ES3059911T3

ES3059911T3 - Biomimetic implants

Info

Publication number: ES3059911T3
Application number: ES17882172T
Authority: ES
Inventors: Yacov Koffler; Shaochen Chen; Mark Tuszynski; Wei Zhu
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2026-03-24
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: WO2018111900A1; JP7162901B2; US20190350720A1; EP3551139C0; KR102573503B1; CA3046959A1; EP4663212A3; EP3551139B1; CN110475528B; CN110475528A; EP4663212A2; JP2020504662A; US12364609B2; AU2017375956B2; JP7719505B2; JP2023009050A; KR20190095940A; EP3551139A1; AU2023219917A1; US20260013994A1

Abstract

Se describen dispositivos implantables para lesiones de la médula espinal y los nervios periféricos. Los implantes incluyen una estructura impresa en 3D con células madre en su interior. Asimismo, se describen métodos para tratar lesiones neuronales con dichos implantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Implantes biomiméticos

[0003] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

[0004] La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional estadounidense n.º 62/433142, presentada el 12 de diciembre de 2016.

[0005] Declaración relativa a la investigación o el desarrollo patrocinados por el gobierno federal

[0006] La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de la subvención n.º EB014986, concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

[0007] Campo

[0008] Se divulgan en el presente documento implantes biomiméticos tridimensionales que contienen células madre para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y de nervios periféricos.

[0009] Antecedentes

[0010] Los procedimientos para bioimprimir tejido funcional se han enfrentado a muchos retos, entre los que se encuentra la falta de técnicas de biofabricación adecuadas para construir microarquitecturas tridimensionales (3D) complejas esenciales para guiar el crecimiento celular y favorecer la maduración del tejido. La impresión tridimensional de estructuras del sistema nervioso central no se ha logrado con éxito anteriormente. El documento US 2003/0039676 (A1) divulga un osteoimplante con soporte de carga, procedimientos para fabricar el osteoimplante y un procedimiento para reparar tejido duro, tal como hueso y dientes, empleando el osteoimplante. El documento US 2013/0344601 (A1) divulga técnicas, sistemas, aparatos y material para fabricar un biomaterial microestructurado.

[0011] Sumario

[0012] En el presente documento se describen dispositivos implantables o implantes para la reparación de tejidos. Se trata de tejido de la médula espinal o tejido nervioso periférico. Estos implantes se utilizan para tratar lesiones en cualquiera de estos tipos de tejidos.

[0013] Los implantes pueden incluir una estructura impresa tridimensional sin capas. El implante incluye la estructura tridimensional que incluye un primer extremo y un segundo extremo, y una pluralidad de canales que se originan en el primer extremo y terminan en el segundo extremo.

[0014] El implante es biomimético. El implante puede ser biomimético de una médula espinal e incluir un núcleo (que representa la materia gris de la médula espinal) y una cubierta (que representa la materia blanca de la médula espinal), en la que la cubierta contiene canales lineales. En otras realizaciones, el implante puede ser biomimético de un nervio periférico e incluir una estructura de panal de canales lineales en disposición compacta. En casos de la médula espinal o de nervios periféricos, los canales lineales pueden guiar a los axones en regeneración hacia otro lado de la lesión. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

[0015] Así, se divulgan en el presente documento implantes biomiméticos para lesiones de la médula espinal o nervios periféricos, comprendiendo el implante: un implante tridimensional (3D), que incluye un primer extremo y un segundo extremo que comprenden un núcleo y una cubierta y están conformados en una forma biomimética que imita la estructura de un nervio o médula espinal en la zona de la lesión; y una pluralidad de canales lineales dentro de la cubierta que se originan en el primer extremo y terminan en el segundo extremo, en los que la pluralidad de canales lineales dentro de la cubierta da soporte a la regeneración axonal lineal y alineada del receptor a través de la zona de la lesiónin vivo, en los que la estructura del implante permanece intacta cuatro semanas después de la implementación, en los que el implante tiene un módulo elástico entre aproximadamente 200 kPa y aproximadamente 300 kPa y en los que la pluralidad de canales lineales guía un axón en regeneración desde el primer extremo hasta el segundo extremo.

[0016] En algunas realizaciones, el implante se produce mediante impresión 3D.

[0017] En algunas realizaciones, el implante comprende además al menos un tipo de célula madre incluida en la pluralidad de canales lineales, en el que dicho al menos un tipo de célula madre es una célula madre neural. En algunas realizaciones, la célula madre neural es una célula madre embrionaria, una célula madre derivada de iPSC ("induced pluripotent stem cells", células madre pluripotentes inducidas), una célula madre neural directamente diferenciada o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, dicho al menos un tipo de célula madre es una célula madre mesenquimal. En algunas realizaciones, la célula madre está diseñada para expresar BDNF, NT3, GDNF o una combinación de los mismos.

[0018] En algunas realizaciones, el implante impreso tridimensional incluye diacrilato de polietilenglicol, o gelatina de metacrilol, o una combinación de los mismos.

[0019] En algunas realizaciones, el implante es biomimético de la médula espinal. En algunas realizaciones, el implante es biomimético de un nervio periférico.

[0020] En algunas realizaciones, la pluralidad de canales lineales son paralelos entre sí. En algunas realizaciones, la pluralidad de canales lineales comprende secciones transversales hexagonales agrupadas en forma de una estructura de panal.

[0021] En algunas realizaciones, la lesión neurológica es una lesión de la médula espinal, una lesión motora completa de la médula espinal, una lesión motora incompleta de la médula espinal o una lesión de un nervio periférico. En algunas realizaciones, la lesión neurológica es una lesión de la médula espinal. En algunas realizaciones, la lesión neurológica es una lesión de un nervio periférico.

[0022] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además proporcionar terapia física al receptor.

[0023] También se divulgan en el presente documento procedimientos para fabricar un implante biomimético como el divulgado en el presente documento, comprendiendo el procedimiento: explorar la ubicación de la médula espinal o del nervio periférico en el receptor que necesita tratamiento para determinar la zona de la lesión; e imprimir tridimensionalmente el implante para abarcar la zona de la lesión.

[0024] Breve descripción de los dibujos

[0025] Las figuras 1A-E representan un implante impreso en 3D que imita la arquitectura de la médula espinal. La figura 1A muestra una configuración de impresora 3D que incluye una fuente de luz UV (longitud de onda de 365 nm), un ordenador para la generación de un flujo de imágenes laminadas y la sincronización del sistema, un dispositivo digital de microespejos (DDM) para la generación de patrones ópticos, un conjunto de ópticas de proyección, una platina para el control de la posición de la muestra y un sistema de obtención de imágenes CCD para la supervisión en línea del proceso de fabricación. La figura 1B representa la impresión 3D sin capas de proyección continua a microescala ("microscale continuous projection 3D printing", µCPP), que crea estructuras sin capas discretas, como suele observarse en las impresoras 3D de inyección de tinta. La figura 1C muestra el marcaje de neurofilamentos de cadena pesada (NF200) de axones en médula espinal intacta de rata T3. Dirección rostral hacia la izquierda de la imagen, caudal hacia la derecha. Los axones de la sustancia blanca (parte superior del panel) están muy organizados en disposición paralela que se extienden desde la dirección rostral a la caudal, mientras que los axones de la sustancia gris (parte inferior del panel) no están presentes en disposición lineal. El implante divulgado imita la organización lineal de la sustancia blanca. La línea blanca delimita la interfaz entre la materia blanca y la gris. La figura 1D representa las proyecciones de diferentes tractos axónicos (fascículos) en el cuadrante dorso-lateral de la médula espinal de la rata T3. Se ilustran el tracto rubro-rubroespinal (Ru), el tracto rafe-rafeespinal (Ra), el tracto retículoretículoespinal (Ret), el tracto propio-propioespinal (Pr), el tracto espinotalámico-espinotalámico (ST) y el tracto CST-corticoespinal (C). La parte central en forma de mariposa es el núcleo del implante (análogo a la "materia gris" de la médula espinal normal) y el resto de la ilustración es la cubierta del implante (análoga a la "materia blanca" de la médula espinal normal). La figura 1E muestra el guiado obtenido en el eje rostrocaudal, por el cual se guía a los axones en regeneración (línea) a su tracto adecuado en el lado distante de la lesión. Las flechas señalan el punto de entrada y salida de los axones en regeneración en el implante, lo que demuestra que el implante mantiene las coordenadas 3D exactas a lo largo de toda la zona de la lesión, ajustándose a la arquitectura natural del receptor.

[0026] La figura 2 representa las mediciones mecánicas del módulo elástico del implante mediante análisis mecánico dinámico (AMD).

[0027] Las figuras 3A-E representan un ejemplo de implante espinal tal como se describe en el presente documento. La figura 3A ilustra una imagen de resonancia magnética (RM) sagital cervical media ponderada en T1 de una lesión medular humana clínicamente completa (ASIA A). En la cara anterior (lado derecho) de la lesión (flecha) se aprecia un trozo de sustancia blanca del receptor preservada. La figura 3B ilustra un contorno trazado de la cavidad de la lesión quística de la figura 3A. La figura 3C ilustra un modelo 3D de diseño asistido por ordenador ("computer-aided design", CAD) de un implante que se va a imprimir en 3D, correspondiente a la forma precisa de una lesión. La figura 3D ilustra un implante impreso. La figura 3E ilustra un ajuste hipotético del implante impreso en 3D de la figura 3D en una cavidad de contusión humana.

[0028] La figura 4 muestra un implante impreso en 3D implantado en una zona con una lesión medular, cuatro semanas después de su implantación. La figura 4 ilustra una imagen transversal de un implante en una zona de lesión con los axones marcados (neurofilamento NF200) que demuestra que la estructura general del implante permanece intacta cuatro semanas después de la implantación (sección transversal). La barra de escala es de 500 µm.

[0029] Las figuras 5A-C muestran implantes impresos en 3D implantados en zonas con lesión medular cuatro semanas después de su implantación. La tinción de Nissl de la zona del implante (zona de una sección completa T3) revela una capa celular reactiva (flechas) en la zona de implantación de un andamio de agarosa (figura 5A), que se atenúa sustancialmente tras la implantación de un implante impreso en 3D de diacrilato de polietilenglicol/gelatina de metacrilol (PEGDA/GelMa) divulgado en el presente documento (figura 5B). La barra de escala es de 200 µm. La dirección rostral es hacia la izquierda, la caudal hacia la derecha. La línea interrumpida delimita la interfaz de la médula espinal del receptor con el implante. La figura 5C representa la cuantificación del grosor de la capa celular reactiva (CCR), ± E.E.M. *p< 0,05 (prueba de latde Student). Las figuras 6A-D muestran implantes impresos en 3D implantados en zonas con lesión medular cuatro semanas después de su implantación. Se muestra una cicatriz glial del receptor revelada por la inmunorreactividad de la proteína ácida fibrilar glial ("glial fibrillary acidic protein", GFAP) en el animal con lesión solamente (sin implante) (figura 6A), con andamio de agarosa en la zona de la lesión (figura 6B) o con implante impreso en 3D en la zona de la lesión (figura 6C) (dirección rostral hacia la izquierda, caudal hacia la derecha). La barra de escala en la figura 6A y 6B es de 250 µm, y de 100 µm en la figura 6C. Obsérvese que no existe una barrera marcada con GFAP alrededor de un implante de PEGDA/GelMa impreso en 3D; en lugar de ello, las fibras gliales se disponen longitudinalmente en los canales, donde pueden dar soporte potencialmente a la extensión de los axones. La figura 6D representa la cuantificación de la intensidad de GFAP en la médula espinal del receptor que rodea la zona de la lesión ± E.E.M. *p< 0,05 (ANOVA con Tukeya posteriori).

