ES3060334T3 - Detecting hematological disorders using cell-free dna in blood - Google Patents

Detecting hematological disorders using cell-free dna in blood

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ES3060334T3
ES3060334T3 ES23214529T ES23214529T ES3060334T3 ES 3060334 T3 ES3060334 T3 ES 3060334T3 ES 23214529 T ES23214529 T ES 23214529T ES 23214529 T ES23214529 T ES 23214529T ES 3060334 T3 ES3060334 T3 ES 3060334T3
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Rossa Wai Kwun Chiu
Kwan Chee Chan
Kun Sun
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Abstract

Se proporcionan técnicas para detectar trastornos hematológicos utilizando ADN libre en una muestra de sangre, por ejemplo, plasma o suero. Por ejemplo, un ensayo puede dirigirse a una o más regiones diferencialmente metiladas específicas de un linaje celular hematológico particular (por ejemplo, eritroblastos). El nivel de metilación se puede cuantificar a partir del ensayo para determinar la cantidad de fragmentos de ADN metilados o no metilados en una mezcla libre de células de la muestra de sangre. El nivel de metilación se puede comparar con uno o más valores de corte, por ejemplo, que corresponden a un rango normal para el linaje celular hematológico en cuestión, como parte de la determinación del grado de un trastorno hematológico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Detección de trastornos hemáticos utilizando ADN acelular en sangre
[0003] Antecedentes
[0004] Para determinar si existe un trastorno hemático (p. ej., anemia) en una persona, se realiza un examen histológico de una biopsia de médula ósea utilizando técnicas convencionales. Sin embargo, una biopsia de médula ósea es un procedimiento invasivo que provoca dolor y ansiedad a los pacientes que se someten a tal procedimiento. Por lo tanto, es deseable identificar nuevas técnicas para detectar y caracterizar los trastornos hemáticos en una persona.
[0005] La anemia puede estar causada por múltiples afecciones clínicas, cada una de ellas con su propio tratamiento. Por consiguiente, sería clínicamente útil determinar la causa de un caso de anemia, y después, investigar o tratar en consecuencia. Una de las causas de la anemia es la carencia de un nutriente necesario para la eritropoyesis (proceso de producción de glóbulos rojos), tales como, pero sin limitación, hierro, B12, folato, etc. Otra causa de anemia es la hemorragia, que puede ser aguda o crónica. La hemorragia puede producirse, por ejemplo, por menorragia o sangrado del tubo gastrointestinal. La anemia también se encuentra con frecuencia en numerosos trastornos crónicos, lo que se conoce como anemia de enfermedad crónica, que puede presentarse en el cáncer y en enfermedades inflamatorias intestinales.
[0006] Por consiguiente, es deseable proporcionar nuevas técnicas de cribado de sujetos para detectar un trastorno hemático, para determinar la causa de un trastorno hemático, para el seguimiento de un sujeto con un trastorno hemático y/o para determinar un tratamiento adecuado para un sujeto con un trastorno hemático. En el documento US 2011/028333 A1 se desvela un método de empleo del análisis de metilación del ADN para el diagnóstico, el pronóstico y la predicción del cáncer.
[0007] Breve sumario
[0008] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquiera de los aspectos, ejemplos o realizaciones fuera del ámbito de las reivindicaciones, no forman parte de la invención reivindicada y se proporcionan a título ilustrativo. Algunas realizaciones proporcionan sistemas, métodos y aparatos para detectar trastornos hemáticos utilizando ADN acelular en una muestra de sangre, p. ej., utilizando plasma o suero. Por ejemplo, un ensayo puede dirigirse a una o más regiones diferencialmente metiladas específicas de un linaje celular hemático particular (es decir, eritroblastos). A partir del ensayo puede cuantificarse un nivel de metilación para determinar una cantidad de fragmentos de ADN metilados o no metilados en una mezcla acelular de la muestra de sangre. El nivel de metilación puede compararse con uno o más valores de corte, p. ej., que corresponden a un intervalo normal del linaje celular hemático en particular como parte de la determinación de un nivel de un trastorno hemático. Algunas realizaciones pueden medir una cantidad de ADN del linaje celular hemático particular (p. ej., ADN de eritroblastos) en una muestra de sangre de manera similar utilizando uno o más niveles de metilación.
[0009] Dicho análisis puede proporcionar una detección de un trastorno hemático sin tener que realizar el procedimiento invasivo de una biopsia de médula ósea. Por ejemplo, nuestros resultados demuestran que las células de la médula ósea contribuyen con una proporción significativa al ADN acelular circulante. Un análisis de las firmas de metilación de las células hematopoyéticas en el ADN acelular circulante puede reflejar el estado de las células de la médula ósea. Dichas realizaciones pueden ser particularmente útiles para hacer un seguimiento de la respuesta de la médula ósea a los tratamientos, por ejemplo, la respuesta al tratamiento con hierro oral en pacientes con anemia ferropénica. Las realizaciones también pueden utilizarse para asignar a los pacientes a diferentes procedimientos, p. ej., una biopsia de médula ósea o investigaciones menos invasivas.
[0010] Otras realizaciones, útiles para entender la invención, se refieren a sistemas y a medios legibles por ordenador asociados a los métodos descritos en el presente documento.
[0011] Se puede obtener una mejor comprensión de la naturaleza y ventajas de las realizaciones de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.
[0012] Breve descripción de los dibujos
[0013] La FIG.1 muestra las densidades de metilación de los sitios de CpG dentro del promotor del gen de la ferroquelatasa (FEQ) de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0014] Las FIGS.2A y 2B muestran un análisis de ADN universalmente metilado y no metilado utilizando ensayos de PCR digital diseñados para detectar ADN metilado y no metilado de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG.3 A es un gráfico que muestra una correlación entre el % de E en los glóbulos sanguíneos y el número de GR nucleados (eritroblastos) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 3B es un diagrama de flujo que ilustra un método 300 para determinar una cantidad de células de un linaje celular particular en una muestra biológica analizando ADN acelular de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0015] La FIG.4 muestra el % No met. en la capa leucoplaquetaria y el plasma de mujeres sanas no gestantes y gestantes en diferentes trimestres de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0016] La FIG. 5 es un gráfico que muestra la ausencia de correlación entre el % No met. en la capa leucoplaquetaria y el plasma.
[0017] Las FIGS. 6A y 6B muestran porcentajes de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en sujetos sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El % de E puede definirse igual que el % No met.
[0018] La FIG.7 muestra la ausencia de correlación entre los resultados del % de E(FEQ) en ADN plasmático y la edad de los sujetos sanos.
[0019] La FIG.8 es un gráfico del % No met. frente a las concentraciones de hemoglobina en pacientes con anemia aplásica, beta-talasemia mayor y sujetos de control sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0020] La FIG. 9 es un gráfico del % No met. en plasma de pacientes con anemia ferropénica (carencia de hierro (Fe)) y hemorragia aguda de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0021] La FIG. 10 muestra la relación entre el porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en el plasma y el nivel de hemoglobina entre pacientes con anemia aplásica, insuficiencia renal crónica (IRC), β-talasemia mayor, anemia ferropénica y sujetos sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0022] Las FIGS. 11A y 11B muestran relaciones entre el recuento/índice de reticulocitos y el nivel de hemoglobina entre pacientes anémicos con anemia aplásica, insuficiencia renal crónica (IRC), β-talasemia mayor y anemia ferropénica de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0023] La FIG.12 es un gráfico del % No met. en plasma de pacientes con síndrome mielodisplásico y policitemia rubra vera de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0024] La FIG.13A muestra un porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en plasma entre pacientes con anemia aplásica (AA) y síndrome mielodisplásico (SMD) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG.13B muestra un porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en plasma entre los grupos que responden al tratamiento y los que no responden al tratamiento de anemia aplásica de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0025] La FIG.14 es un gráfico del % No met. en plasma frente a las concentraciones de hemoglobina en sujetos normales y dos pacientes con leucemia de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0026] Las FIGS. 15A y 15B muestran densidades de metilación de los sitios de CpG dentro de las RDM específicas de eritroblastos en el cromosoma 12 de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0027] La FIG. 16 muestra la modificación de histonas (H3K4mel y H3K27Ac) sobre otras dos RDM específicas de eritroblastos (Eri-1 y Eri-2) de la base de datos ENCODE.
[0028] Las FIGS.17A y 17B muestran la correlación entre el porcentaje de secuencias de ADN eritroide (% de E) en el ADN de la capa leucoplaquetaria de pacientes con β-talasemia mayor medido a través de los ensayos con PCR digital dirigidos al marcador de Eri-1 (FIG.17A) y al marcador de Eri-2 (FIG.17B) y el porcentaje de eritroblastos entre todos los glóbulos blancos periféricos medido utilizando un analizador hemático automatizado.
[0029] Las FIGS.18A y 18B muestran la correlación de los resultados del % de E(FEQ) y % de E(Eri-1) y % de E(Eri-2) en el ADN de la capa leucoplaquetaria de pacientes con β-talasemia mayor.
[0030] La FIG. 19 muestra el porcentaje de ADN eritroide en sujetos sanos y pacientes con anemia aplásica y β-talasemia mayor utilizando análisis de PCR digital dirigido a las tres RDM (regiones diferencialmente metiladas) específicas de eritroblastos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0031] Las FIGS. 20A y 20B muestran mediciones en serie del porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en el ADN plasmático y el porcentaje de recuentos de reticulocitos de pacientes con anemia ferropénica que reciben terapia con hierro intravenoso en el estado previo al tratamiento y dos días después del tratamiento de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0032] La FIG.21A muestra el cambio en serie del % de E en plasma en la RDM de eritroblastos de una paciente con anemia ferropénica debida a menorragia que recibe tratamiento con hierro oral de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG.21B muestra el cambio en la hemoglobina después del tratamiento.
[0033] La FIG. 22 muestra el cambio en serie del % No met. en plasma en la RDM de eritroblastos de pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) que reciben tratamiento con eritropoyetina (EPO) recombinante o agentes estimuladores de la eritropoyesis (AEE).
[0034] La FIG.23 A muestra el cambio en serie del % No met. en plasma en la RDM de eritroblastos de pacientes con anemia aplásica que reciben tratamiento con globulina antitimocítica (GAT) o ciclosporina como terapia inmunosupresora de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG.23B muestra el cambio en serie de hemoglobina en los pacientes con anemia aplásica que reciben tratamiento.
[0035] Las FIGS.24A y 24B muestran gráficos del % No met. en plasma frente a las concentraciones de hemoglobina de los cuatro pacientes con anemia aplásica.
[0036] La FIG. 25 ilustra gráficos de cajas y bigotes que muestran la concentración absoluta de ADN eritroide en la RDM asociada al gende la FEQ(copias/ml de plasma) en sujetos sanos y pacientes anémicos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0037] La FIG. 26 es un diagrama de flujo que ilustra un método para analizar una muestra de sangre de un mamífero de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
[0038] La FIG.27 ilustra un sistema 2700 de acuerdo con una realización de la presente invención.
[0039] La FIG.28 muestra un diagrama de bloques de un sistema informático ilustrativo que puede utilizarse con el sistema y los métodos de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.
[0041] TÉRMINOS
[0043] Un "metiloma" proporciona una medida de la cantidad de metilación del ADN en una pluralidad de sitios o locus en un genoma. El metiloma puede corresponder a todo el genoma, a una parte sustancial del genoma o a una o más partes relativamente pequeña(s) del genoma.
[0044] Un "linaje celular" indica la historia evolutiva de un tejido u órgano a partir del embrión fecundado. Diferentes tipos de tejido (p. ej., diferentes tipos de glóbulos sanguíneos) tendrán diferentes linajes celulares. Los glóbulos rojos (GR) proceden de proeritroblastos a través de una serie de células intermedias. Los proeritroblastos, megacarioblastos y mieloblastos, proceden de las células progenitoras mieloides comunes. Los linfocitos proceden de las células progenitoras linfoides comunes. Los GR nucleados son eritroblastos, los GR inmaduros desnucleados son reticulocitos y los GR maduros desnucleados son eritrocitos, que son los glóbulos rojos del torrente circulatorio que transportan la hemoglobina.
[0045] Una "mezcla acelular" corresponde a una muestra que incluye fragmentos de ADN acelular de varias células. Por ejemplo, la mezcla acelular puede incluir fragmentos de ADN acelular de diversos linajes celulares. El plasma y el suero son ejemplos de mezcla acelular obtenida de una muestra de sangre, p. ej., mediante centrifugación. Otras mezclas acelulares pueden proceder de otras muestras biológicas. Una "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra que se tome de un sujeto (p. ej., de un ser humano, tal como de una mujer gestante, de una persona con cáncer o de una persona que se sospecha que tiene cáncer, de un receptor de un trasplante de órgano o de un sujeto que se sospecha que tiene un proceso patológico que afecte a un órgano, tal como el corazón en caso de infarto de miocardio, el cerebro en caso de ictus o el sistema hematopoyético en caso de anemia) y contiene una o más moléculas de ácido nucleico de interés. La muestra biológica puede ser un líquido corporal, tal como sangre, plasma, suero, orina, líquido vaginal, líquido de un hidrocele (p. ej., del testículo), o líquidos de lavados vaginales, líquido pleural, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo, saliva, sudor, lágrimas, esputo, líquido de lavado broncoalveolar, etc. También pueden utilizarse muestras de heces. En diversas realizaciones, la mayor parte del ADN presente en una muestra biológica que se ha enriquecido con ADN acelular (p. ej., una muestra de plasma obtenida a través de un protocolo de centrifugación) puede ser acelular (en lugar de celular), p. ej., superior al 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. El protocolo de centrifugación puede incluir 3000 g x 10 minutos, obtener la parte de líquido y volver a centrifugar a 30000 g durante otros 10 minutos para eliminar las células residuales.
[0046] Un "metiloma plasmático" es el metiloma determinado a partir del plasma o suero de un animal (p. ej., de un ser humano). El metiloma plasmático es un ejemplo de un metiloma acelular ya que el plasma y el suero incluyen ADN acelular. El metiloma plasmático es también un ejemplo de metiloma mixto, ya que es una mezcla de ADN procedente de diferentes órganos o tejidos o células presentes en un organismo. En una realización, dichas células son las células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitación, células del linaje eritroide (es decir, de los glóbulos rojos), del linaje mieloide (p. ej., neutrófilos y sus precursores), y del linaje megacariocítico. En la gestación, el metiloma plasmático puede contener información metilómica del feto y de la madre. En un paciente con cáncer, el metiloma plasmático puede contener información metilómica de las células tumorales y de otras células del organismo del paciente. El "metiloma celular" corresponde al metiloma determinado a partir de células (p. ej., glóbulos sanguíneos) del paciente. El metiloma de los glóbulos sanguíneos se denomina metiloma de los glóbulos sanguíneos (o metiloma sanguíneo). Las técnicas para determinar un metiloma se describen con más detalle en la solicitud de patente PCT n.º WO2014/043763 titulada "Non-Invasive Determination Of Methylome Of Fetus Or Tumor From Plasma".
[0047] Un "sitio" corresponde a un único sitio, que puede ser una sola posición de base o un grupo de posiciones de bases correlacionadas, p. ej., un sitio de CpG. Un "locus" puede corresponder a una región que incluya múltiples sitios. Un locus puede incluir únicamente un sitio, lo que haría que el locus fuera equivalente a un sitio en ese contexto.
[0048] El "índice de metilación" de cada sitio genómico (p. ej., un sitio de CpG) puede referirse a la proporción de fragmentos de ADN (p. ej., determinados a partir de lecturas de secuencia o sondas) que muestran metilación en el sitio sobre el número total de lecturas que cubren ese sitio. Una "lectura" puede corresponder a información (p. ej., estado de metilación en un sitio) obtenida de un fragmento de ADN. Se puede obtener una lectura utilizando reactivos (p. ej., cebadores o sondas) que hibriden preferentemente con fragmentos de ADN de un estado de metilación particular. Normalmente, dichos reactivos se aplican después del tratamiento con un proceso que modifica diferencialmente las moléculas de ADN dependiendo de su estado de metilación, p. ej., conversión de bisulfito, o enzima de restricción sensible a metilación. Una lectura puede ser una lectura de secuencia. Una "lectura de secuencia" se refiere a una cadena de nucleótidos secuenciada de cualquier parte o de la totalidad de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una lectura de secuencia puede ser una cadena corta de nucleótidos (p. ej., 20-150) secuenciados a partir de un fragmento de ácido nucleico, una cadena corta de nucleótidos en uno o ambos extremos de un fragmento de ácido nucleico o la secuenciación de todo el fragmento de ácido nucleico que existe en la muestra biológica. Una lectura de secuencia puede obtenerse de diversos modos, p. ej., usando técnicas de secuenciación o sondas (p. ej., en matrices de hibridación o sondas de captura, o técnicas de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,polymerase chain reaction) o la amplificación lineal con un único cebador o la amplificación isotérmica.
[0049] La "densidad de metilación" de una región puede referirse al número de lecturas en sitios dentro de la región que muestran metilación dividido entre el número total de lecturas que cubren los sitios en la región. Los sitios pueden tener características específicas, p. ej., ser sitios de CpG (citosina (C) y guanina (G) unidas por un enlace fosfodiéster (p, del inglésphosphodiester)). Por tanto, la "densidad de metilación de CpG" de una región, puede referirse al número de lecturas que muestran la metilación de CpG dividido entre el número total de lecturas que cubren los sitios de CpG en la región (p. ej., un sitio de CpG particular, sitios de CpG dentro de una isla de CpG o una región más grande). Por ejemplo, en el genoma humano, la densidad de metilación de cada bin (por las siglas del inglésbarcode index number, número de índice de código de barras) de 100 kb puede determinarse a partir del número total de citosinas que después del tratamiento con bisulfito no se convirtieron (lo que corresponde a citosinas metiladas) en los sitios de CpG, como una proporción de todos los sitios de CpG cubiertos por lecturas de secuencia asignadas a la región de 100 kb. Este análisis también puede realizarse para otros tamaños de bin, p. ej., 500 bp, 5 kb, 10 kb, 50 kb o 1 Mb, etc. Una región podría ser el genoma completo o un cromosoma o parte de un cromosoma (p. ej., un brazo cromosómico). El índice de metilación de un sitio de CpG, es el mismo que la densidad de metilación de una región cuando la región solo incluye ese sitio de CpG. La "proporción de citosinas metiladas" puede referirse al número de sitios de citosina, "C", que se muestra que están metilados (por ejemplo, no convertidos después de la conversión con bisulfito) sobre el número total de restos de citosina analizados, es decir, incluyendo citosinas fuera del contexto de CpG, en la región. El índice de metilación, la densidad de metilación y la proporción de citosinas metiladas, son ejemplos de "niveles de metilación". Aparte de la conversión con bisulfito, para consultar el estado de metilación de las moléculas de ADN, pueden utilizarse otros procesos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, enzimas sensibles al estado de metilación (p. ej., enzimas de restricción sensibles a metilación), proteínas de unión a metilación, secuenciación de una sola molécula utilizando una plataforma sensible al estado de metilación (p. ej., secuenciación por nanoporos (Schreiberet al.Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915) y mediante el análisis en tiempo real de moléculas individuales de Pacific Biosciences (Flusberget al.Nat Methods 2010; 7: 461-465)).
[0051] Un "perfil de metilación" (también denominado estado de metilación) incluye información relacionada con la metilación del ADN de una región. La información relacionada con la metilación del ADN puede incluir, pero sin limitación, un índice de metilación de un sitio de CpG, una densidad de metilación de sitios de CpG de una región, una distribución de sitios de CpG de una región contigua, un patrón o nivel de metilación de cada sitio de CpG individual dentro de una región que contiene más de un sitio de CpG y metilación distinta de CpG. Un perfil de metilación de una parte sustancial del genoma puede considerarse equivalente al metiloma. La "metilación del ADN" en los genomas de mamíferos normalmente se refiere a la adición de un grupo metilo al carbono 5' de los restos de citosina (es decir, 5-metilcitosinas) entre los dinucleótidos de CpG. La metilación del ADN puede producirse en citosinas en otros contextos, por ejemplo, CHG y CHH, donde H es adenina, citosina o timina. La metilación de citosina también puede presentarse en forma de 5-hidroximetilcitosina. También hay referencias sobre la metilación en bases distintas de la citosina, como la N<6>-metiladenina.
[0053] Un "tejido" corresponde a un grupo de células que se agrupan formando una unidad funcional. En un mismo tejido pueden encontrarse más de un tipo de células. Los distintos tipos de tejido pueden consistir en diferentes tipos de células (p. ej., hepatocitos, células alveolares o glóbulos sanguíneos), pero también pueden corresponder a tejido de distintos organismos (madre frente a feto) o a células sanas frente a células tumorales. Los "tejidos de referencia" corresponden a tejidos utilizados para determinar los niveles de metilación específicos de tejido. Pueden utilizarse múltiples muestras de un mismo tipo de tejido de diferentes individuos para determinar un nivel de metilación específico de tejido para ese tipo de tejido. El mismo tejido del mismo individuo en diferentes momentos, puede presentar diferencias debidas a la fisiología (p. ej. gestación) o a la patología (p. ej. cáncer o anemia o infección o mutación). El mismo tipo de tejido de distintos individuos puede presentar diferencias debidas a la fisiología (p. ej. edad, sexo) o a la patología (p. ej. cáncer o anemia o infección o mutación).
