ES3058701T3

ES3058701T3 - Improved protein recovery

Info

Publication number: ES3058701T3
Application number: ES19759237T
Authority: ES
Inventors: Abhiram Arunkumar; Nripen Singh; Ameya Borwankar
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2026-03-12
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: US20250092090A1; KR20250174710A; FI3837273T3; EP4659850A3; WO2020036903A1; JP2021534149A; CN112566920A; US20210171573A1; US12103949B2; KR102893280B1; PT3837273T; KR20210044821A; JP7483679B2; EP4659850A2; PL3837273T3; JP2024105393A; CN112566920B; EP3837273B1; EP3837273A1; DK3837273T3

Abstract

Esta divulgación proporciona un nuevo método de lavado que utiliza una técnica de lavado de recuperación que minimiza las pérdidas de rendimiento debido a un lavado inadecuado y previene o reduce la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Recuperación de proteínas mejorada

[0003] Antecedentes de la divulgación

[0004] La administración subcutánea de una variedad de proteínas terapéuticas es un campo de rápido crecimiento, especialmente para subtipos de proteínas específicas tales como anticuerpos monoclonales, que requieren que se administren grandes cantidades de fármaco. Con el fin de formular correctamente estas moléculas, se requiere una concentración de más de 100 g/l. Se sabe que tanto la fabricación de estas moléculas a estas altas concentraciones como la recuperación a gran escala de productos altamente concentrados a escala usando filtración de flujo tangencial (TFF) u otros métodos de filtración son difíciles.

[0005] El documento US 2007/0237762 describe un procedimiento para concentrar proteínas, que incluye una primera y una segunda secuencia de ultrafiltración y de diafiltración, a temperaturas elevadas, tales como por encima de aproximadamente 30 °C. Se refiere además a un procedimiento para preparar composiciones de anticuerpos altamente concentradas y productos de anticuerpos altamente concentrados.

[0006] La filtración de flujo tangencial (TFF) es un método rápido y eficiente para la separación y purificación de biomoléculas. Puede aplicarse a una amplia gama de campos biológicos tales como inmunología, química de proteínas, biología molecular, bioquímica y microbiología. La TFF puede usarse para concentrar y desalar disoluciones de muestra que varían en volumen de 10 ml a miles de litros, y puede usarse para fraccionar biomoléculas grandes a partir de pequeñas, cosechar suspensiones celulares y aclarar caldos de fermentación y lisados celulares. La filtración por membrana es una técnica de separación ampliamente usada en el laboratorio de ciencias de la vida. Dependiendo de la porosidad de la membrana, puede clasificarse como un proceso de microfiltración o ultrafiltración. Se usan membranas de ultrafiltración, con tamaños de poro generalmente entre 0,001 y 0,1 µm, para concentrar y desalar moléculas disueltas (proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono y otras biomoléculas), tampones de intercambio y fraccionamiento bruto. Las membranas de ultrafiltración se clasifican normalmente por corte de peso molecular (MWCO) en lugar de tamaño de poro.

[0007] Se conoce bien que, durante la ultrafiltración de alta viscosidad a altas concentraciones de proteína previstas en la fase de sustancia farmacológica (>150 mg/ml), la carga de lograr la concentración objetivo recae sobre el proceso de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF). Un problema encontrado en la fabricación es la retención de proteína en el tubo de fabricación u otras áreas de "retención", lo que conduce a una mala recuperación en el recipiente de recogida y, por lo tanto, a un bajo rendimiento. Por lo tanto, la práctica típica ha sido emplear un lavado de recuperación para empujar la proteína retenida en el recipiente de recogida para aumentar el rendimiento general. Si el comportamiento de lavado siguiera las condiciones ideales de flujo pistón, no habría dilución durante el lavado y, en su lugar, el tampón de lavado simplemente empujaría la proteína al recipiente de recogía y tomaría su lugar en las áreas de "retención", y la recuperación de la proteína atrapada en las áreas de "retención" sin dilución no sería un problema. Sin embargo, en condiciones reales, el lavado de recuperación provoca la dilución del producto porque se produce dilución entre el tampón de lavado de recuperación y la proteína que se empuja al recipiente de recogida. Por lo tanto, existe la necesidad de reducir o evitar la dilución de un producto objetivo durante un lavado de recuperación.

[0008] Sumario de la invención

[0009] La presente invención se refiere a un método para reducir o evitar la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración que comprende (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que está entre aproximadamente 10 y 40 litros por metro cuadrado por hora (LMH), reduciendo o evitando de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para mejorar o aumentar una concentración de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración que comprende (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón de lavado a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que está entre aproximadamente 10 y 40 litros por metro cuadrado por hora (LMH), mejorando de ese modo la concentración de proteína objetivo en comparación con una concentración de proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH.

[0010] En algunas realizaciones, el número de Reynold ("Re") del flujo en el lavado de recuperación es de menos de 2000, menos de 1500, menos de 1000, menos de 900, menos de 800, menos de 700, menos de 600, menos de 500, menos de 400, menos de 300, menos de 200, menos de 100, menos de 90, menos de 80, menos de 70, menos de 60, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, menos de 5, menos de 4 o menos de 3, en donde el Re se calcula con la siguiente fórmula:

[0011]

[0014] y

[0016] en donde D es el diámetro del canal (m) o diámetro equivalente en el caso de geometrías de canal de flujo no cilíndricas, υ es la velocidad promedio (m/s) (Q/A<c>), ρ es la densidad (kg/m<3>) y µ es la viscosidad (Pa·s).

[0018] En algunas realizaciones, el número de Reynold (Re) del flujo en el lavado de recuperación está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 45, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 35, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10, o entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6.

[0020] En algunas realizaciones, el número de Reynold (Re) del flujo en el lavado de recuperación es de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30. En algunas realizaciones, el Re del flujo en el lavado de recuperación es de aproximadamente 3,8.

[0022] En algunas realizaciones, la velocidad de flujo del lavado está entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 30 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 40 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 40 LMH, o entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 30 LMH.

[0024] Los presentes métodos pueden ser especialmente eficaces durante la ultrafiltración de alta viscosidad a altas concentraciones de proteína previstas en la fase de sustancia farmacológica (>150 mg/ml). En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es de al menos aproximadamente 1 mPa·s (centipoise), al menos aproximadamente 2 mPa·s, al menos aproximadamente 3 mPa·s, al menos aproximadamente 4 mPa·s, al menos aproximadamente 5 mPa·s, al menos aproximadamente 6 mPa·s, al menos aproximadamente 7 mPa·s, al menos aproximadamente 8 mPa·s, al menos aproximadamente 9 mPa·s, al menos aproximadamente 10 mPa·s, al menos aproximadamente 11 mPa·s, al menos aproximadamente 12 mPa·s, al menos aproximadamente 13 mPa·s, al menos aproximadamente 14 mPa·s, al menos aproximadamente 15 mPa·s, al menos aproximadamente 16 mPa·s, al menos aproximadamente 17 mPa·s, al menos aproximadamente 18 mPa·s, al menos aproximadamente 19 mPa·s, al menos aproximadamente 20 mPa·s, al menos aproximadamente 21 mPa·s, al menos aproximadamente 22 mPa·s, al menos aproximadamente 23 mPa·s, al menos aproximadamente 24 mPa·s, al menos aproximadamente 25 mPa·s, al menos aproximadamente 26 mPa·s, al menos aproximadamente 27 mPa·s, al menos aproximadamente 28 mPa·s, al menos aproximadamente 29 mPa·s o al menos aproximadamente 30 mPa·s.

[0026] En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es alta, y es de al menos aproximadamente 20 mPa·s (centipoise), al menos aproximadamente 21 mPa·s, al menos aproximadamente 22 mPa·s, al menos aproximadamente 23 mPa·s, al menos aproximadamente 24 mPa·s, al menos aproximadamente 25 mPa·s, al menos aproximadamente 26 mPa·s, al menos aproximadamente 27 mPa·s, al menos aproximadamente 28 mPa·s, al menos aproximadamente 29 mPa·s, al menos aproximadamente 30 mPa·s, al menos aproximadamente 31 mPa·s, al menos aproximadamente 32 mPa·s, al menos aproximadamente 33 mPa·s, al menos aproximadamente 34 mPa·s, al menos aproximadamente 35 mPa·s, al menos aproximadamente 36 mPa·s, al menos aproximadamente 37 mPa·s, al menos aproximadamente 38 mPa·s, al menos aproximadamente 39 mPa·s, al menos aproximadamente 40 mPa·s, al menos aproximadamente 41 mPa·s, al menos aproximadamente 42 mPa·s, al menos aproximadamente 43 mPa·s, al menos aproximadamente 44 mPa·s, al menos aproximadamente 45 mPa·s, al menos aproximadamente 46 mPa·s, al menos aproximadamente 47 mPa·s, al menos aproximadamente 48 mPa·s, al menos aproximadamente 49 mPa·s, al menos aproximadamente 50 mPa·s, al menos aproximadamente 51 mPa·s, al menos aproximadamente 52 mPa·s, al menos aproximadamente 53 mPa·s, al menos aproximadamente 54 mPa·s, al menos aproximadamente 55 mPa·s, al menos aproximadamente 56 mPa·s, al menos aproximadamente 57 mPa·s, al menos aproximadamente 58 mPa·s, al menos aproximadamente 59 mPa·s, al menos aproximadamente 60 mPa·s, al menos aproximadamente 61 mPa·s, al menos aproximadamente 62 mPa·s, al menos aproximadamente 63 mPa·s, al menos aproximadamente 64 mPa·s, al menos aproximadamente 65 mPa·s, al menos aproximadamente 66 mPa·s, al menos aproximadamente 67 mPa·s, al menos aproximadamente 68 mPa·s, al menos aproximadamente 69 mPa·s, al menos aproximadamente 70 mPa·s, al menos aproximadamente 71 mPa·s, al menos aproximadamente 72 mPa·s, al menos aproximadamente 73 mPa·s, al menos aproximadamente 74 mPa·s, al menos aproximadamente 75 mPa·s, al menos aproximadamente 76 mPa·s, al menos aproximadamente 77 mPa·s, al menos aproximadamente 78 mPa·s, al menos aproximadamente 79 mPa·s, al menos aproximadamente 80 mPa·s, al menos aproximadamente 81 mPa·s, al menos aproximadamente 82 mPa·s, al menos aproximadamente 83 mPa·s, al menos aproximadamente 84 mPa·s, al menos aproximadamente 85 mPa·s, al menos aproximadamente 86 mPa·s, al menos aproximadamente 87 mPa·s, al menos aproximadamente 88 mPa·s, al menos aproximadamente 89 mPa·s, al menos aproximadamente 90 mPa·s, al menos aproximadamente 91 mPa·s, al menos aproximadamente 92 mPa·s, al menos aproximadamente 93 mPa·s, al menos aproximadamente 94 mPa·s, al menos aproximadamente 95 mPa·s, al menos aproximadamente 96 mPa·s, al menos aproximadamente 97 mPa·s, al menos aproximadamente 98 mPa·s, al menos aproximadamente 99 mPa·s o al menos aproximadamente 100 mPa·s.

