ES3058169T3 - Methods for the preparation of culture media based on saccharified plant extracts and related products - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la preparación rentable y sostenible de medios de cultivo celular o medios de fermentación y sus concentrados líquidos o secos. El método comprende los pasos de: a) proporcionar una planta que contiene almidón; b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño medio de partícula de 500 μm o menos para obtener un puré; c) someter el puré molido a una separación de fases que resulta en una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida; e) recombinar las fases procesadas por separado; y f1) añadir agua a las fases recombinadas para obtener el medio de cultivo celular o medio de fermentación, o f2) someter la al menos una fase líquida o las fases recombinadas a un paso de secado y/o concentración para obtener el suplemento para un medio de cultivo celular o medio de fermentación; donde, en el paso d), la fase sólida separada se somete a un paso de sacarificación. También se describen los productos obtenidos mediante los métodos mencionados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos para la preparación de medios de cultivo a base de extractos vegetales sacarificados y productos relacionados

[0003] Campo de la invención

[0004] Esta invención se refiere a métodos y/o técnicas para una preparación rentable y sostenible de medios de cultivo celular complejos o medios de fermentación a base de plantas que contienen almidón sacarificado.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Los medios de cultivo son una fuente de nutrientes y factores de crecimiento necesarios para el crecimiento de microorganismos y célulasex vivoen condiciones de laboratorio.

[0007] Muchos tipos de medios de cultivo, que pueden clasificarse en función de su composición nutricional, consistencia o su uso en laboratorios de ciencias de la vida, se han desarrollado para cultivar microorganismos selectivos o deseados, células o plantas pequeñas.

[0008] Normalmente, se está haciendo una distinción general entre medios definidos e indefinidos.

[0009] Un medio definido (también conocido como medio químicamente definido o medio sintético) es un medio químicamente caracterizado producido a partir de sustancias químicas puras, en donde no hay presente levadura, tejido animal o vegetal. Siempre que se defina su composición, dichos medios también pueden prepararse usando extractos vegetales purificados, tales como proteínas vegetales (véase el documento WO 2021/148955 A1) o lípidos y péptidos vegetales (véase el documento WO 98/15614).

[0010] Por otro lado, un medio indefinido (es decir, un medio basal o complejo) se caracteriza porque contiene una fuente de carbono, agua, diversas sales, una fuente de aminoácidos y nitrógeno en cantidades desconocidas. Como ejemplo, la adición de suplementos orgánicos de origen natural (es decir, agua de coco, extracto de levadura, extracto de malta, extracto de patata, homogenato de banana, compuestos algales) para preparar medios de cultivo de plantas indefinidas se reseña en la publicación Z. Molnáret al, Acta Biologica Szegediensis 2011, 55(1), 123-127. El documento US 2011/0212489 A1 divulga un medio de cultivo que comprende un hidrolizado de semillas de plantas que contiene proteínas y aceite (incluidas semillas de girasol). El documento US 2004/0185561 A1 divulga un medio de cultivo celular que comprende un extracto vegetal no hidrolizado (p. ej., de frutos secos, guisantes o patatas) y se comprueba su efecto promotor del crecimiento como parte de un cultivo de células animales, especialmente queratinocitos. Otros ejemplos de medios de cultivo que incorporan extractos vegetales se divulgan en los documentos US 2021/284700 A1 y WO 2014/100685 A1.

[0011] En la tecnología comercial de cultivo celular, los medios de cultivo desempeñan un papel muy importante en la eficacia y la viabilidad económica de los procesos de producción a escala industrial. Las publicaciones recientes sugieren que los cultivos de células vegetales o sus extractos pueden utilizarse como productos alimenticios (véase, p. ej., E. Nordlundet al., Food Res Int.2018, 107, 297-305 y R. Eiblet al., Appl. Microbiol. Biotechnol.2018, 102, 8661-8675) y fabricarse con menos energía y menor impacto posible en el medio ambiente en comparación con las plantas enteras, e independientemente de la ubicación y la estación del año. Sin embargo, el uso de medios de cultivo celular definidos requiere protocolos de purificación elaborados y/o productos químicos con un alto grado de pureza, que es un factor de coste importante a la hora de transferir dichos procesos a una escala comercialmente relevante. Mientras que la adición de suplementos orgánicos procedentes de fuentes naturales (p. ej., para preparar medios de cultivo vegetales indefinidos) puede influir ventajosamente en la supervivencia de las células, la adhesión y la proliferación, sigue siendo deseable producir eficazmente medios de cultivo que contengan macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, aminoácidos o suplementos de nitrógeno, fuente(s) de carbono y reguladores del crecimiento a costes de procesamiento reducidos.

