ES3059720T3

ES3059720T3 - Regulation of gene expression through aptamer-modulated polyadenylation

Info

Publication number: ES3059720T3
Application number: ES17748182T
Authority: ES
Inventors: Michael Volles; Olivier Danos; Xuecui Guo
Original assignee: Meiragtx Gene Regulation Ltd
Current assignee: Meiragtx Gene Regulation Ltd
Priority date: 2016-02-02
Filing date: 2017-02-02
Publication date: 2026-03-23
Anticipated expiration: 2037-02-02
Also published as: IL260840A; JP7184649B2; US20240191239A1; EP3411081A1; EP3411081A4; US11697815B2; IL260840B2; WO2017136591A1; US12559757B2; AU2017213835A1; CN109511259A; AU2017213835C1; EP3411081C0; KR20180117630A; EP3411081B1; MY197192A; CA3048620A1; EA201891721A1; PH12018501650B1; PH12018501650A1

Abstract

La invención proporciona construcciones de polinucleótidos para la regulación de la expresión génica mediante la modulación, basada en aptámeros, de la supresión de la poliadenilación mediada por la ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 (snRNP), así como métodos para utilizar dichas construcciones con el fin de regular la expresión génica en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se une al aptámero. La construcción de polinucleótido contiene un sitio de unión a U1 en el contexto de un riboswitch que comprende una región efectora y un aptámero, de manera que cuando el aptámero se une a un ligando, se produce la expresión del gen diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Regulación de la expresión génica a través de poliadenilación modulada por aptámero

[0003] Campo de la invención

[0004] La invención proporciona constructos polinucleótidos para la regulación de la expresión génica mediante la modulación basada en aptámeros de la supresión mediada por snRNP U1 de la poliadenilación y métodos para utilización de los constructos para regular la expresión génica en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se une al aptámero. El constructo polinucleótido contiene un sitio de unión a U1 en el contexto de un interruptor ribosómico que comprende una región efectora y un aptámero, de modo que cuando el aptámero se une a un ligando, ocurre la expresión del gen diana.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Los ARN mensajero (ARNm) en células eucarióticas se producen a partir de transcritos de pre-ARNm mediante un procesamiento postranscripcional extenso, que incluye la adición de caperuza al extremo 5', la eliminación de intrones mediante corte y empalme, y el corte y poliadenilación del extremo 3’. El corte y empalme es llevado a cabo por un espliceosoma, un gran complejo de ARN-proteína que comprende predominantemente ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, por sus siglas en inglés). El espliceosoma predominante (tipo U2) contiene los snRNP U1, U2, U4, U6 y U5, mientras que un espliceosoma tipo U12, mucho menos abundante, comprende los snRNP UH, U12, U4atac, U6atac y U5.

[0007] El extremo 3' de prácticamente todos los ARNm eucarióticos comprende una cola poli(A): un homopolímero de 20 a 250 residuos de adenosina. La cola poli(A) se añade al pre-ARNm en el núcleo mediante escisión y poliadenilación, un proceso catalizado por un gran complejo de proteínas. En vertebrados, la adición de una cola poli(A) depende de dos elementos de ARN de acción en cis, la secuencia de poliadenilación AAUAAA altamente conservada, que se encuentra cadena arriba del sitio de poliadenilación y un elemento rico en GU poco conservado que se encuentra cadena abajo. La adición de una cola poli(A) al ARNm lo protege de la degradación, entre otras funciones.

[0008] Se ha demostrado que el snRNP U1 presenta una función independiente del corte y empalme en el procesamiento del preARNm al suprimir el procesamiento del extremo 3' del pre-ARNm, inhibir la señal de poliadenilación intrónica aberrante y garantizar la direccionalidad del promotor. Por ejemplo, Fortes et al. (PNAS, 100:8264-69), han introducido de uno a tres sitios de unión de U1 en la UTR 3’, lo que lleva a una reducción en la expresión del gen informador. Weigand JE y Suess B (Nucleic Acids Research (2007) vol. 35, n.º 12, p. 4179-4185) describen un sistema de expresión génica condicional in vivo, que utiliza la inhibición mediada por un aptámero de tetraciclina del corte y empalme del pre-ARNm, de tal manera que la adición de tetraciclina reduce la expresión de un gen informador. Weigand y Suess informaron de que se conseguía una regulación eficiente cuando el aptámero se insertaba en proximidad al sitio de corte y empalme a la secuencia de consenso del sitio de corte y empalme que se localiza dentro del tallo del aptámero. Este interruptor ribosómico basado en el corte y empalme también se da a conocer en Berens et al., Biotechnology Journal (2015) vol.10, n.º 2, p.246-257; Groher et al., Biochimica et biophysica acta (2014) vol.

[0009] 1839, n.º 10, p.964-973; Wittmann A. et al., FEBS Letters (2012) vol.586, n.º 15, p.2076-2083.

[0010] El documento US2009/170793 da a conocer interruptores ribosómicos, insertados en la región del sitio de corte y empalme 3', la región del sitio de corte y empalme 5', o la secuencia de punto de ramificación de un intrón en un gen diana, que modulan el corte y empalme del preARNm en respuesta a un ligando de aptámero.

[0011] El documento WO 2008/121963 da a conocer una molécula de ácido nucleico útil para inhibir la expresión de un gen de interés, que comprende un dominio de hibridación operablemente ligado a por lo menos un dominio efector, en donde el dominio de hibridación se hibrida con el pre-ARNm del gen de interés y en donde el dominio efector se hibrida con el snRNA U1 de la snRNP U1.

[0012] El documento WO 2014/008474 da a conocer un método para modular la expresión de un gen en una célula, en donde el método comprende poner en contacto una célula con un agente que regula uno o más snRNP U1 (U1) o el nivel de U1.

[0013] El documento WO 2016/126747 da a conocer una plataforma y métodos de utilización de la plataforma para la regulación de la expresión de un gen diana utilizando la exposición a un ligando de aptámero para controlar el corte y empalme de un exón alternativo.

[0014] El documento WO 2018/025085 da a conocer métodos de cribado para identificar un aptámero que se une a un ligando, o un ligando que se une a un aptámero, que utiliza un casete de polinucleótido para la regulación de la expresión de un gen informador, en donde el casete de polinucleótido contiene un interruptor ribosómico en el contexto de un intrón 5'-exón alternativo-intrón 3', en donde el interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero de tal manera que cuando el aptámero se une a un ligando, se produce la expresión del gen informador.

[0015] Descripción resumida de la invención

[0016] En un aspecto, la presente invención proporciona un constructo de ADN recombinante para la regulación de la expresión de un gen diana que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende la secuencia codificante del gen diana y una región no traducida (UTR, por sus siglas en inglés) 3' y un interruptor ribosómico, en donde el interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende un U1, en el que el interruptor ribosómico se encuentra en la UTR 3' del gen diana en el lado 5' del sitio de unión de la señal de poliadenilación en la snRNP y una secuencia complementaria al sitio de unión de la snRNP U1. En una realización, el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

[0017] En una realización, la secuencia efectora comprende, además del sitio de unión de la snRNP U1 y la secuencia complementaria al sitio de unión de la snRNP U1, una secuencia adicional que es capaz de formar un tallo cuando el aptámero se une al ligando. En una realización, la región efectora comprende una secuencia formadora de tallo que presenta de 9 a 11 pares de bases. En una realización, la región efectora comprende, además, una secuencia formadora de tallo con una o más bases desapareadas en el tallo.

[0018] En una realización, el sitio de unión de snRNP U1 es de 8 a 10 nucleótidos. En una realización, el sitio de unión de snRNP U1 comprende la secuencia CAGGTAAG. En una realización, el sitio de unión de la snRNP U1 se selecciona del grupo que consiste en CAGGTAAGTA, CAGGTAAGT y CAGGTAAG.

[0019] En una realización, el casete de polinucleótido comprende dos o más interruptores ribosómicos situados en la UTR 3' del gen diana en el lado 5’ de la señal de poliadenilación, en donde cada interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende un sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1. En una realización, los dos o más interruptores ribosómicos comprenden cada uno un aptámero que se une al mismo ligando. En una realización, los dos o más interruptores ribosómicos comprenden diferentes aptámeros que se unen a diferentes ligandos.

[0020] En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para modular la expresión de un gen diana, que comprende:

[0021] (a) insertar uno o más de los casetes de polinucleótido en la UTR 3’ de un gen diana, en donde el casete de polinucleótido comprende un interruptor ribosómico, en donde el interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende el sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1,

[0022] (b) introducir el gen diana que comprende el casete de polinucleótido en una célula, y

[0023] (c) exponer la célula a un ligando que se une específicamente al aptámero en una cantidad eficaz para incrementar la expresión del gen diana.

[0024] En una realización, el ligando es una molécula pequeña.

[0025] En una realización, la región efectora comprende una secuencia adicional que es capaz de formar un tallo cuando el aptámero se une al ligando.

[0026] En una realización, la región efectora comprende una secuencia formadora de tallo que presenta de 9 a 11 pares de bases, opcionalmente que comprende, además, una secuencia formadora de tallo con una o más bases desapareadas en el tallo.

[0027] En una realización, el casete de polinucleótido se inserta a aproximadamente 87 y/o a aproximadamente 140 nucleótidos en el lado 5' de la señal de poliadenilación. En una realización, el casete de polinucleótido se inserta en uno o más de aproximadamente 74, aproximadamente 110 o aproximadamente 149 nucleótidos en el lado 5' de la señal de poliadenilación.

[0028] En una realización, dos o más de los casetes de polinucleótido se insertan en la UTR 3' del gen diana. En una realización, los dos o más casetes de polinucleótido comprenden diferentes aptámeros que se unen específicamente a diferentes ligandos de molécula pequeña. En una realización, los dos o más casetes de polinucleótido comprenden el mismo aptámero. En una realización, los dos o más casetes de polinucleótido se insertan en diferentes localizaciones de la UTR 3’ del gen diana.