[0028] En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 10 mPa·s, de aproximadamente 3 mPa ·s a aproximadamente 10 mPa·s, de aproximadamente 1 mPa·s a aproximadamente 9 mPa·s, de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 8 mPa·s, de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 7 mPa·s, de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 6 mPa·s, de aproximadamente 3 mPa·s a aproximadamente 6 mPa·s, de aproximadamente 4 mPa·s a aproximadamente 5 mPa·s o de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 5 mPa·s.

[0030] En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de al menos aproximadamente 100 g/l, al menos aproximadamente 110 g/l, al menos aproximadamente 120 g/l, al menos aproximadamente 130 g/l, al menos aproximadamente 140 g/l, al menos aproximadamente 150 g/l, al menos aproximadamente 160 g/l, al menos aproximadamente 170 g/l, al menos aproximadamente 180 g/l, al menos aproximadamente 190 g/l, al menos aproximadamente 200 g/l, al menos aproximadamente 210 g/l, al menos aproximadamente 220 g/l, al menos aproximadamente 230 g/l, al menos aproximadamente 240 g/l, al menos aproximadamente 250 g/l, al menos aproximadamente 260 g/l, al menos aproximadamente 270 g/l, al menos aproximadamente 280 g/l, al menos aproximadamente 290 g/l o al menos aproximadamente 300 g/l antes de las filtraciones.

[0032] En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 110 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 120 g/l a aproximadamente 240 g/l, de aproximadamente 150 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 130 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 140 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 160 g/l a aproximadamente 220 g/l o de aproximadamente 170 g/l a aproximadamente 230 g/l.

[0034] En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de aproximadamente 90 g/l, aproximadamente 100 g/l, aproximadamente 110 g/l, aproximadamente 120 g/l, aproximadamente 130 g/l, aproximadamente 140 g/l, aproximadamente 150 g/l, aproximadamente 160 g/l, aproximadamente 170 g/l, aproximadamente 180 g/l, aproximadamente 190 g/l, aproximadamente 200 g/l, aproximadamente 210 g/l, aproximadamente 220 g/l, aproximadamente 230 g/l, aproximadamente 240 g/l, aproximadamente 250 g/l, aproximadamente 260 g/l, aproximadamente 270 g/l, aproximadamente 280 g/l, aproximadamente 290 g/l o aproximadamente 300 g/l.

[0036] De ese modo, los presentes métodos pueden dar como resultado un mayor rendimiento de proteína después del lavado de recuperación al evitar o reducir la dilución de la proteína objetivo durante el lavado de recuperación. En algunas realizaciones, el rendimiento de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 100 % en comparación con el rendimiento de la proteína objetivo antes del proceso de lavado de recuperación que consiste en (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a 100 litros por metro cuadrado por hora (LMH).

[0038] En algunas realizaciones, el rendimiento de la proteína objetivo después del lavado de recuperación aumenta en al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 % o al menos el 20 % en comparación con un rendimiento de la proteína objetivo obtenida después de un lavado de recuperación con una velocidad de flujo de 300 LMH. En algunas realizaciones, el paso en (i) es a una velocidad de flujo de alimentación mayor que la velocidad de flujo de lavado en (ii).

[0040] En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de alimentación es de al menos 200 LMH, al menos 210 LMH, al menos 220 LMH, al menos 230 LMH, al menos 240 LMH, al menos 250 LMH, al menos 260 LMH, al menos 270 LMH, al menos 280 LMH, al menos 290 LMH, al menos 300 LMH, al menos 310 LMH, al menos 320 LMH, al menos 330 LMH, al menos 340 LMH, al menos 350 LMH, al menos 360 LMH, al menos 370 LMH, al menos 380 LMH, al menos 390 LMH, al menos 400 LMH, al menos 410 LMH, al menos 420 LMH, al menos 430 LMH, al menos 440 LMH, al menos 450 LMH, al menos 460 LMH, al menos 470 LMH, al menos 480 LMH, al menos 490 LMH o al menos 500 LMH.

[0042] En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de alimentación está entre 200 LMH y 500 LMH, entre 200 LMH y 450 LMH, entre 250 LMH y 450 LMH, 450 LMH, entre 300 LMH y 450 LMH, entre 300 LMH y 400 LMH, o entre 300 LMH y 350 LMH. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de alimentación es de aproximadamente 300 LMH.

[0044] En algunas realizaciones, el conjunto de filtración comprende una membrana. En algunas realizaciones, la membrana de filtración útil para el conjunto de filtración se deriva de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), polisulfona, polietersulfona, poliarilsulfona, celulosa regenerada, poliamida, polipropileno, polietileno, politetrafluoroetileno, acetato de celulosa, poliacrilonitrilo, copolímero de vinilo, poliamidas (tales como "nailon 6" o nailon 66"), policarbonato, PFA o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende un ácido orgánico o inorgánico o una sal del mismo.

[0046] En algunas realizaciones, el ácido orgánico o inorgánico es citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódicocitrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónicogliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gliconato de potasio, etc.), oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.), sal de trimetilamina, (por ejemplo, Tris), fosfato o histidina. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende histidina. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende un azúcar. En algunas realizaciones, el azúcar es sacarosa, trehalosa, manitol, xilitol, eritritol, lactosa, glucosa, azúcar en polvo o pululano. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende histidina 20 mM y sacarosa 250 mM.

[0048] En algunas realizaciones, se usa un tampón de filtración durante (i). En algunas realizaciones, el tampón de filtración es el mismo que el tampón de lavado. En otras realizaciones, el tampón de filtración es diferente del tampón de lavado. En algunas realizaciones, el tampón de filtración comprende un ácido orgánico o inorgánico o una sal del mismo.

[0050] En algunas realizaciones, el ácido orgánico o inorgánico es citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódicocitrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónicogliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gliconato de potasio, etc.), oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.), sal de trimetilamina, (por ejemplo, Tris), fosfato o histidina.

[0052] En algunas realizaciones, el tampón de filtración comprende un azúcar. En algunas realizaciones, el azúcar es sacarosa, trehalosa, manitol, xilitol, eritritol, lactosa, glucosa, azúcar en polvo o pululano. En algunas realizaciones, el tampón de lavado y/o el tampón de filtración está a un pH de aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9 o aproximadamente 9,5.

[0053] En algunas realizaciones, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de proteína pura, una muestra de proteína a granel clarificada, una muestra de cultivo celular y cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra de cultivo celular se deriva de medios de cultivo celular que comprenden células de mamífero. En algunas realizaciones, las células de mamífero se seleccionan de células de ovario de hámster chino (CHO), células HEK293, mieloma de ratón (NSO), células de riñón de cría de hámster (BHK), fibroblastos de riñón de mono (COS-7), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la proteína objetivo comprende un anticuerpo o una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína objetivo comprende un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo seleccionado de IgM, IgA, IgE, IgD e IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-CXCR4, un anticuerpo anti-CD73, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-CSF1R o un anticuerpo anti-IL8.

[0054] En algunas realizaciones, la proteína objetivo comprende una enzima, una hormona, una citocina, un receptor de superficie celular, una proteasa, un receptor de citocina o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína objetivo es una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína de fusión se fusiona con un resto heterólogo. En algunas realizaciones, el resto heterólogo es un resto que prolonga la semivida. En algunas realizaciones, el resto que prolonga la semivida comprende un Fc.

[0055] Breve descripción de las figuras

[0056] La figura 1 (figura 1) muestra los datos generados a partir de un proceso a escala reducida usando un tubo de alimentación de tamaño 16 (área de membrana de 176 cm<2>). Después de la concentración del retenido de TFF por encima de la concentración objetivo antes del lavado de recuperación, se sometieron a prueba varias velocidades de flujo de lavado de recuperación diferentes. Tal como puede observarse en la figura 1, mayores velocidades de flujo de lavado de recuperación conducen a una mayor dilución del retenido de TFF concentrado.

[0057] La figura 2 (figura 2) muestra una comparación de los números de Reynold calculados usando tubos con diversas áreas de sección transversal. Las áreas de sección transversal se muestran en la tabla 1.

[0058] La figura 3 (figura 3) muestra una comparación de números de Reynold calculados en comparación con la viscosidad de un fluido que se desplaza a velocidad fija a través de tubos de diversas áreas de sección transversal.

[0059] Descripción detallada de la divulgación

[0060] La presente divulgación proporciona un enfoque altamente eficaz para reducir o prevenir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación. Específicamente, el enfoque usa velocidades de flujo más lentas para combatir los efectos de dilución del flujo turbulento que se produce cuando el número de Reynold (Re) calculado es alto. En algunas realizaciones, el Re calculado útil para los presentes métodos es inferior a 2000.

[0061] Tal como se muestra en los ejemplos de trabajo, el enfoque es eficaz para reducir o prevenir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación causada por la velocidad de flujo de lavado de recuperación. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para reducir o prevenir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación mediante el uso de una velocidad de flujo de lavado de recuperación de 30 LMH, reduciendo o previniendo de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de recuperación de 100 LMH. El uso de tal sistema permite una dilución muy mínima de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación, lo que permite alcanzar una concentración objetivo final más alta sin sacrificar el rendimiento o la concentración del producto, ya sea debido a la ausencia de un lavado de recuperación o una dilución excesiva debido a una velocidad de flujo de lavado de recuperación más rápida.

[0062] En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para purificar una proteína de interés a partir de una mezcla que comprende la proteína de interés y uno o más contaminantes. Los posibles contaminantes incluyen proteínas de la célula huésped (HCP), especies de alto peso molecular (HMW), especies de bajo peso molecular (LMW) o ADN.

[0063] En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para purificar un anticuerpo. En determinadas realizaciones, la mezcla se deriva de fluido de cultivo celular cosechado, sobrenadante de cultivo celular, lisado celular y volumen clarificado.

[0064] I. Términos

[0065] Con el fin de que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, en primer lugar se definen determinados términos. Tal como se usa en esta solicitud, salvo que se disponga expresamente lo contrario en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado que se expone a continuación. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la solicitud.