[0012] Además, teniendo en cuenta que los medios de cultivo comunes utilizados en el sector de la ciencia de los alimentos suelen derivarse de la ciencia farmacéutica, con un conjunto diferente de requisitos legales para su aprobación, una transferencia directa de dichas tecnologías a la ciencia de los alimentos comerciales para la preparación de alimentos basados en cultivos celulares es un reto importante (debido a la declaración necesaria como nuevo alimento, por ejemplo). Por ejemplo, la adición de suplementos hormonales para el control de la diferenciación celular puede ser objeto de declaración en función de la aplicación y la región.

[0013] Por consiguiente, sería deseable proporcionar medios de cultivo para aplicaciones alimentarias que puedan producirse de forma sostenible y económica, y que no dependan únicamente de la síntesis químicain vitrode tales aditivos hormonales.

[0014] El documento DE 102004026152 A1 divulga un proceso para la biosíntesis de sustancias químicas que implica la licuefacción y sacarificación de plantas que contienen almidón para proporcionar una fuente de carbono para la fermentación de precisión. Otros ejemplos de materiales sacarificados derivados de plantas que contienen almidón se divulgan en los documentos EP 3556 222 A1 y JP 2008-000100 A. Sin embargo, los procesos de licuefacción y sacarificación del almidón normalmente implican condiciones duras, es decir, altas temperaturas (muy por encima del punto de gelificación del almidón) a las que se descomponen los componentes termolábiles de la planta que contiene almidón. Por lo tanto, sigue siendo deseable proporcionar un proceso para la preparación de medios de cultivo, que conserva los componentes termosensibles (p. ej., antioxidantes y vitaminas) de la planta, haciendo que los medios producidos de este modo sean útiles para una gama más amplia de aplicaciones.

[0015] Compendio de la invención

[0016] La presente invención resuelve este objetivo con la materia objeto de las reivindicaciones tal como se definen en el presente documento. Las ventajas de la presente invención se explicarán con más detalle en la sección siguiente y otras ventajas serán evidentes para el experto en la técnica al considerar la divulgación de la invención.

[0017] En términos generales, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de un medio de cultivo celular o un medio de fermentación, que comprende: a) proporcionar una planta que contiene almidón; b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño de partícula medio de 500 µm o inferior para proporcionar un puré; c) someter el puré molido a una separación de fases que dé lugar a una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida; e) recombinar las fases procesadas por separado; y f1) añadir agua a las fases recombinadas para proporcionar el medio de cultivo celular o el medio de fermentación; en donde, en la etapa d), la fase sólida separada se somete a una etapa de sacarificación; y en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 55 °C superiores.

[0018] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un suplemento para un medio de cultivo celular o un medio de fermentación, que comprende: a) proporcionar una planta que contiene almidón; b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño de partícula medio de 500 µm o inferior para proporcionar un puré; c) someter el puré molido a una separación de fases que dé lugar a una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida; e) recombinar las fases procesadas por separado; y f2) someter la al menos una fase líquida o las fases recombinadas a una etapa de secado y/o concentración para proporcionar el suplemento para un medio de cultivo celular o un medio de fermentación; en donde, en la etapa d), la fase sólida separada se somete a una etapa de sacarificación; y en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 55 °C superiores.

[0019] Breve descripción de los dibujos

[0020] La FIG.1 es un diagrama de flujo que ilustra ejemplos de los métodos según la primera y la segunda realización de la presente invención.