[0030] Las figuras 7A-B muestran implantes impresos en 3D implantados en zonas con lesión medular cuatro semanas después de su implantación. Los implantes están bien vascularizados (inmunomarcaje con RECA-1 para vasos sanguíneos) (figura 7A), y la tinción con azul de toluidina muestra vasos sanguíneos (asteriscos) (figura 7B). La barra de escala en la figura 7A es de 25 µm, y de 20 µm en la figura 7B.

[0031] Las figuras 8A-B muestran implantes impresos en 3D implantados en zonas con lesión medular cuatro semanas después de su implantación. Los axones del receptor marcados con NF200 no atraviesan una cicatriz presente alrededor de los andamios de agarosa (figura 8A), pero penetran fácilmente en el implante impreso en 3D (figura 8B). La barra de escala es de 100 µm. La línea discontinua indica la entrada del implante desde la cara rostral de la zona de la lesión.

[0032] Las figuras 9A-C muestran implantes impresos en 3D implantados en zonas con lesión medular cuatro semanas después de su implantación. La figura 9A es una imagen de micrografía electrónica dentro de un canal que muestra axones (asteriscos) asociados a una célula de Schwann envolvente vecina (Sc). La barra de escala es de 1 µm. La figura 9B representa un canal ampliado de la figura 9A que presenta células de Schwann marcadas con S100 envolviendo a axones marcados con NF200 (flecha). La barra de escala es de 5 µm. La figura 9C es una micrografía electrónica de un canal que muestra un axón mielinizado en el implante con una célula de Schwann (SC). La barra de escala es de 0,5 µm.

[0033] Las figuras 10A-H muestran los implantes impresos en 3D descritos en el presente documento y cargados con células madre neurales, cuatro semanas después de su implantación en ratas. La figura 10A muestra canales llenos de células madre neurales que expresan GFP (flechas) (sección horizontal). La barra de escala es de 200 µm. La figura 10B muestra una entrada rostral al canal por la que penetran axones del receptor marcados con NF200; las células del receptor se distinguen de los axones derivados del injerto por la ausencia de expresión de GFP. La barra de escala es de 50 µm. La figura 10C muestra cómo las células madre neurales implantadas extienden axones que expresan GFP y que están linealizados por la arquitectura lineal del implante. La figura 10D muestra axones serotoninérgicos del receptor marcados con 5HT entrando en un canal lleno de células madre desde la cara rostral (izquierda) de una lesión y regenerándose linealmente en el canal (flecha). La barra de escala es de 100 µm. La figura 10E muestra axones serotoninérgicos regenerándose linealmente en un implante vacío que carece de células madre, aunque el número de axones penetrantes es reducido. La barra de escala es de 100 µm. La figura 10F muestra axones serotoninérgicos marcados con 5HT que se están regenerando en el extremo caudal de un implante que contiene células madre, respetando los límites lineales creados por la arquitectura del implante. La barra de escala es de 50 µm. La figura 10G representa la cuantificación de axones 5HT que alcanzan la parte caudal del implante. *p< 0,05 (ANOVA, E.E.M.). La figura 10H muestra axones motores marcados con 5HT que salen de la cara caudal del canal para regenerarse en la médula espinal del receptor distal a la lesión (flecha). La línea delimita la salida del canal caudal hacia la médula espinal caudal. La barra de escala es de 50 µm.

[0034] La figura 11 representa, a nivel ultraestructural, axones de diferentes diámetros que están presentes dentro de los canales, y muchos axones están mielinizados después de la implantación del implante de la figura 10. La barra de escala es de 500 µm.

[0035] Las figuras 12A-B muestran el análisis ultraestructural de las zonas de implante cuatro semanas después de la implantación. La figura 12A muestra la presencia de axones de diferentes diámetros (asteriscos) dentro de los canales, y muchos axones están mielinizados (M). La barra de escala es de 500 nm. La figura 12B muestra oligodendrocitos que envían múltiples procesos para mielinizar y envolver axones. La barra de escala es de 0,2 µm.

[0036] La figura 13 muestra implantes impresos cargados con células madre neurales, cuatro semanas después de la implantación. Se forman sinapsis (flechas) entre los axones dentro de los canales y las dendritas de las células madre neurales implantadas. La barra de escala es de 200 µm. Las sinapsis son asimétricas y los botones presinápticos contienen vesículas redondeadas, lo que indica que son excitatorias.

[0037] Las figuras 14A-B muestran implantes impresos cargados con células madre neurales, cuatro semanas después de la implantación. La figura 14A muestra axones del receptor 5HT que se están regenerando en los canales del implante y forman contactos aposicionales (flechas) con dendritas (marcadas con Map2) de células madre neurales implantadas (GFP) cuatro semanas después de la implantación. La barra de escala es de 10 µm. La figura 14B representa la cuantificación de axones 5HT que alcanzan el extremo caudal del implante. *p< 0,05 (ANOVA P < 0,01, Tukeya posterioriP < 0,01 que compara ambos grupos de CMN-implante con el grupo de sólo injerto de CMN y el grupo de implante vacío).

[0038] Las figuras 15A-G muestran implantes impresos cargados con células madre neurales en estudios invivoa largo plazo. Las figuras 15A-E representan la anatomía seis meses después del implante. Figura 15A: Los canales permanecen estructuralmente intactos y están rellenos de células madre neurales que expresan GFP. Sección horizontal, dirección rostral hacia la izquierda. Figura 15B: Los axones corticoespinales marcados anterógradamente con RFP entran en el implante y se extienden linealmente en dirección caudal, alineados por la arquitectura del implante. Sección horizontal. Figura 15C: Los axones corticoespinales (CST) convergen en la neurona marcada con NeuN dentro del canal, formando contactos potenciales de tipo botón con el soma. Figura 15D: Los axones inmunorreactivos a GFP se extienden desde el implante hacia el interior de la materia blanca y gris del receptor caudal a la lesión. Materia blanca ventrolateral, 2 mm caudal respecto a la lesión. Figura 15E: Los axones marcados con GFP derivados de células madre neurales (CMN) forman estructuras similares a botones potenciales en neuronas del receptor inmunorreactivas a NeuN de la sustancia gris situadas a 2 mm caudales respecto a la lesión. Las figuras 15F-G representan estudios de comportamiento. Figura 15F: Los animales tratados con células madre neurales/implante muestran una recuperación funcional significativa en la escala locomotora BBB cinco meses después del implante, reflejando un movimiento constante de cada una de las tres articulaciones de ambas extremidades posteriores (**p< 0,05, *p< 0,01). Figura 15G: Esquema del estudio electrofisiológico realizado seis meses después del implante. Se aplicó estimulación eléctrica transcraneal a la corteza motora del cerebro y se registraron los potenciales evocados motores (PEM) en las extremidades posteriores.

[0039] Las figuras 16A-D muestran implantes impresos en 3D cargados con células madre neurales, seis meses después de la implantación. Las ratas con implantes de células madre impresas en 3D muestran una recuperación parcial de las respuestas de PEM (figura 16A). Esta recuperación se suprime con la posterior resección del cordón por encima del implante (figura 16B). Los animales con implantes vacíos no muestran recuperación de los PEM (figura 16C). La figura 16D muestra que la amplitud media de los PEM es significativamente mayor en los animales implantados con implantes que contienen células madre neurales (p< 0,01).

[0040] La figura 17 muestra animales con implantes cargados de células madre que presentan una mejora funcional significativa en la escala motora BBB, indicado por el movimiento de cada una de las tres articulaciones de ambas piernas (*p< 0,05, **p< 0,01). N = 8 en el grupo CMN/implante y N = 6 en el grupo de implante vacío. Las figuras 18A-B muestran imágenes longitudinales de implantes impresos de diferentes longitudes, (figura 18A) 2 mm y (figura 18B) 4 mm. La barra de escala es de 0,5 mm.

[0041] Las figuras 19A-D muestran tinciones Nissl de implantes de agarosa (figura 19A), PEGDA/GelMa (figura 19B) y ácido hialurónico (figura 19C) que muestran la persistencia de la arquitectura del implante en agarosa y PEGDA a las 4 semanas, y la degradación de un andamio de ácido hialurónico. La figura 19D demuestra que el grosor de la CCR se reduce significativamente en los implantes de PEGDA-GelMa (p< 0,05, ANOVA; Tukeya posteriorique compara el grupo PEGDA con los andamios de agarosa y HA). Promedio ± e.e.m. La barra de escala es de 250 µm.

[0042] La figura 20 representa la degradación del implante medida por la reducción del grosor de la pared. *p< 0,0001, **p< 0,001 (ANOVA; Tukeya posteriori).

[0043] Las figuras 21A-D muestran la regeneración de neuronas, cuatro semanas después de la implantación. La figura 21A muestra implantes marcados con GFP de 4 animales diferentes que demuestran un llenado completo y uniforme de los canales con células madre neurales de roedores, que también ocupan las interfaces entre los implantes y el receptor (flechas). La barra de escala es de 0,5 mm. La figura 21B-C muestra células derivadas de células madre en los canales que expresan el marcador neuronal Hu (figura 21B) o NeuN (figura 21C), además de GFP. La barra de escala es de 5 µm. La figura 21D demuestra que también expresan el marcador de oligodendrocitos Olig2, junto con GFP, y la figura 21E ilustra que expresan el marcador de astrocitos GFAP, junto con GFP. La barra de escala es de 5 µm.

[0044] La figura 22 muestra la distribución de marcadores de diferenciación de células madre en las células del injerto dentro de los canales.

[0045] La figura 23 muestra un axón serotoninérgico (flecha) visible en un injerto de células madre inyectado en la zona de la lesión sin implante; el axón está orientado verticalmente y, por lo tanto, desalineado en el eje rostral-caudal de la zona de la lesión. La línea interrumpida delimita la interfaz injerto-receptor. Dirección rostral hacia la izquierda, caudal (zona de la lesión) hacia la derecha. La barra de escala es de 50 µm. Las figuras 24A-B muestran canales sin relleno de células madre (figura 24A) o injertos de células madre sin implante (figura 24B), que contienen sustancialmente menos axones marcados con 5HT en la cara caudal del implante. La barra de escala es de 50 µm.

[0046] La figura 25 representa la representación 3D de 10 µm z-apilamiento de axones motores del receptor marcados con 5HT dentro de un canal que no se marcaron con GFP, lo que indica que no hay cuerpos celulares neuronales serotoninérgicos en los injertos de células madre neurales derivadas de la médula espinal.