[0029] En algunas realizaciones, el gen diana que comprende el casete de polinucleótido se incorpora en un vector para la expresión del gen diana. En una realización, el vector es un vector vírico. En una realización, el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector de virus adenoasociado y vector lentivírico.

[0030] En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido proporcionado en la presente memoria. En una realización, el vector es un vector vírico. En una realización, el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector de virus adenoasociado y vector lentivírico.

[0031] Breve descripción de las figuras

[0032] Figuras 1a-1b. El sitio de unión de U1 en la UTR 3' suprime la expresión del gen diana (luciferasa).

[0033] Figura 1a. Esquemas para la inserción de la secuencia de unión de U1 en la 3' UTR en diferentes posiciones del vector pRL-SV40. Se enumeran las secuencias de unión de consenso de U1 de tipo salvaje y mutante.

[0034] Figura 1b. Resultados del ensayo de luciferasa de Renilla. Las células HEK 293 fueron transfectadas con los constructos indicados que contienen en diversas posiciones en la UTR 3' ya sea la secuencia de unión de consenso de U1 o la secuencia mutante. Los resultados se expresaron como media±DE (n=3), y el factor de reducción se calculó como la razón entre la actividad de luciferasa del constructo mutante y la actividad de luciferasa del constructo de tipo salvaje.

[0035] Figuras 2a-2b. Efecto de la longitud de la secuencia de unión de U1 en la UTR 3’ sobre la supresión de la expresión génica.

[0036] Figura 2a. La longitud completa y las secuencias truncadas de los sitios de unión de U1 insertadas en la posición -87 en la UTR 3’.

[0037] Figura 2b. Las células HEK 293 fueron transfectadas con los constructos indicados que contenían secuencias de unión de U1 de longitud completa o truncadas insertadas en -87 y se determinó la actividad de luciferasa.

[0038] Figuras 3a-3b. El efecto de la estructura de tallo-bucle en el sitio de U1 en la UTR 3’ sobre la expresión génica. Figura 3a. La secuencia de la estructura de tallo-bucle que incluía el sitio de unión de U1 en el tallo. Se realizaron mutaciones para generar un tallo roto (mostrado a la derecha).

[0039] Figura 3b. Los resultados del ensayo de actividad de luciferasa indican que la estructura de tallo-bucle que secuestra el sitio de unión de U1 eliminó completamente el efecto supresor de la interferencia de U1 sobre la expresión génica.

[0040] Figuras 4a-4c. Utilización de un aptámero de teofilina para regular la interferencia de U1 en la UTR 3’ de un gen diana.

[0041] Figura 4a. Los esquemas que muestran la interferencia de U1 modulada por aptámero en la UTR 3' y la expresión génica. En ausencia del ligando de aptámero (panel superior), un sitio de U1 insertado en la UTR 3’ está disponible para la unión de snRNP U1 y la interferencia de poliadenilación mediada por U1, suprimiendo de esta manera la expresión del gen diana. En presencia del ligando de aptámero (panel inferior), la unión de aptámero/ligando conduce a la formación de un tallo que secuestra el sitio de unión de U1 de la unión de la snRNP U1. La interferencia de poladenilación mediada por U1 se anula, lo que resulta en la expresión del gen diana.

[0042] Figura 4b. La secuencia del tallo de la región efectora que secuestra el sitio de unión de U1 y conecta el aptámero de teofilina, generado por truncado en serie del tallo de la horquilla y el tallo inferior del aptámero de teofilina. Se muestran las secuencias de tallo para los constructos U1_theo_1, 8 y 9. Se muestra la teofilina como [symbol]. Figura 4c. Las células HEK 293 se transfectaron con los constructos indicados y se trataron con o sin teofilina 3 mM. La inducción se calculó como la razón entre el valor de la actividad de luciferasa obtenida de las células tratadas con teofilina y la actividad de luciferasa obtenida de células no tratadas.

[0043] Figuras 5a-5c. Optimización de la secuencia del tallo de la región efectora para mejorar la regulabilidad de la accesibilidad del sitio de U1.

[0044] Figura 5a. Las secuencias de tallo U1_theo_8 y U1_theo_9, con las mutaciones secuenciales enumeradas junto a los nucleótidos correspondientes. Las mutaciones secuenciales crean un desapareamiento en el tallo de la región efectora.

[0045] Figura 5b. Se generó un total de nueve constructos mediante la mutación secuencial de U1_theo 8 y se transfectaron en células HEK 293. Las células transfectadas se trataron con o sin teofilina 3 mM y se midió la actividad de luciferasa. Los resultados se expresaron como medias±DE, y el factor de inducción se indica para el constructo U1_theo_8 a

[0046] Figura 5c. Se generó un total de ocho constructos mediante la mutación secuencial de U1_theo 9 y se transfectó cada uno en células HEK 293. Las células transfectadas se trataron con o sin teofilina 3 mM y se midió la actividad de luciferasa. Los resultados se expresan como medias±errores estándar (EE)

[0047] Figuras 6a-6b. Efecto de múltiples interruptores ribosómicos U1_theo en la UTR 3' sobre la regulación de la expresión del gen diana.

[0048] Figura 6a. Un esquema que muestra las cuatro copias de U1_theo 8_1 en la UTR 3' del gen diana (luciferasa). Figura 6b. Las células HEK 293 se transfectaron con los constructos indicados y se trataron con teofilina a diferentes concentraciones. Cuatro copias de U1_theo_8_1 en la UTR 3' produjeron una inducción de 4.3 veces de la actividad de luciferasa a una concentración de 6 mM.

[0049] Figuras 7a-7c. Utilización de un aptámero de guanina para modular la interferencia de U1.

[0050] Figura 7a. Esquema que indica la secuencia U1_Gua en diferentes posiciones en la UTR 3’ que contiene la señal de poli(A) temprana del SV40.

[0051] Figura 7b. Esquema que muestra la secuencia del tallo de la región efectora en el interruptor U1 _Gua que secuestra el sitio de U1 (en presencia del ligando de guanina) y conecta el aptámero de guanina. La guanina se muestra como s.

[0052] Figura 7c. El aptámero de guanosina regula la interferencia de U1 con poliadenilación en respuesta al tratamiento con guanina. Las células HEK 293 se transfectaron con los constructos indicados.

[0053] Se utilizaron constructos que contenían el sitio mutante de U1 y su secuencia complementaria como control. Los resultados se expresaron como medias±DE, se muestran los factores de inducción para cada constructo.

[0054] Figura 8. El interruptor ribosómico U1_Gua funciona en el contexto de la secuencia poliA de la beta globina humana.

[0055] Descripción detallada de la invención

[0056] La invención proporciona constructos de ADN recombinante tal como se definen en las reivindicaciones para la regulación de la expresión génica mediante la modulación basada en aptámeros de la supresión mediada por snRNP U1 de la poliadenilación y métodos para utilización de los constructos para regular la expresión génica en respuesta a la presencia o ausencia de un ligando que se une al aptámero. El constructo de ADN recombinante contiene por lo menos un interruptor ribosómico que contiene una región efectora y un aptámero. La región efectora contiene un sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1 de tal manera que las dos secuencias son capaces de formar un tallo que aísla el sitio de unión de snRNP U1, evitando de esta manera la unión de la snRNP U1. La región efectora puede contener una secuencia adicional y su complemento de modo que el tallo de la región efectora sea un aptámero más largo que el sitio de unión de la snRNP U1 y su secuencia complementaria. El aptámero comprende una secuencia de ARN que se une a un ligando y, en respuesta a esta unión, altera la conformación de la región efectora. Cuando el ligando del aptámero no está presente, la región efectora no forma un tallo. El sitio de unión de la snRNP U1 está disponible y está unido por una snRNP U1, lo que inhibe la poliadenilación del ARNm. Cuando el ligando del aptámero está presente, se une al aptámero, causando que la región efectora forme un tallo, lo que impide que la snRNP U1 se una al sitio de unión de U1. La snRNP U1 no es atraída a la UTR 3’ del ARNm del gen diana y se produce la poliadenilación del mensaje.

[0057] El casete de polinucleótido de regulación génica se refiere a un constructo de ADN recombinante que, cuando se inserta en el ADN de un gen diana en la UTR 3’ en el lado 5’ de la señal de poliadenilación, proporciona la capacidad de regular la expresión del gen diana mediante la supresión mediada por aptámero/ligando de la poliadenilación por la snRNP U1. Tal como se utiliza en la presente memoria, un casete o constructo de polinucleótido es un ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN) que comprende elementos derivados de diferentes fuentes (p. ej., de diferentes organismos, diferentes genes del mismo organismo, y similares). El casete de polinucleótido comprende un interruptor ribosómico. El interruptor ribosómico en el contexto de la presente invención contiene una región sensora (es decir, un aptámero) y una región efectora que juntas son responsables de detectar la presencia de un ligando que se une a la región sensora y altera la conformación de la región efectora que contiene un sitio de unión a snRNP U1 y una secuencia que es complementaria al sitio de unión a la snRNP U1. La expresión del gen diana puede incrementarse cuando el ligando del aptámero está presente y reducirse cuando el ligando está ausente.

[0058] Interruptor ribosómico

[0059] La expresión «interruptor ribosómico», tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento regulador de un polinucleótido de ARN. Un interruptor ribosómico en el contexto de la presente invención contiene una región sensora (es decir, un aptámero) y una región efectora que juntas son responsables de detectar la presencia de un ligando (p. ej., una molécula pequeña) y modular la accesibilidad de la unión de la snRNP U1 situada en la región efectora. El interruptor ribosómico puede ser recombinante, utilizando polinucleótidos de dos o más fuentes. El término «sintético» tal como se utiliza en este contexto de un interruptor ribosómico se refiere a un interruptor ribosómico que no ocurre de forma natural. Las regiones sensora y efectora pueden estar unidas por un conector polinucleotídico. El conector polinucleotídico puede formar un tallo de ARN (es decir, una región del polinucleótido de ARN que es de doble cadena).

