ES3061241T3 - Trailshort antibody and methods of use - Google Patents

Trailshort antibody and methods of use

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ES3061241T3
ES3061241T3 ES18751393T ES18751393T ES3061241T3 ES 3061241 T3 ES3061241 T3 ES 3061241T3 ES 18751393 T ES18751393 T ES 18751393T ES 18751393 T ES18751393 T ES 18751393T ES 3061241 T3 ES3061241 T3 ES 3061241T3
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Abstract

Este documento proporciona anticuerpos contra el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) corto, y más específicamente, anticuerpos humanizados contra TRAIL corto que pueden neutralizarlo. Por ejemplo, se proporcionan materiales y métodos para utilizar uno o más anticuerpos humanizados contra TRAIL corto para inducir apoptosis (p. ej., mediante la muerte celular mediada por TRAIL, la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) y/o la eliminación de células T CD8+). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpo anti-Trailshort y métodos de uso
[0003] ANTECEDENTES
[0004] 1. Campo técnico
[0005] Este documento se refiere a los anticuerpos contra el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL) corto, y más particularmente a los anticuerpos humanizados anti-TRAILshort que pueden neutralizar TRAILshort. Por ejemplo, este documento proporciona materiales y métodos para utilizar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort humanizados para inducir la apoptosis.
[0006] 2. Información de antecedentes
[0007] TRAIL es una proteína inmunorreguladora, expresada por células inmunes y otras células, que puede matar células infectadas por virus o malignas mediante la unión al receptor 1 de TRAIL (TRAIL-R1) o TRAIL-R2 en células diana. TRAILshort es una variante de ayuste de TRAIL que es capaz de bloquear la muerte celular mediada por TRAIL. TRAIL puede unirse a uno de los cinco receptores cognados, TRAIL-R1, R2, R3, R4 u osteoprotegerina, aunque sólo la unión a TRAIL-R1 o R2 induce la muerte por apoptosis de la célula portadora del receptor (Wang and El-Deiry, 2003 Oncogene 22:8628-8633).
[0008] Badley AD et al. describen en Cell Death and Disease, vol. 4, no. 7, 1 de julio de 2013, en la página e718, que alterar las rutas de muerte celular es un enfoque para curar la infección por VIH.
[0009] Barblu L et al. describen en Clinical Immunology, vol.155, no.1, 7 de agosto de 2014, páginas 17-26, una reducción de la expresión del receptor de muerte 5 y una apoptosis de las células T CD4<+>de los controladores del VIH. El documento US 2015/218275 A1 describe moléculas de anticuerpos anti-TIM-3 que pueden usarse para tratar, prevenir y diagnosticar afecciones y trastornos inmunes, cancerosos o infecciosos.
[0010] El documento US 2010/172914 A1 describe que las isoformas de TRAIL modulan la apoptosis y pueden usarse para tratar un mamífero que tiene una afección asociada a la apoptosis.
[0011] Schnepple DJ et al. describen en The Journal of Biological Chemistry, vol.286, no.41, 14 de octubre de 2011, en las páginas 35742-35754, un aislamiento de un antagonista de TRAIL del suero de pacientes infectados con VIH. El documento US 2002/155109 A1 describe anticuerpos biespecíficos que se unen al receptor 1 de TRAIL y al receptor 2 de TRAIL que inducen la apoptosis de células tumorales y células infectadas por virus.
[0012] SUMARIO
[0013] La presente invención está definida por las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes representan realizaciones adicionales de la invención.
[0014] TRAILshort es una nueva variante de ayuste de TRAIL, capaz de unirse a TRAIL-R1 ("R1") y/o TRAIL-R2 ("R2"). Cuando se une a R1 y/o R2, TRAILshort evita que TRAIL de longitud completa induzca la muerte celular (Schnepple et al., 2011 J Biol Chem 286, 35742-35754).
[0015] Este documento proporciona anticuerpos contra TRAILshort (por ejemplo, anticuerpos anti-TRAILshort), y más particularmente contra anticuerpos anti-TRAILshort humanizados que pueden neutralizar TRAILshort, pero no se unen a un TRAIL de longitud completa. Este documento también proporciona materiales y métodos para obtener y utilizar anticuerpos contra TRAILshort. Por ejemplo, se pueden usar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort humanizados para modular (p. ej., aumentar o disminuir) la apoptosis (p. ej., a través de muerte celular mediada por TRAIL, citotoxicidad por células asesinas naturales (NK), muerte por células T CD8+, muerte por células T con receptores quiméricos de antígeno (CAR), y/o viroterapia oncolítica). En algunos casos, uno o más anticuerpos anti-TRAILshort humanizados se pueden usar para tratar el cáncer (por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, carcinoma de ovario, melanoma, carcinoma de páncreas, cáncer de útero, y cáncer hematológico tales como neoplasias malignas de células B) y/o infecciones virales crónicas (por ejemplo, infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]).
[0016] Como se demuestra aquí, los efectos anti-TRAIL de TRAILshort se pueden neutralizar eficazmente utilizando un anticuerpo específico de TRAILshort. La neutralización de TRAILshort es eficaz para inducir la apoptosis mediante muerte celular mediada por TRAIL, citotoxicidad por NK, muerte por células T CD8+, muerte por células T CAR, y/o viroterapia oncolítica.
[0017] En general, un aspecto de este documento presenta un anticuerpo que se une a TRAILshort. El anticuerpo anti-TRAILshort puede incluir un dominio de región variable de cadena pesada (VH) que incluye las regiones determinantes de complementariedad (CDR) expuestas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio de región variable de cadena ligera (VL) que comprende las CDR expuestas en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado que incluye una secuencia de dominio VH expuesta en SEQ ID NO:6. La cadena pesada puede incluir una secuencia que incluye SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado que incluye una secuencia de dominio VL expuesta en SEQ ID NO:20. El dominio VL puede incluir una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). El anticuerpo puede ser un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede unirse a TRAILshort. El anticuerpo puede neutralizar TRAILshort. En algunos casos, el anticuerpo puede ser biespecífico (por ejemplo, puede incluir un fragmento de unión a antígeno que se une a TRAILshort y un fragmento de unión a antígeno que se une a otro antígeno, tal como un antígeno de superficie celular (también denominado marcador de superficie celular)).
