ES3060476T3 - Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47 - Google Patents

Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47

Info

Publication number
ES3060476T3
ES3060476T3 ES22191294T ES22191294T ES3060476T3 ES 3060476 T3 ES3060476 T3 ES 3060476T3 ES 22191294 T ES22191294 T ES 22191294T ES 22191294 T ES22191294 T ES 22191294T ES 3060476 T3 ES3060476 T3 ES 3060476T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
aml
mice
expression
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES22191294T
Other languages
English (en)
Inventor
Siddhartha Jaiswal
Irving L Weissman
Catriona Jamieson
Ravindra Majeti
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40885608&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES3060476(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Application granted granted Critical
Publication of ES3060476T3 publication Critical patent/ES3060476T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0093—Purging against cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57505—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the blood, e.g. leukaemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

Se proporcionan métodos para manipular la fagocitosis de células, incluidas las células hematopoyéticas (por ejemplo, células hematopoyéticas circulantes, células de la médula ósea, etc.) y las células de tumores sólidos. En algunas modalidades de la invención, las células circulantes son células madre hematopoyéticas o células progenitoras hematopoyéticas, especialmente en el contexto de un trasplante, donde se desea protegerlas de la fagocitosis. En otras modalidades, las células circulantes son células leucémicas, en particular leucemia mieloide aguda (LMA), donde se desea aumentar la fagocitosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Métodos para manipular la fagocitosis mediada por CD47
[0003] ANTECEDENTES
[0004] El sistema reticuloendotelial (RES) es una parte del sistema inmunitario. El RES está constituido por las células fagocíticas situadas en el tejido conectivo reticular, principalmente monocitos y macrófagos. El RES está constituido por 1) monocitos circulantes; 2) macrófagos residentes en el hígado, el bazo, los ganglios linfáticos, el timo, los tejidos submucosos de las vías respiratoria y el tracto digestivo, la médula ósea y los tejidos conectivos; y 3) células similares a los macrófagos, incluyendo las células dendríticas de los ganglios linfáticos, las células de Langerhans de la piel y las células microgliales del sistema nervioso central. Estas células se acumulan en los ganglios linfáticos y el bazo. El RES tiene la función de depurar los patógenos, la materia particulada en circulación y las células hematopoyéticas envejecidas o dañadas.
[0005] Para eliminar las células o partículas extrañas en la respuesta inmunitaria innata, cuando el receptor de fosfatidilserina (PSR) reacciona a la fosfatidilserina (PS) se induce la fagocitosis mediada por macrófagos, que puede exteriorizarse desde las membranas de las células muertas, como las células apoptóticas y necróticas. A su vez, la interacción entre la PS y el PSR desempeña una función crucial en la depuración de las células apoptóticas por los macrófagos. Una vez que los macrófagos han realizado la fagocitosis, la respuesta inflamatoria se regula a la baja mediante un aumento de factores como la IL-10, el TGF-β y la prostaglandina E2 (PGE2). El estricto equilibrio entre las respuestas inflamatorias y antiinflamatorias, tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa, desempeña una función fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular y en la protección del huésped frente a invasiones extrínsecas.
[0006] El documento EP1693385 describe un anticuerpo anti-CD47 humanizado. Manna et al. (2004) Cancer Research 64(3): 1026-1036 describe que CD47 media la destrucción de las células tumorales mamarias a través de la inhibición dependiente de Gi de la proteína quinasa A. El documento US 2007/111238 describe métodos para diagnosticar y evaluar el tratamiento de trastornos sanguíneos. Liu et al. (2002) Journal of Biological Chemistry 277(12):10028-10036 describe que la proteína reguladora de señales (SIRPalfa), un ligando celular para CD47, regula la transmigración de neutrófilos. Majeti et al. (2008) describen que el CD47 es un factor pronóstico independiente y una diana terapéutica de anticuerpos en las células madre de la leucemia mieloide aguda humana. Pettersen et al. (1999) describen que el CD47 señala la muerte de las células T. Manna et al. (2003) The Journal of Immunology 170(7):3544-3553 describe un mecanismo de destrucción de las células T dependiente del CD47: inhibición heterodimérica dependiente de Gi de la proteína quinasa A. Majeti et al. (2009) Developmental Cell 138(2):286-299 describe que el CD47 es un factor de pronóstico adverso y una diana terapéutica de anticuerpos en las células madre de la leucemia mieloide aguda humana. Jaiswal et al. (2009) Cell 138(2):271-285 describen que CD47 se regula al alza en las células madre hematopoyéticas circulantes y las células de leucemia para evitar la fagocitosis. Subramanian et al. (2005) Blood 107(6):2548-2556 describen interacciones específicas de especie y tipo celular entre CD47 y SIRPα humana.
[0007] La relación causal entre la inflamación y la progresión neoplásica es un concepto ampliamente aceptado. Los datos respaldan ahora el concepto de inmunovigilancia del cáncer, según el cual una de las funciones fisiológicas del sistema inmunitario es reconocer y destruir las células transformadas. Sin embargo, algunas células tumorales son capaces de evadir el reconocimiento y la destrucción por parte del sistema inmunitario. Una vez que las células tumorales han escapado, el sistema inmunitario puede participar en su crecimiento, por ejemplo, promoviendo la vascularización de los tumores.
[0008] Tanto las células inmunitarias adaptativas como las innatas participan en la vigilancia y la eliminación de las células tumorales, pero los monocitos/macrófagos pueden ser la primera línea de defensa en los tumores, ya que se colonizan rápidamente y secretan citoquinas que atraen y activan las células dendríticas (CD) y las células NK, que a su vez pueden iniciar la respuesta inmunitaria adaptativa contra las células transformadas.
[0009] Los tumores que escapan del mecanismo inmunitario pueden ser consecuencia de alteraciones que se producen durante la fase de vigilancia inmunitaria. Por ejemplo, algunas células tumorales desarrollan deficiencias en las vías de procesamiento y presentación de antígenos, lo que facilita la evasión de una respuesta inmunitaria adaptativa, como la ausencia o funciones anómalas de componentes de la vía de señalización del receptor de IFN-γ. Otros tumores suprimen la inducción de señales de peligro proinflamatorias, lo que lleva, por ejemplo, a una maduración alterada de las CD. Por último, la inhibición de las funciones protectoras del sistema inmunitario también puede facilitar el escape tumoral, como la sobreproducción de las citoquinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-β, que pueden ser producidas por muchas células tumorales, pero también por macrófagos o células T reguladoras.
[0010] Un tumor puede verse como un órgano aberrante iniciado por una célula cancerosa tumorigénica que ha adquirido la capacidad de proliferar indefinidamente a través de mutaciones acumuladas. Desde esta perspectiva de un tumor como un órgano anómalo, para comprender mejor cómo se desarrollan los tumores pueden aplicarse los principios de la biología normal de las células madre. Muchas observaciones sugieren que las analogías entre las células madre normales y las células tumorigénicas son adecuadas. Tanto las células madre normales como las células tumorigénicas tienen un gran potencial proliferativo y la capacidad de dar lugar a nuevos tejidos (normales o anómalos). Tanto los tumores como los tejidos normales están compuestos por combinaciones heterogéneas de células, con diferentes características fenotípicas y diferentes potenciales proliferativos.
[0012] Las células madre se definen como células que tienen la capacidad de perpetuarse a sí mismas mediante la autorrenovación y de generar células maduras de un tejido particular mediante diferenciación. En la mayoría de los tejidos, las células madre son poco frecuentes. Como resultado, las células madre deben identificarse prospectivamente y purificarse cuidadosamente para poder estudiar sus propiedades. Quizás la propiedad más importante y útil de las células madre sea la de la autorrenovación. A través de esta propiedad, pueden encontrarse paralelismos sorprendentes entre las células madre y las células cancerosas: los tumores a menudo pueden originarse a partir de la transformación de células madre normales, vías de señalización similares pueden regular la autorrenovación en las células madre y las células cancerosas, y los cánceres pueden comprender células poco frecuentes con un potencial indefinido de autorrenovación que impulsan la tumorigénesis.
[0014] El estudio de los marcadores de la superficie celular específicos o regulados al alza específicamente en las células cancerosas es fundamental para proporcionar dianas para reducir el crecimiento o agotar las células cancerosas. En la presente se proporciona un marcador para la leucemia mieloide, especialmente un marcador para la leucemia mieloide aguda (LMA). Nuestros estudios han revelado una función de este marcador en ayudar a las células madre de la LMA a evitar su depuración por fagocitosis. Se proporcionan métodos para usar este marcador con el fin de aumentar la fagocitosis de las células madre de la LMA (AML SC), así como para mejorar el trasplante de células madre hematopoyéticas y progenitoras.
[0016] Curiosamente, se ha demostrado que ciertos marcadores son compartidos por las células madre de leucemia y las células madre hematopoyéticas (HSC). Durante el desarrollo normal, las HSC migran a nichos ectópicos en la vida fetal y adulta a través del torrente sanguíneo. Una vez en el torrente sanguíneo, las HSC deben navegar por los lechos vasculares del bazo y el hígado antes de establecerse en un nicho. En estos lechos vasculares, los macrófagos cumplen la función de eliminar las células dañadas y las partículas extrañas del torrente sanguíneo. Además, durante los estados inflamatorios, los macrófagos se vuelven más activos en la fagocitosis. Por lo tanto, las células madre recién llegadas se enfrentan a la posibilidad de ser fagocitadas durante el trayecto, a menos que pueda generarse una protección adicional. La exploración de los mecanismos por los que las HSC endógenas evitan ser depuradas por fagocitosis puede proporcionar información sobre las formas de mejorar el éxito del trasplante de células madre hematopoyéticas y progenitoras. La presente invención satisface estas y otras necesidades.
[0018] RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0020] La invención proporciona un anticuerpo anti-CD47 para su uso en un método para reducir el crecimiento de las células madre de la LMA (AMLSC) en un paciente, aumentando su depuración por fagocitosis al impedir la interacción entre el CD47 de la superficie de las AMLSC y el receptor SIRPα en la superficie de las células fagocíticas. Cualquier referencia a un método de tratamiento puesto en práctica en el cuerpo humano o animal debe interpretarse como sustancias y composiciones para su uso en tales tratamientos.
[0022] Se proporcionan métodos para manipular la fagocitosis de las células hematopoyéticas, incluyendo las células hematopoyéticas circulantes, por ejemplo, las células de la médula ósea. En algunos casos, las células circulantes son células madre hematopoyéticas o células progenitoras hematopoyéticas, especialmente en un contexto de trasplantes, en donde es deseable la protección contra la fagocitosis. En otros casos, las células circulantes son células de leucemia, en particular de leucemia mieloide aguda (LMA), donde es deseable un aumento de la fagocitosis. En ciertos casos, se proporcionan métodos para manipular la fagocitosis por macrófagos de las células hematopoyéticas circulantes. En otros casos más, se proporcionan métodos para manipular la fagocitosis de tumores sólidos.
[0024] En algunos casos, las células progenitoras o madre hematopoyéticas se protegen de la fagocitosis en la circulación proporcionando al animal huésped una molécula mimética del CD47, que interactúa con SIRPα en las células fagocíticas, como los macrófagos, y disminuye la fagocitosis. El mimético del CD47 puede ser CD47 soluble; CD47 recubierto en la superficie de las células que se van a proteger, un mimético de CD47 que se une a SIRPα en el sitio de unión de CD47, y similares. En algunos casos, el CD47 se proporciona como una proteína de fusión, por ejemplo, CD47 soluble fusionado a un fragmento Fc, por ejemplo, Fc de IgG1, Fc de IgG2, Fc de IgA, etc.
[0026] En otros casos, las células tumorales, por ejemplo, células tumorales sólidas, células de leucemia, etc., son diana de la fagocitosis mediante el bloqueo de CD47 en la superficie celular. Se ha demostrado que las células de leucemia, en particular las células de LMA, evaden la vigilancia de los macrófagos mediante la regulación al alza de la expresión de CD47. A un paciente se le administran agentes que enmascaran la proteína CD47, por ejemplo, anticuerpos que se unen a CD47 e impiden la interacción entre CD47 y SIRPα, lo que aumenta la depuración de las células de LMA mediante fagocitosis. En otros aspectos, un agente que enmascara el CD47 se combina con anticuerpos monoclonales dirigidos contra uno o más marcadores adicionales de AMLSC, por ejemplo, CD96 y similares, composiciones que pueden ser sinérgicas para mejorar la fagocitosis y la eliminación de AMLSC en comparación con el uso de agentes individuales. En otros casos, las células de tumores sólidos son diana de la fagocitosis mediante el bloqueo del CD47 presente en la superficie celular.
[0028] En la presente se divulgan métodos para dirigirse o agotar células madre cancerosas de LMA, el método comprendido poner en contacto una población de células, por ejemplo, sangre de un paciente con leucemia, con un reactivo que se une específicamente al CD47 con el fin de dirigirse o agotar las AMLSC. En ciertos aspectos, el reactivo es un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, por ejemplo, un isótopo radiactivo, un agente quimioterapéutico, una toxina, etc. En algunos casos, la depleción se realiza en una población de célulasex vivo, por ejemplo, la purga de productos de células madre autólogas (sangre periférica o médula ósea movilizada) para su uso en trasplantes autólogos en pacientes con leucemia mieloide aguda. En otro caso, se proporcionan métodos para dirigirse a células cancerosas de un tumor sólido en un sujeto humano administrando un anticuerpo contra CD47 al sujeto.
[0030] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0032] Figura 1. Análisis FACS de la expresión de CD47 en HSC y progenitoras humanas de síndrome mielodisplásico (SMD, azul), leucemia mieloide crónica en fase acelerada (LMC FA, verde) y médula ósea normal (rojo).
[0033] Figura 2. ET frente a PV. Análisis FACS de la expresión de CD47 en trastornos mieloproliferativos humanos, como la trombocitemia esencial (ET, azul) y la policitemia vera (PV, verde), HSC, progenitoras y células positivas de linaje, en comparación con la médula ósea humana normal (rojo).
[0034] Figura 3A. Perfiles de progenitores de médula ósea normal (izquierda), mielofibrosis pospolicitémica con metaplasia mieloide (PPMM) y crisis blástica de LMC. Figura 3B. Análisis FACS de la expresión de CD47 en médula ósea humana normal (rojo) frente a UMPD (verde) frente a PV (azul = ML) frente a LMC atípica (naranja), HSC, progenitoras y células positivas de linaje.
[0035] Figura 4. Aumento de la expresión de CD47 por progenitores de LMMC (azul) en comparación con la médula ósea normal (rojo) con progresión de la enfermedad.
[0036] Figuras 5A-5B. (A) Perfiles de progenitores de médula ósea normal (izquierda) frente a LMA (derecha). (B) Análisis FACS de la expresión de CD47 en células progenitoras y de linaje positivas (blastos) de médula ósea humana normal (rojo) frente a LMA (azul).
[0037] Figura 6. El CD47 se expresa en mayor medida en las LSC de la LMA en comparación con sus equivalentes normales. A. La expresión relativa de CD47 en HSC de médula ósea normal (Lin-CD34+CD38-CD90+) y MPP (Lin-CD34+CD38-CD90-CD45RA-), así como en LSC (Lin-CD34+CD38-CD90-) y células de leucemia a granel de muestras de LMA humana se determinó mediante citometría de flujo. Se normalizó la intensidad media de fluorescencia para el tamaño celular y frente a células positivas del linaje para tener en cuenta los análisis realizados en días diferentes. En las diferentes poblaciones la misma muestra de médula ósea normal (rojo, n = 3) o LMA (azul, n = 13) se indica con el mismo símbolo. Las diferencias entre la expresión media de HSC con LSC (p = 0,003), HSC con leucemia masiva (p = 0,001), MPP con LSC (p = 0,004) y MPP con leucemia masiva (p = 0,002) fueron estadísticamente significativas usando una prueba t de Student bilateral. La diferencia entre la expresión media de LSC de LMA en comparación con la LMA masiva no fue estadísticamente significativa con p = 0,50 usando una prueba t de Student bilateral pareada. B. Características clínicas y moleculares de muestras primarias de LMA humana manipuladas in vitro y/o in vivo.
[0038] Figura 7. El anticuerpo anti-CD47 estimula la fagocitosis por macrófagosin vitrode LSC de LMA humana primaria. Las LSC de LMA se purificaron mediante FACS a partir de dos muestras de LMA humana primaria, se marcaron con el colorante fluorescente CFSE y se incubaron con macrófagos derivados de médula ósea de ratón o en presencia de un control de isotipo (A) o de un anticuerpo anti-CD47 (B). Estas células se evaluaron mediante microscopía de inmunofluorescencia para detectar la presencia de LSC marcadas con fluorescencia dentro de los macrófagos. (C) Se determinó el índice fagocítico para cada condición calculando la cantidad de células ingeridas por cada 100 macrófagos.
[0039] Figura 8A-C. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el CD47 humano permiten preferentemente la fagocitosis de las LSC de LMA humanas por macrófagos humanos y murinos. A, B. Las LSC de LMA marcadas con CFSE se incubaron con macrófagos derivados de sangre periférica humana (A) o macrófagos derivados de médula ósea de ratón (B) en presencia de control de isotipo de IgG1, IgG1 anti-CD45 o IgG1 anti-CD47 (B6H12.2). Estas células se evaluaron mediante microscopía de inmunofluorescencia para determinar la presencia de LSC marcadas con fluorescencia dentro de los macrófagos (indicadas con flechas). C. Las LSC de LMA marcadas con CFSE o las células CD34+ de médula ósea normal se incubaron con macrófagos humanos (izquierda) o de ratón (derecha) en presencia de los anticuerpos indicados y, a continuación, se evaluó la fagocitosis mediante microscopía de inmunofluorescencia. Se determinó el índice fagocítico para cada condición calculando la cantidad de células ingeridas por cada 100 macrófagos. Para las LSC de LMA, las diferencias entre el isotipo o el anticuerpo anti-CD45 con el tratamiento con anticuerpos anti-CD47 bloqueantes (B6H12.2 y BRIC126) fueron estadísticamente significativas con p<0,001 para todas las comparaciones por pares con macrófagos humanos y de ratón. En el caso de los macrófagos humanos, las diferencias entre las LSC de LMA y las células CD34<+>normales fueron estadísticamente significativas para B6H12.2 (p<0,001) y BRIC126 (p=0,002).
[0040] Figura 9. El anticuerpo anti-CD47 estimula la fagocitosisin vitrode LSC de LMA humana primaria por los macrófagos. Las LSC de LMA se purificaron mediante FACS a partir de cuatro muestras primarias de LMA humana, se marcaron con el colorante fluorescente CFSE y se incubaron con macrófagos de sangre periférica humana, o en presencia de un control de isotipo, un anticuerpo anti-CD45 de isotipo compatible o un anticuerpo anti-CD47. (A) Estas células se evaluaron mediante microscopía de inmunofluorescencia para detectar la presencia de LSC marcadas con fluorescencia dentro de los macrófagos. Se determinó el índice fagocítico para cada condición calculando la cantidad de células ingeridas por cada 100 macrófagos. (B) Los macrófagos se recogieron, se tiñeron con un anticuerpo anti-macrófagos humanos marcado con fluorescencia y se analizaron mediante citometría de flujo. Los eventos doblemente positivos hMac+CFSE+ identifican los macrófagos que han fagocitado LSC marcadas con CFSE. Cada muestra se representa con un color diferente.
[0041] Figura 10A-B:Un anticuerpo monoclonal dirigido contra el CD47 humano inhibe el injerto de LSC de LMA in vivo.Se incubaron tres muestras primarias de LMA humana con control de isotipo de IgG1, IgG1 anti-CD45 o anticuerpo de IgG1 anti-CD47 (B6H12.2) antes del trasplante en ratones NOG recién nacidos. Se analizó una parte de las células para determinar el recubrimiento mediante tinción con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón y se analizó mediante citometría de flujo (A). Trece semanas después, se sacrificaron los ratones y se analizó la médula ósea para determinar el porcentaje de células de leucemia mieloide CD45+CD33+ humanas mediante citometría de flujo (B). La diferencia en el injerto medio entre las células recubiertas con anti-CD47 y las células recubiertas con isotipo (p < 0,001) y anti-CD45 (p = 0,003) fue estadísticamente significativa.
[0042] Figura 11. El CD47 está regulado al alza en la leucemia mieloide aguda murina. Se muestran gráficos típicos de células madre y progenitoras para células leucémicas hMRP8bcrabl x hMRP8bcl2 en comparación con animales control no leucémicos. Las células seleccionadas Lin- c-Kit+ Sca-1+ de la médula ósea de control (a) y del bazo leucémico (b) y las células seleccionadas Lin- c-Kit+ Sca-1- de la médula ósea de control (c) y del bazo leucémico (d) muestran alteraciones en la hematopoyesis normal en ratones leucémicos. La frecuencia se muestra como porcentaje de la fracción mononuclear total de la médula ósea o el bazo. (e) La RT-PCR cuantitativa muestra que CD47 está regulado al alza en las células leucémicas de la médula ósea. Se muestran los datos de 3 conjuntos de ratones trasplantados con células leucémicas o de control hRMP8bcrabl x hMRP8bcl2 de la médula ósea y se sacrificaron entre 2 y 6 semanas después. Los resultados se normalizaron con respecto a la expresión de betaactina y ARN ribosómico 18S. Se determinó la razón de cambio con respecto al control de células Bcl-2+ de médula ósea trasplantadas completas. Las barras de error representan 1 desviación estándar. (f) Los histogramas muestran la expresión de CD47 en poblaciones seleccionadas de ratones leucémicos (gris) y de control (negro). Figura 12. Expansión de GMP y regulación al alza de CD47 en la leucemia mieloide humana. a) Gráficos FACS representativos de progenitores mieloides (CD34+CD38+Lin-) que incluyen progenitores mieloides comunes (CMP), progenitores megacariocíticos-eritroides (MEP) y progenitores granulocíticos-macrofágicos (GMP) en médula ósea (BM) normal frente aLMC, LMC de BC y AML. b) Histogramas FACS comparativos de la expresión de CD47 por células madre hematopoyéticas (HSC; CD34+CD38-CD90+Lin-) y progenitoras (CD34+CD38+Lin-) normales (rojo; n = 6) y con leucemia mieloide aguda (LMA, azul; n = 6). c) Histogramas FACS comparativos de la expresión de CD47 por células madre hematopoyéticas (HSC; CD34+CD38-CD90+Lin) y progenitoras comprometidas (CD34+CD38+Lin-) normales (rojo) y con leucemia mieloide crónica. Panel superior: HSC, progenitores y células positivas para linaje normales (n = 7) frente a LMC en fase crónica (n = 4). Panel central: HSC, progenitores y células positivas para linaje normales (n = 7) frente a LMC en fase acelerada (n = 7). Panel inferior: HSC, progenitores y células positivas para linaje normales (n = 7) frente a LMC en crisis blástica (n = 4). Figura 13. La sobreexpresión de CD47 murino aumenta la tumorigenicidad de las células MOLM-13. a) Las células MOLM-13 se transdujeron o con un virus de control o con un virus que expresaba el ADNc de CD47 murino de la forma 2. Las líneas celulares resultantes, denominadas Tet o Tet-CD47, se trasplantaron competitivamente a ratones RAG/deficientes en cadena RAG/gamma común con células MOLM-13 no transducidas (5x10<5>Tet (n=6) o Tet-47 (n=8) células con 5x10<5>MOLM-13). Se analizó a los ratones para determinar GFP y quimerismo de CD45 humano cuando estaban moribundos. b) El quimerismo de MOLM-13 en los tejidos hematopoyéticos se determinó mediante el quimerismo de CD45 humano y la medición del tamaño de la lesión tumoral. c) Se trazó la supervivencia de los ratones trasplantados competitivamente con MOLM-13 más células MOLM-13 Tet o Tet-CD47. Los ratones de control murieron por una gran carga tumoral en el sitio de la inyección, pero no se produjo injerto en los tejidos hematopoyéticos. d) Secciones de hematoxilina y eosina del hígado trasplantado con Tet-CD47 MOLM-13 (200x). Es evidente la infiltración tumoral periportal (flecha) y sinusoidal (punta de flecha). e) Se inyectaron 1x10<6>células Tet (n = 5) o Tet-CD47 MOLM-13 (n = 4) en el fémur derecho de ratones RAG2-/-, Gc-/-y se analizaron los tejidos 50-75 días después y se determinó el quimerismo de las células MOLM-13 en la médula ósea. f) Curva de supervivencia de ratones trasplantados intrafemoralmente con células MOLM-13 Tet o Tet-CD47. g) Ejemplos de formación de tumores hepáticos y hepatomegalia en ratones trasplantados con MOLM-13 Tet-CD47 frente a ratones trasplantados de control. La fluorescencia de GFP muestra la formación de nódulos tumorales, así como una infiltración difusa.
[0043] Figura 14. La sobreexpresión de CD47 evita la fagocitosis de células MOLM-13 vivas no opsonizadas. a) Se incubaron células MOLM-13 Tet o Tet-CD47 con macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) durante 2, 4 o 6 horas y se determinó el índice fagocítico. Las barras de error representan 1 d.e. (n = 6 para cada punto temporal). b) Análisis FACS de BMDM incubadas con células Tet o Tet-CD47. c) Fotomicrografías de BMDM incubadas con células MOLM-13 Tet o Tet-CD47 a las 2 y 24 horas (400X). d) Se trasplantaron células MOLM-13 Tet o Tet-CD47 a ratones RAG2-/-, Gc-/- y se analizaron los macrófagos de la médula, el bazo y el hígado 2 horas después. Se seleccionó la fracción de GFP+ de los macrófagos. Los resultados son representativos de 3 experimentos.