[0060] Región efectora

[0061] La región efectora del interruptor ribosómico comprende una secuencia de ARN que, en respuesta a la unión del ligando al sensor (es decir, un aptámero), forma una estructura de tallo (una región de doble cadena) que reduce la accesibilidad de un sitio de unión de la snRNP U1 a la snRNP U1. La región efectora comprende un sitio de unión a snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1. Cuando el aptámero se une a su ligando, la región efectora forma un tallo y de esta manera secuestra el sitio de unión de snRNP U1, impidiendo la unión de la snRNP U1. Bajo determinadas condiciones (por ejemplo, cuando el aptámero no está unido a su ligando), la región efectora se encuentra en un contexto que proporciona acceso al sitio de unión de snRNP U1, permitiendo que la snRNP U1 se una al ARNm e inhiba la poliadenilación, lo que lleva a la degradación del mensaje.

[0062] El sitio de unión de snRNP U1 puede ser cualquier secuencia polinucleotídica que sea capaz de unirse al snRNP U1, atrayendo de esta manera la snRNP U1 a la UTR 3’ de un gen diana y suprimiendo la poliadenilación del mensaje del gen diana. El sitio de unión de la snRNP U1 (también denominado en la presente memoria «sitio de unión de U1» o «sitio de U1») puede ser el sitio de consenso CAGGTAAGTA (CAGGUAAGUA cuando se encuentra en el ARNm). El sitio de unión de la snRNP U1 puede ser una variación de esta secuencia de consenso, incluyendo, por ejemplo, secuencias que son más cortas o que presentan uno o más nucleótidos cambiados respecto a la secuencia de consenso. El sitio de unión de la snRNP U1 puede contener la secuencia CAGGTAAG. En algunas realizaciones, el sitio de unión está codificado por la secuencia seleccionada de entre CAGGTAAGTA, CAGGTAAGT y CAGGTAAG. El sitio de unión de la snRNP U1 puede ser cualquier sitio de corte y empalme 5' de un gen, p. ej., el sitio de corte y empalme 5' del exón 2 del gen DHFR humano (ver los Ejemplos 7 y 8).

[0063] La porción del tallo de la región efectora debe presentar una longitud (y contenido de GC) suficiente para inhibir la unión de snRNP U1 al sitio de unión de snRNP U1 tras la unión del ligando al aptámero, al mismo tiempo que permite el acceso al sitio de unión de snRNP U1 cuando el ligando no está presente en cantidades suficientes. La porción del tallo de la región efectora puede comprender secuencia de tallo además del sitio de unión de snRNP U1 y su secuencia complementaria. Esta secuencia de tallo adicional puede comprender secuencia del tallo del aptámero. La longitud y la secuencia de la porción del tallo pueden modificarse utilizando técnicas conocidas con el fin de identificar tallos que permitan una expresión de fondo aceptable del gen diana cuando no está presente ningún ligando y niveles de expresión aceptables del gen diana cuando el ligando está presente. Si el tallo es, por ejemplo, excesivamente largo, puede ocultar el acceso al sitio de unión de snRNP U1 en presencia o ausencia del ligando. Si el tallo es excesivamente corto, es posible que no forme un tallo estable capaz de secuestrar el sitio de unión de la snRNP U1, en cuyo caso la snRNP U1 se unirá e inhibirá la poliadenilación del mensaje (lo que lleva a la degradación del ARNm del gen diana) en presencia o ausencia del ligando. La longitud total del tallo de la región efectora puede estar comprendida entre aproximadamente 7 pares de bases y aproximadamente 20 pares de bases. La longitud del tallo puede ser de entre aproximadamente 8 pares de bases y aproximadamente 11 pares de bases. La longitud del tallo puede ser de entre 8 pares de bases y 11 pares de bases. Además de la longitud del tallo, el contenido de pares de bases GC del tallo puede alterarse para modificar la estabilidad del tallo.

[0064] El tallo de la región efectora puede contener uno o más nucleótidos desapareados cuyas bases no se aparean con la porción complementaria del tallo de la región efectora.

[0065] Aptámero/Ligando

[0066] La región de sensor de la presente invención es un aptámero. El término «aptámero» tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleótido de ARN que se une específicamente a un ligando. El término «ligando» se refiere a una molécula que se une específicamente a un aptámero. El ligando puede ser una molécula de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 1.000 daltons), incluyendo, por ejemplo, lípidos, monosacáridos, segundos mensajeros, cofactores, iones metálicos, otros productos naturales y metabolitos, ácidos nucleicos, así como la mayoría de los fármacos terapéuticos. El ligando puede ser un polinucleótido con dos o más bases nucleotídicas. El ligando puede seleccionarse del grupo que consiste en 8-azaguanina, monohidrato de adenosín-5'-monofosfato, anfotericina B, avermectina B1, azatioprina, acetato de clormadinona, mercaptopurina, hidrocloruro de moricizina, N6-metiladenosina, nadida, progesterona, hidrocloruro de promazina, pamoato de pirvinium, sulfaguadina, propionato de testosterona, tioguanosina, tiloxapol y vorinostat.

[0067] Los ligandos de aptámeros también pueden ser componentes endógenos de la célula que se incrementan significativamente bajo condiciones fisiológicas/patológicas específicas, tales como la transformación oncogénica; entre ellos se pueden incluir moléculas de segundo mensajero, tales como GTP o GDP, calcio, ácidos grasos, o ácidos grasos que se metabolizan incorrectamente, tales como 13-HODE en el cáncer de mama (Flaherty, JT et al., Plos One, Vol. 8, e63076, 2013), aminoácidos o metabolitos de aminoácidos, metabolitos en la ruta de la glucólisis que generalmente presentan niveles más altos en células cancerosas o en células normales en enfermedades metabólicas, y moléculas asociadas al cáncer, tales como Ras o la proteína Ras mutante, EGFR mutante en cáncer de pulmón, indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) en muchos tipos de cáncer. Entre los ligandos endógenos se incluyen metabolitos de progesterona en el cáncer de mama, tal como se da a conocer JP Wiebe (Endocrine-Related Cancer (2006) 13:717-738). Entre los ligandos endógenos también se incluyen metabolitos con niveles incrementados que resultan de mutaciones en enzimas metabólicos clave en el cáncer de riñón, tales como lactato, glutatión y quinurenina, tal como se da a conocer en Minton, DR y Nanus, DM (Nature Reviews, Urology, Vol.12, 2005).

[0069] Los aptámeros presentan regiones de unión que son capaces de formar complejos con una molécula diana prevista (es decir, el ligando). La especificidad de la unión se puede definir en términos de las constantes de disociación comparativas (Kd) del aptámero para su ligando en comparación con la constante de disociación del aptámero para moléculas no relacionadas. De esta manera, el ligando es una molécula que se une al aptámero con mayor afinidad que a material no relacionado. Normalmente, la Kd del aptámero con respecto a su ligando será por lo menos unas 10 veces menor que la Kd del aptámero con moléculas no relacionadas. Alternativamente, la Kd puede ser por lo menos aproximadamente 20 veces menor, por lo menos aproximadamente 50 veces menor, por lo menos aproximadamente 100 veces menor, y por lo menos aproximadamente 200 veces menor. Un aptámero normalmente presentará entre aproximadamente 15 y 200 nucleótidos de longitud. Más habitualmente, un aptámero presentará entre aproximadamente 30 y 100 nucleótidos de longitud.

[0071] Los aptámeros que pueden incorporarse como parte del interruptor ribosómico pueden ser aptámeros que ocurren de forma natural, o modificaciones de los mismos, o aptámeros que se diseñan de novo y/o se seleccionan a través de la evolución sistémica de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX, por sus siglas en inglés) u otros métodos de selección. Entre los ejemplos de aptámeros que se unen a ligandos de molécula pequeña se incluyen, aunque sin limitación, teofilina, dopamina, sulforrodamina B, celobiosa, kanamicina A, lividomicina, tobramicina, neomicina B, viomicina, cloranfenicol, estreptomicina, citoquinas, moléculas de superficie celular y metabolitos. Para una revisión de aptámeros que reconocen moléculas pequeñas, ver, p. ej., Famulok, Science 9:324-9 (1999) y McKeague, M. y DeRosa, M.C. J. Nuc. Aci.2012. El aptámero puede ser un polinucleótido complementario.

[0073] Métodos para identificar el aptámero/ligando

[0075] El aptámero puede diseñarse para unirse a un ligando de molécula pequeña en particular. Se dan a conocer métodos para diseñar y seleccionar aptámeros que se unen a ligandos particulares en el documento 62/370.599. Entre otros métodos para el cribado de aptámeros se incluyen, por ejemplo, SELEX. Se dan a conocer métodos para diseñar aptámeros que se unen selectivamente a una molécula pequeña utilizando SELEX en, p. ej., las patentes U.S. n.º 5.475.096, n.º 5.270.163 y Abdullah Ozer, et al. Nuc. Aci.2014. Se describen modificaciones del procedimiento SELEX en las patentes U.S. n.º 5.580.737 y n.º 5.567.588.