[0047] La figura 26 muestra (K1, la barra de escala es de 100 µm) axones motores marcados con 5HT visibles en la médula espinal del receptor caudales a la lesión en la materia gris del receptor, (K2, la barra de escala es de 50 µm) en la materia blanca del receptor, y (K3, la barra de escala es de 25 µm) cruzando de la materia blanca a la gris. La tinción con NF200 de los axones receptores es visible.

[0048] Las figuras 27A-B muestran un único canal del implante impreso en 3D cargado con células madre neurales, que demuestra la vascularización. Axón marcado con GAP43 dentro de un canal cargado con CMN que expresan GFP (figura 27A, la barra de escala es de 25 µm). Axones marcados con GAP43 en la médula espinal del receptor, caudales al implante (figura 27B, la barra de escala es de 25 µm).

[0049] Las figuras 28A-B muestran la tinción con azul de toluidina, las flechas señalan los vasos sanguíneos (figura 28A, la barra de escala es de 100 µm). Imagen EM, el vaso sanguíneo está marcado con un asterisco (figura 28B, la barra de escala es de 1 µm).

[0050] La figura 29 representa el marcaje con PDGFR de pericitos que reveló que rodean a los vasos sanguíneos marcados con RECA-1 que indican el restablecimiento de BBB. La barra de escala es de 15 µm.

[0051] La figura 30 demuestra que la latencia de los PEM fue más corta en animales implantados con implantes de células madre que en animales tratados con implantes vacíos, y fue cercana a la latencia observada en animales intactos (p< 0,01).

[0052] La figura 31 representa los registros de potencial motor evocado de animales que recibieron implantes con y sin células madre.

[0053] La figura 32A muestra un implante que incluye canales lineales. La figura 32B es una versión ampliada de la figura 32A.

[0054] La figura 33A muestra un implante que incluye una estructura de panal de canales lineales en disposición compacta. La figura 33B es una versión ampliada de la figura 33A.

[0055] Descripción detallada

[0056] En el presente documento se divulgan implantes y procedimientos para la impresión rápida tridimensional (3D) a microescala de implantes que facilitan la regeneración, que biomimetizan la compleja arquitectura fascicular a microescala de la médula espinal o los nervios periféricos. Los implantes, compuestos de un polímero, pueden imprimirse rápidamente y son escalables hasta tamaños y geometrías de lesión clínicamente pertinentes para la médula espinal o los nervios periféricos. Los axones lesionados del receptor se regeneran en implantes biomiméticos tridimensionales, establecen sinapsis con las células madre neurales implantadas en el dispositivo y, a su vez, las células madre neurales implantadas extienden axones fuera del implante y dentro de la médula espinal o el nervio periférico del receptor, por debajo de la lesión, para restablecer la transmisión sináptica y mejorar significativamente los resultados funcionales. Se forman nuevas transmisiones electrofisiológicas de sustitución en la zona de la lesión que favorecen una mejora motora funcional significativa. Así pues, los complejos implantes biomiméticos tridimensionales ofrecen un medio para facilitar la regeneración del sistema nervioso central mediante la medicina de precisión.

[0057] En el presente documento se describen implantes médicos que ayudan a restablecer la función corporal. La función puede restablecerse en un mamífero, que puede incluir un ser humano, un caballo, un cerdo, una vaca, un toro, una cabra, una oveja, un delfín, un perro, un gato, un camello o similares. En una realización, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones, el mamífero se denomina receptor.

[0058] Estos implantes médicos pueden utilizarse en algunas realizaciones para facilitar la regeneración axonal después de una lesión de la médula espinal o de un nervio periférico.

[0059] En algunas realizaciones, los implantes médicos comprenden un implante tridimensional y opcionalmente células madre. En algunas realizaciones, los implantes se fabrican mediante impresión 3D. Estos implantes pueden diseñarse a medida para adaptarse a la anatomía de cada paciente. Los términos "andamio" e "implante" se utilizan indistintamente y se refieren a la estructura impresa en 3D con o sin células madre.

[0060] Aunque los andamios o implantes de bioingeniería dan soporte a la regeneración de axones en las zonas de lesión de la médula espinal, o de nervios periféricos, estas tecnologías se han visto limitadas por las respuestas a cuerpos extraños en las zonas de implantación, los requisitos de producción engorrosos, las limitaciones en la ampliación a lesiones de tamaño humano y la falta de biomimetismo de la médula espinal natural o de nervios periféricos. Los implantes y procedimientos de uso de los implantes descritos en el presente documento incluyen estructuras que biomimetizan la compleja arquitectura fascicular de una médula espinal o de los nervios periféricos. Los implantes, que pueden imprimirse, pueden fabricarse de forma sencilla y rápida, reducen las respuestas a cuerpos extraños y/o favorecen la regeneración axonal lineal y alineada del receptor en la zona de la lesión. Además, se pueden cargar células madre neurales en los implantes. Las células madre pueden dar soporte a los axones en regeneración del receptor cuando atraviesan la zona de la lesión y tienden un puente más allá de la misma, y facilitan la regeneración funcionalin vivo.

[0061] Se utiliza una médula espinal como plantilla para diseñar un implante de médula espinal (figura 1A). Se incluyen microcanales para proporcionar la alineación de los canales del implante con los tractos axonales del receptor por encima y por debajo de la lesión (figura 1D-E). La zona interna de "materia gris" de la médula espinal normalmente no contiene axones que se proyecten por debajo de la zona de la lesión, por lo que este componente del implante, el núcleo, está diseñado como una región sólida que mejora la integridad estructural del implante (figura 1D). El uso de implantes de microcanales de agarosa demostró que el 80 % de los axones del receptor que entraban en una zona de lesión podían ser guiados por conductos lineales, o paralelos, para alcanzar el extremo opuesto (caudal) de la lesión. Sin embargo, la agarosa suscitó una respuesta a cuerpos extraños que consistía en una capa celular reactiva a base de colágeno que atenuaba y atrapaba a los axones dentro del implante, impidiendo el crecimiento de los axones más allá de los canales. Por lo tanto, en el presente documento se describen implantes fabricados a partir de una mezcla de materiales degradables que reducen la capa celular reactiva debido a la reducción de la respuesta a cuerpos extraños, lo que permite a los axones del receptor penetrar mejor e incluso avanzar más allá de la lesión.

[0062] Los materiales utilizados para formar los implantes comprenden polímeros biológicamente aceptables. En algunas realizaciones, el polímero puede incluir polímeros a base de polietilenglicol, tales como, entre otros, diacrilato de polietilenglicol (PEGDA) y poli(etilenglicol)diacrilamida. En algunas realizaciones, el polímero puede incluir hidrogeles de gelatina de metacrilol (GeIMA). En algunas realizaciones, los polímeros pueden incluir combinaciones de diacrilato de polietilenglicol, poli(etilenglicol)diacrilamida y gelatina de metacrilol. En algunas realizaciones, los polímeros pueden incluir combinaciones de diacrilato de polietilenglicol y gelatina de metacrilol. En algunas realizaciones, los polímeros pueden incluir combinaciones de poli(etilenglicol)diacrilamida y gelatina de metacrilol.

[0063] En algunas realizaciones, el material biocompatible PEGDA se utiliza como material de implante. El propio PEGDA no es adhesivo para las células, por lo que se incluye gelatina de metacrilato (GelMa), un colágeno desnaturalizado fotopolimerizable que conserva los ligandos de unión celular y los sitios de degradación de metaloproteinasa de la matriz, para favorecer la adhesión de las células a las paredes del implante y la viabilidad celular a largo plazo. Se probaron diferentes concentraciones de cada material y la densidad de reticulación de los implantes impresos hasta que se identificaron combinaciones que imitaban las propiedades mecánicas del tejido nativo de la médula espinal o del nervio periférico, ya que un desajuste de las propiedades mecánicas entre un implante y el receptor podría provocar compresión o laceración en las interfaces de la médula espinal o del nervio periférico, causando un fallo en la integración.

[0064] Una ventaja de la bioimpresión 3D es la capacidad para imprimir rápidamente implantes de diferentes tamaños y formas irregulares para ajustarse a las zonas de lesión individuales del paciente que pueden identificarse en imágenes de resonancia magnética (RM). Se imprimió un implante formado por PEGDA/GelMa para ajustarse a la forma precisa de una cavidad de lesión de una médula espinal humana según la RM, como se muestra en la figura 3A-E. Se han impreso implantes que se ajustan a la morfología incluso de cavidades de lesiones humanas complejas.

[0065] Los implantes divulgados en el presente documento comprenden un núcleo y una cubierta. El núcleo es análogo a la parte de "materia gris" de la médula espinal o el nervio periférico normales y la cubierta es análoga a la parte de "materia blanca" de la médula espinal o el nervio periférico normales.

[0066] Los implantes incluyen una pluralidad de canales lineales dentro de la cubierta. En algunas realizaciones, dichos uno o más canales se extienden desde una primera superficie a una segunda superficie. En algunas realizaciones, la primera superficie es una superficie superior y la segunda superficie es una superficie inferior. En algunas realizaciones, la primera superficie es una superficie inferior y la segunda superficie es una superficie superior. En algunas realizaciones, la primera superficie es una primera superficie lateral y la segunda superficie es una segunda superficie lateral. En algunas realizaciones, la primera superficie es una superficie superior y la segunda superficie es una superficie lateral. En algunas realizaciones, la primera superficie es una superficie inferior y la segunda superficie es una superficie lateral.

[0067] Los canales pueden tener una forma de sección transversal que sea propicia para el crecimiento del tejido en su interior. En algunas realizaciones, la forma de la sección transversal puede ser cuadrada, triangular, pentagonal, hexagonal, heptagonal, octagonal, rectangular, trapezoidal, elíptica, en forma de cabeza de tornillo Torx, en forma de estrella con cualquier número de brazos, en forma de trébol, en forma de hoja con cualquier número de brazos, otra forma curvilínea o rectilínea, o similar, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, un grupo o racimo de canales puede tener una configuración de panal.

[0068] En algunas realizaciones, pueden utilizarse dos o más secciones transversales de canal diferentes en un único implante. En algunas realizaciones, algunos canales son de sección rectangular y otros hexagonales (formando una estructura de panal). Se puede utilizar cualquier combinación que consiga un uso terapéutico.

[0069] En algunas realizaciones, los implantes pueden cargarse con al menos un tipo de célula madre. En algunas realizaciones, dicho al menos un tipo de célula madre es una célula madre neural. La célula madre neural es una célula madre embrionaria, una célula madre derivada de iPSC, una célula madre diferenciada, células madre neurales directamente diferenciadas (por ejemplo, diferenciación a partir de piel para producir neuronas sin pasar por un estado de célula madre), una célula madre neural que exprese GFP o una combinación de las mismas. En otras realizaciones, dicho al menos un tipo de célula madre es una célula madre mesenquimal. La célula madre puede diseñarse para expresar BDNF, NT3, GDNF o una combinación de los mismos.