[0044] Figura 15. Una mayor expresión de CD47 en las células MOLM-13 se correlaciona con el potencial tumorigénico y la evasión de la fagocitosis. a) se dividieron Las células MOLM-13 Tet-CD47 en clones de expresión alta y baja como se ha descrito. Los histogramas muestran la expresión de CD47 en células MOLM-13 de alta expresión (negro), MOLM-13 de baja expresión (gris) y médula ósea de ratón (sombreado). Se muestran los valores obtenidos para MFI/FSC<2>(x10<9>). b) A los ratones trasplantados con células MOLM-13 CD47hi se les administró doxiciclina durante 2 semanas. Los histogramas muestran el nivel de expresión de CD47 en ratones no tratados (sombreados) y tratados (sombreados), con los valores de MFI/FSC<2>(x10<9>) indicados. c) Supervivencia de ratones RAG2-/-, Gc-/- trasplantados con 1 x 10<6>MOLM-13 CD47<hi>), CD47<lo>, o MOLM-13 CD47<hi>con administración de doxiciclina dos semanas después del trasplante. d) Tamaño del hígado y el bazo de los ratones en la necropsia o 75 días después del trasplante con 1 x 10<6>MOLM-13 CD47<hi>, CD47<lo>, o MOLM-13 CD47<hi>con administración de doxiciclina dos semanas después del trasplante. e) Quimerismo de células humanas en médula ósea y bazo de ratones en el momento de la necropsia o 75 días después del trasplante con 1 x 10<6>MOLM-13 CD47<hi>, CD47<lo>o MOLM-13 CD47<loi>con administración de doxiciclina dos semanas después del trasplante. f) Expresión de CD47 murino en células MOLM-13 CD47<lo>injertadas en la médula ósea (abierto) en comparación con la línea celular original (sombreado). Se indican los valores de MFI/FSC<2>(x10<9>). g) Se incubaron 2,5 x 10<5>células MOLM-13 CD47<hi>o CD47<lo>con 5 x 10<4>BMDM durante 2 horas. Se muestra el índice fagocítico. h) Se incubaron 2,5 x10<5>células RFP CD47<hi>y MOLM-13 GFP CD47<lo>con 5 x 10<4>BMDM durante 2 horas. Se muestra el índice fagocítico para tres muestras separadas de RFP CD47<hi>(rojo) y GFP MOLM-13 CD47<lo>(verde). i) Se incubaron 2,5 x 10<5>células RFP CD47<hi>y MOLM-13 GFP CD47<lo>con 5 x 10<4>BMDM durante 24 horas. Las microfotografías muestran imágenes de campo claro (arriba a la izquierda), RFP (arriba a la derecha), GFP (abajo a la izquierda) y combinadas (abajo a la derecha).
[0045] Figura 16. a) Análisis FACS de la expresión de CD47 de células madre hematopoyéticas de médula ósea (ckit+Sca+Lin-), progenitores mieloides (c-kit+Sca-Lin-) o blastos (c-kit lo Sca-Lin-) de Fas Ipr/lpr hMRP8bcl-2 no leucémicos (azul) y Fas Ipr/lpr hMRP8bcl-2 leucémicos (verde). b) La médula ósea de ratón se transdujo con retrovirus que contenía p210 bcr/abl, tal y como se ha descrito anteriormente<24>. Los ratones se sacrificaron cuando estaban moribundos y se analizaron los bazos. Se muestra la expresión de CD47 en células c-Kit+ Mac-1+ en los bazos de dos ratones leucémicos (histogramas sin sombrear) y en la médula ósea de un ratón de tipo salvaje (histograma sombreado). c) Los histogramas muestran la expresión de CD47 en poblaciones seleccionadas de ratones leucémicos hMRP8bcrabl x hMRP8bcl2 (rojo), hMRP8bcl2 no leucémicos (azul) y de tipo salvaje (verde). El CD47 se tiñó usando anti-CD47 de ratón conjugado con FITC (Pharmingen).
[0046] Figura 17. a) Se muestra la expresión de CD47 humano (histogramas negros) en líneas celulares de leucemia humana y HSC de sangre de cordón umbilical. La tinción de control de isotipo se muestra en gris. b) El MFI de CD47 sobre el fondo se normalizó al tamaño celular dividiéndolo por FSC<2>. El valor obtenido para cada tipo de célula se muestra encima de la barra. c) Las células HL-60 se injertan en médula ósea de ratón. Se inyectaron 5 x 10<5>células por vía intravenosa en animales RAG2-/-, Gc-/- y los ratones se analizaron 4 semanas después. d) Las células se tiñeron con CFSE y se co-cultivaron con BMDM. Se contaron los eventos fagocíticos después de 2 h. Para la irradiación, se administró a las células Jurkat una dosis de 2 Gray y se incubaron durante 16 h antes del ensayo de fagocitosis.
[0047] Figura 18. (a) Análisis de células madre y progenitoras de la médula ósea de ratones IAP+/+, IAP+/-, e IAP-/-. Las células madre (izquierda) se seleccionan en células de linaje c-Kit+ Sca-1+. Los progenitores mieloides (derecha) se seleccionan en células de linaje c-Kit+ Sca-1+. La frecuencia en toda la médula ósea se muestra junto a cada población seleccionada. (b) Producción de colonias en el día 7 de LT-HSC clasificadas individualmente. G: granulocito; M: macrófago; GM: granulocito y macrófago; GEMM: granulocito, macrófago, eritroide y megacariocito; Meg: megacariocito. (c) Curva de supervivencia de ratones receptores a los que se les administró una dosis de radiación de 9,5 Gray y se les trasplantaron las células mostradas. Todos los ratones de control con radiación murieron en un plazo de 12 a 15 días. n = 5 para cada grupo. (d) Ejemplos de gráficos de quimerismo CD45.1/CD45.2 a las 4 semanas después del trasplante. A los ratones CD45.1 se les trasplantaron 50 LT-HSC (CD45.2) y 2 x 10<5>de médula auxiliar CD45.1. Las células se seleccionan en células B220- CD3- Mac-1+ de dispersión lateral media/alta. Las células IAP-/- no se injertaron. (e) Resumen del análisis de quimerismo de ratones trasplantados con 50 o 500 células IAP+/+ o IAP-/-. (f) Las células enriquecidas con c-Kit IAP+/+ o IAP-/- se incubaron con BMDM de tipo salvaje. Los resultados indican el índice fagocítico medio calculado a partir de tres muestras separadas. Las barras de error representan 1 d.e. (g) Fotomicrografías de ensayos de fagocitosis tomadas después de 2 horas. Se muestra el genotipo de las células enriquecidas con -Kit.
[0048] Figura 19. (a) Se movilizaron ratones con Cy/G y se analizó la médula ósea el día 2. Se muestra el nivel de expresión de CD47 en las células c-Kit+. (b) Se muestran las selecciones de células madre y progenitoras mieloides para la médula ósea movilizada el día 2. Los histogramas de la izquierda muestran el nivel de expresión de CD47 en LT-HSC y GMP de la médula en estado estacionario (histograma sombreado), movilizada el día 2 (línea negra) y movilizada el día 5 (línea gris). (c) MFI relativa de CD47 para GMP en los días 0-5 de la movilización con Cy/G. Los resultados se normalizaron de tal manera que el estado estacionario de GMP fuera igual a 100. (d) Se muestran las selecciones de células madre y progenitoras mieloides para la médula ósea del día 2 después del tratamiento con LPS. Los histogramas muestran el nivel de expresión de CD47 en el día 2 después del LPS (línea negra), el día 5 después del LPS (histograma sombreado en gris oscuro), el estado estacionario (histograma sombreado en gris claro) y LT-HSC y GMP IAP-/- (histograma sombreado en negro). (e) Evaluación de las células KLS en los órganos hematopoyéticos de ratones IAP+/+ e IAP-/- movilizados entre los días 2 y 5. Se analizan dos ratones por genotipo y día.
[0049] Figura 20. (a) Nivel de expresión de CD47 de LT-HSC IAP+/+, IAP+/-, e IAP-/-. Las cantidades mostradas son el MFI para cada grupo. (b) Análisis del quimerismo del donante para trasplantes de ratones IAP+/+ (arriba) o IAP+/-(abajo). Se extrajo sangre de los ratones a las 2, 8 y 40 semanas después del trasplante. Se trasplantaron 2 x 10<6>células del donante a receptores congénicos irradiados subletalmente.
[0050] Figura 21A-D: Identificación y separación de progenitores normales y leucémicos del mismo paciente basándose en la expresión diferencial de CD47. A. La expresión de CD47 en la fracción enriquecida con LSC Lin-CD34+CD38-de la muestra SU008 se determinó mediante citometría de flujo. Las células que expresaban CD47hi y CD47lo se identificaron y purificaron mediante FACS. Los paneles de la izquierda se seleccionan en las células de linaje negativo, mientras que los de la derecha se seleccionan en las células Lin-CD34+CD38-. B. Las células Lin-CD34+CD38-CD47lo y Lin-CD34+CD38-CD47hi se sembraron en placas en metilcelulosa completa, capaz de soportar el crecimiento de todas las colonias mieloides. Catorce días después, se determinó la formación de colonias mieloides mediante evaluación morfológica. Se presentan CFU-G/M (izquierda) y BFU-E (derecha) representativas. C. Se trasplantaron células Lin-CD34+CD38-CD47lo a dos ratones NOG recién nacidos. Doce semanas después, se sacrificaron los ratones y se analizó la médula ósea para determinar la presencia de células mieloides humanas CD45+CD33+ y células linfoides humanas CD45+CD19+ mediante citometría de flujo. D. Se evaluaron mediante PCR HSC de médula ósea normal, células de leucemia SU008 a granel, células Lin-CD34+CD38-CD47hi, células Lin-CD34+CD38-CD47lo o células CD45+ humanas purificadas de la médula ósea de ratones injertados con células Lin-CD34+CD38-CD47lo para determinar la presencia de la mutación FLT3-ITD en. Se indican los productos de FLT3 de tipo salvaje y de FLT3-ITD.
[0051] Figura 22: La expresión aumentada de CD47 en la LMA humana se asocia con malos resultados clínicos. Supervivencia libre de eventos (A, C) y global (B, D) de 132 pacientes con LMA con citogenética normal (A, B) y el subgrupo de 74 pacientes sin la mutación FLT3-ITD (C, D). Los pacientes se estratificaron en grupos de expresión de CD47 baja y de CD47 alta sobre la base de un umbral óptimo (28% alta, 72% baja) determinado mediante análisis de micromatrices a partir de un conjunto de datos de entrenamiento independiente. Las medidas de significación se basan en estimaciones de verosimilitud logarítmica del valor p, cuando se trata el modelo con expresión de CD47 como una clasificación binaria.
[0052] Figura 23A-E: Un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 humano elimina la LMA in vivo. Se trasplantó LSC de LMA a ratones NOG recién nacidos y, entre 8 y 12 semanas después, se analizaron la sangre periférica (A, B) y la médula ósea (C-E) para determinar el injerto de referencia antes del tratamiento con anticuerpo anti-CD47 (B6H12.2) o anticuerpo IgG de control (día 0). Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales diarias de 100 microgramos durante 14 días, al final de los cuales se sacrificaron y se analizó la sangre periférica y la médula ósea para determinar el porcentaje de leucemia CD45+CD33+ humana. A. Quimerismo leucémico humano antes y después del tratamiento en la sangre periférica de ratones representativos tratados con anticuerpo anti-CD47 e IgG de control, determinado por citometría de flujo. B. El resumen del quimerismo leucémico humano en la sangre periférica evaluado durante varios días en el transcurso del tratamiento demostró la eliminación de la leucemia en los ratones tratados con anticuerpo anti-CD47 en comparación con el tratamiento con IgG de control (p = 0,007). C. Quimerismo leucémico humano antes y después del tratamiento en la médula ósea de ratones representativos tratados con anticuerpos anti-CD47 o IgG de control, determinado mediante citometría de flujo. D. El resumen del quimerismo leucémico humano en la médula ósea en el día 14 con respecto al día 0 demostró una reducción drástica de la carga leucémica en ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 en comparación con el tratamiento con IgG de control (p<0,001). E. Secciones H&E de cavidades representativas de la médula ósea de ratones injertados con SU004 después del tratamiento con IgG de control (paneles 1 y 2) o con anticuerpo anti-CD47 (paneles 4 y 5). Las médulas tratadas con IgG estaban repletas de blastos leucémicos monomórficos, mientras que las médulas tratadas con anticuerpos anti-CD47 eran hipocelulares, lo que demostraba la eliminación de la leucemia humana. En algunos ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 que contenían leucemia residual, se detectaron macrófagos que contenían células picnóticas fagocitadas, lo que confirmaba la eliminación de la leucemia humana (paneles 3, 6, flechas).
[0053] Figura 24. La expresión aumentada de CD47 predice una peor supervivencia global en el DLBCL y el cáncer de ovario. (A) Una cohorte de 230 pacientes con linfoma difuso de células B grandes (p = 0,01). (B) Una cohorte de 133 pacientes con carcinoma de ovario en estadio avanzado (III/IV) (p = 0,04).
[0054] Figura 25: El anticuerpo anti-CD47 permite la fagocitosis de células madre de tumores sólidos in vitro. Las células indicadas se incubaron con macrófagos humanos en presencia de anticuerpos del isotipo de IgG1, anti-HLA o anti-CD47, y el índice fagocítico se determinó mediante microscopía de inmunofluorescencia. Estadísticas: Células de cáncer de vejiga con isotipo de IgG1 en comparación con anti-HLA (p = 0,93) y anti-CD47 (p = 0,01); urotelio vesical normal con isotipo de IgG1 en comparación con anti-HLA (p = 0,50) y anti-CD47 (p = 0,13); células de cáncer de ovario con isotipo de IgG1 en comparación con anti-HLA (p = 0,11) y anti-CD47 (p < 0,001). Cada punto de datos individual representa una muestra distinta de tejido tumoral o normal.
[0056] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES
[0058] Se proporcionan métodos para manipular células hematopoyéticas, incluyendo células hematopoyéticas circulantes. En algunas realizaciones, las células progenitoras o madre hematopoyéticas se protegen de la fagocitosis en la circulación proporcionando al animal huésped una molécula mimética de CD47, que interactúa con SIRPα en las células fagocíticas, como los macrófagos, y disminuye la fagocitosis. En otros casos, las células de leucemia son diana de la fagocitosis bloqueando CD47 en la superficie celular. En otros casos, las células de tumores sólidos son diana de la fagocitosis bloqueando CD47 en la superficie celular. En otro caso, se proporcionan métodos para dirigirse o agotar las células madre cancerosas de la LMA, el método comprendiendo poner en contacto las células sanguíneas reactivas con un anticuerpo que se une específicamente al CD47 con el fin de dirigirse o agotar las AMLSC. En otro caso, se proporcionan métodos para dirigirse a las células cancerosas de un tumor sólido en un sujeto humano administrando un anticuerpo contra el CD47 al sujeto.
[0059] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que está comprendido dentro de la invención cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños y también están comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos también están incluidos en la invención.
[0060] Los métodos enumerados en la presente pueden llevarse a cabo en cualquier orden de los eventos enumerados que sea lógicamente posible, así como en el orden enumerado de los eventos.
[0061] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque en la puesta en práctica o las pruebas de la presente invención también pueden usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
[0062] Cabe señalar que, como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta exposición sirva de base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la enumeración de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
[0063] Las publicaciones analizadas en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de la presente debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a antedatar dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales, que pueden ser necesario que se confirmen de manera independiente.
[0064] DEFINICIONES
[0065] Polipéptidos CD47. Las tres variantes de transcripción del CD 47 humano (variante 1, NM 001777; variante 2, NM 198793; y variante 3, NM 001025079) codifican tres isoformas del polipéptido CD47. La isoforma 1 del CD47 (NP 001768), la más larga de las tres isoformas, tiene una longitud de 323 aminoácidos. La isoforma 2 del CD47 (NP 942088) tiene una longitud de 305 aminoácidos. La isoforma 3 de CD47 tiene una longitud de 312 aminoácidos. Las tres isoformas son idénticas en la secuencia en los primeros 303 aminoácidos. Los aminoácidos 1-8 comprenden la secuencia señal, los aminoácidos 9-142 comprenden el dominio similar a la inmunoglobulina CD47, que es el fragmento soluble, y los aminoácidos 143-300 son el dominio transmembrana.
[0066] Los "miméticos de CD47" incluyen moléculas que funcionan de manera similar a CD47 al unirse y activar el receptor SIRPα. Las moléculas útiles como miméticos de CD47 incluyen derivados, variantes y fragmentos biológicamente activos de CD47 natural. Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo, como se define a continuación, que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con un polipéptido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen polipéptidos en los que se añaden uno o más residuos de aminoácidos en el extremo N o C terminal, o dentro de la secuencia nativa; se eliminan aproximadamente entre uno y cuarenta residuos de aminoácidos, y opcionalmente se sustituyen por uno o más residuos de aminoácidos; y derivados de los polipéptidos anteriores, en los que se ha modificado covalentemente un residuo de aminoácido de tal manera que el producto resultante tenga un aminoácido que no sea de origen natural. Normalmente, una variante biológicamente activa tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de secuencia nativa, preferiblemente por lo menos un aproximadamente 95% y, más preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 99%. Los polipéptidos variantes pueden estar glicosilados de manera natural o no natural, es decir, el polipéptido tiene un patrón de glicosilación que difiere del patrón de glicosilación que se encuentra en la proteína de origen natural correspondiente. Los polipéptidos variantes pueden tener modificaciones postraduccionales que no se encuentran en la proteína CD47 natural.
[0067] Son de interés los fragmentos de CD47 soluble, en particular los fragmentos biológicamente activos y/o los fragmentos que corresponden a dominios funcionales. Los fragmentos de interés tendrán típicamente una longitud de por lo menos aproximadamente 10 aa a por lo menos aproximadamente 15 aa, normalmente por lo menos aproximadamente 50 aa, pero normalmente no superarán una longitud de aproximadamente 142 aa, donde el fragmento tendrá un tramo de aminoácidos que es idéntico al CD47. Se pretende que un fragmento "de por lo menos 20 aa de longitud" incluya, por ejemplo, 20 o más aminoácidos contiguos de, por ejemplo, el polipéptido codificado por un ADNc para CD47. En este contexto, "aproximadamente" incluye el valor mencionado específicamente o un valor mayor o menor en varios (5, 4, 3, 2 o 1) aminoácidos. Las variantes proteicas descritas en la presente están codificadas por polinucleótidos que se encuentran dentro del alcance de la divulgación. Para seleccionar los codones adecuados para construir las variantes correspondientes puede usarse el código genético. Para producir polipéptidos pueden usarse polinucleótidos, y estos polipéptidos pueden usarse para producir anticuerpos mediante métodos conocidos.
[0069] Un polipéptido de "fusión" es un polipéptido que comprende un polipéptido o una parte del mismo (por ejemplo, uno o más dominios) fusionado o unido a un polipéptido heterólogo. Una proteína CD47 soluble de fusión, por ejemplo, compartirá por lo menos una propiedad biológica en común con un polipéptido CD47 soluble de secuencia nativa. Los ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen las inmunoadhesinas, como se ha descrito anteriormente, que combinan una parte del polipéptido CD47 con una secuencia de inmunoglobulina, y los polipéptidos etiquetados con epítopos, que comprenden un polipéptido CD47 soluble o una parte del mismo fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede elaborarse un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para no interferir con la actividad biológica del polipéptido CD47. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen en general por lo menos seis residuos de aminoácidos y, habitualmente, entre 6 y 60 residuos de aminoácidos.
[0071] Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido como las modificaciones covalentes del mismo. Los derivados y la fusión del CD47 soluble tienen aplicación como moléculas miméticas del CD47.
[0073] Los primeros 142 aminoácidos del polipéptido CD47 comprenden la región extracelular de CD47 (SEQ ID NO: 1). Las tres isoformas tienen una secuencia de aminoácidos idéntica en la región extracelular, por lo que para generar CD47 soluble puede usarse cualquiera de las isoformas. El "CD47 soluble" es una proteína CD47 que carece del dominio transmembrana. El CD47 soluble se secreta fuera de la célula que lo expresa en lugar de localizarse en la superficie celular. El CD47 soluble puede fusionarse con otro polipéptido para proporcionar una funcionalidad añadida, por ejemplo, para aumentar la estabilidad in vivo. En general, dichos componentes de fusión son una proteína plasmática estable que es capaz de prolongar la vida media plasmáticain vivode la proteína CD47 soluble cuando está presente como fusión, en particular cuando dicha proteína plasmática estable es un dominio constante de inmunoglobulina. En la mayoría de los casos en los que la proteína plasmática estable se encuentra normalmente en forma multimérica, por ejemplo, inmunoglobulinas o lipoproteínas, en los que las cadenas polipeptídicas iguales o diferentes se unen normalmente mediante disulfuro y/o no covalentemente para formar un polipéptido multicadena ensamblado. Se ha descrito la CD47 soluble fusionada a la Ig G1 humana (Motegi S. et al. EMBO J. 22(11): 2634-2644).
[0075] Las proteínas plasmáticas estables son proteínas que tienen típicamente entre 30 y 2000 residuos, que presentan en su entorno nativo una vida media prolongada en la circulación, es decir, mayor de aproximadamente 20 horas. Ejemplos de proteínas plasmáticas estables adecuadas son las inmunoglobulinas, la albúmina, las lipoproteínas, las apolipoproteínas y la transferrina. La región extracelular del CD47 se fusiona típicamente con la proteína plasmática en el extremo N-terminal de la proteína plasmática o fragmento de la misma que sea capaz de conferir una vida media prolongada al CD47 soluble. Son satisfactorios los aumentos mayores a aproximadamente el 100% en la vida media plasmática del CD47 soluble.
[0077] Normalmente, el CD47 soluble se fusiona en el extremo C-terminal con el extremo N-terminal de la región constante de las inmunoglobulinas en lugar de la región o regiones variables de las mismas, aunque también pueden usarse fusiones N-terminales. Típicamente, tales fusiones conservan los dominios bisagra, CH2 y CH3 por lo menos funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, cuyas cadenas pesadas pueden incluir IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE e IgD, normalmente una o una combinación de proteínas de la clase IgG. Las fusiones también se realizan en el extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminales al CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera. Esto se logra normalmente construyendo la secuencia de ADN adecuada y expresándola en un cultivo celular recombinante. Alternativamente, los polipéptidos pueden sintetizarse de acuerdo con métodos conocidos.
[0079] El sitio exacto en el que se realiza la fusión no es crítico; pueden seleccionarse sitios particulares para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión del CD47. El sitio óptimo se determinará mediante experimentos rutinarios.
[0081] En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas híbridas se ensamblan como monómeros, o heteromultímeros o homomultímeros, y particularmente como dímeros o tetrámeros. En general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en la que existen la IgG, la IgD y la IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular más alto; la IgM existe generalmente como un pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. La inmunoglobulina IgA, y ocasionalmente la inmunoglobulina IgG, también pueden existir en forma multimérica en el suero. En el caso de los multímeros, cada unidad de cuatro cadenas puede ser igual o diferente.
[0083] Los miméticos y/o proteínas de fusión CD47 adecuados pueden identificarse mediante el cribado de compuestos, detectando la capacidad de un agente para imitar la actividad biológica de CD47. Una actividad biológica de CD47 es la activación del receptor SIRPα en los macrófagos. Pueden realizarse ensayosin vitrocomo primera selección de la eficacia de un agente candidato y, habitualmente, se realizará un ensayoin vivopara confirmar el ensayo biológico. Los agentes deseables son eficaces para bloquear temporalmente la activación del receptor SIRPα. Los agentes deseables son de naturaleza temporal, por ejemplo, debido a la degradación biológica.
[0085] Los ensayosin vitropara la actividad biológica del CD47 incluyen, por ejemplo, la inhibición de la fagocitosis de células porcinas por macrófagos humanos, la unión al receptor SIRPα, la fosforilación de tirosina SIRPα, etc. Un ensayo ejemplar para la actividad biológica del CD47 pone en contacto una composición de macrófagos humanos en presencia de un agente candidato. Las células se incuban con el agente candidato durante aproximadamente 30 minutos y se lisan. El lisado celular se mezcla con anticuerpos anti-SIRPα humanos para inmunoprecipitar SIRPα. Las proteínas precipitadas se resuelven mediante SDS PAGE, luego se transfieren a nitrocelulosa y se sondan con anticuerpos específicos para fosfotirosina. Un agente candidato útil como mimético de CD47 aumenta la fosforilación de tirosina de SIRPα en por lo menos un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70%, o un 80%, o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fosforilación observado en ausencia del agente candidato. Otro ensayo ejemplar para la actividad biológica de CD47 mide la fagocitosis de células hematopoyéticas por macrófagos humanos. Un agente candidato útil como mimético de CD47 da como resultado una regulación a la baja de la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia del agente candidato.
[0087] El polinucleótido que codifica el CD47 soluble o el CD47-Fc soluble puede introducirse en un vector de expresión adecuado. El vector de expresión se introduce en una célula adecuada. Los vectores de expresión tienen generalmente sitios de restricción convenientes situados cerca de la secuencia promotora para permitir la inserción de secuencias de polinucleótidos. Pueden prepararse casetes de transcripción que comprendan una región de inicio de la transcripción, el gen CD47 o un fragmento del mismo, y una región de terminación de la transcripción. Los casetes de transcripción pueden introducirse en una variedad de vectores, por ejemplo, plásmidos; retrovirus, por ejemplo, lentivirus; adenovirus; y similares, donde los vectores pueden mantenerse de manera transitoria o estable en las células, habitualmente durante un periodo de por lo menos aproximadamente un día, más habitualmente durante un periodo de por lo menos aproximadamente varios días a varias semanas.
[0089] Las varias manipulaciones pueden llevarse a caboin vitroo pueden realizarse en un huésped adecuado, por ejemplo, E. coli. Después de cada manipulación, el constructo resultante puede clonarse, aislarse el vector y cribarse o secuenciarse el ADN para garantizar la corrección del constructo. La secuencia puede cribarse mediante análisis de restricción, secuenciación o similares.
[0091] El CD47 soluble puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción ácida, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía de fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de afinidad con proteína G, por ejemplo, la cromatografía con hidroxiapatita y la cromatografía con lectina. Lo más preferible es emplear cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") para la purificación.
[0093] El CD47 soluble también puede recuperarse a partir de: productos de células purificadas, ya sean aisladas directamente o cultivadas; productos de procedimientos de síntesis química; y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos.
[0095] Para obtener una respuesta diferencial a las distintas concentraciones pueden realizarse una pluralidad de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones. Como se sabe en la técnica, la determinación de la concentración eficaz de un agente usa típicamente un intervalo de concentraciones resultante de diluciones 1:10 u otra escala logarítmica. Las concentraciones pueden refinarse aún más con una segunda serie de diluciones, si es necesario. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección del agente, o a la concentración o por debajo de la concentración del agente que no produzca un cambio detectable en la unión.