[0019] En otro aspecto, este documento presenta una composición que incluye un anticuerpo que se une a TRAILshort (por ejemplo, un anticuerpo que incluye un dominio VH que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio VL que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16), para uso en un método de tratamiento de una infección. La infección es una infección crónica (por ejemplo, una infección por VIH). El anticuerpo aumenta la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK). El mamífero puede ser un ser humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado. El método también puede incluir la administración al mamífero de un agonista de TRAIL (por ejemplo, TRAIL recombinante, un anticuerpo anti-TRAIL-R1, un anticuerpo anti-TRAIL-R2, o un oligómero de TRAIL). El método también puede incluir la administración al mamífero de una terapia antirretroviral (p. ej., abacavir, didanosina, emtricitabina, entecavir, lamivudina, estavudina, fumarato de tenofovir disoproxil, zalcitabina, zidovudina, delavirdina, efavirenz, etravirina, nevirapina, rilpivirina, arifovir, enfutivir, enfutivir, enfutivir, maraviroc, dolutegravir, elvitegravir, raltegravir, bevirimat, amprenavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir, atazanavir, darunavir, tipranavir, TRIM5alpha, antagonistas de tat, o tricosantina).
[0021] En otro aspecto, este documento presenta una composición que incluye un anticuerpo que se une a TRAILshort (por ejemplo, un anticuerpo que incluye un dominio VH que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio VL que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16), para uso en un método de tratamiento de cáncer, en la que el anticuerpo induce la apoptosis en una célula cancerosa del cáncer. El cáncer puede ser, por ejemplo, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de cabeza y cuello, linfoma, leucemia, carcinoma de ovario, melanoma, carcinoma de páncreas, o neoplasias malignas de células B. El mamífero puede ser un ser humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado. El método también puede incluir la administración al mamífero de un agonista de TRAIL (por ejemplo, TRAIL recombinante, un anticuerpo anti-TRAIL-R1, un anticuerpo anti-TRAIL-R2, o un oligómero de TRAIL). El método también puede incluir la administración al mamífero de un tratamiento contra el cáncer (por ejemplo, un agente de quimioterapia, radioterapia, braquiterapia, o cirugía). Cuando el tratamiento del cáncer es un agente de quimioterapia, el agente de quimioterapia se puede seleccionar del grupo que consiste en altretamina, busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, lomustina, melfalán, oxalaplatino, temozolomida, tiotepa, 5-fluorouracilo (5-FU), 6-mercaptopurina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, y pemetrexed, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, actinomicina-D, bleomicina, mitomicina-C, mitoxantrona, topotecán, irinotecán, etopósido, tenipósido, mitoxantrona, docetaxel, estramustina, ixabepilona, paclitaxel, vinblastina, vincristina, vinorelbina, prednisona, etilprednisolona, dexametasona, L-asparaginasa, bortezomib, retinoides, tretinoína, bexaroteno, trióxido de arsénico, CHOP, R-CHOP, trastuzumab, pertuzumab, ipilimumab, dinutuximab, siltuximab, cetuximab, panitumumab, necitumumab, ramucirumab, bevacizumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, olaratumab, denosumab, blinatumomab, rituximab, ofatumumab, obinutuzumab, daratumumab, alemtuzumab, elotuzumab, gemtuzumab ozogamicina, brentuximab vedotin, trastuzumab, emtansina, apatinib, cabozantinib, alectinib, crizotinib, dasatinib, imatinib, nilotinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, sorafenib, sunitinib, tofacitinib, cobimetinib, trametinib, bortezomib, disulfiram, lactacistina, tamoxifeno, obatoclax, navitoclax, gossypol, iniparib, olaparib, perifosina, dabrafenib, vemurafenib, trametinib, abemaciclib, palbociclib, ribociclib, trilaciclib, fulvestrant, temsirolimus, everolimus, vemurafenib, trametinib, dabrafenib, o vintafolida.
[0023] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos normales en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento para practicar la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto entre la presente memoria descriptiva y una referencia aquí mencionada, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
[0024] Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción que sigue. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
[0026] DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0028] La Figura 1 muestra que TRAILshort se produce tanto en células no infectadas como en células infectadas por VIH. La expresión génica de células individuales en células T CD4 primarias de pacientes VIH positivos (VIH+; N=6) y controles VIH negativos (VIH-; N=3) se evaluó mediante tecnología Fluidigm. A) Mapa de calor representativo de la expresión de transcritos de ARNm para TRAIL, TRAILshort, niveles de ARNm, y marcadores de superficie celular en células individuales de un solo paciente VIH positivo. B) Expresión del gen ARNm del VIH en células de pacientes VIH+ y VIH- (Pts). C) Expresión del gen HLA-DR en células de pacientes VIH+ y VIH-. D) Expresión del mensaje de TRAILshort en células de pacientes VIH+ y VIH-. E) Expresión de TRAILshort en células VIH+ y VIH-, determinada por la expresión celular de los genes del VIH. F) Expresión de TRAILshort en células individuales que expresan TRAIL o no expresan TRAIL. G) Expresión de TRAILshort en reposo (CD25, CD38 y HLA-DR) o activadas (cualquier expresión de CD25, CD38 y/o HLA-DR). H) Expresión de TRAILshort en subconjuntos de células T - RTE: inmigrantes tímicos recientes; TCM: células T de memoria central; TEM: células T de memoria efectora; TTM: células T de memoria transicional.
