ES3059610T3 - Diagnostic methods - Google Patents

Abstract

En un aspecto, la invención se refiere al uso de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en genes de canales iónicos de potencial de receptor transitorio (TRP), receptores de acetilcolina (AchR) y/o receptores adrenérgicos (ADR) como sondas, herramientas o reactivos para identificar, detectar, diagnosticar, monitorizar o gestionar/tratar a sujetos con, o predispuestos a, afecciones médicas (o síntomas de las mismas), tales como síndrome de fatiga crónica (SFC), encefalomielitis miálgica (EM), síndrome de la Guerra del Golfo (SGG), síndrome del intestino irritable (SII), sensibilidad química múltiple (SCM), fibromialgia y migraña, así como algunas afecciones médicas causadas por desregulación del calcio, la acetilcolina, TRP y ADR, y desregulación en los sistemas gastrointestinal, cardiovascular, neurológico, genitourinario e inmunitario. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos, kits y ensayos para identificar, detectar, diagnosticar, monitorizar o gestionar/tratar a sujetos con una o más de esas afecciones médicas o síntomas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos de Diagnóstico

[0003] Campo técnico

[0004] En algunos aspectos, la presente invención se refiere en general al uso de polimorfismos de nucleótido único (SNP) en el canal iónico del potencial receptor transitorio (TRP), genes como sondas, herramientas o reactivos para la identificación, detección, diagnóstico, seguimiento o gestión/tratamiento de sujetos con, o predispuestos al síndrome de fatiga crónica (CFS).

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Se entenderá claramente que, si en el presente documento se hace referencia a una publicación de la técnica anterior, esta referencia no constituye una admisión de que la publicación forma parte del conocimiento general común en la técnica en Australia o en cualquier otro país.

[0007] Se sabe que el síndrome de fatiga crónica/encefalomielitis miálgica (CFS/ME) afecta aproximadamente al 1-4% de las personas en todo el mundo [1a, 2a]. El CFS/ME es de etiología desconocida y no existe ninguna prueba diagnóstica específica. El síndrome de fatiga crónica (CFS) es un trastorno inexplicable con múltiples alteraciones fisiológicas. La enfermedad se caracteriza por un deterioro significativo de la actividad física y una fatiga debilitante, acompañados de alteraciones de la memoria, la cognición y la concentración, una mayor sensación de dolor y una desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune [14a-31a]. Las investigaciones realizadas hasta la fecha sugieren un deterioro inmune significativo. Sin embargo, aún no se ha determinado el mecanismo de este trastorno. Los pacientes con CFS pueden presentar reacciones a diversos factores ambientales y biológicos [11a-13a]. Además, hay pruebas que sugieren que el CFS puede tener un componente alérgico [14a-16a].

[0008] Las afecciones médicas causadas por la desregulación del TRP se caracterizan por síntomas específicos o desregulación, entre los que se incluyen: deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la experiencia del dolor; desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; síntomas respiratorios; y desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune.

[0009] Los canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) se expresan en casi todas las células y tienen un efecto significativo en las funciones fisiológicas [3b]. Varias canalopatías se han asociado a genes TRP, ya que tienen consecuencias para la función celular [4b, 18b, 19b]. La desregulación de los TRP se ha asociado a condiciones patológicas y enfermedades que incluyen dolor crónico, vejiga hiperactiva, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertrofia cardiaca, enfermedad de Alzheimer familiar, enfermedades de la piel, displasias esqueléticas, neuropatías motoras, neuropatías neurosensoriales (incluida la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (tipo 2C) y el cáncer [4b-8b]. Los canales iónicos TRP tienen un papel importante en la señalización del Ca<2+>. Los canales iónicos TRP se activan tras fluctuaciones o desviaciones del entorno celular. Los factores que pueden influir en estos cambios son los agentes estresantes, como los patógenos, la temperatura, la presión, los productos químicos, la oxidación/reducción, las toxinas, la osmolaridad y el pH [9b, 10b]. Los canales iónicos TRP se activan en presencia de irritantes, productos inflamatorios y toxinas xenobióticas.

[0010] Los TRP de mamíferos se componen de seis grupos principales que incluyen el TRPA (anquirina), TRPC (canónico), TRPM (melastatina), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) y TRPV (vanilloide) [1b, 2b]. En general, los canales TRPC son canales de cationes no selectivos, sólo dos son canales de Ca<2+>altamente permeables y dos son impermeables al Ca<2+>. Varios TRP son permeables al Mg<2+>y al Zn<2+>[3b].

[0011] Los polimorfismos de nucleótido único (SNP) se producen en las secuencias codificantes de los genes, en las regiones no codificantes de genes o en las regiones intergénicas de los genes. Los SNP ubicados dentro de una secuencia codificante pueden o no cambiar necesariamente la secuencia de aminoácidos de la proteína que se produce. Los SNP que no alteran la secuencia polipeptídica se denominan sinónimos (a veces denominados variantes silenciosas), mientras que los SNP que dan lugar a secuencias polipeptídicas diferentes se denominan no sinónimos. Los polimorfismos de un único nucleótido no sinónimo (nsSNP) resultan en cambios en la expresión de las proteínas que pueden resultar en una señalización aberrante, como la pérdida o ganancia de función en su efecto. Es importante destacar que se ha reportado de que las variantes silenciosas afectan empalme y pueden provocar enfermedades humanas [10d, 11d]. Las variantes génicas que afectan el empalme pueden inducir la omisión de exones y activar isoformas de empalme alternativas de la transcripción genética, lo que puede dar lugar a transcripciones genéticas alteradas y fenotipos de enfermedad.

[0012] A pesar de la investigación intensiva, hasta la fecha, la fisiopatología del CFS/ME aún no se entiende completamente y las herramientas de diagnóstico claras siguen siendo esquivas. Por lo tanto, siguen siendo necesarios medios rápidos, rentables y confiables para identificar, examinar, diagnosticar, controlar y/o gestionar/tratar a las personas que padecen, o corren el riesgo de padecer, una condición médica como el CFS/ME.

[0013] El documento WO2010/097706 describe métodos de eliminación de polimorfismos genéticos para evaluar enfermedades inmunes crónicas. El documento WO2008/010082 describe métodos para determinar los fenotipos de la fibromialgia o del síndrome de fatiga crónica mediante polimorfismos.

[0014] Resumen de la invención

[0015] La presente invención se refiere a un método de identificación de un sujeto en riesgo de desarrollar el síndrome de fatiga crónica (CFS) o de diagnóstico de un sujeto que tiene CFS, dicho método comprende testear una muestra biológica que se ha obtenido del sujeto para al menos un único polimorfismo de nucleótido (SNP) de al menos un gen de canal iónico de potencial receptor transitorio (TRP) que se sabe que se correlaciona con el CFS, en donde el SNP del gen de canal iónico TRP es rs12682832 (TRPM3), rs11142508 (TRPM3), rs655207 (TRPC4), o rs6650469 (TRPC4).

[0016] A partir de las reivindicaciones adjuntas pueden distinguirse características, realizaciones y variaciones preferidas de la invención. La Descripción Detallada no debe considerarse en modo alguno como limitante del alcance del resumen de invención precedente. En la Descripción Detallada se hace referencia a los siguientes dibujos.

[0017] Breve descripción de las figuras

[0018] Las figuras que ilustran la materia objeto ajena a la invención se incluyen únicamente para propósitos ilustrativos. Figura 1: Pureza de Células Asesinas Naturales. La pureza de las células NK representa una contaminación mínima de otros tipos de células. Los datos se muestran para ME/CFS (n = 39) y controles sin fatiga (n = 30), y se presentan como media ± SEM.

[0019] Figura 2: Reducción de la actividad citotóxica NK en el CFS/ME. Evaluación in vivo de la actividad citotóxica NK de líneas celulares tumorales K562 en CFS/ME (n=39) y controles sin fatiga (n=30). Actividad lítica representada por el porcentaje de lisis de las células objetivo en el eje y. Datos presentados como media ± SE *P<0.05.

[0020] Figura 3. Expresión de TRPM3 (%) en linfocitos B y células NK seleccionadas de células mononucleares periféricas HC (n = 19) y CFS/ME (n = 18). (A) Los subconjuntos de células NK se caracterizaron como células NK CD56<Bright>y células NK CD56<Dim>. La identificación de la expresión superficial de TRPM3 en los subconjuntos de células NK se analizó mediante citometría de flujo indirecta. (B) Las células B se caracterizaron como células B totales (CD3-CD19<+>) y se empleó citometría de flujo indirecta para identificar la expresión de superficie de TRPM3 en las células B. Los histogramas muestran las medias ±SEM. *Denota p<0.05. HC: controles sanos; CFS: síndrome de fatiga crónica; ME: encefalomielitis miálgica.

[0021] Figura 4: Influjo de calcio citoplasmático de Fura-AM en células CD19<+B>y células NK CD56<Bright>. (A). La curva de respuesta al influjo de calcio de las células CD19<+>B, expresada como área bajo la curva, se midió durante la reticulación de biotinas conjugadas con anti-IgM y anti-CD21 con estreptavidina o en presencia de ionomicina, 2-APB o tapsigargina mediante citometría de flujo. (B). Respuesta de influjo de calcio citoplasmático Fura-AM durante los receptores de células NK CD56<Bright>, las biotinas conjugadas anti-CD314 y anti-CD335 se reticularon con estreptavidina o en presencia de ionomicina, 2-APB o Thapsigargin mediante citometría de flujo. Los histogramas muestran las medias ±SEM. *Denota significancia estadística en p<0.05.

[0022] Figura 5: Gráfico citométrico de flujo representativo de los fenotipos de células NK CD56<bright>CD16<dim/->y CD56<dim>CD16<+>(A). Las comparaciones de los fenotipos de células NK CD56<bright>CD16<dim/->y CD56<dim>CD16<+>entre CFS/ME y NFC no revelaron diferencias significativas (B). Los datos se presentan como porcentaje medio con rango intercuartílico. Figura 6: Gráfico citométrico de flujo de células NK ERK1/2 CD56<bright>CD16<dim/->para un individuo representativo (A). ERK1/2 en células NK CD56<bright>CD16<dim/->se compararon entre los grupos CFS/ME y NFC y no se observaron diferencias significativas. La estimulación con PMA/I provocó un aumento significativo de la fosforilación de ERK1/2 en comparación con las células US (***p<0.001) y K562 (****p<0.0001) tanto en CFS/ME como en NFC. Los datos se presentan como IMF con rango intercuartílico.

[0023] Figura 7: Gráfico citométrico de flujo representativo para MEK 1/2 en células NK CD56<dim>CD16<+>(A). No se observaron diferencias significativas cuando se comparó MEK1/2 entre CFS/ME y NFC (B). Tanto en CFS/ME como en NFC, la estimulación con PMA/I produjo un aumento significativo de MEK1/2 fosforilada en comparación con la estimulación con US (****p<0.0001) y K562 (****p<0.0001). Los datos se presentan como IMF con rango intercuartílico.

[0024] Figura 8: Gráfico de citometría de flujo representativo de p38 en células NK CD56<dim>CD16<+>(A). Se comparó p38 entre CFS/ME y NFC y no se observaron diferencias significativas (B). La estimulación con PMA/I provocó un aumento significativo de la p38 fosforilada en comparación con las células incubadas con US y K562 (*p<0.05). Los datos se presentan como IMF con rango intercuartílico.

[0025] Figura 9: Diagramas citométricos de flujo representativos de Stat-3 en células NK CD56<dim>CD16+ (A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). La comparación de Stat-3 en células NK CD56<dim>CD16+(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) entre CFS/ME y NFC no reveló diferencias significativas. En las células NK<CD56dimCD16+>y<CD56brightCD16dim/->, la estimulación con PMA/I provocó un aumento significativo en Stat-3 en comparación con US (****p<0.0001) y K562 (****p<0.0001) tanto en CFS/ME como en NFC.

[0026] Figura 10: Análisis citométrico de flujo representativo de NF-Kβ en células NK CD56<dim>CD16+ (A) y CD56<bri>g<ht>CD16<dim/->(B). No se observaron diferencias significativas al comparar NF-κβ entre CFS/ME y NFC en células NK CD56<dim>CD16+ (C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D). El NF-κβ fosforilado aumentó significativamente después de la estimulación con PMA/I en las células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) en comparación con US (****p<0.0001) y K562 (****p<0.0001) en CFS/ME y NFC. Los datos se presentan como IMF con rango intercuartílico.

[0027] Figura 11: Gráficos citométricos de flujo representativos de Iκβ en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD1<6dim/->(B). Se comparó Irβ en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) de CFS/ME y NFC y no se observaron diferencias significativas. La estimulación con PMA/I provocó una reducción significativa de Iκβ en las células NK CD56<dim>CD16<+>(*p<0.05) y CD56<bright>CD16<dim/->(***p<0.001) de CFS/ME y NFC. La incubación con PMA/I también provocó una reducción significativa (*p<0.05) en Iκβ en células NK CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con CFS/ME. Figura 12: Gráficos representativos de citometría de flujo para el análisis de PKC-α en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). Se comparó PKC-α en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) de CFS/ME y NFC y no se observaron diferencias significativas. En las células NK CD56<dim>CD16<+>procedentes de NFC, la estimulación con PMA/I provocó un aumento significativo (**p<0.01) de la fosforilación de PKC-α en comparación con las células K562. La PKC-α aumentó significativamente en las células NK CD56<bright>CD16<dim/->después de la estimulación con PMA/I en comparación con US (*p<0.05) y K562 (***p<0.001) en NFC.

[0028] Figura 13: Análisis citométrico de flujo de JNK en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). No se observaron diferencias significativas cuando se comparó JNK en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) de CFS/ME y NFC. Se observaron aumentos significativos de JNK fosforilada en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) después de la estimulación con PMA/I en comparación con US (**p<0.01) y K562 (***p<0.001) en CFS/ME y NFC.

[0029] Figura 14: Actividad citotóxica de las células NK en CFS/ME y NFC en tres proporciones E:T.

[0030] Figura 15: Gráficos representativos de citometría de flujo para CD107a en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). CD107a se midió en células US y después de la estimulación con células K562 o PMA/I. La comparación de CD107a en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) entre CFS/ME y NFC no reveló diferencias significativas. La expresión de CD107a aumentó significativamente después de la estimulación con K562 y PMA/I (****p<0.0001) en células NK CD56<dim>CD16<+>tanto de CFS/ME como de NFC. En las células NK CD56<bright>CD16<dim/->, la estimulación con PMA/I aumentó significativamente la expresión de CD107a en comparación con las células K562 y US (****p<0.0001) de CFS/ME y NFC.

[0031] Figura 16: Análisis citométrico de flujo de CD107b en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). No se observaron diferencias significativas cuando se comparó la expresión de CD107b entre CFS/ME y NFC en las células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D). En las células NK CD56<dim>CD16<+>, la estimulación con células K562 (*p<0.05) y PMA/I (****p<0.0001) provocó un aumento significativo de la expresión de CD107b tanto en CFS/ME como en NFC en comparación con US. La estimulación con PMA/I aumentó significativamente la expresión de CD107b en las células NK CD56<bright>CD16<dim/->de CFS/ME y NFC en comparación con K562 y US (****p<0.0001).

[0032] Figura 17: Perforina, granzimas A y B y CD57 de células NK CD56<dim>CD16<+>de pacientes con CFS/ME.

[0033] Figura 18: Perforina, granzimas A y B y CD57 de células NK CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con CFS/ME.

[0034] Figura 19: Gráficos citométricos de flujo representativos para la producción de IFN-γ por parte de células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). La comparación de la producción de IFN-γ en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) entre CFS/ME y NFC no reveló diferencias significativas. La producción de IFN-γ aumentó significativamente después de la estimulación con PMA/I tanto en las células NK CD56<dim>CD16<+>como en las CD56<bright>CD16<dim/->en comparación con US y K562 (****p<0.0001).

[0035] Figura 20: Gráficos de citometría de flujo para TNF-α en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). Entre las cohortes CFS/ME y NFC, la producción de TNF-α en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) no fue significativamente diferente. En las células NK CD56<dim>CD16<+>, la estimulación con PMA/I aumentó significativamente la producción de TNF-α en comparación con las células incubadas con US y K562 (****p<0.0001) tanto en CFS/ME como en NFC.

[0036] Figura 21: Análisis citométrico de flujo de la producción de GM-CSF en células NK CD56<dim>CD16<+>(A) y CD56<bright>CD16<dim/->(B). La producción de GM-CSF en células NK CD56<dim>CD16<+>(C) y CD56<bright>CD16<dim/->(D) no fue significativamente diferente cuando se comparó entre las cohortes de CFS/ME y NFC. La estimulación con PMA/I provocó un aumento significativo de la producción de GM-CSF CD56d<im>CD16+ y CD56<bright>CD16<dim>/- tanto en las células CFS/ME como en las NFC en comparación con las células incubadas US y K562 (****p<0.0001, ***p<0.001). Figura 22. Pureza de las células asesinas naturales. Las medidas de pureza de las células NK se representan como % total de células CD3<->CD56<+>. Los datos se presentan como media ± DE para el grupo de CFS/ME (n= 24) y el grupo de control (n=11).

[0037] Figura 23. Mapa de calor de la expresión de genes quinasa que muestra (A) genes significativamente regulados al alza y (B) genes significativamente regulados a la baja de pacientes con CFS/ME grave en comparación con controles sin fatiga.

[0038] Figura 24: Frecuencia de SNP por cromosoma.

[0039] Figura 25: Diagrama de Manhattan de la prueba exacta de Fisher en 950 SNP.

[0040] Figura 26: Frecuencia de los 10 SNP principales de la prueba exacta de Fisher. Casos: Grupo con CFS/ME; Controles: Grupo de control sano; MAF: alelo menor.

[0041] Figura 27: Proporción de pacientes con CFS/ME ("Casos") y grupo de control sano ("Controles") que son homocigotos mayores (GG), heterocigotos (AG) u homocigotos menores (AA) para el SNP rs2322333 α1A adrenérgico (ADRA1A). Descripción detallada

[0042] El síndrome de fatiga crónica (CFS) y la encefalomielitis miálgica (EM) son afecciones médicas significativamente debilitantes caracterizadas por fatiga persistente y otros síntomas específicos que duran un mínimo de seis meses. CFS y ME suelen utilizarse indistintamente para describir la misma enfermedad, aunque no tiene que ser el caso. La fatiga que experimentan los sujetos humanos que padecen CFS no se debe al esfuerzo ni está causada por otra condición médica, y no se alivia significativamente con el descanso. Se trata de una enfermedad compleja que implica una desregulación de los sistemas inmune y nervioso central, una disfunción del metabolismo energético celular y del transporte de iones, y anomalías cardiovasculares.

[0043] Los pacientes con CFS/ME pueden clasificarse además en afectados leves, moderados, graves o muy graves por su enfermedad. Los pacientes con CFS/ME leve tienen movilidad y a menudo siguen trabajando, los pacientes con CFS/ME moderado tienen movilidad reducida y están limitados en las tareas diarias, como las tareas domésticas, los pacientes con CFS/ME grave sólo pueden realizar las tareas mínimas necesarias relacionadas con la higiene y dependen de una silla de ruedas, mientras que los pacientes con CFS/ME muy grave no pueden realizar ninguna tarea diaria por sí mismos y están esencialmente postrados en cama [3e]. El ICC es el conjunto de criterios más reciente y preciso utilizado para el diagnóstico del CFS/ME y contiene referencias a estos subgrupos de gravedad de los pacientes con CFS/ME, aunque no es un componente necesario de las directrices [4e].

[0044] Se han emprendido varias iniciativas sanitarias para avanzar en la investigación de la(s) causa(s) probable(s), el mecanismo, las medidas preventivas y las posibles estrategias terapéuticas para el CFS/ME. En la actualidad, ninguna de estas iniciativas ha tenido éxito y la comunidad médica sigue desconcertada por la enfermedad.

[0045] Actualmente no existen pruebas diagnósticas disponibles en el mercado ni métodos definitivos para la detección del CFS/ME.

[0046] El aspecto más desconcertante del CFS/ME es su naturaleza multifactorial y multisintomática y la dificultad resultante en el diagnóstico del CFS/ME. El método actual de diagnóstico consiste en descartar otras posibles causas de los síntomas que presentan los pacientes. Cuando los síntomas son atribuibles a otras afecciones determinadas, se excluye el diagnóstico de CFS/ME. Como resultado, se produce un prolongado proceso de "eliminación" que a menudo incluye varios intentos de estrategias de tratamiento infructuosas. Este proceso puede durar entre 6 y 18 meses. En consecuencia, supone una grave carga financiera para el sujeto y para el sistema sanitario y la economía.

[0047] Aunque no existe un tratamiento específico para el CFS/ME, puede tratarse adecuadamente una vez que se diagnostica que un paciente padece CFS. Además, hay indicios que sugieren que cuanto antes se adopte un régimen de gestión, mayores serán las posibilidades de mejora, aunque no existe una cura y las mejoras se basan en gran medida en datos empíricos. Una prueba de diagnóstico/examen ayudaría significativamente a diagnosticar/examinar el CFS/ME, reduciendo así el sufrimiento del paciente y los costos sanitarios asociados a la espera de muchos meses antes de ser diagnosticado de CFS/ME.

[0048] La presente invención se describe con más detalle a continuación.

[0049] Los presentes inventores han identificado, por primera vez, SNP del canal iónico TRP que se correlacionan con CFS y ME o síntomas específicos de los mismos. Los inventores creen que los SNP identificados de los genes de los canales iónicos TRP también se correlacionan con otras afecciones médicas o síntomas de las mismas, como el IBS, el MCS, la fibromialgia y la migraña, así como algunas afecciones médicas causadas por la desregulación en el calcio, la acetilcolina, el TRP y el ADR, y la desregulación en los sistemas gastrointestinal, cardiovascular, neurológico, genitourinario e inmune.

[0050] "Condición médica", tal como se utiliza en la presente especificación, puede incluir (pero no se limita a): CFS o síntomas específicos del mismo; ME o síntomas específicos del mismo; GWS, IBS; MCS; rinitis no alérgica; fibromialgia; migraña; o artritis reumatoide. "Condición médica", tal como se utiliza en la presente especificación, también puede incluir (pero no se limita a) afecciones o síntomas causados por una desregulación del calcio (especialmente en relación con el CFS, ME, GWS, IBS, MCS, fibromialgia o migraña); causados por una desregulación de la acetilcolina (especialmente en relación con CFS, ME, GWS, IBS, MCS, fibromialgia o migraña); causados por una desregulación del TRP (especialmente en relación con CFS, ME, GWS, IBS, MCS, fibromialgia o migraña); causada por una desregulación de la ADR; causada por una desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular, neurológico, genitourinario e inmune (especialmente en relación con CFS, ME, GWS, IBS, MCS, rinitis no alérgica, fibromialgia o migraña).

[0051] Los síntomas específicos de CFS o ME incluyen: fatiga neuromuscular, en particular fatiga por esfuerzo; dificultades de memoria y concentración; dolor muscular y articular; alteración de la presión sanguínea, en particular síndrome de taquicardia ortostática postural; dolor de cabeza; desregulación inmunológica; dolor de garganta; inflamación de ganglios linfáticos/glándulas; síntomas gastrointestinales incluyendo IB, diarrea, estreñimiento y dolor abdominal; sensibilidades químicas; e intolerancias a fármacos y sustancias químicas.

[0052] Las afecciones médicas causadas por la desregulación del TRP se caracterizan por síntomas específicos o desregulación, entre los que se incluyen: deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la sensación de dolor; desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; síntomas respiratorios; y desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune (sensibilidades "alérgicas" inmunológicas).

[0053] Las afecciones médicas causadas por la desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular, neurológico, genitourinario e inmune (especialmente en lo que respecta a CFS, ME, GWS, IBS, MCS, fibromialgia o migraña) se caracterizan por síntomas o desregulaciones específicos, entre ellos deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la sensación de dolor; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; frecuencia o molestias urinarias; síntomas respiratorios; y sensibilidades "alérgicas" inmunológicas.

[0054] Por lo tanto, uno o más de esos SNP pueden usarse para identificar, examinar, diagnosticar o seguir sujetos con, o predispuestos a, esas condiciones médicas o síntomas de las mismas.

[0055] Además, se pueden utilizar una o más sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas basados en genes/alelos o productos genéticos del canal iónico TRP para identificar, examinar, diagnosticar, seguir o gestionar/tratar sujetos con, o predispuestos a, dichas afecciones médicas o síntomas de las mismas.

[0056] La invención proporciona un método para identificar a un sujeto en riesgo de desarrollar el síndrome de fatiga crónica (CFS) o diagnosticar a un sujeto que tiene CFS, dicho método comprende analizar una muestra biológica que se ha obtenido del sujeto para al menos un polimorfismo de nucleótido único (SNP) de al menos un gen de canal iónico de potencial receptor transitorio (TRP) que se sabe que se correlaciona con el CFS, en donde el SNP del gen de canal iónico TRP es rs12682832 (TRPM3), rs11142508 (TRPM3), rs655207 (TRPC4), o rs6650469 (TRPC4).

[0057] En otra realización preferida, la al menos una sonda, herramienta o reactivo es para ensayar la expresión de la proteína/polipéptido del canal iónico TRP en la superficie de células, preferiblemente células sanguíneas como células NK, T y/o B.

[0058] Definiciones

[0059] El término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia monocatenaria de bases ribonucleotídicas o desoxirribonucleotídicas, análogos conocidos de nucleótidos naturales o mezclas de los mismos. Un oligonucleótido comprende una molécula basada en ácido nucleico que incluye ADN, ARN, ARP, LNA, UNA o cualquier combinación de los mismos. Los oligonucleótidos suelen tener menos de unos 50 nucleótidos de longitud y pueden prepararse mediante síntesis química directa o clonación y restricción de las secuencias apropiadas.

[0060] El término "polinucleótido" se refiere a un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o análogos conocidos de nucleótidos naturales, o mezclas de los mismos. Un polinucleótido comprende una molécula basada en ácido nucleico que incluye ADN, ARN, ARP, LNA, UNA o cualquier combinación de los mismos. El término incluye la referencia a la secuencia especificada, así como a la secuencia complementaria de la misma, a menos que se indique lo contrario.

[0061] El término "polinucleótido" incluye las variantes modificadas químicamente, tal y como las conocen los expertos en la materia.

[0062] El término "complementario" se refiere a la capacidad de dos secuencias de nucleótidos monocatenarios para emparejarse, normalmente según las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Para que dos moléculas de nucleótidos sean complementarias, no es necesario que presenten una complementariedad del 100% en las regiones de emparejamiento de bases, sino que debe existir una complementariedad suficiente para que se produzca el emparejamiento de bases. De este modo, puede tolerarse cierto grado de desapareamiento entre las secuencias y las secuencias pueden seguir siendo complementarias.

[0063] "Ácido nucleico" como se usa aquí incluye 'polinucleótido', 'oligonucleótido', y 'molécula de ácido nucleico', y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster que se encuentra entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado.

[0064] Tal como se utiliza en este documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en (i). A efectos del presente documento, la replicación puede serin vitrooin vivo.

[0065] Los términos "aislado", "purificado" y "sustancialmente purificado" utilizados en el presente documento significan esencialmente libre de asociación con otros componentes/contaminantes biológicos, por ejemplo, como una proteína de origen natural que ha sido separada de contaminantes celulares y de otro tipo mediante el uso de anticuerpos u otros métodos o como un producto de purificación de un cultivo celular huésped recombinante.

[0066] "Sonda", tal como se utiliza en el presente documento, puede significar un oligonucleótido capaz de unirse a un ácido nucleico/ARN objetivo de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, normalmente a través del emparejamiento de bases complementarias, normalmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Las sondas pueden unirse a secuencias objetivo que carezcan de complementariedad completa con la secuencia de la sonda, dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Puede haber cualquier número de desapareamientos de pares de bases que interfieran con la hibridación entre la secuencia objetivo y los ácidos nucleicos monocatenarios descritos en el presente. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que no puede producirse hibridación ni siquiera en las condiciones de hibridación menos estrictas, la secuencia no es una secuencia objetivo complementaria. Una sonda puede ser monocatenaria o parcialmente monocatenaria y parcialmente bicatenaria. La orientación de cadena de la sonda está determinada por la estructura, la composición y las propiedades de la secuencia objetivo. Las sondas pueden estar marcadas directa o indirectamente, por ejemplo con biotina, a la que posteriormente puede unirse un complejo de estreptavidina. Las sondas pueden utilizarse para métodos de detección y diagnóstico, como se describe en el presente documento. Las sondas pueden fijarse o inmovilizarse a un sustrato o aparato sólido, como un biochip.

[0067] Por "objetivo", tal como se utiliza en el presente documento (si el contexto lo permite), puede entenderse un oligonucleótido o porciones o fragmentos del mismo, que pueden unirse a una o más sondas en condiciones de hibridación estrictas.

[0068] Sujeto

[0069] El sujeto puede ser cualquier mamífero. Los mamíferos son seres humanos, primates, ganado y animales de granja (caballos, ovejas y cerdos), animales de compañía (perros y gatos) y animales de laboratorio (ratas, ratones y conejos). El sujeto es preferiblemente humano.

[0070] Los sujetos humanos que tienen CFS y/o ME pueden definirse de acuerdo con la definición de caso del CDC Estadounidense de 1994 [26a] y en las siguientes citas [75a, 76a, 77a, 78a, 79a, 80a, 81a, 82a].

[0071] Los controles/sujetos no fatigados/sanos (por ejemplo, que no padecen CFS/ME) preferiblemente no tienen antecedentes médicos ni síntomas de fatiga o enfermedad persistente. También es preferible excluir de los sujetos humanos a personas fumadoras, embarazadas/en periodo de lactancia o inmóviles, o que padecieran trastornos autoinmunes, tiroideos o cardíacos antes de la aparición del CFS/ME.

[0072] Descripción general de las técnicas generales

[0073] Los pasos/técnicas de aislamiento de una muestra biológica de un sujeto, procesamiento de una muestra biológica, extracción de ADN genómico, extracción de ARN, extracción de polipéptidos, detección y caracterización de ADN, detección y caracterización de ARN, detección y caracterización de polipéptidos, secuenciación de ADN, análisis de secuencias de ADN, estudios de genotipado de SNP, localización e identificación de ARN, elaboración de perfiles de ARN, detección de ARN, secuenciación de ARN, análisis de secuencias de ARN, medición de un nivel de expresión de ARN, comparación de los niveles de expresión (expresión diferencial o desregulación) de un ARN, aislamiento de polipéptidos, secuenciación y caracterización de polipéptidos, medición de un nivel de expresión de polipéptidos, comparación de los niveles de expresión (expresión diferencial o desregulación) de un polipéptido, caracterización de la señalización disfuncional a través de la vía de la proteína cinasa activada por mitógeno de células (como PBMC o células NK), y detección de cambios en las vías de la cinasa dependiente del calcio pueden llevarse a cabo de cualquier forma adecuada.

[0074] Debe apreciarse que las metodologías generalmente descritas para los SNP, como la expresión diferencial o la caracterización del ARN o de la proteína o de la función de proteína, etc., pueden aplicarse igualmente a otras formas de la descripción, como la comprobación de cambios en el metabolismo del calcio, la comprobación de la señalización disfuncional a través de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno o la detección de cambios en las vías de la quinasa dependiente del calcio.

[0075] También debe apreciarse que las metodologías generalmente descritas para cualquier forma de la invención pueden ser igualmente aplicables a una o más formas de la invención.

[0076] Muestra biológica

[0077] Cualquier muestra biológica que comprenda ácido nucleico/un polinucleótido (por ejemplo, ADN genómico o ARN) del sujeto es adecuada para su uso en los métodos de la invención. La muestra biológica puede procesarse para aislar el ácido nucleico/polinucleótido. Alternativamente, pueden utilizarse células enteras u otras muestras biológicas sin aislar los ácidos nucleicos/polinucleótidos contenidos en ellas.

[0078] Cualquier muestra biológica que comprenda polipéptido/proteína del sujeto es adecuada para su uso en los métodos de la invención. La muestra biológica puede procesarse para aislar el polipéptido/proteína. Alternativamente, pueden utilizarse células enteras u otras muestras biológicas sin aislar el polipéptido/proteína nucleico contenido en ellas. La invención se refiere a una muestra que ha sido aislada de un sujeto. Cualquier forma de la invención se refiere a una muestra que ha sido aislada del sujeto y a la prueba de esa/esas. Por ejemplo, las pruebas para detectar diferencias en la expresión de genes/productos genéticos pueden implicar el aislamiento de más de una muestra biológica, incluso de diferentes tejidos de ese sujeto.

[0079] La muestra biológica puede ser cualquier muestra adecuada derivada del sujeto - obtenida de forma no invasiva o invasiva. Puede ser de origen celular, extracelular o ambos. Por ejemplo: 1. Células bucales (boca) se obtienen haciendo buches con enjuague bucal en la boca o frotando o cepillando el interior de la mejilla con un hisopo o cepillo; 2. Sangre - obtenida por punción en el dedo y recolección de las gotas (mancha de sangre seca) o por venopunción (sangre total); 3. Piel - obtenida mediante biopsia (punción); 4 Tejido orgánico - obtenido por biopsia; 5. Plasma -obtenido por fraccionamiento del plasma sanguíneo; 6. Orina - obtenida por micción; 7. Heces - obtenidas por muestra de heces; 8. Líquido cefalorraquídeo - obtenido por punción lumbar; y 9. Esputo: obtenido por expectoración o aspiración nasotraqueal.

[0080] Las técnicas de recolección de muestras biológicas son bien conocidas por los expertos.

[0081] En algunas realizaciones, la muestra biológica puede ser un biofluido como sangre, plasma, suero, otro aislado/componente sanguíneo, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo, leche o fluido ductal, y puede ser fresco, congelado o fijado. En algunas realizaciones preferidas, por ejemplo, el biofluido o la muestra biológica que comprende plasma o suero puede extraerse quirúrgicamente y preferiblemente por extracción, por ejemplo mediante agujas hipodérmicas o de otro tipo.

[0082] El biofluido típicamente contendrá al menos un SNP/gen/producto genético (ARN y/o polipéptido) de interés, y será relativamente estable.

[0083] En algunas realizaciones, se emplea la recolección de plasma. La obtención/extracción de plasma puede realizarse de cualquier forma adecuada, pero preferiblemente inmediatamente después de la extracción de sangre periférica. La obtención de plasma puede implicar un paso de centrifugación para separar el plasma de otros componentes sanguíneos, y el almacenamiento congelado de ese plasma.

[0084] En algunas realizaciones, se pueden obtener diferentes muestras biológicas de diferentes tejidos de un mismo sujeto. Descripción general de la detección de polimorfismos

[0085] La detección de un polimorfismo objetivo (SNP) en una muestra de polinucleótidos derivada de un individuo puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, la amplificación de una secuencia con cebadores específicos; la determinación de la secuencia de nucleótidos de la muestra de polinucleótidos; el análisis de hibridación; el análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple; la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante; la detección de escisión por desapareamiento; la secuenciación del exoma y similares. La detección de un polimorfismo objetivo también puede realizarse detectando una alteración en el nivel de un transcrito de ARN/ARNm del gen; una modificación aberrante del gen correspondiente, por ejemplo, un patrón de metilación aberrante; la presencia de un patrón de empalme de tipo no silvestre del transcrito/ARNm correspondiente; una alteración en el nivel de expresión o traducción del polipéptido correspondiente; una alteración en la longitud del polipéptido correspondiente; y/o una alteración en la actividad del polipéptido correspondiente.

[0086] Metodologías de detección de polimorfismos

[0087] Como se ha mencionado, la detección de un polimorfismo objetivo mediante el análisis de una muestra de polinucleótidos puede llevarse a cabo de varias maneras. Una muestra de ácido nucleico de prueba puede amplificarse con cebadores que amplifican una región que se sabe que comprende el(los) polimorfismo(s) objetivo(s). El ADN genómico o el ARNm pueden utilizarse directamente. Alternativamente, la región de interés puede clonarse en un vector adecuado y cultivarse en cantidad suficiente para el análisis. El ácido nucleico puede amplificarse mediante técnicas convencionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para obtener cantidades suficientes para el análisis. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en diversas publicaciones, entre ellas, por ejemplo, "PCR Protocols (Methods in Molecular Biology)" (2000) J. M.S. Bartlett y D. Stirling, eds, Humana Press; y "PCR Applications: Protocols for Functional Genomics" (1999) Innis, Gelfand y Sninsky, eds., Academic Press. Una vez amplificada la región que comprende un polimorfismo objetivo, éste puede detectarse en el producto de PCR mediante secuenciación nucleotídica, análisis de polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) o cualquier otro método conocido en la técnica. Al realizar el análisis SSCP, el producto PCR puede digerirse con una endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia dentro del producto PCR generado utilizando como plantilla una secuencia de referencia, pero no reconoce un producto PCR correspondiente generado utilizando como plantilla una secuencia variante en virtud del hecho de que la secuencia variante ya no contiene un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción.

[0088] La PCR también puede utilizarse para determinar si un polimorfismo está presente utilizando un cebador que sea específico para el polimorfismo. Tales métodos pueden comprender los pasos de recolectar de un sujeto una muestra biológica que comprende el material genético del sujeto como molde, opcionalmente aislar ácido nucleico molde (ADN genómico, ARNm, o ambos) de la muestra biológica, poner en contacto la muestra de ácido nucleico molde con uno o más cebadores que hibridan específicamente con una molécula de ácido nucleico polimórfica objetivo en condiciones tales que se produce la hibridación y amplificación de las moléculas de ácido nucleico molde en la muestra, y detectar la presencia, ausencia y/o cantidad relativa de un producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. La observación de un producto de amplificación del tamaño esperado es una indicación de que el polimorfismo objetivo contenido en el cebador polimórfico objetivo está presente en la muestra de ácido nucleico de prueba. Parámetros como las condiciones de hibridación, la longitud del cebador polimórfico y la posición del polimorfismo dentro del cebador polimórfico pueden elegirse de forma que la hibridación no se produzca a menos que un polimorfismo presente en el cebador o cebadores también esté presente en el ácido nucleico de la muestra. Los expertos en la materia saben muy bien cómo seleccionar y variar dichos parámetros. Véase, por ejemplo, Saiki et al. (1986) Nature 324:163; y Saiki et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6230.