[0097] Los compuestos de interés para el cribado incluyen agentes biológicamente activos de numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, aunque en algunos casos también se incluyen moléculas inorgánicas, moléculas organometálicas, inmunoglobulinas, proteínas CD47 quiméricas, proteínas relacionadas con CD47, secuencias genéticas, etc. También son de interés las moléculas orgánicas pequeñas, que comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, en particular enlaces de hidrógeno, y que típicamente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, incluyendo péptidos, polinucleótidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.
[0099] Los compuestos se obtienen de una amplia variedad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, hay disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos, incluyendo biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Alternativamente, hay disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales, o pueden producirse fácilmente. Además, las bibliotecas y los compuestos naturales o producidos sintéticamente se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales.
[0101] Por "manipulación de la fagocitosis" se entiende una regulación al alza o una regulación a la baja de la fagocitosis de por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80%, o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención. Por lo tanto, en el contexto de la disminución de la fagocitosis de las células hematopoyéticas circulantes, particularmente en un contexto de trasplante, manipular la fagocitosis significa una regulación a la baja de la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70%, o un 80%, o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención.
[0103] Inhibidores de CD47. Los agentes de interés como inhibidores de CD47 incluyen miembros de unión específicos que impiden la unión de CD47 con el receptor SIRPα. El término "miembro de unión específico" o "miembro de unión", como se usa en la presente, se refiere a un miembro de un par de unión específico, es decir, dos moléculas, habitualmente dos moléculas diferentes, en donde una de las moléculas (es decir, el primer miembro de unión específico) se une específicamente a la otra molécula (es decir, el segundo miembro de unión específico) por medios químicos o físicos. Los inhibidores de CD47 útiles en los métodos de la divulgación incluyen análogos, derivados y fragmentos del miembro de unión específico original.
[0105] En la invención, el miembro de unión específico es un anticuerpo. Se pretende que el término "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica con una forma específica que se adapte y reconozca un epítopo, en donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. Los anticuerpos utilizados en la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales porque pueden reproducirse mediante cultivo celular o recombinantemente, y pueden modificarse para reducir su antigenicidad.
[0107] Los anticuerpos policlonales pueden generarse mediante un protocolo estándar inyectando una composición antigénica a un animal de producción. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Cuando se utiliza una proteína completa, o una sección más grande de la proteína, los anticuerpos pueden generarse inmunizando al animal de producción con la proteína y un adyuvante adecuado (por ejemplo, Freund, Freund completo, emulsiones de aceite en agua, etc.). Cuando se utiliza un péptido más pequeño, es ventajoso conjugar el péptido con una molécula más grande para elaborar un conjugado inmunoestimulador. Las proteínas conjugadas utilizadas comúnmente disponibles en el mercado para dicho uso incluyen la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de lapa californiana (KLH). Para generar anticuerpos contra epítopos particulares, pueden utilizarse péptidos derivados de la secuencia completa. Alternativamente, para generar anticuerpos contra porciones peptídicas relativamente cortas de la proteína diana, puede provocarse una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, como la ovoalbúmina, la BSA o la KLH. Alternativamente, para los anticuerpos monoclonales, pueden formarse hibridomas aislando las células inmunitarias estimuladas, como las del bazo del animal inoculado. A continuación, estas células se fusionan con células inmortalizadas, como células de mieloma o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una línea celular inmortal secretora de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos pueden producirse mediante ingeniería genética. Para su uso en la presente invención se prefieren los anticuerpos humanos humanizados, quiméricos o xenogénicos, que producen una menor respuesta inmunitaria cuando se administran a humanos.
[0109] Además de las inmunoglobulinas completas (o sus homólogas recombinantes), los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab')<2>u otros fragmentos) son útiles como fracciones de anticuerpo en la presente invención. Tales fragmentos de anticuerpo pueden generarse a partir de inmunoglobulinas completas mediante ricina, pepsina, papaína u otra escisión de proteasa. Los "fragmentos" o inmunoglobulinas mínimas pueden diseñarse utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse enlazando una región variable de cadena ligera con una región variable de cadena pesada a través de un conector peptídico (por ejemplo, poliglicina u otra secuencia que no forme un motivo de hélice alfa o lámina beta).
[0111] La eficacia de un inhibidor de CD47 se evalúa analizando la actividad de CD47. Se usan los ensayos mencionados anteriormente o versiones modificadas de los mismos. En un ensayo ejemplar, las SC de LMA se incuban con macrófagos derivados de la médula ósea, en presencia o ausencia del agente candidato. Un inhibidor de CD47 de la superficie celular regulará al alza la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70%, o un 80%, o hasta aproximadamente un 90% en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente candidato. De manera similar, un ensayoin vitropara determinar los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPα mostrará una disminución de la fosforilación de por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70%, o un 80%, o hasta aproximadamente un 90%, en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.
[0113] En un caso, el agente, o una composición farmacéutica que comprenda el agente, se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir de manera detectable la unión de CD47 al receptor SIRPα presente en la superficie de las células fagocíticas. La cantidad eficaz se determina mediante pruebas empíricas rutinarias en la técnica. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la cantidad de células que se trasplanten, el sitio del trasplante y factores específicos del receptor del trasplante.
[0115] Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en la presente para referirse a una célula que es capaz de realizar fagocitosis. Hay tres categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.
[0117] El término "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o monitorización. El término abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, como espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. El término abarca muestras que han sido manipuladas de cualquier manera después de su obtención, como por ejemplo mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes. El término abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido.
[0119] Las células madre hematopoyéticas (HSC), como se usan en la presente, se refieren a una población de células que tienen la capacidad de autorrenovarse y dar lugar a todos los linajes hematopoyéticos. Tales poblaciones celulares se han descrito con detalle en la técnica. Las células progenitoras hematopoyéticas incluyen los progenitores comprometidos con la línea mieloide (CMP), los progenitores comprometidos con la línea linfoide (CLP), los progenitores de megacariocitos y los progenitores multipotentes. La célula restringida a linaje linfoide más temprana conocida en la médula ósea de ratón adulto es el progenitor común de linfocitos (CLP), y la célula restringida a linaje mieloide más temprana conocida es el progenitor mieloide común (CMP). De manera importante, estas poblaciones celulares poseen un nivel extremadamente alto de fidelidad de linaje en ensayos de desarrolloin vitroein vivo. Una descripción completa de estos subconjuntos celulares puede encontrarse en Akashi et al. (2000) Nature 404(6774):193, Patente de Estados Unidos Nº 6.465.247; y la solicitud publicada USSN 09/956.279 (progenitor mieloide común); Kondo et al. (1997) Cell 91(5):661-7, y la Solicitud internacional WO99/10478 (progenitor linfoide común); y revisado por Kondo et al. (2003) Annu Rev Immunol. 21:759-806. La composición puede congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante periodos de tiempo prolongados, pudiéndose utilizar tras su descongelación. Para dicha composición, las células se almacenarán habitualmente en un medio con un 10% de DMSO, un 50% de FCS y un 40% de RPMI 1640.
[0121] Las poblaciones de interés para su uso en los métodos de la divulgación incluyen composiciones sustancialmente puras, por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 50% de HSC, por lo menos aproximadamente un 75% de HSC, por lo menos aproximadamente un 85% de HSC, por lo menos aproximadamente un 95% de HSC o más; o pueden ser combinaciones de una o más poblaciones de células madre y progenitoras, por ejemplo, glóbulos blancos obtenidos por aféresis, etc. Cuando se desean poblaciones celulares purificadas, la población objetivo puede purificarse de acuerdo con técnicas conocidas. Por ejemplo, una población que contiene glóbulos blancos, que incluye particularmente muestras de sangre o médula ósea, se tiñe con reactivos específicos para marcadores presentes en células madre y progenitoras hematopoyéticas, marcadores que son suficientes para distinguir los principales grupos de células madre y progenitoras. Los reactivos, por ejemplo, anticuerpos, pueden marcarse de manera detectable o pueden marcarse indirectamente en el procedimiento de tinción.
[0123] Puede usarse cualquier combinación de marcadores que sea suficiente para seleccionar las células madre/progenitoras de interés. Una combinación de marcadores de interés puede incluir CD34 y CD38, que distingue las células madre hematopoyéticas (CD34<+>, CD38<->de las células progenitoras, que son CD34<+>, CD38<+>). Las HSC son negativas para los marcadores de linaje y positivas para la expresión de CD90.
[0124] En el linaje mieloide hay tres poblaciones celulares, denominadas CMP, GMP y MEP. Estas células son CD34<+>CD38<+>, son negativas para múltiples marcadores de linaje maduro, incluyendo marcadores linfoides tempranos como CD7, CD10 e IL-7R, y se distinguen además por los marcadores CD45RA, una isoforma de CD45 que puede regular negativamente por lo menos algunas clases de señalización del receptor de citoquinas, e IL-3R. Estas características son CD45RA<->IL-3Rα<lo>(CMP), CD45RA<+>IL-3Raα<lo>(GMP) y CD45RA<->IL-3Rα(-) (MEP). Las células CD45RA<->IL-3Rα<lo>dan lugar a GMP y MEP, y por lo menos un tercio genera colonias tanto de GM como de MegE a nivel unicelular. Los tres progenitores del linaje mieloide se tiñen negativamente para los marcadores Thy-1 (CD90), IL-7Rα (CD127) y con un panel de marcadores de linaje, que pueden incluir CD2, CD3, CD4, CD7, CD8; CD10; CD11b; CD14; CD19; CD20; CD56; y glicoforina A (GPA) en humanos y CD2; CD3; CD4; CD8; CD19; IgM; Ter110; Gr-1 en ratones. Con la excepción del subconjunto MEP de ratón, todas las células progenitoras son positivas para CD34. En el ratón, todos los subconjuntos de progenitores pueden caracterizarse además como Sca-1 negativo (Ly-6E y Ly-6A) y c-kit alto. En los humanos, los tres subconjuntos son CD38<+>.
[0126] Los progenitores linfoides comunes, CLP, expresan niveles bajos de c-kit (CD117) en su superficie celular. En la técnica se conocen los anticuerpos que se unen específicamente a c-kit en humanos, ratones, ratas, etc. Alternativamente, para identificar las células que expresan c-kit puede usarse el ligando de c-kit, el factor de Steel (Slf),.Las células CLP expresan niveles elevados de la cadena alfa del receptor de IL-7 (CDw127). En la técnica se conocen los anticuerpos que se unen al CDw127 humano o de ratón. Alternativamente, las células se identifican mediante la unión del ligando al receptor, IL-7. Las CLP humanas expresan niveles bajos de CD34. Los anticuerpos específicos para el CD34 humano están disponibles en el mercado y son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Chen et al. (1997) Immunol Rev 157:41-51. Las células CLP humanas también se caracterizan por ser positivas para CD38 y positivas para CD10. El subconjunto CLP también tiene el fenotipo de carecer de expresión de marcadores específicos de linaje, ejemplificados por B220, CD4, CD8, CD3, Gr-1 y Mac-1. Las células CLP se caracterizan por carecer de expresión de Thy-1, un marcador característico de las células madre hematopoyéticas. El fenotipo de las CLP puede caracterizarse además como Mel-14-, CD43<lo>, HSA<lo>, CD45<+>y receptor común de citoquinas positivo para la cadena γ.
[0128] Las células progenitoras de megacariocitos (MKP) son positivas para la expresión de CD34 y el antígeno tetraspanina CD9. El antígeno CD9 es una molécula de 227 aminoácidos con 4 dominios hidrófobos y 1 sitio de N-glicosilación. El antígeno se expresa ampliamente, pero no está presente en ciertas células progenitoras en los linajes hematopoyéticos. Las células MKP expresan CD41, también conocida como integrina IIb/IIIa de la glicoproteína, que es el receptor plaquetario para el fibrinógeno y varias otras moléculas de la matriz extracelular, para las que existen anticuerpos disponibles en el mercado, por ejemplo, de BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, número de catálogo 340929, 555466. Las células MKP son positivas para la expresión de CD117, que reconoce el receptor tirosina quinasa c-Kit. Los anticuerpos están disponibles comercialmente, por ejemplo, en BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, número de catálogo 340529. Las células MKP también son negativas para el linaje y negativas para la expresión de Thy-1 (CD90).
[0130] La expresión "tumor sólido", como se usa en la presente, se refiere a una masa anómala de tejido que habitualmente no contiene quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se denominan por el tipo de células que los forman. Ejemplos de tumores sólidos son los sarcomas, los carcinomas, los linfomas, etc.
[0132] Anticuerpos anti-CD47. Ciertos anticuerpos que se unen al CD47 impiden su interacción con el receptor SIRPα. Los anticuerpos incluyen anticuerpos libres y fragmentos de unión a antígenos derivados de los mismos, y conjugados, por ejemplo, anticuerpos pegilados, conjugados de fármacos, radioisótopos o toxinas, y similares.
[0134] Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítopo específico, o una combinación de epítopos, permitirán el direccionamiento y/o la depleción de las poblaciones celulares que expresan el marcador. Para seleccionar poblaciones celulares que expresan el marcador o marcadores pueden utilizarse varias técnicas que usan anticuerpos monoclonales, que incluyen la separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, el "cribado por adhesión (panning)" con anticuerpos unidos a una matriz sólida (es decir, una placa) y la citometría de flujo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.985.660; y Morrison et al. Cell, 96:737-49 (1999)). Estas técnicas permiten el cribado de poblaciones particulares de células; en la inmunohistoquímica de muestras de biopsia; en la detección de la presencia de marcadores liberados por las células cancerosas en la sangre y otros fluidos biológicos, y similares.
[0136] También se encuentran dentro del alcance de la presente invención las versiones humanizadas de dichos anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad.
[0138] La expresión "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo sintético o recombinante que reconoce más de una proteína. Los ejemplos incluyen los anticuerpos biespecíficos 2B1, 520C9xH22, mDX-H210 y MDX447. Los anticuerpos biespecíficos dirigidos contra una combinación de epítopos permitirán el direccionamiento y/o la depleción de poblaciones celulares que expresen la combinación de epítopos. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares incluyen aquellos que se dirigen a una combinación de CD47 y un marcador de células cancerosas como CD96, CD97, CD99, PTHR2, HAVCR2, etc. La generación de anticuerpos biespecíficos se describe en la bibliografía, por ejemplo, en USPN 5989830, USPN 5798229.
[0139] Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se usan en la presente para referirse de manera general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización parcial o total o cura de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular un humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad o el síntoma en un sujeto que pueda estar predispuesto a la enfermedad o al síntoma, pero que aún no se le haya diagnosticado que la tenga; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el síntoma.
[0140] Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente", usados indistintamente en la presente, se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desee un diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular los humanos.
[0141] Una "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a un microorganismo o una célula eucariota o línea celular cultivada como una entidad unicelular que puede ser, o ha sido, usada como receptor de un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que haya sido transfectada. Se entiende que la progenie de una sola célula puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total al progenitor original, debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.
[0142] Los términos "cáncer", "neoplasia", "tumor" y "carcinoma" se usan indistintamente en la presente para referirse a células que muestran un crecimiento relativamente autónomo, de tal manera que presentan un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. En general, las células de interés para la detección o el tratamiento en la presente solicitud incluyen células precancerosas (por ejemplo, benignas), malignas, premetastásicas, metastásicas y no metastásicas. Es de particular interés la detección de células cancerosas. El término "normal", como se usa en el contexto de "célula normal", se entiende que se refiere a una célula de fenotipo no transformado o que presenta una morfología de célula no transformada del tipo de tejido que se está examinando. "Fenotipo canceroso" se refiere de manera general a cualquiera de una variedad de fenómenos biológicos que son característicos de una célula cancerosa, fenómenos que pueden variar según el tipo de cáncer. El fenotipo canceroso se identifica generalmente por anomalías en, por ejemplo, el crecimiento o la proliferación celular (por ejemplo, crecimiento o proliferación incontrolados), la regulación del ciclo celular, la movilidad celular, la interacción célula-célula o la metástasis, etc.
[0143] "Diana terapéutica" se refiere a un gen o producto génico que, tras la modulación de su actividad (por ejemplo, mediante la modulación de la expresión, la actividad biológica y similares), puede proporcionar la modulación del fenotipo canceroso. Como se usa a lo largo del documento, se entiende que "modulación" se refiere a un aumento o una disminución del fenómeno indicado (por ejemplo, la modulación de una actividad biológica se refiere a un aumento de una actividad biológica o a una disminución de una actividad biológica).
[0144] MÉTODOS PARA EL TRASPLANTE
[0145] Se proporcionan métodos para manipular la fagocitosis de las células hematopoyéticas circulantes. En algunos casos, las células circulantes son células madre hematopoyéticas o células progenitoras hematopoyéticas, particularmente en un contexto de trasplante en el que es deseable la protección contra la fagocitosis. En otros casos, las células circulantes son células de leucemia, particularmente leucemia mieloide aguda (LMA), donde es deseable una mayor fagocitosis.
[0146] En algunos casos, las células progenitoras o madre hematopoyéticas se protegen de la fagocitosis en la circulación proporcionando al animal huésped una molécula mimética de CD47, que interactúa con SIRPα en los macrófagos y disminuye la fagocitosis de los macrófagos. El mimético de CD47 puede ser CD47 soluble; CD47 recubierto en la superficie de las células que se van a proteger, un mimético de CD47 que se une a SIRPα en el sitio de unión de CD47, y similares. En algunos casos, el CD47 se proporciona como una proteína de fusión, por ejemplo, CD47 soluble fusionado con un fragmento Fc, por ejemplo, Fc de IgG1, Fc de IgG2, Fc de IgA,etc.
[0147] En la técnica son bien conocidos los métodos para generar proteínas que carecen de la región transmembrana. Por ejemplo, un CD47 soluble puede generarse introduciendo un codón de parada inmediatamente antes de la secuencia de polinucleótidos que codifica la región transmembrana. Alternativamente, la secuencia polinucleotídica que codifica la región transmembrana puede sustituirse por una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de fusión, como Fc de IgG1. Las secuencias de fragmentos Fc de diferentes fuentes están disponibles a través de bases de datos de acceso público, que incluyen Entrez, Embl, etc. Por ejemplo, el ARNm que codifica el fragmento Fc de IgG1 humana se proporciona con el número de acceso X70421.
[0148] En la presente se divulgan métodos para trasplantar células progenitoras o madre hematopoyéticas a un receptor mamífero. La necesidad de un trasplante puede estar provocada por condiciones genéticas o ambientales, por ejemplo, quimioterapia, exposición a radiación, etc. Las células para el trasplante pueden ser mezclas de células, por ejemplo, linfocitos de la capa leucocitaria de un donante, o pueden ser parcial o sustancialmente puras. Las células pueden ser células autólogas, especialmente si se extraen antes de la terapia citorreductora u otra terapia, o células alogénicas, y pueden usarse para el aislamiento de células progenitoras o madre hematopoyéticas y su posterior trasplante.
[0149] Las células pueden combinarse con el mimético soluble de CD47 antes de su administración. Por ejemplo, las células pueden combinarse con el mimético a una concentración de entre aproximadamente 10 µg/ml, aproximadamente 100 µg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, etc., a una temperatura de aproximadamente 4ºC, aproximadamente 10ºC, aproximadamente 25ºC, aproximadamente 37ºC, durante un periodo de tiempo suficiente para recubrir las células donde, en algunas realizaciones, las células se mantienen en hielo. En otras realizaciones, las células se ponen en contacto con el mimético de CD47 inmediatamente antes de su introducción en el receptor, donde las concentraciones del mimético son las descritas anteriormente.
[0150] La composición que comprende células progenitoras o madre hematopoyéticas y un mimético de CD47 se administra en cualquier medio fisiológicamente aceptable, normalmente por vía intravascular, aunque también pueden introducirse en el hueso u otro sitio conveniente, donde las células pueden encontrar un sitio adecuado para la regeneración y la diferenciación. Habitualmente, se administrarán por lo menos 1x10<5>células, preferiblemente 1x10<6>o más. La composición puede introducirse mediante inyección, catéter o similar.
[0151] TRASTORNOS MIELOPROLIFERATIVOS, LEUCEMIAS Y SÍNDROME MIELODISPLÁSICO
[0152] Las leucemias agudas son leucemias que progresan rápidamente que se caracterizan por la sustitución de la médula ósea normal por células blásticas de un clon que surge de la transformación maligna de una célula hematopoyética. Las leucemias agudas incluyen la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y la leucemia mieloide aguda (LMA). La LLA afecta a menudo al SNC, mientras que la leucemia monoblástica aguda afecta a las encías y la LMA provoca acumulaciones localizadas en cualquier sitio (sarcomas granulocíticos o cloromas).
[0153] Los síntomas que se presentan habitualmente son inespecíficos (por ejemplo, fatiga, fiebre, malestar general, pérdida de peso) y reflejan el fallo de la hematopoyesis normal. Son muy comunes la anemia y la trombocitopenia (del 75 al 90%). El recuento de leucocitos puede estar disminuido, ser normal o estar aumentado. Las células blásticas se encuentran frecuentemente en el frotis sanguíneo, a menos que el recuento de leucocitos esté notablemente disminuido. Los blastos de la LLA pueden distinguirse de los de la LMA mediante estudios histoquímicos, citogenéticos, de inmunofenotipado y estudios de biología molecular. Además de los frotis con las tinciones habituales, se usan transferasa terminal, mieloperoxidasa, negro de Sudán B y esterasa específica y no específica.
[0154] La LLA es la neoplasia maligna más común en los niños, con un pico de incidencia entre los 3 y los 5 años. También se da en adolescentes y tiene un segundo pico más bajo en adultos. El tratamiento típico hace hincapié en la introducción temprana de un régimen intensivo con múltiples fármacos, que puede incluir prednisona, vincristina, antraciclina o asparaginasa. Otros fármacos y combinaciones son la citarabina y el etopósido, y la ciclofosfamida. La recaída se produce habitualmente en la médula ósea, pero también puede producirse en el SNC o en los testículos, sola o concurrente con la médula ósea. Aunque en muchos niños pueden inducirse segundas remisiones, las remisiones posteriores tienden a ser breves.
[0155] La incidencia de la LMA aumenta con la edad; es la leucemia aguda más común en adultos. La LMA puede estar asociada con la quimioterapia o la irradiación (LMA secundaria). Las tasas de inducción de la remisión son más bajas que con la LLA, y según los informes, la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo se produce en solamente del 20 al 40% de los pacientes. El tratamiento difiere mucho del de la LLA ya que la LMA responde a menos fármacos. El régimen básico de inducción incluye citarabina, junto con daunorrubicina o idarrubicina. Algunos regímenes incluyen 6-tioguanina, etopósido, vincristina y prednisona.
[0156] La policitemia vera (PV) es un trastorno mieloproliferativo crónico idiopático que se caracteriza por un aumento de la concentración de Hb y de la masa de glóbulos rojos (eritrocitosis). La PV se da en aproximadamente 2,3/100.000 personas al año, con mayor frecuencia en hombres (aproximadamente 1,4:1). La edad media en el momento del diagnóstico es de 60 años (intervalo, 15 a 90 años; rara vez en la infancia); el 5% de los pacientes tienen <40 años en el momento de la aparición. La médula ósea a veces parece normal, pero habitualmente es hipercelular; la hiperplasia afecta a todos los elementos de la médula y sustituye a la grasa de la médula. Hay un aumento de la producción y el recambio de glóbulos rojos, neutrófilos y plaquetas. Puede haber un aumento de megacariocitos en aglomerados. El hierro de la médula está ausente en >90% de los pacientes, incluso cuando no se ha realizado flebotomía.
[0157] Los estudios de mujeres con PV que son heterocigotas en el locus ligado al cromosoma X para G6PD han demostrado que los glóbulos rojos, los neutrófilos y las plaquetas tienen la misma isoenzima G6PD, lo que respalda un origen clonal de este trastorno a nivel de células madre pluripotentes.
[0158] Eventualmente, aproximadamente el 25% de los pacientes presentan una reducción de la supervivencia de los glóbulos rojos y no logran aumentar adecuadamente la eritropoyesis, desarrollan anemia y mielofibrosis. La hematopoyesis extramedular se produce en el bazo, el hígado y otros sitios con potencial para la formación de células sanguíneas.
[0159] Sin tratamiento, el 50% de los pacientes sintomáticos fallecen en el plazo de 18 meses desde el diagnóstico. Con tratamiento, la mediana de supervivencia es de 7 a 15 años. La trombosis es la causa más común de muerte, seguida de las complicaciones de la metaplasia mieloide, hemorragia y desarrollo de leucemia.
[0160] La incidencia de transformación en leucemia aguda es mayor en los pacientes tratados con fosfato radiactivo (<32>P) o agentes alquilantes que en los tratados solo con flebotomía. La PV que se transforma en leucemia aguda es más resistente a la quimioterapia de inducción que la leucemia de novo.
[0161] Como la PV es la única forma de eritrocitosis para la que puede estar indicado el tratamiento mielosupresor, es fundamental realizar un diagnóstico preciso. El tratamiento debe individualizarse de acuerdo con la edad, el sexo, el estado médico, las manifestaciones clínicas y los hallazgos hematológicos.
[0162] El síndrome mielodisplásico (SMD) es un grupo de síndromes (preleucemia, anemias refractarias, leucemia mielocítica crónica negativa para Ph, leucemia mielomonocítica crónica, metaplasia mieloide) que se observan comúnmente en pacientes de edad avanzada. Puede estar implicada la exposición a carcinógenos. El SMD se caracteriza por la proliferación clonal de células hematopoyéticas, incluyendo las formas eritroides, mieloides y megacariocíticas. La médula ósea es normal o hipercelular, y la hematopoyesis ineficaz provoca citopenias variables, siendo la más frecuente la anemia. La producción celular desordenada también se asocia con anomalías morfológicas celulares en la médula y la sangre. Puede producirse hematopoyesis extramedular, lo que lleva a hepatomegalia y esplenomegalia. En ocasiones, hay mielofibrosis en el momento del diagnóstico o puede desarrollarse durante el curso del SMD. El clon del SMD es inestable y tiende a progresar a LMA.