[0021] Descripción detallada de la invención

[0022] Para una comprensión más completa de la presente invención, ahora se hace referencia a la siguiente descripción de las realizaciones ilustrativas de la misma:

[0023] Métodos para la preparación de medios de cultivo celular o de fermentación

[0024] En una primera realización, la presente invención se refiere, en general, a un método para la preparación de un medio de cultivo celular o medio de fermentación, que comprende: a) proporcionar una planta que contiene almidón; b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño de partícula medio de 500 µm o inferior para proporcionar un puré; c) someter el puré molido a una separación de fases que dé lugar a una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida; e) recombinar las fases procesadas por separado; y f1) añadir agua a las fases recombinadas para proporcionar el medio de cultivo celular o el medio de fermentación; en donde, en la etapa d), la fase sólida separada se somete a una etapa de sacarificación; y en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 55 °C superiores.

[0025] En una segunda realización, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un suplemento para un medio de cultivo celular o un medio de fermentación, que comprende: a) proporcionar una planta que contiene almidón; b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño de partícula medio de 500 µm o inferior para proporcionar un puré; c) someter el puré molido a una separación de fases que dé lugar a una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida; e) recombinar las fases procesadas por separado; y f2) someter la al menos una fase líquida o las fases recombinadas a una etapa de secado y/o concentración para proporcionar el suplemento para un medio de cultivo celular o un medio de fermentación; en donde, en la etapa d), la fase sólida separada se somete a una etapa de sacarificación; y en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 55 °C superiores.

[0026] La Fig.1 es un diagrama de flujo que ejemplifica un método para la preparación de un medio de cultivo celular o medio de fermentación (según la primera realización) y un método de preparación de un suplemento para un medio de cultivo celular o medio de fermentación (según la segunda realización) según la presente invención.

[0027] Se entenderá que las características preferidas especificadas a continuación con respecto a los métodos de la invención se aplican tanto para el método de la primera como de la segunda realización, excepto las características que se excluyen mutuamente.

[0028] Los términos "cultivo" o "cultivo celular", como se utilizan en el presente documento, se refieren al mantenimiento, crecimiento y/o diferenciación de células en un entornoin vitro.

[0029] "Fermentación", como se utiliza en el presente documento, incluye la fermentación microbiana tradicional, donde los microorganismos convierten el sustrato en productos comestibles, así como una fermentación de precisión, que implica la producción de enzimas o ingredientes proteínicos específicos, por ejemplo, mediante microorganismos.

[0030] Las plantas que contienen almidón para su uso en el método de la presente invención se seleccionan preferiblemente de entre plantas de cultivo, preferiblemente de cereales, legumbres, cultivo oleaginoso, caña de azúcar, remolacha azucarera, tubérculos, frutas y mezclas de los mismos, más preferiblemente de maíz, trigo, legumbres, caña de azúcar, remolacha azucarera, zanahorias, patatas, boniatos, frutas y mezclas de los mismos en vista de los contenidos favorables de fuentes de carbono y sus precursores para usar en medios de cultivo o de fermentación. En este sentido, puede preferirse que la planta tenga un contenido de almidón nativo de al menos el 20 % en peso basado en el peso seco total de la planta.

[0031] En particular, uno o más tipos de plantas pueden usarse para el procesamiento en la presente invención. En algunas realizaciones, puede preferirse que la planta que contiene almidón proporcionada en la etapa a) esté presente en estado inmaduro o que la planta que contiene almidón se combine con una o más plantas en estado inmaduro (p. ej., una microverdura) antes de molerla en la etapa b) para utilizar contenidos relativamente altos de fitohormonas. En consecuencia, al introducir hormonas de crecimiento vegetal, se facilitan los requisitos legales para su aprobación, ya que no se requieren suplementos hormonales adicionales producidos químicamente o refinados.

[0032] Antes de la fase de molienda b), la planta que contiene almidón se lava y/o se esteriliza en superficie preferiblemente. Las etapas de lavado y/o esterilización en superficie no están particularmente limitadas siempre que reduzcan eficazmente la contaminación microbiana de la superficie, y los métodos adecuados pueden incluir la esterilización química (p. ej., con solución de etanol (≥70 % (v/v), 8-hidroxiquinoleína y sus derivados o sales de los mismos, y solución de hipoclorito de sodio (p. ej., al 5 % (v/v)) o similares), lavado con agua esterilizada, esterilización superficial o pasteurización mediante calor y/o irradiación con rayos ionizantes (p. ej., irradiación UV), esterilización por ultrasonidos y combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, la esterilización en superficie se produce mediante la pasteurización por vapor saturado en vacío parcial.

