ES3058740A1 - Nanopartícula lipídica, composición farmacéutica y uso de la nanopartícula en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una nanopartícula lipídica y a una composición que comprende dicha nanopartícula para su uso en el tratamiento del cáncer. De forma concreta, la invención propone una nanopartícula lipídica con una estructura que permite la eficaz encapsulación de ARNm de un antígeno inmunogénico exógeno para su expresión en células tumorales, lo que permite la activación del sistema inmune y el ataque inmunológico hacia el tumor. El diseño de las nanopartículas lipídicas ha sido desarrollado para cargar y transfectar eficientemente el ARNm de una proteína inmunogénica, evitando la expresión en células sanas, lo que ventajosamente minimiza la citotoxicidad residual al emplearse las nanopartículas de la invención. El enfoque innovar de la invención se basa por tanto en la utilización de antígenos virales o inmunogénicos a los que gran parte de la población es inmune, de forma natural o adquirida.

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Nanopartícula lipídica, composición farmacéutica y uso de la nanopartícula en el tratamiento del cáncer

[0005] SECTOR DE LA TÉCNICA

[0007] La presente invención se enmarca en el campo de la terapia génica para el tratamiento de tumores. De forma concreta, la invención se refiere a una nanopartícula lipídica con una estructura que permite la eficaz encapsulación de ARNm de un antígeno inmunogénico para la expresión de un antígeno inmunogénico exógeno en células tumorales, lo que permite la activación del sistema y el ataque inmunológico hacia el tumor. El diseño de las nanopartículas lipídicas ha sido desarrollado para cargar y transfectar eficientemente el ARNm de una proteína inmunogénica, evitando la expresión en células sanas, lo que ventajosamente minimiza la citotoxicidad residual al emplearse las nanopartículas de la invención.

[0009] El enfoque innovar de la invención se basa en la utilización de antígenos virales o inmunogénicos a los que gran parte de la población es inmune, en vez de en neoantígenos, que es la aproximación actualmente empleada en la clínica.

[0011] ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

[0013] El cáncer es una de las enfermedades con mayor prevalencia, y es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Además, la tasa de morbilidad está en aumento (Ferlay J, Ervik M, Lam F, Colombet M, Mery L, Piñeros M, et al. Global Cancer Observatory: Cancer Today. Lyon: International Agency for Research on Cancer; 2020). Hay más de un centenar de tipos de cáncer, dependiendo de su agresividad, el tipo celular o tejido del que provienen, sus mutaciones genéticas, etc. Esta variabilidad hace que cada tumor sea diferente en cada paciente, e incluso que cada célula de un mismo tumor tenga particularidades y comportamiento diferentes (Nguyen, A.; Yoshida, M.; Goodarzi, H.; Tavazoie, S.F. Highly variable cancer subpopulations that exhibit enhanced transcriptome variability and metastatic fitness. Nat. Commun. 2016, 7, 11246.)). Por todo ello, a pesar de los esfuerzos realizados por los investigadores y personal médico, el tratamiento del cáncer sigue siendo un problema sin solución trivial, especialmente en los tipos de cáncer más agresivos.

[0014] Las terapias convencionales como la quimioterapia, la radioterapia, la cirugía, y distintas combinaciones de estas, tienen importantes limitaciones como un índice terapéutico estrecho, los elevados y graves efectos secundarios, la aparición de resistencias, y la aparición de recidivas. Por ejemplo, un gran número de quimioterapéuticos tienen un índice terapéutico estrecho, y su uso en elevadas dosis causa una gran cantidad de efectos secundarios no deseados. En el caso de fármacos hidrofóbicos, se observa que tienen un perfil farmacocinético muy pobre, acumulándose en tejidos y órganos grasos, llegando muy poca cantidad de estos al tumor. Además, la aparición de resistencia a fármacos es otra importante limitación en el tratamiento actual de los tumores. En el caso de la radioterapia, la zona tratada es siempre mayor a la zona tumoral, causando también importantes efectos secundarios. Por otro lado, uno de los grandes problemas de la cirugía es la aparición de recidivas.

[0016] Por todos estos motivos, han surgido alternativas como la inmunoterapia, es decir, en la activación o potenciación del sistema inmune para que ataque a las células tumorales, ya que suelen evadirlo en condiciones normales (S. Tan, D. Li, and X. Zhu, Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond, Biomed. Pharmacother. 124 (2020), https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.109821). Dentro de estas terapias encontramos las vacunas contra el cáncer, el uso de anticuerpos para bloquear los mecanismos de evasión que tienen los tumores para escapar del sistema inmune, o la transformación de células T con un receptor que reconoce específicamente las células tumorales (terapia CAR-T) (Sun, D., Shi, X., Li, S., Wang, X., Yang, X., & Wan, M. (2024). CAR-T cell therapy: A breakthrough in traditional cancer treatment strategies (Review). Molecular medicine reports, 29(3), 47). Las vacunas contra el cáncer se basan en la introducción o expresión de neoantígenos en el paciente. Estos neoantígenos son antígenos específicos presentes en las células tumorales, pero que por sí mismos no inducen una respuesta inmune al estar en un entorno inmunodeprimido como es el microambiente tumoral (TME). La expresión de los neoantígenos en una mayor cantidad y fuera de este entorno puede a ayudar a su reconocimiento por el sistema inmune como moléculas a atacar específicamente, activando la respuesta contra las células tumorales (S. Srivastava, D. Singh, S.K. Verma, M. Pandey, A. Sharma, H. Pandey, A. Mishra, Recent advancements in cancer vaccines: A systematic review, Vacunas. 25 (2023) 97– 108. https://doi.org/10.1016/j.vacun.2023.10.005). Respecto al uso de anticuerpos para bloquear la evasión inmune tumoral, mediante esta estrategia se reactiva el reconocimiento de las células tumorales y el desarrollo de una respuesta contra éstas (Kumar M, Thangavel C, Becker RC, Sadayappan S. Monoclonal Antibody-Based Immunotherapy and Its Role in the Development of Cardiac Toxicity. Cancers (Basel). 2020;13(1):86).

[0017] Sin embargo, estas aproximaciones también pueden tener limitaciones, como su baja efectividad, debido a su baja inmunogenicidad intrínseca (es decir, que no tengan neoantígenos o sean poco inmunogénicos, que el bloqueo de sus señales de evasión no sea suficiente para desatar una respuesta inmune fuerte, etc.). Estas limitaciones no son las únicas. Por ejemplo, en el caso de las vacunas de cáncer se requiere un diseño personalizado de neoantígenos a expresar, debido a la variabilidad de los tumores entre diferentes pacientes. La tecnología CAR-T es sólo válida para tumores líquidos, y la transformación de linfocitos es costosa, debe ser personalizada y puede inducir efectos secundarios. Incluso cabe señalar que la activación del sistema inmunológico por estos medios puede provocar efectos adversos y toxicidad en el organismo.

