ES3061210T3

ES3061210T3 - Gene therapy for ocular disorders

Info

Publication number: ES3061210T3
Application number: ES20183330T
Authority: ES
Inventors: Jean Bennett; Jeannette Bennicelli; Junwei Sun
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2026-03-31
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: CN109069668A; EP3795180A1; JP7057281B2; US11090392B2; BR112018011838A2; KR20180099719A; MX2018007230A; ES2826384T3; MX2022010959A; EP3389724B1; JP2019502378A; AU2016370487A1; CN109069668B; JP2022088656A; US20200061209A1; RU2018125468A3; WO2017106202A2; AU2016370487C1; RU2018125468A; US20210330816A1

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos oculares en un sujeto. En un aspecto, se proporciona un vector viral adenoasociado que incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica CNGA3. En otro aspecto, se proporciona un vector viral adenoasociado que incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica CNGB3. En otro aspecto, se proporciona un vector viral adenoasociado que incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica REP-1. En las modalidades deseadas, el sujeto es humano, gato, perro, oveja o primate no humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Terapia génica para trastornos oculares

[0003] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] La coroideremia (CHM) es una enfermedad retiniana hereditaria ligada al cromosoma X que se caracteriza por la degeneración de los fotorreceptores, el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la coriocapilar. Los síntomas se desarrollan en la 1.ª o 2.ª década de vida con quejas de mala visión nocturna (nictalopía) y pérdida progresiva de la visión periférica. Los campos visuales se reducen a medida que la enfermedad avanza. Esto culmina con la pérdida de la visión central (agudeza visual) y la ceguera ya en la cuarta década de vida. Se han encontrado más de 140 mutaciones en el gen CHM que causan coroideremia. Las mutaciones pueden dar lugar a la producción de una proteína escolta Rab 1 (REP-1) anormalmente pequeña, no funcional y/o inestable, a una disminución de la función de la proteína o a la pérdida de la producción de la proteína REP-1. La falta de REP-1 normal altera la capacidad de las proteínas Rab para ayudar en el tráfico intracelular. La inmovilidad de las proteínas y los orgánulos dentro de la célula hace que las células funcionen mal y mueran prematuramente.

[0005] El gen de la coroideremia, CHM, codifica la proteína escolta Rab-1 (REP-1), una proteína de 653 aminoácidos que participa en la regulación del tráfico de membranas. Dado que el locus CHM se encuentra en el cromosoma X, la coroideremia solo se diagnostica normalmente en varones. Aunque las mujeres portadoras de la enfermedad suelen ser asintomáticas, los exámenes de retina a menudo revelan una degeneración irregular de la retina y el EPR, y las mujeres pueden verse afectadas dependiendo del grado de inactivación del cromosoma X normal (lionización). Coussa, RG, Traboulsi, EI (2012) Choroideremia: a review of general findings and pathogenesis, Ophthalmic Genet 33(2):57-65. Véase también Vasireddy et al, AAV-mediated gene therapy for choroideremia: preclinical studies in personalized models. PLoS One.7 de mayo de 2013;8(5):e61396.

[0006] La acromatopsia es un grupo heterogéneo de enfermedades retinianas hereditarias autosómicas recesivas que se caracterizan por una disminución temprana de la agudeza visual, daltonismo parcial o total, nistagmo, fotoaversión y pérdida de la función de los fotorreceptores de los conos. Aproximadamente el 80 % de los pacientes con acromatopsia presentan mutaciones en la subunidad alfa o beta (A3 y B3) del canal catiónico controlado por cGMP, el canal regulado por nucleótidos cíclicos (CNG) de los fotorreceptores de los conos. Homólogos a la enfermedad humana, los ratones con deficiencia de Cnga3 revelan una pérdida de la funcionalidad específica de los conos que conduce al mal funcionamiento y la degeneración de los fotorreceptores de los conos afectados.

[0007] Por lo tanto, se necesitan composiciones útiles para expresar CNGA3 o CNGB3 en sujetos humanos.

[0008] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0009] La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. La coroideremia (CHM) es una degeneración retiniana ligada al cromosoma X que es sintomática en la 1.ª o 2.ª década de vida y causa nictalopía y pérdida de la visión periférica. La enfermedad progresa hasta la mediana edad, cuando la mayoría de los pacientes quedan ciegos. La CHM es un objetivo favorable para la terapia de aumento génico, ya que la enfermedad se debe a la pérdida de función de una proteína necesaria para la salud de las células retinianas, la proteína escolta Rab 1 (REP1), que está codificada por el genCHM. El ADNc de CHM puede encapsidarse en un virus adenoasociado recombinante (rAAV), que tiene un historial consolidado en estudios de terapia génica en humanos. Además, existen ensayos sensibles y cuantitativos para documentar la actividad de la REP1, incluida su capacidad para prenilar proteínas Rab como Rab27 y para corregir un defecto en la localización y el tráfico de Rab27 debido a la falta de prenilación en las células deficientes en REP-1.

[0010] En el presente documento se describe una secuencia de ADNc optimizada por codones que codifica la proteína escolta Rab 1 (REP-1). La secuencia de ADNc optimizada por codones puede ser una variante de SEQ ID NO: 3. La secuencia de ADNc optimizada por codones puede ser SEQ ID NO: 1. La secuencia de ADNc puede estar optimizada por codones para su expresión en humanos.

[0011] También se describe un casete de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP-1. El casete de expresión puede incluir la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 1. La secuencia codificante de REP-1 puede estar situada entre las secuencias de ITR de 5' y 3' del AAV. El genoma del vector puede incluir toda la secuencia de ácido nucleico entre, e incluyendo, la ITR de 5' y la ITR de 3'.

[0012] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector AAV incluye una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína escolta humana 1 (REP-1), y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de REP-1 a una célula hospedadora. La secuencia REP-1 puede codificar una proteína REP-1 de longitud completa. La secuencia REP-1 puede ser la secuencia de proteína de SEQ ID NO: 2.

[0013] También se describe una secuencia de ADNc optimizada por codones que codifica el canal alfa 3 activado por nucleótidos cíclicos (CNGA3). La secuencia de ADNc optimizada por codones puede ser una variante de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15. La secuencia de ADNc optimizada por codones puede ser SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11. La secuencia de ADNc puede estar optimizada por codones para su expresión en humanos.

[0014] También se describe un casete de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica el canal alfa 3 activado por nucleótidos cíclicos (CNGA3). El casete de expresión puede incluir la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15. La secuencia codificante de CNGA3 puede estar situada entre las secuencias de ITR de 5' y 3' del AAV.

[0015] También se describe un casete de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica el canal alfa 3 activado por nucleótidos cíclicos (CNGB3). El casete de expresión puede incluir la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. La secuencia codificante de CNGB3 puede estar situada entre las secuencias de ITR de 5' y 3' del AAV.

[0016] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector de AAV incluye una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que codifica CNGA3 humano, y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de CNGA3 a una célula hospedadora. La secuencia CNGA3 puede codificar una proteína CNGA3 de longitud completa. La secuencia CNGA3 puede ser la secuencia de proteína de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14. También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector de AAV incluye una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que codifica CNGB3 humano, y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de CNGB3 a una célula hospedadora. La secuencia CNGB3 puede codificar una proteína CNGB3 de longitud completa. La secuencia CNGB3 puede ser la secuencia de proteína de SEQ ID NO: 20.

[0017] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican REP-1, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedadora.

[0018] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGA3, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de CNGA3 en una célula hospedadora.

[0019] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGB3, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de CNGB3 en una célula hospedadora.

[0020] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV2 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican REP-1, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedadora.

[0021] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV2 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGA3, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de CNGA3 en una célula hospedadora.

[0022] También se describe un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV2 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGB3, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de CNGB3 en una célula hospedadora.

[0023] También se describe una composición farmacéutica que incluye un portador, un diluyente, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable y al menos un vector vírico como se describe en el presente documento.

[0024] También se describe una composición farmacéutica que comprende un portador, un diluyente, un excipiente y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable y la secuencia de ácido nucleico, un plásmido, un vector o un vector vírico, como el rAAV, descrito específicamente en el presente documento.

[0025] También se describe un método para tratar la coroideremia. El método puede incluir la administración de una composición que incluye el vector de AAV que codifica REP-1, como se describe en el presente documento, a un sujeto que lo necesite.

[0026] También se describe un método para tratar la acromatopsia. El método puede incluir la administración de una composición que incluye el vector de AAV que codifica CNGA3, como se describe en el presente documento, a un sujeto que lo necesite.

[0027] También se describe un método para tratar la acromatopsia. El método puede incluir la administración de una composición que incluye el vector de AAV que codifica CNGB3, como se describe en el presente documento, a un sujeto que lo necesite.

[0028] También se describe un plásmido para producir un vector de AAV. El plásmido puede incluir la secuencia de ADNc optimizada por codones que codifica REP-1. El plásmido puede incluir la secuencia de ADNc optimizada por codones que codifica CNGA3, como se describe en el presente documento. El plásmido puede incluir una secuencia de ADNc optimizada por codones que codifica CNGB3, que es una secuencia que comparte al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21. El plásmido puede ser modular.

[0029] También se describe un método para generar un virus rAAV. El método incluye el cultivo de una célula de encapsidación que porta el plásmido descrito en el presente documento en presencia de secuencias víricas suficientes para permitir la encapsidación del genoma vírico del casete de expresión génica en una envoltura o cápside infecciosa de AAV. También se describe un AAV recombinante producido según el método.

[0030] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0031] La FIG. 1A y la FIG. 1B son geles que muestran la expresión de la proteína REP-1in vitrotras la transfección de células HEK 84-31 cultivadas. El primer carril de cada gel muestra la expresión de REP-1 optimizada por codones, como se describe en el presente documento, expresada a partir del plásmido p944. El segundo carril muestra la expresión de REP-1 nativa a partir del plásmido p742. El tercer carril muestra la expresión endógena de REP-1 por las células 84-31 que no fueron transfectadas con un plásmido. El último carril es un blanco. Los geles demuestran que la secuencia de REP-1 optimizada por codones, como se describe en el presente documento, da lugar a un nivel de expresión de la proteína más alto que la secuencia de REP-1 nativa, y que los niveles de expresión de los plásmidos transfectados de forma exógena son mucho más altos que la expresión endógena de REP-1.

[0032] La FIG. 2 es una alineación de la secuencia codificante de REP-1 nativa de SEQ ID NO: 1 frente a la secuencia codificante de REP-1 optimizada por codones de SEQ ID NO: 3.

[0033] La FIG. 3 es una alineación de la secuencia codificante de CNGA3 nativa de SEQ ID NO: 13 frente a la secuencia codificante de CNGA3 optimizada por codones de SEQ ID NO: 9.

[0034] La FIG. 4 es una alineación del ORF nativo de CNGB3 (SEQ ID NO: 19) frente al ORF modificado de CNGB3 (SEQ ID NO: 21) frente al ORF modificado de CNGB3 con extremos modificados (SEQ ID NO: 23). Se resaltan las mutaciones puntuales.

[0035] La FIG.5 es un mapa plasmídico de p584, descrito en el presente documento. La secuencia de p584 se muestra en SEQ ID NO: 7.

[0036] La FIG. 6 es un mapa plasmídico de AAV.hCHMco.Versión 2a, descrito en el presente documento. La secuencia de la Versión 2a se muestra en SEQ ID NO: 25.

[0037] La FIG. 7 es un mapa plasmídico de AAV.hCHMco.Versión 2b, descrito en el presente documento. La secuencia de la Versión 2b se muestra en SEQ ID NO: 26.

[0038] La FIG. 8 es un mapa plasmídico de AAV.hCHMco.Versión 3a, descrito en el presente documento. La secuencia de la Versión 3a se muestra en SEQ ID NO: 27.

[0039] La FIG. 9 es un mapa plasmídico de AAV.hCHMco.Versión 3b, descrito en el presente documento. La secuencia de la Versión 3b se muestra en SEQ ID NO: 28.

[0040] La FIG. 10 es un mapa plasmídico de AAV.hCHM.Versión 1, descrito en el presente documento. La secuencia de la Versión 1 se muestra en SEQ ID NO: 29.

[0041] La FIG. 11 es una representación gráfica del efecto de la inserción lambda en la impureza del producto de AAV. Todos los vectores de la versión a (que contienen lambda) tienen señales Kan+ muy reducidas en la prueba qPCR. La FIG. 12A es una transferencia Western que muestra la detección con anticuerpo anti-REP-1 humano de una proteína de ~75-80 kDa en tejidos oculares de ratones CD-1 inyectados con AAV8.2b a 5E9 (dosis alta) copias del genoma del vector. Los animales inyectados con AAV8.2b a 5E8 (dosis baja) mostraron una banda de proteína muy débil a ~75-80 kDa. La FIG. 12B es un análisis de transferencia Western de tejidos oculares de ratones CD1 inyectados con AAV8.3b (2 ratones/grupo) detectados con anticuerpo anti-REP-1, que reveló la presencia de una proteína de ~75-80 kDa en un ojo inyectado con dosis baja y en ambos ojos inyectados con dosis alta de AAV8.3b. En los tejidos oculares de los ratones no inyectados no se detectó expresión de REP-1.

[0042] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0043] Los métodos y composiciones descritos en el presente documento implican composiciones y métodos para administrar CHM optimizado que codifica REP-1 a sujetos mamíferos para el tratamiento de trastornos oculares, principalmente enfermedades que causan ceguera, como la coroideremia. Además, los métodos y composiciones descritos en el presente documento implican composiciones y métodos para administrar CNGA3 o CNGB3 optimizados a sujetos mamíferos para el tratamiento de trastornos oculares, principalmente enfermedades que causan ceguera, como la acromatopsia. Dichas composiciones pueden implicar la optimización por codones de la secuencia codificante de REP-1, CNGA3 o CNGB3. Se cree que estas características aumentan la eficacia del producto y aumentan la seguridad, ya que se usa una dosis menor de reactivo. Se prevé que esta optimización del casete transgénico podría, en teoría, maximizar el nivel de producción de la proteína experimental en comparación con los niveles que se pueden generar usando la secuencia endógena. Sin embargo, también se incluyen en el presente documento composiciones que incluyen las secuencias codificantes nativas de REP1, CNGA3 y CNGB3, como se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. Debe entenderse que cuando se describe un ejemplo para REP-1, CNGA3 o CNGB3, se pretende citar un ejemplo similar para los demás. Los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención y por referencia a textos publicados, que proporcionan a un experto en la materia una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud. Las definiciones contenidas en esta memoria descriptiva se proporcionan para mayor claridad en la descripción de los componentes y composiciones del presente documento y no pretenden limitar la invención reivindicada. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones.

[0044] El gen de la coroideremia,CHM,codifica la proteína escolta Rab 1 (REP-1), una proteína de 653 aminoácidos que se cree que participa en el tráfico de membranas. Como se usa en el presente documento, los términos «REP-1» y «CHM» se usan indistintamente cuando se refieren a la secuencia codificante. Dado que el locus CHM se encuentra en el cromosoma X, la coroideremia solo se diagnostica normalmente en varones. Aunque las mujeres portadoras de la enfermedad suelen ser asintomáticas, los exámenes de retina a menudo revelan una degeneración irregular de la retina y el EPR, y las mujeres pueden verse afectadas dependiendo del grado de inactivación del cromosoma X normal (lionización). Véase Coussa, citado anteriormente. La secuencia de aminoácidos nativa que codifica REP-1 humana se encuentra en el número de acceso del GenBank P24386 y se reproduce aquí en SEQ ID NO: 2. La secuencia de ácido nucleico nativo humano del CHM se reproduce aquí en SEQ ID NO: 3 (número de acceso NM_000390.2).

[0045] Los canales iónicos regulados por nucleótidos cíclicos (CNG) son mediadores clave que subyacen a la transducción de señales en los receptores retinianos y olfativos. Se sabe que los defectos genéticos en CNGA3 y CNGB3, que codifican dos subunidades estructuralmente relacionadas de los canales CNG de los conos, provocan acromatopsia. CNGA3 es una proteína de 694 aminoácidos. CNGB es una proteína de 809 aminoácidos.

[0046] La acromatopsia es un grupo heterogéneo de trastornos retinianos congénitos, autosómicos recesivos, que se manifiestan por una disfunción temprana de los fotorreceptores de los conos, una agudeza visual muy reducida, daltonismo parcial o total y fotofobia. La secuencia de ácido nucleico nativo que codifica el CNGA3 humano se informa en el número de acceso del GenBank XM_011210554.1 y se reproduce en SEQ ID NO: 13. La secuencia de ácido nucleico nativo que codifica el CNGA3 humano se informa en el número de acceso del GenBank XM_011210554.1 y se reproduce en SEQ ID NO: 13. La secuencia de ácido nucleico nativo de la variante X1 de CNGA3 humano, que incluye un exón adicional, se informa en el número de acceso del GenBank NM_001298.2 y se reproduce en SEQ ID NO: 15. La secuencia de ácido nucleico nativo que codifica CNGB3 humano se reproduce en SEQ ID NO: 19.

[0047] En ciertos ejemplos descritos en el presente documento, un sujeto tiene un «trastorno ocular», para cuyo tratamiento se han diseñado los componentes, composiciones y métodos de esta divulgación. Como se usa en el presente documento, el término «sujeto» como se usa en el presente documento se refiere a un animal mamífero, incluyendo un ser humano, un animal veterinario o de granja, un animal doméstico o una mascota, y animales normalmente usados para la investigación clínica. El sujeto de estos métodos y composiciones puede ser un ser humano. Aún otros sujetos adecuados incluyen, sin limitación, ratones, ratas, perros, felinos, porcinos, bovinos, ovinos, primates no humanos y otros. Como se usa en el presente documento, el término «sujeto» se usa indistintamente con «paciente».