[0055] La expresión "nivel de un trastorno", también denominada"clasificación de un trastorno", puede referirse a una clasificación de si el trastorno existe, al tipo de trastorno, al estadio del trastorno y/o a cualquier otra medida de la gravedad del trastorno. El nivel puede ser un número u otros caracteres. El nivel puede ser cero. El nivel del trastorno puede utilizarse de diversas maneras. Por ejemplo, el cribado puede comprobar si el trastorno está presente en una persona de la que no se sabía previamente que lo padeciera. La evaluación puede investigar a una persona a la que se le ha diagnosticado el trastorno para supervisar la evolución del mismo a lo largo del tiempo, estudiar la eficacia de las terapias o determinar el pronóstico. En una realización, el pronóstico puede expresarse como la probabilidad de que un paciente muera a causa del trastorno, o la probabilidad de que el trastorno avance después de un periodo de tiempo específico. La detección puede significar 'cribado' o puede significar comprobar si una persona, con características sugestivas del trastorno (p. ej., síntomas u otras pruebas positivas), tiene el trastorno.
[0057] La anemia es una afección en la que el número de glóbulos rojos o su capacidad de transporte de oxígeno, son insuficientes para satisfacer las necesidades fisiológicas, que pueden variar según la edad, sexo, altitud, tabaquismo y estado de gestación. De acuerdo con las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la anemia puede diagnosticarse cuando la concentración de hemoglobina es inferior a 130 g/l en hombres e inferior a 110 g/l en mujeres. La expresión "grado de anemia" puede reflejarse mediante la concentración de hemoglobina en el sujeto. Un nivel más bajo de hemoglobina indica un grado más grave de anemia. Según la recomendación de la OMS, anemia grave se refiere a una concentración de hemoglobina <80 g/l en hombres y <70 g/l en mujeres, anemia moderada se refiere a una concentración de hemoglobina de 80 - 109 g/l en hombres y de 70 - 99 g/l en mujeres y anemia leve se refiere a una concentración de hemoglobina de 110 - 129 g/l en hombres y de 100 - 109 g/l en mujeres.
[0059] Un "valor de separación" corresponde a una diferencia o a una relación entre dos valores, p. ej., dos contribuciones fraccionarias o dos niveles de metilación. El valor de separación puede ser una simple diferencia o relación. El valor de separación puede incluir otros factores, p. ej., factores multiplicativos. Como otros ejemplos, se puede utilizar una diferencia o relación de funciones de los valores, p. ej., una diferencia o relación de los logaritmos neperianos (In) de los dos valores. Un valor de separación puede incluir una diferencia y una relación.
[0060] El término "clasificación", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier número u otros caracteres que se asocian con una propiedad particular de una muestra. Por ejemplo, un símbolo "+" (o la palabra "positivo/a)" podría significar que una muestra se clasifica como que presenta deleciones o amplificaciones. La clasificación puede ser binaria (p. ej., positiva o negativa) o tener más niveles de clasificación (p. ej., una escala de 1 a 10 o de 0 a 1). Las expresiones"corte"y"umbral"se refieren a un número predeterminado utilizado en una operación. Un valor umbral puede ser un valor por encima o por debajo del cual se aplica una clasificación particular. Cualquiera de estas expresiones puede utilizarse en cualquiera de estos contextos.
[0061] Descripción detallada
[0062] En algunas realizaciones, la contribución del ADN acelular (también denominado ADN circulante) procedente de los eritroblastos se cuantifica utilizando una o más firmas de metilación (es decir, una firma por marcador) específicas de los eritroblastos en relación con el ADN acelular procedente de otro tejido. Un marcador (p. ej., una región diferencialmente metilada, RDM) puede incluir un sitio o un grupo de sitios que contribuyen a una misma firma. La contribución del ADN acelular procedente de los eritroblastos puede utilizarse para determinar el nivel de un trastorno hemático, tal como anemia. Por ejemplo, las realizaciones pueden utilizarse para evaluar la anemia en un feto, en un neonato o en un niño. En el contexto de la anemia, las realizaciones pueden utilizarse para investigar a alguien de quien se sospecha que tiene anemia, o a quien se le ha diagnosticado anemia: (i) dilucidar las causas de la anemia; (ii) controlar el avance del estado clínico a lo largo del tiempo, (iii) estudiar la eficacia de las terapias o (iv)determinar el pronóstico. Por consiguiente, las realizaciones han identificado el ADN eritroide como un componente principal hasta ahora no reconocido de la reserva de ADN circulante y como un biomarcador no invasivo para el diagnóstico diferencial y el seguimiento de la anemia, así como de otros trastornos hematológicos.
[0063] I. INTRODUCCIÓN
[0064] El ADN plasmático es un analito cada vez más utilizado en diagnósticos moleculares. Existen estudios de investigación en curso sobre sus aplicaciones clínicas, especialmente en pruebas prenatales no invasivas (1- 7) y oncología (8-12). A pesar de la gran variedad de aplicaciones clínicas, el origen tisular del ADN circulante no se conoce por completo. Se ha demostrado que el ADN circulante se libera predominantemente de las células hematopoyéticas utilizando trasplante de médula ósea con incompatibilidad de sexo como sistema modelo (13, 14). Kunet al.demostraron recientemente que una proporción significativa de ADN plasmático tiene firmas de metilación de neutrófilos y linfocitos (15). Sin embargo, actualmente no hay información sobre si el ADN de origen eritroide (eritroblastos) podría ser también detectable en el plasma.
[0065] Los glóbulos rojos (GR) son la mayor población de células hematopoyéticas de la sangre. La concentración de glóbulos rojos (GR) es de aproximadamente 5 x 10<12>por litro de sangre. Dado que la longevidad de cada glóbulo rojo es de unos 120 días, el organismo necesita producir 2 x 10<11>GR al día o 9,7 x 10<9>GR por hora. Los GR rojos maduros de los seres humanos carecen de núcleo.
[0066] Es durante la etapa de extracción del núcleo cuando los eritroblastos pierden sus núcleos y maduran hasta convertirse en reticulocitos en la médula ósea (16). El proceso de extracción del núcleo es un complejo proceso de múltiples etapas que implica acciones estrechamente reguladas de señalización celular y acciones citoesqueléticas. El material nuclear de los eritroblastos es fagocitado y degradado por los macrófagos de la médula en las islas eritroblásticas, p. ej., en la médula ósea (17). Postulamos que parte del material de ADN degradado del linaje eritroide procedente de la médula ósea se liberaría en la circulación.
[0067] Las realizaciones pueden identificar firmas de metilación de ADN desde células de origen eritroide y usar tales firmas para determinar si el ADN eritroide es detectable en plasma humano. Los metilomas de referencia de alta resolución de diferentes tejidos y tipos de células hematopoyéticas se han hecho públicos a través de proyectos de colaboración que incluyen el Proyecto BLUEPRINT (18, 19) y el Proyecto Roadmap Epigenomics (20). Otros investigadores y nosotros mismos hemos demostrado anteriormente que es posible rastrear el origen del ADN plasmático mediante el análisis de las firmas de metilación relacionadas con los tejidos (15, 21, 22). En la solicitud de patente PCT n.º WO 2016/008451 titulada "Methylation Pattern Analysis Of Tissues In A DNA Mixture" (Análisis de patrones de metilación de tejidos en una mezcla de ADN) pueden encontrarse más detalles de un análisis de este tipo para determinar la contribución de un determinado tejido a una mezcla acelular (p. ej., plasma).
[0068] Para validar nuestra hipótesis y demostrar la presencia de ADN eritroide en el plasma, identificamos regiones diferencialmente metiladas (RDM) específicas de eritroblastos mediante el análisis de los perfiles de metilación de eritroblastos y de otros tipos de tejidos. Basándose en los hallazgos, hemos desarrollado ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) digital dirigidos a las RDM específicas de los eritroblastos para permitir el análisis cuantitativo del ADN eritroide en muestras biológicas. Específicamente, utilizando perfiles de metilación de alta resolución de eritroblastos y de otros tipos de tejidos, se descubrió que tres locus genómicos estaban hipometilados en los eritroblastos pero hipermetilados en otros tipos celulares. Se desarrollaron ensayos de PCR digital para la medición del ADN eritroide utilizando la región diferencialmente metilada de cada locus.
[0069] Aplicamos estos ensayos de PCR digital para estudiar las muestras de plasma de sujetos sanos y de pacientes que padecían distintos tipos de anemia. También exploramos la posible utilidad clínica de los ensayos en la evaluación de la anemia. Aunque en los ejemplos se utilizan ensayos de PCR, pueden utilizarse otros ensayos, tales como secuenciación.
[0070] En sujetos con anemia de diferentes etiologías, demostramos que el análisis cuantitativo del ADN eritroide circulante (p. ej., utilizando un marcador de metilación) refleja la actividad eritropoyética en la médula ósea. En el caso de pacientes con actividad eritropoyética reducida, como se ilustra con la anemia aplásica, disminuyó el porcentaje de ADN eritroide circulante. En el caso de pacientes con eritropoyesis aumentada pero ineficaz, como se ilustra con la βtalasemia mayor, el porcentaje aumentó. Además, se observó que el nivel plasmático de ADN eritroide se correlacionaba con la respuesta al tratamiento en la anemia aplásica y la anemia ferropénica. El análisis del ADN plasmático mediante ensayos de PCR digital dirigidos a las otras dos regiones diferencialmente metiladas mostró resultados similares.
[0071] II. REGIONES DIFERENCIALMENTE METILADAS (RDM) DE LOS ERITROBLASTOS
[0072] Nuestra hipótesis es que el proceso de extracción del núcleo de los eritroblastos u otros procesos implicados en la maduración de los GR, contribuirían significativamente a la reserva de ADN acelular circulante. Para determinar la contribución del ADN circulante procedente de los eritroblastos, identificamos las regiones diferencialmente metiladas (RDM) en el ADN de los eritroblastos comparando los perfiles de metilación del ADN de los eritroblastos con los de otros tejidos y glóbulos sanguíneos. Se estudiaron los perfiles de metilación de los eritroblastos y de otros glóbulos sanguíneos (neutrófilos, linfocitos B y linfocitos T) y tejidos (hígado, pulmón, colon, intestino delgado, páncreas, glándula suprarrenal, esófago, corazón, cerebro y placenta) del proyecto BLUEPRINT y del proyecto Roadmap Epigenomics, así como de los metilomas generados por nuestro grupo (18-20, 23).
[0073] En un ejemplo sencillo, una o más RDM pueden utilizarse directamente para determinar una contribución de ADN circulante desde los eritroblastos, p. ej., determinando un porcentaje de fragmentos de ADN metilados (para las RDM hipermetiladas) o no metilados (para las RDM hipometiladas). El porcentaje puede utilizarse directamente o modificarse (p. ej., multiplicarse por un factor de escala). Otras realizaciones pueden llevar a cabo procedimientos más complicados, p. ej., resolver un sistema de ecuaciones lineal. Como se describe en la solicitud de patente PCT n.º WO 2016/008451, los niveles de metilación en N sitios genómicos pueden utilizarse para calcular una contribución de M tejidos, donde M es menor o igual a N. Los niveles de metilación en cada sitio pueden calcularse para cada tejido. El sistema de ecuaciones lineal A x = b puede resolverse, donde b es un vector de las densidades de metilación medidas en los N sitios, x es un vector de la contribución de los M tejidos, y A es una matriz de M filas y N columnas, y cada fila proporciona las densidades de metilación en los tejidos N en el sitio particular de esa fila. Si M es menor que N, entonces puede realizarse una optimización por mínimos cuadrados. La matriz A de dimensiones N por M puede estar formada por los niveles de metilación específicos de los tejidos de referencia, tal y como se ha obtenido de las fuentes anteriores.
[0074] A. Identificación de RDM
[0075] Para identificar una región diferencialmente metilada (RDM), tejido de un tipo/linaje en particular (p. ej., eritroblastos) puede aislarse y a continuación analizarse, p. ej., utilizando secuenciación sensible a metilación, como se describe en el presente documento. Las densidades de metilación en un sitio a través de tipos de tejidos (p. ej., sólo dos tipos de eritroblastos y otros) pueden analizarse para determinar si existe una diferencia suficiente, para identificar el sitio para su uso en una RDM.
[0076] En algunas realizaciones, para identificar un marcador de metilación de eritroblastos puede utilizarse uno o más de los siguientes criterios. (1) Un sitio de CpG está hipometilado en los eritroblastos si la densidad de metilación del sitio de CpG es inferior al 20 % en los eritroblastos y superior al 80 % en otros glóbulos sanguíneos y tejidos, y viceversa. (2). Para ser una RDM, la región puede requerir incluir múltiples sitios de CpG (p. ej., 3, 4, 5 o más) que estén hipometilados. Por tanto, se puede elegir un tramo de múltiples sitios de CpG dentro de la RDM para analizar mediante el ensayo con el fin de mejorar la relación entre la señal y el ruido y la especificidad de la RDM. (3) La RDM puede elegirse para que tenga un tamaño representativo de una molécula de ADN en la mezcla acelular. En el plasma, existen principalmente fragmentos cortos de ADN, siendo la mayoría inferiores a 200 pb (1, 24, 25). En realizaciones que determinan la presencia de moléculas de ADN eritroide en el plasma, la RDM puede definirse dentro de un tamaño representativo de una molécula de ADN plasmático (es decir, 166 pb) (1). Las variaciones de dichos criterios pueden utilizarse junto con estos tres criterios, p. ej., para identificar un sitio de CpG como hipometilado pueden utilizarse umbrales diferentes al 20 % y al 80 %. Como indica más adelante, algunos resultados utilizan sitios de CpG seleccionados dentro de tres RDM específicas de eritroblastos que están hipometiladas en los eritroblastos.
[0077] Con los criterios definidos anteriormente, identificamos tres RDM específicas de eritroblastos en el genoma completo. Una RDM estaba dentro de la región intrónica del gen de la ferroquelatasa(FEQ)en el cromosoma 18. En esta región, las diferencias en las densidades de metilación entre los eritroblastos y otros tipos celulares son las mayores entre las tres RDM identificadas. El genFEQcodifica la ferroquelatasa, que es una enzima responsable de la etapa final de la biosíntesis del grupo hemo (26). Como se muestra en la FIG.1, los cuatro sitios de CpG seleccionados dentro de la RDM específica de eritroblastos estaban hipometilados en los eritroblastos, pero hipermetilados en otros glóbulos sanguíneos y tejidos.
[0078] La FIG.1 muestra las densidades de metilación de los sitios de CpG dentro del promotor del gen de la ferroquelatasa (FEQ) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El genFEQse localiza en el cromosoma 18 y las coordenadas genómicas de los sitios de CpG se muestran en el eje X. Como se muestra, las densidades de metilación de los sitios de CpG se encuentran dentro de la región intrónica del gen FEQ. Los cuatro sitios de CpG situados dentro de la región 110 delimitada por las dos líneas de puntos verticales, estaban hipometilados en los eritroblastos pero hipermetilados en otros tejidos o tipos celulares. Con fines ilustrativos, los resultados individuales del pulmón, corazón, intestino delgado, colon, timo, estómago, glándulas suprarrenales, esófago, vejiga, cerebro, ovario y páncreas, no se muestran. Sus valores medios se representan como "Otros tejidos".
[0079] Dado que los sitios de CpG situados dentro de esta región están hipometilados, las secuencias que no estén metiladas en los cuatro sitios de CpG situados entre las dos líneas de puntos de la FIG. 1, se verían enriquecidas en ADN procedente de los eritroblastos. Por tanto, la cantidad de secuencias hipometiladas en una muestra de ADN reflejaría la cantidad de ADN procedente de eritroblastos.
[0080] Se desarrolló un ensayo para detectar ADN metilado o no metilado en los sitios de CpG identificados. Cuanto mayor sea el número de sitios de CpG dentro de una molécula de ADN plasmático, más específico será el ensayo. La mayoría de las moléculas de ADN plasmático tienen menos de 200 pb, con un promedio de 166 pb. Por tanto, todos los sitios de CpG pueden estar dentro de 166 pb entre sí, pero pueden estar dentro de 150, 140, 130, 120, 110 o 100 pb entre sí. En otras realizaciones, solo pares de sitios de CpG pueden estar dentro de dichas distancias entre sí.
[0081] En otras realizaciones, un sitio de CpG puede definirse como hipometilado en los eritroblastos si la densidad de metilación del sitio de CpG es inferior al 10 % (u otro umbral) en los eritroblastos y superior al 90 % (u otro umbral) en todos los demás tejidos y glóbulos sanguíneos. Un sitio de CpG puede definirse como hipermetilado en los eritroblastos si la densidad de metilación del sitio de CpG es superior al 90 % (u otro umbral) en los eritroblastos e inferior al 10 % (u otro umbral) en todos los demás tejidos y glóbulos sanguíneos. En algunas implementaciones, una RDM puede tener al menos dos sitios de CpG dentro de 100 pb, todos mostrando metilación diferencial para los eritroblastos. En una implementación de identificación de una RDM, para que sea útil a efectos diagnósticos, se puede requerir que todos los sitios de CpG, que se encuentran a 100 pb (o alguna otra longitud), muestren hipometilación o hipermetilación en los eritroblastos en comparación con todos los demás tejidos y glóbulos sanguíneos. Por ejemplo, la pluralidad de sitios de CpG puede abarcar 100 pb o menos en un genoma de referencia correspondiente al mamífero. Como otro ejemplo, cada sitio de CpG puede encontrarse a 100 pb de otro sitio de CpG. Por tanto, los sitios de CpG pueden abarcar más de 100 pb.
[0082] En algunas realizaciones, la una o más regiones diferencialmente metiladas pueden identificarse de la siguiente manera. Pueden obtenerse índices de metilación (p. ej., densidades) de una pluralidad de sitios para cada una de una pluralidad de linajes celulares, incluido el linaje celular hemático en particular y los demás linajes celulares, p. ej, como se muestra en la FIG. 1. En cada sitio de la pluralidad de sitios, los índices de metilación de la pluralidad de linajes celulares pueden compararse entre sí. Basándose en la comparación, pueden identificarse uno o más sitios de la pluralidad de sitios, cada uno de ellos con un índice de metilación en el linaje celular hemático particular que está por debajo/por encima de un primer umbral de metilación e índices de metilación en cada uno de los otros linajes celulares que están por encima/por debajo de un segundo umbral de metilación. De esta manera, pueden identificarse sitios hipometilados y/o hipermetilados. Son ejemplos del primer umbral de metilación el 10 %, 15 % o 20 % para los sitios hipometilados, mientras que los ejemplos del segundo umbral de metilación pueden ser el 80 %, 85 % o 90 %. A continuación, puede identificarse una región diferencialmente metilada que contenga el uno o más sitios, p. ej., utilizando los criterios descritos anteriormente.
[0083] B. Detección de secuencias de ADN metiladas y no metiladas
[0084] Para detectar secuencias de ADN metiladas y no metiladas en las RDM específicas de los eritroblastos, pueden desarrollarse dos ensayos de PCR digital: uno dirigido a las secuencias no metiladas y el otro dirigido a las secuencias metiladas. En otras realizaciones, también pueden utilizarse otros métodos para detectar y/o cuantificar secuencias metiladas y no metiladas de una RDM, tal como secuenciación sensible a metilación (p. ej. secuenciación por bisulfito o secuenciación siguiendo procesos bioquímicos o enzimáticos que modifiquen diferencialmente el ADN basándose en su estado de metilación), PCR en tiempo real específica de metilación, análisis con enzimas de restricción sensibles a metilación y análisis con micromatrices. Por tanto, pueden utilizarse otros tipos de ensayos, además de los ensayos de PCR.
[0085] En un ejemplo, puede detectarse una RDM de eritroblastos después de tratamiento con bisulfito. El estado de metilación de los sitios de CpG puede determinarse basándose en los resultados de la detección (p. ej., señales de PCR). Para el gen FEQ, para amplificar la RDM de eritrocitos después de tratamiento con bisulfito, para su secuenciación pueden utilizarse los siguientes cebadores: 5’-TTTAGTTTATAGTTGAAGAGAATTTGATGG-3’ y 5’-AAACCCAACCATACAACCTCTTAAT-3 ’.
[0086] En otro ejemplo, para aumentar la especificidad del análisis, pueden utilizarse dos cebadores directos que cubran tanto el estado metilado como el no metilado del sitio de CpG en particular. A continuación se enumeran dichos conjuntos de cebadores utilizados en dos ensayos de PCR digital que se dirigen específicamente a secuencias metiladas y no metiladas.
[0088]
[0090] Tabla1: Ensayo para la detección específica de secuencias no metiladas.
[0092]
[0094] Tabla2: Ensayo para la detección específica de secuencias metiladas
[0095] Los nucleótidos subrayados en los cebadores inversos y las sondas eran las citosinas diferencialmente metiladas en los sitios de CpG. Los cebadores inversos y las sondas de los ensayos de secuencias no metiladas y metiladas se unen a las secuencias no metiladas y metiladas específicamente debido a las diferencias en los nucleótidos subrayados.
[0096] C.Confirmación utilizando ADN universalmente metilado y universalmente no metilado
[0097] Se realizó un análisis de ADN universalmente metilado y universalmente no metilado para confirmar la precisión de los dos ensayos.