[0019] Por todo ello, aunque la inmunoterapia supone un avance importante en el tratamiento de tumores, aún hay grandes cuestiones a mejorar como su estabilidad, seguridad, eficacia y biodisponibilidad (R. S. Riley, C. H. June, R. Langer, M. J. Mitchell, Nat. Rev. Drug Discovery.

[0020] 2019, 18, 175.).

[0022] Por otro lado, se conoce la publicación ‘Protective immunity elicited by measles vaccine exerts anti-tumor effects on measles virus hemagglutinin gene-modified cancer cells in a mouse model’ de los autores Y. Qi, K. Xing, L. Zhang, F. Zhao, M. Yao, A. Hu, X. Wu. En dicha publicación se divulga que cuando una línea tumoral transgénica que expresa la proteína H del virus del sarampión es inyectada en ratones inmunocompetentes y previamente vacunados frente al sarampión, ésta es rechazada. Sin embargo, en esta publicación no se divulga el uso de este conocimiento como una estrategia terapéutica en pacientes, ni se dan los medios, herramientas o formulación para diseñar y obtener un tratamiento en el contexto del cáncer.

[0024] DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0026] La presente invención se refiere a unas nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm que codifica una proteína inmunogénica para la que el sistema inmune ha sido inmunizado previamente, tal como la hemaglutinina (proteína H) del virus del sarampión. Esta inmunidad previa puede haber sido adquirida mediante vacunación, infección previa o estar presente a través de los anticuerpos naturales presentes frente a un antígeno concreto. Así, las nanopartículas lipídicas de la invención resultan aptas para su uso en la expresión de dicha proteína inmunogénica exógena en la superficie de las células tumorales, con la consiguiente activación del sistema inmune contra éstas.

[0028] La presente invención queda definida conforme a la descripción y al juego de reivindicaciones que acompaña la presente memoria. Un primer aspecto de la presente invención se refiere al diseño y estructura una nanopartícula lipídica que comprende:

[0030] - una capa externa de lípidos que origina una envolvente esférica, capa externa que contiene, al menos, un lípido con carga positiva, lípidos estructurales y un lípido PEGilado (lípido modificado con una cadena de PEG (polietilenglicol)); y

[0032] - al menos una micela en el espacio interior delimitado por la capa externa, micela cuya estructura presenta, al menos, un lípido con carga positiva y un lípido estructural, de forma que la micela contiene en su interior ARNm de, al menos, un antígeno inmunogénico exógeno, es decir, ARN de un virus y/o un antígeno inmunogénico. Los lípidos con carga positiva interaccionan con el ARNm, que tiene carga negativa, de tal forma que “emulsionan” el ARNm, formando una micela a su alrededor;

[0034] siendo el tamaño hidrodinámico o diámetro de la nanopartícula inferior a 200 nm.

[0036] Preferentemente, el lípido ionizable es DLin-KC2 DMA (2-(2,2-Di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina), SM-102 (8-{(2-hidroxietil)[6-oxo-6-(undeciloxi)hexil]amino}octanoato de 9-heptadecanilo), DLin-MC3-DMA (ácido 4-(dimetilamino)-butanoico,éster(10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-octadecadien-1-il-10,13-nonadecadien-1-ílico), 4A3-SC8 (2-metil-3-(octilsulfanil)propanoato de 2-{[3-({3-[(3-{bis[3-(2-{[2-metil-3-(octilsulfanil)propanoil]oxi}etoxi)-3-oxopropil]amino}propil)(metil)amino]propil}[3-(2-{[2-metil-3-(octilsulfanil)propanoil]oxi}etoxi)-3-oxopropil]amino)propanoil]oxi}etilo), ALC-0315 (6-((2-hexildecanoil)oxi)-N-(6-((2-hexildecanoil)oxi)hexil)-N-(4-hidroxibutil)hexan-1-aminio), C14-4(1,1'-((2-(2-(4-(2-((2-(2-(bis(2-hidroxitetradecil)amino)etoxi)etil)(2-hidroxitetradecil)amino)etil)piperazin-1-il)etoxi)etil)azanediil)bis(tetradecan-2-ol))

[0037] o una mezcla de los mismos. Además, como lípido catiónico, se emplea preferentemente el DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano).

[0038] Por otro lado, los lípidos estructurales preferentemente son colesterol ((3β)-colest-5-en-3-ol), DSPC (distearoilfosfatidilcolina), DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) y/o SOPC (1-estearoil-2-oleoil-sn-gliceril-3-fosfocolina). En cuanto al lípido PEGilado, preferentemente es DMG-PEG (Dimiristoilglicerol-Polietilenglicol), C14-PEG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)]) y/o ALC-0159 (2-[(polietilenglicol)-2000]-N,N-ditetradecilacetamida).

[0040] La inclusión de un lípido ionizable y además un lípido catiónico, permite, por un lado, la óptima interacción del ARNm con los lípidos para su encapsulación, y por otro, las nanopartículas formadas adquieren una carga superficial positiva, lo que les hace especialmente internalizables por células tumorales.

[0042] Así, gracias a su composición estructural, las nanopartículas de la invención encapsulan con una elevada eficiencia el ARNm y tienen un gran rendimiento en la transfección de varios tipos celulares tumorales (cáncer de mama, de colón, páncreas, pulmonar y melanoma) con reducida citotoxicidad, como se detallará en el apartado de realización preferente de la presente memoria.

[0044] De forma preferente igualmente, y con objeto de mejorar la especificidad de la nanopartícula lipídica, la expresión del ARNm se controla con secuencias de unión de microARN o añadiendo elementos o ligandos de direccionamiento de la nanopartícula, lo que consigue una mayor internalización de la misma en las células tumorales. Así, con objeto de facilitar la incorporación de estos ligandos de direccionamiento específico, de forma opcional la nanopartícula lipídica presenta en su capa externa un lípido con grupos reactivos para establecer un enlace covalente con los mismos, siendo estos ligandos biomoléculas que reconocen específicamente receptores o moléculas de membrana de células cancerígenas o tumorales. Estas biomoléculas pueden ser anticuerpos, péptidos, aptámeros, vitaminas y/o azúcares que reconozcan específicamente un receptor sobreexpresado de una célula cancerígena o tumoral. Preferentemente, y entre otras opciones no limitativas de la presente invención, el receptor sobreexpresado será EGFR (Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico), PD-L1 (Ligando 1 de muerte programada), CD-47 (Clúster de diferenciación 47), HER2 (Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2), CTLA-4 (Antígeno 4 del linfocito T citotóxico), CD-44 (Clúster de diferenciación 44) y mutaciones de los mismos, integrinas (αvβ3 y αvβ5) y/o un receptor de folato (FRα o FRβ).