[0070] Los implantes pueden formarse prácticamente a cualquier longitud. En algunas realizaciones, los implantes pueden tener longitudes de aproximadamente 1 mm, aproximadamente 2 mm, aproximadamente 3 mm, aproximadamente 4 mm, aproximadamente 5 mm, aproximadamente 6 mm, aproximadamente 7 mm, aproximadamente 8 mm, aproximadamente 9 mm, aproximadamente 10 mm, aproximadamente 20 mm, aproximadamente 30 mm, aproximadamente 40 mm, aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 2 mm y aproximadamente 4 mm, entre aproximadamente 2 mm y aproximadamente 10 mm, o entre aproximadamente 2 mm y aproximadamente 20 mm. Los implantes se conforman con formas y estructuras que imitan la arquitectura de la médula espinal. Estas estructuras pueden incluir canales y vías axónicas. Las vías axónicas pueden incluir el tracto rubro-rubroespinal, el tracto raferafeespinal, el tracto retículo-retículoespinal, el tracto propio-propioespinal, el tracto espinotalámico-espinotalámico y el tracto CST-corticoespinal.

[0071] Los implantes incluyen entradas y salidas de axones en los implantes, denominados en el presente documento "canales", que coinciden con la arquitectura natural del receptor.

[0072] Los implantes tienen un módulo elástico entre aproximadamente 200 kPa y aproximadamente 300 kPa, y opcionalmente superior a aproximadamente 250 kPa.

[0073] En algunas realizaciones, los implantes son sustancialmente bioestables. Sustancialmente bioestable significa que los implantes están más del 80 %, del 90 %, del 95 %, del 99 % intactos o totalmente intactos después de 3 meses, después de 4 meses, después de 5 meses, después de 6 meses, después de 1 año o después de cinco años tras la implantación.

[0074] En algunas realizaciones, los implantes pueden resistir el depósito de colágeno sobre sus superficies. En algunas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento pueden reducir el depósito de colágeno en comparación con un implante formado por otro polímero o material metálico en más de aproximadamente un 50 %, más de aproximadamente un 60 %, más de aproximadamente un 70 %, más de aproximadamente un 80 %, más de aproximadamente un 90 % o más de aproximadamente un 95 %.

[0075] En algunas realizaciones, los implantes pueden resistir el depósito de células reactivas (o reducir el tamaño de la capa celular reactiva) en la zona de implantación. En algunas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento pueden reducir el tamaño de la capa celular reactiva en comparación con un implante formado por otro polímero o material metálico en más de aproximadamente un 20 %, más de aproximadamente un 30 %, más de aproximadamente un 40 %, más de aproximadamente un 50 % o más de aproximadamente un 60 %. En algunas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento pueden reducir el tamaño de la capa celular reactiva en comparación con un implante formado por agarosa en más de aproximadamente un 20 %, más de aproximadamente un 30 %, más de aproximadamente un 40 %, más de aproximadamente un 50 % o más de aproximadamente un 60 %.

[0076] En algunas realizaciones, los implantes pueden atraer una capa celular reactiva mínima después de la implantación que tiene un grosor de menos de aproximadamente 400 µm, menos de aproximadamente 350 µm, menos de aproximadamente 300 µm, menos de aproximadamente 250 µm, o entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 200 µm.

[0077] En algunas realizaciones, los implantes pueden reducir la formación de cicatrices gliales en la zona de implantación en comparación con un implante formado por otro material polimérico o metálico en más de aproximadamente un 50 %, más de aproximadamente un 60 %, más de aproximadamente un 70 %, más de aproximadamente un 80 % o más de aproximadamente un 90 %. La formación de cicatrices gliales (gliosis) es un proceso celular reactivo que implica astrogliosis y que se produce tras una lesión del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, los implantes pueden reducir la formación de cicatrices gliales en la zona de implantación en comparación con un implante formado por agarosa en más de aproximadamente un 50 %, más de aproximadamente un 60 %, más de aproximadamente un 70 %, más de aproximadamente un 80 % o más de aproximadamente un 90 %.

[0078] En algunas realizaciones, los implantes pueden reducir la formación de cicatrices gliales en la zona de implantación en comparación con una lesión no tratada en más de aproximadamente un 20 %, más de aproximadamente un 30 %, más de aproximadamente un 40 %, más de aproximadamente un 50 % o más de aproximadamente un 60 %.

[0079] Cuando se comparan con un implante de agarosa, los presentes implantes pueden dar lugar a fibras gliales que se disponen longitudinalmente en los canales donde potencialmente pueden dar soporte a la extensión de los axones. Los implantes descritos en el presente documento pueden estar bien vascularizados, permitiendo así que los vasos sanguíneos se infiltren en el implante.

[0080] Además, los implantes pueden permitir que los axones penetren en el material del implante. Esta penetración contrasta con la de otros implantes, tales como los basados en agarosa, en los que los axones no logran atravesar las cicatrices de astrocitos que se producen alrededor de esos implantes. Los axones que penetran en los implantes descritos en el presente documento pueden asociarse con las células de Schwann envolventes vecinas.

[0081] En algunas realizaciones, cuando los implantes están cargados con al menos un tipo de célula madre, los axones del receptor pueden entrar en un canal lleno de células madre y regenerarse lineal o paralelamente en el canal. En otras realizaciones, los axones serotoninérgicos del receptor pueden entrar en un canal lleno de células madre desde una cara rostral de una lesión y regenerarse lineal o paralelamente en el canal. En algunas realizaciones, los axones serotoninérgicos pueden entrar en un implante y regenerarse lineal o paralelamente en un canal, incluso cuando no están presentes células madre. Sin embargo, esta regeneración puede reducirse entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 20 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 %, entre aproximadamente un 30 % y aproximadamente un 40 % o entre aproximadamente un 40 % y aproximadamente un 50 %, en comparación con los implantes que contienen células madre.

[0082] En algunas realizaciones, los axones del receptor en regeneración pueden alcanzar la parte caudal del implante. En algunas realizaciones, cuando se cargan con al menos un tipo de célula madre, los implantes provocan un aumento de los axones que alcanzan la parte caudal del implante de al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 100 % o al menos aproximadamente un 120 % en comparación con un implante sin células madre.

[0083] En algunas realizaciones, los implantes pueden permitir que los axones motores salgan de una cara caudal de un canal para regenerarse dentro de la médula espinal del receptor, o un nervio periférico, distal a la lesión. En otras realizaciones, los axones motores pueden seguir siendo detectables hasta aproximadamente 3,5 mm, hasta aproximadamente 2,5 mm o hasta aproximadamente 4,5 mm más allá de la lesión.

[0084] En algunas realizaciones, los canales en los implantes descritos en el presente documento pueden alojar o solicitar axones de diferentes diámetros. Además, los axones que se regeneran dentro de los canales pueden estar mielinizados. En algunas realizaciones, cuando se forman axones en los canales, se pueden formar sinapsis entre los axones dentro de los canales y las dendritas de las células madre neurales implantadas. Las sinapsis pueden ser asimétricas y/o botones presinápticos que contienen vesículas redondeadas. En algunas realizaciones, al menos una parte de las sinapsis formadas puede ser excitatoria.

[0085] En algunas realizaciones, los axones del receptor pueden regenerarse en canales y formar contactos aposicionales con las dendritas de las células madre neurales implantadas.

[0086] En algunas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento pueden proporcionar una recuperación al menos parcial de las respuestas de potencial evocado motor (PEM). Los potenciales evocados motores se registran desde los músculos tras la estimulación directa de la médula espinal, ya sea magnética o eléctrica. En algunas realizaciones, estas respuestas de PEM pueden estar en los brazos y/o las piernas, incluidos los dedos de manos y pies. Un implante cargado con células madre puede aumentar las respuestas de PEM en comparación con un implante vacío entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10 veces, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10 veces, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 veces o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8 veces. En algunas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento pueden proporcionar al menos una mejora funcional parcial del comportamiento motor posterior a la lesión. El comportamiento motor de roedores tras la lesión se mide mediante la escala motora de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB). La escala (0-21) representa etapas secuenciales de recuperación y categoriza combinaciones de movimientos articulares, movimientos de las extremidades posteriores, pasos, coordinación de extremidades anteriores y posteriores, posición y estabilidad del tronco, colocación de las patas y posición de la cola.

[0087] En algunas realizaciones, después de la implantación, los canales del implante pueden llenarse uniformemente con células madre. En algunas realizaciones, tras la implantación, los canales pueden llenarse uniformemente con células madre neurales. En algunas realizaciones, las células madre pueden ocupar interfaces entre el implante y el receptor. En algunas realizaciones, las células derivadas de células madre en los canales pueden expresar un marcador neuronal, tal como, entre otros, Hu o NeuN. En otras realizaciones, las células derivadas de células madre en los canales pueden expresar un marcador de oligodendrocitos, tal como, por ejemplo, entre otros, Olig2 o un marcador de astrocitos, tal como, por ejemplo, GFAP. En algunas realizaciones, las células pueden expresar dos o más de los anteriores.

[0088] Sorprendentemente, en algunas realizaciones, no existen cuerpos celulares neuronales serotoninérgicos en los injertos de células madre neurales derivadas de la médula espinal. En algunas realizaciones, prácticamente no existen cuerpos celulares neuronales serotoninérgicos en los injertos de células madre neurales derivadas de la médula espinal.

[0089] En algunas realizaciones, los receptores implantados con los implantes descritos en el presente documento cargados con al menos un tipo de célula madre pueden presentar una latencia de PEM más corta en relación con los hospedadores implantados con implantes vacíos. En algunas realizaciones, los receptores implantados con los implantes descritos en el presente documento cargados con al menos un tipo de célula madre pueden mostrar una latencia de PEM que se asemeja mucho a la latencia observada en receptores intactos. En algunas realizaciones, la latencia de PEM puede estar entre aproximadamente 9 ms y aproximadamente 12 ms, entre aproximadamente 8 ms y aproximadamente 10 ms, entre aproximadamente 8 ms y aproximadamente 12 ms, entre aproximadamente 9 ms y aproximadamente 10 ms, o entre aproximadamente 7 ms y aproximadamente 13 ms.

[0090] Como se ha comentado, en algunas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento se imprimen. La bioimpresión de tejidos funcionales, en general, se enfrenta a muchos retos, entre los que se encuentra la falta de técnicas de biofabricación adecuadas para construir microarquitecturas 3D complejas esenciales para guiar el crecimiento celular y facilitar la maduración de los tejidos. Los procedimientos habituales de bioimpresión por inyección de tinta o extrusión utilizan boquillas para depositar los materiales, lo que permite imprimir estructuras simples en 2D, tales como piel o cartílago, y estructuras simples en 3D, tales como vasos sanguíneos, válvulas aórticas y tráqueas. En algunas realizaciones, un implante como el descrito en el presente documento puede fabricarse utilizando impresión 3D de proyección continua a microescala (µCPP). La impresión por proyección continua a microescala puede fabricar arquitecturas 3D complejas con diversos biomateriales y células. Este tipo de impresión puede realizarse sin necesidad de explorar en las direcciones X e Y (a diferencia de los procedimientos basados en boquillas). De este modo, se pueden fabricar objetos 3D en una impresión continua en la dirección Z. En algunos casos, sólo se necesitan unos segundos para imprimir un implante completo. En algunas realizaciones, un implante puede imprimirse en aproximadamente 1 segundo, aproximadamente 2 segundos, menos de aproximadamente 2 segundos, menos de aproximadamente 3 segundos, menos de aproximadamente 4 segundos, menos de aproximadamente 5 segundos, menos de aproximadamente 10 segundos, menos de aproximadamente 20 segundos o menos de aproximadamente 30 segundos. En una realización, sólo se necesitan aproximadamente 1,6 segundos para imprimir un implante completo de 2 mm. Esta velocidad de impresión representa un ritmo unas 1000 veces superior al de las impresoras de boquilla tradicionales.