[0163] La anemia es la característica clínica más común, asociada habitualmente con macrocitosis y anisocitosis. Es habitual cierto grado de trombocitopenia; en el frotis sanguíneo, las plaquetas varían en tamaño y algunas parecen hipogranulares. El recuento de glóbulos blancos puede ser normal, elevado o reducido. La granularidad citoplasmática de los neutrófilos es anómala, con anisocitosis y una cantidad variable de gránulos. Los eosinófilos también pueden presentar una granularidad anómala. La monocitosis es característica del subgrupo de leucemia mielomonocítica crónica, y en los subgrupos menos diferenciados pueden aparecer células mieloides inmaduras. El pronóstico depende en gran medida de la clasificación y de cualquier enfermedad asociada. La respuesta del SMD a la quimioterapia de la LMA es similar a la de la LMA, después de haber considerado la edad y el cariotipo.
[0164] TRATAMIENTO DEL CÁNCER
[0165] La invención proporciona métodos para reducir el crecimiento de las células cancerosas aumentando su depuración por fagocitosis, mediante la introducción de un agente bloqueador de CD47, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47. Las células cancerosas son células madre de LMA. En otros casos, las células cancerosas pueden ser las de un tumor sólido, como un glioblastoma, un melanoma, etc. Al bloquear la actividad de CD47, se evita la regulación a la baja de la fagocitosis que se encuentra en ciertas células tumorales, por ejemplo, las células de LMA.
[0166] Además de CD47, hemos descubierto una serie de marcadores específicos de las SC de LMA. Estos incluyen CD96, CD97, CD99, PTHR2, HAVCR2, etc. Estos marcadores se han divulgado en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 61/011,324, presentada el 15 de enero de 2008.
[0167] "Reducir el crecimiento de las células cancerosas" incluye, pero no se limita a, reducir la proliferación de las células cancerosas y reducir la incidencia de que una célula no cancerosa se convierta en cancerosa. Puede determinarse fácilmente si se ha logrado una reducción en el crecimiento de las células cancerosas usando cualquier ensayo conocido, que incluyen pero no se limitan a, la incorporación de [(<3>)H]-timidina; el recuento del número de células durante un período de tiempo; la detección y/o medición de un marcador asociado con la LMA, etc.
[0168] Puede evaluarse si una sustancia, o una cantidad específica de la sustancia, es eficaz para tratar el cáncer usando cualquiera de una variedad de ensayos de diagnóstico conocidos para el cáncer que incluyen, pero no se limita a, biopsia, estudios radiográficos de contraste, tomografía computarizada y la detección de un marcador tumoral asociado al cáncer en la sangre del individuo. La sustancia puede administrarse de manera sistémica o local, habitualmente de manera sistémica.
[0169] Como alternativa, un agente, por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico que reduce el crecimiento de las células cancerosas, puede dirigirse a una célula cancerosa mediante la conjugación con el anticuerpo específico contra CD47. Por tanto, en la presente se divulga un método para administrar un fármaco a una célula cancerosa, que comprende administrar un complejo fármaco-anticuerpo a un sujeto, en donde el anticuerpo es específico para un polipéptido asociado al cáncer y el fármaco es uno que reduce el crecimiento de las células cancerosas, una variedad de los cuales se conocen en la técnica. El direccionamiento puede lograrse acoplando (por ejemplo, enlazando, directamente o a través de una molécula conectora, ya sea de manera covalente o no covalente, para formar un complejo fármaco-anticuerpo) un fármaco a un anticuerpo específico para un polipéptido asociado al cáncer. Los métodos de acoplamiento de un fármaco a un anticuerpo son bien conocidos en la técnica y no es necesario detallarlos en la presente.
[0170] En ciertas realizaciones, puede usarse un anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo biespecífico en el que un dominio de unión al antígeno se dirige contra CD47 y el otro dominio de unión al antígeno se dirige contra un marcador de células cancerosas, como CD96, CD97, CD99, PTHR2, HAVCR2, etc.
[0171] La depleción de AMLSC es útil en el tratamiento de la LMA. La depleción puede lograrse mediante varios métodos. La depleción se define como una reducción de la población objetivo de hasta aproximadamente un 30%, o hasta aproximadamente un 40%, o hasta aproximadamente un 50%, o hasta aproximadamente un 75% o más. Una depleción eficaz se determina habitualmente por la sensibilidad de la enfermedad particular a los niveles de la población diana. Por tanto, en el tratamiento de ciertas enfermedades, podría ser beneficios una depleción de incluso aproximadamente del 20% a.
[0172] Para poner en contacto la sangre del pacientein vitrooin vivose usa un agente específico para CD47 que agota específicamente las AMLSC diana, en donde después del paso de contacto, se produce una reducción del número de AMLSC viables en la población diana. Una dosis eficaz de anticuerpos para tal propósito es suficiente para disminuir la población diana al nivel deseado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos para tales propósitos pueden tener una baja antigenicidad en humanos o pueden ser anticuerpos humanizados.
[0173] En la invención, los anticuerpos para agotar la población diana se añaden a la sangre del paciente in vivo. EJEMPLO 1
[0174] CD47 ES UN MARCADOR DE LEUCEMIAS MIELODES
[0175] Materiales y métodos
[0176] Inmunohistoquímica.Se realizaron citocentrifugaciones de poblaciones de progenitores mieloides doblemente clasificadas (CMP, GMP), células CD45 RA+ con IL-3Rα alto y células CD14+c-kit+lin- usando un aparato de citocentrifugación Shandon. Las citocentrifugaciones se tiñeron con Giemsa diluido 1/5 con H20 durante 10 minutos, seguido de una tinción con May-Grunwald durante 20 minutos. Las citocentrifugaciones se analizaron con la ayuda de un microscopio Zeiss.
[0177] Muestras de médula ósea y sangre periférica humanas.Se obtuvieron muestras de médula ósea normal con el consentimiento informado de donantes remunerados de entre 20 y 25 años que eran seronegativos para la hepatitis A, B, C y el VIH (All Cells). Las muestras de médula ósea con LMMC se obtuvieron con el consentimiento informado de pacientes no tratados previamente en el Centro Médico de la Universidad de Stanford.
[0178] Análisis citométrico de flujo y clasificación celular de HSC y progenitores mieloides de médula ósea humana.Se extrajeron fracciones mononucleares después de centrifugación por densidad con Ficoll de acuerdo con métodos estándar y se analizaron en fresco o posteriormente a la descongelación rápida de muestras previamente congeladas en 90% de FCS y 10% de DMSO en nitrógeno líquido. En algunos casos, las células CD34+ se enriquecieron a partir de fracciones mononucleares con la ayuda de perlas inmunomagnéticas (kit de aislamiento de progenitores CD34+, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Antes del análisis y la clasificación por FACS, los progenitores mieloides se tiñeron con anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE)-Cy5 específicos del marcador de linaje que incluían CD2 RPA-2.10; CD11b, ICRF44; CD20, 2H7; CD56, B159; GPA, GA-R2 (Becton Dickinson - PharMingen, San Diego), CD3,S4.1;CD4, S3.5; CD7, CD7-6B7; CD8, 3B5; CD10, 5-1B4, CD14, TUK4; CD19, SJ25-C1 (Caltag, South San Francisco, CA) y anti-CD34 conjugado con APC, HPCA-2 (Becton Dickinson-PharMingen), anti-CD38 biotinilado, HIT2 (Caltag), además de anti-IL-3Rα conjugado con PE, 9F5 (Becton Dickinson- ParMingen) y anti-CD45RA conjugado con FITC, MEM56 (Caltag), seguido de tinción con estreptavidina-Texas Red para visualizar las células teñidas con CD38-BIO y resuspensión en yoduro de propidio para excluir las células muertas. Se incluyeron muestras no teñidas y controles de isotipo para evaluar la fluorescencia de fondo.
[0179] Después de la tinción, las células se analizaron y clasificaron usando un FACS Vantage modificado (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) equipado con un láser de colorante de 599 nm y un láser de argón de 488 nm. Las células progenitoras doblemente clasificadas (HSC) se identificaron como CD34+ CD38+ y negativas para el linaje. Los progenitores mieloides comunes (CMP) se identificaron sobre la base de la tinción CD34+ CD38+ IL-3Rα+ CD45RA- lin-, y su progenie, incluyendo los progenitores de granulocitos/macrófagos (GMP), eran CD34+CD38+IL-3Rα+ CD45RA+, mientras que los progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP) se identificaron sobre la base de la tinción CD34+ CD38+ IL-3Rα - CD45RA- lin- (Manz, PNAS 11872).
[0180] Expresión de CD47 por progenitores normales frente a mieloproliferativos y de LMA
[0181] Se obtuvieron muestras de sangre periférica y médula ósea con el consentimiento informado de pacientes con trastornos mieloproliferativos y leucemia mieloide aguda en el Centro Médico de la Universidad de Stanford, de acuerdo con las regulaciones del Comité de Ética de la Investigación (IRB) de Stanford y la Ley de Portabilidad y Responsabilidad de Seguros Médicos (HIPAA). Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica o médula ósea (1-5x10<6>células) con el cóctel de linaje anterior, pero excluyendo CD7, CD11b y CD14. Posteriormente, las muestras se tiñeron con CD14 PE (1/25), CD47 FITC (1/25), CD38 Bio (Bio) y c-kit APC (1/25) o CD34 APC o FITC (1/50) durante 45 minutos, seguido de lavado y tinción con estreptavidina Texas Red (1/25) durante 45 minutos y, finalmente, resuspensión en yoduro de propidio.
[0182] Análisis
[0183] Aquí mostramos que la sobreexpresión de CD47 es característica de la progresión de los trastornos mieloproliferativos humanos a LMA (véanse las Figuras 1 a 5B). El CD47 controla la función de la integrina, pero también la capacidad de los macrófagos para fagocitar células, dependiendo del nivel de expresión de CD47. Por tanto, la expresión aberrante de CD47 puede permitir que las LSC evadan tanto la inmunidad innata como la adaptativa del huésped.
[0184] El análisis de la expresión de CD47 humano se realizó mediante FACS en HSC, progenitores y células positivas para linaje normales, con trastorno mieloproliferativo (MPD) preleucémico o LMA humanas derivadas de médula ósea o sangre periférica. Las muestras de MPD (n = 63) incluyeron policitemia vera (PV; n = 15), metaplasia mieloide pospolicitémica/mielofibrosis (PPMM/MF; n = 5), trombocitemia esencial (ET; n = 8), leucemia mieloide crónica atípica (aLMC; n = 2), LMC (n = 7), leucemia eosinofílica crónica (CEL; n = 1), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC; n = 13) y leucemia mieloide aguda (LMA; n = 12). Como hemos observado en los modelos transgénicos de ratones leucémicos, la progresión de los trastornos mieloproliferativos humanos a LMA (n = 12) se asoció con una expansión del conjunto de GMP (70,6% ± D.E. 2,15) en comparación con la médula ósea normal (14,7% ± D.E.2,3). Además, el análisis FACS reveló que la expresión de CD47 aumentó primero 1,7 veces en la LMA en comparación con las HSC normales y luego aumentó hasta 2,2 veces más que lo normal con el compromiso de los progenitores de la LMA con el linaje mieloide. El CD47 se sobreexpresó en los progenitores primitivos de la LMA y su descendencia, pero no en la mayoría de los MPD (MFI 2,3 ± D.E.0,43) en comparación con la médula ósea normal (MFI 1,9 ± D.E. 0,07). Por lo tanto, el aumento de la expresión de CD47 es un marcador diagnóstico útil para la progresión a LMA y, además, representa una nueva diana terapéutica.
[0185] Ejemplo 2
[0186] Las leucemias humanas y murinas regulan al alza CD47 para evadir la destrucción por los macrófagos
[0187] El CD47 facilita el injerto, inhibe la fagocitosis y se expresa en mayor medida en las LSC de LMA.Determinamos la expresión de CD47 en LSC de LMA humana y HSC normal mediante citometría de flujo. Se analizaron HSC (Lin-CD34+CD38-CD90+) de tres muestras de sangre periférica movilizada humana normal y LSC de LMA (Lin-CD34+CD38-CD90-) de siete muestras de LMA humana para determinar la expresión superficial de CD47 (Figura 6). El CD47 se expresó en niveles bajos en la superficie de las HSC normales; sin embargo, de media, se expresó aproximadamente 5 veces más en las LSC de LMA, así como en los blastos leucémicos a granel.
[0188] El anticuerpo monoclonal anti-CD47 humano estimula la fagocitosis e inhibe el injerto de LSC de LMA.Para comprobar el modelo según el cual la sobreexpresión de CD47 en LSC de LMA evita la fagocitosis de estas células a través de su interacción con SIRPα en las células efectoras, hemos utilizado un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 que se sabe que altera la interacción entre CD47 y SlRPα. Se obtuvo el hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal CD47 antihumano de ratón, denominado B6H12, de la ATCC y se usó para producir anticuerpos purificados. En primer lugar, realizamos ensayos de fagocitosisin vitro. Las LSC de LMA humanas primarias se purificaron mediante FACS a partir de dos muestras de LMA humana y, a continuación, se cargaron con el colorante fluorescente CFSE. Estas células se incubaron con macrófagos derivados de la médula ósea de ratón y se monitorizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 7) y citometría de flujo (Figura 9) para identificar las células fagocitadas. En ambos casos, no se observó fagocitosis en presencia de un anticuerpo de control isotípico; sin embargo, con la adición del anticuerpo anti-CD47 se detectó una fagocitosis significativa (Figura 9). Por tanto, el bloqueo del CD47 humano con un anticuerpo monoclonal es capaz de estimular la fagocitosis de estas células por los macrófagos de ratón.
[0189] A continuación, investigamos la capacidad del anticuerpo anti-CD47 para inhibir el injerto de LSC de LMAin vivo.Dos muestras primarias de LMA humana o no se trataron o se recubrieron con el anticuerpo anti-CD47 antes de su trasplante en ratones NOG recién nacidos. Trece semanas después, los ratones se sacrificaron y se analizó el injerto de médula ósea leucémica humana mediante citometría de flujo (Figura 10). Los ratones de control mostraron injerto leucémico, mientras que los ratones trasplantados con las células recubiertas con anti-CD47 mostraron poco o ningún injerto. Estos datos indican que el bloqueo del CD47 humano con un anticuerpo monoclonal es capaz de inhibir el injerto de LSC de LMA.
[0191] La CD96 es una molécula de superficie celular específica de las células madre de la leucemia mieloide aguda humana.CD96, originalmente denominada Tactile, se identificó por primera vez como una molécula de superficie de las células T que se regula al alza significativamente tras la activación de las células T. CD96 se expresa en niveles bajos en las células T y NK en reposo y se regula al alza significativamente tras la estimulación en ambos tipos de células. No se expresa en otras células hematopoyéticas, y el examen de su patrón de expresión mostró que solo está presente en algunos epitelios intestinales. El dominio citoplasmático de CD96 contiene un motivo ITIM putativo, pero se desconoce si este funciona en la transducción de señales. CD96 promueve la adhesión de las células NK a las células diana que expresan CD155, lo que da como resultado la estimulación de la citotoxicidad de las células NK activadas.
[0193] Expresión preferencial en la superficie celular de moléculas identificadas a partir del análisis de la expresión génica.Además de CD47 y CD96, se sabe que varias moléculas descritas en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 61/011,324 se expresan en las LSC de la LMA, incluyendo: CD123, CD44, CD99 y CD33.
[0195] La progresión tumoral se caracteriza por varias características distintivas, que incluyen la independencia de las señales de crecimiento, la inhibición de la apoptosis y la evasión del sistema inmunitario, entre otras. Aquí demostramos que la expresión de CD47, un ligando del receptor de la proteína reguladora de la señal inhibidora de los macrófagos alfa (SIRPα), aumenta en la leucemia mieloide humana y murina y permite a las células evadir la fagocitosis y aumentar su potencial tumorigénico. El CD47, también conocido como proteína asociada a la integrina (IAP), es una pentaspanina transmembrana similar a la inmunoglobulina que se expresa en gran medida en los tejidos de los mamíferos. Aportamos pruebas de que el CD47 está regulado al alza en las células madre y progenitoras de la leucemia mieloide en ratones y humanos, así como en los blastos leucémicos. En consonancia con la función biológica de CD47 en el desarrollo y mantenimiento de la leucemia mieloide, demostramos que la sobreexpresión ectópica de CD47 permite que una línea celular de leucemia mieloide crezca en ratones con deficiencia de células T, B y NK mientras que, por el contrario, se depura rápidamente cuando se trasplanta a estos receptores. También se ha demostrado que el potencial leucemogénico de CD47 depende de la dosis, ya que los clones con expresión más alta tienen un mayor potencial de formación de tumores que los clones con expresión más baja. También demostramos que CD47 actúa promoviendo la leucemogénesis al inhibir la fagocitosis de las células de leucemia por los macrófagos.
[0197] El CD47 se regula al alza significativamente en la médula ósea transgénica leucémica Fas<Ipr/Ipr>x hMRP8bcl2 y en ratones leucémicos hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2. Los transcritos de CD47 aumentan en la médula ósea leucémica hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2 entre 3 y 4 veces según la RT-PCR cuantitativa, y entre 6 y 7 veces en la médula leucémica enriquecida con c-Kit en comparación con la médula ósea sana hMRP8bcl2+ (Figura 11e). El bazo leucémico presentaba una expansión de la población de progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP), así como de los subconjuntos de progenitores y células madre c-Kit+ Sca-1+ Lin-, en comparación con los ratones de control, que tenían el mismo genotipo que los ratones leucémicos, pero no desarrollaron la enfermedad (Figura 11a-d). Se descubrió que los niveles de expresión de la proteína CD47 comenzaban a aumentar en los ratones leucémicos con respecto a los ratones de control en la etapa de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSC) Flk2- CD34-c-Kit+ Sca-1+ Lin- (Figura 11f). Este nivel aumentado de expresión se mantuvo en las GMP y los blastos Mac-1+, pero no en los progenitores restringidos a megacariocitos/eritroides (MEP) (Figura 11f). El aumento de CD47 entre las células de leucemia y las normales fue de entre 3 y 20 veces. Todos los ratones que desarrollaron leucemia que hemos examinado de ratones trasplantados hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2 (n = 3) y secundarios (n = 3), ratones primarios Fas<Ipr/Ipr>x hMRP8bcl2 primarios (n = 14) y secundarios (n = 19), y ratones primarios hMRP8bcl2 x hMRP8bcl2 (n = 3) y secundarios (n = 12) presentaban una expresión aumentada de CD47. También hemos descubierto un aumento de la expresión de CD47 en ratones que recibieron células de médula ósea de ratón transducidas con retrovirus p210bcr/abl y que desarrollaron leucemia.
[0199] Se realizó un análisis mediado por FACS de las poblaciones de progenitores hematopoyéticos humanos en sangre y médula derivadas de sangre de cordón umbilical normal y sangre periférica movilizada (n = 16) y trastornos mieloproliferativos (MPD), incluyendo policitemia vera (PV; n = 16), mielofibrosis (MF; n = 5), trombocitemia esencial (ET; n = 7), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC; n = 11) y leucemia mieloide crónica atípica (aLMC; n = 1), así como leucemia mieloide crónica en fase de crisis blástica (LMC; n = 19), LMC en fase crónica (n = 7) y leucemia mieloide aguda (AML; n = 13). Este análisis demostró que los progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP) se expandían en los MPD con potencial de diferenciación mieloide sesgada, incluyendo la LMC atípica, la LMMC en fase proliferativa y la leucemia aguda, incluyendo la LMC en crisis blástica y la LMA (Figura 12a). Las HSC y los progenitores de MA mostraron de manera uniforme niveles más altos de expresión de CD47 en comparación con los controles normales (Figura 12b); todas las muestras de LMC-BC y LMA tenían niveles elevados de CD47. Además, la progresión de la LMC en fase crónica a la crisis blástica se asoció con un aumento significativo de la expresión de CD47 (Figura 12c). Usando los métodos descritos en este estudio, hemos descubierto que la expresión de la proteína CD47 humana en la LMC-BC aumentó 2,2 veces en las células CD90+ CD34+ CD38-Lin- con respecto a las normales (p = 6,3 x 10<-5>), 2,3 veces en las células CD90- CD34+ CD38- Lin- con respecto a las normales (p = 4,3 x 10<-5>) y 2,4 veces en las células CD 34+ CD38+ Lin- (p = 7,6 x 10<-6>) (Figuras 12b-12c); sin embargo, usando un protocolo de tinción optimizado más reciente, hemos observado que CD47 aumenta aproximadamente 10 veces en la LMA y la LMC-BC en comparación con las HSC y los progenitores humanos normales.
[0201] A continuación, se planteó la pregunta de si la expresión forzada de CD47 de ratón en células de leucemia humanas conferiría una ventaja competitiva en la formación de tumores en ratones. Las células MOLM-13, derivadas de un paciente con LMA 5a, se transducían con Tet-MCS-IRES-GFP (Tet) o Tet-CD47-MCS-IRES-GFP (Tet-CD47) (Figura 13a), y los integrantes estables se propagaban sobre la base de la expresión de GFP. A continuación, las células se trasplantaron por vía intravenosa en un entorno competitivo con células MOLM-13 no transducidas en ratones T, B y NK deficientes en el gen 2 de activación de la recombinación, deficientes en la cadena gamma común (RAG2-/-, Gc-/-). Solo las células transducidas con Tet-CD47 fueron capaces de dar lugar a tumores en estos ratones, injertándose eficazmente en la médula ósea, el bazo y la sangre periférica (Figuras 13a-b). Los tumores también se caracterizaron por una gran carga tumoral en el hígado (Figuras 13b, 13g), lo que es particularmente significativo porque se piensa que el hígado es el órgano con mayor número de macrófagos, y se estima que las células de Kupffer pueden constituir el 80% de la población total de macrófagos del tejido. Estas células también constituyen el 30% del revestimiento sinusoidal, situándolas de este modo estratégicamente en los puntos de entrada al hígado. Por lo tanto, un injerto significativo ahí tendría que deshabilitar la respuesta citotóxica de los macrófagos. Además de desarrollar nódulos tumorales, las células MOLM-13 Tet-CD47 mostraron patrones de afectación hepática típicos de la LMA humana, con células de leucemia que se infiltraban en el hígado con un patrón sinusoidal y perivenoso. (Figura 13d). En general, los ratones trasplantados con MOLM-13 Tet-CD47 murieron más rápidamente que los ratones trasplantados con MOLM-13 Tet, que prácticamente no presentaron injerto de células de leucemia en los tejidos hematopoyéticos (Figura 13c). Los ratones MOLM-13-Tet siguieron presentando una mortalidad significativa, muy probablemente debido al crecimiento localizado en el lugar de la inyección (seno retroorbitario) con extensión al cerebro.
[0203] Como se ha demostrado que el CD47 es importante para la migración de las células hematopoyéticas y se sabe que modula la unión a las proteínas de la matriz extracelular, ya sea por interacción directa o a través de su efecto sobre las integrinas, una posibilidad para explicar la falta de crecimiento de las células MOLM-13 Tet en ratones era su incapacidad para migrar a los nichos. Para comprobar esta posibilidad, se inyectaron directamente células MOLM-13 Tet o MOLM-13 Tet-CD47 en la cavidad femoral de ratones inmunodeficientes. Las células MOLM-13 Tet-CD47 fueron capaces de injertarse en todos los huesos y otros tejidos hematopoyéticos de los ratones receptores, mientras que las células MOLM-13 Tet tuvieron un injerto mínimo, si es que hubo alguno, solo en el sitio de la inyección (Figura 13e). Los ratones trasplantados de esta manera con células MOLM-13 Tet-CD47 murieron aproximadamente entre 50 y 60 días después del trasplante (n = 4), mientras que los ratones que recibieron células MOLM-13 Tet (n = 5) permanecieron vivos durante por lo menos 75 días sin signos de enfermedad, momento en el que fueron sacrificados para su análisis. Estos resultados sugieren una función distinta o adicional a la migración o el retorno al lugar de origen del CD47 en el injerto de MOLM-13.
[0205] Se ha demostrado que la ausencia total de CD47 da como resultado la fagocitosis de los eritrocitos y leucocitos murinos trasplantados, debido a la falta de interacción con SIRPα en los macrófagos. Por tanto, probamos si la sobreexpresión de CD47 podía prevenir la fagocitosis de células MOLM-13 vivas y no opsonizadas. Incubamos células MOLM-13 Tet o Tet-CD47 con macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) durante 2-24 horas y evaluamos la fagocitosis contando el número de células GFP+ ingeridas bajo un microscopio o evaluando la frecuencia de macrófagos GFP+ usando un citómetro de flujo. La expresión de CD47 redujo drásticamente la depuración de estas células por los macrófagos en todos los puntos temporales analizados, mientras que las MOLM-13-Tet fueron fagocitadas rápidamente de una manera que aumentó con el tiempo (Figuras 14a-c). También inyectamos células MOLM-13 en ratones y analizamos los órganos hematopoyéticos 2 horas después para buscar pruebas de fagocitosis por los macrófagos. Los macrófagos de la médula ósea, el bazo y el hígado tenían una fracción GFP+ más alta cuando se inyectaban células MOLM-13 Tet en comparación con las células que expresaban CD47. Esto indica que la sobreexpresión de CD47 puede compensar las señales profagocíticas ya presentes en las células de leucemia, lo que les permite sobrevivir cuando, de otro modo, serían depuradas por los macrófagos.
[0207] Un informe reciente indica que la falta de reactividad del CD47 entre especies podría mediar los xenorechazos de células trasplantadas. Además, un estudio reciente ha demostrado que el CD47 humano es incapaz de interactuar con el SIRPα de ratones C57BI/6, pero es capaz de reaccionar con el receptor de ratones diabéticos no obesos (NOD), que son más permisivos con el injerto de células humanas que los ratones C57BI/6. Además, también hemos observado que las células HL-60, una línea celular promielocítica humana con niveles más altos de expresión de CD47 humano que MOLM-13, pueden injertarse en ratones y provocar leucemia. Las células Jurkat, una línea celular de linfocitos T humanos de l, tienen niveles muy altos de CD47 humano y son fagocitadas por macrófagos murinosin vitroa una tasa mucho menor que las MOLM-13. Por tanto, nuestros datos indican que la capacidad de las células para injertarse en ratonesin vivoo evadir la fagocitosisin vitropor los macrófagos de ratón se correlaciona con el nivel de expresión de CD47 humano.