[0048] Como se usa en el presente documento, «trastorno ocular» incluye distrofias de conos y bastones y enfermedades de la retina, incluyendo, sin limitación, la enfermedad de Stargardt (autosómica dominante o autosómica recesiva), la retinitis pigmentosa y la distrofia de patrón. En los ejemplos, el sujeto tiene acromatopsia. En los ejemplos, el sujeto tiene coroideremia o una degeneración retiniana hereditaria ligada al cromosoma X. Los signos clínicos de dichas enfermedades oculares incluyen, pero no están limitados a, disminución de la visión periférica, disminución de la visión central (lectura), disminución de la visión nocturna, pérdida de la percepción del color, reducción de la agudeza visual, disminución de la función de los fotorreceptores, cambios pigmentarios y, en última instancia, ceguera.

[0049] Como se usa en el presente documento, el término «tratamiento» o «tratar» se define como la administración a un sujeto de uno o más compuestos o composiciones descritos en el presente documento con el fin de mejorar uno o más síntomas de una enfermedad ocular. Por lo tanto, el «tratamiento» puede incluir uno o más de reducir la aparición o la progresión de una enfermedad ocular, prevenir la enfermedad, reducir la gravedad de los síntomas de la enfermedad o retrasar su progresión, incluida la progresión de la ceguera, eliminar los síntomas de la enfermedad, retrasar la aparición de la enfermedad o controlar la progresión de la enfermedad o la eficacia de la terapia en un sujeto determinado.

[0051] El término «exógeno», como se usa para describir una secuencia de ácido nucleico o una proteína, significa que el ácido nucleico o la proteína no se encuentran de forma natural en la posición en la que existen en un cromosoma o en una célula hospedadora. Una secuencia de ácido nucleico exógena también se refiere a una secuencia derivada e insertada en la misma célula hospedadora o sujeto, pero que está presente en un estado no natural, por ejemplo, con un número de copias diferente o bajo el control de diferentes elementos reguladores.

[0053] El término «heterólogo», como se usa para describir una secuencia de ácido nucleico o una proteína, significa que el ácido nucleico o la proteína se derivó de un organismo diferente o de una especie diferente del mismo organismo que la célula hospedadora o el sujeto en el que se expresa. El término «heterólogo», cuando se usa en referencia a una proteína o un ácido nucleico en un plásmido, casete de expresión o vector, indica que la proteína o el ácido nucleico está presente con otra secuencia o subsecuencia con la que la proteína o el ácido nucleico en cuestión no se encuentra en la misma relación entre sí en la naturaleza.

[0055] Los términos «porcentaje (%) de identidad», «identidad de secuencia», «porcentaje de identidad de secuencia» o «porcentaje idéntico» en el contexto de las secuencias de ácido nucleico se refieren a las bases de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para su correspondencia. El porcentaje de identidad se determina comparando dos secuencias alineadas en condiciones óptimas sobre las secuencias que se van a comparar. La longitud de la comparación de identidad de secuencias puede ser la longitud completa de la secuencia codificante de REP-1, CNGA3 o CNGB3, o un fragmento de al menos aproximadamente 100 y 150 nucleótidos, o según se desee. Sin embargo, también puede ser deseable la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo, de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, normalmente de al menos aproximadamente 20 a 24 nucleótidos, al menos aproximadamente 28 a 32 nucleótidos, al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. También hay disponibles programas de alineación de secuencias múltiples para secuencias de ácido nucleico. Ejemplos de dichos programas incluyen «Clustal W», «CAP Sequence Assembly», «BLAST», «MAP» y «MEME», a los que se puede acceder a través de servidores web en Internet. Otros expertos en la materia conocen otras fuentes de dichos programas. Alternativamente, también se usan las utilidades Vector NTI. También hay una serie de algoritmos conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos, incluidos los contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse usando Fasta<™>, un programa de GCG Versión 6.1. También puede usarse software de análisis de secuencias comúnmente disponible, más específicamente, BLAST o herramientas de análisis proporcionadas por bases de datos públicas.

[0057] El término «aislado» significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se trata de un material natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado, incluso si posteriormente se reintroduce en el sistema natural. Dichos polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían formar parte de una composición, y seguir estando aislados, ya que dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural.

[0059] Por «modificado genéticamente» se entiende que las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína REP-1 o CNGA3 o CNGB3 descritas en el presente documento se ensamblan y se colocan en cualquier elemento genético adecuado, por ejemplo, ADN desnudo, fago, transposón, cósmido, episoma, etc., que transfiere las secuencias de REP-1, CNGA3 o CNGB3 que lleva a una célula hospedadora, por ejemplo, para generar sistemas de administración no víricos (por ejemplo, sistemas basados en ARN, ADN desnudo o similares) o para generar vectores víricos en una célula hospedadora de encapsidación y/o para su administración a células hospedadoras en un sujeto. El elemento genético puede ser un plásmido. Los métodos usados para preparar dichas construcciones modificadas son conocidos por los expertos en manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

[0061] El término «transgén», como se usa en el presente documento, significa una secuencia de ácido nucleico exógena o modificada que codifica una proteína que está bajo el control de un promotor o una secuencia de control de la expresión en un casete de expresión, genoma de rAAV, plásmido recombinante o plásmido de producción, vector o célula hospedadora descrita en esta memoria descriptiva. El transgén puede ser una secuencia de CHM (REP-1) humana, que codifica una proteína REP-1 funcional. El transgén puede ser un ácido nucleico de CHM (REP-1) optimizado por codones que codifica la secuencia de aminoácidos de REP-1 establecida en SEQ ID NO: 2. El transgén puede estar codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. = El transgén de REP-1 puede estar codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 5 incluye extremos modificados, que incluyen sitios de restricción para la clonación en un plásmido, como un plásmido de producción descrito en el presente documento.

[0062] En la invención reivindicada, el transgén es una secuencia de CNGA3 humana, que codifica una proteína CNGA3 funcional. El transgén puede ser una secuencia codificante de CNGA3 optimizada por codones de SEQ ID NO: 10. En determinadas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9. El transgén puede incluir extremos modificados, tales como los mostrados en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, que incluyen sitios de restricción para la clonación en un plásmido, tal como un plásmido descrito en el presente documento. El transgén puede ser una secuencia codificante de CNGA3 optimizada por codones de SEQ ID NO: 12. En determinadas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 11. El transgén puede estar codificado por la secuencia codificante nativa de CNGA3, que se establece en SEQ ID NO: 13.

[0063] El transgén puede ser una secuencia de CNGB3 humana, que codifica una proteína CNGB3 funcional. El transgén puede ser una secuencia codificante de CNGB3 optimizada por codones que es una secuencia que comparte al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 19 o 21. El transgén puede estar codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 23. SEQ ID NO: 23 incluye extremos modificados, que incluyen sitios de restricción para la clonación en un plásmido, como un plásmido de producción descrito en el presente documento. Los nucleótidos 13 a 2448 de SEQ ID NO: 23 proporcionan el ORF para CNGB3. El transgén puede ser una secuencia codificante de CNGB3 optimizada por codones de SEQ ID NO: 20. El transgén puede estar codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 19. El transgén puede estar codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 21. El transgén puede incluir extremos modificados para la clonación en un plásmido, como los plásmidos descritos en el presente documento. SEQ ID NO: 21 es una secuencia de ADNc novedosa en la que se han realizado ciertas mutaciones silenciosas en la secuencia codificante nativa. Se contemplan modificaciones adicionales a la secuencia nativa, como se describe en el presente documento.

[0064] Como se describe en el presente documento, la secuencia de ácido nucleico que codifica REP-1, CNGA o CNGB comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador unido covalentemente al mismo. El polipéptido con marcador puede seleccionarse de «marcadores de epítopo» conocidos, incluyendo, sin limitación, un polipéptido con marcador myc, un polipéptido con marcador glutatión-S-transferasa, un polipéptido con marcador proteína fluorescente verde, un polipéptido con marcador myc-piruvato cinasa, un polipéptido con marcador His6, un polipéptido con marcador hemaglutinina del virus de la gripe, un polipéptido con marcador flag y un polipéptido con marcador proteína de unión a maltosa.

[0065] Un «vector», como se usa en el presente documento, es una molécula de ácido nucleico en la que se puede insertar un transgén de ácido nucleico exógeno, heterólogo o modificado genéticamente, que luego se puede introducir en una célula hospedadora adecuada. Los vectores tienen preferiblemente uno o más orígenes de replicación y uno o más sitios en los que se puede insertar el ADN recombinante. Los vectores suelen tener medios convenientes por los que se pueden seleccionar las células con vectores de las que no los tienen, por ejemplo, codifican genes de resistencia a fármacos. Los vectores comunes incluyen plásmidos, genomas víricos y (principalmente en levaduras y bacterias) «cromosomas artificiales». En el presente documento se describen determinados plásmidos.

[0066] Los «vectores víricos» se definen como virus defectuosos en la replicación que contienen el transgén de ácido nucleico exógeno o heterólogo de CHM (REP-1) o CNGA3 o CNGB3. Un casete de expresión como el descrito en el presente documento puede diseñarse en un plásmido que se usa para la administración de fármacos o para la producción de un vector vírico. Los vectores víricos adecuados son preferiblemente defectuosos en la replicación y se seleccionan de aquellos que se dirigen a las células oculares. Los vectores víricos pueden incluir cualquier virus adecuado para la terapia génica, incluyendo, pero no están limitados a, adenovirus, virus del herpes, lentivirus, retrovirus, parvovirus, etc. Sin embargo, para facilitar la comprensión, en el presente documento se hace referencia al virus adenoasociado como un vector vírico a modo de ejemplo.

[0067] Un «virus defectuoso en la replicación» o «vector vírico» se refiere a una partícula vírica sintética o recombinante en la que un casete de expresión que contiene un gen de interés se encapsida en una cápside o envoltura vírica, donde cualquier secuencia genómica vírica también encapsidada dentro de la cápside o envoltura vírica es deficiente en replicación; es decir, no pueden generar viriones descendientes, pero conservan la capacidad de infectar las células diana. El genoma del vector vírico puede no incluir genes que codifiquen las enzimas necesarias para la replicación (el genoma puede manipularse para que sea «sin tripas» - que contenga solo el transgén de interés flanqueado por las señales necesarias para la amplificación y la encapsidación del genoma artificial), pero estos genes pueden suministrarse durante la producción. Por lo tanto, se considera seguro para su uso en terapia génica, ya que la replicación y la infección por viriones descendientes no pueden producirse excepto en presencia de la enzima vírica necesaria para la replicación.

[0068] Como se describe en el presente documento, el casete de expresión, incluido cualquiera de los descritos en el presente documento, que se emplea para generar un genoma de AAV recombinante.

[0069] Como se usa en el presente documento, el término «célula hospedadora» puede referirse a la línea celular de encapsidación en la que se produce un AAV recombinante a partir de un plásmido de producción. Alternativamente, el término «célula hospedadora» puede referirse a cualquier célula diana en la que se desee la expresión del transgén. Por lo tanto, una «célula hospedadora» se refiere a una célula procariota o eucariota que contiene ADN exógeno o heterólogo que ha sido introducido en la célula por cualquier medio, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección, transformación, infección vírica, transfección, administración de liposomas, técnicas de fusión de membranas, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección vírica y fusión de protoplastos.

[0070] Como se usa en el presente documento, el término «célula hospedadora» puede referirse a cultivos de células oculares de diversas especies de mamíferos para la evaluación in vitro de las composiciones descritas en el presente documento. En otros ejemplos del presente documento, el término «célula hospedadora» se refiere a las células empleadas para generar y encapsidar el vector vírico o el virus recombinante. Aún en otros ejemplos, el término «célula hospedadora» pretende hacer referencia a las células oculares del sujeto que está siendo tratado in vivo para la enfermedad ocular.

[0071] Como se usa en el presente documento, el término «células oculares» se refiere a cualquier célula del ojo o asociada a la función del ojo. El término puede referirse a cualquiera de las células fotorreceptoras, incluidas los fotorreceptoras de los bastones, los fotorreceptores de los conos y las células ganglionares fotosensibles, las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR), las células de Müller, las células coroideas, las células bipolares, las células horizontales y las células amacrinas. En una realización, las células oculares son las células fotorreceptoras. En otra realización, las células oculares son células del EPR.

[0072] Los «plásmidos» se designan generalmente en el presente documento con una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números, de acuerdo con las convenciones de nomenclatura estándar que son familiares para los expertos en la materia. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión que pueden usarse según la presente invención son bien conocidos y están fácilmente disponibles para los expertos en la materia. Además, los expertos pueden construir fácilmente cualquier número de otros plásmidos adecuados para su uso en la invención. Las propiedades, la construcción y el uso de dichos plásmidos, así como de otros vectores, en la presente invención serán fácilmente evidentes para los expertos a partir de la presente divulgación.

[0073] Como se usa en el presente documento, el término «secuencia de control transcripcional» o «secuencia de control de expresión» se refiere a secuencias de ADN, tales como secuencias iniciadoras, secuencias potenciadoras y secuencias promotoras, que inducen, reprimen o controlan de otro modo la transcripción de secuencias de ácido nucleico codificadoras de proteínas a las que están operativamente unidas.

[0074] Como se usa en el presente documento, el término «unido operativamente» o «asociado operativamente» se refiere tanto a secuencias de control de la expresión que son contiguas a la secuencia de ácido nucleico que codifica REP-1 o CNGA3 como a secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar la transcripción y la expresión de las mismas.

[0075] El término «AAV» o «serotipo de AAV», como se usa en el presente documento, se refiere a las docenas de virus adenoasociados naturales y disponibles, así como a los AAV artificiales. Entre los AAV aislados o manipulados a partir de primates humanos o no humanos (NHP) y bien caracterizados, el AAV2 humano es el primer AAV que se desarrolló como vector de transferencia génica; se ha usado ampliamente para experimentos de transferencia génica eficaces en diferentes tejidos diana y modelos animales. A menos que se especifique lo contrario, la cápside del AAV, las ITR y otros componentes seleccionados del AAV descritos en el presente documento pueden seleccionarse fácilmente entre cualquier AAV, incluidos, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8 y AAVAnc80, variantes de cualquiera de los AAV conocidos o mencionados o AAV aún por descubrir, o variantes o mezclas de los mismos. Véase, por ejemplo, el documento de patente WO 2005/033321. En una realización, la cápside del AAV es una cápside de AAV8bp, que se dirige preferentemente a las células bipolares. Véase el documento de patente WO 2014/024282. En otra realización, la cápside del AAV es una cápside de AAV7m8, que ha demostrado una administración preferente a la retina externa. Véase Dalkara et al., In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous, Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013). En una realización, la cápside del AAV es una cápside de AAV8. En otra realización, la cápside del AAV es una cápside de AAV9. En otra realización, la cápside del AAV es una cápside de AAV5. En otra realización, la cápside del AAV es una cápside de AAV2.

[0076] Como se usa en el presente documento, en relación con el AAV, el término «variante» significa cualquier secuencia de AAV que se derive de una secuencia de AAV conocida, incluidas aquellas que comparten al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 99 % o una identidad de secuencia superior en la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico. La cápside de AAV descrita en el presente documento puede incluir variantes que pueden incluir hasta aproximadamente un 10 % de variación con respecto a cualquier secuencia de cápside de AAV descrita o conocida. Es decir, la cápside de AAV comparte aproximadamente del 90 % al 99,9 % de identidad, aproximadamente del 95 % al 99 % de identidad o aproximadamente del 97 % al 98 % de identidad con una cápside de AAV proporcionada en el presente documento y/o conocida en la técnica. La cápside de AAV puede compartir al menos un 95 % de identidad con una cápside de AAV. Al determinar el porcentaje de identidad de una cápside de AAV, la comparación puede realizarse sobre cualquiera de las proteínas variables (por ejemplo, vp1, vp2 o vp3). La cápside de AAV puede compartir al menos un 95 % de identidad con vp3 del AAV8. Se puede usar un AAV autocomplementario.

[0078] Las ITR u otros componentes del AAV se pueden aislar o manipular fácilmente usando técnicas disponibles para los expertos en la materia a partir de un AAV. Dicho AAV se puede aislar, manipular u obtener de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden manipularse mediante medios sintéticos u otros medios adecuados, haciendo referencia a secuencias publicadas, como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos como, por ejemplo, GenBank, PubMed o similares. Los virus AAV pueden manipularse mediante técnicas convencionales de biología molecular, lo que permite optimizar estas partículas para la administración específica de secuencias de ácido nucleico a las células, minimizar la inmunogenicidad, ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, lograr una degradación eficiente, administración precisa al núcleo, etc.

[0080] Como se usa en el presente documento, «AAV artificial» significa, sin limitación, un AAV con una proteína de cápside no natural. Dicha cápside artificial puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, usando una secuencia de AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse de un AAV seleccionado diferente, de partes no contiguas del mismo AAV, de una fuente vírica no de AAV o de una fuente no vírica. Un AAV artificial puede ser, sin limitación, un AAV pseudotipado, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV «humanizada». Los vectores pseudotipados, en donde la cápside de un AAV se sustituye por una proteína de cápside heteróloga, son útiles en la invención. AAV2/5 y AAV2/8 son vectores pseudotipados a modo de ejemplo.

[0081] «AAV autocomplementario» se refiere a un plásmido o vector que tiene un casete de expresión en el que una región codificante portada por una secuencia de ácido nucleico de AAV recombinante ha sido diseñada para formar una plantilla de ADN bicatenario intramolecular. Tras la infección, en lugar de esperar a la síntesis mediada por células de la segunda cadena, las dos mitades complementarias del scAAV se asociarán para formar una unidad de ADN bicatenario (ADNbc) que está lista para su replicación y transcripción inmediatas. Véase, por ejemplo, D M McCarty et al., «Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis», Gene Therapy, (agosto de 2001), Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254. Los AAV autocomplementarios se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 6.596.535; 7.125.717; y 7.456.683.