[0030] La Figura 2 muestra que los interferones tipo I impulsan la producción de TRAILshort. Para A, B y C, las células T CD4 en reposo no infectadas primarias (CD25, CD69, HLA-DR) no se estimularon o se estimularon con interferones (A), interleucinas (B) u otras proteínas biológicamente activas (C), y el ARNm de TRAILshort se midió por qRT-PCR. D) Se comparó la expresión concomitante de ARNm de TRAIL y TRAILshort entre muestras. E) Las células T CD4 en reposo se estimularon como se muestra, y la expresión de la proteína TRAILshort se evaluó mediante transferencia Western. F) Las PBMC se trataron con control de vehículo, agonistas TLR 7, 8 o 9 o control inactivo TL9 durante 24 horas, y se midió la expresión de ARNm de TRAILshort. G) Las células T CD4 aisladas en reposo se trataron de manera similar a las PBMC en (F), y se midió el ARNm de TRAILshort. H) Las PBMC se trataron como en (F), y después de 24 horas, las células T CD4 se separaron y se midió el ARNm de TRAILshort en el subconjunto CD4. Los datos representan medias (SEM) de 5 experimentos independientes por tratamiento. P<0,05 se considera estadísticamente significativo.
[0032] La Figura 3 muestra que el extremo C de TRAILshort es extracelular e interactúa con los receptores de "muerte" de TRAIL, pero no con los receptores "señuelo" de TRAIL. A) Alineación esquemática de los exones, regiones citosólicas, transmembrana, extracelular y 3' no traducida (UTR) de TRAIL<FL>y TRAILshort. B) Las células 293T que expresaban transitoriamente TRAILshort con c-myc clonado en el dominio EC se tiñeron con un anticuerpo anti-c-myc o un control de isotipo. Clave: Relleno gris (eGFP TRAILshort myc con control de isotipo); línea discontinua (eGFP, anti-myc); línea continua (eGFP TRAILshort, anti-myc). C) Los lisados de células 293T que expresaban transitoriamente TRAIL R1 o R2 etiquetados con FLAG en el extremo C se combinaron con lisados de células que expresaban TRAIL<FL>etiquetado con HA en el extremo N o TRAILshort etiquetado con HA en el extremo N (como se indica en la parte superior de los paneles), y después se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-HA. Las proteínas complejadas se resolvieron y se inmunotransfirieron para FLAG o para HA. Los lisados de entrada totales se muestran en los dos paneles inferiores. D) Los lisados de células 293T que expresan los receptores señuelo de TRAIL R3 y R4 se combinaron con lisados de células que expresan TRAIL<FL>etiquetado con HA en el extremo N o TRAILshort etiquetado con HA en el extremo N (como se indica en la parte superior de los paneles), y después se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-HA. Las proteínas complejadas se resolvieron y se inmunotransfirieron para FLAG o para HA. Los lisados de entrada totales se muestran en los dos paneles inferiores. E) La unión de TRAILshort a los receptores de TRAIL R1, R2, R3 y R4 se determinó mediante ELISA. F) Unión de TRAILshort a receptores de TRAIL R1, R2, R3 y R4 visualizada mediante microscopía confocal. Los datos mostrados son representativos de cuatro experimentos independientes.
[0034] La Figura 4 muestra que TRAILshort está contenido en vesículas extracelulares. A) Las células T Jurkat que expresan transitoriamente GFP-TRAILshort se analizaron mediante microscopía confocal, y las células se contratiñeron con DAPI. B) Las fracciones de membrana o citosólicas de células T Jurkat infectadas y no infectadas (NI) con VIH se analizaron para determinar HSP 70 (proteína selectiva del citosol) o para TRAILshort. C) Se prepararon fracciones citosólicas, de membrana y sobrenadante a partir de células T Jurkat infectadas y no infectadas (NI) con VIH, y se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpo anti-TRAILshort. D) Las vesículas extracelulares de las células CD4+ estimuladas con PHA se fijaron y se tiñeron con ácido fosfotúngstico, y luego se analizaron mediante microscopía electrónica. Barra de escala, 2 µm. E) Las vesículas extracelulares de células CD4+ estimuladas y no estimuladas con PHA se analizaron mediante transferencia Western para TRAILshort. F) Análisis de transferencia Western de preparaciones de vesículas extracelulares purificadas de células 293T que expresan transitoriamente HA-TRAIL<FL>y HA-TRAILshort. G) Análisis citométrico de flujo de preparaciones de vesículas extracelulares de sobrenadantes de células 293T transfectadas con eGFP-TRAILshort solo, Ruby-TRAIL<FL>solo. H) Las vesículas extracelulares del sobrenadante de células 293T transfectadas con HA-TRAIL<FL>solo, HA-TRAILshort solo, o cotransfectadas con relaciones 1:1 o 1:2 de HA-TRAIL<FL>/HA-TRAILshort se usaron para tratar células T Jurkat diana. La actividad apoptótica se determinó mediante la tinción de células Jurkat para la caspasa 3 escindida. I) Confirmación mediante transferencia Western de la expresión de HA-TRAIL<FL>y HA-TRAILshort en vesículas extracelulares en células 293T de (H). J) Los sobrenadantes de células T CD4 primarias de control, infectadas por VIH, y simuladas, en cultivo, se separaron en fracciones de microvesículas o exosomas como se indica y se analizaron mediante transferencia Western con el anticuerpo monoclonal específico anti-TRAILshort.
