ES3059447T3 - Focusing method for holographic imaging system - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método de enfoque para adquirir una imagen de una superficie de interés (6) de una muestra (1) mediante un generador de imágenes holográficas (2), que comprende los siguientes pasos: - posicionar la muestra (1) que comprende al menos un objeto de referencia con una forma conocida y descrita por parámetros característicos que comprenden al menos parámetros de posición; - adquirir una imagen y determinar la posición del objeto de referencia con respecto al plano de adquisición (2') mediante la aplicación de un modelo de difracción de luz que involucra los parámetros espaciales del objeto de referencia estimados aproximando la apariencia del objeto de referencia en la imagen holográfica adquirida; - determinar la posición de la superficie de interés con respecto al plano de adquisición a partir de una posición del objeto de referencia y enfocar la adquisición de la imagen. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Procedimiento de enfoque para un sistema de formación de imágenes holográficas

[0003] Campo técnico

[0004] La presente invención se refiere al campo del formación de imágenes, y más específicamente trata de la localización de una superficie de interés en una muestra mediante procedimientos holográficos, con vistas a su enfoque para la adquisición de una imagen de esta superficie de interés.

[0005] Técnica anterior

[0006] Se han desarrollado varios procedimientos de enfoque para la formación de imágenes. Se trata de procedimientos que tienen como objetivo medir con precisión la posición de una superficie de interés, típicamente un plano, de manera que sea capaz de ajustar/elegir el plano focal del objeto de un sistema de formación de imágenes, y así ser capaz de adquirir imágenes de calidad de esta superficie de interés.

[0007] Por ejemplo, el documento EP 3339835 propone un procedimiento que consiste en dirigir un frente de onda de radiación coherente a través de una muestra de objetos en una suspensión, capturar un diagrama de interferencia entre el frente de onda de la radiación coherente y un frente de onda de la radiación difractada por el objeto con un sensor de imagen, determinar digitalmente el plano focal del por lo menos un objeto, y reconstruir digitalmente una imagen no focalizada de por lo menos un objeto a partir del diagrama de interferencia en un plano de imagen que es sustancialmente paralelo al sensor de imagen y en un plano con un desplazamiento predeterminado con respecto al plano focal. El procedimiento comprende además identificar por lo menos una parte de la imagen desenfocada correspondiente a por lo menos un objeto de la muestra, y calcular a partir de cada una de dichas partes por lo menos una característica del objeto correspondiente.

[0008] El procedimiento propuesto por el documento EP 3339835 es sencillo de implementar pero la etapa de determinar el plano focal de por lo menos un objeto se lleva a cabo mediante un algoritmo de autofocus convencional que tiene varios inconvenientes, como, por ejemplo, la falta de precisión, varias de las cuales se explican a continuación. La posición del plano focal del objeto de un sistema de formación de imágenes holográficas, que corresponde a una superficie en la que se deben posicionar los objetos a convertir en imágenes para maximizar la calidad de las imágenes generadas (nitidez, contraste, etc.), se puede estimar de manera aproximada conociendo las características ópticas (por ejemplo, la distancia focal) del sistema de formación de imágenes holográficas, y su posicionamiento. Sin embargo, se plantean varias dificultades. Por ejemplo, en el contexto de la microscopía holográfica, los objetos que se van a convertir en imágenes en una superficie de interés tienen típicamente un tamaño del orden de un micrómetro, de modo que un error de posicionamiento de unos pocos micrómetros del plano focal del objeto tiene consecuencias importantes en la calidad de las imágenes obtenidas. Así, incluso en el caso más simple, en el que la superficie de interés que se va a convertir en imágenes corresponde al soporte físico de una muestra plana (caso de un portaobjetos de microscopio), el enfoque es importante y puede resultar compleja y tediosa. Además, en el caso en el que una muestra sea un objeto complejo o tridimensional, la superficie de interés que se desea convertir en imágenes puede no estar en una posición conocida como la superficie de un soporte de la muestra, sino por ejemplo a una cierta distancia de esta superficie. Tal muestra también puede presentar varias superficies de interés para ser convertidas en imágenes, en diferentes posiciones con respecto al sistema de formación de imágenes. Además, al igual que la superficie de interés, la superficie focal del objeto (generalmente denominada, por abuso del lenguaje, “plano focal”) puede no ser una superficie plana en presencia de aberraciones ópticas.

[0009] En la práctica, a menudo es necesario adquirir y analizar una serie de imágenes adquiridas en diferentes posiciones en el eje óptico, es decir, en diferentes coordenadas z en el eje óptico, que describen las posiciones relativas de la muestra con respecto al sensor de imagen. Se extraen descriptores de cada una de estas imágenes, y factores de mérito derivan de ellos con el fin de identificar una imagen de calidad cuyas coordenadas z se estiman que son las del plano focal. Estos procedimientos se basan en el supuesto de que en el plano focal, el contraste de la imagen es máximo, y los factores de mérito se relacionan con la maximización de los contrastes locales, gradientes, varianza, entropía, densidad espectral de potencia, etc.

[0010] Si tales suposiciones son relevantes en algunos casos, particularmente cuando están presentes objetos opacos en el plano focal, estos procedimientos no son, sin embargo, adecuados para todas las situaciones. Por ejemplo, la microscopía de campo claro(“brightfield”)de objetos que no absorben la luz muestra contrastes muy bajos, incluso en el plano focal, y la mayoría de los factores de calidad pueden no maximizarse en tal situación.

[0011] Otros procedimientos sólo se pueden utilizar bajo condiciones materiales específicas. Por ejemplo, algunos criterios de enfoque sólo son utilizables para objetos que se presentan como puros desfasadores o puros absorbentes de amplitud. Es por ejemplo el caso en Liebling, M. & Unser, M. “Autofocus for digital Fresnel holograms by use of a Fresnelet-sparsity criterion”JOSA A 21, 2424-2430 (2004), Dubois, F., Schockaert, C., Callens, N. & Yourassowsky, C.“Focus plane detection criteria in digital holography microscopy by amplitudeanalysis

” Opt. Express 14, 5895-5908 (2006), y Trujillo, C. A. & Garcia-Sucerquia, J.‘‘Automatic method for focusing biological specimens in digital lensless holographie microscopy’’Opt. Lett.39, 2569-2572 (2014).

[0012] Otros criterios requieren el uso de múltiples longitudes de onda para la luz de iluminación, lo que puede ser experimentalmente difícil y aún depende de ciertas suposiciones en cuanto a la dependencia de la absorción y el desfase del objeto convertido en imagen en función de la longitud de onda.

