ES3059228T3 - Hybrid mushroom strain b14528 and descendants thereof - Google Patents

Abstract

Un cultivo híbrido de Agaricus bisporus, denominado cepa B14528, incluye un cultivo representativo de la cepa, depositado en la Biblioteca Nacional de Investigación (NRRL) con el número de acceso 50900. Se describe un método para producir un cultivo híbrido de Agaricus bisporus que comprende el apareamiento de una línea homocariótica J12998-s39 con una línea homocariótica BW-s191. Además, se proporcionan setas, partes del cultivo y productos que lo incorporan. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Cepa híbrida de champiñón B14528 y descendientes de la misma

[0003] Campo técnico

[0004] La presente invención se refiere a una nueva clase de cultivos híbridos del champiñón del champiñón comestible cultivadoAgaricus bisporus(Lange) Imbach, y a métodos para producir y utilizar dicho cultivo híbrido. Más particularmente, la presente invención se refiere a una cepa híbrida recientemente desarrollada denominada B14528 y a cultivos que descienden, o derivan de otro modo, de la cepa B14528 deAgaricus bisporus.

[0005] Listado de secuencias

[0006] El archivo de listado de secuencias SYL.P.PC0014 Sequence Listing_T25.txt que tiene un tamaño de 2073 bytes y fecha de creación del 20 de febrero de 2015 se presentó electrónicamente con la presente solicitud de patente.

[0007] Antecedentes de la invención

[0008] El champiñón comestibleAgaricus bisporus(Lange) Imbach var.bisporus,un microorganismo que pertenece a los hongos basidiomicetos, se cultiva ampliamente en todo el mundo. En Europa y América del Norte, es la especie de champiñón más cultivada. El valor de la cosecha anual de champiñónAgaricus bisporusen los Estados Unidos fue de aproximadamente 1,110,000,000 de dólares en 2012-2013, según el Servicio Nacional de Estadísticas de Agricultura de la Junta de Estadísticas de Agricultura del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (20 de agosto de 2013).

[0009] Los cultivos deAgaricus,como los de otros microorganismos, se preparan, se mantienen, se propagan y se almacenan en medios estériles utilizando métodos de laboratorio microbiológico. Las herramientas estériles y las técnicas asépticas se utilizan en salas limpias o campanas de transferencia estériles para manipular las células de cultivos puros con diversos fines incluyendo la propagación clonal y para el desarrollo de nuevas cepas mediante diversas técnicas, incluidas la germinación de esporas en medios de cultivo estériles y uniones controladas en medios de cultivo estériles. También se preparan inóculos de cultivo comerciales, incluidos el “sustrato con micelio” y el “inóculo de revestimiento” de champiñón, utilizando métodos de producción microbiológica a gran escala, por ejemplo, introduciendo asépticamente el inóculo de un cultivo puro de una cepa deAgaricus bisporusen entre 1 y 14,000 litros de medio de cultivo esterilizado en condiciones estériles, y se proporcionan al usuario final como cultivos puros en medios de cultivo estériles contenidos en envases estériles.

[0010] Los champiñones se cultivan comercialmente en estructuras especialmente diseñadas en granjas dedicadas. Si bien hay muchas variaciones en los métodos, la siguiente descripción es típica. El compost preparado a partir de material lignocelulósico tal como paja, aumentado con material nitrogenado, se termina y se pasteuriza dentro de una instalación adecuada. El inóculo del champiñón, que comprende un “sustrato portador” friable esterilizado sobre el cual se ha incorporado asépticamente un cultivo puro de una cepa de champiñones a través de un inóculo y después se ha propagado, se mezcla con el compost pasteurizado y se incuba durante aproximadamente 13 a aproximadamente 19 días a una temperatura controlada, tiempo durante el cual el micelio del cultivo del champiñón coloniza toda la masa de compost y comienza a digerirlo. Después se coloca una “capa de revestimiento” no nutritiva de material como turba sobre el compost hasta una profundidad de aproximadamente 3,81 cm a aproximadamente 5,08 cm (de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2 pulgadas). Puede incorporarse a la capa de revestimiento un “inóculo de revestimiento” adicional que incorpore el mismo cultivo de champiñones para acelerar la formación y la cosecha de champiñones y mejorar la uniformidad de la distribución del micelio y los champiñones dentro y sobre la superficie del revestimiento. Las condiciones ambientales, incluyendo la temperatura y la humedad, en las instalaciones de cultivo se gestionan después cuidadosamente para promover y controlar la transición del cultivo del crecimiento vegetativo al reproductivo en la interfaz revestimiento/aire. En unos aproximadamente 13 a aproximadamente 18 días adicionales después del revestimiento, los champiñones se habrán desarrollado hasta la etapa correcta para su cosecha y venta. Se recolectará una cosecha de champiñones que comprenda el cultivo original durante un período de 3 a 4 días. Aparecen descargas adicionales de champiñones a intervalos de aproximadamente una semana. Comercialmente, se producen y se cosechan dos o tres descargas de champiñones antes de retirar el compost y reemplazarlo en la instalación de cultivo.

[0011] [0006]En términos generales, las cepas pueden diferenciarse en función de los rasgos asociados con el champiñón, tales como su tamaño, la forma (p. ej., la redondez del sombrero, el grosor de la carne), el color (es decir, sombrero blanco frente a pardo), la textura superficial (p. ej., la suavidad del sombrero), la densidad y/o firmeza del tejido, la maduración retardada, un número de esporas basidiales superior a dos, la ausencia de esporas, el aumento del contenido de materia seca, la mejora de la vida útil y la reducción de la decoloración, así como rasgos asociados con el cultivo en sí, y/o productos que incorporan el cultivo, y/o cultivos que incorporan el cultivo, incluidos el aumento del rendimiento de los cultivos, la alteración de la distribución del rendimiento a lo largo del tiempo, la disminución del intervalo entre el micelio y la recolección, la resistencia a la infección, los síntomas o la transmisión de enfermedades bacterianas, víricas o fúngicas, la resistencia a los insectos, la resistencia a los nematodos, la facilidad de gestión de los cultivos, la idoneidad del cultivo para la cosecha mecánica y las respuestas conductuales a las condiciones ambientales, incluidos los factores de estrés, la composición del sustrato de nutrientes, las influencias estacionales, las prácticas agrícolas, las interacciones entre sí o con otros (compatibilidad o incompatibilidad) con diversas cepas de champiñones, por dar algunos ejemplos. Las cepas también pueden diferenciarse en función de su huella genotípica (presencia de alelos específicos en loci marcadores definidos en el genoma nuclear o mitocondrial). Las cepas pueden tener una ascendencia diferente, lo que se reflejará directamente en el genotipo e indirectamente, en algunos casos, en el fenotipo.

[0013] Entre el cinco y el treinta por ciento de los champiñonesAgaricuscultivados en los Estados Unidos, Europa y otros lugares tienen un píleo de color pardo, según con las preferencias de los consumidores por una apariencia tradicional o “anticuada”. El segmento de mercado de champiñones “portabella” se abastece mediante el cultivo de cepas de sombrero pardo (= marrones). Los requisitos del mercado para los champiñones marrones en los EE. UU. y otros lugares son relativamente limitados y precisos para muchos rasgos fenotípicos observables, tales como el tamaño, la forma, el color, la conservación del color, la firmeza y los rasgos relacionados, tales como la vida útil. En consecuencia, las cepas genéticamente diferentes de champiñonesAgaricus bisporusmarrones de éxito comercial a menudo no pueden diferenciarse fácilmente en función de la apariencia de los champiñones, que en general deben cumplir con los requisitos del mercado.

[0015] Alrededor de 1980, las dos primeras cepas híbridas blancas deA. bisporus,desarrolladas en un laboratorio de Horst, Países Bajos, se introdujeron en el cultivo comercial. Estas dos cepas “Horst”, denominadas U1 y U3, son cepas híbridas estrechamente relacionadas producidas por cruces entre dos cepas cultivadas blancas preexistentes, según M. Imbernon y col.,Mycologia,88(5), 749-761 (1996). Los dos progenitores de U1 y U3 son cepas comerciales que pertenecen a dos tipos de cepas categóricas arraigadas conocidas como las cepas “smooth-white” (SW) y “off-white” (OW). Los homocariontes (o “líneas”) originales obtenidos de las cepas SW y OW, y utilizados en la hibridación que produjo la cepa U1, se designaron H39 y H97, respectivamente; es posible que estos cultivos ya no existan (A. Sonnenberg,pers. comm.).

[0017] Sin embargo, varios laboratorios han desheterocariotizado la cepa U1 y obtenido cultivos de neohaplontes que incorporan uno o el otro tipo nuclear correspondiente a los aportados por H39 o H97, así como el tipo mitocondrial de U1. Los presentes inventores se refieren categóricamente a estos dos tipos de neohaplontes de U1 como líneas u homocariontes SWNC y OWNC, respectivamente. A. Sonnenberg depositó una línea OWNC designada “H97” en la colección pública de cultivos del Fungal Genetics Stock Center de Kansas, EE.UU., con el número 10389, y en la colección pública de la American Type Culture Collection de Maryland, EE.UU., con el número MYA-4626. El genoma de H97 se secuenció y se puso en el dominio público por el Joint Genome Institute de California, EE.UU. (Véase Morin y col.2012).

[0019] Un tipo tradicional de cepa de champiñónA. bisporuscon sombrero marrón, denominada más frecuentemente cepa “Old-Fashioned Brown” (u “OFB”; los ejemplos del tipo de cepa OFB incluyen las cepas SB-65, SB-295 y RWK-2042 de Sylvan), que se originaron como una cepa silvestre en Europa y fue la principal cepa de cultivar marrón durante muchas décadas, incluso convirtiéndose en el único cultivar marrón de uso generalizado en los últimos años del siglo veinte. Desde la década de 1980 se han desarrollado algunas cepas híbridas diferentes de sombrero marrón, y algunas han disfrutado de cierto éxito comercial. Todos los ejemplos descritos públicamente de cepas híbridas de sombrero marrón relevantes desde el punto de vista comercial han tenido padres o abuelos tanto de sombrero marrón como de sombrero blanco. Los híbridos que tienen una línea precursora de sombrero blanco y una línea precursora de sombrero marrón se denominan categóricamente híbridos BW o de tipo BW. Este híbrido de tipo BW es heteroalélico en el locusPPC-1que determina el color en la estructura base 8 del genoma nuclear. Sylvan America, Inc. desarrolló y patentó el primer híbrido BW, la cepa X618 (más tarde llamada SC-600 y comercializada como S600), una cepa de color marrón claro, y más tarde solicitó patentes para una clase de cepas que incluía la cepa BW híbrida J10263, que no tiene esporas. Sylvan ha desarrollado numerosas líneas de reproducción y cepas híbridas a partir de estas dos y de muchas otras cepas híbridas de tipo BW, a partir de la década de 1980. Otros han desarrollado y patentado la cepa Broncoh híbrida BW, que es de color marrón claro a medio. Sin embargo, otros han desarrollado y patentado la cepa híbrida BR06 (N.º de Registro ATCC). La PTA-6876 (que más tarde se creyó que se comercializó como Heirloom), una cepa de color marrón oscuro que utilizaba la cepa híbrida BW 4x29 o 4-29 (N.º de Registro de ATCC PTA-6877) como precursora.

[0021] Las esporas heterocarióticas de una cepa inicial conserva la gran mayoría del genotipo parental (este comportamiento lo demostraron R. W. Kerrigan y col. enGenetics, 133, 225-236 (1993)). Un grupo de cepas desarrolladas mediante clonación o cultivo de esporas, o mediante cualquier otro método de “derivación esencial”, como se analiza más adelante, a partir de un solo progenitor (a diferencia de la exogamia entre dos progenitores diferentes) se denomina grupo de linaje derivado. Muchas cepas comerciales de champiñones desarrolladas a partir de la cepa OFB cumplen los criterios de variedades esencialmente derivadas (tal como se aplica el término a las variedades vegetales).

[0023] Agaricus bisporus

tiene un síndrome reproductivo conocido como anfitalismo, en el cual dos ciclos de vida distintos funcionan simultáneamente. Como en otros hongos, el propágulo reproductivo es una espora.Agaricusproduce esporas meióticamente, en un meiosporangio conocido como un basidio. En un primer ciclo de vida, las esporas deA. bisporusreciben cada una de un único núcleo postmeiótico haploide; estas esporas son competentes para cruzarse pero no son competentes para reproducir champiñones. Estas esporas haploides germinan para producir descendencia o líneas homocariotas que pueden cruzarse con otros homocariotas compatibles para producir nuevos heterocariotas híbridos que son competentes para producir champiñones. Los heterocariontes generalmente presentan mucha menos capacidad para cruzarse que los homocariontes. Este primer ciclo de vida se llama heteromixis o, más comúnmente, exogamia. Este ciclo de vida funciona pero normalmente no predomina en cepas deAgaricus bisporusvar.bisporus.

[0025] Un segundo ciclo de vida endogámico llamado intramixis predomina en la mayoría de las cepas deAgaricus bisporusvar.bisporus.La mayoría de las esporas reciben dos núcleos postmeióticos y la mayoría de estos pares de núcleos consisten en pares nucleares no hermanos (NSNP, por sus siglas en inglés) que tienen un genotipo heteroalélico en la mayoría o en todos los locus ligados centroméricos incluyendo el locus MAT. Ese genotipo MAT determina el fenotipo heterocariota de esta descendencia, que son reproductivamente competentes y pueden producir una cosecha de champiñones. De manera inusual entre los eucariotas, se ha observado que ha ocurrido relativamente poco entrecruzamiento cromosómico en la descendencia postmeiótica deA. bisporus;empíricamente, se pierde muy poco heteroalelismo (análogo a la heterocigosidad) entre la descendencia heterocariota de una cepa heterocariota. En consecuencia, los genotipos y fenotipos heterocariotas precursores y de la descendencia tienden a parecerse mucho entre sí, como se ha señalado anteriormente; por este motivo, la derivación esencial, p. ej., los métodos de producción de variedades esencialmente derivadas (EDV, por sus siglas en inglés), es una técnica de desarrollo de cepas bien conocida entre los productores comerciales de sustratos con micelio.