[0036] La Figura 5 muestra que la protección de TRAILshort contra TRAIL puede transferirse a las células vecinas. A) Las células efectoras 293T que expresaban TRAIL<FL>, TRAILshort o ambos se mezclaron con células T Jurkat diana marcadas con CTO. Después de la incubación, las células se analizaron mediante citometría de flujo, seleccionando poblaciones positivas (Jurkat) para Cell Tracker Orange (CTO) y tiñendo para células vivas/muertas. B) Las células 293T se transfectaron con 1, 2, 5, 10 o 20 µg de TRAIL<FL>marcado con HA en el extremo N solo, y se analizaron mediante Western con un anticuerpo anti-HA. C) Las células 293T se cotransfectaron con 1, 2, 5 o 10 µg de TRAILshort y 10 µg constantes de TRAIL<FL>, y se analizaron mediante transferencia Western. D) Las células efectoras 293T transfectadas con cantidades crecientes de TRAIL<FL>de (B) se cocultivaron con células Jurkat diana CTO+ y se determinó el porcentaje de muerte de células Jurkat CTO+. E) Las células efectoras 293T de (D), cotransfectadas con cantidades crecientes de TRAILshort a TRAIL<FL>constante, se cocultivaron con la célula diana y se analizaron como en (C). F) Esquema de plásmidos que codifican TRAILshort con etiqueta Ruby en el extremo N (Ruby-TRAILshort), una construcción que carece del dominio transmembrana (Ruby-TRAILshortΔTM), y la etiqueta Ruby sola (panel inferior). Análisis Western con anticuerpos anti-TRAILshort y controles anti-actina de lisados de células 293T transfectadas con estas construcciones (panel superior). G) Las células 293T se transfectaron con las construcciones en (F) y se muestran micrografías representativas (panel superior). Los sobrenadantes de las células transfectadas 293T se recolectaron y se utilizaron para tratar células HeLa diana que después se analizaron mediante microscopía confocal. Se muestran micrografías representativas que superponen los núcleos de HeLa teñidos con DAPI y los canales de filtro ruby-TRAILshort o Ruby-TRAILshortΔTM (panel inferior). Las células HeLa tratadas con sobrenadante de células 293T que expresan Ruby TRAILshort sólo tienen Ruby TRAILshort localizado en la superficie punteada de las membranas plasmáticas. H) Las células HeLa de (G) que se pretrataron con sobrenadantes de 293T transfectados con Ruby, Ruby-TRAILshort o Ruby-TRAILshortΔTM se trataron con un super killer (sk)-TRAIL. La muerte celular se cuantificó mediante tinción de caspasa 3 activa a lo largo del tiempo. En el punto temporal más a la derecha, las cuatro trazas son, de arriba a abajo, sk-TRAIL Ruby, sk-TRAIL Ruby-TRAILshortΔTM, sk-TRAIL medio, sk-TRAIL Ruby-TRAILshortΔTM. Datos representativos de cuatro experimentos independientes. P<0,05 se considera estadísticamente significativo mediante regresión lineal.
[0038] La Figura 6 muestra que TRAILshort contiene un dominio PEST, y es ubiquitinado y degradado por el proteasoma. A) Las células 293T se transfectaron con TRAILshort marcado con HA en el extremo N, se trataron con cicloheximida (100 µg/ml), y se analizaron en los momentos indicados mediante análisis Western con un anticuerpo anti-HA. B) Los supuestos dominios PEST en TRAILshort se indican con "+" debajo de la secuencia de péptidos de TRAILshort. C) Se diseñó una mutación de prolina 76 a alanina (P76A) en el dominio PEST de TRAILshort, y las células se transfectaron y analizaron en presencia de cicloheximida como en (A). D) TRAILshort marcado con HA se transfectó en células 293T y se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-HA, después los inmunoprecipitados se trataron con diversas enzimas desubiquitinantes (DUB) que distinguen entre los enlaces de ubiquitina Lys48 y Lys63 (OTUB1, AMSH, OOTUD3, TRABID, OTUD7B, YOD1, Otulina, o USP2). Las muestras tratadas se separaron mediante SDS-PAGE y después se inmunotransferieron para ubiquitina. E) Las células 293T transfectadas con TRAILshort se incubaron en presencia de MG132 durante los tiempos indicados, después se cosecharon, y analizaron por western con anti-TRAILshort. F) La expresión de TRAILshort aumenta en el mutante P76A. TRAILshort y P76A TRAILshort se transfectaron en células 293T y se analizaron mediante citometría de flujo para TRAILshort (paneles inferiores) o con un anticuerpo de control de isotipo (paneles superiores). Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
[0040] La Figura 7 muestra que TRAILshort es necesario y suficiente para causar resistencia a TRAIL. A) Las células T Jurkat, que expresan constitutivamente TRAILshort, fueron inducidas a morir mediante la adición de sk-TRAIL, en presencia o ausencia de cantidades crecientes de anticuerpo anti-TRAILshort. La muerte celular se midió mediante tinción de caspasa 3 activa. Las células de control se treataron con un aumento del anticuerpo anti-TRAILshort únicamente. En el punto temporal más a la derecha, los cuatro trazos superiores son, de arriba a abajo, 5 µg/ml de anti-TRAILshort, 2,5 µg/ml de anti-TRAILshort, 1 µg/ml de anti-TRAILshort y 0 µg/ml de anti-TRAILshort. B) Las células HeLa, que no expresan TRAILshort, fueron estimuladas a morir mediante la adición de sk-TRAIL en ausencia o presencia de cantidades crecientes de una proteína de fusión que consiste en el dominio extracelular de TRAILshort fusionado a Fc (Ts-ECD:Fc) o con control de seroalbúmina bovina (BSA), y se analizaron como en (A). Las células de control adicionales se trataron con un aumento de TRAILshort-ECD:Fc solo. En el punto temporal más a la derecha, los cinco primeros trazos son, de arriba a abajo, 0 µg/ml anti-TRAILshort-ECD:Fc, 10 µg/ml BSA, 5 µg/ml anti-TRAILshort-ECD:Fc, 2,5 µg/ml anti-TRAILshort-ECD:Fc y 10 µg/ml anti-TRAILshort-ECD:Fc. Los datos son representativos de seis experimentos independientes.