[0082] Por «administrar», como se usa en los métodos, se entiende la administración de la composición a la célula seleccionada diana, que se caracteriza por la enfermedad ocular. En una realización, el método implica la administración de la composición mediante inyección subretiniana al EPR, a las células fotorreceptoras u otras células oculares. Se puede emplear la inyección intravítrea a las células oculares. En otro método más, se puede emplear la inyección a través de la vena palpebral a las células oculares. Otros métodos de administración pueden ser seleccionados por un experto en la materia a partir de esta divulgación. Por «administrar» o «vía de administración» se entiende la administración de la composición descrita en el presente documento, con o sin un vehículo o excipiente farmacéutico, al sujeto. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea. La administración puede repetirse periódicamente. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento están diseñadas para su administración a sujetos que las necesiten por cualquier vía adecuada o una combinación de diferentes vías. La administración directa en el ojo (opcionalmente mediante administración ocular, inyección subretiniana, inyección intrarretiniana, intravítrea, tópica) o administración por vías sistémicas, por ejemplo, intrarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y otras vías de administración parenterales. Las moléculas de ácido nucleico y/o los vectores descritos en el presente documento pueden administrarse en una sola composición o en múltiples composiciones. Opcionalmente, se pueden administrar dos o más AAV diferentes, o múltiples virus [véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO202011/126808 y WO 2013/049493]. Múltiples virus pueden contener diferentes virus defectuosos en la replicación (por ejemplo, AAV y adenovirus), solos o en combinación con proteínas.

[0084] Ciertas composiciones descritas en el presente documento son secuencias de ácido nucleico aisladas, o diseñadas sintética o recombinante, que proporcionan secuencias optimizadas por codones novedosas que codifican REP-1 o CNGA3 o CNGB3. Como se describe en el presente documento, se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada o manipulada, optimizada por codones, que codifica REP-1 humana. La secuencia optimizada por codones puede ser SEQ ID NO: 1. La secuencia optimizada por codones puede incluir sitios de restricción aminoterminales y carboxiterminales para la clonación. En ejemplos, como el divulgado en SEQ ID NO: 5, la secuencia codificante de REP-1 incluye un sitio de restricción NotI aminoterminal y un sitio de restricción BamHI carboxiterminal, además de una secuencia consenso Kozak. Además, la secuencia optimizada por codones, descrita en el presente documento, puede incluir uno o más sitios de restricción adicionales para permitir la adición de marcadores, como un marcador de epítopo. Cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa, la REP-1 optimizada por codones puede tener un porcentaje de identidad de al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 % o al menos un 90 %, incluyendo cualquier número entero entre cualquiera de esos intervalos. La REP-1 optimizada por codones puede tener un porcentaje de identidad con la secuencia nativa de al menos un 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %. En un ejemplo, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa SEQ ID NO: 3, se revela que la REP-1 optimizada por codones (SEQ ID NO: 1) tiene un porcentaje de identidad de secuencia de solo un 74 % (véase la FIG.2).

[0086] También se proporciona una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones, aislada o modificada, que codifica CNGA3 humano. La secuencia optimizada por codones puede ser SEQ ID NO: 9. La secuencia optimizada por codones puede ser una variante de CNGA3 mostrada en SEQ ID NO: 11. La secuencia optimizada por codones puede incluir sitios de restricción aminoterminales y carboxiterminales para la clonación. La secuencia codificante de CNGA3 puede incluir un sitio de restricción NotI aminoterminal y un sitio de restricción BglII carboxiterminal, además de una secuencia consenso Kozak. Se pueden encontrar ejemplos de secuencias de CNGA3 que incluyen dichas modificaciones en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. Además, la secuencia optimizada por codones, descrita en el presente documento, puede incluir uno o más sitios de restricción adicionales para permitir la adición de marcadores, como un marcador de epítopo. Cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa, la CNGA3 optimizada por codones puede tener un porcentaje de identidad de al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 % o al menos un 90 %, incluyendo cualquier número entero entre cualquiera de esos intervalos. Como se describe en el presente documento, el CNGA3 optimizado por codones puede tener un porcentaje de identidad con la secuencia nativa de al menos un 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %. En un ejemplo, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa SEQ ID NO: 13, se revela que la CNGA3 optimizada por codones (SEQ ID NO: 9) tiene un porcentaje de identidad de secuencia de solo un 80 % (véase la FIG.3).

[0088] Como se describe en el presente documento, se proporciona una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones, aislada o modificada, que codifica CNGB3 humano. La secuencia optimizada por codones puede ser una secuencia que comparta al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO 21. La secuencia optimizada por codones puede incluir sitios de restricción aminoterminales y carboxiterminales para la clonación, por ejemplo, como se muestra en SEQ ID NO: 23. Además, la secuencia optimizada por codones, descrita en el presente documento, puede incluir uno o más sitios de restricción adicionales para permitir la adición de marcadores, como un marcador de epítopo. Cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa (como se muestra en SEQ ID NO: 19), CNGB3 optimizado por codones puede tener un porcentaje de identidad de al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 % o al menos un 90 %, incluyendo cualquier número entero entre cualquiera de esos intervalos. Como se describe en el presente documento, el CNGB3 optimizado por codones puede tener un porcentaje de identidad con la secuencia nativa de al menos un 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %.

[0090] Las secuencias de ácido nucleico optimizadas que codifican las construcciones de REP-1 o CNGA3 descritas en el presente documento pueden manipularse en cualquier elemento genético adecuado, por ejemplo, ADN desnudo, fago, transposón, cósmido, molécula de ARN (por ejemplo, ARNm), episoma, etc., que transfiere las secuencias de REP-1 o CNGA3 que lleva a una célula hospedadora, por ejemplo, para generar nanopartículas que portan ADN o ARN, vectores víricos en una célula hospedadora de encapsidación y/o para su administración a células hospedadoras en el sujeto. El elemento genético es un plásmido.

[0092] El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, administración de liposomas, técnicas de fusión de membranas, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección vírica y fusión de protoplastos. Los métodos usados para preparar dichas construcciones son conocidos por los expertos en manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

[0094] Se proporcionan diversos casetes de expresión que emplean SEQ ID NO. 1 o 5 para la expresión de la proteína REP-1. Un ejemplo de un plásmido que contiene dicho casete de expresión se muestra en SEQ ID NO. 25. Un ejemplo de un plásmido que contiene dicho casete de expresión se muestra en SEQ ID NO. 26. Un ejemplo de un plásmido que contiene dicho casete de expresión se muestra en SEQ ID NO. 27. Un ejemplo de un plásmido que contiene dicho casete de expresión se muestra en SEQ ID NO. 28. Como se usa en el presente documento, el «genoma del vector» es la secuencia de ácido nucleico que está encapsidada entre las ITR de 5' y 3', incluidas las propias ITR. El término «genoma del vector» puede usarse indistintamente con «casete de expresión». Por lo tanto, el genoma del vector puede incluir una ITR de 5', un potenciador del CMV, un promotor de beta-actina de pollo, el exón 1 y el intrón de CBA, una secuencia Kozak, un CHM optimizado por codones, poli A de bGH y una ITR de 3'. El genoma del vector puede comprender los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 25. El genoma del vector puede comprender los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 26. El genoma del vector puede comprender los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 27. El genoma del vector comprende los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 28.

[0096] En los ejemplos, se proporciona una variedad de casetes de expresión que emplean las SEQ ID NO.9, 11 o 13 para la expresión de la proteína CNGA3. Se proporciona una variedad de casetes de expresión que emplean SEQ ID NO.

[0097] 19, 21 o 23 para la expresión de la proteína CNGAB. Como se usa en el presente documento, un «casete de expresión» se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias codificantes para las proteínas optimizadas REP-1 o CNGA3 o CNGB3, promotor, y puede incluir otras secuencias reguladoras para las mismas, cuyo casete puede manipularse en un elemento genético o plásmido, y/o encapsidarse en la cápside de un vector vírico (por ejemplo, una partícula vírica). Un casete de expresión puede comprender una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP-1. El casete puede proporcionar la REP-1 optimizada por codones asociada operativamente con secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP-1 en una célula hospedadora.

[0099] En el presente documento se describe un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica CNGA3. El casete puede proporcionar la CNGA3 optimizada por codones asociada operativamente con secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica CNGA3 en una célula hospedadora.

[0101] En otro ejemplo, un casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica CNGB3. El casete puede proporcionar la CNGB3 optimizada por codones asociada operativamente con secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica CNGB3 en una célula hospedadora.

[0103] En el presente documento se describe un casete de expresión para su uso en un vector de AAV. El casete de expresión de AAV puede incluir al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. El casete de expresión puede comprender secuencias de ITR de 5' y secuencias de ITR de 3'. Las ITR de 5' y 3' pueden flanquear la secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP-1 o CNGA3 o CNGB3, opcionalmente con secuencias adicionales que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP -1, CNGA3 o CNGB3 en una célula hospedadora. Por lo tanto, como se describe en el presente documento, un casete de expresión de AAV pretende describir un casete de expresión como el descrito anteriormente, flanqueado en su extremo 5' por una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de 5' del AAV y en su extremo 3' por una ITR de 3' del AAV. Por lo tanto, este genoma de rAAV contiene las secuencias mínimas necesarias para encapsidar el casete de expresión en una partícula vírica de AAV, es decir, las ITR de 5' y 3' del AAV. Las ITR del AAV pueden obtenerse a partir de las secuencias de ITR de cualquier AAV, como se describe en el presente documento. Estas ITR pueden ser del mismo origen de AAV que la cápside empleada en el AAV recombinante resultante, o de un origen de AAV diferente (para producir un pseudotipo de AAV). Las secuencias de TR del AAV2, o la versión eliminada del mismo (ΔITR), pueden usase por comodidad y para acelerar la aprobación reglamentaria. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otras fuentes de AAV. A continuación, cada genoma rAAV puede introducirse en un plásmido de producción. El plásmido de producción es el descrito en el presente documento o como se describe en el documento de patente WO2012/158757. En la técnica se conocen varios plásmidos para su uso en la producción de vectores de rAAV, y son útiles en el presente documento. Los plásmidos de producción se cultivan en las células hospedadoras que expresan las proteínas cap y/o rep del AAV. En las células hospedadoras, cada genoma del rAAV es rescatado y se encapsida en la proteína de la cápside o la proteína de la envoltura para formar una partícula vírica infecciosa.

[0105] Un tipo de plásmido de producción es el que se muestra en SEQ ID NO: 7, denominado p584. Este plásmido se usa en los ejemplos para la generación del vector rAAV-REP-1. Dicho plásmido es uno que contiene una secuencia de ITR de 5' del AAV; un promotor seleccionado; una secuencia de poliA; y una ITR de 3'; además, también contiene una secuencia de relleno, como lambda. Se puede incluir una región de relleno lambda no codificante en el esqueleto del vector. La secuencia de ácido nucleico que codifica REP-1, CNGA3 o CNGB2 se inserta en lugar de entre el promotor seleccionado y la secuencia de poliA, o un plásmido similar. Se puede encontrar un ejemplo de p584 que incluye la secuencia codificante de REP-1 en SEQ ID NO: 8. El plásmido de producción se puede modificar para optimizar la eficiencia de producción del plásmido del vector. Dichas modificaciones incluyen la adición de otras secuencias neutras o la eliminación de parte o partes o la totalidad de la secuencia de relleno lambda para modular el nivel de superenrollamiento del plásmido del vector. Dichas modificaciones se contemplan en el presente documento. Se pueden incluir secuencias terminadoras y otras secuencias en el plásmido.

[0107] Se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante para la administración de las construcciones de REP-1, CNGA3 y CNGB3 y las secuencias optimizadas descritas en el presente documento. Un vector vírico de virus adenoasociado (AAV) es una partícula de AAV resistente a la Dnasa que tiene una cápside de proteína de AAV en la que se encapsidan secuencias de ácido nucleico para su administración a las células diana. Una cápside de AAV está compuesta por 60 subunidades de proteína de cápside (cap), VP1, VP2 y VP3, que están dispuestas en una simetría icosaédrica en una proporción de aproximadamente 1:1:10 a 1: 1:20, dependiendo del AAV seleccionado. Los AAV pueden seleccionarse como fuentes para las cápsides de los vectores víricos de AAV identificados anteriormente. Véanse, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.º 2007-0036760-A1; la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.º 2009-0197338-A1; el documento de patente EP 1310571. Véanse también el documento de patente WO 2003/042397 (AAV7 y otros AAV simios), la patente de EE. UU. 7790449 y la patente de EE. UU. 7282199 (AAV8), los documentos de patente WO 2005/033321 y US 7.906.111 (AAV9), y WO 2006/110689, y WO 2003/042397 (rh.10). Estos documentos también describen otros AAV que pueden seleccionarse para generar AAV. En el presente documento se describe una cápside de AAV para su uso en el vector vírico que puede generarse mediante mutagénesis (es decir, mediante inserciones, eliminaciones o sustituciones) de una de las cápsides de AAV mencionadas anteriormente o su ácido nucleico codificante. Como se describe en el presente documento, la cápside de AAV puede ser quimérica, comprendiendo dominios de dos, tres, cuatro o más de las proteínas de la cápside de AAV mencionadas anteriormente. La cápside de AAV puede ser un mosaico de monómeros Vp1, Vp2 y Vp3 de dos o tres AAV diferentes o AAV recombinantes. Una composición de rAAV puede comprender más de uno de las Cap mencionadas anteriormente.

[0109] Como se describe en el presente documento, la cápside de AAV incluye variantes que pueden incluir hasta aproximadamente el 10 % de variación con respecto a cualquier secuencia de cápside del AAV descrita o conocida. Es decir, la cápside de AAV comparte aproximadamente del 90 % al 99,9 % de identidad, aproximadamente del 95 % al 99 % de identidad o aproximadamente del 97 % al 98 % de identidad con una cápside de AAV proporcionada en el presente documento y/o conocida en la técnica. Como se describe en el presente documento, la cápside del AAV comparte al menos un 95 % de identidad con una cápside del AAV. Al determinar el porcentaje de identidad de una cápside de AAV, la comparación puede realizarse sobre cualquiera de las proteínas variables (por ejemplo, vp1, vp2 o vp3). Como se describe en el presente documento, la cápside del AAV comparte al menos un 95 % de identidad con vp3 del AAV8. Como se describe en el presente documento, se usa un AAV autocomplementario. Como se describe en el presente documento, es deseable utilizar una cápside de AAV que muestre tropismo por la célula diana deseada, por ejemplo, fotorreceptores, EPR u otras células oculares. Como se describe en el presente documento, la cápside de AAV es una cápside mutante de tirosina en la que ciertos residuos de tirosina expuestos en la superficie se sustituyen por fenilalanina (F). Dichas variantes de AAV se describen, por ejemplo, en Mowat et al, Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach, Gene Therapy 21, 96-105 (enero de 2014).

[0111] Para encapsidar un casete de expresión o un genoma de rAAV o un plásmido de producción en viriones, las ITR son los únicos componentes del AAV necesarios en cis en la misma construcción que el transgén. Como se describe en el presente documento, las secuencias codificantes para la replicación (rep) y/o la cápside (cap) se eliminan del genoma del AAV y se suministranen transo mediante una línea celular de encapsidación con el fin de generar el vector de AAV. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, un AAV pseudotipado puede contener ITR de una fuente que difiere de la fuente de la cápside del AAV. Además, o como alternativa, se puede utilizar una cápside de AAV quimérica. También se pueden seleccionar otros componentes del AAV. Las fuentes de dichas secuencias de AAV se describen en el presente documento y también pueden aislarse u obtenerse mediante manipulación a partir de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden obtenerse mediante medios sintéticos u otros medios adecuados, haciendo referencia a secuencias publicadas, como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos como, por ejemplo, GenBank<®>, PubMed<®>o similares.

[0113] Se conocen en la técnica métodos para generar y aislar vectores víricos AAV adecuados para su administración a un sujeto. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. 7790449; la patente de EE.UU. 7282199; los documentos de patente WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; y US 7588772 B2]. En un sistema, una línea celular productora se transfecta de forma transitoria con una construcción que codifica el transgén flanqueado por ITR y una construcción o construcciones que codifican rep y cap. En un segundo sistema, una línea celular de encapsidación que suministra rep y cap de forma estable se transfecta transitoriamente con una construcción que codifica el transgén flanqueado por ITR. En cada uno de estos sistemas, los viriones del AAV se producen en respuesta a la infección con adenovirus o herpesvirus auxiliares, lo que requiere la separación de los rAAV de los virus contaminantes. Más recientemente, se han desarrollado sistemas que no requieren la infección con virus auxiliares para recuperar el AAV - las funciones auxiliares necesarias (es decir, adenovirus E1, E2a, VA y E4 o herpesvirus UL5, UL8, UL52 y UL29, y polimerasa del herpesvirus) también son suministradas,en trans,por el sistema. En estos sistemas más nuevos, las funciones auxiliares pueden suministrarse mediante la transfección transitoria de las células con construcciones que codifican las funciones auxiliares necesarias, o bien las células pueden manipularse para que contengan de forma estable genes que codifican las funciones auxiliares, cuya expresión puede controlarse a nivel transcripcional o postranscripcional.

[0115] En otro sistema más, el transgén flanqueado por ITR y genes rep/cap se introduce en células de insectos mediante infección con vectores basados en baculovirus. Para revisiones sobre estos sistemas de producción, véase, en general, por ejemplo, Zhang et al., 2009, «Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production», Human Gene Therapy 20:922-929. Los métodos de fabricación y uso de estos y otros sistemas de producción de AAV también se describen en las siguientes patentes de EE. UU.: 5.139.941; 5.741.683; 6.057.152; 6.204.059; 6.268.213; 6.491.907; 6,660,514; 6.951.753; 7.094.604; 7.172.893; 7.2 01.898; 7.229.823; y 7.439.065. Véase, en general, por ejemplo, Grieger y Samulski, 2005, «Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications», Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, «Recent developments in adeno-associated virus vector technology», J. Gene Med.10:717-733; y las referencias citadas más adelante.

[0117] Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por los expertos en la manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). Del mismo modo, los métodos de generación de viriones del rAAV son bien conocidos y la selección de un método adecuado no es una limitación para la presente invención. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al., (1993) J. Virol., 70:520-532 y la patente de EE. UU. n.º 5.478.745.

