ES3059612T3 - Anti-alk2 antibody - Google Patents

Anti-alk2 antibody

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ES3059612T3
ES3059612T3 ES16743511T ES16743511T ES3059612T3 ES 3059612 T3 ES3059612 T3 ES 3059612T3 ES 16743511 T ES16743511 T ES 16743511T ES 16743511 T ES16743511 T ES 16743511T ES 3059612 T3 ES3059612 T3 ES 3059612T3
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Takenobu Katagiri
Kenji Osawa
Sho TSUKAMOTO
Shinnosuke TSUJI
Yoshirou KAWAGUCHI
Kensuke Nakamura
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Abstract

Se proporcionan: un anticuerpo que se une específicamente a una proteína ALK2 y tiene la actividad de inhibir la transducción de señales BMP mediada por ALK2; un método para producir el anticuerpo; y una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo para el tratamiento y/o la prevención de la osificación heterotópica y/o la osteodistrofia, la anemia o el glioma pontino intrínseco difuso (DIPG). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpo anti-ALK2
[0003] Campo técnico de la invención
[0004] La presente invención se refiere a una sustancia útil como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la osificación ectópica y/o la displasia ósea, y a un método para tratar y/o prevenir la osificación ectópica y/o la displasia ósea. Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía, o a los métodos de diagnósticoin vivoen la descripción y los ejemplos deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos métodos.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] La fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) es una enfermedad genética que provoca la formación ectópica de tejidos cartilaginosos u óseos en tejidos blandos, tales como el músculo esquelético, el tendón y el ligamento, donde normalmente no se forman tejidos óseos (Literaturas no de patente 1 a 3). En esta enfermedad, la osificación ectópica se produce en todo el cuerpo, incluyendo la cara, de modo que los huesos ectópicos y los huesos normales existentes se fusionan reduciendo notablemente la amplitud de movimiento de las articulaciones o deformando el cuerpo (Literaturas no de patente 1 a 3).
[0007] La osificación ectópica en la FOP procede de forma crónica con el crecimiento, mientras que también se conoce la osificación ectópica aguda que procede mientras se manifiesta un síntoma llamado brote causado por una lesión muscular, una infección vírica o similares (Literatura no de patente 1). El brote es una inflamación con respuesta inflamatoria o dolor sostenido como síntomas principales. El brote es inducido por una contusión, una caída, una inyección intramuscular o algo similar, que provoca una lesión muscular. Además, también se conocen brotes repentinos sin una causa clara. En el caso de la FOP, los actos médicos invasivos como la biopsia y la operación están contraindicados debido a que los huesos ectópicos se forman tras el brote. Por lo tanto, los tejidos óseos ectópicos no pueden extirparse quirúrgicamente. Los tejidos óseos ectópicos en la FOP están formados por células de cartílago u osteoblastos normales, y el metabolismo óseo de los huesos heterotópicos es el mismo que el de los tejidos óseos normales. Como tal, sólo los tejidos óseos ectópicos no pueden eliminarse médicamente mediante fármacos o similares.
[0008] Aún no se ha establecido ninguna terapia fundamental para suprimir la osificación ectópica en la FOP, y sólo se ha realizado un tratamiento sintomático para el dolor o similares. Por lo tanto, los tejidos óseos ectópicos que se forman en el FOP son muy difíciles de eliminar, por lo que se espera el desarrollo de un fármaco prometedor que pueda ejercer efectos profilácticos antes de la aparición de la osificación ectópica.
[0009] El gen de cinasa similar al receptor de activina 2 (ALK2), que codifica un receptor de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) que induce la formación ectópica de hueso en los tejidos blandos, incluyendo los tejidos musculares esqueléticos, ha sido identificado como un gen responsable de la FOP (Literatura no de patente 4). El gen ALK2 es idéntico al gen del receptor 1 de activina A de tipo I (ACVR1). Se ha encontrado ALK2 con una sustitución de aminoácidos en casos familiares y esporádicos de FOP (Literatura no de patente 4).
[0010] La ALK2 humana o de ratón es una proteína transmembrana de paso único que consiste en 509 aminoácidos y tiene un péptido señal y funciona como un receptor transmembrana de tipo serina-treonina cinasa que se une a las BMP (Literaturas no de patente 1 a 3). La ALK2 se une a las BMP en su región extracelular N-terminal y activa el sistema de transducción de señales intracelular cadena abajo a través de una serina-treonina cinasa intracelular. Los receptores BMP se clasifican en función de sus estructuras y funciones en 2 tipos: receptores de tipo I, incluyendo el ALK2; y receptores de tipo II (Literaturas no de patente 1 a 3). Los receptores de tipo II son enzimas constitutivamente activas que muestran actividad cinasa incluso si no están unidas a BMP. Por otro lado, los receptores de tipo I, incluyendo ALK2, son enzimas inactivas en un estado no unido a BMP y presentan actividad cinasa de forma dependiente de la unión a BMP. Esto se debe probablemente a que al unirse al BMP, la cinasa del receptor de tipo II fosforila el dominio intracelular del receptor de tipo I como el sustrato, lo que puede cambiar su conformación, y activa el receptor de tipo I (Literaturas no de patente1 a 3).
[0011] Se sabe que los receptores de tipo I se convierten en activos constitutivos independientes de un receptor de tipo II mediante la sustitución de un aminoácido concreto en la región intracelular (Literaturas no de patente 1 a 3). La sobreexpresión de estos mutantes constitutivamente activos de los receptores de tipo I activan el sistema de transducción de señales intracelulares sin estimulación BMP. Por lo tanto, los receptores de tipo I se consideran moléculas responsables que transducen las señales de las BMP del exterior al interior de las células.
[0012] Una mutación en ALK2 identificada en pacientes con FOP familiar y esporádica típica fue la mutación R206H en la que Arg206 se sustituye por His (Literatura no de patente 4). Se ha informado de que todas las mutaciones genéticas identificadas previamente en casos de FOP causan sustituciones de aminoácidos en la región intracelular de ALK2. La mayoría de estas mutaciones de los casos de FOP residen principalmente en la región de unión a ATP o alrededor de la misma en el dominio intracelular de ALK2 (Literatura no de patente 5).
[0013] La sobreexpresión de los mutantes ALK2 identificados en FOP en células cultivadas activa el sistema de transducción de señales intracelulares de BMP sin estimulación de BMP (Literatura no de patente 6). En consecuencia, por ejemplo, se están desarrollando como agentes terapéuticos para la FOP pequeños inhibidores moleculares de la cinasa ALK2, métodos de ARNi o de omisión de exón que suprimen específicamente la expresión de ALK2 genéticamente mutada, inhibidores del factor transcripcional corriente abajo del receptor ALK2 e inhibidores de la diferenciación de los osteoblastos mediada por la señal BMP (Literatura de patente 1 y Literaturas no de patente 1 a 3).
[0014] Se espera que todos los pequeños compuestos moleculares o ácidos nucleicos actualmente en desarrollo como terapéutica para la FOP inhiban la señal intracelular ALK2 después de penetrar en las membranas celulares. Sin embargo, aún no se ha establecido ningún método eficaz de administración de fármacos de ácidos nucleicos. Además, aún persisten problemas como la baja especificidad de los inhibidores de la cinasa para otras familias de receptores ALK con gran similitud a ALK2. Por ello, se ha deseado desarrollar nuevas terapias para la FOP que tengan una alta especificidad para ALK2. Los fármacos anticuerpos que actúan sobre la región extracelular de ALK2 e inhiben su señal son un enfoque terapéutico muy seguro que utiliza el sistema inmunológico fisiológico. Los fármacos anticuerpos facilitan el suministro estable del fármaco a través del flujo sanguíneo y son capaces de inhibir específicamente el ALK2 sin actuar sobre otras familias de receptores ALK con alta identidad con el mismo. Además, cabe esperar que los fármacos anticuerpos tengan un efecto inhibidor sobre la ALK2 de tipo silvestre y sobre varias ALK2 mutantes intracelulares, incluyendo los nuevos mutantes no identificados. Se espera que los fármacos anticuerpos no inhiban la ALK3 expresada en las células de todo el organismo. Por lo tanto, a diferencia de los inhibidores generales de la diferenciación de los osteoblastos, cabe esperar que los anticuerpos que inhiben específicamente la ALK2 sirvan como fármacos con menos probabilidades de influir en el crecimiento, el mantenimiento y la regeneración de los tejidos esqueléticos normales. Sin embargo, hasta ahora no se conoce ningún anticuerpo que se una específicamente a ALK2 y muestre efectos terapéuticos en la FOP.
[0015] Literatura de la técnica anterior
[0016] Literatura de patente
[0017] Literatura de patente 1: Publicación internacional No. WO2007/123896
[0018] Literatura no de patente
[0019] Literatura no de patente 1: T. Katagiri, J. Oral Biosci., 52, 33-41 (2010)
[0020] Literatura no de patente 2: T. Katagiri, J. Oral Biosci., 54, 119-123 (2012)
[0021] Literatura no de patente 3: T. Katagiri y S. Tsukamoto, Biol. Chem., 394, 703-714 (2013)
[0022] Literatura no de patente 4: E.M. Shore et al., Nat. Genet., 38, 525-527 (2006)
[0023] Literatura no de patente 5: A. Chaikuad et al., J. Biol. Chem., 287, 36990-36998 (2012)
[0024] Literatura no de patente 6: T. Fukuda et al., J. Biol. Chem., 284, 7149-7156 (2009)
[0025] Técnica anterior citada
[0026] WO 2014/051109 A1 divulga un anticuerpo monoclonal anti-BMP9 que se une a la BMP9 humana (proteína morfogenética ósea-9), o un fragmento de anticuerpo de la misma.
[0027] da Silveira JC, et al. Reprod Biol Endocrinol.26 de mayo de 2014 ;12:44, divulga que los exosomas aislados del líquido folicular pueden regular los miembros de la vía de señalización TGFB/BMP en las células de la granulosa, y posiblemente desempeñan un papel en la regulación de la maduración del folículo.
[0028] Kaplan et al. Expert Opin Orphan Drugs.2013 Ago;1(8):637-649, revela oportunidades y retos para el desarrollo de una terapéutica eficaz para la fibrodisplasia osificante progresiva.
[0029] Anticuerpo del receptor de activina tipo-I (A) (ALK2). Hoja de datos sc-73676, Catálogo en línea de Santa Cruz Biotechnologies, 1 de enero de 2015, divulga un anticuerpo monoclonal de ratón ACTR-IA (Y0311) criado contra el dominio extracelular de ACTR-IA de origen humano.
[0030] Xu H, et al. [Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2010 Jul;13(7):659-64, divulga que la señalización de BMP7 a través de BMPR1A y BMPR1B inhibe la proliferación de la célula de carcinoma pulmonar de gran tamaño NCI-H460. Human Activin RIA/ALK-2 antibody, R&D systems catalogue, 7 de febrero de 2018, divulga un anticuerpo de activina humana RIA/ALK-2.
[0031] Hatsell SJ, et al. Sci Transl Med. 2 de septiembre de 2015;7(303):303ra137, sugiere que ACVR1(R206H) causa FOP al ganar capacidad de respuesta al ligando normalmente antagonista activina A, lo que demuestra que este ligando es necesario y suficiente para impulsar HO en un modelo genéticamente preciso de FOP.
[0032] WO 2019/172165 A1 divulga una composición farmacéutica que puede utilizarse en un método para tratar y/o prevenir a un paciente que tiene osificación heterotópica y/o tumor cerebral, en donde la composición farmacéutica se caracteriza porque el paciente tiene una mutación activada en la proteína ALK2 que es causa de osificación heterotópica o tumor cerebral, el residuo de aminoácido en la posición-330 en ALK2 es prolina, y un principio activo de la composición es un anticuerpo anti-ALK2 que tiene una propiedad para unirse a ALK2, una propiedad para reticularse con ALK2 y una propiedad para inhibir la transferencia de señales BMP o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo.
[0033] Lai YT, et al. Dev Biol. 2000 Jun 1;222(1):1-11 divulga que ChALK2 puede mediar la transformación en el cojín auriculoventricular (AV) .Macias-Silva M, et al. J Biol Chem. 1998 Oct 2; 273(40):25628-36, divulga que ALK1 y ALK2 inducen vías dependientes de Smad1 y que ALK2 funciona como un mediador de la señalización de BMP7 pero no de activina.
[0034] Arduin E, et al. Mol Immunol.2015 Feb;63(2):456-63, divulga pruebas experimentales de que dos mutaciones Fc investigadas en la columna vertebral de la IgG de ratón conducen a propiedades de “silenciamiento” similares a las demostradas previamente para la IgG humana y, por lo tanto, representan un método útil para alterar las funciones efectoras en anticuerpos herramienta que se utilizarán en modelos de ratón.
[0035] Shen Y, et al. MAbs.2013 mayo-jun; 5(3):418-31, divulga que la presencia de la serina terminal de la λ Lc crea un enlace disulfuro intercatenario más débil entre la Lc y la Hc, lo que conduce a una estabilidad ligeramente reducida y a un compromiso potencial de la función de IgG1λ.
[0036] Breve descripción de la invención
[0037] Problema que debe resolver la invención
[0038] Un objeto de la presente invención es proporcionar una sustancia útil como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la osificación ectópica y/o la displasia ósea, y un método para tratar y/o prevenir la osificación ectópica y/o la displasia ósea.
[0039] Medios para la solución del problema
[0040] Los presentes inventores han realizado ahora estudios diligentes para alcanzar el objeto y, en consecuencia, han completado la presente invención mediante la obtención con éxito de un anticuerpo novedoso que se une específicamente a ALK2 y tiene efectos terapéuticos y/o profilácticos sobre la osificación ectópica y/o la displasia ósea.
[0041] Específicamente, la presente invención abarca los siguientes aspectos:
[0042] En un aspecto, la invención abarca un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una región extracelular de ALK2 e inhibe la transducción de señales BMP mediada por ALK2, en donde
[0043] una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; o en donde
[0044] una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o la SEQ ID NO: 71, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; o
[0045] en donde
[0046] una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; o en donde
[0047] una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
[0048] En un aspecto del anticuerpo monoclonal o de un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, el anticuerpo comprende además
[0049] (a) una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0050] a1) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
[0051] a2) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30;
[0052] a3) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105;
[0053] a4) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;
[0054] a5) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;
[0055] a6) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;
[0056] a7) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46;
[0057] a8) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;
[0058] a9) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107;
[0059] a10) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109;
[0060] a11) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111;
[0061] a12) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113;
[0062] a13) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121;
[0063] a14) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123;
[0064] a15) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos a1) a a14);
[0065] a16) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos a1) a a14); y
[0066] (b) una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las siguientes secuencias de aminoácidos:
[0067] b1) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;
[0068] b2) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34;
[0069] b3) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;
[0070] b4) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38;
[0071] b5) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50;
[0072] b6) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52;
[0073] b7) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54;
[0074] b8) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;
[0075] b9) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58;
[0076] b10) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115;
[0077] b11) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117;
[0078] b12) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119;
[0079] b13) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125;
[0080] b14) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127;
[0081] b15) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129;
[0082] b16) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las secuencias de aminoácidos b1) a b15); y
[0083] b17) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las secuencias de aminoácidos b1) a b15);
[0084] en donde una combinación de una secuencia de aminoácidos en (a) y una secuencia de aminoácidos en (b) se selecciona del grupo que consiste en las combinaciones de: a1) y b1); a1) y b2); a2) y b1); a2) y b2); a2) y b3); a2) y b4); a3) y b3); a4) y b5); y a4) y b6); a4) y b7); a5) y b5); a5) y b6); a5) y b7); a6) y b5); a6) y b6); a6) y b7); a6) y b8); a7) y b7); a7) y b8); a7) y b9); a8) y b8); a9) y b6); a10) y b8); a11) y b10); a11) y b11); a11) y b12); a12) y b10); a12) y b11); a12) y b12); a13) y b13); a13) y b14); a13) y b15); a14) y b13); a14) y b14); y a14) y b15).
[0085] En un aspecto del anticuerpo monoclonal o del fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o
[0086] el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o
[0087] el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o
[0088] el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o
[0089] el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0090] En un aspecto del anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, el anticuerpo es scFv, o el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fab', y Fv.
[0091] En un aspecto del anticuerpo monoclonal o del fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, o el anticuerpo está humanizado.
[0092] En un aspecto del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, la cadena pesada comprende una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina G1 humana, una cadena pesada de inmunoglobulina G2 humana o una cadena pesada de inmunoglobulina G4 humana, y la cadena ligera comprende una región constante de una cadena ligera κ de inmunoglobulina humana.
[0093] En un aspecto del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, el anticuerpo es un anticuerpo que comprende una cadena pesada en la que se delecionan de uno a varios aminoácidos carboxilo-terminales. En un aspecto, la invención abarca la composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención.
[0094] En un aspecto, la invención abarca al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención, o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de la osificación ectópica, la anemia o el glioma pontino intrínseco difuso (DIPG). En un aspecto, la invención abarca al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, para su administración concurrente o separada con al menos uno de cualquier fármaco seleccionado del grupo que consiste en antiinflamatorios, esteroides, bifosfonatos, relajantes musculares y agonistas del receptor de ácido retinoico (RAR) γ, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la osificación ectópica.
[0095] En un aspecto del al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno o al menos una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención, la osificación ectópica es fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), heteroplasia ósea progresiva (POH), osificación ectópica traumática u osificación ectópica tras artroplastia con implante, preferiblemente en donde la osificación ectópica es fibrodisplasia osificante progresiva (FOP).
[0096] En un aspecto la invención abarca un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención
[0097] En un aspecto, el polinucleótido de acuerdo con la invención comprende
[0098] (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: a1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27;
[0099] a2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29;
[0100] a3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 104;
[0101] a4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39;
[0102] a5) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41;
[0103] a6) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43;
[0104] a7) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45;
[0105] a8) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47;
[0106] a9) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 106;
[0107] a10) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 108;
[0108] a11) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 110;
[0109] a12) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 112;
[0110] a13) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 120;
[0111] a14) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122;
[0112] a15) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a14);
[0113] a16) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a14);
[0114] a17) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a14); y
[0115] (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: b1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31;
[0116] b2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33;
[0117] b3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35;
[0118] b4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37;
[0119] b5) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49;
[0120] b6) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 51;
[0121] b7) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 53;
[0122] b8) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 55;
[0123] b9) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 57;
[0124] b10) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 114;
[0125] b11) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116;
[0126] b12) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118;
[0127] b13) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124;
[0128] b14) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 126;
[0129] b15) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128;
[0130] b16) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b15);
[0131] b17) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b15); y
[0132] b18) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b15); en donde una combinación de una secuencia de polinucleótidos en (a) y una secuencia de polinucleótidos en (b) se selecciona del grupo que consiste en las combinaciones de: a1) y b1); a1) y b2); a2) y b1); a2) y b2); a2) y b3); a2) y b4); a3) y b3); a4) y b5); y a4) y b6); a4) y b7); a5) y b5); a5) y b6); a5) y b7); a6) y b5); a6) y b6); a6) y b7); a6) y b8); a7) y b7); a7) y b8); a7) y b9); a8) y b8); a9) y b6); a10) y b8); a11) y b10); a11) y b11); a11) y b12); a12) y b10); a12) y b11); a12) y b12); a13) y b13); a13) y b14); a13) y b15); a14) y b13); a14) y b14); y a14) y b15).
[0134] En un aspecto, la invención abarca un vector que comprende cualquier polinucleótido de acuerdo con la invención.
[0135] En un aspecto, la invención abarca una célula huésped transformada que comprende cualquier polinucleótido de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención.
[0137] En un aspecto, la invención abarca un método para producir un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, que comprende el paso de cultivar una célula hospedera de acuerdo con la invención y purificar el anticuerpo monoclonal a partir del producto del cultivo.
[0139] De acuerdo con la presente invención, puede obtenerse un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la osificación ectópica y/o la displasia ósea.
[0141] Breve descripción de los dibujos
[0143] [Figura 1] Esta figura es un gráfico que muestra el reconocimiento de ALK2-His&Fc de ratón (“mALK2-Fc”) por los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D, y la unión de estos anticuerpos monoclonales al Fc humano. Se utilizó un medio como control (“Medio de control”).
[0144] [Figura 2A] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D no reconocen las células que expresan una proteína fluorescente EGFP. [Figura 2B] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocen las células que expresan ALK2 de ratón de tipo silvestre (mALK2(WT)-EGFP).
[0145] [Figura 2C] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocen las células que expresan ALK2 humana de tipo silvestre (hALK2(WT)-EGFP).
[0146] [Figura 2D] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocen las células que expresan ALK2 humana que tiene una mutación FOP (R206H) (hALK2(R206H)-EGFP).
[0147] [Figura 3] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocen específicamente sólo las células que expresan ALK2 y no reconocen las células que expresan ALK1, ALK3 o ALK6.
[0148] [Figura 4] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocen las células que expresan ALK2 de tipo silvestre y las células que expresan los 12 tipos de mutantes ALK2 mostrados identificados en FOP.
[0149] [Figura 5] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D inhiben, de forma dependiente de la dosis, la actividad de la luciferasa (luc) específica de BMP inducida por BMP7 en células HEK293A en las que se ha sobreexpresado ALK2 de tipo silvestre o un mutante R206H.
[0150] [Figura 6] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D no pueden inhibir completamente la diferenciación inducida por BMP2 de las células C2C12 en células similares a los osteoblastos.
[0151] [Figura 7] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D inhiben, de forma dependiente de la dosis, la diferenciación inducida por BMP7 o GDF2/BMP9 de las células C2C12 en células similares a los osteoblastos.
[0152] [Figura 8] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-15A y A2-27D inhiben la osteoinducción ectópica inducida por BMP7 o GDF2/BMP9 en tejidos musculares esqueléticos de ratón.
[0153] [Figura 9] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos quiméricos cA2-15A y cA2-27D presentan una actividad inhibidora equivalente a la de los anticuerpos monoclonales de rata A2-15A y A2-27D, respectivamente, contra la actividad de la luciferasa (luc) específica de BMP inducida por BMP7.
[0154] [Figura 10] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos quiméricos cA2-15A y cA2-27D inhiben, de forma dependiente de la dosis, la diferenciación inducida por BMP de las células C2C12 en células similares a los osteoblastos.
[0155] [Figura 11] Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de cada secuencia CDR del anticuerpo A2-15A. [Figura 12] Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de cada secuencia CDR del anticuerpo A2-27D. [Figura 13] Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de cada secuencia CDR del anticuerpo A2-11E. [Figura 14] Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de cada secuencia CDR del anticuerpo A2-25C. [Figura 15] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-15A-H1 humanizada.
[0156] [Figura 16] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-15A-H4 humanizada.
[0157] [Figura 17] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-15A-L1 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0158] [Figura 18] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-15A-L4 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0159] [Figura 19] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-15A-L6 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0160] [Figura 20] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-15A-L7 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0161] [Figura 21] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H1 humanizada.
[0162] [Figura 22] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H2 humanizada.
[0163] [Figura 23] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H3 humanizada.
[0164] [Figura 24] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H4 humanizada.
[0165] [Figura 25] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H5 humanizada.
[0166] [Figura 26] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-27D-L1 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0167] [Figura 27] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-27D-L2 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0168] [Figura 28] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-27D-L3 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0169] [Figura 29] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-27D-L4 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0170] [Figura 30] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que comprende secuencias que codifican la hA2-27D-L5 humanizada, y la secuencia de aminoácidos de la misma.
[0171] [Figura 31] Esta figura es un gráfico que muestra que un anticuerpo A2-15A humanizado (IgG1) y los anticuerpos A2-27D humanizados (IgG1) inhiben, de forma dependiente de la dosis, la actividad de la luciferasa (luc) específica de BMP inducida por BMP7.
[0172] [Figura 32] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la IgG2 humanizada de tipo hA2-15A-H4.
[0173] [Figura 33] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H2-LALA humanizada.
[0174] [Figura 34] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-27D-H3-LALA humanizada.
[0175] [Figura 35] Esta figura es un gráfico que muestra que un anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2) y un anticuerpo A2-27D humanizado (LALA) inhiben, de forma dependiente de la dosis, la actividad de la luciferasa (luc) específica de BMP inducida por BMP7.
[0176] [Figura 36] Esta figura es un gráfico que muestra que el anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2) y el anticuerpo A2-27D humanizado (LALA) inhiben la osteoinducción ectópica inducida por BMP7 en tejidos musculares esqueléticos de ratón.
[0177] [Figura 37] Esta figura muestra la estructura cristalina de rayos X de un complejo de ALK2-ECD humano y cA2-27D-Fab quimérico humano.
[0178] [Figura 38] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-11E-H3 humanizada.
[0179] [Figura 39] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-11E-H4 humanizada.
[0180] [Figura 40] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-11E-L2 humanizada.
[0181] [Figura 41] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-11E-L3 humanizada.
[0182] [Figura 42] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-11E-L4 humanizada.
[0183] [Figura 43] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-25C-H3 humanizada.
[0184] [Figura 44] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-25C-H4 humanizada.
[0185] [Figura 45] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-25C-L1 humanizada.
[0186] [Figura 46] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-25C-L2 humanizada.
[0187] [Figura 47] Esta figura muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de hA2-25C-L3 humanizada.
[0188] [Figura 48] Esta figura es un gráfico que muestra que los anticuerpos humanizados A2-11E (IgG1) y los anticuerpos humanizados A2-25C (IgG1) inhiben, de forma dependiente de la dosis, la diferenciación inducida por BMP de las células C2C12 en células similares a los osteoblastos.
[0189] [Figura 49] Esta figura muestra la estructura cristalina de rayos X de un complejo de ALK2-ECD humano y cA2-25C-Fab quimérico humano.
[0190] [Figura 50] Esta figura es un gráfico que muestra que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A2-27D inhibe la actividad de la luciferasa (Luc) inducida por BMP7 en ALK2 de tipo silvestre (WT) y en los 13 tipos de mutantes mostrados.
[0191] Modos de realización de la invención
[0192] 1. Definición
[0193] Tal como se utiliza en la presente, el término “gen” incluye no sólo el ADN, sino también el ARNm, el ADNc y el ARNc.
[0194] Tal como se utiliza en la presente , el término “polinucleótido” se emplea con el mismo significado que un ácido nucleico e incluye también ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y cebadores.
[0195] Tal como se utilizan en la presente, el “polipéptido” y la “proteína” se emplean indistintamente.
[0196] Tal como se utilizan en la presente, la “fracción de ARN” se refiere a una fracción que contiene ARN.
[0197] Tal como se utiliza en la presente, la “célula” también incluye las células de individuos animales y las células cultivadas.
[0198] Como se utiliza en la presente, “ALK2” se utiliza con el mismo significado que la proteína ALK2 e incluye ALK2 de tipo silvestre y mutantes (también denominados ALK2 mutantes).