[0077] Las técnicas de selección para identificar aptámeros generalmente implican preparar una gran agrupación de moléculas de ADN o ARN de la longitud deseada que contengan una región que esté randomizada o mutagenizada. Por ejemplo, una agrupación de oligonucleótidos para la selección de aptámeros podría contener una región de 20 a 100 nucleótidos aleatorios flanqueada por regiones de secuencia definida que presentan entre 15 y 25 nucleótidos de longitud y resultan útiles para la unión de los cebadores de PCR. La agrupación de oligonucleótidos se amplifica utilizando técnicas estándar de PCR, u otros medios que permitan la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos seleccionados. La agrupación de ADN puede ser transcrito in vitro para producir una agrupación de transcritos de ARN cuando se desea un aptámero de ARN. El grupo de oligonucleótidos de ARN o ADN se somete seguidamente a una selección basada en su capacidad para unirse específicamente al ligando deseado. Entre las técnicas de selección se incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad, aunque se puede utilizar cualquier protocolo que permita la selección de ácidos nucleicos en función de su capacidad para unirse específicamente a otra molécula. Las técnicas de selección para identificar aptámeros que se unen a moléculas pequeñas y que funcionan dentro de una célula pueden involucrar métodos de cribado basados en células. En el caso de la cromatografía de afinidad, los oligonucleótidos se ponen en contacto con el ligando diana que ha sido inmovilizado sobre un sustrato en una columna o sobre perlas magnéticas. El oligonucleótido se selecciona preferentemente para la unión de ligandos en presencia de concentraciones salinas, temperaturas y otras condiciones que imitan las condiciones fisiológicas normales. Los oligonucleótidos en la agrupación que se unen al ligando resultan retenidas en la columna o perla, y las secuencias no unidas se lavan. Los oligonucleótidos que se unen al ligando seguidamente se amplifican (después de transcripción inversa si se utilizaron transcritos de ARN) mediante PCR (generalmente después de la elución). El procedimiento de selección se repite en las secuencias seleccionadas durante un total de aproximadamente tres a diez rondas iterativas del procedimiento de selección. A continuación, los oligonucleótidos resultantes se amplifican, clonan y secuencian utilizando procedimientos estándar para identificar las secuencias de los oligonucleótidos que son capaces de unirse al ligando diana. Una vez que se ha identificado una secuencia de aptámero, el aptámero puede optimizarse adicionalmente mediante la realización de rondas adicionales de selección a partir de una agrupación de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de aptámero mutagenizada.

[0078] La selección de aptámeros in vivo puede utilizarse después de una o más rondas de selección in vitro (p. ej., SELEX). Por ejemplo, Konig, J. et al. (RNA.2007, 13(4):614-622) describen la combinación de SELEX y un sistema de tres híbridos de levadura para la selección in vivo de aptámeros.

[0079] Genes diana

[0080] El casete de regulación génica de la presente invención es una plataforma que puede utilizarse para regular la expresión de cualquier gen diana que se pueda expresar en una célula, tejido u organismo diana. La expresión «gen diana» se refiere a un polinucleótido que se introduce en una célula y es capaz de ser transcrito a ARN y traducido y/o expresado bajo las condiciones apropiadas. Alternativamente, el gen diana es endógeno a la célula diana y el casete de regulación génica de la presente invención se posiciona en el gen diana (por ejemplo, en la UTR 5' o 3' de un gen diana endógeno). Un ejemplo de un gen diana es un polinucleótido codificante de un polipéptido terapéutico. El gen diana puede codificar un ARN, tal como un ARNmi, ARNr, ARN no codificantes pequeños o largos, ARN de horquilla corta (ARNhc) y cualquier otro ARN regulador. El gen diana puede ser exógeno a la célula en la que se va a transcribir el constructo de ADN recombinante. Alternativamente, el gen diana puede ser endógeno a la célula en la que se va a transcribir el constructo de ADN recombinante.

[0081] El gen diana según la presente invención puede ser un gen codificante de una proteína, o una secuencia codificante de un ARN no codificante de proteína. El gen diana puede ser, por ejemplo, un gen codificante de una proteína estructural, un enzima, una proteína de señalización celular, una proteína mitocondrial, una proteína de dedo de zinc, una hormona, una proteína transportadora, un factor de crecimiento, una citoquina, una proteína intracelular, una proteína extracelular, una proteína transmembrana, una proteína citoplasmática, una proteína nuclear, una molécula receptora, una proteína de unión a ARN, una proteína de unión a ADN, un factor de transcripción, maquinaria de traducción, una proteína de canal, una proteína motora, una molécula de adhesión celular, una proteína mitocondrial, un enzima metabólico, una quinasa, una fosfatasa, factores de intercambio, una proteína chaperona y moduladores de cualquiera de los mismos. El gen diana puede codificar eritropoyetina (Epo), hormona de crecimiento humano (hGH), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés), insulina humana, proteína asociada a CRISPR 9 (cas9) o una inmunoglobulina (o porción de la misma), incluyendo, p.ej., un anticuerpo terapéutico.

[0082] Constructos de expresión

[0083] La presente invención contempla la utilización de un vector recombinante para la introducción en células diana de un constructo de ADN recombinante tal como se define en las reivindicaciones codificante de un gen diana y que contiene el casete de regulación génica descrito en la presente memoria. El constructo de ADN recombinante de la presente invención puede incluir elementos adicionales de ADN, incluidos segmentos de ADN que permiten la replicación del ADN en una célula huésped y la expresión del gen diana en esa célula a niveles apropiados. El experto habitual en la materia apreciará que las secuencias de control de la expresión (promotores, intensificadores y similares) se seleccionan basándose en su capacidad para promover la expresión del gen diana en la célula diana. El término «vector» se refiere a un plásmido recombinante, un cromosoma artificial de levadura (YAC, por sus siglas en inglés), minicromosoma, minicírculo de ADN o virus (incluidas las secuencias derivadas de virus) que comprende un polinucleótido que se va a introducir en una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo. En una realización, el vector recombinante es un vector vírico. El vector recombinante puede ser una combinación de múltiples vectores víricos. Los vectores víricos para la expresión mediada por aptámeros de un gen diana en una célula, tejido u organismo diana son conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen vectores adenovíricos (AV), vectores de virus adenoasociados (VAA), vectores retrovíricos y lentivíricos, y vectores de virus del herpes simple de tipo 1 (VHS1).

[0084] Entre los vectores adenovíricos se incluyen, por ejemplo, aquellos basados en el adenovirus humano de tipo 2 y el adenovirus humano de tipo 5 que se han convertido en defectuosos en replicación mediante deleciones en las regiones E1 y E3. El casete transcripcional puede insertarse en la región E1, dando como resultado un vector AV recombinante con deleción de E1/E3. Entre los vectores adenovíricos se incluyen, además, vectores adenovíricos de alta capacidad dependientes de ayudantes (también conocidos como vectores de alta capacidad, o en inglés como «gutless» o «gutted»), que no contienen secuencias de codificación vírica. Estos vectores contienen los elementos de acción en cis necesarios para la replicación y empaquetamiento del ADN vírico, principalmente las secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) y la señal de empaquetamiento (W). Estos genomas de vector AV dependientes de ayudantes presentan el potencial de llevar desde unos pocos cientos de pares de bases hasta aproximadamente 36 kb de ADN foráneo.

[0085] Entre los vectores de virus adenoasociados recombinantes, «VAAr», se incluye cualquier vector derivado de cualquier serotipo de virus adenoasociado, incluyendo, aunque sin limitación, VAA-1, VAA-2, VAA-3, VAA-4, VAA-5, VAA-7 y VAA-8, VAA-9, VAA-10, y similares.

[0086] Los vectores VAAr pueden presentar uno o más de los genes de tipo salvaje del VAA delecionados total o parcialmente, preferentemente los genes Rep y/o Cap, pero conservar secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias funcionales de ITR se conservan para el rescate, replicación, empaquetado e integración cromosómica potencial del genoma de VAA. Las ITR no necesitan ser las secuencias nucleotídicas de tipo salvaje, y pueden ser alteradas (p. ej., mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos) siempre que las secuencias proporcionen rescate funcional, replicación y empaquetado.

[0087] Alternativamente, se pueden utilizar otros sistemas, tales como vectores lentivíricos, en realizaciones de la invención. Los sistemas basados en lentivirus pueden transducir células no proliferativas, así como células en división, lo que los hace útiles para aplicaciones con diana en, por ejemplo, las células no proliferativas del SNC. Los vectores lentivíricos se derivan del virus de la inmunodeficiencia humana y, al igual que ese virus, se integran en el genoma del huésped, proporcionando el potencial para la expresión génica a largo plazo.

[0088] Los polinucleótidos, incluidos los plásmidos, YAC, minicromosomas y minicirculos, que llevan el gen de interés que contiene el casete de regulación génica también se pueden introducir en una célula u organismo mediante sistemas de vector no víricos utilizando, por ejemplo, lípidos catiónicos, polímeros, o ambos como portadores. Los sistemas de polímero de polilisina conjugada (PLL, por sus siglas en inglés) y polímero de polietilenimina (PEI) también se pueden utilizar para introducir el vector en células. Entre otros métodos para introducir el vector en células se incluyen la inyección hidrodinámica y la electroporación, así como la utilización de ultrasonidos, tanto para el cultivo celular como para los organismos. Para una revisión de los sistemas de introducción víricos y no víricos para la introducción de genes, ver Nayerossadat, N. et al. (Adv Biomed Res.2012; 1:27).

[0089] Métodos de modulación de la expresión de un gen diana

[0090] En un aspecto, la presente invención proporciona un método para modular la expresión de un gen diana (p. ej., un gen terapéutico), mediante (a) la inserción del casete de regulación génica de la presente invención en la UTR 3’ de un gen diana, en donde el casete de polinucleótidos comprende un interruptor ribosómico, en donde el interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende un sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1, (b) la introducción del gen diana que comprende específicamente el casete de regulación génica en una célula, y (c) la exposición de la célula a un ligando que se une específicamente al aptámero en una cantidad eficaz para incrementar la expresión del gen diana. En una realización, el ligando es una molécula pequeña La expresión del gen diana en las células diana puede conferir una propiedad deseada a la célula en la que se ha introducido, o alternativamente llevar a un resultado terapéutico deseado.

