 igual o inferior a 49,5 ng/ml;

(c) tiene valores de KD iguales o inferiores a 15,7 nM;

(d) tiene reactividad cruzada con CD40 de macaco cangrejero con un valor de KD igual o inferior a aproximadamente 10,3 nM;

(e) inhibe CD40L uniéndose a CD40;

(f) impide los efectos sinérgicos y aditivos de las funciones mediadas por CD40L;

(g) induce la maduración de las células presentadoras de antígeno, determinada por la liberación de IL12p70, con un valor de CE<50>igual o inferior a 208 ng/ml

y/o determinada por la inducción de CD86 en células dendríticas en al menos 7,5 veces y con una CE<50>igual o inferior a 148 ng/ml; y/o

(h) reduce el nivel de CD40 en la superficie celular en menos del 50 %.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende

una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 5, y

una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 19.

10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer.

11. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer es un tumor sólido.

12. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de páncreas, carcinoma pancreático avanzado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células broncoalveolares, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de riñón, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de glándulas salivales o cáncer de útero.

13. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el anticuerpo se utiliza en el tratamiento del cáncer en combinación con agentes citotóxicos o citostáticos, radioterapia, terapia dirigida, inmunoterapia o cirugía convencional.

14. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.