[0013] Sería posible añadir a la muestra partículas cuyas características ópticas son conocidas, con el fin de utilizarlas para el enfoque a través de los factores de mérito. Por ejemplo, las partículas de oro, que presentan un contraste de amplitud en el plano focal muy fuerte, y un contraste de fase mínimo, pueden ser usadas para ello. Por ejemplo, Bon, P. et al. “Three- dimensional nanometre localization of nanoparticles to enhance super-resolution microscopy.”Nat. Commun.6, 7764 (2015), propone tal procedimiento. Sin embargo, este enfoque requiere mediciones precisas de fase y amplitud, por lo que se requieren equipos ópticos específicos.

[0014] Presentación de la invención

[0015] La invención tiene como objetivo permitir el enfoque, para la adquisición de imágenes por un sensor de imagen, de una superficie de interés en una muestra, sin recurrir a equipos sofisticados, incluso en condiciones desventajosas tales como el formación de imágenes en campo claro de objetos de bajo contraste.

[0016] Para ello, la invención propone un procedimiento de enfoque para la adquisición de una imagen de una superficie de interés de una muestra mediante un sensor de imagen de un sistema de formación de imágenes tal como según la reivindicación independiente 1. Otros aspectos de la invención se presentan en las reivindicaciones subordinadas.

[0017] El procedimiento permite realizar un enfoque que consiste en hacer coincidir la posición de la superficie de interés con el plano de adquisición del sensor de imagen, mediante el análisis de una imagen bidimensional simple. A diferencia de los procedimientos utilizados anteriormente, el procedimiento según la invención no requiere reconstrucción de fase en el plano de adquisición, no requiere iluminación según múltiples longitudes de onda ni requiere un análisis por barrido mecánico de múltiples posiciones z en el eje óptico de la muestra.

[0018] La invención también se refiere a un sistema de formación de imágenes holográficas tal como se define en la reivindicación independiente 15.

[0019] Presentación de las figuras

[0020] Otras características, objetivos y ventajas de la invención se desprenderán de la siguiente descripción, que tiene carácter meramente ilustrativo y no limitativo, y que debe leerse en conjunto con los dibujos adjuntos, en los que: - la figura 1 es una vista esquemática simplificada de un sistema de formación de imágenes holográficas según un posible modo de realización de la invención;

[0021] - la figura 2 es una vista en sección esquemática de una muestra que presenta una superficie de interés y objetos de referencia, según un posible modo de realización de la invención;

[0022] - la figura 3 es un ejemplo de una imagen holográfica de una muestra que comprende varias bolas de poliestireno como objetos de referencia;

[0023] - la figura 4 es un modelo tridimensional que muestra las posiciones de los objetos de referencia de la imagen de la figura 3, determinadas por el procedimiento según un posible modo de realización de la invención; - la figura 5 muestra el resultado de un enfoque digital de la imagen de la figura 3 a partir de las posiciones de los objetos de referencia, determinadas por el procedimiento según un posible modo de realización de la invención.

[0024] Descripción detallada

[0025] La figura 1 representa esquemáticamente un sistema de formación de imágenes, que aquí es un sistema de formación de imágenes holográficas en línea para obtener imágenes de una muestra 1 mediante un sensor de imágenes 2 digitales, colocado en un plano de imagen del sistema de formación de imágenes holográficas. El sistema de formación de imágenes se describe como un sistema de formación de imágenes holográficas porque es capaz de adquirir imágenes holográficas, pero este mismo sistema de formación de imágenes también podría adquirir imágenes no holográficas. Un eje óptico 5 une la muestra 1 y el sensor de imágenes 2. Este eje óptico 5 se muestra aquí como recto, pero podría ser más complejo, en función de las configuraciones. Una fuente de luz 4 está configurada para iluminar la muestra 1 en el campo de visión (o “field-of-view”) del sistema de formación de imágenes holográficas mediante un haz de iluminación de luz de iluminación suficientemente coherente para la adquisición de un holograma, es decir coherente o parcialmente coherente. La luz de iluminación tiene las características convencionales para la formación de imágenes holográficas, sin restricciones especiales adicionales. La luz de iluminación puede ser así monocromática (por ejemplo con una longitud de onda de alrededor de 500 nm) o posiblemente estar compuesta de varias longitudes de onda, utilizadas por ejemplo una detrás de otra. El sistema de formación de imágenes puede comprender un conjunto de elementos ópticos 8 en la trayectoria de la luz entre la muestra 1 y el sensor de imágenes 2. En el ejemplo ilustrado, el sistema de formación de imágenes holográficas está equipado con un objetivo de microscopio 8a y una lente de tubo 8b, dispuestos entre la muestra 1 y el sensor de imágenes digital 2. Sin embargo, un elemento óptico tal como el objetivo del microscopio 8a es opcional, no limitándose la invención a la microscopía holográfica con lente o a un conjunto particular de elementos ópticos. La disposición aquí descrita es, por supuesto, un ejemplo no limitativo. Se puede utilizar cualquier sistema de formación de imágenes holográficas, en línea o no, con o sin objetivo de microscopio, etc. En efecto, el procedimiento se basa en la explotación de una imagen holográfica adquirida por un sistema de formación de imágenes. Así, tan pronto como un sistema de formación de imágenes pueda adquirir una imagen holográfica en la que aparezcan los patrones de interferencia provocados por los objetos de referencia, este sistema de formación de imágenes será adecuado para implementar el procedimiento. El sistema de formación de imágenes también comprende un sistema automatizado de procesamiento de datos, no mostrado, que comprende por lo menos un procesador y una memoria, y que está configurado para recibir por lo menos una imagen holográfica del sensor de imágenes 2 y procesar esta imagen holográfica con el fin de determinar una posición de la superficie de interés 6 con respecto al sistema de formación de imágenes holográficas (y en particular con respecto a su plano de adquisición 2’).

[0027] La muestra 1 comprende la superficie de interés 6 que se desea convertir en imágenes. La superficie de interés 6 puede ser plana en el caso más simple, o puede ser curva. La superficie de interés 6 puede extenderse en un plano perpendicular al eje óptico 5, o puede presentar una inclinación (a menudo denominada con el término inglés “tilt”) con respecto a un plano perpendicular al eje óptico 5. Se designa por posición de la superficie de interés 6 la disposición espacial de la superficie de interés 6, incluida su ubicación y su posible inclinación, en el sistema de formación de imágenes. La superficie de interés 6 puede ser parte de la muestra 1, en particular cuando la muestra 1 es un objeto tridimensional con un cierto volumen que contiene varias superficies o capas en varias posiciones sobre el eje óptico 5. De manera más general, la superficie de interés 6 corresponde a la ubicación de la parte de la muestra 1 que se busca convertir en imágenes. Generalmente, la muestra 1 descansa sobre un soporte 12, tal como un portaobjetos de microscopio, y la superficie de interés 6 puede corresponder ventajosamente a la interfaz 12a entre el soporte 12 y la muestra 1, o incluso a una superficie paralela a esta interfaz 12a como en el ejemplo ilustrado, o por lo menos cuya posición puede deducirse de la posición de la interfaz 12a entre el soporte 12 y la muestra 1. Cabe señalar que la elección de la superficie de interés 6 puede beneficiarse de una forma de conocimiento previo sobre la muestra 1 y lo que se desea observar, como por ejemplo el tamaño de los microorganismos 15 presentes en la muestra 1 y susceptibles de descansar sobre el soporte 12.