[0091] En el método de la invención, se inserta uno o más casetes de regulación génica en la región 3’ no traducida del gen diana. Puede insertarse un solo casete de regulación génica en la UTR 3' de un gen diana. Alternativamente, se pueden insertar 2, 3, 4 o más casetes de regulación genética en el gen diana. Se pueden insertar dos casetes de regulación génica en el gen diana. En el caso de que se inserten múltiples casetes de regulación génica en un gen diana, cada uno de ellos puede contener el mismo aptámero de modo que un solo ligando pueda utilizarse para modular la escisión por ribonucleasa de los múltiples casetes y modular de etsa manera la expresión del gen diana. Alternativamente, en el caso de que se inserten múltiples casetes de regulación génica en un gen diana, cada uno de ellos puede contener un aptámero diferente de manera que la exposición a múltiples ligandos de molécula pequeña diferentes module la expresión del gen diana. Se pueden insertar múltiples casetes de regulación génica en un gen diana, cada uno de los cuales contiene diferentes secuencias de sustrato de ribonucleasa. Lo anterior puede resultar útil para reducir la recombinación y mejorar la facilidad de incorporación en vectores víricos.

[0092] Los casetes de polinucleótidos de la presente invención resultan eficaces para modular la expresión del gen diana cuando el casete de polinucleótidos se encuentra en la UTR 3' del gen diana en cualquier localización cadena arriba (5') de la señal de poliadenilación (p. ej., AATAAA). El casete de polinucleótidos también resulta eficaz para modular la expresión del gen diana mediante el bloqueo de la poliadenilación cuando están presentes diferentes secuencias de señal de poli(A), por ejemplo, las señales de poli(A) tempranas y tardías de SV40 (ver, p. ej., los Ejemplos 4 a 6 y 8). Por lo menos un casete de polinucleótido de la presente invención puede insertarse a aproximadamente 87 o a aproximadamente 140 nucleótidos en el lado 5' de la secuencia de poliadenilación. Un casete de polinucleótido de la presente invención puede insertarse en, o en proximidad a, ambas localizaciones. Se puede insertar un casete de polinucleótido en uno o más de aproximadamente 74, aproximadamente 110 o aproximadamente 149 nucleótidos en el lado 5' de la señal de poliadenilación.

[0093] El casete de polinucleótido de la presente invención puede utilizarse en combinación con otros mecanismos para la regulación de la expresión del gen diana. Un casete de polinucleótido de la presente invención puede utilizarse en combinación con un casete de regulación génica que modula la expresión del gen diana mediante la regulación mediada por aptámero del corte y empalme alternativo, tal como se describe en el documento WO 2016/126747. Métodos de tratamiento y composiciones farmacéuticas

[0095] Se da a conocer, aunque no se reivindica en la presente memoria un método para regular el nivel de una proteína terapéutica introducida mediante terapia génica. El «gen diana» puede codificar para la proteína terapéutica. El «gen diana» puede codificar para una proteína que sea endógena o exógena a la célula.

[0096] La secuencia génica terapéutica que contiene el casete regulador con interruptor ribosómico activado por aptámero se introduce en las células diana in vitro o ex vivo, p. ej., mediante un vector. La especificidad celular del «gen diana» puede ser controlada por el promotor u otros elementos dentro del vector. La introducción del constructo de vector que contiene el gen diana y el casete de polinucleótido, y la transfección de los tejidos diana que resulta en la transfección estable del gen diana regulado, es frecuentemente la primera etapa en la producción de la proteína terapéutica. Sin embargo, debido a la presencia del casete regulador dentro de la secuencia génica diana, el gen diana no se expresa a niveles significativos, es decir, está en el «estado apagado» en ausencia del ligando específico que se une al aptámero contenido dentro del interruptor ribosómico del casete regulador. Solo al administrar el ligando específico del aptámero (o que alternativamente está presente en cantidades suficientes) se activa la expresión del gen diana. La introducción del constructo de vector que contiene el gen diana y la introducción del ligando activador generalmente están separados en el tiempo. La introducción del ligando activador controlará cuándo se expresa el gen diana, así como el nivel de expresión de proteína. El ligando puede administrarse por una serie de vías, entre las que se incluyen, aunque sin limitación, las vías oral, intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), intraocular o tópica.

[0097] El momento de administración del ligando dependerá de la necesidad de activación del gen diana. Por ejemplo, si la proteína terapéutica codificada por el gen diana se requiere de forma constante, se puede administrar un ligando de molécula pequeña por vía oral a diario, o múltiples veces al día, para garantizar la activación continua del gen diana y, por lo tanto, la expresión continua de la proteína terapéutica. Si el gen diana presenta un efecto de larga duración, el ligando inductor podría administrarse con menos frecuencia.

[0098] La presente invención permite que la expresión del transgén terapéutico sea controlada temporalmente, de una manera determinada por la dosificación temporal del ligando específico para el aptámero dentro del interruptor ribosómico del casete de polinucleótido regulador. La expresión incrementada del transgén terapéutico solo con la administración del ligando, incrementa la seguridad de un tratamiento de terapia génica al permitir que el gen diana esté desactivado en ausencia del ligando.

[0099] Pueden utilizarse diferentes aptámeros para permitir que diferentes ligandos activen la diana. Cada gen terapéutico que contiene un casete regulador puede presentar un aptámero específico dentro del casete que será activado por una molécula pequeña específica. Lo anterior implica que cada gen terapéutico solo puede ser activado por el ligando específico del aptámero contenido en el gen. En estos casos, cada ligando solo puede activar un gen terapéutico. Lo anterior permite la posibilidad de que se puedan introducir varios «genes diana» diferentes en un individuo y que cada uno se active con la administración del ligando específico para el aptámero contenido dentro del casete regulador que se encuentra en cada gen diana.

[0100] La presente invención permite que cualquier proteína terapéutica cuyo gen pueda administrarse al cuerpo (tal como la eritropoyetina (EPO) o un anticuerpo terapéutico) sea producida por el cuerpo cuando se administra el ligando activador. Este método de administración de proteína terapéutica puede reemplazar la fabricación de tales proteínas terapéuticas fuera del cuerpo, para después inyectarlas o infusionarlas, p. ej., anticuerpos utilizados para el cáncer o para bloquear enfermedades inflamatorias o autoinmunes. El cuerpo que contiene el gen diana regulado se convierte en la fábrica de producción de moléculas biológicas, que se activa cuando se administra el ligando específico del gen. Los niveles de dosificación y el momento de la administración de una proteína terapéutica pueden ser importantes para el efecto terapéutico. Por ejemplo, en la administración de AVASTINA (anticuerpo anti-VEGF) para el cáncer. La presente invención incrementa la facilidad de dosificación en respuesta a la monitorización de los niveles y efectos de proteínas terapéuticas.

[0101] El gen puede codificar para una nucleasa que puede presentar como diana y editar una secuencia de ADN particular. Entre tales nucleasas se incluyen Cas9, las nucleasas que contienen dedos de zinc o las TALEN. En el caso de estas nucleasas, la proteína de la nucleasa puede ser necesaria solo durante un corto período de tiempo que resulte suficiente para editar los genes endógenos diana. Sin embargo, si se administra un gen de nucleasa no regulado al cuerpo, esta proteína puede estar presente durante el resto de la vida de la célula. En el caso de las nucleasas, existe un riesgo creciente de edición no específica (fuera de diana) cuanto más tiempo esté presente la nucleasa. La regulación de la expresión de dichas proteínas presenta una ventaja significativa en cuanto a seguridad. En este caso, se podría administrar un vector que contenga el gen diana de la nucleasa, que contenga un casete regulador, en las células apropiadas en el cuerpo. El gen diana se encuentra en estado «desactivado» en ausencia del ligando específico del casete, por lo que no se produce nada de nucleasa. Solo cuando se administra el ligando activador, se produce la nucleasa. Una vez haya transcurrido el tiempo suficiente que permita realizar las ediciones necesarias, el ligando será retirado y no se administrará de nuevo. De esta manera, el gen de la nucleasa queda en estado «desactivado» y no se produce nucleasa adicional y la edición se detiene. Este enfoque puede utilizarse para corregir afecciones genéticas, incluyendo una serie de retinopatías hereditarias, tales como LCAIO, causadas por mutaciones en CEP290 y la enfermedad de Stargardt, causada por mutaciones en ABCA4.

[0102] La administración de un gen diana regulado que codifica para una proteína terapéutica que se activa únicamente con la administración de un ligando específico puede utilizarse para regular genes terapéuticos para tratar muchos tipos diferentes de enfermedades, p. ej., cáncer con anticuerpos terapéuticos, trastornos inmunitarios con proteínas o anticuerpos inmunomoduladores, enfermedades metabólicas, enfermedades raras, tales como la PNH con anticuerpos anti-C5 o fragmentos de anticuerpos como el gen regulado, o angiogénesis ocular con anticuerpos terapéuticos, y DMAE seca con proteínas inmunomoduladoras.

[0103] Una amplia variedad de genes diana específicos, que permiten el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y afecciones específicas, resultan adecuados para la utilización en la presente invención. Por ejemplo, se puede utilizar insulina o un análogo de insulina (preferentemente insulina humana o un análogo de insulina humana) como el gen diana para tratar la diabetes tipo I, la diabetes tipo II o el síndrome metabólico; puede utilizarse hormona de crecimiento humana como el gen diana para tratar a niños con trastornos del crecimiento o adultos con deficiencia de hormona de crecimiento; la eritropoyetina (preferentemente la eritropoyetina humana) puede utilizarse como el gen diana para tratar la anemia debido a enfermedad renal crónica, anemia debida a mielodisplasia o anemia debida a la quimioterapia del cáncer.

[0104] La presente invención puede resultar especialmente adecuada para tratar enfermedades causadas por defectos de un solo gen, tal como la fibrosis quística, la hemofilia, la distrofia muscular, la talasemia o la anemia de células falciformes. De esta manera, la β, γ, δ o ζ-globina humana puede utilizarse como el gen diana para tratar la β-talasemia o la anemia de células falciformes; el Factor VIII o el Factor IX humano puede utilizarse como el gen diana para tratar la hemofilia A o la hemofilia B.