[0066] El termino “y/o”, cuando se usa en el presente documento, debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" tal como se usa en una frase tal como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, se pretende que el término “y/o” tal como se usa en una frase tal como “A, B y/o C” abarque cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

[0067] Se entiende que, siempre que se describan aspectos en el presente documento con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

[0068] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica con la que está relacionada esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2ª ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3ª ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.

[0069] Las unidades, los prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los encabezados proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, que pueden obtenerse por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

[0070] Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas. Tal como se usa en el presente documento, debe entenderse que los artículos indefinidos “un” o “una” hacen referencia a “uno o más” de cualquier componente mencionado o enumerado.

[0071] La expresión "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" se refieren a un valor o composición que está dentro de un intervalo de error aceptable para el valor o composición particular tal como se determina por un experto habitual en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor o composición, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar según la práctica en la técnica. De manera alternativa, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %. Además, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores o composiciones particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, debe suponerse que el significado de "aproximadamente de" o "que comprende esencialmente" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición particular.

[0072] Tal como se describe en el presente documento, debe entenderse que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de número entero incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario.

[0073] Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína de interés” se usa en su sentido más amplio para incluir cualquier proteína (ya sea natural o recombinante), presente en una mezcla, para la que se desea purificación. Tales proteínas de interés incluyen, sin limitación, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, citocinas, inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos) y/o cualquier proteína de fusión.

[0074] El término “clarificación” se refiere al proceso de eliminación de materiales particulados. La clarificación puede reducir la carga de la cromatografía posterior (por ejemplo, AEX o CEX) durante un proceso de purificación. En algunos ejemplos, la clarificación es un método para eliminar coloides, lípidos, ADN-ARN, células residuales y otras partículas del cultivo celular. También puede usarse filtración, y puede incluir filtros de profundidad. “Masa clarificada” se refiere a una mezcla que se ha sometido al proceso de clarificación.

[0075] El término "inactivación de virus" se refiere a un proceso de eliminación de contaminantes virales infecciosos de una mezcla. Actualmente, existen muchos métodos diferentes para inactivar virus patógenos contagiosos, que incluyen, por ejemplo, inactivación por calor, inactivación con disolvente/detergente (S/D), inactivación por pH, inactivación química y/o inactivación por irradiación ultravioleta.

[0076] El término "cromatografía" se refiere a cualquier tipo de técnica que separa una proteína de interés (por ejemplo, un anticuerpo) de otras moléculas (por ejemplo, contaminantes) presentes en una mezcla. Habitualmente, la proteína de interés se separa de otras moléculas (por ejemplo, contaminantes) como resultado de diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase en movimiento, o en procesos de unión y elución. El término "matriz" o "matriz de cromatografía" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier tipo de sorbente, resina o fase sólida que, en un proceso de separación, separa una proteína de interés (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moléculas presentes en una mezcla.

[0077] Los ejemplos no limitantes incluyen resinas particuladas, monolíticas o fibrosas así como membranas que pueden ponerse en columnas o cartuchos. Los ejemplos de materiales para formar la matriz incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirenodivinil)benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualquiera de los anteriores. Ejemplos de tipos de matriz típicos adecuados para el método de la presente divulgación son resinas de intercambio catiónico, resinas de afinidad, resinas de intercambio aniónico o resinas de modo mixto. Un "ligando" es un grupo funcional que está unido a la matriz de cromatografía y que determina las propiedades de unión de la matriz. Los ejemplos de "ligandos" incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio iónico, grupos de interacción hidrófoba, grupos de interacción hidrófila, grupos de interacciones tiofílicas, grupos de afinidad metálica, grupos de afinidad, grupos de bioafinidad y grupos de modo mixto (combinaciones de los mencionados anteriormente). Algunos ligandos preferidos que pueden usarse en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio catiónico fuerte, tales como sulfopropilo, ácido sulfónico; grupos de intercambio aniónico fuerte, tales como cloruro de trimetilamonio; grupos de intercambio catiónico débil, tales como ácido carboxílico; grupos de intercambio aniónico débil, tales como N5N dietilamino o DEAE; grupos de interacción hidrófoba, tales como fenilo, butilo, propilo, hexilo; y grupos de afinidad, tales como proteína A, proteína G y proteína L. Con el fin de que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, en primer lugar se definen determinados términos. Tal como se usa en esta solicitud, salvo que se disponga expresamente lo contrario en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado que se expone a continuación. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la solicitud.

[0079] El término "cromatografía de afinidad" se refiere a una técnica de separación de proteínas en la que una proteína de interés (por ejemplo, una región Fc que contiene proteína de interés o anticuerpo) se une específicamente a un ligando que es específico para la proteína de interés. Tal ligando se denomina generalmente ligando bioespecífico. En algunas realizaciones, el ligando bioespecífico (por ejemplo, proteína A o una variante funcional de la misma) está unido covalentemente a un material de matriz de cromatografía y es accesible para la proteína de interés en solución a medida que la solución entra en contacto con la matriz de cromatografía. La proteína de interés generalmente retiene su afinidad de unión específica por el ligando bioespecífico durante las etapas cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen de manera apreciable o específica al ligando. La unión de la proteína de interés al ligando inmovilizado permite que las proteínas contaminantes o las impurezas proteicas pasen a través de la matriz de cromatografía, mientras que la proteína de interés permanece unida específicamente al ligando inmovilizado en el material en fase sólida. La proteína de interés unida específicamente se retira entonces en forma activa del ligando inmovilizado en condiciones adecuadas (por ejemplo, pH bajo, pH alto, alto contenido de sal, ligando competidor, etc.), y se hace pasar a través de la columna cromatográfica con el tampón de elución, libre de las proteínas contaminantes o impurezas proteicas que se dejaron pasar anteriormente a través de la columna. Puede usarse cualquier componente como ligando para purificar su proteína de unión específica respectiva, por ejemplo, anticuerpo. Sin embargo, en diversos métodos según la presente divulgación, se usa proteína A como ligando para una región Fc que contiene una proteína objetivo. Las condiciones para la elución del ligando bioespecífico (por ejemplo, proteína A) de la proteína objetivo (por ejemplo, una proteína que contiene región Fc) pueden determinarse fácilmente por un experto habitual en la técnica. En algunas realizaciones, puede usarse proteína G o proteína L o una variante funcional de las mismas como ligando bioespecífico. En algunas realizaciones, se usa un ligando bioespecífico tal como proteína A a un intervalo de pH de 5-9 para unirse a una región Fc que contiene proteína, lavar o reequilibrar el conjugado de ligando bioespecífico/proteína objetivo, seguido de elución con un tampón que tiene un pH de aproximadamente o inferior a 4 que contiene al menos una sal.

[0081] Los términos “purificar”, “separar” o “aislar”, tal como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a aumentar el grado de pureza de una proteína de interés a partir de una composición o muestra que comprende la proteína de interés y una o más impurezas. Normalmente, el grado de pureza de la proteína de interés aumenta al eliminar (completa o parcialmente) al menos una impureza de la composición.

[0083] El término “tampón”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que, por su presencia en disolución, aumenta la cantidad de ácido o álcali que debe añadirse para provocar un cambio de unidad en el pH. Una solución tamponada resiste los cambios de pH mediante la acción de sus componentes conjugados ácidobase. Las soluciones tamponadas para su uso con reactivos biológicos generalmente son capaces de mantener una concentración constante de iones de hidrógeno de modo que el pH de la disolución esté dentro de un intervalo fisiológico. Los componentes de tampón tradicionales incluyen, pero no se limitan a, sales orgánicas e inorgánicas, ácidos y bases.

[0085] El término “columna de cromatografía” o “columna” en relación con la cromatografía tal como se usa en el presente documento, se refiere a un recipiente, frecuentemente en forma de un cilindro o un pilar hueco que se llena con la resina o matriz de cromatografía. La resina o matriz de cromatografía es el material que proporciona las propiedades físicas y/o químicas que se emplean para la purificación.

[0087] Los términos "intercambio iónico" y "cromatografía de intercambio iónico" se refieren a un proceso cromatográfico en el que un soluto ionizable de interés (por ejemplo, una proteína de interés en una mezcla) interactúa con un ligando cargado de manera opuesta unido (por ejemplo, por unión covalente) a un material de intercambio iónico en fase sólida en condiciones apropiadas de pH y conductividad, de modo que el soluto de interés interactúa de manera no específica con el compuesto cargado más o menos que las impurezas o contaminantes de soluto en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla pueden lavarse de una columna del material de intercambio iónico o se unen o excluyen de la resina, más rápido o más lento que el soluto de interés. "Cromatografía de intercambio iónico" incluye específicamente cromatografía de intercambio catiónico (CEX), de intercambio aniónico (AEX) y de modo mixto.

[0088] Tal como se usa en el presente documento, el término “contaminante” se usa en su sentido más amplio para cubrir cualquier componente o compuesto no deseado dentro de una mezcla. En cultivos celulares, lisados celulares o masa clarificada (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular clarificado), los contaminantes incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de la célula huésped (por ejemplo, ADN) y proteínas de la célula huésped presentes en un medio de cultivo celular. Las proteínas contaminantes de la célula huésped incluyen, sin limitación, aquellas producidas de forma natural o recombinante por la célula huésped, así como proteínas relacionadas con o derivadas de la proteína de interés (por ejemplo, fragmentos proteolíticos) y otros contaminantes relacionados con el proceso. En determinadas realizaciones, el precipitado contaminante se separa del cultivo celular usando un medio tal como centrifugación, filtración estéril, filtración en profundidad y filtración de flujo tangencial.

[0089] La expresión "número de Reynolds" (Re) se calcula con la siguiente fórmula:

[0091]

[0093] y

[0094] en donde D es el diámetro del canal (m) o diámetro equivalente en el caso de geometrías de canal de flujo no cilíndricas, υ es la velocidad promedio (m/s) (Q/Ac), ρ es la densidad (kg/m<3>) y µ es la viscosidad (PA s). Un número de Reynolds es una unidad adimensional y describe la relación de las fuerzas de inercia con respecto a las fuerzas viscosas en un fluido que fluye. Se usa en muchas correlaciones de flujo de fluidos y se usa para describir los límites de los regímenes de flujo de fluidos (laminar, de transición y turbulento). El flujo laminar se produce cuando un fluido fluye en capas paralelas, sin interrupción entre capas. Cuando el número de Reynolds es menor de aproximadamente 2.000, el flujo en un tubo es generalmente laminar. Cuando el número de Reynolds es superior a aproximadamente 4.000, el flujo es turbulento. Un número de Reynolds entre 2.000 y 4.000 representa un área de transición entre el flujo laminar y el flujo turbulento.