[0199] Tal como se utiliza en la presente, el “fragmento de unión al antígeno de un (el) anticuerpo”, también denominado “fragmento funcional de un (el) anticuerpo”, significa un fragmento parcial del anticuerpo que tiene una actividad de unión al antígeno e incluye, por ejemplo, Fab, F(ab')<2>, Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. El fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo también incluye el Fab', que es un fragmento monovalente de las regiones variables del anticuerpo obtenido por tratamiento del F(ab')<2>en condiciones reductoras. Sin embargo, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo no se limita a estas moléculas siempre que el fragmento de unión a antígeno tenga la capacidad de unirse al antígeno. Dicho fragmento de unión al antígeno incluye no sólo un fragmento obtenido tratando una molécula de longitud completa de la proteína del anticuerpo con una enzima apropiada, sino una proteína producida en células huésped apropiadas utilizando un gen de anticuerpo modificado genéticamente.
[0200] Tal como se utiliza en la presente, el “epítopo”, también llamado “determinante antigénico”, se refiere generalmente a un sitio antigénico de unión a anticuerpos que consiste en al menos 7 aminoácidos, al menos 8 aminoácidos, al menos 9 aminoácidos o al menos 10 aminoácidos, de un antígeno. Tal como se utiliza en la presente, el epítopo significa un péptido parcial o una conformación parcial de ALK2 a la que se une un anticuerpo anti-ALK2 particular. El epítopo como un péptido parcial de ALK2 puede determinarse mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, tal como el inmunoensayo, y puede determinarse, por ejemplo, mediante el método siguiente: se preparan varias estructuras parciales de ALK2. Para la preparación de las estructuras parciales, puede utilizarse una técnica de síntesis de oligopéptidos conocida en la técnica. Por ejemplo, se preparan en orden una serie de fragmentos de polipéptidos que tengan una longitud adecuada a partir de la terminación C o N de ALK2 mediante el uso de una técnica de recombinación génica bien conocida por los expertos en la técnica. A continuación, se estudia la reactividad del anticuerpo con el mismo para determinar aproximadamente un sitio de reconocimiento. A continuación, se sintetizan péptidos más cortos y se puede estudiar la reactividad del anticuerpo con estos péptidos para determinar el epítopo. Alternativamente, el epítopo como una conformación parcial de ALK2 al que se une un anticuerpo ALK2 concreto puede determinarse identificando los residuos de aminoácidos de ALK2 adyacentes al anticuerpo mediante el análisis de la estructura cristalina de rayos X. Siempre que un segundo anticuerpo anti-ALK2 se una a un péptido parcial o a una conformación parcial que esté unida por un primer anticuerpo anti-ALK2, se puede determinar que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comparten un epítopo. Si no se determina la secuencia o estructura específica de un epítopo, se puede determinar que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comparten el epítopo confirmando que el segundo anticuerpo anti-ALK2 compite (de forma cruzada) con el primer anticuerpo anti-ALK2 por la unión a ALK2 (es decir, que el segundo anticuerpo interfiere en la unión del primer anticuerpo a ALK2). Cuando el primer anticuerpo y el segundo se unen a un epítopo común y el primer anticuerpo tiene una actividad como la inhibición de las señales BMP mediadas por ALK2, cabe esperar que el segundo anticuerpo también tenga una actividad similar.
[0201] Se sabe que las cadenas pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tienen cada una tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las regiones determinantes de la complementariedad, también llamadas dominios hipervariables, están situadas en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Estos sitios tienen una estructura primaria particularmente variable y están separados en tres lugares de las respectivas estructuras primarias de las cadenas polipeptídicas pesada y ligera. Tal como se utilizan en la presente, las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3 a partir de la terminación amino de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada para las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 a partir de la terminación amino de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera para las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí en la conformación y determinan la especificidad para el antígeno a unir.
[0202] En la presente invención, la expresión “se hibrida en condiciones estrictas” significa una hibridación en condiciones que implican hibridación a aproximadamente 50 a 70°C (por ejemplo, 68°C) en una disolución de hibridación disponible comercialmente Disolución de Hibridación ExpressHyb (fabricada por Clontech Laboratories, Inc.), o hibridación a aproximadamente 50 a 70°C (por ejemplo, 68°C) en presencia de aproximadamente 0,7 a 1,0 M de NaCl utilizando un filtro inmovilizado con ADN, seguido de un lavado a aproximadamente 50 a 70°C (por ejemplo, 68°C) utilizando una disolución SSC con una concentración de aproximadamente 0,1 a 2 × (la SSC con una concentración de 1 × consiste en 150 mM de NaCl y 15 mM de citrato de sodio; si es necesario, la disolución puede contener aproximadamente 0,1 a 0,5% de SDS) que permita la identificación, o hibridación en condiciones equivalentes a las mismas.
[0203] Tal como se utiliza en la presente, el término “varios” en las frases “uno a varios” y “uno o varios” se refiere a 2 a 10. El término “varios” es preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 5 o 6 o menos, más preferiblemente 2 o 3.
[0204] 2. ALK2
[0205] El gen ALK2 es un gen responsable de la FOP que codifica un receptor de BMP que induce la formación ectópica de hueso en los tejidos blandos, incluyendo los tejidos musculares esqueléticos. Se han encontrado ALK2 mutantes con sustituciones de aminoácidos en casos de FOP familiar y esporádica. Por ejemplo, los mutantes L196P (mutación que sustituye la leucina en la posición 196 por prolina), delP197_F198insL (mutación que suprime la prolina en la posición 197 y la fenilalanina en la posición 198 e inserta leucina), R202I (mutación que sustituye la arginina en la posición 202 por isoleucina), R206H (mutación que sustituye la arginina en la posición 206 por histidina), Q207E (mutación que sustituye la glutamina en la posición 207 por ácido glutámico), R258S (mutación que sustituye la arginina en la posición 258 por serina), R258G (mutación que sustituye la arginina en la posición 258 por glicina), G325A (mutación que sustituye la glicina en la posición 325 por alanina), G328E (mutación que sustituye la glicina en la posición 328 por ácido glutámico), G328R (mutación que sustituye la glicina en la posición 328 por arginina), G328W (mutación que sustituye la glicina en la posición 328 por triptófano), G356D (mutación que sustituye la glicina en la posición 356 por ácido aspártico), y R375P (mutación que sustituye la arginina en la posición 375 por prolina) se conocen como mutantes de ALK2 humana.
[0206] La ALK2 utilizada en la presente invención puede obtenerse por síntesisin vitroo por producción a partir de células huésped mediante manipulación genética. Específicamente, el ADNc de ALK2 se inserta en un vector que permite su expresión. A continuación, la proteína ALK2 puede obtenerse por síntesis en una disolución que contenga enzimas, sustratos y sustancias energéticas necesarias para la transcripción y la traducción, o mediante la expresión a partir de otras células hospederas procariotas o eucariotas transformadas con el vector.
[0207] La ALK2 utilizada en la presente invención es ALK2 derivada de un mamífero incluyendo un humano o un ratón. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la ALK2 humana están disponibles con referencia al No. de acceso GenBank NM-001105. En la presente, la secuencia de aminoácidos también se divulga como SEQ ID NO: 84, y la secuencia de nucleótidos se divulga como SEQ ID NO: 85. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la ALK2 de ratón están disponibles con referencia al No. de acceso del GenBank NP-001103674. En la presente, la secuencia de aminoácidos también se divulga como SEQ ID NO: 86, y la secuencia de nucleótidos se divulga como SEQ ID NO: 87. ALK2 también se denomina ACVR1 (receptor de activina A tipo I 1) o ACTR1 (receptor de activina tipo 1), y todos estos términos representan las mismas moléculas. El ADNc de ALK2 puede obtenerse mediante un método denominado PCR, que consiste en llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo, “PCR”) (Saiki, R.K., et al., Science, (1988) 239, 487-49), por ejemplo, con una biblioteca de ADNc que exprese el ADNc de ALK2 como un molde utilizando cebadores que amplifiquen específicamente el ADNc de ALK2.
[0208] El ADNc ALK2 también incluye un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica la ALK2 humana o de ratón, y codifica una proteína que tiene una actividad biológica equivalente a ALK2. El ADNc ALK2 incluye además una variante de empalme que se ha transcrito a partir del locus del gen ALK2 humano o de ratón, o un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con el mismo, y codifica una proteína que tiene una actividad biológica equivalente a la ALK2.
[0209] La ALK2 también incluye una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la ALK2 humana o de ratón, o una secuencia de aminoácidos de la misma libre de la secuencia señal mediante la sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a la ALK2. ALK2 incluye además una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por una variante de empalme transcrita a partir del locus del gen ALK2 humano o de ratón, o una secuencia de aminoácidos derivada de esta secuencia de aminoácidos mediante la sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a ALK2.
[0210] 3. Detección de osificación ectópica y/o displasia ósea
[0211] La osificación ectópica y/o la displasia ósea son inducidas por la transducción de señales BMP mediada por ALK2. La “osificación ectópica” significa la formación de hueso en un lugar donde el hueso está originalmente ausente. Por “displasia ósea” se entiende la forma o calidad anormal del hueso existente. Algunos ejemplos de “osificación ectópica” pueden incluir, pero no se limitan a, la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), la heteroplasia ósea progresiva (POH), la osificación ectópica traumática, y la osificación ectópica tras una artroplastia con implante. Los ejemplos de “displasia ósea” pueden incluir, pero no se limitan a, la espondiloartritis (SpA) y la espondilitis anquilosante (AS).
[0212] La ALK2 es un receptor transmembrana de serina-treonina cinasa que se une a BMP. La ALK2 se une a BMP en la región extracelular N-terminal y activa un sistema de transducción de señales intracelular cadena abajo a través de la serina-treonina cinasa intracelular. La proteína morfogenética ósea (BMP) es un factor de crecimiento multifuncional que pertenece a la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGF-β), y se han identificado aproximadamente 20 miembros de la familia BMP. Se ha confirmado que la BMP induce la formación ectópica de hueso en los tejidos blandos, incluyendo los tejidos musculares esqueléticos, por lo que se considera que participa en las enfermedades que promueven la formación anormal de hueso. Se considera que la BMP-2 y la BMP-4 tienen mayor afinidad por la ALK3 que por la ALK2. Dado que ALK3 se expresa de forma ubicua en comparación con ALK2, BMP-2 o BMP-4 parecen utilizarse a menudo en general en experimentos de inducción de osificación ectópica en diversos sitios. Por otro lado, la BMP-7 tiene una afinidad relativamente alta por la ALK2. En general, se considera que la BMP-9 tiene una gran afinidad por la ALK1 y también se ha descubierto que tiene una afinidad relativamente alta por la ALK2. En la FOP, la osificación ectópica se produce mediante ALK2. Por lo tanto, la presencia o ausencia de efectos terapéuticos y/o profilácticos sobre la FOP puede confirmarse probablemente probando la eficacia para la osteoinducción ectópica causada por la activación de las señales mediadas por ALK2 mediante BMP-7 y BMP-9.
[0213] El cultivo de mioblastos (células C2C12) en presencia de BMP suprime su diferenciación en células musculares maduras a través de un mecanismo de transducción de señales intracelulares específico para BMP e induce en cambio la diferenciación en osteoblastos. Por lo tanto, la transducción de señales de BMP mediada por ALK2 puede analizarse con modelos de inducción de la diferenciación de células C2C12 en osteoblastos por BMP. 4. Producción del anticuerpo anti-ALK2
[0214] El anticuerpo de la presente invención contra ALK2 puede obtenerse por un método descrito en, por ejemplo, WO2009/091048, WO2011/027808, o WO2012/133572. Específicamente, se inmuniza a los animales no humanos con el antígeno de interés. Se recolectan linfas, tejidos linfáticos, muestras de sangre o células derivadas de la médula ósea de los animales tras el establecimiento de la inmunidad. Se seleccionan las células plasmáticas y/o los plasmoblastos de los animales no humanos que se unen específicamente al antígeno de interés. De las células plasmáticas y/o plasmoblastos obtenidos se recolecta el gen de un anticuerpo frente al antígeno de interés y se identifica su secuencia de nucleótidos. El anticuerpo o un fragmento del mismo puede obtenerse con base en la secuencia de nucleótidos identificada del gen. Alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede obtenerse mediante la obtención de células plasmáticas y/o plasmoblastos de la misma manera que en el caso anterior a partir de la sangre de un paciente humano infectado. El anticuerpo obtenido puede someterse a pruebas de su actividad de unión a ALK2 para seleccionar un anticuerpo aplicable a enfermedades humanas. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal obtenido de este modo pueden incluir A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D.
[0215] Aquí, los números de aminoácidos asignados a los CDR/FR característicos de un anticuerpo se disponen de acuerdo con la numeración KABAT (KABAT et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
[0216] El anticuerpo monoclonal también puede obtenerse de acuerdo con un método conocido en la técnica (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; y Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) fusionando células productoras de anticuerpos que producen el anticuerpo contra ALK2 con células de mieloma para establecer hibridomas. Ejemplos específicos de un método de este tipo se describen en WO2009/48072 (publicado el 16 de abril de 2009) y WO2010/117011 (publicado el 14 de octubre de 2010). Sin embargo, el método de obtención de anticuerpos monoclonales corresponde a un campo ya establecido y no se limita a los ejemplos específicos descritos anteriormente.
[0217] El anticuerpo de la presente invención incluye anticuerpos monoclonales contra ALK2 descritos anteriormente, así como, por ejemplo, anticuerpos policlonales que tienen efectos terapéuticos y/o profilácticos similares, anticuerpos recombinantes creados artificialmente con el fin de, por ejemplo, reducir la antigenicidad heterogénea contra humanos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y similares. Estos anticuerpos pueden producirse mediante métodos conocidos.
[0218] Los ejemplos del anticuerpo quimérico pueden incluir anticuerpos quiméricos que comprenden regiones variables y regiones constantes (Fc) de anticuerpos derivados de diferentes especies, por ejemplo, las regiones variables de un anticuerpo derivado de ratón o rata unidas a regiones constantes derivadas de humanos (véase Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)). Un ejemplo del anticuerpo quimérico derivado de A2-15A puede incluir un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de SEQ ID NO: 20 del Listado de Secuencias y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 237 de SEQ ID NO: 22. Un ejemplo del anticuerpo quimérico derivado de A2-27D puede incluir un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 24 del Listado de Secuencias y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 26.
[0220] Los ejemplos del anticuerpo humanizado pueden incluir un anticuerpo que comprenda CDR solas integradas en un anticuerpo derivado del ser humano (véase Nature (1986) 321, p.522-525), y un anticuerpo que comprenda las secuencias CDR, así como residuos de aminoácidos de una porción de estructuras injertadas en un anticuerpo humano mediante un método de injerto CDR (Publicación internacional No. WO90/07861).
[0222] El anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-15A se incluye en el anticuerpo de la presente invención siempre que el anticuerpo humanizado contenga todas las 6 secuencias CDR de A2-15A y tenga actividad de unión frente a ALK2. La región variable de cadena pesada del anticuerpo A2-15A comprende CDRH1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 (GFTFSHYYMA), CDRH2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 (SITNSGGSINYRDSVKG), y CDRH3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (EGGENYGGYPPFAY). La región variable de cadena ligera del anticuerpo A2-15A comprende CDRL1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 (RANQGVSLSRYNLMH), CDRL2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 (RSSNLAS), y CDRL3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (QQSRESPFT). Las secuencias de aminoácidos de estas CDR también se describen en la Figura 11.
[0224] El anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-27D se incluye en el anticuerpo de la presente invención siempre que el anticuerpo humanizado contenga todas las 6 secuencias CDR de A2-27D y tenga actividad de unión frente a ALK2. La región variable de cadena pesada del anticuerpo A2-27D comprende CDRH1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 (GSTFSNYGMK), CDRH2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 (SISRSSTYIYYADTVKG), y CDRH3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 (AISTPFYWYFDF). La región variable de cadena ligera del anticuerpo A2-27D comprende CDRL1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 (LASSSVSYMT), CDRL2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 (GTSNLAS), y CDRL3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (LHLTSYPPYT). Las secuencias de aminoácidos de estas CDR también se describen en la Figura 12.
[0226] El anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-11E se incluye en el anticuerpo de la presente invención siempre que el anticuerpo humanizado contenga todas las 6 secuencias CDR de A2-11E y tenga actividad de unión frente a ALK2. La región variable de cadena pesada del anticuerpo A2-11E comprende CDRH1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 (GFTFSNYYMY), CDRH2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 (SINTDGGSTYYPDSVKG), y CDRH3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 (STPNIPLAY). La región variable de cadena ligera del anticuerpo A2-11E comprende CDRL1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 (KASQNIYKYLN), CDRL2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 (YSNSLQT), y CDRL3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 (FQYSSGPT). Las secuencias de aminoácidos de estas CDR también se describen en la Figura 13.
[0228] El anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-25C se incluye en el anticuerpo de la presente invención siempre que el anticuerpo humanizado contenga todas las 6 secuencias CDR de A2-25C y tenga actividad de unión frente a ALK2. La región variable de cadena pesada del anticuerpo A2-25C comprende CDRH1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 (GFTFSYYAMS), CDRH2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (SISRGGDNTYYRDTVKG), y CDRH3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (LNYNNYFDY). La región variable de cadena ligera del anticuerpo A2-25C comprende CDRL1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 (QASQDIGNWLS), CDRL2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 (GATSLAD), y CDRL3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 (LQAYSAPFT). Las secuencias de aminoácidos de estas CDR también se describen en la Figura 14.
[0230] En la presente se describe un anticuerpo humanizado con ingeniería CDR preparado mediante la sustitución de 1 a 3 residuos de aminoácidos en cada CDR por otros residuos de aminoácidos que tiene actividad de unión contra ALK2. Los ejemplos de sustitución de aminoácidos en CDRL2 pueden incluir la sustitución de un aminoácido de CDRL2 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. CDRL2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 (RSSNLAQ) es una CDRL2 preferida de la invención. La secuencia de aminoácidos de esta CDR también se describe en la Figura 11.
[0232] Los ejemplos reales del anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-15A pueden incluir una combinación arbitraria de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 del Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 del Listado de Secuencias, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.
[0234] Los ejemplos preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[0236] Los ejemplos más preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que tienen una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[0238] Otros ejemplos preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[0239] Otros ejemplos preferidos adicionales de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[0241] Los ejemplos más preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[0242] Los ejemplos reales del anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-27D pueden incluir una combinación arbitraria de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 del Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 del Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 del Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 del Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[0244] Los ejemplos preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0246] Ejemplos más preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0248] Otros ejemplos preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0250] Otros ejemplos preferidos adicionales de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0252] Los ejemplos más preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0254] Los ejemplos reales del anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-11E pueden incluir una combinación arbitraria de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 del Listado de Secuencias, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.
[0256] Los ejemplos preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.
[0257] Los ejemplos más preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que tienen una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.
[0259] Los ejemplos reales del anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo A2-25C pueden incluir una combinación arbitraria de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 del Listado de Secuencias, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, o una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
[0261] Los ejemplos preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
[0262] Los ejemplos más preferidos de la combinación pueden incluir un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que tienen una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, y un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 467 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
[0264] Otros ejemplos del anticuerpo de la presente invención pueden incluir un anticuerpo humano. Por anticuerpo humano anti-ALK2 se entiende un anticuerpo humano producido únicamente a partir de secuencias genéticas de anticuerpos derivadas del cromosoma humano. El anticuerpo humano anti-ALK2 puede obtenerse mediante un método que utiliza ratones productores de anticuerpos humanos portadores de fragmentos cromosómicos humanos que comprenden genes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997), 16, p.133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res. (1998), 26, p.3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; y Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97, p.722-727).
[0265] Específicamente, dicho ratón productor de anticuerpos humanos puede crearse como un animal recombinante en el que se han interrumpido los loci génicos de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endógenas y, en su lugar, se han integrado los loci génicos de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humanas mediante un vector, tal como un vector de cromosoma artificial humano (HAC) o un vector de cromosoma artificial de ratón (MAC), preparando un animalknockouto un animal transgénico, o cruzando estos animales.
[0267] Alternativamente, las células eucariotas pueden transformarse con ADNc que codifiquen las cadenas pesada y ligera, respectivamente, de dicho anticuerpo humano, preferiblemente con vectores que comprendan los ADNc, mediante una técnica de recombinación génica. Se cultivan las células transformadas que producen un anticuerpo monoclonal humano recombinante. Este anticuerpo puede obtenerse a partir del sobrenadante del cultivo. En este contexto, por ejemplo, pueden utilizarse como hospederos células eucariotas, preferiblemente células de mamíferos, tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.
[0269] Asimismo, se conoce un método para obtener un anticuerpo humano derivado de la visualización de fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Wormstone, I.M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002), 43 (7), p.2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; y Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002), 109 (3), p.427-431).
[0270] Por ejemplo, un método de visualización de fagos (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116), que consiste en permitir que las regiones variables de un anticuerpo humano se expresen como Fv monocatenario (scFv) en la superficie del fago y seleccionar un fago que se una al antígeno. El fago seleccionado en función de su capacidad para unirse al antígeno puede someterse a un análisis genético para determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables del anticuerpo humano que se une al antígeno. Si se determina la secuencia de ADN de unión del scFv al antígeno, se puede preparar un vector de expresión que tenga esta secuencia y transferirlo a los hospedadores adecuados, seguido de la expresión para obtener el anticuerpo humano (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994), 12, p.433-455; y Nature Biotechnology (2005), 23 (9), p.1105-1116).
[0272] En la presente se describen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el del anticuerpo proporcionado por la presente invención. Los ejemplos de los mismos incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el del anticuerpo A2-11E, el anticuerpo A2-15A, el anticuerpo A2-25C y/o el anticuerpo A2-27D.
[0274] Cuando un anticuerpo se une o reconoce una conformación parcial de un antígeno, el epítopo de este anticuerpo puede determinarse identificando los residuos de aminoácidos del antígeno adyacentes al anticuerpo mediante el análisis de la estructura de rayos X. Por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento del mismo y el antígeno o un fragmento del mismo pueden unirse entre sí, cristalizarse y analizarse estructuralmente para identificar residuos de aminoácidos en el antígeno que tengan una distancia de interacción entre el residuo de aminoácido y el anticuerpo. La distancia de interacción es de 8 angstroms o menor, preferiblemente de 6 angstroms o menor, más preferiblemente de 4 angstroms o menor. Uno o más residuos de aminoácidos que tengan tal distancia de interacción con el anticuerpo pueden constituir el epítopo (determinante antigénico) para el anticuerpo. Cuando el número de estos residuos de aminoácidos es de dos o más, estos aminoácidos pueden no ser adyacentes entre sí en la secuencia primaria.
[0276] Un fragmento Fab del anticuerpo quimérico A2-27D y un péptido que contiene un fragmento ECD (números de aminoácidos 21 a 123 de SEQ ID NO: 84) de ALK2 humana se unen entre sí y se cristalizan en condiciones que incluyen 2% (v/v) de Tacsimate (pH 7,0), 100 mM de HEPES (pH 7,5) y 20% (p/v) de polietilenglicol 3.350 para obtener cristales que tienen un sistema cristalino monoclínico centrado en el cuerpo con un grupo espacial C121 y celdas unitarias de a = c = 119,39 angstroms, b = 37,32 angstroms y β = 92,54. La fase puede determinarse mediante un método de sustitución molecular utilizando coordenadas de estructura tridimensional de la misma (véase el Ejemplo 16).
[0278] El anticuerpo A2-27D reconoce una conformación parcial en la ALK2 humana. En la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 84) de ALK2 humana, los residuos de aminoácidos que tienen una distancia de interacción con el anticuerpo A2-27D, es decir, el epítopo, están constituidos por cada uno de los residuos de ácido glutámico (Glu) en la posición 18, glicina (Gly) en la posición 19, isoleucina (Ile) en la posición 39, asparagina (Asn) en la posición 40, ácido aspártico (Asp) en la posición 41, glicina (Gly) en la posición 42, fenilalanina (Phe) en la posición 43, histidina (His) en la posición 44, valina (Val) en la posición 45, tirosina (Tyr) en la posición 46, asparagina (Asn) en la posición 82, treonina (Thr) en la posición 84, glutamina (Gln) en la posición 86, leucina (Leu) en la posición 87, prolina (Pro) en la posición 88, y treonina (Thr) en la posición 89. En la presente se describe un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una forma modificada del anticuerpo o del fragmento que se une a este epítopo o tiene una distancia de interacción entre el anticuerpo o el fragmento y cada uno de los residuos de aminoácidos.
[0280] Un fragmento Fab del anticuerpo quimérico A2-25C y un péptido que contiene un fragmento ECD (números de aminoácidos 21 a 123 de SEQ ID NO: 84) de ALK2 humana se unen entre sí y se cristalizan en condiciones que incluyen Li<2>SO<4>0,15 M, citrato de Na 0,1 M (pH 3,4), 18% de PEG6,000 (p/v) y 20% de etilenglicol (v/v) para obtener cristales que tienen un sistema cristalino ortorrómbico con un grupo espacial P2<1>2<1>2<1>y celdas unitarias de a = 74,49 angstroms, b = 128,05 angstroms y c = 147,73 angstroms. La fase puede determinarse mediante un método de sustitución molecular utilizando coordenadas de estructura tridimensional de la misma (véase el Ejemplo 21).
[0282] El anticuerpo A2-25C reconoce una conformación parcial en la ALK2 humana. En la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 84) de ALK2 humana, los residuos de aminoácidos que tienen una distancia de interacción con el anticuerpo A2-25C, es decir, el epítopo, están constituidos por cada uno de los residuos de ácido glutámico (Glu) en la posición 18, glicina (Gly) en la posición 19, leucina (Leu) en la posición 20, isoleucina (Ile) en la posición 39, asparagina (Asn) en la posición 40, ácido aspártico (Asp) en la posición 41, glicina (Gly) en la posición 42, fenilalanina (Phe) en la posición 43, histidina (His) en la posición 44, valina (Val) en la posición 45, tirosina (Tyr) en la posición 46, y treonina (Thr) en la posición 84. En la presente se describe un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una forma modificada del anticuerpo o del fragmento que se une a este epítopo o tiene una distancia de interacción con estos residuos de aminoácidos.