[0089] Alternativamente, se conocen en la técnica diversos métodos que utilizan la ligadura de oligonucleótidos como medio para detectar polimorfismos. Véase, por ejemplo, Riley et al. (1990) Nucleic Acids Res.18:2887-2890; y Delahunty et al. (1996) Am. J. Hum. Genet.58:1239-1246.

[0090] En una reacción de amplificación puede incluirse una etiqueta detectable. Las etiquetas adecuadas incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Texas Red, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2’,7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), marcadores radiactivos, por ejemplo,<32>P,<35>S,<3>H; etc. La etiqueta puede ser un sistema de dos etapas, en donde el ADN amplificado se conjuga con biotina, haptenos, etc. que tienen un compañero de unión de alta afinidad, por ejemplo, avidina, anticuerpos específicos, etc., en donde el compañero de unión se conjuga con una etiqueta detectable. La etiqueta puede conjugarse con uno o ambos cebadores. Alternativamente, el agrupamiento de nucleótidos utilizado en la amplificación se etiqueta, de forma que se incorpora la etiqueta al producto de amplificación.

[0091] El ácido nucleico de la muestra puede secuenciarse mediante un método de terminación de cadena dideoxi u otros métodos bien conocidos. El ADN genómico o el ARNm pueden utilizarse directamente. Si se utiliza ARNm, puede hacerse primero una copia de ADNc. Si se desea, el ácido nucleico de la muestra puede amplificarse mediante una etapa de PCR. Pueden utilizarse diversas reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen pertinente, o una parte del mismo en la que se sabe que se produce un polimorfismo específico, y detectar polimorfismos comparando la secuencia del ácido nucleico de la muestra con un polinucleótido de referencia que contenga un polimorfismo objetivo. Se puede utilizar cualquiera de los diversos procedimientos automatizados de secuenciación. Véase, por ejemplo, WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Cromatografía 36:127-162.

[0092] La hibridación con la secuencia variante también puede utilizarse para determinar la presencia de un polimorfismo objetivo. El análisis de hibridación se puede realizar de diferentes maneras, incluidas, entre otras, transferencias Southern, transferencias Northern, transferencias puntuales, micromatrices, etc. El patrón de hibridación de una secuencia de control y variante a una matriz de sondas de oligonucleótidos inmovilizadas en un soporte sólido, como se describe en U.S.5.445.934, o en WO 95/35505, también puede utilizarse como medio para detectar la presencia de secuencias variantes. La identificación de un polimorfismo en una muestra de ácido nucleico puede realizarse hibridando una muestra y ácidos nucleicos de control a matrices de alta densidad que contengan cientos o miles de sondas de oligonucleótidos. Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244-255; y Kozal et al. (1996) Nature Med.2:753-759.

[0093] El análisis del polimorfismo conformacional de una única cadena (SSCP); la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE); la detección de escisión por desapareamiento; y el análisis de heterodúplex en matrices de gel también pueden utilizarse para detectar polimorfismos. Alternativamente, cuando un polimorfismo crea o destruye un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción (polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, RFLP), la muestra se digiere con esa endonucleasa, y los productos se fraccionan por tamaño para determinar si el fragmento fue digerido. El fraccionamiento se realiza mediante electroforesis en gel o capilar, en particular geles de acrilamida o agarosa. Las técnicas mencionadas son bien conocidas en la técnica. Se puede encontrar una descripción detallada de estas técnicas en diversas publicaciones, entre las que se incluyen, por ejemplo, "Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA" (1997) G. R. Taylor, ed., CRC Press, y las referencias citadas en ellas.

[0094] Detección de SNP

[0095] Como se ha mencionado anteriormente, se pueden utilizar varios métodos para determinar la presencia o ausencia de un SNP en un sujeto/muestra biológica. El genotipo se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis de micromatrices, secuenciación, extensión de cebadores, ligadura de oligonucleótidos específicos de alelos, determinación de masa de productos de extensión de cebadores, análisis de polimorfismos de longitud de restricción, análisis de polimorfismos conformacionales de cadena simple, pirosecuenciación, dHPLC o electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Además, una vez secuenciado el ácido nucleico de un sujeto o muestra, la información de la secuencia puede conservarse y buscarse posteriormente sin recurrir al propio ácido nucleico original. Así, por ejemplo, una alteración o mutación de secuencia puede identificarse escaneando una base de datos de información de secuencias utilizando un ordenador u otros medios electrónicos.

[0096] En general, las regiones de ácido nucleico que contienen los SNP de interés (regiones objetivo) se someten preferiblemente a una reacción de amplificación. Para la amplificación puede utilizarse cualquier técnica o método adecuado. En general, cuando se van a analizar múltiples SNP, es preferible amplificar simultáneamente todas las regiones objetivo correspondientes (que comprenden las variaciones de nucleótidos).

[0097] Algunas realizaciones de la invención pueden comprender la determinación de la unión de una sonda de oligonucleótido a una muestra genómica. La sonda puede comprender una secuencia de nucleótidos que se une específicamente a un SNP concreto. Pueden derivarse sondas oligonucleotídicas adecuadas basadas en el SNP y las secuencias nucleotídicas de cualquiera de las Tablas 1 a 7, 9, 10, 12 a 17, 26 a 28, y 34 a 36. La sonda oligonucleotídica puede incluir una etiqueta y la unión de la sonda puede determinarse detectando la presencia de la etiqueta.

[0098] Algunas realizaciones de la invención pueden comprender la hibridación de una, dos o más sondas oligonucleotídicas o cebadores con el ácido nucleico objetivo. Cuando el ácido nucleico es ADN bicatenario, la hibridación suele ir precedida de una desnaturalización para producir ADN monocatenario. La hibridación puede formar parte de un procedimiento de amplificación, por ejemplo PCR, o de un procedimiento de sondeo que no implique amplificación, por ejemplo PCR. Un ejemplo de procedimiento sería una combinación de PCR e hibridación de baja rigurosidad. Puede utilizarse cualquier procedimiento de detección adecuado para identificar los eventos de hibridación satisfactorios y el ácido nucleico hibridado aislado.

[0099] La unión de una sonda al ácido nucleico objetivo (por ejemplo ADN) puede medirse utilizando cualquiera de una variedad de técnicas. Por ejemplo, las sondas pueden ser radiactivas, fluorescentes o enzimáticas. Otros métodos que no emplean el etiquetado de la sonda incluyen el examen de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, la amplificación mediante PCR, la escisión con RNasa y el sondeo con oligonucleótidos específicos de alelos. El sondeo puede emplear la técnica estándar de Southern blotting. Por ejemplo, el ADN puede extraerse de las células y digerirse con diferentes enzimas de restricción. A continuación, los fragmentos de restricción pueden separarse por electroforesis en un gel de agarosa, antes de desnaturalizarlos y transferirlos a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada puede hibridarse con los fragmentos de ADN del filtro y determinarse la unión. El ADN para sondeo puede prepararse a partir de preparaciones de ARN de células. El destinatario experto puede determinar fácilmente la rigurosidad adecuada para la hibridación selectiva, la longitud del oligonucleótido, la composición de las bases y la temperatura.

[0100] Por ejemplo, las condiciones de hibridación selectiva adecuadas para oligonucleótidos de 17 a 30 bases incluyen hibridación durante la noche a 42°C en 6X SSC y lavado en 6X SSC en series de temperaturas crecientes de 42°C a 65°C. Otras condiciones y protocolos adecuados se describen en Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

[0101] Un oligonucleótido para uso en amplificación de ácido nucleico puede tener unos 30 o menos nucleótidos de longitud (por ejemplo, 18, 20, 22, 24 o 26). Por lo general, los cebadores específicos tienen una longitud superior a 14 nucleótidos. Los expertos en la materia conocen bien el diseño de cebadores para su uso en procesos como PCR. Varias técnicas para sintetizar cebadores de oligonucleótidos son bien conocidas en la técnica, incluyendo métodos de síntesis de fosfotriester y fosfodiester.

[0102] El ácido nucleico también puede detectarse utilizando una sonda específica de variante o alelo. Dicha sonda puede corresponder en secuencia a una región de ácido nucleico genómico, o su complemento, que contenga uno o más de los SNP de interés. En condiciones convenientemente estrictas, la hibridación específica de dicha sonda con el ácido nucleico de prueba es indicativa de la presencia de la alteración de secuencia en el ácido nucleico de prueba. Para una detección eficaz, se puede utilizar más de una sonda en la misma muestra de prueba.

[0103] El ácido nucleico en una muestra de prueba, que puede ser una muestra genómica o una región amplificada de la misma, puede secuenciarse para identificar o determinar la identidad de un alelo polimórfico. Por lo tanto, el alelo del SNP en el ácido nucleico de prueba puede compararse con el SNP descrito en el presente documento para determinar si el ácido nucleico de prueba contiene uno o más alelos asociados con la condición médica o su síntoma.

[0104] Ya que generalmente no será eficiente en tiempo o trabajo secuenciar todo el ácido nucleico en una muestra de prueba, una reacción de amplificación específica como PCR usando uno o más pares de cebadores puede ser empleada para amplificar la región de interés en el ácido nucleico, por ejemplo la región particular en la que ocurren los SNP de interés. A continuación, el ácido nucleico amplificado puede secuenciarse como se ha indicado anteriormente, y/o analizarse de cualquier otro modo para determinar la presencia o ausencia de un nucleótido concreto. El ácido nucleico para las pruebas puede prepararse a partir de ácido nucleico extraído de células o en una biblioteca mediante otras técnicas, como la digestión con enzimas de restricción y la electroforesis.

[0105] La secuenciación de un producto amplificado puede implicar la precipitación con isopropanol, resuspensión y secuenciación utilizando un kit de secuenciación TaqFS+ Dye terminator. Los productos de extensión se pueden electroforizar en un secuenciador de ADN ABI 377 y los datos se analizan con el software Sequence Navigator. El ácido nucleico de una muestra de prueba puede sondearse en condiciones de hibridación selectiva y/o someterse a una reacción específica de amplificación del ácido nucleico, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (revisada, por ejemplo, en "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. lnnis et al, 1990, Academic Press, Nueva York, Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51 :263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, y Ehrlich et al, Science, 252:1643-1650, (1991)). La PCR comprende los pasos de desnaturalización del ácido nucleico molde (si es bicatenario), el recocido del cebador con el objetivo y la polimerización. El ácido nucleico sondado o utilizado como molde en la reacción de amplificación puede ser ADN genómico, ADNc o ARN.

[0106] Otras técnicas específicas de amplificación de ácidos nucleicos incluyen la activación por desplazamiento de cadena, el sistema de replicasa QB, la reacción en cadena de reparación, la reacción en cadena de ligasa, la amplificación por círculo rodante y la transcripción activada por ligadura. Los métodos de la presente invención pueden, por tanto, comprender la amplificación de la región en dicha muestra genómica que contiene la una o más posiciones de polimorfismo de nucleótido único de interés.

[0107] Los oligonucleótidos alelo-específicos pueden usarse en PCR para amplificar específicamente secuencias particulares si están presentes en una muestra de prueba. La evaluación de si una banda de PCR contiene una variante genética puede llevarse a cabo de varias formas conocidas por los expertos en la materia. El producto de la PCR puede, por ejemplo, tratarse de forma que permita visualizar el polimorfismo en un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida desnaturalizante, seleccionando bandas específicas vinculadas a las variantes genéticas.

[0108] En algunas realizaciones, la región de la muestra genómica que comprende un polimorfismo puede amplificarse utilizando un par de cebadores oligonucleotídicos, de los cuales el primer miembro del par comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia complementaria que es proximal a y 5' de la posición del polimorfismo de nucleótido único, y el segundo miembro del par de cebadores comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia complementaria proximal y 3' de la posición del polimorfismo de nucleótido único.

[0109] En otras realizaciones, el primer miembro del par de cebadores oligonucleotídicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia complementaria proximal a 5' o 3' del polimorfismo, y el segundo miembro del par puede comprender una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones estrictas con un alelo particular del polimorfismo y no con otros alelos, de modo que la amplificación sólo se produce en presencia del alelo particular.

[0110] Otro aspecto de la presente descripción proporciona un par de cebadores de amplificación de oligonucleótidos. Un par adecuado de cebadores de amplificación de acuerdo con este aspecto puede tener un primer miembro que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia complementaria que es proximal a y 5' de un polimorfismo de nucleótido único y un segundo miembro que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia complementaria que es proximal a y 3' del polimorfismo de nucleótido único.

[0111] El alelo del al menos un polimorfismo (es decir, la identidad del nucleótido en la posición del polimorfismo de nucleótido único) puede entonces determinarse determinando la unión de una sonda de oligonucleótido a la región amplificada de la muestra genómica. Una sonda oligonucleotídica adecuada comprende una secuencia de nucleótidos que se une específicamente a un alelo particular del al menos un polimorfismo y no se une específicamente a otros alelos del al menos un polimorfismo.

[0112] Otros pares adecuados de cebadores de amplificación pueden tener un primer miembro que comprenda una secuencia de nucleótidos que hibride con una secuencia complementaria proximal y 5' o 3' de un polimorfismo de nucleótido único y un segundo miembro del par que comprenda una secuencia de nucleótidos que hibride en condiciones estrictas con un alelo particular del polimorfismo y no con otros alelos, de modo que la amplificación sólo se produzca en presencia del alelo particular.

[0113] El destinatario experto puede preparar fácilmente cebadores de PCR adecuados para la amplificación de regiones objetivo de ADN que comprenden los SNP de la invención. Otro aspecto de la presente descripción proporciona un oligonucleótido que se hibrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico que comprende un alelo particular de un polimorfismo de la invención, y no se une específicamente a otros alelos del SNP. La hibridación puede determinarse en condiciones de hibridación selectiva adecuadas, tal como se describe en el presente documento. Tales oligonucleótidos pueden utilizarse en un método de detección de ácido nucleico.

[0114] En algunas realizaciones preferidas, los oligonucleótidos de acuerdo con la presente descripción tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden tener hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, más preferiblemente hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. El valor límite «aproximadamente X nucleótidos" utilizado anteriormente incluye el valor límite "X nucleótidos".

[0115] Pueden emplearse enfoques que se basan en la hibridación entre una sonda y el ácido nucleico de prueba y la posterior detección de un desapareamiento. En condiciones adecuadas (temperatura, pH, etc.), una sonda de oligonucleótidos se hibridará con una secuencia que no sea totalmente complementaria. El grado de emparejamiento de bases entre las dos moléculas será suficiente para que se recuezan a pesar de un desapareamiento. Son bien conocidos en la técnica diversos enfoques para detectar la presencia de un desapareamiento entre dos moléculas de ácido nucleico de recocido. Por ejemplo, la RNasa A se escinde en el lugar de un desapareamiento. La escisión se puede detectar mediante una electroforesis del ácido nucleico de prueba al que se ha unido la sonda o sonda relevante y buscando moléculas más pequeñas (es decir, moléculas con mayor movilidad electroforética) que el híbrido sonda/prueba de longitud completa.

[0116] El análisis del genotipo puede realizarse mediante análisis de micromatrices. Puede utilizarse cualquier tecnología de micromatrices adecuada. Preferiblemente, se utiliza la metodología descrita en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/IB2006/00796, presentada el 12 de enero de 2006. Esta tecnología utiliza una matriz de ADN de baja densidad y la hibridación con sondas de oligonucleótidos específicas de cada alelo para detectar SNP.

[0117] Típicamente en esta tecnología, las regiones de ácido nucleico que contienen los SNP de interés (regiones objetivo) pueden ser sometidas a una reacción de amplificación. Para la amplificación puede utilizarse cualquier técnica o método adecuado. En general, cuando se van a analizar múltiples SNP, es preferible amplificar simultáneamente todas las regiones objetivo correspondientes (que comprenden las variaciones).

[0118] Por ejemplo, se puede llevar a cabo una PCR multiplex, utilizando pares apropiados de cebadores PCR oligonucleótidos. Puede utilizarse cualquier par adecuado de cebadores que permita la amplificación específica de una región objetivo. En un aspecto, los cebadores permiten la amplificación en el menor número posible de reacciones de PCR.

[0119] Después de la amplificación, el ácido nucleico amplificado puede ser fragmentado, por ejemplo, mediante digestión con una nucleasa adecuada como la ADNasa I. Normalmente, el ADN amplificado (opcionalmente fragmentado) se etiqueta a continuación. Las etiquetas adecuadas son conocidas en la técnica.

[0120] Una micromatriz comprende típicamente una pluralidad de sondas depositadas sobre un soporte sólido. En general, el soporte sólido comprende sondas oligonucleotídicas adecuadas para la discriminación entre posibles nucleótidos en cada variable SNP que se determine en el método. La micromatriz también suele incluir controles positivos y/o negativos adicionales.

[0121] Típicamente, para un SNP con los posibles alelos A y B, habrá al menos una sonda capaz de hibridar específicamente con el alelo A (sonda 1) y una sonda capaz de hibridar específicamente con el alelo B (sonda 2) en las condiciones de hibridación seleccionadas. Estas sondas forman un par de sondas. Normalmente, las sondas pueden utilizarse para discriminar entre A y B (por ejemplo, los alelos de tipo silvestre y mutante). Las sondas pueden examinar tanto la cadena sentido como la antisentido. Normalmente, las sondas 1 y 2 examinan la misma cadena de ácido nucleico (por ejemplo, la cadena sentido o la cadena antisentido), aunque en algunos casos las sondas pueden examinar cadenas diferentes. En un aspecto las sondas 1 y 2 tienen la misma secuencia excepto por el sitio de la variación genética. En un caso, las sondas de un par de sondas tienen la misma longitud. En algunos aspectos, cuando se proporcionan dos o más pares de sondas para el análisis de una variación genética, las sondas pueden tener todas la misma longitud.

[0122] Preferiblemente se proporciona más de un par de sondas para la detección de cada variación genética. Así, se pueden proporcionar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más pares de sondas por variación genética. En un aspecto, se proporcionan (al menos) 2 pares de sondas. El objetivo es reducir la tasa de falsos positivos y negativos en los métodos actuales.

[0123] Por ejemplo, para una variación genética dada puede haber:

[0124] Sonda 1 capaz de hibridar con la variación genética A (por ejemplo, un alelo normal)

[0125] Sonda 2 capaz de hibridar con la variación genética B (por ejemplo, un alelo mutante)

[0126] Sonda 3 capaz de hibridar con la variación genética A (por ejemplo, un alelo normal)

[0127] Sonda 4 capaz de hibridar con la variación genética B (por ejemplo, un alelo mutante).

[0128] Las sondas pueden examinar la misma cadena o cadenas diferentes. Así, en una realización, las sondas 3 y 4 son las sondas complementarias de las sondas 1 y 2 respectivamente y están diseñadas para examinar la cadena complementaria. En un aspecto se prefiere que las sondas proporcionadas para la detección de cada variación genética examinen ambas cadenas.

[0129] Se pueden proporcionar más de 2 pares de sondas para el análisis de una variación genética como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, cuando una variación genética existe como una cualquiera de 4 bases en la misma cadena (por ejemplo, hay tres posibilidades mutantes), se puede proporcionar al menos un par de sondas para detectar cada posibilidad. Preferiblemente, se proporcionan al menos 2 pares de sondas para cada posibilidad.

[0130] Se conocen varios métodos en la técnica para diseñar sondas de oligonucleótidos adecuadas para su uso en chips de ADN. Se trata de "traslape estándar", "traslape alternativo", "traslape en bloque" y "traslape en bloque alternativo". Cualquiera de estas estrategias puede utilizarse para diseñar sondas para la presente invención. Preferiblemente se utiliza el mosaico estándar, en particular con 2 pares de sondas, por ejemplo 2 pares de sondas complementarias como se ha indicado anteriormente. Por lo tanto, es preferible que la secuencia de oligonucleótidos sea complementaria al ADN objetivo o a la secuencia en las regiones que flanquean al nucleótido o nucleótidos variables. Sin embargo, en algunos casos, pueden introducirse uno o más desapareamientos. Las sondas de oligonucleótidos para su uso en la presente invención presentan típicamente la base a examinar (el sitio de la variación genética) en el centro del oligonucleótido.

[0131] En general las sondas para uso en la presente invención comprenden o en algunas realizaciones consisten (esencialmente) de 17 a 27 nucleótidos, por ejemplo, 19, 21, 23, o 25 nucleótidos o 18, 20, 22, 24 o 26 nucleótidos. Las sondas proporcionadas para la detección de cada variación genética (como se ha descrito anteriormente) suelen ser capaces de discriminar entre las variantes genéticas A y B (por ejemplo, los alelos normales y mutantes) en las condiciones de hibridación seleccionadas. Preferiblemente, la capacidad de discriminación de las sondas es sustancialmente del 100%. Si la capacidad de discriminación no es del 100%, es preferible rediseñar las sondas. Preferiblemente, la temperatura de fusión de los complejos sonda/destino se sitúa en el intervalo de 75-85°C.

[0132] En general las sondas se suministran sobre el soporte en réplica. Típicamente, se proporcionan al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 réplicas de cada sonda, en particular, 6, 8 o 10 réplicas. Así, por ejemplo, el soporte (o chip de ADN) puede comprender o incluir 10 réplicas para cada una de (al menos) 4 sondas utilizadas para detectar cada variación genética (es decir, 40 sondas). Alternativamente, el soporte (o chip de ADN) puede comprender o incluir 8 réplicas para cada una de (al menos) 4 sondas utilizadas para detectar cada variación genética (es decir, 32 sondas). Además, el soporte (o chip de ADN) puede comprender o incluir 6 réplicas para cada una de las (al menos) 4 sondas utilizadas para detectar cada variación genética (es decir, 24 sondas). En general, el soporte también comprende una o más sondas oligonucleotídicas de control que son útiles como controles positivos y/o negativos de las reacciones de hibridación. También se proporcionan en réplica, como en el caso anterior.

[0133] Típicamente, el chip o matriz incluirá sondas de control positivo, por ejemplo, sondas que se sabe que son complementarias e hibridables a secuencias en las moléculas polinucleotídicas objetivo, sondas que se sabe que hibridan a un ADN de control externo, y sondas de control negativo, por ejemplo, sondas que se sabe que no son complementarias e hibridables a secuencias en las moléculas polinucleotídicas objetivo. El chip puede tener uno o más controles específicos para cada objetivo, por ejemplo, 2, 3 o más controles. También puede haber al menos un control para la matriz.

[0134] Las sondas de control positivo se diseñan generalmente para hibridar por igual con todas las muestras de ADN objetivo y proporcionan una intensidad de señal de referencia con la que se puede comparar la hibridación del ADN objetivo (muestra) con las sondas de prueba. Los controles negativos comprenden "blancos" donde sólo se ha aplicado solvente (DMSO) al soporte u oligonucleótidos de control que se han seleccionado para que no muestren hibridación, o sólo una hibridación mínima, con el ADN objetivo, por ejemplo humano (el ADN de prueba). La intensidad de cualquier señal detectada en las características del oligonucleótido blanco o de control negativo es una indicación de interacciones no específicas entre el ADN de la muestra y la matriz y, por lo tanto, es una medida de la señal de fondo con respecto a la cual debe discriminarse la señal de las interacciones reales entre la sonda y la muestra.

[0135] Deseablemente, el número de secuencias en la matriz será tal que donde el número de ácidos nucleicos adecuados para la detección de variaciones genéticas es n, el número de ácidos nucleicos de control positivo y negativo es n', donde n' es típicamente de 0.01 a 0.4n.

[0136] Un ejemplo de chip/micromatriz de ADN que puede utilizarse es Fibrochip.

[0137] Un Fibro-chip comprende sondas de oligonucleótidos adecuadas para la detección de algunas o todas las variaciones genéticas (SNP).

[0138] En general, una matriz comprende un soporte o superficie con una matriz ordenada de sitios de unión (por ejemplo, hibridación) o sondas. Cada sonda (es decir, cada réplica de sonda) está ubicada en una posición predeterminada conocida en el soporte sólido, de modo que la identidad (es decir, la secuencia) de cada sonda puede determinarse a partir de su posición en la matriz. Preferiblemente, las sondas depositadas sobre el soporte, aunque mantienen una disposición predeterminada, no se agrupan por variación genética sino que tienen una distribución aleatoria. Normalmente, tampoco se agrupan dentro de la misma variación genética. Si se desea, esta distribución aleatoria puede ser siempre la misma. Las sondas pueden disponerse sobre el soporte en submatrices.

[0139] El soporte sobre el que se deposita la pluralidad de sondas puede ser cualquier soporte sólido al que puedan unirse oligonucleótidos. Por ejemplo, dicho soporte puede ser de un material no poroso, por ejemplo, vidrio, silicona, plástico, o de un material poroso como una membrana o filtro (por ejemplo, nylon, nitrocelulosa) o un gel. En una realización, dicho soporte es un soporte de vidrio, como un portaobjetos de vidrio.

[0140] Las sondas pueden fijarse al soporte mediante técnicas convencionales de inmovilización de oligonucleótidos en la superficie de los soportes.

[0141] En una realización, el soporte es un portaobjetos de vidrio y en este caso, las sondas, en el número de réplicas establecidas (por ejemplo, 6, 8 o 10) se imprimen en portaobjetos de vidrio pretratados, por ejemplo recubiertos con aminosilanos, utilizando equipos para la producción automatizada de chips de ADN por deposición de los oligonucleótidos en los portaobjetos de vidrio ("micro-arrayer"). La deposición se realiza en condiciones adecuadas, por ejemplo, mediante reticulación con radiación ultravioleta y calentamiento (80°C), manteniendo la humedad y controlando la temperatura durante el proceso de deposición, normalmente a una humedad relativa de entre el 40-50% y normalmente a una temperatura de 20°C.

[0142] Las sondas replicadas se distribuyen uniformemente entre las áreas o sectores (submatrices), que típicamente constituyen un chip de ADN. El número de réplicas y su distribución uniforme por el chip de ADN minimiza la variabilidad derivada del proceso de impresión que puede afectar a los resultados experimentales. Asimismo, pueden imprimirse controles de hibridación positivos y negativos (como se describe en el presente documento).

[0143] Para controlar la calidad del proceso de fabricación del chip de ADN, en términos de señal de hibridación, ruido de fondo, especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de cada réplica, así como las diferencias causadas por las variaciones en la morfología de las características de la sonda manchada después de la impresión, se puede utilizar un ADN comercial. Por ejemplo, como control de calidad de la impresión de los chips de ADN, la hibridación puede llevarse a cabo con un ADN comercial (por ejemplo, ADN k562 de Alto Peso Molecular, Promega).

[0144] En general, los métodos para utilizar micromatrices para genotipado son conocidos en la técnica.

[0145] En un aspecto, los datos de los presentes micromatrices pueden analizarse y utilizarse para determinar el genotipo de acuerdo con los métodos de la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/IB2006/00796 presentada el 12 de enero de 2006. Normalmente, después de la amplificación del ADN objetivo y la fragmentación opcional (por ejemplo, mediante digestión con DNasa I), el ADN objetivo se etiqueta como se describe en el presente documento.

[0146] A continuación, el ADN marcado puede hibridarse con una micromatriz en condiciones de hibridación adecuadas que pueden ser determinadas por el experto. Por ejemplo, puede utilizarse una estación de hibridación automática. En general, la micromatriz se escanea y se determinan las intensidades de la etiqueta en las posiciones específicas de la sonda para determinar qué alelo está presente en el ADN objetivo hibridado en la matriz.

[0147] En un aspecto, después de la hibridación, la intensidad de la señal de la etiqueta se detecta en cada posición de la sonda en la micromatriz para determinar el grado de hibridación en cada posición. Esto puede hacerse por cualquier medio adecuado para detectar y cuantificar la etiqueta dada. Por ejemplo, las etiquetas fluorescentes pueden cuantificarse utilizando un escáner confocal de fluorescencia.

[0148] Este valor de intensidad de señal es típicamente corregido para eliminar el ruido de fondo por medio de controles en la matriz. Cuando una micromatriz incluye pares de sondas y réplicas de sondas como se describe en el presente documento, puede calcularse una media de la señal de hibridación para cada sonda (basada en las señales de las réplicas de sondas). La relación entre la media de la señal de hibridación del alelo A y la suma de las medias de las señales de hibridación de los alelos A y B puede definirse entonces para cada par de sondas utilizado para el genotipado de cada SNP (relaciones 1 y 2).

[0149] Los 2 valores de proporción correspondientes a cada uno de los 3 genotipos posibles (AA, AB y BB) pueden calcularse utilizando ADN objetivo de individuos control de cada genotipo identificados previamente mediante, por ejemplo, análisis de secuencias (al menos 10 por genotipo).

[0150] Mediante la comparación de los resultados del ADN de prueba con las proporciones de control, se puede asignar un genotipo a un individuo de prueba. Esto puede hacerse utilizando el software MG 1,0.

[0151] Como se ha mencionado anteriormente, el genotipado también puede llevarse a cabo utilizando métodos de secuenciación. Típicamente, el ácido nucleico que comprende los SNP de interés se aísla y amplifica como se describe en el presente documento. Los cebadores complementarios a la secuencia objetivo se diseñan de forma que se encuentren a una distancia adecuada (por ejemplo, 50-400 nucleótidos) del polimorfismo. A continuación, se realiza la secuenciación mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse utilizando un software que tiene como objetivo seleccionar la(s) secuencia(s) dentro de una ventana apropiada que tengan valores de Tm adecuados y no posean una estructura secundaria o que se hibriden con una secuencia no objetivo.

[0152] Referencias adicionales que describen varios protocolos para detectar la presencia de un polimorfismo objetivo incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: Patentes Estadounidenses Nos. 6.703.228; 6.692.909; 6.670.464; 6.660.476; 6.653,079; 6.632.606; 6.573,049.

[0153] Secuenciación del exoma

[0154] Los SNP pueden identificarse y caracterizarse mediante secuenciación del exoma. La secuenciación del exoma (también conocida como secuenciación del exoma completo o WES) es una técnica para secuenciar todos los genes codificantes de proteínas de un genoma (conocido como exoma). Consiste en seleccionar primero sólo el subconjunto de ADN que codifica proteínas (conocido como exones) y, a continuación, secuenciar ese ADN utilizando cualquier tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento. A continuación se describen brevemente distintas técnicas de enriquecimiento de objetivos:

[0155] PCR- La PCR es una tecnología para amplificar secuencias específicas de ADN. Utiliza un fragmento de ADN monocatenario como punto de partida para la amplificación del ADN. La PCR uniplex utiliza sólo un punto de partida (cebador) para la amplificación y la PCR multiplex utiliza varios cebadores.

[0156] Sondas de inversión molecular (MIP) - Las sondas de inversión molecular utilizan sondas de oligonucleótidos de ADN monocatenario flanqueadas por extremos específicos del objetivo. Los huecos entre las secuencias flanqueantes se rellenan y se ligan para formar un fragmento circular de ADN. Las sondas que no han reaccionado permanecen lineales y se eliminan mediante exonucleasas.

[0157] Captura híbrida - Las micromatrices contienen oligonucleótidos monocatenarios con secuencias del genoma humano para traslapar la región de interés fijada a la superficie. El ADN genómico se cizalla para formar fragmentos de doble cadena. Los fragmentos se someten a una reparación final para producir extremos romos y se añaden adaptadores con secuencias de cebado universales. Estos fragmentos se hibridan con oligos en la micromatriz. Los fragmentos no hibridados se lavan y se eluyen los fragmentos deseados. A continuación, los fragmentos se amplifican mediante PCR.

[0158] Captura en solución - Para capturar regiones genómicas de interés mediante captura en solución, se sintetiza un conjunto de oligonucleótidos personalizados (sondas) y se hibrida en solución con una muestra de ADN genómico fragmentado. Las sondas (marcadas con microesferas) se hibridan selectivamente con las regiones genómicas de interés, tras lo cual las microesferas (que ahora incluyen los fragmentos de ADN de interés) se pueden retirar y lavar para eliminar el exceso de material. A continuación, se retiran las perlas y se pueden secuenciar los fragmentos genómicos, lo que permite la secuenciación selectiva del ADN de regiones genómicas (por ejemplo, exones) de interés.

[0159] Secuenciación - Las plataformas de secuenciación incluyen la clásica secuenciación Sanger, el secuenciador Roche 454, el Illumina Genome Analyzer II y el Life Technologies SOLiD & Ion Torrent - todos los cuales han sido utilizados para la secuenciación del exoma.

[0160] Tipos de secuenciación: Secuenciación Sanger; secuenciación SNP del exoma; pirosecuenciación; secuenciación de ARN; y, secuenciación de proteínas.

[0161] Metodologías de detección del nivel de expresión

[0162] Pueden realizarse estudios bioquímicos para determinar si un polimorfismo de secuencia en una región codificante o región de control de interés está asociado con la condición médica. Los polimorfismos asociados a la condición pueden incluir la eliminación o truncamiento del gen, mutaciones que alteran el nivel de expresión, que afectan a la actividad del polipéptido, etc.

[0163] Existen varios métodos para determinar el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico polimórfica, por ejemplo, ARN/ARNm o un polipéptido polimórfico (proteína) en una muestra particular. El diagnóstico puede realizarse mediante un número de métodos para determinar la ausencia o presencia o cantidades alteradas de ARN/ARNm o polipéptido normal o anormal en una muestra del paciente.

[0164] Caracterización de la expresión del ARN

[0165] Los métodos de la descripción del objeto en los que el nivel de expresión génica (polimórfica) es de interés típicamente implicarán la comparación de la abundancia de ácido nucleico relevante de una muestra de interés con la de un valor de control para determinar cualquier diferencia relativa, donde la diferencia puede medirse cualitativa y/o cuantitativamente, cuyas diferencias se relacionan entonces con la presencia o ausencia de un patrón de expresión génica anormal.

[0166] Una variedad de métodos diferentes para determinar la abundancia de ácido nucleico en una muestra son conocidos por los expertos en la materia, donde los métodos particulares de interés incluyen los descritos en: Pietu et al., Genome Res. (junio de 1996) 6:492-503; Zhao et al., Gene (24 de abril de 1995) 156: 207-213; Soares , Curr. Opin. Biotechnol. (octubre de 1997) 8: 542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (noviembre de 1994) 32: 125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (febrero z, 1994) 216: 299-304; Stolz & Tuan, MoI. Biotechnol. (diciembre de 199606: 225-230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2: 907; y McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143: 298, También son interesantes los métodos descritos en el documento WO 97/27317.

[0167] Las técnicas de manipulación del ARN se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias, cuyo contenido íntegro se incorpora al presente documento:

[0168] PureLink (Invitrogen), reactivo Trizol (Invitrogen), Stratagene (ARN total y ARN pequeño), TRI-Reagent (Sigma-Aldrich), Nucleospin (Machery-Nagel) y RNA-Bee (Tel-test). Referencia [89a].

[0169] El grado en que difiere la expresión del ARN sólo tiene que ser lo suficientemente grande como para cuantificarlo mediante técnicas de caracterización estándar como matrices de expresión, RT-qPCR, análisis Northern y protección de RNasa.

[0170] Pruebas de blotting e hibridación: [103a.104a].

[0171] Micromatrices: [105a].

[0172] Pruebas de nueva generación que cubren todas las plataformas: [107a].

[0173] Diferentes formas de ensayar la expresión: PCR en tiempo real, Affymetrix, Agilent, Illumina y Nanostring.

[0174] Métodos de elaboración de perfiles: micromatriz Agilent, matriz exiqon, micromatriz exiqon, matriz miRCURY LNA ncode, matriz LC Sciences, matriz ABI Taqman, affymetrix, matriz illumine, secuenciación de ligadura SOLiD, ensayo Illumina HiSeq y TaqMan miR.

[0175] Herramientas o reactivos para el ensayo de expresión diferencial de ARN: sondas verdes SYBR y sondas TaqMan. Detección de ligadura ferulizada radiomarcada: [110a, 111a].

[0176] Preferiblemente, para uno o más métodos de la invención de la descripción, el nivel de expresión de ARN o expresión diferencial puede llevarse a cabo utilizando: Análisis Northern y una sonda que se une específicamente al ARN; protección con RNasa; o, transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) usando uno o más oligonucleótidos/primers que amplificarán el ARN transcrito. Se puede utilizar un cebador universal en combinación con uno o más oligonucleótidos/cebadores que amplificarán el ARN transcrito. Preferiblemente, se utiliza RT-qPCR. Preferiblemente, el/los método/s pueden comprender el paso de análisis estadístico para identificar la expresión diferencial.

[0177] En algunas realizaciones, el ARN puede extraerse del plasma utilizando un kit disponible comercialmente. El tamaño, la cantidad y la calidad del ARN extraído pueden evaluarse utilizando un chip de ARN pequeño en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

[0178] El perfilado y la secuenciación del ARN pueden llevarse a cabo de cualquier forma adecuada. Se utiliza preferiblemente la secuenciación de alto rendimiento (HTS). Las bibliotecas de ARN pueden construirse utilizando el kit TruSeq Small RNA Sample Preparation (Illumina, San Diego, CA). Las muestras de ARN pueden ligarse con adaptadores 5' y 3', seguidos de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para la construcción de bibliotecas de ADNc y la incorporación de etiquetas de índice. Los fragmentos de la biblioteca de ADNc pueden separarse y fraccionarse por tamaño. Las muestras de la biblioteca de ADNc pueden agruparse en cantidades equimolares y utilizarse para la generación de clusters y el análisis de secuencias.