[0033] En la etapa b), la planta que contiene almidón se muele hasta alcanzar un tamaño medio de partícula de 500 µm o inferior. Se prefieren especialmente, además, tamaños de partículas promedio de 200 µm o menos, 100 µm o menos, 90 µm o menos, 50 µm o menos, o incluso 30 µm o menos, para mejorar la liberación de nutrientes en la fase líquida. La molienda de la mezcla puede llevarse a cabo en una o en múltiples etapas. El molino usado para este propósito no está particularmente limitado y puede incluir un molino de pasadores, un molino de martillos, un molino tamizador, un molino coloidal o combinaciones de los mismos (p. ej., en caso de múltiples etapas de molienda). Puede ser preferible el uso de molinos que funcionan mediante el uso de vibración, oscilación y/o rotación a frecuencias ultrasónicas (como, p. ej., un molino coloidal de dientes) en al menos una (sub)etapa de molienda, ya que influye ventajosamente en la eficacia de la extracción, presumiblemente debido a la dinámica de reacción inducida sonoquímicamente. El tamaño de partícula promedio puede medirse como el momento volumétrico medio (D[4,3]) y normalmente se define por todos los tamaños de partícula que contribuyen de acuerdo con su fracción volumétrica colectivamente, de modo que el tamaño de partícula medio en el intervalo se pondera con la porción de volumen correspondiente, y todos estos valores ponderados se promedian aritméticamente. Los tamaños de partícula y su distribución se pueden determinar adecuadamente mediante métodos conocidos en la técnica (p. ej., mediante un analizador de tamaño de partículas). En una realización preferida, la etapa de molienda b) se lleva a cabo a una temperatura inferior a 40 °C y preferiblemente a una temperatura de 0 a 35 °C, tal como, p. ej., inferior o igual a la temperatura ambiente (es decir, 25 °C). En otra realización preferida, la planta que contiene almidón puede someterse a una molienda húmeda, más preferiblemente en presencia de agua, que, opcionalmente, puede enfriarse antes de añadirse para controlar aún más el régimen de temperatura. Tales métodos permiten una elevada liberación de valiosos componentes vegetales en la fase líquida, evitando al mismo tiempo la degradación de los antioxidantes termosensibles, vitaminas y otros agentes biológicamente activos.

[0034] En la etapa c), el puré finamente molido se somete a una separación de fases que da como resultado una fase sólida y una fase líquida. El método de separación de las fases no está particularmente limitado y puede incluir, por ejemplo, filtración, decantación, centrifugación o similares.

[0035] En la etapa d), la fase sólida se procesa independientemente de la fase líquida y se recombina con la fase líquida en la etapa e).

[0036] Como ejemplo, el procesamiento independiente de la fase sólida puede incluir una etapa de filtrado, centrifugación o calentamiento (p. ej., al vacío) de la fase sólida inicialmente separada para eliminar aún más los líquidos restantes, y recombinar dicha fase líquida con la fase acuosa desde la etapa inicial de separación o en una etapa posterior de procesamiento de dichas fases. También, la fase líquida puede someterse a etapas de purificación adicionales, p. ej., mediante procesos de membrana o filtración usando filtros de rotación al vacío para eliminar las partículas finas. Según la presente invención, la fase sólida se procesa independientemente sometiéndola al menos a una etapa de sacarificación, en donde los materiales que contienen carbohidratos (p. ej., materiales amiláceos, materiales celulósicos, materiales lignocelulósicos) se convierten en azúcares de bajo peso molecular, tales como sacarosa y/o glucosa, por ejemplo. El almidón está formado por unidades de α-D(+)-glucosa y, según el tipo de enlaces glucosídicos, se distingue entre amilosa y amilopectina como los bloques de construcción de alto peso molecular del grano de almidón.