[0119] Los vectores del rAAV comprenden una cápside del AAV y un casete de expresión del AAV que comprende secuencias que codifican REP-1 o CNGA3 o CNGB3, como se ha descrito anteriormente. El casete de expresión del rAAV puede comprender secuencias de repetición terminal invertida del AAV y una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP-1 o CNGA3 o CNGB3, y secuencias de control de expresión que dirigen la expresión de las proteínas codificadas en una célula hospedadora. El casete de expresión del rAAV puede comprender además uno o más de un intrón, una secuencia Kozak, una poliA y elementos reguladores postranscripcionales. Dichos vectores del rAAV para su uso en composiciones farmacéuticas para su administración en el ojo pueden emplear una cápside de cualquiera de los muchos AAV conocidos identificados anteriormente.

[0120] Otros componentes convencionales de los casetes de expresión y los vectores incluyen otros componentes que pueden optimizarse para una especie específica usando técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la optimización por codones, como se describe en el presente documento. Los componentes de los casetes, vectores, plásmidos y virus u otras composiciones descritas en el presente documento incluyen una secuencia promotora como parte de las secuencias de control de la expresión. El promotor puede ser específico de la célula. El término «específico de la célula» significa que el promotor concreto seleccionado para el vector recombinante puede dirigir la expresión del transgén optimizado de REP-1 o CNGA3 o CNGB3 en un tipo de célula ocular concreto. El promotor puede ser específico para la expresión del transgén en las células fotorreceptoras. El promotor puede ser específico para la expresión en los conos y bastones. El promotor puede ser específico para la expresión en los bastones. El promotor puede ser específico para la expresión en los conos. El promotor específico de fotorreceptores puede ser un promotor de la rodopsina cinasa humana. Se ha demostrado que el promotor de la rodopsina cinasa es activo tanto en los bastones como en los conos. Véase, por ejemplo, Sun et al., Gene Therapy with a Promoter Targeting Both Rods and Cones Rescues Retinal Degeneration Caused by AIPL1 Mutations, Gene Ther. Enero de 2010; 17(1): 117-131. El promotor puede modificarse para añadir uno o más sitios de restricción para facilitar la clonación.

[0122] En una realización, el promotor es un promotor de rodopsina humana. El promotor puede modificarse para incluir restricciones en los extremos para la clonación. Véase, por ejemplo, Nathans y Hogness, Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin, PNAS, 81:4851-5 (Agosto de 1984). El promotor puede ser una parte o un fragmento del promotor de la rodopsina humana. El promotor puede ser una variante del promotor de la rodopsina humana.

[0124] Otros promotores a modo de ejemplo incluyen el promotor de la proteína cinasa 1 (GRK1) receptora acoplada a la proteína G humana (número de acceso al Genbank AY327580). En un ejemplo, el promotor es un fragmento de 292 nt (posiciones 1793-2087) del promotor GRK1 (véase Beltran et al., Gene Therapy 201017:1162-74). En un ejemplo, el promotor es el promotor de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptora (IRBP) humana proximal. El promotor puede ser un fragmento de 235 nt del promotor hIRBP. El promotor puede ser el promotor proximal RPGR (Shu et al., IOVS, mayo de 2102). Otros promotores útiles en esta divulgación incluyen, sin limitación, el promotor de opsina de bastones, el promotor de opsina rojo-verde, el promotor de opsina azul, el promotor de cGMP-βfosfodiesterasa (Qgueta et al., IOVS, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec;41(13):4059-63), el promotor de la opsina de ratón (Beltran et al., 2010 citado anteriormente), el promotor de la rodopsina (Mussolino et al., Gene Ther, julio de 2011, 18(7):637-45); la subunidad alfa de la transducina de conos (Morrissey et al., BMC Dev, Biol, Jan 2011, 11:3); el promotor de la fosfodiesterasa beta (PDE); el promotor de la retinitis pigmentosa (RP1) (Nicord et al., J. Gene Med, Dec 2007, 9(12):1015-23); el promotor NXNL2/NXNL1 (Lambard et al., PloS One, Oct. 2010, 5(10):e13025), el promotor RPE65; el promotor de la degeneración retiniana lenta/periferina 2 (Rds/perph2) (Cai et al., Exp Eye Res.

[0125] 2010 Aug;91(2):186-94); y el promotor de VMD2 (Kachi et al., Human Gene Therapy, 2009 (20:31-9)). En una realización, el promotor se selecciona del promotor EF1α humano, el promotor de la rodopsina, la rodopsina cinasa, la proteína de unión interfotorreceptora (IRBP), los promotores de la opsina de los conos (rojo-verde, azul), secuencias aguas arriba de opsina de los conos que contienen la región de control del locus de conos rojo-verde, transducción de conos y promotores de factores de transcripción (cremallera de leucina de la retina neural (Nrl) y receptor nuclear específico de fotorreceptores Nr2e3, bZIP).

[0127] En otra realización, el promotor es un promotor ubicuo o constitutivo. Un ejemplo de promotor adecuado es un promotor híbrido de β-actina de pollo (CBA) con elementos potenciadores del citomegalovirus (CMV). El promotor puede ser el promotor CB7. Otros promotores adecuados incluyen el promotor de β-actina humana, el promotor del factor de elongación 1α humano, el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor del virus simio 40 y el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple. Véase, por ejemplo, Damdindorj et al., (Agosto de 2014) A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors. PloS ONE 9(8): e106472. Otros promotores adecuados incluyen promotores víricos, promotores constitutivos, promotores regulables [véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 2011/126808 y WO 2013/04943]. Alternativamente, se puede utilizar un promotor que responda a señales fisiológicas en el casete de expresión, los genomas del rAAV, los vectores, los plásmidos y los virus descritos en el presente documento. El promotor puede ser de tamaño pequeño, inferior a 1000 pb, debido a las limitaciones de tamaño del vector del AAV. El promotor puede ser inferior a 400 pb. Un experto en la materia puede seleccionar otros promotores. En un ejemplo, la construcción de REP-1 incorpora un promotor ubicuo. En otro ejemplo, la construcción de CNGA3 incorpora un promotor específico para fotorreceptores. En un ejemplo, la construcción de REP-1 incluye un promotor de CBA con elementos potenciadores del CMV.

[0128] En una realización, el promotor es un promotor inducible. El promotor inducible puede seleccionarse de promotores conocidos, incluyendo el promotor de rapamicina/rapálogo, el promotor de ecdisona, el promotor sensible al estrógeno y el promotor sensible a la tetraciclina, o el interruptor represor heterodimérico. Véase Sochor et al, An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications. Scientific Reports, 24 de noviembre de 2015;5:17105 y Daber R, Lewis M., A novel molecular switch. J Mol Biol. 28 de agosto de 2009;391(4):661-70, Publicación electrónica 21 de junio de 2009.

[0129] Las construcciones de casete, vector, plásmido y virus descritas en el presente documento pueden contener otras secuencias apropiadas de inicio, terminación y potenciadoras de la transcripción, señales eficaces de procesamiento del ARN, como señales de corte y empalme y poliadenilación (poliA); secuencias TATA; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso Kozak); intrones; secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secuencias que mejoran la secreción del producto codificado. El casete o vector de expresión puede contener ninguno, uno o más de cualquiera de los elementos descritos en el presente documento. Ejemplos de secuencias de poliA adecuadas incluyen, por ejemplo, poliA de SV40, hormona de crecimiento bovina (bGH) y TK. Ejemplos de potenciadores adecuados incluyen, por ejemplo, el potenciador del CMV, el potenciador del RSV, el potenciador de la alfafetoproteína, el promotor/potenciador mínimo de TTR, LSP (promotor de la globulina de unión a Th/alfa1-microglobulina/potenciador de la bikunina), entre otros. Se puede incluir una secuencia Kozak aguas arriba de la secuencia codificante del transgén para mejorar la traducción desde el codón de inicio correcto. En un ejemplo, el exón 1 y el intrón de CBA se incluyen en el casete de expresión. En un ejemplo, el transgén se coloca bajo el control de un promotor híbrido de β-actina de pollo (CBA). Este promotor consiste en el potenciador inmediato temprano del citomegalovirus (CMV), el promotor proximal de β-actina de pollo y el exón 1 de CBA flanqueado por secuencias del intrón 1.

[0130] En un ejemplo, el casete de expresión contiene una ITR de 5', un promotor de CBA, un potenciador del CMV, el exón 1 y el intrón de CBA, una secuencia Kozak, una secuencia de CHM humano optimizado por codones (SEQ ID NO: 1), poli A de bGH y una ITR de 3'.

[0131] Estas secuencias de ácido nucleico, vectores, casetes de expresión y vectores víricos de rAAV descritos en el presente documento pueden ser útiles en una composición farmacéutica, que también comprende un portador, tampón, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, etc. Dichas composiciones farmacéuticas se usan para expresar REP-1 o CNGA3 o CNGB3 optimizados en las células oculares mediante la administración de dichos AAV recombinantes o AAV artificiales.

[0132] Para preparar estas composiciones farmacéuticas que contienen las secuencias de ácido nucleico, los vectores, los casetes de expresión y los vectores víricos rAAV, es preferible evaluar las secuencias, los vectores o los vectores víricos para detectar la contaminación mediante métodos convencionales y, a continuación, formularlos en una composición farmacéutica adecuada para su administración en el ojo. Dicha formulación implica el uso de un vehículo o portador farmacéuticamente y/o fisiológicamente aceptable, en particular uno adecuado para su administración en el ojo, como solución salina tamponada u otros tampones, por ejemplo, HEPES, para mantener el pH en niveles fisiológicos adecuados y, opcionalmente, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, agentes estabilizadores, tampones, portadores, adyuvantes, diluyentes, etc. Para la inyección, el portador será normalmente un líquido. Los portadores fisiológicamente aceptables a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, agua estéril y apirógena y solución salina tamponada con fosfato estéril y apirógena. En la publicación de patente de EE. UU. n.º 7.629.322 se proporciona una variedad de ejemplos de dichos portadores conocidos. En un ejemplo, el portador puede ser una solución isotónica de cloruro sódico. En otro ejemplo, el portador puede ser una solución salina equilibrada. En un ejemplo, el portador incluye Tween. Si el virus se va a almacenar a largo plazo, se puede congelar en presencia de glicerol o Tween20.

[0133] La composición del portador o excipiente puede contener NaCl 180 mM, NaPi 10 mM, pH 7,3 con Pluronic F68 (PF68) al 0,0001 % - 0,01 %. La composición exacta del componente de la solución salina del tampón oscila de NaCl 160 mM a 180 mM. Opcionalmente, se usa un tampón de pH diferente (potencialmente HEPES, bicarbonato de sodio, TRIS) en lugar del tampón descrito específicamente. Como alternativa, también es útil un tampón que contenga NaCl al 0,9 %.

[0134] Opcionalmente, las composiciones descritas en el presente documento pueden contener, además del rAAV y/o variantes y portador(es), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, como conservantes o estabilizadores químicos. Los conservantes adecuados a modo de ejemplo incluyen clorobutanol, sorbato potásico, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.

[0135] Las composiciones farmacéuticas que contienen al menos un virus rAAV defectuoso en la replicación, como se describe en el presente documento, pueden formularse con un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante fisiológicamente aceptable, para su uso en aplicaciones de transferencia génica y terapia génica. En el caso de los vectores víricos AAV, la cuantificación de las copias del genoma («GC»), los genomas del vector («VG») o las partículas víricas puede usarse como medida de la dosis contenida en la formulación o suspensión. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para determinar el número de copias del genoma (GC) de las composiciones de virus defectuoso en la replicación de la invención. Un método para realizar la titulación del número de GC de AAV es el siguiente: Las muestras de vectores de AAV purificados se tratan primero con Dnasa para eliminar el ADN del genoma de AAV no encapsulado o el ADN plasmídico contaminante del proceso de producción. A continuación, las partículas resistentes a la Dnasa se someten a un tratamiento térmico para liberar el genoma de la cápside. Los genomas liberados se cuantifican mediante PCR en tiempo real usando conjuntos de cebadores/sondas dirigidos a una región específica del genoma vírico (normalmente la señal de poli A). En otro método, la dosis eficaz de un virus adenoasociado recombinante que porta una secuencia de ácido nucleico que codifica el transgén REP-1 o CNGA3 optimizado se mide como se describe en S.K. McLaughlin et al., 1988 J. Virol., 62:1963.

[0137] Como se usa en el presente documento, el término «dosis» puede referirse a la dosis total administrada al sujeto durante el tratamiento, o a la cantidad administrada en una administración de dosis única (o dosis de múltiples unidades o divididas). Las composiciones farmacéuticas de virus pueden formularse en unidades de dosis para contener una cantidad de virus defectuoso en la replicación que porta las secuencias de ácido nucleico optimizadas por codones que codifican REP-1 o CNGA3 o CNGB3, como se describe en el presente documento, que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1,0 × 10<9>GC a aproximadamente 1,0 × 10<15>GC, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<9>, 2 × 10<9>, 3 × 10<9>, 4 × 10<9>, 5 × 10<9>, 6 × 10<9>, 7 × 10<9>, 8 × 10<9>o 9 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<10>, 2 × 10<10>, 3 × 10<10>, 4 × 10<10>, 5 × 10<10>, 6 × 10<10>, 7 × 10<10>, 8 × 10<10>o 10 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<11>, 2 × 10<11>, 3 × 10<11>, 4 × 10<11>, 5 × 10<11>, 6 × 10<11>, 7 × 10<11>, 8 × 10<11>o 11 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<12>, 2 × 10<12>, 3 × 10<12>, 4 × 10<12>, 5 × 10<12>, 6 × 10<12>, 7 × 10<12>, 8 × 10<12>o 12 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<13>, 2 × 10<13>, 3 × 10<13>, 4 × 10<13>, 5 × 10<13>, 6 × 10<13>, 7 × 10<13>, 8 × 10<13>o 13 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<14>, 2 × 10<14>, 3 × 10<14>, 4 × 10<14>, 5 × 10<14>, 6 × 10<14>, 7 × 10<14>, 8 × 10<14>o 14 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Las composiciones pueden formularse para contener al menos 1 × 10<15>, 2 × 10<15>, 3 × 10<15>, 4 × 10<15>, 5 × 10<15>, 6 × 10<15>, 7 × 10<15>, 8 × 10<15>o 15 × 10<9>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Para su aplicación en humanos, la dosis puede oscilar de 1 × 10<10>a aproximadamente 1 × 10<12>GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o fraccionarios dentro del intervalo. Todas las dosis pueden medirse mediante cualquier método conocido, incluyendo la medición mediante oqPCR o PCR digital en gotas (ddPCR), como se describe, por ejemplo, en M. Lock et al., Hum Gene Ther Methods. abril de 2014;25(2):115-25). Doi: 10.1089/hgtb.2013.131.

[0138] Las dosis anteriores pueden administrarse en una variedad de volúmenes de formulación de portador, excipiente o tampón, que oscilan de aproximadamente 25 a aproximadamente 1000 microlitros, incluyendo todos los números dentro del intervalo, dependiendo del tamaño del área a tratar, el título vírico usado, la vía de administración y el efecto deseado del método. El volumen del portador, excipiente o tampón puede ser de al menos aproximadamente 25 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 50 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 75 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 100 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 125 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 150 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 175 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 200 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 225 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 250 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 275 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 300 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 325 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 350 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 375 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 400 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 450 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 500 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 550 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 600 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 650 µl. El volumen puede ser de aproximadamente 700 µl. El volumen puede estar entre aproximadamente 700 y aproximadamente 1000 µl.

[0140] En un ejemplo descrito, las construcciones víricas pueden administrarse en dosis de al menos 1 × 10<9>a aproximadamente al menos 1 × 10<11>GC en volúmenes de aproximadamente 1 µl a aproximadamente 3 µl para sujetos animales pequeños, como ratones. Para sujetos veterinarios más grandes que tienen ojos de aproximadamente el mismo tamaño que los ojos humanos, son útiles las dosis y volúmenes humanos más grandes indicados anteriormente. Véase, por ejemplo, Diehl et al., J. Applied Toxicology, 21:15-23 (2001) para un análisis de las buenas prácticas para la administración de sustancias a diversos animales veterinarios.

[0142] Es deseable que se utilice la concentración efectiva más baja de virus u otro vehículo de administración para reducir el riesgo de efectos indeseables, como toxicidad, displasia retiniana y desprendimiento. El médico responsable puede seleccionar otras dosis dentro de estos intervalos, teniendo en cuenta el estado físico del sujeto, preferiblemente humano, que se está tratando, la edad del sujeto, el trastorno ocular concreto y el grado al que se ha desarrollado el trastorno, si es progresivo.

[0144] También se describe en el presente documento un método para tratar, retrasar o detener la progresión de la ceguera en un sujeto mamífero que padece o corre el riesgo de desarrollar coroideremia. Se puede administrar un rAAV que porte las secuencias optimizadas por codón de REP-1, preferiblemente suspendido en un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante fisiológicamente compatible, a un sujeto deseado, incluido un sujeto humano. Este método puede comprender la administración a un sujeto que lo necesite de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión, genomas de rAAV, plásmidos, vectores o vectores de rAAV o composiciones que los contengan. La composición puede administrarse por vía subretiniana. La composición puede administrarse por vía intravítrea. La composición puede administrarse usando una combinación de vías de administración adecuadas para el tratamiento de enfermedades oculares, y también puede implicar la administración a través de la vena palpebral u otras vías de administración intravenosas o convencionales.

[0146] También se describe en el presente documento un método para tratar, retrasar o detener la progresión de la ceguera en un sujeto mamífero que padece o corre el riesgo de desarrollar acromatopsia. Se puede administrar un rAAV que porte la secuencia nativa, modificada u optimizada por codones de CNGA3 o CNGB3, preferiblemente suspendida en un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante fisiológicamente compatible, a un sujeto deseado, incluido un sujeto humano. Este método puede comprender la administración a un sujeto que lo necesite de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión, genomas de rAAV, plásmidos, vectores o vectores de rAAV o composiciones que los contengan. La composición puede administrarse por vía subretiniana. La composición puede administrarse por vía intravítrea. La composición puede administrarse usando una combinación de vías de administración adecuadas para el tratamiento de enfermedades oculares, y también puede implicar la administración a través de la vena palpebral u otras vías de administración intravenosas o convencionales.