[0045] Como se ha detallado, otra forma de mejorar la especificidad de la nanopartícula lipídica es controlando la expresión del ARNm contenido en la misma mediante el uso de microARNs. Así, preferentemente el ARNm incluye en la sección 3’ o 5’ UTR una secuencia de microARN complementaria o reconocible por el microARN sobreexpresado en las células sanas, y no presente en células cancerígenas o tumorales. Algunos microARNs no limitativos que cumplen estas características son miR-34a, miR-383, miR-122, y/o el clúster miR-15/16 (10.1101/gad.1184404, 10.1016/j.bbrep.2015.10.011). De esta forma, si el ARNm entrara en células sanas, su expresión se bloquearía, haciendo que proteína o antígeno inmunogénico de que se trate únicamente se exprese en las células diana tumorales a eliminar por el sistema inmune.

[0046] Preferentemente, el microARN miR-34a comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:2 TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:2; el microARN miR-383 comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:3 AGATCAGAAGGTGATTGTGGCT o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:3; el microARN miR-122 comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:4 TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:4; el microARN miR-15 comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:5 TAGCAGCACATCATGGTTTACA o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:5; y el microARN miR-16 comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:6 TAGCAGCACGTAAATATTGGCG o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:6.

[0048] Así, ante la expresión de las proteínas virales en las células tumorales se induce una respuesta inmune frente a las mismas que acaba desembocando en su lisis. Efectivamente, la presencia de la proteína vírica o inmunogénica en la membrana de las células tumorales provoca la unión de anticuerpos a estas, y por tanto la opsonización de las mismas. La presencia de estos anticuerpos unidos a la célula inducirá la activación del complemento por vía clásica y la activación de respuestas tipo ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) en macrófagos y células NK que dirigirán la lisis de la célula cancerosa. Por otro lado, se activarán los linfocitos Tc (CD8+) que reconocerán los péptidos derivados de la digestión de la proteína viral o inmunogénica expuestos en los complejos MHC I de la célula cancerosa. Este reconocimiento dirigirá también la lisis de la célula cancerosa. Dado que el sistema inmune ha sido inmunizado anteriormente contra las proteínas del virus o proteína inmunogénica de que se trate, la respuesta inmune es rápida pues el organismo ya ha generado anticuerpos previamente contra este antígeno. Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de la nanopartícula lipídica (o de una composición farmacéutica que la comprenda) para la expresión de una proteína inmunogénica exógena en la superficie de una célula tumoral. Preferentemente la proteína inmunogénica exógena es la hemaglutinina del virus del sarampión (proteína H del virus del sarampión, mientras que la célula tumoral es una célula tumoral de un ser humano).

[0050] Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una nanopartícula lipídica según la descripción anterior, así como un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.

[0052] Por otro lado, un cuarto aspecto de la invención se refiere a una nanopartícula lipídica o una composición farmacéutica como las anteriormente descritas para su uso como fármaco o medicamento, preferentemente, para su uso en el tratamiento del cáncer. Preferentemente, el cáncer está seleccionado del grupo compuesto por cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer de páncreas y cáncer de pulmón. En cuanto a la forma de administración de las nanopartículas lipídicas o composición farmacéutica que las comprende, preferentemente se administran por vía intratumoral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Las nanopartículas o composición farmacéutica de la invención pueden ser administrada por sí sola, o en combinación con otros principios activos para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, en combinación con un tratamiento con un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico adicional o con un tratamiento de radioterapia, administrándose en dosis simples o múltiples.

[0054] Finalmente, un quinto aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de preparación de las nanopartículas lipídicas, que comprende las etapas de:

[0056] - disolución de los lípidos en etanol;

[0057] - emulsión de la disolución de la disolución obtenida en la etapa anterior en una disolución tampón de ácido málico a pH 3;

[0058] - extrusión de la emulsión de lípidos obtenida en la etapa anterior a través de una membrana polimérica de 100 nm de poro para la obtención de nanopartículas lipídicas;

[0059] - adición de ARNm de un antígeno exógeno a las nanopartículas lipídicas y reposo de la mezcla obtenida durante, al menos, una hora, para la encapsulación del ARNm en el interior de las nanopartículas lipídicas; y - dialización de las nanopartículas con PBS a pH 7.5 durante, al menos, 8 horas para la purificación de las nanopartículas lipídicas con ARNm encapsulado,

[0061] de forma que en el procedimiento descrito las etapas de emulsión, extrusión y encapsulación se llevan a cabo a una temperatura entre 30ºC y 40ºC, preferentemente a 37ºC, para asegurar la correcta disolución de los lípidos, la óptima encapsulación y la minimización de agregación de las nanopartículas. Asimismo, es importante que el ARNm que se adiciona a las nanoparículas lipídicas esté disuelto en agua libre de ADNasas y ARNasas, evitando el uso de disoluciones o tampones con sales que, en presencia de una mezcla con elevada cantidad de etanol, precipitan, lo que favorece la agregación de las nanopartículas y dificulta la encapsulación del ARNm. Por otro lado, como se ha detallado anteriormente, antígeno exógeno en este contexto se refiere a un antígeno no presente en el individuo que recibiría el tratamiento con las nanopartículas de la invención. Así, el objeto de la invención atañe igualmente a las nanopartículas lipídicas obtenidas por el procedimiento descrito, a una composición farmacéutica que comprenda dichas nanopartículas y al uso de ambas como fármaco, preferentemente, para el tratamiento del cáncer.

[0063] Por todo lo anterior, la invención que se preconiza ofrece una serie de ventajas reseñables con respecto al estado de la técnica.

[0065] Respecto a las terapias convencionales:

[0067] - Se trata de un enfoque focalizado en el entorno tumoral. La inyección intratumoral asegura el efecto contenido sobre el tumor, limitando el daño en otras zonas.

[0068] - La posibilidad de modificar la NP controlando la expresión del mRNA y/o añadiendo elementos de direccionamiento para la unión específica con células tumorales minimiza la aparición de efectos secundarios.

[0069] - Las nanopartículas de la invención ofrecen la posibilidad de realizar un tratamiento biológico, con moléculas biocompatibles, como los ácidos nucleicos y los lípidos, y que despierta el propio sistema inmune del paciente.

[0070] - El uso de nanopartículas lipídicas como vectores para encapsular el ARNm es una plataforma idónea porque este tipo de nanopartículas han sido ampliamente utilizadas en contextos como la vacuna del COVID-19, por lo que existe una tecnología y una industria preparada para su producción en masa, con una calidad médica y a un precio asequible.

[0071] - Las nanopartículas lipídicas de la invención pueden combinarse con otras estrategias terapéuticas, por ejemplo, con inhibidores del punto de control inmunológico (como anti-PD-1 o anti-CTLA-4), para potenciar aún más la respuesta inmunitaria, o con radioterapia o quimioterapia, mejorando su eficacia al convertir el tumor en un blanco más accesible para el sistema inmune.

[0072] - Dado que el ARNm es degradado de manera natural en las células, la expresión del antígeno inmunogénico en las células tumorales es transitoria, lo que permite una modulación del tratamiento. Esto podría ser útil para minimizar efectos no deseados a largo plazo.