[0037] En principio, todos los tipos de almidón son adecuados para la sacarificación. Los gránulos de almidón nativo tienden a ser insensibles a los ácidos o las enzimas a temperatura ambiente. Sin embargo, la reactividad del almidón aumenta al calentarlo en suspensiones acuosas, que tiene como efecto la descomposición de la estructura cristalina del almidón por absorción de agua, dando lugar a una gelatinización. Con este propósito, la suspensión que contiene almidón se calienta normalmente a temperaturas de al menos 70 °C (normalmente entre 90 y 170 °C) durante períodos de tiempo prolongados (al menos 60 minutos, normalmente entre 2-3 horas), a veces a presión elevada. Para compensar el aumento de viscosidad durante tal proceso, la concentración de almidón puede mantenerse baja (mediante dilución previa o por etapas de la suspensión de la fase sólida) o, preferiblemente, el almidón puede hidrolizarse simultáneamente en una etapa de licuefacción, p. ej., mediante la adición de ácidos (p. ej., a un pH de 1 a 4) y/o enzimas, antes de la sacarificación. Algunos ejemplos de enzimas hidrolizantes del almidón incluyen, pero sin limitación, la α-amilasa, amiloglucosidasa (denominada alternativamente glucoamilasa) y variantes de las mismas. Como alternativa, la hidrólisis del almidón puede realizarse mediante métodos de vaporización a alta presión (p. ej., en un vaporizador Henze), en donde se aplican temperaturas de entre 150 y 160 °C y presiones de entre 5 y 6 bar. Sin embargo, en vista de los costes energéticos comparativamente elevados, tales métodos se prefieren menos. Los métodos a baja temperatura, como el denominado proceso de maceración en frío, por ejemplo, son también conocidos y se llevan a cabo a presión ambiente a temperaturas inferiores a 65 °C, pero solo son aplicables a sustratos ricos en amilasa y tienden a dar lugar a grados de hidrólisis sustancialmente inferiores.

[0038] En la etapa de sacarificación, que puede realizarse en una única o en múltiples etapas, se ajusta la composición de carbohidratos. En una realización preferida, la etapa de sacarificación incluye un tratamiento enzimático, tratamiento ácido, irradiación de microondas asistida por catalizador sólido, tratamiento térmico bajo presión, tratamiento con vapor o combinaciones de los mismos.

[0039] El producto sacarificado obtenido de este modo puede purificarse, p. ej., eliminando los sólidos suspendidos mediante filtración.

[0040] En particular, la separación de la fase líquida de la fase sólida en la etapa c) tiene la ventaja de que la fase líquida no se ve afectada por las etapas de procesamiento aplicadas a la fase sólida separada. En consecuencia, la fase líquida no necesita someterse a las duras condiciones de procesamiento que inevitablemente se aplican durante la hidrólisis y la sacarificación, para que se conserven los micro y macronutrientes termosensibles transferidos a la fase líquida durante la molienda y la mezcla.

[0041] En este sentido, se prefiere que, durante todo el proceso de preparación, la fase líquida no se someta a temperaturas de 55 °C o superiores. En realizaciones preferidas adicionales, la fase líquida no se somete a temperaturas de 45 °C o superiores, y preferiblemente de manera especial, la fase líquida no se someta a temperaturas de 35 °C o superiores. Por otro lado, la fase sólida puede someterse a un tratamiento térmico a 65 °C o más, tal como 85 °C o más, o incluso 90 °C o más (p. ej., durante la etapa de licuefacción y/o sacarificación).