[0091] El uso de luz focalizada para la polimerización genera una resolución de impresión de 1 µm, una mejora de 50 veces con respecto a las impresoras de inyección de tinta basadas en boquillas. En los enfoques basados en inyección de tinta o extrusión, la integridad mecánica puede verse comprometida por interfaces artificiales entre las gotas o líneas y puede causar fallos mecánicos durante o después de la aplicaciónin vivo. Al proporcionar una resolución sin capas en la dirección Z, es posible que las estructuras no presenten estos artefactos planares (interfaces) inducidos por un movimiento de una platina lineal a una nueva posición. Así pues, la µCPP descrita en el presente documento puede mejorar la integridad mecánica de los implantes impresos en 3D y ofrecer una rápida fabricación de complejas estructuras biomiméticas en 3D con una resolución a microescala.

[0092] En algunas realizaciones, el implante se imprime como una sola parte para su implantación en la zona de una sección de la médula espinal o una lesión de nervio periférico. En algunas realizaciones, el implante se imprime en dos o más partes, por lo que una médula espinal o un nervio periférico dañados, pero no seccionados, pueden tratarse con un implante descrito en el presente documento. Si la lesión de la médula espinal (LME), o del nervio periférico, no es una sección, dichas una o más partes del implante pueden implantarse rodeando el tejido superviviente, y las partes pueden adherirse entre sí utilizando un adhesivo biológicamente aceptable. De este modo, se puede conservar cualquier tejido superviviente y fomentar la regeneración de la médula espinal o del nervio periférico en la zona de la lesión.

[0093] Un implante se personaliza para cada paciente. Una vez obtenida la imagen de la lesión de la médula espinal o el nervio periférico de un paciente, se crea un modelo tridimensional mediante software CAD. A continuación, este modelo se utiliza para imprimir un implante específico para el paciente que se ajuste a la lesión y la rellene. Así, a veces no es necesario imprimir todo el implante tal como se ha diseñado, como en la figura 1D. Si la lesión no es tan grande como toda la médula espinal (lesión parcial), el modelo sería más pequeño que el mostrado en la figura 1D. El médico tomará la decisión final sobre qué parte de la zona de la lesión, o toda ella, puede rellenarse con un implante. Por ejemplo, el médico puede decidir imprimir sólo la parte de los canales (sin la forma de mariposa).

[0094] En otras realizaciones, un implante biomimético impreso en 3D se imprime basándose en una lesión de la médula espinal, o del nervio periférico, y solo una parte del implante impreso se implanta en la zona de la lesión. En algunas realizaciones, sólo se implanta la parte de panal.

[0095] El implante descrito en el presente documento puede presentar estabilidadin vivoy dar soporte a la regeneración y la remielinización de axones a través de zonas de LME extensa (completa). Más de 500000 personas en Estados Unidos padecen LME, con los consiguientes costes psicológicos y económicos importantes, tanto para los pacientes como para sus cuidadores. La impresión tridimensional mediante los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento puede permitir la fabricación de implantes personalizados que se "ajusten" a la anatomía precisa de la lesión de un individuo para estimular, guiar y alinear la regeneración de los axones. Además, los implantes pueden cargarse con células madre neurales para producir implantes que favorezcan aún más la reparación neural o la remielinización.

[0096] En algunas realizaciones, los axones motores del receptor pueden regenerarse y tender un puente más allá de una zona de lesión completa de la médula espinal, o de un nervio periférico, hacia dentro la médula espinal distal, o nervio periférico, a través de un implante biomimético.

[0097] En otras realizaciones, los presentes implantes pueden favorecer la recuperación de la función en el modelo más difícil de LME, la sección completa de la médula espinal.

[0098] En algunas realizaciones, por medio de la convergencia de la impresión 3D rápida y la biología de células madre, los presentes implantes pueden ofrecer tratamiento de la médula espinal, o de un nervio periférico, proporcionando una terapia regenerativa específica para el paciente.

[0099] En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden favorecer la regeneración axonal después de una lesión de la médula espinal o de un nervio periférico.

[0100] En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden proporcionar la regeneración o la remielinización de más de cientos de axones lesionados del receptor a distancias de 1-20 milímetros o más. En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden proporcionar la regeneración o la remielinización de más de miles de axones lesionados del receptor a distancias de 1 a 20 milímetros o más. En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden proporcionar la regeneración o la remielinización de axones del receptor a distancias de 1-20 mm, de 1-10 mm, de 1-5 mm, de 1-4 mm, de 1-3 mm, de 1-2 mm, de 2-4 mm, de 3-4 mm, de 2-5 mm, o de 3-5 mm. En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden dar soporte a axones que pueden extenderse a distancias superiores a aproximadamente 50 mm, superiores a aproximadamente 100 mm, superiores a aproximadamente 150 mm, superiores a aproximadamente 200 mm, o más.

[0101] En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden proporcionar a los receptores una mejora funcional incluso después de una sección completa de la médula espinal o de un nervio periférico. En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden proporcionar beneficios funcionales a los receptores después de la implantación de células madre, que dan como resultado el "empalme" del circuito lesionado, en el que los axones del receptor penetran y forman sinapsis con las neuronas en el injerto, y los axones derivados del injerto, a su vez, se extienden desde la zona de la lesión y forman sinapsis con las neuronas intraespinales o periféricas del receptor caudales a la lesión. En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden optimizar la utilidad funcional de los axones que emergen de los implantes de células madre neurales en zonas de lesión. En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden alinear circuitos cortados con sus proyecciones caudales correctas de sustancia blanca.

[0102] En algunas realizaciones, los presentes implantes pueden proporcionar implantes "a medida" para lesiones de pacientes individuales.

[0103] También se describen procedimientos de fabricación de los implantes descritos en el presente documento. Los procedimientos pueden incluir las etapas de explorar una región que necesita tratamiento e imprimir un implante como se describe en el presente documento. La impresión puede ser en 3D.

[0104] También se describen kits. Los kits pueden incluir un implante e instrucciones de uso en un envase unificador.

[0105] Algunos kits pueden incluir una exploración de una región que necesita tratamiento e instrucciones de uso en un recipiente unificador.

[0106] Otros kits pueden incluir una exploración de una región que necesita tratamiento, los polímeros necesarios para imprimir un implante e instrucciones de uso en un recipiente unificador.

[0107] Otros kits pueden incluir una exploración de una región que necesita tratamiento, PEGDA y GelMa para imprimir un implante, e instrucciones de uso en un recipiente unificador.

[0108] Ejemplo 1

[0109] Se utilizó médula espinal de rata como plantilla para diseñar un implante de médula espinal.

[0110] Materiales del implante utilizados en este ejemplo: El PEGDA (Pn = 700 Da) se adquirió a Sigma-Aldrich (EE. UU.). La gelatina de metacrilato (GelMa) se sintetizó como se describe en informes anteriores (Soman, P.et al., Biotechnol. Bioeng., 110:3038-3047, 2013). El fotoiniciador fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP) se sintetizó como se ha documento previamente (Fairbanks, B.D.et al., Biomaterials, 30:6702-6707, 2009). El material de matriz utilizado para imprimir los implantes se elaboró mezclando GelMa al 7,5 % (p/v), PEGDA al 25 % (v/v) y LAP al 0,225 % (p/v) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS).

[0111] Impresión en 3D de implantes utilizada en este ejemplo: La bioimpresora 3D descrita en el presente documento (µCPP) incluye los seis componentes siguientes, como se muestra en la figura 1A: (1) una fuente de luz LED UV (365 nm) para la fotopolimerización; (2) un chip digital de microespejos (DDM) (Texas Instruments) compuesto por una disposición de microespejos de 1920 x 1080 para la generación de patrones ópticos; (3) un sistema óptico de proyección para visualizar el patrón óptico en el chip DDM en el plano de fabricación de la platina; (4) una platina automática que sostiene la solución de monómero para la fabricación; (5) una cámara digital para la supervisión en tiempo real y la obtención de imágenes del proceso de fabricación; y (6) un ordenador que coordina la fuente de luz UV, el chip DDM, la platina y la cámara para el proceso de impresión en 3D.

[0112] Impresión del implante de médula espinal de rata utilizada en este ejemplo: Se generaron imágenes digitales del núcleo (que representa la materia gris de la médula espinal) y de la cubierta (que representa la materia blanca de la médula espinal) procesando la imagen en sección transversal de una médula espinal, que posteriormente se importaron al chip DDM para controlar los microespejos durante el proceso de impresión. Se incorporaron canales (de 200 µm de diámetro) en la cubierta para proporcionar una guía lineal, o paralela, para la regeneración axonal. El núcleo se diseñó como un bloque sólido de GelMa, PEGDA al 25 % (v/v) y LAP al 0,225 % (p/v) para mejorar la resistencia mecánica del implante impreso. La solución monomérica del material matriz se cargó en un depósito con un espaciador de PDMS de 2 mm para controlar la altura del eje z de los implantes impresos. Se inició un proceso de impresión continua utilizando un software de desarrollo propio para controlar la impresora 3D. El implante se imprimió en dos etapas, de 0,8 segundos de duración cada una, una para la imagen de la cubierta y la siguiente para la imagen del núcleo. A continuación, se retiró el implante impreso del depósito y se enjuagó tres veces con DPBS estéril y antibióticos (penicilina-estreptomicina al 1 %).

[0113] Impresión del implante de médula espinal humana utilizada en este ejemplo: Se utilizó una resonancia magnética cervical para modelizar una lesión medular crónica típica. Se trazó la lesión y se utilizó un modelo 3D de diseño asistido por ordenador ("Computer-Aided Design", CAD) de la médula espinal para ajustarlo a las dimensiones de la lesión humana. A continuación, el modelo 3D se cortó en una serie de máscaras digitales a lo largo de la dirección longitudinal de la médula espinal, que se importaron al chip DDM secuencialmente. Al cambiar dinámicamente la máscara digital con el movimiento de la platina, se obtuvo el implante de médula espinal específico para el paciente mediante los procedimientos descritos anteriormente.