[0074] Respecto a otras aproximaciones de la inmunoterapia:

[0076] - En el caso de que el ARNm contenido en la nanopartícula sea de un virus, el antígeno inmunogénico expresado en las células tumorales es reconocido ampliamente por la población vacunada o inmunizada frente a dicho virus, y no requiere diseñar antígenos de forma personalizada, superando así la heterogeneidad tumoral.

[0077] - El antígeno viral es significativamente diferente a los antígenos propios de los mamíferos, por lo que se reduce el riesgo de una respuesta cruzada frente a un antígeno propio.

[0078] - Esta estrategia basada en un antígeno viral reduce las probabilidades de inducir resistencia tumoral, ya que el sistema inmunológico ataca a las células en función de un antígeno extraño y no debido a una mutación específica (neoantígeno).

[0079] - La nanopartícula lipídica se puede adaptar a la expresión de otros antígenos inmunogénicos (sistema ABO, residuo α-gal, …).

[0080] - El antígeno viral está orientado para expresarse específicamente en el entorno tumoral, por lo que la respuesta inmune va dirigida hacia las células tumorales. Aunque haya activación sistémica del sistema inmune, sólo habrá expresión del antígeno en la zona tumoral. En el caso de las vacunas de cáncer, la expresión de los neoantígenos está separada físicamente del tumor. Esto podría reducir efectos secundarios y potenciar la acción de la terapia con las nanopartículas lipídicas de la invención. - Se transforman las células tumorales in vivo, gracias al uso de nanopartículas lipídicas como vehículo. No es necesario el cultivo de células fuera del individuo como en el caso de las estrategias CAR-T.

[0081] - Por otro lado, el uso de nanopartículas lipídicas como vectores para encapsular el ARNm es una plataforma idónea porque este tipo de nanopartículas han sido ampliamente utilizadas en contextos como la vacuna del COVID-19, por lo que existe una tecnología y una industria preparada para su producción en masa, con una calidad médica y a un precio asequible.

[0083] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0085] Para complementar la descripción que seguidamente se va a realizar y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con los ejemplos preferentes de realización práctica de la misma que a continuación se detallan, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de planos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

[0087] La Figura 1 muestra una representación esquemática de la estructura y composición de la nanopartícula de acuerdo con un ejemplo práctico de realización de la misma denominado LNP-H, en el que el ARNm es ARNm de la proteína H del sarampión.

[0089] La Figura 2 muestra una gráfica de la distribución del tamaño de las nanopartículas LNP-H medido por dispersión de luz dinámica (DLS), donde en el eje de abscisas se ha representado el tamaño en nm y en el eje de ordenadas la dispersión en %.

[0091] La Figura 3 muestra una imagen de microscopía electrónica de transmisión de las nanopartículas LNP-H de las figuras anteriores, donde la barra de escala representa 200 nm.

[0093] La Figura 4 muestra una representación esquemática de la actuación de la nanopartícula lipídica del ejemplo de la figura 1, donde se observa en su uso para expresar la proteína H en la superficie de una célula tumoral, activando el sistema inmune y causando la muerte de la célula tumoral.

[0095] La Figura 5 muestra los resultados de los ensayos in vitro de transfección de las LNP-H, donde las figuras 5.A, 5.B y 5.C muestran las gráficas de eficiencia de transfección medida como % de células positivas 24 horas después del tratamiento con LNP-H de líneas celulares de MCF7, SK-MEL-103 y B16-BL6 respectivamente (n=3, SD).

[0097] La Figura 6 muestra una imagen de inmunofluorescencia de células MCF7, B16-BL6 y SK-MEL-103 sin tratar (imágenes de la izquierda) y tratadas con las nanopartículas LNP-H a distintas concentraciones: 0,5 μg/mL en la figura 6A, 1 μg/mL en la figura 6B y 1,5 μg/mL en la figura 6C

[0099] La Figura 7 muestra unos gráficos con ensayos de viabilidad WST-1 para el tratamiento con LNP-H con distintas concentraciones de ARNm encapsulado en líneas celulares MCF7, SK-MEL-103 y B16-BL6 (n=3, SD), donde en el eje de ordenadas se ha representado la viabilidad celular en %.

[0101] La Figura 8 muestra unos gráficos con ensayos en esferoides para la validación de las LNP-H, mostrando el resultado del tratamiento con LNP-H con distintas concentraciones de ARNm encapsulado en esferoides de B16-BL6 (figura 8A) y esferoides de SK-MEL-103 (figura 8B), donde en el eje de ordenadas se ha representado la eficiencia de transfección como % de células positivas (n=3, SD).

[0103] La Figura 9 muestra unas imágenes IVIS de los resultados del ensayo de validación de expresión in vivo en ratones inmunocompetentes tratados con LNP-Luc, nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de luciferasa como reportero.

[0105] La Figura 10 una gráfica del volumen tumoral desde el primer día de tratamiento hasta punto final en un ensayo según el Ejemplo 2.2 realizado en un modelo de melanoma, B16-BL6, en ratones inmunocompetentes C57BL/6, donde en el eje de abscisas se ha representado el tiempo en días y en el eje de ordenadas el volumen tumoral en mm<3>. Para la estadística se aplicó ANOVA ordinario de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey, **<0,01. V-Vehículo: ratones vacunados tratados con el vehículo PBS; V-LNP Luc: ratones vacunados tratados con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de luciferasa; NV-LNP H: ratones no vacunados tratados con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de proteína H; V-LNP H: ratones vacunados tratados con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de proteína H.

[0107] La Figura 11 es una imagen representativa de los tumores de cada grupo del ensayo según el Ejemplo 2.2. V-Vehículo: ratones vacunados tratados con el vehículo PBS; V-LNP Luc: ratones vacunados tratados con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de luciferasa; NV-LNP H: ratones no vacunados tratados con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de proteína H; V-LNP H: ratones vacunados tratados con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de proteína H.

[0109] La Figura 12 muestra imágenes histológicas representativas de inmunofluorescencia de una tinción TUNEL para muestras del ensayo según el Ejemplo 2.2. La tinción TUNEL marca la presencia de células apoptóticas. El marcador de núcleos (DAPI) se muestra en azul y las células TUNEL-positivas en verde. Barra de escala: 50 µm.

[0111] La Figura 13 muestra porcentaje de células TUNEL positivas (apóptoticas) (eje ordenadas) en tumores obtenido de la inmunotinción de la figura 12 (n ≥ 4 tumores por grupo, SEM). Para la estadística se aplicó Kruskal-Wallis seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn en la figura h (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

[0113] La Figura 14 muestra una gráfica del resultado de un ensayo de validación de la activación de la respuesta inmune, donde se ha representado el % de linfocitos T citotóxicos (CD8+) con respecto del total de las células T (CD3+) infiltradas en los tumores B16-BL6 (eje ordenadas) para cada condición aplicada in vivo. Los tumores fueron extraídos 6 días después del inicio del tratamiento. Para la estadística se aplicó ANOVA ordinario de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.*<0.05; **<0.01; ***<0.001; ****<0.0001.