[0041] La Figura 8 muestra que la sobreexpresión de TRAILshort reduce la citotoxicidad de las células NK. A) Una transferencia Western muestra sobreexpresión de TRAILshort-EGFP-C1 en células Jurkat. B) Las células NK se co-cultivaron con células Jurkat marcadas con CTO y se tiñeron para caspasa -3 activada. C) Se realizaron ensayos de citotoxicidad con células Jurkat en presencia de TRAILshort o plásmido de control con relaciones E:Tt crecientes. EGFP-C1 está a la izquierda y TRAILshort-EGFP-C1 está a la derecha en todos los casos. La Figura 9 contiene citometría de flujo que muestra que el VIH IIIB induce la expresión superficial de TRAILshort en las células NK. Las células NK se incubaron con sobrenadantes de cultivo que contenían el virus VIH IIB o la proteína recombinante Gp120, y se tiñeron para la expresión superficial de TRAILshort y TRAIL<FL>. La Figura 10 contiene gráficos que muestran que TRAILshort no afecta la activación de NK. Las células NK se cocultivaron con células Jurkat que sobreexpresaban TRAILshort (barras grises), se aislaron, y se tiñeron para CD16, perforina, CD107, y CD69.
[0042] La Figura 11 contiene diagramas esquemáticos que muestran A) cómo TRAILshort ocupa el receptor de TRAIL 1 y/o 2 en una célula diana, evitando así la muerte celular mediada por TRAIL; y B) cómo un anticuerpo anti-TRAILshort puede unirse a TRAILshort y bloquearlo para permitir que TRAIL se una a R1 o R2 e induzca la apoptosis.
[0043] La Figura 12 contiene secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) y de las regiones variables de cadena ligera (VL) de anticuerpos anti-TRAILshort representativos. A. Una alineación de secuencias de aminoácidos que incluye la secuencia de VH murino (VH0) (SEQ ID NO: 4) alineada con cuatro variantes de VH humanizadas: VH1 (SEQ ID NO:5), VH2 (SEQ ID NO:6), VH3 (SEQ ID NO:7), y VH4 (SEQ ID NO:8). Las CDR están subrayadas. B. Una alineación de secuencias de aminoácidos que incluye la secuencia de VL murino (VL0) (SEQ ID NO: 17) alineada con cuatro variantes de VL humanizadas: VL1 (SEQ ID NO: 18), VL2 (SEQ ID NO: 19), VL3 (SEQ ID NO:20), y VL4 (SEQ ID NO:21). Las CDR están subrayadas.
[0044] La Figura 13 contiene secuencias de aminoácidos de anticuerpos anti-TRAILshort humanizados. A. Secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas humanizadas HC0 (SEQ ID NO:9), HC1 (SEQ ID NO:10), HC2 (SEQ ID NO:11), HC3 (SEQ ID NO:12) y HC4 (SEQ ID NO: 13). B. Secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas humanizadas LC0 (SEQ ID NO:22), LC1 (SEQ ID NO:23), LC2 (SEQ ID NO:24), LC3 (SEQ ID NO:25) y LC4 (SEQ ID NO:26).
[0045] La Figura 14 muestra que la administración in vivo del anticuerpo anti-TRAILshort (2.2) puede reducir la cantidad de células leucémicas y prolongar la supervivencia en ratones. A) Fotografías que muestran la expresión representativa de luciferasa el día 52 en ratones tratados el día 27 con anticuerpo anti-TRAILshort (panel izquierdo) o control de isotipo (IC; panel derecho) y el día siguiente (por ejemplo, día 28) con anticuerpo anti-receptor 2 de TRAIL (anti-DR5). B) Fotografías optimizadas para representación en escala de grises que muestran la expresión de luciferasa el día 45 en ratones tratados el día 27 con anticuerpo anti-TRAILshort (panel izquierdo) o control de isotipo (IC; panel derecho) y el día siguiente (por ejemplo, día 28) con anticuerpo anti-receptor 2 de TRAIL (anti-DR5). C) Un gráfico que muestra la expresión de luciferasa en ratones tratados con IC o anticuerpo anti-TRAILshort el día 27 como lo indican las líneas de puntos, y tratados con anticuerpo anti-receptor 2 de TRAIL (anti-DR5) el día 28 como lo indica la línea discontinua. D) Un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con IC o anticuerpo anti-TRAILshort el día 27 como lo indican las líneas de puntos y con anticuerpo anti-receptor 2 de TRAIL (anti-DR5) el día 28 como lo indica la línea discontinua. E) Un gráfico que muestra la expresión de luciferasa en ratones tratados con IC o anticuerpo anti-TRAILshort en los días 20, 27 y 34 como lo indican las líneas punteadas. F) Un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones tratados con IC o anticuerpo anti-TRAILshort en los días 20, 27 y 34 como lo indican las líneas punteadas.
[0046] La Figura 15 contiene gráficos que muestran el efecto del anticuerpo anti-TRAILshort sobre la citotoxicidad de sk-TRAIL en diferentes líneas de células cancerosas. Las células cancerosas se preincubaron con el anticuerpo anti-TRAIL short 2.2 (Ts 2.2) o el control IgG3, y luego se añadió sk-TRAIL a las células. Se midió la muerte celular (Caspasa 3/7+) a lo largo del tiempo en A) células de leucemia linfoma Jeko y HBL1, B) células de cáncer de páncreas L 3.6, BxPc3 y Miapaca, C) células de melanoma MeLa 15, sk-mel-28, C32TG y A375, y D) células de cáncer de ovario TYKNU, Kuramochi, hOvtax2, CaOv3, COV362, PEO1, OVCAR5 y Ovcar8. Cuando se muestran, los valores de p se refieren a sk-TRAIL solo frente a sk-TRAIL con la adición del anticuerpo anti-TRAIL short 2.2.