[0179] Los datos de secuencias generados pueden analizarse de cualquier forma adecuada. En algunas realizaciones, se pueden generar secuencias FASTQ sin procesar.

[0180] En algunas realizaciones, la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) puede utilizarse para la expresión y comparación.

[0181] Caracterización de polipéptidos

[0182] Se pueden buscar polimorfismos a nivel proteico. El detección de mutaciones en un polipéptido polimórfico puede basarse en las características funcionales o antigénicas de la proteína. Los pruebas funcionales incluyen pruebas de unión a cofactores, pruebas de actividad enzimática, pruebas de unión a sustratos o pruebas de expresión de superficie. Por ejemplo, los pruebas de truncamiento de proteínas son útiles para detectar deleciones que puedan afectar a la actividad biológica de la proteína. La actividad del polipéptido polimórfico codificado puede determinarse por comparación con un polipéptido de referencia que carezca de un polimorfismo específico. Alternativamente, la estructura tridimensional de la proteína puede ensayarse, por ejemplo mediante polarización de fluorescencia o espectroscopia de dicroísmo circular, en donde la estructura tridimensional del polipéptido polimórfico codificado puede determinarse por comparación con la proteína purificada portadora del alelo opuesto del polimorfismo.

[0183] Alternativamente, pueden utilizarse varios inmunoensayos diseñados para detectar polimorfismos en polipéptidos polimórficos. La ausencia o presencia de unión de anticuerpos a un polipéptido polimórfico puede determinarse por diversos métodos, como la citometría de flujo de células disociadas, la microscopía, la radiografía, el recuento por centelleo, etc. La inmunocitoquímica y la citometría de flujo, en particular la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), pueden utilizarse para evaluar la expresión de proteínas en la superficie de las células, incluidos los distintos tipos de células sanguíneas.

[0184] Se pueden encontrar descripciones detalladas de cómo hacer anticuerpos, incluyendo anticuerpos que son específicos para epítopos, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos simples dentro de epítopos, en una variedad de publicaciones, incluyendo, por ejemplo "Making and using Antibodies: A Practical Handbook" (2006) G.C. Howard and M.R. Kaser, eds. CRC Press; "Antibody Engineering: Methods and Protocols" (2004) B.K.C. Lo, ed, Humana Press; y US Patent No.6,054.632, cuya descripción se incorpora en el presente documento por referencia.

[0185] Los métodos para realizar la secuenciación de proteínas incluyen: Degradación de Edman; huella de masa peptídica; espectrometría de masas; y, digestiones de proteasas. Por ejemplo, la detección puede utilizar la tinción de células o secciones histológicas con anticuerpos marcados, realizada de acuerdo con métodos convencionales. Las células se permeabilizan para teñir las moléculas citoplasmáticas. Los anticuerpos de interés se añaden a la muestra celular y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión al epítopo, normalmente al menos aproximadamente 10 minutos. El anticuerpo puede etiquetarse con radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes u otras etiquetas para su detección directa. Alternativamente, se utiliza un anticuerpo o reactivo de segunda etapa para amplificar la señal. Tales reactivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede conjugarse con biotina, añadiéndose avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante como reactivo de segunda etapa. Alternativamente, el anticuerpo secundario conjugado con un compuesto fluorescente, por ejemplo fluoresceína, rodamina, rojo Texas, etc. La detección final utiliza un sustrato que se somete a un cambio de color en presencia de la peroxidasa.

[0186] La ausencia o presencia de unión de anticuerpos puede determinarse por varios métodos, incluyendo citometría de flujo de células disociadas, microscopía, radiografía, recuento de centelleo, etc. Se pueden encontrar descripciones detalladas de cómo fabricar anticuerpos en diversas publicaciones, como por ejemplo "Making and using Antibodies: A Practical Handbook" (2006) G.C. Howard and M.R. Kaser, eds. CRC Press; "Antibody Engineering: Methods and Protocols" (2004) B.K.C. Lo, ed, Humana Press.

[0187] Kits y ensayos

[0188] El kit o ensayo para identificar a un sujeto con CFS o con riesgo de desarrollar CFS puede comprender una o más sondas, herramientas o reactivos, incluyendo oligonucleótidos de ácido nucleico o cebadores, conjuntos de sondas de ácido nucleico, anticuerpos contra polipéptidos polimórficos (por ejemplo, inmovilizados en un sustrato), reactivos del sistema de producción de señales, medios de etiquetado y detección, controles y/u otros reactivos como amortiguadores, nucleótidos o enzimas, por ejemplo polimerasa, nucleasa o transferasa, dependiendo del protocolo particular que se vaya a realizar. Otros ejemplos de reactivos incluyen matrices que comprenden sondas que son específicas para uno o más de los genes de interés o uno o más polimorfismos de los mismos, y anticuerpos contra epítopos de las proteínas codificadas por estos genes de interés, en donde el epítopo puede comprender un polimorfismo de interés.

[0189] Un kit o prueba puede incluir uno o más artículos y/o reactivos para la realización del método, tales como medios para proporcionar la muestra de prueba en sí, por ejemplo, un hisopo para extraer células de la cavidad bucal o una jeringa para extraer una muestra de sangre (dichos componentes generalmente son estériles).

[0190] Además de los componentes anteriores, los kits o ensayos pueden incluir instrucciones. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits de varias formas, una de las cuales puede ser como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una pieza o piezas de papel en los que está impresa la información, en el empaque del kit, en un inserto del empaque, etc. Otra forma sería un medio legible por computadora, por ejemplo, un disquete, CD, etc., en el que se haya grabado la información. Otra forma que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

[0191] Biochip

[0192] El biochip es un aparato que puede ser utilizado en conjunción con los métodos de la invención, en ciertas realizaciones, comprende un sustrato sólido que comprende una sonda unida o una pluralidad de sondas/oligonucleótidos. Las sondas pueden ser capaces de hibridar con una secuencia objetivo en condiciones de hibridación estrictas. Las sondas pueden unirse en direcciones espacialmente definidas sobre el sustrato. Puede utilizarse más de una sonda por secuencia objetivo, con sondas solapadas o sondas para diferentes secciones de una secuencia objetivo concreta. En una realización, se utilizan dos o más sondas por secuencia objetivo. Las sondas pueden ser capaces de hibridar con diferentes objetivos, como un gen/alelo o producto genético del canal iónico TRP. Las sondas pueden unirse al biochip de diversas maneras, como podrán apreciar los expertos en la materia. Las sondas pueden sintetizarse primero y unirse después al biochip, o pueden sintetizarse directamente en el biochip. El sustrato sólido puede ser un material que puede modificarse para contener sitios individuales discretos apropiados para la unión o asociación de las sondas y es susceptible de al menos un método de detección. Ejemplos representativos de sustratos incluyen vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, teflón, etc.), polisacáridos, nylon o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales basados en sílice incluyendo silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos y plásticos. Los sustratos pueden permitir la detección óptica sin fluorescencia apreciable.

[0193] El sustrato puede ser plano, aunque también pueden utilizarse otras configuraciones de sustratos. Por ejemplo, las sondas pueden colocarse en la superficie interior de un tubo, para el análisis de muestras de flujo continuo con el fin de minimizar el volumen de la muestra. Del mismo modo, el sustrato puede ser flexible, como una espuma flexible, incluyendo espumas de celdas cerradas hechas de plásticos particulares.

[0194] El biochip y la sonda pueden derivatizarse con grupos funcionales químicos para la posterior unión de ambos. Por ejemplo, el biochip puede derivatizarse con un grupo funcional químico que incluya, entre otros, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Mediante estos grupos funcionales, las sondas pueden unirse utilizando grupos funcionales en las sondas directa o indirectamente mediante enlazadores. Las sondas pueden unirse al soporte sólido por el extremo 5', el extremo 3' o a través de un nucleótido interno.

[0195] La sonda también puede estar unida al soporte sólido de forma no covalente. Por ejemplo, se pueden fabricar oligonucleótidos biotinilados, que pueden unirse a superficies recubiertas covalentemente con estreptavidina, dando lugar a la unión. Alternativamente, las sondas pueden sintetizarse en la superficie mediante técnicas como la fotopolimerización y la fotolitografía.

[0196] Se puede utilizar una variedad de condiciones de hibridación, incluyendo condiciones de alta, moderada y baja rigurosidad como se ha descrito anteriormente. Los pruebas pueden realizarse en condiciones de rigurosidad que permitan la hibridación de la sonda sólo con el objetivo. La rigurosidad puede controlarse alterando un parámetro de paso que sea una variable termodinámica, incluyendo, entre otros, la temperatura, la concentración de formamida, la concentración de sal, la concentración de sal caotrópica, el pH o la concentración de solvente orgánico.

[0197] Las reacciones de hibridación pueden llevarse a cabo de varias maneras. Los componentes de la reacción pueden añadirse simultánea o secuencialmente, en diferentes órdenes. Además, la reacción puede incluir una variedad de otros reactivos. Entre ellos se incluyen sales, amortiguadores, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc., que pueden utilizarse para facilitar una hibridación y detección óptimas, y/o reducir las interacciones inespecíficas o de fondo. También pueden utilizarse, según proceda, reactivos que mejoren la eficiencia del ensayo, como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas y agentes antimicrobianos, en función de los métodos de preparación de la muestra y de la pureza del objetivo.

[0198] Los biochips ejemplares incluyen un surtido organizado de sondas de oligonucleótidos descritas anteriormente inmovilizadas en una plataforma apropiada. Cada sonda se une selectivamente a un ácido nucleico objetivo en una muestra.

[0199] De acuerdo con otra realización, el biochip también puede incluir uno o más controles positivos o negativos. Por ejemplo, los oligonucleótidos con secuencias aleatorias pueden utilizarse como controles positivos, indicando la orientación del biochip basándose en dónde se coloquen en el biochip, y proporcionando controles para el tiempo de detección del biochip.

[0200] El biochip puede hacerse de la siguiente manera. Se seleccionan y obtienen las sondas de oligonucleótidos que se incluirán en el biochip. Las sondas pueden seleccionarse, por ejemplo, basándose en SNP particulares de interés. Las sondas pueden sintetizarse utilizando métodos y materiales conocidos por los expertos en la materia, o pueden sintetizarse y obtenerse de una fuente comercial, como GeneScript USA (Piscataway, N.J.).

[0201] Cada sonda discreta es entonces unida a una plataforma apropiada en una localización discreta, para proporcionar un conjunto organizado de sondas. Las plataformas adecuadas son las membranas y los portaobjetos de vidrio. Las membranas adecuadas incluyen, por ejemplo, membranas de nylon y membranas de nitrocelulosa. Las sondas se unen a la plataforma mediante métodos y materiales conocidos por los expertos en la materia. En resumen, las sondas se pueden unir a la plataforma sintetizándolas directamente en la plataforma o colocándolas mediante un sistema de impresión con o sin contacto. La localización de la sonda puede realizarse utilizando cualquiera de los sistemas disponibles en el mercado, como el GeneMachines(TM) OmniGrid (San Carlos, California).

[0202] Las realizaciones particularmente preferidas de la invención se definen en las reivindicaciones.

[0203] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención.

[0204] Otras ventajas de la invención resultarán evidentes de la lectura de esta especificación.

[0205] Ejemplos

[0206] Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos en modo alguno de la naturaleza general de la divulgación de la descripción a lo largo de esta especificación. Los ejemplos que quedan fuera del ámbito de la invención se incluyen como ejemplos comparativos.

[0207] Ejemplo 1: El papel de la superfamilia del receptor potencial transitorio (TRP) en el CFS.

[0208] La superfamilia del potencial receptor transitorio (TRP) en humanos comprende 27 canales catiónicos con permeabilidad a cationes monovalentes y divalentes. Estos canales se expresan ampliamente en células y tejidos humanos y tienen significantes funciones sensoriales y reguladoras en la mayoría de las funciones fisiológicas. Metodología

[0209] Sujetos

[0210] El estudio comprendió 115 pacientes con CFS (edad= 48.68±1,06 años) y 90 controles no fatigados (edad= 46.48±1.22 años). Los pacientes con CFS se definieron de acuerdo con los criterios del CDC de 1994 para el CFS [20b]. se recolectaron 10 ml de muestras de sangre total de todos los participantes en tubos con EDTA.

[0211] Extracción de ADN

[0212] El ADN genómico se extrajo de todas las muestras de sangre total utilizando el minikit de ADN en sangre de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Se utilizó el Nanodrop (Nanodrop) para evaluar la calidad y la cantidad del ADN extraído. En el ensayo SNP se utilizaron aproximadamente 2 μg de ADN genómico.

[0213] Estudios de genotipado de SNP

[0214] El análisis SNP fue realizado por Geneworks utilizando el ensayo MassARRAY iPLEX Gold (Sequenom Inc.) como se describió previamente. Se desarrollaron ensayos personalizados para 240 SNP en los 21 genes TRP (TRPA1,TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPMS, TRPM6, TRPM7, TRPM8, TRPVI, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5yTRPV6).Se crearon cebadores y cebadores de extensión para cada uno de los SNP utilizando el Assay Designer (Sequenom Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ADN se amplificó mediante PCR en las siguientes condiciones: 94°C durante 2 minutos, 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto. A continuación, los productos de amplificación se trataron con fosfatasa alcalina de camarón (SAP) a 37°C durante 40 min, 85°C durante 5 min de reacción y una incubación final a 4°C. Los cebadores de extensión se optimizaron para controlar la relación señal-ruido, donde los cebadores no extendidos (UEP) se examinaron en el spectroCHIP y se evaluaron en Typer 4,0 para permitir la división en UEP de masa baja, UEP de masa media y UEP de masa alta. Para realizar la reacción de extensión iPLEX, se preparó una mezcla que contenía la reacción iPLEX Gold utilizando el amortiguador iPLEX Gold Buffer Plus, la mezcla de terminación iPLEX, la enzima iPLEX y la mezcla de cebadores. La reacción iPLEX se cicló a una desnaturalización inicial de 94°C durante 30 s, recocido a 52°C durante 5 min, extensión a 80°C durante 5 min (se realizaron 5 ciclos de recocido y extensión, sin embargo la reacción completa se realizó en 40 ciclos) y extensión de nuevo a 72°C durante 3 min. Se utilizaron perlas de resina para aclarar todos los productos de la reacción iPLEX Gold. Después de la reacción iPLEX Gold, se realizó el MassARRAY utilizando el espectrómetro de masas MassARRAY, los datos generados se analizaron utilizando el software TyperAnalyzer.

[0215] Análisis estadístico

[0216] Se utilizó el conjunto de herramientas de análisis del genoma completo PLINK v1,07 [21b] para determinar las asociaciones entre los pacientes con CFS y el grupo de control sin fatiga. Se utilizó una prueba χ2 de dos columnas para determinar la significancia, donde se determinó que un valor p de ≤0.05 era significativo.

[0217] Resultados

[0218] Participantes

[0219] De los 115 pacientes con CFS (edad = 48.68±1,06 años), 84 (73,04%) eran mujeres y 31 (26.96%) hombres. Los 90 controles no fatigados (edad= 46.48±1.22 años) comprendían 59 (65.56%) mujeres y 31 (34.44%) hombres. Todos los participantes de los grupos de pacientes y de control sin fatiga eran de ascendencia europea y residían en Australia en el momento de la extracción de sangre.

[0220] Estudios de asociación SNP

[0221] De los 240 SNP que se examinaron en el presente estudio, 233 se identificaron con éxito en ambos grupos de participantes. De los 233, se observó que trece se asociaban significativamente con el CFS (Tabla 1).

[0222] Tabla 1: Análisis de la distribución de frecuencias y significancia de los polimorfismos de nucleótido único (SNP) del TRP en pacientes con CFS y controles sin fatiga por orden de significancia.

[0225]

[0226]

[0229] Nueve de estos SNP estaban asociados conTRPM3(rs12682832; p=0.003, rs11142508; p=0.004, rs1160742; p=0.08, rs4454352; p=0.013, rs1328153; p=0.013, rs3763619; p=0.014, rs7865858; p=0.021, rs1504401; p=0041, rs10115622; p=0.050), mientras que el resto estaban asociados conTRPA1(rs2383844; p=0.040, rs4738202; p=0.018) yTRPC4(rs6650469; p=0.016, rs655207; p=0.018).

[0231] Discusión

[0233] El propósito de este estudio fue determinar la presencia de posibles variaciones SNP en pacientes con CFS con un enfoque específico en SNP dentro de las secuencias codificantes de 21 genes de canales iónicos TRP. De los 240 SNP examinados, trece alelos resultaron estar significativamente asociados a los pacientes con CFS en comparación con los controles no fatigados. Estos alelos se localizaban en la secuencia genética de uno de los canales iónicos TRP canónicos (TRPC4), uno de anquirina (TRPA1) y uno de melastatina (TRPM3).

[0235] Hay poca información disponible sobre el papel de estos SNP, sin embargo los TRPs pueden mediar en la posible aparición del CFS. TRPC4 se activa a través de la activación dependiente del receptor de la vía G<q/11>/ PLC β/γ pero también a través de proteínas G<αi>proteínas PI(4.5)P<2>y también Ca<2+>intracelular [22b]. Interviene principalmente en la función vasomotora, la agregación plaquetaria y la función del músculo liso. Por cierto, se sabe que el Ca<2+>es necesario para la regulación de las células inmunes, ya que Ca<2+>actúa como un segundo mensajero para la mayoría de las células, particularmente las células T y las células B. El Ca<2+>intracelular aumenta cuando los receptores de los linfocitos están expuestos a antígenos [23b]. En los pacientes con CFS, existen numerosos informes sobre el compromiso de la función inmunitaria, aunque la información sobre el papel del Ca<2+>en estos pacientes es limitada. Sin embargo, la desregulación de los TRPC puede afectar a la concentración de calcio intracelular y, de forma incidental, a la función de los linfocitos. Se ha demostrado que linfocitos como las células asesinas naturales (NK) y las células T están comprometidos en el CFS. En las células NK, el Ca<2+>potencia la actividad citotóxica y su agotamiento o afluencia excesiva puede tener graves consecuencias en la función de las células NK. En el CFS se ha descrito sistemáticamente una reducción de la actividad citotóxica [24b-29b] y esto puede estar relacionado con una desregulación del Ca<2+>

[0237] La desregulación de TRPC puede afectar las respuestas neuronales en particular aquellas asociadas con la estimulación de receptores muscarínicos. Después de la activación de TRPC por PLC se produce un influjo de Ca<2+>que causa una inducción en los receptores muscarínicos, y mantiene el disparo neuronal incesante [30b, 31b]. Por lo tanto, la secreción de Ca<2+>y la disponibilidad de TRPC en el entorno neuronal son fundamentales para la función óptima de los receptores muscarínicos y la función general del cerebro. Cabe destacar que este proceso es esencial para la memoria, la atención, la agudeza sensorial, la emoción, el dolor y el control motor [32b, 33b] y se produce en la amígdala, el córtex entorrinal, el hipocampo y el córtex prefrontal [34b]. En el CFS se han identificado déficits neuronales relacionados con la memoria y la atención [35b-37b]. La eliminación o el compromiso de TRPC4 también pueden afectar a la función intestinal. TRPC4 y TRPC6 se emparejan con receptores muscarínicos en el intestino activando la despolarización del músculo liso, la entrada de Ca<2+>y la contracción del músculo liso [38b]. La disfunción intestinal es un componente del CFS [39b], sin embargo, el alcance del daño en la pared intestinal o el papel exacto de los canales iónicos en el intestino aún está por determinar. TRPC4 puede estar regulada simultáneamente por receptores acoplados a proteínas G (GPCR) Gαi y Gαq [40b].

[0239] TRPA1 es un receptor químico múltiple que ha sido identificado en neuronas sensoriales nociceptivas (fibras C) y tiene un papel en la regulación de la liberación de neuropéptidos, la sensación de dolor y la inflamación [41b]. Puede activarse tanto por agentes inflamatorios exógenos como endógenos, lo que provoca inflamación y dolor [42b]. Los GPCR también activan TRPA1 vía señalización PLC sensibilizando el canal iónico a varios estímulos [43b]. TRPA1 puede activarse y posteriormente inactivarse en presencia de concentraciones de calcio intracelular y extracelular [44b, 45b]. Se ha propuesto que el gen TRPA1 afecta a la sensibilidad a los estímulos nociceptivos [46b], por lo que los pacientes con CFS que expresan SNP en el gen TRPA1 pueden aumentar su sensibilidad a los estímulos nociceptivos. En el CNS los astrocitos expresan canales TRPA1 y estos canales son necesarios para la captación de calcio y la regulación neuronal en los astrocitos. Por lo tanto, los cambios en el nivel de calcio pueden afectar a la función de los astrocitos y a la comunicación interneuronal [45b, 47b]. Se ha demostrado que la activación de TRPA1 induce cefalea aguda y esto puede ocurrir a través del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) que causa vasodilatación en la arteria meníngea [45b, 48b]. Cabe destacar que el dolor de cabeza es un síntoma importante del CFS. El TRPA1 también es un actor clave en la migraña, el dolor neuropático, articular y muscular que experimentan con mayor frecuencia los pacientes con fibromialgia [49b, 50b]. TRPA1 forma heterotetrámeros funcionales con TRPV1, por lo que las variaciones en el gen TRPA1 pueden sugerir déficits funcionales de TRPV1 que pueden no estar relacionados con el polimorfismo en los nucleótidos [51b]. Los analgésicos y los fármacos antinociceptivos se dirigen a TRPV1 y TRPA1 respectivamente para aliviar la sensación de dolor [52b-54b] y estos fármacos se prescriben habitualmente a los pacientes con CFS. Quizás en el CFS estos fármacos no sean efectivos debido a alteraciones o variaciones en estos canales iónicos.

[0240] Los canales TRPM son en su mayoría permeables al magnesio y al calcio. Sólo TRPM4 y TRPM5 son impermeables a los cationes divalentes. El TRPM3 es permeable a los cationes, incluidos el Ca<2+>y el Zn<2+>. Sin embargo, el perfil de permeación depende en gran medida de la variante empalmada expresada [55b]. Hasta la fecha no se ha descrito ninguna canalopatía TRPM3 hereditaria. TRPM3 se ha implicado en síndromes de dolor inflamatorio, artritis reumatoide y secreción de citoquinas proinflamatorias. Como las células β pancreáticas también tienen una alta proporción de canales TRPM3 [45b, 56b-58b], existe la probabilidad de que se produzcan perturbaciones en la regulación de la insulina/glucosa en pacientes con CFS. Las alteraciones metabólicas también se han identificado desde hace tiempo como una característica cardinal del CFS. El TRPM3 más caracterizado en humanos se encuentra en el sistema nervioso central (CNS) y en el ojo [55b]. El TRPM3 interviene en la detección del calor y en la transmisión del dolor. Los ratones deficientes en TRPM3 muestran claros déficits en sus respuestas de evitación al calor nocivo y en el desarrollo de hiperalgesia inflamatoria por calor [55b]. Se ha reportado una desregulación de las respuestas termorreguladoras en pacientes con CFS [59b]. El dolor generalizado es una característica del CFS y se produce en ausencia de daño tisular, lo que sugiere posibles alteraciones del CNS [60b]. Dado que el TRPM3 desempeña un papel en la nocicepción y la termorregulación, puede tener un papel en el patomecanismo del CFS. Además, TRPM3 es activado por el sulfato de pregnenolona, lo que sugiere que tiene efectos neuroendocrinos [61b, 62b] y también podría estar implicado en la regulación de la señalización glutamatérgica en el cerebro [63b].

[0241] Estos hallazgos implican los canales iónicos TRP (predominantemente TRPM3) en la etiología y el patomecanismo del CFS. La desregulación de los TRP, incluida la familia TRPM3, es probablemente pertinente en la predisposición de los pacientes con CFS a las alteraciones del metabolismo del calcio y se alinea con la presentación de los síntomas. Potencialmente, la afluencia desregulada de iones de calcio a las células afectará a una serie de componentes vitales de la maquinaria reguladora celular. Estos componentes incluyen las adenilato ciclasas (AC) sensibles al calcio y, por tanto, la expresión y función del AMPc.

[0242] Ejemplo 2: El papel de los SNP de los receptores de ACh (nAChRs y mAChRs) en el CFS/ME.

[0243] Metodología

[0244] Sujetos

[0245] El estudio incluyó 115 pacientes con CFS/ME (edad = 48.68 ± 1,06 años) y 90 controles no fatigados (edad = 46.48 ± 1.22 años). Los pacientes con CFS se definieron de acuerdo con los criterios del CDC de 1994 para el CFS [36c]. Se recolectó un volumen de 10 ml de sangre total de todos los participantes en tubos con EDTA.

[0246] Extracción de ADN

[0247] El ADN genómico se extrajo de todas las muestras de sangre total utilizando el minikit de ADN en sangre de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). La calidad y cantidad del ADN extraído se determinó mediante el Nanodrop (Nanodrop), donde se utilizaron aproximadamente 2 μg de ADN genómico para realizar el ensayo SNP.Estudios de genotipado de SNP

[0248] Se examinó un total de 464 polimorfismos de nucleótido único (SNP) para nueve genes receptores de ACh de mamíferos (M1, M2, M3, M4, M5, alfa 2, 5, 7 y 10) mediante el ensayo iPLEX Gold de Agena Biosciences. Geneworks completó el análisis SNP según lo definido previamente (MassARRAY iPLEX Gold Assay) [37c]. Se desarrollaron pruebas personalizados para 464 SNP en los 9 genes de receptores de acetilcolina de mamíferos (M1, M2, M3, M4, M5, alfa 2, 5, 7 y 10). Se crearon cebadores y cebadores de extensión para cada uno de los SNP utilizando el Assay Designer [37c] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación del ADN se realizó como se ha descrito anteriormente. Brevemente, el ADN se amplificó mediante PCR bajo las siguientes condiciones 94°C durante 2 minutos, 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto. A continuación, los productos de amplificación se trataron con fosfatasa alcalina de camarón (SAP) a 37°C durante 40 min, 85°C durante 5 min de reacción y una incubación final a 4°C. Los cebadores de extensión se optimizaron para controlar la relación señalruido, donde los cebadores no extendidos (UEP) se examinaron en el spectroCHIP y se evaluaron en Typer 4,0 para permitir la división en UEP de masa baja, UEP de masa media y UEP de masa alta. Para realizar la reacción de extensión iPLEX, se preparó una mezcla que contenía la reacción iPLEX Gold utilizando el amortiguador iPLEX Gold Buffer Plus, la mezcla de terminación iPLEX, la enzima iPLEX y la mezcla de cebadores. La reacción iPLEX se cicló a una desnaturalización inicial de 94°C durante 30 s, recocido a 52°C durante 5 min, extensión a 80°C durante 5 min (se realizaron 5 ciclos de recocido y extensión, sin embargo la reacción completa se realizó en 40 ciclos) y extensión de nuevo a 72°C durante 3 min. Se utilizaron perlas de resina para aclarar todos los productos de la reacción iPLEX Gold. Después de la reacción iPLEX Gold, se realizó el MassARRAY utilizando el espectrómetro de masas MassARRAY, y los datos generados se analizaron con el software TyperAnalyzer.

[0249] Análisis estadístico

[0250] Se implementó el conjunto de herramientas de análisis del genoma completo PLINK v1,07 [39c] para determinar las asociaciones entre los pacientes con CFS y el grupo de control sin fatiga. Se utilizó una prueba χ2 de dos columnas en la que el nivel alfa de significancia se estableció en un valor p de ≤0.05.

[0251] Resultados

[0252] Participantes

[0253] De los 115 pacientes con CFS (edad= 48.68±1,06 años), 84 (73,04%) eran mujeres y 31 (26.96%) hombres. 90 controles no fatigados (edad= 46.48±1.22 años) comprendían 59 (65.56%) mujeres y 31 (34.44%) hombres. Todos los participantes de ambos grupos eran de origen europeo. Todos residían en Australia en el momento de la extracción de sangre.

[0254] Estudios de asociación SNP

[0255] De los 464 SNP que se examinaron en el presente estudio, 393 se identificaron con éxito en ambos grupos de participantes. De las 393, se observó que diecisiete estaban significativamente asociadas con el CFS (Tabla 2). Tabla 2: Análisis de la distribución de frecuencias y significancia de los polimorfismos de nucleótido único (SNP) del receptor de acetilcolina en pacientes con CFS y controles sin fatiga por orden de significancia.

[0258]

[0259]

[0261] Diecisiete SNP se asociaron significativamente con los pacientes con CFS/ME en comparación con los controles. Nueve de estos SNP estaban asociados con mAChRM3 (rs4463655; p=0.00, rs589962; p=0.00, rs1072320; p=0.00, rs7543259; p=0.01, rs6661621; p=0.01 rs7520974; p=0.02, rs726169; p=0.02, rsrs6669810; p=0.02, rsrs6429157; p=0.04), mientras que el resto se asociaron con nACh alfa 10 (rs2672211; p=0.01, rs2672214; p=0.01, rs2741868; p=0.01, rs2741870; p=0.01, rs2741862; p=0.03) alfa 5 (rs951266; p=0.012; rs7180002, p=0.04) y alfa 2 (rs2565048; p=0.01).

[0262] Discusión

[0263] Este estudio reveló una serie de variaciones del SNP AChR en pacientes con CFS/ME. Específicamente, dentro de las secuencias codificantes de nueve genes AChR de los 464 SNP examinados, se encontraron 17 alelos significativos asociados a los pacientes con CFS/ME en comparación con los controles no fatigados. Además, estos alelos estaban localizados en la secuencia genética de uno de los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRM3) y de tres receptores nicotínicos de acetilcolina alfa (nAChRα2, nAChRα5 y nAChRα10). Curiosamente, en el Ejemplo 1 los inventores identificaron una serie de SNP en la familia TRP, concretamente TRPC4. La importancia de los SNP en mAChRM3 y TRPC4 es que este último se acopla a mAChRM3 y puede ser activado por ACh [40c-42c].

[0264] Hay poca información disponible sobre el papel de estos SNP AChR, sin embargo el papel de ACh en la señalización celular de calcio (Ca<2+>) sugiere que estos AChRs pueden mediar, en parte, la expresión clínica de CFS/ME. Además, los inventores han mostrado en el Ejemplo 1 SNP significativos en la familia de canales iónicos TRP, concretamente TRPA1, TRPM3 y TRPC4, utilizando la misma cohorte de pacientes con CFS/ME. Estos hallazgos sugieren la posibilidad de aberraciones significativas en la señalización celular del Ca<2+>, posiblemente reflejadas en la presentación clínica de los pacientes con CFS/ME.

[0265] Los receptores mAChR son responsables de iniciar la contracción del músculo liso, como en los tractos gastrointestinal y genitourinario, así como de los efectos en las células inmunes, epiteliales, ováricas y de la piel ocular, respiratorias y de las glándulas secretoras [43c-46c. 33c. 34c. 32c. 47c-52c. 35c. 5c]. Los nAChR también se han descrito en linfocitos T y B [53c.54c]. Los linfocitos T humanos expresan las subunidades del receptor α3, α4, α7, β2 y β4 [55c], mientras que en el timo de ratón y humano se ha descubierto que la expresión de mAChR desempeña un papel en el desarrollo y la proliferación de los linfocitos T [53c. 56c-58c]. Las subunidades α4 o α7 también se han descrito en linfocitos B y se ha descubierto que estimulan la proliferación, al tiempo que disminuyen la producción de anticuerpos [59c]. Dichos hallazgos ofrecen una posible perspectiva sobre los SNP caracterizados en este Ejemplo, teniendo en cuenta que investigaciones previas han reportado de un compromiso de la función inmunitaria en pacientes con CFS/ME. De forma significativa, los cambios en el número y la función de linfocitos como los linfocitos asesinos naturales (NK) y los linfocitos T y B en estos estudios sugieren un mayor influjo de Ca<2+>.

[0266] Los receptores mAChRM3 están localizados en el tracto gastrointestinal y son controlados en parte por el sistema nervioso parasimpático, a través del nervio vago [60c]. Donde las fibras nerviosas hacen sinapsis dentro de la pared intestinal, el principal neurotransmisor, la acetilcolina, suele estimular la motilidad GI. Además, los datos clínicos reportan de que los nAChR están implicados en la enfermedad inflamatoria intestinal [61c]. La desregulación de los canales mediados por Ca<2+>, como el influjo o la reducción del flujo de Ca<2>, podría provocar cambios significativos en la motilidad GI. Los pacientes con CFS/ME suelen presentar problemas gastrointestinales asociados, como síndrome del intestino irritable y estreñimiento [12c.28c].

[0267] La desregulación de los receptores mAChRM3 puede afectar a las respuestas metabólicas y cardíacas. En el páncreas normal, los receptores mAChRM3 desempeñan un papel en la regulación de la secreción de insulina y glucagón [62c.

[0268] 63c]. Se ha descrito que los receptores muscarínicos de acetilcolina expresados por las células β pancreáticas desempeñan un papel importante en el mantenimiento de una liberación adecuada de insulina y en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa en todo el organismo [62c]. Los cambios en los canales mediados por el Ca<2+>pueden dar lugar a resultados metabólicos adversos de la glucosa, como se implica en los pacientes con CFS/ME [64c]. Es probable que los SNP de AChR en pacientes con CFS afecten a la modulación del Ca<2+>en las vías intracelulares a través de la afluencia de iones Ca<2+>. Las células β pancreáticas dependen de una disminución transitoria del Ca<2+>para iniciar la compleja secuencia de eventos que da lugar a la secreción de insulina después de la exposición a la glucosa. Hellman et al. [65c] reporta que la elevación de la glucosa induce una inhibición transitoria de la liberación de insulina al disminuir el Ca<2+>citoplasmático por debajo del valor basal en las células β pancreáticas. Se observó que este período coincidía con un aumento de la liberación de glucagón y, por lo tanto, se afirmó que era el punto de partida de los pulsos antisincrónicos de insulina y glucagón. Concluyen que el periodo de disminución inicial de la concentración citoplasmática de iones de calcio regula la posterior respuesta de las células β a la glucosa. Por lo tanto, se puede argumentar que la elevación aberrante de las concentraciones intracelulares de Ca<2+>a través de la actividad permisiva del TRP y el AChR impedirá la secuencia habitual y necesaria de acontecimientos requeridos para iniciar la respuesta de la insulina a la glucosa en los pacientes con CFS.

[0270] Los receptores cardíacos mAChRM3 desempeñan una serie de funciones patológicas y fisiológicas. mAChM2 no es el único receptor muscarínico implicado en la función cardíaca, sino que el control parasimpático mAChRM3 de la función cardíaca está bien establecido [66c]. Un reporte de van Borren et al. [67c] muestra el efecto de la estimulación de los AChR muscarínicos sobre los transitorios de Ca<2+>, la producción de AMPc y la frecuencia de marcapasos en los nódulos sinoauriculares (SA) del conejo. Descubrieron que los efectos de desaceleración del marcapasos de los agonistas muscarínicos se ven aumentados por la inhibición transitoria de Ca<2+>, lo que sugiere que un efecto cronotrópico negativo de los agonistas muscarínicos se obtiene, en parte, por la inhibición transitoria de Ca<2+>y la posterior reducción del AMPc. Estos hallazgos implican que el agonismo muscarínico tendrá un efecto sobre la función del nodo SA exacerbando las alteraciones de los mecanismos cardio-reguladores adecuados, particularmente en un entorno en el que es probable que las concentraciones intracelulares de Ca<2+>se vean alteradas debido a los efectos directos de la actividad del receptor. Las consecuencias clínicas, como la alteración de las respuestas cardiovasculares ortostáticas, podrían predecirse y alinearse con la presentación de los síntomas en el CFS/ME [13c. 21c. 25c. 27c.

[0271] 29c].

[0273] En el sistema vascular, el endotelio contiene nAChRs, incluyendo α3, α5, α7, α10, β2, βy β4 [68c. 48c. 69c]. Dependiendo del tipo de músculo liso, está presente un subtipo específico de nAChR; α3 y α5 se encuentran en las arterias, mientras que α7 está ampliamente distribuido, aunque no está presente en el sistema circulatorio renal. Los nAChR α5, α7, β2 y β3 se han encontrado en las células endoteliales del cerebro [70c] y son un componente importante de la barrera hematoencefálica (BHE). El ensamblaje del receptor nAChR es importante para la permeabilidad iónica y la desensibilización. Se sabe que las subunidades α7 del nAChR se desensibilizan rápidamente y tienen una alta permeabilidad Ca<2+>:Na<+>. Una combinación de subunidades α7 con α5 nAChR da lugar a receptores con propiedades de desensibilización y permeabilidad iónica distintas en relación con el nAChR α7 homomérico [71c.72c]. Se observan cambios más drásticos en la cinética del canal nAChR cuando la subunidad nAChR α5 se incorpora a receptores con las subunidades nAChR α3 y β4, lo que sugiere que las conformaciones de las subunidades pueden influir en las propiedades funcionales [73c. 74c] de estos receptores. En el presente ejemplo se identificaron SNP en las subunidades α5 y α3 de los nAChR, lo que implica anomalías en la transducción de señales en la cohorte de pacientes del inventor. Según los informes, los nAChR están implicados en la excitación, el sueño y la fatiga, así como en las funciones responsables del procesamiento del dolor, la memoria y la cognición [75c-77c].

[0275] Se sabe que los canales selectivos de Ca<2+>dependientes de voltaje (CaV) y las redes de señalización de Ca<2+>intracelulares y los canales iónicos no selectivos desempeñan un papel importante en la integridad, la función y el ciclo celular. Los resultados de este ejemplo sugieren que existe un papel intrínseco entre los SNP de los receptores TRP y ACh que puede sustentar la patología del CFS/ME.