[0027] Las cepas actualmente disponibles para la industria de los champiñones permiten a los productores producir champiñones de manera exitosa y rentable. Existen varios factores que influyen en el grado de éxito y rentabilidad alcanzado. Las características de las cepas que son factores que pueden mejorar la rentabilidad del productor incluyen mayor productividad (mayor rendimiento o tiempo de ciclo más corto), captura acelerada de ingresos (cosecha más temprana), menores costes (por ejemplo, mayor facilidad y velocidad de cosecha), menores mermas (pérdida de peso antes de la venta), menor sobrepeso del producto en los paquetes (peso adicional del producto envasado, debido a tamaños particulares de champiñones individuales), mayor uniformidad de las respuestas del rendimiento del cultivo a las variaciones en las materias primas, condiciones y prácticas de crecimiento, rendimiento superior del cultivo en instalaciones particulares, regiones, etc., menores pérdidas por enfermedades incluyendo agentes de enfermedad víricos, bacterianos y fúngicos y/o menores pérdidas por plagas de insectos y nematodos del cultivo. También existen propiedades mejorables del producto de champiñones que aumentan la demanda por parte de los consumidores y comercializadores en la cadena de distribución y, por lo tanto, aumentan el volumen de ventas y/o el precio de venta, tal como un atractivo visual mejorado (coloración, forma, tamaño o textura de la superficie más deseables), características de sabor mejoradas o distintivas, cualidades de conservación mejoradas (mayor persistencia de los atributos visuales deseables), etc. De este modo, hay muchas características por las que una cepa nueva pueda considerarse superior en una instalación de producción o mercado de venta en particular, o en la industria a nivel regional o global. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevas cepas híbridas de cultivos de champiñónAgaricus bisporusy microorganismos que proporcionen características mejoradas para la rentabilidad del productor y para productos de champiñones mejorados en comparación con otras cepas anteriores deAgaricus bisporus.

[0029] También existe la necesidad de cepas deA. bisporusmarrones comercialmente aceptables con diferentes genotipos, en relación con el grupo de linaje derivado de OFB y con Heirloom, por dos motivos. En primer lugar, se sabe que las cepas incompatibles con otras cepas en cultivo (tales como las cepas OFB y Heirloom) retrasan la propagación de enfermedades víricas entre cultivos de diferentes cepas. Este es un problema particular para los productores de champiñones marrones, que, cuando se cultivan en forma de “portabella” o de sombrero abierto, liberan esporas que pueden transmitir la infección por el virus a toda la instalación. En segundo lugar, es bien sabido que cuando una industria de cultivos agrícolas depende en gran medida de un solo linaje genético (es decir, crea un monocultivo comercial como el que existe ahora para el linaje OFB deA. bisporus, y que podría existir para Heirloom), hay un mayor riesgo de fallos impredecibles y catastróficos de los cultivos a escala de toda la instalación o incluso de toda la industria. La experiencia de la industria ha demostrado que las cepas de champiñón, incluidas las cepas actuales de portabella marrón, pueden ser vulnerables a estos riesgos, como se analizó en Beyer y col., 2013, “First report ofSyzygites megalocarpus(Mucorales) web mold on the commercial portabella button mushroomAgaricus bisporusin North America”. Plant Disease 97(1): 142. Por lo tanto, desde una perspectiva de la gestión de riesgos y la seguridad alimentaria, es muy deseable proporcionar simultáneamente tanto la diversificación genética como las características de rendimiento y de los cultivos comercialmente aceptables.

[0031] [0016]Por último, cabe señalar que Robles y col. patente US-7,608,760 enseñan que la cepa parda BP-1, obtenida de la naturaleza por R. W. Kerrigan alrededor de 1990, tiene un “fondo genético difícil” y que los diversos cruces de BP-1 con otras cepas diversas producen casi invariablemente híbridos que carecen de “características agronómicas aceptables”. Por lo tanto, Robles enseña también que, entre los cruces de la BP-1 con otras cepas, solo en los cruces con una “cepa de cruzamiento intermediario” especial derivada del cruce de una cepa blanca comercial precursora y una cepa marrón comercial precursora, se obtuvo una cepa híbrida aceptablemente útil. Por lo tanto, un problema en la técnica ha sido la dificultad encontrada al utilizar material genético de la cepa BP-1 en cualquier programa de desarrollo de cepas, excepto en la aplicación restringida enseñada por Robles y col. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar un método distinto, útil y valioso mediante el cual, y de productos en donde, el material genético de BP-1 pueda combinarse con otro material genético deA. bisporusen cruces que no requieran el cruce de BP-1 con una “cepa de cruzamiento intermediario” especial, como enseña Robles.

[0033] Resumen de la invención

[0035] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier referencia a un “aspecto o aspectos de la descripción” indica que dicha descripción no forma parte de la invención reivindicada. La presente invención se refiere en general a un cultivo de champiñónAgaricus bisporusnuevo y distinto que comprende la cepa híbrida B14528 recientemente desarrollada o el cultivo de champiñónAgaricus bisporusque tiene al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa B14528. Se ha realizado un depósito de un cultivo de la cepa híbrida B14528, según se describe en la presente memoria, en la Colección de Cultivos de los Servicios de Investigación Agrícola (NRRL) 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE.UU. La fecha de depósito fue el 7 de febrero de 2014. El cultivo depositado se tomó del mismo cultivo mantenido por Sylvan America, Inc., Kittanning, Pa., el cesionario registrado, desde antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Se han eliminado todas las restricciones sobre el depósito y el depósito tiene previsto cumplir con todos los requisitos de depósito de la Oficina de Patentes y Marcas de los EE.UU., incluyendo 37 C.F.R. Sec.1.801-1.809, y todos los requisitos de depósito bajo el Tratado de Budapest. El n.º de registro de NRRL es 50900. El depositado se mantendrá en el depósito durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, lo que sea mayor, y se reemplazará según sea necesario durante ese período. La cepa se pondrá a disposición del público de manera irrevocable y sin restricciones ni condiciones al momento de la presentación de la solicitud de prioridad o al momento de la emisión de una patente sobre esta cepa según las leyes de patentes.

[0037] Se observa que dichos cultivos de la cepa B14528 producen champiñones, partes de champiñones, partes del cultivo y cepas y líneas que descienden o derivan de dichos cultivos. Por lo tanto, la presente invención abarca la cepa B14528, el cultivo de champiñónAgaricus bisporusque tiene al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa B14528, los cultivos en crecimiento latentes o activos presentes en las esporas latentes o en germinación de la cepa B14528, y los cultivos que incorporan el material genético de la cepa B14528. La presente invención también se refiere a métodos para fabricar y utilizar la cepa B14528.

[0039] Con respecto a las esporas, las esporas vivas son heterocariontes u homocariontes en estado latente. Las esporas son una parte del organismo champiñón. Otras partes incluyen células (definidas como compartimentos hifales que incorporan núcleos, mitocondrias, citoplasma, protoplastos, ARN, ADN, proteínas, membranas celulares y paredes celulares, incluidas paredes transversales), hifas y micelio. Las esporas pueden recolectarse asépticamente en material estéril, suspenderse en agua estéril en diversas diluciones y sembrarse en placas en medios de crecimiento de agar estériles para producir esporas germinadas y los cultivos incorporados dentro de las esporas. Una técnica preferida es tener dentro de la placa de Petri cerrada un cultivo vivo deAgaricusque pueda estimular la germinación de las esporas mediante la difusión de una feromona volátil. Las esporas germinadas pueden aislarse al microscopio utilizando microherramientas estériles tales como agujas de acero, sobre placas de agar con nutrientes frescos. Utilizando este método, pueden obtenerse descendientes heterocariotas y homocariotas de la cepa B14528 que comprenden las esporas y los cultivos incorporados dentro de las esporas de la cepa B14528.

[0041] El desarrollo de nuevas variedades híbridas mediante heteromixis comprende la asociación física controlada y el cruce de dos cultivos compatibles para obtener un nuevo cultivo heterocariótico. Los homocariontes (= “líneas”) son los cultivos iniciales preferidos para realizar cruces ya que tienen la máxima capacidad de anastomosarse y lograr plasmogamia con otros cultivos. También pueden ponerse en contacto físico dos heterocariontes pero con probabilidades excesivamente bajas desde el punto de vista comercial de que un cruce dé como resultado la formación exitosa de un nuevo heterocarionte. La compatibilidad está determinada por el genotipo en el locus MAT; dos homocariontes con el mismo alelo MAT no pueden establecer un heterocarionte después de la anastomosis. En un programa de cruce definido, se obtienen líneas homocariotas y se asocian en combinaciones de pares predeterminadas. En un método, los pares de homocariontes pueden colocarse muy cerca en la superficie de un medio de agar nutritivo en una placa de Petri y dejar que crezcan juntos (en una asociación física), momento en el cual se producen anastomosis entre los dos cultivos. Un resultado exitoso es un cruce. El nuevo heterocarionte híbrido puede obtenerse transfiriendo micelio desde la zona de fusión de la placa. Este método de cruce por pares se usó para desarrollar la cepa B14528.

[0043] Por el contrario, las Variedades Esencialmente Derivadas (EDV) suelen derivar directamente de un único cultivo inicial (por ejemplo, cepa); todas estas derivaciones producen EDV. No existe una definición universalmente aceptada de una EDV; un ejemplo de una definición aplicable a las variedades vegetales lo proporciona la Ley de Protección de Variedades Vegetales de los Estados Unidos (edición revisada, febrero de 2006). La definición empleada en la presente memoria es congruente con el término tal cual se entiende ampliamente. Los métodos de “derivación esencial” para obtener cultivos que son, por definición, por consiguiente, EDV de un único cultivo inicial deA. bisporusincluyen selección somática, selección mediante cultivo de tejidos, germinación de esporas únicas, germinación de esporas múltiples, autofecundación, cruce repetido con el cultivo inicial, mutagénesis y transformación, para proporcionar algunos ejemplos. La transformación mediada por ADN deA. bisporusse ha informado por Velcko, A. J. Jr., Kerrigan, R. W., MacDonald, L. A., Wach, M. P., Schlagnhaufer, C. y Romaine, C. P.

[0044] 2004, Expression of novel genes inAgaricus bisporususing anAgrobacterium-mediatedtransformation technique. Mush. Sci.16: 591-597 y las referencias en los mismos. La transformación puede introducir un único gen o alelo nuevo en el genoma de un cultivo inicial.

[0046] Las EDV se reconocen inequívocamente por su genotipo, que será total o predominantemente un subconjunto de aquel cultivo inicial único. Los porcentajes del genotipo inicial que estará presente en las EDV deAgaricus bisporusvarían desde casi el 100 % en el caso de selecciones somáticas, hasta el 99.x % en el caso de cepas modificadas por transformación mediada por ADN, hasta el 90-99,x % en el caso de selecciones de esporas simples o múltiples o alguna mutagénesis, hasta un promedio del 75-85 % en el caso de cruces entre hermanos descendientes (= autofecundación), hasta el 75 % en promedio en un retrocruzamiento de primera generación. Pueden emplearse muchos métodos de determinación del genotipo, incluyendo los métodos descritos a continuación y otros bien conocidos en la técnica, para determinar el porcentaje de ADN de un cultivo inicial que está presente en otro cultivo. En la presente invención, las EDV tienen al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa B14528.

[0048] El cruce repetido con el cultivo inicial para realizar introgresión de un solo rasgo en el fondo genético de un cultivo inicial se denomina conversión de rasgos introgresiva y, según las definiciones aceptadas de las EDV, también produce una EDV del cultivo inicial. En un ejemplo hipotético, en la primera repetición sucesiva de este proceso, una cepa resultante de esta generación tendrá en promedio aproximadamente el 75 % del ADN de la cepa inicial, mientras que aproximadamente el 25 % del ADN habrá sido aportado por una segunda cepa o línea; a medida que se repite este proceso, la representación del ADN de la cepa inicial aumentará, acercándose al 97 % en promedio después de 3 repeticiones sucesivas adicionales. No existe un umbral cuantitativo universalmente aceptado para la proporción de ADN aportada por un cultivo inicial en una EDV de un cultivo inicial; los inventores consideran que una identidad genotípica del 75 al 100 % con un cultivo inicial es indicativa de una EDV de un cultivo inicial. También se ha establecido que un EDV de un EDV es también un EDV de una cepa inicial. ComoAgaricus bisporusalterna generaciones entre cepas heterocariotas y líneas homocariotas, los criterios de derivación esencial se aplican por igual a los cultivos de ambas cepas y líneas.

[0050] Finalmente, se entenderá que “derivación” no incluye “descendencia por cruce” y que “derivación” y “descendencia” son dos conceptos completamente diferentes que no deben confundirse. Además, una EDV debe, axiomáticamente, tal cual se entiende bien en la técnica, solo ser obtenible con posterioridad en el tiempo y en la ejecución del proceso a la variedad o cepa inicial.