[0047] La Figura 16 contiene un gráfico que muestra la cuantificación del ARNm de TRAILshort (TRAIL-s) en diferentes células cancerosas. Se utilizó qRTPCR para calcular la cantidad de copias de TRAIL-s utilizando estándares de TRAIL-s.
[0048] La Figura 17 contiene imágenes de inmunohistoquímica que muestran tejidos teñidos con el anticuerpo anti-TRAILshort 2.2. Se muestran ejemplos de tejidos cancerosos normales y correspondientes teñidos positivamente para TRAILshort (panel superior). También se muestran muestras malignas con un aumento de 40x (panel inferior). Los tejidos de cáncer pancreático, gástrico y de próstata tienen una expresión significativamente elevada de TRAILshort en comparación con los tejidos no malignos.
[0049] La Figura 18 muestra que la expresión de TRAILshort se observa en la inmunohistoquímica de micromatrices de tejido. La figura es un resumen de 8 micromatrices de tejido (TMA) realizadas utilizando el anticuerpo anti-TRAIL-short 2.2 a una dilución de 1:400. El círculo interior representa el porcentaje de casos en esa matriz positivos para la tinción de TRAIL-short. El círculo exterior representa la puntuación inmunorreactiva que se calcula de la siguiente manera: porcentaje de tejido positivo (0-25 %=1, 26-50 %=2, 51-75 %=3 y 76-100 %=4) multiplicado por la intensidad de la tinción (negativa=0, débil=1, moderada=2, y fuerte=3).
[0050] La Figura 19 muestra que TRAILshort se encuentra en muchos tumores humanos. El nivel de TRAILshort, cuantificado como lecturas por millón por kilobase (RPKM), se muestra en diversos tumores humanos. Los datos se determinaron a partir del Cancer Genome Atlas (TCGA).
[0051] La Figura 20 muestra que los niveles crecientes de TRAILshort están asociados con una peor supervivencia en algunos tumores humanos. La supervivencia se evaluó mediante el análisis de Kaplan Meyer para pacientes con linfoma difuso de células B grandes (A), adenocarcinoma de colon y recto (B), carcinoma de células renales cromófobo (C), adenocarcinoma pancreático (D), y timoma (E). Valor de p como se muestra
[0052] La Figura 21 valida que el anticuerpo anti-TRAILshort interactúa con el antígeno TRAILshort. Las células HEK293T se transfectaron con plásmidos que codifican la proteína fluorescente verde (GFP) (fila superior), GFP-TRAILshort (fila central) o GFP-TRAIL<FL>(fila inferior). Las células se tiñeron con anticuerpo anti-TRAILshort, ficoeritrina de cabra anti-ratón secundaria (PE) (columna central izquierda) y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (columna central derecha). Las células se analizaron mediante microscopía confocal para detectar el marcador PE (rojo; columna más a la izquierda), GFP (verde; columna central izquierda), y núcleos teñidos con DAPI (azul; columna central derecha). También se muestran imágenes compuestas de los tres colores superpuestos (fusión; columna más a la derecha).
[0053] La Figura 22 muestra que el clon HC2LC3 del anticuerpo anti-TRAILshort mostró una afinidad de 3,8 pM y una eliminación sinérgica significativa en presencia de sk-TRAIL (1 ng/ml).
[0054] La Figura 23 muestra que algunas células derivadas de pacientes respondieron al anticuerpo anti-TRAILshort más sk-TRAIL. Las células de los bazos de pacientes sometidos a esplenectomía por sospecha de malignidad hematológica se aislaron recientemente y se trataron con nada (control), con superkiller TRAIL (sk-TRAIL, un agonista de TRAIL oligomerizado), con anticuerpo anti-TRAILshort humanizado (clon HC2LC3) o con anticuerpo de control de isotipo (IgG4), en las concentraciones indicadas (y solo o en combinación según se indique). La muerte celular a lo largo del tiempo se monitorizó utilizando la plataforma de imágenes de células vivas Incucyte analizando la actividad de la caspasa 3/7 activa a lo largo del tiempo. A) Resultado de un paciente con linfoma de células T angioinmunoblástico (el panel inferior muestra IHC para TRAILshort de un caso diferente con el mismo diagnóstico y muestra expresión significativa de TRAILshort). B) Resultado de un paciente con linfoma de Hodgkin (el panel inferior muestra IHC para TRAILshort de un caso diferente con el mismo diagnóstico y muestra una expresión mínima de TRAILshort). C) Resultado de un paciente con linfoma de células B recurrente (panel inferior que muestra citometría de flujo para TRAILshort, TRAIL, DR4 y DR5 de las mismas células). D) Resultado de un paciente con linfoma de células del manto (panel inferior que muestra citometría de flujo para TRAILshort, TRAIL, DR4 y DR5 de las mismas células). E) Resultado de un paciente con linaje de células B de linfoma no Hodgkin/ciclina D positiva.
[0055] La Figura 24 contiene gráficos que muestran el efecto del anticuerpo anti-TRAILshort sobre la citotoxicidad de sk-TRAIL en diferentes líneas de células cancerosas derivadas de pacientes humanos. Las células de los bazos de los pacientes se recibieron recientes en RPMI y se analizaron para determinar su sensibilidad a la citotoxicidad en presencia de sk-TRAIL a una dosis de 1 ng/ml en presencia o ausencia de dosis crecientes de clon HC2LC3 anti-TRAIL short (1,25, 2,5 o 5 µg); los controles se trataron con IgG4 humana a las mismas dosis. La muerte celular se monitorizó cada 2 horas según el número de células positivas para la caspasa 3/7 escindida, a lo largo de 72 horas. El tipo de cáncer que se muestra en los paneles A-I es el que está marcado. La Figura 25 muestra una capacidad de respuesta a anti-TRAILshort más sk-TRAIL mayor que la de sk-TRAIL solo en varias líneas de células cancerosas derivadas de pacientes humanos. Se muestra el número de células muertas a las 48 horas posteriores al tratamiento con sk-TRAIL en una dosis de 1 ng/ml solo o sk-TRAIL (misma dosis) más clon HC2LC3 anti-TRAIL short en una dosis de 5 µg/ml. La capacidad de respuesta se definió como un aumento estadísticamente significativo en el número de células muertas después de la adición del anticuerpo anti-TRAIL short. Se muestran las estadísticas para la prueba de la t por pares.