[0105] Los ligandos utilizados en la presente invención se combinan generalmente con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables para formar composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un paciente. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen solventes, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares, generalmente utilizados en las técnicas farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en forma de tabletas, píldoras, cápsulas, trociscos, y similares, y se formulan para ser compatibles con su vía de administración prevista. Entre los ejemplos de vías de administración se incluyen parenteral, p. ej., intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutánea, oral, inhalación, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal.

[0106] Las composiciones farmacéuticas que comprenden ligandos pueden administrarse a un paciente en un régimen de dosificación de manera que se administre al paciente una cantidad de ligando suficiente para regular de manera deseable el gen diana. En el caso de que el ligando sea una molécula pequeña y la forma de administración sea una tableta, cápsula o similar, preferentemente la composición farmacéutica comprende de 0,1 mg a 10 g de ligando; de 0,5 mg a 5 g de ligando; de 1 mg a 1 g de ligando; de 2 mg a 750 mg de ligando; de 5 mg a 500 mg de ligando; o de 10 mg a 250 mg de ligando.

[0107] Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse una vez al día o múltiples veces al día (p. ej., 2, 3, 4, 5 o más veces al día). Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden dosificadas con menos frecuencia que una vez al día, p. ej., una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, o una vez al mes o una vez cada pocos meses. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un paciente solo un pequeño número de veces, p. ej., una vez, dos veces, tres veces, etc.

[0108] Se da a conocer, aunque no se reivindica en la presente memoria un método para tratar a un paciente que necesita una expresión incrementada de una proteína terapéutica codificada por un gen diana, en donde el método comprende administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende un ligando para un aptámero, en donde previamente se había administrado al paciente un ADN recombinante que comprende el gen diana, en donde el gen diana contiene un casete de regulación génica de la presente invención que proporciona la capacidad de regular la expresión del gen diana por el ligando del aptámero mediante el corte y empalme alternativo de pre-ARNm del gen diana, incrementando de esta manera la expresión de la proteína terapéutica.

[0109] Artículos fabricados y kits

[0110] En la presente memoria también se dan a conocer, aunque no se reivindican, kits o artículos fabricados para la utilización en los métodos descritos en la presente memoria. En aspectos, los kits comprenden las composiciones descritas en la presente memoria (p. ej., para composiciones para la administración de un vector que comprende el gen diana que contenía el casete de regulación génica) en un empaquetamiento adecuado. El embalaje adecuado para composiciones (tales como composiciones oculares para inyección) descritas en la presente memoria se conoce en la técnica e incluye, por ejemplo, viales (tales como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, tarros, envases flexibles (p. ej., bolsas de Mylar o plástico selladas) y similares. Estos artículos de fabricación además pueden esterilizarse y/o sellarse.

[0111] Los kits que comprenden las composiciones descritas en la presente memoria pueden comprender una o más instrucciones sobre los métodos de utilización de la composición, tales como los usos descritos en la presente memoria. Los kits descritos en la presente memoria pueden incluir, además, otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para llevar a cabo la administración, incluyendo, p. ej., cualesquiera métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el kit puede comprender VAAr para la expresión del gen diana que comprende el casete de regulación génica de la presente invención, un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para la inyección, y uno o más de: un tampón, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa y un prospecto con instrucciones para llevar a cabo las inyecciones. El kit puede resultar adecuado para la inyección intraocular, la inyección intramuscular, la inyección intravenosa y similares.

[0112] Los términos «homología» y «homólogo» tal como se utilizan en la presente memoria se refieren al porcentaje de identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia y otra puede determinarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, la homología se puede determinar mediante una comparación directa de dos moléculas de polipéptidos mediante la alineación de la información de la secuencia y utilizando programas informáticos fácilmente disponibles. Dos secuencias de polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos son «sustancialmente homólogas» entre sí cuando, tras alinearse óptimamente con las inserciones o deleciones apropiadas, por lo menos aproximadamente el 80 %, por lo menos aproximadamente el 85 %, por lo menos aproximadamente el 90 % y por lo menos aproximadamente el 95 % de los nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, coinciden a lo largo de una longitud definida de las moléculas, según se determina mediante los métodos anteriormente indicados.

[0113] La expresión «porcentaje de identidad de secuencia» con respecto a una secuencia polipeptídica o de ácido nucleico de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos o nucleótidos en la secuencia polipeptídica o de ácido nucleico de referencia, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencias. La alineación para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos se puede conseguir de maneras conocidas por el experto habitual en la materia, por ejemplo, utilizando programas informáticos disponibles públicamente, incluyendo BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El término «polinucleótido» o «ácido nucleico» tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, dicho término incluye, aunque sin limitación, ADN o ARN de cadena simple, doble o múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases nucleotídicas naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas.

[0114] El término «heterólogo» o «exógeno» se refiere a un derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara o en la que se introduce o incorpora. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un tipo de célula diferente es un polinucleótido heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). De manera similar, una secuencia celular (p. ej., un gen o una porción del mismo) que se incorpora en un vector vírico es una secuencia nucleotídica heteróloga con respecto al vector.

[0115] La tabla a continuación contiene una lista de las secuencias de ADN de los constructos descritos en la presente memoria, así como otras secuencias tal como se describe. El sitio de unión de U1 y su secuencia mutante se muestran en letras minúsculas resaltadas en gris; la estructura de tallo-bucle (TB) se muestra en letras minúsculas subrayadas; las secuencias de aptámeros se muestran en letras minúsculas subrayadas con línea ondulada; la secuencia de señal de poli(A) se muestra en letras minúsculas subrayadas con línea gruesa, y las secuencias codificantes para los genes de luciferasa se muestran en letras mayúsculas.

[0118]

[0119] (continuación)

[0120]

[0121] (continuación)

[0122]

[0123] (continuación)

[0124]

[0125] (continuación)

[0126]

[0127] (continuación)

[0128]

[0129] (continuación)

[0132]

[0134] EJEMPLO 1

[0135] Efectos sobre la expresión de genes diana de localización y número de copia del sitio de unión de U1 en la UTR 3' Procedimiento experimental:

[0136] Constructos de plásmido: se sintetizaron oligonucleótidos (oligos) (IDT) que contenían ya sea la secuencia de unión a U1 de consenso de tipo salvaje o a su secuencia mutante. Los oligos sintetizados se clonaron en la UTR 3’ del vector de expresión de luciferasa pRL-SV40 (Promega) utilizando el kit de clonación Gibson Assembly (NEB). Los constructos se purificaron (Qiagen) y verificaron mediante secuenciación del ADN (Genewiz).

[0137] Transfección: se sembraron 3,5x10<4>células HEK 293 en una placa de 96 pocillos de fondo plano el día anterior a la transfección. Se añadió ADN plasmídico (500 ng) a un tubo o a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Por separado, se añadió el reactivo TranslT-293 (Mirus; 1,4 µl) a 50 µI de medio Opti-mem I (Life Technologies) y se dejó reposar durante cinco minutos a temperatura ambiente («TA»). A continuación, se añadieron 50 µI de este reactivo de transfección diluido al ADN, se mezcló y se incubó a TA durante 20 minutos. Finalmente, se añadieron 7 µI de esta solución a un pocillo de células en la placa de 96 pocillos.

[0138] Ensayo de luciferasa de Renilla de células en cultivo: veinticuatro horas después del cambio de medio, se sacaron las placas del incubador y se equilibraron a TA durante varios minutos en un banco de laboratorio, y se aspiró el medio. Se añadió el tampón Glo-lysis (Promega, 100 µI, TA), y las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante por lo menos cinco minutos. A continuación, se mezcló el contenido de los pocillos mediante trituración de 50 µI y se mezclaron 20 µI de cada pocillo con 20 µI de reactivo Renilla-glo en una placa de 384 pocillos de color blanco sólido. Diez minutos después, se midió la luminiscencia utilizando un aparato Tecan con un tiempo de lectura de 500 ms. La actividad de luciferasa se expresó como la media de unidades relativas de luz (URL) ± DE.

[0139] Resultados:

[0140] Con el fin de construir una plataforma de regulación génica basada en la poliadenilación de U1, se insertó una secuencia de unión a U1 en la UTR 3' de un gen informador diana. La secuencia de consenso de unión a U1 de 10 nucleótidos («nt») (denominada en la presente memoria como «de tipo salvaje», o «wt», por sus siglas en inglés) se introdujo ya sea 87 nt (U1-87) o 140 nt (U1-140) cadena arriba de la secuencia poli(A) AATAAA en la UTR 3’ del gen de luciferasa en el vector pRL-SV40, tal como se muestra en la Figura

[0141] 1b; la inserción de la secuencia mutante de unión a U1 de 10 nt en la posición -87 (mut U1-87) no presentó ningún efecto supresor sobre la expresión del gen de luciferasa en comparación con la expresión del constructo pRL-SV40 no modificado. Sin embargo, la inserción de una secuencia de unión a U1 de tipo salvaje de 10 nt en la posición -87 (U1-87 wt) inhibió el 98 % de la expresión de luciferasa de Renilla en comparación con la actividad de luciferasa del vector de control pRL-SV40. En comparación con el constructo mut U1-87, U1-87 wt generó una reducción de 50 veces de la actividad de luciferasa.

[0142] De manera similar, el sitio de U1 mutante en -140 (U1-140 mut) no causó inhibición de la expresión del gen de luciferasa. Sin embargo, la secuencia de unión a U1 del tipo salvaje en la ubicación -140 (U1-140 wt) resultó en un 91 % de inhibición de la actividad de la luciferasa, generando una inhibición de 12 veces la actividad de la luciferasa en comparación con U1-140 mut.