[0052] Las huellas genotípicas son descripciones del genotipo en locus definidos, donde se registra la presencia de alelos caracterizados. Estas huellas dactilares proporcionan técnicas poderosas y eficaces para reconocer clones y todos los tipos de EDV de una cepa inicial, así como para reconocer la ascendencia dentro de linajes exogámicos. Existen muchas técnicas disponibles para definir y caracterizar locus y alelos en el genotipo. El enfoque más detallado lo proporciona la secuenciación del genoma completo (WGS), que permite la caracterización directa y la comparación de las secuencias de ADN a lo largo de todo el genoma. Utilizando este enfoque para generar huellas genotípicas robustas que incorporen un gran número de locus marcadores, es posible establecer la naturaleza de la relación entre dos cepas, incluyendo cepas relacionadas por descendencia genealógica a lo largo de varias generaciones. Sylvan America, Inc., el cesionario del inventor ha rastreado marcadores genéticos a lo largo de cuatro a seis generaciones de sus árboles genealógicos de cría. Si hay un número suficiente de marcadores raros en una cepa o línea inicial, será posible identificar la descendencia de una cepa o línea inicial después de varias generaciones exogámicas sin una experimentación indebida. En un ejemplo hipotético, la expectativa media de representación genómica de una línea haploide inicial después de 4 generaciones exogámicas es del 3,1 % (50 %/2<4>) en un híbrido F4, lo que corresponde a aproximadamente 1 Mb del ADN genómico nuclear deA. bisporus.Basándose en los análisis de Sylvan America, Inc., esa cantidad de ADN de cada una de las dos cepas no relacionadas deA. bisporuspuede contener de forma típica de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 20,000 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), cualquiera de los cuales puede proporcionar un marcador distintivo que vincule el híbrido F4 con la línea inicial. Al utilizar múltiples marcadores independientes, pueden identificarse los ancestros de una cepa con una probabilidad muy alta de éxito y con una confianza razonable.

[0054] [0026]Un rasgo de interés biológico y comercial es la incompatibilidad entre heterocariontes. La genética de estos sistemas de autorreconocimiento y reconocimiento de otros no está bien dilucidada en hongos basidiomicetos tales comoAgaricus,pero se sabe que en otros géneros involucran múltiples alelos en múltiples loci independientes. Las diferencias en el supuesto genotipo en los loci de incompatibilidad impiden que las anastomosis tengan éxito y la continuidad citoplasmática entre mezclas físicas de dos o más heterocariontes. Una consecuencia de estas respuestas antagónicas es el retraso del crecimiento y el desarrollo y la reducción del rendimiento de los cultivos; este tipo de pérdida parcial de la cosecha es bien conocida y evidente para el productor experimentado. Otra consecuencia de la incompatibilidad heterocariótica es la restricción de la oportunidad de que los virus endocelulares se muevan libremente a través de las redes miceliales o entre ellas. Las enfermedades víricas, tales como las causadas por los virus LIV o MVX, pueden tener un impacto negativo grave en la productividad de las instalaciones y deben remediarse mediante prácticas de higiene a las que puede ayudarse mediante la rotación de cepas. Un método para mejorar la higiene de las granjas de champiñones denominado “interrupción del virus” consiste en reemplazar el material de cultivo (abono, sustrato con micelio, inóculo de revestimiento) que incorpora una cepa inicial por un inóculo y el material de cultivo que incorpora otra cepa diferente que es incompatible con la cepa inicial. En la implementación más eficaz del método de interrupción del virus, todo el material biológico de la cepa inicial en una granja de champiñones se reemplaza por material biológico de la segunda cepa incompatible. La incompatibilidad de las cepas crea una barrera eficaz, aunque no absoluta, para el traslado del virus desde los depósitos biológicos de una instalación a nuevos cultivos. El uso rotativo del cultivo entre cepas de champiñones de diferentes genotipos también puede interrumpir los ciclos de infección e infestación de plagas y patógenos exógenos.

[0056] Como se observado anteriormente, los productores de cepas híbridas de champiñones siempre están buscando variedades híbridas que permitan a los agricultores producir cultivos de champiñones de manera exitosa y rentable. En el caso de la cepa B14528 y su grupo de linaje derivado, los atributos positivos documentados en al menos una cepa hasta ahora incluyen un rendimiento total cosechado que puede superar el de cepas como OFB y 28Cc (que se obtuvo como un clon somático de Heirloom), un color marrón y un aspecto atractivos, buena firmeza, densidad y peso por pieza, y un tiempo de producción que puede acelerarse en comparación con otras cepas pardas, un rasgo que es particularmente adecuado para determinados segmentos del mercado y que tiende a acelerar la captura de ingresos y disminuir el tiempo de ciclo de la cosecha (lo que podría permitir un mayor rendimiento).

[0058] Además, la cepa B14528 tiene un genotipo diferente de los del grupo de linaje derivado de OFB y de las cepas 28A y 28C, que, al igual que la cepa 28Cc, se obtuvieron como clones somáticos de Heirloom y que comparten su genotipo y fenotipo. La cepa B14528 se puede distinguir de todas las demás cepas conocidas por su genotipo y también por su fenotipo. Como se esperaba del nuevo genotipo y del árbol genealógico, la cepa B14528 es incompatible con las cepas OFB utilizadas comercialmente y con la cepa 28Cc derivada de Heirloom, que es una característica conocida por retrasar la propagación de enfermedades víricas entre cepas. Por lo tanto, la cepa B14528 confiere un beneficio potencial en los programas de rotación de cepas diseñados para gestionar la higiene de las instalaciones. Se ha descubierto que la cepa B14528 proporciona simultáneamente tanto una diversificación genética como un rendimiento y unas características de cultivo aceptables desde el punto de vista comercial.

[0060] Estas y otras ventajas de la presente invención sobre el estado de la técnica existente relacionada con los champiñones y cultivos deAgaricus bisporus, que se pondrán de manifiesto a partir de la descripción que sigue, se consiguen mediante la invención como se describe y se reivindica a continuación en la memoria.

[0062] Uno o más aspectos de la presente invención pueden lograrse mediante un cultivo híbrido de champiñones deAgaricus bisporusdenominado cepa B14528, habiéndose depositado un cultivo representativo de la cepa con el número de registro de NRRL 50900. La cepa B14528 puede incluir diversas partes del cultivo, incluidas hifas, esporas y células, estando presentes dichas partes en el micelio vegetativo del cultivo o en los champiñones producidos por el cultivo o en ambos. Las esporas pueden ser esporas latentes o germinadas, y pueden incluir heterocariontes y homocariontes incorporados en las mismas. En una o más realizaciones de la descripción, una parte del cultivo híbrido de champiñones puede seleccionarse del grupo que consiste en ADN, ARN y proteínas, en donde el ADN incluye los mismos caracteres alélicos que están presentes en la cepa B14528 como se describe para los alelos en los loci marcadores ITS, p1n150-G3-2, MFPC-1-ELF, AN, AS y FF y en una columna etiquetada B14528 de la tabla V a continuación en la presente memoria, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado bajo el número de registro de NRRL 50900, y en donde dicho ARN y proteínas han expresado caracteres de secuencia correspondientes a y determinados por los caracteres alélicos del ADN.

[0064] Se pueden producir uno o más productos que incorporen el cultivo híbrido de champiñones deAgaricus bisporusdenominado cepa B14528. Dichos productos incluyen micelio, sustrato con micelio, inóculo, inóculo de revestimiento, champiñones frescos, champiñones procesados, trozos de champiñones y sustratos colonizados seleccionados entre granos, abono y materia particulada friable. Se apreciará que los trozos de friable se refieren a tallos, píleos y otras partes más grandes del propio champiñón. Las esporas de los champiñones pueden ser esporas latentes o germinadas, y pueden incluir heterocariontes y homocariontes incorporados en las mismas.

[0066] Uno o más aspectos adicionales de la presente invención pueden lograrse mediante un cultivo de champiñonesAgaricus bisporusde una variedad esencialmente derivada que tenga al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo del cultivo híbridos de champiñón de la cepa B14528. En una o más realizaciones, un cultivo deAgaricus bisporusproducido por derivación esencial tiene al menos una de las características esenciales de la cepa B14528, por ejemplo, el mismo fenotipo de compatibilidad heterocariótica y/o las características adicionales de redondez del sombrero, grosor de la pulpa, rendimiento y tiempo de producción con respecto a las cepas comerciales OFB y Heirloom, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900. Como se indica en las definiciones, la variedad esencialmente derivada (EDV) tiene al menos el 90 % del genoma o genotipo que está presente en el genoma o genotipo del cultivo inicial de la cepa B14528, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900. En otras realizaciones, la EDV es un cultivo de una cepa derivada de (1) un único cultivo inicial de la cepa B14528 o (2) una variedad esencialmente derivada de un único cultivo inicial de la cepa B14528, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900, de modo que al menos el 90 % de su genoma o genotipo está presente en el genoma o genotipo del cultivo inicial de la cepa B14528.

[0067] Otros aspectos adicionales de la presente descripción pueden lograrse mediante un cultivo deAgaricus bisporusque tiene las características fisiológicas y morfológicas esenciales de la cepa B14528, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900. Se apreciará que las características fisiológicas de la cepa incluirán también sus características de rendimiento. En una o más realizaciones, el cultivo tiene todas las características fisiológicas y morfológicas de la cepa B14528 en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900.

[0069] Otros aspectos más de la presente descripción pueden lograrse mediante un cultivo híbrido de champiñones deAgaricus bisporuscon una huella genotípica que tenga alelos en los loci marcadores ITS, p1N150-G3-2, MFPC-1-ELF, AN, AS y FF, en donde todos los alelos de los loci marcadores ITS, p1N150-G3-2, MFPC-1-ELF, AN, AS y FF de dicha huella están presentes en la huella genotípica de la cepa B14528, en donde se ha depositado un cultivo de la cepa B14528 con el número de registro de NRRL 50900. En una o más realizaciones, el cultivo tiene una huella genotípica con caracteres alélicos en los loci marcadores descritos en una columna denominada B14528 de la tabla V, en donde todos los caracteres alélicos de dicha huella están presentes en la huella genotípica de la cepa B14528, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900.

[0071] Otros aspectos de la invención pueden lograrse mediante un método para producir un cultivo híbrido de champiñones deAgaricus bisporusque incluye la etapa de cruzar una línea homocariótica denominada B12998-s39, cuyo cultivo se depositó con el número de registro de NRRL 50899, con una segunda línea homocariótica obtenida de una cepa híbrida de tipo BW denominada BW-S191, cuyo cultivo se depositó con el número de registro de NRRL 50901. Dicho cruce proporciona el cultivo híbrido de champiñones denominado cepa B14528, que muestra antagonismo hacia las cepas heterocarióticas del grupo de linaje derivado de OFB y 28Cc/Heirloom. La incompatibilidad heterocariótica observable demuestra la distinción genética de la cepa B14528 en relación con cepas como la OFB y la 28Cc/Heirloom. En una o más realizaciones, el método incluye además proporcionar un cultivo de champiñones de la invención en productos de champiñones seleccionados del grupo que consiste en micelio, sustrato con micelio, inóculo, inóculo de revestimiento, champiñones frescos, champiñones procesados, partes de champiñones, extractos y fracciones de champiñones, trozos de champiñones y sustratos colonizados seleccionados entre granos, abono y materia particulada friable. En otras realizaciones, el método puede incluir proporcionar el cultivo de champiñones en cultivos derivados seleccionados del grupo que consiste en homocariontes, heterocariontes, aneuploides, subcultivos somáticos, cultivos de explantes tisulares, protoplastos, esporas latentes, esporas en germinación, descendientes endogámicos y descendientes exogámicos, cultivos transgénicos y cultivos con un genoma que incorpora una conversión de un solo locus.

[0073] Uno o más aspectos adicionales de la presente invención pueden lograrse mediante un cultivo, una célula o un cultivo que incluya la célula, producido mediante el método o los métodos anteriores. Por lo tanto, una o más realizaciones pueden incluir un método que incluya además la etapa de criar el cultivo híbrido de champiñones para producir champiñones híbridos y partes de champiñones. Otras realizaciones pueden proporcionar métodos en donde el cultivo híbrido de champiñones producido, o la célula, incluye un perfil de marcadores que tiene alelos en los loci marcadores ITS, p1N150-G3-2, MFPC-1-ELF, AN, AS y FF, en donde todos los alelos de los loci marcadores ITS, p1N150-G3- 2, MFPC-1-ELF, AN, AS y FF de dicho perfil de marcadores también están presentes en el perfil de marcadores de la cepa B14528, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900. Otras realizaciones más pueden proporcionar métodos en donde el cultivo híbrido de champiñones producido, o la célula, incluye un perfil de marcadores que tiene caracteres alélicos en los loci marcadores descritos en una columna denominada B14528 de la tabla V, en donde todos los caracteres alélicos de dicho perfil de marcadores también están presentes en el perfil de marcadores de la cepa B14528, en donde un cultivo de la cepa B14528 se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900.

[0075] Finalmente, otro aspecto de la presente invención puede lograrse mediante un método que utiliza el cultivo híbrido de champiñones seleccionado de una cepa B14528 o un cultivo de champiñonesAgaricus bisporusque tiene al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa B14528, habiéndose depositado un cultivo representativo de la cepa con el número de registro de NRRL 50900. En una realización, el método incluye además cultivar una cosecha de champiñones comestibles llevando a cabo las etapas descritas anteriormente en la presente memoria. En otra realización, el método puede incluir el uso de la cepa B14528 o variedades esencialmente derivadas de la cepa B14528 en la rotación de cultivos para reducir la presión de patógenos y los reservorios de patógenos en las instalaciones de cultivo de champiñones, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. En otra realización más, el método incluye utilizar la cepa B14528 y variedades esencialmente derivadas de la cepa B14528 para producir descendencia como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

[0077] Descripción detallada de la invención

[0079] Inicialmente, para proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que debe darse a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

[0081] Alelo: Una unidad hereditaria del genoma en un locus definido, identificado en última instancia por su secuencia de ADN (o por otros medios); en un genotipo, un carácter alélico.

[0082] Anfitalismo: Un síndrome reproductivo en el cual tanto la heteromixis como la intramixis están activas.

[0083] Anastomosis: Fusión de dos o más hifas que logra continuidad citoplasmática.

[0084] Basidiomiceto: Un grupo monofilético de hongos que producen meiosporas en los basidios; un miembro de una subdivisión correspondiente de hongos tales como los Basidiomycetales o Basidiomycotina.

[0085] Basidio: La célula meiosporangial, en la cual se producen la cariogamia y la meiosis, y tras la que se forman las basidiosporas.

[0086] Bioeficiencia: Para los cultivos de champiñones, el peso fresco neto del cultivo cosechado dividido por el peso seco del sustrato de compost en el momento del inóculo, para cualquier área de cultivo muestreada o peso de compost dados.