[0098] Las secuencias universalmente metiladas del ADN metilado humano CpGenome (EMD Millipore) y las secuencias universalmente no metiladas del ADN de control humano no metilado EpiTect (Qiagen) se utilizaron para confirmar la especificidad de los dos ensayos de PCR digital, que se diseñaron para la detección y cuantificación de secuencias metiladas y no metiladas en la RDM específica de eritroblastos. El ADN metilado humano CpGenome se purificó de células HCT116 DKO seguido de metilación enzimática de todos los nucleótidos de CpG utilizando metiltransferasa M.SssI (que significa metiltransferasa del primer aislado deSpiroplasmasp.). Las secuencias de ADN universalmente metiladas y universalmente no metiladas se analizaron en la misma placa como controles positivos y negativos. Los valores de corte de las señales de fluorescencia positivas se determinaron con referencia a los controles. El número de secuencias de ADN metiladas y no metiladas en cada muestra se calculó utilizando recuentos combinados de pocillos duplicados seguido de la corrección de Poisson (4).
[0099] Las FIGS.2A y 2B muestran un análisis de ADN universalmente metilado y no metilado utilizando ensayos de PCR digital diseñados para detectar ADN metilado y no metilado de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El eje vertical corresponde a la intensidad de la señal de fluorescencia relativa de las secuencias no metiladas. El eje horizontal corresponde a la intensidad de la señal de fluorescencia relativa de las secuencias metiladas. Los datos se generaron utilizando ADN que se sabe que está metilado o no metilado. Estos análisis tienen por objeto demostrar la especificidad de los ensayos con respecto al ADN metilado o no metilado.
[0100] Para el análisis de ADN universalmente no metilado, la señal de amplificación se detectó utilizando el ensayo de ADN no metilado (los puntos azules 210 del gráfico 205 de la FIG.2A corresponden a la señal positiva de FAM), donde los puntos azules 210 no se detectaron utilizando el ensayo de ADN metilado (gráfico 255 de la FIG.2B). Para el análisis del ADN universalmente metilado, la señal de amplificación se utilizó utilizando el ensayo de ADN metilado (los puntos verdes 220 del gráfico 250 de la FIG.2B corresponden a la señal positiva de VIC), donde los puntos verdes 220 no se detectaron utilizando el ensayo de ADN no metilado (gráfico 200 de la FIG. 2A). Los puntos negros de cada panel representan las nanogotas sin ninguna señal amplificada. Las líneas verticales y horizontales gruesas dentro de cada uno de los cuatro paneles representan el umbral de la señal de fluorescencia de los resultados positivos. Estos resultados confirmaron la especificidad de los dos ensayos para detectar ADN metilado y no metilado en la RDM específica de eritroblastos.
[0101] Para seguir evaluando la sensibilidad analítica del ensayo basado en el genFEQasociado a la RDM, las muestras con las secuencias no metiladas se diluyeron en serie a concentraciones fraccionarias específicas (es decir, porcentaje de secuencias no metiladas entre todas las secuencias (no metiladas y metiladas) en la RDM asociada al gen de laFEQ). Había un total de 1.000 moléculas por reacción. Las secuencias no metiladas pudieron detectarse en un porcentaje tan bajo como el 0,1 % de la cantidad total de secuencias metiladas y no metiladas (véase la Tabla 3).
[0104]
[0106] Tabla 3:Concentraciones medidas (porcentajes de secuencias no metiladas) a diferentes concentraciones de entrada de secuencias no metiladas para la evaluación de la sensibilidad del ensayo dirigido a la RDM asociada al gen de laFEQ.
[0107] Adicionalmente, para evaluar las posibles variaciones (p. ej., debidas al pipeteo), medimos repetidamente el porcentaje de secuencias no metiladas en una muestra mezclada artificialmente de secuencias metiladas y no metiladas a una concentración fraccional específica (% de secuencias no metiladas = 30 %) en 20 reacciones distintas. Utilizamos un total de 500 moléculas metiladas y no metiladas para cada reacción. Esta cifra es comparable a la que hemos observado en el número total de moléculas metiladas y no metiladas en nuestro análisis de PCR digital para detectar muestras de ADN plasmático. Observamos una media del 30,4 % y una desviación estándar del 1,7 % en las 20 mediciones repetidas del porcentaje de secuencias no metiladas. El coeficiente de variación intraensayo calculado fue del 5,7 %.
[0108] III. ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LOS ENSAYOS PARA DIFERENTES MUESTRAS
[0109] Para confirmar la especificidad tisular de los ensayos por PCR digital dirigidos a la RDM asociada al genFEQpara detectar ADN eritroide, probamos los ensayos con PCR digital en varias muestras que tenían diferentes cantidades de células eritroblásticas, según las mediciones realizadas utilizando técnicas distintas de las de estos ensayos con PCR digital. La cantidad de secuencias no metiladas de ADN detectadas con los ensayos de PCR digital debe reflejar la cantidad de ADN eritroide. De manera similar, la cantidad de secuencias metiladas debe reflejar el ADN de otros tejidos o tipos celulares. Por lo tanto, definimos el porcentaje de ADN eritroide (% de E) en una muestra biológica como el porcentaje de secuencias no metiladas entre todas las secuencias detectadas (no metiladas y metiladas) en una RDM específica de eritroblastos. Por consiguiente, se analizaron muestras de sangre utilizando ensayos específicos para secuencias metiladas y no metiladas en la región diferencialmente metilada (RDM) con el fin de determinar la correlación entre el porcentaje de secuencias no metiladas, % No met. (también denominado % de E), y la existencia de ADN procedente de eritroblastos. El % No met. (% de E) son ejemplos de niveles de metilación.
[0110] El porcentaje de ADN eritroide (% de E) se calculó como:
[0111] <% de E = ୒º ୢୣ ୱୣୡ୳ୣ୬ୡ୧ୟୱ ୢୣ ୅ୈ୒𝐧𝐨𝐦𝐞𝐭𝐢𝐥𝐚𝐝𝐚𝐬>
[0113] <୒º ୢୣ ୱୣୡ୳ୣ୬ୡ୧ୟୱ ୢୣ ୅ୈ୒𝐦𝐞𝐭𝐢𝐥𝐚𝐝𝐚𝐬ା ୒º ୢୣ ୱୣୡ୳ୣ୬ୡ୧ୟୱ ୢୣ ୅ୈ୒𝐧𝐨𝐦𝐞𝐭𝐢𝐥𝐚𝐝𝐚𝐬>
[0114] Dado que las diferencias en las densidades de metilación entre los eritroblastos y otros tipos celulares son las mayores en la RDM dentro del genFEQ, procedimos primero al análisis del % de E basado en este sitio marcador para comprobar nuestra hipótesis. Posteriormente, analizamos el % de E basado en las otras dos RDM específicas de eritroblastos en un subconjunto de muestras para validar los resultados del % de E a partir de la RDM asociada al gen de laFEQ. Los resultados del % de E basados en la RDM dentro del genFEQse indicarían como % de E(FEQ). También pueden utilizarse otros porcentajes o relaciones, tal como el porcentaje de secuencias metiladas, o simplemente una relación entre secuencias metiladas y secuencias no metiladas, donde cualquiera de los valores puede estar en el numerador y en el denominador de la relación.
[0115] Específicamente, el número de secuencias de ADN metiladas y no metiladas en cada muestra en los cuatro sitios de CpG del genFEQde la FIG.1 se determinó mediante PCR digital. A continuación, se calculó el porcentaje de ADN no metilado (% No met./% de E) en la muestra. En una realización, para que un fragmento de ADN se considere no metilado, los cuatro sitios de CpG deben estar no metilados.
[0116] Para analizar la capacidad de las señales del ensayo con objeto de cuantificar eritroblastos, se utilizan dos escenarios. Uno de los escenarios es el de la sangre del cordón umbilical frente a la sangre de adultos, ya que los dos tipos de muestras varían en cuanto al número de eritroblastos. Y, en el otro escenario, los sujetos con beta-talasemia mayor tienen un número apreciable de eritroblastos en su sangre.
[0117] A. Muestras enriquecidas en eritroblastos frente a la capa leucoplaquetaria de sujetos sanos
[0118] El número de eritroblastos en la sangre adulta es muy bajo. La sangre de cordón umbilical tiene un número mucho mayor de eritroblastos. Por tanto, el % de E para los cuatro sitios de CpG debería ser mucho mayor en la sangre de cordón umbilical que en la de los pacientes sanos. Por consiguiente, para confirmar la especificidad tisular de los ensayos con PCR digital dirigidos a la RDM asociada al gen de laFEQpara detectar ADN eritroide, probamos los ensayos con PCR digital en muestras que incluían ADN extraído de 12 tipos diferentes de tejidos normales y en muestras enriquecidas con eritroblastos. Se incluyeron 4 muestras de diferentes individuos de cada tipo de tejido. Para el análisis, se preparó una muestra enriquecida en eritroblastos a partir de sangre de cordón umbilical.
[0119] Específicamente, para confirmar la relación entre la densidad de metilación en las RDM y el % de E, se recogieron muestras de sangre venosa de 21 sujetos sanos y de 30 mujeres gestantes (10 en el primer trimestre, 10 en el segundo trimestre y 10 en el tercer trimestre). Las muestras de sangre se centrifugaron a 3.000 g durante 10 minutos para separar el plasma de los glóbulos sanguíneos. La capa leucoplaquetaria se recogió después de la centrifugación. Las muestras de plasma se recogieron y volvieron a centrifugarse a 30.000 g para eliminar las glóbulos sanguíneos residuales.
[0120] En cuanto a los 12 tipos diferentes de tejido normal, se incluyeron 4 muestras de diferentes individuos de cada tipo de tejido. Como se muestra en la Tabla 4, los valores de la mediana de % de E(FEQ) de todo el ADN de los tejidos fueron bajos (intervalo de valores de la mediana: del 0,00 % al 2,63 %).
[0123]
[0124] continuación
[0127]
[0130] Tabla 4. La tabla muestra la mediana del porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en 4 conjuntos de 12 tipos de tejidos, obteniéndose cada muestra de tejido de un individuo diferente.
[0132] A continuación se describen los procedimientos experimentales para el enriquecimiento a partir de sangre de cordón umbilical mediante citometría de flujo y clasificación celular y la posterior extracción de ADN. Después de dar a luz a sus bebés, se recogieron 1-3 ml de sangre de cordón umbilical de cada una de las ocho mujeres. Las células mononucleares se aislaron de las muestras de sangre de cordón después de realizar la centrifugación en gradiente de densidad utilizando el kit Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). Después de recoger las células mononucleares, durante 30 minutos y en la oscuridad a 4 °C, se incubaron 1 x 10<8>células con 1 ml de la mezcla de anticuerpos anti-CD235a (Glicoforina A) conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-CD71 conjugados con ficoeritrina (PE) (Miltenyi Biotec) en una dilución 1:10 en solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se realizó la clasificación y el análisis de las células mediante el clasificador celular por fusión BD FACS Aria (BD Biosciences). A continuación, utilizando el clasificador celular BD FACS Aria Fusion (BD Biosciences), se realizó la clasificación y el análisis de las células CD235a+CD71+. Dado que CD235a y CD71 estaban específicamente presentes en los eritroblastos, las células CD235a+CD71+ estarían enriquecidas en eritroblastos (Bianchiet al.Prenatal Diagnosis 1993;13:293-300).
[0134] Como el número de células obtenidas en cada caso era pequeño, las células de los ocho casos se agruparon para su análisis posterior. Los dos anticuerpos son específicos de eritroblastos y se adhieren a su superficie. Los dos anticuerpos están conjugados respectivamente con FITC y ficoeritrina. Estas dos sustancias se unen a microesferas magnéticas y las microesferas pueden clasificarse utilizando el clasificador celular. Por lo tanto, los eritroblastos marcados con Ac (anticuerpo) pueden capturarse. Utilizando citometría de flujo y clasificación celular con anticuerpos anti-CD71 (receptor de transferrina) y anti-CD235a (glicoforina A) (véanse el apartado complementario Materiales y Métodos), se enriquecieron eritroblastos a partir de 8 muestras de sangre de cordón umbilical y posteriormente se agruparon. Se extrajo ADN de la muestra agrupada.
[0136] El % de E(FEQ) del ADN de las muestras de sangre de cordón umbilical agrupadas fue del 67 % en los cuatro sitios de CpG analizados en el ensayo para detectar las células CD235a+CD71+ (en su mayoría eritroblastos). Respecto al % de E(FEQ) en el ADN de la capa leucoplaquetaria de 20 sujetos sanos, que tenía un número indetectable de eritroblastos en su sangre periférica, la mediana del % de E en el ADN de la capa leucoplaquetaria fue del 2,2 % (intervalo intercuartílico: 1,2 - 3,1 %). La observación de bajas proporciones de secuencias no metiladas específicas de eritroblastos en la capa leucoplaquetaria de sujetos sanos, está en consonancia con el hecho de que los GR maduros no poseen núcleo. Dado que CD235a y CD71 son marcadores de superficie celular específicos de eritroblastos (Bianchiet al.Prenatal Diagnosis 1993;13:293-300), el elevado % de E(FEQ) en las células enriquecidas para CD235a y CD71, muestra que el ensayo para detectar ADN no metilado en la RDM específica de eritroblastos, sería capaz de detectar el ADN procedente de eritroblastos. Por consiguiente, este elevado % de E para las muestras enriquecidas en eritroblastos, junto con los bajos resultados de % de E para el ADN de otros tipos de tejidos y el ADN de la capa leucoplaquetaria de sujetos sanos, muestra que el ensayo con PCR digital para detectar secuenciasFEQno metiladas era específico para ADN procedente de eritroblastos.
[0138] B. Caso de pacientes con beta-talasemia mayor
[0140] En pacientes que padecen beta-talasemia mayor, la médula ósea intenta producir muchos glóbulos rojos (GR). Sin embargo, la producción de hemoglobina es defectuosa. Como resultado, muchos GR no contienen suficiente hemoglobina y contienen un exceso de cadenas de globina alfa. Estos GR defectuosos se eliminarían de la médula ósea y nunca se convertirían en GR maduros. Existen dos tipos de cadenas de globina: alfa y beta. Una molécula de hemoglobina requiere dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Si no se producen las cadenas beta, las cadenas alfa en exceso se agregan entre sí y no puede formarse hemoglobina funcional.
[0141] En pacientes con beta-talasemia mayor, la eritropoyesis aumentada pero ineficaz daría lugar a una producción reducida de GR maduros (Schrieret al.Current Opinion in Hematology 2002;9:123-6). Esto se acompaña de hematopoyesis extramedular compensatoria y de la presencia de glóbulos rojos nucleados en la circulación. Como se describe a continuación, un paciente con beta-talasemia mayor tendrá más glóbulos rojos nucleados que un paciente sano. El número de GR nucleados en la sangre periférica puede contarse en un frotis sanguíneo y expresarse como número de GR nucleados por cada 100 glóbulos blancos (GB).
[0142] Dado que los pacientes con talasemia mayor generalmente tienen un mayor número de eritroblastos en la sangre periférica que los individuos sanos debido a la eritropoyesis ineficaz (27), dichos pacientes también proporcionan un buen mecanismo para evaluar la especificidad y la sensibilidad de los ensayos. Por lo tanto, analizamos la sensibilidad de nuestros ensayos con PCR digital en el ADN de la capa leucoplaquetaria de quince pacientes con β-talasemia mayor. Todos ellos tenían un número detectable de eritroblastos en la sangre periférica medido con un analizador hemático automatizado (UniCel DxH 800 Coulter Cellular Analysis System, Beckman Coulter) y confirmado mediante recuento manual.
[0143] La FIG.3 A es un gráfico que muestra una correlación entre el % de E(FECH) en los glóbulos sanguíneos y el número de GR nucleados (eritroblastos) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El % de E se mide a través de los ensayos con PCR digital dirigidos a la RDM asociada al gen de laFEQ. Como se muestra en los ejes, el gráfico muestra la correlación entre el porcentaje de secuencias de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en el ADN de la capa leucoplaquetaria y el porcentaje de eritroblastos entre todos los glóbulos blancos periféricos, medido utilizando un analizador hemático automático.
[0144] Como se muestra en la FIG.3 A, el % de E(FEQ) en el ADN de la capa leucoplaquetaria se correlacionó bien con el porcentaje de eritroblastos entre los glóbulos blancos periféricos medido con el analizador hemático (r= 0,94,P <0,0001, correlación de Pearson). La buena relación lineal entre el % de E y el recuento de eritroblastos en la capa leucoplaquetaria de los pacientes con talasemia demuestra que los ensayos con PCR digital proporcionaron una buena medición cuantitativa del contenido de ADN eritroide en las muestras, ya que los eritroblastos no están metilados en la RDM mientras que los otros glóbulos sanguíneos si lo están. Por lo tanto, cuanto mayor sea la proporción de eritroblastos en una muestra de sangre, mayor sería el % de E. Un objetivo de este experimento es demostrar que los ensayos pueden utilizarse para reflejar la cantidad de ADN procedente de eritroblastos en una muestra. Estos resultados respaldan además que el % de E del gen de la ferroquetalasa (FEQ) refleja la proporción de ADN procedente de eritroblastos.
[0145] Esta correlación también existiría en otros pacientes. Pero, dado que el número de eritroblastos puede ser elevado en los pacientes que padecen beta-talasemia mayor, sus muestras proporcionan una buena prueba para identificar dicha correlación. Como puede observarse en la FIG.3 A, los pacientes tenían un amplio intervalo de % de E y de número de eritroblastos, lo que proporciona un buen mecanismo para evaluar la correlación.
[0146] C. Método de determinación de la cantidad de ADN celular de un linaje celular en particular
[0147] En algunas realizaciones, una cantidad de fragmentos de ADN no metilados o metilados en una mezcla acelular (p. ej., una muestra de plasma o suero) puede utilizarse para determinar un número de células (u otra cantidad de ADN) de un linaje celular particular cuando la cantidad se cuantifica en una o más RDM específicas del linaje celular particular. Como se muestra en la FIG.3 A, el porcentaje de fragmentos de ADN no metilados en la RDM asociada al gen de la ferroquetalasa (FEQ) se correlaciona con el número de eritroblastos en la muestra de sangre. También podría usarse una concentración absoluta. En el caso de una RDM hipermetilada, puede utilizarse la cantidad (p. ej., un porcentaje o una concentración absoluta) de fragmentos de ADN metilados. Pueden utilizarse diversos linajes celulares, como se describe en el presente documento.
[0148] Para determinar el número de células, puede utilizarse una función de calibración. En el ejemplo de la FIG. 3A, el ajuste de la línea a los puntos de datos puede proporcionar la función de calibración. Como ejemplos, la función de calibración puede almacenarse mediante sus parámetros funcionales (p. ej., la pendiente y la intersección y para una línea, o más parámetros para otras funciones), o almacenarse mediante un conjunto de puntos de datos a partir del cual pueda obtenerse un ajuste de curva. Los puntos de datos (p. ej., denominados puntos de datos de calibración) pueden tener valores conocidos para la cantidad de ADN del linaje celular (p. ej., el número de células), los cuales pueden determinarse mediante otra técnica, tal como se determinó el número de eritroblastos.
[0149] Por consiguiente, un método puede determinar la cantidad de ADN de un linaje celular particular en una muestra de sangre. A partir de un ensayo puede determinarse el número de secuencias metiladas o no metiladas de una o más RDM, como se describe en el presente documento. Se puede determinar un nivel de metilación y compararlo con un valor de calibración de una función de calibración. Por ejemplo, el nivel de metilación puede compararse con una línea (u otra función de calibración) para determinar la intersección de la función con ese nivel de metilación y, por tanto, la cantidad correspondiente de ADN (p. ej., el valor en el eje horizontal de la FIG.3A). En otras realizaciones, el nivel de metilación puede compararse con puntos de datos de calibración individuales, p. ej., que tienen un nivel de metilación cercano al nivel de metilación medido de una muestra.
[0150] La FIG. 3B es un diagrama de flujo que ilustra un método 300 para determinar una cantidad de células de un linaje celular particular en una muestra biológica analizando ADN acelular de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El método 300 puede utilizar mediciones como las mostradas en la FIG.3A. Algunas partes del método 300 pueden realizarse manualmente y otras mediante un sistema informático. En una realización, un sistema puede realizar todas las etapas. Por ejemplo, un sistema puede incluir elementos robóticos (p. ej., para obtener una muestra y realizar un ensayo), un sistema de detección para detectar señales de un ensayo, y un sistema informático para analizar las señales. Las instrucciones para controlar dicho sistema pueden almacenarse en uno o más medios legibles por ordenador, tal como la lógica de configuración de una matriz de puertas programables en campo (FPGA,field programmable gate array), memoria flash y/o un disco duro. La FIG.27 muestra dicho sistema.
[0151] En el bloque 310, se obtiene una mezcla acelular de la muestra biológica. La muestra biológica puede ser una muestra de sangre, pero también pueden ser otras muestras que incluyan ADN acelular, como se describe en el presente documento. Como ejemplos de una mezcla acelular se incluyen plasma o suero. La mezcla acelular puede incluir ADN acelular de una pluralidad de linajes celulares.
[0152] En el bloque 320, los fragmentos de ADN de la mezcla acelular se ponen en contacto con un ensayo correspondiente a una o más regiones diferencialmente metiladas. Cada una de la una o más regiones diferencialmente metiladas es específica de un linaje celular particular (p. ej., un linaje celular hemático particular, como los eritroblastos) al estar hipometilada o hipermetilada en relación con otros linajes celulares.