[0208] Para modelar el efecto tumorigénico de tener una expresión de CD47 alta frente a baja, clasificamos los clones de células MOLM-13 que expresan CD47 murino en expresores altos y bajos. Cuando se ajustó por el tamaño celular, la densidad de CD47 en las células MOLM-13 CD47<lo>fue aproximadamente igual a la de las células de la médula ósea de ratón, mientras que las células MOLM-13 CD47<hi>tuvieron una expresión aproximadamente 9 veces mayor, un aumento proporcional al cambio observado en la expresión de CD47 en las células de leucemia primarias en comparación con sus homólogas normales (Figura 15a). Cuando se trasplantaron células de alta o baja expresión a los receptores, solo los ratones trasplantados con células de alta expresión sucumbieron a la enfermedad a los 75 días de edad (Figura 15c). Además, la organomegalia fue más pronunciada en los ratones trasplantados con células de alta expresión (Figura 15d). Los ratones que recibieron células MOLM-13 CD47<lo>seguían presentando masas hepáticas notables. Sin embargo, las masas eran invariablemente 1-2 nódulos grandes que estaban bien encapsulados y físicamente segregados del parénquima hepático, en marcado contraste con las masas tumorales de las células MOLM-13 CD47hi, que consistían en cientos de pequeñas masas dispersas por todo el parénquima. Por tanto, estas grandes masas tumorales consisten en células que han encontrado nichos libres de macrófagos para crecer separadas del cuerpo principal del órgano. Como era de esperar, la infiltración de células MOLM-13 en la médula ósea y el bazo de los ratones receptores fue mucho mayor en los ratones trasplantados con células MOLM-13 CD47<hi>(Figura 15e). También examinamos el nivel de expresión de CD47 en dos ratones que recibieron células MOLM-13 CD47<lo>, pero que presentaban un injerto significativo en la médula. En ambos casos, las células persistentes después de 75 días tenían niveles mucho más altos de CD47 que la línea original (Figura 15f), lo que indica que existe una fuerte presión de selecciónin vivopara los altos niveles de expresión de CD47 en las células leucémicas. En conjunto, estos datos indican que el nivel de expresión de CD47 es un factor significativo en el potencial tumorigénico y que, en una población heterogénea de células leucémicas, hay una fuerte selección de aquellos clones con alta expresión de CD47.
[0210] A continuación, planteamos la pregunta de si un nivel más alto de expresión de CD47 proporcionaría una protección adicional contra la fagocitosis de los macrófagos. Realizamos un ensayo de fagocitosisin vitrocon células MOLM-13 que expresaban proteína fluorescente roja (RFP) CD47<hi>y CD47<lo>. Después de la incubación con macrófagos, se fagocitó un número mucho mayor de células CD47<lo>en comparación con las células CD47<hi>(Figura 15g). Si se comparan los índices fagocíticos de las células MOLM-13 de control, las células MOLM-13 CD47 a granel (sin clasificar), las células MOLM-13 CD47<lo>y CD47<hi>, se observa una correlación directa entre el nivel de expresión de CD47 y la capacidad de evadir la fagocitosis (Figura 14a, Figura 15f). Además, cuando las células MOLM-13 RFP CD47<lo>y las células MOLM-13 GFP CD47<hi>se coincubaron con macrófagos en los mismos pocillos, las células de baja expresión eran mucho más propensas a ser fagocitadas (Figura 15h, 15i). Por lo tanto, en una población mixta de células con diferentes niveles de expresión de CD47, es más probable que las células con baja expresión sean depuradas por depuración por fagocitosis con el tiempo.
[0212] También titulamos la expresión de CD47 usando otro método. Como CD47 se expresa en las células MOLM-13 usando un sistema Tet-OFF, para controlar la expresión de CD47 en las células MOLM-13 utilizamos el elemento promotor inducible por Tet. Dos semanas después del trasplante con células MOLM-13 CD47<hi>, se administró doxiciclina a una cohorte de ratones y se les realizó un seguimiento hasta 75 días después del trasplante. Durante este periodo, ninguno de los ratones a los que se les había administrado doxiciclina sucumbió a la enfermedad ni presentó una gran infiltración de células MOLM-13 en los órganos hematopoyéticos (Figuras 15b-d). A las dosis de doxiciclina usadas en este experimento, la expresión de muCD47 en las células MOLM-13 se redujo a niveles por debajo de los de la médula ósea normal de los ratones, pero cabe destacar que no desapareció por completo (Figura 15b). Por tanto, se requiere un nivel elevado y sostenido de expresión de CD47 para que la supervivencia robusta de las células MOLM-13 en los órganos hematopoyéticos.
[0214] En la bibliografía se han descrito muchos ejemplos de depuración de tumores por células T, B y NK, lo que indica que un sistema inmunitario sano es esencial para regular el crecimiento de tumores incipientes. Sin embargo, hasta la fecha se han producido pocos ejemplos que indiquen que la fagocitosis mediada por macrófagos puede frenar el desarrollo de tumores. En conjunto, nuestros estudios revelan que la expresión ectópica de CD47 puede permitir que células tumorales que de otro modo serían inmunogénicas crezcan rápidamente en un huésped deficiente en células T, B y NK. Además, es probable que esto refleje un mecanismo usado por las leucemias mieloides humanas para evadir el sistema inmunitario del huésped, ya que CD47 se regula al alza de manera consistente en las leucemias mieloides murinas y humanas, incluyendo todas las formas de leucemia mieloide crónica y aguda probadas hasta la fecha. Por tanto, parece probable que las células tumorales sean capaces de ser reconocidas como diana por los macrófagos activados y depuradas mediante fagocitosis. Al regular al alza el CD47, los cánceres son capaces de escapar a esta forma de vigilancia tumoral del sistema inmunitario innato.
[0216] Esta forma de evasión inmunitaria es especialmente importante, ya que estos cánceres ocupan a menudo sitios con una alta infiltración de macrófagos. El CD47 se clonó por primera vez como marcador de células tumorales ováricas, lo que indica que también puede desempeñar una función en la prevención de la fagocitosis de otros cánceres de tejidos. Además, los tumores sólidos a menudo hacen metástasis en tejidos ricos en macrófagos, como el hígado, los pulmones, la médula ósea y los ganglios linfáticos, lo que indica que deben ser capaces de escapar de la destrucción mediada por los macrófagos en esos tejidos. Por tanto, encontrar métodos para alterar la interacción entre CD47 y SIRPα puede resultar muy útil para desarrollar nuevas terapias contra el cáncer. Impedir la interacción entre CD47 y SIRPα es doblemente eficaz, ya que los antígenos de las células tumorales fagocitadas pueden ser presentados por los macrófagos para activar una respuesta inmunitaria adaptativa, lo que lleva a una mayor destrucción del tumor.
[0218] Métodos
[0220] Ratones.Se crearon ratones transgénicos hMRP8bcrabl, hMRP8bcl2 y Fas<Ipr/Ipr>como se ha descrito anteriormente y se cruzaron para obtener transgénicos dobles. Cruzando entre sí ratones heterocigotos se obtuvieron homocigotos hMRP8bcl2. Como fuente de células de tipo salvaje se usaron ratones C57BI/6 Ka de nuestra colonia. Para los experimentos de trasplante, se trasplantaron células a ratones C57BI/6 RAG2<-/->con cadena gamma común (Gc)<-/->a los que se les administró una dosis de radiación de 4 Gy usando rayos gamma de un irradiador de cesio (Phillips). Las leucemias primarias de ratón se trasplantaron a ratones CD45.2 C57BI6/Ka a los que se les administró una dosis de radiación de 9,5 Gy. Los ratones se sacrificaron cuando se encontraban moribundos.
[0222] Tejidos de ratón.Se lavaronlos huesos largos con PBS suplementado con un 2% de suero fetal bovino como medio de tinción (SM). Los bazos y los hígados se disociaron usando portaobjetos de vidrio esmerilado en SM y, a continuación, se pasaron por una malla de nailon. Todas las muestras se trataron con tampón de lisis ACK para lisar los eritrocitos antes de realizar análisis adicionales.
[0224] Análisis cuantitativo por RT-PCR.Se obtuvo médula ósea de ratones leucémicos hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2 o de ratones de control hMRP8bcl2. Las células se enriquecieron con c-Kit usando microperlas de c-Kit y una columna autoMACS (Miltenyi). El ARN se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) y se realizó la transcripción inversa usando la polimerasa inversa SuperScriptll (Invitrogen). Se usó ADNc correspondiente a aproximadamente 1000 células por reacción de PCR. La PCR cuantitativa se realizó con un kit SYBR green en una máquina ABI Prism 7000 PCR (Applied Biosystems) a 50ºC durante 2 minutos, seguido de 95ºC durante 10 minutos y luego 40 ciclos de 95ºC durante 15 minutos seguidos de 60ºC durante 1 minuto. Como controles para la cantidad de ADNc se usaron betaactina y ARN 18S y se normalizaron los resultados de la expresión de CD47. Las secuencias de los cebadores directos e inversos del ARN 18S fueron TTGACGGAAGGGCACCACCAG y GCACCACCACCCACGGAATCG, respectivamente; para la beta-actina fueron TTCCTTCTTGGGTATGGAAT y GAGCAATGATCTTGATCCTC, y para el CD47 fueron AGGCCAAGTCCAGAAGCATTC y AATCATTCTGCTGCTCGTTGC.
[0226] Muestras de médula ósea y sangre periférica humanas.Se obtuvieron muestras de médula ósea normal con el consentimiento informado de donantes remunerados de entre 20 y 25 años de edad que eran seronegativos para la hepatitis A, B, C y el VIH (All Cells). Las células sanguíneas y de médula ósea fueron donadas por pacientes con leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia mieloide aguda (AML) y se obtuvieron con el consentimiento informado de pacientes que no habían recibido tratamiento previo.
[0228] Líneas celulares.Se obtuvieron células MOLM-13 de DSMZ. Se obtuvieron células HL-60 y Jurkat de ATCC. Las células se mantuvieron en medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) más un 10% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone). Para fraccionar las células MOLM-13 en aquellas con expresión alta y baja de CD47, se tiñeron las células MOLM-13 Tet-CD47 con anticuerpo anti-CD47 de ratón Alexa-680 (mIAP301). El 5% más alto y más bajo de células que expresaban CD47 de ratón se clasificó en un BD FACSAria y se volvió a cultivar en IMDM 10% de FCS durante 2 semanas. Las células se clasificaron en tres rondas más de selección siguiendo el mismo protocolo para obtener las células de alta y baja expresión usadas en este estudio. Para obtener constructos de proteína fluorescente roja (RFP), se clonó el ADN de mCherry RFP en el vector vacío Lentilox 3.7 (pLL3.7). El lentivirus obtenido a partir de este constructo se usó para infectar líneas celulares.
[0230] Tinción celular y citometría de flujo.La tinción de células madre y progenitoras de ratón se realizó usando los siguientes anticuerpos monoclonales: en el cóctel de linajes se usaron Mac-1, Gr-1, CD3, CD4, CD8, B220 y Ter119 conjugados con Cy5-PE (eBioscience), se usaron c-Kit PE-Cy7 (eBioscience), Sca-1 Alexa680 (e13-161-7, producido en nuestro laboratorio), CD34 FITC (eBioscience), CD16/32 (FcGRII/III) APC (Pharmingen) y CD135 (Flk-2) PE (eBioscience) como se ha descrito anteriormente para teñir subconjuntos de células madre y progenitoras de ratón. El anticuerpo CD47 de ratón (clon mIAP301) se evaluó usando un anticuerpo biotinilado producido en nuestro laboratorio. A continuación, las células se tiñeron con Quantum Dot 605 conjugado con estreptavidina (Chemicon). Las muestras se analizaron usando un FACSAria (Beckton Dickinson).
[0232] Para las muestras humanas, se extrajeron fracciones mononucleares después de centrifugación por densidad con Ficoll de acuerdo con métodos estándar y se analizaron en fresco o posteriormente a la descongelación rápida de muestras previamente congeladas en 90% de FCS y 10% de DMSO en nitrógeno líquido. En algunos casos, las células CD34+ se enriquecieron a partir de fracciones mononucleares con la ayuda de perlas inmunomagnéticas (kit de aislamiento de progenitores CD34+, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Antes del análisis y la clasificación por FACS, los progenitores mieloides se tiñeron con anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE)-Cy5 específicos del marcador de linaje, que incluían CD2 RPA-2.10; CD11b, ICRF44; CD20, 2H7; CD56, B159; GPA, GA-R2 (Becton Dickinson - PharMingen, San Diego), CD3,S4.1;CD4, S3.5; CD7, CD7-6B7; CD8, 3B5; CD10, 5-1B4, CD14, TUK4; CD19, SJ25-C1 (Caltag, South San Francisco, CA) y anti-CD34 conjugado con APC, HPCA-2 (Becton DickinsonPharMingen), anti-CD38 biotinilado, HIT2 (Caltag), además de anti-IL-3Rα conjugado con PE, 9F5 (Becton Dickinson-ParMingen) y anti-CD45RA conjugado con FITC, MEM56 (Caltag), seguido de tinción con estreptavidina-Texas Red para visualizar las células teñidas con CD38-BIO.
[0233] Después de la tinción, las células se analizaron usando un FACS Vantage modificado (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) equipado con un láser de colorante de 599 nm y un láser de argón de 488 nm o un FACSAria. Las células madre hematopoyéticas (HSC) se identificaron como CD34+ CD38+ CD90+ y de linaje negativo. Para evaluar la expresión de CD47 en todas las muestras humanas se usó FITC anti-CD47 humano (clon B6H12, Pharmingen). La razón de cambio para la expresión de CD47 se determinó dividiendo la intensidad media de fluorescencia de CD47 para todas las muestras de LMC-BC, LMC-CP o LMA por la intensidad media de fluorescencia de las células normales para una población celular dada. Los progenitores mieloides comunes (CMP) se identificaron basándose en la tinción de CD34+ CD38+ IL-3Rα+ CD45RA- lin-, y su progenie, incluyendo los progenitores de granulocitos/macrófagos (GMP), eran CD34+CD38+IL-3Rα+ CD45RA+ Lin-, mientras que los progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP) se identificaron basándose en la tinción de CD34+ CD38+ IL-3Rα -CD45RA- Lin-.
[0234] Para determinar la densidad de CD47 de ratón o humano, las células se tiñeron con cantidades saturantes de anticuerpo anti-CD47 y se analizaron en un FACSAria. Como la dispersión frontal es directamente proporcional al diámetro celular y la densidad es igual al nivel de expresión por unidad de superficie, usamos el software FloJo para calcular la media geométrica de la intensidad fluorescente del canal CD47 y la dividimos por la media geométrica del valor de dispersión frontal al cuadrado (FSC<2>) para obtener una aproximación de la densidad de expresión de CD47 en la membrana.
[0235] El injerto de células MOLM-13 se evaluó usando anti-CD45 humano PE-Cy7 (Pharmingen), anti-CD45.2 de ratón APC (clon AL1-4A2) y anti-CD47 de ratón Alexa-680 (mIAP301). Todas las muestras se volvieron a suspender en tampón con yoduro de propidio antes del análisis para excluir las células muertas. Los datos FACS se analizaron usando el software FloJo (Treestar).
[0236] Preparación y transducción lentiviral.Se obtuvieron plásmidos pRRL.sin-18.PPT.Tet07.IRES.GFP.pre, CMV, VSV y tet transactivador (tTA) de Luigi Naldini. El ADNc murino de longitud completa para la forma 2 de CD47 fue proporcionado por Eric Brown (UCSF). El constructo del ADNc de CD47 se ligó al sitio BamHI/Nhel de Tet-MCS-IRES-GFP. El ADN plasmídico se transfectó en células 293T usando protocolos estándar. El sobrenadante se recogió y se concentró usando una centrífuga Beckman LM-8 (Beckman). Las células se transdujeron con Tet o Tet-CD47-MCS-IRES-GFP y lentivirus tTA durante 48 horas. Las células GFP+ se clasificaban por pureza y se cultivaban durante varias generaciones para garantizar la estabilidad de los transgenes.
[0237] Inyecciones.Las células se inyectaron por vía intravenosa en los senos retroorbitarios de los ratones receptores o a través de la vena de la cola, como se indica. Para las inyecciones intrafemorales, las células se inyectaron en la cavidad femoral de ratones anestesiados en un volumen de 20 µl usando una aguja de calibre 27. Para anestesiar a los ratones cuando fue necesario se usó una cámara de gas isoflurano.
[0238] Injerto de células MOLM-13.Se sacrificó a los animales cuando estaban moribundos y se extrajeron la médula ósea, el bazo y el hígado. Se obtuvo sangre periférica mediante sangrado de la cola de los animales una hora antes del sacrificio. El injerto de células MOLM-13 en la médula, el bazo y la sangre periférica se determinó como se ha descrito anteriormente. La carga tumoral en el hígado se determinó calculando el área de cada nódulo tumoral visible usando la fórmula ((longitud en mm anchura en mm)/2) *π. A continuación, se sumó el área de cada nódulo por hígado.
[0239] Administración de doxiciclina. Se añadió clorhidrato de doxiciclina (Sigma) al agua potable a una concentración final de 1 mg/ml. El agua potable se sustituyó cada 4 días y se protegió de la luz. Además, los ratones recibieron un bolo de 10 µg de doxiciclina mediante inyección intraperitoneal una vez a la semana.
[0240] Macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM).Se extrajeron fémures y tibias de ratones C57BI/6 Ka, la médula se lavó y se colocó en una suspensión estéril de PBS. La suspensión de médula ósea se cultivó en IMDM más 10% de FBS con 10 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos murinos recombinantes (MCSF, Peprotech) durante entre 7 y 10 días.
[0241] Ensayos de fagocitosis in vitro.Los BMDM se obtuvieron mediante incubación en tripsina/EDTA (Gibco) durante 5 minutos y raspado suave. Los macrófagos se sembraron en placas a 5 x 10<4>células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos (Falcon). Después de 24 horas, se sustituyó el medio por IMDM libre de suero. Después de 2 horas adicionales, se añadieron 2,5 x 10<5>células MOLM-13 Tet o Tet-CD47 a los pocillos que contenían macrófagos y se incubaron a 37ºC durante los tiempos indicados. Después de la coincubación, los pocillos se lavaron concienzudamente con IMDM tres veces y se examinaron con un Eclipse T5100 (Nikon) usando un conjunto de filtros de proteína fluorescente verde (GFP) mejorada o Texas Red (Nikon). Se contó el número de células GFP+ o RFP+ dentro de los macrófagos y se calculó el índice fagocítico usando la fórmula: índice fagocítico = número de células ingeridas/(número de macrófagos/100). Se contaron por lo menos 200 macrófagos por pocillo. Para el análisis de la fagocitosis mediante citometría de flujo, se recogieron los macrófagos después de la incubación con células MOLM-13 usando tripsina/EDTA y un raspado suave. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-Mac-1 PE y se analizaron en un BD FACSAria. Se tomaron imágenes fluorescentes y de campo claro por separado usando una Eclipse T5100 (Nikon), una lámpara de mercurio de presión súper alta (Nikon), un filtro de paso de banda de proteína fluorescente verde endow (eGFP) (Nikon), un filtro de paso de banda Texas Red (Nikon) y una cámara RT Slider (Spot Diagnostics). Las imágenes se fusionaron con el software Photoshop (Adobe).
[0243] Para los ensayos in vivo, se extrajo médula ósea de los huesos largos de las patas, el bazo y el hígado dos horas después de inyectar las células diana en ratones RAG2<-/->,Gc<-/->. Se prepararon en suspensiones de células individuales en PBS más FCS al 2%. Las células se marcaron con anti-CD45 humano conjugado con Cy7-PE y biotina anti-F4/80 de ratón (eBiosciences). Se realizó una tinción secundaria con estreptavidina-APC (eBiosciences). Las células que eran CD45- humanas y F4/80+ se consideraron macrófagos, y en esta fracción se evaluaron las células GFP+.
[0245] EJEMPLO 3
[0247] Las células madre y progenitoras hematopoyéticas regulan al alza CD47 para facilitar la movilización y la migración dirigida a los tejidos hematopoyéticos
[0249] Aquí mostramos que las células madre hematopoyéticas (HSC) de ratones deficientes en CD47 (IAP<-/->) no logran injertarse en receptores de tipo salvaje. Como era de esperar, estas células son depuradas rápidamente por los macrófagos del huésped, mientras que las HSC IAP<+/+>no lo son. Cuando se obliga a las células madre y progenitoras a dividirse e introducirse en la circulación usando ciclofosfamida/G-CSF o lipopolisacárido, el CD47 se regula rápidamente al alza en estas células. Proponemos que los niveles más altos de CD47 en las células madre durante la hematopoyesis y la movilización bajo estrés proporcionan una protección adicional contra la fagocitosis por parte de los macrófagos activados del sistema reticuloendotelial. En apoyo de esta hipótesis, demostramos que las células IAP<+/->trasplantadas a receptores de tipo salvaje pierden el injerto con el tiempo, mientras que las células de donantes de tipo salvaje no lo hacen. Concluimos que la fagocitosis es un mecanismo fisiológico importante que depura los progenitores hematopoyéticos a lo largo del tiempo, y que para prevenir la depuración fagocítica es necesaria la sobreexpresión de CD47.
[0251] Las HSC tienen la capacidad de migrar a nichos ectópicos en la vida fetal y adulta a través del torrente sanguíneo. Además, las HSC pueden ser impulsadas a la circulación usando una combinación de agentes citotóxicos y citoquinas que primero aumentan la cantidad de HSC in situ. Una vez en el torrente sanguíneo, las HSC deben navegar por los lechos vasculares del bazo y el hígado. Los macrófagos de estos sitios funcionan para eliminar las células dañadas y las partículas extrañas del torrente sanguíneo. Además, durante los estados inflamatorios, los macrófagos se vuelven más activos en la fagocitosis. Por lo tanto, es posible que se requiera una protección adicional contra la fagocitosis para las células madre recién llegadas a estos sitios.
[0253] Determinamos si la expresión de CD47 en las células madre y progenitoras de la médula ósea tenía una función en la regulación de la hematopoyesis normal. Se ha demostrado que la expresión de CD47 es esencial para prevenir la fagocitosis de los glóbulos rojos, las células T y las células de la médula ósea en su totalidad en un entorno de trasplante. Por lo tanto, nos preguntamos si la falta de CD47 impediría que las HSC se injertaran después de ser administradas por vía intravenosa. Para comprobarlo, usamos el ratón con deleción del gen CD47 (IAP<-/->). Estos ratones se desarrollan con normalidad y no presentan anomalías graves. Sin embargo, mueren muy rápidamente tras una exposición bacteriana intraperitoneal porque los neutrófilos no migran rápidamente al intestino. Además, las células de estos ratones no se trasplantan a receptores de tipo salvaje, pero sí se injertan en receptores IAP-/-.
[0255] Primero examinamos las frecuencias de células madre y progenitoras en ratones IAP<+/->e IAP<-/->. Al examinar las células del compartimento de células madre y progenitoras mieloides, no se observaron diferencias entre estos ratones y los ratones de tipo salvaje (Figura 18a). A continuación, probamos la capacidad de las células madre de estos ratones para determinar su capacidad de formar colonias en un ensayoin vitro. Clasificamos células madre Flk2-CD34- KLS altamente purificadas de estos ratones y las sembramos en placas en metilcelulosa en presencia de un cóctel de citoquinas estándar. Examinamos la formación de colonias al séptimo día y observamos que no había diferencias significativas entre las células madre de tipo salvaje y las IAP-/- en cuanto a la cantidad y el tipo de colonias formadas (Figura 18b).
[0257] A continuación, nos preguntamos si las células de médula ósea de ratones IAP<-/->podrían rescatar a los ratones receptores de los efectos de la irradiación letal. Típicamente, en este ensayo una dosis de 2 x 10<5>células de médula ósea rescatará al 100% de los ratones receptores de tipo salvaje. Descubrimos que la médula ósea IAP<-/>) no podía rescatar a estos receptores (Figura 18c). Sin embargo, la administración de estas células prolongó la esperanza de vida; normalmente, los ratones mueren entre los días 12 y 15 después de la irradiación, pero los ratones que recibieron médula ósea IAP<-/->vivieron entre 7 y 10 días más (Figura 18c). Aún no conocemos la razón de la prolongación de la vida útil en este caso, aunque hemos observado que los progenitores multipotentes y los progenitores de megacariocitos y eritrocitos pueden prolongar la supervivencia después de una irradiación letal, y que la contribución de estas células tras el trasplante de médula ósea completa puede haber contribuido a la prolongación del tiempo de supervivencia.
[0259] A continuación, clasificamos las células madre Flk-2-CD34-KLS de células de tipo salvaje e IAP<-/->y las trasplantamos a receptores de tipo salvaje junto con 2 x 10<5>células competidoras. Ninguno de los ratones que recibieron HSC IAP<-/->, ni en dosis de 50 ni en dosis de 500, presentó injerto de células donantes, lo que indica que CD47 era en efecto necesario para la capacidad de trasplante de estas células (Figura 18d-e). Especulamos que esto se debía a la fagocitosis de las células que carecían de CD47, como se ha demostrado para los eritrocitos y las células T. Para probar esto, enriquecimos las células c-Kit<+>de la médula ósea de ratones de tipo salvaje e IAP<-/->y las coincubamos con macrófagos derivados de la médula ósea. En este ensayo las células madre y progenitoras IAP<-/->fueron fagocitadas fácilmente, mientras que las células de tipo salvaje solo fueron fagocitadas mínimamente (Figura 18f-g). Curiosamente, cuando se incubaron con macrófagos IAP<-/->, hubo una fagocitosis significativamente menor de las células IAP<-/->, lo que confirma que los macrófagos de estos ratones son realmente anómalos en su capacidad fagocítica.