[0056] La Figura 26 muestra resultados generales sobre la capacidad de respuesta de líneas celulares derivadas de pacientes humanos a anti-TRAILshort tanto sólo como en combinación con sk-TRAIL. La capacidad de respuesta se definió como un aumento estadísticamente significativo en el número de células muertas durante el tratamiento con sk-TRAIL solo.
[0057] La Figura 27 muestra una mayor expresión de TRAILshort en líneas celulares que responden a anti-TRAILshort. A) Cuantificación del número de copias del ARNm de TRAILshort mediante qPCR en tiempo real en diversas líneas celulares respondedoras y no respondedoras. B) Porcentaje de positividad de TRAILshort medido mediante tinción de 3 líneas celulares utilizando anti-TRAIL-short 2.2 conjugado con CF555 o isotipo por citometría de flujo.
[0059] La Figura 28 muestra la expresión de TRAILshort en células 293T y tejidos tumorales de pacientes. Se muestran portaobjetos de inmunohistoquímica teñidos para TRAILshort usando un anticuerpo anti-TRAILshort a una dilución de 1:400. A) La columna izquierda muestra células 293T transfectadas con EGFP (aumento de 20x), y la columna derecha células 293T transfectadas con TRAILshort EGFP (aumento de 20x) y teñidas con anticuerpo específico para TRAILshort (que aparece marrón). La fila superior son imágenes compuestas, la fila central son componentes de imágenes teñidas de azul, y la fila inferior son componentes de imágenes teñidas de marrón (teñidas para TRAILshort). B) Tejido de paciente con adenocarcinoma de páncreas con aumento de 20x (izquierda) y 40x (derecha). La fila superior son imágenes compuestas, la fila central son componentes de imágenes teñidas de azul, y la fila inferior son componentes de imágenes teñidas de marrón (teñidas para TRAILshort). C) Tejido de amígdalas de paciente con carcinoma de células escamosas con aumento de 20x (izquierda) y 40x (derecha). La fila superior son imágenes compuestas, la fila central son componentes de imágenes teñidas de azul, y la fila inferior son componentes de imágenes teñidas de marrón (teñidas para TRAILshort).
[0061] La Figura 29 muestra que los ratones NSG implantados con células de linfoma de células T Jurkat humanas son tratados eficazmente con la combinación de anticuerpo anti-DR5 más anti-TRAILshort. Los tumores establecidos se trataron cada 2 semanas con 10 mg/kg cada 14 días de (i) control de isotipo para TRAILshort e isotipo para anticuerpos anti-DR5 (denominado Isotipo), (ii) anticuerpo anti-TRAILshort clon 2.2 más un control de isotipo para anti-DR5 (denominado Anti-TRAILshort), (iii) un control de isotipo para anticuerpo anti-TRAILshort más anticuerpo anti-DR5 (denominado control de isotipo más Anti-DR5), o (iv) anti-TRAILshort (2.2) más anti-DR5, según se indique. A) A lo largo del tiempo, se analizó la expresión de luciferasa en ratones mediante imágenes de cuerpo entero. B) Supervivencia evaluada mediante análisis de Kaplan Meyer.
[0063] La Figura 30 muestra que el anticuerpo anti-TRAILshort más el control de isotipo o el anticuerpo anti-TRAILshort más el anticuerpo anti-DR5 dan como resultado un crecimiento tumoral suprimido en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer humano. A los ratones NSG se les implantó por vía subcutánea la línea celular de linfoma de células B grandes difuso humano (HBL-1) y se midió diariamente el tamaño del tumor. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño mayor o igual a 100 mm cúbicos, los ratones recibieron los tratamientos indicados mediante inyecciones IP semanales con 10 mg/kg cada 14 días de (i) controles de isotipo para TRAILshort y para anticuerpos anti-DR5 (IC+IC), (ii) anticuerpo anti-TRAILshort clon 2.2 más un control de isotipo para anti-DR5 (2.2 IC), (iii) un control de isotipo para anticuerpo anti-TRAILshort más anticuerpo anti-DR5 (IC DR5), o (iv) anti-TRAILshort (2.2) más anticuerpo anti-DR5 según se indique (2.2 DR5). A) A lo largo del tiempo, se analizó en las ratas el tamaño del tumor y el número de veces de cambio calculado a partir del valor inicial. B) Supervivencia evaluada mediante análisis de Kaplan Meyer.
[0065] La Figura 31 muestra que TRAILshort se puede detectar en tejidos mediante hibridación in situ (ISH). Los tejidos de macacos infectados con el virus de inmunodeficiencia simia (VIS) se tiñeron con sondas específicas de longitud completa de TRAIL o con sondas específicas de TRAILshort, y se visualizaron con los siguientes aumentos. En A-D, la columna izquierda tiene un aumento de 10×, la columna central tiene un aumento de 20×, y la columna derecha tiene un aumento de 40×. En A-D, la fila superior son imágenes compuestas, la fila central son componentes de esas imágenes compuestas que aparecen en rojo (TRAIL en (A) y (C) y TRAILshort en (B) y (D)), y la fila inferior son componentes de esas imágenes compuestas que aparecen en azul. A) Tejido de ganglio linfático axilar de macaco infectado con VIS teñido con sonda específica de TRAIL. B) Tejido de ganglio linfático axilar de macaco infectado con VIS teñido con sonda específica de TRAILshort. C) Tejido de bazo de macaco infectado con VIS teñido con sonda específica de TRAIL. D) Tejido de bazo de macaco infectado con VIS teñido con la sonda específica de TRAILshort.