[0087] Reproducción: Desarrollo de cepas, líneas o variedades utilizando métodos que enfatizan el cruce sexual; véase Descendiente.

[0088] Cepa híbrida tipo BW: Una categoría de cepas iniciales (y sus grupos de linaje derivados) obtenidas por hibridación de una línea precursora de sombrero blanco y una línea precursora de sombrero marrón (es decir, las dos líneas llevan alelos que determinan el color del sombrero blanco o marrón, respectivamente, en el locusPPC1), ejemplificado por SC-600, Broncoh, 4x29, J10259, J10261, J10263 y B12998; híbrido tipo BW, cepa BW, BW.

[0089] Sombrero: Píleo; parte del champiñón, la estructura que contiene las laminillas.

[0090] Redondez del sombrero: Estrictamente, una relación entre la distancia máxima entre las partes superior e inferior del sombrero, dividida por la distancia máxima a través del sombrero, medida en un champiñón biseccionado longitudinalmente; generalmente promediado sobre muchos especímenes; subjetivamente, una propiedad “redondeada” de la forma del sombrero.

[0091] Sustrato portador: Un medio que tiene propiedades tanto nutricionales como físicas adecuadas para lograr tanto el crecimiento como la dispersión de un cultivo.

[0092] Capa de revestimiento, revestimiento: Una capa de material no nutritivo tal como turba o suelo, que se aplica a la superficie superior de una masa de compost colonizado para permitir el desarrollo del cultivo de champiñones.

[0093] Inóculo de revestimiento (Cl): Una formulación de material de inóculo que incorpora un cultivo de champiñones, normalmente de una cepa heterocariota definida, adecuada para mezclar en la capa de revestimiento.

[0094] Clonación: Propagación somática sin selección.

[0095] Capacidad de combinación: La capacidad de un individuo para transmitir rasgos o un rendimiento superior a su descendencia (los métodos de evaluación conocidos y disponibles varían según el rasgo).

[0096] Compatibilidad: Véasecompatibilidad de heterocarionte.

[0097] Cultivo: El organismo vivo tangible; el organismo propagado en diversos medios de cultivo y sustratos; un caso de una cepa física, línea, homocarionte o heterocarionte; la suma de todas las partes del cultivo, incluyendo hifas, champiñones, esporas, células, núcleos, mitocondrias, citoplasma, protoplastos, ADN, ARN, proteínas, membranas celulares y paredes celulares.

[0098] Derivación: Desarrollo de una cepa o cultivo a partir de una única cepa inicial, o predominantemente a partir de una única cepa inicial, a diferencia de la descendencia mediante cruce sexual entre dos cepas precursoras; véase Variedad esencialmente derivada (EDV).

[0099] Grupo de linaje derivado: Una cepa o variedad inicial y el conjunto de EDV derivadas de esa única cepa o variedad inicial.

[0100] Descendiente: La producción de descendencia de dos padres y/o cuatro abuelos y/o progenitores adicionales, a través de cruce sexual; a diferencia de la derivación de una única cepa inicial.

[0101] Diploide: Que tiene dos complementos cromosómicos haploides dentro de una sola envuelta nuclear.

[0102] [0060]Derivación esencial: Un proceso mediante el cual una Variedad esencialmente derivada se obtiene a partir de una variedad o cepa inicial o de una EDV de una variedad o cepa inicial; modificación de un cultivo inicial utilizando métodos que incluyen selección somática, selección por cultivo de tejidos, autofecundación incluyendo reproducción intramíctica a través de esporas únicas y esporas múltiples y cruce de líneas de descendencia hermanas, retrocruce con la variedad inicial o mutagénesis y/o transformación genética de la variedad inicial para producir un cultivo distinto en el cual el genotipo del cultivo resultante sea predominantemente el del cultivo inicial.

[0103] Variedad esencialmente derivada (EDV): (Nota: Las definiciones de EDV, por ejemplo, como se aplican a las plantas en la PVPA de EE.UU., incorporan elementos de (1) parentesco, (2) métodos de derivación y (3) pruebas empíricas). Una variedad que tiene del 75 al 99,99999 % de identidad genética con una cepa o variedad inicial, o del 100 % en un heterocarionte con reasociación internuclear de cromosomas. Generalmente, una variedad que deriva total o predominantemente de una variedad inicial o de una EDV de una variedad inicial, y que se conforma a características especificadas o “esenciales” de la variedad inicial excepto por las diferencias distintivas resultantes del acto de derivación, es una EDV de la variedad inicial. En la técnica del desarrollo de cepas de champiñones, una cepa o cultivo derivado predominante o enteramente de una única cepa o cultivo inicial, teniendo la mayor parte o la totalidad, pero al menos el 75 %, de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa o cultivo inicial; una cepa o cultivo obtenido a partir de una cepa o cultivo inicial mediante selección somática, selección de cultivos de tejidos, autofecundación incluyendo el cruce de líneas de descendencia hermanas y reproducción intramíctica mediante esporas únicas o múltiples, retrocruce con la cepa o cultivo inicial o mutagénesis y/o transformación genética de la cepa o cultivo inicial; una cepa o cultivo reconstituido a partir de neohaplontes derivados de una cepa o cultivo inicial, independientemente de si las líneas haploides se han transmitido a otros heterocariontes o han salido de ellos; una cepa o cultivo con el mismo fenotipo esencial que el de una cepa o cultivo inicial; en contraste con el descendiente (a través del cruce sexual entre dos cepas precursoras).

[0104] Grosor de la carne: Una relación entre la distancia máxima entre la parte superior del tallo y la parte más superior del sombrero, dividida por la distancia máxima a través del sombrero, medida en un champiñón biseccionado longitudinalmente; generalmente promediado sobre muchos especímenes; llamado subjetivamente “carnosidad”.

[0105] Descarga: Un período de producción de champiñones dentro de un ciclo de cultivo, separado por intervalos de no producción; el término descarga abarca los términos “brote” y “ola” y puede leerse como cualquiera de esos términos.

[0106] Hongo: Un organismo clasificado como miembro del Reino Fungi.

[0107] Descendencia genealógica: Descendencia de progenitores, incluyendo los padres, a lo largo de un número limitado (por ejemplo, 10 o menos) de generaciones cruzadas de forma típica; a diferencia de la derivación de una única cepa inicial.

[0108] Huella genotípica: Una descripción del genotipo en un conjunto definido de locus marcadores; el genotipo conocido.

[0109] Laminilla: Lamela; parte del champiñón, la estructura que contiene el himenóforo y el basidio.

[0110] Haploide: Que tiene solo un único complemento de cromosomas nucleares; véasehomocarionte.

[0111] Heteroalélico: Que tiene dos alelos diferentes en un locus; análogo a heterocigoto.

[0112] Heteroalelismo: Diferencias entre cromosomas homólogos en un genotipo heterocariota; análogo a heterocigosidad.

[0113] Heterocarionte: Como un término técnico esto se refiere a un heterocarionte sexual: un cultivo que tiene dos tipos complementarios (es decir, necesariamente heteroalélicos en el locusMAT) de núcleos haploides en un citoplasma común y es, por lo tanto, funcional y fisiológicamente análogo a un individuo diploide (pero representado citogenéticamente como N+N en lugar de 2N), y que es potencialmente competente desde el punto de vista reproductivo, y que presenta reacciones de incompatibilidad propia/no propia con otros heterocariontes; también denominado una cepa o estirpe en el contexto de la reproducción.

[0114] Compatibilidad de heterocarionte: La ausencia de antagonismo observada durante la proximidad física o el contacto entre dos heterocariontes que no son genéticamente idénticos; véase Incompatibilidad de heterocarionte.

[0115] Incompatibilidad con heterocarionte: El fenómeno de antagonismo observado durante la proximidad física o el contacto entre dos heterocariontes que no son genéticamente idénticos; un sistema de reconocimiento propio/no propio de múltiples locus que funciona en heterocariontes basidiomicetos.

[0116] Heterocariota: Que tiene el carácter de un heterocarionte.

[0117] Heteromixis: Ciclo de vida que implica el cruce entre dos individuos o gametos haploides diferentes y no hermanos; exogamia.

[0118] Homoalélico: Que no tiene más de un alelo en un locus. El término equivalente en un organismo diploide es “homocigoto”. Las líneas haploides son por definición completamente homoalélicas en todos los locus no duplicados.

[0119] Homocarionte: Un cultivo haploide con un único tipo (o linaje somático) de núcleo haploide (citogenéticamente representado como N) y que normalmente es reproductivamente incompetente y que no exhibe reacciones típicas de incompatibilidad propia/no propia con heterocariontes, y que puede funcionar como un gameto en anastomosis sexualmente complementarias; una “línea” que, al igual que una línea vegetal endogámica, transmite un genotipo uniforme a la descendencia; una línea predominantemente homoalélica que se cruza bien y fructifica mal es supuesto putativo homocarionte para fines de desarrollo de cepas; véase el análisis a continuación.

[0120] Homocariota: Que tiene el carácter de un homocarionte; haploide.

[0121] Cepa híbrida tipo HW: Una categoría de cepas obtenidas por hibridación de cepas precursoras, y que tienen un color de sombrero blanco, que también comprende cualquier grupo de linaje derivado que incluya una cepa inicial que también sea una cepa híbrida de tipo HW y sus EDV, ilustradas por las cepas U1, A-15, S-130, AS 2796, AS3003, B7970, J9277, B9798, J10102, J10117, J10165, J11500 y otras; cepa Hybrid White, híbrido tipo HW, cepa HW, HW.

[0122] Híbrido: De origen biprecursor, usualmente se aplica a cepas y cultivos heterocariotas producidos en cruces controlados.

[0123] Hibridación: Asociación física, por ejemplo en una placa de Petri que contiene un medio nutritivo estéril a base de agar, de dos cultivos, usualmente homocariontes, en un intento de lograr anastomosis, plasmogamia y formación de un heterocarionte sexual (= cruce); teniendo éxito en lo anterior.

[0124] Hifas: Elementos filiformes del micelio, compuestos por compartimentos similares a células.

[0125] Endogamia: Cruces que incluyen cruces de líneas hermanas, cruces retrospectivos con líneas o cepas precursoras e intramixis; reproducción que involucra a padres que están genéticamente relacionados.

[0126] Incompatibilidad: Véaseincompatibilidad de heterocarionte.

[0127] Inóculo: Un cultivo en una forma que permite la transmisión y la propagación del cultivo, por ejemplo, a través de nuevos medios; los tipos comerciales especializados de inóculo incluyen micelio y Cl; plural: inóculos.

[0128] Intramixis: Ciclo de vida sexual uniprecursor que implica la formación de un par de núcleos posmeióticos complementarios “acoplados” dentro del basidio o espora individual.

[0129] Conversión de rasgos introgresivos: cruce de la descendencia de un híbrido con una línea o cepa precursora de tal modo que un rasgo deseado de una cepa se introduce en un fondo genético predominante de la otra línea o cepa precursora.

[0130] Lamela: véase “laminilla”.

[0131] Línea: Un cultivo utilizado en cruces para producir una cepa híbrida; ordinariamente un homocarionte que es, por lo tanto, homoalélico, de lo contrario un cultivo no heterocariota (no NSNPP) que es altamente homoalélico; prácticamente, un cultivo funcionalmente homocariota y total o predominantemente homoalélico; análoga en la reproducción de plantas a una línea endogámica que es predominante o totalmente homocigota.

[0132] Grupo de linaje: véase “grupo de linaje derivado”. El conjunto de EDV derivadas de una única cepa o variedad inicial.

[0133] Locus: Una parte contigua definida del genoma, homóloga aunque a menudo varía entre diferentes genotipos; plural: locus.

[0134] Selección asistida por marcadores: Uso de marcadores genéticos enlazados, incluyendo marcadores moleculares, para rastrear los locus de interés que determinan rasgos entre la descendencia y a través de pedigríes.

[0135] MAT: El locus de tipo de cruce, que determina la compatibilidad sexual y el estado heterocariota.

[0136] Cruce: La unión sexual de dos cultivos a través de anastomosis y plasmogamia; los métodos para obtener cruces entre cultivos de champiñones son bien conocidos en la técnica.

[0137] Micelio: El cuerpo vegetativo o talo del organismo champiñón, que comprende hifas filiformes.

[0138] Champiñón: La estructura reproductiva de un hongo agárico; un agárico; un producto alimenticio cultivado del mismo nombre.

[0139] Neohaplonte: Un cultivo o línea haploide obtenido mediante desheterocariotización física (reducción a componentes haploides) de un heterocarionte; un homocarionte obtenido somáticamente.

[0140] OFB: Cepa tipo Old-Fashioned Brown; un grupo de linaje derivado de un cultivar tradicional que se origina a partir de una única cepa silvestre inicial en Europa y que también incluye sus EDV, ilustrado por las cepas SB-65, SB-295, RWK_2042; cepa OFB, cepa tipo OFB.

[0141] Descendencia: Descendientes, por ejemplo, de un heterocarionte precursor, dentro de una única generación; utilizado más frecuentemente para describir cultivos obtenidos a partir de esporas de un champiñón de una cepa.

[0142] Exogamia: Cruce entre individuos no emparentados o distantemente emparentados.

[0143] Cepa tipo OW: Una categoría de cepas cultivares tradicionalmente denominadas cepas “Off-white”, que comprende una cepa inicial y su grupo de linaje derivado, ilustrado por la cepa Somycel 76; cepa OW, OW.

[0144] Precursor: Un progenitor inmediato de un individuo; una cepa precursora es un heterocarionte, una línea precursora es un homocarionte; un heterocarionte puede ser el progenitor de un heterocarionte F1 a través de una línea precursora intermedia.

[0145] Reproducción asistida por pedigrí: El uso de información genealógica para identificar combinaciones deseables de líneas en programas de cruce controlado.

[0146] Fenotipo: Características observables de una cepa o línea según se expresan y se manifiestan en un entorno.