[0114] Fabricación de andamios de plantillas de agarosa utilizados en este ejemplo: Las plantillas de haces de fibras multicomponente ("multi-component fiber bundle", MCFB) se fabricaron a partir de fibras de poliestireno de 200 µm de diámetro (Paradigm Optics, Vancouver, WA) dispuestas en una disposición hexagonal muy compacta separada por una matriz continua de poli(metacrilato de metilo) (PMMA). Se dispusieron con un espaciado de 66 µm en una disposición con forma de panal para generar implantes finales con tamaños de pared de 66 µm y diámetros de canal de 200 µm. Los haces se extruyeron y fusionaron simultáneamente, de forma que las fibras de poliestireno quedaban orientadas paralelamente al eje longitudinal de los haces. Las plantillas de haces de fibras multicomponente se recortaron hasta una longitud de 2 mm y una anchura y profundidad de sección transversal de 1,5 mm. Se unieron cierres terminales de poliestireno de 1,5 mm de longitud a los terminales de los haces de fibras utilizando ciclohexano para anclar las fibras de poliestireno y formar una plantilla de haces de fibras multicomponente rígida y externa. A continuación, se alinearon en serie seis de estas unidades de haces de fibras multicomponente con dos cierres laterales de poliestireno, que las aglutinó en una disposición de plantilla lineal. A continuación, se eliminó selectivamente la matriz de poli(metacrilato de metilo) sumergiéndola tres veces en carbonato de propileno al 99,7 % (Sigma-Aldrich), seguido de un enjuague con etanol al 95 % y otro con agua destilada. La agarosa ultrapura (30 mg/ml, Sigma-Aldrich) se disolvió en agua destilada a 100 °C y después se enfrió hasta 65 °C. Las plantillas de haces de fibras multicomponente se sumergieron en la solución de agarosa y se centrifugaron (300 rpm durante 30 s) para permeabilizar la agarosa a través de la disposición compacta de fibras de poliestireno. A continuación, se dejó gelificar el molde de agarosa a temperatura ambiente, se recortó y se sumergió en tetrahidrofurano al 99 % (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente durante 24 h. Esto se repitió dos veces para eliminar el molde de poliestireno, lo que dio lugar a andamios de agarosa individuales que flotaban libremente. Se recogieron los andamios y se lavaron secuencialmente en acetona, etanol al 95 % y tres ciclos de agua estéril. Se conservaron en agua estéril a temperatura ambiente hasta su uso.

[0115] Preparación de las células madre neurales E14 utilizadas en este ejemplo: Brevemente, se diseccionaron las médulas espinales de embriones E14 F344 que expresan GFP y se retiraron las meninges. El tejido se tripsinizó durante 15 minutos y se centrifugó a 2500 rpm a temperatura ambiente. El tejido se resuspendió en medio NeuroBasal (Gibco) que contenía B27 al 2 % (Gibco), y el tejido de la médula espinal se trituró suavemente utilizando pipetas Pasteur pulidas al fuego progresivamente más pequeñas. A continuación, las células se centrifugaron a 2500 rpm durante 2 minutos, se resuspendieron en medio NeuroBasal que contenía B27 y se filtraron utilizando un colador de filtro celular de 40 µm.

[0117] Procedimientos quirúrgicos utilizados en este ejemplo: Se siguieron estrictamente las directrices de los NIH para el cuidado y la seguridad de los animales de laboratorio. Los implantes se implantaron en una sección completa a nivel de la médula espinal T3. Brevemente, se anestesió profundamente a los animales, se realizó una laminectomía T3, seguida de una sección de la médula espinal utilizando una combinación de microtijeras y microaspiración. Se retiró un bloque de 1,8 mm y se implantó un implante de 2 mm de longitud, con lo que el implante quedó sujeto de forma segura entre los segmentos seccionados de la médula espinal. El grupo 1 (n = 14) recibió andamios de agarosa vacíos, el grupo 2 (n = 14) recibió implantes impresos en 3D vacíos, el grupo 3 (n = 14) recibió implantes impresos en 3D cargados con células madre neurales E14 suspendidas en una matriz de fibrina que contenía un cóctel de factores de crecimiento de cuatro componentes: BDNF 50 ng/µl (Peprotech) para favorecer la supervivencia de las células madre neurales, VEGF 10 ng/µl (Peprotech) y bFGF 10 ng/µl (Peprotech) para estimular la angiogénesis, y MDL2817050 µM (Sigma), un inhibidor de la calpaína para la neuroprotección. El grupo 4 (n = 8) se sometió a una cirugía simulada en la que se realizó una lesión, pero no se implantó ningún implante. El grupo 5 (n = 8) recibió implantes de células progenitoras neurales multipotentes derivadas de la médula espinal de rata E14, como se ha descrito previamente (Lu, P.et al., Cell, 150:1264-1273, 2012). Las células se suspendieron en la misma matriz de fibrinógeno/trombina con el cóctel de factores de crecimiento descrito anteriormente. Tras el implante, se suturaron los músculos dorsales y la piel y se administraron antibióticos y analgésicos.

[0119] Se diseñaron microcanales (200 µm de diámetro) para guiar y alinear los axones desde su punto de sección por encima de la lesión hasta su punto correcto de reentrada en la médula espinal intacta por debajo de la lesión (figura 1A-E). La zona del núcleo interno normalmente no contiene axones que se proyectan por debajo de la zona de la lesión. Así, este componente del implante se diseñó como una región sólida que mejoraba el soporte estructural del implante. Trabajos anteriores con implantes de microcanales de agarosa demostraron que el 80 % de los axones que entraban en la zona de la lesión eran guiados por el implante y tendían un puente hacia el lado opuesto de la lesión. Sin embargo, la agarosa provoca una respuesta a cuerpos extraños consistente en una capa celular reactiva a base de colágeno que atenúa y atrapa los axones dentro del implante, impidiendo la salida de los axones de los canales. Así, los implantes se fabricaron a partir de un material degradable que puede reducir la capa celular reactiva debido a la reducción de la respuesta a cuerpos extraños, lo que permite que los axones del receptor penetren y atraviesen mejor la lesión. Se utilizó una combinación de dos materiales biocompatibles, diacrilato de polietilenglicol (PEGDA) y gelatina de metacrilato (GelMa), como material de implante. El PEGDA no es adhesivo para las células, por lo que se añadió GelMa, que es un colágeno desnaturalizado fotopolimerizable que conserva los ligandos de unión celular y los sitios de degradación de metaloproteinasa de la matriz (MMP), lo que podría mejorar la viabilidad celular a largo plazo. Las concentraciones de cada material y la densidad de reticulación de los implantes impresos pueden diseñarse para imitar las propiedades mecánicas del tejido nativo de la médula espinal, ya que un desajuste de las propiedades mecánicas entre un implante y el receptor podría provocar compresión o laceración en las interfaces de la médula espinal, causando un fallo en la integración.

[0121] Se utilizó un análisis mecánico dinámico (AMD) para medir el módulo elástico de los implantes de PEGDA/GelMa impresos en 3D. El módulo elástico de los implantes bioimpresos utilizados para la implantación se situó entre 260 kPa y 300 kPa (figura 2), de acuerdo con el módulo elástico de la médula espinal nativa de 200-600 kPa.

[0123] Se realizó el inmunomarcaje. Las médulas espinales se seccionaron en un criostato a intervalos de 20 µm y se procesaron para: 1) el marcaje con GFP, para evaluar la supervivencia y la diferenciación de las células injertadas y la extensión de los axones (GFP policlonal de conejo, Invitrogen, dilución de 1:500); 2) marcadores de células neurales, incluidos Hu para neuronas jóvenes (policlonal humano, dilución de 1:500), NeuN para núcleos neuronales maduros (monoclonal de ratón, Abcam, dilución de 1:500), MAP-2 para neuronas maduras (monoclonal de ratón, BD Biosciences, dilución de 1500), neurofilamento 200 para marcar axones (monoclonal de ratón, Millipore, dilución de 1:500), serotonina para neuronas maduras y axones (5HT, policlonal de cabra, ImmunoStar, dilución de 1:500), proteína ácida fibrilar glial para astrocitos (GFAP, policlonal de pollo, Millipore, dilución de 1:500), Olig2 para oligodendrocitos (Olig 2, monoclonal de ratón, IBL, dilución de 1:200); 3) S100 para marcar las células de Schwann (policlonal de conejo, Dako, dilución de 1:500); 4) colágeno de tipo IV (policlonal de conejo, Biogenex, dilución de 1:500). Las secciones se incubaron durante una noche a temperatura ambiente para los anticuerpos primarios, seguida de la incubación en anticuerpos secundarios de cabra o burro conjugados con Alexa 488, 594 o 647 (1:250, Invitrogen) durante 3 horas a temperatura ambiente. El grosor de la capa celular reactiva se midió en secciones teñidas con Nissl con un aumento total de 200x (se cuantificaron ocho secciones por animal y los resultados se expresaron como media ± EEM). La inmunorreactividad de GFAP se cuantificó como el valor gris medio por píxel medido en la interfaz médula espinal del receptor-implante, en secciones inmunomarcadas con GFAP (se cuantificaron ocho secciones por animal, y los resultados se expresaron como media ± EEM). La cuantificación de los axones motores 5HT se realizó utilizando imágenes ampliadas 200X de la parte de 400 µm de la parte caudal de los canales (los axones se contaron manualmente y se cuantificaron 8 secciones por animal). La diferenciación de las células madre dentro de los canales se cuantificó utilizando los anticuerpos mencionados. Cada portaobjetos se contramarcó con DAPI y GFP y las células se contaron manualmente. El número de cada tipo celular se normalizó con respecto al total de núcleos marcados con DAPI/GFP en los canales (se cuantificaron ocho secciones por animal; la cuantificación se realizó mediante ImageJ).

[0124] Análisis estadístico - Las comparaciones de dos grupos se ensayaron mediante la prueba de latde Student bilateral (software JMP) a un nivel de significación designado de P < 0,05. Las comparaciones entre grupos múltiples se ensayaron mediante ANOVA unilateral (software JMP) con un nivel de significación designado de P < 0,05, seguido de un análisisa posteriorimediante la prueba de Tukey.

[0125] Microscopía electrónica - El análisis detallado de la formación de sinapsis y la mielinización de los axones se realizó mediante microscopía electrónica de la siguiente manera: los sujetos se perfundieron con paraformaldehído al 4 % y glutaraldehído al 0,25 %, las médulas espinales se postfijaron con tetróxido de osmio al 1 %, se deshidrataron y se incluyeron en resina Durcupan. Se tiñeron secciones semifinas de 0,5 µm con azul de toluidina para determinar la morfología general. A continuación, se seccionaron secciones de 60 nm con un ultramicrotomo y se visualizaron con un microscopio FEI 200KV Sphera en el Centro de Microscopía Crioelectrónica de la UCSD.

[0126] Obtención de imágenes de microscopía electrónica de barrido - Se utilizó la microscopía electrónica de barrido ("scanning electron microscopy", SEM, Zeiss Sigma 500) para obtener imágenes del implante de médula espinal específico del paciente. Los implantes se deshidrataron en una serie de baños de etanol y se secaron con un secador de punto supercrítico (Tousimis AutoSamdri 815A) y, a continuación, se recubrieron por pulverización catódica con iridio utilizando Emitech K575X durante 7 segundos a una corriente de depósito de 85 mA. Tras el recubrimiento por pulverización catódica, se tomaron imágenes de los implantes con el microscopio electrónico de barrido Zeiss Sigma 500 a 5 kV.

[0127] Análisis funcional - La escala de puntuación de la locomoción de 21 puntos en campo abierto BBB fue evaluada semanalmente por dos observadores independientes que no conocían las identidades de los grupos.