[0143] También se sometió a ensayo el efecto inhibidor de 2 o 3 copias de la secuencia de unión a U1 insertadas en -140 en la UTR 3'. Tal como se muestra en la Figura 1b, dos copias (2xU1-140 wt) o tres copias (3xU1-140 wt) de la secuencia de unión a U1 tipo salvaje resultaron en una mayor reducción de la actividad de luciferasa que una copia única del sitio U1 en la misma ubicación (U1-140 wt), generando una inhibición de 272 veces y 462 veces, respectivamente, en comparación con sus constructos mutantes correspondientes. Por lo tanto, estos resultados indican que múltiples copias de la secuencia de unión a U1 presentan una función sinérgica en la supresión de la expresión génica.

[0144] EJEMPLO 2

[0145] Efecto de la longitud de la secuencia de unión a U1 sobre la expresión del gen diana en la UTR 3'.

[0146] Procedimientos experimentales: tal como se describen en el Ejemplo 1.

[0147] Resultados:

[0148] Basándose en los resultados descritos en el Ejemplo 1, se caracterizó adicionalmente el efecto supresor de un sitio de unión a U1 insertado 87 nt (U 1-87) cadena arriba de la secuencia de señal de poliadenilación tardía de SV40. Con el fin de determinar la longitud mínima de la secuencia de unión a U1 para reprimir la expresión del gen diana introducido en el 3', se generó una serie de constructos que contenían secuencias truncadas secuencialmente en 3' del sitio de U1, tal como se muestra en la Figura 2a. Tal como se muestra en la Figura 2b, el sitio de U1 de 9 nt (87-9) funcionó tan bien como el sitio de U1 de 10 nt (U1-87). Sin embargo, cuando la secuencia de unión a U1 se acortó a 8 nt, el efecto supresor del sitio de U1 se redujo en cierta medida, resultando en una eficiencia tres veces menor. Cuando la secuencia del sitio de U1 era de 7 nt o menor, el efecto supresor era significativamente menos eficiente. Estos resultados indican que el sitio de unión a U1 insertado 87 nt cadena arriba de la señal poli(A) de SV40 en la UTR 3' es más eficaz para reprimir la expresión del gen diana cuando presenta por lo menos 8 nt de longitud con el fin de reclutar eficientemente la snRNP U1 y suprimir la poliadenilación. Se seleccionó una secuencia de unión a U1 de 9 nt insertada 87 nt cadena arriba de la secuencia de señal poliA tardía de SV40 para una caracterización adicional. EJEMPLO 3

[0149] Efecto de la formación de estructuras secundarias de tallo-bucle en el sitio de U1 en la UTR 3' sobre la expresión génica.

[0150] Procedimiento experimental:

[0151] Se sintetizaron secuencias de tallo-bucle que contenían una secuencia de unión a U1 de 9 nt de tipo salvaje (IDT) y se clonaron en el vector pRL-SV40. Las secuencias de constructo se verificaron mediante secuenciación del ADN (Genewiz). Se transfectaron células HEK 293 y se llevaron a cabo ensayos de luciferasa de Renilla tal como se describe en el Ejemplo 1.

[0152] Resultados:

[0153] Para determinar el efecto de una estructura de horquilla o de tallo-bucle sobre la supresión mediada por el sitio de U1 de la expresión génica, se incluyó el sitio de U1 de 9 nt en una estructura de tallo-bucle (TB). En dicha estructura de tallo-bucle, tal como se muestra en la Figura 3a, el sitio de U1 y su secuencia complementaria forman el tallo. Se creó una secuencia mutante como control en la que no se forma tallo (TB roto). Tal como se muestra en la Figura 3b, la incorporación del sitio de U1 de 9 nt en la estructura de tallo-bucle (U187-9 TB) anuló completamente el efecto supresor del sitio de U1 en la UTR 3', mientras que la secuencia de control que no podía formar una estructura de tallo-bucle (U187-9 TB roto) mostró poco efecto sobre la función supresora del sitio de U1. Estos resultados respaldan que un sitio de U1 incluido en una estructura de tallo-bucle no es accesible para la unión de snRNP U1, por lo tanto, la expresión génica no resulta suprimida mediante supresión de poliadenilación mediada por snRNP U1.

[0154] EJEMPLO 4

[0155] Utilización del aptámero de teofilina para regular la expresión del gen diana mediante la modulación.

[0156] Interferencia de U1 con la poliadenilación

[0157] Procedimientos experimentales:

[0158] Se sintetizaron oligonucleótidos (IDT) que contenían ya sea la longitud completa de las secuencias del tallo de la estructura de tallo-bucle y el aptámero de teofilina o las secuencias truncadas del tallo, y se clonaron (IDT) en el vector pRL-SV40 utilizando el kit de clonación Gibson Assembly (NEB). Las secuencias de constructo se verificaron mediante secuenciación del ADN (Genewiz).

[0159] Transfección y tratamiento de ligando de aptámero: Se transfectaron células HEK 293 tal como se describe en el Ejemplo 1. Cuatro horas después de la transfección, se aspiró el medio, y se añadió un nuevo medio con o sin teofilina 3 mM. Se llevó a cabo un ensayo de luciferasa de Renilla de 20 a 24 horas después del tratamiento con teofilina, tal como se describe en el Ejemplo 1. Se expresó el factor de inducción como el cociente de la actividad de luciferasa obtenida en presencia del ligando de aptámero dividida por el valor obtenido en ausencia del ligando de aptámero. Resultados:

[0160] Con el fin de regular la accesibilidad de un sitio de U1 en la UTR 3' de un gen diana, y regular de esta manera la expresión del gen diana, la secuencia del tallo de la estructura del aptámero se unió directamente al tallo de la estructura de tallo-bucle sometida a ensayo en el Ejemplo 3. En la presente configuración, tal como se ilustra en la Figura 4a, la inserción de la secuencia de aptámero interrumpe la formación de la estructura de tallo, por lo tanto, el sitio de U1 en la UTR 3' es accesible para la unión de snRNP U1. Sin embargo, en presencia de un ligando de aptámero, la unión aptámero/ligando provoca un cambio conformacional en la estructura del ARN, facilitando la formación de tallo y secuestrando el sitio de U1 de la unión de snRNP U1 en la UTR 3'.

[0161] Se sometió a ensayo un aptámero sintético de teofilina en dicha configuración mediante la unión de la secuencia del tallo inferior de la estructura del aptámero de teofilina al tallo de la estructura de tallo-bucle, generando un tallo de 19 pares de bases tal como se muestra en la Figura 4b. Los presentes inventores plantearon que si el tallo era excesivamente largo, la formación del tallo podría ser independiente de la existencia de la secuencia de aptámero y producirse en ausencia del ligando de aptámero. A la inversa, si el tallo era excesivamente corto, incluso en presencia de un ligando de aptámero, no se podría formar una estructura de aptámero estable.

[0162] Por lo tanto, para determinar una longitud óptima del tallo (incluyendo cualquier tallo del aptámero y el tallo que contiene el sitio de unión de U1), se realizaron truncados en serie del tallo, generando nueve constructos con una longitud del tallo comprendida entre 19 y 11 pb. Tal como se muestra en la Figura 4c, con los constructos U1_theo_1 a U1_theo_6, la actividad de luciferasa no resultó significativamente suprimida en comparación con el constructo U1 87-9 en ausencia de teofilina, lo que sugiere el secuestro del sitio de U1 debido a la formación de tallo. Además, no se produjo ningún incremento de la actividad de luciferasa después del tratamiento con teofilina. Sin embargo, en los constructos 8 y 9, la actividad de la luciferasa se incrementó con el tratamiento con teofilina, lo que sugiere que la unión de aptámero/ligando bloquea adicionalmente la accesibilidad del sitio de U1, lo que lleva a una mayor expresión del gen diana.

[0163] EJEMPLO 5

[0164] Optimización de la secuencia del tallo para mejorar la regulabilidad de la accesibilidad de U1 debido a la unión de aptámero/ligando.

[0165] Procedimientos experimentales: tal como se describe en el Ejemplo 4.

[0166] Resultados:

[0167] Los constructos U1_theo_8 y 9 mostraron un pequeño incremento de la actividad de luciferasa con el tratamiento de teofilina. Para potenciar adicionalmente la regulabilidad de la accesibilidad del sitio de U1 cuando el aptámero no está unido al ligando, se debilitó la estructura del tallo mediante mutaciones secuenciales de las bases del tallo, tal como se muestra en la Figura 5a. Sin embargo, esta estrategia no mejoró la inducción de la actividad de luciferasa del constructo U1_theo_9, tal como se muestra en la Figura 5c, pero mejoró la regulabilidad del constructo U1_theo_8. Tal como se muestra en la Figura 5b, en una serie de nueve constructos generados a partir de U1_theo_8, los constructos U1_theo_8_1 a 5 generaron una actividad de luciferasa incrementada después del tratamiento de teofilina en comparación con la actividad de luciferasa en ausencia de ligando de aptámero. El factor de inducción se incrementó al comparar con el factor de inducción del constructo U1_theo_8 (1,3 veces), estando comprendido entre 1,8 y 2,6 veces. Por lo tanto, los presentes inventores construyeron un interruptor ribosómico sintético que regula la interferencia de U1 mediante poliadenilación a través de la unión de aptámero/ligando.

[0168] EJEMPLO 6

[0169] Efectos de múltiples interruptores ribosómicos U1_theo en la regulación de la expresión de genes diana.

[0170] Procedimientos experimentales:

[0171] Se sintetizaron oligos que contenían cuatro copias de la secuencia U1_theo 8_1 en tándem (IDT) y se clonaron utilizando la estrategia y kit de clonación de Gibson (NEB). Se transfectaron células HEK 293 y se llevaron a cabo ensayos de luciferasa de Renilla tal como se describe en el Ejemplo 4.