[0148] Para su uso en estos métodos, el volumen y el título vírico de cada dosis se determinan individualmente, como se describe más adelante en el presente documento, y pueden ser iguales o diferentes de otros tratamientos realizados en el mismo ojo o en el ojo contralateral. El médico responsable puede determinar las dosis, las administraciones y las pautas, teniendo en cuenta las enseñanzas de la presente memoria descriptiva. La composición puede administrarse en una dosis única seleccionada de entre las enumeradas anteriormente en un solo ojo afectado. La composición puede administrarse como una dosis única seleccionada de las enumeradas anteriormente en ambos ojos afectados, ya sea de forma simultánea o secuencial. La administración secuencial puede implicar un desfase horario de administración de un ojo a otro de intervalos de minutos, horas, días, semanas o meses. El método puede implicar la administración de las composiciones en un ojo en dos o más dosis (por ejemplo, dosis divididas). Se pueden realizar múltiples inyecciones en diferentes partes del mismo ojo. Una segunda administración de un rAAV que incluya el casete de expresión seleccionado (por ejemplo, un casete que contenga CHM) puede realizarse en un momento posterior. Dicho momento puede ser semanas, meses o años después de la primera administración. Dicha segunda administración se realiza, en un ejemplo, con un rAAV que tiene una cápside diferente a la del rAAV de la primera administración. El rAAV de la primera y la segunda administración pueden tener la misma cápside.

[0150] Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse en una sola composición o en múltiples composiciones. Opcionalmente, se pueden administrar dos o más AAV diferentes, o múltiples virus [véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO2011/126808 y WO 2013/049493]. Los múltiples virus pueden contener diferentes virus defectuosos en la replicación (por ejemplo, AAV y adenovirus).

[0152] En ciertos ejemplos, es deseable realizar estudios de imagen y funcionales de la retina no invasivos para identificar las áreas de los fotorreceptores de los conos y bastones que deben ser objeto de la terapia. Se pueden emplear pruebas de diagnóstico clínico para determinar la ubicación o ubicaciones precisas de una o más inyecciones subretinianas. Estas pruebas pueden incluir electrorretinografía (ERG), perimetría, mapeo topográfico de las capas de la retina y medición del grosor de sus capas mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT), mapeo topográfico de la densidad de conos mediante óptica adaptativa (AO), examen ocular funcional, etc., dependiendo de la especie del sujeto tratado, su estado físico y de salud y la dosis. Teniendo en cuenta los estudios de imagen y funcionales, en algunos ejemplos se realizan una o más inyecciones en el mismo ojo con el fin de tratar diferentes áreas del ojo afectado. El volumen y el título vírico de cada inyección se determinan individualmente, como se describe más adelante en el presente documento, y pueden ser iguales o diferentes de otras inyecciones realizadas en el mismo ojo o en el ojo contralateral. Se puede realizar una única inyección de mayor volumen para tratar todo el ojo. El volumen y la concentración de la composición de rAAV pueden seleccionarse de manera que solo se vea afectada la región de las células oculares dañadas. El volumen y/o la concentración de la composición de rAAV pueden ser de mayor cantidad, con el fin de alcanzar porciones más grandes del ojo, incluidos los fotorreceptores no dañados.

[0154] En un ejemplo de los métodos descritos en el presente documento, una administración intraocular única de una composición como la descrita en el presente documento, por ejemplo, una administración de AAV de un casete de REP-1 optimizado, es útil para prevenir la pérdida de visión y la ceguera en un sujeto en riesgo de desarrollar coroideremia. En otro ejemplo de los métodos descritos en el presente documento, una administración intraocular única de una composición como la descrita en el presente documento, por ejemplo, una administración de AAV de un casete de CNGA3 o CNGB3 optimizado, es útil para prevenir la pérdida de visión y la ceguera en un sujeto en riesgo de desarrollar acromatopsia.

[0155] Por lo tanto, la composición puede administrarse antes de la aparición de la enfermedad. En otro ejemplo, la composición puede administrarse antes del inicio del deterioro o la pérdida de la visión. En otro ejemplo, la composición puede administrarse después del inicio del deterioro o la pérdida de la visión. En otro ejemplo más, la composición puede administrarse cuando están funcionando o permanecen menos del 90 % de los conos y/o bastones o fotorreceptores, en comparación con un ojo no enfermo.

[0156] En otro ejemplo, el método incluye la realización de estudios adicionales, por ejemplo, estudios funcionales y de imagen para determinar la eficacia del tratamiento. Para el examen en animales, dichas pruebas incluyen la evaluación de la función retiniana y visual mediante electrorretinogramas (ERG) que examinan la función de los fotorreceptores de los conos y los bastones, nistagmo optocinético, pupilometría, pruebas de laberinto acuático, preferencia luz-oscuridad, tomografía de coherencia óptica (para medir el espesor de varias capas de la retina), histología (espesor de la retina, filas de núcleos en la capa nuclear externa, inmunofluorescencia para documentar la expresión transgénica, recuento de fotorreceptores de los conos, tinción de secciones de retina con aglutinina de cacahuete, que identifica las vainas de los fotorreceptores de los conos).

[0157] Específicamente para sujetos humanos, tras la administración de una dosis de una composición descrita en esta memoria descriptiva, se evalúa la eficacia del tratamiento usando electrorretinogramas (ERG) para examinar la función de los fotorreceptores de los conos y los bastones, la agudeza visual mediante pupilometría, pruebas de sensibilidad al contraste y visión del color, pruebas de campo visual (campos visuales de Humphrey/campos visuales de Goldmann), pruebas de movilidad perimétrica (pista de obstáculos) y pruebas de velocidad de lectura. Otras pruebas de eficacia útiles a las que se somete al sujeto después del tratamiento con una composición farmacéutica descrita en el presente documento son la resonancia magnética funcional (IRMf), pruebas de sensibilidad a la luz de campo completo, estudios de la estructura de la retina, incluyendo tomografía de coherencia óptica, fotografía del fondo de ojo, autofluorescencia del fondo de ojo, oftalmoscopia láser de barrido con óptica adaptativa, pruebas de movilidad, pruebas de velocidad y precisión de lectura, microperimetría y/u oftalmoscopia. Estas y otras pruebas de eficacia se describen en la patente de EE. UU. n.º 8.147.823; en la publicación de solicitud de patente internacional en tramitación junto con la presente WO 2014/011210 o WO 2014/124282.

[0158] Cualquiera de los métodos descritos anteriormente puede realizarse en combinación con otra terapia o terapia secundaria. Los métodos de tratamiento de estas enfermedades oculares pueden implicar el tratamiento del sujeto con la composición descrita en detalle en el presente documento en combinación con otra terapia, como el tratamiento con antibióticos, el tratamiento paliativo para el dolor y similares. La terapia adicional puede ser cualquier terapia conocida actualmente, o aún desconocida, que ayude a prevenir, detener o mejorar estas mutaciones o defectos o cualquiera de los efectos asociados a ellos. La terapia secundaria puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de las composiciones descritas anteriormente. Una terapia secundaria puede implicar enfoques no específicos para mantener la salud de las células de la retina, como la administración de factores neurotróficos, antioxidantes y agentes antiapoptóticos. Los enfoques no específicos se logran mediante la inyección de proteínas, ADN recombinante, vectores víricos recombinantes, células madre, tejido fetal o células modificadas genéticamente. Estas últimas podrían incluir células modificadas genéticamente que están encapsuladas.

[0159] También se describe un método para generar un rAAV recombinante que comprende la obtención de un plásmido que contiene un casete de expresión de AAV como se ha descrito anteriormente y el cultivo de una célula de encapsidación que porta el plásmido en presencia de secuencias víricas suficientes para permitir la encapsidación del genoma vírico del AAV en una envoltura o cápside infecciosa del AAV. Métodos específicos de generación de vectores de rAAV se han descrito anteriormente y pueden emplearse en la generación de un vector de rAAV que pueda administrar REP-1 o CNG A3 o CNGB3 optimizados por codones en los casetes de expresión y genomas descritos anteriormente y en los ejemplos de a continuación.

[0160] También se proporciona un vector que comprende cualquiera de los casetes de expresión descritos en el presente documento. Como se ha descrito anteriormente, dichos vectores pueden ser plásmidos de una variedad de orígenes y son útiles en determinadas realizaciones para la generación de virus recombinantes defectuosos en la replicación, como se describe más adelante en el presente documento.

[0161] El vector puede ser un plásmido que comprende un casete de expresión, en donde el casete de expresión comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica REP-1, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula hospedadora.

[0162] El vector puede ser un plásmido que comprende un casete de expresión, en donde el casete de expresión comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica CNGA3, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula hospedadora.

[0163] El vector puede ser un plásmido que comprende un casete de expresión de AAV, en donde el casete de expresión comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones que codifica CNGB3, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula hospedadora.

[0164] Cabe señalar que el término «un» o «una» se refiere a uno o más. Como tal, los términos «un» o «una», «uno o más» y «al menos uno» se usan indistintamente en el presente documento.

[0165] Las palabras «comprende», «comprenden» y «que comprende» deben interpretarse de forma inclusiva y no exclusiva. Las palabras «consiste», «que consiste» y sus variantes deben interpretarse de forma exclusiva y no inclusiva. Si bien en la memoria descriptiva se presentan diversas realizaciones usando la expresión «que comprende», en otras circunstancias, también se pretende interpretar y describir una realización relacionada usando la expresión «que consiste en» o «que consiste esencialmente en».

[0166] Como se usa en el presente documento, el término «aproximadamente» significa una variabilidad del 10 % con respecto a la referencia dada, a menos que se especifique lo contrario.

[0167] El término «regulación» o variaciones del mismo, como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una composición para inhibir uno o más componentes de una vía biológica.

[0168] A menos que se defina de otro modo en esta memoria descriptiva, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia y por referencia a textos publicados, que proporcionan a un experto en la materia una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

[0169] Ejemplo 1 - Diferenciación de células madre pluripotentes en EPR

[0170] La coroideremia carece de un modelo murino relevante y no existe un modelo canino, por lo que la transducción y la expresión se prueban en un modelo de células de la retina humana de la enfermedad. Dado que es imposible obtener células de la retina de un paciente vivo, el EPR se genera a partir de células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pluripotentes se dirigen al EPR usando el protocolo descrito por Buchholz et al., Rapid and Efficient Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Retinal Pigmented Epithelium, Stem Cells Translational Medicine, 2013;2:384-393. Véase también Cereso et al., Proof of concept for AAV2/5-mediated gene therapy in iPSC-derived retinal pigment epithelium of a choroideremia patient, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2014) 1, 14011. Se conocen otros métodos para producir EPR en la técnica.

[0171] En resumen, la línea de células madre pluripotentes inducidas humanas se mantiene en medio Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) que contiene GlutaMAX-I 2 mM, sustituto del suero inactivado al 20 %, aminoácidos no esenciales del medio Eagle modificado 0,1 mM (MEM NEAA), β-mercaptoetanol 0,1 mM y 4 ng/ml de bFGF sobre una capa de fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina C o irradiados. Las células madre pluripotentes se someten a pases directamente a Matrigel (BD Biosciences) en DMEM/F12 con 1X B27, 1X N2 y 1X NEAA (Invitrogen). Desde el día 0 al 2, se añaden 50 ng/ml de nogina, 10 ng/ml de Dkk1, 10 ng/ml de IGF1 y nicotinamida 10 mM al medio base. Desde el día 2 al 4, se añaden 10 ng/ml de nogina, 10 ng/ml de Dkk1, 10 ng/ml de IGF1, 5 ng/ml de bFGF y nicotinamida 10 mM al medio base. Desde el día 4 al 6, se añaden 10 ng/ml de Dkk1, 10 ng/ml de IGF1 y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems) al medio base. Desde el día 6 al 14, se añaden 100 ng/ml de activina A, SU540210 µM (EMD Millipore, Darmstadt, Alemania) y VIP 1 mM al medio base. Los experimentos de control se realizan solo en medio base (DMEM/F12, B27, N2 y NEAA).

[0172] Las células se enriquecen mecánicamente raspando las células con morfología distinta de EPR. Posteriormente, el EPR restante se digiere usando TrypLE Express (Invitrogen) durante 5 minutos a 37 °C. Las células se someten a pases a través de un filtro unicelular de 30 µm y se siembran en plástico para cultivo de tejidos recubierto de Matrigel, membranas Transwell o portaobjetos con cámaras tratados con CC2. Las células enriquecidas se cultivan en DMEM con alto contenido de glucosa con suero fetal bovino (FBS) al 1 %, GlutaMAX y piruvato de sodio durante 30 días.

[0173] Ejemplo 2 - Células transducidas con AAV-REP-1

[0174] En resumen, el vector vírico AAV2/8CMV.CBA-REP-1 que incorpora secuencias optimizadas por codones de REP-1 se produce mediante transfección transitoria de células HEK293, y las partículas víricas se precipitan a partir del sobrenadante usando polietilenglicol. Véase, por ejemplo, Guo et al, Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus, J Virol Methods. Agosto de 2012; 183(2): 139-146. Los vectores se purifican mediante doble centrifugación con CsCl, se dializan y se titulan mediante ensayo de inmunotransferencia por puntos.

[0175] Para los experimentos de prenilación, se siembran EPR en placas de 24 pocillos y se estima una confluencia de 1,2 × 10<6>células. Las células se transducen con 100.000 vg por célula y los ensayos de prenilación se realizan 4 semanas después de la transducción. Los experimentos se realizan por triplicado.

[0176] Ejemplo 3 - Prenilación

[0177] Se realiza un ensayo de prenilación in vitro como se describe en Vasireddy et al, PloS One. 2013 May 7;8(5):e61396, citado anteriormente, usando [3H]-geranilgeranil pirofosfato (GGPP) (Perkin Elmer, Boston, MA, EE. UU.) como donante de grupos prenilo, en presencia de Rab geranilgeranil transferasa recombinante y RAB27. La incorporación de grupos prenilo radiomarcados en la proteína RAB27 se mide mediante recuento por centelleo. Para garantizar la coherencia, los valores de control se normalizan a 100 y se usan como valor base. Todos los experimentos se realizan por triplicado, y la comparación estadística de la prenilación entre los grupos experimentales y de control se evalúa usando la prueba de latde Student bilateral para datos independientes. En resumen, 48 horas después de la transducción, las células del EPR transducidas se lavan con PBS frío. Se recogen los sedimentos celulares y se lavan a fondo con PBS frío. Las células se lisan en hielo durante 30 minutos usando RIPA inhibidores de proteasas. En un protocolo alternativo, las células se someten a sonicación. Las fracciones citosólicas se recogen centrifugando el lisado a 75.000 - 100.000gdurante 1 - 2 h a 4 °C.

[0178] Las reservas se preparan para la reacción de prenilación de la siguiente manera.

[0181]

[0184] El volumen de reacción final usado para la prenilación es de 25 µl

[0187]

[0188] La mezcla de reacción se incuba a 37 °C durante 30 min. La reacción se detiene añadiendo 9:1 de etanol/HCl y se incuba durante 30 minutos. Las proteínas se recogen en papeles de filtro de fibra de vidrio (papeles Whatman) mediante filtración al vacío (0,1 ml). Los filtros se lavan cuidadosamente con tampón fosfato frío - 3 veces para eliminar el material no unido. Las membranas se secan con cuidado. Los filtros se colocan en 5 ml de mezcla de centelleo y se realiza el recuento de centelleo. Véase también Tolmachova et al., CHM/REP1 cDNA delivery by lentiviral vectors provides functional expression of the transgene in the retinal pigment epithelium of choroideremia mice, The Journal of Gene Medicine, 2012; 14-158-68.

[0189] Los ensayos para el estudio de viabilidad de CNGA3 o CNGB3 pueden incluir el uso de un modelo animal mutante espontáneo (por ejemplo, el ratón Cnga3-/- o la oveja Awassi). El modelo de ratón podría cruzarse con un ratón fotorreceptor «todo conos», el ratón Nrl-/-, para obtener inactivaciones dobles. Este último ratón (Cnga3-/-Nrl-/-) podría acelerar la identificación de la eficacia. La eficacia podría medirse mediante pupilometría, medidas de agudeza visual y contraste (por ejemplo, usando optocinética), electrorretinogramas y comportamiento visual. En última instancia, la histología documentará la expresión del transgén con mejores resultados en las demás medidas. También se usarán enfoques histológicos para documentar cualquier efecto de la intervención en los fotorreceptores de los conos (número total de fotorreceptores de los conos, densidad, ubicación, etc.).

[0190] De forma similar a la coroideremia, como se ha comentado anteriormente, los ensayos para el estudio de viabilidad para la terapia de refuerzo génico para la acromatopsia asociada a CNGA3 o CNGB3 pueden incluir el uso de modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Los modelos de iPSC, generados a partir de pacientes con acromatopsia debida a mutaciones de CNGA3 o CNGB3, se diferenciarán en precursores retinianos y/o células fotorreceptoras in vitro. El ADNc natural de CNGA3 (o CNGB3) se administrará a estas células usando AAV recombinante y las células se analizarán para la biogénesis y la preservación de la función del canal relevante (activado por nucleótidos cíclicos, CNG) compuesto por estas subunidades. La función del canal se evaluará mediante electrofisiología en parches de membrana. La restauración del canal debería rescatar las corrientes activadas por cGMP. Estudios adicionales pueden probar la sensibilidad de la función del canal antes y después de la administración del ADNc CNG natural a ligandos fisiológicos.

[0191] Ejemplo 4: Expresión in vitro de AAV.CHM humano optimizado por codones

[0192] El objetivo de este estudio era evaluar la capacidad de expresión de CHM mediada por AAV tras la administración génica usando una serie de vectores AAV2 y AAV8 de última generación que codifican el gen CHM optimizado por codones (SEQ ID NO: 1) en las líneas celulares 84-31 y COS-7.