[0115] La Figura 15 muestra una gráfica del resultado de un ensayo de validación de la activación de la respuesta inmune, donde se ha representado el ratio entre linfocitos T citotóxicos (CD8+) y linfocitos T helper (CD4+) infiltradas en los tumores B16-BL6 para cada condición aplicada in vivo. Los tumores fueron extraídos 6 días después del inicio del tratamiento. Para la estadística se aplicó ANOVA ordinario de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.*<0.05; **<0.01; ***<0.001; ****<0.0001.

[0117] La Figura 16 muestra imágenes histológicas representativas de inmunofluorescencia en una tinción CD8. El marcador de núcleos (DAPI) se muestra en azul y las células CD8 en verde. Barra de escala: 50 µm.

[0119] La Figura 17 muestra unos gráficos con los resultados de la validación de la adquisición de memoria frente a la proteína H del sistema inmune, como porcentaje de linfocitos T positivos para las citoquinas TNF-α (fig. 17A), granzima B (fig. 17B) e IFN-γ (fig. 17C), después de ser incubados con proteína H. En el eje de abscisas se han representado las distintas muestras, mientras que en el eje de ordenadas se ha representada el porcentaje de células T positivas para cada tipo de citoquina, respectivamente. *<0.05; **<0.01. ANOVA ordinario de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

[0121] La Figura 18 muestra una gráfica del resultado de un ensayo de validación de la activación de la respuesta inmune, donde se ha representado el % de esplenocitos que presentan la proteína CD107b para cada condición aplicada in vivo. La presencia de la CD107b en esplenocitos indica que estos están activados. Para esta prueba los esplenocitos fueron estimulados con 16 μg/mL de proteína H durante 5 días y cocultivados con células B16-BL6, tratadas previamente con LNP H, durante 18 horas (n = 6, SEM). Para la estadística se aplicó ANOVA ordinario de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.*<0.05; **<0.01; ***<0.001; ****<0.0001.

[0123] La Figura 19 muestra una gráfica del resultado de un ensayo de validación de la actividad citotóxica de los esplenocitos contra las células B16-BL6 tratadas con LNP-H, donde se ha representado el % células B16 vivas para cada condición aplicada in vivo. Para esta prueba los esplenocitos fueron estimulados con 16 μg/mL de proteína H durante 5 días y cocultivados con células B16-BL6, tratadas previamente con LNP H, durante 18 horas (n = 6, SEM). Para la estadística se aplicó ANOVA ordinario de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.*<0.05; **<0.01; ***<0.001; ****<0.0001.

[0124] La Figura 20 muestra una gráfica correspondiente a citometría de flujo realizada sobre un ensayo con células pancreáticas Capan-2 para mostrar la internalización mejorada de las nanopartículas cuando se emplean agentes de direccionamiento específicos en la nanopartícula, tal como el folato. En el jee de ordenadas se ha representado el porcentaje de internalización de las nanopartículas en las células Capan-2, mientras que en el eje de abscisas se ha representado el tipo de muestra ensayado, donde LNP-luc corresponde a nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de luciferasa, mientras que LNP-luc-folato corresponde a nanopartículas lipídicas que contienen ARNm de luciferasa y folato en su superficie, y donde las series rayadas corresponden a muestras donde se añadió un exceso de folato para bloquear los receptores FRαβ. *<0,05; **<0,01; ***<0,001. ANOVA ordinario de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey

[0126] EJEMPLOS

[0128] Ejemplo 1: Nanopartícula lipídica LNP-H

[0130] De acuerdo con un ejemplo de realización práctica de la invención, la nanopartícula lipídica permite la expresión de la proteína hemaglutinina del virus del sarampión, que es una glicoproteína presente en la envoltura del virus e implicada en su entrada a la célula. Ventajosamente, la vacuna contra el sarampión está altamente distribuida en todo el mundo desarrollado y su distribución en los países en desarrollo está siendo promulgada por la OMS (Minta AA, Ferrari M, Antoni S, et al. Progress Toward Measles Elimination — Worldwide, 2000–2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2023;72:1262–1268.). Por otra parte, tiene una alta efectividad pues sobre un 96% de los pacientes desarrolla inmunidad protectora tras la segunda dosis de la vacuna (Di Pietrantonj C, Rivetti A, Marchione P, Debalini MG, Demicheli V. Vaccines for measles, mumps, rubella, and varicella in children. Cochrane Database Syst Rev. 2020;4(4)). Se espera así que la mayoría de los potenciales pacientes presenten anticuerpos frente al virus, los cuales están dirigidos en gran parte contra la proteína H (Rik L. de Swart, Selma Yüksel, Albert D. M. E. Osterhaus de Swart RLYüksel S, Osterhaus ADME.

[0131] 2005. Relative Contributions of Measles Virus Hemagglutinin- and Fusion Protein-Specific Serum Antibodies to Virus Neutralization. J Virol 79:. J. Virol., 79 (2005) (2005), pp. 11547-11551).