[0153] En diversas realizaciones, el ensayo puede implicar PCR o secuenciación. La puesta en contacto con los fragmentos de ADN puede implicar una cubeta de lectura, nanogotas, microesferas u otros mecanismos, para proporcionar una interacción del ensayo con los fragmentos de ADN. Como ejemplos de este tipo de ensayo se incluyen secuenciación del genoma completo mediante bisulfito, secuenciación dirigida mediante bisultifo (por captura de hibridación o secuenciación de amplicones), otra secuenciación sensible a metilación (p. ej., secuenciación de ADN en tiempo real de una sola molécula (SMRT,single molecule real-time) de Pacific Biosciences), PCR en tiempo real específica de metilación y PCR digital. En el presente documento se describen ejemplos adicionales de ensayos que pueden utilizarse en el método 300, p. ej., en el apartado XII. Aunque el ejemplo de la FIG. 3 A corresponde a eritroblastos, también pueden utilizarse otros linajes celulares, incluidos otros linajes celulares hemáticos.
[0154] En el bloque 330, basándose en las señales obtenidas del ensayo, se detecta un primer número de fragmentos de ADN metilados o no metilados en la mezcla acelular en una o más regiones diferencialmente metiladas. Los ensayos pueden proporcionar diversas señales, tales como señales luminosas o eléctricas. Las señales pueden proporcionar una señal específica por fragmento de ADN, o una señal agregada que indique un número total de fragmentos de ADN con la firma de metilación (p. ej., como en la PCR en tiempo real).
[0155] En una realización, la secuenciación puede utilizarse para obtener una lectura de secuencia de un fragmento de ADN, y el fragmento de ADN puede alinearse con un genoma de referencia. Si el fragmento de ADN se alinea con una de las RDM, se puede incrementar un contador. Dado que la señal proviene de un ensayo particular de ADN metilado o no metilado, se puede suponer que el fragmento de ADN tiene esa firma de metilación. En otra realización, una lectura de PCR (p. ej., una señal luminosa de un pocillo positivo) puede utilizarse para incrementar dicho contador.
[0156] En el bloque 340, utilizando el primer número, se determina un primer nivel de metilación. El primer nivel de metilación puede ser una concentración normalizada o absoluta, p. ej., por volumen de muestra biológica. En la FIG. 25 se muestra un ejemplo de concentración absoluta.
[0157] Para un valor normalizado, utilizando el primer número puede determinarse un nivel de metilación y un número total de fragmentos de ADN en la mezcla acelular en una o más regiones diferencialmente metiladas. Como se ha descrito anteriormente, el nivel de metilación puede ser un porcentaje de fragmentos de ADN no metilados. En otras realizaciones, el porcentaje puede ser de fragmentos de ADN metilado, que tendrían una relación inversa con respecto a los ejemplos anteriores para los eritroblastos. En diversas implementaciones, el nivel de metilación puede determinarse utilizando un porcentaje global en todos los sitios de la RDM, mediante un promedio de los porcentajes individuales en cada sitio, o mediante un promedio ponderado en cada sitio.
[0158] En el bloque 350, se obtienen uno o más puntos de datos de calibración. Cada punto de datos de calibración puede especificar (1) una cantidad de células del linaje celular hemático concreto y (2) un nivel de metilación de calibración. El uno o más puntos de referencia de calibración se determinan a partir de una pluralidad de muestras de calibración. La cantidad de células puede especificarse como una cantidad particular (p. ej., un número o una concentración) o un intervalo de cantidades. Los puntos de datos de calibración pueden determinarse a partir de muestras de calibración con cantidades conocidas de células, que puede medirse mediante diversas técnicas descritas en el presente documento. Al menos algunas de las muestras de calibración tendrían una cantidad diferente de células, pero algunas muestras de calibración pueden tener la misma cantidad de células.
[0159] En diversas realizaciones, uno o más puntos de calibración pueden definirse como un punto discontinuo, un conjunto de puntos discontinuos, como una función, como un punto discontinuo y una función, o cualquier otra combinación de conjuntos de valores discontinuos o continuos. Como un ejemplo, un punto de datos de calibración podría determinarse a partir de un nivel de metilación de calibración de una muestra con una cantidad de células particular del linaje particular.
[0160] En una realización, los valores medidos de un mismo nivel de metilación a partir de múltiples muestras en la misma cantidad de células, podrían combinarse para determinar un punto de datos de calibración para una cantidad de células particular. Por ejemplo, puede obtenerse un promedio de los niveles de metilación a partir de los datos de metilación de muestras de la misma cantidad de células, para determinar un punto de datos de calibración particular (o proporcionar un intervalo que corresponda al punto de datos de calibración). En otra realización, para determinar una cantidad promedio de células, pueden utilizarse múltiples puntos de datos con el mismo nivel de metilación de calibración.
[0161] En una implementación, se miden los niveles de metilación de muchas muestras de calibración. Para cada muestra de calibración, se determina un valor de calibración del nivel de metilación, donde el nivel de metilación puede representarse gráficamente frente a la cantidad conocida de células de las muestras (p. ej., como en la FIG. 3A). A continuación, se puede ajustar una función a los puntos de datos del gráfico, donde el ajuste funcional define los puntos de datos de calibración que se utilizarán para determinar la cantidad de células de una nueva muestra. En el bloque 360, el primer nivel de metilación se compara con un nivel de metilación de calibración de al menos un punto de datos de calibración. La comparación puede realizarse de varias formas. Por ejemplo, la comparación puede consistir en si el primer nivel de metilación es mayor o menor que el nivel de metilación de calibración. La comparación puede implicar la comparación con una curva de calibración (compuesta por los puntos de datos de calibración), y así la comparación puede identificar el punto de la curva que tiene el primer nivel de metilación. Por ejemplo, un valor X calculado del primer nivel de metilación puede utilizarse como entrada en una función F(X), donde F es la función de calibración (curva). El resultado de F(X) es la cantidad de células. Se puede proporcionar un intervalo de error, que puede ser diferente para cada valor de X, proporcionando así un intervalo de valores como resultado de F(X).
[0162] En el bloque 370, la cantidad de células del linaje celular particular en la muestra biológica se estima basándose en la comparación. En una realización, se puede determinar si el primer nivel de metilación está por encima o por debajo de un nivel umbral de metilación de calibración, y de este modo, determinar si la cantidad de células de la muestra actual está por encima o por debajo de la cantidad de células correspondiente al nivel umbral de metilación de calibración. Por ejemplo, si el primer nivel de metilación calculado X<1>de la muestra biológica está por encima de un nivel de metilación de calibración Xc, entonces puede determinarse que la cantidad de células N<1>de la muestra biológica está por encima de la cantidad de células Nc correspondiente a Xc. Esta relación de por encima y por debajo puede depender de cómo se defina el parámetro. En dicha realización, puede ser necesario un solo punto de datos de calibración.
[0163] En otra realización, la comparación se realiza introduciendo el primer nivel de metilación en una función de calibración. La función de calibración puede comparar eficazmente el primer nivel de metilación con los niveles de metilación de calibración identificando el punto de una curva correspondiente al primer nivel de metilación. La cantidad estimada de células se proporciona entonces como el valor de salida de la función de calibración.
[0164] IV. ORIGEN DEL ADN ACELULAR DE ERITROBLASTOS EN PLASMA
[0165] Utilizando la relación establecida entre el % No met. y el ADN procedente de eritroblastos, el % No met. de plasma puede utilizarse para cuantificar el ADN procedente de eritroblastos en plasma. El % No met. en plasma se determinó utilizando los ensayos anteriores. Se observa una diferencia de % No met. en la capa leucoplaquetaria y el plasma. El análisis demuestra que el ADN acelular de eritroblastos en plasma procede de la eritropoyesis en la médula ósea, y no de los eritroblastos que se encuentran en el torrente circulatorio.
[0166] Tras confirmar que el % No met. determinado por los dos ensayos PCR digital refleja con exactitud la cantidad de ADN procedente de eritroblastos en una muestra, procedimos a comparar la proporción de ADN procedente de eritroblastos en la capa leucoplaquetaria y el plasma de sujetos de control sanos y de mujeres gestantes.
[0167] La FIG.4 muestra el % No met. en la capa leucoplaquetaria y el plasma de mujeres sanas no gestantes y gestantes en diferentes trimestres de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Las muestras de plasma tenían un % No met. significativamente más elevado en comparación con el de la capa leucoplaquetaria en cada grupo de sujetos (P<0,01, prueba de Wilcoxon para datos emparejados (sign-rank test) de cada comparación por pares entre el plasma y la capa leucoplaquetaria).
[0168] Los resultados de la FIG. 4 muestran que la cantidad de ADN procedente de eritroblastos es baja en los glóbulos sanguíneos, como cabía esperar, ya que el número de GR nucleados es bajo. Un resultado sorprendente es que la cantidad de ADN procedente de eritroblastos en plasma es elevada. Si el ADN procedente de eritroblastos en plasma procede de glóbulos sanguíneos, cabría esperar que ambas cantidades fueran similares. Por tanto, estos datos demuestran que el origen del ADN procedente de eritroblastos en el plasma corresponde al de la eritropoyesis en la médula ósea.
[0169] La FIG. 5 es un gráfico que muestra la ausencia de correlación entre el % No met. en la capa leucoplaquetaria y el plasma. No se observó ninguna correlación significativa entre el % No met. de ADN de la capa leucocitaria y plasma (R<2>=0,002, P=0,99, correlación de Pearson). La ausencia de correlación puede observarse en todos los sujetos, incluidas mujeres no gestantes, mujeres gestantes en el 1<er>trimestre, 2º trimestre y 3<er>trimestre. Al igual que con los resultados de la FIG.4, esto es sorprendente, ya que cabría esperar que ambos estuvieran correlacionados si el ADN procedente de eritroblastos tuviera su origen en los glóbulos sanguíneos presentes en el torrente circulatorio.
[0170] La observaciones respecto a que el ADN plasmático tiene un porcentaje de no metilación (% No met. ) mucho más elevado que el de la capa leucoplaquetaria y respecto a la ausencia de correlación entre el % No met. del ADN del plasma y de la capa leucoplaquetaria, sugieren que el ADN circulante acelular portador de la firma de metilación de los eritroblastos probablemente procede de la médula ósea durante el proceso de eritropoyesis, en lugar de proceder de los glóbulos sanguíneos circulantes. Por consiguiente, el ADN plasmático acelular con la firma de metilación de los eritroblastos se genera en la médula ósea, en lugar de generarse a partir de GR nucleados en el torrente circulatorio, ya que el número de GR nucleados en el torrente circulatorio es muy bajo en sujetos sanos y mujeres gestantes. Y, dado que la contribución de los glóbulos blancos (GB) a la firma de metilación de los eritroblastos es muy baja, esta contribución no proporciona ninguna dependencia medible del ADN plasmático acelular con la firma de metilación de los eritroblastos.
[0171] V. NIVEL DE METILACIÓN COMO MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ERITROPOYESIS
[0172] Basándose en las observaciones anteriores, determinamos que el % No met. en una RDM de eritroblastos reflejaría la actividad de la eritropoyesis en la médula ósea. Un elevado % No met. indicaría una alta actividad de la eritropoyesis. Dicho de otro modo, el análisis del ADN de eritroblastos presente en plasma/suero, serviría como biopsia líquida de la médula ósea. Este análisis sería particularmente útil para investigar la anemia, p. ej., para determinar si la anemia se debe a la reducción de la eritropoyesis (p. ej., anemia aplásica), a una eritropoyesis defectuosa (p. ej., disfunción en la producción de GR en caso de talasemia) o a un aumento del consumo de GR (p. ej., hemorragia y anemia hemolítica). Para este fin, se incluyeron 35 sujetos sanos y 75 pacientes anémicos con diferentes etiologías. Se llevaron a cabo la recogida y el procesamiento de muestras de sangre periférica, la extracción de ADN de plasma y de la capa leucoplaquetaria así como la conversión del ADN mediante bisulfito. En el apartado XII se describen con más detalle los métodos.
[0173] A. Medición del ADN eritroide acelular en el plasma de sujetos sanos
[0174] Tras confirmar la especificidad de nuestros ensayos, los utilizamos para analizar el plasma de sujetos sanos. Analizamos el % de E(FEQ) en el plasma de 35 sujetos sanos, incluido el mismo grupo de 20 sujetos que también proporcionó las muestras de la capa leucoplaquetaria. La mediana del % de E(FEQ) del ADN plasmático fue del 30,1 % (intervalo intercuartílico: 23,8 - 34,8 %). Esto sugería que el ADN eritroide comprendía una proporción significativa de la reserva de ADN circulante en el plasma de individuos sanos. Para determinar el origen del ADN eritroide plasmático, comparamos los resultados correspondientes de % de E(FEQ) en el plasma y la capa leucoplaquetaria de los 20 sujetos sanos.
[0175] Las FIGS.6A y 6B muestran porcentajes de ADN eritroide (% de (FEQ)) en sujetos sanos. La FIG.6A muestra el % de E en el ADN de la capa leucoplaquetaria y el ADN plasmático de sujetos sanos, donde el valor de % de E es mayor en el plasma (parte acelular) que en la capa leucoplaquetaria (parte celular). La mediana del % de E en el ADN plasmático (mediana: 26,7 %, intervalo intercuartílico: 23,7 - 30,4 %) fue significativamente superior a la del ADN de la capa leucoplaquetaria emparejada (mediana: 2,2 %, intervalo intercuartílico: 1,2 - 3,1 %)(P <0,0001, prueba de Wilcoxon para datos emparejados).
[0176] La FIG. 6B muestra la ausencia de correlación entre el % de E en el ADN de la capa leucoplaquetaria y en el ADN plasmático de los sujetos sanos correspondientes. Hubo una ausencia de correlación entre los resultados emparejados de % de E(FEQ) en el ADN plasmático y en el ADN de la capa leucoplaquetaria(r =0,002,P =0,99, correlación de Pearson). Ambos hallazgos en las FIGS.6A y 6B muestran que es poco probable que el ADN eritroide circulante se haya originado predominantemente a partir de los eritroblastos circulantes en la sangre periférica.
[0177] La FIG.7 muestra la ausencia de correlación entre los resultados del % de E(FEQ) en ADN plasmático y la edad de los sujetos sanos. El gráfico muestra que los resultados de % de E (FECH) no están correlacionados con la edad de los sujetos (r=0,21,p=0,23, correlación de Pearson).
[0178] B. Discriminación entre pacientes con beta-talasemia mayor y anemia aplásica
[0179] Tras determinar que el ADN eritroide en plasma no se liberaba predominantemente de eritroblastos intactos en la circulación, propusimos que era más probable que estas moléculas de ADN se liberaran de la médula ósea durante la eritropoyesis. Pensamos que el análisis cuantitativo del ADN eritroide en el plasma podría proporcionar información sobre la actividad eritropoyética en la médula ósea.
[0180] Para confirmar la capacidad de medir la actividad de la eritropoyesis en la médula ósea usando plasma, se incluyeron pacientes con beta-talasemia mayor y anemia aplásica del Departamento de Medicina, Hospital de Prince of Wales, Hong Kong. Se recogieron muestras de sangre venosa antes de la transfusión. El % de ADN plasmático no metilado se determinó mediante PCR digital para cada paciente. Estos resultados se correlacionaron con los niveles de hemoglobina. Los niveles de hemoglobina pueden medirse mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia, p. ej., mediante una técnica fotométrica realizada en contadores automáticos de glóbulos sanguíneos. Los niveles de hemoglobina pueden medirse a partir de una parte de GR, p. ej., obtenida después de centrifugar.
[0181] Estos dos grupos de pacientes (beta-talasemia mayor y anemia aplásica) representan dos espectros diferentes de actividad eritropoyética. En pacientes con beta-talasemia mayor, la eritropoyesis es muy activa. Sin embargo, debido a la producción defectuosa de la cadena funcional de beta-globina, se reduce la producción GR maduros. En pacientes con anemia aplásica, se reduce la eritropoyesis, lo que conlleva una menor producción de GR.
[0182] La FIG.8 es un gráfico del % No met. frente a las concentraciones de hemoglobina en pacientes con anemia aplásica, beta-talasemia mayor y sujetos de control sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En pacientes con beta-talasemia, se redujeron las concentraciones de hemoglobina, pero el % No met. aumentó significativamente en comparación con los sujetos de control sanos (P<0,01, prueba de Mann-Whitney para datos independientes). De hecho, los valores de % No met. en 10 (89 %) de los 11 pacientes con beta-talasemia eran superiores a los valores de todos los sujetos de control sanos. Esta observación está en consonancia con el aumento de la eritropoyesis, aunque defectuosa, en estos pacientes.
[0183] En cambio, para los seis pacientes con anemia aplásica sometidos a transfusiones regulares, sus valores de % No met. eran inferiores a los valores de todos los sujetos de control sanos. Esta observación es coherente con la reducción de la eritropoyesis en estos pacientes.
[0184] Para los tres pacientes con anemia aplásica que estaban en remisión clínica, sus niveles de hemoglobina eran normales y no requerían transfusiones periódicas. Sus valores de % No met. no fueron significativamente diferentes de los valores de los sujetos de control sanos (P=0,53, prueba de Mann-Whitney para datos independientes). Por consiguiente, el análisis cuantitativo de ADN específico de eritroblastos en plasma sería útil para el seguimiento de los pacientes con disfunción de la médula ósea, p. ej., para determinar si la anemia aplásica se encuentra en remisión. Adicionalmente, el análisis cuantitativo de ADN específico de eritroblastos puede utilizarse para orientar los tratamientos. Por ejemplo, los pacientes que tienen anemia aplásica que no se encuentra en remisión pueden tratarse con transfusiones de sangre regulares.
[0185] Por consiguiente, el % No met. es mayor en los pacientes con talasemia y menor en los pacientes con anemia aplásica. En el caso de la talasemia, la médula está activa porque el paciente está anémico y la médula quiere producir más GR en la circulación. Por lo tanto, la tasa de eritropoyesis es superior a la de los sujetos sanos sin anemia. En los casos de pacientes con anemia aplásica, la anemia se debe a la reducción de la producción de GR. En conjunto, estos resultados indican que el análisis del perfil de metilación específico de los eritroblastos sería útil para reflejar la actividad de la eritropoyesis en la médula ósea.
[0186] Los pacientes pueden diagnosticarse mediante una combinación de medición de hemoglobina y % No met. Por ejemplo, un paciente que tiene una hemoglobina inferior a 11,8 y un % de E superior a 50, puede clasificarse como que padece β-talasemia. Mientras que, un paciente que tiene una hemoglobina inferior a 11,8 y un % de E inferior a 25 puede clasificarse como que padece anemia aplásica.
[0187] C.Anemia ferropénica y tratamiento
[0188] La anemia puede deberse a la carencia de un nutriente (p. ej. hierro, B12, folato, etc.), hemorragia (p. ej., debido a menorragia o sangrado del tubo gastrointestinal) o a un trastorno crónico (p. ej. cáncer, enfermedades inflamatorias intestinales).
[0189] La FIG. 9 es un gráfico del % No met. en plasma de pacientes con anemia ferropénica (carencia de hierro (Fe)) y hemorragia aguda. Se estudiaron tres pacientes con anemia ferropénica y un paciente que presentaba hemorragia aguda gastrointestinal. En dos pacientes con ferropenia, la anemia se debía a la menorragia. En un paciente, la muestra de sangre se recogió antes de iniciar la terapia de suplementación con hierro. En el otro, la muestra de sangre se recogió 1 semana después de iniciar la terapia de suplementación con hierro. El tercer paciente con anemia ferropénica padecía una enfermedad inflamatoria intestinal y la muestra de sangre se recogió antes de iniciar la terapia de suplementación con hierro.
[0190] Se determinó el % de No met. plasmático de cada paciente y se comparó con los valores de los sujetos de control sanos. Se observó un aumento del % de No met. plasmático en el paciente con sangrado agudo del tubo gastrointestinal. En los dos pacientes con ferropenia cuyas muestras se recogieron antes de iniciar la terapia de suplementación con hierro, sus valores de % de No met. plasmático no aumentaron en comparación con los sujetos sanos a pesar de tener niveles bajos de hemoglobina. En el paciente con ferropenia cuya muestra se recogió 1 semana después de iniciar la terapia de suplementación con hierro, se observó un aumento del % de No met. plasmático. Estos resultados muestran que el % No met. plasmático refleja la actividad de la eritropoyesis en respuesta al tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento con suplementos de hierro muestra un aumento de la actividad de la eritropoyesis. Adicionalmente, estos resultados muestran que la respuesta en el % de No met. sería más rápida que el aumento del nivel de hemoglobina. El uso del % de No met. puede ser un indicador precoz de si dicho tratamiento es eficaz y, por tanto, si debe continuarse o interrumpirse. Por lo tanto, el % de No met. puede proporcionar una orientación para predecir la respuesta a los tratamientos de la anemia, por ejemplo, terapia con hierro, antes de que puedan observarse cambios en el nivel de hemoglobina.
[0191] En algunas realizaciones, el % de No met. plasmático puede utilizarse para reflejar la respuesta a los tratamientos de la anemia. Por ejemplo, en pacientes con anemia ferropénica, la respuesta a la suplementación oral de hierro podría variar entre diferentes sujetos debido a la variación en la absorción del hierro a través del tubo intestinal. En dicho escenario, la ausencia de aumento del % de No met. en plasma tras iniciar la suplementación oral de hierro, puede utilizarse para indicar la necesidad de terapia con hierro intravenoso.