[0172] Resultados:

[0173] El constructo U1_theo 8-1 generó una inducción de 1,8 veces después del tratamiento con teofilina, debido a un nivel de expresión basal relativamente alto del gen de luciferasa. Con el fin de reducir el nivel basal de expresión del gen diana, se introdujeron cuatro copias de la secuencia U1_theo_8_1 en tándem en la UTR 3', tal como se muestra en la Figura 6a. De hecho, tal como se muestra en la Figura 6b, cuatro copias de U1_theo_8_1 redujeron la expresión del nivel basal en un 83 % en comparación con la copia única de U1_theo_8_1. Con el tratamiento de teofilina, el constructo de cuatro copias incrementó la actividad de luciferasa de manera dependiente de la dosis, generando el 40 % de la actividad de luciferasa del vector de control 87-9 TB y una inducción máxima de 4,3 veces con teofilina 6 mM. Estos resultados indican que múltiples copias del interruptor ribosómico del sitio de U1 en tándem pueden reducir el nivel de expresión basal del gen diana, mejorando la regulabilidad del gen diana. En la configuración del constructo actual, se utilizó la misma secuencia de aptámero en las cuatro copias de los casetes de regulación. Se pueden utilizar diferentes secuencias de aptámeros en cada copia de interruptor ribosómico.

[0174] EJEMPLO 7

[0175] Utilización del aptámero xpt-guanina para regular la expresión de genes diana mediante la modulación de la interferencia de U1.

[0176] Procedimientos experimentales:

[0177] Constructos de plásmido: el gen EGFP en el vector pEGFP-C1 se sustituyó por la secuencia codificante del gen de luciferasa de luciérnaga para generar un vector pFLuc que contenía una secuencia de señal de poliadenilación temprana de SV40. Se sintetizaron oligos que contenían ya sea el sitio de unión de U1 de tipo salvaje o mutante a partir del sitio de corte y empalme 5' del exón 2 del DHFR humano y la secuencia del aptámero xpt-guanina seguida de la secuencia complementaria de los últimos siete nt de la secuencia del sitio de U1 (IDT) y se clonaron en el vector pFLuc utilizando la estrategia y el kit de clonación de Gibson (NEB).

[0178] Transfección y tratamiento de ligando aptámero: Se transfectaron células HEK 293 tal como se describe en el Ejemplo 1. Cuatro horas después de la transfección, se aspiró el medio, y se añadió nuevo medio con o sin guanina 500 µM. Ensayo de luciferasa de luciérnaga de células en cultivo: veinticuatro horas después del cambio de medio, se sacaron las placas del incubador y se equilibraron a TA durante varios minutos en un banco de laboratorio, y después se aspiraron. Se añadió el tampón Glo-lysis (Promega, 100 µI, TA), y las placas se mantuvieron a TA durante por lo menos cinco minutos. A continuación, el contenido del pocillo se mezcló mediante trituración en 50 µl y se mezclaron 20 µl de cada muestra con 20 µl de reactivo bright-glo (Promega) que había sido diluido al 10 % en tampón de lisis Glo. Los 96 pocillos estaban espaciados en una placa opaca blanca de 384 pocillos. Después de cinco minutos de incubación a TA, se midió la luminiscencia utilizando un aparato Tecan con un tiempo de lectura de 500 ms. La actividad de luciferasa se expresó como la media de unidades relativas de luz (URL) ± DE.

[0179] Resultados:

[0180] La utilización de un par de aptámero/ligando adicional, ya sea aptámeros sintéticos o naturales, en esta plataforma de regulación génica basada en la interferencia de U1, se sometió a ensayo mediante la inserción de un sitio de U1 de 10 nt, el sitio de corte y empalme 5' del exón 2 de DHFR, unido con el aptámero xpt-guanina en diferentes posiciones en el vector pRLuc, tal como se muestra en la Figura 7a. En este sitio de U1 de 10 nt, solo los últimos siete nt estaban diseñados para hibridarse con su secuencia complementaria situada en el extremo 3' de la secuencia del aptámero xpt-guanina, tal como se muestra en la Figura 7b. Esta configuración de secuencia se generó mediante truncado en serie de la secuencia de tallo que conecta el tallo del aptámero P1 y el tallo formado por el sitio de U1 y su secuencia complementaria, y demostró un alto rango dinámico en un interruptor ribosómico basado en aptámero para corte y empalme alternativo. En el presente estudio, los inventores introdujeron dicha configuración de secuencia a 149 nt, 110 nt o 74 nt cadena arriba de la secuencia de señal poli(A) temprana de SV40 en la región UTR 3', generando los constructos U1_Guan_1, 2 y 3. Además, se generó un sitio de U1 mutante como secuencia de control. Tal como se muestra en la Figura 7c, tras el tratamiento con guanina, la actividad de luciferasa se incrementó 2,4, 2,0 y 1,7 veces a partir de los constructos U1_Gua_1, 2 y 3, respectivamente.

[0181] EJEMPLO 8

[0182] La interferencia de U1 modulada por aptámeros no es específica de la secuencia de poliA.

[0183] Procedimientos experimentales:

[0184] Constructos de plásmido: la secuencia de poliadenilación temprana de SV40 fue sustituida por la secuencia de poliA de beta-globina humana en el vector pFLuc para generar pFLuc_HBGPA. Se sintetizaron oligos que contenían ya sea el sitio de unión de U1 de tipo salvaje o mutante a partir del sitio de corte y empalme 5' del exón 2 del DHFR humano y la secuencia del aptámero xpt-guanina seguida de la secuencia complementaria de los últimos siete nt de la secuencia del sitio de U1 (IDT) y se clonaron en el vector pFLuc utilizando la estrategia y el kit de clonación de Gibson (NEB).

[0185] La transfección y el ensayo de luciferasa eran los indicados en el Ejemplo 7.

[0186] Resultados:

[0187] Los presentes inventores han demostrado la interferencia de U1 modulada por aptámeros con la poliadenilación en el contexto de la secuencia de poliA tardía o de poliA temprana de SV40, tal como se muestra en los Ejemplo 4 a 6. Además, para demostrar la interferencia de U1 modulada por aptámeros, es decir la expresión del gen diana no estaba limitada a las secuencias poliA de SV40, se sometió a ensayo la interferencia de U1 modulada por aptámero de guanina en el contexto de la secuencia poliA del gen de la beta-globina humana. Tal como se muestra en la Figura 8, tras el tratamiento con guanina, la actividad de luciferasa se incrementó 2,1 veces a partir del constructo wtU1_Gua_HBGPA. En contraste, el mutU1_Gua_HBGPA no indujo la actividad de luciferasa en comparación con las muestras no tratadas. Estos resultados demuestran que la interferencia modulada por aptámeros de U1 no es específica de la secuencia poliA.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Constructo de ADN recombinante para la regulación de la expresión de un gen diana, que comprende una secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia codificante del gen diana y una región 3’ no traducida (UTR) y un interruptor ribosómico, en donde el interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende un sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1, en donde el interruptor ribosómico se localiza en la UTR 3' del gen diana en el lado 5' de la señal de poliadenilación.

2. Constructo de ADN recombinante según la reivindicación 1, en el que el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

3. Constructo de ADN recombinante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la secuencia efectora comprende una secuencia adicional que es capaz de formar un tallo cuando el aptámero se une al ligando.

4. Constructo de ADN recombinante según la reivindicación 3, en el que la región efectora comprende una secuencia formadora de tallo que presenta de 9 a 11 pares de bases, que opcionalmente comprende, además, una secuencia formadora de tallo con una o más bases desapareadas en el tallo.

5. Constructo de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sitio de unión de la snRNP U1 se selecciona del grupo que consiste en CAGGTAAGTA, CAGGTAAGT y CAGGTAAG.

6. Constructo de ADN recombinante según la reivindicación 1, en el que el constructo de ADN recombinante comprende dos o más interruptores ribosómicos localizados en la UTR 3' del gen diana en el lado 5' de la señal de poliadenilación, en donde cada interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende un sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1.

7. Constructo de ADN recombinante según la reivindicación 6, en el que

(a) los dos o más interruptores ribosómicos comprenden cada uno un aptámero que se une al mismo ligando, o

(b) los dos o más interruptores ribosómicos comprenden diferentes aptámeros que se unen a diferentes ligandos.

8. Método para modular la expresión de un gen diana, que comprende:

(a) insertar uno o más casetes de polinucleótido en la UTR 3’ de un gen diana, en donde el casete de polinucleótido comprende un interruptor ribosómico, en donde el interruptor ribosómico comprende una región efectora y un aptámero, en donde la región efectora comprende un sitio de unión de snRNP U1 y una secuencia complementaria al sitio de unión de snRNP U1,

(b) introducir el gen diana que comprende el casete de polinucleótido en una célula, y

(c) exponer la célula a un ligando que se une específicamente al aptámero en una cantidad eficaz para incrementar la expresión del gen diana.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el ligando es una molécula pequeña.

10. Método según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la región efectora comprende una secuencia adicional que es capaz de formar un tallo cuando el aptámero se une al ligando.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la región efectora comprende una secuencia formadora de tallo que presenta de 9 a 11 pares de bases, que opcionalmente comprende además una secuencia formadora de tallo con una o más bases desapareadas en el tallo.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el casete de polinucleótido se inserta a aproximadamente 74, aproximadamente 87, aproximadamente 110, aproximadamente 140 o aproximadamente 149 nucleótidos en el lado 5’ de la señal de poliadenilación.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que se insertan dos o más casetes de polinucleótido en la UTR 3' del gen diana.

14. Método según la reivindicación 13, en el que los dos o más casetes de polinucleótido comprenden:

(a) diferentes aptámeros que se unen específicamente a diferentes ligandos de molécula pequeña, o

(b) el mismo aptámero.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que los dos o más casetes de polinucleótido se insertan en diferentes localizaciones de la UTR 3' del gen diana.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que el gen diana que comprende el casete de polinucleótido está incorporado en un vector para la expresión del gen diana.

17. Vector que comprende el constructo de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

18. Método según la reivindicación 16, o el vector según la reivindicación 17, en el que el vector es un vector vírico, opcionalmente en el que el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector de virus adenoasociado y vector lentivírico.