[0133] Este ejemplo de nanopartícula lipídica que contiene ARNm de la proteína H se denominará en adelante LNP-H. Concretamente, en el ejemplo de nanopartícula LNP-H, el ARNm comprende una secuencia de ARNm codificante (ORF) que codifica la proteína H de acuerdo con la secuencia (en orientación 5’ a 3’) SEQ ID NO: 1 (ATGTCACCACAACGAGACCGGATAAATGCCTTCTACAAAGATAACCCCCATCCCAAGG GAAGTAGGATAGTCATTAACAGAGAACATCTTATGATTGATAGACCTTATGTTTTGCTGG CTGTTCTGTTTGTCATGTTTCTGAGCTTGATCGGGTTGCTAGCCATTGCAGGCATTAGAC TTCATCGGGCAGCCATCTACACCGCAGAGATCCATAAAAGCCTCAGCACCAATCTAGAT GTAACTAACTCAATCGAGCATCAGGTCAAGGACGTGCTGACACCACTCTTCAAAATCAT CGGTGATGAAGTGGGCCTGAGGACACCTCAGAGATTCACTGACCTAGTGAAATTAATCT CTGACAAGATTAAATTCCTTAATCCGGATAGGGAGTACGACTTCAGAGATCTCACTTGGT GTATCAACCCGCCAGAGAGAATCAAATTGGATTATGATCAATACTGTGCAGATGTGGCT GCTGAAGAGCTCATGAATGCATTGGTGAACTCAACTCTACTGGAGACCAGAACAACCAA TCAGTTCCTAGCTGTCTCAAAGGGAAACTGCTCAGGGCCCACTACAATCAGAGGTCAAT TCTCAAACATGTCGCTGTCCCTGTTAGACTTGTATTTAGGTCGAGGTTACAATGTGTCAT CTATAGTCACTATGACATCCCAGGGAATGTATGGGGGAACTTACCTAGTGGAAAAGCCT AATCTGAGCAGCAAAAGGTCAGAGTTGTCACAACTGAGCATGTACCGAGTGTTTGAAGT AGGTGTTATCAGAAATCCGGGTTTGGGGGCTCCGGTGTTCCATATGACAAACTATCTTG AGCAACCAGTCAGTAATGATCTCAGCAACTGTATGGTGGCTTTGGGGGAGCTCAAACTC GCAGCCCTTTGTCACGGGGAAGATTCTATCACAATTCCCTATCAGGGATCAGGGAAAGG TGTCAGCTTCCAGCTCGTCAAGCTAGGTGTCTGGAAATCCCCAACCGACATGCAATCCT GGGTCCCCTTATCAACGGATGATCCAGTGATAGACAGGCTTTACCTCTCATCTCACAGA GGTGTTATCGCTGACAATCAAGCAAAATGGGCTGTCCCGACAACACGAACAGATGACAA GTTGCGAATGGAGACATGCTTCCAACAGGCGTGTAAGGGTAAAATCCAAGCACTCTGC GAGAATCCCGAGTGGGCACCATTGAAGGATAACAGGATTCCTTCATACGGGGTCTTGTC TGTTGATCTGAGTCTGACAGTTGAGCTTAAAATCAAAATTGCTTCGGGATTCGGGCCATT GATCACACACGGTTCAGGGATGGACCTATACAAATCCAACCACAACAATGTGTATTGGC TGACTATCCCGCCAATGAAGAACCTAGCCTTAGGTGTAATCAACACATTGGAGTGGATA CCGAGATTCAAGGTTAGTCCCTACCTCTTCACTGTCCCAATTAAGGAAGCAGGCGAAGA CTGCCATGCCCCAACATACCTACCTGCGGAGGTGGATGGTGATGTCAAACTCAGTTCCA ATCTGGTGATTCTACCTGGTCAAGATCTCCAATATGTTTTGGCAACCTACGATACTTCCA GGGTTGAACATGCTGTGGTTTATTACGTTTACAGCCCAAGCCGCTCATTTTCTTACTTTT ATCCTTTTAGGTTGCCTATAAAGGGGGTCCCCATCGAATTACAAGTGGAATGCTTCACAT GGGACCAAAAACTCTGGTGCCGTCACTTCTGTGTGCTTGCGGACTCAGAATCTGGTGG ACATATCACTCACTCTGGGATGGTGGGCATGGGAGTCAGCTGCACAGTCACCCGGGAA GATGGAACCAATCGCAGATAG) o una secuencia con un 85% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1.

[0135] En la figura 1 puede observarse esquemáticamente la nanopartícula LNP-H (1), que de acuerdo con un ejemplo de realización preferente presenta en su estructura externa envolvente un lípido ionizable (DLin-KC2-DMA) y otro catiónico (DOTAP) (2), que permiten unirse al ARNm (3), el cual presenta carga negativa, lípidos que provocan la esponja de protones necesaria para el escape lisosomal, el cual es un proceso necesario para liberar el ARNm (3) en el citoplasma. La capa externa contiene igualmente DMG-PEG (7) como lípido PEGilado, que contribuye a estabilizar la nanopartícula (1) y potenciar su biocompatibilidad. Por otro lado, en el ejemplo ilustrado los lípidos estructurales son colesterol (4) y SOPC (5) para la capa externa, mientras que la micela (6) que contiene el ARNm (3) presenta DLin-KC2-DMA y DOTAP (2), SOPC (5) y DMG.

[0137] Con objeto de evaluar la correcta funcionalidad de las nanopartículas LNP-H, se procedió a su caracterización. Las nanopartículas LNP-H son esféricas, con un tamaño inferior a 200 nm y una dispersión de tamaño baja, tal y como se ilustra en el gráfico de la figura 2 y la figura 3.

[0139] En la Tabla 1 se resume la caracterización de las nanopartículas LNP-H:

[0141] Tabla 1. Caracterización nanopartículas LNP-H

[0143]

[0146] Como puede observarse, la eficiencia de encapsulación está por encima del 85%, y se puede observar cómo a pH ácido las nanopartículas se protonan (potencial Z más positivo), pudiendo actuar como esponja de protones. La eficiencia de encapsulación se midió con el kit comercial Quant-iT. Este kit contiene una sonda que fluorece al entrar en contacto con el material genético pero que es incapaz de atravesar membranas lipídicas. Se mide por tanto la señal fluorescente de las nanopartículas integras y de las nanopartículas tratadas con Tritón, el cual destruye las mismas. Con la primera medida se determina la cantidad de material genético que hay en el exterior de la nanopartícula, y con la segunda, la cantidad total de material genético en la muestra. La diferencia entre la cantidad exterior y la cantidad total muestra la cantidad encapsulada. La eficiencia de encapsulación se ha calculado como el porcentaje de material genético encapsulado respecto a la cantidad de material genético total.

[0148] Por otro lado, en la figura 4 se observa una representación esquemática de la LNP-H (1) durante su uso en la expresión de la proteína H (9) en la superficie de una célula tumoral (8), para la activación del sistema inmune (10) (anticuerpos, células T, macrófagos, etc), lo que deriva en la muerte celular (11) de la célula tumoral (8). En primer lugar, las nanopartículas LNP-H (1) son internalizadas por las células tumorales (8), y se libera el ARNm (3) en el citoplasma, pudiéndose transcribir en las células (8) y expresando en su superficie la proteína H (9). El sistema inmune (10) es capaz de reconocer la proteína H (9), al tener memoria frente a ésta, gracias a la vacunación. La activación del sistema inmune (10) provoca la muerte celular (11) de las células tumorales (8) que expresan la proteína H (9) por distintos medios (sistema del complemento, fagocitosis por macrófagos, lisis celular dirigida por células T o NKs, etc.).

[0150] Como se ha detallado anteriormente, con objeto de mejorar la especificidad de la nanopartícula lipídica y su internalización en las células tumorales, preferentemente la nanopartícula presenta ligandos de direccionamiento específico, tal como folatos. Con objeto de evidenciar este efecto mejorado en las nanopartículas se trataron células pancreáticas Capan-2 con 0,5 mg/mL de LNP-luc marcada durante 10 minutos. En algunas de los pocillos conteniendo las muestras se añadió un exceso de folato, representado como ‘+ folato’ en la figura 20, para bloquear los receptores FRαβ. Tal y como se observa en la figura 20, la internalización de las nanopartículas LNP-luc-folato fue significativamente mayor en comparación con las nanopartículas LNP-luc que no presentaban dicho agente de direccionamiento. Este aumento de la captación se suprimió cuando se bloqueó FRαβ con un exceso de folato libre, lo que indica un direccionamiento específico al receptor FRαβ.

[0152] Ejemplo 2: Ensayos en líneas celulares de tumor

[0154] Para validar las nanopartículas diseñadas en el contexto de la presente invención, se realizaron ensayos en líneas celulares de tumor. Para ello, se realizaron ensayos de transfección y de citotoxicidad en varias líneas celulares, incluyendo líneas de cáncer de mama y melanoma.