[0128] Electrofisiología - Se midieron los PEM en las extremidades posteriores. Brevemente, los animales fueron anestesiados utilizando propofol (100 mg/kg, PropoFlo Abbot). Se llevó a cabo la estimulación eléctrica transcraneal (duración del pulso de 1 ms a 9 mV con un estimulador aislado de corriente constante DS3 (Digitimer, Welwyn Garden City, Reino Unido)) mediante dos electrodos de estimulación de acero inoxidable de 30 G situados percutáneamente. Los PEM se registraron mediante electrodos en anillo situados en ambas extremidades posteriores hasta que entre tres y cinco potenciales registrados más altos (estables) fueron similares. Los PEM se registraron en la semana 26 tras el implante.

[0129] En algunas realizaciones, una ventaja de la bioimpresión 3D es la capacidad de imprimir rápidamente implantes de diferentes tamaños (figura 17A-B) y formas poco frecuentes para ajustarse a las localizaciones de las lesiones individuales de los pacientes, tal como se identificaron preoperatoriamente en las resonancias magnéticas. Se imprimió un implante para ajustarse a la forma y el tamaño concisos de la cavidad de una lesión crónica de un paciente, mostrada en la figura 3A-E.

[0130] Los implantes bioimpresos se implantaron en zonas de sección completa T3 de médula espinal de rata. Se trata del modelo más grave de lesión medular y el más difícil para el estudio de la regeneración de la médula espinal. También es un modelo para estudiar la regeneración axónica, ya que los axones se seccionan en el momento de la lesión, a diferencia de la contusión, en la que hay un borde de tejido preservado con axones supervivientes, lo que dificulta la determinación de si los axones observados se están regenerando realmente o si se trata de axones preservados o que están brotando. Diecinueve ratas Fischer 344 fueron sometidas a secciones completas de la médula espinal T3 y a la colocación inmediata de un implante de 2 mm de longitud en la zona de la lesión. Ocho animales de control sólo tenían la lesión. Cuatro semanas más tarde, se retiraron las médulas espinales y se evaluaron la estructura del implante, la biocompatibilidad y la regeneración/remielinización axonal. Los resultados se compararon con los de animales que habían recibido previamente implantes de plantillas de agarosa con la misma lesión y el mismo tiempo de supervivencia.

[0131] Cuatro semanas después de la implantación, los implantes de PEGDA/GelMa impresos en 3D mantuvieron la integridad estructural: los canales y el núcleo sólido del implante conservaron su estructura previa a la implantación sin roturas ni deformaciones en todos los animales (figura 4). La biodegradación del implante aún no era evidente en este punto temporal de cuatro semanas. Los esfuerzos anteriores con otros materiales de implante, tal como el ácido hialurónico, dieron como resultado una degradación más rápida del implante y el colapso de la estructura (figura 18A). La degradación del implante se caracterizó a lo largo de 6 meses, mostrando una reducción de 44 µm en el grosor de la pared, lo que representa la conservación del 66 % de la estructura (figura 19). El mantenimiento de la estructura del implante se considera fundamental para conservar el soporte físico en la zona de la lesión y para sostener, organizar y alinear el crecimiento de los axones en regeneración.

[0132] El análisis anatómico seis meses después demostró que todos los implantes conservaban su arquitectura 3D (figura 15A); sin embargo, el grosor de las paredes de los implantes se redujo en un 49 % en comparación con su tamaño previo al implante, lo que sugiere una lenta degradación con el paso del tiempo. Entre los animales implantados con implantes vacíos, los axones marcados con neurofilamento del receptor se regeneraron en los implantes en cantidades relativamente modestas (118 ± 8), similares a las observadas cuatro semanas después de la implantación (97 ± 8 axones). En ningún caso se regeneraron axones del receptor más allá del implante y hacia dentro la médula espinal distal del receptor en animales implantados con implantes vacíos. Entre los animales implantados con implantes 3D biomiméticos de PEGDA/GelMa cargados con células madre neurales, las células injertadas sobrevivieron durante el periodo de seis meses y llenaron completamente todos los canales (figura 15). No se detectó marcaje de nestina, lo que indica la finalización de la maduración de las células madre neuronales implantadas, y tampoco se detectó marcaje de Ki67, lo que indica la finalización de la división celular de los injertos. Como se observó en los implantes de 4 semanas, los axones inmunorreactivos a 5HT entraron en el implante. Unos 87 ± 5 axones serotoninérgicos alcanzaron el extremo caudal de los canales cargados con células madre neurales, y continuaron regenerándose hacia dentro de la médula espinal caudal, similar al número de axones observado cuatro semanas después de la implantación (figura 14B); esta observación sugiere que la regeneración de los axones serotoninérgicos en los implantes se completa en cuatro semanas. Los axones motores corticoespinales del receptor, marcados anterógradamente mediante inyecciones de vectores AAV2 que expresan la proteína roja fluorescente ("red fluorescent protein", RFP) en la corteza motora, también se regeneraron en implantes cargados con células madre (figura 15B) y se extendieron hasta los puntos medios de los implantes, a una distancia de 1 mm. Los axones corticoespinales formaron estructuras putativas similares a botones en neuronas marcadas con NeuN dentro de los canales del implante (figura 15C). Además, los axones marcados con GFP derivados del injerto se proyectaron fuera de los implantes y dentro de la médula espinal del receptor caudales a la lesión, formando estructuras putativas similares a botones sobre las neuronas del receptor en la médula espinal caudales a la lesión (figura 15D-E). La cantidad de crecimiento axonal derivado del injerto desde los implantes hasta el interior de la médula espinal distal del receptor (figura 15D) superaba con creces el número de axones serotoninérgicos del receptor que se regeneraban más allá del implante; esta observación sugiere que el restablecimiento de los relés neuronales a través de la zona de la lesión, si existe, puede estar mediada por axones del receptor que se están regenerando en el implante, forman sinapsis con las células madre neurales injertadas, y los axones derivados de las células madre se extienden hacia dentro de la médula espinal distal del receptor.

[0134] Se produjo una atenuación de la capa celular reactiva entre los animales que recibieron implantes impresos en 3D, en comparación con los andamios de plantillas de agarosa, caracterizada por la reducción del depósito de colágeno (figura 4B) y la reducción del tejido granular (figura 5A). La capa celular reactiva tenía un grosor de 340 ± 52 µm, una reducción significativa del 35 % en comparación con los andamios de agarosa (P < 0,05; figura 5A). Las respuestas de los astrocitos también se vieron atenuadas por los implantes impresos en 3D: en los sujetos con lesión de control, los astrocitos se volvieron reactivos y "amurallaron" la zona de la lesión (figura 6A). En los animales con andamios de agarosa, las paredes de los astrocitos seguían presentes y separaban el andamio de la médula espinal del receptor (figura 6B). Por el contrario, los implantes impresos en 3D mostraron una atenuación del grosor de la cicatriz astrocitaria y una reorganización de la cicatriz, de forma que ya no interrumpía la continuidad entre la médula espinal del receptor y los canales del implante (figura 6C). En algunas realizaciones, los procesos de los astrocitos pasaron de formar una pared perpendicular en la interfaz con el receptor a formar filamentos que penetraban linealmente en el implante, con los que se asociaban los axones en regeneración del receptor. Los implantes impresos tridimensionales mostraron una reducción del 66 % en la inmunorreactividad de los astrocitos, en comparación con los andamios de agarosa, y una reducción del 97 %, en comparación con los animales que sólo presentaban lesiones (P < 0,05; figura 6D). Los implantes se vascularizaron fácil y extensamente a lo largo de toda su longitud (figura 7A-B).

[0136] De acuerdo con la reducción del grosor de la capa celular reactiva, los axones del receptor que se acercaban al implante impreso en 3D se alineaban a lo largo del eje rostral-caudal (descendente) de la médula espinal, y penetraban fácilmente en los canales del implante sin desviación; esto contrastaba con la frecuente desalineación y desviación axonal que se producía en las interfaces de los andamios de agarosa con el receptor (figura 8A-B). Las células de Schwann del sistema nervioso periférico migraban hacia el interior de los implantes y recubrían o remielinizaban los axones en regeneración del receptor (figura 9A-C).

[0138] En algunas realizaciones, los implantes para la reparación de la médula espinal descritos en el presente documento pueden cargarse con células que pueden mejorar la regeneración o la remielinización. Así, los implantes impresos en 3D se cargaron con células madre neurales de rata que expresaban GFP extraídas de médulas espinales embrionarias de día 14 de ratas Fischer 344. Un total de 3 x 10<6>células se cargaron en implantes en un volumen de 8 µl mediante inyección directa. Un total de 14 ratas fueron sometidas a una sección completa de la médula espinal T3, en la que se extrajo un segmento de médula espinal de 1,8 mm de longitud, y se implantó un implante impreso en 3D de 2 mm de longitud cargado con células madre neurales. Los animales sobrevivieron cuatro semanas y fueron sacrificados para evaluar la integridad del implante, la supervivencia de las células y la regeneración y la remielinización de los axones del receptor.

[0140] En algunas realizaciones, las células madre sobrevivieron en cada animal injertado y llenaron los canales del implante (figura 10A, figura 20A-D). También estaban presentes células madre neurales en las interfaces entre los implantes y la médula espinal del receptor, sin distorsionar la arquitectura del implante o de la médula espinal del receptor (figura 20A-D). De las muestras analizadas, el 47 ± 2 % de las células madre injertadas expresaron el marcador neuronal temprano Hu (figura 21A), el 20 ± 3 % de las células injertadas expresaron el marcador neuronal maduro NeuN (figura 521B), el 11 ± 2 % de las células expresaron el marcador de oligodendrocitos Olig2 (figura 21C), y el 21 ± 3 % de las células expresaron el marcador de astrocitos GFAP (figura 21D y 22). No se detectó el marcador del estado de célula madre nestina.

[0142] Los axones del receptor penetraron fácilmente en los implantes (distinguiéndose de los axones derivados del injerto por la ausencia de expresión del indicador GFP) (figura 10B). Muchos axones serotoninérgicos de largo recorrido del receptor también penetraron fácilmente en los implantes impresos en 3D cargados con células madre y se linealizaron de acuerdo con la orientación de los canales (figura 10C). Un injerto de células madre no fue capaz de linealizar los axones que habían penetrado (figura 23). Los axones 5HT fueron guiados hacia los extremos caudales de los implantes para la regeneración (figura 10E). Por el contrario, pocos axones serotoninérgicos alcanzaron el extremo caudal de implantes vacíos (carentes de rellenos de células madre) o de un injerto de células madre (figura 24A-B). Se cuantificó una media de 85 ± 21 axones serotoninérgicos dentro de los 400 µm caudales de los canales cargados de células madre por implante y por animal, en comparación con 11± 5 axones en implantes vacíos impresos en 3D. Una media de 8 ± 4 axones serotoninérgicos alcanzó el extremo de la zona de la lesión en los animales con injertos de células madre sin implantes, una reducción de 10 veces en el número de axones en comparación con los implantes que contienen injertos de células madre (P < 0,05 ANOVA, P < 0,05 Tukeya posteriori, que comparan implantes con células madre con implantes sin células madre; figura 10F). Por lo tanto, los implantes impresos en 3D que contienen células madre neurales pueden, en algunas realizaciones, mejorar la regeneración de los axones del receptor hacia el extremo caudal de una lesión. En otras realizaciones, esta mejora puede ser significativa y sustancial.