[0095] El término "lavado de recuperación" se refiere a una etapa de purificación de proteínas donde una muestra de proteína que ya se ha concentrado por encima de su concentración objetivo deseada se somete a un lavado para desplazar proteína adicional que aún no ha alcanzado el recipiente de recogida. La cantidad de sobreconcentración en la etapa de sobreconcentración influye en el volumen de lavado que puede usarse en la etapa de recuperación, porque determina la cantidad de dilución posible antes de alcanzar la concentración de proteína objetivo final. En muchos procesos de purificación de proteínas a escala, una cantidad significativa de proteína puede mantenerse fuera de los recipientes de recogida en el tubo, la tubería u otras áreas de "retención", y es necesario un lavado de recuperación para recuperar una mayor cantidad de producto proteico en el recipiente de recogida u otro recipiente usado para recoger el producto proteico purificado. En ausencia de un lavado de recuperación, el producto proteico que se ha acumulado en el tubo, la tubería u otras áreas de "retención" del sistema de purificación de proteínas a gran escala puede perderse o no recuperarse debido a su incapacidad para alcanzar el recipiente de recogida de proteínas u otro recipiente usado para recoger el producto proteico purificado.

[0096] El término "tampón de lavado" se refiere a la disolución o mezcla usada durante el lavado de recuperación que se usa para aumentar el rendimiento de proteína global, diluir la proteína hasta su concentración objetivo final, o ambos. El tampón de lavado también se usa para empujar la proteína fuera de la tubería u otras áreas del conjunto de filtración donde se acumula la proteína.

[0097] El término "tampón de filtración" se refiere a la solución o mezcla usada durante la filtración que se usa para hacer pasar una alimentación que contiene una proteína de interés sobre o a través de una membrana.

[0098] El término “conjunto de filtración” se refiere a todo el sistema usado para realizar la purificación de proteínas. Un ejemplo de un conjunto de filtración es un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) donde una alimentación que contiene una proteína de interés se somete a un flujo de alimentación que es perpendicular a una membrana de filtración. Los sistemas de TFF disponibles comercialmente incluyen el sistema de filtración de flujo tangencial de flujo AKTA<®>(GE Life Sciences). Otro ejemplo de un conjunto de filtración es un sistema de filtración de flujo directo (DFF) donde una alimentación que contiene una proteína de interés se somete a un flujo de alimentación que es paralelo a una membrana de filtración.

[0099] El término "velocidad de flujo de alimentación" (LMH), o a veces "velocidad de flujo cruzado", se refiere a una velocidad de flujo en una etapa en la purificación de proteínas por filtración de flujo tangencial (TFF) en la que una alimentación que contiene una proteína de interés se somete a un flujo de alimentación que es perpendicular a una membrana de filtración. El flujo tangencial de la alimentación evita que las partículas atrapadas en la superficie del filtro se acumulen y, por lo tanto, interfieran con la filtración. Durante una etapa de concentración de ultrafiltración, el flujo de alimentación al casete de membrana de ultrafiltración proporciona la presión transmembrana (TMP) y el flujo de flujo cruzado necesarios para la concentración y el intercambio de tampón. En el contexto de los sistemas de filtración de flujo directo (DFF), el término "velocidad de flujo de alimentación" se refiere a una velocidad de flujo que es paralela a una membrana de filtración.

[0101] El término "velocidad de flujo de lavado" (LMH) se refiere a una velocidad de flujo usada en una etapa de purificación de proteínas donde una muestra de proteína que ya se ha concentrado por encima de su concentración objetivo deseada se somete a un lavado para desplazar la proteína no presente en el recipiente de recogida. La velocidad de flujo de lavado representa la velocidad a la que fluye un tampón de lavado a través del sistema durante la fase de lavado de recuperación del procedimiento de purificación.

[0103] El término "diafiltración" se refiere al proceso de eliminar, reemplazar o disminuir la concentración de sales o disolventes de disoluciones que contienen proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas. El proceso usa filtros de membrana permeables para separar los componentes de una disolución o mezcla en función del tamaño molecular. Las moléculas que son más pequeñas que los poros de la membrana pasan libremente a través de la membrana.

[0105] El término “ultrafiltración” se refiere al proceso de separación de partículas de un tamaño de partículas de otro tamaño usando un filtro. La ultrafiltración es un proceso de membrana impulsado por la presión que se usa ampliamente para la concentración de proteínas y el intercambio de tampones. La ultrafiltración es una separación basada en el tamaño, donde se retienen especies más grandes que los poros de la membrana y las especies más pequeñas pasan a través del filtro. La ultrafiltración se realiza a través de diferencias en las velocidades de filtración de diferentes componentes a través de la membrana bajo presión.

[0107] El término "anticuerpo" se refiere, en algunas realizaciones, a una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada (abreviada en el presente documento como CH). En algunos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos IgG de origen natural, la región constante de cadena pesada comprende una bisagra y tres dominios, CH1, CH2 y CH3. En algunos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos IgG de origen natural, cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (abreviado en el presente documento como CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Una cadena pesada puede tener la lisina C-terminal o no. El término "anticuerpo" puede incluir un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico.

[0109] Un "anticuerpo IgG", por ejemplo, un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humano, tal como se usa en el presente documento tiene, en algunas realizaciones, la estructura de un anticuerpo IgG de origen natural, es decir, tiene el mismo número de cadenas pesadas y ligeras y enlaces disulfuro que un anticuerpo IgG de origen natural de la misma subclase. Por ejemplo, un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 puede consistir en dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC), donde las dos HC y LC están unidas por el mismo número y ubicación de puentes disulfuro que se producen en los anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de origen natural, respectivamente (a menos que el anticuerpo se haya mutado para modificar los puentes disulfuro).

[0111] Una inmunoglobulina puede ser de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. El isotipo IgG se divide en subclases en determinadas especies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en ratones. Las inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG1, existen en varios alotipos, que difieren entre sí en como máximo unos pocos aminoácidos. "Anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, anticuerpos tanto de origen natural como de origen no natural; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humano y no humanos y anticuerpos completamente sintéticos.

[0113] El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo pueden realizarla fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab (fragmento de escisión de papaína) o un fragmento monovalente similar que consiste en los dominios VL, VH, LC y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2 (fragmento de escisión de pepsina) o un fragmento bivalente similar que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada y (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite prepararse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. usa 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y se examina la utilidad de los fragmentos de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

[0115] Una "región Fc" (región cristalizable de fragmento), "dominio Fc" o "Fc" se refiere a la región C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo que media en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, incluyendo la unión a receptores de Fc ubicados en diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) o al primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. Por lo tanto, una región Fc comprende la región constante de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de región constante (por ejemplo, CH1 o CL). En los isotipos de anticuerpo IgG, IgA e IgD, la región Fc comprende dos fragmentos de proteína idénticos, derivados del segundo (CH2) y tercer (CH3) dominios constantes de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; las regiones Fc de IgM e IgE comprenden tres dominios constantes de cadena pesada (dominios CH 2-4) en cada cadena polipeptídica. El isotipo IgG se divide en subclases en determinadas especies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en ratones. Para IgG, la región Fc comprende los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre los dominios CH1 y CH2. Aunque la definición de los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina puede variar, tal como se define en el presente documento, se define que la región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde un residuo de aminoácido D221 para IgG1, V222 para IgG2, L221 para IgG3 y P224 para IgG4 hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada, en donde la numeración es según el índice EU como en Kabat. El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana se extiende desde el aminoácido 237 hasta el aminoácido 340, y el dominio CH3 está situado en el lado C-terminal de un dominio CH2 en una región Fc, es decir, se extiende desde el aminoácido 341 hasta el aminoácido 447 o 446 (si el residuo de lisina C-terminal está ausente) o 445 (si los residuos de glicina y lisina C-terminales están ausentes) de una IgG. Tal como se usa en el presente documento, la región Fc puede ser una Fc de secuencia nativa, incluyendo cualquier variante alotípica, o una Fc variante (por ejemplo, una Fc de origen no natural).

[0117] Un "receptor de Fc" o "FcR" es un receptor que se une a la región Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen a un anticuerpo IgG comprenden receptores de la familia FcγR, que incluyen variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. La familia FcγR consiste en tres receptores activadores (FcγRI, FcγRIII y FcγRIV en ratones; FcγRIA, FcγRIIA y FcγRIIIA en seres humanos) y un receptor inhibidor (FcγRIIB). En la técnica se conocen diversas propiedades de FcγR humanos. La mayoría de los tipos de células efectoras innatas coexpresan uno o más FcγR activadores y el FcγRIIB inhibidor, mientras que las células citolíticas naturales (NK) expresan selectivamente un receptor de Fc activador (FcγRIII en ratones y FcγRIIIA en seres humanos) pero no el FcγRIIB inhibidor en ratones y seres humanos. La IgG1 humana se une a la mayoría de los receptores de Fc humanos y se considera equivalente a la IgG2a murina con respecto a los tipos de receptores de Fc activadores a los que se une.

[0119] El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN.

[0121] Tal como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE) que se codifica por los genes de región constante de cadena pesada.

[0123] Los aminoácidos se denominan en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, del mismo modo, se denominan por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

[0125] Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente mediante enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “proteína” abarque una molécula compuesta por uno o más polipéptidos, que, en algunos casos, pueden estar asociados mediante enlaces distintos de los enlaces amida. Por otro lado, una proteína también puede ser una única cadena polipeptídica. En este último caso, la única cadena polipeptídica puede comprender en algunos casos dos o más subunidades polipeptídicas fusionadas entre sí para formar una proteína. Los términos "polipéptido" y "proteína" también se refieren a los productos de modificaciones posteriores a la expresión, que incluyen, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido o proteína puede derivarse de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, pero no necesariamente se traduce a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier manera, incluso por síntesis química.

[0126] Los términos “polinucleótido” o “nucleótido” tal como se usan en el presente documento pretenden abarcar un ácido nucleico singular así como ácidos nucleicos plurales, y se refieren a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc) o ADN plasmídico (ADNp). En determinados aspectos, un polinucleótido comprende un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN, ADNc o ARN, presentes en un polinucleótido. Cuando se aplica a un ácido nucleico o polinucleótido, el término “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno nativo, por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica una proteína de unión a antígeno contenida en un vector se considera aislado para los fines de la presente divulgación. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o purificados (parcial o sustancialmente) de otros polinucleótidos en una disolución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARNin vivooin vitrode polinucleótidos de la presente divulgación. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados según la presente divulgación incluyen además tales moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede incluir elementos reguladores tales como promotores, potenciadores, sitios de unión a ribosomas o señales de terminación de la transcripción.