[0284] El anticuerpo descrito anteriormente puede evaluarse para determinar su actividad de unión al antígeno mediante, por ejemplo, un método descrito en los Ejemplos 2, 6, 9 o 10 para seleccionar anticuerpos adecuados. La constante de disociación del anticuerpo es, por ejemplo, de 1 ×10<-6>a 1 ×10<-12>M, pero no se limita a este rango siempre que el anticuerpo de la presente invención produzca los efectos terapéuticos o profilácticos de interés. La constante de disociación del anticuerpo para el antígeno (ALK2) puede medirse utilizando Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) con base en la resonancia de plasmón superficial (SPR) como principios de detección. Por ejemplo, el anticuerpo ajustado a una concentración adecuada se hace reaccionar como un analito con el antígeno inmovilizado como un ligando en una fase sólida. La asociación y la disociación entre ellas pueden medirse para obtener una constante de velocidad de asociación ka1, una constante de velocidad de disociación kd1, y una constante de disociación (KD; KD = kd1 / ka1). La evaluación de la actividad de unión frente a ALK2 no se limita al uso de Biacore T200 y puede realizarse utilizando, por ejemplo, un instrumento basado en la resonancia de plasmón superficial (SPR) como principios de detección, KinExA (Sapidyne Instruments Inc.) basado en el ensayo de exclusión cinética como principios de detección, el sistema BLItz (Pall Corp.) basado en la interferometría de biocapa como principios de detección, o ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas).
[0286] Un ejemplo de otro índice para comparar las propiedades de los anticuerpos puede incluir la estabilidad de los mismos. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es un método que puede medir con rapidez y precisión el punto medio de transición (Tm), que sirve como un buen índice de la estabilidad estructural relativa de las proteínas. Los valores de Tm pueden medirse mediante DSC y compararse para determinar la diferencia en la estabilidad térmica. Se sabe que la estabilidad de conservación de un anticuerpo se correlaciona hasta cierto punto con la estabilidad térmica del mismo (Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273). Se puede seleccionar un anticuerpo adecuado tomando su estabilidad térmica como el índice. Los ejemplos de otros índices para seleccionar el anticuerpo pueden incluir altos rendimientos en células hospederas adecuadas y baja agregación en una disolución acuosa. Por ejemplo, un anticuerpo con el mayor rendimiento no siempre presenta la mayor estabilidad térmica. Por lo tanto, es necesario seleccionar el anticuerpo más adecuado para su administración a humanos mediante un juicio exhaustivo basado en los índices mencionados anteriormente.
[0287] También se conoce un método para obtener una inmunoglobulina de cadena única uniendo las secuencias de longitud completa de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo utilizando un enlazador apropiado (Lee, H-S, et al., Molecular Immunology (1999) 36, p. 61-71; y Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4). Dichas inmunoglobulinas de cadena única pueden dimerizarse para conservar una estructura y una actividad similares a las de los anticuerpos que son originalmente tetrámeros. En la presente se describe un anticuerpo que tiene una única región variable de cadena pesada y carece de una secuencia de cadena ligera. Un anticuerpo de este tipo, denominado anticuerpo de dominio único (sdAb) o nanocuerpo, se ha observado realmente en camellos o llamas y se ha informado de que mantiene la capacidad de unirse a un antígeno (Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35; y Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8).
[0289] La actividad citotóxica celular dependiente del anticuerpo de la presente invención puede mejorarse ajustando la modificación de la cadena de azúcar unida con el anticuerpo. Por ejemplo, los métodos descritos en WO99/54342, WO2000/61739y WO2002/31140 son conocidos como una técnica de este tipo para ajustar la modificación de la cadena de azúcar del anticuerpo, aunque esta técnica no se limita a ello.
[0291] En el caso de preparar un anticuerpo aislando temporalmente el gen del anticuerpo y transfiriendo después el gen a un hospedador apropiado, el hospedador apropiado puede utilizarse en combinación con un vector de expresión.
[0292] Los ejemplos específicos del gen del anticuerpo pueden incluir un gen (o un polinucleótido) que codifique una secuencia de cadena pesada y un gen (o un polinucleótido) que codifique una secuencia de cadena ligera del anticuerpo descrito en la presente, y una combinación de estos genes (o polinucleótidos).
[0294] Los ejemplos específicos del polinucleótido que codifica el anticuerpo o un componente del anticuerpo (cadena pesada o ligera) son los siguientes.
[0295] (1) Un polinucleótido que comprende los siguientes polinucleótidos (a) y/o (b):
[0296] (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: a1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27;
[0297] a2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29;
[0298] a3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 104;
[0299] a4) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a3);
[0300] a5) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a3);
[0301] a6) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a3); y
[0302] a7) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en la secuencia de nucleótidos a1) o a2); y/o
[0303] (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: b1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31;
[0304] b2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33;
[0305] b3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35;
[0306] b4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37;
[0307] b5) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b4);
[0308] b6) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b4);
[0309] b7) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b4); y
[0310] b8) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b4).
[0311] (2) Un polinucleótido que comprende los siguientes polinucleótidos (a) y/o (b):
[0312] (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: a1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39;
[0313] a2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41;
[0314] a3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43;
[0315] a4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45;
[0316] a5) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47;
[0317] a6) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 106;
[0318] a7) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 108;
[0319] a8) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos a1) a a7);
[0320] a9) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos a1) a a7);
[0321] a10) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos a1) a a7); y
[0322] a11) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos a1) a a7); y/o
[0323] (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: b1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49;
[0324] b2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 51;
[0325] b3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 53;
[0326] b4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 55;
[0327] b5) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 57;
[0328] b6) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b5);
[0329] b7) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b5);
[0330] b8) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b5); y
[0331] b9) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b5).
[0332] (3) Un polinucleótido que comprende los siguientes polinucleótidos (a) y/o (b):
[0333] (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos:
[0334] a1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 110;
[0335] a2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 112;
[0336] a3) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de nucleótidos a1) o a2); a4) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos a1) o a2); a5) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos a1) o a2); y
[0337] a6) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en la secuencia de nucleótidos a1) o a2); y/o
[0338] (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos:
[0339] b1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 114;
[0340] b2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116;
[0341] b3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118;
[0342] b4) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b3);
[0343] b5) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b3);
[0344] b6) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b3); y
[0345] b7) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b3).
[0346] (4) Un polinucleótido que comprende los siguientes polinucleótidos (a) y/o (b):
[0347] (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos:
[0348] a1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 120;
[0349] a2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122;
[0350] a3) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de nucleótidos a1) o a2); a4) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos a1) o a2); a5) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos a1) o a2); y
[0351] a6) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en la secuencia de nucleótidos a1) o a2); y/o
[0352] (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos:
[0353] b1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124;
[0354] b2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 126;
[0355] b3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128;
[0356] b4) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b3);
[0357] b5) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b3);
[0358] b6) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b3); y
[0359] b7) una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) o una adición (o adiciones) de uno a varios nucleótidos en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b3).
[0361] Para la transformación de las células hospederas, un gen (o polinucleótido) de secuencia de cadena pesada y un gen (o polinucleótido) de secuencia de cadena ligera pueden insertarse en un mismo vector de expresión o pueden insertarse en vectores de expresión separados. En el caso de utilizar células eucariotas hospedadoras, pueden utilizarse células animales, vegetales o microorganismos eucariotas. Los ejemplos de las células animales pueden incluir células de mamíferos, por ejemplo, células COS de mono (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de ratón NIH3T3 (No. ATCC: CRL-1658), y celulares deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220) de células de ovario de hámster chino (células CHO, ATCC CCL-61). En el caso de utilizar células procariotas, algunos ejemplos pueden serE. coliyBacillus subtilis.El gen del anticuerpo de interés se transfiere a estas células por transformación, y las células transformadas se cultivanin vitropara obtener anticuerpos. Dichos métodos de cultivo pueden diferir en su rendimiento en función de las secuencias de los anticuerpos. Un anticuerpo fácil de producir como un fármaco puede seleccionarse con su rendimiento como un índice entre anticuerpos que tengan una actividad de unión equivalente.
[0363] Los ejemplos del isotipo del anticuerpo de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD, e IgE. Los ejemplos preferidos del isotipo pueden incluir IgG e IgM, más preferiblemente IgG1, IgG2 e IgG4.
[0365] En el caso de utilizar IgG1 como un isotipo del anticuerpo de la presente invención, las funciones efectoras pueden ajustarse mediante la sustitución de una parte de los residuos de aminoácidos en las regiones constantes (véase WO88/07089, WO94/28027y WO94/29351). Los ejemplos de dicha variante de IgG1 incluyen IgG1 LALA (IgG1-L234A,L235A) e IgG1 LAGA (IgG1-L235A,G237A). Se prefiere IgG1 LALA.
[0367] En el caso de utilizar IgG4 como un isotipo del anticuerpo de la presente invención, la separación exclusiva de IgG4 puede suprimirse con una semivida prolongada mediante la sustitución de una parte de los residuos de aminoácidos en las regiones constantes (véase Molecular Immunology, 30, 1105-108 (1993)). Los ejemplos de este tipo de mutante de IgG4 e incluyen IgG4 pro (IgG4-S241P).
[0369] El anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo que tiene el sitio de unión a antígeno del anticuerpo, o una forma modificada del mismo.
[0370] Un fragmento del anticuerpo puede obtenerse tratando el anticuerpo con una enzima proteolítica, tal como la papaína o la pepsina, o expresando un gen de anticuerpo modificado genéticamente en células cultivadas apropiadas. Entre tales fragmentos de anticuerpo, un fragmento que mantiene la totalidad o una parte de las funciones que posee la molécula de longitud completa del anticuerpo puede denominarse fragmento de unión al antígeno del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones del anticuerpo pueden incluir generalmente la actividad de unión a antígeno, la actividad de inhibición de la actividad del antígeno, la actividad de potenciación de la actividad del antígeno, la actividad citotóxica celular dependiente del anticuerpo, la actividad citotóxica dependiente del complemento y la actividad citotóxica celular dependiente del complemento. La función que posee el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo de acuerdo con la presente invención es una actividad de unión a la región extracelular de ALK2 e inhibición de la transducción de señales BMP mediada por ALK2, más preferiblemente una actividad de supresión de la osificación ectópica y/o displasia ósea.
[0372] Ejemplos del fragmento del anticuerpo pueden incluir Fab, F(ab')<2>, Fv, Fv monocatenario (scFv) que comprenda Fvs de cadena pesada y ligera unidos mediante un enlazador apropiado, diacuerpo o diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. El fragmento del anticuerpo también incluye el Fab', que es un fragmento monovalente de las regiones variables del anticuerpo obtenido mediante el tratamiento del F(ab')<2>en condiciones reductoras.
[0374] El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo multiespecífico que tiene especificidad para al menos dos tipos diferentes de antígenos. Una molécula de este tipo suele unirse a dos tipos de antígenos (es decir, un anticuerpo biespecífico). El “anticuerpo multiespecífico” de acuerdo con la presente invención engloba un anticuerpo que tiene especificidad para más tipos (por ejemplo, 3 tipos) de antígenos.
[0376] El anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede ser un anticuerpo de longitud completa o puede ser un fragmento de dicho anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico). El anticuerpo biespecífico puede prepararse uniendo las cadenas pesada y ligera (pares HL) de dos tipos de anticuerpos, o puede prepararse fusionando hibridomas productores de diferentes anticuerpos monoclonales para preparar células de fusión productoras de anticuerpos biespecíficos (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539).
[0378] El anticuerpo de la presente invención puede ser Fv monocatenario (también denominado scFv). El Fv monocatenario se obtiene uniendo las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo mediante un enlazador polipeptídico (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg y Moore ed., Springer Verlag, Nueva York, p.269-315 (1994); y Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). Asimismo, un fragmento biscFv preparado mediante la unión de dos scFv a través de un enlazador polipeptídico también puede utilizarse como un anticuerpo biespecífico.
[0380] El método para preparar el Fv monocatenario es bien conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. No.4,946,778, 5,260,203, 5,091,513y 5,455,030).Eneste scFv, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera están unidas mediante un enlazador que impide que estas regiones formen un conjugado, preferiblemente un enlazador polipeptídico (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p. 5879-5883). La región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera en el scFv pueden derivarse del mismo anticuerpo o pueden derivarse de anticuerpos diferentes. Por ejemplo, se utiliza un péptido arbitrario monocatenario que consiste en 12 a 19 residuos como el enlazador polipeptídico que une estas regiones variables.
[0382] Para obtener el ADN que codifica el scFv, cada porción de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos completa o deseada en las secuencias de ADN que codifica la cadena pesada o la región variable de cadena pesada del anticuerpo y el ADN que codifica la cadena ligera o la región variable de cadena ligera del mismo, se utiliza como un molde y se amplifica mediante PCR utilizando un par de cebadores que flanquean ambos extremos del molde. Posteriormente, el ADN que codifica el resto de enlace polipeptídico se amplifica aún más en combinación con un par de cebadores definidos de forma que el resto de enlace polipeptídico pueda unirse en sus extremos a los ADN de las cadenas pesada y ligera, respectivamente.
[0384] Una vez preparado el ADN que codifica el scFv, puede obtenerse por métodos rutinarios un vector de expresión que comprenda el ADN y un hospedero transformado con el vector de expresión. Además, el hospedero puede utilizarse para obtener el scFv de acuerdo con un método rutinario. Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser producidos por un hospedero de la misma manera que en el caso anterior, obteniendo y expresando el gen.
[0385] El anticuerpo de la presente invención puede tener una mayor afinidad por el antígeno mediante la multimerización. Los anticuerpos del mismo tipo pueden ser multimerizados, o una pluralidad de anticuerpos que reconocen una pluralidad de epítopos, respectivamente, del mismo antígeno pueden ser multimerizados. Los ejemplos de un método para multimerizar estos anticuerpos pueden incluir la unión de dos scFv a un dominio CH3 de IgG, la unión de los mismos a estreptavidina y la introducción de un motivo de hélice-giro-hélice.
[0387] En la presente se describe un anticuerpo policlonal que es una mezcla de tipos plurales de anticuerpos anti-ALK2 que difieren en la secuencia de aminoácidos. Un ejemplo del anticuerpo policlonal puede incluir una mezcla de tipos plurales de anticuerpos que difieren en las CDR. Un anticuerpo obtenido mediante el cultivo de una mezcla de células productoras de diferentes anticuerpos, seguido de la purificación a partir de los cultivos puede utilizarse como tal anticuerpo policlonal (véase WO2004/061104).
[0389] El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo que tenga una identidad de 95% a 99% con respecto a las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo. En este contexto, el término “identidad” tiene una definición general utilizada en la técnica. El % de identidad se refiere al porcentaje del número de aminoácidos idénticos en relación con el número total de aminoácidos (incluyendo los huecos) cuando se alinean dos secuencias de aminoácidos de forma que se obtenga la mayor consistencia de aminoácidos. Los anticuerpos que tienen una capacidad de unión al antígeno y un efecto inhibidor sobre la transducción de señales BMP a niveles análogos a los anticuerpos descritos anteriormente pueden seleccionarse combinando secuencias que presenten una alta identidad con las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera. Dicha identidad es generalmente de 80% o superior, preferiblemente de 90% o superior, más preferiblemente de 95% o superior, y más preferiblemente de 99% o superior. Alternativamente, los anticuerpos que tienen varios efectos equivalentes a los anticuerpos descritos anteriormente pueden seleccionarse combinando secuencias de aminoácidos que comprenden una sustitución (o sustituciones), una deleción (o deleciones) y/o una adición (o adiciones) de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y/o ligeras. El número de residuos de aminoácidos a sustituir, delecionar y/o añadir es generalmente de 10 o menos residuos de aminoácidos, preferiblemente de 5 o 6 o menos residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 2 o 3 o menos residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 1 residuo de aminoácido.
[0391] Se sabe que la cadena pesada de un anticuerpo producido por células de mamífero cultivadas carece de un residuo de lisina carboxilo-terminal (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). Además, se sabe que la cadena pesada de dicho anticuerpo carece de dos residuos de aminoácidos carboxilo-terminales (glicina y lisina) y en su lugar tiene un residuo de prolina amidado en el extremo terminal carboxilo (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)).
[0392] Se sabe que un residuo aminoterminal de glutamina o ácido glutámico en la cadena pesada o ligera de un anticuerpo se modifica por piroglutamilación durante la preparación del anticuerpo, y el anticuerpo de la presente invención puede tener dicha modificación (WO2013/147153).
[0393] Dicha deleción en la secuencia de la cadena pesada o modificación en la secuencia de la cadena pesada o ligera no influye en la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno ni en sus funciones efectoras (activación del complemento, efectos citotóxicos dependientes del anticuerpo, etc.).
[0394] Por lo tanto, la presente invención también abarca un anticuerpo que ha recibido la deleción o la modificación. Ejemplos de ello pueden incluir una variante de deleción derivada de una cadena pesada mediante la deleción de 1 o 2 aminoácidos en su extremo carboxilo, una forma amidada de la variante de deleción (por ejemplo, una cadena pesada que tenga un residuo de prolina amidada en el sitio carboxilo-terminal), y un anticuerpo que tenga un residuo de aminoácido amino-terminal piroglutamilado en una cadena pesada o ligera del mismo. Sin embargo, la variante de deleción en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la presente invención no se limita a los tipos descritos anteriormente siempre que la variante de deleción mantenga la capacidad de unirse al antígeno y las funciones efectoras. Las dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo de acuerdo con la presente invención pueden ser cadenas pesadas de cualquier tipo seleccionado del grupo que consiste en la cadena pesada de longitud completa y las variantes de deleción descritas anteriormente, o pueden ser una combinación de cadenas pesadas de cualesquiera dos tipos seleccionados de entre ellas. La relación cuantitativa de cada variante de deleción puede verse influida por el tipo de células de mamífero cultivadas que producen el anticuerpo de acuerdo con la presente invención y las condiciones de cultivo. Ejemplos de un caso así pueden incluir la deleción de un residuo de aminoácido carboxilo-terminal cada uno en las dos cadenas pesadas como componentes principales del anticuerpo de acuerdo con la presente invención.
[0395] La identidad entre dos tipos de secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando los parámetros por defecto del algoritmo Blast versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El algoritmo Blast también está disponible accediendo a www.ncbi.nlm.nih.gov/blast en Internet. Se calculan dos tipos de valores porcentuales, Identidad (o Identidades) y Positividad (o Positividades), de acuerdo con el algoritmo Blast. El primero es un valor que indica residuos de aminoácidos idénticos entre dos tipos de secuencias de aminoácidos entre las que debe determinarse la identidad. Este último es un valor numérico que se determina teniendo en cuenta también los residuos de aminoácidos similares en cuanto a sus estructuras químicas. En este caso, el valor de identidad se define como el valor de “Identidad” cuando los residuos de aminoácidos son idénticos entre las secuencias de aminoácidos.
[0396] Un anticuerpo conjugado con cualquiera de varias moléculas, tal como el polietilenglicol (PEG), también puede utilizarse como una forma modificada del anticuerpo.
[0397] El anticuerpo de la presente invención puede ser además cualquiera de los conjugados formados por estos anticuerpos con otros fármacos (inmunoconjugados). Entre los ejemplos de este tipo de anticuerpos se puede incluir el anticuerpo conjugado con un material radiactivo o un compuesto que tenga un efecto farmacológico (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).
[0398] El anticuerpo obtenido puede purificarse hasta que sea homogéneo. Para la separación y purificación del anticuerpo se puede utilizar un método de separación y purificación de proteínas utilizado habitualmente. El anticuerpo puede separarse y purificarse mediante enfoques adecuadamente seleccionados o combinados, por ejemplo, cromatografía en columna, filtración a través de un filtro, ultrafiltración, desalinización, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida y/o enfoque isoeléctrico (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); y Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), aunque el método de separación y purificación no se limita a ello.
[0399] Los ejemplos de cromatografía pueden incluir la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrófoba, la cromatografía de filtración en gel, la cromatografía en fase inversa y la cromatografía de adsorción.
[0400] Estas aproximaciones cromatográficas pueden llevarse a cabo mediante cromatografía líquida, tal como HPLC o FPLC.
[0401] Los ejemplos de la columna para uso en la cromatografía de afinidad pueden incluir columnas de proteína A y columnas de proteína G.
[0402] Los ejemplos de columnas de proteína A pueden incluir Hyper D, POROS y Sepharose F.F. (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
[0403] Asimismo, el anticuerpo puede purificarse aprovechando su actividad de unión al antígeno mediante un portador inmovilizado por el antígeno.
[0404] 5. Fármaco que comprende el anticuerpo anti-ALK2
[0405] Un anticuerpo inhibidor de la actividad biológica de ALK2 puede obtenerse de entre los anticuerpos anti-ALK2 obtenidos por los métodos descritos anteriormente en el apartado anterior “4. Producción del anticuerpo anti-ALK2”. Dicho anticuerpo inhibidor de la actividad biológica de ALK2 inhibe la actividad biológica de ALK2, es decir, la transducción de señales BMP mediada por ALK2,in vivoy, como tal, puede utilizarse farmacéuticamente como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la osificación ectópica y/o la displasia ósea o como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la anemia.
[0406] Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse y/o prevenirse con el anticuerpo anti-ALK2 incluyen la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), la heteroplasia ósea progresiva (POH), la osificación ectópica traumática, la osificación ectópica tras una artroplastia con implante, la espondiloartritis (SpA), la espondilitis anquilosante (AS), la anemia o el glioma pontino intrínseco difuso (DIPG), y el adelgazamiento del cabello. La enfermedad es preferiblemente la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), la heteroplasia ósea progresiva (POH), la osificación ectópica traumática o la osificación ectópica tras una artroplastia con implante, más preferiblemente la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), aunque la enfermedad no se limita a ello siempre que la enfermedad esté causada por la transducción de señales BMP mediada por ALK2. En los pacientes con FOP también se observa fusión o deformidad de los dedos de las manos o de los pies, fusión o deformidad cervical, o similares, y también se manifiesta pérdida de audición. Estas condiciones también se incluyen en la enfermedad causada por la transducción de señales BMP mediada por ALK2.
[0407] Se han confirmado mutaciones activadoras en ALK2 en todos los pacientes con FOP, y hasta el momento se han notificado 10 o más tipos de mutaciones. Todas estas mutaciones han resultado ser mutaciones de aminoácidos (mutaciones de sentido erróneo) presentes en la región intracelular de la proteína ALK2 y no provocan ningún cambio en la secuencia de aminoácidos de la región extracelular. El anticuerpo de la presente invención se une a la región extracelular de ALK2 y, como tal, puede utilizarse como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para todos los pacientes con FOP, independientemente de los tipos de mutaciones.
[0408] El tratamiento de la FOP significa la curación de los síntomas de la FOP, la mejora de los síntomas, la mitigación de los síntomas o la supresión de la progresión de los síntomas.
[0409] La prevención de la FOP significa eludir o suprimir la aparición del brote o la osificación ectópica.
[0410] El anticuerpo de la presente invención también se une no sólo a la ALK2 mutada sino también a la ALK2 de tipo silvestre e inhibe las señales cadena abajo. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención también puede utilizarse como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la osificación ectópica no hereditaria diferente de la FOP. Algunos ejemplos de osificación ectópica no hereditaria son la osificación ectópica tras una contusión cerebral, la osificación ectópica tras una lesión medular, la osificación ectópica tras una lesión por quemadura y la osificación ectópica tras una artroplastia con implante. Se ha informado de la implicación de neuropéptidos, células grasas y células del sistema inmunitario, tales como los macrófagos, como una causa de la osificación ectópica no hereditaria (véase J. Cell. Biochem., 112, 10 (2011); J. Cell. Biochem., 112, 10 (2011); y J. Pathol., 236, 2 (2015)). Se ha sugerido que un mecanismo similar también está implicado en la reagudización en pacientes con FOP (véase Hum. Pathol., 32, 8 (2001); e Histol. Histopathol., 29, 10 (2014)). Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención puede utilizarse como un fármaco terapéutico y/o profiláctico no sólo para la osificación ectópica en la FOP, sino también para la osificación ectópica no hereditaria.
[0411] El gen de la hepcidina es conocido como un gen objetivo cuya transcripción está regulada positivamente por la vía de transducción de señales BMP-ALK en la anemia (véase Blood, 118, 15 (2011)). La hepcidina es una hormona peptídica producida principalmente en el hígado, y regula la degradación de un transportador, llamado ferroportina, que se expresa en el tracto gastrointestinal y participa en la absorción del hierro (véase Science, 306, 5704 (2004)). Se ha informado de un potencial fármaco terapéutico para la anemia debido a que la inhibición funcional de la hepcidina o la supresión de su nivel de expresión conduce a la promoción de la captación de hierro desde el tracto gastrointestinal mediante el aumento del nivel de expresión de la ferroportina (véase Pharmacol Ther, 146 (2015)). Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención también puede utilizarse como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para la anemia por deficiencia de hierro al aumentar la absorción de hierro mediante la supresión de la expresión de hepcidina en el hígado.
[0412] Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede utilizarse como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para el glioma pontino intrínseco difuso (DIPG). El DIPG es un astrocitoma difuso (infiltrante) que se encuentra principalmente en la protuberancia del tronco encefálico y, según los informes, representa aproximadamente de 75 a80% de los tumores pediátricos del tronco encefálico. Existe un informe que afirma que menos del 10% de los niños con DIPG sobreviven más de 2 años, ya que el tronco encefálico regula funciones esenciales como la respiración (Khuong-Quang D-A et al., Acta Neuropathol 124: 439-447, 2012). El anticuerpo de la presente invención también puede utilizarse como un fármaco terapéutico y/o profiláctico para el DIPG.
[0413] Los ejemplos del anticuerpo anti-ALK2 como estos fármacos pueden incluir anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados preparados por los métodos descritos en “4. Producción de anticuerpo anti-ALK2” a partir del anticuerpo A2-15A, el anticuerpo A2-27D, el anticuerpo A2-11E o el anticuerpo A2-25C. También pueden utilizarse como fármacos un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano que se une al mismo epítopo que el del anticuerpo A2-15A, el anticuerpo A2-27D, el anticuerpo A2-11E y/o el anticuerpo A2-25C. La actividad biológica de ALK2 (actividad inhibidora de señales de BMP) del anticuerpo anti-ALK2 puede confirmarsein vitro,por ejemplo, mediante el ensayo de luciferasa utilizando plásmidos reporteros que tengan insertada una secuencia que responda a BMP, la fosforilación de SMAD1/5/8, el análisis de la expresión de los genes objetivo de BMP o la medición de la actividad de la fosfatasa alcalina en mioblastos de ratón C2C12 inducidos a diferenciarse en osteoblastos mediante la estimulación con un ligando de BMP.
[0414] Los efectos terapéuticos o profilácticos del anticuerpo anti-ALK2 sobre la osificación ectópica o la displasia ósea pueden confirmarsein vivoutilizando animales de laboratorio, por ejemplo, administrando el anticuerpo anti-ALK2 por vía subcutánea o intravenosa a modelos inducidos de osificación ectópica con gránulos que contienen ligando BMP trasplantados al músculo del ratón, o a modelos de ratón FOP que albergan ALK2 mutado, y analizando la formación de hueso ectópico.
[0415] El anticuerpo anti-AKL2 así obtenido es útil como un fármaco, en particular, como una composición farmacéutica destinada a tratar o prevenir la osificación ectópica, tal como la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP).