[0029] La muestra 1 comprende por lo menos un objeto de referencia 10 que está ubicado en una posición correspondiente a la posición de la superficie de interés 6. Un objeto de referencia 10 tiene una forma conocida. Esta forma es conocida ya que puede describirse mediante parámetros geométricos. Alternativamente, la forma puede ser conocida sólo en términos del tamaño del objeto de referencia 10, por lo menos con respecto a la longitud de onda de la luz de iluminación, por ejemplo cuando el objeto de referencia 10 está en un caso límite de dispersión de Rayleigh, es decir con una dimensión de 5 a 10 veces más pequeña que esa longitud de onda. En este caso, no hay parámetros geométricos. Preferentemente, la muestra 1 comprende varios objetos de referencia 10, por lo menos 3 objetos de referencia 10, y preferentemente por lo menos 5 objetos de referencia 10. Aunque es posible que la muestra 1 contenga una multitud de objetos de referencia 10, normalmente no es necesario que aparezcan más de una o dos docenas de objetos de referencia 10 en una imagen adquirida.

[0031] Los parámetros de caracterización asociados a los objetos de referencia 10 comprenden por lo menos parámetros de posición que ubican individualmente cada uno de los objetos de referencia 10, típicamente unas coordenadas de posición. Por posición de un objeto de referencia 10 se entiende la disposición espacial de dicho objeto de referencia 10, comprendiendo su ubicación y posible inclinación, en el sistema de formación de imágenes. Preferentemente, los parámetros de caracterización asociados con los objetos de referencia 10 también comprenden parámetros geométricos que describen la forma conocida de los objetos de referencia 10. Los parámetros geométricos corresponden a un conocimiento a priori de la forma geométrica de los objetos de referencia 10. A este respecto, los objetos de referencia 10 tienen una forma geométrica simple, y preferentemente, un objeto de referencia 10 tiene una forma esférica, cilíndrica o elipsoidal. En el caso de un objeto de referencia 10 que tenga una forma esférica, los parámetros geométricos pueden estar constituidos simplemente por el radio de una esfera que modele el objeto de referencia 10, correspondiendo entonces las coordenadas de posición a la posición del centro de esta esfera. De manera más general, los parámetros geométricos son los que tiene en cuenta el modelo de difracción de luz que se utilizará (por ejemplo el modelo de Mie, el modelo de Mie generalizado, el modelo de Thompson o el modelo de Rayleigh). Así, para un objeto de referencia 10 globalmente esférico, el modelo de difracción de luz de Mie (o solución de Lorenz-Mie) requiere únicamente el radio de la esfera como parámetro geométrico. En el caso de un objeto de referencia 10 con una forma globalmente cilíndrica, un radio y una longitud constituyen los únicos parámetros geométricos necesarios para describir la forma. Por lo tanto, no es necesario conocer todos los parámetros geométricos de los objetos de referencia 10, sino únicamente aquellos que corresponden a una aproximación de la forma de los objetos de referencia 10 y que son utilizados por el modelo de difracción de la luz.

[0033] El tamaño del objeto de referencia 10 no es importante y puede tener, por ejemplo, un diámetro (dimensión más grande) de entre 10 nm y 100 µm. La elección del tamaño del objeto de referencia 10 está más bien condicionada por aspectos secundarios. Por una parte, el tamaño del objeto de referencia 10 debe permitir generar un contraste suficiente, teniendo en cuenta la longitud de onda de la luz de iluminación, la diferencia de índice con el medio alrededor del objeto de referencia 10, e incluso el contraste generado por otros objetos en la imagen holográfica. El diámetro del objeto de referencia 10 es así preferentemente mayor que 10 nm, y más preferentemente incluso mayor que 100 nm. Por otra parte, la superficie proyectada de los objetos de referencia 10 sobre el sensor de imágenes 2 no debe ser demasiado grande de manera que no se altere la calidad de la imagen holográfica. Típicamente, una superficie proyectada de menos de 10 % (y más preferentemente incluso de menos de 1 %) permitirá una buena calidad de imagen holográfica, siempre que el resto de la muestra 1 no sea demasiado denso. Además, los objetos de referencia 10 no deben ocultar el resto de la muestra 1, y en particular la superficie de interés 6. El tamaño de los objetos de referencia 10 se elige por lo tanto de manera que no ocupe demasiado espacio en el campo de visión del sensor de imágenes 2. A este respecto, los objetos de referencia 10 están preferentemente alejados los unos de los otros, y no adyacentes, y están distribuidos preferentemente sobre todo el campo de visión del sensor de imágenes 2, de manera dispersa.

[0035] Un objeto de referencia 10 tiene, como cualquier material, un índice de refracción. En la medida en que el objeto de referencia 10 es distinto del resto de la muestra 1, su índice de refracción difiere del medio que lo rodea, aunque sea muy ligeramente. Así, un índice de refracción de un objeto de referencia 10 que difiere de 0,01 el índice de refracción del medio que rodea al objeto de referencia 10 permite identificar su impacto en la difracción de la luz en una imagen adquirida, y por lo tanto permite implementar el procedimiento. Preferentemente, sin embargo, el índice de refracción del objeto de referencia 10 difiere en por lo menos 0,05 con respecto al índice de refracción de la parte de la muestra 1 inmediatamente adyacente al objeto de referencia 10, y preferentemente en por lo menos 0,1. Se conoce preferentemente el índice de refracción del objeto de referencia 10 y se introduce en el modelo de difracción de luz. En particular, en el caso en el que el objeto de referencia 10 sea opaco, es decir, que el componente complejo de su índice de refracción pueda considerarse que tiende al infinito en la longitud de onda considerada, el modelo de difracción de luz puede modificarse en consecuencia para limitar el número de parámetros a ajustar para reducir el tiempo de cálculo y evitar un posible sobreajuste. En el caso de un objeto de referencia 10 transparente o parcialmente transparente, el índice de refracción del objeto de referencia 10 también puede ser desconocido, o conocido de manera imprecisa, y puede estimarse de la misma manera que los parámetros geométricos o de posición asociados con el objeto de referencia 10, mediante el uso del modelo de difracción, y así ser parte de los parámetros de caracterización asociados con el objeto de referencia 10.