[0127] Intervalos:Tal como se describe en el presente documento, debe entenderse que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de número entero incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario.

[0128] El término "especie de HMW" se refiere a una cualquiera o más proteínas no deseadas presentes en una mezcla. Las especies de alto peso molecular pueden incluir dímeros, trímeros, tetrámeros u otros multímeros. Estas especies a menudo se consideran impurezas relacionadas con el producto, y pueden estar unidas de forma covalente o no covalente, y también pueden, por ejemplo, consistir en monómeros mal plegados en los que están expuestos residuos de aminoácidos hidrófobos a un disolvente polar, y pueden causar agregación.

[0129] El término "especie de LMW" se refiere a una cualquiera o más especies no deseadas presentes en una mezcla. Las especies de bajo peso molecular a menudo se consideran impurezas relacionadas con el producto, y pueden incluir especies recortadas, o medias moléculas para compuestos destinados a ser diméricos (tales como anticuerpos monoclonales).

[0130] El término "proteínas de la célula huésped" o HCP se refiere a las proteínas no deseadas generadas por una célula huésped no relacionadas con la producción de la proteína de interés prevista. Pueden secretarse proteínas de la célula huésped no deseadas en el sobrenadante de cultivo celular aguas arriba. También pueden liberarse proteínas de la célula huésped no deseadas durante la lisis celular. Las células usadas para el cultivo celular aguas arriba requieren proteínas para el crecimiento, la transcripción y la síntesis de proteínas, y estas proteínas no relacionadas no son deseables en un producto farmacológico final.

[0131] Diversos aspectos de la divulgación se describen en detalle adicional en las siguientes subsecciones.

[0132] II. Métodos de lavado de recuperación

[0133] La presente divulgación se refiere a un método de reducción o prevención de la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a 300 litros por metro cuadrado por hora (LMH), reduciendo o evitando de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para mejorar o aumentar una concentración de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón de lavado a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a 300 litros por metro cuadrado por hora (LMH), mejorando de ese modo la concentración de proteína objetivo en comparación con una concentración de proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En algunas realizaciones, la concentración deseada de la proteína objetivo es mayor de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 110 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 140 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 160 mg/ml, aproximadamente 170 mg/ml, aproximadamente 180 mg/ml, aproximadamente 190 mg/ml o aproximadamente 200 mg/ml.

[0135] Un enfoque estándar para purificar una proteína de interés en un proceso de fabricación posterior es concentrar la disolución de proteína a una concentración ligeramente superior (por ejemplo, un 20 % superior) con el fin de acomodar la dilución que se produce a partir del lavado de recuperación. Esta estrategia funciona bien para operaciones de UF/DF a concentraciones relativamente bajas de 50 mg/ml antes de la formulación. Por ejemplo, la proteína objetivo puede concentrarse hasta 55-60 mg/ml en las etapas de filtración y diluirse hasta 50 mg/ml antes de la formulación. A concentraciones de proteína de 55-60 mg/ml, la viscosidad de algunos anticuerpos monoclonales está normalmente en el intervalo de 2-6 mPa·s a temperatura ambiente.

[0137] En el caso de altas concentraciones de proteína, la concentración final y la dilución conducen a un círculo vicioso. Cuando la concentración de proteína es alta, es deseable concentrar la proteína objetivo a un nivel muy alto (es decir, superior a la concentración deseada después de la filtración) con el fin de permitir que el lavado de recuperación diluya la proteína hasta la concentración correcta, evitando de ese modo una dilución excesiva. Por ejemplo, concentrar la proteína a una concentración alta, por ejemplo, de 150 mg/ml a 170 mg/ml, podría llevar un tiempo sustancial, lo que conduciría a pasos de canal adicionales a través de la membrana y potencialmente afectaría a la calidad del producto. Además, incluso después de que se logre una alta concentración durante/después de la etapa de filtración, existe un alto riesgo de sobredilución del producto durante el lavado de recuperación. Esto se debe a que, en muchos procesos de purificación de proteínas a escala, puede mantenerse una cantidad considerable de proteína fuera de los tanques de retenido en el tubo o la tubería. Por lo tanto, debido a la alta cantidad de proteína mantenida en el tubo o la tubería, un lavado de recuperación inicial podría no acumular la cantidad total del producto de recuperación en el recipiente de recogida. Esto puede conducir a un lavado de recuperación adicional, lo que puede diluir aún más la concentración de producto final. Los presentes métodos se diseñan para prevenir o reducir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación al ralentizar la velocidad de flujo de lavado de un tampón de lavado. Por tanto, los presentes métodos permiten omitir o evitar la etapa de lavado de recuperación adicional durante el proceso de lavado de recuperación.

[0139] En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un método para reducir o prevenir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente descripción se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a 300 litros por metro cuadrado por hora (LMH), inferior a aproximadamente 250 LMH, inferior a aproximadamente 200 LMH, inferior a aproximadamente 150 LMH, inferior a aproximadamente 140 LMH, inferior a aproximadamente 130 LMH, inferior a aproximadamente 120 LMH, inferior a aproximadamente 110 LMH o inferior a aproximadamente 100 LMH, reduciendo o evitando de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para mejorar o aumentar una concentración de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente descripción se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón de lavado a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a 300 litros por metro cuadrado por hora (LMH), inferior a aproximadamente 250 LMH, inferior a aproximadamente 200 LMH, inferior a aproximadamente 150 LMH, inferior a aproximadamente 140 LMH, inferior a aproximadamente 130 LMH, inferior a aproximadamente 120 LMH, inferior a aproximadamente 110 LMH o inferior a aproximadamente 100 LMH, mejorando de ese modo la concentración de proteína objetivo en comparación con una concentración de proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En el método según la invención, la velocidad de flujo de lavado está entre aproximadamente 10 y 40 LMH.

[0140] Con el fin de prevenir o reducir la dilución de la proteína objetivo según los presentes métodos, el flujo en el conjunto de filtración es flujo laminar. El flujo laminar se produce cuando un fluido fluye en capas paralelas, sin interrupción entre capas. Cuando el número de Reynolds es menor de aproximadamente 2.000, el flujo en un tubo es generalmente laminar. Cuando el número de Reynolds es superior a aproximadamente 4.000, el flujo es turbulento. Un número de Reynolds entre 2.000 y 4.000 representa un área de transición entre el flujo laminar y el flujo turbulento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el número de Reynold ("Re") del flujo en el lavado de recuperación es de menos de 2000, menos de 1900, menos de 1800, menos de 1700, menos de 1600, menos de 1500, menos de 1400, menos de 1300, menos de 1200, menos de 1100, menos de 1000, menos de 900, menos de 800, menos de 700, menos de 600, menos de 500, menos de 400, menos de 300, menos de 200, menos de 100, menos de 90, menos de 80, menos de 70, menos de 60, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2 o menos de 1, en donde el Re se calcula con la siguiente fórmula:

[0143]

[0146] y

[0148] en donde D es el diámetro del canal (m) o diámetro equivalente en el caso de geometrías de canal de flujo no cilíndricas, υ es la velocidad promedio (m/s) (Q/A<c>), ρ es la densidad (kg/m<3>) y µ es la viscosidad (Pa·s).

[0150] En algunas realizaciones, el número de Reynold (Re) del flujo en el lavado de recuperación es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 45, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 35, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4, o entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3.

[0152] En algunas realizaciones, el número de Reynold (Re) del flujo en el lavado de recuperación es de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30. En algunas realizaciones, el número de Reynold (Re) del flujo en el lavado de recuperación es de aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59 o aproximadamente 60. En algunas realizaciones, el Re del flujo en el lavado de recuperación es de aproximadamente 3,8.

[0154] En determinadas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un método para reducir o prevenir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a aproximadamente 100 litros por metro cuadrado por hora (LMH), reduciendo o evitando de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para mejorar o aumentar una concentración de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón de lavado a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a aproximadamente 100 litros por metro cuadrado por hora (LMH), mejorando de ese modo la concentración de proteína objetivo en comparación con una concentración de proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de lavado está entre aproximadamente 5 LMH y aproximadamente 100 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 100 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 90 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 80 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 70 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 60 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 50 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 40 LMH, entre aproximadamente 10 LMH y aproximadamente 30 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 50 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 100 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 90 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 80 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 70 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 60 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 50 LMH, entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 40 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 100 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 90 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 80 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 70 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 60 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 50 LMH, entre aproximadamente 30 LMH y aproximadamente 40 LMH, o entre aproximadamente 20 LMH y aproximadamente 30 LMH. En el método según la invención, la velocidad de flujo de lavado está entre aproximadamente 10 y 40 LMH.

[0156] En algunas realizaciones de la divulgación, la velocidad de flujo de lavado es de al menos aproximadamente 10 LMH, al menos aproximadamente 20 LMH, al menos aproximadamente 30 LMH, al menos aproximadamente 40 LMH, al menos aproximadamente 50 LMH, al menos aproximadamente 60 LMH, al menos aproximadamente 70 LMH, al menos aproximadamente 80 LMH, al menos aproximadamente 90 LMH o al menos aproximadamente 100 LMH. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de lavado es de aproximadamente 30 LMH.

[0158] En determinadas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un método para reducir o prevenir la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a aproximadamente 30 litros por metro cuadrado por hora (LMH), reduciendo o evitando de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para mejorar o aumentar una concentración de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón de lavado a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que es inferior a aproximadamente 30 litros por metro cuadrado por hora (LMH), mejorando de ese modo la concentración de proteína objetivo en comparación con una concentración de proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH.

[0160] En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es de al menos aproximadamente 1 mPa·s (centipoise), al menos aproximadamente 2 mPa·s, al menos aproximadamente 3 mPa·s, al menos aproximadamente 4 mPa·s, al menos aproximadamente 5 mPa·s, al menos aproximadamente 6 mPa·s, al menos aproximadamente 7 mPa·s, al menos aproximadamente 8 mPa·s, al menos aproximadamente 9 mPa·s, al menos aproximadamente 10 mPa·s, al menos aproximadamente 11 mPa·s, al menos aproximadamente 12 mPa·s, al menos aproximadamente 13 mPa·s, al menos aproximadamente 14 mPa·s, al menos aproximadamente 15 mPa·s, al menos aproximadamente 16 mPa·s, al menos aproximadamente 17 mPa·s, al menos aproximadamente 18 mPa·s, al menos aproximadamente 19 mPa·s, al menos aproximadamente 20 mPa·s, al menos aproximadamente 21 mPa·s, al menos aproximadamente 22 mPa·s, al menos aproximadamente 23 mPa·s, al menos aproximadamente 24 mPa·s, al menos aproximadamente 25 mPa·s, al menos aproximadamente 26 mPa·s, al menos aproximadamente 27 mPa·s, al menos aproximadamente 28 mPa·s, al menos aproximadamente 29 mPa·s o al menos aproximadamente 30 mPa·s.