[0277] Las adenilato ciclasas (AC) son críticas en la producción de AMPc a partir de ATP a través de un mecanismo no redundante. El Ca<2+>promueve la producción de AMPc a través del AC1 sensible al Ca<2+>en el nódulo sinoatrial (SA) del cobaya, aunque el papel del otro subtipo de AC estimulado por Ca<2+>(AC8) en el nódulo SA del cobaya es incierto [78c]. Los cinco receptores muscarínicos de ACh (M(1)-M(5)) se expresan de forma diferencial en el cerebro. M(2) y M(4) están acopladas a la inhibición de la adenilil ciclasa estimulada, mientras que M(1), M(3) y M(5) están acopladas principalmente a la vía de los fosfoinositidos [79c]. Sin embargo, como la ACh está mediada en gran medida por Ca<2+>, se plantea la cuestión de si la entrada permisiva de Ca<2+>ocurre a través de TRP y SNP de AChR y si esta combinación de factores puede resultar en una desregulación de la actividad de AC y las interacciones cAMP/Ca<2+>. El apoyo a este argumento se pone de manifiesto cuando TRPC4 se acopla a mAChRM3 y es activado por ACh [40c-42c].

[0279] Un componente clave de la regulación del CA y la producción de AMPc se logra a través de dos neuropéptidos vasoactivos estimulantes del CA, a saber, el péptido intestinal vasoactivo (VIP) y el polipéptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP). En las neuronas cardiacas que expresan transcripciones TRPC, el PACAP activa canales catiónicos no selectivos permeables al calcio, que probablemente son miembros de la familia TRPC [80c]. La inhibición de los aumentos de calcio intracelular por la aplicación de bloqueantes de los canales de calcio indica que el PACAP actúa sobre la afluencia de calcio [81c]. En particular, es la afluencia de iones de calcio, y no la liberación de los depósitos de iones de calcio, lo que se requiere para el aumento de la excitabilidad inducido por el PACAP en las neuronas intracardíacas de cobaya. Es importante destacar que la expresión de los genes PACAP está controlada por las señales de calcio y AMPc en las neuronas, lo que sugiere que la entrada desregulada de calcio en las células tendrá efectos sobre la expresión de PACAP. La expresión genética dependiente de la actividad está controlada conjuntamente por señales de Ca<2+>y AMPc no solo a nivel transcripcional sino también a nivel postraduccional para la expresión acumulativa de ARNm en neuronas [82c]. Investigaciones anteriores han demostrado en linfocitos NK aislados un aumento significativo del número de VPAC1R en pacientes con CFS/ME en comparación con los controles [15c]. El aumento del número de VPAC1R en estos linfocitos puede haberse producido para compensar el deterioro de la señalización de AC y AMPc.

[0280] En conclusión, los inventores reportan por primera vez de la presencia de SNP en receptores para ACh (predominantemente M3 y CFS) y en asociación con SNP TRP en pacientes con CFS/ME. La función aberrante de la ACh y el TRP en estos pacientes puede tener muchas consecuencias perjudiciales para la homeostasis fisiológica. Es posible que estos escenarios estén asociados a los patomecanismos y la sintomatología del CFS/ME y requieren más investigación.

[0281] Ejemplo 3 - Polimorfismos de nucleótido único no sinónimo en AChR y TRP en la encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica

[0282] En los Ejemplos 1 y 2 los inventores identificaron polimorfismos de nucleótido único (SNP) en genes para canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) y receptores de acetilcolina (AChRs), que tienen papeles importantes en la señalización de calcio (Ca<2+>) y acetilcolina (ACh). Los polimorfismos de un solo nucleótido no sinónimo (nsSNP) son aquellos SNP que provocan cambios en la expresión de proteína de estos receptores y que pueden ser responsables de una señalización aberrante y, por tanto, de un posible cambio de función.

[0283] En este Ejemplo los inventores determinan que los nsSNP están presentes en aquellos SNP previamente identificados en los genes de los canales iónicos TRP y AChR en pacientes con CFS/ME.

[0284] Método

[0285] Sujetos

[0286] Los pacientes con CFS se definieron de acuerdo con los criterios del CDC de 1994 para el CFS [32d]. se examinaron 115 pacientes con CFS/ME (edad= 48.68±1,06 años) y 90 controles sin fatiga (edad= 46.48±1.22 años) en busca de nsSNP en genes de canales iónicos TRP y AChRs.

[0287] Extracción de sangre y de ADN

[0288] Se recolectó un volumen de 10 mL de sangre total de todos los participantes en tubos EDTA. El ADN genómico se extrajo de todas las muestras de sangre total utilizando el minikit de ADN en sangre de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los estudios de genotipado de SNP se realizaron como se ha descrito previamente.

[0289] Análisis nsSNP

[0290] En el presente estudio se examinó un total de81 SNP: 53 nsSNP para cuatro genes AChR (M3, y alfa 2, 5 y 10) y 28 nsSNP para genes de canales iónicos TRP(TRPA1, TRPC4, TRPM3 y TRPM4).

[0291] Análisis estadístico de nsSNP

[0292] Se tomaron los 81 SNP resultantes del análisis PLINK con valores p de < 0.1 y se utilizaron como entrada en el Predictor de Efecto de Variante, para determinar el efecto de las variantes. Las variantes resultantes establecidas a un nivel alfa de p<0.05 y sus consecuencias se pueden encontrar en las Tablas 3-4 y 5-6 para TRP y AChR, respectivamente. Los análisis se realizaron en el Australian Genome Research Facility Ltd, The Walter and Eliza Hall Institute, Parkville, Victoria, Australia.

[0293] Tabla 3:Distribución de frecuencias y significancia de los nsSNP del potencial receptor transitorio (TRP) en pacientes con CFS/ME y controles sin fatiga en orden de significancia.

[0294]

[0295]

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[0300] Tabla 4:Distribución de frecuencias y significancia de los nsSNP del potencial receptor transitorio (TRP) en pacientes con CFS/ME y controles sin fatiga en orden de significancia.

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[0303]

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[0305]

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[0308] Tabla 5: Distribución de frecuencias y significancia de los nsSNP del receptor de acetilcolina (AChR) en pacientes con CFS/ME y controles sin fatiga en orden de significancia.

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[0316] Tabla 6:Distribución de frecuencias y significancia de nsSNP del receptor de acetilcolina (AChR) en pacientes con CFS/ME y controles sin fatiga en orden de significancia.

[0318]

[0319]

[0320]

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[0322] Resultados

[0323] Participantes

[0324] Había 115 pacientes con CFS (edad= 48.68±1,06 años), de los cuales 84 (73,04%) eran mujeres y 31 (26.96%) eran hombres. Había 90 controles no fatigados (edad= 46.48±1.22 años), de los cuales 59 (65.56%) eran mujeres y 31 (34.44%) hombres. Todos los participantes de ambos grupos eran de ascendencia europea y residían en Australia en el momento de la extracción de sangre.

[0325] De81 SNP identificados en los genes de los canales iónicos TRP y AChR, 29 nsSNP se localizaron en variantes del intrón, así como en variantes de la región reguladora, y en variantes up-stream y down-stream. Se identificaron un total de 12 nsSNP para genes de canales iónicos TRP(TRPA1, TRPC4 y TRPM3 y TRPM4) en el grupo de CFS/ME. Específicamente, 7 nsSNP destacaban para TRPM3, 2 nsSNP para TRPC4, 2 nsSNP para TRPA1 y 1 nsSNP para TRPM4. Se encontró un total de 17 nsSNP para el AChR, donde se identificaron 10 nsSNP para mAChM3, 4 nsSNP para nAChα10, 1 nsSNP para nAChα5 y 2 nsSNP para nAChα2. Las Tablas 3-4 y las Tablas 5-6 representan los nsSNP para el canal iónico TRP y los genes AChR, respectivamente.

[0326] El gen predominante en el que se notificaron estos nsSNP para los canales iónicos TRP fue el gen 80036, ya que tuvo 51 eventos notificables significativos (66%) de un total de77 eventos. Los nsSNP restantes para los canales iónicos TRP se encontraron en los genes 7223, 101927086 y 54795, donde cada uno notificó de 12 (15%), 2 (2%) y 5 (6%) eventos, respectivamente.

[0327] El análisis de los nsSNP para AChRs encontró que el gen 1131 tenía 44 eventos notificables (59%) de un número total de 74 eventos. Los nsSNP restantes para los genes AChR se encontraron en los genes 417, 4928, 57053, 100873984, 1138 y 1142, donde cada uno notificó de 12 (16%), 6 (8%), 4 (5%), 2 (3%), 2 (3%) y 2 (3%) eventos, respectivamente. Discusión

[0328] Este es el primer estudio que notifica la presencia de variaciones nsSNP en genes de canales iónicos TRP y genes AChR en pacientes con CFS/ME. En conjunto, se identificaron 29 nsSNP en genes de canales iónicos TRP y AChRs. Se identificaron un total de 12 nsSNP para genes de canales iónicos TRP(TRPA1, TRPC4, TRPM3 y TRPM4) y 17 nsSNP para genes AChR (10 nsSNP para mAChM3, 4 nsSNP para nAchα10, 1 nsSNP para nAchα5 y 2 nsSNP para nAchα2).

[0329] La información disponible sobre el papel de los nsSNP en estos canales iónicos AChR y TRP en la enfermedad es limitada. Los inventores reportan ahora de nsSNP localizados en variantes de intrones, variantes de regiones reguladoras y variantes anteriores y posteriores de los genes de los canales iónicos TRP y AChR en su cohorte de pacientes. Es probable que estas variantes sean críticas para contribuir a las perturbaciones del canal iónico TRP y la función AChR mediadas a través de la señalización alterada de calcio y ACh y manifestadas como compromiso del sistema fisiológico. Por lo tanto, el papel crítico de los AChR y los canales iónicos TRP en la señalización celular de Ca<2+>sugiere que estos nsSNP pueden contribuir a la manifestación clínica del CFS/ME.

[0330] La identificación de los genes que contienen estos nsSNP tanto para los canales iónicos TRP como para los AChRs reveló papeles importantes en la señalización de las células de calcio así como en la función de la acetilcolina con papeles adicionales en la inhibición de la adenilato ciclasa respectivamente. Cabe destacar que los genes 80036 y 1131, que representaban la mayoría de los nsSNP, influyen en estas funciones. Por ejemplo, el gen 80036 está asociado con los mecanismos de señalización del calcio y el agotamiento de los almacenes de calcio a través de diferentes isoformas que se han identificado mediante empalme alternativo [33d]. El gen 1131 codifica los receptores colinérgicos muscarínicos que presentan características como la unión de la acetilcolina, así como la inhibición de la adenilato ciclasa, la degeneración de fosfoinositidos y la mediación del canal de potasio. Como se ha señalado anteriormente, los receptores muscarínicos median la actividad de la acetilcolina en los sistemas nerviosos central y periférico. El receptor colinérgico muscarínico 3 (mAChRM3), controla la contracción del músculo liso y la secreción glandular [34d].

[0331] La importancia de los descubrimientos de los inventores es apoyada por otros que sugieren que el empalme alternativo en las secuencias codificantes y también en las secuencias no codificantes puede tener resultados significativos inesperados en el mecanismo de empalme de los transcripciones genéticas [10d, 11d]. Las variantes genéticas de empalme que se encuentran en los exones y las variantes intrónicas profundas, así como las variantes anteriores y posteriores, desempeñan un papel en los mecanismos de empalme alternativo que dan lugar a diversas isoformas de proteínas. Esta alteración de la expresión de las isoformas de proteínas puede ser un factor importante que afecte a los cambios en la función de las proteínas. Por cierto, el gen humano tiene el mayor número medio de isoformas de ARNm por gen [35d], con una media de siete isoformas de ARNm por gen [36d, 37d]. Además, los elementos reguladores en las secuencias de intrones, así como el ensamblaje del espliceosoma, añaden un nivel significativo de complejidad al mecanismo de empalme para la correcta codificación de una secuencia de proteína. Los potenciadores y silenciadores ubicados en los exones o en los intrones son esenciales para el reconocimiento de la secuencia correcta del exón [38d]. Además, otros han demostrado que los intrones son capaces de generar espliceosomas activos, dando lugar a eventos de empalme alternativo [39d, 40d]. Es importante destacar que los datos de los inventores muestran que la mayor proporción de variantes intrónicas, así como de variantes de la región reguladora, se producen en los nsSNP de los genes TRPM3 y mAChM3 y pueden alterar los transcripciones del gen.

[0333] Las investigaciones realizadas hasta la fecha destacan la importancia de dichas variantes para afectar a los transcripciones de los genes al causar empalmes alternativos que dan lugar a anomalías en el ARNm y en los productos de traducción. El empalme alternativo en los genes TRPM3 y mAChM3 puede dar lugar a una señalización aberrante de Ca<2+>debido a las vías secundarias conocidas que implican Ca<2+>y que median efectos tanto para los canales iónicos TRPM como para los AChR. Los cambios en la señalización de los AChR y los canales iónicos TRP pueden tener importantes implicaciones fisiológicas para los pacientes con CFS/ME, ya que estos canales iónicos TRP y AChR se encuentran en casi todas las células del organismo. El predominio de los síntomas del CNS en el CFS/ME puede deberse en parte a que el TRPM3 está distribuido sustancialmente en el CNS [41d]. El metabolismo y la señalización del calcio en el contexto del canal iónico TRPC, así como la función de los receptores muscarínicos, son vitales para el funcionamiento del CNS. La memoria, la atención, la agudeza sensorial, la emoción, el dolor y el control motor [42d, 43d] son funciones críticas localizadas en varias regiones del cerebro [44d]. Se ha reportado de que estas funciones del CNS están significativamente alteradas en pacientes con CFS/ME [45d-47d]. Los canales iónicos TRPM3 también intervienen en la detección del calor, la nocicepción y la transmisión del dolor [48d, 49d]. En pacientes con CFS/ME también se ha descrito una desregulación de las respuestas termorreguladoras, así como dolor central y periférico [50d], lo que sugiere que los nsSNP descritos en este estudio pueden contribuir a las posibles alteraciones del CNS en estos pacientes.

[0335] Curiosamente, TRPM3 es el único canal iónico TRP descubierto hasta ahora que tiene un segundo canal integrado o poro Omega [51d]. Este poro se caracteriza por tener características que lo distinguen del canal principal TRPM3, como características de activación y flujo de corriente y permeabilidad al Na<+>y K<+>en lugar de al Ca2<+>, que pueden ser relevantes en la señalización. Por ejemplo, parece que el canal Omega actúa para potenciar la señal mediada a través del canal TRPM3 principal, lo que confiere a TRPM3 cualidades únicas de señalización magnificada, en particular la nocicepción y la transmisión del dolor. Como ha habido una serie de hallazgos previos que reportan de cambios significativos en las citoquinas inflamatorias de pacientes con CFS/ME [52d-54d] se plantea la cuestión de si un mediador inflamatorio puede actuar sobre el poro Omega para ejercer un efecto sobre la apertura del poro y la promulgación de una señal nociceptiva [55d]. Por lo tanto, existe la posibilidad de que los nsSNP notificables para TRPM3 en conjunto con este poro omega puedan potenciar y amplificar la señalización patológica de TRPM3 cuando es estimulada por agentes inflamatorios o de otro tipo.

[0337] Los receptores mAChM3 han sido documentados en el tracto gastrointestinal y son controlados en parte por el sistema nervioso parasimpático, a través del nervio vago [56d]. Se ha demostrado que la ACh interviene en la motilidad intestinal a través de las fibras nerviosas que hacen sinapsis en la pared intestinal. Las perturbaciones de los canales mediadas por Ca2<+>a través de una afluencia excesiva o una reducción del flujo de Ca2<+>podrían causar cambios significativos en la motilidad GI. Es plausible que el empalme alternativo de los nsSNP en el intrón y las regiones reguladoras de los genes mAChM3 y TRPC4 pueda causar una motilidad gastrointestinal irregular a través de la activación de la despolarización del músculo liso [57d]. Además, TRPC4 se acopla a mAChRM3 en el intestino, activando la despolarización del músculo liso, la entrada de Ca<2+>y la contracción del músculo liso [57d]. TRPC4 puede estar regulada simultáneamente por receptores acoplados a proteínas G (GPCR) [58d]. También se ha descrito un aumento de las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-8 mediado por la colinergia en pacientes con síndrome del intestino irritable [59d]. Los pacientes con CFS/ME reportan de disfunción intestinal o síndrome de intestino irritable que incluye diarrea [14d, 30d], mientras que otros investigadores han reportado de IL-6 e IL-8 elevadas en este grupo de pacientes [60d].

[0339] Los nsSNP del intrón o de las regiones reguladoras de los receptores mAChRM3 pueden afectar a las respuestas metabólicas y cardiacas. Los receptores mAChRM3, junto con los canales iónicos TRPM3, desempeñan un papel en la regulación de la secreción de insulina y glucagón [61d, 62d]. Los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) expresados por las células β pancreáticas funcionan para mantener la homeostasis de la glucosa en todo el cuerpo [61d]. Los nsSNP documentados en los genes mAChM3R pueden mediar cambios en los canales de Ca<2+>influyendo así en la función de las células β pancreáticas e impactar en el metabolismo de la glucosa en pacientes con CFS/ME [63d]. La función cardiaca a través del control parasimpático mAChRM3 está bien establecida [37d] y los efectos de ralentización del marcapasos de los agonistas muscarínicos se ven aumentados por la inhibición de los transitorios de Ca<2+>, lo que da lugar a una alteración de los mecanismos de regulación cardiaca. Es importante destacar que los nsSNP (variantes del intrón o regiones reguladoras) encontrados en la mAChM3 pueden alterar las concentraciones intracelulares de Ca<2+>, dando lugar a cambios en la respuesta de la insulina a la glucosa u otros estímulos, así como contribuir a los efectos cardiovasculares ortostáticos. Estas dos alteraciones fisiológicas se han descrito en pacientes con CFS/ME [15d, 23d, 27d, 29d, 31d].

[0341] Los canales iónicos TRPA1 se encuentran en los astrocitos del CNS y contribuyen a la captación de calcio y a la regulación de los astrocitos [64d-67d]. Los canales iónicos TRPA1 también inician el dolor de cabeza agudo, además de mediar el dolor y la migraña en pacientes con fibromialgia [68d]. Ambos síntomas se identifican en pacientes con CFS/ME, lo que sugiere que los nsSNP para TRPA1 pueden desempeñar un papel en la patología de esta enfermedad.

[0342] Conclusión

[0343] Este Ejemplo muestra una alta proporción de nsSNP (es decir, SNP no sinónimos) en variantes intrónicas y variantes reguladoras para canales iónicos TRP y genes AChR en la cohorte de pacientes con CFS/ME de los inventores. Se ha sugerido que el empalme alternativo silencioso está implicado en fenotipos de enfermedades, por ejemplo, a través de la omisión de exones, isoformas de empalme alternativas del transcrito genético o espliceosomas alternativos. Los resultados de los inventores sugieren que tales variantes genéticas pueden dar lugar a anomalías fenotípicas en la expresión de los canales iónicos TRP y en la expresión de los AChR, que conducen a una regulación alterada del calcio y la acetilcolina en el CFS/ME y proporcionan una posible justificación para el desarrollo de esta enfermedad debilitante o la predisposición a padecerla.

[0344] Ejemplo 4: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos de los genes de los canales iónicos TRPM3 y de los receptores mAChM3 en pacientes con CFS/ME

[0345] En los Ejemplos anteriores los inventores describen SNP en genes para canales iónicos TRP y AChRs, que tienen papeles importantes en la señalización de calcio (Ca<2+>) y acetilcolina (ACh). Los inventores comunican ahora, a partir de esta misma cohorte de pacientes, datos adicionales que muestran la prevalencia de los genotipos SNP del canal iónico TRP (TRPM3) de la melastatina y del receptor muscarínico de la acetilcolina (mAChM3R) en pacientes con CFS/ME.

[0346] La extracción de ADN genómico y los estudios de genotipado SNP se realizaron como se ha descrito previamente. Se utilizó el conjunto de herramientas de análisis del genoma completo PLINK v1,07 e IBM<®>SPSS<®>Statistics (versión 21) para determinar la frecuencia de genotipos entre los pacientes con CFS y los controles sin fatiga. Se utilizó una prueba χ2 de dos columnas, donde el nivel alfa de significancia se fijó en una p<0.05 y sus consecuencias pueden consultarse en la Tabla 7 para TRPM3 y mAChM3, respectivamente. El análisis de las frecuencias de genotipos SNP en la familia TRPM3(rs12682832; rs11142508; rs3763619)y mAChM3R(rs12036141; rs589962; rs1072320; rs7543259; rs7520974; rs726169; rsrs6669810; rsrs6429157)demostró una alta prevalencia en esta cohorte de pacientes con CFS/ME en comparación con los controles no fatigados (Tabla 7).

[0347] Tabla 7: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos de los genes TRPM3 y mAChM3 en pacientes con CFS y controles sin fatiga.

[0350]

[0352] Los mAChRs están implicados en la función autonómica, particularmente parasimpática y exocrina, como en el páncreas, glándulas exocrinas y regulación cardiaca inotrópica y cronotrópica. Dado que los AChR se distribuyen de forma diferencial por todo el cuerpo, es axiomático que los tejidos que expresan un predominio de AChR se verán afectados de forma diferencial por los SNP en los receptores de ACh muscarínicos frente a los nicotínicos. Del mismo modo, los TRP se distribuyen de forma diferencial por todo el cuerpo en todos los tejidos. A esta complejidad se añade la relativa falta de conocimientos sobre las interacciones entre los TRP y los AChR en humanos. Curiosamente, ciertos receptores muscarínicos de ACh son antagonistas del TRPM3 a través, por ejemplo, del mAChM1R acoplado a fosfolipasa C [21h, 22h]. Dada esta investigación en desarrollo sobre la interdependencia de los mAChR y las familias TRP, los inventores se preguntan si las combinaciones de genotipos SNP de mAChM3R y TRPM3 en pacientes con CFS/ME contribuyen al patomecanismo y los fenotipos de esta enfermedad.

[0353] Aunque la distribución de estos receptores varía en las células mononucleares de sangre periférica, es probable que genotipos SNP como los identificados en esta cohorte de pacientes contribuyan a perturbaciones de la función del canal iónico TRP y AChR mediadas a través de la señalización alterada de calcio y ACh y se manifiesten como compromiso del sistema fisiológico. El papel fundamental de los AChR y los canales iónicos TRP en la señalización celular de Ca<2+>sugiere que una mayor caracterización de TRPM3 y mAChM3R podría dilucidar las perturbaciones de la señalización de segundos mensajeros en el CFS/ME. Además, los cambios en la estructura de estos receptores pueden contribuir a posibles respuestas autoinmunes. Una publicación reciente de Loebel et al [23h] sugiere un posible mecanismo autoinmune en un subgrupo de pacientes con CFS que afecta a los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) y a los receptores β adrenérgicos (βAdR). Sin embargo, las pruebas de una patología autoinmune son modestas, ya que sólo una minoría (29.5%) de los pacientes expresaron anticuerpos contra estos receptores. A pesar de las múltiples infusiones de Rituximab, sólo 15 de 25 pacientes respondieron. Sin embargo, la posibilidad de que algunos mecanismos autoinmunes contribuyan a los patomecanismos del CFS/ME podría ser una respuesta a la estructura alterada de los receptores o canales iónicos afectados por el SNP.

[0354] Ejemplo 5: Citotoxicidad de asesinos naturales y SNP en los genes de los canales iónicos TRP y AChR de células asesinas naturales aisladas en pacientes con ME/CFS

[0355] Las células NK son linfocitos granulares que se encuentran en la sangre periférica, la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos [1j-4j]. En la sangre periférica, las células NK constituyen el 15% de los linfocitos y pueden agruparse en cuatro subtipos según la expresión de superficie y la densidad de CD56 (molécula de adhesión de células neurales) y CD16 [receptor Fcγ III, el receptor de baja afinidad para la inmunoglobulina G (IgG)] [1j-3j, 5j, 6j]. Estos fenotipos incluyen CD56<bright>CD16<-/dim>, CD56<dim>CD16<bright>, CD56<dim>CD16-, CD56-CD16<bright>[1j-3j]. Aproximadamente el 90% de las células NK en sangre periférica son CD56<dim>CD16<bright>y CD56<bright>comprenden aproximadamente el 10% [2j-4j, 7j]. La actividad citotóxica de las células NK requiere una serie de procesos regulados para garantizar la apoptosis de la célula objetivo [8j].

[0356] Aunque se sabe poco sobre la señalización de calcio en las células NK, se ha observado que la vía de apoptosis dependiente de gránulos es dependiente de calcio mientras que la vía del receptor de muerte no lo es [9j, 10j]. En este caso, el transporte de proteínas líticas, la exocitosis y la fusión han mostrado una clara dependencia del calcio [11j-13j]. El calcio también es necesario para la reorientación de los microtúbulos y del esqueleto de actina, así como para la activación de la transcripción de genes de citoquinas [13j]. Además, los estudios han demostrado la relación entre la movilización de calcio y la anulación de la degranulación en células NK deficientes en fosfolipasa C (PLC)-γ2 [13j-15j].

[0357] Los canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) se expresan en casi todas las células y tienen un efecto significativo en las funciones fisiológicas [16j]. La desregulación de los TRP se ha asociado a condiciones patológicas y enfermedades [17j-21j]. Los canales iónicos TRP se activan en presencia de irritantes, productos inflamatorios y toxinas xenobióticas. Los canales iónicos TRP desempeñan un papel importante en la señalización del Ca<2+>.

[0358] La acetilcolina (ACh) se une a dos proteínas de membrana, a saber, los receptores muscarínicos (mAChR) y nicotínicos (nAChR), de los que existen múltiples isoformas. La ACh desempeña funciones no neuronales, denominadas sistema colinérgico no neuronal (NNCS), donde la ACh desempeña funciones endocrinas y paracrinas del tejido localizadas en el músculo liso, las células β pancreáticas, las células gliales, los linfocitos, las células del cristalino ocular y el endotelio vascular cerebral [17j-26j] que está mediada a través de la señalización de Ca<2+>. Los receptores de acetilcolina (AChR) transmiten señales de activación en diversos tejidos humanos, como el músculo esquelético y liso, todas las fibras nerviosas autónomas preganglionares, los nervios parasimpáticos autónomos postganglionares, así como en muchas localizaciones del sistema nervioso central (CNS) [27j-29j].

[0359] El CFS/ME se caracteriza por un deterioro significativo de la actividad física y una fatiga debilitante acompañada de un deterioro de la memoria, la cognición y la concentración, una mayor experiencia del dolor, así como una desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune [30j-42j]. Es importante destacar que la disfunción de las células NK, en particular la reducción de la actividad citotóxica de las células NK, es un hallazgo constante en los pacientes con CFS/ME [32j-36j, 39j, 43j]. Los inventores han descrito anteriormente SNP en genes de canales iónicos TRP y genes AChR, concretamente para los canales iónicos TRP TRPM3, TRPA1, TRPC4, el receptor muscarínico mAChRM3 y los receptores nicotínicos alfa nAChR alfa 10, alfa 5 y alfa 2 en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con CFS/ME. Estas anomalías SNP en los genes de los canales iónicos TRP y AChR pueden producir proteínas receptoras alteradas, cambiando potencialmente las estructuras de los canales iónicos TRP y AChR y también sus funciones.

[0360] El objetivo del presente estudio fue determinar la actividad citotóxica NK así como si los SNP y sus genotipos estaban presentes en los genes de los canales iónicos TRP y AChR en células NK aisladas de pacientes con CFS/ME.

[0361] Método

[0362] Sujetos

[0363] Los pacientes con CFS se definieron de acuerdo con los criterios del CDC de 1994 para el CFS [45j]. Para este estudio se reclutó a un total de 39 pacientes con CFS/ME y 30 controles no fatigados sin antecedentes médicos ni síntomas de fatiga prolongada o enfermedad de ningún tipo [45j].

[0364] Preparación de muestras y mediciones

[0365] Se extrajo un volumen de 80 ml de sangre de la vena antecubital de los participantes en tubos de recolección con heparina de litio y EDTA entre las 9 y las 11 horas. Las muestras de sangre de rutina se analizaron en las 6 horas siguientes a la recolección y se analizaron para recuento de glóbulos rojos, linfocitos, granulocitos y monocitos utilizando un contador celular automatizado (ACT Differential Analyzer, Beckman Coulter, Miami, FL). Consulte la Tabla 8.

[0366] Tabla 8: Características de los participantes con síndrome de fatiga crónica y controles sin fatiga

[0369]

[0371] Aislamiento de células NK

[0372] Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de 20 mL de sangre total para células NK utilizando Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). El enriquecimiento de NK se realizó utilizando el kit de aislamiento de NK (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las NK enriquecidas se examinó en el citómetro de flujo FACS Calibur (BD Bioscience, San Diego, CA) después de la tinción con CD16/CD56 como se ha descrito previamente [35j] (BD Bioscience, San Diego, CA). Se utilizaron la citometría de flujo y la evaluación con hemocitómetro para determinar la pureza de las células NK aisladas. La recuperación de células aisladas se calculó basándose en la observación de que las NK representan el 2% de los linfocitos de sangre periférica respectivamente [46j]. La recuperación se expresó como la relación entre el porcentaje del número total de células NK aisladas y el porcentaje de células presentes en el volumen de sangre recogido. Las células enriquecidas se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron 1a - 80 °C hasta su posterior evaluación.

[0373] Citotoxicidad de las células NK

[0374] La actividad citotóxica NK se realizó como se describió previamente [36j, 39j]. Brevemente, tras aislar los linfocitos NK mediante centrifugación en gradiente de densidad y marcarlos con PKH-26 al 0.4% (Sigma, St Louis, MO), las células NK se incubaron con células K562, durante 4 horas a 37°C en un 95% de aire, 5% de CO<2>a una proporción de efector a objetivo de 25 (células NK):1 (K562). Los inventores y otros investigadores han demostrado previamente que una relación E:T de 25:1 es la más óptima para evaluar la actividad citotóxica [36j, 39j]. La lisis de células NK se determinó tras cuatro horas de células NK con células K562, la lisis NK se calculó para determinar la muerte inducida de células tumorales o apoptosis [47j]. Se empleó la citometría de flujo Fortessa X-20 (BD Bioscience, San Jose, CA), utilizando reactivos Annexin V-FITC y 7-AAD (BD Pharmingen, San Diego, CA). La actividad citotóxica NK se realizó en las 2-4 horas siguientes a la recepción de todas las muestras de sangre.

[0375] Extracción de ADN

[0376] Se recolectó un volumen de40 mL en tubos con EDTA para el análisis de SNP. El ADN genómico se extrajo de todas las muestras de sangre total utilizando el minikit de ADN en sangre de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los estudios de genotipado de SNP se realizaron como se ha descrito previamente.

[0377] Análisis SNP

[0378] Se examinó un total de 678 SNP de células NK aisladas para veintiún genes de canales iónicos TRP de mamíferos(TRPA1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5yTRPV6) y para nueve genes de receptores de ACh de mamíferos (muscarínicos M1, M2, M3, M4, M5, nicotínicos alfa 2, 3, 5, 7, 10 y épsilon) y se examinaron utilizando MassARRAY iPLEX Gold Assay (Sequenom Inc.). La calidad y cantidad del ADN extraído se determinó mediante el Nanodrop (Nanodrop), donde se utilizaron aproximadamente 2 μg de ADN genómico para realizar el análisis SNP. El análisis de SNP se realizó como se ha descrito previamente. Brevemente, se empleó MassARRAY (plataforma de espectrometría de masas MALTI-TOF) para discriminar alelos basándose en la extensión de una sola base de un cebador de extensión de masa conocida que está diseñado para unirse directamente junto al sitio SNP de interés. Los pocillos multiplexados personalizados se diseñaron in silico utilizando Assay Design Suite de Agena. A continuación, se construyeron los multiplex diseñados utilizando oligonucleótidos sintetizados a medida que se agrupan para el procesamiento de las muestras. La química iPLEX Gold utilizó dos grupos de oligo multiplexados para cada pocillo de genotipado. Éstas se agruparon y equilibraron antes de compararlas con las muestras de ADN. En primer lugar, se utilizó un agrupamiento PCR multiplexado para generar amplicones cortos que incluyeran todos los marcadores genómicos de interés en ese pocillo concreto. Después de realizar la PCR y los pasos de limpieza, se llevó a cabo un paso secundario de "extensión" de la PCR utilizando grupos de cebadores de extensión diseñados para unirse directamente a los sitios SNP de interés. Se añadió una mezcla de terminación a la fase de extensión que permitió que estos cebadores de extensión se extendieran una sola base. Como el peso molecular del cebador de extensión es conocido, la discriminación del alelo pudo medirse utilizando las alturas de pico del cebador no extendido y de este cebador más las posibles posibilidades de extensión de una sola base para el SNP.

[0379] Pruebas de canales iónicos TRP y AChR SNP

[0380] Se crearon cebadores y cebadores de extensión para cada uno de los SNP utilizando el Assay Designer (Sequenom Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las siguientes condiciones: 94°C durante 2 minutos, 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto. A continuación, los productos de amplificación se trataron con fosfatasa alcalina de camarón a 37°C durante 40 minutos, 85°C durante 5 minutos de reacción y una incubación final a 4°C. Los cebadores de extensión se optimizan para controlar la relación señal-ruido donde los cebadores no extendidos (UEP) se examinan en el spectroCHIP y se evalúan en Typer 4,0 para permitir la división en UEP de masa baja, UEP de masa media y UEP de masa alta. Para realizar la reacción de extensión iPLEX, se preparó una mezcla de reacción iPLEX Gold utilizando iPLEX Gold Buffer Plus, mezcla de terminación iPLEX, enzima iPLEX y mezcla de cebadores. La reacción iPLEX se cicló a una desnaturalización inicial de 94°C durante 30 segundos, recocido a 52°C durante 5 minutos, extensión a 80°C durante 5 minutos (se realizaron cinco ciclos de recocido y extensión, pero la reacción completa se realizó en 40 ciclos) y extensión de nuevo a 72°C durante 3 minutos. Se utilizaron perlas de resina para aclarar todos los productos de reacción del iPLEX Gold. Después de la reacción iPLEX Gold, se realizó el MassARRAY utilizando el espectrómetro de masas MassARRAY, y los datos generados se analizaron utilizando el software TyperAnalyzer.

[0381] Análisis estadístico

[0382] El análisis estadístico se realizó con el software SPSS versión 22 [IBM Corp]. Los datos experimentales representados en este estudio se reportan como media más/menos el error estándar de la media (±SEM), mientras que todos los datos clínicos se reportan como media más/menos la desviación estándar (±SD). Las evaluaciones comparativas entre los participantes (CFS/ME y controles sin fatiga) se realizaron con la prueba de análisis de la varianza (ANOVA) y el criterio de significancia se fijó en p<0.05.

[0383] El PLINK v1.07 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) se usó para determinar las asociaciones entre los pacientes con CFS y el grupo de control sin fatiga. Se utilizó una prueba χ2 de dos columnas para examinar las diferencias en las que se determinó que un valor p de <0.05 era significativo y las variantes resultantes y sus consecuencias se pueden encontrar en la Tabla 9 para TRP y AChR, respectivamente. También se completó otro análisis de genotipos para las diferencias entre el CFS y el grupo sin fatiga según una prueba χ2 de dos columnas con una significancia de p <0.05 y los resultados se presentan en la Tabla 10. Los análisis se realizaron en el Australian Genome Research Facility Ltd, The Walter and Eliza Hall Institute, Parkville, Victoria, Australia.

[0384] Tabla 9:Análisis de la frecuencia, distribución y significancia de los SNP en los genes de los canales iónicos TRP y AChR en pacientes con CFS/ME (n=39_) y controles sin fatiga (n=30) por orden de significancia

[0385]

[0387] Tabla 10:Análisis del genotipo, razón de probabilidades y significancia de los SNP en los genes de los canales iónicos TRP y AChR en pacientes con CFS/ME (n=39) y controles sin fatiga (n=30) por orden de significancia

[0389]

[0391] Resultados

[0392] Participantes

[0393] Había 39 pacientes con CFS (edad = 51.69 ± 2.00 años), de los cuales el 72% eran mujeres y el 18% hombres. Hubo 30 controles no fatigados (edad = 47.60 ± 2.39 años), de los cuales el 24% eran mujeres y el 76% hombres. Todos los participantes de ambos grupos eran de ascendencia europea y residían en Australia en el momento de la extracción de sangre. No hubo cambios significativos en los recuentos de glóbulos blancos entre los pacientes con CFS/ME y el grupo de control no fatigado. La Tabla 8 presenta las características de los participantes.

[0394] Pureza de las células NK

[0395] No hubo diferencias significativas entre los grupos en cuanto a los niveles de pureza NK. La figura 1 muestra los altos niveles de pureza (> 93%) de las células NK tras el aislamiento y enriquecimiento.

[0396] Actividad citotóxica de las células NK

[0397] Hubo una diferencia significativa para la actividad citotóxica NK entre los grupos en la proporción E:T de 25:1. Los pacientes con CFS/ME presentaron una reducción significativa del % de lisis NK (17 ± 4.68) en comparación con el grupo de control (31 ± 6.78) (Figura 2).