[0193] Para maximizar la expresión de CHM, se produjo una secuencia de CHM optimizado por codones (SEQ ID NO: 1). Se sintetizó el plásmido optimizado por codones y se usó en la creación de todos los casetes de expresión transgénica de CHM de última generación. Para superar el posible problema de contaminación de genomas de AAV no funcionales, se incluyó una región de relleno lambda no codificante en el esqueleto del vector. La incorporación del relleno no solo aumenta la longitud del plásmido, sino que también disminuye la posibilidad de contaminación del esqueleto del ADN plasmídico durante la encapsidación del AAV. El impacto de la incorporación de una región de relleno en el esqueleto del vector para eliminar las impurezas del ADN plasmídico se llevó a cabo como un estudio independiente. Se usaron dos esqueletos de plásmidos províricos AAV recombinantes (alta y baja copia) para generar las diferentes construcciones. El plásmido de alta copia se diseñó basándose en el origen del vector pUC. El plásmido de baja copia se diseñó basándose en el origen p15A. Para mejorar aún más la traducción desde el codón de iniciación correcto, se incorporó una secuencia Kozak aguas arriba del codón de inicio.

[0194] Se han diseñado un total de cuatro plásmidos para el presente estudio y los descritos en los siguientes ejemplos (Tabla 1). Además, también se generó un plásmido que porta la secuencia nativa de CHM, que actualmente se está usando en un ensayo clínico (versión 1). Los mapas de plásmidos para cada una de la Versión 2a, 2b, 3a y 3b, y la Versión 1 se muestran en las FIG.6-10, respectivamente.

[0195] Tabla 1: Características de los plásmidos

[0197]

[0198]

[0201] La expresión in vitro de estas construcciones se probó en las líneas celulares COS-7 y 84-31. Las características diseñadas de las construcciones de CHM de última generación se describen en la Tabla 1.

[0202] Se generaron plásmidos províricos AAV recombinantes de alta y baja copia mediante la clonación del ADNc de CHM humano (hCHM) optimizado por codones (SEQ ID NO: 1) en el casete transgénico. El transgén se colocó bajo el control de un promotor híbrido de β-actina de pollo (CBA). Este promotor consiste en el potenciador inmediato temprano del citomegalovirus (CMV), el promotor proximal de β-actina de pollo y el exón 1 de CBA flanqueado por secuencias del intrón 1. Los plásmidos províricos de alto y bajo número de copias también contienen repeticiones terminales invertidas de AAV y una secuencia de poliA. Los esqueletos de plásmidos de última generación usadas en el presente estudio contienen un relleno de fragmento de fago lambda seguido del gen de selección bacteriana kanamicina. Plásmidos adicionales carecen del relleno, pero contienen el gen de selección kanamicina. El vector de alto número de copias es similar al de los plásmidos pUC (~300 copias/célula bacteriana). El plásmido de bajo número de copias (~10 copias/célula bacteriana) tiene un origen de p15A. Para mejorar la traducción desde el codón de iniciación correcto, todas las construcciones de última generación contienen una secuencia consenso KOZAK aguas arriba del codón de inicio, ATG. Los plásmidos generados se verifican mediante secuencias usando cebadores que pueden dirigirse específicamente a la secuencia de extensión del promotor potenciador o a la secuencia de CHM optimizado por codones. Los mapas de plásmidos y las secuencias de las cinco construcciones se muestran en las FIG.6-10. Se utilizó una transfección triple estándar con fosfato cálcico para generar los vectores de AAV que se enumeran a continuación (véase la Tabla 2 para la calificación de los vectores). Se generaron los serotipos AAV2 y AAV8 de los vectores para garantizar que los resultados fueran independientes del serotipo.

[0203] Tabla 2: Resumen de los vectores de AAV2 y AAV8 generados y concentración de las reservas víricas

[0205]

[0208] La línea celular 84-31 es un subclon de la línea celular 293 HEK (células renales embrionarias humanas) y expresa de forma constitutiva proteínas E4 del adenovirus para mejorar la transducción del virus AAV. Las células COS-7 son líneas celulares similares a los fibroblastos que se derivan de tejidos renales de mono. Tanto las células 84-31 como COS-7 se sembraron, por separado, en placas de cultivo celular de 6 pocillos y se transdujeron con uno de los diez artículos de prueba (AAV2 o AAV8) a cinco multiplicidades de infección (MOI) diferentes. Después de 36-48 horas, se recogieron las células, se lisaron y se prepararon muestras de proteínas para SDS-PAGE, seguido de un análisis de transferencia Western para detectar la expresión de CHM exógeno.

[0209] Tanto las células 84-31 como COS-7 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido en glucosa, con un suero fetal bovino al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % de a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2. El día antes de la transducción (18-24 h antes), se sembraron células a una densidad de 3E5 en 2 ml de medio de cultivo celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2. Los pocillos de las células COS-7 y 84-31 se infectaron con los vectores de AAV que se enumeran a continuación con diversas multiplicidades de infección (MOI) (Tabla 3 y Tabla 4). No se añadió ningún virus a las células de control negativo (células no transducidas). En resumen, se retiró el medio de cultivo de tejido y se añadió una alícuota fresca de 2 ml de medio a cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos. A continuación, se midió la cantidad predeterminada de vector de AAV (directamente de la reserva) y se añadió a cada pocillo (Tabla 3 y Tabla 4). Para una MOI de 1E4, se diluyó 1 µl del reserva de virus respectivo en 10 µl con medio de cultivo celular. A partir de esta disolución, se añadió el volumen predeterminado del virus al pocillo respectivo (Tabla 3 y 4). Las células se incubaron con el virus de AAV durante 36-48 horas a 37 °C con 5 % de CO2 hasta su recogida. Las células se observaron al microscopio antes de la recogido para comprobar si presentaban anomalías.

[0210] Tabla 3: Dosis de infección de cuatro vectores AAV2 y AAV8 hCHM de última generación en células COS-7.

[0212]

[0213]

[0215] Tabla 4: Tasas de infección de cuatro vectores AAV2 y AAV8 hCHM de última generación en células 84-31

[0216]

[0217]

[0220] En primer lugar, se usaron las líneas celulares COS7 y 84-31 para comprobar si la expresión in vitro de CHM era independiente de la línea celular. Una vez establecida la independencia, todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo únicamente en células 84-31, que han demostrado una eficiencia de transducción superior con AAV. Los pocillos de las células 84-31 se infectaron con los vectores AAV que se enumeran a continuación con diversas MOI (véanse las Tablas 3 y 4).

[0222] Análisis de transferencia Western: 1. Se prepararon lisados celulares. Las células transducidas con AAV, junto con las células de control no tratadas, se recogieron 36-48 h después de la infección, tras un lavado exhaustivo con PBS. A continuación, las células se lisaron en hielo usando tampón RIPA con inhibidores de proteasas. Los lisados celulares se clarificaron mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min. 2. Cuantificación y preparación de proteínas. La cuantificación de proteínas de los lisados celulares se llevó a cabo usando el kit de ensayo de proteínas ThermoFisher Micro BCATM siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de proteínas se determinó tomando una lectura de DO a 562 nm. Para evaluar la expresión in vitro de CHM, se cargaron entre 40-60 ug de proteína medida en geles Bis-Tris al 4-12 %. 3. SDS-PAGE y transferencia. Se llevaron a cabo SDS-PAGE y análisis de transferencia Western según protocolos conocidos. En resumen, los geles de proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se bloquearon en leche y se incubaron con los anticuerpos primarios. Se usó el anticuerpo anti-REP-12F1 humano (2F1, dilución 1:1000) y uno de los siguientes: anticuerpo anti-GAPDH (dilución 1:1000), anticuerpo anti-actina (dilución 1:1000) o anticuerpo anti-tubulina (dilución 1:5000) como anticuerpos primarios para cada transferencia. Después de lavar la transferencia, se usaron anticuerpos anti-IgG de ratón conjugados con HRP y/o anticuerpos anti-IgG de conejo a una concentración de 1:5000 como anticuerpos secundarios. Las transferencias se revelaron por quimioluminiscencia usando reactivos ECL según las instrucciones del fabricante. Controles: 1. Controles de carga: Uno de los siguientes: se usaron anticuerpo anti-actina, anticuerpo anti-tubulina o anticuerpo anti-GAPDH como control de carga para demostrar la carga igual de proteína en cada pocillo de los geles. El anticuerpo anti-tubulina detecta una proteína de ~51 kDa. El anticuerpo anti-actina detecta una proteína de ~42 kDa, y el anticuerpo anti-GAPDH detecta una proteína de ~39 kDa. Las transferencias iniciales se sondaron con anticuerpo anti-tubulina, anticuerpo anti-actina o anticuerpo anti-GAPDH, dependiendo de su disponibilidad. Después de los experimentos iniciales, para mantener la coherencia, se usó el anticuerpo anti-GAPDH como control de carga. 2. Control positivo: tras establecer la producción de la proteína hREP-1 en células COS-7 transducidas con AAV2.V2a, se usaron lisados de células AAV2.V2a-Cos-7 como control positivo en experimentos posteriores de transferencia Western. 3. Control negativo: se usaron células no tratadas como control negativo. Los análisis de los resultados de la transferencia Western de la producción de proteína REP-1 en diversas líneas celulares se resumen en la Tabla 5.

[0224] Tabla 5

[0227]

[0228]

[0231] El anticuerpo monoclonal humano específico para REP-1 detectó una única proteína hREP-1 de ~ 75-80 kDa en células transducidas con AAV2.copt de última generación. CHM/ AAV8.copt.CHM. No se observó una banda de 75-80 kDa en los lisados celulares de las células de control no tratadas. El sondeo de las transferencias con anticuerpos anti-actina/anti-tubulina/anti-GAPDH mostró una banda de igual densidad en todos los carriles de la transferencia Western, incluidos en los de los controles no tratados. El anticuerpo anti-actina detectó una banda de peso molecular de proteína de ~42 kDa, el anticuerpo anti-tubulina detectó una proteína de ~ 51 kDa y el anticuerpo anti-GAPDH detectó una proteína de ~39 kDa. Todos los anticuerpos detectaron solo bandas específicas del peso molecular de tamaño esperado. No se observaron bandas inespecíficas en ninguna de las transferencias. Se usó un marcador de peso molecular preteñido para comparar los pesos moleculares de la proteína de interés.

[0232] En resumen, se observó la proteína REP-1 con el tamaño esperado en las células COS-7 y 84-31 transducidas con AAV2.V2a, AAV2.V2b, AAV2.hCHM.V3a y AAV2.hCHM.V3b. Los controles no tratados no revelaron la presencia de la proteína REP-1 humana del tamaño esperado. El marcaje de la transferencia con anticuerpo anti-actina detectó una banda de proteína de igual intensidad en todos los carriles del gel de ~ 42 kDa. Se usó una escala de proteínas preteñida para comparar los pesos moleculares de REP-1 y actina. Datos no mostrados.

[0233] Los resultados indican que los vectores de serotipos AAV2 y AAV8 que contienen plásmidos de última generación son capaces de transducir eficazmente las células 84-31 y COS-7. La expresión de CHM en los plásmidos de última generación se encontraba en el intervalo detectable y mostraba una tendencia dependiente de la dosis. La transducción de células con los virus hCHM de última generación dio lugar a la producción de la proteína REP-1 del tamaño previsto.

[0234] Ejemplo 5: Comparación de la expresión de proteínas in vitro de AAV.CHM humano optimizado por codones con AAV.CHM humano nativo

[0235] El objetivo de este estudio era delinear la eficiencia de transducción de los vectores de AAV (serotipos 2 y 8) que contienen diversas versiones de los casetes transgénicos que contienen CHM, midiendo los niveles de proteína REP-1 en un modelo de estudio basado en la línea celular 84-31.

[0236] Plásmidos y vectores: Se compararon un total de 5 plásmidos transgénicos en AAV2 o AAV8: Versión 1 (que se ha usado anteriormente en un ensayo clínico en curso) y cuatro versiones de última generación (V2a, V2b, V3a y V3b). Los plásmidos se manipularon como se describe en el Ejemplo 4, y sus características se muestran en la Tabla 1. La Tabla 2 anterior muestra un resumen de los vectores AAV2 y AAV8 generados y la concentración de las reservas víricas.

[0237] Diseño del estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento)

[0238] 1. En un experimento piloto, se transdujeron células COS-7 y 84-31 con AAV2.hCHM.Versión 1, Versión 2a y Versión 2b. Se realizó una transferencia Western para comparar los niveles de eficiencia de transducción en las dos líneas celulares.

[0239] 2. Las células 84-31, sembradas en placas de 6 pocillos, se transdujeron con uno de los 10 artículos de prueba (Versión 1, 2a, 2b, 3a y 3b en el acervo AAV2 o AAV8) a una MOI de 3E5. Después de 36-48 horas, las células se recogieron y se lisaron. El lisado se cargó en SDS-PAGE y se sometió a análisis de transferencia Western adicionales. Se compararon los niveles de proteína REP-1 entre todas las versiones de la construcción. Se prepararon dos placas separadas para cada experimento con AAV2.CHM o AAV8.CHM, que se analizaron por separado.

[0240] Administración del material de prueba

[0241] 3.4.1 Cultivo celular

[0242] Tanto las células 83-41 como COS-7 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido en glucosa, con un suero fetal bovino al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % de a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2.

[0243] 3.4.2 Preparación de las células para la transducción:

[0244] El día antes de la transducción (18-24 h antes), las células 83-41 y COS-7 se sembraron a una densidad de 3E5 en 2 ml de medio de cultivo celular por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2.

[0245] 3.4.3 Transducción:

[0246] Los pocillos de células 84-31 y Cos-7 se infectaron con vectores AAV como se describe a continuación a una MOI de 3E5 (véase la Tabla 6 para el experimento piloto y la Tabla 7 para la segunda serie de experimentos). No se añadió ningún virus al control negativo (no transducido). En resumen, primero se retiró el medio de cultivo de tejido y se sustituyó con 2 ml de medio fresco/pocillo en cada uno de los pocillos de la placa de cultivo celular de 6 pocillos. A continuación, se midió la cantidad predeterminada de vector de AAV (véase la Tabla 2 para los volúmenes de vector usados para la transducción) (a partir de la reserva) y se añadió directamente a cada pocillo. Las células se incubaron con el virus AAV durante 36-48 horas a 37 °C con 5 % de CO2 hasta su recogida. Las células se observaron al microscopio antes de la recogida para comprobar si presentaban alguna anomalía. Se realizó un análisis de transferencia Western como se describe en el Ejemplo 4.

[0247] Tabla 6: Experimento piloto: Dosis de infección de AAV2.hCHM.V1, 2a, 2b en células 84-31 y COS-7.

[0249]

[0252] Tabla 7: Dosis de infección de los vectores de última generación AAV.hCHM y V1 (AAV2 y AAV8) en células 84-31

[0254]

[0255]

[0258] Resultados: Comparación de la expresión de hCHM nativo (AAV2.hCHM.V1) frente a los vectores CHM AAV2a y 2b optimizados por codones en células 84-31 y COS-7

[0259] En este experimento, las células 84-31 y COS-7 se transdujeron sin vector (control sin tratar), con AAV2.hCHM.Versión1, AAV2.hCHM.Versión2a o Aav2.hCHM.Versión2b. El análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-REP-1 humano mostró que los niveles de proteína REP-1 eran detectables a ~ 75-80 kDa en todas las muestras transducidas con AAV2 (V1, V2a, V2b) y en ambas líneas celulares (datos no mostrados). Se observó una expresión de proteína ligeramente mejor en la línea celular 84-31 (Tabla 8). El anticuerpo anti-REP1 detectó una cantidad insignificante de proteína REP-1 en las células no tratadas. El marcaje de la transferencia con el anticuerpo GAPDH detectó una banda de ~ 39 kDa en todos los lisados celulares, incluidas las células no tratadas.

[0260] La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de proteína) de las transferencias usando el software ImageJ demostró que, tras normalizar los valores a la expresión de la proteína GAPDH endógena, la eficiencia de transducción era similar en las células 84-31 y COS-7. (Véase la Tabla 8 para los resultados). Basándose en esto, se usó la línea celular 84-31, que es de origen humano, para realizar más experimentos.

[0261] En conclusión, AAV2.V1, AAV2.V2a y Aav2.V2b indujeron la producción de la proteína REP-1 tanto en las células 84-31 como COS-7 con una eficiencia de transducción similar.

[0262] Tabla 8: Evaluación densitométrica de las transferencias Western

[0264]

[0265] Comparación de la expresión de CHM nativo frente a vectores AAV2 CHM optimizado por codones en células 84-31: usando un anticuerpo anti-REP-1 humano, los análisis de transferencia Western de las células 84-31 transducidas con AAV2.hCHM. V2a, V3a, V2b, V3b y V1 detectaron una banda de ~ 75-80 kDa en todas las condiciones (datos no mostrados). El anticuerpo anti-REP1 detectó una cantidad insignificante de proteína REP-1 en las células no tratadas. El marcaje de la transferencia con el anticuerpo GAPDH detectó una banda de ~ 39 kDa en todos los lisados celulares, incluidas las células no tratadas. La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de expresión) de las transferencias usando el software ImageJ demostró un aumento en la expresión de AAV2.hCHM.V2a, 3a, 2b y 3b en comparación con AAV2.hCHM. V1 tras normalizar los valores con respecto a la producción de la proteína GAPDH endógena. Véanse las Tablas 9 y 10 para los resultados.