[0162] En algunas realizaciones, la presente divulgación puede ser particularmente eficaz para filtrar una proteína objetivo que tiene alta viscosidad. En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es alta, y es de al menos aproximadamente 20 mPa·s (centipoise), al menos aproximadamente 21 mPa·s, al menos aproximadamente 22 mPa·s, al menos aproximadamente 23 mPa·s, al menos aproximadamente 24 mPa·s, al menos aproximadamente 25 mPa·s, al menos aproximadamente 26 mPa·s, al menos aproximadamente 27 mPa·s, al menos aproximadamente 28 mPa·s, al menos aproximadamente 29 mPa·s, al menos aproximadamente 30 mPa·s, al menos aproximadamente 31 mPa·s, al menos aproximadamente 32 mPa·s, al menos aproximadamente 33 mPa·s, al menos aproximadamente 34 mPa·s, al menos aproximadamente 35 mPa·s, al menos aproximadamente 36 mPa·s, al menos aproximadamente 37 mPa·s, al menos aproximadamente 38 mPa·s, al menos aproximadamente 39 mPa·s, al menos aproximadamente 40 mPa·s, al menos aproximadamente 41 mPa·s, al menos aproximadamente 42 mPa·s, al menos aproximadamente 43 mPa·s, al menos aproximadamente 44 mPa·s, al menos aproximadamente 45 mPa·s, al menos aproximadamente 46 mPa·s, al menos aproximadamente 47 mPa·s, al menos aproximadamente 48 mPa·s, al menos aproximadamente 49 mPa·s, al menos aproximadamente 50 mPa·s, al menos aproximadamente 51 mPa·s, al menos aproximadamente 52 mPa·s, al menos aproximadamente 53 mPa·s, al menos aproximadamente 54 mPa·s, al menos aproximadamente 55 mPa·s, al menos aproximadamente 56 mPa·s, al menos aproximadamente 57 mPa·s, al menos aproximadamente 58 mPa·s, al menos aproximadamente 59 mPa·s, al menos aproximadamente 60 mPa·s, al menos aproximadamente 61 mPa·s, al menos aproximadamente 62 mPa·s, al menos aproximadamente 63 mPa·s, al menos aproximadamente 64 mPa·s, al menos aproximadamente 65 mPa·s, al menos aproximadamente 66 mPa·s, al menos aproximadamente 67 mPa·s, al menos aproximadamente 68 mPa·s, al menos aproximadamente 69 mPa·s, al menos aproximadamente 70 mPa·s, al menos aproximadamente 71 mPa·s, al menos aproximadamente 72 mPa·s, al menos aproximadamente 73 mPa·s, al menos aproximadamente 74 mPa·s, al menos aproximadamente 75 mPa·s, al menos aproximadamente 76 mPa·s, al menos aproximadamente 77 mPa·s, al menos aproximadamente 78 mPa·s, al menos aproximadamente 79 mPa·s, al menos aproximadamente 80 mPa·s, al menos aproximadamente 81 mPa·s, al menos aproximadamente 82 mPa·s, al menos aproximadamente 83 mPa·s, al menos aproximadamente 84 mPa·s, al menos aproximadamente 85 mPa·s, al menos aproximadamente 86 mPa·s, al menos aproximadamente 87 mPa·s, al menos aproximadamente 88 mPa·s, al menos aproximadamente 89 mPa·s, al menos aproximadamente 90 mPa·s, al menos aproximadamente 91 mPa·s, al menos aproximadamente 92 mPa·s, al menos aproximadamente 93 mPa·s, al menos aproximadamente 94 mPa·s, al menos aproximadamente 95 mPa·s, al menos aproximadamente 96 mPa·s, al menos aproximadamente 97 mPa·s, al menos aproximadamente 98 mPa·s, al menos aproximadamente 99 mPa·s o al menos aproximadamente 100 mPa·s. En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo está entre aproximadamente 20 mPa·s y aproximadamente 100 mPa·s, entre aproximadamente 20 mPa·s y aproximadamente 90 mPa·s, entre aproximadamente 25 mPa·s y aproximadamente 100 mPa·s, entre aproximadamente 25 mPa·s y aproximadamente 90 mPa·s, entre aproximadamente 30 mPa·s y aproximadamente 100 mPa·s, entre aproximadamente 30 mPa·s y aproximadamente 90 mPa·s, entre aproximadamente 30 mPa·s y aproximadamente 80 mPa·s, entre aproximadamente 30 mPa·s y aproximadamente 70 mPa·s, entre aproximadamente 40 mPa·s y aproximadamente 60 mPa·s. En otras realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es de aproximadamente 10 mPa·s, aproximadamente 20 mPa·s, aproximadamente 30 mPa·s, aproximadamente 40 mPa·s, aproximadamente 50 mPa·s, aproximadamente 60 mPa·s, aproximadamente 70 mPa·s, aproximadamente 80 mPa·s, aproximadamente 90 mPa·s o aproximadamente 100 mPa·s.

[0164] En algunas realizaciones, la viscosidad de la proteína objetivo es baja y es de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 10 mPa·s, de aproximadamente 3 mPa ·s a aproximadamente 10 mPa·s, de aproximadamente 1 mPa·s a aproximadamente 9 mPa·s, de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 8 mPa·s, de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 7 mPa·s, de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 6 mPa·s, de aproximadamente 3 mPa·s a aproximadamente 6 mPa·s, de aproximadamente 4 mPa·s a aproximadamente 5 mPa·s, o de aproximadamente 2 mPa·s a aproximadamente 5 mPa·s.

[0166] Por lo tanto, los presentes métodos pueden mejorar la concentración de una proteína objetivo después de un lavado de recuperación al prevenir o reducir la dilución de la proteína objetivo durante el lavado de recuperación. En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de al menos aproximadamente 100 g/l, al menos aproximadamente 110 g/l, al menos aproximadamente 120 g/l, al menos aproximadamente 130 g/l, al menos aproximadamente 140 g/l, al menos aproximadamente 150 g/l, al menos aproximadamente 160 g/l, al menos aproximadamente 170 g/l, al menos aproximadamente 180 g/l, al menos aproximadamente 190 g/l, al menos aproximadamente 200 g/l, al menos aproximadamente 210 g/l, al menos aproximadamente 220 g/l, al menos aproximadamente 230 g/l, al menos aproximadamente 240 g/l, al menos aproximadamente 250 g/l, al menos aproximadamente 260 g/l, al menos aproximadamente 270 g/l, al menos aproximadamente 280 g/l, al menos aproximadamente 290 g/l, o al menos aproximadamente 300 g/l al menos aproximadamente 200 g/l, al menos aproximadamente 210 g/l, al menos aproximadamente 220 g/l, al menos aproximadamente 230 g/l, al menos aproximadamente 240 g/l, al menos aproximadamente 250 g/l, al menos aproximadamente 260 g/l, al menos aproximadamente 270 g/l, al menos aproximadamente 280 g/l, al menos aproximadamente 290 g/l o al menos aproximadamente 300 g/l antes de las filtraciones.

[0168] En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 110 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 120 g/l a aproximadamente 240 g/l, de aproximadamente 150 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 130 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 140 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 160 g/l a aproximadamente 220 g/l o de aproximadamente 170 g/l a aproximadamente 230 g/l.

[0170] En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 110 g/l a aproximadamente 300 g/l, de aproximadamente 110 g/l a aproximadamente 290 g/l, de aproximadamente 120 g/l a aproximadamente 290 g/l, de aproximadamente 120 g/l a aproximadamente 280 g/l, de aproximadamente 130 g/l a aproximadamente 280 g/l, de aproximadamente 130 g/l a aproximadamente 270 g/l, de aproximadamente 140 g/l a aproximadamente 270 g/l, de aproximadamente 140 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 150 g/l a aproximadamente 260 g/l, de aproximadamente 150 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 160 g/l a aproximadamente 250 g/l, de aproximadamente 160 g/l a aproximadamente 240 g/l, de aproximadamente 170 g/l a aproximadamente 240 g/l, de aproximadamente 170 g/l a aproximadamente 230 g/l, de aproximadamente 180 g/l a aproximadamente 230 g/l, de aproximadamente 180 g/l a aproximadamente 220 g/l, de aproximadamente 190 g/l a aproximadamente 220 g/l, de aproximadamente 190 g/l a aproximadamente 210 g/l o de aproximadamente 200 g/l a aproximadamente 210 g/l.

[0172] En algunas realizaciones, la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de aproximadamente 90 g/l, aproximadamente 100 g/l, aproximadamente 110 g/l, aproximadamente 120 g/l, aproximadamente 130 g/l, aproximadamente 140 g/l, aproximadamente 150 g/l, aproximadamente 160 g/l, aproximadamente 170 g/l, aproximadamente 180 g/l, aproximadamente 190 g/l, aproximadamente 200 g/l, aproximadamente 210 g/l, aproximadamente 220 g/l, aproximadamente 230 g/l, aproximadamente 240 g/l, aproximadamente 250 g/l, aproximadamente 260 g/l, aproximadamente 270 g/l, aproximadamente 280 g/l, aproximadamente 290 g/l o aproximadamente 300 g/l.

[0174] En algunas realizaciones, el rendimiento de la proteína objetivo después del lavado de recuperación según los presentes métodos es de al menos el 70 %, al menos el 71 %, al menos el 72 %, al menos el 73 %, al menos el 74 %, al menos el 75 %, al menos el 76 %, al menos el 77 %, al menos el 78 %, al menos el 79 %, al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 100 % en comparación con el rendimiento de la proteína objetivo antes del proceso de lavado de recuperación.

[0176] En algunas realizaciones, el rendimiento de la proteína objetivo después del lavado de recuperación según los presentes métodos aumenta en al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 2 %, al menos aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 4 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 6 %, al menos aproximadamente el 7 %, al menos aproximadamente el 8 %, al menos aproximadamente el 9 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 11 %, al menos aproximadamente el 12 %, al menos aproximadamente el 13 %, al menos aproximadamente el 14 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 16 %, en al menos aproximadamente el 17 %, al menos aproximadamente el 18 %, al menos aproximadamente el 19 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 21 %, al menos aproximadamente el 22 %, al menos aproximadamente el 23 %, al menos aproximadamente el 24 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 26 %, al menos aproximadamente el 27 %, al menos aproximadamente el 28 %, al menos aproximadamente el 29 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 36 %, al menos aproximadamente el 37 %, al menos aproximadamente el 38 %, al menos aproximadamente el 39 % o al menos aproximadamente el 40 %, en comparación con un rendimiento de la proteína objetivo obtenida después de un lavado de recuperación con una velocidad de flujo de 300 LMH. En algunas realizaciones, el paso en (i) es a una velocidad de flujo de alimentación mayor que la velocidad de flujo de lavado en (ii).