[0261] Como la movilización de las células madre y progenitoras implica varios pasos en los que entran en contacto con los macrófagos (salida de los sinusoides de la médula, entrada en los sinusoides de la médula y el hígado, y en la zona marginal del bazo), nos preguntamos si CD47 se regula al alza en la médula de los ratones a los que se ha inducido a la movilización. El protocolo más usado implica la administración del fármaco ciclofosfamida (Cy), que destruye las células en división (principalmente progenitoras mieloides), seguido de un tratamiento con factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). Esto implica administrar ciclofosfamida el primer día y luego administrar G-CSF todos los días a partir de entonces. Por convención, el primer día después de la administración de ciclofosfamida se denomina día 0. El número máximo de células madre en la médula ósea se alcanza el día 2; a partir de los días 3-4, estas salen de la médula ósea hacia la periferia, y su cantidad en el bazo y el hígado alcanza un pico el día 5; también se movilizan los progenitores mieloeritroides. Durante la respuesta de movilización se produce un aumento característico de la frecuencia de células madre y progenitores mieloides.
[0263] Por tanto, administramos este protocolo de movilización a ratones de tipo salvaje y sacrificamos a los ratones entre los días 2 a 5. Descubrimos que el día 2 había un aumento notable de CD47 en las células de la médula ósea c-Kit<+>(Figura 19a). Descubrimos que el día 2 de la movilización había un aumento de aproximadamente cuatro veces en el nivel de CD47 en las células madre y progenitoras (Figura 19b). El aumento se observó a todos los niveles de la jerarquía de progenitores mieloides, ya que tanto las LT-HSC como las GMP mostraron este aumento en la expresión de CD47 (Figura 19b). Para el día 5, cuando la salida de la médula se había detenido en gran medida, los niveles de CD47 habían vuelto a niveles casi normales. En la Figura 19c se muestra la intensidad media de fluorescencia de la expresión de CD47 en las GMP entre los días 0 y 5 de la movilización. Los niveles de CD47 son en realidad inferiores a lo normal después de la mieloablación en el día 0, pero aumentan rápidamente hasta alcanzar un pico en el día 2. A partir de entonces, la expresión disminuye rápidamente y los niveles en el día 5 son equivalentes a los del estado estacionario.
[0265] También se piensa que las endotoxinas contribuyen a la movilización de la médula ósea. Esto puede representar una respuesta fisiológica a la infección, en la que es necesario aumentar la producción normal de células inmunitarias de la médula para eliminar los patógenos causantes de la infección. El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias gramnegativas. Se une a la proteína de unión a lípidos (LBP) en el suero, que luego puede formar un complejo con CD1411 y el receptor tipo toll 4 (TLR-4) 12 en monocitos, macrófagos y células dendríticas. Esto da como resultado la activación de los macrófagos y provoca una respuesta proinflamatoria. También se ha demostrado que la administración de LPS aumenta la capacidad fagocítica de los macrófagos. Esto puede deberse al hecho de que los complejos LBP-LPS actúan como opsoninas.
[0267] Probamos si la administración de LPS en ratones afectaría a la expresión de CD47 en las células madre y progenitoras. Reflejando el patrón observado en la movilización inducida por Cy/G, el LPS provocó la expansión de las células madre y progenitoras a los dos días después del tratamiento, seguido de la migración al bazo y al hígado (Figura 19d). Dos días después de la administración de LPS, las células madre y progenitoras de la médula ósea habían regulado al alza el CD47 en un grado similar al de la movilización inducida por Cy/G. Al quinto día, cuando hubo remitido la respuesta inflamatoria, los niveles de la proteína habían descendido a niveles de equilibrio (Figura 19d).
[0269] Como CD47 se regulaba al alza constantemente en la respuesta de movilización, decidimos probar la capacidad de movilización de las células madre y progenitoras después de la administración de Cy/G. El ratón con deleción del gen CD47 presenta defectos en la migración de neutrófilos a los sitios de inflamación y de células dendríticas a los órganos linfoides secundarios. Se desconoce la función exacta de CD47 en la migración de estas células, pero puede estar relacionada con una asociación deficiente de la integrina en la circulación (CD47 se une a varias integrinas) o con la falta de interacción con SIRPα en las células endoteliales. Por lo tanto, razonamos que si CD47 estaba implicado en la capacidad de migración de estas células en la respuesta de movilización, los ratones IAP-/- mostrarían un número reducido de células en los órganos periféricos después de Cy/G.
[0270] Para probar esta hipótesis, administramos Cy/G a ratones tanto de tipo salvaje como con deleción de gen y sacrificamos a los ratones entre los días 2 y 5. Para cada ratón, analizamos la cantidad de células madre y progenitoras en la médula, el bazo y el hígado. Decidimos usar la población KLS bruta como sustituto de las HSC, ya que la cantidad de células CD34- disminuye considerablemente en estados proliferativos, lo que dificulta el cálculo preciso de la cantidad de LT-HSC. Como las GMP son las más expandidas de todas las poblaciones en la movilización, decidimos analizar también su número. Para calcular el recuento absoluto de progenitores, se estimó la celularidad total de la médula, el bazo y el hígado contando la cantidad de células mononucleares en todo el órgano con un hemocitómetro. En el caso de la médula ósea, se asumió que los huesos largos de las patas representaban el 15% de la médula total. A continuación, este número se multiplicó por la frecuencia de la población celular para determinar un recuento absoluto.
[0272] Descubrimos que había poca diferencia en la movilización de KLS o GMP entre los ratones de tipo salvaje y los IAP<-/->(Figura 19e). Se observó una ligera disminución en la capacidad de los ratones IAP<-/->para trasladar progenitores al bazo al tercer día, pero al cuarto y quinto día habían recuperado el número normal de células en la periferia. Los compartimentos de la médula y el hígado tenían un aspecto similar al de los ratones de tipo salvaje. Por lo tanto, los ratones IAP<-/->no presentan un defecto significativo de movilización.
[0274] Los eritrocitos heterocigotos IAP<+/->tienen aproximadamente la mitad de CD47 que los eritrocitos y plaquetas de tipo salvaje. También hay un aumento dependiente de la dosis en la cantidad de fagocitosis que se produce en los eritrocitos y plaquetas IAP<+/->opsonizados con inmunoglobulina con respecto a los de tipo salvaje. Nuestra observación de que los niveles de CD47 aumentan en estados de estrés y movilización nos llevó a plantear la hipótesis de que las células que eran genéticamente hemicigotas para CD47 podrían ser más propensas a la fagocitosis y a la eliminación por los macrófagos con el tiempo. Por lo tanto, planteamos la pregunta de si las células madre IAP<+/->estarían en desventaja con respecto a las células madre de tipo salvaje en la contribución a largo plazo a la hematopoyesis.
[0276] Primero analizamos los niveles de CD47 expresados en las células madre IAP<+/+>, IAP<+/->e IAP<-/->. El análisis FACS de las células madre CD34<->Flk-2<->KLS reveló que el MFI de CD47 en las HSC heterocigotas era, efectivamente, aproximadamente la mitad del nivel de las células madre de tipo salvaje (Figura 20a). A continuación, trasplantamos estas células y examinamos su capacidad para injertarse y producir células hematopoyéticas en un receptor. Administramos a ratones receptores congénicos de tipo salvaje 475 Gy, una dosis subletal de irradiación. A continuación, trasplantamos a una cohorte de receptores 2 x 10<6>células de médula ósea completa de tipo salvaje y a otra la misma dosis de células de médula ósea IAP<+/->. Se esperaba que dicha dosis contuviera aproximadamente entre 50 y 100 HSC. Como el quimerismo de granulocitos en la sangre periférica es un buen marcador sustitutivo de la aptitud de las células madre, analizamos las células de la sangre de estos receptores a intervalos periódicos. Cuando se trasplantó médula de tipo salvaje a receptores de tipo salvaje, el quimerismo en granulocitos se mantuvo hasta 40 semanas. Sin embargo, cuando se trasplantaron células IAP<+/->, 3 de los 5 ratones perdieron el quimerismo del donante con el tiempo, a pesar de que el injerto había sido satisfactorio inicialmente (Figura 20b).
[0278] Hemos observado que el CD47 se regula al alza en la superficie de las células hematopoyéticas en la progresión de la leucemia. También hemos descubierto un aumento análogo en el nivel de expresión de CD47 cuando se estimuló a los ratones para que movilizaran células madre y progenitoras a la periferia usando Cy/G, o cuando se les expuso al LPS. Pero ¿por qué se regula al alza el CD47 en estos estados? Varios estudios han descrito un efecto dependiente de la dosis del CD47 en la prevención de la fagocitosis. Los eritrocitos y plaquetas IAP<+/->, que tienen la mitad del nivel de CD47 que las células de tipo salvaje, son fagocitados más fácilmente que sus homólogos normales. Las pruebas también indican que el nivel de expresión de CD47 en las células se correlaciona bien con la capacidad de la célula para interactuar con el receptor inhibidor SIRPα en los macrófagos. Recientemente, Danska et al informaron de que la capacidad de los ratones NOD-SCID para soportar el trasplante de células hematopoyéticas humanas se correlacionaba con una mutación en el receptor SIRPalfa en estos ratones. Aquí mostramos que las células madre y progenitoras que expresan niveles más altos de CD47 son menos propensas a ser eliminadas por fagocitosis.
[0280] Estos estudios apuntan a la función de la regulación al alza de CD47 en la protección de las células madre hematopoyéticas durante los estados en los que son más propensas a ser fagocitadas por los macrófagos, como después de la mieloablación y durante la movilización. Los macrófagos tienen la función de eliminar las células envejecidas o dañadas que encuentran; parece que también pueden eliminar las células madre dañadas. Por tanto, las células madre sanas en recuperación podrían regular al alza el CD47 durante una respuesta de movilización para evitar su depuración, mientras que las células madre dañadas no lo hacen y son depuradas. Especulamos que este es un mecanismo por el cual el sistema hematopoyético se autorregula para garantizar que solo las células sanas y sin daños puedan sobrevivir, proliferar y utilizar recursos durante estados de alto estrés. La movilización de HSC y progenitores al torrente sanguíneo y, desde allí, a los sitios hematopoyéticos después de una inflamación inducida por LPS es muy interesante; las HSC migran de la sangre a la médula usando la integrina α4β1 (Wagers y Weissman, Stem Cells 24(4):1087-94, 2006) y el receptor de quimiocinas CXCR4 (Wright DE et al., J Exp Med 195(9): 1145-54, 2002). Anteriormente hemos demostrado que la integrina α4β1 se une a la VCAM1 en el estroma hematopoyético (Mikaye K et al. J Exp Med 173(3):599-607, 1991); la VCAM1 es también la adresina vascular en los vasos que las células T inflamatorias usan para reconocer e introducirse en los sitios locales de muerte celular e inflamación. Además de expresar la proteína CD47 asociada a la integrina, las HSC itinerantes expresan la integrina funcional α4β1, lo que lleva a especular que la migración de células madre y progenitoras hematopoyéticas en estados de inflamación pueden no solo volver a sembrar la hematopoyesis de la médula, sino también participar en la inflamación local.
[0281] Materiales y métodos
[0282] Ratones. En nuestra colonia se mantuvieron ratones C57BI/6 CD45.1 y C57BI/6 CD45.2 (tipo salvaje). Los ratones IAP-/- se obtuvieron de Eric Brown (Universidad de California, San Francisco). Estos se criaron en un fondo C57BI6/J y se cruzaron con nuestra colonia de tipo salvaje.
[0283] Cribado. Se cruzaron IAP+/- entre sí para generar descendencia IAP-/- e IAP+/-. Los ratones se seleccionaron mediante PCR del ADN de la cola. Se usaron los siguientes cebadores: 3' Neo-GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTC; 5' IAP-TCACCTIGTTGTTCCTGTACTAC AAGCA; 3' IAP-TGTCACTTCGCAAGTGTAGTTCC.
[0284] Tinción y clasificación celular. La tinción de células madre y progenitoras de ratón se realizó usando los siguientes anticuerpos monoclonales: en el cóctel de linajes se usaron Mac-1, Gr-1, CD3, CD4, CD8, B220 y Ter119 conjugados con Cy5-PE (eBioscience), se usaron c-Kit PE-Cy7 (eBioscience), Sca-1 Alexa680 (e13-161-7, producido en nuestro laboratorio), CD34 FITC (eBioscience), CD16/32 (FcGRII/III) APC (Pharmingen) y CD135 (Flk-2) PE (eBioscience) como se ha descrito anteriormente para teñir subconjuntos de células madre y progenitoras de ratón 21 22. El anticuerpo CD47 de ratón (clon mIAP301) se evaluó usando un anticuerpo biotinilado producido en nuestro laboratorio. A continuación, las células se tiñeron con Quantum Dot 605 conjugado con estreptavidina (Chemicon). Las muestras se analizaron usando un FACSAria (Beckton Dickinson).
[0285] Las células madre CD34- Flk2- KLS se clasificaron dos veces usando un BD FACSAria. Las células de sangre periférica se obtuvieron de un sangrado de la vena de la cola y los glóbulos rojos se eliminaron mediante precipitación con Dextran T500 (Sigma) y lisis ACK. Las células se tiñeron con anti-CD45.1 APC, anti-CD45.2 FITC, anti-Ter119 PE (Pharmingen), anti-B220 Cy5-PE (eBiosciences), anti-CD3 Cascade Blue y anti-Mac-1 Cy7-PE (eBiosciences). Los granulocitos eran Ter119- B220- CD3-Mac-1+ SSC hi. Las células se analizaron usando un BD FACSAria.
[0286] Todas las muestras se volvieron a suspender en tampón que contenía yoduro de propidio antes del análisis para excluir las células muertas. Los datos FACS se analizaron usando el software FloJo (Treestar).
[0287] Ensayo de formación de coloniasin vitro. Las LT-HSC se clasificaron directamente por clonación en una placa de 96 pocillos que contenía medio de metilcelulosa (Methocult 3100) preparado como se ha descrito. El medio también se suplementó con factor de células madre recombinante de ratón (SCF), interleucina (IL)-3, IL-11, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), trombopoyetina (Tpo) y eritropoyetina (Epo). Las colonias se puntuaron para CFU-G, CFU-M, CFU-GM, CFU-GEMM y Meg.
[0288] Transferencias celulares. Para las transferencias de médula ósea completa, se aislaron células IAP+/+, IAP+/-, o IAP-/- recién extraídas de los huesos largos de las patas. Las células se contaron usando un hemocitómetro y se volvieron a suspender en PBS+ FCS al 2% a 100 ul. Para algunos experimentos, se usaron células CD45.1 de ratones C57BI/6 Ka CD45.1 como donantes en ratones CD45.2 de tipo salvaje.
[0289] Para las células clasificadas, estas se clasificaron en tampón PBS en la dosis correcta (es decir, 50 o 500 células por tubo) y se volvieron a suspender en 100 µl de PBS FCS al 2%. Para los experimentos de competencia, se añadieron 2 x 10<5>células de médula ósea completa recién aisladas de C57BI/6 CD45.1 a la suspensión de células madre de 100 µl.
[0290] Se irradiaron ratones receptores C57BI/6 Ka CD45.1 o C57BI/6 J CD45.2 usando una fuente de cesio a las dosis indicadas. La dosis subletal fue de 4,75 Gray y la dosis letal fue una dosis dividida de 9,5 Gray. Las células se transfirieron usando una jeringuilla de calibre 27 a los senos retroorbitarios de ratones anestesiados con isoflurano.
[0291] Ensayo de movilización. Los ratones se movilizaron con ciclofosfamida (Sigma) (200 mg/kg) y G-CSF (Neupogen) (250 µg/kg) como se ha descrito anteriormente. Se administró LPS bacteriano de E. coli 055:B5 (Sigma) a una dosis de 40 mg/kg en la cavidad peritoneal.
[0292] Para el análisis de los órganos movilizados, se prepararon el bazo completo, el hígado completo y los huesos largos de las patas una suspensión celular única. Se determinó la densidad celular usando un hemocitómetro para determinar la celularidad general de las células hematopoyéticas en estos órganos.
[0293] Enriquecimiento de células c-Kit<+>. La médula ósea completa del ratón se tiñó con microperlas de CD117 (Miltenyi). Las células c-Kit<+>se seleccionaron en una columna AutoMACS Midi (Miltenyi) usando un separador magnético.
[0294] Ensayo de fagocitosisin vitro. Se prepararon BMDM como se ha descrito anteriormente. Antes del ensayo las células de médula ósea enriquecidas con c-Kit se tiñeron con CFSE (Invitrogen). Se sembraron en placas 2,5 x 10<5>células enriquecidas con c-Kit con 5 x 10<4>macrófagos. Los macrófagos y las células c-Kit se obtuvieron de ratones IAP<+/+>o IAP<-/->. Las células se incubaron durante 2 horas y se determinó el índice fagocítico. Las fotografías se tomaron como se ha descrito anteriormente.
[0295] Ejemplo 4
[0296] El CD47 es un factor de pronóstico independiente y una diana terapéutica para anticuerpos en células de leucemia mieloide aguda humana.
[0297] La leucemia mieloide aguda (LMA) se organiza como una jerarquía celular iniciada y mantenida por un subconjunto de células madre leucémicas (LSC) autorrenovables. Planteamos la hipótesis de que el aumento de la expresión de CD47 en las LSC de la LMA contribuye a la patogénesis al inhibir su fagocitosis a través de la interacción de CD47 con un receptor inhibidor en los fagocitos. Descubrimos que el CD47 se expresaba en mayor medida en las LSC de LMA que en sus homólogas normales, y que el aumento de la expresión de CD47 predecía una peor supervivencia global en tres cohortes independientes de pacientes adultos con LMA. Además, los anticuerpos monoclonales bloqueantes contra el CD47 permitieron preferentemente la fagocitosis de las LSC de LMA por los macrófagos in vitro e inhibieron su injerto in vivo. Por último, el tratamiento de ratones con injerto de LMA humana con anticuerpos anti-CD47 eliminó la LMA in vivo. En resumen, el aumento de la expresión de CD47 es un factor de pronóstico independiente deficiente que puede ser objeto de tratamiento en las células madre de la LMA humana con anticuerpos monoclonales capaces de estimular la fagocitosis de las LSC.
[0298] RESULTADOS
[0299] El CD47 se expresa en mayor medida en las LSC de la LMA que en sus homólogas normales y está asociado a la mutación FLT3-ITD.En nuestra investigación de varios modelos murinos de leucemia mieloide, identificamos un aumento de la expresión de CD47 en las células de leucemia murinas en comparación con la médula ósea normal. Esto nos llevó a investigar la expresión de CD47 en las LSC de la LMA humana y sus homólogas normales. Usando citometría de flujo, observamos que CD47 se expresaba en mayor medida en múltiples especímenes de LSC de LMA que en HSC y MPP de la médula ósea normal (Figura 6). Este aumento de la expresión se extendió a la mayoría de células de leucemia, que expresaban CD47 de manera similar a la fracción enriquecida de LSC.
[0300] El examen de un subconjunto de estas muestras indicó que la expresión de superficie de CD47 se correlacionaba con la expresión del ARNm de CD47. Para investigar la expresión de CD47 en los subgrupos morfológicos, citogenéticos y moleculares de la LMA, se analizaron los datos de expresión génica de una cohorte previamente descrita de 285 pacientes adultos (Valk et al., 2004 N Engl J Med 350, 1617-1628). No se encontraron diferencias significativas en la expresión de CD47 entre los subtipos FAB (Francés-Americano-Británico). En la mayoría de los subgrupos citogenéticos, CD47 se expresó a niveles similares, excepto en los casos que presentaban t(8;21)(q22;q22), un grupo de riesgo favorable que tenía una expresión de CD47 estadísticamente significativa más baja. En los subgrupos de LMA caracterizados molecularmente, no se encontró ninguna asociación significativa entre la expresión de CD47 y las mutaciones en el dominio tirosina quinasa de FLT3 (FLT3-TKD), la sobreexpresión de EVI1 o las mutaciones en CEBPA, NRAS o KRAS. Sin embargo, una mayor expresión de CD47 se correlacionó fuertemente con la presencia de FLT3-ITD (p<0,001), que se observa en casi un tercio de las LMA con cariotipos normales y se asocia con una peor supervivencia global. Este descubrimiento se confirmó por separado en dos conjuntos de datos independientes de 214 y 137 pacientes con LMA (Tabla 1).
[0301] Tabla 1: Características clínicas y moleculares de la muestra de LMA de la cohorte de validación y comparación entre los grupos de expresión de CD47 baja y CD47 alta
[0302]
[0303] (continuación)
[0304]
[0305] (continuación)
[0308]
[0310] Identificación y separación de progenitores normales y leucémicos del mismo paciente sobre la base de la expresión diferencial de CD47.En la fracción Lin-CD34+CD38- enriquecida con LSC del espécimen SU008, se detectó una población poco frecuente de células que expresaban CD47lo, además de la mayoría de células que expresaban CD47<hi>(Figura 21A). Estas poblaciones se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) hasta una pureza >98% y se trasplantaron a ratones NOG recién nacidos o se sembraron en placas en metilcelulosa completa. Las células CD47<hi>no lograron injertarse in vivo ni formar colonias in vitro, como puede observarse con algunos especímenes de LMA.
[0311] Sin embargo, las células CD47<lo>se injertaron con hematopoyesis mielo-linfoide normal in vivo y formaron numerosas colonias mieloides morfológicamente normales in vitro (Figura 21B,C). Este espécimen albergaba la mutación FLT3-ITD, que se detectó en la mayoría de las células de leucemia (Figura 21D). Las células CD47<hi>purificadas contenían la mutación FLT3-ITD y, por lo tanto, formaban parte del clon leucémico, mientras que las células CD47<lo>no la contenían. Las células humanas aisladas de ratones injertados con las células CD47<lo>contenían solo FLT3 de tipo salvaje, lo que indica que las células CD47<lo>contenían progenitores hematopoyéticos normales.
[0312] Una expresión aumentada de CD47 en la LMA humana se asocia con malos resultados clínicos.Planteamos la hipótesis de que el aumento de la expresión de CD47 en la LMA humana contribuye a la patogénesis. A partir de esta hipótesis, predijimos que la LMA con una expresión más alta de CD47 se asociaría con peores resultados clínicos. En consonancia con esta hipótesis, el análisis de un grupo previamente descrito de 285 pacientes adultos con LMA con diversas anomalías citogenéticas y moleculares (Valk et al., 2004) reveló que una estratificación dicotómica de los pacientes en grupos de expresión de CD47 baja y de CD47 alta de se asociaba con un aumento significativo del riesgo de muerte en el grupo de expresión alta (p = 0,03). La asociación de la supervivencia global con esta estratificación dicotómica de la expresión de CD47 se validó en una segunda cohorte de prueba de 242 pacientes adultos (Metzeler et al., 2008 Blood) con cariotipos normales (LMA-NK) (p = 0,01).
[0313] Al aplicar esta estratificación a una cohorte de validación distinta de 137 pacientes adultos con cariotipos normales (Bullinger et al., 2008 Blood 111, 4490-4495), confirmamos el valor pronóstico de la expresión de CD47 tanto para la supervivencia global como para la supervivencia libre de eventos (Figura 22). El análisis de las características clínicas de los grupos de expresión baja y alta de CD47 en esta cohorte de validación cruzada también identificó diferencias estadísticamente significativas en el recuento de glóbulos blancos (WBC) y el estado de FLT3-ITD, y no se hubo diferencias en las tasas de remisión completa y el tipo de terapia de consolidación, incluyendo el trasplante alogénico (Tabla 1). El análisis de Kaplan-Meier demostró que la expresión alta de CD47 en el momento del diagnóstico se asociaba significativamente con una peor supervivencia libre de eventos y global (Figura 22 A,B). Los pacientes en el grupo de baja expresión de CD47 tuvieron una mediana de supervivencia libre de eventos de 17,1 meses, en comparación con los 6,8 meses del grupo de alta expresión de CD47, lo que corresponde a una razón de riesgos de 1,94 (intervalo de confianza del 95%: 1,30 a 3,77, p = 0,004). En cuanto a la supervivencia global, los pacientes del grupo con baja expresión de CD47 tuvieron una mediana de 22,1 meses, en comparación con los 9,1 meses del grupo con alta expresión de CD47, lo que corresponde a una razón de riesgos de 2,02 (intervalo de confianza del 95%: 1,37 a 4,03, p = 0,002). Cuando se consideró la expresión de CD47 como una variable continua, el aumento de la expresión también se asoció con una peor supervivencia libre de eventos (p = 0,02) y supervivencia global (p = 0,02).
[0314] A pesar de la asociación con FLT3-ITD (Tabla 1), la expresión aumentada de CD47 en el momento del diagnóstico se asoció significativamente con una peor supervivencia libre de eventos y global en el subgrupo de 74 pacientes sin FLT3-ITD, tanto si se consideraba como una clasificación binaria (Figura 22C,D) como si se consideraba como una variable continua (p = 0,02 tanto para la supervivencia libre de eventos como para la supervivencia global). En el análisis multivariable que tuvo en cuenta la edad, el estado de FLT3-ITD y la expresión de CD47 como variable continua, el aumento de la expresión de CD47 siguió estando asociado con una peor supervivencia libre de eventos, con una razón de riesgos de 1,33 (intervalo de confianza del 95%: 1,03 a 1,73, p = 0,03) y una peor supervivencia global, con una razón de riesgos de 1,31 (intervalo de confianza del 95%: 1,00 a 1,71, p = 0,05) (Tabla 2).
[0315] Tabla 2
[0318]
[0321] Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 humano permiten preferentemente la fagocitosis de las LSC de LMA por los macrófagos humanos.Planteamos la hipótesis de que el aumento de la expresión de CD47 en la LMA humana contribuye a la patogénesis al inhibir la fagocitosis de las células de leucemia, lo que nos llevó a predecir que la alteración de la interacción entre CD47 y SIRPα con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 permitirán preferentemente la fagocitosis de las LSC de la LMA. Se han generado varios anticuerpos monoclonales anti-CD47 humano, incluyendo algunos capaces de bloquear la interacción entre CD47 y SIRPα (B6H12.2 y BRIC126) y otros incapaces de hacerlo (2D3) (Subramanian et al., 2006 Blood 107, 2548-2556). Se probó la capacidad de estos anticuerpos para permitir la fagocitosis de las LSC de la LMA, o de las células CD34+ normales de la médula ósea humana, por los macrófagos humanos in vitro. La incubación de las LSC de la LMA con macrófagos humanos en presencia del anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o del anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón anti-CD45 humano no dio como resultado una fagocitosis significativa, según se determinó mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 8A) o citometría de flujo. Sin embargo, la adición de los anticuerpos bloqueantes anti-CD47 B6H12.2 y BRIC126, pero no del anticuerpo no bloqueante 2D3, permitió la fagocitosis de las LSC de LMA (Figura 8A,C). No se observó fagocitosis de células CD34+ normales con ninguno de los anticuerpos (Figura 8C).