[0267] Tabla 9: Valores de la proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV2.hCHM. V1, Va, V2b, V3a o V3b para la PLACA 1 (no se muestra la transferencia Western)

[0270]

[0273] Tabla 10: Valores de la proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV2.hCHM. V1, V2a, V2b, V3a o V3b para la PLACA 2 (no se muestra la transferencia Western)

[0276]

[0279] Comparación de la expresión de CHM nativo frente a CHM optimizado por codones en vectores AAV8.V1, V2a, V3a, V2b, V3b en células 84-31: Análisis de transferencia Western de células transducidas con AAV8.V1, AAV8.V2a, AAV8.V3a, AAV8.2b, AAV8.3b, con anticuerpo anti-REP-1 humano detectó una banda de ~75-80 kDa en todas las células transducidas (datos no mostrados). El anticuerpo anti-REP1 detectó una cantidad insignificante de proteína REP-1 en las células no tratadas. El marcaje de la transferencia con el anticuerpo GAPDH detectó una banda de ~ 39 kDa en todos los lisados celulares, incluidas las células no tratadas. La evaluación densitométrica de las transferencias con el software ImageJ demostró una mayor expresión de AAV8.hCHM.V2a; 3a; 2b; 3b en comparación con AAV8.V1. Los valores se obtienen tras normalizar primero los valores de CHM con respecto a la expresión de la proteína GAPDH endógena respectiva y, a continuación, se normalizan con respecto al nivel de expresión de la media de la Versión 1. Véanse la Tabla 11 y la Tabla 12 para los resultados.

[0280] Tabla 11: Valores de expresión de la proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV8 hCHM Versión 1, 2a, 2b, 3a y 3b - PLACA 1 (no se muestra la transferencia Western)

[0283]

[0286] Tabla 12: Valores de expresión de la proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV8 hCHM Versión 1, 2a, 2b, 3a y 3b - PLACA 2 (no se muestra la transferencia Western)

[0289]

[0292] Conclusión: Los estudios de expresión comparativos demostraron que la aplicación de vectores AAV que portan AAV.hCHM.Versión 2a, 2b, 3a y 3b de última generación indujo un aumento en la producción de la proteína REP-1 en comparación con la Versión 1 (usada actualmente en ensayos clínicos) tanto en vectores de serotipo AAV2 como AAV8 en células 84-31.

[0294] Ejemplo 6: Evaluación del efecto del relleno lambda en la producción de vectores de AAV mediante análisis de título por qPCR

[0296] Se realizó una única qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) en los 8 vectores de AAV que se muestran en la Tabla 2, arriba, con el fin de evaluar el efecto de las secuencias de relleno lambda en la cantidad de impurezas de ADN. Se usó un patrón de plásmido de AAV linealizado para generar el patrón del ensayo. Se diseñaron conjuntos de cebador-sonda en la región promotora CMV/CBA para la cuantificación del genoma de AAV correctamente encapsidado o en la región codificante de la resistencia a la kanamicina (KanR) para la encapsidación inversa. Los patrones y las muestras de vectores se analizaron en dos conjuntos, uno con el conjunto de cebadorsonda CMV/CBA y otro con el conjunto KanR. Los valores de las muestras de vectores (copias del genoma vírico por ml) se determinaron a partir de cada curva de calibración respectiva. El efecto de la secuencia de relleno se evaluó comparando la cantidad relativa de impurezas que contenían KanR en cada lote de vectores con las secuencias que contenían CMV/CBA.

[0297] Reactivos:

[0298] Título del vector vírico que contiene el transgén:

[0299] Referencia: Promotor del CMV-CBA

[0300] Cebadores: CMV-F: CCC ACT TGG CAG TAC ATC AA

[0301] CMV-R: GCC AAG TAG GAA AGT CCC ATA A

[0302] FAM-Sonda: /56-FAM/CA TAA TGC C/ZEN/A GGC GGG CCA TTT AC/3IABkFQ/

[0303] Título del vector vírico que contiene impurezas:

[0304] Referencia: Gen de resistencia a la kanamicina

[0305] Cebadores:

[0306] KAN-F: GAT GGT CGG AAG TGG CAT AA

[0307] KAN-R: TGC GCC AGA GTT GTT TCT

[0308] FAM-Sonda: /56-FAM/CC GTC AGC C/ZEN/A GTT TAG TCT GAC CA/3IABkFQ/

[0309] Reactivo de dilución: Diluyente Q (PF-68 al 0,001 % en agua libre de nucleasas): Disolución de PF-68 al 1 % diluida 1000 veces con agua estéril. Diluyente S: Diluyente Q 2 ng/µl de ADN de esperma de salmón (Cat. de Agilent Technologies n.º 201190)

[0310] Mezcla maestra universal ABI TaqManTM (Applied Biosystems 4304437/4326708)

[0311] Kit de purificación de productos de PCR Qiagen (Qiagen 28104)

[0312] • ABI QuantStudio 6 Flex System

[0313] PREPARACIÓN DE MUESTRAS

[0314] Se preparó disolución de digestión con Dnasa combinando lo siguiente: tampón Dnasa (10X) 5 µl, H2O sin nucleasas 30 µl, Dnasa I (Invitrogen, 18068-015) 5 µl

[0315] Se mezclaron diez µl de cada muestra de vector de AAV y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de digestión se inactivó añadiendo 50 µl de disolución de SDS/EDTA/NaCl (SDS al 0,2 %/EDTA 5 mM/NaCl 0,2 M) e incubando a 95 °C durante 10 minutos. Cada muestra de vector de AAV se diluyó 10-100.000 veces en diluyente S para el análisis de qPCR.

[0316] PREPARACIÓN DE PATRONES PARA qPCR

[0317] El ADN patrón de referencia (linealizado) se preparó digiriendo el plásmido p1008 (plásmido transgénico de baja copia sin relleno) con XhoI y purificándolo con el kit de purificación de PCR de Qiagen. El material purificado se analizó en gel de agarosa para confirmar su identidad y se cuantificó mediante Nanodrop. El número de copias de ADN se determinó a partir de la concentración de la reserva usando la siguiente equivalencia: 1 pb = 1,096E-21 g. Los patrones de qPCR se prepararon según la siguiente tabla:

[0318] Tabla 13

[0320]

[0321]

[0324] Configuración de la reacción de PCR

[0325] Se analizaron muestras de ADN extraídas por triplicado (3 pocillos) en una sola serie de qPCR. La serie incluyó patrones de ADN de referencia por triplicado, que oscilaban de 103 a 108 copias por pocillo. Se incluyó un control sin molde (NTC) como control negativo. Cada preparación de vector de AAV se analizó con los conjuntos de cebador/sonda CMV/CBA y KanR. De manera similar, para la cuantificación de cada conjunto, los estándares también se analizaron con los conjuntos de cebador/sonda CMV/CBA y KanR.

[0326] Tabla 14: Configuración de la reacción de PCR

[0328]

[0331] La secuencia de la reacción de PCR se configuró de la siguiente manera: 50 °C, 2 minutos, 1 ciclo; 95 °C, 10 minutos, 1 ciclo; 95 °C, 15 segundos, 40 ciclos; 60 °C, 1 minuto, 40 ciclos

[0332] Rendimiento de la serie. Los patrones se prepararon y se analizaron a 103 a 108 copias de ADN por pocillo. El límite inferior del ensayo se fijó en 1000 copias, ya que la sensibilidad del ensayo no era un factor importante para este experimento. Se generó una curva de calibración para el análisis usando los números de copias de patrón y los valores CT (ciclo umbral) de los patrones. Se realizó una regresión lineal de los patrones usando el software ABI (datos no mostrados). El ajuste de la curva de calibración tuvo un coeficiente de correlación (valor R2) de 0,998 o superior, lo que indica un modelo de ajuste fiable. La pendiente de las curvas de calibración fue de -3,5. La pendiente se usó para calcular la eficiencia de la reacción de amplificación, y los valores entre -3,2 y -3,6 representaban una eficiencia de amplificación entre el 90 % y el 110 %. Ambas reacciones del patrón se realizaron con una eficiencia del 92,6-93,8 %. La precisión de los pocillos por triplicado osciló del 2~10 %, lo que indica una buena concordancia entre las réplicas. El control sin molde (NTC) dio como resultado una amplificación no cuantificable por debajo del límite inferior del ensayo.

[0333] Tabla 15: Resumen del ajuste de la curva de calibración

[0335]

[0338] RESULTADOS:

[0339] Determinación de los valores de las muestras: Los valores de las muestra (genoma de AAV y número de copias de encapsidación inversa) se interpolaron a partir de cada curva de calibración coincidente (CMV/CBA o KanR), usando valores CT. El número de copias de ADN interpolado se corrigió para la dilución inicial y/o la dilución de la digestión. Se aplicó el factor de corrección adicional de 2 se aplicó para tener en cuenta la diferencia entre los patrones de ADN bicatenario y el ADN monocatenario en las muestras.

[0340] Los resultados del análisis para los 8 vectores de AAV se resumen en la siguiente tabla, con una comparación cuantitativa entre la concentración de AAV que contiene el transgén (CMV/CBA) y la concentración de impurezas que contienen KanR. El análisis de los resultados demuestra que la inserción del relleno lambda en el plásmido transgénico redujo eficazmente la aparición de ADN del esqueleto del plásmido (es decir, KanR) durante la producción de AAV de ~7-20 veces (FIG.11).

[0341] Tabla 16: Amplificación por qPCR de kanamicina frente a CMV/CBA expresada en porcentaje

[0343]

[0346] Ejemplo 6: Expresión in vitro de vectores de AAV8 de última generación en células iPS mediante transferencia Western.

[0347] El objetivo de este estudio era evaluar la capacidad de la expresión de CHM mediada por AAV tras la administración génica usando una serie de vectores de AAV2 y AAV8 de última generación que portaban el gen codificador REP-1 optimizado por codones en líneas celulares pluripotentes inducidas (iPSC).

[0348] La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPS) se ha utilizado con éxito como plataforma para probar vectores de terapia génica en varios estudios de viabilidad y terapia génica, incluidas las enfermedades oculares. Estas células iPS específicas del paciente proporcionan un valioso sistema modelo in vitro para estudiar la patogénesis de la enfermedad y establecer un modelo para probar la viabilidad de la terapia génica cuando no se dispone de modelos animales relevantes. Como etapa preliminar para probar la terapia de refuerzo génico mediada por AAV de los presentes inventores para la coroideremia (CHM),se han generado células iPS a partir de pacientes humanos portadores de mutaciones en el gen causante, CHM, que codifica la proteína escolta Rab 1 (REP-1) (véase el Ejemplo 1) (el método se describe en NCP.003). Las células iPS generadas se usaron para evaluar la expresión in vitro de las construcciones de AAV.CHM optimizado por codones de última generación de los presentes inventores. Los plásmidos y vectores fueron los descritos en el Ejemplo 4. Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son células madre generadas en el laboratorio a partir de células somáticas, células mononucleares de sangre periférica, que fueron reprogramadas para volver a un estado pluripotente. La reprogramación de las células sanguíneas permite el desarrollo de modelos celulares in vitro personalizados para aplicaciones terapéuticas. En este informe, se usaron células iPS de individuos afectados por CHM para evaluar la producción in vitro de la proteína REP-1 mediante análisis de transferencia Western. La siguiente tabla (Tabla 17) describe los detalles de las células iPS estudiadas y sus respectivas mutaciones causantes de la enfermedad CHM.

[0349] Tabla 17: Una visión general de las células iPS generadas a partir de pacientes con mutaciones de CHM

[0352]

[0353]

[0356] Diseño del estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento)

[0357] 1. Las células iPS sembradas en una placa de cultivo celular de 12 pocillos se infectan con AAV2. hCHM Versión 1, Versión 2a; Versión 2b; Versión 3a; Versión 3b (AAV2.V1; V2a; V2b; V3a; V3b) a una MOI de 1E5 o 3E5. Tras 24 horas de transducción, se añadió 1 ml de medio de cultivo de células iPS a las células. 36-48 horas desde la transducción, se recogieron las células, se lisaron y se procesaron para SDS-PAGE, seguido de análisis de transferencia Western. Se evaluó la producción de la proteína REP-1 en células transducidas con todas las versiones de las construcciones y se comparó con controles no tratados.

[0358] 2. Como experimento piloto, tres líneas celulares iPS diferentes sembradas en una placa de cultivo celular de 12 pocillos se transducen con AAV8. hCHM Versión 1 y AAV8. hCHM Versión 2a (AAV8.V1; AAV8.V2a) a una MOI de 1E6. Las líneas celulares iPS se derivaron de tres individuos afectados por CHM con mutaciones no relacionadas en el gen REP1 y se sembraron en placas separadas para este fin. Tras 36-48 horas, las células se recogieron y lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western en comparación con el lisado celular no tratado.

[0359] Administración del material de prueba

[0360] 3.4.1 Cultivo celular

[0361] Cultivo de células iPS de pacientes con CHM. En resumen, las células iPS se cultivaron en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, alimentadores) en medios de cultivo de células iPS a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2 y 5 % de O2.

[0362] 3.4.2 Preparación de células para la transducción

[0363] El día antes de sembrar las células, se recubrieron placas de 12 pocillos con Matrigel, como se describe en la referencia NCP.003 (NCP.003: Culturing of iPS cells from CHM patient and controls). Antes de la transducción de las células iPS con los respectivos vectores víricos AAV2 o AAV8, las células cultivadas en MEF se sembraron en Matrigel sin MEF (cultivo sin alimentadores). Las células se sembraron a una densidad de 4,5+E5 a 6+E5 en 1 ml de medio de cultivo de células iPS en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2 y 5 % de O2.

[0364] 3.4.3 Transducción

[0365] Para infectar las células iPS con vectores víricos, las células se cultivaron hasta una confluencia de aproximadamente el 50-60 %. (Esto puede tardar 2-4 días en condiciones sin alimentador). Una vez alcanzada una confluencia del 50-60 %, se disoció un pocillo de los 12 y se realizó un recuento celular para determinar el número total de células por pocillo. A continuación, los pocillos de las células iPS se infectaron con los vectores de AAV que se enumeran a continuación con la MOI predeterminada (véanse las Tablas 18 y 19). Antes de la transducción, se retiró el medio de cultivo de células iPS antiguo de las placas y se añadió 1 ml de medio de cultivo de células iPS nuevo en cada pocillo. Se añadieron directamente a cada pocillo volúmenes predeterminados del virus de la reserva. Véase la Tabla 18. Y la Tabla 19. Para la información sobre el número total de células infectadas, la MOI y el volumen de virus usado para la infección. A continuación, las células se incubaron a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2 y 5 % de O2 durante 18-24 horas. Tras 18-24 horas de transducción, se observaron las células al microscopio para detectar cualquier anomalía o muerte celular. En ese momento, se añadió otro ml de medio de cultivo de células iPS fresco a cada pocillo que contenía células infectadas y no infectadas, y se incubaron durante 18-24 horas adicionales a 37 °C en un entorno suministrado con 5 % de CO2 y 5 % de O2. Las células se observaron al microscopio antes de su recogida para evaluar cualquier muerte celular o aspecto anormal.

[0366] Tabla 18: Detalles de la infección y MOI de los vectores AAV2.hCHMV2a, 2B, 3a, 3b de última generación y los vectores AAV2.hCHM.V1 en células iPS derivadas de pacientes con CHM.

[0368]

[0370] Tabla 19: Dosis de infección de los vectores AAV8.V2a y AAV8.V1 en tres líneas celulares iPS derivadas de tres pacientes diferentes con CHM.

[0373]

[0375] Método de medición de los resultados - se realizó un análisis de transferencia Western como se describe en el presente documento.

[0376] Resultados

[0377] 5.1 Expresión de AAV2- hCHM V1, V2a, V2b, V3a, V3b en la línea celular iPS JB588: El anticuerpo monoclonal humano específico para REP-1 detectó una única proteína hREP-1 de ~ 75-80 kDa en las células iPS JB 588 transducidas (datos no mostrados). No se observó ninguna banda en el caso del control no tratado, lo que confirma la presencia de la enfermedad (datos no mostrados). La intensidad de la banda de la proteína REP-1 con una MOI de 3E5 fue mayor en todos los vectores en comparación con una MOI de 1E5. La administración mediada por el virus AAV2. hCHM recombinante del gen hCHM a las células iPS dio lugar a una producción dependiente de la dosis de la proteína REP-1. El sondeo de las transferencias con el anticuerpo contra GAPDH mostró una banda de igual densidad en todos los lisados. GAPDH detectó una proteína de ~39 kDa. Tanto los anticuerpos REP-1 como GAPDH detectaron solo bandas específicas del peso molecular esperado. No se observaron bandas inespecíficas en las transferencias.

[0378] Expresión de AAV8 -hCHM. V1, V2a en células iPS: el anticuerpo monoclonal humano específico para REP-1 detectó una única proteína REP-1 de ~ 75-80 kDa en las células iPS derivadas de pacientes JB527, JB500 y JB588 transducidas (datos no mostrados). No se observó ninguna banda de proteína en el caso del control no tratado. (Datos no mostrados). El sondeo de las transferencias con anticuerpo contra GAPDH mostró una banda de igual densidad en todos los lisados celulares, incluidos los lisados celulares de células no tratadas. El anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda de proteína específica de ~39 kDa. Tanto los anticuerpos REP-1 como GAPDH detectaron solo bandas de proteína específicas con el peso molecular de tamaño esperado. No se observaron bandas de proteína inespecíficas detectables en la transferencia.

[0379] Conclusiones

[0380] Los resultados preliminares presentados en el presente informe revelaron las siguientes observaciones: el análisis de transferencia Western confirmó la presencia de CHM (ausencia de la proteína REP-1) en cada una de las tres iPSC derivadas de pacientes (JB588, JB500, JB527). Los estudios de expresión in vitro demostraron que la infección de células iPS de pacientes con CHM con AAV2.hCHM. Versión 2a, 2b, 3a, 3b y AAV2.hCHM Versión 1 (un candidato actual para ensayos clínicos) indujo la producción de la proteína REP-1 en todos las MOI probadas. La infección de las células iPS con AAV8. hCHM.Versión 2a y AAV8.hCHM Versión1 a una MOI de 1E6 dio lugar a la producción de la proteína REP1 en las tres líneas celulares iPS de CHM. El nivel de producción de REP1 fue mayor en las iPSC infectadas con AAV8.hCHM.V2a que con AAV8.hCHM.V1.