[0178] Según los presentes métodos, la proteína objetivo se hace pasar a través del conjunto de filtración mientras la filtración está en funcionamiento. La velocidad de flujo en una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF) en donde una alimentación que contiene una proteína objetivo se denomina en el presente documento velocidad de flujo de alimentación en lugar de velocidad de flujo de lavado. El flujo tangencial de la alimentación evita que las partículas atrapadas en la superficie del filtro se acumulen y, por lo tanto, interfieran con la filtración. Durante una etapa de concentración de ultrafiltración, el flujo de alimentación al casete de membrana de ultrafiltración proporciona la presión transmembrana (TMP) y el flujo de flujo cruzado necesarios para la concentración y el intercambio de tampón.

[0180] En la presente divulgación, la velocidad de flujo de alimentación es mayor que la velocidad de flujo de lavado. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de alimentación es de al menos 200 LMH, al menos 210 LMH, al menos 220 LMH, al menos 230 LMH, al menos 240 LMH, al menos 250 LMH, al menos 260 LMH, al menos 270 LMH, al menos 280 LMH, al menos 290 LMH, al menos 300 LMH, al menos 310 LMH, al menos 320 LMH, al menos 330 LMH, al menos 340 LMH, al menos 350 LMH, al menos 360 LMH, al menos 370 LMH, al menos 380 LMH, al menos 390 LMH, al menos 400 LMH, al menos 410 LMH, al menos 420 LMH, al menos 430 LMH, al menos 440 LMH, al menos 450 LMH, al menos 460 LMH, al menos 470 LMH, al menos 480 LMH, al menos 490 LMH o al menos 500 LMH, en donde la velocidad de flujo de lavado es inferior a la velocidad de flujo de alimentación, por ejemplo, inferior a 100 LMH.

[0182] En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de alimentación está entre 200 LMH y 500 LMH, entre 200 LMH y 450 LMH, entre 250 LMH y 450 LMH, 450 LMH, entre 300 LMH y 450 LMH, entre 300 LMH y 400 LMH, o entre 300 LMH y 350 LMH. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo de alimentación es de aproximadamente 300 LMH.

[0184] Según los presentes métodos, se usa un conjunto de filtración para llevar a cabo la filtración de la proteína de interés. Un conjunto de filtración generalmente comprende elementos tales como un soporte de filtro, un casete de filtración y un puerto para que fluya el filtrado. El casete de filtración es el elemento del conjunto que generalmente contiene el filtro de membrana que se usa para la separación y purificación de biomoléculas. Se usa una membrana de filtración para purificar la proteína objetivo de interés. En algunas realizaciones, se usa una membrana de filtración para retener células, restos celulares, orgánulos y otros componentes mientras se permite que las proteínas y los solutos más pequeños pasen al filtrado. En algunas realizaciones, el conjunto de filtración comprende una membrana. En otras realizaciones, la membrana útil para la membrana del conjunto de filtración se deriva de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), polisulfona, polietersulfona, poliarilsulfona, celulosa regenerada, poliamida, polipropileno, polietileno, politetrafluoroetileno, acetato de celulosa, poliacrilonitrilo, copolímero de vinilo, poliamidas (tales como "nailon 6" o nailon 66"), policarbonato, PFA o cualquier combinación de los mismos.

[0185] Los métodos según la presente divulgación incluyen el uso de un tampón de lavado durante un lavado de recuperación para recuperar la proteína que se mantiene fuera de los recipientes de recogida en el tubo, la tubería u otras áreas de "retención". Es necesario un lavado de recuperación para recuperar una mayor cantidad de producto proteico en el recipiente de recogida u otro recipiente usado para recoger el producto proteico purificado, ya que no toda la proteína purificada alcanza el recipiente de recogida durante la ejecución de purificación inicial. En algunos casos, la purificación y concentración de proteínas a altos niveles puede conducir a una agregación de proteínas no deseada. La modificación del pH, el contenido de sal u otros componentes del tampón puede ser necesaria para evitar la agregación de proteínas u otros efectos no deseados durante el proceso de purificación y concentración. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende un ácido orgánico o inorgánico o una sal del mismo. En algunas realizaciones, el ácido orgánico o inorgánico es citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínicohidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumáricofumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónicogliconato de potasio, etc.), oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálicohidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), lactato (por ejemplo, mezcla de ácido lácticolactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.), sal de trimetilamina, (por ejemplo, Tris), fosfato o histidina. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende histidina. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende un azúcar. En algunas realizaciones, el azúcar es sacarosa, trehalosa, manitol, xilitol, eritritol, lactosa, glucosa, azúcar en polvo o pululano. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende histidina 20 mM y sacarosa 250 mM.

[0187] Según los métodos de la presente divulgación, se usa un tampón de filtración durante el proceso de hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento. El tampón de filtración es esencial para proteger el equipo de cromatografía y filtración aguas abajo, y se usa durante el proceso de purificación y concentración de proteínas. El tampón de filtración difiere del tampón de lavado en que el tampón de lavado se usa durante la recuperación del lavado, que sigue al proceso de purificación y concentración de proteínas. En algunas realizaciones, los componentes en el tampón de filtración son los mismos que los del tampón de lavado. En otras realizaciones, los componentes en el tampón de filtración son diferentes de los del tampón de lavado.

[0189] La purificación y concentración de proteínas a altos niveles puede conducir a la agregación de proteínas no deseadas. La modificación del pH, el contenido de sal u otros componentes del tampón puede ser necesaria para evitar la agregación de proteínas u otros efectos no deseados durante el proceso de purificación y concentración. En algunas realizaciones, el tampón de filtración comprende un ácido orgánico o inorgánico o una sal del mismo. En algunas realizaciones, el ácido orgánico o inorgánico es citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódicocitrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónicogliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gliconato de potasio, etc.), oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.), sal de trimetilamina, (por ejemplo, Tris), fosfato o histidina.

[0191] En algunas realizaciones, el tampón de filtración comprende un azúcar. En algunas realizaciones, el azúcar es sacarosa, trehalosa, manitol, xilitol, eritritol, lactosa, glucosa, azúcar en polvo o pululano. En algunas realizaciones, el tampón de lavado y/o el tampón de filtración está a un pH de aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9 o aproximadamente 9,5.

[0192] Según los métodos de la presente invención, una muestra que contiene una proteína de interés se hace pasar en primer lugar a través de un conjunto de filtración y luego se somete a un lavado de recuperación. En algunas realizaciones, la muestra puede haberse sometido ya a actividades de purificación previas directamente aguas arriba de la etapa de lavado por filtración y recuperación, tal como filtración de virus, cromatografía de intercambio aniónico (AEX), cromatografía de intercambio catiónico (CEX), filtración en profundidad, tratamiento con ácido o cromatografía de proteína A. La muestra que se somete a purificación y filtración puede derivarse de fuentes tales como cultivos celulares, lisados celulares o masa clarificada (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular clarificado). En algunas realizaciones, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de proteína pura, una muestra de proteína a granel clarificada, una muestra de cultivo celular y cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra de cultivo celular se deriva de medios de cultivo celular que comprenden células de mamífero. En algunas realizaciones, las células de mamífero se seleccionan de células de ovario de hámster chino (CHO), células HEK293, mieloma de ratón (NSO), células de riñón de cría de hámster (BHK), fibroblastos de riñón de mono (COS-7), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) o cualquier combinación de las mismas.

[0193] La proteína objetivo útil para los presentes métodos es cualquier proteína, polipéptido o péptido, ya sea de origen natural o producido de forma recombinante. En algunas realizaciones, la proteína objetivo tiene alta viscosidad. En algunas realizaciones, la proteína objetivo es una proteína con un alto peso molecular (por ejemplo, de 100 kDa a 500 kDa). En otras realizaciones, la proteína objetivo es una proteína con un peso molecular bajo. En otras realizaciones, la proteína objetivo tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 10 kDa, al menos aproximadamente 20 kDa, al menos aproximadamente 30 kDa, al menos aproximadamente 40 kDa, al menos aproximadamente 50 kDa, al menos aproximadamente 60 kDa, al menos aproximadamente 70 kDa, al menos aproximadamente 80 kDa, al menos aproximadamente 90 kDa, al menos aproximadamente 100 kDa, al menos aproximadamente 110 kDa, al menos aproximadamente 120 kDa, al menos aproximadamente 130 kDa, al menos aproximadamente 140 kDa, al menos aproximadamente 150 kDa, al menos aproximadamente 160 kDa, al menos aproximadamente 170 kDa, al menos aproximadamente 180 kDa, al menos aproximadamente 190 kDa o al menos aproximadamente 200 kDa, y hasta 400 kDa o 500 kDa.

[0194] En algunas realizaciones, la proteína objetivo comprende un anticuerpo o una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína objetivo comprende un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo seleccionado de IgM, IgA, IgE, IgD e IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los presentes métodos pueden ser aplicables a cualquier anticuerpo que se una específicamente a un antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-CXCR4, un anticuerpo anti-CD73, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-CSF1R o un anticuerpo anti-IL8.

[0195] En algunas realizaciones, la proteína objetivo comprende una enzima, una hormona, una citocina, un receptor de superficie celular, una proteasa, un receptor de citocina o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína objetivo es una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína de fusión se fusiona con un resto heterólogo. En algunas realizaciones, el resto heterólogo es un resto que prolonga la semivida. En algunas realizaciones, el resto heterólogo comprende albúmina, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, un polipéptido de unión a inmunoglobulina, una inmunoglobulina G (IgG), polipéptido de unión a albúmina (ABP), un resto de PASilación, un resto de HESilación, XTEN, un resto de PEGilación, una región Fc y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el resto que prolonga la semivida comprende un resto no polipeptídico. En algunas realizaciones, el resto que prolonga la semivida comprende un polipéptido. En algunas realizaciones, el resto que prolonga la semivida comprende un Fc. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión para la presente divulgación comprende una sustitución de aminoácido en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, variantes de Fc), que altera las funciones efectoras independientes de antígeno de la región constante de Ig, en particular la semivida en circulación de la proteína.