[0192] D. Discriminación entre diversos trastornos anémicos
[0193] Se incluyeron pacientes anémicos que padecían anemia aplásica (AA), insuficiencia renal crónica (IRC), anemia ferropénica debida a hemorragia crónica y β-talasemia mayor. Se incluyeron diferentes entidades patológicas para representar los dos extremos del espectro de la actividad eritropoyética en la médula ósea.
[0194] La FIG. 10 muestra la relación entre el porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en el plasma y el nivel de hemoglobina entre pacientes con anemia aplásica, insuficiencia renal crónica (IRC), β-talasemia mayor, anemia ferropénica y sujetos sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El % de E(FECH) del ADN plasmático de los pacientes anémicos y de los 35 controles sanos se representa gráficamente frente al nivel de hemoglobina. La línea de puntos horizontal representa la mediana del % de E de los sujetos sanos. La línea vertical corresponde a un valor de corte (11,5, como se representa) del nivel de hemoglobina medido entre los sujetos que tienen anemia y los que no la tienen.
[0195] Analizamos el % de E de ADN plasmático en 13 pacientes con AA que cumplían los criterios diagnósticos (28) y que no respondieron a la terapia inmunosupresora. La mediana del % de E de ADN plasmático del grupo con AA fue del 12,4 % (intervalo intercuartílico: 7,5 - 13,7 %), que fue significativamente inferior a la de los controles sanos(P <0,0001, prueba de Mann-Whitney para datos independientes; FIG.10). De manera similar, el resultado de la mediana del % de E de 18 pacientes con IRC que precisaron diálisis fue del 16,8 % (intervalo intercuartílico: 12,2 - 21,0 %), que también fue significativamente inferior a la de los controles sanos(P< 0,0001, prueba de Mann-Whitney para datos independientes; FIG. 10). Estos hallazgos concuerdan con la fisiopatología de la reducción de la actividad eritropoyética en pacientes con AA(28, 29) e IRC(30).
[0196] En el caso de pacientes con β-talasemia mayor, la médula ósea intenta compensar el estrés hipóxico con un aumento de la eritropoyesis aunque ineficaz (31). Entre los 17 pacientes con β-talasemia mayor incluidos, la mediana del % de E de ADN plasmático fue del 65,3 % (intervalo intercuartílico: 60,1 - 78,9 %), que fue significativamente superior a la de los controles sanos(P <0,0001, prueba de Mann-Whitney para datos independientes; FIG.10).
[0197] En el caso de los sujetos con anemia ferropénica, se incluyeron 11 pacientes que padecían anemia ferropénica debida a menorragia o úlcera péptica (saturación de transferrina < 16 % o nivel de ferritina en suero < 30 ng/ml). Su mediana del % de E de ADN plasmático fue del 37,8 % (intervalo intercuartílico: 31,8 - 43,0 %), que fue significativamente superior a la de los controles sanos(P =0,002, prueba de Mann-Whitney para datos independientes; FIG. 10). Este hallazgo puede explicarse por el aumento compensatorio de la actividad eritropoyética de la médula como respuesta a hemorragia crónica (32).
[0198] Por consiguiente, los pacientes pueden diagnosticarse mediante una combinación de medición de hemoglobina y % de E. Como ejemplos, un paciente que tiene un nivel de hemoglobina inferior a 11,5 (u otro valor) y un % de E superior a 50, puede clasificarse como un paciente que padece anemia con actividad eritropoyética aumentada, p. ej., βtalasemia. Mientras que, un paciente que tiene un nivel de hemoglobina inferior a 11,5 y un % de E inferior a 50 y superior a 28, puede clasificarse como un paciente que padece anemia con actividad eritropoyética intermedia, p. ej., anemia ferropénica. Y, un paciente que tiene un nivel de hemoglobina inferior a 11,5 y un % de E inferior a 28, puede clasificarse como un paciente que padece anemia con actividad eritropoyética reducida, p. ej., anemia aplásica o insuficiencia renal crónica.
[0199] En algunas realizaciones, para determinar la clasificación de un trastorno hemático, se puede medir el nivel de hemoglobina de la muestra de sangre. El nivel de hemoglobina puede compararse con un umbral de hemoglobina (p. ej., 11,5). La clasificación del trastorno hemático puede basarse además en la comparación del nivel de hemoglobina con el umbral de hemoglobina, además de con un nivel de metilación.
[0200] Se muestra un resumen de los parámetros % de E(FEQ), de glóbulos rojos y de reticulocitos de los sujetos, en las Tablas 5 y 6, y en las Figuras 11A y 11B, respectivamente.
[0203]
[0206] Tabla 5. Tabla que resume la mediana del porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en el ADN plasmático de sujetos sanos y pacientes anémicos.
[0208] En la Tabla 6 a continuación, se muestran los valores de la mediana y los intervalos intercuartílicos (entre paréntesis). Se utilizan las siguientes abreviaturas: Hct, significa hematocrito, VEM, significa volumen eritrocitario medio, HCM, significa hemoglobina celular media, CHCM, significa concentración de hemoglobina celular media y ADE significa amplitud de distribución eritrocitaria.
[0210]
[0213] Tabla 6. Parámetros de glóbulos rojos (GR) de controles sanos y de pacientes anémicos incluidos.
[0215] Las FIGS. 11A y 11B muestran relaciones entre el recuento/índice de reticulocitos y el nivel de hemoglobina entre pacientes anémicos con anemia aplásica, insuficiencia renal crónica (IRC), β-talasemia mayor y anemia ferropénica.
[0216] El índice de reticulocitos se calcula como: recuento de reticulocitos × hematocrito/ hematocrito normal. Como puede observarse, la cantidad de reticulocitos (GR inmaduros) en la sangre no ofrece una discriminación fiable entre los distintos trastornos. Estos resultados muestran que los recuentos de reticulocitos y el índice de reticulocitos no pudieron diferenciar anemias de distinta etiología, p. ej., diferenciar la talasemia de la anemia aplásica.
[0217] E. Síndrome mielodisplásico y policitemia rubra vera
[0218] La FIG.12 es un gráfico del % No met. plasmático en pacientes con síndrome mielodisplásico y policitemia rubra vera. En pacientes con síndrome mielodisplásico, se observó un aumento del % No met. plasmático con el nivel de hemoglobina reducido. También se observó un aumento del % No met. plasmático en un paciente con policitemia rubra vera. Estos resultados demuestran que la detección y cuantificación de la firma de metilación del ADN eritroblástico en plasma, es útil para la detección y seguimiento de la proliferación anómala o displasia de la médula ósea en la que están implicadas las células mieloblásticas.
[0219] Por consiguiente, como se puede observar, estos dos trastornos hemáticos también muestran niveles más elevados de ADN acelular de eritroblastos, permitiendo de este modo la detección de un trastorno hemático. En algunas realizaciones, el diagnóstico exacto puede basarse en el examen histológico de la biopsia de médula ósea. Por tanto, puede realizarse una biopsia de médula ósea en respuesta a la detección de un alto % No met. De manera similar, puede realizarse una biopsia de médula ósea en respuesta a la detección de un bajo % No met. en presencia de anemia pero en ausencia de carencia nutricional, por ejemplo, ferropenia, carencia de vitamina B12 o carencia de folato. Estos criterios para realizar una biopsia de médula ósea, pueden reducir el número de tales biopsias, al tiempo que permiten controlar la salud de la médula ósea. Por consiguiente, el % No met. sería más útil para controlar la respuesta al tratamiento.
[0220] F. Otras discriminaciones para la anemia
[0221] También es posible discriminar entre otros trastornos.
[0222] 1. Anemia aplásica (AA) y síndrome mielodisplásico (SMD)
[0223] Tanto la anemia aplásica como el SMD son afecciones de insuficiencia medular. A pesar de sus características clínicas similares de pancitopenia, estas dos entidades patológicas tienen mecanismos fisiopatológicos diferentes. En la AA, la médula ósea en hipocelular sin rasgos de displasia. En el SMD, normalmente, la médula ósea es hipercelular y presenta displasia que afecta a uno o varios linajes (33), aunque también se ha reconocido el SMD hipocelular. La FIG.13A muestra un porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en plasma entre pacientes con anemia aplásica (AA) y síndrome mielodisplásico (SMD) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La mediana del % de E de ADN plasmático de 8 pacientes con SMD fue del 50,3 % (intervalo: 37,4 - 60,8 %). Dos casos tenían SMD con displasia unilinaje, 4 tenían displasia multilinaje, y 2 tenían SMD con exceso de blastos (34). Todas sus biopsias de médula ósea previas mostraban hipercelularidad eritroide. La mediana del % de E de los pacientes con SMD fue significativamente superior a la de los 13 pacientes con AA incluidos(P <0,0001, prueba de Mann-Whitney para datos independientes; FIG. 13A). El mayor resultado de la mediana del % de E observado en los pacientes con SMD concuerda con los hallazgos de la biopsia de médula ósea y con la fisiopatología de la eritropoyesis ineficaz en el SMD.
[0224] Por consiguiente, el SMD pueden diferenciarse de la anemia aplásica utilizando el % de E u otro nivel de metilación. Por ejemplo, puede utilizarse un valor de corte de 30 para clasificar una muestra como correspondiente a anemia aplásica o a SMD.
[0225] 2. Grupos de AA con respuesta al tratamiento y sin respuesta al tratamiento
[0226] La FIG. 13B muestra un porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en plasma entre los grupos que responden al tratamiento y los que no responden al tratamiento de anemia aplásica de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Analizamos 8 pacientes más con anemia aplásica que respondieron a la terapia inmunosupresora, aumentando de este modo el nivel de hemoglobina. La mediana del % de E de ADN plasmático del grupo que respondió al tratamiento fue del 22,5 % (intervalo intercuartílico: 17,2 - 27,1 %), que fue superior a la del grupo que no respondió (mediana: 12,3 %; intervalo intercuartílico: 7,5 - 13,7 %)(P =0,0003, prueba de Mann-Whitney para datos independientes; FIG.13B). Hubo una diferencia pequeña pero significativa entre los resultados de E% del grupo que respondió al tratamiento y los controles sanos(P= 0,01, prueba de Mann-Whitney para datos independientes). Estos resultados reflejan una recuperación de la actividad eritropoyética en la médula ósea. Dado que la recuperación en el % de E puede detectarse antes que los niveles de hemoglobina, el % de E puede utilizarse para determinar precozmente si un paciente está respondiendo a la terapia inmunosupresora. Cuando el paciente no responde, pueden aplicarse otros tratamientos (p. ej., tratamientos más agresivos), por ejemplo, realizar un trasplante de células madre o prescribir estimulantes de la médula ósea (p. ej., sargramostim, filgrastim y pegfilgrastim).
[0227] G. Leucemia
[0228] Además de la leucemia, también pueden detectarse otros trastornos sanguíneos utilizando una RDM específica de eritroblastos, como la del gen de la ferroquetalasa (FEQ).
[0229] La FIG.14 es un gráfico del % No met. en plasma frente a las concentraciones de hemoglobina en sujetos normales y dos pacientes con leucemia de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El % No met. se determina utilizando la RDM del gen FEQ. Los valores de % No met. en el plasma de los pacientes con leucemia o trastornos mieloproliferativos son superiores a los de la mediana de % No met. en el plasma de los sujetos normales. Esta observación está en consonancia con la observación de que la eritropoyesis está aumentada, pero es defectuosa, en pacientes con leucemia. Por tanto, podría utilizarse un valor de corte de aproximadamente 45 para el % No met. con el fin de diferenciar entre sujetos sanos y sujetos que tienen leucemia, determinando de este modo un nivel de un trastorno hemático. También puede utilizarse el nivel de hemoglobina, p. ej., un paciente con un nivel de hemoglobina inferior a 8 puede identificarse como un paciente que tiene leucemia a diferencia de la beta-talasemia, que generalmente tiene un nivel de hemoglobina entre 8 y aproximadamente 11,8, como se muestra en la FIG.10.VI. RESULTADOS DE OTROS MARCADORES DE METILACIÓN
[0230] Analizamos el % de E basado en las otras dos RDM en el plasma de un subconjunto de muestras para validar los resultados anteriores del % de E a partir de la RDM asociada al de gen de laFEQ. Se observaron diferencias similares en el porcentaje de ADN eritroide en el plasma entre sujetos sanos y pacientes con anemia aplásica y β-talasemia mayor utilizando las otras dos RDM específicas de eritroblastos, como la RDM del gen de laFEQ.
[0231] A. Otras dos RDM específicas de eritroblastos
[0232] Las otras dos RDM situadas en el cromosoma 12 también están hipometiladas. La región genómica asociada a estas dos RDM no se había identificado anteriormente dentro de ningún gen anotado.
[0233] Las FIGS. 15A y 15B muestran densidades de metilación de los sitios de CpG dentro de las RDM específicas de eritroblastos en el cromosoma 12 de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 15A muestra una región 1510 en las coordenadas genómicas del cromosoma 12: 48227688 - 48227701, que incluye 3 sitios. La FIG.
[0234] 15B muestra una región 1560 en las coordenadas genómicas del cromosoma 12: 48228144 - 48228154, que también incluye 3 sitios. Las coordenadas genómicas corresponden al genoma de referencia humano hg19. Todos los sitios de CpG seleccionados situados dentro de la región sombreada estaban hipometilados en los eritroblastos, pero hipermetilados en otros tejidos o tipos celulares. Otros tejidos representan el pulmón, colon, intestino delgado, páncreas, glándula suprarrenal, esófago, corazón y cerebro.
[0235] Estas otras dos RDM específicas de eritroblastos se denominan Eri-1 y Eri-2. El % de E basado en las otras dos RDM (cro 12: 48227688-48227701 y cro 12: 48228144-48228154) se indicaría como % de E(Eri-1) y % de E(Eri-2), respectivamente.
[0236] La FIG. 16 muestra la modificación de histonas (H3K4mel y H3K27Ac) sobre otras dos RDM específicas de eritroblastos (Eri-1 y Eri-2) de la base de datos ENCODE. Revisamos los datos disponibles públicamente sobre la modificación de histonas y el conjunto de datos CHIP-seq sobre estas dos RDM en el tipo celular eritroblasto de la base de datos ENCODE. Las RDM Eri-1 y Eri-2 están marcadas por dos modificaciones de histonas asociadas a potenciadores (H3K4mel y H3K27Ac), lo que sugiere que tienen funciones reguladoras, especialmente la de un potenciador. El gen más cercano en dirección 3' es el genHDAC7, que se encuentra aproximadamente a 15 kb.B. Muestras enriquecidas con eritroblastos
[0237] Analizamos el porcentaje de ADN eritroide basado en las otras dos RDM en las muestras enriquecidas con eritroblastos de 8 muestras de sangre de cordón umbilical descritas anteriormente. El % de E(Eri-1) y el % de E(Eri-2) del ADN extraído de las muestras agrupadas fue del 66,5 % y el 68,5 %. Estos valores de % de E fueron similares a los del % de E basados en la RDM asociada al gen de laFEQ, es decir, del 67 %. Dados los hallazgos similares en las tres RDM, el valor de % de E inferior al esperado (es decir, inferior al esperado cuando se realiza el enriquecimiento) podría deberse a la selectividad incompleta del protocolo de enriquecimiento.
[0238] C.Correlación de%de E en la capa leucoplaquetaria de pacientes con β-talasemia mayor con eritroblastosEl porcentaje de ADN eritroide basado en las dos RDM se analizó en el ADN de la capa leucoplaquetaria del mismo grupo de pacientes con β-talasemia mayor. El % de E para las dos RDM en el ADN de la capa leucoplaquetaria se correlacionó bien con el porcentaje de eritroblastos, de manera similar a la mostrada en la FIG.3A.
[0239] Las FIGS.17A y 17B muestran la correlación entre el porcentaje de secuencias de ADN eritroide (% de E) en el ADN de la capa leucoplaquetaria de pacientes con β-talasemia mayor medido a través de los ensayos con PCR digital dirigidos al marcador de Eri-1 (FIG.17A) y al marcador de Eri-2 (FIG.17B) y el porcentaje de eritroblastos entre todos los glóbulos blancos periféricos medido utilizando un analizador hemático automatizado. El % de E(Ery-1) y el % de E(Ery-2) en el ADN de la capa leucoplaquetaria se correlacionó bien con el porcentaje de eritroblastos entre los glóbulos blancos periféricos medido con el analizador hemático (r= 0,938 yr= 0,928, ambosP <0,0001, correlación de Pearson).
[0240] Las FIGS.18A y 18B muestran la correlación de los resultados del % de E(FEQ) y % de E(Eri-1) y % de E(Eri-2) en el ADN de la capa leucoplaquetaria de pacientes con β-talasemia mayor. Los resultados de % de E procedentes de estas dos RDM también se correlacionaron bien con los resultados emparejados de % de E procedentes del sitio marcador del genFEQen el ADN de la capa leucoplaquetaria de los 15 pacientes con β-talasemia mayor.
[0241] D.%de E en plasma de sujetos sanos y de pacientes anémicos
[0242] Analizamos el % de E(Eri-1) y el % de E(Eri-2) en el ADN plasmático de sujetos sanos y de pacientes con anemia aplásica y β-talasemia mayor. Los resultados de % de E basados en las tres RDM específicas de eritroblastos en el mismo grupo de sujetos sanos, en 7 pacientes con anemia aplásica y en 9 con β-talasemia mayor, se analizaron. La FIG.19 muestra el porcentaje de ADN eritroide en los sujetos sanos y en los pacientes con anemia aplásica y βtalasemia mayor utilizando el análisis de PCR digital dirigido a las tres RDM específicas de eritroblastos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La mediana del % de E(Eri-1) en el ADN plasmático de 13 sujetos sanos fue del 16,7 % (intervalo intercuartílico: 10,9 - 23,5 %) y la mediana del % de E(Eri-2) en el mismo grupo de sujetos sanos fue del 25,0 % (intervalo intercuartílico: 22,2 - 27,3 %). Basándose en el marcador Eri-1, el % de E(Eri-1) de los pacientes con anemia aplásica y β-talasemia mayor fue del 13,78 % y del 61,69 % respectivamente. Basándose en el marcador Eri-2, el % de E(Eri-2) de los pacientes con anemia aplásica y β-talasemia mayor fue del 14,13 % y del 64,95 % respectivamente. Se observaron diferencias similares en el porcentaje de ADN eritroide en el plasma entre sujetos sanos y pacientes con anemia aplásica y β-talasemia mayor utilizando las dos RDM específicas de eritroblastos, de manera comparable a la observada con la RDM específica de eritroblastos en el genFECH.
[0243] VII. RESULTADOS DEL TRATAMIENTO
[0244] Como se ha descrito anteriormente, el % de E puede utilizarse para controlar la eficacia del tratamiento de la anemia.A. Mediciones de% de E(FEQ) en ADN plasmático en pacientes con anemia ferropénica antes y después de terapia con hierro.
[0245] Controlamos los cambios en serie en el nivel de hemoglobina, recuentos de reticulocitos y % de E de ADN plasmático en 4 pacientes con anemia ferropénica que recibían tratamiento con hierro intravenoso debido a la intolerancia a los efectos secundarios gastrointestinales del hierro oral. En lugar de pacientes en terapia con hierro por vía oral, elegimos observar los cambios en este grupo de pacientes para evitar el posible factor de confusión a causa de las diferentes respuestas al tratamiento debidas a una absorción gastrointestinal variable. Medimos estos parámetros antes del tratamiento y dos días después del mismo.
[0246] Las FIGS. 20A y 20B muestran mediciones en serie del porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) en el ADN plasmático y el porcentaje de recuentos de reticulocitos de pacientes con anemia ferropénica que reciben terapia con hierro intravenoso en el estado previo al tratamiento y dos días después del tratamiento de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG.20A muestra el cambio en serie del % de E de ADN plasmático. La FIG.20B muestra el cambio en serie del porcentaje de recuentos de reticulocitos.
[0247] Excepto para el sujeto 1, el % de E de ADN plasmático y el recuento de reticulocitos aumentaron, mientras que el nivel de hemoglobina permaneció inicialmente estático justo después del inicio del tratamiento. En cuanto al eventual cambio en el nivel de hemoglobina, los sujetos 3 y 4 acabaron teniendo un cambio drástico de nivel, un 84,7 % y un 75,3 %, respectivamente. El sujeto 2 no acudió a la visita de seguimiento y no proporcionó una muestra adicional para la medición de la hemoglobina después del tratamiento. El sujeto 1, que presentó un cambio mínimo en el % de E de ADN plasmático, presentó el menor aumento del nivel de hemoglobina (12,2 %). Por tanto, el cambio en el % de E de ADN plasmático, puede demostrar la respuesta dinámica en cuanto a la actividad eritropoyética de la médula ósea al tratamiento con hierro, y utilizarse como un factor pronóstico precoz de la respuesta del paciente al tratamiento. La ausencia de aumento en el recuento de reticulocitos del sujeto 1 sugiere que la producción de GR no respondía adecuadamente al tratamiento con hierro. La ausencia de respuesta a la terapia con hierro puede reflejarse también por la ausencia de aumento del % de E, que corresponde a la actividad de la médula ósea. Pero, para el sujeto 1, el nivel de hemoglobina antes del inicio de la terapia con hierro era superior al de los otros 3 sujetos, y se aproximaba más al intervalo de referencia de los sujetos sanos. La ausencia de aumento del % de E(FEQ) en el sujeto 1 puede reflejar la ausencia de un aumento compensatorio de la actividad eritropoyética en la médula ósea debido a un déficit menor del nivel de hemoglobina desde el nivel normal. El recuento de reticulocitos del sujeto 1 fue inicialmente aproximadamente igual al de los otros sujetos y, por tanto, no indicaría que la actividad de la médula ósea sea de un nivel suficiente. Por consiguiente, en el caso de anemia con una actividad eritropoyética intermedia, un % de E en el extremo superior del intervalo normal para pacientes sanos puede indicar una respuesta positiva al tratamiento, o al menos una respuesta indeterminada, y por tanto en tal situación no debería suspenderse el tratamiento.