[0037] La muestra 1 puede comprender un medio de inmersión 14, y el modelo de difracción de luz puede involucrar un índice de refracción de dicho medio de inmersión 14, que se estima ajustando el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia en la imagen holográfica, de la misma manera que los parámetros de caracterización asociados con el objeto, mediante el uso del modelo de difracción.

[0038] Aparte del hecho de que el objeto de referencia 10 debe tener una forma conocida descrita por parámetros de caracterización asociados a él, o bien un tamaño muy pequeño con respecto a la longitud de onda de la luz de iluminación, pocas restricciones pesan sobre la elección de un objeto de referencia 10. Un objeto de referencia 10 puede ser opaco o transparente, y puede estar hecho de diversos materiales, como por ejemplo sílice, poliestireno o un metal tal como el oro. A la luz de las consideraciones anteriores, un objeto de referencia 10 puede ser un objeto artificial añadido a la muestra 1. La ventaja de añadir un objeto de referencia artificial radica principalmente en el conocimiento detallado de sus parámetros geométricos y su índice de refracción, así como en la regularidad de su forma. En el caso de objetos de referencia artificiales 10 añadidos a la muestra 1, estos se eligen para que tengan una forma simple y regular, preferentemente cilíndrica o elipsoidal, y más preferentemente una forma esférica, con el fin de permitir la mejor correspondencia entre la forma real del objeto de referencia 10 y su aproximación descrita por los parámetros de caracterización tomados en cuenta por el modelo de difracción. Por ejemplo, en el caso ilustrado en la figura 2, los objetos de referencia 10 son bolas de poliestireno, opacas, con un diámetro de 1 µm.

[0040] El objeto de referencia 10 también puede estar presente en el soporte 12 de la muestra 1, formando parte del soporte 12 a nivel de su interfaz con la muestra 1. Por ejemplo, es posible grabar, por ejemplo mediante fotolitografía, la superficie 12a del soporte 12 para hacer aparecer formas, preferentemente redondeadas, que puedan responder a las exigencias de un objeto de referencia (nervaduras redondeadas por ejemplo).

[0042] Un objeto de referencia 10 también puede ser un microorganismo presente en la muestra 1. Por ejemplo, la bacteriaStaphylococcus epidermidistiene una forma casi esférica, con un tamaño conocido dentro de un cierto intervalo (que, por lo tanto, se puede estimar mediante ajuste), así como un índice de refracción también conocido dentro de un cierto intervalo (que, por lo tanto, se puede estimar mediante ajuste). Se trata además de una bacteria comensal de los humanos, típica de la flora cutánea, y por lo tanto es susceptible que esté presente habitualmente en una muestra que se va a convertir en imágenes (naturalmente o por contaminación). Se pueden utilizar otros tipos de microorganismos, siempre que tengan una forma que pueda describirse mediante parámetros geométricos susceptibles de ser tomados en cuenta por el modelo de difracción de luz, y que su tamaño e índice de refracción puedan estimarse. De esta manera, se puede aprovechar ventajosamente los constituyentes naturales de la muestra 1. Cabe señalar que es posible utilizar al mismo tiempo objetos artificiales inertes añadidos a la muestra 1 y microorganismos presentes en la muestra 1.

[0044] Como se ha mencionado anteriormente, el objeto de referencia 10 se ubica en una posición correspondiente a la posición de la superficie de interés 6, es decir, que existe una relación de correspondencia entre la posición de la superficie de interés 6 y la posición de cada objeto de referencia 10. Si bien algunas configuraciones no plantean ningún problema, como por ejemplo en el caso en el que el objeto de referencia 10 está presente de forma natural en la muestra 1 a nivel de la superficie de interés 6 (por ejemplo, en el caso de microorganismos), o cuando la superficie de interés 6 coincide con una superficie del soporte 12 sobre la que se forman los objetos de referencia 10, otras configuraciones pueden requerir a veces tomar precauciones para asegurar la correspondencia entre la posición de un objeto de referencia 10 y la superficie de interés 6. Cuando la superficie de interés 6 coincide con la superficie 12a del soporte 12, o está unida a esta superficie 12a del soporte 12 por ejemplo por una relación de paralelismo, es posible colocar los objetos de referencia 10 directamente sobre la superficie 12a del soporte 12 antes de colocar el resto de la muestra 1 sobre el soporte 12. Así, un medio de inmersión 14 fluido (por ejemplo agua) que contiene los objetos de referencia 10 en suspensión puede depositarse previamente sobre la superficie 12a del soporte 12 antes de colocar el resto de la muestra 1.

[0046] Una vez colocada la muestra 1, la muestra 1 se ilumina por la luz de iluminación, y el sensor de imágenes 2 adquiere por lo menos una imagen holográfica bidimensional. Puede tratarse de una imagen adquirida de manera aislada, o de una serie de imágenes, y en particular de una serie de imágenes holográficas adquiridas para diferentes posiciones del plano de adquisición 2’ con respecto a la muestra 1 a lo largo del eje óptico 5 y/o con diferentes longitudes de onda para la luz de iluminación.

[0048] Estas diferentes posiciones del plano de adquisición 2’ con respecto a la muestra 1 se pueden obtener mediante diferentes posiciones de la muestra 1 a lo largo del eje óptico 5 con respecto al sensor de imágenes 2, por ejemplo moviendo la muestra 1 y su soporte 12 sobre el eje óptico entre cada adquisición de imagen mediante una platina motorizada. También es posible mover el sensor de imágenes 2, por ejemplo mediante un raíl motorizado o una platina motorizada. También es posible obtener estas diferentes posiciones del plano de adquisición 2’ mediante la modificación de un elemento óptico del sistema de formación de imágenes holográficas moviendo el plano de adquisición 2’, modificando un foco de rayos de luz incidentes en el sensor de imágenes 2 de manera que se mueva el plano de adquisición 2’ del sensor de imágenes 2.

[0050] Así como se puede utilizar cualquier tipo de sistema de formación de imágenes holográficas como se mencionó anteriormente, se pueden utilizar varias técnicas de adquisición de imágenes holográficas, siempre que la imagen adquirida muestre los efectos ópticos de la presencia de los objetos de referencia 10 en el campo de visión del sensor de imágenes digital 2, y en particular las figuras de interferencia generadas por las interferencias entre la luz de iluminación y la luz dispersada por los objetos de referencia 10, que aparecen en la imagen holográfica como patrones de interferencia causados por el objeto de referencia. No hace falta decir, sin embargo, que la imagen se adquiere con el sistema de formación de imágenes holográficas en una configuración adaptada para obtener imágenes de los objetos de referencia 10 (o más bien de los patrones de interferencia causados por ellos), y por lo tanto con los ajustes apropiados (iluminación, etc.) comunes para un experto en la técnica.