[0196] Ejemplos

[0197] Ejemplo 1

[0198] Evaluación del diseño a escala reducida

[0199] Con el fin de evaluar los posibles procesos de lavado de recuperación, se diseñó un modelo a escala reducida para analizar los cambios en el tamaño de los tubos. Este modelo a escala reducida usó un área de membrana de 176 cm<2>y se sometió a prueba por primera vez usando tubos de tamaño 16. En la tabla 1 se describen diversos tubos usados en el modelado. Se usó una concentración de proteína de partida de 250 g/l y se sometieron a prueba diversas velocidades de flujo de alimentación de lavado. Estos datos se representan en la figura 1. Una velocidad de flujo de alimentación de lavado más alta conduce a una concentración de proteína final más baja y, por lo tanto, serían deseables velocidades de flujo de lavado más bajas, tal como se observa en la figura 1.

[0200] Tabla 1. Tubos dependientes de escala

[0203]

[0204]

[0206] El efecto del parámetro de velocidad de flujo sobre el número de Reynold se exploró usando una mezcla con una viscosidad y densidad fijas, y se detalla en la figura 2. La mezcla tenía una viscosidad de 17 mPa·s y una densidad de 1,08 g/cm<3>, y se usó una velocidad de flujo fija de 30 litros/M<2>/hora. Debido a las diferencias en la sección transversal de los diversos tubos usados, tuvieron que ajustarse las velocidades de flujo específicas para cada tubo. Se usó una velocidad de flujo de 0,03 l/min para el sistema CM150, y se usó una velocidad de flujo de 0,04 l/min para DCM.

[0207] El efecto de la viscosidad sobre el número de Reynold también se evaluó usando una velocidad de flujo fija de 0,019 m/s. Estos datos se resumen en la figura 3. Viscosidades más altas condujeron a números de Reynold calculados más altos para cada uno de los tipos de tubos.

[0208] Ejemplo 2

[0209] Evaluación de la estrategia de lavado usando diversos anticuerpos monoclonales

[0210] Se evaluaron tres anticuerpos monoclonales (A, B y C) usando el proceso de lavado diseñado. Los datos recogidos del proceso de lavado con anticuerpo A se detallan en la tabla 2. Estos datos incluyen el flujo de lavado (LMH), el número de Reynold (Re), la concentración de retenido, la concentración de sustancia farmacológica purificada, el rendimiento, el rendimiento esperado y el volumen de lavado. Después de la evaluación de un proceso de lavado a escala reducida, el enfoque también se validó en la escala de filtración de flujo tangencial (TFF) de CM150 para el anticuerpo monoclonal A. En todos los casos, la velocidad de flujo se estableció en un flujo de 30 litros/M<2>/hora. Teniendo en cuenta la sección transversal del tubo usado en el sistema CM150, esto corresponde a un número de Reynold de 265 en el sistema CM150. Se generaron datos adicionales a escala reducida y de TFF de CM150 para los anticuerpos monoclonales B y C, y estos datos se presentan en la tabla 2 y tabla 3, respectivamente.

[0211] Tabla 2. Datos para el anticuerpo monoclonal A

[0213]

[0215] Tabla 3. Lavado de recuperación de 30 litros/M<2>/hora del anticuerpo monoclonal B

[0217]

[0219] Tabla 3. Lavado de recuperación de 30 litros/M<2>/hora del anticuerpo monoclonal C

[0221]

[0222]

[0224] La amplitud y el alcance de la presente invención deben definirse solo según las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Método para reducir o evitar la dilución de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración que comprende (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que está entre 10 y 40 litros por metro cuadrado por hora (LMH), reduciendo o evitando de ese modo la dilución de la proteína objetivo en comparación con la dilución de una proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH.

2. Método para mejorar o aumentar una concentración de una proteína objetivo durante un lavado de recuperación después de una filtración que comprende (i) hacer pasar una muestra que contiene la proteína objetivo a través de un conjunto de filtración a una velocidad de flujo de alimentación mientras la filtración está en funcionamiento y (ii) hacer pasar un tampón de lavado a través del conjunto de filtración durante un lavado de recuperación a una velocidad de flujo de lavado que está entre 10 y 40 litros por metro cuadrado por hora (LMH), mejorando de ese modo la concentración de proteína objetivo en comparación con una concentración de proteína objetivo obtenida con una velocidad de flujo de lavado de 300 LMH.

3. Método de la reivindicación 1 o 2, en donde el número de Reynold ("Re") del flujo en el lavado de recuperación es de

(i) menos de 2000, menos de 1500, menos de 1000, menos de 900, menos de 800, menos de 700, menos de 600, menos de 500, menos de 400, menos de 300, menos de 200, menos de 100, menos de 90, menos de 80, menos de 70, menos de 60, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, menos de 5, menos de 4 o menos de 3; o

(ii) entre 1 y 50, entre 1 y 45, entre 1 y 40, entre 1 y 35, entre 1 y 30, entre 1 y 25, entre 1 y 20, entre 1 y 15, entre 1 y 10, entre 2 y 40, entre 2 y 10, entre 2 y 9, entre 3 y 8, entre 4 y 7, entre 4 y 6, entre 3 y 7, entre 3 y 6, entre 3 y 5, entre 2 y 8 entre 2 y 2 y 6, entre 2 y 5, entre 3 y 10 o entre 4 y 6; o

(iii) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30; donde Re se calcula con la siguiente fórmula:

y

en donde D es el diámetro del canal (m) o diámetro equivalente en el caso de geometrías de canal de flujo no cilíndricas, υ es la velocidad promedio (m/s) (Q/A<c>), ρ es la densidad (kg/m<3>) y µ es la viscosidad (Pa·s).

4. Método de la reivindicación 1 o 3, en donde la velocidad de flujo de lavado es de

(i) entre 10 LMH y 30 LMH, entre 20 LMH y 40 LMH, entre 30 LMH y 40 LMH, o entre 20 LMH y 30 LMH; o

(ii) 30 LMH.

5. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la concentración de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de

(i) al menos 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 210 g/l, 220 g/l, 230 g/l, 240 g/l, 250 g/l, 260 g/l, 270 g/l, 280 g/l, 290 g/l o 300 g/l antes de las filtraciones; o

(ii) de 100 g/l a 300 g/l, de 110 g/l a 250 g/l, de 120 g/l a 240 g/l, de 150 g/l a 250 g/l, de 130 g/l a 260 g/l,de 140 g/l a 260 g/l, de 160 g/l a 220 g/l, o de 170 g/l a 230 g/l, o 90 g/l, o 100 g/l, o g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 210 g/l, 220 g/l, 230 g/l, 240 g/l, 250 g/l, 260 g/l, 270 g/l, 280 g/l, 290 g/l o 300 g/l.

6. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el rendimiento de la proteína objetivo después del lavado de recuperación es de al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 100 % en comparación con el rendimiento de la proteína objetivo

antes del proceso de lavado de recuperación que consiste en (i) y (ii); o

en donde el rendimiento de la proteína objetivo después del lavado de recuperación aumenta en al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 % o al menos el 20 % en comparación con un rendimiento de la proteína objetivo obtenida después de un lavado de recuperación con una velocidad de flujo de 300 LMH.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 6, en donde la velocidad de flujo es de (i) al menos 200 LMH, al menos 210 LMH, al menos 220 LMH, al menos 230 LMH, al menos 240 LMH, al menos 250 LMH, al menos 260 LMH, al menos 270 LMH, al menos 280 LMH, al menos 290 LMH, al menos 300 LMH, al menos 310 LMH, al menos 320 LMH, al menos 330 LMH, al menos 340 LMH, al menos 350 LMH, al menos 360 LMH, al menos 370 LMH, al menos 380 LMH, al menos 390 LMH, al menos 400 LMH, al menos 410 LMH, al menos 420 LMH, al menos 430 LMH, al menos 440 LMH, al menos 450 LMH, al menos 460 LMH, al menos 470 LMH, al menos 480 LMH, al menos 490 LMH o al menos 500 LMH;

(ii) entre 200 LMH y 500 LMH, entre 200 LMH y 450 LMH, entre 250 LMH y 450 LMH, 450 LMH, entre 300 LMH y 450 LMH, entre 300 LMH y 400 LMH, o entre 300 LMH y 350 LMH; o

(iii) 300 LMH.

8. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se usa un tampón de filtración durante la etapa (i) del método, en donde el tampón de filtración es el mismo que el tampón de lavado o en donde el tampón de filtración es diferente del tampón de lavado.

9. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el tampón de lavado y/o el tampón de filtración comprenden

(i) un ácido orgánico o inorgánico o una sal del mismo, en donde el ácido orgánico o inorgánico es citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínicosuccinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínicosuccinato disódico, etc.), tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido monosódico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónicogliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálicohidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acéticohidróxido de sodio, etc.), sal de trimetilamina, (por ejemplo, Tris), fosfato o histidina; y/o

(ii) un azúcar, opcionalmente en donde el azúcar es sacarosa, trehalosa, manitol, xilitol, eritritol, lactosa, glucosa, azúcar en polvo o pululano.

10. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el tampón de lavado comprende histidina 20 mM y sacarosa 250 mM.

11. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el tampón de lavado y/o el tampón de filtración está a un pH de 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9 o 9,5.

12. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de proteína pura, una muestra de proteína a granel clarificada, una muestra de cultivo celular y cualquier combinación de las mismas, opcionalmente en donde la muestra de cultivo celular se deriva de medios de cultivo celular que comprenden células de mamífero, opcionalmente en donde las células de mamífero se seleccionan de células de ovario de hámster chino (CHO), células HEK293, mieloma de ratón (NSO), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de fibroblastos de riñón de mono (COS-7), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) o cualquier combinación de las mismas.

13. Método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la proteína objetivo comprende un anticuerpo o una proteína de fusión; y/o una enzima, una hormona, una citocina, un receptor de superficie celular, una proteasa, un receptor de citocina, o cualquier combinación de los mismos.

14. Método de la reivindicación 13, en donde la proteína objetivo comprende un anticuerpo y en donde el anticuerpo es

(i) un isotipo seleccionado de IgM, IgA, IgE, IgD e IgG, opcionalmente en donde el anticuerpo IgG se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; y/o

(ii) un anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-CXCR4, un anticuerpo anti-CD73, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-CSF1R o un anticuerpo anti-IL8.

15. Método de la reivindicación 13, en donde la proteína objetivo es una proteína de fusión, opcionalmente en donde la proteína de fusión se fusiona con un resto heterólogo, opcionalmente en donde el resto heterólogo es un resto que prolonga la semivida, opcionalmente en donde el resto que prolonga la semivida comprende un Fc.