[0147] Plasmogamia: Establecimiento, a través de anastomosis, de la continuidad citoplasmática que conduce a la formación de un heterocarionte sexual.

[0148] Progenitor: Ancestro, incluyendo el precursor (el progenitor directo).

[0149] Autofecundación: Cruce entre líneas hermanas; también intramixis.

[0150] Somático: Del micelio vegetativo.

[0151] Prole: Un cultivo de champiñones, típicamente un cultivo puro de un heterocarionte, típicamente sobre un sustrato estéril que es materia particulada friable y dispersable, en algunos casos grano de cereal; inóculo comercial para compost; la referencia al inóculo incluye la referencia al cultivo sobre un sustrato.

[0152] Espora: Parte del champiñón, el propágulo reproductivo.

[0153] Tallo: Estípite; parte del champiñón, la estructura que sostiene el sombrero.

[0154] Medio de cultivo estéril: Medio nutritivo, esterilizado en autoclave u otros métodos, que soporta el crecimiento del organismo; los ejemplos incluyen medio nutritivo sólido a base de agar tal como el Agar patata dextrosa (PDA), caldo nutritivo y muchos otros materiales.

[0155] Pie: véase “tallo”.

[0156] Cepa: Un heterocarionte con características definidas o una identidad o ascendencia específica; equivalente a una variedad.

[0157] Cepa tipo SW: Una categoría de cepas cultivares tradicionalmente denominadas cepas “Smooth-white”, que comprende una cepa inicial y su grupo de linaje derivado, ilustrado por la cepa Somycel 53; cepa SW, SW.

[0158] Cultivo de tejido: Un micelio vegetativo desdiferenciado obtenido de un tejido diferenciado del champiñón.

[0159] Conversión de rasgos: Introducción selectiva de los determinantes genéticos de uno (una conversión de un solo locus) o más rasgos deseables en el trasfondo genético de una cepa inicial, conservando la mayor parte del trasfondo genético de la cepa inicial. Véase “Conversión de rasgos introgresivos” y “Transformación”.

[0160] Transformación: Un proceso mediante el cual el material genético transportado por una célula individual se altera mediante la incorporación de ADN extraño (exógeno) a su genoma; un método para obtener una conversión de rasgos que incluye una conversión de un único locus.

[0161] [0119]Brote de virus: Uso varias cepas incompatibles, es decir, cepas que presentan incompatibilidad de heterocarionte, sucesivamente en un programa de rotación de cepas planificada dentro de una instalación de producción de champiñones para reducir la transmisión del virus desde los reservorios de virus en el sitio a los cultivos recién plantados.

[0163] Rendimiento: El peso fresco neto del cultivo cosechado, normalmente expresado en kilos por centímetro cuadrado (libras por pie cuadrado).

[0165] Patrón de rendimiento: La distribución del rendimiento dentro de cada descarga y entre todas las descargas; influye en el tamaño, la calidad, los costes de recolección y la presión relativa de las enfermedades sobre el cultivo y el producto.

[0167] Con respecto a la definición de homocarionte anterior, se observa que los homocariontes y las líneas homoalélicas están sujetos a consideraciones técnicas y prácticas: Un homocarionte en términos clásicos es un cultivo haploide que axiomáticamente es completamente homoalélico. En términos prácticos, para fines de desarrollo de cepas fúngicas, la definición se amplía un poco para dar cabida tanto a las limitaciones técnicas como a la variación citológica, tratando todas las líneas predominantemente homoalélicas como homocariontes. Las limitaciones técnicas incluyen el hecho de que los genomas contienen regiones de ADN duplicadas que incluyen elementos repetidos, tales como transposones, y también pueden incluir grandes duplicaciones de segmentos cromosómicos debido a acontecimientos de translocación históricos; dichas regiones pueden parecer no homoalélicas según la mayoría de los métodos de genotipado. Dos genomas diferentes deA. bisporussecuenciados por el Joint Genome Institute, una instalación federal de EE. UU., difieren en la longitud estimada en un 4.4 % y en el número de genes en un 8.2 %, lo que sugiere una cantidad considerable de duplicación o reordenamiento del ADN dentro de diferentes cepas de la especie. Ningún genoma disponible actualmente deA. bisporuspuede explicar completamente la disposición física de dichos elementos y translocaciones, por lo que las secuencias genómicas ensambladas de las líneas haploides pueden tener regiones que parecen ser heteroalélicas utilizando los métodos de genotipado actualmente disponibles. Citológicamente, una descendencia homocariota normalmente será una espora que recibe un núcleo posmeiótico haploide. Sin embargo, una espora que recibe dos núcleos de tercera división del basidio será genéticamente equivalente a un homocarionte. Una espora que recibe dos núcleos posmeióticos “hermanos” de segunda división será un homocarionte funcional, aunque pueden estar presentes algunas “islas” distales de heteroalelismo debido a entrecruzamientos durante la meiosis. También, una meiosis que tiene una separación asimétrica de homólogos puede producir una espora aneuploide, funcionalmente homocariota, en la cual está presente un cromosoma extra, que produce una región de heteroalelismo. Todos estos cultivos son altamente homoalélicos y todos funcionan como homocariontes. Las limitaciones tecnológicas hacen que no sea práctico distinguir entre dichos cultivos y también descartar la duplicación de segmentos de ADN como explicación de las regiones limitadas y aisladas del ensamblaje de la secuencia del genoma que parecen ser heteroalélicas. Por lo tanto, en la presente solicitud, el uso del término “homoalélico” para caracterizar una línea incluye líneas total o predominantemente homoalélicas, y los cultivos descritos de este modo son homocariontes funcionales, son supuestamente homocariotas y todos se definen como homocariontes en la presente solicitud.

[0169] Ahora, con respecto a la invención y como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere a cultivos de la cepa híbrida B14528 deAgaricus bisporusy a cultivos derivados o descendientes de B14528 que tienen al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa B14528. Estos cultivos tienen muchos usos, incluida la producción de cultivos de champiñones. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a métodos de preparación y uso de cultivos de champiñones de la cepa B14528 yAgaricus bisporusque tienen al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo de la cepa B14528.

[0171] La cepa híbrida B14528 es el producto de dos generaciones de cruces lineales controlados realizados por Sylvan America, Inc. El cruce inicial se realizó entre la cepa Somycel 76, una cepa de tipo OW (Somycel S.A. es una filial de Sylvan) que se depositó el 18 de febrero de 2014 con el número de registro de NRRL 50903, y la cepa natural BP-1, una cepa depositada con el número de registro de la ATCC PTA-6903 y obtenido originalmente en torno a 1990 por R. W. Kerrigan como director del programa de recursos deAgaricus. Véase Kerrigan, R. W.1996. “Characteristics of a large collection of wild edible mushroom germ plasm: theAgaricusResource Program”. págs.302-308 en Culture collections to improve the quality of life. R. A. Sampson, J. A. Stalpers, D. van der Mei y A. H. Stouthamer, editores. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Bajos. Este primer cruce produjo la cepa híbrida B12998. Se ha realizado un depósito de la cepa híbrida B12998 en la Colección de Cultivos de los Servicios de Investigación Agrícola (NRRL) 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE. UU. La fecha de depósito fue el 18 de febrero de 2014. El cultivo depositado se tomó del mismo cultivo mantenido por Sylvan America, Inc., Kittanning, Pa., desde antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Se han eliminado todas las restricciones sobre el depósito y el depósito tiene previsto cumplir con todos los requisitos de depósito de la Oficina de Patentes y Marcas de los EE.UU., incluyendo 37 C.F.R. Sec.1.801-1.809, y todos los requisitos de depósito bajo el Tratado de Budapest. El n.º de Registro de NRRL es 50902.

[0173] En la siguiente generación, la línea homocariótica B12998-s39, descendiente del primer híbrido, se cruzó con la línea homocariótica BW-s191 para producir la nueva cepa híbrida B14528. La línea BW-s191 es una línea homocariótica única originada por Sylvan America, Inc. a partir de una espora germinada obtenida de un champiñón de un cultivo producido al cultivar en Sylvan un cultivo depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo como PTA-6877, un cultivo sin restricciones.

[0174] Los cultivos de la cepa B14528 producen cosechas comercialmente aceptables y deseables de champiñones marrones. La tabla I presenta los datos de rendimiento en libras por pie cuadrado, en cuatro pruebas de cultivo independientes con replicación interna. En todas las pruebas, se dan los rendimientos promedio de múltiples réplicas. En la prueba 13-247 se realizaron dos tratamientos de la B14528 y dos de las dos cepas de control, la cepa OFB SB-295 y la cepa 28Cc, que se obtuvo como un clon somático de la cepa Heirloom disponible en el mercado y sirve como sustituto de la misma. En la prueba 13-367, se dan los rendimientos promedio de una y dos descargas de un cultivo cultivado como champiñones portabella. Como se muestra en la tabla I, la productividad de la cepa B14528 es al menos similar, y normalmente es superior, a la productividad de las cepas OFB SB-295 y 28Cc, con un rendimiento de primera descarga que varía del 83 % al 167 % (con un promedio del 121 %) del de la cepa 28Cc, y con un rendimiento total que varía del 105 % al 145 % (con un promedio del 122 %) del de la cepa de 28Cc, en estas cuatro cepas.

[0175] Tabla i

[0178]

[0180] La distribución del cultivo durante el período de cosecha de dos o tres descargas fue proporcional entre las cepas ensayadas, lo que significa que el porcentaje de aumento del rendimiento de la cepa B14528 en relación con las cepas de control fue aproximadamente el mismo en cada descarga. De forma ventajosa, se cosecharon más libras del cultivo de B14528 normalmente durante la primera descarga, cuando la presión de las enfermedades y las plagas es más baja y la calidad del producto puede ser, en consecuencia, mayor.

[0181] En la primera descarga, la cosecha del cultivo (es decir, el rendimiento diario acumulado) se aceleró. El tiempo hasta la primera cosecha de B14528 fue aproximadamente equivalente al de las cepas OFB y 28Cc (todas entre 13 y 14 días después del revestimiento) en estas pruebas. Sin embargo, en los primeros días de la primera descarga, los datos de rendimiento diario acumulados de la tabla II, que muestran los promedios de las pruebas 13-357 y 13-365 como porcentaje del rendimiento de control, muestran que la cosecha de la cepa B14528 se aceleró con respecto a la del control de 28Cc.

[0182] Tabla II

[0183] Rendimiento diario acumulado:

[0184] Rendimiento de B14528 como porcentaje del rendimiento de 28Cc

[0187]

[0189] De hecho, en cada descarga, se cosechó antes una mayor proporción de la cosecha de la B14528 que de las cepas de control SB-295 y 28Cc. Las descargas de B14528 a menudo terminaron su producción un día antes que las de las cepas de control. Esto es ventajoso porque la sala de cultivo se puede vaciar y rellenar un día antes cuando se cultiva la B14528, lo que acorta el tiempo de ciclo de cultivo en aproximadamente un 2-3 %, dependiendo del sistema de cultivo utilizado, y aumenta la productividad de las instalaciones en una cantidad correspondiente.

[0190] La incompatibilidad entre cepas también puede ser un rasgo comercial útil de los champiñones. La B14528 es incompatible tanto con la cepa 28Cc, un clon somático de Heirloom que sirve como sustituto de esa cepa en estas pruebas, como con el grupo de linaje derivado de OFB representado por la SB-295. Cuando el material de revestimiento que incorpora inóculo de la B14528 se coloca sobre abono colonizado con cualquiera de las otras dos cepas marrones o, por el contrario, cuando cualquiera de las otras dos cepas marrones se coloca sobre la B14528, se produce una pérdida parcial de la cosecha, lo que demuestra la incompatibilidad, como muestran los datos de rendimiento de la tabla III:

[0191] Tabla III

[0194]

[0195] a continuación

[0198]

[0201] También se observará en la tabla III que el rendimiento de la primera ruptura de la B14528 en este ensayo fue algo superior al de cualquiera de las otras dos cepas de los tres apareamientos “propios”.

[0203] Los champiñones producidos por la cepa B14528 tienen un píleo de color marrón. Las tablas de colores de la Royal Horticultural Society (RHS) indicaron que el color del sombrero de los champiñones B14528 puede describirse como intermedio en el intervalo del RHS 176B “marrón rojizo moderado” al RHS 199A “marrón oliva moderado”. Se han realizado mediciones directas del color del sombrero del champiñón de la cepa B14528 utilizando un colorímetro Minolta y el sistema de espacio de color L-a-b. Se realizó una medición en los sombreros de cada uno de diez champiñones de primera ruptura cultivados en una instalación de prueba. Los valores medios, más o menos el error estándar, para los componentes de color L, a y b medidos fueron los siguientes: L = 64.57 ± 0.14; a = 7.60 ± 0.05; b = 24.36 ± 0.09. Los colores que se encuentran dentro del espacio de color descrito por estas distribuciones de tres parámetros o que coinciden sustancialmente con él se denominan “marrones” según las prácticas estándar y aceptadas de la industria comercial de los champiñones.

[0205] La cepa B14528 produce cosechas de champiñones que pueden tener un peso promedio por pieza más alto que los producidos por la cepa 28Cc o la cepa SB-295 (OFB) en condiciones idénticas. Esto es ventajoso porque cuesta menos dinero por libra recolectar los champiñones más pesados, lo que aumenta la rentabilidad. La tabla IV muestra el peso promedio, en gramos, de champiñones cultivados en una sola prueba, la prueba 14-24, en donde todas las condiciones, excepto la cepa, fueron iguales entre los tratamientos. Se usó abono colonizado por micelio como inóculo de revestimiento para B14528 y 28Cc; se usó un inóculo de revestimiento en forma de partículas esterilizado para la SB-295. Se pesaron veinte champiñones tomados al azar de entre todos los recolectados el día 14 después del revestimiento (es decir, al principio de la primera ruptura), o el día 17 para el SB-295 (que era más lento), y se obtuvo un peso promedio. Esto se repitió diez veces para cada cepa. El peso promedio por champiñón fue de 20.8 g en la cepa B14528 y de 15.5 g en la cepa 28Cc, y esta diferencia del 34 % fue estadísticamente significativa en el nivel de p = 0.0007 (resultado de la prueba de la t). El peso promedio por pieza de los champiñones de la cepa SB-295 fue de 17.8, y este fue significativamente diferente del valor de B14528 en el nivel de p = 0.015 (resultado de la prueba de la t).