[0052] La figura 3 muestra un ejemplo de una imagen holográfica de intensidad bidimensional adquirida por un sensor de imágenes 2 de un sistema de formación de imágenes holográficas. Los objetos de referencia 10 son aquí bolas de poliestireno opacas con un diámetro de aproximadamente 1 µm colocadas sobre la superficie de un soporte 12. Esta muestra se convierte en imagen mediante una luz de iluminación a una longitud de onda de aproximadamente 510 nm.

[0054] Una vez adquirida la imagen holográfica, se determina la posición del objeto de referencia 10 o de varios objetos de referencia 10 con respecto al plano de adquisición 2’. Para ello, se utiliza un modelo de difracción de la luz por el objeto de referencia 10. El modelo de difracción se utiliza para detectar un objeto de referencia 10 en la imagen holográfica adquirida y determinar su posición con respecto al plano de adquisición 2’. El modelo de difracción permite, a partir de las características del objeto de referencia 10, predecir las interferencias generadas por la presencia del objeto de referencia 10 en el campo de visión, y por lo tanto el aspecto del objeto de referencia 10 en la imagen holográfica adquirida, en función de su posición con respecto al plano de adquisición 2’. Más específicamente, el modelo de difracción de luz tiene en cuenta los parámetros geométricos del objeto de referencia 10 y las coordenadas de posición del objeto de referencia 10, así como eventualmente el índice de refracción del objeto de referencia 10. Se pueden tener en cuenta otros parámetros, y en particular el índice del medio de inmersión 14, o características del sistema de formación de imágenes holográficas tales como la longitud de onda de la luz de iluminación, el aumento, la apertura digital, etc. Sin embargo, estos otros parámetros son elementos de diseño del instrumento, conocidos y fijados por el usuario. Por lo tanto, corresponden únicamente a ajustes que, además, no varían para los distintos objetos de referencia 10 de una misma imagen. Así, los parámetros importantes son los parámetros geométricos del objeto de referencia 10 y las coordenadas de posición del objeto de referencia 10, y en menor medida sus características ópticas (en particular su índice de refracción).

[0055] Los parámetros de caracterización asociados al objeto de referencia son las variables ajustadas para hacer corresponder mejor las figuras de interferencia descritas por el modelo con los patrones de interferencia que aparecen en la imagen holográfica adquirida. Los parámetros asociados con el objeto de referencia 10, o por lo menos las coordenadas de posición del objeto de referencia, se estiman ajustando el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia en la imagen holográfica adquirida. La adecuación entre las figuras de interferencia descritas por el modelo de difracción y los patrones de interferencia que aparecen en la imagen holográfica adquirida permite determinar que los parámetros de caracterización (parámetros de posición, parámetros geométricos y parámetros ópticos) utilizados en el modelo de difracción son los del objeto de referencia 10. Esta estimación se puede lograr mediante la minimización de un criterio. Puede tratarse de un enfoque de problema inverso basado en la máxima verosimilitud, y/o que comprende a priori (por ejemplo, una recuperación cuadrática de los valores esperados de los parámetros geométricos y ópticos) y/o restricciones (por ejemplo, en el intervalo de valores aceptados de los parámetros geométricos u ópticos). A modo de ejemplo, bajo una hipótesis de ruido aleatorio gaussiano sobre la intensidad captada por cada uno de los píxeles del sensor de imágenes digital 2, puede tratarse de un procedimiento de mínimos cuadrados, eventualmente ponderado, entre los datos D (es decir la imagen adquirida) y un modelo M de difracción de la luz por la interacción de la onda incidente y del objeto de referencia, en función de un vector de parámetros espaciales V que describe este objeto de referencia, y que predice el campo electromagnético y en última instancia la intensidad en el plano de la imagen en el que se ubica el sensor de imágenes 2. Con, como objeto de referencia 10, una esfera de radio r cuyo centro se ubica en las coordenadas (x, y, z), el vector de parámetros a estimar toma la forma V=(x, y, z, r)<1>, y la estimación E de los parámetros se determina por minimización de la norma L2 de la diferencia entre los datos D y el modelo M aplicado al vector de parámetros a estimar V:

[0058]

[0061] en donde W es una matriz de ponderación opcional que puede tener en cuenta los píxeles muertos o que faltan, o permitir la consideración de la matriz de covarianza de ruido. En este ejemplo, se supone que el objeto de referencia 10 es esférico y el modelo puede típicamente ser el modelo de Mie. Se pueden considerar otras formas de un objeto de referencia 10, con otros parámetros geométricos que describen estas formas. El modelo de difracción de luz se elige en particular en función de la forma conocida del objeto de referencia 10, y el modelo puede ser, por ejemplo, el modelo de Mie, el modelo de Mie generalizado, el modelo de Thompson, o el modelo de Rayleigh, o el modelo de propagación de Rayleigh-Sommerfeld. El modelo de Mie es particularmente adecuado para los objetos de referencia 10 esféricos de un tamaño comparable a la longitud de onda de la luz de iluminación, el modelo de Mie generalizado se aplica preferentemente a objetos de formas cilíndricas o elipsoidales; el modelo de Thompson que se aplica a objetos esféricos opacos, y el modelo de Rayleigh que se aplica preferentemente a objetos de referencia 10 de un tamaño menor que 5 a 10 veces la longitud de onda de la luz de iluminación, y de forma cualquiera.

[0063] Además, cuando el índice de refracción se encuentra entre los parámetros de caracterización que se deben estimar mediante el ajuste en el modelo de difracción, se puede añadir al vector de los parámetros a estimar, de la misma manera que los parámetros geométricos y de posición. En el ejemplo anterior, el vector de parámetros a estimar tomaría la forma V=(x, y, z, r, n)<t>, siendo n el índice de refracción del objeto de referencia 10. También es posible estimar otros parámetros involucrados en la difracción o propagación de la luz que estarían sujetos a incertidumbre. Preferentemente, sin embargo, el número de parámetros a estimar se reduce lo más posible con el fin de no alterar la precisión del procedimiento.

[0065] Preferentemente, varios objetos de referencia 10 están presentes en el campo de visión del sensor de imágenes 2 y aparecen en la imagen holográfica adquirida. La determinación de la posición de cada objeto de referencia 10, mediante la determinación de sus respectivos parámetros de posición con respecto al plano de adquisición 2’, se lleva a cabo preferentemente de manera iterativa, objeto de referencia 10 tras objeto de referencia 10, preferentemente restando cada vez de los datos de la imagen holográfica adquirida el aspecto de un objeto de referencia 10 cuyos parámetros de caracterización asociados a dicho objeto de referencia 10 se han determinado previamente. Es notablemente posible aplicar un algoritmo de tipo voraz.