[0042] Aunque no es necesario en sí mismo, pueden añadirse otros aditivos al puré o a la fase líquida durante o después de la etapa c) para ajustar aún más, enriquecer y/o complementar el perfil nutricional según la aplicación deseada. Aunque sin limitarse a estos, dichos aditivos pueden comprender macronutrientes (p. ej., fuentes de nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S)), micronutrientes (p. ej., fuentes de hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu) y molibdeno (Mo)), fuente(s) de carbono (p. ej., sacarosa, glucosa, melaza de caña de azúcar, extracto de plátano y agua de coco), vitaminas (p. ej., tiamina (B1), ácido nicotínico, piridoxina (B6), biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, ácido pantoténico, tocoferol (vitamina E), riboflavina, ácido p-aminobenzoico), aminoácidos o suplementos de nitrógeno (p. ej., hidrolizado de caseína, L-glutamina, L-asparagina, adenina, glicina, glutamina, asparagina, L-arginina, cisteína y L-tirosina), complementos orgánicos indefinidos (p. ej., hidrolizados de proteínas, leche de coco, extracto de levadura, extracto de malta, plátano molido, zumo de naranja y zumo de tomate), reguladores del crecimiento (p. ej., auxinas naturales y sintéticas, citoquininas, giberelinas, ácido abscísico y derivados de los mismos) y agentes solidificantes, por ejemplo). Los aditivos preferidos incluyen, pero sin limitación: una o más sales que incluyen Ca<2+>, SO<4>2-

, Mg<2+>, PO<4>3-

, Cl-, NO<3>-

y/o iones NH<4>+

; una o más vitaminas, preferiblemente vitamina B5; uno o más reguladores del crecimiento, preferiblemente uno o más seleccionados de agua de coco estéril, una citoquinina y una auxina, más preferiblemente uno o más seleccionados del tidiazurón, zeatina o ácido giberélico de kinetina, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indolacético (IAA) o ácido indolbutírico (IBA); y/o una o más fitohormonas.

[0043] Una vez procesado según la descripción anterior, tras la recombinación previa del extracto sacarificado licuado obtenido de la fase sólida, la fase líquida puede diluirse en agua (preferiblemente agua estéril) en la etapa f1), si es necesario, para proporcionar el medio de cultivo celular o de fermentación en forma lista para su uso en la etapa f). Si se considera necesario, la fase líquida puede esterilizarse. El método de esterilización no está particularmente limitado y puede incluir un tratamiento térmico (p. ej., autoclave), irradiación con rayos ionizantes, esterilización basada en ultrasonidos, filtración estéril a través de filtros microporosos y combinaciones de los mismos, mientras que la filtración estéril se usa preferiblemente en presencia de componentes termolábiles.

[0044] Puede añadirse un agente solidificante (p. ej., agar) al medio líquido de cultivo celular o de fermentación a una concentración del 0,1 al 0,5 % en % en peso o del 1 al 3,0 % en peso para proporcionar un medio semisólido o sólido, respectivamente.

[0045] Otro método conveniente para la preparación de medios de cultivo celular o de fermentación consiste en preparar un suplemento en forma de polvo seco o una solución madre concentrada, que puede disolverse y/o diluirse a la concentración preferida inmediatamente antes de su uso, respectivamente. En este caso, tras la recombinación previa del extracto sacarificado licuado obtenido de la fase sólida, la fase líquida obtenida en la etapa c) o después de la etapa d) se somete a una etapa de concentración y/o secado en la etapa f2). Dicha etapa puede implicar un tratamiento térmico en condiciones de baja presión para expulsar el agua. Sin embargo, los métodos a baja temperatura, tales como la liofilización, se prefieren debido a la menor pérdida de nutrientes termosensibles.

[0046] Medios y suplementos de medios

[0047] La presente invención según la primera realización puede usarse para proporcionar un medio de cultivo celular o un medio de fermentación.

[0048] Como se ha descrito anteriormente, el medio de cultivo celular o el medio de fermentación obtenido según la invención que contiene concentraciones favorables de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, aminoácidos o suplementos de nitrógeno, fuente(s) de carbono y reguladores del crecimiento, puede producirse de forma sostenible y barata mediante agricultura regenerativa o biológica, y no requiere protocolos de purificación elaborados en comparación con los medios definidos.

[0049] La presente invención según la segunda realización puede usarse para proporcionar un suplemento para un medio de cultivo celular o un medio de fermentación.