[0416] Como un ejemplo, el anticuerpo anti-ALK2 puede administrarse solo o en combinación con al menos un fármaco terapéutico adicional para la osificación ectópica en el tratamiento o prevención de la osificación ectópica. Como otro ejemplo, el anticuerpo anti-ALK2 puede administrarse en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco terapéutico. Los ejemplos del fármaco terapéutico adicional para la osificación ectópica que puede administrarse en combinación con el anticuerpo anti-ALK2 pueden incluir, pero no se limitan a, antiinflamatorios, esteroides, bifosfonatos, relajantes musculares y agonistas del receptor del ácido retinoico (RAR).
[0417] Los ejemplos del fármaco antiinflamatorio pueden incluir aspirina, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, naproxeno, piroxicam, rofecoxib, celecoxib, azatioprina, penicilamina, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, infliximab y etanercept. Se prefiere indometacina, ibuprofeno, piroxicam o celecoxib.
[0418] Los ejemplos del esteroide pueden incluir prednisolona, beclometasona, betametasona, fluticasona, dexametasona y hidrocortisona. Se prefiere prednisolona.
[0419] Los ejemplos de bifosfonato pueden incluir alendronato, cimadronato, clodronato, etidronato, ibandronato, incadronato, minodronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, piridronato, risedronato, tiludronato y zoledronato. Se prefiere pamidronato o zoledronato.
[0420] Los ejemplos del relajante muscular pueden incluir ciclobenzaprina, metaxalona y baclofeno. Se prefiere baclofeno. Los ejemplos de agonista del receptor y del ácido retinoico pueden incluir el palovaroteno.
[0421] Dependiendo del estado de la osificación ectópica o del grado previsto de tratamiento y/o prevención, pueden administrarse dos o tres o más fármacos terapéuticos adicionales, y estos fármacos terapéuticos adicionales pueden incluirse en el mismo preparado y de este modo administrarse al mismo tiempo. El fármaco terapéutico adicional y el anticuerpo anti-ALK2 también pueden incluirse en el mismo preparado y de este modo administrarse al mismo tiempo. Asimismo, el anticuerpo anti-ALK2 y el fármaco terapéutico adicional pueden incluirse en preparados separados y administrarse al mismo tiempo. Alternativamente, el agente adicional y el anticuerpo anti-ALK2 pueden administrarse por separado uno tras otro. Específicamente, un fármaco terapéutico que contiene el anticuerpo anti-ALK2 o el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo como un principio activo puede administrarse tras la administración del fármaco terapéutico adicional, o bien el fármaco terapéutico adicional puede administrarse tras la administración del fármaco terapéutico que contiene el anticuerpo anti-ALK2 o el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo como un principio activo. Para su administración en terapia génica, un gen para una proteína que sirva como fármaco terapéutico para la osificación ectópica y el gen para el anticuerpo anti-ALK2 pueden insertarse en un sitio cadena abajo de regiones promotoras separadas o de la misma región promotora y pueden introducirse en vectores separados o en el mismo vector.
[0422] El anticuerpo anti-ALK2 o el fragmento del mismo puede conjugarse con un fármaco terapéutico para la osificación ectópica para producir un conjugado de fármaco dirigido descrito en M.C. Garnet, “Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216. Para este propósito, una molécula de anticuerpo, así como cualquier fragmento de anticuerpo, es aplicable a menos que sus propiedades de reconocimiento de ALK2 sean completamente suprimidas. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo pueden incluir fragmentos tales como Fab, F(ab')<2>y Fv. En la presente invención también pueden utilizarse el anticuerpo y el fragmento. La forma de conjugación del anticuerpo anti-ALK2 o del fragmento del anticuerpo con el fármaco terapéutico para la FOP puede adoptar diversas formas descritas, por ejemplo, en M.C. Garnet, “Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G.T. Hermanson, “Bioconjugate Techniques”, Academic Press, California (1996), Putnam y J. Kopecek, “Polymer Conjugates with Anticancer Activity”, Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Ejemplos específicos de ello pueden incluir una manera en la que el anticuerpo anti-ALK2 se conjuga químicamente con el fármaco terapéutico para la osificación ectópica, ya sea directamente o a través de un espaciador, tal como un oligopéptido, y una forma en la que el anticuerpo anti-ALK2 se conjuga con el fármaco terapéutico para la osificación ectópica a través de un portador de fármaco apropiado. Los ejemplos de portador del fármaco pueden incluir liposomas y polímeros hidrosolubles. Los ejemplos de tal manera a través del portador del fármaco pueden incluir más específicamente una manera en la que el fármaco terapéutico para la osificación ectópica se encapsula en un liposoma y el liposoma se conjuga con el anticuerpo, y una manera en la que el fármaco terapéutico para la osificación ectópica se conjuga químicamente con un polímero soluble en agua (compuesto que tiene un peso molecular del orden de 1000 a 100.000) ya sea directamente o a través de un espaciador como un oligopéptido y el polímero soluble en agua se conjuga con el anticuerpo. La conjugación del anticuerpo (o del fragmento) con el fármaco terapéutico para la osificación ectópica o el portador del fármaco (por ejemplo, un liposoma o un polímero hidrosoluble) puede llevarse a cabo mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, tal como el descrito en G.T. Hermanson, “Bioconjugate Techniques”, Academic Press, California (1996), y Putnam y J. Kopecek, “Polymer Conjugates with Anticancer Activity”, Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. La encapsulación del fármaco terapéutico para la osificación ectópica en el liposoma puede llevarse a cabo mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, tal como el método descrito, por ejemplo, en, D.D. Lasic, “Liposomes: From Physics to Applications”, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1993). La conjugación del fármaco terapéutico para la osificación ectópica con el polímero hidrosoluble puede llevarse a cabo mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, tal como el método descrito en D. Putnam y J Kopecek, “Polymer Conjugates with Anticancer Activity”, Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. El conjugado del anticuerpo (o el fragmento) con la proteína como un fármaco terapéutico para la osificación ectópica (o un fragmento del mismo) puede prepararse mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente o un método de ingeniería genética bien conocido por los expertos en la técnica .
[0424] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica y/o profilácticamente eficaz del anticuerpo anti-ALK2 de acuerdo con la invención y opcionalmente un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable.
[0425] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica y/o profilácticamente eficaz del anticuerpo anti-ALK2, una cantidad terapéutica y/o profilácticamente eficaz de al menos un fármaco terapéutico para la osificación ectópica, y un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable.
[0427] Se prefiere que el material farmacéuticamente aceptable utilizado en la composición farmacéutica de la presente invención no sea tóxico para un receptor de la composición farmacéutica, preferiblemente en términos de una dosis o una concentración administrada.
[0429] La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender materiales farmacéuticos para cambiar o mantener el pH, la presión osmótica, la viscosidad, la transparencia, el color, la tonicidad, la esterilidad, la estabilidad, la solubilidad, la liberación sostenida, la absorbibilidad o la permeabilidad. Los ejemplos de materiales farmacéuticos pueden incluir, pero no se limitan a, los siguientes: aminoácidos, tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, arginina y lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico, sulfato de sodio y bisulfito de sodio; disoluciones amortiguadoras, tales como disoluciones amortiguadoras de fosfato, citrato o borato, bicarbonato de sodio y disoluciones Tris-HCl; materiales de relleno, tales como manitol y glicina; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); agentes complejantes, tales como cafeína, polivinilpirrolidina, β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina; agentes volumétricos, tales como glucosa, manosa y dextrina; otros carbohidratos, tales como monosacáridos y disacáridos; agentes colorantes; correctores; diluyentes; emulgentes; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidina; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal; antisépticos, tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno; disolventes, tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol; alcoholes de azúcar, tales como manitol y sorbitol; agentes suspensores; tensoactivos, tales como éster de sorbitán, polisorbatos, tales como polisorbato 20 y polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina y colesterol; potenciadores de la estabilidad, tales como sacarosa y sorbitol; potenciadores de la elasticidad, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol y sorbitol; agentes de transporte; excipientes y/o agentes auxiliares farmacéuticos. La cantidad de estos materiales farmacéuticos añadidos es preferiblemente de 0,01 a 100 veces, en particular, de 0,1 a 10 veces en relación con el peso del anticuerpo anti-ALK2. Los componentes adecuados de la composición farmacéutica en un preparado pueden ser determinados adecuadamente por los expertos en la técnica en función de una enfermedad aplicable, una vía de administración aplicable, etc.
[0430] El excipiente o el portador de la composición farmacéutica puede ser líquido o sólido. Los excipientes o portadores apropiados pueden ser agua inyectable, disolución salina fisiológica, líquidos cefalorraquídeos artificiales u otros materiales utilizados habitualmente en la administración parenteral. Se puede utilizar una disolución salina fisiológica neutra o una disolución salina fisiológica que contiene albúmina sérica como un portador. La composición farmacéutica puede contener una disolución amortiguadora Tris de pH 7,0 a 8,5, una disolución amortiguadora de acetato de pH 4,0 a 5,5, o una disolución amortiguadora de citrato de pH 3,0 a 6,2. Estas disoluciones amortiguadoras también pueden contener sorbitol u otros compuestos. Los ejemplos de la composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir una composición farmacéutica que comprenda el anticuerpo anti-ALK2, y una composición farmacéutica que comprenda el anticuerpo anti-ALK2 y al menos un fármaco terapéutico para la osificación ectópica. La composición farmacéutica de la presente invención se prepara en forma de un producto liofilizado o de un líquido como un medicamento con una receta seleccionada y una pureza necesaria. La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-ALK2, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-ALK2 y al menos un fármaco terapéutico para la osificación ectópica también puede formarse como un producto liofilizado utilizando un excipiente apropiado, tal como la sacarosa.
[0431] La composición farmacéutica de la presente invención puede prepararse para su administración parenteral o puede prepararse para su absorción en el tracto gastrointestinal por vía oral. La receta y la concentración del preparado pueden determinarse en función de un método de administración. Dado que el anticuerpo anti-ALK2 contenido en la composición farmacéutica de la presente invención tiene una mayor afinidad por ALK2, es decir, una constante de disociación (valor KD) más baja para ALK2, el anticuerpo anti-ALK2 puede ejercer su eficacia incluso a una dosis reducida en un ser humano. Por lo tanto, la dosis de la composición farmacéutica de la presente invención a un humano también puede determinarse en función de este resultado. La dosis para la administración del anticuerpo anti-ALK2 de tipo humano a un humano es, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg, que puede administrarse una o dos veces o más cada 1 a 180 días. Sin embargo, la dosis y el número de dosis deben determinarse generalmente teniendo en cuenta el sexo, el peso corporal y la edad del paciente, los síntomas, la gravedad, las reacciones adversas, etc., y, por lo tanto, no se limitan a la dosis o el uso descritos anteriormente. Ejemplos no limitativos de la forma de la composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir inyecciones, incluyendo goteos intravenosos, supositorios, formulaciones transnasales, formulaciones sublinguales y formulaciones de absorción transdérmica. La vía de administración es una vía de administración oral o una vía de administración parenteral. Los ejemplos no limitativos de la vía de administración parenteral incluyen las vías intravenosa, intraarterial, intramuscular, intrarrectal, transmucosa e intradérmica.
[0432] Ejemplos
[0433] La presente invención se describirá específicamente a continuación con Ejemplos; sin embargo, la invención no se limita a ellos. En los siguientes Ejemplos, a menos que se especifique lo contrario, las operaciones relativas a la manipulación genética se realizaron de acuerdo con los métodos descritos en “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o cuando se emplearon reactivos o kits comerciales, se utilizaron de acuerdo con los manuales de dichos productos comerciales.
[0434] <Ejemplo 1>
[0435] Preparación de anticuerpos anti-ALK2 de rata (11E2, 15A6, 25C11 y 27D11: en lo sucesivo abreviados como A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D)
[0436] 1)-1 Preparación de un antígeno
[0437] ALK2-His&Fc de ratón (Cat. # 50297-M03H) de Sino Biological Inc. se utilizó como mALK2-Fc, que es el antígeno.
[0438] 1)-2 Inmunización de los animales
[0439] Se mezcló 1 mg/mL de ALK2-His&Fc de ratón con un volumen igual de TiterMaxGold (TiterMax, EE. UU.) para preparar una emulsión. A dos ratas hembras Wister de 6 semanas de edad se les administró por vía subcutánea 100 µg por rata del antígeno con el adyuvante en dos dosis divididas. Después de 1 a 2 semanas, se administraron por vía subcutánea 40 µg de sólo la disolución de antígeno, y al cabo de 3 días, se extrajeron asépticamente células del bazo y de varios ganglios linfáticos como células productoras de anticuerpos, y se sometieron a la siguiente fusión celular.
[0440] 1)-3 Fusión celular con células de mieloma
[0441] Las células productoras de anticuerpos descritas anteriormente se mezclaron con una línea celular de mieloma (células P3U1) derivada de ratones BALB/c en una relación de 5:1 a 10:1, y se fusionaron durante 3 minutos utilizando polietilenglicol 1500 a 50%, y después se diluyeron durante 6 minutos. Las células fusionadas se sembraron con células alimentadoras (timocitos) en diez placas de 96 pozos por rata. Las células se cultivaron en medio RPMI1640 con 15% de FBS (que contiene glutamina, ácido pirúvico, penicilina y estreptomicina) y suplemento HAT.
[0442] 1)-4 Selección de hibridomas
[0443] Una semana después de la fusión celular, utilizando cada sobrenadante de cultivo, se seleccionaron mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) los clones que reconocían ALK2-His&Fc de ratón utilizado como antígeno, y se excluyeron los clones que sólo reconocían el Fc humano (Sino Biological Inc.). La prueba ELISA se realizó de la siguiente manera.
[0444] En primer lugar, el antígeno diluido a 1 µg/ml con PBS se inmovilizó en una placa ELISA de 96 pozos (NUNC, Cat. # 442404) durante 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. Se retiró la disolución inmovilizada y se bloqueó la placa con una disolución de leche desnatada al 0,5% disuelta en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de hibridomas descrito anteriormente y se dejó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar la placa, se añadió un anticuerpo IgG anti-rata marcado con ALP (SBA, Inc.) diluido con leche desnatada al 0,5% hasta 1:2500, y se dejó la placa durante 1 hora más a temperatura ambiente. Tras lavar la placa, se hizo reaccionar un sustrato de fenilfosfato durante 20 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 492 nm.
[0445] Los hibridomas seleccionados se clonaron dos veces o más mediante dilución limitante. Mediante las operaciones descritas, se aislaron líneas celulares de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales A2-11E, A2-15A, A2-25C, y A2-27D.
[0446] Los resultados se muestran en la Figura 1. Los resultados mostraron que cada uno de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocían la ALK2-His&Fc de ratón y no se unían al Fc humano.
[0447] <Ejemplo 2>
[0448] Evaluaciónin vitrode anticuerpos anti-ALK2 de rata (A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D)
[0449] 2)-1 Cribado de anticuerpos mediante citometría de flujo
[0450] 2)-1-1 Preparación de células de ratón y humanas que expresan ALK2
[0451] Las células HEK293A se sembraron en una placa de 100 mm a 3 × 10<4>células/cm<2>, y se cultivaron durante la noche en medio DMEM con 15% de FBS en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, las células HEK293A se transfectaron con cada uno de pcDEF3/ALK2(WT) de ratón-EGFP, pcDEF3/ALK2(WT) humana-EGFP, pcDEF3/ALK2 humana (R206H)-EGFP, y pcDEF3, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), y se siguieron cultivando durante la noche. Al día siguiente, se dispensaron 100 µl de cada una de las suspensiones celulares ajustadas a 1 × 10<6>células/mL en una microfuga de 1,5 ml y se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos; a continuación, se eliminó el sobrenadante. A las células se añadieron 100 µl de IgG purificada diluida a 1 µg/mL, y se dejaron las células durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar las células con PBS tres veces, se añadieron 100 µl de harina Alexa 647 de IgG anti-cabra (H+L) (Life Technologies) diluida a 1:200, y se dejaron de nuevo las células durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar las células con PBS tres veces, se detectó la fluorescencia con un citómetro de flujo (FACS Aria II: BD Biosciences). Los datos se analizaron con el software BD Diva (BD Biosciences) y se trazaron la intensidad de EGFP expresada por las células y la intensidad de fluorescencia de la harina Alexa 647 teñida.
[0452] Los resultados se muestran en las Figuras 2A a 2D. Se confirmó que cada uno de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D no reconocían las células que expresaban la proteína fluorescente EGFP (Figura 2A), pero reconocían específicamente las células de ratón que expresaban ALK2 (Figura 2B), así como las células humanas de tipo silvestre y FOP que expresaban ALK2 (Figuras 2C y 2D, respectivamente). Estos resultados muestran que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D son anticuerpos que se unen a la región extracelular de ALK2.
[0453] 2)-2 Cribado de anticuerpos mediante inmunotinción
[0454] 2)-2-1 Preparación de células humanas que expresan ALK1, ALK2, ALK3 y ALK6
[0455] Las células C2C12 de ratón se sembraron en una placa de 96 pozos (Greiner Bio-One) a 5 × 10<3>células/pozo, y se cultivaron durante la noche en medio DMEM con 15% de FBS en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, las células C2C12 se transfectaron con cada uno de pcDEF3/ALK1 humana-EGFP, pcDEF3/ALK2 humana-EGFP, pcDEF3/ALK3 humana-EGFP, pcDEF3/ALK6 humana-EGFP, y pcDEF3 como control, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), y se siguieron cultivando durante la noche.
[0456] 2)-2-2 Tinción de inmunofluorescencia de ALK1, ALK2, ALK3 y ALK6 humanas
[0457] Las células C2C12 se fijaron con formalina neutra al 10% (Nacalai Tesque, Japón) durante 20 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se bloquearon con suero normal de cabra al 10% durante 30 minutos. Tras retirar el agente de bloqueo, se añadió IgG purificada diluida a 10 µg/mL con el agente de bloqueo, y se dejaron las células durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS tres veces, se añadió IgG anti-rata de cabra conjugada con Alexa 594 (Invitrogen) diluida a 1:1000 con el agente de bloqueo, y se dejaron las células durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar las células con PBS tres veces, se fijaron con formalina neutra al 10% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron nuclearmente con DAPI (LifeTechnologies). Las señales fluorescentes se analizaron con un microscopio de fluorescencia BZ-9000 (Keyence).
[0458] Los resultados se muestran en la Figura 3. Se confirmó que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocían específicamente sólo las células que expresaban ALK2 y no reconocían las células que expresaban ALK1, ALK3 y ALK6. Estos resultados muestran que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D son anticuerpos que se unen específicamente a ALK2.
[0459] 2)-2-3 Preparación de células que expresan los mutantes de ALK2 identificados en FOP
[0460] Se sembraron células C2C12 de ratón en una placa de 96 pozos (Greiner Bio-One) a 0,5 ×10<3>células/pocillo, y se cultivaron en medio DMEM con 15% de FBS durante toda la noche en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, las células C2C12 se transfectaron con cada uno de los ADNc de ALK2 humana de tipo silvestre integrados en pcDEF3; pcDEF3/ALK2-L196P humana, pcDEF3/ALK2-P197 humana_F198delinsL, pcDEF3/ALK2-R202I humana, pcDEF3/ALK2-R206H humana, pcDEF3/ALK2-Q207E humana, pcDEF3/ALK2-R258S humana, pcDEF3/ALK2-G325A humana, pcDEF3/ALK2-G328E humana, pcDEF3/ALK2-G328R humana, pcDEF3/ALK2-G328W humana, pcDEF3/ALK2-G356D humana, y pcDEF3/ALK2-R375P humana, que son variantes identificadas en FOP; y pcDEF3 como un control, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), y se siguieron cultivando durante la noche.
[0461] 2)-2-4 Tinción de inmunofluorescencia de los mutantes de ALK2 identificados en FOP
[0462] Las células C2C12 se fijaron con formalina neutra al 10% (Nacalai Tesque, Japón) durante 20 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se bloquearon con suero normal de cabra al 10% durante 30 minutos. Tras retirar el agente de bloqueo, se añadió IgG purificada diluida a 10 µg/mL con el agente de bloqueo, y se dejaron las células durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS tres veces, se añadió IgG anti-rata de cabra conjugada con Alexa 594 (Invitrogen) diluida a 1:1000 con el agente de bloqueo, y se dejaron las células durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar las células con PBS tres veces, se fijaron con formalina neutra al 10% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron nuclearmente con DAPI (LifeTechnologies). Las señales fluorescentes se analizaron con un microscopio de fluorescencia BZ-9000 (Keyence).
[0463] Los resultados se muestran en la Figura 4. Se confirmó que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D reconocían las células que expresaban los 12 tipos de mutantes ALK2 identificados en el FOP, además de las células que expresaban ALK2 de tipo silvestre. Estos resultados muestran que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D son anticuerpos que se unen a la ALK2 de tipo silvestre y a cada uno de los mutantes de ALK2 en FOP.
[0464] 2)-3 Cribado de anticuerpos mediante ensayo reportero de luciferasa
[0465] La actividad inhibidora de la señalización intracelular mediada por ALK2 de cada uno de los anticuerpos monoclonales se analizó utilizando un reportero de luciferasa específico de BMP. Las células HEK293A se sembraron en una placa blanca de 96 pozos para el ensayo de luciferasa (Greiner Bio-One) a 1 ×10<4>células/pozo, y se cultivaron durante la noche en medio DMEM con 15% de FBS en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, las células HEK293A se transfectaron con pcDEF3/ALK2(WT) humana-V5-His o pcDEF3/ALK2 humana (R206H)-V5-His, pGL4,26/Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7, 949 (2002)), y phRL SV40 (Promega), utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 2,5 horas, se sustituyó el medio por OPTI-MEM I (LifeTechnologies) fresco y se siguieron cultivando las células durante 1 hora. A continuación, se sustituyó el medio por OPTI-MEM I que contenía el anticuerpo monoclonal diluido en serie y 10 ng/mL de BMP7 (Milteney) o 0,5 ng/mL de BMP9 (Peprotech), y se siguieron cultivando las células durante toda la noche. Al día siguiente, se midieron las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla con el lector de placas GENios (TECAN), utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega).
[0466] Los resultados se muestran en la Figura 5. Se confirmó que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D suprimían la actividad de la luciferasa específica de BMP inducida por BMP7 de forma dependiente de la dosis, en las células HEK293A que sobreexpresaban ALK2 de tipo silvestre y R206H mutante.
[0467] 2)-4 Cribado de anticuerpos mediante ensayo de inducción de diferenciación de osteoblastos inducida por BMP La actividad inhibidora de la señalización intracelular endógena mediada por ALK2 de cada uno de los anticuerpos monoclonales se analizó en función del efecto sobre la actividad inducida por BMP para inducir la diferenciación de las células C2C12 en osteoblastos. Las células C2C12 se sembraron en una placa de 96 pozos (Greiner Bio-One) a 0,5 × 10<3>células/pozo, y se cultivaron en medio DMEM con 15% de FBS durante toda la noche en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, el medio se sustituyó por OPTI-MEM I que contenía el anticuerpo monoclonal diluido en serie y 200 ng/mL de BMP2 (Corefront Corporation), 200 ng/mL de BMP7 (Miteney) o 20 ng/mL de GDF2/BMP9 (Peprotech), y las células se siguieron cultivando durante 3 días. Tras retirar el medio de las células C2C12 y lavarlas con PBS, se trataron las células con 50 µl/pozo de una disolución helada de acetona:etanol (1:1) durante 1 minuto, y se lavaron adicionalmente con PBS tres veces. La actividad de ALP se midió como un índice de la diferenciación en células para la formación de osteoblastos. Para medir la actividad de ALP, se añadieron 100 µl/pozo de una disolución de sustrato (0,1 M de dietanolamina (Sigma-Aldrich)-HCl, pH 10,0, que contenía 1 mg/mL de 4-nitrofenilfosfato (Sigma-Aldrich) y 1 mM de MgCl<2>), y se hizo reaccionar durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de NaOH 3M, y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando el lector de microplacas Infinite F50 (TECAN).
[0468] Los resultados se muestran en las Figuras 6 y 7. Se confirmó que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D apenas suprimían la diferenciación inducida por BMP2 de las células C2C12 en células similares a osteoblastos (Figura 6), pero suprimían la diferenciación inducida por BMP7 y GDF2/BMP9 de las células C2C12 en células similares a osteoblastos de forma dependiente de la dosis (Figura 7). Estos resultados demuestran que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D son anticuerpos que suprimen la ALK2 endógena expresada fisiológicamente por las células C2C12.
[0469] <Ejemplo 3>
[0470] Secuenciación de nucleótidos de los ADNc que codifican las regiones variables de los anticuerpos anti-ALK2 de rata (A2-11E, A2-15A, A2-25C y A2-27D)
[0471] 3)-1 Secuenciación de nucleótidos de los ADNc que codifican las regiones variables de A2-11E
[0472] 3)-1-1 Preparación de ARN total a partir de hibridomas productores de A2-11E
[0473] Para amplificar los ADNc que contienen regiones variables de A2-11E, se preparó ARN total a partir de los hibridomas productores de A2-11E, utilizando el reactivo TRIzol (Ambion).
[0474] 3)-1-2 Síntesis de un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready)
[0475] Se sintetizó un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) a partir de 1 µg del ARN total preparado en el Ejemplo 3)-1-1, utilizando el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech).
[0476] 3)-1-3 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena pesada de A2-11E
[0477] UPM (Mezcla universal de cebadores A: incluida en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE) y un oligonucleótido que tiene la secuencia: 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3: SEQ ID NO: 88) se utilizaron como cebadores para la amplificación por PCR de un ADNc que contenía la región variable del gen de cadena pesada de A2-11E. Se utilizó el UPM incluido en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech), y el RG2AR3 se diseñó a partir de la secuencia de una región constante de cadena pesada de rata en una base de datos.
[0478] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena pesada de A2-11E mediante PCR 5'-RACE utilizando esta combinación de cebadores y el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-1-2 como un molde. La PCR se realizó utilizando KOD -Plus- (TOYOBO, Japón) como polimerasa, y utilizando el programa de PCR Touchdown de acuerdo con el manual del kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech). El ADNc que contiene la región variable de cadena pesada amplificado por PCR 5'-RACE se purificó utilizando el kit de purificación PCR MinElute (QIAGEN), y después se clonó utilizando el kit de clonación PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen), y se realizó el análisis de la secuencia de nucleótidos del ADNc clonado que contiene la región variable de cadena pesada.
[0479] Como cebadores de secuencia, el oligonucleótido que tiene la secuencia: 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3: SEQ ID NO: 88) diseñado a partir de la secuencia de una región constante de cadena pesada de rata en una base de datos y se utilizó el NUP (cebador universal anidado A: incluido en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE).
[0480] El análisis de la secuencia se realizó utilizando un analizador de secuencias genéticas (“ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems” o “Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems”), y la reacción de secuencia se realizó utilizando GeneAmp 9700 (Applied Biosystems).