[0067] Tan pronto como aparecen más de tres objetos de referencia no alineados en la imagen holográfica adquirida, es posible determinar no sólo la posición relativa de los objetos de referencia en el eje óptico 5 (coordenadas en z) con respecto al plano de adquisición 2’, sino también la orientación de la superficie denominada de referencia en la que se organizan estos objetos de referencia 10. Así, la determinación de la posición de la superficie de interés 6 puede comprender, después de la determinación de las posiciones de los objetos de referencia 10, la determinación de una superficie de referencia en la que se organizan estos objetos de referencia 10, por ejemplo mediante una interpolación de las coordenadas de posición de los objetos de referencia 10 con respecto al plano de adquisición 2’ para determinar las coordenadas paramétricas de esta superficie de referencia en la que se organizan los objetos de referencia 10. La posición de la superficie de interés 6 se puede determinar entonces con respecto a esta superficie de referencia gracias a la correspondencia que relaciona la superficie de referencia y la superficie de interés 6.

[0069] La figura 4 es una representación tridimensional que muestra las posiciones de siete objetos de referencia 10 de la imagen de la figura 3, con respecto al plano de adquisición 2’, determinándose estas posiciones ajustando un modelo de Mie de difracción de luz, que involucra los parámetros de posición, geométricos y ópticos de las bolas, en este caso las coordenadas de posición (x, y, z), el radio de las bolas y su índice de refracción. Cada punto representa el centro de una bola. Las coordenadas se dan en decenas de micrómetros, tanto para el eje óptico 5 en z como para las coordenadas en x e y perpendiculares al eje óptico 5 en z. De la figura 4 se desprende que los objetos de referencia 10 están bien organizados en un plano de referencia, en este caso el de la superficie 12a de soporte 12 sobre la que descansan.

[0071] En el ejemplo de la figura 4, la superficie de referencia 6’, cuya posición se ha podido determinar, es la superficie 12a del soporte 12 sobre la que se depositan las bolas. Se trata de un caso particular especialmente ventajoso, pero se podría haber elegido otra superficie de referencia, como por ejemplo el centro de las bolas, que están desplazadas en z con respecto al soporte 12 por una distancia correspondiente a los radios r de las bolas. Sin embargo, tal superficie que pasa por el centro de las bolas puede ser irregular y no plana, si las bolas no tienen todas exactamente el mismo radio. Es preferible por lo tanto elegir como superficie de referencia 6’ la superficie 12a del soporte 12 que es en principio plana y no depende de la regularidad de los radios de las bolas.

[0073] Una vez determinada la posición de un objeto de referencia 10 con respecto al plano de adquisición 2’, a través de sus parámetros de posición (típicamente sus coordenadas de posición), es posible, a partir de los parámetros de posición del objeto de referencia 10, determinar la posición de la superficie de interés 6 con respecto al plano de adquisición 2’, ya que el objeto de referencia 10 se encuentra en una posición correspondiente a la posición de la superficie de interés 6. En el caso en el que se hayan determinado las coordenadas paramétricas de una superficie de referencia 6’ en la que están organizados los objetos de referencia 10, la posición de la superficie de interés 6 se puede determinar a partir de las coordenadas paramétricas de esta superficie de referencia 6’.

[0075] La posición de la superficie de interés 6 puede coincidir con la posición del objeto de referencia 10, lo que es la correspondencia más simple. Así, en el ejemplo de la figura 4, si la superficie de interés 6 coincidiera con la interfaz entre la muestra 1 y el soporte 12, la posición del objeto de referencia 10 o de la superficie de referencia 6’ que se deduce de él, daría directamente la posición de la superficie de interés 6 con respecto del plano de adquisición 2’. La posición de la superficie de interés 6 puede no coincidir con la posición del objeto de referencia 10, pero siempre existe una correspondencia entre la posición de la superficie de interés 6 y la posición del objeto de referencia 10. En este caso, la posición de la superficie de interés 6 se puede definir con respecto a la posición del objeto de referencia 10. Esta correspondencia puede ser, por ejemplo, un desplazamiento en una dirección, en particular a lo largo del eje óptico 5.

[0077] En el ejemplo de la figura 4, la posición de la superficie de interés 6 corresponde al centro de los objetos de referencia 10 que descansan sobre la superficie 12a del soporte 12. En el ejemplo de la figura 4, la superficie de interés 6 cuya posición puede determinarse a partir de las posiciones de los objetos de referencia 10 no es por lo tanto la superficie 12a del soporte 12 que forma la interfaz entre la muestra 1 y el soporte 12, sino que se puede definir con respecto al centro de las bolas, mediante una simple traslación a lo largo del eje óptico 5. Basta tener en cuenta las posiciones de las bolas sobre la superficie 12a del soporte 12 como superficie de referencia 6’, y desplazar las coordenadas en z de un valor correspondiente a una vez el radio r de las bolas, que se puede haber determinado como parámetro geométrico que forma los parámetros de caracterización asociados a cada objeto de referencia 10. Es fácil elegir otra superficie de interés 6. Por ejemplo, si se desea conocer la posición de la parte superior de las bolas que forman otra superficie de interés 6, basta con trasladar el doble del radio de las bolas a partir de la superficie 12a del soporte 12 tomada como superficie de referencia 6’.

[0079] Por ejemplo, si la muestra 1 contiene microorganismos que tienen 2 µm de grosor que descansan sobre el soporte 12, la superficie de interés 6 se puede elegir como la que pasa a través de los centros de estas bacterias; y por lo tanto la superficie de interés 6 estará definida por un desplazamiento de 1 µm con respecto a la superficie 12a del soporte 12 tomada como superficie de referencia 6’. Sin embargo, pueden ser posibles otros desplazamientos. Si la superficie de interés 6 coincide con la superficie en la que se organizan los centros de las bolas, se puede determinar por lo tanto que la superficie de interés 6 formada por el plano de los centros de las bolas se ubica sobre el eje óptico 5 a una distancia de aproximadamente 17,5 µm del plano de adquisición 2’. Ventajosamente, como en estos ejemplos, la correspondencia entre la posición de la superficie de referencia y la posición de la superficie de interés 6 puede depender de parámetros geométricos del objeto de referencia 10. Sin embargo, esto no es necesario. Por ejemplo, puede ser deseable obtener una imagen de una superficie de interés 6 ubicada a una distancia dada, no relacionada con los parámetros geométricos de los objetos de referencia, con respecto a los objetos de referencia 10. Para convertir en imágenes una superficie de interés 6 a 5 µm de la superficie 12a del soporte 12, basta con una traslación de 5 µm con respecto a las coordenadas en z (a lo largo del eje óptico 5) de la parte inferior de las bolas.