[0207] La cepa B14528 produce cosechas de champiñones que pueden tener una densidad tisular (masa/volumen) promedio más alta que los producidos por la cepa 28Cc o la cepa SB-295 en condiciones idénticas de cultivo. Esto es ventajoso porque cuesta menos dinero por libra recolectar los champiñones más densos del mismo tamaño, lo que aumenta la rentabilidad. Los costes de envasado y transporte también pueden ser más bajos para los champiñones más densos y sus cualidades de conservación pueden ser superiores. La tabla IV muestra la densidad promedio, en gramos/cc, de las mismas muestras de champiñones recolectadas cultivadas en la prueba descrita anteriormente, prueba 14-24. Después de pesar los champiñones como se ha descrito anteriormente, el volumen de cada muestra se determinó mediante el desplazamiento de fluido y la densidad promedio se calculó dividiendo el peso promedio por el volumen promedio. La densidad promedio por muestra de champiñón fue de 0.69 g/cc en la cepa B14528 y de 0.60 g/cc en la cepa 28Cc, y esta diferencia del 15 % fue estadísticamente significativa en el nivel de p = 0.00017 (resultado de la prueba de la t). La densidad promedio de los champiñones de la SB-295 fue de 0.61 y esta fue significativamente diferente del valor de B14528 en el nivel de p = 2.4e<-6>(resultado de la prueba de la t).

[0209] Tabla IV

[0211] Peso de la pieza en gramos y densidad en g/cc, para champiñones de B14528, 28Cc y SB-295.

[0214]

[0215] a continuación

[0218]

[0221] La huella genotípica conocida de la cepa B14528 muestra numerosas diferencias con la de las cepas derivadas de Heirloom OFB y 28A y 28C. Los datos sobre el genotipo de Heirloom, además de los proporcionados en la patente US-7,608,760, se obtuvieron del análisis de cultivos denominados 28A y 28C, ambos derivados clonalmente de la cepa Heirloom disponible en el mercado y que, por lo tanto, también tienen el genotipo de Heirloom. Una huella única permite identificar inequívocamente la cepa B14528 (y sus variedades esencialmente derivadas y descendientes). Desde el punto de vista agronómico, la diversidad genética entre las cepas cultivadas es un objetivo deseable porque está bien establecido que los monocultivos genéticos entre las especies de cultivos agrícolas pueden conducir a un alto riesgo de fracasos desastrosos debido a determinadas enfermedades, plagas o presiones ambientales. Por lo tanto, cualquier cepa comercial deseable con novedad genética es valiosa. La cepa B14528 cumple esos criterios.

[0223] Para los fines de la presente invención, Sylvan America Inc. ha obtenido la secuencia genómica completa de la cepa B14528 y de los cultivos de sus líneas parentales y de las EDV seleccionadas de B14528 utilizando el siguiente método. Los cultivos de la línea parental homocariótica se cultivaron en un medio de cultivo en caldo estéril después de la maceración. Después de 2-4 semanas, las células de las hifas se recogieron por filtración, se congelaron a -80 °C y se liofilizaron hasta que se secaron. El tejido del sombrero se obtuvo de champiñones producidos por cultivos de la cepa heterocariótica B14528, y se congeló y liofilizó hasta que se secó. El ADN se extrajo utilizando un protocolo de CTAB seguido de tratamiento con RNasa y purificación en gel. Un contratista, SeqWright, preparó bibliotecas de ADN a partir del ADN de cada cultivo y secuenció las bibliotecas utilizando la tecnología Illumina MiSeq. El contratista realizó los montajes de las lecturas de la secuencia genómica utilizando la secuencia genómica de referencia de dominio público de H97. Por consiguiente, Sylvan America, Inc. conoce con certeza de aproximadamente el 93 % a aproximadamente el 95 % de todo el genotipo de la cepa B14528. El número total de marcadores que distinguen la cepa B14528 que conoce el cesionario es, según un análisis realizado por un programa de software, de aproximadamente 750,000. En la tabla V se proporciona un breve extracto del genotipo de la línea B14528 y su línea parental B12998-s39 en numerosos loci marcadores caracterizados por secuencia distribuidos a intervalos a lo largo de cada una de las 19 estructuras base de referencia H97 V2.0 de más de 100 Kb de longitud.

[0224] Tabla V

[0226]

[0227] a continuación

[0228]

[0229] a continuación

[0230]

[0231] a continuación

[0234]

[0237] La tabla V presenta una “huella digital” extraída del genotipo marcador de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) de las secuencias genómicas completas de la línea B12998-s39 y de la cepa B14528 híbrida F1. Los códigos de nucleótidos y de ambigüedad de la IUPAC se utilizan para representar las secuencias marcadoras de ADN de 9 bases observadas informadas anteriormente, cada una de las cuales representa uno o dos caracteres alélicos en un locus marcador genotípico. La identidad de cada locus marcador está especificada por la información de la posición del andamiaje y del SNP derivada de la secuencia del genoma de referencia H97 V2.0 publicada por el U.S. Department of Energy Joint Genome Institute (Morin y col.2012). Es evidente que los alelos de la línea B12998-s39 están incorporados dentro del genotipo heteroalélico de la cepa heterocariota híbrida B14528.

[0239] Es decir, se apreciará que cada nucleótido del genoma nuclear deAgaricus bisporustiene una identidad única y específica, especificada por el número de estructura base y el número de posición de nucleótido de ese nucleótido dentro de la secuencia de referencia estándar de la técnica (versión 2.0) deA. bisporuslínea H97, según lo determinado y puesto en el dominio público por el D.O.E. de EE.UU. Joint Genome Institute and theAgaricusGenome Consortium, como se describe en la publicación por Morin y col., “Genome sequence of the button mushroomAgaricus bisporusreveals mechanisms governing adaptation to a humic-rich ecological niche”. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 109: 17501-17506 (2012). Como se sabe en la técnica, cualquier marcador genético o locus marcador en el genoma deA. bisporuspuede identificarse especificando la información posicional de la secuencia de referencia H97. Por ejemplo, el primer marcador que aparece en la tabla V aparece en 1:101993 (es decir, estructura base 1: posición 101993).

[0241] Solo por conveniencia, la tabla V también proporciona secuencias cortas que flanquean la posición del nucleótido marcador; en el primer ejemplo en 1:101993, la secuencia proporcionada es GAAGnACAT, donde “n” representa la posición del nucleótido variable en 1:101993 que constituye el marcador genético informativo. La cantidad de secuencia flanqueante que se muestra es arbitraria y se proporciona solo como una ayuda para confirmar la “búsqueda” correcta del marcador en la secuencia del genoma de referencia.

[0243] Asimismo, las características del marcador proporcionadas en la columna etiquetada como B14528 en la tabla V se refieren al genotipo heteroalélico de B14528 en el que un alelo (es decir, dos idénticos) o dos alelos diferentes pueden estar presentes en cualquier locus del marcador (cada locus correspondiente a una sola fila de la tabla). En el caso de un locus marcador heteroalélico con dos alelos diferentes presentes en el genotipo, se ha empleado una abreviatura para describir e identificar la presencia de dos alelos. Se utilizan los “códigos de ambigüedad de nucleótidos de la IUPAC” estándar, por ejemplo, utilizando el código “y” para indicar que un alelo se caracteriza por una “T” en esa posición y el otro alelo por una “C” en esa misma posición.

[0245] A continuación, se proporciona una breve descripción del genotipo de la cepa B14528 en otros seis loci marcadores no ligados. Debido a que el heterocarionte B14528 incorpora dos conjuntos de cromosomas, hay dos copias alélicas (dos caracteres o elementos del genotipo) en cada locus del marcador. Por lo tanto, el breve extracto del genotipo que se proporciona a continuación consta de 12 alelos, caracteres o elementos. El breve extracto del genotipo fue preparado por Sylvan America, Inc. utilizando reacciones en cadena de la polimerasa específicas para amplificar las regiones genómicas que enmarcan los marcadores definidos de cada uno de los ADN de cultivo. Para este fin, se puede utilizar cualquier cebador de PCR adecuado que enmarque las regiones marcadoras definidas; los métodos de diseño y uso de cebadores de PCR adecuados son bien conocidos en la técnica. El ADN del producto de PCR amplificado fue secuenciado por un contratista, Eurofins, utilizando métodos de su elección, y los genotipos se determinaron mediante inspección directa de estas secuencias en comparación con la base de datos de secuencias marcadoras/alélicas de referencia de Sylvan America.

[0247] Descripción del marcador P1N150-g3-2:

[0249] El extremo 5' de este segmento marcador comienza en la posición 1 con la primera “T” de la secuencia TCCCAAGT, que corresponde a la posición 868615 de la estructura base 1 del H97 JGI V2.0 (Morin y col.2012) y se extiende en una orientación inversa (en relación con la orientación de la estructura base) durante aproximadamente 600 nt en la mayoría de los alelos; una inserción del transposón Abr1 en la posición 207 en el ADN del alelo 1T ha producido un segmento más largo. En la actualidad, se han documentado 9 alelos que incorporan al menos 30 posiciones polimórficas de diversas cepas de la colección de cría de Sylvan America.

[0250] Los alelos presentes en el árbol genealógico inmediato de la B14528, o en las cepas pardas cultivadas comercialmente, incluyen los alelos 1T, 2, 3 y 5, caracterizados de la siguiente manera (utilizando el formato: carácter de base nucleotídica @ posición de alineación, en función de la alineación de los alelos 2, 3 y 5, y las partes alineables del alelo 1T):

[0251] Alelo 1T:inserción del transposón Abr1 de 320 nt@206^207;“A” @ 321; “T” @ 327;”C” @ 374; “G” @ 378; “G” @ 422; “C” @ 431; “G” @ 472; etc.

[0252] Alelo 2: sin inserción de Abr1; “A” @ 321; “C” @ 327, “C” @ 374; “C” @ 378; “G” @ 422; “T” @ 431; “G” @472; etc. Alelo 3: sin inserción de Abr1; “A” @ 321; “T” @ 327, “G” @ 374; “C” @ 378; “G” @ 422; “T” @ 431; 'A' @472; etc. Alelo 5: sin inserción de Abr1; “G” @ 321; “C” @ 327, “C” @ 374; “C” @ 378; “G” @ 422; “T” @ 431; “G” @472; etc.

[0253] El marcador “p1n150-3G-2” es un refinamiento del marcador p1n150 informado sobre el Cromosoma 1 por Kerrigan, R.W., y col. “Meiotic behavior and linkage relationships in the secondarily homothallic fungusAgaricus bisporus”.Genetics 133, 225-236 (1993) y se ha mostrado que está vinculado al locus MAT (tipo de cruce) en Xu y col., “Localization of the mating type gene inAgaricus bisporus”. App. Env. Microbiol. 59(9): 3044-3049 (1993) y también se ha utilizado en otros estudios publicados. Si bien pueden utilizarse y se han utilizado varios cebadores diferentes para amplificar segmentos de ADN en los que está presente el marcador p1 n150-3G-2 y a partir de los cuales pueden secuenciarse, digerirse, caracterizarse electroforéticamente o analizarse de otro modo, las secuencias de cebadores empleadas en la presente invención para el desarrollo de los datos descritos son: Directo: 5'-aggcrycccatcttcasc-3' (Id. de sec. n.° 1); Inverso: 5'-gttcgacgacggactgc-3' (Id. de sec. n.° 2), con 35 ciclos de PCR, temperatura de hibridación de 56 °C, tiempo de extensión de 1 min.

[0254] Debido al enlace con el locus MAT, que es obligatoriamente heteroalélico en los heterocariontes fértiles, los genotipos de todos los heterocariontes conocidos y esperados en p1N150-G3-2 también son heteroalélicos.

[0255] La línea homocariótica B12998-S39 porta el alelo 5. La línea homocariótica BW-S191 porta el alelo 2. La cepa heterocariótica B14528 tiene un genotipo heteroalélico “2/5” para el locus del marcador p1N150-G3-2 (y también para el locusMATligado), lo que indica la presencia de los alelos 2 y 5, lo que la distingue de las cepas OFB, que tienen un genotipo “1T/3”, y también de la cepa 28C (y, por lo tanto, de Heirloom, 28Cc, etc.), que tiene un genotipo “1T/5” y carece del alelo 2, así como de otras cepas que son homoalélicas y/o que portan otros alelos diferentes.

[0256] Descripción del marcador ITS (= región ITS 1+2):

[0257] El segmento ITS forma parte de la región del ADNr nuclear, que es un casete que se repite en tándem hasta unas 100 veces en el genoma haploide deA. bisporus. Por lo tanto, no existe una ubicación precisa única de esta secuencia en el genoma H97 ensamblado y, de hecho, es difícil o imposible ensamblar con precisión la secuencia en todas las repeticiones en tándem. Se incluyeron tres copias de casete en la estructura base 10 del conjunto H97 JGI V2.0, comenzando en la posición 1612110; también se ensambla una copia parcial en la estructura base 29 (Morin y col.

[0258] 2012). El extremo 5' de este segmento marcador comienza en la posición 1 con la primera “G” de la secuencia GGAAGGAT y se extiende en una orientación hacia adelante (en relación con la orientación de la estructura base) durante aproximadamente 703-704 nt en la mayoría de los alelos. En la actualidad, se han documentado más de 9 alelos que incorporan al menos 11 posiciones polimórficas de diversas cepas de la colección de cría de Sylvan.