[0323] Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 humano permiten la fagocitosis de las LSC de LMA por los macrófagos de ratón.La interacción entre CD47 y SIRPα se ha relacionado con un regulador crítico del rechazo de xenotrasplantes en varios trasplantes entre especies; sin embargo, hay informes contradictorios sobre la capacidad del CD47 de una especie para unirse y estimular el SIRPα de otra especie. Con el fin de evaluar directamente el efecto de la inhibición de la interacción del CD47 humano con el SIRPα de ratón, se llevaron a cabo los ensayos de fagocitosis in vitro descritos anteriormente con macrófagos de ratón. La incubación de LSC de LMA con macrófagos de ratón en presencia del anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o del anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón anti-CD45 humano no dio como resultado una fagocitosis significativa, según se determinó mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 8B) o citometría de flujo. Sin embargo, la adición de los anticuerpos bloqueantes anti-CD47 B6H12.2 y BRIC126, pero no del anticuerpo no bloqueante 2D3, permitió la fagocitosis de las LSC de LMA (Figura 8B,C).
[0325] Un anticuerpo monoclonal dirigido contra el CD47 humano inhibe el injerto de LSC de LMA y elimina la LMA in vivo.Se probó la capacidad del anticuerpo bloqueante anti-CD47 B6H12.2 para dirigirse a las LSC de LMA in vivo. En primer lugar, se utilizó una estrategia de recubrimiento previo en la que las LSC de LMA se purificaron mediante FACS y se incubaron con control de isotipo de IgG1, anticuerpo anti-CD45 humano o anticuerpo anti-CD47 humano. Se analizó una alícuota de las células para determinar el recubrimiento mediante tinción con un anticuerpo secundario, lo que demostró que tanto el anticuerpo anti-CD45 como el anticuerpo anti-CD47 se unían a las células (Figura 10A). Las células restantes se trasplantaron a ratones NOG recién nacidos, que se analizaron para detectar el injerto leucémico 13 semanas después (Figura 10B). En todos los ratones excepto uno, las células recubiertas con el control de isotipo y el anticuerpo anti-CD45 mostraron un injerto leucémico a largo plazo. Sin embargo, la mayoría de los ratones a los que se les habían trasplantado células recubiertas con el anticuerpo anti-CD47 no presentaron un injerto leucémico detectable.
[0327] A continuación, se utilizó una estrategia de tratamiento en la que primero se injertó a los ratones LSC de LMA humana y luego se les administraron diariamente inyecciones intraperitoneales de 100 microgramos de IgG de ratón o anticuerpo anti-CD47 durante 14 días, el injerto leucémico determinándose antes y después del tratamiento. El análisis de la sangre periférica mostró una eliminación casi completa de la leucemia circulante en los ratones tratados con anticuerpo anti-CD47, a menudo después de una única dosis, sin respuesta en los ratones de control (Figura 23A,B). De manera similar, hubo una reducción significativa en el injerto leucémico en la médula ósea de los ratones tratados con anticuerpo anti-CD47, mientras que la afectación leucémica aumentó en los ratones de control tratados con IgG (Figura 23 C,D). El análisis histológico de la médula ósea identificó blastos leucémicos monomórficos en los ratones tratados con IgG de control (Figura 23E, paneles 1,2) y áreas hipocelulares despejadas en los ratones tratados con anticuerpo anti-CD47 (Figura 23E, paneles 4,5). En la médula ósea de algunos ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 que contenían leucemia residual, se detectaron macrófagos que contenían células picnóticas fagocitadas, lo que capturó la eliminación de la leucemia humana (Figura 23E, paneles 3,6).
[0329] Aquí informamos de la identificación de una expresión más alta de CD47 en las LSC de la LMA en comparación con sus homólogas normales y planteamos la hipótesis de que el aumento de la expresión de CD47 en la LMA humana contribuye a la patogénesis al inhibir la fagocitosis de estas células a través de la interacción de CD47 con SIRPα. En consonancia con esta hipótesis, demostramos que el aumento de la expresión de CD47 en la LMA humana se asocia con una disminución de la supervivencia global. También demostramos que la alteración de la interacción entre CD47 y SIRPα con anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 permite preferentemente la fagocitosis de las LSC de LMA por los macrófagos in vitro, inhibe el injerto de LSC de LMA y elimina la LMA in vivo. En conjunto, estos resultados establecen la justificación para considerar el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD47 como una nueva terapia para la LMA humana.
[0331] La influencia patogénica de CD47 parece ser mecánicamente distinta de las dos clases principales de mutaciones complementarias en un modelo propuesto para la patogénesis de la LMA. De acuerdo con este modelo, las mutaciones de clase I, que afectan principalmente a la proliferación y la apoptosis (por ejemplo, FLT3 y NRAS), y las mutaciones de clase II, que afectan principalmente a la diferenciación de las células hematopoyéticas (por ejemplo, CEBPA, MLL y NPM1), cooperan en la leucemogénesis. Como se ha demostrado aquí, CD47 contribuye a la patogénesis a través de un mecanismo distinto, que confiere una ventaja de supervivencia a las LSC y a los blastos descendientes al evadir la fagocitosis por parte del sistema inmunitario innato. Aunque se han descrito estrategias para evadir las respuestas inmunitarias en muchos tumores humanos, creemos que el aumento de la expresión de CD47 representa el primer mecanismo de evasión inmunitaria de este tipo con implicaciones pronósticas y terapéuticas para la LMA humana.
[0333] Una mayor expresión de CD47 es un marcador de las células madre de leucemia y un pronóstico para la supervivencia global en la LMA. Las LSC de la LMA se enriquecen en la fracción Lin-CD34+CD38-, que en la médula ósea normal contiene HSC y MPP. La identificación de moléculas de la superficie celular que puedan distinguir entre células madre leucémicas y normales es esencial para la evaluación basada en citometría de flujo de la enfermedad residual mínima (MRD) y para el desarrollo de estrategias de separación prospectivas para su uso en terapias celulares. Recientemente se han identificado varias moléculas candidatas, que incluyen CD123, CD96, CLL-1 y ahora CD47. La CD123 fue la primera molécula que se demostró que se expresaba en mayor medida en las LSC de la LMA en comparación con las poblaciones normales enriquecidas con HSC. Anteriormente, identificamos la expresión específica de CD96 en las LSC de la LMA en comparación con las HSC normales, y demostramos que solo eran capaces de injertarse in vivo las células de leucemia CD96+, y no las CD96-.
[0335] Se identificó CLL-1 como una molécula de superficie específica de las LSC de LMA expresada en la mayoría de las muestras de LMA y no en las HSC normales; de manera importante, la presencia de células Lin-CD34+CD38-CLL-1+ en la médula ósea de varios pacientes en remisión hematológica era predictiva de recaída. Aquí demostramos que no solo CD47 se expresa en mayor medida en las LSC de la LMA en comparación con las HSC y las MPP normales, sino que esta expresión diferencial puede usarse para separar las HSC/MPP normales de las LSC. Esta es la primera demostración de la separación prospectiva de las células madre normales de las leucémicas en la misma muestra de paciente, y ofrece la posibilidad de terapias de trasplante de HSC autólogas sin LSC.
[0337] Inicialmente identificamos una expresión más alta de CD47 en las LSC de la LMA, pero observamos que la expresión en los blastos a granel era la misma. Por ello, decidimos usar los datos publicados sobre la expresión génica en la LMA a granel para investigar la relación entre la expresión de CD47 y los resultados clínicos. En consonancia con nuestra hipótesis, descubrimos que el aumento de la expresión de CD47 era un predictor independiente de un peor resultado clínico en pacientes con LMA con cariotipo normal, incluyendo el subgrupo sin la mutación FLT3-ITD, que es el subgrupo más grande de pacientes con LMA. Como este análisis dependía de la expresión relativa del ARNm de CD47, un ensayo de PCR cuantitativa para el pronóstico de la LMA podría basarse en el nivel de expresión de CD47. Dicho ensayo podría utilizarse en la toma de decisiones terapéuticas adaptadas al riesgo, en particular en el gran subgrupo de pacientes con LMA con cariotipos normales que carecen de la mutación FLT3-ITD.
[0339] Dirigirse a CD47 en las LSC de LMA con anticuerpos monoclonales terapéuticos. Las moléculas de la superficie celular que se expresan preferentemente en las LSC de LMA en comparación con sus homólogas normales son candidatas para el direccionamiento de anticuerpos monoclonales terapéuticos. Hasta ahora, se han dirigido varias moléculas en la LMA, incluyendo CD33, CD44, CD123 y ahora CD47. El CD33 es la diana del conjugado de anticuerpo monoclonal gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg), que está aprobado para el tratamiento de la LMA recidivante en pacientes de edad avanzada. Se ha demostrado que el direccionamiento de CD44 con un anticuerpo monoclonal reduce notablemente el injerto de LMA en ratones, con pruebas de que actúa específicamente sobre las LSC para inducir la diferenciación. Recientemente se ha informado de que un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD123 es eficaz para reducir la función de las LSC de la LMA in vivo. Aquí informamos de que un anticuerpo monoclonal dirigido contra el CD47 es capaz de estimular la fagocitosis de las LSC de la LMA in vitro e inhibir el injerto in vivo.
[0340] Varias líneas de evidencia sugieren que el direccionamiento de CD47 con un anticuerpo monoclonal probablemente actúa alterando la interacción entre CD47 y SIRPα, impidiendo de este modo una señal inhibidora de la fagocitosis. En primer lugar, dos anticuerpos anti-CD47 bloqueantes permitieron la fagocitosis de las LSC de la LMA, mientras que un anticuerpo no bloqueante no lo hizo, a pesar de que los tres se unen a las células de manera similar. En segundo lugar, en el caso del anticuerpo B6H12.2 usado para la mayoría de nuestros experimentos, el anticuerpo anti-CD45 de isotipo compatible, que también se une a las LSC, no produjo los mismos efectos. De hecho, el anticuerpo B6H12.2 es un isotipo de IgG1 de ratón, que es menos eficaz para unirse a los receptores Fc de ratón que los anticuerpos de isotipo de IgG2a o IgG2b.
[0341] Para las terapias clínicas humanas, el bloqueo de CD47 en las LSC de la LMA con anticuerpos monoclonales humanizados promueve la fagocitosis de las LSC a través de un mecanismo similar, como lo indica la fagocitosis in vitro mediada por macrófagos humanos (Figura 8A,C). Se detecta una mayor expresión de CD47 en las LSC de la LMA; sin embargo, CD47 se expresa en tejidos normales, incluyendo las HSC de la médula ósea. Identificamos un efecto preferencial de los anticuerpos anti-CD47 en la fagocitosis de las LSC de la LMA en comparación con las células CD34+ de la médula ósea normal por parte de los macrófagos humanos in vitro. De hecho, no se detectó un aumento de la fagocitosis de las células CD34+ normales en comparación con el control de isotipo, lo que demuestra que el bloqueo de CD47 con anticuerpos monoclonales es una estrategia terapéutica viable para la LMA humana.
[0342] Las pruebas experimentales presentadas aquí proporcionan la justificación para los anticuerpos monoclonales anti-CD47 como monoterapia para la LMA. Sin embargo, tales anticuerpos pueden ser igualmente eficaces, si no más, como parte de una estrategia combinada. La combinación de un anticuerpo anti-CD47, capaz de bloquear una fuerte señal inhibidora de la fagocitosis, con un segundo anticuerpo capaz de unirse a una molécula específica de las LSC (por ejemplo, CD96) y activar los receptores Fc de los fagocitos, lo que proporciona una fuerte señal positiva para la fagocitosis, puede dar lugar a un estímulo sinérgico para la fagocitosis y la eliminación específica de las LSC de la LMA. Además, las combinaciones de anticuerpos monoclonales contra las LSC de la LMA que incluyen anticuerpos anti-CD47 bloqueantes y anticuerpos IgG1 humanos dirigidos contra otros dos antígenos de la superficie celular tendrán más probabilidades de eliminar las células de leucemia con variantes de epítopos preexistentes o pérdida de antígenos que pueden reaparecer en pacientes tratados con un único anticuerpo.
[0343] PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
[0344] Muestras humanas.Se adquirieron células mononucleares normales de médula ósea humana de AllCells Inc. (Emeryville, California). Las muestras de leucemia mieloide aguda humana (Figura 1A) se obtuvieron de pacientes del Centro Médico de la Universidad de Stanford con su consentimiento informado, de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB (Stanford IRB Nº 76935 y 6453). Las células humanas positivas para CD34 se enriquecieron con perlas magnéticas (Miltenyi Biotech).
[0345] Análisis por citometría de flujo y clasificación celular.Para el análisis y la clasificación de las LSC de LMA (Lin-CD34+CD38-CD90-, donde el linaje incluía CD3, CD19 y CD20), HSC (Lin-CD34+CD38-CD90+) y MPP (Lin-CD34+CD38-CD90-CD45RA-) se usó un panel de anticuerpos como se ha descrito anteriormente (Majeti et al., 2007). El análisis de la expresión de CD47 se realizó con un anticuerpo anti-CD47 humano PE (clon B6H12, BD Biosciences, San José, California).
[0346] Preparación del ADN genómico y análisis de FLT3-ITD mediante PCR.El ADN genómico se aisló de los sedimentos celulares usando un kit Gentra Puregen de acuerdo con el protocolo del fabricante (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota). El estado de FLT3-ITD se cribó mediante PCR usando cebadores que generaron un producto de tipo salvaje de 329 pb y productos ITD de tamaños variables mayores.
[0347] Anticuerpos anti-CD47 humano.Los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD47 humano incluyeron: BRIC126, IgG2b (Abcam, Cambridge, MA), 2D3, IgG1 (Ebiosciences. San Diego, CA) y B6H12.2, IgG1. El hibridoma B6H12.2 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante del hibridoma mediante cromatografía de afinidad con proteína G de acuerdo con los procedimientos estándar o se obtuvo de BioXCell (Lebanon, NH).
[0348] Ensayo de colonias de metilcelulosa.La formación de colonias de metilcelulosa se analizó sembrando en placas las células clasificadas en una placa de 6 pocillos, cada pocillo conteniendo 1 ml de metilcelulosa completa (Methocult GF+ H4435, Stem Cell Technologies). Las placas se incubaron durante 14 días a 37ºC y, a continuación, se evaluaron sobre la base de su morfología.
[0349] Ensayos de fagocitosis in vitro.Las LSC de LMA humana o las células CD34+ de médula ósea normal se marcaron con CFSE y se incubaron con macrófagos de ratón o humanos en presencia de 7 µg/m de control de isotipo de IgG1, IgG1 anti-CD45 o anticuerpo anti-CD47 (clones B6H12.2, BRIC126 o 2D3) durante 2 horas. A continuación, las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia para determinar el índice fagocítico (número de células ingeridas por cada 100 macrófagos). En algunos casos, las células se recogieron y se tiñeron con un marcador de macrófagos de ratón o humano, y las células fagocitadas se identificaron mediante citometría de flujo como macrófagos+CFSE+. El análisis estadístico usando la prueba t de Student se realizó con GraphPad Prism (San Diego, California).
[0351] Ensayo de injerto con recubrimiento previo in vivo.Las LSC aisladas de especímenes de LMA se incubaron con 28 ug/ml de control de isotipo de IgG1, anticuerpo anti-CD45 de IgG1 o anticuerpo anti-CD47 de IgG1 (B6H12.2) a 4ºC durante 30 minutos. A continuación, se tiñó una pequeña alícuota de células con anticuerpo secundario de burro anti-PE de ratón (Ebioscience) y se analizó mediante citometría de flujo para evaluar el recubrimiento. A continuación, se trasplantaron aproximadamente 10<5>LSC recubiertas a cada ratón NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOG) recién nacido irradiado. Los ratones se sacrificaron 13 semanas después del trasplante y se analizó la médula ósea para detectar el injerto de leucemia humana (hCD45+hCD33+) mediante citometría de flujo (Majeti et al., 2007 Cell Stem Cell 1, 635-645). La presencia de leucemia humana se confirmó mediante tinción de Wright-Giemsa de células hCD45+ y PCR FLT3-ITD. El análisis estadístico mediante la prueba t de Student se realizó con GraphPad Prism (San Diego, CA).
[0353] Tratamiento con anticuerpos in vivo de ratones con injerto de LMA.Se trasplantaron 1-25x10<5>LSC purificadas por FACS a crías NOG. Entre ocho y doce semanas después, se evaluó el injerto de LMA humana (células hCD45+CD33+) en la sangre periférica y la médula ósea mediante sangrado de la cola y aspiración del fémur, respectivamente. A continuación, los ratones injertados se trataron con inyecciones intraperitoneales diarias de 100 microgramos de anticuerpo anti-CD47 o control IgG durante 14 días. El día 15 se sacrificaron los ratones y se analizó la sangre periférica y la médula ósea para detectar LMA.
[0355] Pacientes con LMA, datos de expresión génica en micromatrices y análisis estadístico.Se analizaron los datos de expresión génica y clínicos de tres cohortes de pacientes adultos con LMA descritas anteriormente: (1) un conjunto de datos de entrenamiento de 285 pacientes con diversas anomalías citogenéticas y moleculares descritas por Valk et al., (2) un conjunto de datos de prueba de 242 pacientes con cariotipos normales descritos por Metzeler et al., y (3) un conjunto de datos de validación de 137 pacientes con cariotipos normales descritos por Bullinger et al. Los criterios de valoración clínicos analizados incluyeron la supervivencia global y libre de eventos, los eventos definiéndose como el intervalo entre la inclusión en el estudio y la retirada del mismo debido a la falta de remisión completa, la recaída o la muerte por cualquier causa, con datos censurados para los pacientes que no tuvieron ningún evento en la última visita de seguimiento.
[0357] PCR FLT3-ITD.Todas las reacciones se realizaron en un volumen de 50 µl que contenía 5 µl de tampón PCR 10x (KCL 50 mM/Tris 10 nM/MgCl22 mM/0,01% de gelatina), 1 µl de dNTP 10 mM, 2 unidades de Taq polimerasa (Invitrogen), 1 µl de cebador directo 11F 10 µM (5'-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3') y cebador inverso 12R (5'-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3'), y de 10 a 50 ng de ADN genómico. Las condiciones de PCR para la amplificación del gen FLT3 fueron 40 ciclos de desnaturalización (30 segundos a 95ºC), hibridación (30 segundos a 62ºC) y extensión (30 segundos a 72ºC).
[0359] Preparación de macrófagos de ratón y humanos.Se recogieron células mononucleares de médula ósea de ratones BALB/c y se cultivaron en IMDM que contenía un 10% de FBS suplementado con 10 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos murinos recombinante (M-CSF, Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante entre 7 y 10 días para permitir la diferenciación terminal de los monocitos en macrófagos. Las células mononucleares de sangre periférica humana se prepararon a partir de sangre normal desechada del Centro Médico de la Universidad de Stanford. Los monocitos se aislaron adhiriendo células mononucleares a placas de cultivo durante una hora a 37ºC, después de lo cual se eliminaron las células no adherentes mediante lavado. Las células restantes eran >95% CD14 y CD11b positivas. A continuación, las células adherentes se incubaron en IMDM más un 10% de suero humano (Valley Biomedical, Winchester, VA) durante entre 7 y 10 días para permitir la diferenciación terminal de los monocitos en macrófagos.
[0361] Ensayo de fagocitosis in vitro.Se recogieron macrófagos BMDM o de sangre periférica mediante incubación en tripsina/EDTA (Gibco/Invitrogen) durante 5 minutos, seguido de un raspado suave. Se sembraron 5 x 10<4>macrófagos en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos en IMDM al 10% que contenía FBS al 10%. Después de 24 horas, se sustituyó el medio por IMDM sin suero y se cultivaron las células durante 2 horas más. Las LSC se marcaron con fluorescencia con CFSE de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Se añadieron 2 x 10<4>de LSC marcadas con CFSE a los pocillos que contenían macrófagos junto con 7 µg/ml de anticuerpo de isotipo de IgG1 (Ebiosciences), anti-CD45 (clon HI30, Ebiosciences) o anti-CD47, y se incubaron durante 2 horas. A continuación, los pocillos se lavaron tres veces con IMDM y se examinaron con un microscopio de inmunofluorescencia Eclipse T5100 (Nikon) usando un filtro de proteína fluorescente verde mejorado capaz de detectar la fluorescencia del CFSE. Se contó la cantidad de células positivas para CFSE dentro de los macrófagos y se determinó el índice fagocítico como la cantidad de células ingeridas por cada 100 macrófagos. Se contaron por lo menos 200 macrófagos por pocillo. Se tomaron imágenes fluorescentes y de campo claro por separado y se fusionaron con Image Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD). En la Figura 22A y B, las tres imágenes de la izquierda se presentan con un aumento de 200x, y la imagen de la derecha con anti-CD47 con un aumento de 400x. Para el análisis mediante citometría de flujo de la fagocitosis, se recogieron las células de cada pocillo usando tripsina/EDTA. A continuación, las suspensiones celulares se tiñeron con un anticuerpo de macrófagos de ratón anti-ratón F4/80-PECy7 (Ebiosciences) o anti-humano CD14-PECy7 (Ebiosciences) y se analizaron en un FACSAria. Las LSC fagocitadas se definieron como células CFSE+F4/80+ o CFSE+CD14+ cuando se incubaron con macrófagos murinos o humanos, respectivamente.
[0363] Datos de expresión génica de micromatrices.El panel A de la Figura complementaria 22 describe los principales conjuntos de datos de micromatrices analizados en la presente, incluyendo las cohortes de entrenamiento, prueba y validación. Conjunto de entrenamiento: Se obtuvieron los datos de expresión génica, los datos de citogenética y los datos moleculares de los 285 y 465 pacientes con LMA de los que se realizaron perfiles con micromatrices Affymetrix HG-U133A y HG-U133 Plus 2.0 por Valk et al. y Jongen-Lavrencic et al. respectivamente, del Gene Expression Omnibus uszando los números de acceso correspondientes (GSE1159 y GSE6891). Los datos de resultados solo estaban disponibles para el primer conjunto de datos, y la información clínica correspondiente fue amablemente facilitada por los autores. Esta cohorte se presenta como el conjunto de datos de "entrenamiento". El último conjunto de datos se usó para confirmar las asociaciones univariantes con el cariotipo y las mutaciones moleculares descritas en el primero. Sin embargo, estos dos conjuntos de datos se solapaban, ya que 247 de los 285 pacientes del primer estudio se incluyeron en el segundo y, por lo tanto, se excluyeron en la validación de la asociación de FLT3-ITD con la expresión de CD47 en el segundo conjunto de datos. Usando NetAffx4, RefSeq5 y el navegador genómico UCSC Genome Browser6, identificamos 211075_s_at y 213857_s_at como conjuntos de sondas Affymetrix en la micromatriz U133 Plus 2.0 que se asignan exclusivamente a exones transcritos constitutivamente de CD47. Para estimar el nivel de expresión del ARNm para CD47 se empleó la media geométrica de los logaritmos en base 2 de estos dos conjuntos de sondas y las medidas estadísticas correspondientes para las asociaciones con la clasificación FAB, el cariotipo y las mutaciones moleculares. Como los datos proporcionados por Valk et al. como GSE1159 eran mediciones de intensidad de Affymetrix, convertimos estas intensidades a logaritmos normalizados en base 2 de relaciones para permitir la comparación con las mediciones correspondientes de las micromatrices de ADNc usando un esquema convencional. Específicamente, primero (1) normalizamos los datos brutos usando archivos CEL de las 291 micromatrices de este conjunto de datos con gcRMA8, luego (2) generamos relaciones dividiendo la medición de intensidad de cada gen en una matriz determinada por la intensidad media del gen en todas las matrices, (3) transformamos logarítmicamente (base 2) las relaciones resultantes y (4) centramos la mediana de los datos de expresión en todas las micromatrices y luego en todos los genes. Para evaluar el valor pronóstico del CD47, empleamos el conjunto de sondas 213857_s_at de las micromatrices Affymetrix HG-U133A y HG-U133 Plus 2.0, dada su distribución de expresión similar (Figura complementaria 3B), y teniendo en cuenta su posición dentro del transcrito del ARNm en comparación con los clones de ADNc en las micromatrices de ADNc de Stanford, como se indica en el recurso NetAffx.
[0365] Conjunto de pruebas: Se obtuvieron la expresión génica y los datos clínicos de los 242 pacientes adultos con NKAML de los que se habían realizado perfiles con las micromatrices Affymetrix HG-U133A y HG-U133 Plus 2.0 por Metzeler et al. se obtuvieron del Gene Expression Omnibus usando los números de registro correspondientes (GSE12417). Como para este conjunto de datos no había disponibles datos brutos, con el propósito de evaluar el valor pronóstico del CD47, empleamos los conjuntos de datos normalizados proporcionados por los autores (logaritmos en base 2) y evaluamos la expresión del CD47 usando el conjunto de sondas 213857_s_at en las micromatrices correspondientes.
[0367] Conjunto de validación: Se obtuvieron los datos de expresión génica de los 137 pacientes con LMA de cariotipo normal de los que se habían realizado perfiles con micromatrices de ADNc por Bullinger et al. de la base de datos de micromatrices de Stanford 10. Los autores nos proporcionaron amablemente la información clínica correspondiente, incluyendo los datos de resultados y el estado de la mutación FLT3. Usando las anotaciones originales de las características de las micromatrices, así como SOURCE11, RefSeq5 y el navegador genómico UCSC Genome Browser6, identificamos IMAGE:811819 como un clon de ADNc verificado secuencialmente que se corresponde con el exón terminal 3' transcrito constitutivamente de CD47 en las micromatrices de ADNc correspondientes.