[0155] Ejemplo 2.1 Ensayos de transfección y viabilidad celular

[0157] En la figura 5 se muestran los resultados de los ensayos de transfección in vitro realizados para las nanopartículas LNP-H. Para ello, se trataron líneas celulares humanas de cáncer de mama MCF7 (figura 5A), líneas celulares humanas de melanoma SK-MEL-103 (figura 5B) y líneas celulares murinas B16-BL6 de melanoma (figura 5 C1), con lipofectamina como control comercial y con dos concentraciones diferentes de nanopartículas LNP-H, 0,5 μg/mL y 1

[0158] μg/mL para los experimentos con MCF7 y SK-MEL-103, mientras que en el ensayo con la línea B16-BL6 se ensayó también con una concentración de LNP-H de 1,5 μg/mL. En los tres tipos celulares, la eficacia de transfección de la LNP H fue similar (B16-BL6 y MCF-7) o incluso superior (SK-MEL-103) a la del estándar comercial lipofectamina (Lp). En particular, la LNP H alcanzó altas tasas de transfección en todos los tipos celulares, llegando aproximadamente al 80% en B16-BL6 y MCF-7, y casi al 100% en SK-MEL-103.

[0160] Por otro lado, en la figura 6 me muestran las imágenes de inmunofluorescencia de células MCF7 (figura 6A), B16-BL6 (figura 6B) y SK-MEL-103 (figura 6C) sin tratamiento (imágenes de la izquierda) y con tratamiento con las LNP a 0,5, 1 y 1,5 μg/mL respectivamente (derecha). Azul: núcleo, verde: proteína H. Las imágenes confirman la alta eficiencia de la transfección vista ya en citometría. Es importante destacar que, dado que las células no se permeabilizaron durante la citometría o la tinción confocal, la detección de la proteína H confirmó su adecuada localización en la membrana celular, haciéndola fácilmente accesible al sistema inmunitario.

[0162] En la figura 7 se muestran los ensayos de viabilidad con WST-1 medidos 48 h después del tratamiento con LNP-H en MCF7, B16-BL6 y SK-MEL-103 (n=3, SD), con distintas concentraciones de ARNm encapsulado. Los resultados indicaron que la LNP H fue bien tolerada en células B16-BL6 y MCF-7 a concentraciones de hasta 1,5 µg/mL (viabilidad > 80%). Sin embargo, la LNP H mostró una mayor citotoxicidad en SK-MEL-103, y sólo las concentraciones de hasta 1 µg/mL se consideraron no tóxicas.

[0164] Se evaluó así mismo la capacidad de las nanopartículas LNP-H de transfectar esferoides, empleándose lipofectamina como control comercial, obteniéndose también resultados positivos, tal y como se observa en la figura 8 donde se muestran los resultados de los ensayos en esferoides de validación de las LNPs-H evaluados 24 horas después del tratamiento en esferoides de B16-BL6 (figura 8A) y SKMel103 (figura 8B).

[0165] Posteriormente, para corroborar la capacidad de las nanopartículas de transfección in vivo se inocularon 10 µg de nanopartículas LNP-H cargadas con un ARNm codificante para luciferasa intratumoralmente (LNP-Luc) en un modelo de melanoma B16-BL6 en ratones inmunocompetentes C57BL/6. Antes de la medición se añadió subcutáneamente luciferina. Se siguió la expresión de este gen reportero a las 6, 12, 24 y 48 horas (figura 9) via In Vivo Imaging System demostrando la capacidad de las nanopartículas LNP-H de transfectar in vivo con un máximo de señal a las 12h. Así mismo la expresión se mantuvo localizada en la región tumoral sin afectar al resto del organismo, lo que podría minimizar posibles efectos secundarios.

[0167] Ejemplo 2.2 Ensayos de aproximación y validación para el tratamiento terapéutico

[0169] Finalmente, para corroborar el funcionamiento terapéutico del sistema se realiza un ensayo en un modelo de melanoma, B16-BL6, en ratones inmunocompetentes C57BL/6. Para imitar las condiciones humanas, se vacunó a los ratones con dos dosis de la vacuna triple vírica comercial (que incluye la vacuna contra el sarampión), incluyendo también algunos ratones no vacunados como control.4 semanas después de la segunda vacunación se inocularon 2,5 x 105 de células de melanoma de ratón en ambos flancos del animal. Cuando los tumores fueron palpables (20 mm<3>- 30 mm<3>), los animales se asignaron aleatoriamente a los 3 grupos siguientes: vehículo (V-Vehículo), LNPs-Luc (V-LNP-Luc) o LNPs-H (V LNP H). Además, todos los ratones no vacunados fueron tratados con LNP H (NV-LNP H). Entonces, se inyectaron intratumoralmente 10 µg de ARNm encapsulado en LNP en cada tumor del animal. Tras esta primera dosis se aplicaron dos dosis más en días alternos. Un día después de la tercera dosis los ratones fueron eutanasiados. Se siguió el crecimiento tumoral en los 4 grupos hasta alcanzar el punto final. El crecimiento en el grupo de tratamiento, es decir, los ratones vacunados con la proteína LNP-H, fue significativamente menor que en los otros 3 grupos de control, tal y como se muestra en las figuras 10 y 11. Estos resultados demuestran un beneficio terapéutico de la expresión de la proteína H mediada por la LNP en ratones vacunados y subrayan la necesidad de células T de memoria específicas contra el antígeno para impulsar una respuesta inmunitaria antitumoral rápida y eficaz.

[0171] Además, la tinción TUNEL reveló un aumento significativo de células apoptóticas en el grupo V-LNP H en comparación con V-Vehículo (p < 0,001) y NV-LNP H (p = 0,04), y una tendencia en comparación con V-LNP Luc (p = 0,188) (figuras 12 y 13). Estas observaciones fueron coherentes con la reducción observada en el crecimiento tumoral en el grupo V-LNP H.

[0173] Para reforzar los resultados in vivo, se ha estudiado la infiltración de linfocitos T en el microambiente tumoral. Dentro de la población de células T, destacan los linfocitos T citotóxicos (Tc) que son las encargadas de reconocer antígenos extraños, como puede ser la proteína H, y de eliminar las células que los expresan, siendo uno de los actores más importantes en la actividad antitumoral del sistema inmune. Se observó un aumento por citometría de esta población en los ratones vacunados y tratados con las LNPs-H, lo cual demuestra que esta estrategia es capaz de atraer estos linfocitos al tumor (figura 14 y 15). Estos hallazgos fueron apoyados además por microscopía confocal, que reveló infiltración de células T CD8⁺ exclusivamente en secciones tumorales V-LNP H (figura 16).

[0175] El efecto del tratamiento sobre el sistema inmune también se ha validado mediante el estudio de los esplenocitos (células del bazo) de los ratones empleados en el estudio in vivo. Para ello en primer lugar se aislaron esplenocitos, y a continuación se incubaron durante 18 horas con la proteína H. Tras co-incubar estos esplenocitos con la proteína H se estudió por citometría de flujo los niveles de las citoquinas IFN-γ, granzima B y TNF-α para evaluar su estado de activación. Los análisis resumidos en la figura 17 indican que los esplenocitos de los ratones vacunados y tratados con LNPs-H tienen un mayor porcentaje de células positivas con respecto a estas citoquinas en presencia de la proteína H, es decir están más activados. Por lo que la vacuna junto al tratamiento con LNP-H es capaz de activar el sistema inmune frente a la proteína H.