[0381] Ejemplo 7: Comparación de la expresión in vivo de AAV8.CHM humano optimizado por codones frente a AAV.CHM humano nativo

[0382] La terapia génica para una serie de enfermedades de la retina depende de la transducción eficiente de las células diana adecuadas, que para la coroideremia, son las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) y las células fotorreceptoras. Este informe de estudio se centra en la comparación de la expresión in vivo inducida por la construcción basada en la secuencia de CHM nativa (Versión 1) y cuatro casetes transgénicos de última generación encapsidados en un esqueleto de AAV8 en ratones naturales. Los presentes inventores evaluaron aquí el serotipo AAV8 con el fin de mejorar la transferencia génica a las células fotorreceptoras.

[0383] Los experimentos de los presentes inventores se diseñaron para responder a las siguientes preguntas: a. ¿Cómo se compararían estos vectores para la transducción in vivo de fotorreceptores? En particular, ¿cómo de eficaz transduciría el AAV8. CHM de última generación los fotorreceptores tras la inyección subretiniana del artículo de prueba respectivo en comparación con la Versión 1. b?. Respuesta a dosis: ¿Difieren los vectores AAV8. CHM y AAV8. CHM-Versión1 de última generación en la respuesta a la dosis de la expresión génica?.

[0384] Detalles experimentales:

[0385] Los plásmidos y vectores fueron los descritos en el Ejemplo 4. Ratones (animales): Se usaron ratones CD1 naturales para evaluar la expresión in vivo de CHM como se evalúa mediante la producción de la proteína REP-1. La cepa de ratones CD1 es una cepa suiza no consanguínea cuya colonia mantienen los presentes dentro de la empresa. Los detalles del estudio se describen en el protocolo de estudio CAROT PCPR02.01.

[0386] 3.3 Diseño del estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento)

[0387] 3.3.1 Cría de animales: Se inyectaron los artículos de prueba descritos a ratones machos y hembras (~3-4 meses de edad) con un peso de ~ 20-30 g. Los animales se alojaron en las instalaciones del Laboratorio de Recursos Animales (ULAR) de la Universidad de Pensilvania, de acuerdo con la normativa de ULAR de la Universidad de Pensilvania. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de oscuridad. Se les proporcionó comida y agua a voluntad. Todos los animales fueron identificados con números de etiquetas en las orejas.

[0388] 3.4 Administración del material de prueba: Para la administración de la dosis se usó la formulación del artículo de prueba proporcionada por CAROT Vector Core. El material de prueba se almacenó a de -60 a -80 °C. El material de prueba se descongeló en hielo antes de la administración. Para las inyecciones intraoculares, el artículo de prueba se diluyó hasta la concentración objetivo con solución salina tamponada con fosfato, como se describe en la Tabla 20 de formulación. Se preparó un total de 60 µl de mezcla maestra.

[0389] Tabla 20: Tabla de formulación de dosis para inyecciones subretinianas de artículos de prueba.

[0391]

[0394] Preparación del registro de inyecciones antes de las inyecciones subretinianas:

[0395] Se mantuvo un registro de inyecciones con la siguiente información antes de la inyección subretiniana de los artículos de prueba:

[0396] • Número de jaula/número de ratón

[0397] • Identificación del estudio

[0398] • Cepa

[0399] • Fecha de nacimiento

[0400] • Fecha de la inyección

[0401] • Nombre del investigador/inyector

[0402] • Ojo inyectado (izquierdo o derecho)

[0403] • Material de inyección (vector/serotipo)

[0404] • Dosis y volumen

[0405] • Vía de administración (ROA)

[0406] Inyecciones subretinianas: Las inyecciones fueron realizadas por el cirujano mediante inyección subretiniana. En resumen, los animales fueron anestesiados antes de la inyección. La inyección subretiniana del artículo de prueba se realizó usando una jeringa Hamilton 33G. Los detalles de los artículos de prueba y las inyecciones se describen en la Tabla 21. A partir de la mezcla maestra de inyección preparada, se administró un volumen de 1,5 µl por inyección. Se inyectó 5E8 vg/ojo en un ojo por animal y se inyectó 5E9 vg/ojo en el ojo contralateral.

[0407] Tabla 21: Esquema de inyección subretiniana y dosis de inyección

[0409]

[0412] Métodos de medición de resultados

[0413] Sacrificio de animales: a. Después de inyectar a los animales los artículos de prueba, se observó a todos los animales durante 48 horas para cualquier anomalía relacionada con la inyección. B. 21-35 días después de la inyección, se observó a los animales para anomalías oculares mediante oftalmoscopia. C. 90-12 días después de la inyección, se sacrificó a los animales y se recogieron tejidos oculares para evaluar la producción de la proteína REP-1 exógena mediante SDS-PAGE, seguido de un análisis de transferencia Western.

[0414] Recogida de tejido ocular: Se recogió tejido ocular para el análisis de transferencia Western tras extraer el cristalino del ojo con una cuchilla quirúrgica afilada. El ojo (sin el cristalino) se recogió en tubos de congelación debidamente etiquetados.

[0415] Análisis de transferencia Western

[0416] En resumen: 1. Preparación del lisado tisular

[0417] a. Se recogió tejido ocular de los animales inyectados con 2 dosis diferentes de AAV8.CHM y AAV8.V1 de última generación, junto con los tejidos de animales de control no inyectados, tras 21-35 días de la inyección sacrificando a los animales.

[0418] b. A continuación, los tejidos se lisaron en hielo usando tampón RIPA con inhibidores de proteasas.

[0419] c. Los lisados de tejido se clarificaron mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min.

[0420] 2. Cuantificación y preparación de proteínas

[0421] a. La cuantificación de proteínas de los lisados celulares se llevó a cabo usando el kit de ensayo de proteínas Micro BCATM de ThermoFisher siguiendo las instrucciones del fabricante. B. La concentración de proteínas se determinó tomando una lectura de DO a 562 nm. C. Para evaluar la expresión in vivo de CHM, se cargaron entre 20-40 ug de proteína medida en geles Bis-Tris al 4-12 %.

[0422] 3. SDS-PAGE y transferencia Western

[0423] Se transfirieron los geles de proteína a una membrana de nitrocelulosa, se bloquearon en leche y se incubaron con los anticuerpos primarios. Se usaron como anticuerpos primarios el anticuerpo anti-REP-1 2F1 humano (2F1, dilución 1:1000) y/o el anticuerpo anti-GAPDH (dilución 1:1000). Después de lavar la transferencia, se usaron anticuerpos anti-IgG de ratón conjugados con HRP y/o anticuerpos anti-IgG de conejo a una concentración de 1:5000 como anticuerpos secundarios. Las transferencias se revelaron por quimioluminiscencia usando reactivos ECL según las instrucciones del fabricante.

[0424] 4. Controles

[0425] a) Controles de carga: Se usó anticuerpo anti-GAPDH como control de carga para demostrar la carga igual de proteína en cada pocillo de los geles. El anticuerpo anti-GAPDH detecta una proteína de ~39 kDa. B) Control positivo: Se usaron lisados de células COS-7 transducidas con AAV2.V2a como controles positivos. C) Control negativo: Se usaron tejidos oculares de animales no inyectados como control negativo.

[0426] Determinación del valor de la muestra

[0427] Cuantificación del análisis de transferencia Western usando el software ImageJ. En resumen, las evaluaciones densitométricas presentadas en este informe se normalizan primero a los niveles de expresión endógena de la proteína GAPDH de la muestra correspondiente. A continuación, los niveles de expresión se normalizan de nuevo al nivel medio de expresión de REP-1 del control no inyectado.

[0428] Los detalles de las evaluaciones densitométricas y los cálculos del factor de cambio para representar la expresión de la proteína REP-1 se presentan como las Tablas 22 y 23.

[0429] Descripción resumida:

[0430] 1. En las Tablas 22 y 23, la columna 2 muestra los valores brutos de la proteína REP-1 y la columna 3 muestra los valores brutos de la proteína GAPDH.

[0431] 2. El valor de GAPDH de cada muestra se normalizó primero con respecto a los valores de GAPDH del animal 1 de AAV8.V1 y se muestra en la 4.ª columna de la Tabla 22.

[0432] 3. Los valores de cada muestra también se normalizaron con respecto a los valores de GAPDH del animal 2 de AAV8.V1 y se muestran en la 5.ª columna de la Tabla 22.

[0433] 4. A continuación, los valores de REP-1 (columna 2) se normalizan con respecto a la GAPDH normalizada con respecto al animal 1 (columna 4) o a la GAPDH previamente normalizada con respecto al animal 2 (columna 5). Estos se representan en las columnas 6 y 7, respectivamente.

[0434] 5. Los valores normalizados de REP-1 se convierten a continuación en factor de cambio.

[0435] 6. Los valores respectivos de REP-1 se normalizan con respecto a la expresión de REP-1 en el animal 1 o el animal 2 del grupo inyectado con AAV8.V1 y se expresan como factor de cambio (columnas 8 y 9).

[0436] 7. La columna 10 representa el factor de cambio medio en la expresión de la proteína REP-1.

[0437] Resultados

[0438] Comparación de la expresión de CHM usando CHM AAV8.V1 nativo frente a los vectores de CHM optimizado por codones: AAV8.V2a, V2b, V3a y V3b. Se inyectó a ratones CD1 naturales con dos dosis diferentes de cada vector AAV8: una dosis alta de 5E9 vg/ojo y una dosis baja de 5E8 vg/ojo. Los siguientes resultados describen los niveles de proteína REP1 tras la inyección de dosis altas y bajas de AAV8.V1, AAV8.V2a y AAV8.V3a.

[0439] Comparación de la expresión de AAV8.V1 frente a AAV8.V2a y AAV8.V3a (vectores con relleno) en animales inyectados con una dosis alta (5E9 vg/ojo) de vector vírico. El análisis de transferencia Western con anticuerpo humano anti REP-1 detectó una banda de proteína hREP-1 de ~ 75-80 kDa en ambos tejidos oculares (inyectados con dosis bajas y altas) de cada animal tratado con AAV8.V2a o V3a de última generación o con AAV8.Versión1 original. Se observa una banda muy débil (mínima) en el caso de los ratones de control no inyectados, ambos. Se observó una banda de mayor intensidad en los tejidos que fueron transducidos con vectores de última generación (AAV8.V2a y AAV8.V3a) en comparación con los tejidos transducidos con la Versión 1. 1. Los anticuerpos anti-GAPDH mostraron una banda de ~39 kDa de igual densidad en todos los carriles de la transferencia Western, incluidos los controles no inyectados. Se usa un marcador de proteínas preteñido para comparar los pesos moleculares de la proteína de interés. La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de expresión) de las transferencias usando el software ImageJ demostró que la producción de REP-1 aumentó en los animales inyectados con una de las construcciones de dosis alta y baja (V2a o V3a) de AAV8 de última generación. (Véase la Tabla 22 para los valores).

[0440]

[0441]

[0444] 

[0445]

[0446]

[0447]

[0450] Comparación de la expresión de AAV8.V1 frente a AAV8.V2a y AAV8.V3a en animales inyectados con dosis bajas (5E8 vg/ojo) de vector vírico

[0451] El anticuerpo humano anti REP-1, el análisis de transferencia Western de los tejidos oculares de animales inyectados con AAV8.V2a, V3a y AAV8.Versión 1 de última generación a una dosis de 5E8, detectó una banda de proteína hREP-1 de ~ 75-80 kDa en los tejidos de ratones inyectados. Se observó una banda débil (mínima) de REP-1 en los lisados de tejido ocular de los ratones de control no inyectados, ambos. Se observó una banda de mayor intensidad en los lisados de tejido que se transdujeron con vectores de última generación en comparación con los lisados que se transdujeron con la Versión 1. El anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda de proteína de igual intensidad a ~ 39 kDa en todos los lisados celulares. Estos datos demuestran que la administración de V2a CHM de última generación a través de AAV8 da como resultado niveles robustos de proteína REP-1 en comparación con los niveles producidos tras la inyección de AAV8.V3a o AAV8.V1.

[0452] La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de expresión) de las transferencias usando el software ImageJ demuestra además un aumento de la producción de REP-1 en animales inyectados con construcciones AAV8.CHM de última generación (especialmente V2a) en comparación con la Versión 1. Véase la Tabla 23 para los valores. Expresión de AAV8.V2b en ratones CD1

[0453] El presente estudio y la evaluación del efecto del relleno lambda en la producción de vectores de AAV mediante análisis del título de qPCR se llevaron a cabo simultáneamente. Los presentes inventores realizaron todas las inyecciones en animales para el estudio de expresión in vivo como se describe en el protocolo de estudio PCPR.02 y recogieron todas las muestras. Una vez concluido el estudio de qPCR sobre el elemento de relleno lambda (descrito anteriormente), los presentes inventores decidieron llevar a cabo los experimentos de transferencia Western solo para comprobar la expresión de vectores de AAV sin el relleno, como AAV8.2b y AAV8.3b, y excluirlos de análisis posteriores (como la comparación con la Versión 1).

[0454] El anticuerpo humano anti-REP-1 detectó una proteína de ~75-80 kDa en los tejidos oculares de ratones CD-1 inyectados con AAV8.2b a 5E9 (dosis alta) copias del genoma del vector (FIG. 12A). Los animales inyectados con AAV8.2b a 5E8 (dosis baja) mostraron una banda de proteína muy débil de ~75-80 kDa (FIG. 12A). Los lisados de los tejidos oculares de los animales de control no inyectados no mostraron la presencia de la proteína REP-1. El anticuerpo anti-GAPDH detectó una proteína de ~39 kDa en todos los lisados de tejido ocular, incluidos los controles no inyectados. Estos datos pueden establecer la dosis mínima para AAV8.2b.

[0455] Expresión de AAV8.V3b en ratones CD1

[0456] Los presentes inventores realizaron un análisis de transferencia Western en tejidos oculares de ratones CD1 inyectados con AAV8.3b (2 ratones/grupo) con anticuerpo anti-REP-1, que reveló la presencia de una proteína de ~75-80 kDa en un ojo inyectado con dosis baja y en ambos ojos inyectados con dosis alta de AAV8.3b. En los tejidos oculares de los ratones no inyectados no se detectó expresión de REP-1 (FIG.12B). El nivel de REP-1 producido fue dependiente de la dosis en los animales inyectados con AAV8.3b. La inyección con una dosis alta de AAV8.3b (5E9 genomas del vector) indujo una mayor cantidad de REP-1 en comparación con los ojos inyectados con una dosis baja (5E8 genomas del vector). El anticuerpo anti-GAPDH detectó una proteína de ~39 kDa en los lisados de tejido ocular de todos los animales inyectados y no inyectados.

[0457] Estos resultados revelaron las siguientes observaciones:

[0458] 1) Los vectores de última generación AAV8.Versión2a, 2b, 3a y 3b son capaces de transducir los tejidos oculares de manera eficiente.2) La expresión del transgén (CHM optimizado por codones) fue detectable para todos los vectores de última generación. 3) La expresión del transgén (CHM optimizado por codones) depende de la dosis. 4) AAV8.Version2a y AAV8.Versión2b indujeron un aumento de la producción de la proteína REP-1 en comparación con AAV8.Versión 1 en los tejidos oculares de ratones CD-1.5) Existe una variación en el nivel exacto de producción de la proteína transgénica entre los ojos inyectados con la misma dosis, lo que refleja la variabilidad en el procedimiento de administración quirúrgica. Sin embargo, las diferencias en los niveles son grandes entre las dosis bajas (5E8) y altas (5E9). 6) AAV8.CHM.V2a y AAV8.V3a dan lugar a niveles mucho más altos de producción de la proteína REP-1 que AAV8.V1 tras la administración in vivo de una dosis alta (5E9 vg) del vector subretiniano en ratones.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o 11.

2. Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia codificante de la cápside del AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del AAV, una secuencia que codifica el canal alfa 3 regulado por nucleótidos cíclicos (CNGA3) humano que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 u 11, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión del CNGA3 en una célula hospedadora.

3. El vector de AAV de la reivindicación 2, en donde las secuencias de control de la expresión comprenden un promotor.

4. El vector de AAV de la reivindicación 3, en donde el promotor es un promotor de rodopsina o un promotor de rodopsina cinasa.

5. El vector de AAV de la reivindicación 3, en donde el promotor es un promotor específico de células oculares seleccionado de un promotor EF1a humano, un promotor del receptor metabotrópico de glutamato 6 (mGluR6), un promotor de rodopsina, promotores de opsina de los conos y promotores de factores de transcripción (cremallera de leucina de la retina neural (Nrl) y receptor nuclear específico de fotorreceptores Nr2e3, bZIP); o es un promotor inducible, un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido; y, opcionalmente, en donde el promotor es un promotor inducible seleccionado del promotor de rapamicina/rapálogo, el promotor de ecdisona, el promotor sensible al estrógeno y el promotor sensible a la tetraciclina, o un interruptor represor heterodimérico.

6. El vector de AAV de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además uno o más de un intrón, una secuencia Kozak, una poliA y un elemento regulador postranscripcional.

7. El vector de AAV de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la cápside del AAV es una cápside de AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAV8bp o AAV7m8, o una variante de las mismas.

8. El vector de AAV de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde las secuencias ITR son:

de un AAV diferente al que suministra la cápside del AAV; y/o

de AAV2.

9. Un vector de AAV que comprende una secuencia codificante de la cápside de AAV8 y un casete de expresión, en donde dicho casete de expresión comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 u 11 que codifica CNGA3, secuencias ITR y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGA3 en una célula hospedadora.

10. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y al menos el vector de AAV según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de la acromatopsia.

12. La composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, en donde dicha composición es para administración subretiniana, intravítrea, intravenosa o en la coroides.

13. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde dicha composición se administra en una dosis de aproximadamente 10<9>a aproximadamente 10<13>genomas vectoriales (VG).

14. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha composición se administra en un volumen de aproximadamente 100 µl a aproximadamente 500 µl.

15. Un plásmido para producir un vector de AAV, comprendiendo el plásmido la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.