[0259] Los alelos presentes en el árbol genealógico inmediato de la B14528, o en las cepas pardas cultivadas comercialmente, incluyen los alelos I1, I2, I3 e I4 caracterizados de la siguiente manera (utilizando el formato: carácter de base nucleotídica @ posición de alineación, en función de la alineación de 9 alelos).

[0260] Alelo I1: “C” @ 52; “T” @ 461; “T” @ 522; “T” @ 563; etc.

[0261] Alelo I2: “T” @ 52; “T” @ 461; “T” @ 522; “T” @ 563; etc.

[0262] Alelo I3: “C” @ 52; “T” @ 461; “C” @ 522; “C” @ 563; etc.

[0263] Alelo I4: “C” @ 52; “A” @ 461; “C” @ 522; “C” @ 563; etc.

[0264] [0149]El marcador “ITS” se ha adoptado como la secuencia de “códigos de barras” oficial para todos los hongos (Schoch y col., Fungal Barcoding Consortium, “Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi”. Proc. Nat. Acad. Sci. <www.pnas.org/cgi/content/short/1117018109> (2012)) y se ha utilizado en innumerables publicaciones, incluyendo Morin y col., “Genome sequence of the button mushroomAgaricus bisporusreveals mechanisms governing adaptation to a humic-rich ecological niche”. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 109: 17501-17506 (2012) sobre la secuencia del genoma deA. bisporuscompleto. White y col. (1990), Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. En: PCR Protocols: a guide to methods and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds). Academic Press, New York, EE.UU.: 315-322., publicaron numerosas secuencias de cebadores para el marcador ITS, de las cuales los inventores utilizan los cebadores ITS1: 5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3' (Id. de sec. n.° 3) e ITS4: 5'-tcctccgcttattgatatgc-3' (Id. de sec. n.° 4), con 35 ciclos de PCR, temperatura de hibridación de 56 °C, tiempo de extensión de 1 min.

[0265] La línea homocariótica B12998-S39 porta el alelo I1. La línea homocariótica BW-S191 porta el alelo I2. La cepa heterocariótica B14528 tiene un genotipo heteroalélico “I1/I2” para el marcador ITS, lo que indica la presencia de los alelos I1 e I2, lo que la distingue de las cepas OFB, que tienen un genotipo “I3/ I4” y carecen de los alelos I1 e I2, y también de la cepa 28C (y, por lo tanto, de Heirloom), que tiene un genotipo “I1/I1” y carece del alelo I2, así como de otras cepas que son homoalélicas y/o que portan otros alelos diferentes.

[0266] Descripción del marcador MFPC-1-ELF:

[0267] El extremo 5' de este segmento marcador comienza en la posición 1 con la primera “G” de la secuencia GGGAGGGT, que corresponde a la posición 829770 de la estructura base 8 del H97 JGI V2.0 (Morin y col.2012) y se extiende en una orientación hacia adelante (en relación con la orientación de la estructura base) durante aproximadamente 860 nt en la mayoría de los alelos. En la actualidad, se han documentado al menos 7 alelos que incorporan al menos 40 posiciones polimórficas de diversas cepas de la colección de cría de Sylvan.

[0268] Los alelos presentes en el árbol genealógico inmediato de la B14528, o en las cepas pardas cultivadas comercialmente, incluyen los alelos E1, E2, E3, E4 y E6 caracterizados de la siguiente manera (utilizando el formato: carácter de base nucleotídica @ posición de alineación, en función de la alineación de 8 alelos).

[0269] Alelo E1: “A” @ 63; “A” @ 77; “A” @ 232; “G” @ 301; “A” @ 309; “T” @ 334; “A” @ 390; “A” @ 400;“T”@ 446,“A”@ 481; etc.

[0270] Alelo E2: “A” @ 63;“G” @77; “A” @ 232; “G” @ 301; “G” @ 309; “T” @ 334;“G”@ 390;“G”@ 400; “C” @ 446, “G” @ 481; etc.

[0271] Alelo E3: “A” @ 63; “A” @ 77; “A” @ 232; “G” @ 301; “G” @ 309; “T” @ 334; “A” @ 390; “A” @ 400; “C” @ 446, “G” @ 481; etc.

[0272] Alelo E4:“G”@ 63; “A” @ 77; “A” @ 232; “G” @ 301; “G” @ 309; “T” @ 334; “A” @ 390; “A” @ 400; “C” @ 446, “G” @ 481; etc.

[0273] Alelo E6: “A” @ 63; “A” @ 77; “A” @ 232; “A” @ 301; “G” @ 309; “T” @ 334; “A” @ 390; “A” @ 400; “C” @ 446, “G” @ 481; etc.

[0274] El marcador MFPC-1-ELF deriva de una secuencia mapeada por y col., “An expanded genetic linkage map of an intervarietalAgaricus bisporusvar.bisporus - A. bisporusvar.burnettiihybrid based on AFLP, SSR and CAPS markers sheds light on the recombination behaviour of the species”. Fungal Genetics and Biology 47: 226-236 (2010) que está enlazado al locus PPC-1 descrito por Callac y col., “Evidence for PPC1, a determinant of the pilei-pellis color ofAgaricus bisporusfruit bodies”. Fungal Genet. Biol. 23, 181-188 (1998). Se ha utilizado un marcador enlazado equivalente como se describe en Loftus y col., “Use of SCAR marker for cap color inAgaricus bisporusbreeding programs”. Mush. Sci. 15, 201-205 (2000). Si bien pueden utilizarse y se han utilizado varios cebadores diferentes para amplificar segmentos de ADN en los cuales está presente el marcador MFPC-1-ELF y a partir de los cuales puede secuenciarse, digerirse, caracterizarse electroforéticamente o analizarse de otro modo, las secuencias de cebadores empleadas por los inventores para el desarrollo de los datos descritos son: Directo: 5'-aytcrcaamaacataccttcaac-3' (Id. de sec. n.º 5); inverso: 5’-cattcggcgattttctca-3’ (Id. de sec. n.° 6), con 35 ciclos de PCR, temperatura de hibridación de 55 °C, tiempo de extensión de 0,5 min.

[0275] La línea homocariótica B12998-s39 porta el alelo E4. La línea homocariótica BW-s191 porta el alelo E3. La cepa heterocariótica B14528 tiene un genotipo heteroalélico “E3/E4” en el locus del marcador MFPC1-ELF, lo que indica la presencia de los alelos E3 y E4, lo que la distingue de las cepas OFB, que tienen un genotipo “E3/E6” y carecen del alelo E4, y también de otras cepas que son homoalélicas y/o portadoras de otros alelos diferentes.

[0276] Descripción del marcador AN:

[0277] El extremo 5' de este segmento marcador comienza en la posición 1 con la primera “G” de la secuencia GGGTTTGT, que corresponde a la posición 1701712 de la estructura base 9 del H97 JGI V2.0 (Morin y col.2012) y se extiende en una orientación hacia adelante (en relación con la orientación de la estructura base) desde aproximadamente 1660 nt (en el genoma del H97) hasta 1700 nt (en el espacio de alineación) en los alelos conocidos; varias inserciones/deleciones han creado polimorfismos de longitud que, además de las mutaciones puntuales de los nucleótidos individuales, caracterizan a los alelos. En la actualidad, se han documentado 5 alelos que incorporan más de 70 posiciones polimórficas de diversas cepas de la colección de cría de Sylvan.

[0278] Los alelos presentes en el árbol genealógico inmediato de la B14528, o en las cepas pardas cultivadas comercialmente, incluyen los alelos N1, N2, N3 y N4 caracterizados en parte de la siguiente manera (utilizando el formato: carácter de base nucleotídica @ posición de alineación, en función de la alineación de los alelos N1 a N5): Alelo N1:“G”@ 640; [eliminación] @ 844-846; “C” @ 954; “T” @ 882; “A” @ 994, etc.

[0279] Alelo N2: “A” @ 640; [eliminación] @ 844-846; “C” @ 954; “T” @ 882; “A” @ 994, etc.

[0280] Alelo N3: “A” @ 640; [eliminación] @ 844-846; “T”@ 954; “C” @ 882; “G” @ 994, etc.

[0281] Alelo N4: “A” @ 640; [eliminación] @ 844-846; “C” @ 954; “C” @ 882; “G” @ 994, etc.

[0282] La línea homocariótica B12998-s39 porta el alelo N3. La línea homocariótica BW-s191 porta el alelo N4. La cepa heterocariótica B14528 tiene un genotipo heteroalélico “N3/N4” en el locus del marcador AN, lo que indica la presencia de los alelos N3 y N4, lo que la distingue de las cepas OFB, que tienen un genotipo “N4/N4” y carecen del alelo N3, y de otras cepas que son homoalélicas y/o portadoras de los alelos N1 o N2 u otros alelos diferentes.

[0283] Descripción del marcador AS:

[0284] El extremo 5' de este segmento marcador comienza en la posición 1 con la primera “G” en la secuencia GG(T/N)GTGAT, que corresponde a la posición 752867 de la estructura base 4 del H97 JGI V2.0 (Morin y col.2012) y se extiende en una orientación hacia adelante (en relación con la orientación de la estructura base) desde aproximadamente 1620 nt (en el genoma del H97) hasta 1693 nt (en el espacio de alineación) en los alelos conocidos; varias inserciones/deleciones han creado polimorfismos de longitud que, además de las mutaciones puntuales de los nucleótidos individuales, caracterizan a los alelos. En la actualidad, se han documentado 7 alelos que incorporan más de 80 posiciones polimórficas de diversas cepas de la colección de cría de Sylvan.

[0285] Los alelos presentes en el árbol genealógico inmediato de la B14528, o en las cepas pardas cultivadas comercialmente, incluyen los alelos SC y SD caracterizados en parte de la siguiente manera (utilizando el formato: carácter de base nucleotídica @ posición de alineación, en función de la alineación de los alelos SA a SG):

[0286] Alelo SA: “C” @ 28; “A” @ 153; [eliminación] @ 258-263; “G” @ 275;

[0287] [inserción]+”TTTCCCAGC”+[inserción] @ 309-349; “C” @ 404, etc.

[0288] Alelo SC: “T” @ 28; “A” @ 153; “GATATC” @ 258-263; “G” @ 275;

[0289] [inserción]+'TTTCTCAGC'+[inserción] @ 309-349; “C” @ 404, etc.

[0290] Alelo SD: “C” @ 28;“C”@ 153; [eliminación] @ 258-263; “T” @ 275; [eliminación] @ 309-349;“T”@ 404, etc.

[0291] La línea homocariótica B12998-s39 porta el alelo SC. La línea homocariótica BW-s191 porta el alelo SD. El heterocarionte B14528 tiene un genotipo heteroalélico “SC/SD” en el locus del marcador AS, lo que indica la presencia de los alelos SC y SD, lo que lo distingue de la cepa 28C (y por lo tanto de Heirloom), que tiene un genotipo “SA/SD” y carece del alelo SC, y también de otras cepas que son homoalélicas y/o que portan el alelo SA u otros alelos diferentes.

[0292] Descripción del marcador FF:

[0293] El extremo 5' de este segmento marcador comienza en la posición 1 con la primera “T” de la secuencia TTCGGGTG, que corresponde a la posición 281674 de la estructura base 12 del H97 JGI V2.0 (Morin y col.2012) y se extiende en una orientación hacia adelante (en relación con la orientación de la estructura base) durante aproximadamente 570 nt en la mayoría de los alelos. En la actualidad, se han documentado 7 alelos que incorporan al menos 20 posiciones polimórficas de diversas cepas de la colección de cría de Sylvan.

[0294] Los alelos presentes en el árbol genealógico inmediato de la B14528, o en las cepas pardas cultivadas comercialmente, incluyen los alelos FF1, FF2 y FF3 caracterizados de la siguiente manera (utilizando el formato: carácter de base nucleotídica @ posición de alineación, en función de la alineación de los alelos 1 y 2):

[0295] Alelo FF1:“CCG”@ 48-50, “C” @ 91

[0296] Alelo FF2: “TTC” @ 48-50, “C” @ 91

[0297] Alelo FF3: “TTC” @ 48-50, “T” @ 91

[0298] La línea homocariótica B12998-s39 porta el alelo FF3. La línea homocariótica BW-s191 porta el alelo FF1. La cepa heterocariótica B14528 tiene un genotipo heteroalélico “FF1/FF3” en el locus del marcador FF, lo que indica la presencia de los alelos FF1 y FF3. Esto distingue la B14528 de las cepas OFB, que tienen un genotipo “FF1/FF2” y carecen del alelo FF3, y también de muchas otras cepas que son homoalélicas y/o que portan el alelo FF2 u otros alelos diferentes.

[0299] Los marcadores AN, AS y FF se diseñaron a partir de secuencias obtenidas de productos de PCR producidos mediante el uso de cebadores descritos por Robles y col., Patente de EE.UU. N.º 7.608.760, y/o a partir de secuencias genómicas contiguas o superpuestas, para mejorar el rendimiento, la confiabilidad y la consistencia de los resultados, en comparación con los marcadores como se describieron originalmente; son genotípica y genómicamente equivalentes. Si bien pueden utilizarse y se han utilizado varios cebadores diferentes para amplificar segmentos de ADN en los cuales está presente cualquiera del marcador AN, AS o FF y a partir de los cuales puede secuenciarse, digerirse, caracterizarse electroforéticamente o analizarse de otro modo, las secuencias de cebadores empleadas por los inventores para el desarrollo de los datos descritos son: para AN: Directo: 5’-gacgatgcgggactggtggat-3’ (Id. de sec.

[0300] 7); Inverso: 5'-ggtctggcctacrggagtgttgt-3' (Id. de sec. n.° 8), con 35 ciclos de PCR, temperatura de hibridación de 64 °C, tiempo de extensión de 2 min; para AS: Directo: 5'-ccgccagcacaaggaatcaaatg-3' (Id. de sec. n.° 9); Inverso: 5'-tcagtcggccctcaaaacagtcg-3' (Id. de sec. n.º 10), con 35 ciclos de PCR, temperatura de hibridación de 64 °C, tiempo de extensión de 2 min; y para FF: Directo: 5'-tcgggtggttgcaactgaaaag-3' (Id. de sec. n.º 11); Inverso: ttcctttccgccttaattgtttct (Id. de sec. n.° 12), con 35 ciclos de PCR, temperatura de hibridación de 64 °C, tiempo de extensión de 2 min.