[0177] Para evaluar la actividad citotóxica, se estimularon esplenocitos ex vivo con 16 µg/mL de proteína H del virus del sarampión durante cinco días y se co-cultivaron durante 17 horas con B16-BL6 pre-tratados 20 horas antes con 0,5 µg/mL de LNP H. La degranulación de los esplenocitos, un marcador de la actividad citotóxica se evaluó mediante la expresión en superficie de CD107b. Los esplenocitos de los ratones tratados con V-LNP H mostraron un aumento significativo de la expresión de CD107b en comparación con todos los demás grupos (figura 18), lo que indica un mayor potencial citotóxico. Consistentemente, el co-cultivo de estos esplenocitos con células B16-BL6 tratadas con LNP H resultó en una marcada reducción de la viabilidad de las células diana, disminuyendo del 62,9% ± 3,0% en el grupo V-Vehículo al 25,8% ± 3,3% en el grupo V-LNP H (p < 0,0001) (figura 19).

[0179] En conjunto, estos resultados demuestran que el control del crecimiento tumoral mediado por el tratamiento con V-LNP H depende de una respuesta inmunitaria adaptativa dominada por linfocitos T citotóxicos CD8⁺. Estos linfocitos T CD8⁺ reconocen, activan y eliminan eficazmente las células tumorales que expresan la proteína H.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

1ª. Nanopartícula lipídica caracterizada por que comprende:

- una capa externa de lípidos envolvente esférica que contiene, al menos, un lípido ionizable, un lípido con carga positiva, lípidos estructurales y un lípido modificado con una cadena de PEG (polietilenglicol); y

- al menos una micela en el espacio interior delimitado por la capa externa, micela cuya estructura presenta, al menos, un lípido con carga positiva y un lípido estructural, de forma que la micela contiene en su interior ARNm de, al menos, un antígeno inmunogénico exógeno,

donde la nanopartícula presenta un tamaño hidrodinámico inferior a 200 nm

2ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 1ª, caracterizada por que el lípido ionizable es DLin-KC2 DMA, SM-102, DLin-MC3-DMA, 4A3-SC8, ALC-0315, C14-4 o una mezcla de los mismos.

3ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 1ª o 2ª, caracterizada por que el lípido catiónico es DOTAP.

4ª. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que los lípidos estructurales son colesterol, DSPC, DOPE y/o SOPC.

5ª. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que el lípido modificado con una cadena de PEG es DMG-PEG, C14-PEG y/o ALC-0159.

6ª. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que el ARNm es ARNm de la proteína H del virus del sarampión.

7ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 6ª caracterizada por que el ARNm comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:1.

8ª. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que la capa externa presenta un lípido con grupos reactivos para establecer un enlace covalente con una biomolécula que reconoce específicamente receptores o moléculas de membrana de células cancerígenas.

9ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 8ª caracterizada por que las biomoléculas son anticuerpos, péptidos, aptámeros, vitaminas o azúcares que reconozcan específicamente un receptor sobreexpresado de una célula cancerígena.

10ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 9ª caracterizada por que el receptor sobreexpresado de una célula cancerígena es EGFR, PD-L1, CD-47, HER2, CTLA-4, CD-44 o una mutación de los mismos, integrinas y/o un receptor de folato.

11ª. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores de la 1ª a la 7ª caracterizada por que el ARNm incluye en la sección 3’ o 5’ UTR una secuencia de microARN reconocible por el microARN sobreexpresado en una célula sana y no presente en una célula cancerígena.

12ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 10ª caracterizada por que el microARN incluido en la sección 3’ o 5’ UTR del ARNm se selecciona del grupo que consiste en miR-34a, miR-383, miR-122, y/o el clúster miR-15/16.

13ª. Nanopartícula lipídica según reivindicación 12ª caracterizada por que el microARN miR-34a comprende la secuencia SEQ ID NO:2 o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:2; el microARN miR-383 comprende la secuencia SEQ ID NO:3 o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:3; el microARN miR-122 comprende la secuencia SEQ ID NO:4 o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:4; el microARN miR-15 comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:5 o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:5; y el microARN miR-16 comprende la secuencia de nucleótidos (de 5’ a 3’) SEQ ID NO:6 o una secuencia con una identidad de secuencia de, al menos, el 85% con la secuencia SEQ ID NO:6.

14ª. Composición farmacéutica que comprende una nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15ª. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores de la 1ª a la 13ª o composición según reivindicación 14ª para su uso como fármaco.

16ª. Nanopartícula lipídica o composición según reivindicación 15ª para su uso como fármaco en el tratamiento de cáncer.

17ª. Nanopartícula lipídica o composición según reivindicación 16ª para uso para el tratamiento del cáncer en combinación con un tratamiento con un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico, o con un tratamiento de radioterapia.

18ª. Nanopartícula lipídica o composición según reivindicación 16ª o 17ª donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer de páncreas o cáncer de pulmón.

19ª. Nanopartícula lipídica o composición para su uso según cualquier reivindicación de la 15ª a la 18ª donde la nanopartícula o composición se administra por vía intratumoral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.

20ª. Uso de la nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones de la 1ª a la 13ª o de la composición farmacéutica según reivindicación 14ª para la expresión de una proteína inmunogénica exógena en la superficie de una célula tumoral.

21ª. Uso de la nanopartícula lipídica o de la composición farmacéutica según reivindicación 20ª donde la célula tumoral es una célula tumoral de un ser humano.

22ª. Uso de la nanopartícula lipídica o de la composición farmacéutica según reivindicación 20ª o 21ª donde la proteína inmunogénica es la proteína hemaglutinina del virus del sarampión.

23ª. Procedimiento de preparación de las nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones de la 1ª a la 13ª caracterizado por que comprende las etapas de:

- disolución de los lípidos en etanol;

- emulsión de la disolución de la etapa anterior en una disolución tampón de ácido málico a pH 3;

- extrusión de la emulsión de lípidos obtenida en la etapa anterior a través de una membrana polimérica de 100 nm de poro para la obtención de nanopartículas lipídicas;

- adición de ARNm de un antígeno exógeno a las nanopartículas lipídicas y reposo de la mezcla obtenida durante, al menos, una hora, para la encapsulación del ARNm en el interior de las nanopartículas lipídicas; y - dialización de las nanopartículas con PBS a pH 7.5 durante, al menos, 8 horas para la purificación de las nanopartículas lipídicas con ARNm encapsulado,

donde las etapas de emulsión, extrusión y encapsulación se llevan a cabo a una temperatura entre 30ºC y 40ºC; y donde el ARNm está disuelto en agua libre de ADNasas y ARNasas.