[0248] Para normalizar el nivel de hemoglobina, se requiere un aumento de la producción de GR. Por lo tanto, en la anemia ferropénica, el intervalo normal de % de E puede considerarse inadecuado. El aumento del % de E en los sujetos 2-4, indica una respuesta adecuada tras la terapia con hierro, dado que cabría esperar un % de E en el intervalo alto de la normalidad (véase la FIG. 10), o ligeramente por encima de este, en sujetos con anemia ferropénica. Por tanto, los umbrales de % de E para determinar si el tratamiento es eficaz, pueden depender de un valor inicial de % de E. Los umbrales de % de E pueden especificar un cambio particular en el valor relativo al valor inicial, donde la cantidad de cambio puede depender del valor inicial.
[0249] También se investigaron los efectos del tratamiento con hierro por vía oral. Los pacientes con hemorragia crónica, p. ej., debida a menorragia, padecerían anemia ferropénica. Los suplementos de hierro se utilizarían para corregir el estado ferropénico.
[0250] La FIG.21A muestra el cambio en serie del % de E(FEQ) plasmático en la RDM de eritroblastos en una paciente con anemia ferropénica debida a menorragia que recibe tratamiento con hierro oral de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Se analizó el % de E en el plasma de un paciente con anemia ferropénica que recibía tratamiento con hierro antes y siete días después del tratamiento con hierro. En la FIG.21A, se produjo un aumento del % de E tras recibir el tratamiento con hierro. Estos resultados sugieren que el % de E plasmático podría reflejar la actividad de la eritropoyesis en respuesta al tratamiento.
[0251] La FIG.21B muestra el cambio en la hemoglobina tras el tratamiento con hierro por vía oral. El nivel de hemoglobina aún no ha aumentado drásticamente, mientras que se produjo un aumento del % de E(FEQ) en el mismo punto temporal tras el tratamiento. Esto es similar a la FIG. 20A, que muestra que el % de E puede utilizarse como una detección precoz de si el tratamiento es eficaz.
[0252] B. Tratamiento de la enfermedad renal crónica (ERC)
[0253] En pacientes con ERC, una de las principales causas de anemia es la reducción de la producción de eritropoyetina debido a daños renales. La eritropoyetina es una hormona producida por el riñón en respuesta a los bajos niveles de oxígeno en los tejidos. Estimula la médula ósea para que produzca glóbulos rojos. La eritropoyetina exógena se utilizaría para el tratamiento de la anemia de la ERC.
[0254] La FIG. 22 muestra el cambio en serie del % No met. en plasma en la RDM de eritroblastos de pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) que reciben tratamiento con eritropoyetina (EPO) recombinante o agentes estimuladores de la eritropoyesis (AEE). Se analizó el % No met. en el plasma de siete pacientes con ERC que recibían tratamiento con EPO antes y entre 7 y 14 días después del tratamiento con EPO. Las líneas de diferentes formas (colores) corresponden a diferentes pacientes. Todos los pacientes mostraron un aumento del % No met. tras recibir el tratamiento con EPO. Los valores de % No met. muestran distintos niveles de eficacia en los diferentes pacientes. Estos resultados muestran que el % No met. plasmático refleja la actividad de la eritropoyesis en respuesta al tratamiento.
[0255] C.Un tratamiento con GT para la anemia aplásica
[0256] La terapia inmunosupresora de los pacientes con anemia aplásica podría dar lugar a una recuperación hemática en el 60-70 % de los pacientes (Younget al.Blood.2006;108(8):2509-2519). Se analizaron los valores de % No met. en el plasma de 4 pacientes con anemia aplásica que recibían terapia inmunosupresora antes de iniciarla, así como 2 y 4 meses después de la terapia inmunosupresora. Ninguno de los pacientes respondió al tratamiento, y el nivel de hemoglobina no volvió a valores normales durante el período; los cuatro pacientes necesitaron transfusiones de sangre periódicas.
[0257] La FIG.23 A muestra el cambio en serie del % No met. en plasma en la RDM de eritroblastos de pacientes con anemia aplásica que reciben tratamiento con globulina antitimocítica (GAT) o ciclosporina como terapia inmunosupresora de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Entre tres pacientes, no hubo cambios en el % No met. en plasma. Un paciente demostró un aumento significativo del % No met. Esto ocurrió al mismo tiempo que la aparición de los síntomas de un clon de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), en concreto, la eliminación de orina oscura que contiene hemoglobina. Dicho síntoma puede utilizarse para determinar que el paciente no está respondiendo al tratamiento, aunque el % No met. haya aumentado. La HPN es conocida por su aparición en pacientes con anemia aplásica y tiene el mecanismo fisiopatológico de la anemia hemolítica. Un aumento del % No met. refleja un aumento de la actividad eritropoyética como resultado de la hemólisis debida a la HPN.
[0258] La FIG.23B muestra el cambio en serie de hemoglobina en los pacientes con anemia aplásica que reciben tratamiento. Los niveles de hemoglobina no aumentan significativamente. Estos resultados muestran que el % No met. plasmático refleja el cambio en la actividad de la eritropoyesis durante el ciclo del tratamiento, lo cual no cambia la actividad eritropoyética dado que todos los pacientes no respondieron al tratamiento, como se ilustra por la ausencia de cambio en la hemoglobina que se muestra en la FIG.23B.
[0259] Las FIGS.24A y 24B muestran gráficos del % No met. en plasma frente a las concentraciones de hemoglobina de los cuatro pacientes con anemia aplásica. Cada línea corresponde a un paciente y sigue el cambio del % No met. y del nivel de hemoglobina antes del tratamiento y después de 4 meses de tratamiento. La FIG.23 A muestra que el % No met. no cambió significativamente, excepto para el paciente con HPN. La FIG. 23B muestra que los niveles de hemoglobina sí cambiaron, pero no significativamente.
[0260] VIII. USO DE LA CONCENTRACIÓN ABSOLUTA DE ADN ERITROIDE
[0261] Para medir la cantidad de ADN eritroide en plasma/suero, en algunas realizaciones se utiliza el parámetro % de E (también denominado % No met.) en un marcador de hipometilación, aunque también podría utilizarse un marcador de hipermetilación específico de un linaje celular, si está presente. El % de E corresponde a la cantidad de ADN de eritroblastos normalizada con respecto a la cantidad total de ADN (que está mayormente hipermetilado) presente en la muestra.
[0262] Un parámetro alternativo consiste en medir una concentración absoluta de ADN eritroide por unidad de volumen de plasma. Para calcular el % de E, las realizaciones pueden medir la concentración absoluta de ADN no metilado y la concentración absoluta de ADN metilado. En el ensayo con PCR digital, cada punto puede representar una molécula de ADN (p. ej., como se muestra en las FIGS. 2A y 2B). Los recuentos de ADN metilado y no metilado pueden realizarse directamente. En los apartados anteriores, se calculó un valor normalizado (p. ej., % de E), pero en las realizaciones también puede utilizarse la concentración absoluta de moléculas no metiladas para un marcador de hipometilación o la concentración absoluta de moléculas metiladas para un marcador de hipermetilación.
[0263] La FIG. 25 ilustra gráficos de cajas y bigotes que muestran la concentración absoluta de ADN eritroide en la RDM asociada al gende la FEQ(copias/ml de plasma) en sujetos sanos y pacientes anémicos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Las cajas y las líneas en su interior representan el intervalo intercuartílico y los valores de la mediana, respectivamente. Los bigotes superior e inferior representan los valores máximo y mínimo.
[0264] Como se muestra en la FIG.25, mientras que se podían observar distintas agrupaciones entre los diferentes grupos de pacientes utilizando la concentración absoluta de ADN eritroide, los valores normalizados permiten una mejor separación entre los grupos. Teóricamente, el parámetro % de E del plasma también podría verse afectado por las concentraciones de ADN circulante de origen no eritroide, p. ej., ADN de origen mieloide o linfoide. Por ejemplo, en estados anémicos cuando también están afectados los otros linajes hematopoyéticos (p. ej. anemia aplásica o síndrome mielodisplásico), en algunos de estos casos, la liberación alterada de ADN eritroide podría quedar enmascarada.
[0265] IX. OTROS LINAJES HEMÁTICOS
[0266] Este enfoque basado en ADN plasmático para la evaluación hemática puede generalizarse a marcadores de otros linajes celulares hemáticos, p. ej., de la serie mieloide, linfoide y megacariocítica. Los trabajos anteriores sobre el uso de marcadores de metilación del ADN específicos de linaje hemático, se han centrado en sangre total, o glóbulos sanguíneos (Houseman EA,et al.Current Environmental Health Reports 2015; 2: 145-154). Nuestros datos presentados anteriormente muestran claramente que el ADN plasmático contiene información que no está presente en los glóbulos sanguíneos. Por consiguiente, el análisis del ADN plasmático utilizando marcadores epigenéticos de múltiples linajes celulares hemáticos puede proporcionar información diagnóstica valiosa sobre el sistema hemático de un individuo. Por lo tanto, es un reemplazo no invasivo de la biopsia de médula ósea. Pueden diseñarse ensayos que detecten específicamente la firma de metilación de un linaje celular concreto en plasma o suero, de modo que pueda controlarse la actividad de distintos linajes celulares en la médula ósea.
[0267] Un enfoque de este tipo sería útil para la evaluación de muchos escenarios clínicos, incluyendo, pero sin limitación, los siguientes trastornos. Se proporcionan ejemplos de linajes relevantes para los trastornos.
[0268] 1. neoplasia maligna hemática, p. ej., leucemia y linfoma (linaje de células linfoides)
[0269] 2. trastornos de la médula ósea, p. ej., anemia aplásica, mielofibrosis (linaje de células mieloides y linfoides) 3. seguimiento del sistema inmunitario y sus funciones: p. ej., la inmunodeficiencia y la formación de una respuesta inmunitaria durante la enfermedad y los tratamientos (linaje de células linfoides)
[0270] 4. efectos de los fármacos en la médula ósea, p. ej., azatioprina (linaje de células mieloides)
[0271] 5. trastornos autoinmunitarios con manifestaciones hemáticas, p. ej., trombocitopenia inmunitaria (TPI), que es una afección caracterizada por un recuento bajo de plaquetas pero con una médula ósea normal. El análisis del ADN plasmático utilizando marcadores del linaje sanguíneo, p. ej., marcadores megacariocíticos, proporcionaría una valiosa información diagnóstica sobre dicha afección, (marcadores megacarióticos) 6. Infecciones con complicaciones hemáticas, p. ej., infección por parvovirus B19, que puede complicarse con una reducción de la eritropoyesis o incluso con una crisis aplásica más grave, (linaje eritroide)
[0272] X. MÉTODO
[0273] La FIG.26 es un diagrama de flujo que ilustra un método 2600 de análisis de una muestra de sangre de un mamífero de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Algunas partes del método 2600 pueden realizarse manualmente y otras mediante un sistema informático. En una realización, un sistema puede realizar todas las etapas. Por ejemplo, un sistema puede incluir elementos robóticos (p. ej., para obtener una muestra y realizar un ensayo), un sistema de detección para detectar señales de un ensayo, y un sistema informático para analizar las señales. Las instrucciones para controlar dicho sistema pueden almacenarse en uno o más medios legibles por ordenador, tal como la lógica de configuración de una matriz de puertas programables en campo (FPGA,field programmable gate array), memoria flash y/o un disco duro. La FIG.27 muestra dicho sistema
[0274] En el bloque 2610, se obtiene una mezcla acelular de la muestra de sangre. Como ejemplos de mezcla acelular se incluyen plasma o suero. La mezcla acelular puede incluir ADN acelular de una pluralidad de linajes celulares.
[0275] En algunas realizaciones, para obtener la mezcla acelular, se separa una muestra de sangre. El plasma y el suero son diferentes. Ambos corresponden a la parte líquida de la sangre. Para conseguir plasma, se añade un anticoagulante a la muestra de sangre para impedir su coagulación. Para conseguir suero, se deja coagular una muestra de sangre. Por lo tanto, los factores de coagulación se consumirían durante el proceso de coagulación. Con respecto al ADN circulante, durante la coagulación, parte del ADN se liberaría de los glóbulos sanguíneos a la parte líquida. Por lo tanto, en comparación con el plasma, el suero tiene una mayor concentración de ADN. El ADN de las células durante la coagulación puede diluir el ADN que es específico del plasma. Por lo tanto, el plasma resulta ser ventajoso.
[0276] En el bloque 2620, los fragmentos de ADN de la mezcla acelular se ponen en contacto con un ensayo correspondiente a una o más regiones diferencialmente metiladas. Cada una de la una o más regiones diferencialmente metiladas (RDM) es específica de un linaje celular hemático particular al estar hipometilada o hipermetilada en relación con otros linajes celulares. En el presente documento se proporcionan ejemplos de RDM para el linaje celular de los eritroblastos. En diversas realizaciones, el ensayo puede implicar PCR o secuenciación y, por tanto, ser un ensayo de PCR o un ensayo de secuenciación. La puesta en contacto con los fragmentos de ADN puede implicar una cubeta de lectura, nanogotas, microesferas u otros mecanismos, para proporcionar una interacción del ensayo con los fragmentos de ADN. Entre los ejemplos de este tipo de ensayo se incluyen secuenciación del genoma completo con bisulfito, secuenciación dirigida mediante bisultifo (por captura de hibridación o secuenciación de amplicones), otra secuenciación sensible a metilación (p. ej., secuenciación de ADN en tiempo real de una sola molécula (SMRT,single molecule real-time) de Pacific Biosciences), PCR en tiempo real específica de metilación y PCR digital. En el presente documento se describen ejemplos adicionales de ensayos que pueden utilizarse en el método 300, p. ej., en el apartado XII. Aunque los ejemplos utilizan eritroblastos, también pueden utilizarse otros linajes celulares, incluidos otros linajes celulares hemáticos.
[0277] En el bloque 2630, basándose en las señales obtenidas del ensayo, se detecta un primer número de fragmentos de ADN metilados o no metilados en la mezcla acelular en una o más regiones diferencialmente metiladas. Los ensayos pueden proporcionar diversas señales, tales como señales luminosas o eléctricas. Las señales pueden proporcionar una señal específica por fragmento de ADN, o una señal agregada que indique un número total de fragmentos de ADN con la firma de metilación (p. ej., como en la PCR en tiempo real).
[0278] En una realización, la secuenciación puede utilizarse para obtener una lectura de secuencia de un fragmento de ADN, y el fragmento de ADN puede alinearse con un genoma de referencia. Si el fragmento de ADN se alinea con una de las RDM, se puede incrementar un contador. Dado que la señal proviene de un ensayo particular de ADN metilado o no metilado, se puede suponer que el fragmento de ADN tiene esa firma de metilación. En otra realización, una lectura de PCR (p. ej., una señal luminosa de un pocillo positivo) puede utilizarse para incrementar dicho contador.
[0279] En el bloque 2640, utilizando el primer número se determina un nivel de metilación. El primer nivel de metilación puede ser una concentración normalizada o absoluta, p. ej., por volumen de muestra biológica. En la FIG.25 se muestra un ejemplo de concentración absoluta. Entre los ejemplos de un nivel de metilación que se normaliza se incluye el % de E (también denominado % No met).
[0280] Para un valor normalizado, utilizando el primer número puede determinarse un nivel de metilación y un número total de fragmentos de ADN en la mezcla acelular en una o más regiones diferencialmente metiladas. Como se ha descrito anteriormente, el nivel de metilación puede ser un porcentaje de fragmentos de ADN no metilados. En otras realizaciones, el porcentaje puede ser de fragmentos de ADN metilado, que tendrían una relación inversa con respecto a los ejemplos anteriores para los eritroblastos. En diversas implementaciones, el nivel de metilación puede determinarse utilizando un porcentaje global en todos los sitios de la RDM, mediante un promedio de los porcentajes individuales en cada sitio, o mediante un promedio ponderado en cada sitio.
[0281] En el bloque 2650, el nivel de metilación se compara con uno o más valores de corte como parte de la determinación de una clasificación de un trastorno hemático en el mamífero. A partir de datos empíricos pueden seleccionarse uno o más valores de corte, p. ej., como se muestra en las FIGS.8-10 y 12-14. Los valores de corte pueden seleccionarse para proporcionar una sensibilidad y especificidad óptimas que permitan clasificar con precisión un trastorno hemático, p. ej., basado en el aprendizaje supervisado de un conjunto de datos de muestras que se sabe que son normales y que presentan un trastorno.
[0282] Como ejemplo para determinar un valor de corte, puede obtenerse una pluralidad de muestras. Se sabe que cada muestra tiene una clasificación particular del trastorno hemático, p. ej., mediante otras técnicas, como sabrá un experto con conocimientos en la materia. Teniendo la pluralidad de muestras al menos dos clasificaciones del trastorno hemático, p. ej., teniendo o no en trastorno hemático. También pueden incluirse distintos tipos de trastornos, p. ej., como se muestra en la FIG. 10. Puede determinarse un nivel de metilación de una o más regiones diferencialmente metiladas para cada una de la pluralidad de muestras, como los puntos de datos que se muestran en las FIGS.8-10 y 12-14.
[0283] Se puede identificar un primer conjunto de muestras que tengan una primera clasificación del trastorno hemático, p. ej., siendo la primera clasificación muestras de individuos sanos. El primer conjunto puede agruparse, p. ej., como se muestra en las FIGS. 8-10 y 12-14. Puede identificarse un segundo conjunto de muestras que tenga una segunda clasificación del trastorno hemático. El segundo conjunto puede estar formado por pacientes que tienen el trastorno o un tipo de trastorno diferente al de la primera clasificación. Las dos clasificaciones pueden corresponder a distintos grados de tener el mismo trastorno. Cuando el primer conjunto de muestras tiene colectivamente un nivel de metilación estadísticamente más alto que el segundo conjunto de muestras, puede determinarse un valor de corte que discrimine entre el primer conjunto de muestras y el segundo conjunto de muestras con una especificidad y sensibilidad especificadas. Por tanto, para seleccionar un valor de corte adecuado puede utilizarse un equilibrio entre especificidad y sensibilidad.
[0284] XI. Sumario
[0285] Los GR son el tipo de célula más abundante en la sangre periférica, pero no tienen núcleo. En esta divulgación, determinamos que las células del linaje eritroide contribuyen en una proporción significativa a la reserva de ADN plasmático. Antes de este trabajo, se sabía que las células hematopoyéticas contribuían de manera significativa a la reserva de ADN circulante (13, 14), pero muchos investigadores habían asumido que dicho ADN hematopoyético procedía únicamente de los linajes de glóbulos blancos (15). Resultados más recientes que utilizan marcadores de metilación del ADN han demostrado que el ADN plasmático lleva firmas de metilación del ADN de neutrófilos y linfocitos (15).
[0286] Utilizando metilomas de referencia de alta resolución de diversos tejidos, incluidos los eritroblastos (18, 20), distinguimos las moléculas de ADN procedentes de eritroides del ADN de otros tipos de tejidos en la reserva de ADN plasmático. Nuestros ensayos de PCR digital basados en la firma de metilación específica de los eritroblastos, nos permitieron realizar análisis cuantitativos de dichas moléculas de ADN en plasma. Este enfoque nos permitió demostrar la presencia de una cantidad significativa de ADN eritroide en la reserva de ADN plasmático de sujetos sanos.
[0287] Nuestros resultados son coherentes con que las células del linaje eritroide de la médula ósea contribuyen con ADN al plasma. El corolario de esta hipótesis es que el análisis cuantitativo del ADN eritroide en plasma refleja la actividad eritropoyética de la médula y, por tanto, puede ayudar en el diagnóstico diferencial de la anemia. Hemos establecido valores de referencia para el ADN eritroide en el plasma de sujetos sanos. Además, hemos demostrado que los pacientes anémicos tienen una proporción de ADN eritroide circulante aumentada o disminuida, dependiendo de la naturaleza exacta de sus patologías y tratamientos. En particular, pudimos distinguir entre los dos síndromes de insuficiencia medular, es decir, anemia aplásica (AA) y síndrome mielodisplásico (SMD), entre nuestros pacientes incluidos mediante el análisis del porcentaje de ADN eritroide en plasma.
[0288] El recuento de reticulocitos puede utilizarse para proporcionar información sobre la respuesta de la médula en pacientes anémicos. Entre los 11 pacientes con beta-talasemia que estudiamos, cuatro pacientes tenían recuentos de reticulocitos en sangre periférica inferiores al 1 %, el límite de detección. Para los otros siete pacientes, los recuentos de reticulocitos oscilaron entre el 1 % y el 10 %. Para los nueve pacientes con anemia aplásica, sus recuentos de reticulocitos eran inferiores al 1 % independientemente de que recibieran o no transfusiones regulares. Por tanto, el recuento de reticulocitos puede no definir claramente la actividad eritropoyética normal y reducida en la médula ósea debido a la gran imprecisión de los métodos automatizados a bajas concentraciones de reticulocitos (35, 36).