[0050] En el presente documento, el suplemento se proporciona en forma de polvo o como concentrado, que puede conservarse en un frigorífico a 2- 4 °C o en un congelador (-20 °C), respectivamente. Se entenderá que las soluciones madre concentradas y los polvos producidos según el método mencionado anteriormente no necesitan usarse como medios constituyentes tras la dilución, sino que también pueden emplearse como aditivo para medios de cultivo celular o medios de fermentación conocidos.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Método para la preparación de un medio de cultivo celular o medio de fermentación, que comprende:

a) proporcionar una planta que contiene almidón;

b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño de partícula de momento volumétrico medio (D[4,3]) de 500 µm o inferior para proporcionar un puré;

c) someter el puré molido a una separación de fases que dé lugar a una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida;

e) recombinar las fases procesadas por separado; y

f1) añadir agua a las fases recombinadas para proporcionar el medio de cultivo celular o el medio de fermentación; en donde, en la etapa d), la fase sólida separada se somete a una etapa de sacarificación; y

en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 55 °C superiores.

2. Método para la preparación de un suplemento para un medio de cultivo celular o medio de fermentación, que comprende:

a) proporcionar una planta que contiene almidón;

b) moler la planta que contiene almidón hasta un tamaño de partícula de momento volumétrico medio (D[4,3]) de 500 µm o inferior para proporcionar un puré;

c) someter el puré molido a una separación de fases que dé lugar a una fase sólida y al menos una fase líquida; d) procesar por separado la fase sólida y la al menos una fase líquida;

e) recombinar las fases procesadas por separado; y

f2) someter la al menos una fase líquida o las fases recombinadas a una etapa de secado y/o concentración para proporcionar el suplemento para un medio de cultivo celular o un medio de fermentación;

en donde, en la etapa d), la fase sólida separada se somete a una etapa de sacarificación; y

en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 55 °C superiores.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la planta se selecciona de entre las plantas de cultivo, preferiblemente de cereales, legumbres, cultivo oleaginoso, caña de azúcar, remolacha azucarera, tubérculos y frutas, más preferiblemente de maíz, trigo, legumbres, caña de azúcar, remolacha azucarera, zanahorias, patatas, boniatos y frutas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la planta tiene un contenido de almidón de al menos el 20 % en peso basado en el peso seco total.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde, en la etapa a), la planta que contiene almidón está presente en estado inmaduro.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las fases procesadas por separado se someten a una etapa de esterilización, independientemente o tras la recombinación de las fases, preferiblemente por filtración estéril tras la recombinación de las fases.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa de sacarificación incluye un tratamiento enzimático, tratamiento ácido, irradiación de microondas asistida por catalizador sólido, tratamiento térmico bajo presión, tratamiento con vapor o combinaciones de los mismos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la planta que contiene almidón se somete a molienda húmeda en la etapa b), preferiblemente en presencia de agua.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa b) se realiza a temperaturas inferiores a 40 °C, más preferiblemente a temperaturas de 5 a 35 °C.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde, en la etapa b), la planta que contiene almidón se muele hasta alcanzar un tamaño de partícula de momento volumétrico medio (D[4,3]) de 90 µm o menos, preferiblemente de 50 µm o menos, más preferiblemente de 30 µm o menos.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la fase sólida se somete a una etapa de licuefacción previa a la etapa de sacarificación, preferiblemente mediante suspensión de la fase sólida en agua, gelatinizar la suspensión e hidrolizarla en presencia de uno o más tipos de enzimas hidrolizantes del almidón.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde, durante las etapas a) a e), la al menos una fase líquida no se somete a temperaturas de 45 °C superiores.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la fase sólida se somete a un tratamiento térmico a 65 °C o más, tal como 85 °C o superior.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde uno o más de los siguientes se añaden, además, durante o después de la etapa b):

una o más sales que incluyen Ca<2+>, SO<4>2-

, Mg<2+>, PO<4>3-

, Cl-, NO<3>-

y/o iones NH<4>+

;

una o más vitaminas, preferiblemente vitamina B5;

uno o más reguladores del crecimiento, preferiblemente uno o más seleccionados de agua de coco estéril, una citoquinina y una auxina, más preferiblemente uno o más seleccionados del tidiazurón, zeatina o ácido giberélico de kinetina, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indolacético (IAA) o ácido indolbutírico (IBA); y/o una o más fitohormonas.