[0481] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de A2-11E se muestra en SEQ ID NO: 1 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 2.
[0482] 3)-1-4 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena ligera de A2-11E
[0483] UPM (Mezcla universal de cebadores A: incluida en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE) y un oligonucleótido que tiene la secuencia: 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5; SEQ ID NO: 89) se utilizaron como cebadores para la amplificación por PCR de un ADNc que contenía la región variable del gen de cadena ligera de A2-11E. Se utilizó el UPM incluido en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech), y el RKR5 se diseñó a partir de la secuencia de una región constante de cadena ligera de rata en una base de datos.
[0484] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena ligera de A2-11E mediante PCR 5'-RACE utilizando esta combinación de cebadores y el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-1-2 como un molde. La PCR se realizó utilizando KOD -Plus- (TOYOBO, Japón) como polimerasa, y utilizando el programa de PCR Touchdown de acuerdo con el manual del kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech). El ADNc que contiene la región variable de cadena ligera amplificado por PCR 5'-RACE se purificó utilizando el kit de purificación PCR MinElute (QIAGEN), y después se clonó utilizando el kit de clonación PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen), y se realizó el análisis de la secuencia de nucleótidos del ADNc clonado que contiene la región variable de cadena ligera.
[0485] Como cebadores de secuencia, el oligonucleótido que tiene la secuencia: 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5; SEQ ID NO: 89) diseñado a partir de la secuencia de una región constante de cadena ligera de rata en una base de datos y se utilizó el NUP (cebador universal anidado A: incluido en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE).
[0486] El análisis de la secuencia se realizó utilizando un analizador de secuencias genéticas (“ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems” o “Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems”), y la reacción de secuencia se realizó utilizando GeneAmp 9700 (Applied Biosystems).
[0487] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de A2-11E se muestra en SEQ ID NO: 3 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 4.
[0488] 3)-2 Secuenciación de nucleótidos de los ADNc que codifican las regiones variables de A2-15A
[0489] 3)-2-1 Preparación de ARN total a partir de hibridomas productores de A2-15A
[0490] Para amplificar los ADNc que contienen regiones variables de A2-15A, se preparó ARN total a partir de los hibridomas productores de 2-15A, como en el Ejemplo 3)-1-1.
[0491] 3)-2-2 Síntesis de un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready)
[0492] Se sintetizó un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) a partir de 1 µg del ARN total preparado en el Ejemplo 3)-2-1, como en el Ejemplo 3)-1-2.
[0493] 3)-2-3 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena pesada de A2-15A
[0494] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena pesada de A2-15A como en el Ejemplo 3)-1-3, utilizando el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-2-2 como un molde, y se determinó la secuencia.
[0495] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de A2-15A se muestra en SEQ ID NO: 5 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 6.
[0496] 3)-2-4 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena ligera de A2-15A
[0497] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena ligera de A2-15A como en el Ejemplo 3)-1-4, utilizando el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-2-2 como un molde, y se determinó la secuencia.
[0498] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de A2-15A se muestra en SEQ ID NO: 7 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 8.
[0499] 3)-3 Secuenciación de nucleótidos de los ADNc que codifican las regiones variables de A2-25C
[0500] 3)-3-1 Preparación de ARN total a partir de hibridomas productores de A2-25C
[0501] Para amplificar los ADNc que contienen regiones variables de A2-25C, se preparó ARN total a partir de los hibridomas productores de A2-25C, como en el Ejemplo 3)-1-1.
[0502] 3)-3-2 Síntesis de un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready)
[0503] Se sintetizó un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) a partir de 1 µg del ARN total preparado en el Ejemplo 3)-3-1, como en el Ejemplo 3)-1-2.
[0504] 3)-3-3 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena pesada de A2-25C
[0505] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena pesada de A2-25C como en el Ejemplo 3)-1-3, utilizando el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-3-2 como un molde, y se determinó la secuencia.
[0506] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de A2-25C se muestra en SEQ ID NO: 9 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 10.
[0507] 3)-3-4 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena ligera de A2-25C
[0508] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena ligera de A2-25C como en el Ejemplo 3)-1-4, utilizando el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-3-2 como un molde, y se determinó la secuencia.
[0509] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de A2-25C se muestra en SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 12.
[0510] 3)-4 Secuenciación de nucleótidos de los ADNc que codifican las regiones variables de A2-27D
[0511] 3)-4-1 Preparación de ARN total a partir de hibridomas productores de A2-27D
[0512] Para amplificar los ADNc que contienen regiones variables de A2-27D, se preparó ARN total a partir de los hibridomas productores de A2-27D, como en el Ejemplo 3)-1-1.
[0513] 3)-4-2 Síntesis de un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready)
[0514] Se sintetizó un ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) a partir de 1 µg del ARN total preparado en el Ejemplo 3)-4-1, como en el Ejemplo 3)-1-2.
[0515] 3)-4-3 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena pesada de A2-27D
[0516] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena pesada de A2-27D como en el Ejemplo 3)-1-3, utilizando el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-4-2 como un molde, y se determinó la secuencia.
[0517] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de A2-27D se muestra en SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 14.
[0518] 3)-4-4 Amplificación por PCR 5'-RACE y secuenciación de un ADNc que contiene una región variable de cadena ligera de A2-27D
[0519] Se amplificó un ADNc que contenía una región variable de cadena ligera de A2-27D como en el Ejemplo 3)-1-4, utilizando el ADNc (ADNc 5'-RACE-Ready) sintetizado en el Ejemplo 3)-4-2 como un molde, y se determinó la secuencia.
[0520] La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de A2-27D se muestra en SEQ ID NO: 15 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 16.
[0521] <Ejemplo 4>
[0522] Evaluaciónin vivode anticuerpos anti-ALK2 de rata (A2-15A y A2-27D)
[0523] 4)-1 Preparación de sobrenadantes de cultivo de hibridoma
[0524] 1,0 × 10<6>hibridomas obtenidos en el Ejemplo 1)-4 se cultivaron en un medio con alto contenido en glucosa TIL que contenía 10% de FBS (matraz T75), y después se cultivaron a alta densidad utilizando INTEGRA CL1000 (medio con 10% de FBS). A continuación, se sustituyó el medio por un medio libre de suero, se siguieron cultivando las células en INTEGRA CL1000 y se obtuvieron los volúmenes necesarios de sobrenadantes de cultivo de hibridoma. Los sobrenadantes de cultivo de hibridoma obtenidos se almacenaron a una temperatura de 2 a 8°C hasta que se sometieron a purificación.
[0525] 4)-2 Purificación de los anticuerpos a partir de los sobrenadantes de cultivo del hibridoma
[0526] Los anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo obtenidos en el Ejemplo 4)-1 mediante cromatografía de afinidad con proteína G (a 4-6°C) en un solo paso. El paso de sustitución de la disolución amortiguadora tras la purificación por cromatografía de afinidad con proteína G se realizó a una temperatura de 4 a 6°C. Inicialmente, cada sobrenadante de cultivo de hibridomas se aplicó a una columna equilibrada con PBS y empaquetada con proteína G (GE Healthcare Bioscience). Tras la entrada de todo el sobrenadante del cultivo en la columna, la columna se lavó con al menos dos veces el volumen de columna de PBS. A continuación, las fracciones que contenían el anticuerpo se recolectaron mediante elución con una disolución acuosa de glicina/ácido clorhídrico 0,1 M (pH 2,7). Las fracciones recolectadas se ajustaron a un pH de 7,0 a 7,5 mediante la adición de Tris-HCl 1 M (pH 9,0) y, a continuación, se sometieron a una sustitución de la disolución amortiguadora con HBSor (25 mM de histidina/5% de sorbitol, pH 6,0) mediante diálisis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). Las fracciones se concentraron utilizando el dispositivo de filtro centrífugo UF VIVASPIN20 (corte de peso molecular: UF10K, Sartorius, a 4 °C), y ajustada a una concentración de IgG de 8 mg/ml o más. Por último, las fracciones se filtraron utilizando el filtro Minisart-Plus (Sartorius) para obtener una muestra purificada.
[0527] 4)-3 Modelos de inducción de osificación heterotópica inducida por transplante de BMP
[0528] La actividad supresora de la osificación heterotópica de los anticuerpos monoclonales en el tejido muscular esquelético se analizó mediante experimentos de inducción de osificación heterotópica inducida por BMP en ratones. Los gránulos que contenían BMP se prepararon impregnando una esponja de colágeno de tipo I (Collatape, Zimmer Dental) ajustada a un diámetro de 4 mm con 1 µg de BMP7 (Milteney) o 1 µg de GDF2/BMP9 (Peprotech), y liofilizando la esponja durante la noche en una máquina de liofilización (FDU-810, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japón). Se colocó a ratones C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad bajo anestesia general, utilizando un aparato de anestesia simple por inhalación para experimentos con animales pequeños (Natsume Seisakusho Co., Ltd., Japón) e isoflurano al 2% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón), y se trasplantó uno de los gránulos que contenían BMP en el tejido muscular del muslo de cada una de las extremidades inferiores izquierda y derecha. Los ratones recibieron la administración subcutánea de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-15A y A2-27D a 10 mg/kg una vez a la semana, desde 1 semana antes del trasplante hasta la semana 2 después del trasplante, a medida que se iban criando. Se administró un volumen igual de un disolvente (25 mM de histidina/5% de sorbitol, pH 6,0) a un grupo de control. Dos semanas después del trasplante de los gránulos que contienen BMP, se extrajo el fémur con los gránulos que contienen BMP trasplantados y se analizó la osificación heterotópica mediante micro-TC (µCT35, SCANCO).
[0529] Los resultados se muestran en la Figura 8. El análisis de micro-TC mostró que se indujo la osificación heterotópica en el lado derecho del fémur en los ratones trasplantados con BMP7 y GDF2/BMP9 y tratados con el vehículo. Por el contrario, no se detectó osificación heterotópica en los ratones que recibieron la administración de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-15A y A2-27D, aunque se les trasplantó BMP7 y GDF2/BMP9. De este modo, se confirmó que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A2-15A y A2-27D suprimían la inducción de osificación heterotópica en el tejido muscular esquelético inducida por BMP7 y GDF2/BMP9.
[0530] <Ejemplo 5>
[0531] Preparación de anticuerpos quiméricos humanos anti-ALK2 (cA2-15A y cA2-27D)
[0532] 5)-1 Construcción de un vector de expresión de la cadena ligera de anticuerpos quiméricos y humanizados pCMA-LK
[0533] Un fragmento de aproximadamente 5,4 kb obtenido por digestión del plásmido pcDNA3,3-TOPO/LacZ (Invitrogen) con las enzimas de restricción XbaI y PmeI y un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica una señal de secreción de la cadena κ humana y una región constante de cadena κ humana que se muestra en la SEQ ID NO: 17 se ligaron utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion Advantage (Clontech) para preparar pcDNA3,3/LK.
[0534] Se utilizó pcDNA3,3/LK como un molde en la PCR utilizando el siguiente conjunto de cebadores. El fragmento obtenido de aproximadamente 3,8 kb se fosforiló y luego se autoligó, construyendo así un vector de expresión de la cadena ligera de anticuerpos quiméricos y humanizados pCMA-LK que tenía una secuencia señal, un sitio de clonación y una región constante de cadena κ humana cadena abajo del promotor CMV.
[0535] Conjunto de cebadores:
[0536] 5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3,3-F1; SEQ ID NO: 90)
[0537] 5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3,3-R1; SEQ ID NO: 91)
[0538] 5)-2 Construcción de un vector de expresión de la cadena pesada de anticuerpo quimérico y humanizado de tipo IgG1 pCMA-G1
[0539] Un fragmento de ADN que carece de la señal de secreción de la cadena κ humana y de la región constante de cadena κ humana mediante digestión de pCMA-LK con XbaI y PmeI, y un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica aminoácidos de una secuencia señal de la cadena pesada humana y una región constante de IgG1 humana de SEQ ID NO: 18 se ligaron utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion Advantage (Clontech), construyendo así un vector de expresión de anticuerpos quiméricos y humanizados de cadena pesada tipo IgG1 pCMA-G1 que tiene una secuencia señal, un sitio de clonación y una región constante de cadena pesada IgG1 humana cadena abajo del promotor CMV.
[0540] 5)-3 Construcción de un vector de expresión de la cadena pesada cA2-15A
[0541] Utilizando el ADNc que contiene la región variable de cadena pesada de A2-15A que se obtuvo en el Ejemplo 3)-2-3 como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que contiene el ADNc que codifica la región variable de cadena pesada, utilizando KOD -Plus- (TOYOBO, Japón) y el siguiente conjunto de cebadores, y se insertó en un sitio de escisión de la enzima de restricción BlpI del vector de expresión de la cadena pesada quimérica y humanizada de tipo IgG1 pCMA-G1, utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion HD (Clontech), construyendo así un vector de expresión de la cadena pesada cA2-15A. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/cA2-15A”. La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada cA2-15A se muestra en SEQ ID NO: 19, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 20.
[0542] Conjunto de cebadores para la cadena pesada cA2-15A:
[0543] 5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAG-3' (A2-15AH-F; SEQ ID NO: 92) 5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACCAGAGTGCCTTGGCCCCAG-3' (A2-15AH-R; SEQ ID NO: 93) 5)-4 Construcción de un vector de expresión de la cadena ligera cA2-15A
[0544] Utilizando el ADNc que contiene la región variable de cadena ligera de A2-15A que se obtuvo en el Ejemplo 3)-2-4 como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que contiene el ADNc que codifica la región variable de cadena ligera, utilizando KOD -Plus- (TOYOBO, Japón) y el siguiente conjunto de cebadores, y se insertó en un sitio de escisión de la enzima de restricción BsiWI del vector de propósito general de expresión de la cadena ligera quimérica y humanizada pCMA-LK, utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion HD (Clontech), construyendo así un vector de expresión de la cadena ligera cA2-15A. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-LK/cA2-15A”. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera cA2-15A se muestra en SEQ ID NO: 21 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 22.
[0545] Conjunto de cebadores para la cadena ligera cA2-15A:
[0546] 5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTCTTGACCCAGTCTCCTGC-3' (A2-15AL-F; SEQ ID NO: 94) 5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG-3' (A2-15AL-R; SEQ ID NO: 95) 5)-5 Construcción de un vector de expresión de la cadena pesada cA2-27D
[0547] Utilizando el ADNc que contiene la región variable de cadena pesada de A2-27D que se obtuvo en el Ejemplo 3)-4-3 como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que contiene el ADNc que codifica la región variable de cadena pesada, utilizando KOD -Plus- (TOYOBO, Japón) y el siguiente conjunto de cebadores, y se insertó en un sitio de escisión de la enzima de restricción BlpI del vector de expresión de la cadena pesada quimérica y humanizada de tipo IgG1 pCMA-G1, utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion HD (Clontech), construyendo así un vector de expresión de la cadena pesada cA2-27DA. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/cA2-27D”. La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada cA2-27D se muestra en SEQ ID NO: 23 en el Listado de Secuencias, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 24.
[0548] Conjunto de cebadores para la cadena pesada cA2-27D:
[0549] 5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAG-3' (A2-27DH-F; SEQ ID NO: 96) 5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCACGGTTCCTGGGCCCCAG-3' (A2-27DH-R; SEQ ID NO: 97) 5)-6 Construcción de un vector de expresión de la cadena ligera cA2-27D
[0550] Utilizando el ADNc que contiene la región variable de cadena ligera de A2-27D que se obtuvo en el Ejemplo 3)-4-4 como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que contiene el ADNc que codifica la región variable de cadena ligera, utilizando KOD -Plus- (TOYOBO, Japón) y el siguiente conjunto de cebadores, y se insertó en un sitio de escisión de la enzima de restricción BsiWI del vector de propósito general de expresión de la cadena ligera de anticuerpos quimérica y humanizada pCMA-LK, utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion HD (Clontech), construyendo así un vector de expresión de la cadena ligera de anticuerpos cA2-27D. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-LK/cA2-27D”. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del anticuerpo cA2-27D se muestra en SEQ ID NO: 25, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 26.
[0551] Conjunto de cebadores para la cadena ligera cA2-27D:
[0552] 5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGAAATTGTTCTCACTCAGTCTCCAAC-3' (A2-27DL-F; SEQ ID NO: 98) 5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG-3' (A2-15AL-R; SEQ ID NO: 95) 5)-7 Producción de cA2-15A y cA2-27D
[0553] Las células FreeStyle 293F (Invitrogen) se subcultivaron y cultivaron de acuerdo con el manual. Se sembraron 1,2 × 10<9>células FreeStyle 293F (Invitrogen) en la fase de crecimiento logarítmico en frascos Fernbach Erlenmeyer de 3 L (Corning), y se diluyeron con el medio de expresión FreeStyle293 (Invitrogen) hasta 2,0 × 10<6>células/ml, y a continuación se cultivaron las células con agitación a 90 rpm durante 1 hora en una incubadora con un 8% de CO<2>a 37°C. Se disolvieron 1,8 mg de polietilenimina (Polyscience #24765) en 20 ml del medio Opti-Pro SFM (Invitrogen). A continuación, el vector de expresión de la cadena H (0,24 mg) y el vector de expresión de la cadena L (0,36 mg) preparados con NucleoBond Xtra (TaKaRa, Japón) se añadieron en 20 ml del medio Opti-Pro SFM (Invitrogen). Se añadieron 20 ml de la disolución mezclada de vector de expresión/Opti-Pro SFM a 20 ml de la disolución mezclada de polietilenimina/Opti-Pro SFM, y la mezcla se agitó suavemente, se dejó reposar durante 5 minutos y se añadió a las células FreeStyle 293F. Un sobrenadante de cultivo obtenido por agitación a 90 rmp durante 4 horas en un incubador con 8% de CO<2>a 37°C, seguido de la adición de 600 ml del medio EX-CELL VPRO (SAFC Biosciences), 18 ml de GlutaMAX I (GIBCO) y 30 ml de Ultrafiltrado de Levastolato (GIBCO), y mediante cultivo por agitación a 90 rmp durante 7 días en un incubador con 8% de CO<2>a 37°C, se filtró a través de un filtro de cápsula desechable (Advantec #CCS-045-E1H).
[0554] El anticuerpo quimérico del anticuerpo de rata A2-15A obtenido por la combinación de pCMA-G1/cA2-15A y pCMA-LK/cA2-15A se designó como “cA2-15A”, y el anticuerpo quimérico del anticuerpo de rata A2-27D obtenido por la combinación de pCMA-G1/cA2-27D y pCMA-LK/cA2-27D se designó como “cA2-27D”.
[0555] 5)-8 Purificación en dos pasos de cA2-15A y cA2-27D
[0556] Cada uno de los anticuerpos se purificó a partir del sobrenadante de cultivo obtenido en el Ejemplo 5)-7 mediante dos pasos utilizando cromatografía de afinidad rProteína A (a 4 a 6°C) e hidroxiapatita cerámica (a temperatura ambiente). Los pasos de sustitución de la disolución amortiguadora después de la purificación por cromatografía de afinidad de rProteína A y después de la purificación por hidroxiapatita cerámica se realizaron a una temperatura de 4 a 6°C. El sobrenadante del cultivo se aplicó a MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience, columna HiTrap) equilibrada con PBS. Tras la entrada de todo el sobrenadante del cultivo en la columna, la columna se lavó con al menos dos veces el volumen de columna de PBS. A continuación, las fracciones que contenían el anticuerpo se recolectaron mediante elución con una disolución de clorhidrato de arginina 2 M (pH 4,0). Las fracciones se sometieron a una sustitución de disolución amortiguadora con PBS mediante diálisis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), y después se diluyeron 5 veces con disolución amortiguadora 5 mM fosfato de sodio/50 mM MES/pH 7,0, y la disolución de anticuerpos resultante se aplicó a una columna cerámica de hidroxiapatita (Bio-Rad Japón, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) equilibrada con disolución amortiguadora 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7,0. Las fracciones que contenían el anticuerpo se recolectaron realizando una elución en gradiente de concentración lineal con cloruro de sodio. Las fracciones se sometieron a una sustitución de la disolución amortiguadora con HBSor (25 mM de histidina/5% de sorbitol, pH 6,0) mediante diálisis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). Las fracciones se concentraron utilizando el dispositivo de filtro centrífugo UF VIVASPIN20 (corte de peso molecular: UF10K, Sartorius, a 4 °C), y ajustada a una concentración de IgG de 2 mg/ml o más. Por último, las fracciones se filtraron utilizando el filtro Minisart-Plus (Sartorius) para obtener una muestra purificada.
[0557] <Ejemplo 6>
[0558] Evaluación de la actividadin vitrode los anticuerpos quiméricos humanos anti-ALK2 (cA2-15A y cA2-27D) 6)-1 Evaluación de los anticuerpos mediante ensayo reportero de luciferasa
[0559] La actividad inhibidora de la señalización intracelular mediada por ALK2 de cada uno de los anticuerpos quiméricos humanos preparados se analizó utilizando un reportero de luciferasa específico de BMP. Las células HEPG2 se sembraron en una placa blanca de 96 pozos para el ensayo de luciferasa (Corning) a 1 ×10<4>células/pozo, y se cultivaron durante la noche en medio DMEM con 10% de FBS en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, las células HEPG2 se transfectaron con pGL4,26/Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7, 949 (2002)), y phRL SV40 (Promega), utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Tras 2,5 horas, se sustituyó el medio por OPTI-MEM I (LifeTechnologies) fresco, y las células se siguieron cultivando durante 3 horas. A continuación, el medio se sustituyó por OPTI-MEM I que contenía el anticuerpo monoclonal diluido en serie y 10 ng/mL de BMP7 (Milteney), y las células se siguieron cultivando durante toda la noche. Al día siguiente, se midió la actividad de la luciferasa con el lector de placas SpectraMaxM4 (Molecular Devices), utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega).
[0560] Los resultados se muestran en la Figura 9. Se confirmó que cada uno de los anticuerpos quiméricos cA2-15A y cA2-27D demostró una actividad inhibidora comparable a la del anticuerpo monoclonal de rata A2-15A o A2-27D, respectivamente, sobre la actividad de la luciferasa específica de BMP inducida por BMP7.
[0561] 6)-2 Evaluación de los anticuerpos mediante ensayo de diferenciación de osteoblastos inducida por BMP La actividad inhibidora de cada uno de los anticuerpos quiméricos humanos contra la señalización intracelular endógena mediada por ALK2 se analizó en función del efecto sobre la diferenciación de osteoblastos inducida por BMP en células C2C12. Las células C2C12 se sembraron en una placa de 96 pozos (Iwaki & Co., Ltd.) a 5 ×10<3>células/pozo, y se cultivaron en medio DMEM con un 15% de FBS durante toda la noche en condiciones de 5% de CO<2>a 37°C. Al día siguiente, el medio se sustituyó por OPTI-MEM I (LifeTechnologies) fresco que contenía el anticuerpo monoclonal diluido en serie y 2 ng/mL de GDF2/BMP9 (Peprotech), y las células se siguieron cultivando durante 3 días. Tras retirar el medio de las células C2C12 y lavarlas con PBS, se trataron las células con 50 µl/pozo de una disolución helada de acetona:etanol (1:1) durante 1 minuto, y se lavaron adicionalmente con PBS tres veces. La actividad de ALP se midió como un índice de la diferenciación en células para la formación de osteoblastos. Para medir la actividad de ALP, se añadieron 100 µl/pozo de una disolución de sustrato (0,1 M de dietanolamina (Sigma-Aldrich)-HCl, pH 10,0, que contenía 1 mg/mL de 4-nitrofenilfosfato (Sigma-Aldrich) y 1 mM de MgCl<2>), y se hizo reaccionar durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de NaOH 3M, y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando el lector de microplacas SpectraMax M4 (Molecular Devices).
[0562] Los resultados se muestran en la Figura 10. Se confirmó que los anticuerpos quiméricos cA2-15A y cA2-27D suprimían la diferenciación inducida por BMP de las células C2C12 en células similares a los osteoblastos de forma dependiente de la dosis. Estos resultados demuestran que los anticuerpos quiméricos cA2-15A y cA2-27D son anticuerpos que suprimen la ALK2 endógena expresada fisiológicamente por las células C2C12. Además, se confirmó que la actividad inhibidora de cada uno de los anticuerpos quiméricos cA2-15A y cA2-27D era comparable a la del anticuerpo monoclonal de rata A2-15A o A2-27D, respectivamente.
[0563] <Ejemplo 7>
[0564] Diseño de versiones humanizadas de los anticuerpos anti-ALK22-15A y A2-27D
[0565] 7)-1 Diseño de hA2-15 humanizado
[0566] 7)-1-1 Modelado molecular de las regiones variables de A2-15A
[0567] El modelado molecular de las regiones variables de A2-15A se realizó mediante un método conocido como modelado de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las regiones variables de A2-15A determinadas anteriormente se compararon con las secuencias primarias de regiones variables de inmunoglobulinas humanas registradas en el Banco de Datos de Proteínas (las estructuras tridimensionales derivadas de estructuras de cristales de rayos X están disponibles) (Nuc. Acid Res.35, D301-D303 (2007)). Como resultado, se seleccionaron 3KYM y 3S35 como las que tenían la mayor identidad de secuencia con la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, respectivamente, de A2-15A. Las estructuras tridimensionales de las regiones marco se prepararon obteniendo un “modelo marco” mediante la combinación de las coordenadas de 3KYM y 3S35 correspondientes a la cadena pesada y la cadena ligera de A2-15A. A continuación, se incorporó una conformación representativa de cada CDR en el modelo marco.
[0568] Por último, se realizó un cálculo energético para excluir el contacto interatómico desventajoso, con el fin de obtener posibles modelos moleculares de las regiones variables de A2-15A en términos de energía. Los procedimientos descritos anteriormente se realizaron utilizando un programa de análisis de estructuras tridimensionales de proteínas disponible en el mercado, Discovery Studio (Accelrys, Inc.).
[0569] 7)-1-2 Diseño de una secuencia de aminoácidos para hA2-15A humanizado
[0570] El hA2-15 humanizado se construyó utilizando un método comúnmente conocido como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Se seleccionó un anticuerpo aceptor con base en la identidad de aminoácidos en las regiones marco.
[0571] Las secuencias de las regiones marco de A2-15 se compararon con las secuencias de regiones marco de secuencias consenso de subgrupos humanos. Como resultado, la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena y humana y la secuencia consenso del subgrupo 4 de la cadena κ humana definidas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) se seleccionaron como aceptores debido a su elevada identidad de secuencia en las regiones marco. Los residuos de aminoácidos de las regiones marco de la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena y humana y de la secuencia consenso del subgrupo 4 de la cadena κ humana se alinearon con los residuos de aminoácidos de las regiones marco de A2-15A para identificar el número de aminoácidos que difieren entre sí. Los números de estos residuos se analizaron utilizando el modelo tridimensional de A2-15A construido anteriormente. A continuación, se seleccionaron los residuos donantes que se injertarían en los aceptores de acuerdo con los criterios proporcionados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Algunos residuos donantes así seleccionados se transfirieron al anticuerpo aceptor para construir secuencias hA2-15A humanizadas, como se describe en los siguientes Ejemplos.