[0398] Análisis SNP

[0399] De 678 SNP identificados en genes de canales iónicos TRP y AChR de células NK aisladas, hubo 11 SNP para genes de canales iónicos TRP(TRPC4, TRPC2, TRPM3 y TRPM8)significativamente asociados en el grupo CFS/ME. Cinco de estos SNP se asociaron conTRPM3(rs rs6560200; p= 0.010, rs1106948; p= 0.010, rs12350232; p= 0.018, rs11142822; p= 0.021, rs1891301; p= 0.024), mientras que los restantes estaban asociados conTRPM8(rs17865678;p=0.000, rs1156320; p=0.001), TRPC2 (rs7108612; p= 0.034, rs6578398; p= 0.0334) yTRPC4(rs2985167;p=0.001, rs655207;p=0.018). [0238] Catorce SNP se asociaron con genes de receptores de acetilcolina nicotínicos y muscarínicos, donde seis eran nAChR alfa 3 (rs12914385; p=0.015, rs2869546; p=0.021, rs951266; p=0.033, rs4243084; p=0.040, rs3743075; p=0.041, rs3743074; p=0.041), mientras que el resto estaban asociados con el nAChR alfa 2 (rs891398; p=0.017, rs2741343; p=0.019), el nAChR beta 4 (rs12441088; p=0.009), el nAChR alfa 5 (rs7180002; p=0.043) y el nAChR épsilon (rs33970119; p=0.041). La Tabla 9 representa los SNP para los genes de los canales iónicos TRP y AChR aislados de las células NK, respectivamente.

[0400] Análisis del genotipo

[0401] Hubo dieciséis genotipos identificados de SNP que se reportaron significativos para TRPM3 (n=5), TRPM8 (n=2), TRPC4 (n=3), TRPC2 (n=1), nAChR epsilon (n=1), nAChR alpha 2 (n=2), nAChR alpha 3 (n=1) y nAChR beta 4 (n=1). La Tabla 10 representa los genotipos para SNP en los genes TRP y AChR de las células NK aisladas que fueron reportados como estadísticamente significativos entre los grupos. La razón de probabilidades para genotipos específicos de SNP en genes TRP y AChR de células NK aisladas osciló entre 3.13 y 11.39 para el SFC/EM en comparación con el grupo de control sin fatiga.

[0402] Discusión

[0403] Se ha reportado previamente de una actividad citotóxica reducida de las células NK en el CFS/ME y la investigación actual apoya esos hallazgos. La presente investigación reporta hallazgos novedosos para un número de SNP en genes para variantes AChR y TRP y genotipos de células NK aisladas de pacientes con CFS/ME. Otro hallazgo novedoso de esta investigación es la identificación de SNP en TRPM3 y TRPM8 a partir de células NK aisladas, lo que sugiere que los receptores TRPM3 y TRPM8 se localizan en las células NK.

[0404] Esta investigación reporta una reducción significativa de la lisis NK en pacientes con CFS/ME en comparación con los controles no fatigados. Los canales iónicos TRP desempeñan un papel importante en la señalización del Ca<2+>y se ha documentado que las células inmunes expresan las subfamilias TRPC y TRPM, principalmente TRPC-1, 3, 5 y TRPM-2, 4, 7 [49j]. Estos canales no son selectivos y son permeables al calcio. En las células NK, el Ca<2+>desempeña un papel clave en la fusión de gránulos líticos [11j, 50j, 51j], así como para garantizar que los gránulos líticos se movilicen hacia la sinapsis inmunitaria para liberar perforina y granzimas con el fin de destruir las células objetivo [11j, 50j, 51j]. La Rho-GTPasa Miro, proporciona un enlace entre las mitocondrias y los microtúbulos, donde media en la detención dependiente de Ca<2+>de la motilidad mitocondrial [52j]. Dado que la Rho GTPasa Miro modifica la polarización mitocondrial, también puede alterar el transporte de gránulos líticos a la sinapsis inmunitaria, así como la función lítica, debido a la modulación por la concentración citosólica de Ca<2+>a través de los genotipos TRPM y AChR. Está claro que las mitocondrias desempeñan un papel clave en la función de las células NK. El reciente descubrimiento de que las mitocondrias expresan una serie de subtipos de AChR, incluido el nicotínico alfa 3, aunque se expresan de forma diferencial según el tipo de tejido [53j], sugiere que los nAChR pueden influir en la función mitocondrial y regular el estrés oxidante. Resulta interesante que los inventores hayan reportado previamente de una disminución significativa de la función del busto respiratorio de los neutrófilos de pacientes con CFS/ME [34j].

[0405] TRPM2 y TRPM3 movilizan Ca<2+>, donde el último ha demostrado mediar la señalización de Ca<2+>para la polarización y degranulación de gránulos citolíticos [54j]. La ADPR se dirige a los canales TRPM2 de los gránulos citolíticos, lo que provoca una señalización de Ca<2+>mediada por TRPM2, induciendo posteriormente la polarización y degranulación de los gránulos citolíticos, lo que se traduce en una actividad antitumoral. Además, las células NK tratadas con el antagonista ADPR habían reducido la polarización granular inducida por el tumor, la degranulación, la secreción de granzima B y la citotoxicidad de las células NK. Curiosamente, en anteriores investigaciones sobre el CFS/ME se han obtenido resultados similares en las funciones de las células NK [32j-36j], lo que podría sugerir que los cambios en el genotipo de TRPM3 descritos en el presente estudio también pueden desempeñar un papel similar en la polarización y degranulación de los gránulos citolíticos.

[0407] De los 678 SNP examinados, se encontró que once variantes para los canales iónicos TRP y catorce variantes para los AChRs estaban significativamente asociadas con los pacientes con CFS/ME en comparación con los controles no fatigados. Los SNP TRP variantes se localizaron en la secuencia génica de dos de los canales iónicos TRP canónicos (TRPC2 y TRPC4) y dos canales iónicos TRP melastínicos (TRPM3 y TRPM8). Los inventores también reportan SNP variantes en genes para dos de los receptores muscarínicos de acetilcolina tres (mAChRM3), dos receptores muscarínicos de acetilcolina uno (mAChRM1), seis receptores nicotínicos de acetilcolina alfa tres (nAChRα3), tres receptores nicotínicos de acetilcolina alfa dos (nAChRα2), un receptor nicotínico de acetilcolina alfa cinco (nAChRα5), así como un receptor nicotínico de acetilcolina beta cuatro (nAChRβ4) y un receptor nicotínico de acetilcolina épsilon (nAChRε).

[0409] La investigación actual de los inventores reporta asociaciones SNP significativas de genotipos para AChRs en células NK aisladas de pacientes con CFS/ME. Los linfocitos expresan tanto receptores muscarínicos como nicotínicos de acetilcolina (ACh), donde los linfocitos T y B y los monocitos expresan los cinco subtipos de mAChR (M(1)-M(5)), mientras que los nAChR se encuentran para las subunidades 2- 6, 2-4 y 9/10 [55j-58j]. Los linfocitos constituyen un sistema colinérgico independiente de los nervios colinérgicos, lo que da lugar a la regulación de la función inmunitaria [55j, 56j]. Se ha demostrado que los agonistas de los AChR potencian la citotoxicidad de los linfocitos, aumentan su GMPc intracelular y el inositol-1.4.5-trifosfato (IP3) [55j-59j], lo que sugiere que el sistema colinérgico linfocítico está implicado en la regulación de la función inmunitaria a través de los AChR acoplados a la fosfolipasa-C (PLC) mediante cambios en el [Ca2<+>] [60j-65j]. Investigaciones anteriores han destacado la importancia de las variantes a la hora de afectar las transcripciones de genes al causar un empalme alternativo que da lugar a anomalías en el ARNm y los productos de traducción [66j]. Los inventores también han identificado SNP y genotipo en nAChRε en pacientes con CFS/ME. Curiosamente, este SNP se localiza en la región 3' no traducida (3'-UTR), una importante región codificante que a menudo contiene regiones reguladoras que influyen postranscripcionalmente en la expresión génica. el 3'-UTR es un sitio de unión para proteínas reguladoras así como para microARNs (miARNs) [67j]. Al unirse a sitios específicos dentro del 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación del transcrito. La investigación previa de los inventores ha encontrado diferencias significativas en la actividad citotóxica NK así como en los miARN de células NK aisladas de pacientes con CFS/ME [32j].

[0411] Investigadores anteriores sugieren que el empalme alternativo en las secuencias codificantes y no codificantes puede tener resultados inesperados significativos en el mecanismo de empalme de las transcripciones genéticas [68j, 69j]. Las variantes genéticas de empalme localizadas en los exones, intrones, así como el ensamblaje del espliceosoma contribuyen al mecanismo de empalme para la correcta codificación de una secuencia de proteína. Además, los silenciadores y potenciadores ubicados en los exones o en los intrones intervienen en el reconocimiento de la secuencia correcta del exón [70j]. Es importante destacar que los intrones son capaces de generar espliceosomas activos, dando lugar a eventos de empalme alternativo [71j, 72j]. El gen 80036 (TRPM3) está asociado con la entrada de calcio y el agotamiento del almacenamiento de calcio a través de diferentes isoformas que se han identificado mediante empalme alternativo [Fruhwald, Julia, et al. "Alternative splicing of a protein domain indispensable for function of transient receptor potential melastatin 3 (TRPM3) ion channels." Journal of Biological Chemistry 287.44 (2012): 36663-36672]. El "indispensable para la función del canal" (ICF) es una región de 18 residuos de aminoácidos cuya ausencia hace que los canales sean funcionalmente incapaces de mediar la entrada de calcio, y se encuentra desprovisto en una variante de TRPM3 [73j]. La coexpresión de estas variantes de TRPM3 ICF con canales iónicos TRPM3 funcionales muestra además un deterioro de la movilización de calcio [73j]. Dado que las variantes ICF de TRPM3 muestran una expresión ubicua en muchos tejidos y tipos celulares y constituyen el 15% de todas las isoformas TRPM3, la expresión en las células NK puede proporcionar una explicación potencial para la reducción de la actividad citotóxica en pacientes con CFS/ME. Además, la selectividad iónica se produce a través del empalme selectivo del exón 24 y da lugar a dos variantes, TRPM3α1 y TRPM3α2 [73j, 74j]. Se destaca la importancia de estas dos isoformas, ya que TRPM3α1 media preferiblemente la conducción de cationes monovalentes, mientras que TRPM3α2 muestra una permeabilidad elevada y específica hacia los cationes divalentes, en particular el calcio [73j, 74j]. Esta alteración en la función puede atribuirse a la introducción de residuos de aminoácidos cargados positivamente en la región del poro [74j], lo que resulta en aumentos en la repulsión electrostática de cationes divalentes, promoviendo así aumentos en la selectividad monovalente [74j]. Por lo tanto, determinadas variantes de empalme, como TRPM3α1, podrían verse favorecidas, dando lugar a una disminución de la respuesta citotóxica de las células NK, así como de la detección del calor, incluida la desregulación de las respuestas termorreguladoras, la nocicepción y la transmisión del dolor, como la percepción del dolor central y periférico. Además, también se ha identificado que el TRPM8 se activa con el frío y los estímulos nocivos [75j-77j], lo que sugiere que los cambios en el genotipo descritos en esta investigación se corresponden con la presentación clínica de las respuestas termorreguladoras, la nocicepción y la transmisión de la percepción del dolor central y periférico observada en los pacientes con CFS/ME [78j].

[0412] Los resultados de los inventores sugieren que las variantes SNP y los genotipos reportados en las células NK pueden no ser exclusivos de este tipo de célula inmune. Los receptores de acetilcolina y los receptores de canales iónicos TRP están ubicados en múltiples tipos de células y controlan otras funciones de los sistemas corporales. La señalización de Ca<2+>en el contexto de los canales iónicos TRP, así como la función de los AChR, es vital para la función del CNS y existe una gran variedad de receptores nicotínicos expresados en células inmunes animales y humanas [58j]. Las inferencias relativas a los efectos diferenciales sobre la función entre estos sistemas deben tener en cuenta las limitaciones según los subtipos expresados respectivamente. El endotelio contiene receptores nicotínicos; nAChRα3, α5 y β4.α3 y α5 se encuentran en las arterias [79j-81j] y los nAChR α5, α7, β2 y β3 se encuentran en las células endoteliales cerebrales [82j], que son componentes importantes de la barrera hematoencefálica. Otros han descrito varios receptores nAChR localizados en mitocondrias, y dependiendo de los tejidos, las mitocondrias expresan varios subtipos de receptores nicotínicos de forma específica para cada tejido; las mitocondrias del cerebro y del hígado contienen receptores nicotínicos α7β2, α4β2 y menos α3β2, mientras que las mitocondrias del pulmón expresan preferiblemente el subtipo de receptor α3β4 [53j]. Curiosamente, este subtipo épsilon se ha identificado en timomas de pacientes con miastenia gravis [83j]. Cabe destacar que los nAChR están implicados en la excitación, el sueño y la fatiga, así como en las funciones responsables del procesamiento del dolor, la memoria y la cognición, todos los cuales son síntomas clínicos observados en pacientes con CFS/ME [84j-86j].Conclusión

[0413] En este estudio los inventores identificaron, por primera vez, SNP en genes para los canales iónicos TRPM3 y TRPM8 en células NK aisladas. Los inventores también identificaron numerosos SNP de nAChR junto con otros canales TRP en células NK aisladas, lo que indica que el sistema de acetilcolina no neuronal tiene un papel importante en la función de las células NK. Las anomalías en los genotipos de los canales iónicos TRP y AChR sugieren que la alteración del calcio sería una consecuencia funcional importante no sólo para las células NK, sino también en función del tipo de tejido, la susceptibilidad o la predisposición al CFS/ME.

[0414] Ejemplo 6: SNP y genotipos en los genes de los canales iónicos TRP y AChR de linfocitos B aislados en pacientes con ME/CFS

[0415] Se desconoce el patomecanismo del CFS/ME. Sin embargo, un pequeño subgrupo de pacientes ha mostrado anticuerpos muscarínicos y una reducción de la presentación de síntomas después de la intervención anti-CD20. Dado el importante papel del calcio (Ca<2+>) y la señalización de la acetilcolina (ACh) en la activación de las células B y el posible desarrollo de anticuerpos, el objetivo de los inventores en este Ejemplo era determinar los SNP y sus genotipos a partir de células B aisladas de pacientes con CFS/ME.

[0416] La acetilcolina (Ach) es un neurotransmisor colinérgico neuronal que desempeña una función vital transmitiendo señales de activación a receptores situados en el sistema nervioso central (CNS), así como en el músculo esquelético y liso, todas las fibras nerviosas autónomas preganglionares y los nervios parasimpáticos autónomos postganglionares, así como las células inmunes y otros tejidos a través del sistema colinérgico no neuronal [1x-4x]. Existen dos tipos de proteínas de membrana que se unen al ACh conocidas como receptores muscarínicos (mAChRs) y receptores nicotínicos (nAChRs). Es importante destacar que ambas proteínas receptoras (mAChR y nAChR) tienen múltiples isoformas. Mientras que los receptores muscarínicos son receptores metabotrópicos clasificados M1-M5, los receptores nicotínicos son canales iónicos y, con la excepción del nicotínico homomérico alfa 7, son heterómeros con varias combinaciones de normalmente dos subtipos (seleccionados entre 9 alfa y 3 beta) [5x]. La proporción de subtipos afecta a la velocidad de conducción de la señal a través del receptor [6x]. Es importante destacar que un subtipo de receptor puede afectar a la función del receptor del otro subtipo vinculado.

[0417] La ACh también funciona dentro del sistema colinérgico no neuronal (NNCS) donde la ACh se une a AChRs que se han encontrado en células inmunes y otros tipos de células. La ACh es producida por los linfocitos, donde se ha demostrado que los nAChR influyen en la función de los linfocitos B, incluido su desarrollo en la médula ósea, así como en la regulación de la activación de los linfocitos B y la respuesta de los autoanticuerpos [7x-9x]. La ACh también desempeña funciones endocrinas y paracrinas en tejidos como el músculo liso, las células beta pancreáticas, las células gliales, los linfocitos, las células del cristalino ocular y el endotelio vascular cerebral [10x-14x]. La señalización del calcio es muy importante para la activación de los receptores de la superficie celular de las células inmunes. Además, estas funciones de la ACh están mediadas por la señalización del Ca<2+>.

[0418] Curiosamente, se ha descubierto que los receptores muscarínicos de acetilcolina son inhibidos por otro canal de calcio [15x]. Los canales iónicos del potencial receptor transitorio (TRP) de los mamíferos son canales catiónicos permeables al Ca<2+>que, cuando se abren, actúan como una señal excitadora para inducir la despolarización de la célula y provocar la afluencia de Ca<2+>, que desempeña un papel en las vías de señalización intracelular. (TRP) se componen de seis grupos principales: TRPA (anquirina), TRPC (canónico), TRPM (melastatina), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) y TRPV (vanilloide) [16x]. Los TRP están presentes en casi todas las células y su desregulación se ha asociado a condiciones patológicas y enfermedades [17x-22x].

[0419] Los inventores han descrito previamente polimorfismos de nucleótido único (SNP) en genes para receptores donde el calcio Ca<2+>es un componente clave importante en su función. Además, los inventores han demostrado cambios en la movilización intracelular de Ca<2+>para TRPM3 de células NK y linfocitos B. Por lo tanto, estos SNP y sus genotipos para los canales iónicos TRP y AChR pueden producir proteínas receptoras alteradas, cambiando potencialmente las estructuras y funciones de los canales iónicos TRP y AChR. Un estudio reciente informó de que un subgrupo de pacientes con CFS/ME tenía anticuerpos muscarínicos y se produjo una modesta respuesta positiva con reducción de la presentación de síntomas después de la intervención anti-CD20 [39x]. Dada la importancia de la señalización del Ca<2+>y la acetilcolina (ACh) en la activación de las células B, así como su potencial para el desarrollo de anticuerpos, el objetivo de esta investigación fue determinar los SNP y sus genotipos para los TRP y AChR de células B aisladas de pacientes con CFS/ME.

[0420] Método

[0421] Sujetos

[0422] Los pacientes con CFS/ME se definieron de acuerdo con los criterios del CDC de 1994 para el CFS/ME [40x]. Para este estudio se reclutó a un total de 11 pacientes con CFS/ME y 11 controles no fatigados sin antecedentes médicos ni síntomas de fatiga prolongada o enfermedad de ningún tipo [40x].

[0423] Preparación de muestras y mediciones

[0424] Se extrajo un volumen de 40 ml de sangre de la vena antecubital de los participantes en tubos de recolección con heparina de litio y EDTA entre las 9 y las 11 horas. Las muestras de sangre de rutina se analizaron en las 6 horas siguientes a la recolección y se analizaron para recuento de glóbulos rojos, linfocitos, granulocitos y monocitos utilizando un contador celular automatizado (ACT Differential Analyzer, Beckman Coulter, Miami, FL). Consulte la Tabla 11.

[0425] Tabla 11:Características de los participantes con CFS/ME y controles sin fatiga.

[0428]

[0430] Aislamiento de células B

[0431] Se extrajo un volumen de 40 ml de sangre de la vena antecubital de los participantes en tubos de extracción de sangre EDTA entre las 8 am y las 11 am Las muestras de sangre de rutina se analizaron en las 6 horas siguientes a la recolección y se analizaron para recuento de glóbulos rojos, linfocitos, granulocitos y monocitos utilizando un contador celular automatizado (ACT Differential Analyzer, Beckman Coulter, Miami, FL). Consulte la Tabla 11.

[0432] Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 40 mL de sangre entera para el aislamiento de células B utilizando el método descrito previamente Jamies et al. (2004) [69x]. Brevemente, las PBMC se aislaron mediante gradiente de densidad con Ficoll- Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Posteriormente, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.).

[0433] A continuación, las células se resuspendieron en amortiguador de separación autoMACs, que contiene PBS con albúmina de suero bovino, EDTA y 0.09% de azida (Miltenyi Biotec. Auburn, Calif.). La selección negativa inmunomagnética de células B se realizó con un kit de aislamiento de células B II (Miltenyi Biotec. Auburn, Calif.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células no B, como las células T, las células NK, las células dendríticas, los monocitos, los granulocitos y las células eritroides, se marcan magnéticamente de forma indirecta utilizando un cóctel de anticuerpos conjugados con biotina contra CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 y CD235a (Glicoforina A). En consecuencia, el aislamiento de las poblaciones de células B se consigue mediante la depleción de las células marcadas magnéticamente.

[0434] Las células B intactas se midieron con citometría de flujo LSR Fortessa X-20 donde las células se tiñeron fluorescentemente con anti-CD19-BV421 y anti-CD3-PerCP. Los restos celulares y las células muertas se excluyeron del análisis basándose en las señales de dispersión. La pureza media fue del 85.66% ± 9.6% para los controles no fatigados y del 76.5% ±13.1% para los pacientes con CFS/ME, sin que hubiera diferencias significativas entre los grupos en cuanto a los niveles de linfocitos B.

[0435] Extracción de ADN

[0436] Se recolectó un volumen de 40 mL en tubos con EDTA para el análisis de SNP. El ADN genómico se extrajo de todas las muestras de sangre total utilizando el minikit de ADN en sangre de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los estudios de genotipado de SNP se realizaron como se ha descrito previamente.

[0437] Análisis SNP

[0438] Se examinó un total de 661 SNP de células B para veintiún genes de canales iónicos TRP de mamíferos(TRPA1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5yTRPV6) y para nueve genes de receptores ACh de mamíferos (muscarínicos M1, M2, M3, M4, M5, nicotínicos alfa 2, 3, 5, 7, 9, 10, beta 1, 4 y épsilon) y se examinaron utilizando el ensayo MassARRAY iPLEX Gold (Sequenom Inc.).

[0439] La calidad y cantidad del ADN extraído se realizó como se ha descrito previamente [44x, 48x]. Brevemente se utilizó un Nanodrop (Nanodrop) para cuantificar el ADN genómico donde se utilizaron aproximadamente 2 μg de ADN genómico para realizar el análisis SNP. Se empleó MassARRAY (plataforma de espectrometría de masas MALTI-TOF) para discriminar alelos basándose en la extensión de una sola base de un cebador de extensión de masa conocida diseñado para acoplarse directamente junto al sitio SNP de interés. Los pocillos multiplexados personalizados se diseñaron in silico utilizando Assay Design Suite de Agena. A continuación, se construyeron los multiplex diseñados utilizando oligonucleótidos sintetizados a medida que se agrupan para el procesamiento de las muestras. La química iPLEX Gold utilizó dos grupos de oligo multiplexados para cada pocillo de genotipado. Se utilizó un agrupamiento PCR multiplexado para generar amplicones cortos que incluyeran todos los marcadores genómicos de interés en ese pocillo en particular. Después de la PCR y los pasos de limpieza, se llevó a cabo un paso secundario de "extensión" de la PCR utilizando grupos de cebadores de extensión diseñados para unirse directamente a los sitios SNP de interés. Durante la fase de extensión se añadió una mezcla de terminación que permitió extender estos cebadores de extensión una sola base. Dado que se conoce el peso molecular del cebador de extensión, la discriminación del alelo pudo medirse utilizando las alturas de pico del cebador no extendido y de este cebador más las posibles posibilidades de extensión de una sola base para el SNP.

[0440] Pruebas de canales iónicos TRP y AChR SNP

[0441] Se crearon cebadores y cebadores de extensión para cada uno de los SNP utilizando el Assay Designer (Sequenom Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y descritas previamente [44x, 45x]. Brevemente, el ADN se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las siguientes condiciones: 94°C durante 2 minutos, 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto, donde los productos de amplificación se trataron después con fosfatasa alcalina de camarón a 37°C durante 40 minutos, 85°C durante 5 minutos de reacción y una incubación final a 4°C. Los cebadores de extensión se optimizan para controlar la relación señal-ruido, donde los cebadores no extendidos (UEP) se examinan en el spectroCHIP y se evalúan en Typer 4,0 para permitir la división en UEP de masa baja, UEP de masa media y UEP de masa alta. Se preparó una mezcla de reacción iPLEX Gold utilizando iPLEX Gold Buffer Plus, mezcla de terminación iPLEX, enzima iPLEX y mezcla de cebadores para realizar la reacción de extensión iPLEX. Esta reacción consistió en ciclar a una desnaturalización inicial de 94°C durante 30 segundos, recocido a 52°C durante 5 minutos, extensión a 80°C durante 5 minutos (se realizaron cinco ciclos de recocido y extensión, pero la reacción completa se realizó en 40 ciclos) y extensión de nuevo a 72°C durante3 minutos. Se utilizaron perlas de resina para aclarar todos los productos de reacción del iPLEX Gold. Después de la reacción iPLEX Gold, se realizó el MassARRAY utilizando el espectrómetro de masas MassARRAY, y los datos generados se analizaron utilizando el software TyperAnalyzer.

[0442] Análisis estadístico

[0443] El análisis estadístico se realizó con el software SPSS versión 22 [IBM Corp]. Los datos experimentales representados en este estudio se reportan como media más/menos el error estándar de la media (±SEM), mientras que todos los datos clínicos se reportan como media más/menos la desviación estándar (±SD). Las evaluaciones comparativas entre los participantes (CFS/ME y controles sin fatiga) se realizaron con la prueba de análisis de la varianza (ANOVA) y el criterio de significancia se fijó en p<0.05.

[0444] El PLINK v1.07 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) se usó para determinar las asociaciones entre los pacientes con CFS/ME y el grupo de control sin fatiga. Se utilizó una prueba χ2 de dos columnas para examinar las diferencias donde se determinó que un valor p de <0.05 era significativo y las variantes resultantes y sus consecuencias se pueden encontrar en la Tabla 12 para TRP y AChR, respectivamente.

[0446] Tabla 12:Análisis de la frecuencia, distribución y significancia de SNP en células B para canales iónicos TRP y AChRs en pacientes con Síndrome de Fatiga Crónica/Encefalomielitis Miálgica y controles no fatigados por orden de significancia

[0449]

[0450]

[0452] También se completó otro análisis de genotipos para diferencias entre CFS/ME y el grupo sin fatiga según una prueba χ2 de dos columnas con significancia de p <0.05 y los resultados se presentan en la Tabla 13. Los análisis se realizaron en el Australian Genome Research Facility Ltd, The Walter and Eliza Hall Institute, Parkville, Victoria, Australia. Tabla 13:Análisis del genotipo, razón de probabilidades y significancia de SNP en genes de células B para canales iónicos TRP y AChRs en pacientes con Síndrome de Fatiga Crónica/Encefalomielitis Miálgica y controles no fatigados en orden de significancia.

[0455]

[0457] Resultados

[0458] Participantes

[0459] Había 11 pacientes con CFS/ME (edad = 31.82 ± 5.50 años), de los cuales el 72.7% eran mujeres. Hubo 11 controles no fatigados (edad= 33.91 ± 5,06 años), con un 63.6% de mujeres. Todos los participantes de ambos grupos eran de ascendencia europea y residían en Australia en el momento de la extracción de sangre. No hubo cambios significativos en los recuentos de glóbulos blancos entre los pacientes con CFS/ME y el grupo de control no fatigado. La Tabla 11 presenta las características de los participantes.

[0460] Análisis SNP

[0461] De 661 SNP identificados en genes de canales iónicos TRP y AChR de células B, un total de setenta y siete SNP se asociaron con genes de receptores nicotínicos y muscarínicos de acetilcolina en pacientes con CFS/ME. Aparecieron un total de treinta y cinco SNP para mAChM3, mientras que el resto de SNP predominantes se identificaron para nAChR delta (n=12), nAChR alfa 9 (n= 5), TRPV2 (n= 7), TRPM3 (n=4), TRPM4 (n=1), mAChRM2 (n=2) y mAChRM5 (n=3). La Tabla 12 representa los SNP para los genes de los canales iónicos TRP y AChR en linfocitos B.

[0462] Análisis del genotipo

[0463] Se identificaron nueve genotipos de SNP que informaron ser significativos para TRPM3 (n=1), TRPC6 (n=1), mAChRM3 (n=2), nAChR alfa 4 (n=1) y nAChR beta 1 (n=4). La Tabla 13 representa los genotipos para SNP en los genes TRP y AChR de linfocitos B que fueron reportados como estadísticamente significativos entre los grupos. La razón de probabilidades para genotipos específicos de SNP en genes TRP y AChR de linfocitos B osciló entre 7.11 y 26.67 para SFC/EM en comparación con el grupo de control sin fatiga.

[0464] Genotipo con 11 pacientes con CFS/ME y 11 controles sin fatiga. Los datos presentados se incluyen para p<0.05. Los datos se presentan para el gen (TRPM3, TRPC6, AChRM3, alfa 3.4, 7y beta 1), la localización cromosómica (CHR), la identificación del SNP de referencia (RefSNPID), el porcentaje de pacientes con CFS/ME con genotipo (%), el porcentaje de controles sin fatiga (5), la chi-cuadrado (χ2) para la prueba alélica básica (1 df), la razón de probabilidades (OR) y (*) el valor P para este conjunto de pruebas con una significancia de <0.05.

[0465] Discusión

[0466] La presente investigación reporta nuevos hallazgos para un número de SNP en genes para variantes AChR y TRP y genotipos de células B de pacientes con CFS/ME. Estos datos son coherentes con los hallazgos de los inventores anteriores en PBMC y células NK, que muestran células B de alta prevalencia de SNP y genotipos en los genes TRP y AChR en pacientes con CFS/ME.

[0467] Los niveles intracelulares de Ca<2+>están sustancialmente modulados por alteraciones inducidas por receptores y son críticos para la diferenciación y función de los linfocitos. El Ca<2+>regula los receptores de antígenos, los correceptores, la transducción de señales, la función mitocondrial, los factores transcripcionales y la expresión génica [42x-45x]. Por ejemplo, la entrada de Ca<2+>está regulada por canales de la membrana plasmática, canales de receptores intracelulares, canales de cationes no selectivos, transportadores de membrana específicos y el potencial de la membrana celular [20x, 45x, 46x].

[0468] El sistema inmune depende de la señalización colinérgica, ya que las células B y T expresan receptores colinérgicos y regulan las citocinas en las respuestas inflamatorias [47x, 48x] y la función inmunitaria [49x]. La señalización colinérgica influye tanto en las respuestas de las células B [9x] como en las de las células T [50x] y se ha descubierto que inicia la autoinmunidad de las células B [51x]. En los SNP de receptores colinérgicos, el mAChM3R ocupó un lugar destacado (45%), lo que concuerda con los hallazgos de los inventores sobre los SNP y su genotipo en las células NK. En la presente investigación se han notificado dos genotipos SNP para mAChM3R. Sin embargo, dado el pequeño número de muestras, así como teniendo en cuenta los resultados anteriores de los inventores sobre los genotipos SNP de células NK aisladas y PBMC. otros genotipos para este receptor pueden estar presentes en pacientes con CFS/ME. Un estudio reciente ha reportado de un subgrupo de pacientes con CFS/ME que presentaban anticuerpos muscarínicos (mAChM3R) y se produjo una modesta respuesta positiva con reducción de la presentación de síntomas después de la intervención anti-CD20 [39x]. Dado que este hallazgo sólo se comunicó en un pequeño grupo de pacientes y no se reportaron SNP del genotipo, los hallazgos actuales de los inventores, junto con sus hallazgos anteriores del genotipo SNP en células NK aisladas de una cohorte mayor, sugieren que estos cambios en el genotipo SNP y sus combinaciones pueden desempeñar un papel en la función de las células B. Además, la distribución ubicua de los receptores colinérgicos por todo el cuerpo sugiere que las anomalías en los genotipos SNP y su configuración y patrón de heterodímeros pueden contribuir a los diversos síntomas clínicos del CFS/ME.

[0469] Los inventores han identificado SNP en receptores muscarínicos y nicotínicos de diversas células sanguíneas, como PBMC y células asesinas naturales aisladas en cohortes más grandes de pacientes con CFS/ME, sugiriendo que la señalización colinérgica puede estar impedida en este trastorno. La señalización muscarínica tiene un papel en la función gastrointestinal [52x], ya que se ha descubierto que los anticuerpos contra los mAChM3R inhiben la motilidad gastrointestinal y la neurotransmisión colinérgica [53x]. Los mAChM3R están ampliamente distribuidos en el corazón, donde regulan la hidrólisis intracelular de fosfoinositidos para mejorar la contracción cardiaca, la función hemodinámica [54x] y proporcionar un efecto protector contra la isquemia [55x]. Los mAChM3Rs se localizan en el páncreas, donde median el control de la acetilcolina sobre la secreción de insulina y tienen otras funciones reguladoras importantes [56x-58x].

[0470] La señalización nicotínica vía nAChRs está ampliamente distribuida en organismos demostrando el carácter universal de la señalización colinérgica. Los nAChR de tipo muscular, como el β1, son similares en todas las partes del cuerpo [7x]. En los datos de los inventores, hay una alta demostración de SNP y genotipos en los nAChRs, lo que sugiere que la extensión de los genotipos SNP en los receptores colinérgicos puede desempeñar un papel en la función de las células B, ya que la acetilcolina funciona como un regulador paracrino/autocrino de las funciones inmunes y otras funciones fisiológicas [59x]. Los presentes datos destacan los genotipos SNP para el nAChR beta 1, donde los SNP rs3829603 (C/C) y rs4151134 (T/T) se localizan en la región 3' no traducida y demuestran una razón de probabilidades significativa para estos genotipos en el rango entre 17.50-26.67 para el grupo CFS/ME. Esta localización es una región reguladora que influye postranscripcionalmente en la expresión génica: el 3'-UTR es un sitio de unión para proteínas reguladoras [60x]. La unión a sitios específicos dentro del 3'-UTR puede disminuir la expresión génica de varios ARNm, ya sea inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación de la transcripción. Además, el sitio de unión al agonista de los nAChR está ubicado en la interfaz entre subunidades adyacentes. La unión del agonista que se localiza en la subunidad α (α1, α2, α3, α4, α6, α7, o α9), y la unión del sitio de unión del agonista negativo está compuesta por la subunidad α10, β2, β4, δ,γ, o ε. Es importante destacar que las subunidades α5, β1 y β3 se ensamblan en el complejo receptor asumiendo la posición de quinta subunidad, donde no participan directamente en la formación del sitio de unión al agonista, sin embargo, forman una configuración integral para la unión a agonistas y la selectividad del ligando [61x]. Dado el número de genotipos SNP para el nAChR β1 que estaban localizados en la 3'UTR, la quinta subunidad puede alterar la selectividad del ligando. Además, se ha demostrado que diversas combinaciones de subunidades dan lugar a diferentes subtipos de nAChR que varían en los parámetros cinéticos y la selectividad de los canales iónicos, así como en la especificidad del ligando, las vías de señalización y las funciones que se realizan en diferentes tejidos [62x]. La densidad de distribución de los AChR en todo el cuerpo significa que es probable que se vean afectados muchos tejidos en los que se produce la expresión de AChR, lo que sugiere una posible pérdida de función de las vías de señalización colinérgica neuronales y no neuronales en prácticamente todos los tejidos corporales. Curiosamente, los inventores y otros han reportado previamente de cambios en los fenotipos de las células B de pacientes con CFS/ME [26x, 63x] y, en un estudio anterior, los inventores reportaron una reducción de la movilización de calcio en las células B a través de TRPM3 cuando se identificó que este receptor tenía genotipos SNP 3'UTR.

[0471] La señalización colinérgica en el cerebro se centra principalmente en dos loci principales, el cerebro anterior basal y el área pedúnculo-pontina del cerebro posterior [64x]. La vasoconstricción aguda se produce después de la eliminación de la entrada parasimpática colinérgica a las arterias cerebrales del cerebro anterior [65x], lo que indica la importancia crítica de la señalización colinérgica intacta en el cerebro. Tanto la señalización colinérgica nicotínica como la muscarínica influyen en la plasticidad sináptica del hipocampo y en el procesamiento de las funciones cognitivas superiores dependientes de la colinergia [66x]. La señalización colinérgica y glutamatérgica demuestra la interdependencia en la función de las células gliales corticales en estudios sobre el sueño y la vigilia [67x]. Funciones clave del CNS, como la formación de la memoria, están asociadas a la potenciación a largo plazo (LTP) en las sinapsis del hipocampo. Este mecanismo de memoria depende del Ca<2+>a través de su asociación con la señalización colinérgica [68x].

[0472] Conclusión

[0473] Estos hallazgos de genotipos SNP en genes colinérgicos y receptores TRP en células B, y previamente en PBMC y células NK aisladas, sugieren una contribución potencial a la patología generalizada en todos los sistemas de órganos del cuerpo, incluyendo los sistemas inmune, CNS. cardíaco, gastrointestinal y hormonal. Es probable que los efectos de estos genotipos SNP sobre la señalización colinérgica sean especialmente importantes en el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico y el sistema nervioso autónomo, así como en otros sistemas orgánicos. En conjunto, los efectos funcionales de estos genotipos SNP y sus combinaciones sugieren que pueden ser factores contribuyentes en la etiología y los fenotipos clínicos del CFS/ME.

[0474] Ejemplo 7 - Reducción de la expresión de la superficie celular de TRPM3 en células NK y linfocitos B de pacientes con CFS/ME, así como disminución del calcio intracelular

[0475] En los Ejemplos anteriores, los inventores identifican SNP en canales iónicos TRP, concretamente de la familia TRPM3 (rs12682832; rs11142508; rs1160742; rs4454352; rs1328153; rs3763619; rs7865858; rs1504401; rs10115622), así como TRPA1 (rs2383844; rs4738202) y TRPC4 (rs6650469; rs655207) en pacientes con CFS/ME, así como SNP en receptores de ACh, principalmente receptores muscarínicos M3 (mAChRm3), (rs4463655; rs589962; rs1072320; rs7543259; rs6661621; rs7520974; rs726169; rsrs6669810; rsrs6429157), así como los receptores nicotínicos de ACh (nAChR) alfa 10 (rs2672211; rs2672214; rs2741868; rs2741870; rs2741862), alfa 5 (rs951266; rs7180002) y alfa 2 (rs2565048; P = 0.01403. Estos canales y receptores iónicos se expresan ampliamente en células y tejidos de todo el organismo y están estrechamente relacionados con la sintomatología que suele aparecer en el CFS/ME. Los inventores demostraron que se presentan en el 99-100% de los n=115 pacientes con CFS/ME, frente al 0-1% en los controles sanos de n=90 (véase la Tabla 7).