[0080] Con un único objeto de referencia 10, la única información de posición relevante para el enfoque que se puede determinar es la posición del objeto de referencia 10, y por lo tanto de la superficie de interés 6, a lo largo del eje óptico 5, a través de la coordenada en z del objeto de referencia 10. Sin embargo, se trata de la información más valiosa, ya que este conocimiento de la posición de la superficie de interés 6 sobre el eje óptico 5 ya permite por sí solo enfocar el sistema de formación de imágenes para la adquisición de imágenes, es decir, asegurar que se adquiera una imagen de la superficie de interés 6 en el plano focal del sistema de formación de imágenes holográficas. Se trata entonces de tomar como superficie de referencia 6’ un plano de referencia perpendicular al eje óptico 5, y cuya coordenada en z es la del objeto de referencia 10 (como por ejemplo su centro o su lado).

[0081] Preferentemente, la muestra 1 comprende por lo menos tres objetos de referencia 10 en el campo de visión del sensor de imágenes 2, cuyos parámetros de posición con respecto al plano de adquisición 2’ están determinados, y más preferentemente por lo menos cinco objetos de referencia 10. Disponer de parámetros de posición, con respecto al plano de adquisición 2’ de varios objetos de referencia 10, permite mejorar la precisión de la determinación de la posición de la superficie de interés 6 con respecto al plano de adquisición, usando una combinación de parámetros de posición tales como coordenadas de posición de varios objetos de referencia 10, y por ejemplo promediando sus coordenadas en z. Disponer de una pluralidad de coordenadas de posición permite, mediante la explotación de las coordenadas en x e y, definidas en un plano perpendicular al eje óptico 5, determinar también una posible inclinación de la superficie de referencia en la que están organizados los objetos de referencia 10 con respecto al plano de adquisición 2’, y por lo tanto una posible inclinación de la superficie de interés 6 (“tilt”) correspondiente. Como se ha mencionado anteriormente, es posible para ello determinar las coordenadas paramétricas de la superficie de referencia. La pluralidad de coordenadas de posición también permite estimar la precisión de la determinación de la posición, por ejemplo determinando estimadores estadísticos de la dispersión de los resultados, tal como una desviación estándar.

[0083] De igual manera, y con el fin de mejorar aún más la precisión, es posible trabajar a partir de varias imágenes holográficas adquiridas por el sensor de imágenes 2 en diferentes posiciones del plano de adquisición 2’. Para cada una de las imágenes holográficas, se determina la posición de por lo menos un objeto de referencia 10 con respecto al plano de adquisición 2’ de dicha imagen holográfica, y la determinación de la posición de la superficie de interés 6 implica varias posiciones de por lo menos un objeto de referencia 10 para diferentes posiciones del plano de adquisición 2’. También es posible trabajar a partir de varias imágenes holográficas adquiridas por el sensor de imágenes 2 con diferentes longitudes de onda de la luz de iluminación, con el fin de tener en cuenta diferentes efectos ópticos dependiendo de la longitud de onda de la luz de iluminación.

[0085] Una vez determinada la posición de la superficie de interés 6 con respecto al plano de adquisición 2’, se puede proceder a un enfoque de la adquisición de la imagen en base a la posición de la superficie de interés 6 con respecto al plano de adquisición 2’. El enfoque consiste en hacer coincidir las posiciones de la superficie de interés 6 y el plano focal del objeto, correspondiente al plano de adquisición 2’.

[0087] El enfoque puede comprender el desplazamiento relativo de la muestra 1 o del sensor de imágenes 2 a lo largo del eje óptico 5, sobre una distancia de desplazamiento derivada de la posición de la superficie de interés 6 con respecto al plano de adquisición 2’. El enfoque puede consistir en un desplazamiento de la muestra 1 a lo largo del eje óptico 5, por ejemplo mediante un raíl o una platina motorizada que mueve el soporte 12, de forma que la posición de la superficie de interés de la muestra 1 coincida con el plano de adquisición 2’ del sensor de imágenes 2. También es posible modificar un elemento óptico del sistema de formación de imágenes moviendo el plano de adquisición 2’ para hacerlo coincidir con la posición de la superficie de interés. Una imagen adquirida posteriormente permite así convertir en imágenes la superficie de interés con un enfoque en esta superficie de interés 6. Si bien es evidente que esta imagen adquirida después del enfoque puede ser ventajosamente una imagen holográfica, cabe señalar que esta imagen adquirida después del enfoque no es necesariamente una imagen holográfica. Por ejemplo, es posible utilizar una imagen holográfica sólo para el enfoque, y después adquirir una imagen según otros modos de adquisición, como por ejemplo con luz blanca.

[0089] Otra manera de enfocar es utilizar un procedimiento digital (“digital focusing”), denominado también reconstrucción holográfica, que comprende transformar la imagen holográfica adquirida utilizando un modelo de propagación que involucra la posición de la superficie de interés 6 con respecto al plano de adquisición 2’. Una convolución de los datos de la imagen mediante una función compleja permite mover el plano focal a posteriori con respecto a los objetos convertidos en imágenes. En particular, se puede utilizar el modelo de propagación de Rayleigh-Sommerfeld. Por ejemplo, el capítulo 3 de la segunda edición del libro de Joseph W. Goodman, “Introduction to Fourier optics”, McGraw Hill Higher Education, 1996, describe este modelo. El enfoque mediante un procedimiento digital sobre una imagen ya adquirida permite prescindir de la utilización de un sistema mecánico de enfoque.

[0090] La figura 5 muestra el resultado de un enfoque digital (o “computional” en inglés) aplicada a la imagen de la figura 3 mediante una reconstrucción de propagación de Rayleigh-Sommerfeld, en la que el plano focal se ha movido para corresponderse con una superficie de interés 6 elegida como pasando por el centro de las bolas (la superficie de referencia correspondiente a la superficie 12a del soporte 12 sobre el que descansan las bolas). Aunque se pueden observar algunos artefactos (halos alrededor de las bolas), cabe señalar, no obstante, que las bolas son claramente visibles, como si se hubieran colocado directamente en el plano de adquisición 2’ cuando tiene lugar la adquisición de la imagen.

[0091] Del procedimiento descrito anteriormente se desprende que es posible llevar a cabo un enfoque para la adquisición de una imagen de una superficie de interés 6 de una muestra 1 mediante un sensor de imágenes 2 de un sistema de conversión en imágenes de una manera muy precisa, sin necesidad de un equipo específico y sin grandes limitaciones en el sistema de conversión en imágenes, aparte de la capacidad de adquirir previamente una imagen holográfica. Por lo tanto, este procedimiento se puede aplicar a todos los sistemas de formación de imágenes existentes capaces de adquirir una imagen holográfica.