[0301] La tabla VI siguiente proporciona una versión de una tabla de datos que compara los seis loci marcadores de la cepa B14528 con Heirloom, una cepa descendiente de Robles y col., patente US-7,608,760, de varios progenitores, incluida la BP-1 (también conocida como ARP-0023 o AA-0096), además de los datos parentales. La cepa B14528 y Heirloom difieren en 4 de los 6 loci marcadores especificados (todos excepto MFPC-1-ELF y FF distinguen las dos cepas).

[0302] Tabla VI

[0305]

[0307] nx se refiere a un nuevo alelo que aún no se ha definido por completo; desc. es un genotipo desconocido.

[0308] Se apreciará que el ADN de la presente descripción es el que incluye los mismos caracteres alélicos que están presentes en la cepa B14528 según se describe para los alelos en los loci marcadores ITS, p1n150-G3-2 MFPC-1-ELF, AN, AS y FF y en una columna etiquetada B14528 de la tabla V. Por lo tanto, independientemente del proceso de producción del ADN de la cepa B14528, es ADN identificable porque incluye los mismos caracteres alélicos que los presentes en la cepa B14528 que se reivindica.

[0309] [0166]Con respecto al ARN y las proteínas expuestos en la presente descripción, se entiende en la técnica que el dogma central de la biología molecular, plenamente probado experimentalmente, y como se explica en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud, en http://www.ncbi.nlm.nih.qov/Class/MLACourse/Modules/MolBioReview/centraldoqma.html, (febrero de 2014) enseña que el ARN se transcribe directamente del ADN nuclear y mitocondrial de modo que la información presente en la secuencia de ADN se incorpora en la secuencia de ARN correspondiente. De manera similar, la secuencia de aminoácidos de las proteínas se traduce directamente a partir de las secuencias de ARN de tal modo que la información presente en la secuencia de la proteína está determinada directamente por la secuencia de ARN y, en última instancia, por la secuencia de ADN. En conjunto, la transcripción y/o la traducción de una secuencia génica de ADN se denominan “expresión” o “expresión génica”. Los caracteres distintivos de una secuencia de ADN se reflejan en las secuencias únicas correspondientes de las secuencias de ARN y proteína expresadas.

[0311] En conjunto, el genotipo compuesto de la cepa B14528 es nuevo y distinto de todos los demás genotipos de cepas conocidos por Sylvan America, Inc.

[0313] Además, también se ha depositado la línea precursora B12998-s39 de B14528. Específicamente, se ha realizado un depósito de un cultivo de la línea homocariótica deAgaricus bisporusB12998-s39, según se describe en la presente memoria, en la Colección de Cultivos de los Servicios de Investigación Agrícola (NRRL) 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE. UU. La fecha de depósito fue el 7 de febrero de 2014. El cultivo depositado se tomó del mismo cultivo mantenido por Sylvan America, Inc., Kittanning, Pa., el cesionario registrado, desde antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Se han eliminado todas las restricciones sobre el depósito y el depósito tiene previsto cumplir con todos los requisitos de depósito de la Oficina de Patentes y Marcas de los EE.UU., incluyendo 37 C.F.R. Sec. 1.801-1.809, y todos los requisitos de depósito bajo el Tratado de Budapest. El n.º de Registro de NRRL es 50899. El depositado se mantendrá en el depósito durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, lo que sea mayor, y se reemplazará según sea necesario durante ese período. El cultivo se pondrá a disposición del público de manera irrevocable y sin restricciones ni condiciones al momento de la presentación de una solicitud de prioridad o al momento de la emisión de una patente, según las leyes de patentes aplicables.

[0315] Además, también se ha depositado la línea precursora BW-s191 de B14528. Específicamente, se ha realizado un depósito de un cultivo de la línea homocariótica deAgaricus bisporusBW-s191, según se describe en la presente memoria, en la Colección de Cultivos de los Servicios de Investigación Agrícola (NRRL) 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE. UU. La fecha de depósito fue el 7 de febrero de 2014. El cultivo depositado se tomó del mismo cultivo mantenido por Sylvan America, Inc., Kittanning, Pa., el cesionario registrado, desde antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Se han eliminado todas las restricciones sobre el depósito y el depósito tiene previsto cumplir con todos los requisitos de depósito de la Oficina de Patentes y Marcas de los EE.UU., incluyendo 37 C.F.R. Sec. 1.801-1.809, y todos los requisitos de depósito bajo el Tratado de Budapest. El n.º de Registro de NRRL es 50901. El depositado se mantendrá en el depósito durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, lo que sea mayor, y se reemplazará según sea necesario durante ese período. El cultivo se pondrá a disposición del público de manera irrevocable y sin restricciones ni condiciones al momento de la presentación de una solicitud de prioridad o al momento de la emisión de una patente, según las leyes de patentes aplicables.

[0317] Un uso del cultivo de la cepa B14528 es la producción de cultivos de champiñones comestibles para su venta. Otro uso es para mejorar la higiene de las instalaciones mediante la rotación de las cepas y un efecto de “interrupción del virus”. Un tercer uso es incorporar el material genético de la cepa B14528 en la descendencia y en los cultivos derivados o descendientes, incluidas las esporas y protoplastos latentes y en germinación. También existen usos adicionales como se ha indicado anteriormente.

[0319] La hibridación de los cultivos deAgaricus bisporusde la invención se puede lograr permitiendo que dos cultivos diferentes, uno de los cuales es una línea genética presente en una espora de B14528, crezcan juntos en estrecha proximidad, preferiblemente en medios estériles, hasta que se produzca la anastomosis (es decir, la fusión de hifas o células). En un cruce exitoso, el cultivo de fusión resultante es un cultivo híbrido exogámico de primera generación (F1) que incorpora una línea genética presente en una espora de champiñón que forma parte de una realización de la presente invención. Los protoplastos derivados de basidios u otras partes del organismo son otra parte del champiñón B14528 que puede utilizarse para transmitir material genético de la B14528 a nuevos cultivos.

[0321] Los métodos para obtener, manipular y cruzar los cultivos de la presente invención, para producir descendencia, inóculos, productos y cultivos de la presente invención, para utilizar un programa de rotación de cepas para mejorar la higiene de las granjas de champiñones y para obtener la huella genotípica de los cultivos de champiñones, se han descrito anteriormente en la presente memoria y también son bien conocidos por los profesionales de la técnica.

[0323] [0173]Para demostrar la práctica de la invención, se propagó un cultivo de la cepa B14528 como se ha descrito anteriormente para producir inóculos de sustrato con micelio y revestimiento, que se utilizaron para producir cosechas de champiñones marrones según las prácticas de cultivo comerciales estándar descritas anteriormente en la presente memoria (véase la sección Antecedentes de la invención). Los inóculos de cultivo comerciales, incluidos el “sustrato con micelio” de champiñones y el “inóculo de revestimiento”, se prepararon utilizando métodos comerciales de producción microbiológica a gran escala, especialmente, introduciendo de forma aséptica el inóculo de un cultivo puro de la cepa B14528 en entre uno y aproximadamente 2000 litros de medio de cultivo esterilizado en condiciones estériles, y se distribuyeron en envases estériles con fines de prueba. El sustrato con micelio del champiñón se mezcló con abono pasteurizado y se incubó durante 13 a 18 días. Se colocó una capa de revestimiento no nutritiva a base de turba sobre el abono como se ha descrito anteriormente y se incorporó un inóculo de revestimiento a la capa de revestimiento. En condiciones ambientales controladas, los primeros champiñones alcanzaron la etapa correcta de desarrollo entre 13 y 14 días después del revestimiento. Los champiñones se recogieron durante un período de 3 a 4 días. Se cosecharon tres descargas de champiñones antes de concluir cada prueba.

[0325] La cepa B12998 es una cepa heterocariótica obtenida en el programa de desarrollo de cepas de Sylvan America, Inc. No tenía la combinación de caracteres necesaria para tener éxito comercial; sin embargo, su rendimiento y sus características físicas se acercaron a esos criterios, y se consideró que la cepa tenía un potencial desconocido para un mayor desarrollo y mejora. En consecuencia, la B12998 se utilizó como progenitor en 329 cruces con al menos 10 poblaciones diversas deA. bisporus,incluidas varias poblaciones diferentes de tipo BW, que, según se creía, podrían haber tenido algún potencial útil en combinaciones de cruce. Los resultados individuales fueron impredecibles y variables; se esperaba que el experimento pudiera producir un resultado satisfactorio, pero se consideró que la probabilidad general de que fuera así era baja. De los 329 nuevos híbridos obtenidos, hasta ahora solo cuatro tenían un posible interés comercial y solo uno, el B14528, ha cumplido hasta ahora de manera uniforme los criterios diana para una cepa comercial exitosa. Posteriormente, durante las pruebas, se determinó que la cepa B14528 también tenía otros atributos beneficiosos, por ejemplo, la incompatibilidad con otras cepas de variedades marrones.

[0327] Las variedades esencialmente derivadas de la cepa B14528 se obtuvieron a partir de esporas individuales, mezclas de esporas múltiples y (potencialmente) de selecciones tisulares y somáticas, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Para una EDV obtenida por autofecundación a partir de la cepa inicial B14528 y para los loci descritos anteriormente en la presente memoria, todos los marcadores presentes pertenecen a un subconjunto completo o parcial de lo que está presente en la huella de B14528. Dicho de otro modo, para esos loci, no hay ningún marcador presente que no se encuentre también en la huella de B14528. Se obtuvieron esporas de la cepa B14528 y se germinaron y se utilizaron para producir crías heterocarióticas y homocarióticas como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Las líneas de descendencia homocarióticas se pueden utilizar para hacer cruces con otras líneas, y se pueden obtener más híbridos a partir de estos cruces. Los inóculos de sustrato con micelio y de revestimiento de B14528, 28Cc y la cepa OFB SB-295 se utilizaron en combinaciones de propia/propia y propia/no propia en cultivos de prueba para confirmar la incompatibilidad de las dos cepas, un requisito previo para su uso en estrategias de interrupción del virus, todo como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

1. Un cultivo híbrido de champiñón deAgaricus bisporus:

(a) denominado cepa B14528, habiéndose depositado la cepa con el número de registro de NRRL 50900.

2. Un cultivo de champiñónAgaricus bisporusque tiene al menos el 90 % de su genoma o genotipo presente en el genoma o genotipo del cultivo híbrido de champiñónAgaricus bisporusde la reivindicación 1.

3. Una parte del cultivo de champiñónAgaricus bisporusde una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, seleccionada del grupo que consiste en hifas, champiñón, esporas y células; y preferiblemente en donde las esporas se seleccionan entre esporas latentes y germinadas, y en donde las esporas latentes y germinadas incluyen heterocariontes y homocariontes incorporados a las mismas.

4. Un producto que comprende el cultivo de champiñónAgaricus bisporusde una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, seleccionado del grupo que consiste en micelio, sustrato con micelio, inóculo, inóculo de revestimiento, champiñones frescos, champiñones procesados, trozos de champiñones y sustratos colonizados incluyendo grano, abono y materia particulada friable.

5. Heterocariontes y homocariontes obtenidos del cultivo de champiñónAgaricus bisporusde cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o de las partes del cultivo de champiñónAgaricus bisporusde la reivindicación 3.

6. Esporas obtenidas del cultivo de champiñónAgaricus bisporusde cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

7. Champiñones obtenidos del cultivo de champiñónAgaricus bisporusde cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

8. Un método para producir un cultivo híbrido de champiñónAgaricus bisporusque comprende: cruzar una línea homocariótica B12998-s39, cuyo cultivo se ha depositado con el número de registro de NRRL 50899, con una línea homocariótica BW-S191, cuyo cultivo se ha depositado con el número de registro de NRRL 50901, de modo que se produce un cultivo híbrido de champiñón deAgaricus bisporusdenominado cepa B14528, un cultivo representativo de la cepa que se ha depositado con el número de registro de NRRL 50900.

9. El método según la reivindicación 8, en donde dicho cultivo híbrido de champiñón muestra antagonismo hacia las cepas heterocarióticas de los grupos de linaje derivados de OFB y Heirloom.

10. El método según la reivindicación 8, que comprende además: proporcionar el cultivo de champiñones en productos de champiñón seleccionados del grupo que consiste en micelio, sustrato con micelio, inóculo, inóculo de revestimiento, champiñones frescos, champiñones procesados, partes de champiñones, extractos y fracciones de champiñones, trozos de champiñones y sustratos colonizados incluyendo grano, abono y materia particulada friable; o que comprende además: proporcionar el cultivo de champiñones en cultivos derivados seleccionados del grupo que consiste en homocariontes, heterocariontes, aneuploides, subcultivos somáticos, cultivos de explantes tisulares, protoplastos, esporas latentes, esporas en germinación, descendientes endogámicos y descendientes exogámicos, cultivos transgénicos y cultivos que tienen un genoma que incorpora una conversión de un solo locus, descendientes y descendientes exogámicos, cultivos transgénicos y cultivos que tienen un genoma que incorpora una conversión de un solo locus.

11. El método de la reivindicación 8, que comprende además cultivar el cultivo híbrido de champiñones para producir champiñones y partes de champiñones híbridos.

12. Descendencia que incluye heterocariontes y homocariontes obtenidos mediante el método de la reivindicación 8.

13. Usos del cultivo de champiñónAgaricus bisporusde cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, los heterocariontes u homocariontes de la reivindicación 5, las esporas de la reivindicación 6, los champiñones de la reivindicación 7, la descendencia de la reivindicación 12 o el cultivo de champiñón híbridoAgaricus bisporusproducida mediante el método de la reivindicación 8.