[0476] Datos presentados para el gen (TRPM3 y mAChR3), localización cromosómica (CHR), identificación del SNP de referencia (Ref SNP ID), localización del par de bases (BP) del SNP, alelos (A1 y A2), chi-cuadrado (χ2) para la prueba alélica básica (1 df), el valor p para este conjunto de pruebas es de significancia de p < 0.05, odds ratio (OR), porcentaje de pacientes con SFC con SNP y porcentaje de controles sin fatiga con SNP.

[0477] Recientemente otros han reportado que se ha encontrado que los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR3) inhiben TRPM3 vía la acción de la fosfolipasa C [41y]. Dado que los presentes inventores encontraron una asociación significativa con SNP en TRPM3 y mAChR3 en pacientes con CFS/ME y que ambos receptores median la movilización de calcio intracelularmente para la función celular, como la lisis NK, los presentes inventores investigaron la expresión de superficie de TRPM3 en células NK y linfocitos B y determinaron este fenotipo en pacientes con CFS/ME en comparación con controles sanos.

[0478] En este Ejemplo los inventores describen, por primera vez, una reducción significativa en la expresión de la superficie celular de TRPM3 en células NK y linfocitos B de pacientes con CFS/ME, así como una disminución del calcio intracelular.

[0479] Métodos

[0480] La preparación de la muestra y otros pasos se llevaron a cabo en gran medida como se describe en el Ejemplo 5.Ensayo de inmunofenotipado TRPM3

[0481] Las PBMC se incubaron en 20μl de reactivo de bloqueo FCR (Miltenyi Biotech) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con amortiguador fosfato salino (PBS) y se centrifugaron a 400g durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se incubó con anticuerpos primarios marcados con fluorocromos (CD19-BV421, CD3-PerCP, CD56-BV421 y CD16-APC Cy7, BD Bioscience) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células marcadas se lavaron y se incubaron con 10μg de concentración final de anticuerpo TRPM3 antihumano de cabra durante 30 minutos, seguido de un lavado y resuspendido en una concentración final del5% (v/v) de albúmina de suero bovino (Sigma) durante 30 minutos. Las células se lavaron de nuevo y se incubaron con 5 μg de concentración final de IgG de burro anti-cabra FITC (Santa Cruz) durante 30 minutos. Se lavaron las células y se resuspendieron en 200 μl de amortiguador de tinción (BD Bioscience) y se adquirieron a 50.000 eventos utilizando LSRFortessa X-20 (BD Bioscience). Las poblaciones de linfocitos se identificaron mediante diagramas de puntos de dispersión frontal y dispersión lateral (FSC. SSC). Se excluyeron las células CD3<+>y sólo se utilizaron linfocitos CD3<->para caracterizar los linfocitos B y las poblaciones de subconjuntos de células NK mediante CD19, CD56 y CD16. Las células B totales se identificaron como CD19<+>, mientras que los subconjuntos de células NK se caracterizaron mediante la expresión de células NK CD56<Bright>CD16<Dim->, células NK CD56<Dim>CD16<Bright+>y células NK CD56-CD16<+>. La lisis de NK, la degranulación y las proteínas líticas se realizaron como se ha descrito previamente [42y].

[0482] Se utilizó citometría de flujo LSRFotessa X-20 para la determinación secuencial del calcio citoplasmático [Ca2<+>]C y mitocondrial [Ca2<+>]M, para ayudar a comparar la cinética de influjo de Ca2<+>citoplasmático o mitocondrial en linfocitos B y células NK. Se utilizaron mediciones cinéticas de caracterización utilizando la fluorescencia media del colorante Fura-AM o Rhod-2 AM y se aplicó el método de la curva de suavizado para medir el área bajo la curva (AUC).

[0483] Ensayo de afluencia de calcio citoplasmático

[0484] Después de la tinción fenotípica, las células se incubaron con 0.5 ml de amortiguador de tinción que contenía 0.02% de Pluronic<®>F-127 y 1μM de Fura-red AM o Rhod-2 AM durante 30 minutos en la incubadora a 37°C. Las células teñidas se lavaron con DPBS sin calcio ni magnesio. Las células teñidas con Fura AM se estimularon tras 30 segundos de adquisición citométrica de flujo en presencia de una concentración final de 1.4 μg de estreptavidina, 714ng de ionomicina, 50μg de 2-APB o 14μg de Thapsigargin. Los datos se registraron durante 4 minutos. Las células teñidas con Rhod-2 AM se incubaron durante 12 horas más, antes de la adquisición. La tapsigargina es un potente inhibidor de los receptores de las ATPasas de Calcio y eleva la concentración de calcio citoplasmático al inhibir la capacidad de las células para bombear calcio al retículo endoplasmático (RE). se utilizaron 50μg de 2-aminoetoxidifenil borato (2-APB) dada su inhibición deER e IP<3>R. Se identificaron los receptores NK (NG2DA y NKp46) para el entrecruzamiento de la afluencia de calcio para la activación, co-activación y co-estimulación de las células NK humanas en reposo, mientras que, CD19 y el receptor del complemento CR2 (CD21) responsable de la transducción de señales y la activación de la inmunoglobulina M (IgM) se identificaron para el entrecruzamiento de la afluencia de calcio inducida a la activación mejorada de las células B CD19 .

[0485] Análisis estadístico

[0486] El análisis estadístico se realizó con el software IBM SPSS Statistics versión 22 (SPSS, Chicago, USA). Se comprobó la significancia mediante MANOVA (p<0.05 para significancia) entre los grupos sano y CFS/ME utilizando parámetros que incluían TRPM3, afluencia intracelular y de calcio en linfocitos B y células NK. Se empleó Flowjo para analizar los archivos FCS extraídos del software FACSDiva 8 (BD Bioscience). Se realizó una prueba post hoc para determinar específicamente dónde estaba la significancia entre los grupos (Control y CFS/ME). Se utilizó la prueba de Levene para analizar la homogeneidad de la varianza entre los grupos.

[0487] Discusión

[0488] Los inventores han identificado, por primera vez, TRPM3 en células NK y linfocitos B, y también reportan de una reducción significativa de la expresión superficial de TRPM3 en linfocitos B y células NK en pacientes con CFS/ME en comparación con controles sanos (ver Figura 3A y Figura 3B).

[0489] Los inventores también informan, por primera vez, una reducción significativa en la concentración de iones de calcio citoplasmático en los linfocitos B CD19<+>durante la reticulación entre CD21 e IgM después del tratamiento con estepadividina o tapsigargina en pacientes con SFC/EM (Figura 4A), así como las células NK CD56<Bright>también tuvieron una disminución significativa en el calcio citoplasmático en presencia de 2-APB y tapsigargina en pacientes con SFC/EM (Figura 4B). En conjunto, estos hallazgos sugieren que TRPM3 desempeña un papel en la alteración del influjo citoplasmático de calcio en linfocitos B y células NK de pacientes con CFS/ME.

[0490] Ejemplo 8 - Otros SNP y genotipos en los genes de los canales iónicos TRP y AChR de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos B aislados y células NK en pacientes con CFS/ME

[0491] Los ejemplos anteriores describen SNP del canal iónico TRP y genes AChR de PBMC, linfocitos B aislados y células NK que puntuaron significativamente en una cohorte de 115 pacientes con CFS/ME. Utilizando cohortes más amplias, los inventores creen que otros SNP identificados también obtendrán puntuaciones significativas, por lo que también serán útiles como sondas, herramientas o reactivos para identificar, cribar, diagnosticar, monitorear o tratar a sujetos con, o predispuestos a, afecciones médicas (o síntomas de las mismas), como el síndrome de fatiga crónica (CFS), la encefalomielitis miálgica (EM), el síndrome de la guerra del Golfo (GWS), el síndrome del intestino irritable (IBS), la sensibilidad química múltiple (MCS), la fibromialgia y la migraña, así como algunas afecciones médicas causadas por la desregulación del calcio, la acetilcolina y el TRP, y la desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular, neurológico, genitourinario e inmune.

[0492] Los SNP identificados que tienen valores p de 0.05 a 0.1, que los inventores creen que pueden puntuar significativamente en una cohorte mayor de pacientes, se enumeran en las tablas siguientes (Tablas 14 a 17). Tabla 14: Análisis de la distribución de frecuencias y significancia de los SNP del gen AChR en PBMC de pacientes con CFS/ME y controles no fatigados que no fueron significativos en n=115, por orden de significancia.

[0495]

[0497] Tabla 15: Análisis de la distribución de frecuencias y significancia de los SNP del gen del receptor TRP en PBMC de pacientes con CFS/ME y controles no fatigados que no fueron significativos en n=115, por orden de significancia.

[0500]

[0501] Tabla 16: Análisis de la distribución de frecuencias y significancia de los SNP de los genes AChR y TRP en células NK aisladas en pacientes con CFS/ME (n=39) y controles sin fatiga (n=30) que no fueron significativos, por orden de significancia.

[0504]

[0505]

[0506]

[0507]

[0508]

[0509] Tabla 17: Análisis de la distribución de frecuencias y significancia de los SNP de los genes AChR y TRP en linfocitos B aislados en pacientes con CFS/ME (n=11) y controles sin fatiga (n=11) que no fueron significativos, por orden de significancia.

[0512]

[0515] Ejemplo 9 - Secuenciación del exoma para determinar SNP y genotipos en genes de canales iónicos TRP y AChR a partir de linfocitos B aislados en pacientes con CFS/ME

[0516] El Ejemplo 6 anterior describe SNP y genotipos en los genes de los canales iónicos TRP y AChR de linfocitos B aislados en pacientes con ME/CFS. En este ejemplo, los inventores utilizan la secuenciación del exoma para caracterizar los SNP y genotipos en los genes de los canales iónicos TRP y AChR de linfocitos B aislados en pacientes con ME/CFS.

[0517] Métodos

[0518] Para más detalles sobre los sujetos y la preparación de la muestra, véase el Ejemplo 6.

[0519] Extracción de ADN

[0520] El ADN genómico se extrajo de todas las muestras de sangre total utilizando el minikit de ADN en sangre de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Se utilizó el Nanodrop (Nanodrop) para evaluar la calidad y la cantidad del ADN extraído. En el ensayo SNP se utilizaron aproximadamente 2μg de ADN genómico.

[0521] Cuantificación y cualificación del ADN

[0522] La degradación y contaminación del ADN se monitorizó en geles de agarosa al 1%.

[0523] (1) La pureza del ADN se comprobó con el espectrofotómetro NanoPhotometer<®>(IMPLEN, CA, USA).

[0524] (2) La concentración de ADN se midió utilizando el kit de prueba de ADN Qubit<®>en el fluorómetro Qubit<®>2,0 (Life Technologies, CA, USA).

[0525] (3) La distribución de fragmentos de la biblioteca de ADN se midió utilizando el kit de prueba DNA Nano 6000 del sistema Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, USA).

[0526] Preparación de bibliotecas para secuenciación

[0527] Se utilizó una cantidad total de 1 μg de ADN genómico por muestra como material de entrada para la preparación de la muestra de ADN. Las bibliotecas de secuenciación se generaron utilizando el kit Agilent SureSelect Human All ExonV5 (Agilent Technologies, CA, USA) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se añadieron códigos de índice x para atribuir secuencias a cada muestra. Brevemente, la fragmentación se llevó a cabo mediante un sistema de cizallamiento hidrodinámico (Covaris, Massachusetts, USA) para generar fragmentos de 180-280 pb. Los salientes restantes se convirtieron en extremos romos mediante actividades de exonucleasa/polimerasa y se eliminaron las enzimas. Después de la adenilación de los extremos 3' de los fragmentos de ADN, se ligaron oligonucleótidos adaptadores. Los fragmentos de ADN con moléculas adaptadoras ligadas en ambos extremos se enriquecieron selectivamente en una reacción de PCR. Después de la reacción PCR, la biblioteca se hibridó en fase líquida con una sonda marcada con biotina y, a continuación, se utilizaron perlas magnéticas con estreptomicina para capturar los 334.378 exones de 20.965 genes. Las bibliotecas capturadas se enriquecieron en una reacción PCR para añadir etiquetas de índice y prepararlas para la hibridación. Los productos se purificaron con el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA) y se cuantificaron con el ensayo de ADN de alta sensibilidad de Agilent en el sistema Agilent Bioanalyzer 2100.

[0528] Agrupación y secuenciación

[0529] Si la biblioteca cumple los requisitos, el agrupamiento de las muestras codificadas por índice se realizó en un sistema de generación de agrupamientos cBot utilizando TruSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumia, San Diego, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la generación de agrupamientos, las bibliotecas preparadas se secuenciaron en una plataforma Illumina y se generaron lecturas de 125 pb por pares.

[0530] Análisis Resultado

[0531] Datos brutos

[0532] Los datos brutos originales obtenidos de las plataformas de secuenciación de alto rendimiento (por ejemplo, la plataforma illumina) se transformaron en lecturas secuenciadas mediante llamada de bases y se registraron en un archivo FASTQ (que contiene información sobre la secuencia (lecturas) y la correspondiente información sobre la calidad de la secuenciación), como se explica en la sección 4.1 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11)", al que se puede acceder en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1_pdf.

[0533] Control de calidad

[0534] Filtración de datos de secuenciación

[0535] Los pasos del procesamiento de datos que se llevaron a cabo fueron los explicados en la Sección 4.2.1 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11), al que se puede acceder en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf.

[0536] Distribución de la tasa de errores de secuenciación

[0537] La puntuación Phred de una base (puntuación Phred, Qphred) se calculó como se explica en la Sección 4.2.2 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11), accesible en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf.

[0538] Distribución de la calidad de la secuenciación

[0539] La distribución de la calidad de la secuencia se llevó a cabo como se explica en la sección 4.2.4 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11)", accesible en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf.To garantizar el análisis posterior, se requiere que la calidad de la mayoría de las bases sea superior a Q20. Según la característica de secuenciación, la calidad de las bases al final de la secuencia suele ser menor que al principio.

[0540] Resumen estadístico de la calidad de la secuenciación

[0541] Según la característica de secuenciación de la plataforma illumina, para los datos PE se requería que el porcentaje medio de Q20 fuera superior al 90%, el de Q30 superior al 80%, y la tasa media de error inferior al 0.1%. (Véase la sección 4.2.5 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11)", accesible en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf.

[0542] Tabla 18 - Resumen de la calidad de la producción de datos

[0543]

[0544]

[0545]

[0546]

[0547] Alineación de secuencias

[0548] La alineación de secuencias se llevó a cabo como se explica en la Sección 4.3 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11)", accesible en www.filgen.jp/Product/- Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf.

[0549] Profundidad de secuenciación, distribución de la cobertura

[0550] La profundidad, cobertura y distribución de las secuencias se llevó a cabo como se explica en la sección 4.3.1 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11), accesible en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf.

[0551] Estadísticas de cobertura

[0552] Tabla 19-Tasa de mapeo y cobertura:

[0554]

[0555]

[0556]

[0557]

[0558]

[0561] (1) Total: El número de lecturas limpias totales

[0562] (2) Duplicado: Número de lecturas duplicadas

[0563] (3) Mapeado: Número de lecturas totales que se corresponden con el genoma de referencia (porcentaje) (4) Mapeado correcto: El número de lecturas que se mapearon con el genoma de referencia y la dirección es correcta

[0564] (5) PE mapeado: Número de lecturas por pares que se corresponden con el genoma de referencia (porcentaje)

[0565] (6) SE mapeado: Número de lecturas de extremo único que se corresponden con el genoma de referencia (7) Con mate mapeado a un diferente cr: Número de lecturas de mate asignadas a cromosomas diferentes (8) Con mate mapeado a un diferente cr (mapQ>=5): El número de lecturas de mate mapeadas a los diferentes cromosomas y el MAQ >5

[0566] (9) Bases iniciales en el objetivo: Total de bases mapeadas en la región objetivo (región exónica que capturamos)

[0567] (10) Bases_iniciales_cercanas_al_objetivo: Total de bases asignadas a la región flanqueante (la región cercana al objetivo anterior y posterior 200 pb)

[0568] (11) Bases_iniciales_en_el_objetivo_o_cerca_del_objetivo: Longitud total de la región objetivo y de la región flanqueante

[0569] (12) Total de lecturas efectivas: Número de lecturas válidas que se corresponden con el genoma de referencia

[0570] (13) Rendimiento_efectivo_total(Mb): Rendimiento efectivo total

[0571] (14) Secuencias_efectivas_en_objetivo(Mb): Total de lecturas que corresponden a la región objetivo del genoma de referencia

[0572] (15) Secuencias_efectivas_cercanas_al_objetivo(Mb): Total de lecturas mapeadas en la región flanqueante del genoma de referencia

[0573] (16) Secuencias_efectivas_en_o_cerca_del_objetivo(Mb): Total de lecturas que corresponden a la región objetivo del genoma de referencia y a la región flanqueante

[0574] (17) Fracción_de_bases_efectivas_en_objetivo: Porcentaje de las lecturas mapeadas en la región objetivo con respecto a las lecturas del genoma de referencia

[0575] (18) Fracción_de_bases_efectivas_en_o_cerca_del_objetivo: Porcentaje de las lecturas mapeadas en la región objetivo y la región flanqueante respecto a las lecturas del genoma de referencia

[0576] (19) Profundidad_de_secuenciación_media_en_el_objetivo:: La profundidad media de secuenciación que se mapeó en la región objetivo del genoma de referencia

[0577] (20) Profundidad_de_secuenciación_media_cerca_del_objetivo: La profundidad media de secuenciación que se asignó a la región de flanqueo del genoma de referencia

[0578] (21) Tasa de desemparejamiento en la región objetivo: Porcentaje de lecturas erróneas en la región objetivo del genoma de referencia

[0579] (22) Tasa_de_desemparejamiento_en_todas_las_secuencias_efectivas: Porcentaje de lecturas erróneas en el genoma de referencia

[0580] (23) Base cubierta en el objetivo: La longitud de cobertura de la región objetivo

[0581] (24) Cobertura_de_la_región_objetivo: Porcentaje de cobertura de la región objetivo

[0582] (25) Base_cubierta_cerca_del_objetivo: La longitud de cobertura de la región flanqueante

[0583] (26) Cobertura de la región flanqueante: Porcentaje de cobertura de la región flanqueante

[0584] (27) Fracción_del_objetivo_cubierto_con_al_menos_20x: El porcentaje de bases con profundidad >20X en la región objetivo

[0585] (28) Fracción_del_objetivo_cubierto_con_al_menos_10x: El porcentaje de bases con profundidad >10X en la región objetivo

[0586] (29) Fracción_del_objetivo_cubierto_con_al menos_4x: El porcentaje de bases con profundidad >4X en la región objetivo

[0587] (30) Fracción_de_región_flanqueante_cubierta_con_al menos_20x: El porcentaje de bases con profundidad >20X en región flanqueante

[0588] (31) Fracción_de_región_flanqueante_cubierta_con_al menos_10x: El porcentaje de bases con profundidad >10X en región flanqueante

[0589] (32) Fracción_de_región_flanqueante_cubierta_con_al menos_4x: El porcentaje de bases con profundidad >4X en la región flanqueante

[0590] (Fuente: ovogene Bioinformatics Technology Co., Ltd) www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf)

[0591] Resultado de la detección de variaciones

[0592] Resultado de la detección de SNV

[0593] Resultado estadístico SNV

[0594] En general, todo el genoma humano tiene alrededor de 3.6 millones de SNV. La mayoría (más del 95%) de las SNV de alta frecuencia (la frecuencia alélica en la población es superior al 5%) tienen registros en dbSNP (Sherry S T, Ward M H, Kholodov M, et al. dbSNP: the NCBI database of genetic variation[J]. Investigación sobre ácidos nucleicos, 2001, 29(1): 308-311.(dbSNP)). La relación Ts/Tv puede reflejar la precisión de la secuenciación. Generalmente, la proporción en el genoma es de aproximadamente 2.2 y en la región codificante es de aproximadamente 3.2.

[0595] Se utilizó GATK para detectar SNV, y las estadísticas de SNV son las siguientes:

[0596] Tabla 20-Número de SNV en diferentes regiones genómicas

[0598]

[0599]

[0600]

[0601]

[0602] Tabla 21 - Número de SNV de diferentes tipos en la región de codificación

[0605]

[0607] Resultado de la detección InDel

[0608] Resultado estadístico de indel

[0609] Véase la sección 4.4.2 del documento de Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd titulado "Novogene - Cancer Project Report (2014, 11)", accesible en www.filgen.jp/Product/Bioscience5-seq/Cancer_WGS_report_V1.1.pdf. En general, el genoma humano tiene alrededor de 350K InDel (inserción y eliminación, menos de 50 pb de inserción y eliminación).

[0610] La InDel en la región codificante o en el sitio de empalme puede cambiar la traducción de la proteína. La mutación de cambio de marco, en la que el número de bases insertadas o eliminadas no es un múltiplo entero de tres, puede provocar el cambio de todo el marco de lectura. En comparación con la mutación sin desplazamiento de marco, la mutación con desplazamiento de marco está más limitada por la presión selectiva.

[0611] GATK se utilizó para detectar Indel, y el resultado InDel obtenido es el siguiente:

[0612] Tabla 22 - Número de InDel en diferentes regiones genómicas

[0614]

[0615]

[0616]

[0617]

[0618] Tabla 23-Número de InDel de distinto tipo en regiones codificantes

[0620]

[0621]

[0622]

[0623]

[0624] Tabla 24 - InDel y distribución del genotipo

[0627]

[0629] Software utilizado para el análisis

[0630] A continuación se enumeran los softwares utilizados en el análisis bioinformático:

[0631] Tabla 25 - Lista de programas de análisis de exomas

[0634]

[0637] El análisis se realizó utilizando software de asociación como PLINK.

[0638] Análisis estadístico

[0639] Se utilizó el conjunto de herramientas de análisis del genoma completo PLINK v1,0721 para determinar las asociaciones entre los pacientes con CFS y el grupo de control sin fatiga. Se utilizó una prueba χ2 de dos columnas para determinar la significancia, en la que se determinó que un valor p de <0.05 era significativo. El análisis de los datos corrió a cargo del Australian Genome Research Facility.

[0640] Resultados

[0641] La secuenciación del exoma identificó variantes SNP en los genes de los canales TRP y AChR TRPV1, TRPC6, TRPV4, TRPC1, TRPM8, TRPC4, TRPV2, TRPV5, TRPC5, TRPM6, TRPC7, TRPM5, TRPC3, PKD1, TRPV6, PKD2, TRPA1, TRPM7, TRPM2, TRPM4, TRPM3, TRPV3, y CHRNA7, CHRM3, CHRNA4, CHRNA3, CHRNB4, CHRNB2 y CHRNE. Éstas, junto con sus consecuencias anotadas, se describen en los cuadros 26, 27 y 28 siguientes

[0642] Tabla 26: Variantes SNP de canales TRP o receptores ACh (familia TRP, TRPV1, TRPC6, TRPV4, TRPC1, TRPM8, TRPC4, TRPV2, TRPV5, TRPC5, TRPM6, TRPC7, TRPM5, TRPC3, PKD1, TRPV6, PKD2, TRPA1, TRPM7, TRPM2, TRPM4, TRPM3, TRPV3, y CHRNA7, CHRM3, CHRNA4, CHRNA3, CHRNB4, CHRNB2 y CHRNE) anotadas con sus consecuencias.

[0645]

[0646]

[0647]

[0648]

[0649]

[0650]

[0651]

[0652] Tabla 27: Distribución de frecuencias y significancia de los SNP del potencial receptor transitorio (TRP) en pacientes con CFS/ME (n=14) y controles sin fatiga (n=11 de células В aisladas por orden de significancia.

[0654]

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[0683]

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[0686]

[0687] Tabla 28: Distribución de frecuencias y significancia de los SNP de AChR en pacientes con CFS/ME (n=14) y controles sin fatiga (n=11) de células В aisladas por orden de significancia.

[0689]

[0690]

[0691]

[0692]

[0693]

[0694] Se puede encontrar más información sobre estos SNP en http://www .ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/.

[0695] Los SNP y genotipos de las Tablas 26, 27 y 28 son consistentes con los identificados para linfocitos B aislados en el Ejemplo 6.

[0696] El análisis PLINK destacó sinsentido, sinónimos y genes para SNP de las familias TRP y PKD1L2.

[0697] Se identificaron 81.253.759 y 81.253.917 SNP como SNP de sentido erróneo para la secuencia del exón para PKD1L2:NM_001076780:exon1:c.T217C:p.W73R y PKD1L2:NM_001076780:exon1:c.T59C:p.V20A. También se descubrió que el SNP 122.872.719, un receptor TRPC3, estaba significativamente asociado a los pacientes con LCR/EM en comparación con los controles de células B aisladas.

[0698] Estos hallazgos son significativos ya que TRPC3 ha mostrado una asociación directa con PKCbeta que se requiere para la activación posterior en células B [43y]. Además, las subunidades TRPP pueden dividirse en dos subcategorías en función de su similitud estructural. El primer grupo, similar a la poliquistosis renal 1 (PKD1), contiene policistina-1 (anteriormente conocida como TRPP1), PKDREJ, PKD1L1, PKD1L2 y PKD1L3.

[0699] Ejemplo 10 - Moléculas de señalización descendente ERK1/2, MEK1/2 y p38 alteradas en células asesinas naturales CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/>en pacientes con síndrome de fatiga crónica/encefalomielitis miálgica

[0700] Las células asesinas naturales (NK) son células inmunes innatas que comprenden aproximadamente el 10-15% de los linfocitos que circulan en la sangre periférica [1m]. Dos fenotipos predominantes de células NK identificados por la expresión en superficie del agrupamiento de diferenciación (CD) 56 y CD16 y la ausencia de CD3 proporcionan inmunidad al huésped mediante la producción de citocinas inmunorreguladoras y la lisis citotóxica de células objetivo [2m-4m].

[0701] El diez por ciento de las células NK periféricas son células NK CD56<bright>CD16<dim/->que expresan de forma constitutiva receptores para citocinas derivadas de monocitos (monocinas) [5m, 6m]. La ligadura de receptores de monocinas estimula rápidamente a las células NK CD56<bright>CD16<dim/->para que produzcan citocinas, entre las que se incluyen el interferón gamma (IFN-γ), los factores de necrosis tumoral alfa y beta (TNF-α y β), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), la interleucina (IL)-10 y la IL-13 [5m, 6m]. La producción de citocinas de las células NK CD56<bright>CD16<dim/->proporciona una fuente temprana de citocinas que aumenta la actividad citotóxica de las células NK y regula la función de otros linfocitos [2m, 5m, 4m]. Aproximadamente el 90% de las células NK periféricas son células NK CD56<bright>CD16<+>citotóxicas [7m, 5m]. Las células NK citotóxicas contienen un elevado número de gránulos secretores que expresan de forma constitutiva las proteínas líticas inductoras de apoptosis perforina, granzima A y granzima B [3m, 8m].

[0702] Después de que las células NK CD56<dim>CD16<+>reconocen una célula objetivo, las proteínas líticas se liberan mediante un proceso conocido como desgranulación para inducir la lisis citotóxica y la posterior eliminación de las células objetivo infectadas con virus, bacterias o células que han sido transformadas malignamente [9m, 10m].

[0703] A diferencia de los linfocitos T y B, la función efectora de las células NK se rige por una miríada de receptores de superficie que integran señales activadoras o inhibidoras en cascadas de señalización intracelular [11m-13m]. Después de la ligadura del receptor de las células NK, las señales de activación intracelular se propagan a través de cascadas de fosforilación de proteínas por las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK) [14m-16m]. Tres subgrupos principales de MAPK incluyen las quinasas reguladas por señal extracelular (ERK) 1/2, la p38 MAPK (p38) y la c-Jun N-terminal quinasa (JNK) [14m-16m]. En respuesta a estímulos extracelulares, las vías de señalización MAPK transducen señales a objetivos intracelulares específicas para mediar en las respuestas celulares, incluyendo la expresión génica, la mitosis, la motilidad, la supervivencia celular, la apoptosis y la diferenciación [17m]. Dentro de las células NK, la fosforilación de MEK1/2 y p38 regula la producción de citocinas y la fosforilación de ERK1/2 polariza el gránulo secretor hacia la sinapsis inmunitaria para la degranulación [16m, 18m]. Además de la señalización MAPK para las respuestas celulares normales, se ha sugerido que las deficiencias en la señalización MAPK contribuyen a la patología de los procesos patológicos relacionados con la leucemia, la diabetes, las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, la aterosclerosis, la artritis y la inflamación de las vías respiratorias [19m-25m].

[0704] Los reportes longitudinales de una actividad citotóxica de las células NK significativamente reducida en pacientes con Síndrome de Fatiga Crónica/Encefalomielitis Miálgica (CFS/ME) sugieren la presencia de una deficiencia funcional de las células NK que puede contribuir a la patogénesis de la enfermedad [26m-34m]. Las investigaciones actuales sobre los fenotipos, receptores y proteínas líticas de las células NK en el CFS/ME han arrojado resultados equívocos y, lo que es más importante, la señalización intracelular por MAPK en las células NK sigue sin examinarse [27m, 35m, 36m]. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio era investigar la fosforilación de células NK de la cascada de señalización MAPK, incluida la señalización a través de la MAPK quinasa (MAPKK/MEK1/2) y la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK)1/2, así como p38, la actividad citotóxica, la degranulación, las proteínas líticas y la producción de citocinas en células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con CFS/ME.

[0705] Métodos

[0706] Reclutamiento de participantes y criterios de inclusión

[0707] Los pacientes con CFS/ME y los controles no fatigados (NFC) fueron reclutados de una base de datos de participantes del Centro Nacional de Neuroinmunología y Enfermedades Emergentes, Instituto de Salud Menzies de Queensland. Todos los participantes completaron un cuestionario en línea basado en la definición de Fukuda de 1994 para la fatiga y la presentación de los síntomas a fin de determinar la idoneidad para la inclusión en el estudio [37m]. A partir de las respuestas al cuestionario, se incluyeron los pacientes con CFS/ME que cumplían la definición de Fukuda de 1994 y la NFC, Todos los participantes fueron sometidos a pruebas de detección de afecciones excluyentes como epilepsia, afecciones tiroideas, psicosis, diabetes, trastornos cardíacos, tabaquismo, embarazo o lactancia y enfermedades inmunológicas, inflamatorias o autoinmunes.

[0708] Extracción de sangre y aislamiento celular

[0709] Se extrajeron 40 mililitros de sangre con heparina sódica por venopunción de la vena antecubital de cada participante. Para evitar la influencia de la variación circadiana, todas las muestras de sangre se recolectaron por la mañana, entre las 7:30 y 10:00 am. Los análisis de laboratorio se iniciaron en las cuatro horas siguientes a la recolección de sangre para mantener la viabilidad celular. Queensland Pathology evaluó parámetros sanguíneos de rutina, incluido un hemograma completo, velocidad de sedimentación globular, electrolitos y proteína C reactiva de alta sensibilidad, en cada muestra de participante. Las muestras de sangre total se diluyeron con medio no suplementado Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Life Technologies, Carlsbad, USA) y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque (GE Health Care, Uppsala, UP).

[0710] Fosforilación MAPK de las células NK

[0711] La fosforilación de las proteínas de señalización en la vía MAPK incluyendo la señalización a través de la MAPK quinasa (MAPKK/- MEK1/2) y la quinasa regulada por señal extracelular (ERK)1/2 así como p38, se examinó bajo dos condiciones estimulatorias utilizando anticuerpos fosfo-específicos como se describió previamente [38m-40m]. Después del aislamiento, las PBMC en medio RPMI 1640 suplementado con un diez por ciento de FBS se incubaron durante un mínimo de dos horas a 37°C con un cinco por ciento de CO<2>para reducir la fosforilación de fondo. Después del reposo, las PBMC se tiñeron con mAbs para CD56-APC (Miltenyi Biotech, Colonia, BG) o CD56-ficoeritrina-cianina (PE-Cy)7, CD16-violeta brillante (BV)711 y CD3-BV510 (BD Biosciences, San Diego, USA) durante 25 minutos y posteriormente se lavaron. Las PBMC se estimularon con células K562 (E:Tof25:1) o PMA(50ng/ml) más ionomicina (1,0.5μg/ml) como control positivo durante 15 minutos en un baño de agua a 37°C. Se utilizó una muestra paralela de células no estimuladas (US) en medio RPMI solo para determinar los niveles basales de fosforilación. El amortiguador de fijación BD Phosflow 1 (San Diego, USA) que contenía 4.2 % de formaldehído se precalentó a 37°C y se agregó a las PBMC, se incubó durante diez minutos a 37°C y posteriormente se lavó. A continuación, las células se incubaron en amortiguador de lavado permanente BD 1 (San Diego, USA) con FBS y saponina durante diez minutos, tras lo cual se procedió a la tinción con mAbs fosoespecíficos, incluidos transductor de señales y activador de la transcripción (Stat)-3 (pS727)- alexa fluor (AF) 488, MEK1 (pS218)/MEK2 (pS222)-AF488, p38 (pT180/pY182)-PerCP Cy5.5, ERK1/2 (pT202/pY204)-BV421, factor nuclear kappa beta (NF-Kβ, pS529)-AF488, inhibidor kappa beta (Iκβ)-AF647, PKCα (pT497)-AF488 y JNK (pT183/pY185)-AF647 durante 30 minutos y posterior análisis por citometría de flujo.Actividad citotóxica de las células NK

[0712] Se utilizó citometría de flujo para medir la actividad citotóxica de las células NK contra la línea celular de leucemia mielógena crónica humana K562 como se describió previamente [41m, 29m]. Brevemente, las células K562 (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Carlsbad, USA) suplementado con un diez por ciento de suero bovino fetal (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, USA). Después del aislamiento, las PBMC se tiñeron con el colorante fluorescente de enlace celular Paul Karl Horan-26 (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) y se lavaron con RPMI suplementado con un diez por ciento de FBS. Las concentraciones de las PBMC y las células K562 se ajustaron a 2.5 x 10<6>células/ml y 1 x 10<5>células/ml respectivamente y se combinaron en tres proporciones efectorobjetivo (E:T), incluidas 25:1, 12.5:1 y 6.25:1. También se incluyó una muestra de control de sólo células K562 para determinar las células K562 sometidas a apoptosis no inducida por la actividad citotóxica de las células NK. Las PBMC y las células K562 se incubaron durante cuatro horas a 37 C con un cinco por ciento de CO<2>y, a continuación, se tiñeron con anexina V isotiocianato de fluoresceína (FITC) y 7-aminoactinomicina (Becton Dickinson [BD] Pharminogen, San Diego, USA) para su análisis por citometría de flujo en un citómetro de flujo de cuatro colores con láser dual BD Calibur (BD Biosciences, San Diego, USA). La actividad citotóxica NK se calculó como porcentaje de muerte específica de las células K562 para las tres proporciones E:T como se ha descrito previamente [41m].

[0713] Degranulación de las células NK

[0714] La expresión de CD107a y CD107b en la superficie de las células NK se midió como un marcador de la degranulación de las células NK como se reportó previamente [9m]. Las PBMC en presencia de mAbs para CD107a-PE y CD107b-FITC (BD Biosciences, San Diego, USA) se estimularon con células K562 (E: T de 25:1) o PMA (50ng/ml) más ionomicina (0.5μg/ml) durante una hora a 37°C con un cinco por ciento de CO<2>. Se añadió monensina (BD Biosciences, San Diego, USA) a las PBMC y se incubaron las células durante tres horas más. Una muestra de control no estimulada incluía PBMC incubadas únicamente en medio RPMI 1640. Después de cuatro horas de incubación, las células se lavaron y se incubaron con mAbs contra CD56-APC, CD16-BV711 y CD3-BV510 (BD Biosciences, San Diego, USA) durante 25 minutos, lo que fue seguido por un análisis citométrico de flujo.

[0715] Proteínas líticas de las células NK y marcador de maduración

[0716] La tinción intracelular se utilizó para medir las proteínas líticas perforina, granzima A y granzima B contenidas dentro de los gránulos secretores de las células NK [27m, 42m]. Se midió la expresión superficial de CD57 como marcador de la maduración de las células NK [43m]. Las PBMC se incubaron con mAbs para CD56-PE-Cy7, CD16-BV711, CD3-BV510 y CD57-PE-tinte fluorescente a base de cianina (CF)594 durante 25 minutos. A continuación, las PBMC se permeabilizaron con una solución de fijación/permeabilización de BD durante 20 minutos, se lavaron con amortiguador de lavado/permeabilización de BD y se incubaron con mAbs que incluían perforina-APC (Miltenyi Biotec. Colonia, BG), granzima A-FITC y granzima B-V450 (BD Biosciences, San Diego, USA) durante 30 minutos, tras lo cual se realizó un análisis de citometría de flujo.