[0289] Hemos demostrado que el análisis del recuento de reticulocitos o del índice de reticulocitos no permite distinguir las causas de anemia con actividad eritropoyética reducida en nuestra cohorte de pacientes (FIGS.11A y 11B). Nuestros resultados indican que el % No met. en plasma (p. ej., como se muestra en la FIG.10) es más preciso que el recuento de reticulocitos para reflejar la actividad eritropoyética en la médula ósea. No se observó correlación entre el % No met. en plasma y el recuento de reticulocitos o el índice de reticulocitos entre todos los pacientes en los que se midieron ambos parámetros (P=0,3, regresión lineal), como se muestra en las FIG.11A y 11B.
[0290] De manera similar, la presencia de un número anómalamente elevado de eritroblastos en la sangre periférica implica estrés eritropoyético anómalo (37). Sin embargo, la ausencia de eritroblastos en la sangre periférica no implica actividad eritropoyética normal o reducida. Por el contrario, el análisis cuantitativo del ADN plasmático procedente de eritroblastos aporta información sobre la actividad eritropoyética medular que no proporcionan los parámetros hemáticos convencionales de la sangre periférica.
[0291] En caso de beta-talasemia y anemia aplásica, estas dos afecciones se diagnostican normalmente mediante el análisis del hierro en sangre y el patrón de hemoglobina. Pero, tanto la beta-talasemia como la anemia aplásica presentan niveles bajos de hemoglobina, por lo que dicha técnica no discrimina entre la beta-talasemia y la anemia aplásica. El uso del % No met. puede proporcionar mayor especificidad al permitir la discriminación entre estos dos trastornos, como se muestra en las FIGS.8 y 10.
[0292] El porcentaje de ADN no metilado (% No met. ) también puede utilizarse para controlar el tratamiento. Por ejemplo, el análisis del % No met. en pacientes con anemia ferropénica puede utilizarse para controlar la respuesta de la médula ósea a la terapia con hierro por vía oral, como se muestra en la FIG.9. En algunos pacientes, la suplementación oral de hierro puede no absorberse eficazmente a través del tubo gastrointestinal. Como resultado, la eritropoyesis no aumentaría tras el inicio del tratamiento. La ausencia de un aumento en el % No met. puede utilizarse como indicador de la mala respuesta al tratamiento con hierro oral, de modo que pueden iniciarse otros tratamientos, tales como el tratamiento con hierro por vía parenteral (p. ej., dextrano de hierro, gluconato férrico y sacarato de hierro). Como alternativa, la ausencia de aumento en el % No met. puede utilizarse para interrumpir (detener) el tratamiento, de este modo se ahorran los costes de un tratamiento ineficaz. En otra implementación, la ausencia de aumento en el % No met. puede utilizarse para identificar cuándo aumentar una dosis de tratamiento, p. ej., aumentar la dosis de hierro. Cuando hay un aumento en el % No met., el tratamiento puede continuar. Si el aumento del % No met. es suficientemente alto (p. ej., basado en un umbral), entonces el tratamiento puede ser detenerse, ya que se puede suponer que la actividad eritropoyética ha alcanzado un nivel suficiente para, eventualmente, devolver el nivel de hemoglobina a un nivel saludable, evitando de este modo un tratamiento excesivo, costoso o posiblemente perjudicial. Por consiguiente, el trastorno hemático de un mamífero puede tratarse en respuesta a la determinación de que la clasificación del trastorno hemático indica que el mamífero presenta dicho trastorno. Después del tratamiento, el ensayo puede repetirse para determinar un nivel de metilación actualizado, y puede determinarse si continuar realizando el tratamiento basándose en el nivel de metilación actualizado. En una realización, determinar si se debe continuar con el tratamiento puede incluir: detener el tratamiento, aumentar una dosis del tratamiento, o seguir un tratamiento diferente, cuando el nivel de metilación actualizado no haya cambiado con respecto al nivel de metilación hasta situarse dentro de un umbral especificado. En otra realización, determinar si se debe continuar con el tratamiento puede incluir: continuar el tratamiento cuando el nivel de metilación actualizado haya cambiado con respecto al nivel de metilación hasta situarse dentro de un umbral especificado.
[0293] Como otro ejemplo de seguimiento del tratamiento, el análisis del % No met. puede utilizarse para determinar si el tratamiento ha suprimido adecuadamente la eritropoyesis ineficaz en pacientes con talasemia, por ejemplo, mediante transfusión de sangre. La eritropoyesis extramedular es una causa de deformidades óseas en pacientes con talasemia. La eritropoyesis extramedular puede suprimirse mediante transfusión y restablecimiento de los niveles de hemoglobina. El % No met. puede mostrar la respuesta del paciente a estos tratamientos, y el fracaso en la supresión del % No met. puede utilizarse para indicar que debe intensificarse el tratamiento.
[0294] El % No met. también puede utilizarse para diferenciar a los pacientes solo con ferropenia de los que tienen ferropenia junto con otras causas de anemia, por ejemplo, anemia debida a dolencias crónicas. Cabría esperar que los pacientes solo con ferropenia tuvieran un aumento del % No met. después del tratamiento con hierro, pero los pacientes con múltiples causas de anemia no mostrarían una respuesta de elevación de % No met.
[0295] Por consiguiente, hemos demostrado que el porcentaje de ADN eritroide circulante aumenta en respuesta a la terapia con hierro en pacientes con anemia ferropénica, reflejando así un aumento de la actividad eritropoyética de la médula. El cambio dinámico en la proporción de ADN eritroide muestra que la cuantificación del ADN eritroide plasmático permite un control no invasivo del proceso celular relacionado. La rápida cinética del ADN plasmático (p. ej. con semividas del orden de decenas de minutos (38, 39)) sugiere que dicho control podría proporcionar resultados casi en tiempo real. De manera similar, el porcentaje de ADN circulante acelular de otros linajes celulares también permite el control no invasivo del proceso celular relacionado en la médula ósea de los otros linajes celulares.
[0296] El presente trabajo sirve como prueba para demostrar la presencia de material nuclear de células progenitoras y precursoras hematopoyéticas en circulación. Adicionalmente, también podría usarse la presencia de ADN circulante liberado de células precursoras de otros linajes hematopoyéticos.
[0297] En resumen, hemos demostrado que el ADN eritroide contribuye en una proporción significativa a la reserva de ADN plasmático. Este descubrimiento ha llenado una importante laguna en nuestra comprensión de la biología básica de los ácidos nucleicos circulantes. Desde el punto de vista clínico, la medición del ADN eritroide en plasma ha abierto una nueva vía para la investigación y el seguimiento de distintos tipos de anemia y anuncia el inicio de una nueva familia de pruebas hemáticas basadas en ADN acelular.
[0298] XII. MATERIALES Y MÉTODOS
[0299] En este apartado se describen técnicas que se han utilizado y que pueden utilizarse para implementar las realizaciones.
[0300] A. Recogida y preparación de muestras
[0301] En algunas realizaciones, a partir de muestras quirúrgicas anonimizadas, se recuperaron muestras fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE,formalin-fixed paraffin-embedded) de 12 tipos de tejidos normales (hígado, pulmón, esófago, estómago, intestino delgado, colon, páncreas, glándula suprarrenal, vejiga urinaria, corazón, cerebro y placenta), con cuatro casos de cada uno. El examen histológico confirmó que los tejidos recogidos eran normales. El ADN se extrajo del protocolo de tejidos FFPE utilizando el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) con modificaciones del protocolo del fabricante para tejidos fijados. Para eliminar la parafina se utilizó solución de desparafinado (Qiagen) en lugar de xileno. Para invertir la modificación con formaldehído de los ácidos nucleicos, se realizó una etapa de incubación adicional a 90 °C durante 1 hora tras la lisis con tampón ATL y proteasa K.
[0302] Para preparar la muestra enriquecida en eritroblastos para el análisis, inmediatamente después del parto, se recogieron 1-3 ml de sangre de cordón umbilical en un tubo con EDTA de cada una de las ocho mujeres gestantes. Las células mononucleares se aislaron de las muestras de sangre de cordón umbilical mediante centrifugación en gradiente de densidad con solución Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). Se incubaron 1 x 10<8>células mononucleares aisladas con 1 ml de la mezcla de dos anticuerpos: anti-CD235a conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Miltenyi Biotec) y anti-CD71 conjugado con ficoeritrina (PE) (Miltenyi Biotec) en una dilución 1:10 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C. A continuación, las células CD235a+ y CD71+ se clasificaron mediante el citómetro de flujo BD FACSAria Fusion (BD Biosciences) para enriquecer los eritroblastos (1). Las células CD235a+CD71+ de los ocho casos se agruparon para su análisis posterior. Se extrajo ADN de las células CD235a+CD71+ agrupadas utilizando el kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen) con las instrucciones del fabricante.
[0303] Las muestras de sangre periférica se recogieron en tubos con EDTA y se conservaron inmediatamente a 4 °C. Se recogieron 10 ml de sangre venosa periférica de cada paciente. El aislamiento del plasma se realizó 6 horas después de la extracción de sangre. El ADN plasmático se extrajo de 4 ml de plasma. El ADN plasmático y de la capa leucoplaquetaria se obtuvo como se ha descrito anteriormente (2). Resumiendo, las muestras de sangre se centrifugaron primero a 1.600 g durante 10 minutos a 4 °C y la parte de plasma se volvió a centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos a 4 °C. La parte de células sanguíneas se recogió tras la recentrifugación a 2.500 g durante 10 minutos para eliminar cualquier resto de plasma. El ADN del plasma y de la capa leucoplaquetaria se extrajo utilizando el kit QIAamp DSP DNA Mini (Qiagen) y el kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen), respectivamente.
[0304] B. Conversión de ADN con bisulfito
[0305] El ADN plasmático y el ADN genómico extraído de glóbulos sanguíneos y tejidos FFPE se sometieron a dos rondas de tratamiento con bisulfito utilizando el kit Epitect Plus Bisulfite (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante (3). En una realización, el ADN extraído de las muestras biológicas se trató primero con bisulfito. El tratamiento con bisulfito convierte las citosinas no metiladas en uracilos, mientras que las citosinas metiladas permanecen inalteradas. Por lo tanto, después de la conversión con bisulfito, las secuencias metiladas y no metiladas pueden diferenciarse basándose en la diferencia de secuencia en los dinucleótidos CpG. Para el análisis de las muestras de plasma presentadas en los ejemplos seleccionados de esta solicitud, se extrajo ADN de 2-4 ml de plasma. Para el análisis de ADN extraído de glóbulos sanguíneos, en los ejemplos se utilizó 1 µg de ADN para el análisis posterior. En otras realizaciones, podrían utilizarse otros volúmenes de plasma y cantidades de ADN.
[0306] En los ejemplos de esta solicitud, se realizaron dos rondas de tratamiento con bisulfito en cada muestra utilizando el kit EpiTect Bisulfite de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmático convertido con bisulfito se eluyó en 50 µl de agua. El ADN celular convertido con bisulfito se eluyó en 20 µl de agua y, a continuación, se diluyó 100 veces para el análisis posterior.
[0307] C.Ensayos de Metilación
[0308] Para cuantificar la cantidad de ADN procedente de un linaje celular en particular, pueden utilizarse diversos ensayos de metilación.
[0309] 1. Ensayos de PCR
[0310] Se desarrollaron dos ensayos de PCR digital, uno dirigido a las secuencias no metiladas convertidas con bisulfito y el otro dirigido a las secuencias metiladas, para cada una de las tres RDM específicas de eritroblastos. Los cebadores y sondas diseñados para los ensayos se enumeran en la Tabla 7 suplementaria.
[0311] Sitio marcador del gen FEQ(cro 18: 55250563-55250585)
[0312]
[0314] Sitio marcador Eri-1(cro 12: 48227688-48227701)
[0316]
[0318] Sitio marcador Eri-2(cro 12: 48228144-48228154)
[0320]
[0322] Tabla 7.Secuencias de oligonucleótidos para los ensayos de PCR digital para las secuencias metiladas y no metiladas de las RDM específicas de eritroblastos. Los nucleótidos subrayados en los cebadores inversos y las sondas representan las citosinas diferencialmente metiladas en los sitios de CpG. VIC y FAM son los 2 indicadores fluorescentes.
[0323] Como ejemplos, una reacción PCR puede incluir 50 µl con 3 µl de ADN molde convertido con bisulfito, una concentración final de 0,3 µM de cada cebador, 0,5 µM de MgCl<2>y 25 µl de ReadyMix 2x KAPA HiFi HotStart Uracil. Puede utilizarse el siguiente perfil térmico de PCR: 95 °C durante 5 minutos y 35 ciclos de 98 °C 20 segundos, 57 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 15 segundos, seguido de una etapa de extensión final a 72 °C durante 30 segundos. En otras realizaciones, la secuenciación no preferencial de todo el genoma puede realizarse junto con la alineación, pero tal procedimiento puede no ser tan rentable.
[0324] En algunas realizaciones, para el análisis de PCR digital de una muestra, se preparó una mezcla de reacción de 20 µl después del tratamiento con bisulfito. En una realización, la mezcla de reacción contenía 8 µl de ADN molde, una concentración final de 450 nM de cada uno de los dos cebadores directos, 900 nM del cebador inverso y 250 nM para las sondas. En otras realizaciones, se preparó un volumen total de 20 µl de cada mezcla de reacción, que contenía 8 ul de ADN molde, una concentración final de 900 nM de los cebadores directos, 900 nM del cebador inverso y 250 nM de la sonda. A continuación, la mezcla de reacción se utilizó para generar nanogotas utilizando el generador de nanogotas BioRad QX200 de PCR digital en nanogotas (droplet digitalPCR o ddPCR). Normalmente se generan 20.000 nanogotas por muestra. En algunas implementaciones, las nanogotas se transfirieron a una placa transparente de 96 pocillos seguido de un ciclado térmico utilizando una condición idéntica a la de los ensayos de metilación y no metilación específicos: 95 °C × 10 minutos (1 ciclo), 40 ciclos de 94 °C × 15 segundos y 60 °C × 1 minuto, 98 °C × 10 minutos (1 ciclo), seguido de una etapa de reposo a 12 °C. Después de la PCR, las nanogotas de cada muestra se analizaron con el lector de nanogotas BioRad QX200 y los resultados se interpretaron utilizando el programa informático QuantaSoft (versión 1.7).
[0325] 2. Ejemplos de otros ensayos de metilación
[0326] Otros ejemplos de secuenciación sensible a metilación incluyen el uso de una plataforma de secuenciación de una sola molécula que permitiría dilucidar directamente el estado de metilación de las moléculas de ADN (incluyendo N<6>-metiladenina, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina) sin conversión con bisulfito (AB Flusberget al.2010 Nat Methods; 7: 461-465; J Shimet al.2013 Sci Rep; 3:1389); o mediante la inmunoprecipitación de citosina metilada (p. ej., utilizando un anticuerpo contra la metilcitosina o utilizando una proteína o un péptido de unión a ADN metilado (LG Acevedoet al.2011 Epigenomics; 3: 93-101) seguido de secuenciación; o mediante el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación seguido de la secuenciación.
[0327] En algunas realizaciones, los niveles de metilación de los sitios genómicos en la mezcla de ADN pueden determinarse utilizando secuenciación del genoma completo con bisulfito. En otras realizaciones, los niveles de metilación de los sitios de CpG pueden determinarse utilizando análisis de micromatrices de metilación, tales como el sistema HumanMethylation450 de Illumina, o utilizando inmunoprecipitación de metilación (p. ej., utilizando un anticuerpo antimetilcitosina) o tratamiento con una proteína de unión a metilación seguido de análisis de micromatrices o secuenciación de ADN, o utilizando tratamiento con enzimas de restricción sensibles a metilación seguido de secuenciación de micromatrices o ADN, o utilizando secuenciación sensible a metilación, p. ej., utilizando un método de secuenciación de una sola molécula (p. ej. mediante una secuenciación de nanoporos (Schreiberet al.Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915) or by the Pacific Biosciences single molecule real time analysis (Flusberget al.Nat Methods 2010; 7: 461-465)). Los niveles de metilación específicos de tejido pueden medirse de la misma manera. Como otro ejemplo, puede utilizarse secuenciación dirigida con bisulfito, PCR específica de metilación, secuenciación sensible a metilación no basada en bisulfito (p. ej. mediante plataformas de secuenciación de una sola molécula (Powerset al.Efficient and accurate whole genome assembly and methylome profiling of E. coli. BMC Genomics.2013; 14:675) para el análisis del nivel de metilación del ADN plasmático en análisis de desconvolución de la metilación del ADN plasmático. Por consiguiente, los resultados de la secuenciación sensible a metilación pueden obtenerse de varias maneras.
[0328] D. análisis estadístico
[0329] Se utilizó la correlación de Pearson para estudiar la correlación entre el porcentaje de ADN eritroide (% de E(FEQ)) y el porcentaje de eritroblastos entre los GB periféricos medidos con un analizador hemático en pacientes con βtalasemia mayor. También se utilizó la correlación de Pearson para estudiar la correlación entre los resultados emparejados de % de E(FEQ) en el ADN del plasma y en el ADN de la capa leucoplaquetaria de los controles sanos. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para datos emparejados para comparar la diferencia por pares entre el % E en el ADN plasmático y el ADN de la capa leucoplaquetaria de sujetos sanos. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para datos independientes (rank-sum test) para comparar la diferencia entre el % de E en el ADN plasmático de sujetos sanos y de pacientes anémicos de diferentes grupos de enfermedades.
[0330] También desarrollamos nuestros procesos bioinformáticos para identificar las RDM específicas de eritroblastos, basándonos en los criterios descritos en el texto principal. El proceso bioinformático puede implementarse en varias plataformas, p. ej., la plataforma Perl.
[0331] XIII. SISTEMAS ILUSTRATIVOS
[0332] La FIG.27 ilustra un sistema 2700 de acuerdo con una realización de la presente invención. El sistema, tal como se muestra, incluye una muestra 2705, tal como moléculas de ADN acelular dentro de un portamuestras 2710, donde la muestra 2705 puede ponerse en contacto con un ensayo 2708 para proporcionar una señal de una característica física 2715. Un ejemplo de un portamuestras puede ser una cubeta de lectura que incluya sondas y/o cebadores de un ensayo o un tubo a través del cual se desplaza una nanogota (conteniendo la nanogota el ensayo). Las características físicas 2715, tales como un valor de intensidad de fluorescencia, de la muestra, se detectan mediante el detector 2720. El detector puede realizar una medición a intervalos (p. ej., intervalos periódicos) para obtener puntos de datos que conformen una señal de datos. En una realización, un convertidor de analógico a digital convierte una señal analógica proveniente del detector en forma digital en una pluralidad de momentos. Se envía una señal de datos 2725 desde el detector 2720 al sistema lógico 2730. La señal de datos 2725 puede almacenarse en una memoria local 2735, una memoria externa 2740 o un dispositivo de almacenamiento 2745.
[0333] El sistema lógico 2730 puede ser, o puede incluir, un sistema informático, un ASIC (Application-Specific Integrated Circuit, circuito integrado de aplicación específica), un microprocesador, etc. También puede incluir o estar acoplado a una pantalla (p. ej., un monitor, una pantalla LED (Light Emitting Diode, diodo emisor de luz), etc.) y un dispositivo de entrada de usuario (p. ej., un ratón, un teclado, botones, etc.). El sistema lógico 2730 y los demás componentes pueden formar parte de un sistema informático autónomo o conectado a una red, o pueden estar directamente acoplados o incorporados a un dispositivo termociclador. El sistema lógico 2730 también puede incluir un programa informático de optimización que se ejecuta en un procesador 2750. El sistema lógico 1030 puede incluir un medio legible por ordenador que almacene instrucciones para controlar el sistema 1000 y ejecutar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
[0335] Cualquiera de los sistemas informáticos mencionados en el presente documento puede utilizar cualquier número adecuado de subsistemas. En la FIG.28, en el sistema informático 10, se muestran ejemplos de dichos subsistemas. En algunas realizaciones, un sistema informático incluye un único aparato informático, donde los subsistemas pueden ser los componentes del aparato informático. En otras realizaciones, un sistema informático puede incluir varios aparatos informáticos, siendo cada uno de ellos un subsistema, con componentes internos. Un sistema informático puede incluir ordenadores de escritorio y portátiles, tabletas, teléfonos móviles y otros dispositivos móviles.
[0337] Los subsistemas mostrados en la FIG. 28 están interconectados a través de un bus de sistema 75. Se muestran subsistemas adicionales, tales como una impresora 74, un teclado 78, uno o más dispositivos de almacenamiento 79, un monitor 76, que está acoplado al adaptador 82 de pantalla y otros. Los dispositivos periféricos y de entrada/salida, que se acoplan al controlador de E/S 71, pueden conectarse al sistema informático mediante cualquiera de los diversos medios conocidos en la materia, tal como un puerto de entrada/salida (E/S) 77 (p. ej., USB, FireWire<®>). Por ejemplo, el puerto de E/S 77 o la interfaz externa 81 (p. ej., Ethernet, Wi-Fi, etc.), pueden utilizarse para conectar el sistema informático 10 a una red de área amplia, tal como Internet, a un dispositivo de entrada tipo ratón o a un escáner. La interconexión mediante el bus de sistema 75 permite que el procesador central 73 se comunique con cada subsistema y así controlar la ejecución de una pluralidad de instrucciones procedentes de la memoria del sistema 72 o del dispositivo o dispositivos de almacenamiento 79 (p. ej., un disco fijo, tal como un disco duro o un disco óptico), así como el intercambio de información entre subsistemas. La memoria del sistema 72 y/o el dispositivo o dispositivos de almacenamiento 79 pueden incorporar un medio legible por ordenador. Otro subsistema es un dispositivo de recogida de datos 85, tal como una cámara, un micrófono, un acelerómetro y similares. Cualquiera de los datos mencionados en el presente documento puede transferirse de un componente a otro y puede presentarse al usuario.