[0369] Detalles del tratamiento: Se trató a los pacientes con LMA descritos por Valk et al. (conjunto de entrenamiento) de acuerdo con varios protocolos del grupo cooperativo de hematología y oncología holandés-belga. A la mayoría (90%) de los pacientes con LMA-NK descritos por Metzeler et al. (conjunto de prueba) se les trató según el protocolo AMLCG-1999 del Grupo Cooperativo Alemán de LMA, y todos los pacientes recibieron quimioterapia intensiva de doble inducción y consolidación. Los 137 pacientes con LMA-NK descritos por Bullinger et al. (conjunto de validación) recibieron regímenes de tratamiento intensificado del estándar de atención (protocolo AML HD98A), que incluían 2 ciclos de terapia de inducción con idarrubicina, citarabina y etopósido, un ciclo de consolidación con dosis altas de citarabina y mitoxantrona (HAM), seguido de la asignación aleatoria a un ciclo de consolidación tardía con HAM frente a un trasplante autólogo de células hematopoyéticas en caso de que no se dispusiera de un donante familiar HLA idéntico para el trasplante alogénico de células hematopoyéticas.
[0371] Análisis estadístico. Para estimar las diferencias significativas en el nivel de expresión de CD47 entre los subgrupos de LMA basados en categorizaciones morfológicas, citogenéticas y moleculares usamos pruebas t bilaterales y análisis de varianza. Las asociaciones entre los grupos con niveles altos y bajos de CD47 y las

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-CD47 para su uso en un método para reducir el crecimiento de células madre de LMA (AMLSC) en un paciente aumentando su depuración por fagocitosis, impidiendo la interacción entre el CD47 en la superficie de las AMLSC y el receptor SIRPα en la superficie de las células fagocíticas.
2. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1, en donde el paciente es humano.
3. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. El anticuerpo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
ES22191294T 2008-01-15 2009-01-15 Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47 Active ES3060476T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1132408P 2008-01-15 2008-01-15
US18978608P 2008-08-22 2008-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3060476T3 true ES3060476T3 (en) 2026-03-26

Family

ID=40885608

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09701993.9T Active ES2582340T3 (es) 2008-01-15 2009-01-15 Métodos para manipular fagocitosis mediada por CD47
ES22191294T Active ES3060476T3 (en) 2008-01-15 2009-01-15 Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
ES16160470T Active ES2735144T5 (en) 2008-01-15 2009-01-15 Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
ES16160476T Active ES2740823T5 (en) 2008-01-15 2009-01-15 Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09701993.9T Active ES2582340T3 (es) 2008-01-15 2009-01-15 Métodos para manipular fagocitosis mediada por CD47

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16160470T Active ES2735144T5 (en) 2008-01-15 2009-01-15 Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
ES16160476T Active ES2740823T5 (en) 2008-01-15 2009-01-15 Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47

Country Status (11)

Country Link
US (14) US8562997B2 (es)
EP (2) EP4144367B1 (es)
JP (9) JP5547656B2 (es)
AU (1) AU2009205665B2 (es)
CA (3) CA2711938C (es)
DK (3) DK3056514T4 (es)
ES (4) ES2582340T3 (es)
FI (2) FI3056514T4 (es)
PL (1) PL4144367T3 (es)
PT (3) PT2242512T (es)
WO (1) WO2009091601A1 (es)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007033221A2 (en) * 2005-09-13 2007-03-22 The General Hospital Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses
ES2582340T3 (es) 2008-01-15 2016-09-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Métodos para manipular fagocitosis mediada por CD47
EP3043181B1 (en) 2008-01-15 2020-04-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
US11072655B2 (en) 2008-01-15 2021-07-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
HRP20150553T1 (hr) 2009-05-15 2015-08-28 University Health Network Sastavi i metode za lijeäśenje hematoloških maligniteta ciljajuä†i sirp - cd47 interakciju
CA2771336C (en) 2009-09-15 2019-11-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
PT2569013T (pt) * 2010-05-14 2017-02-08 Univ Leland Stanford Junior Anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos para cd47
CN102070719A (zh) * 2010-11-24 2011-05-25 中国人民解放军第四军医大学 一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47
US9873918B2 (en) 2011-08-11 2018-01-23 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes
US20140140989A1 (en) * 2012-02-06 2014-05-22 Inhibrx Llc Non-Platelet Depleting and Non-Red Blood Cell Depleting CD47 Antibodies and Methods of Use Thereof
KR102100388B1 (ko) * 2012-02-06 2020-04-13 인히브릭스, 인크. Cd47 항체 및 그 사용 방법
DK3725807T3 (da) 2012-12-03 2026-01-12 Novimmune Sa Anti-cd47 antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US9221908B2 (en) * 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
BR112015013431A2 (pt) 2012-12-12 2017-11-14 Vasculox Inc anticorpos monoclonais ou respectivos fragmentos ligantes de antígenos, composição farmacêutica, e usos de anticorpo monoclonal ou respectivo fragmento ligante de antígenos
PL3575326T3 (pl) 2012-12-17 2022-07-11 Pf Argentum Ip Holdings Llc Leczenie komórek chorobowych cd47+ z użyciem fuzji sirp alfa-fc
AU2014244083B2 (en) * 2013-03-13 2018-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for modulating chemotherapeutic cytotoxicity
CN112245586A (zh) 2013-03-15 2021-01-22 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于实现治疗有效剂量的抗cd47剂的方法
JP6843611B2 (ja) * 2013-04-29 2021-03-17 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 免疫を強化する抗ｃｄ４７因子の使用
CN103665165B (zh) * 2013-08-28 2016-02-24 江苏匡亚生物医药科技有限公司 一种靶向人CD47-SIRPα信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途
NL2011904C2 (en) * 2013-12-06 2015-06-09 Stichting Vu Vumc Leukemic stem cell markers.
CN106456748A (zh) * 2014-01-08 2017-02-22 小利兰·斯坦福大学托管委员会 小细胞肺癌的靶向疗法
CN106456749B (zh) 2014-03-11 2021-03-30 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗SIRPα抗体和双特异性巨噬细胞增强型抗体
WO2016022971A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Sirp alpha-antibody fusion proteins
WO2016023040A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 Alexo Therapeutics International Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
EP4257145B1 (en) 2014-08-26 2025-06-25 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
CA2959821C (en) * 2014-10-24 2024-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of MHC class I positive cells and for overcoming resistance to anti-CD47 agents/SIRPA
WO2016065245A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Incept, Llc Extra luminal scaffold
EP3012271A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-27 Effimune Method and compositions for inducing differentiation of myeloid derived suppressor cell to treat cancer and infectious diseases
ES2761861T3 (es) 2015-01-21 2020-05-21 Univ Leland Stanford Junior Uso de agonistas de TLR y agente anti-CD47 para mejorar la fagocitosis de las células cancerosas
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
EA035817B1 (ru) 2015-03-10 2020-08-14 Адуро Байотек, Инк. Композиции и способы для активации сигналинга, зависимого от "гена стимулятора интерферона"
AU2016304794B2 (en) 2015-08-07 2021-07-15 ALX Oncology Inc. Constructs having a SIRP-alpha domain or variant thereof
RU2748401C2 (ru) 2015-09-18 2021-05-25 Арч Онколоджи, Инк. Терапевтические антитела к CD47
WO2017053423A1 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Erasmus University Medical Center Anti-cd47 antibodies and methods of use
JP6981973B2 (ja) 2015-10-01 2021-12-17 ヒート バイオロジクス，インコーポレイテッド Ｉ型及びｉｉ型細胞外ドメインを異種キメラタンパク質として連結する組成物及び方法
AU2016361451B2 (en) 2015-11-27 2024-01-25 Cartherics Pty. Ltd. Genetically modified cells and uses thereof
RU2627181C2 (ru) * 2015-12-29 2017-08-03 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантного человеческого белка cd47
PT3402820T (pt) 2016-01-11 2020-08-20 Forty Seven Inc Anticorpos monoclonais anti-cd47 quiméricos, de ratinho ou humanizados
US10257847B2 (en) * 2016-01-29 2019-04-09 Qualcomm Incorporated Small cell and communication network reconfiguration based on wireless device capabilities
IL262251B2 (en) 2016-04-14 2023-09-01 Ose Immunotherapeutics New anti-syrap antibodies and their medical applications
KR102505253B1 (ko) 2016-04-15 2023-03-02 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 암의 치료에서 항-cd47 제제의 치료적으로 효과적인 용량을 결정하고 달성하는 방법
AU2017250029C1 (en) * 2016-04-15 2022-03-24 Pfizer Inc. Macrophage stimulation in CD47 blockade therapy
US11499168B2 (en) * 2016-04-25 2022-11-15 Universitat Basel Allele editing and applications thereof
JP7160683B2 (ja) 2016-04-29 2022-10-25 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 術後癒着の予防及び治療のための方法及び組成物
EP3507367A4 (en) 2016-07-05 2020-03-25 Aduro BioTech, Inc. CYCLIC DINUCLEOTID COMPOUNDS WITH INCLUDED NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF
CN117717604A (zh) 2016-07-19 2024-03-19 梯瓦制药澳大利亚股份有限公司 抗cd47联合治疗
CN109862910A (zh) 2016-08-03 2019-06-07 小利兰·斯坦福大学托管委员会 破坏巨噬细胞上的Fc受体接合增强抗SIRPα抗体疗法的功效
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
EP3529276A4 (en) 2016-10-21 2020-06-17 Arch Oncology, Inc. CD47 THERAPEUTIC ANTIBODIES
EP3532497B1 (en) 2016-10-26 2024-07-24 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
CA3042583A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Trillium Therapeutics Inc. Improvements in cd47 blockade therapy by hdac inhibitors
CA3042581A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Trillium Therapeutics Inc. Enhancement of cd47 blockade therapy by proteasome inhibitors
AU2017371070B2 (en) 2016-12-09 2025-01-02 Alector Llc Anti-SIRP-alpha antibodies and methods of use thereof
KR102642385B1 (ko) 2017-02-06 2024-03-04 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도
US10386368B2 (en) 2017-02-24 2019-08-20 Trustees Of Boston University Isolation of human lung progenitors derived from pluripotent stem cells
US20190367579A1 (en) 2017-02-27 2019-12-05 Shattuck Labs, Inc. Tigit- and light-based chimeric proteins
US11267856B2 (en) 2017-02-27 2022-03-08 Shattuck Labs, Inc. CSF1R-CD40L chimeric proteins
WO2018165015A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of pediatric brain tumors with targeting of cd47 pathway
KR102702926B1 (ko) 2017-04-13 2024-09-06 사이로파 비.브이. 항-sirp 알파 항체
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
US20190062428A1 (en) 2017-06-19 2019-02-28 Surface Oncology, Inc. Combination of anti-cd47 antibodies and cell death-inducing agents, and uses thereof
WO2018237168A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Dosing parameters for cd47 targeting therapies to hematologic malignancies
BR112020001653A2 (pt) 2017-07-26 2020-07-21 Forty Seven, Inc. anticorpos anti-sirp-alfa e métodos relacionados
JP7262440B2 (ja) * 2017-08-02 2023-04-21 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ４７抗体及びその使用
CN109422811A (zh) 2017-08-29 2019-03-05 信达生物制药(苏州)有限公司 抗cd47抗体及其用途
MX2020002303A (es) 2017-08-30 2020-09-10 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co Ltd Dinucleotidos ciclicos como moduladores del estimulador de genes de interferon.
JP7308191B2 (ja) 2017-10-18 2023-07-13 フォーティ セブン， インコーポレイテッド 抗ｃｄ４７剤ベースの卵巣癌療法
US11771764B2 (en) 2017-11-06 2023-10-03 Pfizer Inc. CD47 blockade with radiation therapy
WO2019106912A1 (ja) 2017-11-29 2019-06-06 日本電気株式会社 情報処理システム、情報処理方法及び記憶媒体
GB201720077D0 (en) * 2017-12-01 2018-01-17 Univ Oxford Innovation Ltd Leukaemic stem cell
SG11202004864TA (en) 2017-12-01 2020-06-29 Seattle Genetics Inc Cd47 antibodies and uses thereof for treating cancer
US11891442B2 (en) 2017-12-22 2024-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for treating age-related diseases
CN111699005A (zh) 2018-02-12 2020-09-22 四十七公司 使用抗cd47抗体和抗cd20抗体的抗癌方案
PE20201265A1 (es) 2018-03-21 2020-11-19 Alx Oncology Inc Anticuerpos contra proteina alfa reguladora de senal y metodos de uso
CN110305212A (zh) 2018-03-27 2019-10-08 信达生物制药(苏州)有限公司 抗cd47抗体及其用途
JP7337099B2 (ja) 2018-05-25 2023-09-01 アレクトル エルエルシー 抗ｓｉｒｐａ抗体およびその使用法
WO2020033646A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Orionis Biosciences, Inc. SIRP1α TARGETED CHIMERIC PROTEINS AND USES THEREOF
US10780121B2 (en) 2018-08-29 2020-09-22 Shattuck Labs, Inc. FLT3L-based chimeric proteins
ES3007236T3 (en) 2018-09-04 2025-03-19 Pfizer Cd47 blockade with parp inhibition for disease treatment
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
BR112021005585A2 (pt) 2018-09-27 2021-06-29 Celgene Corporation proteínas de ligação a sirpa e métodos de uso das mesmas
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
WO2020097193A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
EA202190986A1 (ru) 2018-11-26 2021-12-14 Фоти Севен, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К c-Kit
EP3886869A4 (en) 2018-11-28 2022-07-06 Forty Seven, Inc. GENETICALLY MODIFIED ABLATION-RESISTANT HSPCS
US11026973B2 (en) 2019-04-30 2021-06-08 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
CN114126648A (zh) 2019-05-31 2022-03-01 Alx肿瘤生物技术公司 用SIRPα Fc融合体组合免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法
PH12021553197A1 (en) 2019-06-19 2022-11-07 Lepu Biopharma Co Ltd Anti-cd47 antibodies and uses thereof
WO2021011912A1 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Combination of integrin-targeting knottin-fc fusion and anti-cd47 antibody for the treatment of cancer
CN114981409A (zh) 2019-09-03 2022-08-30 美洛德生物医药公司 用于基因组整合的方法和组合物
WO2021053587A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Klaus Strein Bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
CN110755635B (zh) * 2019-11-14 2022-10-11 天津大学 Flu@α-cd47@RGD制剂的合成方法
CN121243368A (zh) 2019-11-27 2026-01-02 Alx肿瘤生物技术公司 用于治疗癌症的组合疗法
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
CA3164623A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Pfizer Inc. Antibodies specific for cd47, pd-l1, and uses thereof
EP4240367A4 (en) 2020-11-04 2024-10-16 Myeloid Therapeutics, Inc. MODIFIED CHIMERIC FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2022125439A2 (en) * 2020-12-07 2022-06-16 The Regents Of The University Of California Innate immune cell silencing by sirp-alpha engager
EP4262828A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics
TW202413428A (zh) 2020-12-23 2024-04-01 大陸商廣東菲鵬製藥股份有限公司 桃園路1號10棟301室 郵編：523808 靶向cd47的抗體、編碼其的核酸、包含其的載體、細胞、藥物組合物、其應用及其試劑盒
WO2022197949A2 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
JP2024515211A (ja) 2021-04-27 2024-04-05 ファイザー・インク Ｄｈｆｒ阻害剤を用いたｃｄ４７遮断療法の増強
BR112023023642A2 (pt) 2021-05-11 2024-01-30 Myeloid Therapeutics Inc Métodos e composições para integração genômica
JP7576358B2 (ja) * 2021-05-12 2024-10-31 国立大学法人北海道大学 急性骨髄性白血病の遺伝子パネル検査のためのアンプリコンｄｎａライブラリー、キット及びそれらの使用
JP2024520902A (ja) 2021-05-13 2024-05-27 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド がんを治療するための併用療法
EP4353265A4 (en) 2021-06-10 2024-10-02 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. METHOD OF TREATING CANCER BY MEANS OF A COMBINATION OF A CD47 INHIBITOR, AN IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR AND STANDARD THERAPY
US20250235504A1 (en) 2021-10-29 2025-07-24 Pfizer Inc. Enhancement of cd47 blockade with taxanes for cd47+ cancer therapy
US20250367255A1 (en) 2021-11-08 2025-12-04 Pfizer Inc. Enhancement Of CD47 Blockade Therapy With Anti-VEGF Agents
CN114262731B (zh) * 2021-12-22 2024-01-23 上海国奥源华安生物科技有限公司 一种检测膀胱癌细胞用检测试剂盒及其制备方法、膀胱癌细胞的检测方法
US20250302953A1 (en) 2022-02-14 2025-10-02 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
KR20250116736A (ko) 2022-12-09 2025-08-01 화이자 인코포레이티드 Cd47 차단제 및 항-bcma/항-cd3 이중특이성 항체 병용 요법
WO2024124107A2 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Pfizer Inc. Cd47 blocking agent and anti-cd20 / anti-cd3 bispecific antibody combination therapy
WO2025088065A1 (en) * 2023-10-25 2025-05-01 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Diagnosis and therapy of aml
CN120758635B (zh) * 2025-09-09 2025-12-30 宁波大学附属第一医院 急性髓系白血病的辅助诊断、预后诊断或危险度分层circRNA标记物及其应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1132408A (en) 1914-06-03 1915-03-16 Joseph Tabor Train-stopping apparatus.
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
JPS6280161U (es) 1985-11-08 1987-05-22
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US5985660A (en) 1994-06-15 1999-11-16 Systemix, Inc. Method of identifying biological response modifiers involved in dendritic and/or lymphoid progenitor cell proliferation and/or differentiation
DK0932417T3 (da) * 1996-10-17 2003-04-14 Immunomedics Inc Non-antigent toxinkonjugat og fusionsprotein af internaliserende receptorsystem
US6908763B1 (en) 1997-08-22 2005-06-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mammalian common lymphoid progenitor cell
HUP0003513A3 (en) * 1997-09-11 2004-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Monoclonal antibody inducing apoptosis
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
CA2279474C (en) * 1998-07-31 2011-01-04 Stemcell Technologies Inc. Novel antibody composition for debulking blood and bone marrow samples from cml patients
US7696325B2 (en) 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
US7312318B2 (en) * 2002-03-01 2007-12-25 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
CA2375974C (en) 1999-06-29 2010-11-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mammalian myeloid progenitor cell subsets
DE19952960A1 (de) 1999-11-03 2001-05-10 Mark Andre Freyberg Verfahren zur Identifizierung von anti-apoptotisch wirksamen Verbindungen
GB9930706D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Medical Res Council Composition for inhibiting macrophage activity
NZ521255A (en) * 2000-03-06 2007-01-26 Univ Kentucky Res Found Methods to impair hematologic cancer progenitor cells and compounds related thereto
TWI241345B (en) 2000-03-10 2005-10-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Apoptosis inducing polypeptide
DE10034607A1 (de) * 2000-07-20 2002-02-07 Gundram Jung Multispezifisches Reagenz zur selektiven Stimulierung von Zelloberflächenrezeptoren
EP1455820A2 (en) * 2001-03-09 2004-09-15 William Herman Targeted ligands
JP4200100B2 (ja) * 2001-11-07 2008-12-24 アジェンシス，インコーポレイテッド 癌の処置および検出において有用な１６１ｐ２ｆ１０ｂと称される、核酸および対応タンパク質
US20050142539A1 (en) * 2002-01-14 2005-06-30 William Herman Targeted ligands
US20040213792A1 (en) 2003-04-24 2004-10-28 Clemmons David R. Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
JP3936673B2 (ja) * 2003-06-02 2007-06-27 国立大学法人群馬大学 Ｃｄ４７部分ペプチドと抗ｓｈｐｓ−１モノクロナール抗体
CA2545166A1 (en) 2003-11-11 2005-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-cd47 antibody
WO2005111623A1 (en) * 2004-05-17 2005-11-24 Crucell Holland B.V. Methods for diagnosis of acute myeloid leukemia
EP1841467A4 (en) * 2005-01-14 2009-01-28 Cytogen Corp COMBINATION CANCER THERAPY WITH ANTI-PSMA ANTIBODIES
HUE025945T2 (en) * 2005-02-15 2016-07-28 Univ Duke Anti-CD19 antibodies and their applications in oncology
CA2607444C (en) * 2005-04-22 2015-03-10 Morphotek, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells
PL1874821T3 (pl) 2005-04-26 2013-09-30 Trion Pharma Gmbh Kombinacja przeciwciał i glikokortykoidów do leczenia raka
JP2007008895A (ja) 2005-07-04 2007-01-18 Chugai Pharmaceut Co Ltd 抗ｃｄ４７抗体とインテグリンリガンドとの併用
JP2005333993A (ja) * 2005-08-03 2005-12-08 Tohoku Techno Arch Co Ltd 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
WO2007033221A2 (en) * 2005-09-13 2007-03-22 The General Hospital Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses
US7514229B2 (en) 2005-09-29 2009-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for diagnosing and evaluating treatment of blood disorders
US20090191202A1 (en) 2005-09-29 2009-07-30 Jamieson Catriona Helen M Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD47
JP5025724B2 (ja) * 2006-04-18 2012-09-12 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション 循環腫瘍性細胞からのタンパク質の検出
JP2009537145A (ja) * 2006-05-15 2009-10-29 バイラル ロジック システムズ テクノロジー コーポレーション 免疫学的疾患および障害を治療するためのｃｄ４７と関連した組成物および方法
WO2008073316A2 (en) * 2006-12-07 2008-06-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and isolation of acute myeloid leukemia stem cells
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
EP2573112A1 (en) * 2007-10-11 2013-03-27 The Hospital For Sick Children Modulation of sirpa - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
EP3043181B1 (en) 2008-01-15 2020-04-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
US11072655B2 (en) 2008-01-15 2021-07-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
ES2582340T3 (es) * 2008-01-15 2016-09-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Métodos para manipular fagocitosis mediada por CD47
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
AU2009279676C1 (en) 2008-08-07 2015-08-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Radioprotectants targeting thrombospondin-1 and CD47
HRP20150553T1 (hr) 2009-05-15 2015-08-28 University Health Network Sastavi i metode za lijeäśenje hematoloških maligniteta ciljajuä†i sirp - cd47 interakciju
CN101562733B (zh) * 2009-05-20 2012-09-05 中兴通讯股份有限公司 将视频采集设备接入次世代网络的装置及方法
CA2771336C (en) 2009-09-15 2019-11-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
PT2569013T (pt) 2010-05-14 2017-02-08 Univ Leland Stanford Junior Anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos para cd47
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
BR112015013431A2 (pt) 2012-12-12 2017-11-14 Vasculox Inc anticorpos monoclonais ou respectivos fragmentos ligantes de antígenos, composição farmacêutica, e usos de anticorpo monoclonal ou respectivo fragmento ligante de antígenos
CN112245586A (zh) 2013-03-15 2021-01-22 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于实现治疗有效剂量的抗cd47剂的方法
CN106456749B (zh) 2014-03-11 2021-03-30 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗SIRPα抗体和双特异性巨噬细胞增强型抗体
WO2018237168A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Dosing parameters for cd47 targeting therapies to hematologic malignancies

Also Published As

Publication number Publication date
DK3056514T4 (da) 2025-10-20
FI3056515T4 (fi) 2025-09-26
US20250333502A1 (en) 2025-10-30
JP7412513B2 (ja) 2024-01-12
PL4144367T3 (pl) 2026-03-30
JP6960507B2 (ja) 2021-11-05
EP4144367C0 (en) 2025-12-03
US20160009814A1 (en) 2016-01-14
JP2023017014A (ja) 2023-02-02
US9624305B2 (en) 2017-04-18
US20170320945A1 (en) 2017-11-09
JP2024026513A (ja) 2024-02-28
JP2016183182A (ja) 2016-10-20
DK3056515T3 (da) 2019-07-01
ES2735144T3 (es) 2019-12-16
JP7193601B2 (ja) 2022-12-20
US20140065169A1 (en) 2014-03-06
US9611329B2 (en) 2017-04-04
US12162939B2 (en) 2024-12-10
US20140161825A1 (en) 2014-06-12
DK2242512T3 (en) 2016-06-06
CA3170329A1 (en) 2009-07-23
FI3056514T4 (fi) 2025-10-06
US9605076B2 (en) 2017-03-28
US20160176976A1 (en) 2016-06-23
EP4144367A1 (en) 2023-03-08
CA2711938C (en) 2019-11-12
US8562997B2 (en) 2013-10-22
JP2014148521A (ja) 2014-08-21
US10640561B2 (en) 2020-05-05
AU2009205665A1 (en) 2009-07-23
JP2020172547A (ja) 2020-10-22
JP6002710B2 (ja) 2016-10-05
US20220267439A1 (en) 2022-08-25
JP2019163342A (ja) 2019-09-26
ES2740823T5 (en) 2025-12-26
JP2018065871A (ja) 2018-04-26
US9765143B2 (en) 2017-09-19
EP4144367B1 (en) 2025-12-03
AU2009205665B2 (en) 2013-12-05
DK3056515T4 (da) 2025-10-20
JP7638360B2 (ja) 2025-03-03
CA3054220C (en) 2022-10-11
CA2711938A1 (en) 2009-07-23
US20210238284A1 (en) 2021-08-05
US20160009815A1 (en) 2016-01-14
JP2011519345A (ja) 2011-07-07
DK3056514T3 (da) 2019-07-01
US9493575B2 (en) 2016-11-15
US20190233515A1 (en) 2019-08-01
PT2242512T (pt) 2016-07-18
JP6556271B2 (ja) 2019-08-07
JP6280161B2 (ja) 2018-02-14
US20160200816A1 (en) 2016-07-14
US9399682B2 (en) 2016-07-26
EP2242512B1 (en) 2016-04-27
ES2582340T3 (es) 2016-09-12
ES2740823T3 (es) 2020-02-06
ES2735144T5 (en) 2026-01-02
JP6742482B2 (ja) 2020-08-19
JP2022001593A (ja) 2022-01-06
US20170190776A1 (en) 2017-07-06
PT3056515T (pt) 2019-07-19
EP2242512A4 (en) 2012-07-25
PT3056514T (pt) 2019-07-19
EP2242512A1 (en) 2010-10-27
WO2009091601A1 (en) 2009-07-23
US20110014119A1 (en) 2011-01-20
CA3054220A1 (en) 2009-07-23
US20160176978A1 (en) 2016-06-23
JP5547656B2 (ja) 2014-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3060476T3 (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
EP3056515B2 (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
US20140161805A1 (en) Methods for Manipulating Phagocytosis Mediated by CD47
AU2014201010B2 (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD47
AU2021240137B2 (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD74
HK40088830A (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
HK1227900A1 (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
HK1227902A1 (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
HK1227900B (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
HK1227902B (en) Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47