[0717] Citocinas de células NK

[0718] La producción de células NK de las citocinas IFN-γ, TNF-α y GM-CSF se determinó mediante tinción intracelular en dos condiciones de estimulación como se ha descrito previamente [9m, 44m]. Después del aislamiento, las PBMC se incubaron en presencia de células K562 (E:T de 25:1) o de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, 50ng/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) más ionomicina (I, 0.5μg/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) durante una hora a 37°C con un cinco por ciento de CO<2>. Se añadió brefeldina A (BD Biosciences, San Diego, USA) para evitar la secreción de citoquinas durante la estimulación y se incubaron las células durante cinco horas más [9m, 44m]. Las PBMC incubadas únicamente en medio RPMI 1640 sirvieron como muestra de control no estimulada. Después de seis horas de incubación, se lavaron las PBMC y se incubaron con anticuerpos monoclonales (mAbs) para CD56-PE-Cy7, CD16-BV711 y CD3-BV510 (BD Biosciences, San Diego, USA) durante 25 minutos. Las PBMC se lavaron posteriormente, se incubaron en solución de fijación/permeabilización de BD (BD Biosciences, San Diego, USA) durante 20 minutos, se lavaron en tampón de permeabilización/lavado de BD (BD Biosciences, San Diego, USA) y luego se incubaron durante 30 minutos con mAbs contra IFN-γ-aloficocianina (APC), TNF-α-proteína-cianina de clorofila peridinina (PerCP-Cy)-5.5 (BD Biosciences, San Diego, USA) y GM-CSF-PE (Biolegend, San Diego, USA) para la detección citométrica de flujo de citocinas intracelulares.

[0719] Análisis multiparamétrico por citometría de flujo

[0720] Los datos se recolectaron en un citómetro de flujo LSR-Fortessa X20 de 14 parámetros (BD Biosciences, San Diego, USA). Se utilizaron diariamente microesferas de tecnología de señalización celular (BD Biosciences, San Diego, USA) para garantizar un rendimiento óptimo de la citometría de flujo y se emplearon ajustes de aplicación para normalizar los valores objetivo durante la duración de los experimentos. En total se obtuvieron entre 2500 y 5000 CD56 positivos. Los datos generados para citocinas de células NK, degranulación, proteínas líticas y maduración celular se analizaron en FlowJo (versión 10.0.8) y los datos de fosforilación se analizaron en Cytobank (versión 5,0) [45m]. El análisis de las células NK se realizó en las células que entraban dentro de la población de linfocitos según las propiedades de dispersión frontal y lateral. Las células NK CD56<+>CD3<->se seleccionaron para determinar las células NK totales, lo cual se extrapoló a un gráfico de CD56 y CD16 para identificar las células NK CD56<bright>CD16<dim/->y CD56<dim>CD16<+>para el análisis de cada marcador de citocinas, desgranulación, fosforilación, proteínas líticas y maduración celular. Se utilizó una combinación de controles de fluorescencia menos uno apropiados, controles de isotipo coincidentes con concentraciones de anticuerpos y muestras no estimuladas para determinar la activación de las células NK para cada análisis.

[0721] Análisis estadístico

[0722] El análisis estadístico de los datos se realizó con Statistical Package for the Social Sciences (versión 22) y GraphPad Prism (versión 6). Se comprobó la normalidad de todos los conjuntos de datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney independiente para identificar cualquier diferencia significativa en los parámetros de las células NK entre los grupos CFS/ME y NFC, Se utilizó una prueba de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis para identificar diferencias significativas en los parámetros de las células NK antes y después de la estimulación dentro de las cohortes de CFS/ME y NFC, La significancia se fijó en p<0.05 y los datos se presentan como meobjetivo ± intervalo intercuartílico, a menos que se indique lo contrario.

[0723] Abreviaturas

[0724] APC: aloficocianina, AF: alexa fluor, BD: Becton Dickinson, BV: violeta brillante, CD: grupo de diferenciación, CF: colorante fluorescente a base de cianina, ERK: quinasas reguladas por señales extracelulares, E:T: efector a diana, FBS: suero bovino fetal, FITC: isotiocianato de fluoresceína, GM-CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, Iκβ: beta kappa inhibidor, I: ionomicina, IFN-y: interferón gamma, IL: interleucina, JNK: quinasa N-terminal Jun, mAB: anticuerpos monoclonales, MAPK: proteína quinasa activada por mitógeno, MFI: intensidad de fluorescencia media, NK: asesina natural, NFC: control no fatigado, NF-κβ: factor nuclear kappa beta, PBMC: células mononucleares sanguíneas periféricas, PE: ficoeritrina, PE-Cy: ficoeritrina-cianina, PerCP-Cy: proteína-cianina de clorofila peridinina, PMA: forbol-12-miristato-13-acetato, p38: proteína quinasa activada por mitógeno p38, RPMI: Roswell Park Memorial Institute, Stat: transductor de señales y activador de la transcripción, TNF: factor de necrosis tumoral, US: no estimulado.

[0725] Resultados

[0726] Inclusión de participantes, parámetros sanguíneos y fenotipos de células NK

[0727] En este estudio se incluyeron 14 pacientes con CFS/ME que cumplían la definición de Fukuda de 1994 (edad media [años] ± error estándar de la media [EEM] = 53.5 ± 2.17) y 11 con NFC (edad media [años] ± EEM = 48.82 ± 3.46). La comparación de las edades de los grupos y de los parámetros sanguíneos, incluida la velocidad de sedimentación globular, la proteína C reactiva de alta sensibilidad y los recuentos sanguíneos completos de glóbulos blancos y rojos, entre el CFS/ME y la NFC no reveló diferencias significativas (Tabla 29). Las células NK totales se compararon según dos poblaciones de fenotipo, que eran CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->entre las cohortes CFS/ME y NFC y no se observaron diferencias significativas (ver Figura 5).

[0728] Tabla 29: Parámetros sanguíneos de CFS/ME y NFC,

[0731]

[0733] ERK1/2 se redujo significativamente en células NK CD56dimCD16+ de pacientes con SFC/EM

[0734] Después de la incubación con células K562 en una proporción E:T de 25:1, ERK1/2 se redujo significativamente en células NK CD56<dim>CD16<+>de pacientes con CFS/ME en comparación con NFC, (Véase la Figura 5.) PMA/I indujo un aumento significativo en la fosforilación de ERK1/2 en células NK CD56<dim>CD16<+>en comparación con las células estimuladas con US y K562 de los participantes con SFC/EM y NFC. La comparación de ERK1/2 en células NK CD56<bright>CD16<dim/->no reveló diferencias significativas entre CFS/ME y NFC. (Véase la Figura 6.)

[0735] MEKl/2 y p38 aumentaron significativamente las células NK D56brightCD16dim/-de pacientes con SFC/EM

[0736] En pacientes con CFS/ME, la fosforilación de MEK1/2 y p38 aumentó significativamente en las células NK CD56<bright>CD16<dim/->después de la incubación con células K562 en una proporción E:T de 25:1 en comparación con la NFC, (Véase la Figura 6.) La estimulación con PMA/I indujo un aumento significativo de MEK1/2 y p38 en comparación con las células estimuladas US y K562 tanto en las cohortes CFS/ME como NFC. La comparación de MEK1/2 y p38 en células NK CD56<dim>CD16<+>de CFS/ME y NFC no reveló diferencias significativas. (Véanse las Figuras 7 y 8.) La medición de proteínas MAPK adicionales, incluidas Stat-3, NF-κβ, lκβ, proteína quinasa c-α y JNK, no reveló diferencias significativas entre las cohortes de CFS/ME y NFC. (Véanse las Figuras 9-13.)

[0737] La actividad citotóxica de las células NK se reduce en CFS/ME

[0738] Tanto en pacientes con CFS/ME como con NFC, la actividad citotóxica de las células NK a 25:1 aumentó significativamente en comparación con las proporciones de 12.5:1 y 6.25:1. En comparación con la NFC, el CFS/ME se redujo en las proporciones 25:1 y 12.5, aunque no fue estadísticamente significativo. (Véase la Figura 14.)CD107a y CD107b aumentaron en las células NK CCD56dimCD16+después de la estimulación

[0739] La expresión de superficie de CD107a y CD107b en células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->aumentó significativamente después de la estimulación con células PMA/I y K562 tanto en CFS/EM como en NFC. (Véanse las Figuras 15 y 16.) La comparación de la expresión de CD107a y CD107b entre el CFS/ME y la NFC en cada condición de estimulación no reveló diferencias significativas. Las células NK CD56<dim>CD16<+>de pacientes con SFC/EM mostraron un aumento de CD107a después de la estimulación con K562, aunque este aumento no fue significativo.No hay diferencias significativas en las proteínas líticas de las células NK de los pacientes con SFC/EM

[0740] Las proteínas líticas de las células NK perforina, granzima A y granzima B se midieron en células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con CFS/ME y NFC. La comparación entre los dos grupos no reveló diferencias significativas. La expresión superficial de CD57 se midió como un marcador de maduración de células NK en células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->y no se observaron diferencias significativas entre los pacientes con SFC/EM y el NFC. (Véanse las Figuras 17 y 18.)

[0741] La producción de citocinas de las células NK CD56dimCD16+ y CD56brightCD16dim/- aumentó después de la estimulación con PMA/I

[0742] La producción de citocinas de las células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->se midió en dos condiciones estimulantes con células PMA/I o K562. La producción de INF-γ, TNF-α y GM-CSF en células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->aumentó después de la estimulación con PMA/I tanto en pacientes con NFC como con CFS/ME. (Véanse las Figuras 19-21.) Las comparaciones de la producción de citocinas de las células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->entre los pacientes con CFS/ME y NFC en las distintas condiciones de estimulación no revelaron diferencias significativas entre los grupos.

[0743] Discusión

[0744] Este es el primer estudio que investiga la señalización intracelular de las MAPK ERK1/2 y MEK1/2 en los fenotipos de células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->en el CFS/ME. Los inventores reportan sobre hallazgos novedosos y significativos de una reducción de ERK1/2 en células NK CD56<dim>CD16<+>junto con un aumento de MEK 1/2 y p38 en células NK CD56<bright>CD16<dim/->. La investigación adicional de otras quinasas reguladas por señales extracelulares contribuirá a la comprensión del papel de la desregulación de la señalización MAPK y la reducción de la función citotóxica de las células NK en el CFS/ME. Las funciones sinérgicas de las células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->son necesarias para la eliminación de las células objetivo y la señalización disfuncional a través de la vía MAPK en pacientes con CFS/ME puede comprometer la eliminación eficaz de las células objetivo.

[0745] Las células CD56<dim>CD16<+>de pacientes con CFS/ME tenían una disminución significativa de ERK1/2 que se ha identificado como un componente importante para la actividad citotóxica debido a la focalización de sustrato de paxilina, una proteína cinasa citoesquelética [46m, 47m]. La activación descendente de ERK1/2 es el resultado de redes de señalización intracelular que propagan señales activadoras a través de cascadas de fosforilación [48m, 49m]. La fosforilación secuencial de la quinasa MAPK (MAPKKK) y la quinasa MAPK (MAPKK/MEK1/2) activa ERK1/2 a través de la fosforilación dual de residuos de treonina y tirosina [48m, 49m]. La fosforilación de ERK1/2 induce un cambio conformacional significativo que es necesario para la actividad citotóxica de las células NK, ya que aumenta la accesibilidad del sustrato para fosforilar la paxilina [50m, 51m]. La paxilina es una proteína adaptadora que proporciona un sitio de acoplamiento para proteínas reguladoras como la ERK1/2 y proteínas estructurales como los microtúbulos y el citoesqueleto de actina [50m, 51m]. La colocalización de ERK2 fosforilada y paxilina con los microtúbulos y el centro organizador de microtúbulos (MTOC) facilita la polarización de los gránulos secretores hacia la sinapsis inmunitaria [14m, 15m, 46m, 51m, 52m]. En los pacientes con CFS/ME, la señalización anormal a través de ERK1/2 puede interferir y retrasar la liberación de las proteínas líticas para inducir la lisis citotóxica de las células objetivo.

[0746] La actividad citotóxica de las células NK se redujo en la cohorte CFS/ME en comparación con la NFC. La reducción significativa de ERK1/2 en las células NK CD56<dim>CD16<+>puede alterar la señalización intracelular necesaria para la polarización de los gránulos secretores a través de la vía MAPK. Dado que la cascada MAPK integra señales recibidas de la superficie celular, la vía está sujeta a complejos mecanismos reguladores y de retroalimentación que pueden contribuir a la reducción observada en ERK1/2 de pacientes con CFS/ME [46m, 53m]. ERK1/2 está bajo regulación constante que también funciona para determinar la especificidad de ERK1/2 para dirigirse a los gránulos secretores en las células NK citotóxicas [14m, 15m, 46m, 53m]. Los mecanismos reguladores de ERK1/2 incluyen las fosfatasas MKP3 y MKPX que desfosforilan las proteínas tirosina cinasas para inhibir su activación [46m, 53m]. La desensibilización del receptor y la disociación de la interacción receptor-ligando modifican la fuerza y la duración de las señales de activación [46m, 53m]. Las proteínas de andamiaje y la localización subcelular de la cascada regulan la fosforilación dirigiendo a ERK1/2 hacia sustratos objetivo en el citoplasma o el núcleo [46m, 53m]. La integración y diafonía de ERK1/2 con otras vías de señalización también actúa como mecanismo de retroalimentación para regular los niveles de fosforilación [46m, 53m]. Dado que ERK1/2 está sujeto a una serie de mecanismos de regulación distintos, se requieren más investigaciones en células NK CD56<dim>CD16<+>de pacientes con CFS/ME para determinar si estos mecanismos de regulación contribuyen a reducir la fosforilación de ERK1/2.

[0748] Se midió la desgranulación de las células NK citotóxicas para investigar si las posibles deficiencias en la señalización intracelular a través de ERK1/2 contribuyen a reducir la actividad citotóxica en pacientes con CFS/ME. Aunque no se observaron diferencias significativas en la expresión de CD107a y CD107b en la superficie de las células NK, las células NK CD56<dim>CD16<+>de pacientes con CFS/ME mostraron un aumento de CD107a después de la estimulación con K562. En apoyo de este hallazgo actual, los inventores informaron previamente de un aumento significativo de CD107a en las células NK después de la estimulación de K562 en una cohorte mayor de pacientes con CFS/ME [27m]. Este hallazgo sugiere que la reducción de ERK1/2 puede retrasar el movimiento del gránulo secretor y del MTOC hacia la sinapsis inmunitaria, pero no impide la degranulación [14m, 15m]. El aumento de la desgranulación de las células NK CD56<dim>CD16<+>de pacientes con SFC/EM sugiere que las células pueden estar bajo un continuo de activación debido a una incapacidad para inducir la lisis citotóxica y la posterior eliminación de las células objetivo [27m].

[0750] La activación continua de las células NK en pacientes con CFS/ME puede ser el resultado de un contacto prolongado con las células objetivo. El cebado cinético facilitado por el contacto sostenido de las células NK con las células objetivo retiene la convergencia de los gránulos secretores y el MTOC en la membrana plasmática [54m]. Este mecanismo se conoce como "muerte en serie", ya que la lisis posterior de las células objetivo es más rápida debido al preacoplamiento de los gránulos secretores, evitando la necesidad de que ERK1/2 inicie la polarización de los gránulos secretores hacia la sinapsis inmunitaria para la degranulación [55m]. Se necesitan más investigaciones para determinar si el gránulo secretor se fusiona completamente con la membrana de las células NK para liberar todo el contenido de proteínas líticas o si las deficiencias en las proteínas líticas pueden contribuir a una menor lisis de las células objetivo en pacientes con CFS/ME [27m, 36m, 56m]. Se ha descrito una reducción de la perforina y la granzima B en las células NK de pacientes con CFS/ME, lo que puede ser consecuencia de una "matanza en serie" [27m, 36m]. Si bien se ha identificado que las células NK de los pacientes con CFS/ME son degranuladoras, la incapacidad de las células NK para eliminar las células objetivo mediante actividad citotóxica sugiere que las células NK pueden estar muy activadas a través de un mecanismo potencial de "muerte en serie" ineficaz.

[0752] La producción de citocinas por parte de las células NK, incluyendo IFN-γ y TNF-α, ha sido identificada como una parte integral de la actividad citotóxica de las células NK y previamente se ha reportado de un aumento de la producción de IFN-γ en el CFS/ME [27m, 29m, 57m]. Las células NK se diferencian y maduran desde células NK CD56<bright>CD16<dim/->a CD56<dim>CD16<+>con función predominante de citocina o efector citotóxico [6m, 58m-60m]. Este proceso de diferenciación sugiere que las células NK CD56<bri>9<ht>CD16<dim/->y CD56<dim>CD16<+>funcionan juntas para optimizar una respuesta eficiente de las células NK que puede verse afectada en pacientes con SFC/EM [6m, 58m-60m]. Se ha descrito que la producción de IFN-γ por parte de las células NK aumenta la actividad citotóxica al aumentar la expresión de la molécula de adhesión ICAM-1 en las células tumorales a través de la vía NF-κβ, lo que mejora la formación de conjuntos y la adherencia con las células NK citotóxicas [60m]. Por el contrario, también se ha observado que el tratamiento con IFN-γ de células tumorales con niveles basales elevados de ICAM-1, como las células K562, regula al alza la clase I de histocompatibilidad mayor, que actúa como ligando para los receptores inhibidores de las células NK y reduce la actividad citotóxica de las NK [61m, 62m, 60m]. En pacientes con SFC/EM, se requieren más investigaciones para determinar si el aumento de IFN-γ puede contribuir al mecanismo ineficiente propuesto de "muerte en serie" que resulta en una mayor desgranulación o si el IFN-γ desensibiliza a las células K562 a la actividad citotóxica mediada por las células NK.

[0754] La fosforilación de MEK 1/2 y p38 se ha implicado en la patogénesis de muchas enfermedades inflamatorias crónicas y el aumento de la producción de IFN-γ puede ser el resultado del aumento de MEK1/2 y p38 en las células NK CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con SFC/EM [27m, 46m, 63m]. La ligadura del receptor a través del estrés ambiental o las citocinas proinflamatorias innatas, incluidas la IL-12 y la IL-18, inician cascadas de señalización intracelular MAPK [17m, 64m-67m]. De forma similar a la activación de ERK1/2, la fosforilación de MEK1/2 y p38 es el resultado de una cascada de fosforilación de proteínas escalonada [17m, 64m-67m]. A su vez, la MEK1/2 activada fosforila a la ERK1/2, dando lugar a la formación de la quimera ERK2-MEK1 [46m, 66m, 67m]. Esta quimera se libera de sus anclajes citoplasmáticos para sufrir un desplazamiento cito-nuclear e iniciar la producción de IFN-γ en el núcleo [46m, 66m, 67m]. La quimera ERK2-MEK1 fosforilada activa el factor de transcripción c-Fos y el heterodímero de proteína activadora (AP)-1 que regula el promotor del gen IFN-γ y la subsiguiente producción de citoquinas [66m, 67m]. Por lo tanto, el aumento de la fosforilación de MEK 1/2 puede dar lugar a un aumento de la producción de IFN-γ de las células NK en pacientes con CFS/ME, como hemos reportado anteriormente [27m, 29m, 57m]. A diferencia de los factores de transcripción del IFN-γ, la p38 fosforilada se transloca al núcleo para mediar en la producción de citocinas regulando la semivida del gen IFN-γ rico en adenilato/uridilato (AU), que estabiliza e impide la degradación del ARNm del IFN-γ [64m, 65m]. En las células NK CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con SFC/EM, un aumento de p38 puede prolongar la transcripción y traducción de IFN-γ [27m, 65m, 64m].

[0756] La síntesis de citoquinas por MEK1/2 y p38 está estrechamente controlada y cada nivel de la cascada de señalización MAPK está sujeto a una regulación que puede estar alterada en pacientes con CFS/ME [46m, 53m]. La fosfatasa MKP1 se localiza en el núcleo y regula a la baja la actividad de MEK1/2 y p38 mediante la desfosforilación de residuos de treonina y tirosina, atenuando la producción de citoquinas [53m, 46m]. Es necesario seguir investigando la regulación de MEK1/2 y p38 en las células NK CD56<bright>CD16<dim/->de pacientes con CFS/ME para determinar si un mecanismo regulador como MPK1 puede contribuir al aumento de la actividad de MEK1/2 y p38 y a la producción de citocinas IFN-γ.

[0757] Las investigaciones sobre la vía de señalización intracelular MAPK en células NK de pacientes con CFS/ME han revelado hallazgos novedosos que pueden explicar los informes anteriores sobre la reducción de la actividad citotóxica de las células NK y el aumento de la producción de citoquinas. Hasta donde saben los inventores, éste es el primer estudio que reporta diferencias significativas en las células NK CD56<dim>CD16<+>ERK1/2 de pacientes con CFS/ME. La actividad citotóxica de las células NK CD56<dim>CD16<+>depende de la acción sinérgica de la producción de citocinas de las células NK CD56<bright>CD16<dim/->. En consecuencia, el aumento de MEK1/2 y p38 puede incrementar la producción de IFN-γ, lo que a su vez puede desensibilizar a las células K562 frente a la actividad citotóxica de las células NK en pacientes con CFS/ME. Los novedosos resultados preliminares de este estudio justifican la realización de nuevas investigaciones en una cohorte más amplia y en subgrupos clínicos concretos de CFS/ME, incluida la gravedad, para dilucidar la causa de la reducción de la actividad citotóxica NK.

[0758] Conclusiones

[0759] Los resultados de este estudio resaltan la importancia de la señalización intracelular a través de la vía MAPK para la función sinérgica de las células NK CD56<dim>CD16<+>y CD56<bright>CD16<dim/->para asegurar la eliminación eficiente de las células objetivo en pacientes con SFC/EM. Es importante destacar que es probable que esta señalización intracelular a través de la vía MAPK sea un mecanismo que funcione en otros tipos de células/tejidos, incluidas las células mononucleares de sangre periférica.

[0760] Ejemplo 11 - Desregulación de la expresión génica de la proteína quinasa dependiente de Ca2<+>en células NK de pacientes con síndrome de fatiga crónica/encefalomielitis miálgica

[0761] En este Ejemplo, se analizó la expresión de ARNm de 528 genes de proteína quinasa dependientes de Ca<2+>en células NK aisladas de pacientes con CFS/ME moderado y severo. La expresión de 92 genes de proteína quinasa dependientes de Ca<2+>fue significativamente diferente en el grupo con SFC/EM grave en comparación con los controles no fatigados. Entre ellos, 37 genes de la proteína cinasa dependiente del Ca<2+>estaban significativamente regulados al alza y 55 genes de la proteína cinasa dependiente del Ca<2+>estaban significativamente regulados a la baja en pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles no fatigados. En pacientes con SFC/EM grave, la disfunción en los genes de la proteína quinasa dependiente de Ca<2+>puede contribuir a alteraciones en la señalización intracelular de las células NK y en la función efectora. Es posible que se presenten cambios similares en los genes de la proteína quinasa dependiente de Ca<2+>en otras células, lo que podría contribuir al patomecanismo de esta enfermedad.

[0762] Introducción

[0763] Los iones de calcio (Ca<2+>) desempeñan un papel integral en la señalización intracelular. El calcio controla diversos procesos celulares, como la transcripción de genes, la contracción muscular y la proliferación celular [1u]. Los efectos de los iones Ca<2+>están mediados por la proteína de unión a Ca<2+>calmodulina, que activa varias proteínas quinasas diferentes. La proteína quinasa dependiente de Ca<2+>/calmodulina incluye la quinasa de cadena ligera de miosina, que señala la contracción muscular, y miembros de la familia de quinasas CaM, que fosforilan varias proteínas diferentes, incluidas enzimas metabólicas, canales iónicos y factores de transcripción [2u].

[0764] En las células asesinas naturales (NK), la señalización de Ca<2+>juega un papel importante en la vía dependiente de gránulos de apoptosis [3u]. El Ca<2+>es necesario para inducir la polarización de los gránulos citolíticos, la transcripción de genes de citocinas y la desgranulación en las células NK [4u, 5u]. El Ca<2+>también regula la fusión de gránulos líticos [5u-7u], así como la movilización de gránulos líticos a la sinapsis inmune para liberar perforina y granzimas para matar las células objetivo [3u, 8u, 9u]. Además, las señales intracelulares descendentes que se producen en las células NK tras la ligadura de las células objetivo para desencadenar la lisis del objetivo están gobernadas por la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) regulada por Ca<2+>[10u]. Las concentraciones intracelulares de Ca<2+>pueden estimular o inhibir la cascada MAPK y, por lo tanto, desempeñar un papel importante en la regulación del proceso celular dependiente de MAPK. Las funciones efectoras de las células NK están reguladas por tres subgrupos específicos de MAPK [11u-13u] que incluyen la MAPK p38 (p38) y la cinasa terminal C-Jun (JNK) que regulan la producción de citoquinas y las cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Estas quinasas regulan la movilización y redistribución de la perforina citoplasmática y la granzima B hacia la zona de contacto con las células objetivo [14u]. Curiosamente, los hallazgos anteriores de los inventores (descritos en el Ejemplo 10) demuestran deficiencias en la señalización de MAPK, así como una concentración reducida de Ca<2+>intracelular en las células NK y en las células B aisladas de pacientes con SFC/EM. En conjunto, estas anomalías pueden contribuir a la disfunción de las células NK, en particular a la reducción de la actividad citotóxica de las células NK que se observa sistemáticamente en los pacientes con CFS/ME [17u-25u].

[0765] Dada la importancia de la señalización de Ca<2+>en la regulación de la función de las células NK, el presente estudio tuvo como objetivo examinar el papel de los genes de la proteína quinasa dependiente de Ca<2+>en células NK aisladas de pacientes con SFC/EM. Esta investigación explora la asociación de alteraciones de la señalización intracelular de NK funcionalmente importantes con el SFC/EM.

[0766] Metodología

[0767] Participantes

[0768] Los participantes fueron reclutados de la base de datos de investigación del Centro Nacional de Neuroinmunología y Enfermedades Emergentes (NCNED) para CFS/ME. Todos los participantes completaron un cuestionario en línea sobre sus antecedentes médicos y síntomas basado en los Criterios de Consenso Internacional (ICC) de 2011 para determinar la idoneidad para el estudio [26u]. Esto requiere la presencia de fatiga debilitante tras el esfuerzo, acompañada además de síntomas neurológicos, inmunes y autonómicos. En este estudio se incluyeron pacientes con CFS/ME que cumplían los síntomas del ICC de 2011 y controles sanos no fatigados. La gravedad del CFS/ME se definió según la escala de discapacidad del Dr. Bell, en el rango entre el 100% (ausencia de síntomas) y el 0% (síntomas graves) [27u]. Los pacientes categorizados como CFS/ME moderado puntuaron >30%. CFS/ME grave: <30% y se consideraban confinados en casa o en cama. La discapacidad de los pacientes se caracterizó además mediante escalas de autoinforme que incluían la Escala de Gravedad de la Fatiga (FSS) y la SF-36 [28u, 29u]. Se excluyó a los participantes que habían sido diagnosticados previamente o tenían antecedentes de alguna enfermedad alternativa que pudiera explicar los síntomas, como trastornos autoinmunes, esclerosis múltiple, psicosis, depresión grave, cardiopatías o trastornos relacionados con la tiroides, o si estaban embarazadas, en periodo de lactancia o eran fumadores.

[0769] Extracción de sangre

[0770] Se recolectaron 40 mililitros de sangre EDTA de la vena antecubital de los participantes en tubos de recolección de sangre EDTA. Todos los análisis de laboratorio se realizaron en las seis horas siguientes a la extracción de sangre para mantener la viabilidad celular. Los patólogos de Queensland también evaluaron los parámetros de las pruebas patológicas rutinarias, incluidos el hemograma completo, la velocidad de sedimentación globular, los electrolitos y la proteína C reactiva de alta sensibilidad en cada muestra de los participantes.

[0771] Aislamiento de células NK

[0772] Las células NK fueron aisladas de 40 mL de sangre total usando selección negativa con RosetteSep Human Natural Killer Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies Australia Pty. Ltd, Victoria, Australia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células NK aisladas se incubaron en medios de cultivo no suplementados Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Life technologies, Carlsbad, USA) y se contaron utilizando azul tripán. Después del aislamiento de las células NK (figura 22), la pureza de las células NK se evaluó también en el citómetro de flujo LSR-Fortessa X-20 (BD Biosciences, San Diego, USA) después de marcarlas con CD3 y CD56 como se ha descrito anteriormente (BD Biosciences, San Diego, USA). Las células NK aisladas se lisaron a una concentración de 10.000 células/μl de amortiguador RLT (Cat No: 79216, QIAGEN, Australia) y se ultracongelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80° C hasta la posterior evaluación de los genes de la proteína cinasa dependiente de Ca<2+>.

[0773] Expresión génica de la proteína cinasa dependiente del Ca2

[0774] La expresión génica se midió directamente mediante recuentos del ARN mensajero (ARNm) correspondiente en cada muestra utilizando un kit de quinasa humana nCounter (Nanostring, Seattle, WA) GX v2 (XT), que es un prueba multiplex para 528 genes que se sabe que se expresan diferencialmente en el quinoma humano [31u]. El sistema nCounter permite la detección directa y el recuento de ácido nucleico mediante sondas reportadoras con múltiples códigos de barras fluoróforos y sondas de captura biotiniladas que se adhieren a microesferas microscópicas, que se fijan a carriles en un cartucho translúcido y se leen en un escáner óptico. Se prepararon lotes de 12 muestras separadas a la vez siguiendo las instrucciones del fabricante, con lisado de células NK hibridado con sondas a 65°C durante 16-18 horas antes de colocarse en la estación automatizada nCounter Prep Station (Nanostring) en la que las muestras se fijaron a cartuchos. A continuación, los cartuchos se colocaron inmediatamente en el escáner óptico nCounter Digital Analyzer (Nanostring) y se leyeron con una resolución objetivo de 550 campos de visión (FOV), que es la resolución máxima de este instrumento.

[0775] Análisis estadístico

[0776] El análisis estadístico se realizó con el software SPSS versión 22 y GraphPad Prism versión 6. Los datos se compararon entre los tres grupos de participantes (control, CFS/ME moderado y CFS/ME grave) y se realizó un análisis estadístico basado en la distribución. Se realizaron pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk en todos los conjuntos de datos para comprobar la distribución gaussiana. Se utilizó el ANOVA para examinar los datos paramétricos y la prueba de Kruskal Wallis de independientes para los datos no paramétricos cuando procedía, fijándose la significancia estadística en un criterio alfa enp< 0.05. La expresión génica se midió directamente mediante recuentos del ARN mensajero (ARNm) correspondiente en cada muestra utilizando el software del paquete DESeq R [32u], donde el nivel alfa de significancia se fijó en un valor ap de < 0.05.

[0777] Resultados

[0778] Participantes

[0779] La Tabla 30 resume las características clínicas de los participantes. El estudio incluyó 11 CFS/ME moderados (edad 54.9 ± 10.3; 83.3 % mujeres) y 12 CFS/ME graves (edad 47.5 ± 8.0; 75.0 % mujeres), y 11 controles no fatigados (edad 50.0 ± 12.3 años; 72.5 % mujeres). No hubo diferencias significativas entre las medias de edad y sexo de los grupos. Todos los participantes en el estudio eran de ascendencia europea y residían en Australia en el momento de la extracción de sangre. La gravedad de la fatiga fue mayor entre los pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles con CFS/ME moderado y sin fatiga (p<0.05). Además, el CFS/ME grave informó de un deterioro significativamente mayor en todas las escalas de la SF-36 en comparación con el CFS/ME moderado y los controles no fatigados (p<0.05), excepto para la salud mental general (p=0.11). La comparación de la edad del grupo y los parámetros sanguíneos, incluida la velocidad de sedimentación globular, la proteína C reactiva de alta sensibilidad y los recuentos sanguíneos completos de glóbulos blancos y rojos entre los grupos participantes no mostró diferencias significativas. La tabla 30 presenta las características de los participantes.

[0780] Tabla 30 Características clínicas entre controles sin fatiga, CFS/ME moderado y CFS/ME grave

[0783]

[0785] Expresión génica de la proteína cinasa dependiente del Ca2

[0786] El análisis de micromatrices de los 528 genes quinasa reveló que había 92 genes que estaban significativamente asociados con los pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles no fatigados. De los 92 genes, 37 genes estaban significativamente regulados al alza (Tabla 31) y 55 genes estaban significativamente regulados a la baja (Tabla 32) en pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles no fatigados. En la Figura 23 se muestra un mapa de calor de la expresión génica con agrupación mediante correlación de Spearman en pacientes con CFS/ME grave y controles sin fatiga. No se observaron alteraciones significativas en la expresión de los genes quinasa en los pacientes con CFS/ME moderada en comparación con los controles sin fatiga.

[0788] Tabla 31. Lista de genes quinasa dependientes del calcio significativamente regulados al alza en el grupo con CFS/ME grave en comparación con los controles sin fatiga.

[0791]

[0794] Tabla 32. Lista de genes quinasa dependientes del calcio significativamente regulados a la baja en el grupo con CFS/ME grave en comparación con los controles sin fatiga.

[0797]

[0798]

[0801] Se analizaron noventa y dos genes asociados a pacientes con CFS/ME grave mediante el análisis de vías MetaCore. Las firmas de genes se asociaron con setenta y siete redes de procesos significativos, incluyendo citotoxicidad NK, IFN-γ, IL-17 de células inmunes, función de células inmunes, procesos fisiológicos, transducción de señales y traducción en pacientes con CFS/ME (Tabla 33).

[0803] Tabla 33. Redes de genes quinasa dependientes del calcio significativas asociadas a los pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles no fatigados.

[0806]

[0807]

[0808]

[0809]

[0812] Discusión

[0814] Este estudio informa, por primera vez, de la expresión diferencial de genes de proteína quinasa dependientes de Ca2<+>de células NK aisladas en pacientes con CFS/ME grave en comparación con controles no fatigados. Treinta y siete genes de la proteína cinasa dependiente del Ca2<+>estaban significativamente regulados al alza y 55 genes de la proteína cinasa dependiente del Ca2<+>estaban significativamente regulados a la baja en pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles sin fatiga. Dado que la presente investigación se llevó a cabo en células NK aisladas, los genes de proteína cinasa dependientes de Ca<2+>que se describen se analizarán en el contexto de las vías intracelulares implicadas en la actividad de JNK, STAT y NFkappa beta (NF-κβ) y la lisis de células NK.

[0816] Los resultados de esta investigación actual destacan una regulación descendente significativa de las proteínas quinasas dependientes de Ca<2+>, concretamente Lck y ZAP70, entre los pacientes con CFS/ME grave en comparación con los controles no fatigados. Las células NK contienen una cadena zeta, asociada al receptor Fc CD16 (FcgRIIIA), donde fosforila Zap-70, así como la cadena gamma transductora asociada [33u]. Las colas citoplasmáticas de las moléculas de adhesión y los receptores activadores de las células NK reclutan a la familia de quinasas Src para fosforilar las ITAM o ITSM [34u-37u]. Posteriormente se fosforilan las moléculas de señalización, incluyendo Lck, Zap70, activación de enlace para células T (LAT) y la proteínaleucocitariade76kDa que contiene dominio SH2 (SLP-76), que continúan fosforilando y movilizando múltiples proteínas de señalización posterior, lo que resulta en la activación de las células NK y el inicio de la exocitosis dependiente de gránulos [38u-40u]. La reducción significativa de la expresión de ZAP70 y Lck puede afectar a la fosforilación de los receptores activadores de las células NK que contienen motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora (ITAM) para fosforilar y movilizar múltiples proteínas de señalización posterior, lo que da lugar a la activación de las células NK y al inicio de la exocitosis dependiente de gránulos. Dada la reducción significativa tanto de ZAP70 como de Lck, siendo éstas proteínas quinasas dependientes de Ca<2+>, el efecto intracelular descendente puede ser significativo para las funciones efectoras de las células NK. Los presentes inventores y otros han descrito previamente una reducción significativa de la lisis NK, cambios en la producción y movilización de citoquinas y redistribución de perforina citoplasmática y granzima B hacia la zona de contacto con las células objetivo [14u, 20u, 41u-45u].

[0818] La reducción significativa en las proteínas quinasas dependientes de Ca<2+>ERK1/2 y MEK1/2 reportada en este estudio actual se alinea con la investigación previa de los inventores que reportó una disminución significativa en ERK1/2 en células NK CD56<dim>CD16<+>comparadas con los controles no fatigados [ver el Ejemplo anterior]. Una reducción significativa de MEK1/2 sugiere un mayor compromiso de las funciones de las células NK efectoras. Después de la activación de los factores desencadenantes, una cascada de señalización a través de la fosforilación secuencial de MAPK, MEK y ERK da lugar a la polarización del gránulo lítico mediada por TUBB [47u] que regula la reorientación del microtúbulo y del centro organizador de microtúbulos (MTOC) hacia las células objetivo para liberar perforina y granzimas. La activación de ERK1/2 facilita la polarización de los gránulos citotóxicos hacia el centro organizador de microtúbulos (MTOC) [48u, 49u]. Las señales intracelulares MAPK activan la reorganización y polarización del citoesqueleto de actina, lo que facilita el movimiento de los gránulos citotóxicos a lo largo de los microtúbulos MTOC hacia la sinapsis inmunitaria [48u, 49u]. Se requiere un umbral crítico de señalización de MAPK, MEK y ERK para que las células NK monten una respuesta de células efectoras. Una reducción significativa en la expresión de MEK2, ERK1 y TUBB, como se ha reportado en esta investigación actual, puede interrumpir estos eventos distales que conducen en última instancia a la citotoxicidad NK reducida. Esta citotoxicidad NK reducida puede deberse a una reducción de la fosforilación ERK1/2, reduciendo la polarización del gránulo secretor hacia la sinapsis inmunitaria para la degranulación 13u, 50u] en pacientes con CFS/ME grave. Es importante destacar que los inventores han reportado de la reducción de ERK1/2 en células NK aisladas. Además, los inventores y otros investigadores han reportado de una reducción significativa de gránulos líticos, como la granzima B de pacientes con CFS/ME [14u, 20u, 41u-45u].