[0339] Un sistema informático puede incluir una pluralidad de los mismos componentes o subsistemas, p. ej., conectados entre sí por la interfaz externa 81 o por una interfaz interna. En algunas realizaciones, los sistemas informáticos, subsistema o aparatos pueden comunicarse a través de una red. En dichos casos, un ordenador puede considerarse como cliente y otro ordenador como servidor, donde cada uno puede formar parte de un mismo sistema informático. Cada uno de un cliente y un servidor puede incluir múltiples sistemas, subsistemas o componentes.
[0341] Algunos aspectos de las realizaciones pueden implementarse en forma de lógica de control utilizando un equipo físico (p. ej., un circuito integrado de aplicación específica o una matriz de puertas programables en campo) y/o utilizando programas informáticos con un procesador generalmente programable de forma modular o integrada. Como se utiliza en el presente documento, un procesador incluye un procesador de un solo núcleo, un procesador de varios núcleos en un mismo chip integrado o múltiples unidades de procesamiento en una sola placa de circuito o en red. Tomando como base la divulgación y las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, un experto familiarizado con la materia, sabrá y apreciará otras formas y/o métodos para implementar las realizaciones de la presente invención, utilizando equipos físicos y una combinación de equipos físicos y programas informáticos.
[0343] Cualquiera de los componentes o funciones de programas informáticos descritos en la presente solicitud pueden implementarse como código de programa informático que será ejecutado por un procesador utilizando cualquier lenguaje de programación adecuado, tal como, por ejemplo, Java, C, C++, C#, Objective-C, Swift o lenguaje de guiones, tal como Perl o Python, utilizando, por ejemplo, técnicas convencionales u orientadas a objetos. El código de programación puede almacenarse como una serie de instrucciones o comandos en un medio legible por ordenador para su almacenamiento y/o transmisión. Un medio legible por ordenador no transitorio adecuado puede incluir una memoria de acceso aleatorio (RAM,random access memory), una memoria de solo lectura (ROM,read only memory), un medio magnético, tal como un disco duro o disquete, o un medio óptico, tal como un disco compacto (CD) o un DVD (disco digital versátil), memoriaflashy similares. El medio legible por ordenador puede ser cualquier combinación de dichos dispositivos de almacenamiento o transmisión.
[0345] Dichos programas también pueden codificarse y transmitirse utilizando señales transmisoras adaptadas para la transmisión a través de redes cableadas, ópticas y/o inalámbricas que se ajusten a una variedad de protocolos, incluida Internet. Como tal, utilizando una señal de datos codificada con dichos programas, puede crearse un medio legible por ordenador. Los medios legibles por ordenador codificados con el código del programa pueden empaquetarse junto con un dispositivo compatible o proporcionarse por separado de otros dispositivos (p. ej., mediante descarga por Internet). Cualquier medio legible por ordenador puede residir en o dentro de un solo producto informático (por ejemplo, un disco duro, un CD o un sistema informático completo) y puede estar presente en o dentro de diferentes productos informáticos dentro de un sistema o red. Un sistema informático puede incluir un monitor, una impresora u otra pantalla adecuada para proporcionar al usuario cualquiera de los resultados mencionados en el presente documento.
[0347] Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede realizarse total o parcialmente con un sistema informático que incluya uno o más procesadores, que pueden configurarse para realizar las etapas. Por tanto, las realizaciones pueden dirigirse a sistemas informáticos configurados para realizar las etapas de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, realizando posiblemente diferentes componentes, una etapa o un grupo de etapas respectivas. Aunque se presentan como etapas numeradas, las etapas de los métodos del presente documento pueden realizarse al mismo tiempo o en un orden diferente. Adicionalmente, pueden utilizarse partes de estas etapas con partes de otras etapas de otros métodos. Además, todas las etapas, o partes de una etapa, pueden ser opcionales. Adicionalmente, cualquiera de las etapas de cualquiera de los métodos puede realizarse con módulos, unidades, circuitos u otros medios de un sistema para realizar estas etapas.
[0349] Los detalles específicos de realizaciones particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada sin apartarse del alcance de las realizaciones de la invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas. Sin embargo, otras realizaciones de la invención pueden dirigirse a realizaciones específicas relativas a cada aspecto individual, o a combinaciones específicas de estos aspectos individuales.
[0351] La descripción anterior de las realizaciones ilustrativas de la invención se ha presentado con fines ilustrativos y descriptivos. No pretende ser exhaustiva ni limitar la invención a la forma precisa descrita, y son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores.
[0353] La mención de "un", "uno/a" o "el/la", se interpreta como "uno(a) o más", a menos que se indique específicamente lo contrario. Se entiende que el uso de "o" hace referencia a un "o inclusivo", y no a un "o exclusivo", a menos que se indique específicamente lo contrario. La referencia a un "primer" componente no requiere necesariamente que se proporcione un segundo componente. Además, la referencia a un "primer" o un "segundo" componente no limita el componente referido a una ubicación concreta, a menos que se indique expresamente.
[0355] XIV. REFERENCIAS
[0357] Las siguientes referencias se han mencionado anteriormente.
[0359] 1. Lo YM, Chan KC, Sun H, Chen EZ, Jiang P, Lun FM,et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. Sci Transl Med 2010;2:61ra91.
[0360] 2. Chiu RW, Chan KC, Gao Y, Lau VY, Zheng W, Leung TY,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:20458-63.
[0361] 3. New MI, Tong YK, Yuen T, Jiang P, Pina C, Chan KC,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia using cell-free fetal DNA in maternal plasma. J Clin Endocrinol Metab 2014;99:E1022-30. 4. Bianchi DW, Parker RL, Wentworth J, Madankumar R, Saffer C, Das AF,et al.DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N Engl J Med 2014;370:799-808.
[0362] 5. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, Leung TY, Sun H, Chan KC,et al.Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: Large scale validity study. BMJ 2011;342:c7401. 6. Bayindir B, Dehaspe L, Brison N, Brady P, Ardui S, Kammoun M,et al.Noninvasive prenatal testing using a novel analysis pipeline to screen for all autosomal fetal aneuploidies improves pregnancy management. Eur J Hum Genet 2015;23:1286-93.
[0363] 7. Scheffer PG, van der Schoot CE, Page-Christiaens GC, de Haas M. Noninvasive fetal blood group genotyping of rhesus D, c, E and of K in alloimmunised pregnant women: Evaluation of a 7-year clinical experience. BJOG 2011;118:1340-8.
[0364] 8. Lo YM, Chan LY, Lo KW, Leung SF, Zhang J, Chan AT,et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res 1999;59:1188-91.
[0365] 9. Leary RJ, Sausen M, Kinde I, Papadopoulos N, Carpten JD, Craig D,et al.Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing. Sci Transl Med 2012;4:162ra54.
[0366] 10. Chan KC, Jiang P, Zheng YW, Liao GJ, Sun H, Wong J,et al.Cancer genome scanning in plasma: Detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin Chem 2013;59:211-24.
[0367] 11. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, Wang Y, Agrawal N,et al.Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014;6:224ra24.
[0368] 12. Izumchenko E, Chang X, Brait M, Fertig E, Kagohara LT, Bedi A,et al.Targeted sequencing reveals clonal genetic changes in the progression of early lung neoplasms and paired circulating DNA. Nat Commun 2015;6:8258.
[0369] 13. Lui YY, Chik KW, Chiu RW, Ho CY, Lam CW, Lo YM. Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation. Clin Chem 2002;48:421-7.
[0370] 14. Zheng YW, Chan KC, Sun H, Jiang P, Su X, Chen EZ,et al.Nonhematopoietically derived DNA is shorter than hematopoietically derived DNA in plasma: A transplantation model. Clin Chem 2012;58:549-58.
[0371] 15. Sun K, Jiang P, Chan KC, Wong J, Cheng YK, Liang RH,et al.Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments. Proc Natl Acad Sci U S A 2015; 112:E5503-12.
[0372] 16. Keerthivasan G, Wickrema A, Crispino JD. Erythroblast enucleation. Stem Cells Int 2011;2011:139851. 17. Chasis JA, Mohandas N. Erythroblastic islands: Niches for erythropoiesis. Blood 2008;112:470-8.
[0373] 18. Adams D, Altucci L, Antonarakis SE, Ballesteros J, Beck S, Bird A,et al.BLUEPRINT to decode the epigenetic signature written in blood. Nat Biotechnol 2012;30:224-6.
[0374] 19. Martens JH, Stunnenberg HG. BLUEPRINT: Mapping human blood cell epigenomes. Haematologica 2013;98:1487-9.
[0375] 20. Kundaje A, Meuleman W, Ernst J, Bilenky M, Yen A, Heravi-Moussavi A,et al.Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature 2015;518:317-30.
[0376] 21. Chim SS, Tong YK, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Chan LY,et al.Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:14753-8.
[0377] 22. Lehmann-Werman R, Neiman D, Zemmour H, Moss J, Magenheim J, Vaknin- Dembinsky A,et al.Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 2016; 113:E1826-34.
[0378] 23. Lun FM, Chiu RW, Sun K, Leung TY, Jiang P, Chan KC,et al.Noninvasive prenatal methylomic analysis by genomewide bisulfite sequencing of maternal plasma DNA. Clin Chem 2013;59:1583-94.
[0379] 24. Chan KC, Zhang J, Hui AB, Wong N, Lau TK, Leung TN,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem 2004;50:88-92.
[0380] 25. Yu SC, Chan KC, Zheng YW, Jiang P, Liao GJ, Sun H,et al.Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing. Proc Natl Acad Sci U S A 2014;111:8583-8.
[0381] 26. Ferreira GC, Franco R, Lloyd SG, Moura I, Moura JJ, Huynh BH. Structure and function of ferrochelatase. J Bioenerg Biomembr 1995;27:221-9.
[0382] 27. Buoro S, Vavassori M, Pipitone S, Benegiamo A, Lochis E, Fumagalli S,et al.Evaluation of nucleated red blood cell count by Sysmex XE-2100 in patients with thalassaemia or sickle cell anaemia and in neonates. Blood Transfus 2015;13:588-94.
[0383] 28. Killick SB, Bown N, Cavenagh J, Dokal I, Foukaneli T, Hill A,et al.Guidelines for the diagnosis and management of adult aplastic anaemia. Br J Haematol 2016;172:187-207.
[0384] 29. Young NS. Acquired aplastic anemia. Ann Intern Med 2002;136:534-46.
[0385] 30. Eschbach JW. Erythropoietin 1991—an overview. Am J Kidney Dis 1991;18:3-9.
[0386] 31. Schrier SL. Pathobiology of thalassemic erythrocytes. Curr Opin Hematol 1997;4:75-8.
[0387] 32. Kasper CK, Whissell DY, Wallerstein RO. Clinical aspects of iron deficiency. JAMA 1965;191:359-63.
[0388] 33. Bejar R, Steensma DP. Recent developments in myelodysplastic syndromes. Blood 2014;124:2793-803. 34. Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau MM,et al.The 2016 revision to the world health organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127:2391-405.
[0389] 35. Buttarello M. Laboratory diagnosis of anemia: Are the old and new red cell parameters useful in classification and treatment, how? Int J Lab Hematol 2016;38 Suppl 1:123-32.
[0390] 36. Buttarello M, Bulian P, Farina G, Temporin V, Toffolo L, Trabuio E, Rizzotti P. Flow cytometric reticulocyte counting. Parallel evaluation of five fully automated analyzers: An NCCLS-ICSH approach. Am J Clin Pathol 2001;115:100-11.
[0391] 37. Danise P, Maconi M, Barrella F, Di Palma A, Avino D, Rovetti A,et al.Evaluation of nucleated red blood cells in the peripheral blood of hematological diseases. Clin Chem Lab Med 2012;50:357-60.
[0392] 38. Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM, Hjelm NM. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999;64:218-24.
[0393] 39. To EW, Chan KC, Leung SF, Chan LY, To KF, Chan AT,et al.Rapid clearance of plasma Epstein-Barr virus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma. Clin Cancer Res 2003;9:3254-9.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método para analizar una muestra de sangre de un mamífero, comprendiendo el método:
detectar un primer número de fragmentos de ADN metilados o no metilados en una mezcla acelular de la muestra de sangre en una o más regiones diferencialmente metiladas basándose en las señales obtenidas de un ensayo, incluyendo la mezcla acelular ADN acelular de una pluralidad de linajes celulares, siendo cada una de la una o más regiones diferencialmente metiladas específica de un linaje celular hemático particular al estar hipometilada o hipermetilada en relación con otros linajes celulares;
determinar un nivel de metilación utilizando el primer número;
comparar el nivel de metilación con uno o más valores de corte;
medir un nivel de hemoglobina de la muestra de sangre;
comparar el nivel de hemoglobina con un umbral de hemoglobina; y
determinar una clasificación de neoplasia hemática en el mamífero basándose en la comparación del nivel de metilación con el uno o más valores de corte y en la comparación del nivel de hemoglobina con el umbral de hemoglobina.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la neoplasia hemática es leucemia.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la neoplasia hemática es linfoma.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
determinar un número total de fragmentos de ADN en la mezcla acelular en una o más regiones diferencialmente metiladas; y
determinar el nivel de metilación utilizando el primer número y el número total.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
determinar un volumen de la mezcla acelular, en donde el nivel de metilación se determina utilizando el primer número y el volumen de la mezcla acelular.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además, identificar la una o más regiones diferencialmente metiladas por:
obtención de índices de metilación de una pluralidad de sitios para cada uno de la pluralidad de linajes celulares, incluyendo el linaje celular hemático particular y los demás linajes celulares;
en cada sitio de la pluralidad de sitios, comparar los índices de metilación de la pluralidad de linajes celulares; identificar uno o más sitios de la pluralidad de sitios que tienen un índice de metilación en el linaje celular hemático particular que está por debajo/por encima de un primer umbral de metilación e índices de metilación en cada uno de los otros linajes celulares que están por encima/por debajo de un segundo umbral de metilación; e identificar una región diferencialmente metilada que contenga el uno o más sitios.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además, determinar el uno o más valores de corte, incluyendo:
determinar un nivel de metilación de la una o más regiones diferencialmente metiladas de cada una de una pluralidad de muestras, sabiendo que cada muestra tiene una clasificación particular de neoplasia hemática; identificar un primer conjunto de la pluralidad de muestras que tiene una primera clasificación de neoplasia hemática, en donde la primera clasificación es que existe neoplasia hemática;
identificar un segundo conjunto de la pluralidad de muestras que tiene una segunda clasificación de neoplasia hemática, teniendo el primer conjunto de la pluralidad de muestras colectivamente un nivel de metilación estadísticamente diferente al del segundo conjunto de la pluralidad de muestras, en donde la segunda clasificación es que no existe neoplasia hemática; y
determinar un valor de corte que discrimine entre el primer conjunto de muestras y el segundo conjunto de muestras con una especificidad y sensibilidad especificadas.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
determinar que la neoplasia hemática existe en el mamífero basándose en la comparación del nivel de metilación con el uno o más valores de corte.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una o más regiones diferencialmente metiladas comprenden sitios de CpG.
10. El método de la reivindicación 9, en donde una primera región de la una o más regiones diferencialmente metiladas
comprende una pluralidad de sitios de CpG que se encuentran a 100 pb entre sí, y en donde toda la pluralidad de sitios de CpG está hipometilada o hipermetilada.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una o más regiones diferencialmente metiladas están hipometiladas.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una de las una o más regiones diferencialmente metiladas se encuentra en el gen FECH.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una de las una o más regiones diferencialmente metiladas se encuentra en el cromosoma 12 en las coordenadas genómicas 48227688 - 48227701.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una de las una o más regiones diferencialmente metiladas se encuentra en el cromosoma 12 en las coordenadas genómicas 48228144 - 48228154.
15. Un programa informático que comprende una pluralidad de instrucciones que pueden ejecutarse en un sistema informático, que cuando se ejecutan de este modo controlan el sistema informático para realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI813141B (zh) 2014-07-18 2023-08-21 香港中文大學 Ｄｎａ混合物中之組織甲基化模式分析
EP3885447B1 (en) 2016-05-30 2024-01-10 The Chinese University Of Hong Kong Detecting hematological disorders using cell-free dna in blood
KR20260032575A (ko) 2016-11-30 2026-03-09 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석
SG11201906397UA (en) 2017-01-25 2019-08-27 Univ Hong Kong Chinese Diagnostic applications using nucleic acid fragments
CN111051536A (zh) 2017-07-26 2020-04-21 香港中文大学 利用不含细胞的病毒核酸改善癌症筛选
WO2019173283A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Marquette University Method and apparatus for non-invasive hemoglobin level prediction
US12098429B2 (en) 2019-03-25 2024-09-24 The Chinese University Of Hong Kong Determining linear and circular forms of circulating nucleic acids
CN110361531B (zh) * 2019-08-02 2023-04-11 天津医科大学总医院 一种检测微粒促凝活性的实验方法
CN115175985A (zh) * 2019-12-20 2022-10-11 威廉马歇莱思大学 从未经处理的生物样本中提取单链dna和rna并测序的方法
GB2598272A (en) * 2020-03-19 2022-03-02 Schreier Stefan Means and method for detecting aberrant erythroblasts
EP3905260A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-03 Sysmex Corporation Method, apparatus and system for testing blood
CN111518876B (zh) * 2020-05-11 2023-01-13 润方（北京）生物医药研究院有限公司 一种牛血红蛋白制品中牛源基因组dna定量检测方法及其应用
KR102517894B1 (ko) * 2021-02-23 2023-04-04 연세대학교 산학협력단 당뇨발에 의한 하지 절단 수술의 치료 반응성을 예측하는 방법
CN120089209B (zh) * 2025-05-08 2025-12-05 中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心) 鉴定肿瘤诱导产生的有核红细胞的方法和装置

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1342794T3 (da) 2002-03-05 2006-04-24 Epigenomics Ag Fremgangsmåde og anordning til at bestemme vævsspecificitet af fritflydende DNA i legemsvæsker
WO2007050706A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 University Of Missouri-Columbia Dna methylation biomarkers in lymphoid and hematopoietic malignancies
US20090176655A1 (en) * 2007-11-16 2009-07-09 Oncomethylome Sciences Sa Methylation detection
US9023819B2 (en) * 2008-06-09 2015-05-05 National Chung Cheng University Treatment of a disease or a condition associated with aberrant gene hypomethylation by a method involving tailored epigenomic modification
US20110028333A1 (en) * 2009-05-01 2011-02-03 Brown University Diagnosing, prognosing, and early detection of cancers by dna methylation profiling
WO2011092592A2 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Nipd Genetics Ltd Methods and compositions for noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies
PL2558854T3 (pl) 2010-04-16 2019-04-30 Chronix Biomedical Biomarkery będące krążącymi kwasami nukleinowymi związanymi z rakiem piersi
CN105243295B (zh) 2010-11-30 2018-08-17 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
CN102206708B (zh) * 2011-03-29 2014-05-28 北京大学 一种检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及方法
US10752953B2 (en) 2011-05-12 2020-08-25 The Johns Hopkins University Method of detecting cancer through generalized loss of stability of epigenetic domains, and compositions thereof
US20140178348A1 (en) 2011-05-25 2014-06-26 The Regents Of The University Of California Methods using DNA methylation for identifying a cell or a mixture of cells for prognosis and diagnosis of diseases, and for cell remediation therapies
CN113355321A (zh) 2011-09-26 2021-09-07 凯杰有限公司 用于分离细胞外核酸的快速方法
EP2768985B1 (en) 2011-10-21 2019-03-20 Chronix Biomedical Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers
US20130122492A1 (en) * 2011-11-14 2013-05-16 Kellbenx Inc. Detection, isolation and analysis of rare cells in biological fluids
SI4056712T1 (sl) * 2012-09-20 2024-10-30 The Chinese University Of Hong Kong Neinvazivno določanje metiloma tumorja iz plazme
US9732390B2 (en) * 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
US20130189684A1 (en) 2013-03-12 2013-07-25 Sequenom, Inc. Quantification of cell-specific nucleic acid markers
US20160340740A1 (en) 2014-01-30 2016-11-24 The Regents Of The University Of California Methylation haplotyping for non-invasive diagnosis (monod)
WO2015159292A2 (en) 2014-04-14 2015-10-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. A method and kit for determining the tissue or cell origin of dna
JP6681841B2 (ja) 2014-05-09 2020-04-15 ライフコーデックス アーゲー 特別な細胞タイプに由来するｄｎａの検出とそれに関連する方法
KR101598371B1 (ko) * 2014-07-14 2016-02-29 브릴리언츠 주식회사 스마트멀티카드
TWI813141B (zh) 2014-07-18 2023-08-21 香港中文大學 Ｄｎａ混合物中之組織甲基化模式分析
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
EP3885447B1 (en) 2016-05-30 2024-01-10 The Chinese University Of Hong Kong Detecting hematological disorders using cell-free dna in blood

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