[0092] La invención no se limita al modo de realización descrito y mostrado en las figuras adjuntas. Todavía son posibles modificaciones, en particular desde el punto de vista de la constitución de las diversas características técnicas o por sustitución de equivalentes técnicos, sin salir, no obstante, del ámbito de protección de la invención.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de enfoque para la adquisición de una imagen de una superficie de interés (6) de una muestra (1) mediante un sensor de imágenes (2) de un sistema de formación de imágenes, que comprende las siguientes etapas:

- colocar la muestra (1) en la que se encuentra la superficie de interés (6), en el campo de visión de un sensor de imágenes (2) del sistema de formación de imágenes, comprendiendo la muestra (1) por lo menos un objeto de referencia (10) que tiene una forma conocida y descrita por parámetros de caracterización asociados al objeto de referencia, comprendiendo estos parámetros de caracterización por lo menos unos parámetros de posición del objeto de referencia (10), estando el objeto de referencia (10) ubicado en una posición correspondiente a una posición de la superficie de interés (6),

- iluminar la muestra (1) mediante una luz de iluminación, y adquirir una imagen holográfica por el sensor de imágenes (2) en un plano de adquisición (2’), de los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia (10),

- determinar la posición del objeto de referencia (10) con respecto al plano de adquisición (2’), utilizando un modelo de difracción de luz por lo menos por un objeto de referencia (10), siendo el modelo de difracción función de la forma conocida del objeto de referencia (10) e implicando los parámetros de caracterización del objeto de referencia (10), estimándose por lo menos los parámetros de posición del objeto de referencia (10) mediante el ajuste en el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia (10) que aparecen en la imagen holográfica,

- determinar la posición de la superficie de interés (6) con respecto al plano de adquisición (2’) a partir de una posición del objeto de referencia (10) definida por los parámetros de posición,

- enfocar la adquisición de imagen sobre la base de la posición de la superficie de interés (6) con respecto al plano de adquisición haciendo coincidir la posición de la superficie de interés con el plano de adquisición.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el objeto de referencia (10) que tiene una forma conocida es un objeto artificial añadido a la muestra (1), o el objeto de referencia (10) que tiene una forma conocida es un microorganismo presente en la muestra.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el objeto de referencia (10) que tiene una forma conocida tiene una forma esférica, cilíndrica o elipsoidal.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modelo de difracción de luz es el modelo de Mie, de Mie generalizado, de Thompson, o de Rayleigh.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los parámetros de caracterización asociados con un objeto de referencia (10) también comprenden parámetros geométricos que describen la forma conocida del objeto de referencia (10).

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que los parámetros geométricos del objeto de referencia (10) se estiman ajustando el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia (10) en la imagen holográfica.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los parámetros de caracterización asociados con el objeto de referencia (10) comprenden un índice de refracción del objeto de referencia (10) que se estima ajustando el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia (10) que aparecen en la imagen holográfica.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra (1) se coloca en un medio de inmersión (14), y el modelo de difracción de luz implica un índice de refracción de dicho medio de inmersión (14) que se estima ajustando el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia (10) que aparece en la imagen holográfica.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra (1) comprende por lo menos tres objetos de referencia (10) no alineados en el campo de visión del sensor de imágenes (2) cuyos parámetros de posición con respecto al plano de adquisición están determinados, y la determinación de la posición de la superficie de interés (6) comprende una determinación de una posición de una superficie de referencia en la que se organizan los objetos de referencia (10), determinándose la posición de la superficie de interés (6) a partir de la posición de la superficie de referencia mediante la correspondencia entre las posiciones de los objetos de referencia (10) y la posición de la superficie de interés (6).

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que los parámetros de posición de los objetos de referencia (10) comprenden coordenadas de posición con respecto al plano de adquisición (2’), y la posición de la superficie de referencia (6’) se determina mediante una interpolación de las coordenadas de posición seguida de una determinación de las coordenadas paramétricas de la superficie de referencia (6’) con respecto al plano de adquisición.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que varias imágenes holográficas son adquiridas por el sensor de imágenes (2) en diferentes posiciones del plano de adquisición (2’) y/o con diferentes longitudes de onda para la luz de iluminación, y para cada una de las imágenes holográficas se determina la posición del por lo menos un objeto de referencia (10) con respecto al plano de adquisición de dicha imagen holográfica, implicando la determinación de la posición de la superficie de interés (6) varias posiciones del por lo menos un objeto de referencia (10).

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enfoque de la adquisición de imágenes comprende el desplazamiento relativo de la muestra (1) y el sensor de imágenes (2) por lo menos a lo largo del eje óptico (5) del sistema de formación de imágenes, sobre una distancia de desplazamiento derivada de la posición de la superficie de interés (6) con respecto al plano de adquisición (2’).

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el enfoque de la adquisición de imágenes comprende modificar un elemento óptico del sistema de formación de imágenes moviendo el plano de adquisición (2’).

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el enfoque de la adquisición de imágenes es un enfoque digital que comprende la transformación de la imagen holográfica adquirida utilizando un modelo de propagación que implica la posición de la superficie de interés (6) con respecto al plano de adquisición (2’).

15. Sistema de formación de imágenes, que comprende:

- un sensor de imágenes (2) configurado para adquirir una imagen holográfica en un plano de adquisición (2’) en un campo de visión,

- una fuente de luz (4) configurada para iluminar una muestra (1) dispuesta en el campo de visión del sensor de imágenes (2), comprendiendo la muestra (1) una superficie de interés (6) y comprendiendo por lo menos un objeto de referencia (10) que tiene una forma conocida y descrita por parámetros de caracterización asociados con el objeto de referencia, comprendiendo estos parámetros de caracterización por lo menos parámetros de posición, estando ubicado el objeto de referencia en una posición correspondiente con la posición de la superficie de interés,

- un sistema automatizado de procesamiento de datos configurado para recibir la imagen holográfica adquirida por el sensor de imágenes (2) y para determinar la posición del objeto de referencia con respecto al plano de adquisición, utilizando un modelo de difracción de luz mediante el por lo menos un objeto de referencia, siendo el modelo de difracción función de la forma conocida del objeto de referencia (10) e involucrando los parámetros de caracterización asociados con el objeto de referencia, estimándose por lo menos los parámetros de posición del objeto de referencia mediante el ajuste en el modelo de difracción de luz para aproximar los patrones de interferencia causados por el objeto de referencia en la imagen holográfica, y determinar la posición de la superficie de interés con respecto al plano focal de adquisición a partir de una posición del objeto de referencia definida por los parámetros de posición,

estando el sistema de formación de imágenes holográficas configurado para la implementación de un procedimiento de enfoque para la adquisición de una imagen de la superficie de interés de la muestra mediante el sensor de imágenes (2) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.