[0819] La unión de las células NK a las células objetivo desencadena que la fosfatidilinositol (PI)-3 quinasa (PI3K) sea activada rápidamente por las tirosina quinasas de la familia Src (SETKs) y/o SYK conduciendo al influjo de calcio [51u] y a la activación de la proteína quinasa C (PKC). En la presente investigación, los inventores reportan de aumentos significativos de PKC alfa en el grupo con CFS/ME grave en comparación con el grupo de control sin fatiga. Es importante destacar que la PKC-alfa, un miembro de la familia de las proteínas quinasas C (PKC) de las quinasas de serina/treonina activadas por Ca<2+>y/o lípidos, funciona posterior a muchas vías de transducción de señales asociadas a la membrana [52u]. La activación de PKC alfa desencadena una cascada de señalización a través de la fosforilación secuencial de las vías MAPK, MEK, ERK y JNK. Los iones de calcio, los iones de magnesio y los diacilgliceroles (DAG) son las moléculas más importantes para regular la actividad PKC-α, ya que bajas concentraciones de estas moléculas aumentan la actividad PKC-alfa. De ahí que el presente estudio destaque la importancia de los canales iónicos de transporte de Ca<2+>en este contexto.

[0821] Como se describió en Ejemplos anteriores, los inventores investigaron el papel de los canales de cationes del potencial receptor transitorio melastatina 3 (TRPM3) y los niveles de calcio intracelular en células NK y B aisladas y encontraron reducciones significativas en el calcio intracelular de cada uno de los tipos celulares, así como una reducción significativa en los receptores TRPM3 de la superficie celular. Estos hallazgos sugieren que la reducción significativa del calcio intracelular de estos tipos celulares puede dar lugar a aumentos significativos de la quinasa dependiente del calcio PKC-alfa. En consecuencia, el efecto descendente de este aumento de la expresión génica sugiere un aumento de p38 y, posteriormente, de la activación de NF-Kβ y la producción de mediadores inflamatorios [54u]. Curiosamente, los inventores han reportado en un Ejemplo anterior de un aumento significativo en células NK aisladas, de MAPK (p38) de pacientes con CFS/ME. Otros investigadores han reportado de un aumento significativo de la producción de NF-Kβ, así como de un aumento de factores proinflamatorios, como IL-6, IFN gamma y productos antiinflamatorios IL10 de pacientes con CFS/ME [56u-62u].

[0823] Además, la activación de la cinasa terminal C-Jun (JNK) es activada por PKC-alfa, donde JNK modifica la actividad de numerosas proteínas localizadas en la mitocondria o activa la inflamación y las citoquinas proinflamatorias como IL-2, IL-6 y TNF-α. El aumento de la activación de PKC alfa puede proporcionar una posible explicación para el aumento de JNK junto con p38, lo que resulta en la producción de citoquinas proinflamatorias como IFNy, TNF alfa, IL-2 e IL-6, de las células NK [63u]. El aumento significativo de PKC-alfa puede sugerir un cambio hacia una respuesta inmunitaria Th1/proinflamatoria. Investigadores anteriores reportaron aumentos significativos de IFN gamma, IL-2, TNF alfa e IL-6 en pacientes con CFS/ME [56u-62u]. Además, la IL-10 antiinflamatoria ejerce efectos inhibidores sobre la secreción de citocinas e impide la secreción de citocinas proinflamatorias por parte de múltiples células, incluidas las células NK (IFN-γ y TNF-α) [63u]. Una disminución de la IL-10 favorece un aumento de las respuestas proinflamatorias y esto puede aumentar la prevalencia de las citocinas de tipo Th1. Es importante destacar que los inventores y otros han reportado de reducciones significativas de IL-10 en pacientes con CFS/ME [64u, 65u].

[0824] Durante la inflamación, las células NK son reclutadas a los ganglios linfáticos donde son activadas por transpresentación de IL-15 por IL-15Rα expresado en células dendríticas [66u]. La activación del IL-15R en las células NK provoca la autofosforilación y la activación de las quinasas Janus (JAK1 y JAK3). Posteriormente, esto induce las vías Ras-Raf-MEK, PI3K-AKT-mTOR y la transducción de señales y activación de la transcripción (STAT) 5 [67u, 68u]. Los estudios han demostrado que la IL-15 activa las células NK para que se doten de gránulos citotóxicos y las sensibilice a estímulos secundarios. Además, investigadores anteriores han reportado de que la vía mTOR es fundamental para la activación inducida por la IL-15 de funciones vitales de las células NK. Por lo tanto, una reducción significativa en mTOR reportada en esta investigación sugiere una función efectora NK reducida de la producción de gránulos líticos y una lisis celular reducida como se ha descrito previamente en pacientes con CFS/ME [14u, 20u, 41u-45u]. Las proteínas Stat5 son activadas por una amplia variedad de citocinas y factores de crecimiento, como IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-9, IL-15 y factores estimulantes de colonias de granulocitos-macrófagos. Es importante destacar que investigaciones anteriores descubrieron que la IL-2, la IL-4 y la IL-15 estaban estrechamente asociadas en el CFS/ME y menos centradas en una citocina individual. Es importante destacar que los autores también destacan que la IL-2, 4 y 15 pertenecen a una familia de citocinas que también incluye la IL-7, IL-9 y son iniciadas por STATS [69u].

[0825] Los genes quinasa identificados en este estudio controlan un gran número de redes de procesos dentro de las células que afectan a la función sináptica, la transducción de señales, las vías de inflamación, la apoptosis, la contracción muscular, el ensamblaje del huso del citoesqueleto de microtúbulos, el ritmo circadiano, el transporte de calcio y la señalización del óxido nítrico. Se identificaron efectos metabólicos, predominantemente vías de expresión génica de la insulina. Las vías de fosforilación y modificación de proteínas predominaron en el análisis de asociación génica. Así pues, este estudio reveló múltiples perturbaciones génicas, metabólicas y de las vías de señalización que se manifiestan en los genes de las cinasas sensibles al calcio. Las vías de la cinasa controlan o regulan numerosas fisiologías, incluidos los sistemas cardiovascular, urogenital, gastrointestinal, neurológico y respiratorio. Las perturbaciones de las cinasas sugieren la probable demostración de un perfil inflamatorio junto con otros mecanismos fisiológicos desregulados, lo que se suma a la desregulación generalizada de los mecanismos inflamatorios en prácticamente todas las células [70u]. Además, la desregulación del Ca<2+>es una consecuencia importante de la alteración de la señalización de los receptores de membrana y es probable que tenga efectos en la función neuronal, como la transmisión de impulsos [71u], así como en la contracción muscular [72u]. El deterioro del control neurológico y motor son síntomas comunes asociados al CFS/ME [26u]. Por lo tanto, se sugiere investigar más a fondo la desregulación de la señalización de Ca<2+>y quinasa en el sistema nervioso central, dada la gran dependencia de la señalización de Ca<2+>para el funcionamiento de las células gliales y neuronales y su papel potencial en el patomecanismo del CFS/ME.

[0826] Conclusión

[0827] Este estudio identifica, por primera vez, 92 genes quinasa dependientes de calcio diferencialmente regulados en células NK de pacientes con CFS/ME en comparación con controles sanos no fatigados. Específicamente, se incrementaron 37 genes y se redujeron 55 genes implicados en numerosas vías metabólicas y de señalización celular, incluida la inflamación. Aunque indican principalmente una alteración funcional en la actividad citotóxica de las NK y una disfunción inmunológica, las quinasas se localizan en todas las células del organismo y pueden estar asociadas a otras manifestaciones clínicas descritas en el CFS/ME.

[0828] Ejemplo 12 - Un estudio de asociación genómica dirigido que examina los canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP), los receptores de acetilcolina (AChR) y los receptores adrenérgicos (ADR) en el síndrome de fatiga crónica/encefalomielitis miálgica (CFS/ME)

[0829] En este Ejemplo los inventores identifican y caracterizan un SNP en el receptor adrenérgico α1(ADRA1A) que es un marcador celular potencial para CFS/ME.

[0830] Introducción

[0831] Los procesos biológicos responsables de los variados síntomas reportados para el CFS/ME pueden involucrar varios canales y receptores iónicos que están localizados en las células de todo el cuerpo. Los canales iónicos de potencial receptor transitorio (TRP) se expresan ampliamente en tejidos y células y se activan y regulan por diversos estímulos del entorno celular, como el dolor, la temperatura, el gusto, la presión y la visión [5p]. Existen seis subfamilias: TRPA (anquirina), TRPC (canónica), TRPM (melastatina), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) y TRPV (vanilloide) [6p].

[0832] La mayoría son canales no selectivos permeables a cationes como el calcio (Ca<2+>), el sodio (Na<+>) y el magnesio (Mg<+>). Esto tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis para una serie de requisitos fisiológicos. En consecuencia, se ha descubierto que la desregulación de estos canales desempeña un papel en condiciones patológicas como el dolor crónico, la vejiga hiperactiva, la diabetes, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la hipertrofia cardiaca, la enfermedad de Alzheimer familiar, las enfermedades cutáneas, las displasias esqueléticas, la neuropatía y el cáncer [7p-12p].

[0833] Además de los TRPs, los receptores de acetilcolina (AChRs) son de particular interés debido a su papel en la transmisión neurológica y neuromuscular [13p.14p]. Su función puede tener un papel en las dificultades para procesar la información y en la pérdida de memoria a corto plazo de la que se ha reportado en el CFS/ME [1p.15p]. Los AChR son de dos tipos que se unen a la acetilcolina y transmiten su señal. Los nicotínicos (nAChRs) son canales iónicos activados por ligandos y participan en las interacciones sinápticas rápidas de los neurotransmisores [16p]. Los muscarínicos (mAChRs) consisten en 17 subunidades diferentes y son receptores acoplados a proteínas G que facilitan respuestas metabólicas lentas a través de cascadas de mensajeros secundarios [17p].

[0834] Además, los receptores adrenérgicos (ADRs) son otra clase de receptores acoplados a proteína G que tienen ligandos catecolamínicos [18p]. Esta unión está asociada a la estimulación del sistema nervioso simpático, comúnmente conocido por la respuesta de lucha o huida en la que se moviliza la energía y el flujo sanguíneo se desvía de los órganos no esenciales al músculo esquelético. Existen 3 tipos de receptores; α1, que interviene principalmente en el Ca<2+>intracelular y en las contracciones posteriores del músculo liso [19p]. Los receptores α2 intervienen en la inhibición de los neurotransmisores, la disminución del AMPc y la disminución de la contracción del músculo liso. Los receptores beta tienen 3 subtipos y aumentan alternativamente la actividad del AMPc dando lugar a contracciones del músculo cardiaco, relajación del músculo liso y glucogenolisis [20p.21p].

[0835] En los Ejemplos anteriores, los inventores identificaron SNP y genotipos significativos en TRPs y AChRs en células mononucleares de sangre periférica en pacientes con CFS/ME en comparación con controles sanos. Específicamente, se identificaron 13 SNP significativos en TRPs y 17 SNP significativos en AChRs (9 mAChRs; 8 nAChRs). El CFS/ME se caracteriza en gran medida por ser una enfermedad heterogénea. Los canales y receptores iónicos mencionados se eligieron como objetivos en un estudio de asociación de todo el genoma debido a su amplia expresión en las células y a su implicación en numerosos procesos fisiológicos. Por lo tanto, el propósito de esta investigación fue identificar si se observa asociación entre los SNP para TRPs, AChRs y ADRs en pacientes con CFS/ME en comparación con los controles sanos.

[0836] Metodología

[0837] Participantes

[0838] Los participantes procedían de la base de datos de investigación sobre CFS/ME del Centro Nacional de Neuroinmunología y Enfermedades Emergentes (NCNED). Se reclutó a participantes de entre 18 y 65 años de redes de apoyo comunitario de la región del sudeste de Queensland y el norte de Nueva Gales del Sur (Australia). Todos los participantes rellenaron un cuestionario de detección en el que se informaba de sus datos sociodemográficos, antecedentes médicos y síntomas. Los pacientes con CFS/ME se clasificaron según los criterios de Fukuda (1). Para ello se requería la presencia de fatiga que repercutiera significativamente en las actividades cotiobjetivos durante al menos 6 meses. No debe deberse a un esfuerzo continuado ni a otras afecciones médicas y debe ir acompañado de al menos cuatro de los siguientes síntomas: malestar postesfuerzo, sueño no reparador, alteración de la memoria a corto plazo o de la concentración, dolor muscular, dolor articular, cefaleas, sensibilidad en los ganglios linfáticos y/o dolor de garganta. Los controles sanos no notificaron ningún indicio de enfermedad. Se excluyeron los participantes que no cumplían los criterios anteriores o con otros diagnósticos médicos que excluyeran el CFS/ME, por ejemplo, trastorno autoinmune, esclerosis múltiple, psicosis, depresión grave, enfermedad cardiovascular. También se excluyó a las participantes embarazadas, lactantes, fumadoras o con antecedentes de abuso de sustancias.

[0839] Extracción de ADN

[0840] Las células mononucleares de sangre periférica se recolectaron en tubos de ácido etilenadiaminotetraacético. Se realizó una patología de rutina para detectar cualquier parámetro anormal, incluido el hemograma completo, la velocidad de sedimentación globular y la proteína C reactiva de alta sensibilidad, realizada por Pathology Queensland. Se utilizó el minikit de ADN en sangre de Qiagen para extraer aproximadamente 2μg de ADN genómico siguiendo las instrucciones del fabricante. Para evaluar la calidad y la cantidad de ADN, se utilizó el escáner óptico nCounter Digital Analyzer (Nanostring, USA). El genotipado del genoma completo se realizó utilizando la matriz HumanOmniExpress BeadChip (Illumina, Corea del Sur).

[0841] Análisis estadístico

[0842] El análisis estadístico se realizó utilizando el software de análisis del genoma completo PLINK v1.07 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) [Purcell, 2007p] para identificar la frecuencia de SNP. Para el control de calidad, se aplicó un filtro de frecuencia alélica mayor de <1%. Además, se eliminaron los SNP con una varianza inferior al 2%. La heterocigosidad de la muestra también se aplicó como medida de control de calidad y se calculó como la proporción de genotipos heterocigotos en relación con todos los genotipos a nivel de SNP y de muestra. Los datos se compararon entre pacientes con CFS/ME y controles sanos utilizando R (R Core Team, 2013). Se utilizó la prueba de probabilidad exacta de Fisher para examinar la asociación significativa de genotipos para cada SNP individual, y se aplicó una corrección de Bonferroni para la corrección de pruebas múltiples como análisis post hoc (p<0.05).

[0843] Resultados

[0844] Características demográficas

[0845] La mayoría de los participantes en este estudio eran de ascendencia caucásica (97.8%). De los 172 participantes, 95 cumplían criterios de CFS/ME y 77 cumplían criterios de controles sanos, y la edad media y la proporción de mujeres era de 45.8 ± 8.9 (69% mujeres) y 42.3 ± 10.3 (63% mujeres) respectivamente. Se analizaron posibles factores de confusión para el análisis, como la edad, el sexo y el origen étnico, en busca de interacciones con los genes de interés, y no se identificaron valores atípicos, por lo que no fue necesario realizar ajustes.

[0846] Estudio de asociación SNP

[0847] Se incluyó un total de 950 SNP para el análisis después de aplicar medidas de control de calidad. Se enumeran en la Tabla 34a.

[0848] Tabla 34a: 26: Variantes SNP del canal TRP, receptores ACh o ADR anotadas con su consecuencia.

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[0885] La distribución de estos SNP por cromosoma se resume en la Figura 24. En consecuencia, la mayoría de los SNP se observaron en el cromosoma 9 (204 SNP).

[0886] La Figura 25 muestra un diagrama de Manhattan de los resultados de la prueba exacta de Fisher. La línea azul (es decir, la línea inferior entre 1 y 2 en el eje logarítmico) corresponde al umbral significativo sin ningún ajuste (valores p brutos). Antes de la corrección de Bonferroni, 60 SNP significativos se asociaron con el CFS/ME en comparación con los controles sanos. La línea roja (es decir, la línea superior entre cuatro y cinco en el eje logarítmico) corresponde al umbral significativo después de la corrección de Bonferroni.

[0887] Los valores p brutos de los 10 principales SNP identificados se resumen en la Tabla 34b. Las frecuencias correspondientes en el CFS/ME en comparación con los controles sanos se muestran en la Figura 26.

[0888] Tabla 34b. Resultados de la prueba exacta de Fisher para los 10 SNP principales antes de las correcciones de Bonferroni

[0889] Nombre SNP valor p bruto padj FDR padj Bonferroni"rs2322333" "6.2e-05" "0.059" "0.059" "rs4779824" "0.002" "0.788" "1"

[0890] "rs11787707" "0.004" "0.788" "1"

[0891] "rs10467996" "0.005" "0.788" "1"

[0892] "rs10118380" "0.01" "0.788" "1"

[0893] "rs7022747" "0.011" "0.788" "1"

[0894] "rs1316971" "0.013" "0.788" "1"

[0895] "rs526302" "0.013" "0.788" "1"

[0896] "rs6719311" "0.013" "0.788" "1"

[0897] "rs11782159" "0.016" "0.788" "1"

[0898] Después del ajuste mediante la corrección de Bonferroni, la asociación con el SNP α1A adrenérgico(ADRA1A ) rs2322333localizado en el cromosoma 8 fue casi significativa (p=0.058) (Figura 27). La proporción de pacientes con CFS/ME con homocigosis mayor (GG) para este SNP fue mayor en comparación con los controles sanos. Además, la clase de genotipo homocigoto menor (AA) era mucho menor en los pacientes con CFS/ME en comparación con los controles sanos (4.2% frente a 24.7) (Figura 27).

[0899] Discusión

[0900] Este estudio es el primero en identificarADRA1Acomo un nuevo gen candidato para el CFS/ME según el análisis del genoma completo. Después de aplicar estrictas correcciones para pruebas múltiples, el SNPADRA1Asiguió siendo predominante. Además, la proporción de pacientes que eran homocigotos menores, AA era mucho menor en el CFS/ME en comparación con los controles sanos. Estos resultados sugieren específicamente que los pacientes que presentan este marcador alélico pueden tener un menor riesgo de desarrollar CFS/ME.

[0901] Las implicaciones fisiológicas específicas deADRA1Aestán implicadas principalmente en la contracción del músculo liso [20p]. Esto es necesario para la vasoconstricción de los vasos sanguíneos de todo el cuerpo, incluida la piel, el sistema gastrointestinal, el sistema genitourinario, el riñón y el cerebro. También interviene en la glucogenolisis y gluconeogénesis del tejido adiposo en el hígado, además de en las secreciones de las glándulas sudoríparas [24p, 25p, 26p]. Estos procesos se han descrito con frecuencia en la sintomatología del CFS/ME [3p.4p]. Por lo tanto, la expresión diferencial deADRA1Apuede explicar fenotipos clínicos particulares del CFS/ME.

[0902] Los ADRA1Ason miembros de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G [27p]. Cuando se activa, la proteína G heterotrimérica (G<g>) activa a su vez la fosfolipasa (PLC). La PLC escinde el fosfatidilinositol 4.5-bifosfato (PIP2), lo que provoca un aumento del inositol trifosfato (IP3) y del diaciglicerol (DAG) (REFS). El IP3 actúa como mensajero secundario y es una molécula soluble capaz de difundirse a través del citoplasma hasta el retículo endoplásmico de las células (o retículo sarcoplásmico en las células musculares) para estimular la afluencia de Ca<2+>. Esto implica la unión del ligando IP3 a los canales de Ca<2+>sensibles al IP3 que resultan en la liberación de Ca<2+>al citoplasma [28p.29p]. Esto contribuye a una serie de procesos celulares, incluyendo una corriente lenta tras despolarización (sADP) en neuronas [30p].

[0903] Como se describió en un Ejemplo anterior, los inventores investigaron la desregulación de los genes quinasa dependientes de Ca<2+>en células asesinas naturales (NK) aisladas de pacientes con CFS/ME [Chacko et al.2016p]. En comparación con los controles sanos, los pacientes con CFS/ME presentan una actividad citotóxica NK reducida [31p-39p]. En las células NK, la señalización de Ca<2+>tiene un papel vital en la vía de apoptosis dependiente de gránulos [40p]. El Ca<2+>es necesario para inducir la polarización de los gránulos citolíticos, la transcripción de genes de citoquinas y la degranulación en las células NK [41p.42p]. Los inventores descubrieron que 92 genes significativos de la proteína cinasa dependiente de Ca<2+>se expresaban de forma diferencial en un grupo de CFS/ME clínicamente grave (confinado en casa o en cama) en comparación con los controles no fatigados. Esto puede contribuir a alterar las redes de señalización intracelular y la función de los efectores. En consecuencia, los inventores también han demostrado alteraciones significativas en la vía de señalización MAPK, así como han observado una disminución de la concentración intracelular de Ca<2+>en células NK, así como en células B aisladas de pacientes con CFS/ME. Además de los receptores adrenérgicos, este estudio seleccionó genes para TRPs, AChRs, y acetilcolinesterasa debido a su papel en la función neurológica, sensorial y motora que se presentan como síntomas de CFS/ME. Aunque éstos no siguieron siendo significativos tras el análisis post hoc. entre los genes adicionales que se observaron con mayor frecuencia en los pacientes con CFS/ME se incluyeronTRPC1, TRPM1, TRPM3, TRPM6, TRPM8yCHRNB4.Anteriormente en los Ejemplos anteriores, los inventores examinaron 678 SNP en células NK aisladas en pacientes con CFS/ME e identificaron 11 genes de canales iónicos TRP significativos paraTRPC4, TRPC2, TRPM3 y TRPM8,así como 14 genes AChR significativos incluyendoCHRNA2, CHRNA2, CHRNB4, CHRNA5yCHRNE(p<0.05). Es importante destacar que el presente estudio examinó 950 SNP adicionales en los que sólo había 80 coincidencias con los estudios anteriores en los Ejemplos anteriores. En particular, se sabe queTRPM3desempeña un papel vital en la señalización de Ca<2+>y ocupó un lugar destacado en los análisis de los inventores. Por lo tanto, los inventores también han investigado previamente y notificado una expresión superficial significativamente disminuida deTRPM3en células NK y B.

[0904] Se desconoce si las asociaciones observadas en este estudio pueden estar implicadas en el mecanismo biológico subyacente del CFS/ME. De particular interés es saber si el papel funcional del SNPrs2322333identificado en este estudio está implicado en la regulación de otros genes. Este SNP está localizado dentro del intrón deADRA1A,algunos estudios GWAS han indicado que los genes intrónicos pueden regular la transcripción de un gen cercano mediante bucles específicos de cromatina [47p]. Además, los resultados de este estudio son indicativos de que debería examinarse una cohorte más amplia para determinar si ser homocigoto menor para varios marcadores alélicos tiene un efecto protector frente al CFS/ME.

[0905] Este estudio es el primer estudio de asociación de genoma completo realizado en una cohorte australiana con CFS/ME. Un punto fuerte de este estudio fue la considerable asociación conADRA1Adetectada en una cohorte preliminar de pacientes, cuando se aplicaron consideraciones estadísticas estrictas.

[0906] Conclusión

[0907] En conclusión, este estudio demostró queADRA1Aes un marcador celular potencial para CFS/ME. Se recomienda que futuros estudios examinen su papel funcional en la variación de otros genes para dilucidar si estos marcadores alélicos tienen un papel protector potencial contra el CFS/ME.

[0908] Ejemplo 13 - Sondas, herramientas y reactivos basados en genes AchR, TRP y ADR y en productos genéticos, así como otros tipos de herramientas y reactivos

[0909] Los Ejemplos anteriores explican cómo los SNP TRP, AchR y ADR pueden usarse como "herramientas" para identificar sujetos con, o predispuestos a, CFS/ME así como otras condiciones médicas o síntomas de las mismas. Este hallazgo clave de SNP permite a los inventores desarrollar sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas basados en genes/alelos y productos genéticos de canales iónicos TRP, receptores de ACh o ADR para identificar, cribar, diagnosticar, monitorear y/o tratar a sujetos con esas afecciones/síntomas médicos o predispuestos a ellos.

[0910] Un experto en la materia podría diseñar, producir o fabricar fácilmente una amplia gama de sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas basados en el canal iónico TRP, en el receptor de ACh o en el gen/alelo ADR y en el producto genético, basándose en la información de las Tablas 1 a 7, 9, 10, 12 a 17, 26 a 28 y 34.

[0911] En términos generales, dichas sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas basados en el canal iónico TRP, el receptor de ACh o el gen/alelo o el producto genético ADR pueden utilizarse para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear o tratar/gestionar sujetos con, o predispuestos a, dichas afecciones médicas.

[0912] En general, tales sondas, herramientas o reactivos basados en o desarrollados a partir de un canal iónico TRP, receptor de ACh o gen o producto genético ADR pueden, por ejemplo, unirse específicamente, detectar, identificar, caracterizar o cuantificar el gen o parte del gen, el producto genético ARN o parte del producto genético ARN, el producto genético polipéptido o parte del producto genético polipéptido.

[0913] En general, dicha sonda, herramienta o reactivo puede ser para la detección de un polimorfismo a nivel genómico, a nivel de transcripción o a nivel polipeptídico.

[0914] En términos generales, dicha sonda, herramienta o reactivo puede ser para la medición cuantitativa o cualitativa de la transcripción o traducción del ARN.

[0915] En general, dicha sonda, herramienta o reactivo puede ser también un anticuerpo u otro tipo de molécula o entidad química capaz de detectar el gen o producto genético (ARN o polipéptido).

[0916] Más específicamente, las sondas, herramientas y reactivos de interés particular incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:

[0917] 1. Una forma aislada, purificada, sintética o recombinante de TRP, AchR o ADR, o un fragmento del mismo, incluido un fragmento que contenga un SNP de interés - monocatenario o bicatenario.

[0918] 2. Un polinucleótido no natural, polinucleótido recombinante, oligonucleótido o forma de ADNc de TRP, AchR o ADR, o un fragmento del mismo, incluido un fragmento que contenga un SNP de interés - monocatenario o bicatenario. 3. Un producto de expresión (ARNm) de TRP, AchR o ADR, o un fragmento del mismo, incluido un fragmento que contenga un SNP de interés. Dependiendo del SNP, el ARNm puede diferir de un producto de expresión en un individuo sano. El producto de expresión puede no estar marcado o estar marcado con una fracción detectable. 4. Un polinucleótido, oligonucleótido, sonda o cebador (sin etiquetar o etiquetado con una fracción detectable) para unirse específicamente a, recoblecerse con, detectar, aislar o amplificar (por ejemplo mediante PCR) TRP, AchR o ADR, o un fragmento de los mismos, incluido un SNP de interés.

[0919] 5. Un polinucleótido, oligonucleótido, sonda o cebador (sin etiquetar o etiquetado con una fracción detectable) que se une específicamente al producto de expresión de 3, se une a él, se detecta, se aísla o se amplifica (por ejemplo, mediante PCR).

[0920] 6. Un vector de expresión, célula recombinante o muestra biológica que comprenda el ácido nucleico o polinucleótido de1, 2, 3, 4 o 5.

[0921] 7. Un producto de expresión (polipéptido/proteína) de TRP, AchR o ADR, o un fragmento del mismo, incluido un fragmento que contenga un SNP de interés. Dependiendo del SNP, el polipéptido puede diferir del polipéptido de un individuo sano. El polipéptido puede estar sin etiquetar o etiquetado con una fracción detectable o para aislamiento (por ejemplo, marcado en el extremo C o N).

[0922] 8. Un anticuerpo monoclonal o policlonal capaz de unirse al producto de expresión de 7.

[0923] Otras sondas, herramientas y reactivos se describen en la sección de la especificación titulada "Descripción detallada". El hallazgo del SNP clave también permite a los inventores desarrollar kits, pruebas, micromatrices, biochips y métodos para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear y/o tratar sujetos con, o predispuestos a, las condiciones médicas/síntomas descritos en esta especificación.

[0924] En términos generales, el kit, prueba, micromatriz, biochip o método para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear y/o tratar sujetos con, o predispuestos a, las condiciones/síntomas médicos, puede comprender uno o más materiales de cualquiera de 1-8. Esto puede ser, por ejemplo, para genotipado, o para identificar o medir la expresión o falta de expresión de productos genéticos.

[0925] En la sección de la especificación titulada "Descripción detallada" se describen otros kits, pruebas, micromatrices, biochips y métodos.

[0926] En la Tabla 35 se muestran ejemplos de polinucleótidos, oligonucleótidos, sondas o cebadores preferidos para unirse específicamente a los SNP de TRP o AchR, o para recocerlos, detectarlos, aislarlos o amplificarlos (por ejemplo, por PCR). En la Tabla 36 se muestra un ejemplo de un polinucleótido, oligonucleótido, sonda o cebador preferido para unirse específicamente a un SNP de ADR, recoblecerse con él, detectarlo, aislarlo o amplificarlo (por ejemplo, mediante PCR).

[0927] Tabla 35: Polinucleótidos, oligonucleótidos, sondas o cebadores preferidos para detectar los SNP de TRP o AChR. (En la página siguiente.)

[0929]

[0930]

[0931]

[0932] Tabla 36: Un polinucleótido, oligonucleótido, sonda o cebador preferido para detectar un SNP de ADR.

[0935]

[0938] Uno o más de los Ejemplos anteriores explican cómo las pruebas del metabolismo del calcio pueden utilizarse para identificar, examinar, diagnosticar o monitorear a un sujeto que padece, o corre el riesgo de padecer, una condición médica o un síntoma de la misma, en particular CFS/ME. Este hallazgo clave de los inventores permite a un experto en la materia desarrollar sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas para el análisis del metabolismo del calcio, como también se describe en otro lugar.

[0939] El Ejemplo 11 anterior explica cómo un gen de quinasa dependiente de calcio diferencialmente regulado puede utilizarse como indicador de una condición médica o síntoma de la misma - particularmente CFS/ME grave. Este hallazgo clave de los inventores permite a un experto en la materia desarrollar sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas para detectar el gen de la quinasa dependiente de calcio regulada diferencialmente, como también se describe en otro lugar.

[0940] En el Ejemplo 10 anterior se explica cómo pueden analizarse las células asesinas naturales (NK) (y otros tipos de células o tejidos) en un sujeto para detectar la señalización disfuncional a través de la vía de la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK), incluida la señalización a través de la cinasa MAPK (MAPKK/MEK1/2) y la cinasa regulada por señal extracelular (ERK)1/2, así como p38, por lo que la señalización disfuncional indica que el sujeto padece la condición médica o sus síntomas, en particular CFS/ME. Este hallazgo clave de los inventores permite a un experto en la materia desarrollar sondas, herramientas, reactivos, métodos y pruebas para ensayar o caracterizar la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno celular, como también se describe en otro lugar.

[0941] Ejemplo 14 - SNP de AchR, TRP y ADR; genes de quinasas dependientes del calcio regulados diferencialmente; y señalización disfuncional a través de la vía MAPK, como indicadores de afecciones médicas

[0942] Basándose en los Ejemplos 1 a 9 y 12, el experto apreciará que los SNP enumerados en las Tablas anteriores, como las Tablas 1 a 7, 9, 10, 12 a 17, 26 a 28 y 34, pueden usarse para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear o tratar/gestionar sujetos con, o predispuestos a, CFS o síntomas específicos del mismo, así como ME o síntomas específicos del mismo.

[0943] El experto también apreciará que los SNP enumerados en las Tablas anteriores, como las Tablas 1 a 7, 9, 10, 12 a 17, 26 a 28 y 34, pueden utilizarse para identificar, detectar, diagnosticar, monitorear o tratar/gestionar sujetos con, o predispuestos a, otras afecciones médicas o síntomas específicos de las mismas, como: IBS; MCS; rinitis no alérgica; fibromialgia; migraña; artritis reumatoide.

[0944] La persona experta también apreciará que los SNP listados en las Tablas anteriores, tales como las Tablas 1 a 7, 9, 10, 12 a 17, 26 a 28 y 34, pueden usarse para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear o tratar/manejar sujetos con, o predispuestos a, otras condiciones médicas o síntomas específicos de las mismas: causados por una desregulación del calcio (especialmente en relación con el síndrome de fatiga crónica, la distrofia muscular, el síndrome del intestino grueso, el síndrome del intestino irritable, la fibromialgia o la migraña); causados por una desregulación de la acetilcolina (especialmente en relación con el síndrome de fatiga crónica, la distrofia muscular, el síndrome del intestino grueso, el síndrome del intestino irritable, la fibromialgia o la migraña); causada por una desregulación del TRP (especialmente en relación con el CFS, el ME, el GWS, el IBS, el MCS, la fibromialgia o la migraña); causada por una desregulación de la ADR; causada por una desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular, neurológico e inmune (especialmente en relación con el CFS, el ME, el GWS, el IBS, el MCS, la rinitis no alérgica, la fibromialgia o la migraña).

[0945] Los síntomas específicos del CFS o ME incluyen: fatiga neuromuscular, en particular fatiga por esfuerzo; dificultades de memoria y concentración; dolor muscular y articular; alteración de la presión sanguínea, en particular síndrome de taquicardia ortostática postural; dolor de cabeza; desregulación inmunológica; dolor de garganta; inflamación de ganglios linfáticos/glándulas; síntomas gastrointestinales incluyendo IB, diarrea, estreñimiento y dolor abdominal; sensibilidades químicas; e intolerancias a fármacos y sustancias químicas.

[0946] Las afecciones/síntomas MCS incluyen: dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; o síntomas respiratorios.

[0947] Las afecciones médicas causadas por la desregulación del calcio (especialmente en lo que respecta al CFS, la EM, el GWS, el IBS, el MCS, la fibromialgia o la migraña) se caracterizan por síntomas específicos o desregulación, como por ejemplo deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la sensación de dolor; desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; síntomas respiratorios; y sensibilidades inmunológicas "alérgicas".

[0948] Las condiciones médicas causadas por la desregulación de la acetilcolina (especialmente en lo que respecta al CFS, ME, GWS, IBS, MCS, fibromialgia o migraña) se caracterizan por síntomas específicos o desregulación tales como: deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la sensación de dolor; desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; síntomas respiratorios; y desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune (sensibilidades "alérgicas" inmunológicas).

[0949] Las condiciones médicas causadas por la desregulación del TRP se caracterizan por síntomas específicos o desregulación, incluyendo deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la experiencia del dolor; desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; síntomas respiratorios; y desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune (sensibilidades "alérgicas" inmunológicas). Las condiciones de medicación causadas por la desregulación en la ADR están tipificadas por síntomas específicos como dificultades respiratorias incluyendo falta de aire, hambre de aire, resfriados y congestión nasofaríngea, condiciones cardiovasculares como hipertensión y palpitaciones, enfermedades gastrointestinales, enfermedades renales, diabetes y función autonómica incluyendo episodios de sudoración.

[0950] Las afecciones médicas causadas por la desregulación de los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmunológico (especialmente en lo que respecta al CFS, ME, GWS, IBS, MCS, fibromialgia o migraña) se caracterizan por síntomas específicos o desregulación, que incluyen: deterioro significativo de la actividad física; fatiga debilitante acompañada de deterioro de la memoria, la cognición y la concentración; aumento de la sensación de dolor; dolor de cabeza; fatiga; confusión; depresión; dificultad para respirar; artralgia; mialgia; náuseas; mareos; problemas de memoria; síntomas gastrointestinales; síntomas respiratorios; y sensibilidades inmunológicas "alérgicas".

[0951] Los inventores señalan que hasta el 45% de los pacientes con CFS tienen IBS. Se están utilizando fármacos muscarínicos M3 para tratar el IBS. Los inventores han identificado anomalías en los receptores Ach en pacientes con CFS.

[0952] Los inventores también señalan que muchos pacientes con CFS tienen dolor de cabeza y sensibilidad a olores químicos. Se ha reportado de que el receptor TRPV1 está aumentado en esta condición.

[0953] Basándose en el Ejemplo 10, el experto apreciará que el análisis de células (tales como células NK) para señalización disfuncional a través de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), incluyendo señalización a través de la quinasa MAPK (MAPKK/MEK1/2) y quinasa regulada por señal extracelular (ERK)1/2 así como p38, puede usarse para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear o tratar/gestionar sujetos con, o predispuestos a una condición médica descrita anteriormente.

[0954] Basándose en el Ejemplo 11, el experto apreciará que uno o más genes de quinasa dependientes de calcio diferencialmente regulados como se enumeran en las Tablas 31 y 32 pueden usarse para identificar, examinar, diagnosticar, monitorear o tratar/gestionar sujetos con, o predispuestos a una condición médica descrita anteriormente. Lista de citas

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Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

1.Un método para identificar a un sujeto en riesgo de desarrollar el síndrome de fatiga crónica (CFS) o diagnosticar a un sujeto que tiene CFS, dicho método comprende analizar una muestra biológica que se ha obtenido del sujeto para detectar al menos un polimorfismo de nucleótido único (SNP) de al menos un gen de canal iónico de potencial receptor transitorio (TRP) que se sabe que se correlaciona con el CFS, en donde el SNP del gen del canal iónico TRP es rs12682832 (TRPM3), rs11142508 (TRPM3), rs655207 (TRPC4) o rs6650469 (TRPC4).

2.El método de la reivindicación 1, en donde el SNP del gen del canal iónico TRP es rs12682832 (TRPM3).

3.El método de la reivindicación 1, en donde el SNP del gen del canal iónico TRP es rs11142508 (TRPM3).

4.El método de la reivindicación 1, en donde el SNP del gen del canal iónico TRP es rs655207 (TRPC4).

5.El método de la reivindicación 1, en donde el SNP del gen del canal iónico TRP es rs6650469 (TRPC4).

6.El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las pruebas se llevan a cabo utilizando una matriz, biochip o kit.