[0144] En algunas realizaciones, los axones motores serotoninérgicos del receptor se regeneraron completamente a través del sitio de lesión/implante y volvieron a entrar en la médula espinal caudal (figura 10G). Los axones serotoninérgicos situados en la médula espinal del receptor caudales a la lesión no procedían del injerto, ya que las células madre neurales del implante no presentaban inmunomarcaje para 5HT (serotonina) y estos axones no presentaban marcaje para GFP (figura 25). Allí, 2 mm más allá del borde caudal del implante, se detectaron axones serotoninérgicos en la materia blanca y gris de la médula espinal del receptor y con frecuencia se ramificaron para entrar en la materia gris (figura 26A-C). Se detectaron axones serotoninérgicos de largo recorrido hasta 3,5 mm más allá de la zona de la lesión (figura 10H), pero no más allá, lo que apoya aún más el hecho de que se trataba de axones en regeneración. En algunas realizaciones, los presentes implantes y dispositivos pueden proporcionar la regeneración de axones motores del receptor dentro y más allá de los implantes implantados en zonas de sección completa de la médula espinal. La regeneración se demostró además por la presencia de axones inmunomarcados con GAP43 en los canales y en la médula espinal caudal del receptor (figura 27A-B).

[0146] En algunas realizaciones, un obstáculo de la ingeniería tisular es la vascularización de los órganos. El azul de toluidina y el análisis microscópico electrónico demostraron una extensa vascularización dentro de los canales del implante (figura 28A-B) descritos en el presente documento. La presencia de inmunomarcaje del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) alrededor de esos vasos sanguíneos confirmó la presencia de pericitos y el restablecimiento de la barrera hematoencefálica (figura 29). El análisis microscópico electrónico de los axones en los canales llenos de células madre neurales demostró una gama de calibres de axones y estados de mielinización, desde axones pequeños no mielinizados (<1 µm de diámetro) hasta axones grandes mielinizados (1-3 µm, figura 11). La tinción con azul de toluidina mostró que los oligodendrocitos mielinizaban esos axones (figura 12). Dado que los implantes estaban cargados con células madre neurales que expresaban el marcador neuronal maduro NeuN, existía la posibilidad de que se formaran sinapsis entre los axones en regeneración del receptor y las neuronas de los canales del implante. En algunas realizaciones, se observaron fácilmente sinapsis asimétricas que recibían entradas de axones que contenían vesículas sinápticas redondeadas, típicas de las sinapsis excitatorias (figura 13). Los axones serotoninérgicos del receptor que se regeneran en canales pueden estar estrechamente asociados con dendritas de neuronas derivadas de células madre, identificadas por comarcaje con MAP2 y GFP (figura 14), lo que también sugiere la formación de sinapsis.

[0148] Los resultados funcionales y conductuales se midieron mediante dos pruebas independientes. Veintiséis semanas después del implante se realizó un estudio electrofisiológico aplicando estimulación eléctrica transcraneal a la corteza motora y se registraron los potenciales evocados motores (PEM) de las extremidades posteriores. El PEM puede utilizarse para comprobar la recuperación electrofisiológica de la función (tanto en seres humanos como en animales) para comprobar el control supraespinal del cerebro sobre el sistema nervioso periférico mediante el registro de señales EMG de los músculos. Veintiséis semanas después de la lesión, las ratas implantadas con implantes impresos en 3D cargados con células madre neurales muestran una recuperación de las respuestas de PEM que fue abolida tras la resección de la médula espinal en el nivel espinal C8 (por encima de la zona del implante; T3). Estos datos indican que la actividad muscular en las extremidades posteriores fue generada por la transmisión sináptica desde el receptor a través del implante (figura 15A-E, figura 31). Así, en algunas realizaciones, los implantes descritos pueden proporcionar transmisión sináptica desde el receptor a través del implante para proporcionar actividad muscular en las extremidades posteriores.

[0150] Dado que las extremidades posteriores estaban desnervados y los animales no se apoyaban sobre ellos, los músculos se atrofiaron y había menos unidades musculares que pudiesen responder. Esto explica la diferencia de magnitud entre los animales intactos y los experimentales (figura 15A-E). En consonancia con esta observación, la amplitud de los PEM fue significativamente mayor que en los animales con implantes vacíos (p< 0,05, figura 15E). Además, la latencia de los PEM registrados (tiempo hasta la amplitud máxima) fue más corta en los implantes de células madre y se aproximó más a la latencia intacta observada (ANOVA,p< 0,01, figura 30).

[0152] Para determinar el grado de recuperación funcional motora mediante implantes biomiméticos 3D de PEGDA/GelMa, se evaluó a los animales mediante la escala locomotora de Beattie Basso Bresnahan (BBB) durante un periodo de 6 meses, hasta que el comportamiento se estabilizó. Los animales que recibieron implantes cargados con células madre neurales mostraron una recuperación funcional significativa en comparación con los animales con implantes vacíos.

[0153] La locomoción de las extremidades posteriores estaba deteriorada (por ejemplo, gravemente) tanto en los sujetos de control de la lesión como en los sujetos injertados, durante las primeras cuatro semanas tras la lesión. En la quinta semana, los receptores del implante cargado con CMN empezaron a mostrar mejoría en la escala BBB, alcanzando un nivel de 7, lo que indica movimiento alrededor de cada articulación de la extremidad posterior, en contraste con un movimiento mínimo o nulo en los controles lesionados (medidas repetidas de ANOVA,p< 0,01; puntos temporales individuales *p< 0,01; figura 16).

[0154] Las puntuaciones funcionales alcanzaron un valor medio de 6,6 0,5 puntos (+ EEM) en la escala BBB en animales que recibieron células madre neurales en implantes seis meses antes, lo que indica movimiento alrededor de cada articulación de la extremidad posterior, en contraste con una puntuación media de 0,3 0,2 puntos en los controles con implantes vacíos, lo que refleja movimientos inconstantes alrededor de una sola articulación (*p< 0,01, ANOVA de medidas repetidas; prueba de latpara puntos temporales individuales y Tukeya posteriori; figura 15F). La formación de relés neurales se investigó más a fondo mediante la transmisión electrofisiológica a través del sitio de sección completo, midiendo el PEM miogénico de las extremidades posteriores en respuesta a la estimulación eléctrica del cerebro (figura 15G, figura 16A-C).

[0155] Seis meses después de la lesión, las ratas implantadas con implantes 3D biomiméticos de PEGDA/GelMa cargados con células madre neurales mostraron recuperación de las respuestas evocadas motoras, mientras que los animales implantados con implantes vacíos mostraron respuestas en la zona del ruido basal (p< 0,01, prueba de lat; figura 15G y figura 16D). La resección de la médula espinal a nivel de C8 (por encima de la zona del implante) provocó la pérdida de todos los potenciales evocados en las extremidades posteriores (figura 16A-C), confirmando la formación de nuevos relés electrofisiológicos a través de la lesión.

[0156] Este estudio demuestra el uso de la impresión 3D rápida para imprimir estructuras biomiméticas del sistema nervioso central. Estos implantes pueden individualizarse fácilmente para adaptarse a formas y longitudes de lesión específicas. Los implantes tridimensionales impresos de PEGDA/GelMa pueden mantener su estructura durante al menos 26 semanasin vivo. Además, los implantes impresos descritos pueden favorecer el injerto de células madre neurales. Más aún, los implantes impresos descritos pueden favorecer la formación de nuevas sinapsis. En algunas realizaciones, los implantes se vascularizaban bien, proporcionando una disponibilidad adecuada de sangre, oxígeno y nutrientes para sostener la supervivencia constante de las células y los axones.

[0157] Las divulgaciones anteriores son realizaciones ilustrativas. Las personas expertas en la materia deben comprender que los dispositivos, las técnicas y los procedimientos descritos en el presente documento ilustran realizaciones representativas que funcionan bien en la práctica de la presente divulgación.

[0158] En el presente documento se describen realizaciones preferidas de la presente invención, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, las variaciones en esas realizaciones preferidas se harán evidentes para los expertos en la técnica tras leer la descripción anterior.

[0159] La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un implante biomimético para lesiones de la médula espinal o de nervios periféricos, comprendiendo el implante:

un implante tridimensional (3D) que incluye un primer extremo y un segundo extremo, que comprende un núcleo y una cubierta y está conformado con una forma biomimética que imita la estructura de un nervio o de la médula espinal en la zona de la lesión; y

una pluralidad de canales lineales dentro de la cubierta que se originan en el primer extremo y terminan en el segundo extremo, en el que la pluralidad de canales lineales dentro de la cubierta da soporte a la regeneración axonal del receptor lineal y alineada a través de la zona de la lesiónin vivo,en el que la estructura del implante permanece intacta cuatro semanas después de la implantación, en el que el implante tiene un módulo elástico entre aproximadamente 200 kPa y aproximadamente 300 kPa y

en el que la pluralidad de canales lineales guía un axón en regeneración desde el primer extremo hasta el segundo extremo.

2. El implante de la reivindicación 1, en el que el implante se produce mediante impresión 3D.

3. El implante de la reivindicación 1, que comprende además al menos un tipo de célula madre incluida en la pluralidad de canales lineales, en el que dicho al menos un tipo de célula madre es una célula madre neural.

4. El implante de la reivindicación 3, en el que la célula madre neural es una célula madre embrionaria, una célula madre derivada de iPSC, una célula madre neural directamente diferenciada o una combinación de las mismas.

5. El implante de la reivindicación 3, en el que dicho al menos un tipo de célula madre es una célula madre mesenquimal.

6. El implante de la reivindicación 3, en el que dicho al menos un tipo de célula madre está diseñada para expresar BDNF, NT3, GDNF o una combinación de los mismos.

7. El implante de la reivindicación 1, en el que el implante impreso tridimensional incluye diacrilato de polietilenglicol o gelatina de metacrilato, o una combinación de los mismos.

8. El implante de la reivindicación 1, en el que el implante es biomimético de una médula espinal, o en el que el implante es biomimético de un nervio periférico.

9. El implante de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de canales lineales son paralelos entre sí.

10. El implante de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de canales lineales comprende secciones transversales hexagonales agrupadas como una estructura de panal.

11. El implante biomimético de la reivindicación 1, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una lesión neurológica en un receptor que lo necesite, comprendiendo el procedimiento:

implantar dicho implante biomimético en una ubicación que necesite tratamiento; y

permitir la regeneración de las células en la zona de la lesión.

12. El implante para el uso de la reivindicación 11, en el que la lesión neurológica es una lesión de la médula espinal, una lesión motora completa de la médula espinal, una lesión motora incompleta de la médula espinal o una lesión de un nervio periférico.

13. El implante para el uso de la reivindicación 12, en el que la lesión neurológica es una lesión de la médula espinal, o en el que la lesión neurológica es una lesión de un nervio periférico.

14. El implante para el uso de la reivindicación 11, que comprende además proporcionar terapia física al receptor.

15. Un procedimiento de fabricación de un implante biomimético según la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:

explorar la ubicación en la médula espinal o el nervio periférico del receptor que necesita tratamiento para determinar la zona de la lesión; e

imprimir tridimensionalmente el implante para que abarque la zona de la lesión.