[0572] 7)-2 Humanización de las cadenas pesadas A2-15A
[0573] 7)-2-1 Cadena pesada de tipo hA2-15A-H1 humanizada
[0574] Una cadena pesada hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 61 (treonina) con glicina, aminoácido número 94 (alanina) con serina, aminoácido número 96 (serina) con asparagina, aminoácido número 103 (ácido aspártico) con asparagina, aminoácido número 107 (serina) con alanina, aminoácido número 112 (treonina) con valina, y aminoácido número 116 (treonina) con alanina en la cadena pesada del cA2-15A quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 20 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-15A-H1 humanizada” (a veces también denominada “hA2-15A-H1”).
[0575] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-15A-H1 humanizada se describe en SEQ ID NO: 28 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 143 a 472 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 se describe en SEQ ID NO: 27 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 427 a 1416 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 también se describen en la Figura 15.
[0576] 7)-2-2 Cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada
[0577] Una cadena pesada hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 61 (treonina) con glicina, aminoácido número 103 (ácido aspártico) con asparagina, y aminoácido número 107 (serina) con alanina en la cadena pesada del cA2-15A quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 20 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada” (a veces también denominada “hA2-15A-H4”).
[0579] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 30 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 143 a 472 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 se describe en SEQ ID NO: 29 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 427 a 1416 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 también se describen en la Figura 16.
[0581] 7)-3 Humanización de la cadena ligera A2-15A
[0583] 7)-3-1 Cadena ligera de tipo hA2-15A-L1 humanizada
[0585] Una cadena ligera hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 24 (leucina) con metionina, aminoácido número 29 (alanina) con ácido aspártico, una posición (residuo faltante) entre los números de aminoácidos 29 y 30 con serina, aminoácido número 36 (glutamina) con ácido glutámico, aminoácido número 41 (serina) con asparagina, aminoácido número 66 (lisina) con prolina, aminoácido número 81 (isoleucina) con valina, aminoácido número 83 (alanina) con ácido aspártico, aminoácido número 99 (asparagina) con serina, aminoácido número 100 (prolina) con serina, aminoácido número 101 (valina) con leucina, aminoácido número 104 (ácido aspártico) con ácido glutámico, aminoácido número 106 (isoleucina) con valina, aminoácido número 108 (treonina) con valina, aminoácido número 123 (alanina) con glutamina, aminoácido número 127 (leucina) con valina, y aminoácido número 129 (leucina) con isoleucina en la cadena ligera del cA2-15A quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 22 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-15A-L1 humanizada” (a veces también denominada “hA2-15A-L1”).
[0587] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L1 humanizada se describe en SEQ ID NO: 32 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 134 a 238 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 se describe en SEQ ID NO: 31 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 425 a 739 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 también se describen en la Figura 17.
[0589] 7)-3-2 Cadena ligera de tipo hA2-15A-L4 humanizada
[0591] Una cadena ligera hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (alanina) con ácido aspártico, una posición (residuo faltante) entre los números de aminoácidos 29 y 30 con serina, aminoácido número 36 (glutamina) con ácido glutámico, aminoácido número 41 (serina) con asparagina, aminoácido número 99 (asparagina) con serina, aminoácido número 100 (prolina) con serina, aminoácido número 108 (treonina) con valina, y aminoácido número 123 (alanina) con glutamina en la cadena ligera del cA2-15A quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 22 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-15A-L4 humanizada” (a veces también denominada “hA2-15A-L4”).
[0593] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 34 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 134 a 238 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 se describe en SEQ ID NO: 33 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 425 a 739 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 también se describen en la Figura 18.
[0595] 7)-3-3 Cadena ligera de tipo hA2-15A-L6 humanizada
[0597] Una cadena ligera hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (alanina) con ácido aspártico, una posición (residuo faltante) entre los números de aminoácidos 29 y 30 con serina, aminoácido número 36 (glutamina) con ácido glutámico, aminoácido número 41 (serina) con asparagina, aminoácido número 79 (serina) con glutamina, aminoácido número 99 (asparagina) con serina, aminoácido número 100 (prolina) con serina, aminoácido número 108 (treonina) con valina, y aminoácido número 123 (alanina) con glutamina en la cadena ligera del cA2-15A quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 22 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-15A-L6 humanizada” (a veces también denominada “hA2-15A-L6”).
[0599] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L6 humanizada se describe en SEQ ID NO: 36 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 134 a 238 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 se describe en SEQ ID NO: 35 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 425 a 739 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 también se describen en la Figura 19.
[0601] 7)-3-4 Cadena ligera de tipo hA2-15A-L7 humanizada
[0603] Una cadena ligera hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (alanina) con ácido aspártico, una posición (residuo faltante) entre los números de aminoácidos 29 y 30 con serina, aminoácido número 36 (glutamina) con ácido glutámico, aminoácido número 41 (serina) con asparagina, aminoácido número 70 (leucina) con alanina, aminoácido número 99 (asparagina) con serina, aminoácido número 100 (prolina) con serina, aminoácido número 108 (treonina) con valina, y aminoácido número 123 (alanina) con glutamina en la cadena ligera del cA2-15A quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 22 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-15A-L7 humanizada” (a veces también denominada “hA2-15A-L7”).
[0605] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L7 humanizada se describe en SEQ ID NO: 38 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 134 a 238 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 se describe en SEQ ID NO: 37 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 425 a 739 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 también se describen en la Figura 20.
[0607] 7)-4 Diseño de hA2-15A humanizado mediante combinaciones de cadenas pesadas y cadenas ligeras
[0609] Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-15A-H1 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-15A-L1 humanizada, que se designó como “hA2-15A-H1/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-15A-H1/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-15A-H1 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-15A-L4 humanizada, que se designó como “hA2-15A-H1/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-15A-H1/L4”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-15A-L1 humanizada, que se designó como “hA2-15A-H4/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-15A-H4/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-15A-L4 humanizada, que se designó como “hA2-15A-H4/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-15A-H4/L4”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-15A-L6 humanizada, que se designó como “hA2-15A-H4/L6 humanizado” (a veces también denominado “hA2-15AH4/L6”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-15A-L7 humanizada, que se designó como “hA2-15A-H4/L7 humanizado” (a veces también denominado “hA2-15A-H4/L7”). Los anticuerpos diseñados anteriormente pueden prepararse de acuerdo con el Ejemplo 8, y evaluarse de acuerdo con los Ejemplos 2 y 4.
[0610] 7)-5 Diseño de hA2-27D humanizada
[0611] 7)-5-1 Modelado molecular de las regiones variables de A2-27D
[0612] El modelado molecular de las regiones variables de A2-27D se realizó mediante un método conocido como modelado de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las regiones variables de A2-27D determinadas anteriormente se compararon con las secuencias primarias de regiones variables de inmunoglobulinas humanas registradas en el Banco de Datos de Proteínas (las estructuras tridimensionales derivadas de estructuras de cristales de rayos X están disponibles) (Nuc. Acid Res.35, D301-D303 (2007)). Como resultado, se seleccionaron 3EYQ y 4I9W como las que tenían la mayor identidad de secuencia con la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, respectivamente, de A2-27D. Las estructuras tridimensionales de las regiones marco se prepararon obteniendo un “modelo marco” mediante la combinación de las coordenadas de 3EYQ y 4I9W correspondientes a la cadena pesada y la cadena ligera de A2-27D. A continuación, se incorporó una conformación representativa de cada CDR en el modelo marco.
[0613] Por último, se realizó un cálculo energético para excluir el contacto interatómico desventajoso, con el fin de obtener posibles modelos moleculares de las regiones variables de A2-27D en términos de energía. Los procedimientos descritos anteriormente se realizaron utilizando un programa de análisis de estructuras tridimensionales de proteínas disponible en el mercado, Discovery Studio (Accelrys, Inc.).
[0614] 7)-5-2 Diseño de una secuencia de aminoácidos para hA2-27D humanizado
[0615] El hA2-27D humanizado se construyó utilizando un método comúnmente conocido como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Se seleccionó un anticuerpo aceptor con base en la identidad de aminoácidos en las regiones marco.
[0616] Las secuencias de las regiones marco de A2-27D se compararon con las secuencias de regiones marco de secuencias consenso de subgrupos humanos. Como resultado, la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena y humana y la secuencia consenso del subgrupo 4 de la cadena κ humana definidas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) se seleccionaron como aceptores debido a su elevada identidad de secuencia en las regiones marco. Los residuos de aminoácidos de las regiones marco de la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena y humana y de la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena κ humana se alinearon con los residuos de aminoácidos de las regiones marco de A2-27D para identificar el número de aminoácidos que difieren entre sí. Los números de estos residuos se analizaron utilizando el modelo tridimensional de A2-27D construido anteriormente. A continuación, se seleccionaron los residuos donantes que se injertarían en los aceptores de acuerdo con los criterios proporcionados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Algunos residuos donantes así seleccionados se transfirieron al anticuerpo aceptor para construir secuencias hA2-27D humanizadas, como se describe en los siguientes Ejemplos.
[0617] 7)-6 Humanización de las cadenas pesadas A2-27D
[0618] 7)-6-1 Cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada
[0619] Una cadena pesada hA2-15A humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 42 (leucina) con alanina, aminoácido número 56 (isoleucina) con valina, aminoácido número 68 (alanina) con serina, aminoácido número 94 (alanina) con serina, aminoácido número 95 (arginina) con lisina, aminoácido número 103 (treonina) con asparagina, aminoácido número 107 (serina) con alanina, aminoácido número 112 (leucina) con valina, aminoácido número 117 (alanina) con arginina, aminoácido número 132 (prolina) con glutamina, y aminoácido número 135 (valina) con leucina en la cadena pesada del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 24 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-H1”).
[0620] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada se describe en SEQ ID NO: 40 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 141 a 470 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 se describe en SEQ ID NO: 39 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 también se describen en la Figura 21.
[0621] 7)-6-2 Cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada
[0623] Una cadena pesada hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 42 (leucina) con alanina, aminoácido número 68 (alanina) con serina, aminoácido número 94 (alanina) con serina, aminoácido número 95 (arginina) con lisina, aminoácido número 103 (treonina) con asparagina, aminoácido número 107 (serina) con alanina, aminoácido número 112 (leucina) con valina, aminoácido número 132 (prolina) con glutamina, y aminoácido número 135 (valina) con leucina en la cadena pesada del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 24 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-H2”).
[0625] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada se describe en SEQ ID NO: 42 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140, y una secuencia que consiste en los residuos de aminoácidos 141 a 470 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 se describe en SEQ ID NO: 41 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 también se describen en la Figura 22.
[0627] 7)-6-3 Cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada
[0629] Una cadena pesada hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 42 (leucina) con alanina, aminoácido número 94 (alanina) con serina, aminoácido número 95 (arginina) con lisina, aminoácido número 103 (treonina) con asparagina, aminoácido número 107 (serina) con alanina, aminoácido número 112 (leucina) con valina, aminoácido número 132 (prolina) con glutamina, y aminoácido número 135 (valina) con leucina en la cadena pesada del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 24 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-H3”).
[0631] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada se describe en SEQ ID NO: 44 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 141 a 470 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 se describe en SEQ ID NO: 43 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los nucleótidos 58 a 420, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 también se describen en la Figura 23.
[0633] 7)-6-4 Cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada
[0635] Una cadena pesada hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 42 (leucina) con alanina, aminoácido número 94 (alanina) con serina, aminoácido número 95 (arginina) con lisina, aminoácido número 103 (treonina) con asparagina, aminoácido número 107 (serina) con alanina, y aminoácido número 135 (valina) con leucina en la cadena pesada del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 24 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-H4”).
[0637] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 46 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 141 a 470 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 se describe en SEQ ID NO: 45 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 también se describen en la Figura 24.
[0638] 7)-6-5 Cadena pesada de tipo hA2-27D-H5 humanizada
[0639] Una cadena pesada hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 35 (arginina) con glicina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 42 (leucina) con alanina, aminoácido número 95 (arginina) con lisina, aminoácido número 103 (treonina) con asparagina, y aminoácido número 135 (valina) con leucina en la cadena pesada del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 24 se designó como “cadena pesada de tipo hA2-27D-H5 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-H5”).
[0640] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H5 humanizada se describe en SEQ ID NO: 48 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 141 a 470 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 se describe en SEQ ID NO: 47 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 también se describen en la Figura 25.
[0641] 7)-7 Humanización de las cadenas ligeras A2-27D
[0642] 7)-7-1 Cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada
[0643] Una cadena ligera hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (treonina) con glicina, aminoácido número 31 (metionina) con leucina, aminoácido número 32 (alanina) con serina, aminoácido número 33 (alanina) con leucina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 39 (valina) con alanina, aminoácido número 42 (asparagina) con serina, aminoácido número 59 (serina) con prolina, aminoácido número 61 (alanina) con glutamina, aminoácido número 62 (serina) con alanina, aminoácido número 64 (lisina) con arginina, aminoácido número 66 (triptófano) con leucina, aminoácido número 77 (valina) con isoleucina, aminoácido número 79 (asparagina) con ácido aspártico, aminoácido número 89 (serina) con ácido aspártico, aminoácido número 90 (tirosina) con fenilalanina, aminoácido número 91 (serina) con treonina, aminoácido número 93 (alanina) con treonina, aminoácido número 96 (serina) con arginina, aminoácido número 97 (metionina) con leucina, aminoácido número 99 (alanina) con prolina, aminoácido número 102 (valina) con fenilalanina, aminoácido número 104 (treonina) con valina, aminoácido número 120 (alanina) con glutamina, aminoácido número 124 (leucina) con valina, y aminoácido número 126 (leucina) con isoleucina en la cadena ligera del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 26 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-L1”).
[0644] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada se describe en SEQ ID NO: 50 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 se describe en SEQ ID NO: 49 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 413 a 727 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 también se describen en la Figura 26.
[0645] 7)-7-2 Cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada
[0646] Una cadena ligera hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (treonina) con glicina, aminoácido número 31 (metionina) con leucina, aminoácido número 32 (alanina) con serina, aminoácido número 33 (alanina) con leucina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 39 (valina) con alanina, aminoácido número 42 (asparagina) con serina, aminoácido número 59 (serina) con prolina, aminoácido número 61 (alanina) con glutamina, aminoácido número 64 (lisina) con arginina, aminoácido número 79 (asparagina) con ácido aspártico, aminoácido número 89 (serina) con ácido aspártico, aminoácido número 90 (tirosina) con fenilalanina, aminoácido número 91 (serina) con treonina, aminoácido número 93 (alanina) con treonina, aminoácido número 96 (serina) con arginina, aminoácido número 97 (metionina) con leucina, aminoácido número 99 (alanina) con prolina, aminoácido número 102 (valina) con fenilalanina, aminoácido número 104 (treonina) con valina, aminoácido número 120 (alanina) con glutamina, aminoácido número 124 (leucina) con valina, y aminoácido número 126 (leucina) con isoleucina en la cadena ligera del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 26 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-L2”).
[0648] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada se describe en SEQ ID NO: 52 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 se describe en SEQ ID NO: 51 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 413 a 727 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 51 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 51 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 también se describen en la Figura 27.
[0650] 7)-7-3 Cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada
[0652] Una cadena ligera hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (treonina) con glicina, aminoácido número 31 (metionina) con leucina, aminoácido número 32 (alanina) con serina, aminoácido número 33 (alanina) con leucina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 39 (valina) con alanina, aminoácido número 42 (asparagina) con serina, aminoácido número 59 (serina) con prolina, aminoácido número 64 (lisina) con arginina, aminoácido número 79 (asparagina) con ácido aspártico, aminoácido número 89 (serina) con ácido aspártico, aminoácido número 91 (serina) con treonina, aminoácido número 93 (alanina) con treonina, aminoácido número 96 (serina) con arginina, aminoácido número 97 (metionina) con leucina, aminoácido número 99 (alanina) con prolina, aminoácido número 102 (valina) con fenilalanina, aminoácido número 124 (leucina) con valina, y aminoácido número 126 (leucina) con isoleucina en la cadena ligera del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 26 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-L3”).
[0654] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada se describe en SEQ ID NO: 54 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 se describe en SEQ ID NO: 53 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 413 a 727 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 53 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 53 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 también se describen en la Figura 28.
[0656] 7)-7-4 Cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada
[0658] Una cadena ligera hA2-27D humanizada se diseñó mediante la sustitución del aminoácido número 29 (treonina) con glicina, aminoácido número 32 (alanina) con serina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 42 (asparagina) con serina, aminoácido número 59 (serina) con prolina, aminoácido número 64 (lisina) con arginina, aminoácido número 79 (asparagina) con ácido aspártico, aminoácido número 89 (serina) con ácido aspártico, aminoácido número 91 (serina) con treonina, aminoácido número 93 (alanina) con treonina, aminoácido número 96 (serina) con arginina, aminoácido número 99 (alanina) con prolina, y aminoácido número 102 (valina) con fenilalanina en la cadena ligera del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 26 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-L4”).
[0660] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 56 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 se describe en SEQ ID NO: 55 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 413 a 727 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 55 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 55 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 también se describen en la Figura 29.
[0662] 7)-7-5 Cadena ligera de tipo hA2-27D-L5 humanizada
[0664] Una cadena ligera hA2-27D humanizada diseñada mediante la sustitución del aminoácido número 29 (treonina) con glicina, aminoácido número 32 (alanina) con serina, aminoácido número 38 (lisina) con arginina, aminoácido número 91 (serina) con treonina, aminoácido número 93 (alanina) con treonina, aminoácido número 96 (serina) con arginina, aminoácido número 99 (alanina) con prolina, y aminoácido número 102 (valina) con fenilalanina en la cadena ligera del cA2-27D quimérico que se muestra en SEQ ID NO: 26 se designó como “cadena ligera de tipo hA2-27D-L5 humanizada” (a veces también denominada “hA2-27D-L5”).
[0666] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L5 humanizada se describe en SEQ ID NO: 58 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129, y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 se describe en SEQ ID NO: 57 en el Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 26 a 85, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412, y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 413 a 727 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 57 codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 57 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 también se describen en la Figura 30.
[0668] 7)-8 Diseño de hA2-27D humanizados mediante combinaciones de cadenas pesadas y cadenas ligeras
[0669] Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H1/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H1/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H1/L2 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H1/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H1/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H1/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H2/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H2/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H2/L2 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H2/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H2/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H2/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H3/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H3/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H3/L2 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H3/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H3/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H3/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H3/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H3/L4”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H4/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H4/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H4/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H4/L4”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L5 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H4/L5 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H4/L5”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-27D-H5 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada, que se designó como “ hA2-27D-H5/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-27D-H5/L4”). Los anticuerpos diseñados como se indica anteriormente pueden prepararse de acuerdo con el Ejemplo 8, y evaluarse de acuerdo con los Ejemplos 2 y 4.
[0671] <Ejemplo 8>
[0673] Construcción de los vectores de expresión del anticuerpo A2-15A humanizado y del anticuerpo A2-27D humanizado y preparación de los anticuerpos
[0674] 8)-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada A2-15A humanizada
[0675] 8)-1-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-15A-H1 humanizada
[0676] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-15A-H1 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 443 de la secuencia de nucleótidos de la hA2-15A-H1 humanizada que se muestra en SEQ ID NO: 27 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). El fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable hA2-15A-H1 humanizada se amplificó utilizando el fragmento de ADN sintetizado como un molde, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd., Japón), y un conjunto de cebadores que se indican a continuación, y se insertó en el sitio de escisión de la enzima de restricción BlpI del vector de expresión de la cadena pesada de anticuerpos quimérica y humanizada de tipo IgG1 pCMA-G1 utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de hA2-15A-H1 humanizado. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-15A-H1”.
[0677] Conjunto de cebadores
[0678] 5'-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3' (EG-Inf-F; SEQ ID NO: 99)
[0679] 5'-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3' (EG1-Inf-R; SEQ ID NO: 100)
[0680] 8)-1-2 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-15A-H4 humanizada
[0681] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-15A-H4 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 443 de la secuencia de nucleótidos de la hA2-15A-H4 humanizada que se muestra en SEQ ID NO: 29 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-15A-H4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-15A-H4”.
[0682] 8)-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera A2-15A humanizada
[0683] 8)-2-1 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L1 humanizada
[0684] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-15A-L1 humanizada, de SEQ ID NO: 31, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). El fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-15A-L1 humanizada se amplificó utilizando el fragmento de ADN sintetizado como un molde, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) y un conjunto de cebadores que se indican a continuación, y se insertó en el lugar del que se extrajo la secuencia que codifica una señal secretora de cadena κ y una región constante de cadena κ humana mediante la digestión del vector de expresión pCMA-LK con las enzimas de restricción XbaI y PmeI, utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de hA2-15A-L1 humanizado. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-15A-L1”. Conjunto de cebadores
[0685] 5'-CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC-3' (CM-inf-F; SEQ ID NO: 101)
[0686] 5'-AGTTAGCCTCCCCCGTTTAAACTC-3' (CM-inf-R; SEQ ID NO: 102)
[0687] 8)-2-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L4 humanizada
[0688] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-15A-L4 humanizada, de SEQ ID NO: 33, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-15A-L4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-15A-L4”.
[0689] 8)-2-3 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L6 humanizada
[0690] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-15A-L6 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 35, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-15A-L6 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-15A-L6”.
[0691] 8)-2-4 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-15A-L7 humanizada
[0692] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-15A-L7 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 37, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-15A-L7 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-15A-L7”.
[0693] 8)-3 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada A2-27D humanizada
[0694] 8)-3-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H1 humanizada
[0695] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-27D-H1 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 437 de la secuencia de nucleótidos de hA2-27D-H1 humanizada de SEQ ID NO: 39 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-H1 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H1”.
[0696] 8)-3-2 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2 humanizada
[0697] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-27D-H2 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 437 de la secuencia de nucleótidos de hA2-27D-H2 humanizada de SEQ ID NO: 41 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-H2 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H2”.
[0698] 8)-3-3 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3 humanizada
[0699] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-27D-H3 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 437 de la secuencia de nucleótidos de hA2-27D-H3 humanizada de SEQ ID NO: 43 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-H3 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H3”.
[0700] 8)-3-4 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H4 humanizada
[0701] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-27D-H4 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 437 de la secuencia de nucleótidos de hA2-27D-H4 humanizada de SEQ ID NO: 45 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-H4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H4”.
[0702] 8)-3-5 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H5 humanizada
[0703] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-27D-H5 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 437 de la secuencia de nucleótidos de hA2-27D-H5 humanizada de SEQ ID NO: 47 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-H5 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H5”.
[0704] 8)-4 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera A2-27D humanizada
[0705] 8)-4-1 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L1 humanizada
[0706] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-27D-L1 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 49, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-L1 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-27D-L”.
[0707] 8)-4-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L2 humanizada
[0708] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-27D-L2 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 51, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-L2 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-27D-L2”.
[0709] 8)-4-3 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L3 humanizada
[0710] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-27D-L3 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 53, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-L3 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-27D-L3”.
[0711] 8)-4-4 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L4 humanizada
[0712] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-27D-L4 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 55, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-L4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-27D-L4”.
[0713] 8)-4-5 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-27D-L5 humanizada
[0714] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia que codifica la hA2-27D-L5 humanizada, como se muestra en SEQ ID NO: 57, se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-27D-L5 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-27D-L5”.
[0715] 8)-5 Preparación del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1) 8)-5-1 Producción del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1) Cada anticuerpo se obtuvo de la misma manera que en el Ejemplo 5)-7. Específicamente, el hA2-15A-H4/L6 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-15A-H4 construido en el Ejemplo 8)-1-2 y el pCMA/hA2-15A-L6 construido en el Ejemplo 8)-2-3. El hA2-27D-H2/L2 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-27D-H2 construido en el Ejemplo 8)-3-2 y el pCMA/hA2-27D-L2 construido en el Ejemplo 8)-4-2. El hA2-27D-H3/L4 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-27D-H3 construido en el Ejemplo 8)-3-3 y el pCMA/hA2-27D-L4 construido en el Ejemplo 8)-4-4.
[0716] 8)-5-2 Purificación en dos pasos del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1)
[0717] Cada sobrenadante de cultivo obtenido en el Ejemplo 8)-5-1 se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 5)-8.
[0718] <Ejemplo 9>
[0719] Evaluación de la actividadin vitrodel anticuerpo A2-15A humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1)
[0720] 9)-1 Evaluación de anticuerpos mediante ensayo reportero de luciferasa
[0721] El hA2-15A-H4/L6 humanizado, el hA2-27D-H2/L2 humanizado y el hA2-27D-H3/L4 humanizado preparados en el Ejemplo 8)-5 se analizaron para determinar su actividad inhibidora frente a las señales intracelulares mediadas por ALK2 utilizando un reportero de luciferasa específico para BMP. Las células HEPG2 se transfectaron con pGL4,26/Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7, 949 (2002)) de la misma manera que en el Ejemplo 6)-1.. Después de 3 horas, el medio se sustituyó por medio de expresión fresco FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.). A continuación, se añadieron cada uno de los anticuerpos humanizados y 10 ng/mL de BMP7 (fabricado por Miltenyi Biotec). Al día siguiente, se midió la actividad de la luciferasa.
[0722] Los resultados se muestran en la Figura 31. Se confirmó que el hA2-15A-H4/L6 humanizado, el hA2-27D-H2/L2 humanizado y el hA2-27D-H3/L4 humanizado inhiben, de forma dependiente de la dosis, la actividad de la luciferasa específica de BMP inducida por BMP7.
[0723] <Ejemplo 10>
[0724] Evaluación de la actividad de unión del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1) contra la ALK2 humana
[0725] Las constantes de disociación de hA2-15A-H4/L6 humanizado, hA2-27D-H2/L2 humanizado y hA2-27D-H3/L4 humanizado preparados en el Ejemplo 8)-5 para el antígeno (Quimera Fc ALK2 humana recombinante, Sino Biological Inc.) se midieron en Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) utilizando el antígeno inmovilizado como un ligando y cada anticuerpo como un analito. El antígeno se añadió a 1,25 µg/mL durante 60 segundos y se inmovilizó en un chip sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). La disolución amortiguadora de funcionamiento utilizado fue HBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, y 0,05% de tensoactivo P20). Se añadieron disoluciones diluidas en serie (de 0,2 a 50 nM) del anticuerpo sobre el chip inmovilizado con antígeno a una tasa de flujo de 30 µl/min durante 300 segundos. Posteriormente, se controló la fase de disociación durante 1800 segundos. Se le añadió una disolución de glicina/ácido clorhídrico 10 mM (pH 1,5) como una disolución regeneradora a una tasa de flujo de 10 µl/min durante 30 segundos dos veces. Los datos se analizaron utilizando modelos de unión bivalentes de software analítico (software BIAevaluation, versión 1,0) para calcular una constante de velocidad de asociación ka, una constante de velocidad de disociación kd y una constante de disociación (KD; KD = kd/ka).
[0726] Los resultados se muestran en la Tabla 1.
[0727] Tabla 1
[0729]
[0731] <Ejemplo 11>
[0732] Preparación del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2)
[0733] 11)-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo IgG2 humanizada pCMA-G2
[0734] El pCMA-LK construido en el Ejemplo 5)-1 se digirió con XbaI y PmeI. El fragmento de ADN obtenido, excepto la secuencia de ADN que codifica la señal secretora de la cadena κ y la región constante de cadena κ humana, se ligó con un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 103) que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una secuencia señal secretora de la cadena pesada humana y una región constante IgG2 humana, utilizando el kit de clonación por PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de la cadena pesada quimérica y humanizada de tipo IgG2 pCMA-G2 que tiene una secuencia señal, un sitio de clonación y la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de cadena pesada IgG2 humana, cadena abajo del promotor CMV.
[0735] 11)-2 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada hA2-15A-H4 de tipo IgG2 humanizada
[0736] Un fragmento de ADN que contiene ADNc codificante de la región variable de cadena pesada se amplificó utilizando el pCMA-G1/hA2-15A-H4 construido en el Ejemplo 8)-1-2 como un molde, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), y un conjunto de cebadores que se indican a continuación, y se insertó en el sitio de escisión de la enzima de restricción BlpI del vector de expresión de la cadena pesada de tipo IgG2 humanizada pCMA-G2 utilizando el kit de clonación PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de IgG2 de tipo hA2-15A-H4 humanizada. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G2/hA2-15A-H4”.
[0737] La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada hA2-15A-H4 de tipo IgG2 humanizada se muestra en SEQ ID NO: 104, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 105. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 104, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 427 a 1404 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 143 a 468 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 104 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 también se describen en la Figura 32.
[0738] Conjunto de cebadores para la cadena pesada hA2-15A-H4 de tipo IgG2 humanizada
[0739] 5'-CAGATGGGTGCTGAGCGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGC-3' (15A-H4-F; SEQ ID NO: 130)
[0740] 5'-CTTGGTGCTGGCTGAGCTGACGGTCACGAGGGTGCC-3' (15A-H4-R; SEQ ID NO: 131)
[0741] 11)-3 Producción del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2)
[0742] El anticuerpo se produjo de la misma manera que en el Ejemplo 5)-7. Un anticuerpo A2-15A humanizado obtenido por la combinación de pCMA-G2/hA2-15A-H4 construido en el Ejemplo 11)-2 y pCMA/hA2-15A-L6 construido Ejemplo 8)-2-3 se designó como 2hA2-15A-H4/L6 humanizado (IgG2)”.
[0743] 11)-4 Purificación en dos pasos de hA2-15A-H4/L6 humanizado (IgG2)
[0744] El sobrenadante de cultivo obtenido en el Ejemplo 11)-3 se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 5)-8.
[0745] <Ejemplo 12>
[0746] Preparación del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA)
[0747] 12)-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2-LALA humanizada Las mutaciones se introdujeron utilizando el pCMA-G1/hA2-27D-H2 construido en el Ejemplo 8)-3-2 como un molde, un conjunto de cebadores dado a continuación y el kit de mutagénesis KOD -Plus- (Toyobo Co., Ltd.) para construir un vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2-LALA. El vector de expresión construido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H2-LALA”.
[0748] La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H2-LALA humanizada se muestra en SEQ ID NO: 106, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 107. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 106, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 106 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 también se describen en la Figura 33.
[0749] Conjunto de cebadores:
[0750] 5'-GCGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCC-3' (LALA-F; SEQ ID NO: 132)
[0751] 5'-GGCTTCAGGTGCTGGGCAGGGTGGGCATGTG-3' (LALA-R; SEQ ID NO: 133)
[0752] 12)-2 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3-LALA humanizada Se construyó un vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3-LALA de la misma manera que en el Ejemplo 12)-1 utilizando el pCMA-G1/hA2-27D-H3 construido en el Ejemplo 8)-3-3 como un molde. El vector de expresión construido se designó como “pCMA-G1/hA2-27D-H3-LALA”.
[0753] La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de tipo hA2-27D-H3-LALA humanizada se muestra en SEQ ID NO: 108, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 109. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 108, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 también se describen en la Figura 34.
[0754] 12)-3 Producción del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA)
[0755] Cada anticuerpo se produjo de la misma manera que en el Ejemplo 5)-7. Un anticuerpo A2-27D humanizado obtenido por la combinación de pCMA-G1/hA2-27D-H2-LALA construido en el Ejemplo 12)-1 y pCMA/hA2-27D-L2 construido en el Ejemplo 8)-4-2 se designó como “hA2-27D-H2/L2 humanizado (IgG1 LALA)”. Un anticuerpo A2-27D humanizado obtenido por la combinación de pCMA-G1/hA2-27D-H3-LALA construido en el Ejemplo 12)-2 y pCMA/hA2-27D-L4 construido en el Ejemplo 8)-4-4 se designó como “hA2-27D-H3/L4 humanizado (IgG1 LALA)”.
[0756] 12)-4 Purificación en dos pasos del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA)
[0757] Cada sobrenadante de cultivo obtenido en el Ejemplo 12)-3 se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 5)-8.
[0758] <Ejemplo 13>
[0759] Evaluación de la actividadin vitrodel anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA)
[0760] 13)-1 Evaluación de anticuerpos mediante ensayo reportero de luciferasa
[0761] El A2-15A-H4/L6 humanizado (IgG2) preparado en el Ejemplo 11)-4 y el A2-27D-H2/L2 humanizado (IgG1 LALA) obtenido en el Ejemplo 12)-4 se analizaron para determinar su actividad inhibidora frente a las señales intracelulares mediadas por ALK2 utilizando un reportero de luciferasa específico para BMP. Las células HEPG2 se transfectaron con pGL4,26/Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7, 949 (2002)) de la misma manera que en el Ejemplo 6)-1. Después de 3 horas, el medio se sustituyó por medio de expresión fresco FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.). A continuación, se añadieron cada uno de los anticuerpos humanizados y 2,5 ng/mL de BMP9. Al día siguiente, se midió la actividad de la luciferasa de la misma manera que en el Ejemplo 6)-1.
[0762] Los resultados se muestran en la Figura 35. Se confirmó que la A2-15A-H4/L6 humanizada (IgG2) y la A2-27D-H2/L2 humanizada (IgG1 LALA) inhiben, de forma dependiente de la dosis, la actividad de la luciferasa específica de BMP inducida por BMP7.
[0763] <Ejemplo 14>
[0764] Evaluación de la actividad de unión del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA) contra la ALK2 humana
[0765] 14)-1 Expresión y purificación del dominio extracelular ALK2 humano
[0766] El ADN que codifica un dominio extracelular ALK2 humano (polipéptido que consiste en los números de aminoácidos 21 a 123 de la secuencia de aminoácidos del No. de acceso NP_001096 de la base de datos de proteínas del NCBI) se insertó en un vector pET-28b(+) (Novagen/Merck KGaA, No. de catálogo: 69865) para construir un plásmido para la expresión de una proteína unida C-terminalmente a una secuencia de etiqueta His.E. coliSHuffle T7 (New England Biolabs Inc., No. de catálogo: C3029H) se transformó con este plásmido y se cultivó en medio TB (Sigma-Aldrich Co. LLC, No. de catálogo: T0918). LaE. colicultivada de este modo se sometió a ultrasonidos y las células bacterianas obtenidas se centrifugaron. El sobrenadante se purificó utilizando la columna cruda HisTrap FF (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., No. de catálogo: 17-5286-01). A continuación, el dominio extracelular ALK2 humano se purificó mediante electroforesis utilizando la columna HiLoad 26/600 Superdex 200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., No. de catálogo: 28-9893-36) hasta obtener una única banda con un peso molecular de 12 kDa.
[0767] 14)-2 Medición de la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA)
[0768] Las constantes de disociación de hA2-15A-H4/L6 humanizado (IgG2) preparado en el Ejemplo 11)-4, y hA2-27D-H2/L2 humanizado (IgG1 LALA) y hA2-27D-H3/L4 humanizado (IgG1 LALA) preparado en el Ejemplo 12)-4 para el antígeno (dominio extracelular ALK2 humano preparado en el Ejemplo 14)-1) se midieron utilizando Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Japón) mediante el método de captura, que consiste en capturar cada anticuerpo como un ligando en un anticuerpo IgG (Fc) anti-humano inmovilizado y ensayar el antígeno como un analito. Aproximadamente 1000 RU del anticuerpo IgG (Fc) anti-humano (kit de captura de anticuerpos humanos, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) se unieron covalentemente a un chip sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) mediante el método de acoplamiento con aminas. Del mismo modo, este anticuerpo se inmovilizó en una célula de referencia. La disolución amortiguadora de funcionamiento utilizado fue HBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, y 0,05% de tensoactivo P20). El anticuerpo se añadió sobre el chip inmovilizado con anticuerpo IgG (Fc) anti-humano durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se añadieron al mismo disoluciones diluidas en serie (de 0,78 a 200 nM) del antígeno a una tasa de flujo de 30 µl/min durante 300 segundos. Posteriormente, se controló la fase de disociación durante 600 segundos. Se le añadió una disolución de cloruro de magnesio 3 M como una disolución regeneradora a una tasa de flujo de 10 µl/min durante 30 segundos. Los datos se analizaron utilizando modelos de unión 1:1 de software analítico (software BIAevaluation, versión 1,0) para calcular una constante de velocidad de asociación ka, una constante de velocidad de disociación kd y una constante de disociación (KD; KD = kd/ka).
[0769] Los resultados se muestran en la Tabla 2.
[0770] Tabla 2
[0772]
[0774] <Ejemplo 15>
[0775] Evaluación de la actividadin vivodel anticuerpo A2-15A humanizado (IgG2) y del anticuerpo A2-27D humanizado (IgG1 LALA)
[0776] El hA2-15A-H4/L6 humanizado (IgG2) preparado en el Ejemplo 11)-4 y el hA2-27D-H2/L2 humanizado (IgG1 LALA) preparado en el Ejemplo 12)-4 se analizaron para determinar su actividad inhibidora contra la osificación ectópica utilizando modelos de ratón con osificación ectópica causada por el trasplante de BMP7. CollaTape (fabricada por Zimmer Biomet Dental K.K.) cortada en forma redonda de 4 mm de diámetro se impregnó con 2,5 µg de BMP7 (fabricada por Miltenyi Biotec), se congeló durante la noche a -80°C y se secó al vacío. Se afeitó el vello de la piel cerca del fémur de cada ratón (C57BL/6; 8-9 semanas de edad) y se realizó una incisión en esta área bajo anestesia mediante aspiración de isoflurano. El papel de filtro liofilizado se trasplantó al músculo esquelético. Dos semanas después del trasplante, el hueso ectópico calcificado se analizó como osificación ectópica mediante micro-TC (fabricado por Comscantecno Co., Ltd.). A continuación, se aisló el hueso ectópico del músculo esquelético y se midió su peso. Cada anticuerpo se administró por vía subcutánea una vez a la semana (días -1 y 6 cuando el día del trasplante se definió como día 0). El anticuerpo se diluyó con un disolvente (HBSor) de forma que su concentración fuera de 1, 3 o 10 mg/kg. La IgG humana de control (fabricada por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) se ajustó a 10 mg/kg con un disolvente y se administró a los ratones de un grupo de control. Los resultados se muestran en la Figura 36. Se confirmó que el hA2-15A-H4/L6 humanizado (IgG2) y el hA2-27D-H2/L2 humanizado (IgG1 LALA) suprimen la osteoinducción ectópica inducida por BMP7 en los tejidos musculares esqueléticos de ratón.
[0777] <Ejemplo 16>
[0778] Análisis del epítopo del anticuerpo A2-27D
[0779] 16)-1 Preparación del fragmento Fab quimérico humano cA2-27D
[0780] Se preparó un fragmento Fab a partir del anticuerpo quimérico humano cA2-27D obtenido en el Ejemplo 5)-8 utilizando el kit de preparación de Fab Pierce.
[0781] 16)-2 Cristalización y análisis estructural del fragmento Fab cA2-27D quimérico humano y del complejo ALK2-ECD El complejo proteico del fragmento Fab cA2-27D quimérico humano obtenido en el Ejemplo 16)-1 y el ALK2-ECD preparado de acuerdo con el Ejemplo 14 se concentraron a 2,4 mg/mL y se utilizaron en el ensayo de cristalización empleando el método de difusión de vapor. A 0,5 µl de la disolución de proteína se añadió una cantidad igual de una disolución precipitante (2% (v/v) de Tacsimate (pH 7,0), 100 mM de HEPES (pH 7,5) y 20% (p/v) de polietilenglicol 3.350), y la disolución resultante se colocó en un recipiente sellado que contenía 50 µl de una disolución precipitante de forma que estas disoluciones no tuvieran contacto entre sí. El recipiente se dejó reposar a 20 °C. Tres días después, se obtuvieron cristales únicos de 0,1 mm × 0,1 mm × 0,1 mm. Los cristales obtenidos se sumergieron en una disolución precipitante suplementada con 20% (v/v) de glicerol, y posteriormente se congelaron en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X se recolectaron bajo una corriente de nitrógeno de 95 K utilizando BL1A de KEK Photon Factory. La intensidad de difracción se digitalizó a partir de la imagen de difracción obtenida utilizando el software XDS (Acta Cryst. (2010). D66, 125-132) para determinar los factores de la estructura cristalina. Los cristales estaban en el sistema cristalino monoclínico centrado en el cuerpo con un grupo espacial C121 y células unitarias de a = c = 119,39 angstroms, b = 37,32 angstroms, y β = 92,54. El método de sustitución molecular se realizó utilizando los factores de estructura obtenidos y las coordenadas de la estructura tridimensional del Fab (se utilizó la estructura del anticuerpo determinada por el análisis de la estructura cristalina anterior) para determinar las fases. El software Phaser (CCP4: Proyecto de Colaboración Computacional No. 4) se utilizó en el cálculo. El cristal contenía un complejo en la unidad asimétrica. El refinamiento de la estructura se realizó con el software Refmac5 (CCP4) y la corrección del modelo con el software coot. Esta operación se realizó repetidamente para obtener un factor R final de 22,3% y un factor R libre de 26,7% con una resolución de 2,6 angstroms. El modelo consiste en un complejo y contiene los números de aminoácidos 1 a 211 de la cadena A2-27D Fab L, los números de aminoácidos 1 a 134 y 141 a 223 de la cadena A2-27D Fab H, los números de aminoácidos 11 a 89 de ALK2-ECD, y 61 moléculas de agua. Los residuos de aminoácidos determinados de ALK2-ECD situados en un radio de 4 angstroms del Fab A2-27D son los siguientes: Glu18, Gly19, Ile39, Asn40, Asp41, Gly42, Phe43, His44, Val45, Tyr46, Asn82, Thr84, Gln86 y Leu87. El modelo de cinta de todo el complejo se muestra en la Figura 37.
[0782] <Ejemplo 17>
[0783] Diseño del anticuerpo A2-11E humanizado y del anticuerpo A2-25C humanizado
[0784] 17)-1 Diseño de hA2-11E humanizada
[0785] 17)-1-1 Modelado molecular de las regiones variables de A2-11E
[0786] El modelado molecular de las regiones variables de A2-11E se llevó a cabo mediante un método generalmente conocido como modelado de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las regiones variables de A2-11E determinadas anteriormente se compararon con las secuencias primarias (se dispone de estructuras tridimensionales derivadas de estructuras cristalinas de rayos X) de regiones variables de inmunoglobulinas humanas registradas en el Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)). Como resultado, se seleccionó 3BN9 por tener la mayor identidad de secuencia con las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de A2-11E. Las estructuras tridimensionales de las regiones marco se prepararon como un “modelo marco” combinando las coordenadas de 3BN9. Posteriormente, la conformación típica de cada CDR se incorporó en el modelo marco.
[0787] Por último, se realizó un cálculo de minimización de energía para excluir el contacto interatómico desventajoso con el fin de obtener posibles modelos moleculares de las regiones variables de A2-11E en términos de energía. Estos procedimientos se realizaron utilizando un programa de análisis de estructuras tridimensionales de proteínas disponible en el mercado, Discovery Studio (fabricado por Accelrys).
[0788] 17)-1-2 Diseño de la secuencia de aminoácidos de hA2-11E humanizada
[0789] La hA2-11E humanizada se construyó mediante un método generalmente conocido como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Se seleccionó un anticuerpo aceptor con base en la identidad de los aminoácidos en las regiones marco.
[0790] Las secuencias de las regiones marco de A2-11E se compararon con las regiones marco de secuencias consenso de subgrupos humanos. Como resultado, una secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena γ humana y una secuencia consenso del subgrupo 1 de la cadena κ humana especificadas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) sr seleccionaron como aceptores debido a su elevada identidad de secuencia en cuanto a las regiones marco. Los residuos de aminoácidos de las regiones marco de la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena γ humana y de la secuencia consenso del subgrupo 1 de la cadena κ humana se alinearon con los residuos de aminoácidos de las regiones marco A2-11E para identificar los números de aminoácidos que no coincidían entre sí. Los números de estos residuos se analizaron utilizando el modelo tridimensional de A2-11E construido anteriormente. A continuación, se seleccionaron los residuos donantes que se injertarían en los aceptores de acuerdo con los criterios proporcionados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Algunos residuos donantes seleccionados de este modo se transfirieron al anticuerpo aceptor para construir la secuencia hA2-11E humanizada como se describe en los Ejemplos siguientes.
[0791] 17)-2 Humanización de la cadena pesada A2-11E
[0792] 17)-2-1 Cadena pesada de tipo hA2-11E-H3 humanizada
[0793] Una cadena pesada hA2-11E humanizada diseñada a partir de la cadena pesada A2-11E de SEQ ID NO: 2 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del posición de aminoácido 7 (treonina) con serina, posición de aminoácido 16 (arginina) con glicina, posición de aminoácido 19 (lisina) con arginina, posición de aminoácido 23 (valina) con alanina, posición de aminoácido 48 (isoleucina) con valina, posición de aminoácido 61 (prolina) con alanina, posición de aminoácido 69 (alanina) con treonina, posición de aminoácido 75 (alanina) con serina, posición de aminoácido 76 (ácido glutámico) con lisina, posición de aminoácido 88 (serina) con alanina, y posición de aminoácido 93 (treonina) con valina se designó como “cadena pesada de tipo hA2-11E-H3”.
[0794] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-11E-H3 humanizada se describe en SEQ ID NO: 111 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 138 a 467 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 se describe en SEQ ID NO: 110 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 110, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 412 a 1401 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 110 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 también se describen en la Figura 38.
[0795] 17)-2-2 Cadena pesada de tipo hA2-11E-H4 humanizada
[0796] Una cadena pesada hA2-11E humanizada diseñada a partir de la cadena pesada A2-11E de SEQ ID NO: 2 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del posición de aminoácido 7 (treonina) con serina, posición de aminoácido 16 (arginina) con glicina, posición de aminoácido 19 (lisina) con arginina, posición de aminoácido 23 (valina) con alanina, posición de aminoácido 69 (alanina) con treonina, posición de aminoácido 75 (alanina) con serina, posición de aminoácido 76 (ácido glutámico) con lisina, posición de aminoácido 88 (serina) con alanina, y posición de aminoácido 93 (treonina) con valina se designó como “cadena pesada de tipo hA2-11E-H4”.
[0797] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-11E-H4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 113 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 138 a 467 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 se describe en SEQ ID NO: 112 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 112, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 412 a 1401 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 112 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 también se describen en la Figura 39.
[0798] 17)-3 Humanización de la cadena ligera A2-11E
[0799] 17)-3-1 Cadena ligera de tipo hA2-11E-L2 humanizada
[0800] Una cadena ligera hA2-11E humanizada diseñada a partir de la cadena ligera A2-11E de SEQ ID NO: 4 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 10 (leucina) con serina, posición del aminoácido 21 (leucina) con isoleucina, aminoácido número 22 (serina) con treonina, aminoácido número 40 (leucina) con prolina, aminoácido número 42 (ácido glutámico) con lisina, aminoácido número 58 (isoleucina) con valina, aminoácido número 83 (valina) con fenilalanina, aminoácido número 85 (isoleucina) con treonina, aminoácido número 87 (fenilalanina) con tirosina, aminoácido número 99 (prolina) con glutamina, aminoácido número 103 (leucina) con valina, aminoácido número 105 (leucina) con isoleucina, y aminoácido número 108 (alanina) con treonina se designó como “cadena ligera de tipo hA2-11E-L2”.
[0801] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-11E-L2 humanizada se describe en SEQ ID NO: 115 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 129 a 233 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 se describe en SEQ ID NO: 114 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 114, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 385 a 699 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 114 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 también se describen en la Figura 40.
[0802] 17)-3-2 Cadena ligera de tipo hA2-11E-L3 humanizada
[0803] Una cadena ligera hA2-11E humanizada diseñada a partir de la cadena ligera A2-11E de SEQ ID NO: 4 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 10 (leucina) con serina, aminoácido número 21 (leucina) con isoleucina, aminoácido número 22 (serina) con treonina, aminoácido número 40 (leucina) con prolina, aminoácido número 42 (ácido glutámico) con lisina, aminoácido número 83 (valina) con fenilalanina, aminoácido número 85 (isoleucina) con treonina, aminoácido número 87 (fenilalanina) con tirosina, aminoácido número 99 (prolina) con glutamina, aminoácido número 103 (leucina) con valina, aminoácido número 105 (leucina) con isoleucina, y aminoácido número 108 (alanina) con treonina se designó como “cadena ligera de tipo hA2-11E-L3”. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-11E-L3 humanizada se describe en SEQ ID NO: 117 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 129 a 233 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 se describe en SEQ ID NO: 116 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 385 a 699 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 también se describen en la Figura 41.
[0804] 17)-3-3 Cadena ligera de tipo hA2-11E-L4 humanizada
[0805] Una cadena ligera hA2-11E humanizada diseñada a partir de la cadena ligera A2-11E de SEQ ID NO: 4 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 10 (leucina) con serina, aminoácido número 21 (leucina) con isoleucina, aminoácido número 40 (leucina) con prolina, aminoácido número 83 (valina) con fenilalanina, aminoácido número 103 (leucina) con valina, aminoácido número 105 (leucina) con isoleucina, y aminoácido número 108 (alanina) con treonina se designó como “cadena ligera de tipo hA2-11E-L4”.
[0806] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-11E-L4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 119 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 129 a 233 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 se describe en SEQ ID NO: 118 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 385 a 699 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 también se describen en la Figura 42.
[0807] 17)-4 Diseño de hA2-11E humanizada mediante la combinación de cadena pesada y cadena ligera
[0808] Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-11E-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-11E-L2 humanizada, que se designó como “ hA2-11E-H3/L2 humanizado” (también denominado “hA2-11E-H3/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-11E-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-11E-L3 humanizada, que se designó como “hA2-11E-H3/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-11EH3/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-11E-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-11E-L4 humanizada, que se designó como “hA2-11E-H3/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-11E-H3/L4”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-11E-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-11E-L2 humanizada, que se designó como “hA2-11E-H4/L2 humanizado” (a veces también denominado “hA2-11EH4/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-11E-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-11E-L3 humanizada, que se designó como “hA2-11E-H4/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-11E-H4/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-11E-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-11E-L4 humanizada, que se designó como “hA2-11E-H4/L4 humanizado” (a veces también denominado “hA2-11EH4/L4”). Estos anticuerpos diseñados pueden prepararse de acuerdo con el Ejemplo 18 y evaluarse de acuerdo con los Ejemplos 2 y 4.
[0809] 17)-5 Diseño de hA2-25C humanizada
[0810] 17)-5-1 Modelado molecular de las regiones variables de A2-25C
[0811] El modelado molecular de las regiones variables de A2-25C se llevó a cabo mediante un método generalmente conocido como modelado de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las regiones variables de AA2-25C determinadas anteriormente se compararon con las secuencias primarias (se dispone de estructuras tridimensionales derivadas de estructuras cristalinas de rayos X) de regiones variables de inmunoglobulinas humanas registradas en el Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)). Como resultado, se seleccionó 3BN9 por tener la mayor identidad de secuencia con las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de A2-25C. Las estructuras tridimensionales de las regiones marco se prepararon como un “modelo marco” combinando las coordenadas de 3BN9. Posteriormente, la conformación típica de cada CDR se incorporó en el modelo marco.
[0812] Por último, se realizó un cálculo de minimización de energía para excluir el contacto interatómico desventajoso con el fin de obtener posibles modelos moleculares de las regiones variables de A2-25C en términos de energía. Estos procedimientos se realizaron utilizando un programa de análisis de estructuras tridimensionales de proteínas disponible en el mercado, Discovery Studio (fabricado por Accelrys).
[0813] 17)-5-2 Diseño de la secuencia de aminoácidos de hA2-25C humanizada
[0814] La hA2-25C humanizada se construyó mediante un método generalmente conocido como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Se seleccionó un anticuerpo aceptor con base en la identidad de los aminoácidos en las regiones marco.
[0815] Las secuencias de las regiones marco de A2-25C se compararon con las regiones marco de secuencias consenso de subgrupos humanos. Como resultado, una secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena γ humana y una secuencia consenso del subgrupo 1 de la cadena κ humana especificadas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) sr seleccionaron como aceptores debido a su elevada identidad de secuencia en cuanto a las regiones marco. Los residuos de aminoácidos de las regiones marco de la secuencia consenso del subgrupo 3 de la cadena γ humana y de la secuencia consenso del subgrupo 1 de la cadena κ humana se alinearon con los residuos de aminoácidos de las regiones marco A2-25C para identificar los números de aminoácidos que no coincidían entre sí. Los números de estos residuos se analizaron utilizando el modelo tridimensional de A2-25C construido anteriormente. A continuación, se seleccionaron los residuos donantes que se injertarían en los aceptores de acuerdo con los criterios proporcionados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Algunos residuos donantes seleccionados de este modo se transfirieron al anticuerpo aceptor para construir la secuencia hA2-25C humanizada como se describe en los Ejemplos siguientes.
[0816] 17)-6 Humanización de la cadena pesada A2-25C
[0817] 17)-6-1 Cadena pesada de tipo hA2-25C-H3 humanizada
[0818] Una cadena pesada hA2-25C humanizada diseñada a partir de la cadena pesada A2-25C de SEQ ID NO: 10 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 19 (lisina) con arginina, aminoácido número 38 (cisteína) con arginina, aminoácido número 42 (treonina) con glicina, aminoácido número 63 (treonina) con serina, aminoácido número 75 (alanina) con serina, aminoácido número 84 (ácido aspártico) con asparagina, aminoácido número 88 (serina) con alanina, aminoácido número 93 (treonina) con valina, aminoácido número 112 (valina) con treonina, y aminoácido número 113 (metionina) con leucina se designó como “cadena pesada de tipo hA2-25C-H3”.
[0819] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-25C-H3 humanizada se describe en SEQ ID NO: 121 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 138 a 467 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 se describe en SEQ ID NO: 120 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 120, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 412 a 1401 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 120 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 también se describen en la Figura 43.
[0820] 17)-6-2 Cadena pesada de tipo hA2-25C-H4 humanizada
[0821] Una cadena pesada hA2-25C humanizada diseñada a partir de la cadena pesada A2-25C de SEQ ID NO: 10 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 19 (lisina) con arginina, aminoácido número 38 (cisteína) con arginina, aminoácido número 42 (treonina) con glicina, aminoácido número 63 (treonina) con serina, aminoácido número 75 (alanina) con serina, aminoácido número 84 (ácido aspártico) con asparagina, aminoácido número 88 (serina) con alanina, y aminoácido número 113 (metionina) con leucina se designó como “cadena pesada de tipo hA2-25C-H4”.
[0822] La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hA2-25C-H4 humanizada se describe en SEQ ID NO: 123 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 138 a 467 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 se describe en SEQ ID NO: 122 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 412 a 1401 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena pesada y la secuencia de la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 también se describen en la Figura 44.
[0823] 17)-7 Humanización de la cadena ligera A2-25C
[0824] 17)-7-1 Cadena ligera de tipo hA2-25C-L1 humanizada
[0825] Una cadena ligera hA2-25C humanizada diseñada a partir de la cadena ligera A2-25C de SEQ ID NO: 12 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 9 (alanina) con serina, aminoácido número 15 (leucina) con valina, aminoácido número 16 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido número 17 (ácido glutámico) con ácido aspártico, aminoácido número 18 (isoleucina) con arginina, aminoácido número 43 (serina) con alanina, aminoácido número 45 (glutamina) con lisina, aminoácido número 66 (arginina) con glicina, aminoácido número 70 (glutamina) con ácido aspártico, aminoácido número 71 (tirosina) con fenilalanina, aminoácido número 72 (serina) con treonina, aminoácido número 74 (lisina) con treonina, aminoácido número 77 (arginina) con serina, aminoácido número 79 (arginina) con glutamina, aminoácido número 80 (valina) con prolina, aminoácido número 83 (isoleucina) con fenilalanina, aminoácido número 84 (glicina) con alanina, aminoácido número 85 (isoleucina) con treonina, aminoácido número 100 (serina) con glutamina, aminoácido número 104 (leucina) con valina, y aminoácido número 109 (alanina) con treonina se designó como “cadena ligera de tipo hA2-25C-L1”.
[0827] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-25C-L1 humanizada se describe en SEQ ID NO: 125 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 se describe en SEQ ID NO: 124 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 388 a 702 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 también se describen en la Figura 45.
[0829] 17)-7-2 Cadena ligera de tipo hA2-25C-L2 humanizada
[0831] Una cadena ligera hA2-25C humanizada diseñada a partir de la cadena ligera A2-25C de SEQ ID NO: 12 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 9 (alanina) con serina, aminoácido número 15 (leucina) con valina, aminoácido número 16 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido número 17 (ácido glutámico) con ácido aspártico, aminoácido número 18 (isoleucina) con arginina, aminoácido número 43 (serina) con alanina, aminoácido número 45 (glutamina) con lisina, aminoácido número 70 (glutamina) con ácido aspártico, aminoácido número 72 (serina) con treonina, aminoácido número 74 (lisina) con treonina, aminoácido número 77 (arginina) con serina, aminoácido número 79 (arginina) con glutamina, aminoácido número 80 (valina) con prolina, aminoácido número 83 (isoleucina) con fenilalanina, aminoácido número 84 (glicina) con alanina, aminoácido número 85 (isoleucina) con treonina, aminoácido número 100 (serina) con glutamina, aminoácido número 104 (leucina) con valina, y aminoácido número 109 (alanina) con treonina se designó como “cadena ligera de tipo hA2-25C-L2”.
[0833] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-25C-L2 humanizada se describe en SEQ ID NO: 127 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 se describe en SEQ ID NO: 126 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 126, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 388 a 702 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 126 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 también se describen en la Figura 46.
[0835] 17)-7-3 Cadena ligera de tipo hA2-25C-L3 humanizada
[0837] Una cadena ligera hA2-25C humanizada diseñada a partir de la cadena ligera A2-25C de SEQ ID NO: 12 del Listado de secuencias mediante el reemplazo del aminoácido número 9 (alanina) con serina, aminoácido número 15 (leucina) con valina, aminoácido número 16 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido número 17 (ácido glutámico) con ácido aspártico, aminoácido número 18 (isoleucina) con arginina, aminoácido número 45 (glutamina) con lisina, aminoácido número 72 (serina) con treonina, aminoácido número 74 (lisina) con treonina, aminoácido número 77 (arginina) con serina, aminoácido número 79 (arginina) con glutamina, aminoácido número 80 (valina) con prolina, aminoácido número 83 (isoleucina) con fenilalanina, aminoácido número 84 (glicina) con alanina, aminoácido número 85 (isoleucina) con treonina, aminoácido número 104 (leucina) con valina, y aminoácido número 109 (alanina) con treonina se designó como “cadena ligera de tipo hA2-25C-L3”.
[0839] La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hA2-25C-L3 humanizada se describe en SEQ ID NO: 129 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la misma y una secuencia que consiste en los números de aminoácidos 130 a 234 de la misma corresponden a la secuencia señal, la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 se describe en SEQ ID NO: 128 del Listado de Secuencias. Una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128, una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la misma y una secuencia que consiste en los números de nucleótidos 388 a 702 de la misma codifican la secuencia señal, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 también se describen en la Figura 47.
[0840] 17)-8 Diseño de hA2-25C humanizada mediante la combinación de cadena pesada y cadena ligera
[0841] Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-25C-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-25C-L1 humanizada, que se designó como “hA2-25C-H3/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-25C-H3/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-25C-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-25C-L2 humanizada, que se designó como “hA2-25C-H3/L2 humanizado” (a veces también denominado “hA2-25C-H3/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-125C-H3 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-25C-L3 humanizada, que se designó como “hA2-25C-H3/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-25C-H3/L3”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-25C-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-25C-L1 humanizada, que se designó como “hA2-25C-H4/L1 humanizado” (a veces también denominado “hA2-25C-H4/L1”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-25C-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-25C-L2 humanizada, que se designó como “hA2-25C-H4/L2 humanizado” (a veces también denominado “hA2-25C-H4/L2”). Se diseñó un anticuerpo que consiste en la cadena pesada de tipo hA2-25C-H4 humanizada y la cadena ligera de tipo hA2-25C-L3 humanizada, que se designó como “hA2-25C-H4/L3 humanizado” (a veces también denominado “hA2-25C-H4/L3”). Estos anticuerpos diseñados pueden prepararse de acuerdo con el Ejemplo 18 y evaluarse de acuerdo con los Ejemplos 2 y 4.
[0842] <Ejemplo 18>
[0843] Construcción y preparación de vectores para el anticuerpo A2-11E humanizado (IgG1) y el anticuerpo A2-25C humanizado (IgG1)
[0844] 18)-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada A2-11E humanizada
[0845] 18)-1-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-11E-H3 humanizada
[0846] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-11E-H3 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 428 de la secuencia de nucleótidos de hA2-11E-H3 humanizada de SEQ ID NO: 110 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-11E-H3 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-11E-H3”.
[0847] 18)-1-2 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-11E-H4 humanizada
[0848] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-11E-H4 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 428 de la secuencia de nucleótidos de hA2-11E-H4 humanizada de SEQ ID NO: 112 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-11E-H4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-11E-H4”.
[0849] 18)-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera A2-11E humanizada
[0850] 18)-2-1 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-11E-L2 humanizada
[0851] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-11E-L2 humanizada representada por los números de nucleótidos 37 a 399 de la secuencia de nucleótidos de hA2-11E-L2 humanizada de SEQ ID NO: 114 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). El fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable hA2-11E-L2 humanizada se amplificó utilizando el fragmento de ADN sintetizado como un molde, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), y un conjunto de cebadores que se indican a continuación, y se insertó en el sitio de clonación por enzima de restricción BsiWI del vector de expresión de la cadena ligera de anticuerpos quimérica y humanizada pCMA-LK construido en el Ejemplo 5)-1 utilizando el kit de clonación PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de hA2-11E-L2 humanizado. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-11E-L2”. Conjunto de cebadores
[0852] 5'-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3' (CM-LKF; SEQ ID NO: 134)
[0853] 5'-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3' (KCL-Inf-R; SEQ ID NO: 135)
[0854] 18)-2-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-11E-L3 humanizada
[0855] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-11E-L3 humanizada representada por los números de nucleótidos 37 a 399 de la secuencia de nucleótidos de hA2-11E-L3 humanizada de SEQ ID NO: 116 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-11E-L3 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 18)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-11E-L3”.
[0856] 18)-2-3 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-11E-L4 humanizada
[0857] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-11E-L4 humanizada representada por los números de nucleótidos 37 a 339 de la secuencia de nucleótidos de hA2-11E-L4 humanizada de SEQ ID NO: 118 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-11E-L4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 18)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-11E-L4”.
[0858] 18)-3 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada A2-25C humanizada
[0859] 18)-3-1 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-25C-H3 humanizada
[0860] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-25C-H3 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 428 de la secuencia de nucleótidos de hA2-25C-H3 humanizada de SEQ ID NO: 120 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-25C-H3 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-25C-H3”.
[0861] 18)-3-2 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo hA2-25C-H4 humanizada
[0862] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-25C-H4 humanizada representada por los números de nucleótidos 36 a 428 de la secuencia de nucleótidos de hA2-25C-H4 humanizada de SEQ ID NO: 122 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-25C-H4 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 8)-1-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA-G1/hA2-25C-H4”.
[0863] 18)-4 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera A2-25C humanizada
[0864] 18)-4-1 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-25C-L1 humanizada
[0865] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-25C-L1 humanizada representada por los números de nucleótidos 37 a 402 de la secuencia de nucleótidos de hA2-25C-L1 humanizada de SEQ ID NO: 124 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-25C-L1 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 18)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-25C-L1”.
[0866] 18)-4-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-25C-L2 humanizada
[0867] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-25C-L2 humanizada representada por los números de nucleótidos 37 a 402 de la secuencia de nucleótidos de hA2-25C-L2 humanizada de SEQ ID NO: 126 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-25C-L2 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 18)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-25C-L2”.
[0868] 18)-4-3 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de tipo hA2-25C-L3 humanizada
[0869] Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN codificante de la región variable de hA2-25C-L3 humanizada representada por los números de nucleótidos 37 a 402 de la secuencia de nucleótidos de hA2-25C-L3 humanizada de SEQ ID NO: 128 se sintetizó (Servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt). Se construyó un vector de expresión hA2-25C-L3 humanizado de la misma manera que en el Ejemplo 18)-2-1. El vector de expresión obtenido se designó como “pCMA/hA2-25C-L3”.
[0870] 18)-5 Producción a pequeña escala del anticuerpo A2-11E humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-25C humanizado (IgG1)
[0871] Las células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) se subcultivaron y cultivaron de acuerdo con el manual.
[0872] Se diluyeron 1 ×10<7>células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) en fase de crecimiento logarítmico hasta 9,6 mL con medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.), después se inocularon en una botella de almacenamiento cuadrada de 30 mL (Nalgene/Thermo Fisher Scientific Inc.) y se agitaron a 90 rpm a 37°C durante 1 hora en una incubadora con un 8% de CO<2>. Se disolvieron 30 µg de polietilenimina (Polysciences #24765) en 200 µl de Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). A continuación, cada vector de expresión de la cadena ligera (6 µg) y cada vector de expresión de la cadena pesada (4 µg) preparados con NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.) se añadieron a 200 µL de Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Se añadieron 200 µl de la disolución mixta de vector de expresión/Opti-Pro SFM a 200 µl de la disolución mixta de polietilenimina/Opti-Pro SFM, y se agitó suavemente la mezcla, se dejó reposar durante 5 minutos y se añadió a las células FreeStyle 293F. Las células se agitaron a 90 rpm a 37°C durante 7 días en una incubadora con 8% de CO<2>, y el sobrenadante de cultivo obtenido se filtró a través de un filtro Minisart-Plus (Sartorius Japan K.K.) y se utilizó como una muestra para la evaluación.
[0873] El hA2-11E-H3/L2 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-11EH3 construido en el Ejemplo 18)-1-1 y el pCMA/hA2-11E-L2 construido en el Ejemplo 18)-2-1. El hA2-11E-H3/L3 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-11E-H3 construido en el Ejemplo 18)-1-1 y el pCMA/hA2-11E-L3 construido en el Ejemplo 18)-2-2. El hA2-11E-H3/L4 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-11E-H3 construido en el Ejemplo 18)-1-1 y el pCMA/hA2-11E-L4 construido en el Ejemplo 18)-2-3. El hA2-11E-H4/L2 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-11E-H4 construido en el Ejemplo 18)-1-2 y el pCMA/hA2-11E-L2 construido en el Ejemplo 18)-2-1. El hA2-11E-H4/L3 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-11E-H4 construido en el Ejemplo 18)-1-2 y el pCMA/hA2-11E-L3 construido en el Ejemplo 18)-2-2. El hA2-11E-H4/L4 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-11E-H4 construido en el Ejemplo 18)-1-2 y el pCMA/hA2-11E-L4 construido en el Ejemplo 18)-2-3.
[0874] El hA2-25C-H3/L1 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-25C-H3 construido en el Ejemplo 18)-3-1 y el pCMA/hA2-25C-L1 construido en el Ejemplo 18)-4-1. El hA2-25C-H3/L2 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-25C-H3 construido en el Ejemplo 18)-3-1 y el pCMA/hA2-25C-L2 construido en el Ejemplo 18)-4-2. El hA2-25C-H3/L3 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-25C-H3 construido en el Ejemplo 18)-3-1 y el pCMA/hA2-25C-L3 construido en el Ejemplo 18)-4-3. El hA2-25C-H4/L1 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-25C-H4 construido en el Ejemplo 18)-3-2 y el pCMA/hA2-25C-L1 construido en el Ejemplo 18)-4-1. El hA2-25C-H4/L2 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-25C-H4 construido en el Ejemplo 18)-3-2 y el pCMA/hA2-25C-L2 construido en el Ejemplo 18)-4-2. El hA2-25C-H4/L3 humanizado se obtuvo mediante la combinación del pCMA-G1/hA2-25C-H4 construido en el Ejemplo 18)-3-2 y el pCMA/hA2-25C-L3 construido en el Ejemplo 18)-4-3.<Ejemplo 19>
[0875] Evaluación de la actividadin vitrodel anticuerpo A2-11E humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-25C humanizado (IgG1)
[0876] 19)-1 Evaluación de los anticuerpos en ensayo de diferenciación de osteoblastos inducida por BMP
[0877] Los anticuerpos A2-11E humanizados (IgG1) y los anticuerpos A2-25C humanizados (IgG1) preparados en el Ejemplo 18)-5 se analizaron en cuanto a su actividad inhibidora contra las señales intracelulares a través de ALK2 endógena, con base en sus efectos sobre el ensayo de diferenciación de osteoblastos inducido por BMP utilizando células C2C12 de la misma manera que en el Ejemplo 6)-2. Se utilizaron 2,5 ng/mL de GDF2BMP9 (fabricado por R&D Systems, Inc.) en la inducción de la diferenciación.
[0878] Los resultados se muestran en la Figura 48. Se confirmó que los anticuerpos humanizados A2-11E (IgG1) y los anticuerpos humanizados A2-25C (IgG1) inhiben, de forma dependiente de la dosis, la diferenciación de las células C2C12 en células similares a los osteoblastos inducida por BMP.
[0879] <Ejemplo 20>
[0880] Evaluación de la actividad de unión del anticuerpo A2-11E humanizado (IgG1) y del anticuerpo A2-25C humanizado (IgG1) contra la ALK2 humana
[0881] Las constantes de disociación de los anticuerpos A2-11E humanizados (IgG1) y los anticuerpos A2-25C humanizados (IgG1) preparados en el Ejemplo 18)-5 para el antígeno (dominio extracelular ALK2 humano preparado en el Ejemplo 14)-1) se midieron utilizando Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) mediante el método de captura, que consiste en capturar cada anticuerpo como un ligando en un anticuerpo IgG (Fc) antihumano inmovilizado y ensayar el antígeno como un analito. Aproximadamente 1000 RU del anticuerpo IgG (Fc) anti-humano (kit de captura de anticuerpos humanos, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) se unieron covalentemente a un chip sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) mediante el método de acoplamiento con aminas. Del mismo modo, este anticuerpo se inmovilizó en una célula de referencia. La disolución amortiguadora de funcionamiento utilizado fue HBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, y 0,05% de tensoactivo P20). El sobrenadante del cultivo que contenía el anticuerpo se añadió sobre el chip inmovilizado con anticuerpos IgG (Fc) anti-humanos durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se añadieron al mismo disoluciones diluidas en serie (de 0,78 a 200 nM) del antígeno a una tasa de flujo de 30 µl/min durante 300 segundos. Posteriormente, se controló la fase de disociación durante 600 segundos. Se le añadió 3 MgClz como una disolución regeneradora a una tasa de flujo de 10 µl/min durante 30 segundos. Los datos se analizaron utilizando modelos de unión 1:1 de software analítico (software BIAevaluation, versión 1,0) para calcular una constante de velocidad de asociación ka, una constante de velocidad de disociación kd y una constante de disociación (KD; KD = kd/ka).
[0882] Los resultados se muestran en la Tabla 3.
[0883] Tabla 3
[0885]
[0887] <Ejemplo 21>
[0888] Análisis del epítopo del anticuerpo A2-25C
[0889] 21)-1 Preparación del fragmento Fab quimérico humano cA2-25C
[0890] El cA2-25C quimérico humano preparado de la misma manera que en el Ejemplo 5)-8 se escindió en fragmentos Fab y Fc utilizando papaína (Sigma-Aldrich Co. LLC), y estos fragmentos se añadieron a la columna HiTrap Protein A HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). El fragmento Fab recuperado como una fracción de flujo se concentró.
[0891] 21)-2 Cristalización y análisis estructural del fragmento Fab cA2-25C quimérico humano y del complejo ALK2-ECD El complejo proteico del fragmento Fab A2-25C quimérico obtenido en el Ejemplo 21)-1 y el ALK2-ECD preparado de acuerdo con el Ejemplo 14 se concentraron a 3,8 mg/mL y se utilizaron en el ensayo de cristalización empleando el método de difusión de vapor. A 0,5 µl de la disolución de proteína se añadió una cantidad igual de una disolución precipitante (Li<2>SO<4>0,15 M, citrato de Na 0,1 M (pH 3,4), PEG6,000 al 18% (p/v) y etilenglicol al 20% (v/v)), y la disolución resultante se colocó en un recipiente sellado que contenía 50 µl de una disolución precipitante de forma que estas disoluciones no tuvieran contacto entre sí. El recipiente se dejó reposar a 20 °C. Tres días después, se obtuvieron cristales únicos de 0,1 mm × 0,05 mm × 0,02 mm. Los cristales obtenidos se congelaron en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X se recolectaron bajo una corriente de nitrógeno de 95 K utilizando BL41XU de Spring8. La intensidad de difracción se digitalizó a partir de la imagen de difracción obtenida utilizando el software mosflm (CCP4: Proyecto de Colaboración Computacional No. 4) para determinar los factores de la estructura cristalina. Los cristales estaban en el sistema cristalino ortorrómbico con un grupo espacial P2<1>2<1>2<1>y células unitarias de a = 74,49 angstroms, b = 128,05 angstroms y c = 147,73 angstroms. El método de sustitución molecular se realizó utilizando los factores de estructura obtenidos y las coordenadas de la estructura tridimensional del Fab (se utilizó la estructura del anticuerpo determinada por el análisis de la estructura cristalina anterior) para determinar las fases. El software Phaser (CCP4: Proyecto de Colaboración Computacional No. 4) se utilizó en el cálculo. El cristal contenía dos complejos en la unidad asimétrica. El refinamiento de la estructura se realizó con el software Refmac5 (CCP4) y la corrección del modelo con el software coot. Esta operación se realizó repetidamente para obtener un factor R final de 22,4% y un factor R libre de 25,3% con una resolución de 2,1 angstroms. El modelo consiste en dos complejos y contiene los residuos de aminoácidos 1 a 212 de la cadena A2-25C Fab L, los residuos de aminoácidos 1 a 219 de la cadena A2-25C Fab H, los residuos de aminoácidos 12 a 52 y 66 a 88 de ALK2-ECD, y 411 moléculas de agua. Los residuos de aminoácidos determinados de ALK2-ECD situados comúnmente en un radio de 4 angstroms de dos Fab A2-25C son los siguientes: Glu18, Gly19, Leu20, Ile39, Asp41, Gly42, Phe43, His44, Val45, Tyr46, y hr84. El modelo de cinta de todo el complejo se muestra en la Figura 49.
[0892] <Ejemplo 22>
[0893] Evaluación de la actividad inhibidora de A2-27D frente a varios mutantes de ALK2

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una región extracelular de ALK2 e inhibe la transducción de señales BMP mediada por ALK2, en donde
una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; o en donde
una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o la SEQ ID NO: 71, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; o
en donde
una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; o en donde
una secuencia de cadena pesada comprende una región variable que tiene CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde la CDRH1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, la CDRH2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, y la CDRH3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; y una secuencia de cadena ligera comprende una región variable que tiene CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde la CDRL1 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, la CDRL2 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, y la CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
2. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende
(a) una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las siguientes secuencias de aminoácidos:
a1) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
a2) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30;
a3) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105;
a4) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;
a5) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;
a6) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;
a7) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46;
a8) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48;
a9) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107;
a10) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109;
a11) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111;
a12) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113;
a13) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121;
a14) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 137 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123;
a15) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de
aminoácidos a1) a a14);
a16) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos a1) a a14); y
(b) una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las siguientes secuencias de aminoácidos:
b1) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;
b2) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34;
b3) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;
b4) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38;
b5) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50;
b6) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52;
b7) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54;
b8) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56;
b9) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58;
b10) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115;
b11) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117;
b12) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 128 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119;
b13) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125;
b14) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127;
b15) una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129;
b16) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las secuencias de aminoácidos b1) a b15); y
b17) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las secuencias de aminoácidos b1) a b15);
en donde una combinación de una secuencia de aminoácidos en (a) y una secuencia de aminoácidos en (b) se selecciona del grupo que consiste en las combinaciones de: a1) y b1); a1) y b2); a2) y b1); a2) y b2); a2) y b3); a2) y b4); a3) y b3); a4) y b5); y a4) y b6); a4) y b7); a5) y b5); a5) y b6); a5) y b7); a6) y b5); a6) y b6); a6) y b7); a6) y b8); a7) y b7); a7) y b8); a7) y b9); a8) y b8); a9) y b6); a10) y b8); a11) y b10); a11) y b11); a11) y b12); a12) y b10); a12) y b11); a12) y b12); a13) y b13); a13) y b14); a13) y b15); a14) y b13); a14) y b14); y a14) y b15).
3. El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 142 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 133 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o
en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 472 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 468 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 238 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o
en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de
región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que consiste en los números de aminoácidos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que consiste en los números de aminoácidos 21 a 129 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o
en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o en donde el anticuerpo es un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o un anticuerpo que consiste en cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 20 a 470 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en los números de aminoácidos 21 a 234 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
4. El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es scFv, o en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fab' y Fv.
5. El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, o en donde el anticuerpo está humanizado.
6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cadena pesada comprende una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina G1 humana, una cadena pesada de inmunoglobulina G2 humana o una cadena pesada de inmunoglobulina G4 humana, y la cadena ligera comprende una región constante de una cadena ligera κ de inmunoglobulina humana.
7. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que comprende una cadena pesada en la que se delecionan de uno a varios aminoácidos carboxiloterminales.
8. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la osificación ectópica, la anemia o el glioma pontino intrínseco difuso (DIPG).
10. Al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, para su administración simultánea o separada con al menos un fármaco seleccionado del grupo que consiste en antiinflamatorios, esteroides, bifosfonatos, relajantes musculares y agonistas del receptor de ácido retinoico (RAR)
γ, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la osificación ectópica.
11. El al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno o la al menos una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde la osificación ectópica es fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), heteroplasia ósea progresiva (POH), osificación ectópica traumática u osificación ectópica tras artroplastia con implante, preferiblemente en donde la osificación ectópica es fibrodisplasia osificante progresiva (FOP).
12. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende
(a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: a1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27;
a2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29;
a3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 426 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 104;
a4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39;
a5) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41;
a6) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43;
a7) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45;
a8) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47;
a9) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 106;
a10) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 420 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 108;
a11) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 110;
a12) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 112;
a13) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 120;
a14) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 58 a 411 de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122;
a15) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a14);
a16) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a14);
a17) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a1) a a14); y
(b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos: b1) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31;
b2) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33;
b3) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35;
b4) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 424 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37;
b5) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49;
b6) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 51;
b7) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 53;
b8) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 55;
b9) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 86 a 412 de la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 57;
b10) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 114;
b11) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116;
b12) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 384 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118;
b13) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124;
b14) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 126;
b15) una secuencia de nucleótidos que consiste en los números de nucleótidos 61 a 387 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128;
b16) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b15);
b17) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de las secuencias de nucleótidos b1) a b15); y
b18) una secuencia de nucleótidos transportada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos b1) a b15); en donde una combinación de una secuencia de polinucleótidos en (a) y una secuencia de polinucleótidos en (b) se selecciona del grupo que consiste en las combinaciones de: a1) y b1); a1) y b2); a2) y b1); a2) y b2); a2) y b3); a2) y b4); a3) y b3); a4) y b5); y a4) y b6); a4) y b7); a5) y b5); a5) y b6); a5) y b7); a6) y b5); a6) y b6); a6) y b7); a6) y b8); a7) y b7); a7) y b8); a7) y b9); a8) y b8); a9) y b6); a10) y b8); a11) y b10); a11) y b11); a11) y b12); a12) y b10); a12) y b11); a12) y b12); a13) y b13); a13) y b14); a13) y b15); a14) y b13); a14) y b14); y a14) y b15).
14. Un vector que comprende cualquier polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13.
15. Una célula hospedera transformada que comprende cualquier polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13, o un vector de acuerdo con la reivindicación 14.
16. Un método para producir un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende el paso de cultivar una célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 15 y purificar el anticuerpo monoclonal a partir del producto del cultivo.
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