[0067] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0069] Este documento proporciona anticuerpos anti-TRAILshort (por ejemplo, anticuerpos anti-TRAILshort humanizados) que pueden neutralizar TRAILshort, así como materiales y métodos para obtener y utilizar anticuerpos anti-TRAILshort. En algunos casos, se pueden usar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort para tratar enfermedades (p. ej., cánceres y/o afecciones hepáticas) y/o infecciones (p. ej., infecciones crónicas). Por ejemplo, se pueden administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero que padece una enfermedad y/o una infección en condiciones en las que se reduce el número de células enfermas (p. ej., células cancerosas) y/o células infectadas. En algunos casos, se pueden usar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort para modular (p. ej., aumentar o disminuir) la apoptosis (p. ej., a través de la muerte celular mediada por TRAIL, citotoxicidad por NK, muerte por células T CD8+, muerte por células CAR T, y/o viroterapia oncolítica). Por ejemplo, se pueden administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero que tenga células enfermas (p. ej., células cancerosas) y/o células infectadas (p. ej., células infectadas por virus) en condiciones en las que se induce la apoptosis en una o más de las células enfermas (p. ej., células cancerosas) y/o una o más de las células infectadas. Este documento también proporciona ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-TRAILshort descrito en este documento, así como construcciones para expresar ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-TRAILshort descrito en este documento.
[0071] Cuando se trata una enfermedad como se describe en este documento, la enfermedad puede ser, por ejemplo, un cáncer (p. ej., carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, tumor de células germinales, blastoma, y metástasis) o una afección hepática. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse como se describe en este documento incluyen, sin limitación, carcinoma de ovario, melanoma, carcinoma pancreático, neoplasias hematológicas (p. ej., neoplasias de células T y neoplasias de células B), cáncer de vejiga, cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas escamosas y cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas), cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama (p. ej., cáncer de mama con receptor hormonal positivo, cáncer de mama HER2 positivo y cáncer de mama triple negativo), cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón (p. ej., cáncer de células papilares renales, cáncer de células claras de riñón, carcinoma de células transicionales renales, y carcinoma de células renales cromófobo), carcinoma hepatocelular, mieloma, y cáncer de útero.
[0073] Cuando se trata una infección como se describe en este documento, la infección puede ser, por ejemplo, una infección crónica y/o una infección viral. Los ejemplos de infecciones que pueden tratarse como se describe en este documento incluyen, sin limitación, infecciones por VIH, VIS, retrovirus endógeno, anellovirus, circovirus, virus del herpes humano, virus de la varicela zóster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, poliomavirus, virus adenoasociado, virus del herpes simple, adenovirus, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus GB C, virus del papiloma, virus de la leucemia de células T humanas, virus relacionado con el virus de la leucemia murina xenotrópica, poliomavirus, virus de la rubéola, parvovirus, virus del sarampión, y virus coxsackie. En algunos casos, las infecciones tratadas como se describe en este documento pueden ser una infección por VIH.
[0075] Cuando se trata la apoptosis no deseada como se describe en este documento, la apoptosis no deseada puede estar asociada, por ejemplo, con cualquier enfermedad y/o afección apropiada. Los ejemplos de enfermedades y/o afecciones asociadas con apoptosis no deseada que pueden tratarse como se describe en este documento incluyen, sin limitación, infarto de miocardio, lesión por isquemia-reperfusión, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y enfermedad de Huntington), lesión hepática (por ejemplo, después del consumo de alcohol, después de la ingestión de medicamentos (por ejemplo, acetaminofeno) y esteatohepatitis no alcohólica).
[0077] Cualquier tipo de mamífero que tenga una enfermedad y/o una infección o que esté en riesgo de desarrollar una enfermedad y/o una infección puede ser tratado como se describe en este documento. Por ejemplo, los seres humanos y otros primates, tales como los monos, que padecen una enfermedad o una infección pueden tratarse con uno o más anticuerpos anti-TRAILshort. En algunos casos, los perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratones y ratas pueden tratarse con uno o más anticuerpos anti-TRAILshort como se describe aquí.
[0078] Se puede utilizar cualquier método apropiado para identificar un mamífero que padece una enfermedad y/o una infección o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad (por ejemplo, cáncer) y/o una infección. Por ejemplo, las técnicas de diagnóstico por imágenes (con o sin contraste, por ejemplo, tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética (RM)), técnicas de biopsia, aspiración de médula ósea, colonoscopia, sigmoidoscopia, examen rectal digital, análisis de sangre, análisis de plaquetas, análisis de heces, análisis de orina, técnicas endoscópicas, técnicas ELISA, técnicas basadas en PCR, técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western) y técnicas histológicas se pueden utilizar para identificar a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene cáncer. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de diagnóstico por imágenes (con o sin contraste; por ejemplo, tomografía computarizada o resonancia magnética), técnicas de biopsia (por ejemplo, examen del tejido hepático) y análisis de sangre para identificar a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene una enfermedad hepática. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de anticuerpos, pruebas de detección de antígenos virales, técnicas de cultivo, técnicas ELISA, técnicas basadas en PCR (por ejemplo, prueba de carga viral), técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western), técnicas de hibridación (por ejemplo, ISH) y técnicas histológicas (por ejemplo, inmunohistoquímica (IHC)) para identificar a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene una infección.
[0080] En algunos casos, se pueden usar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort para identificar a un mamífero con probabilidades de responder bien a las terapias basadas en TRAIL. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero que padece una enfermedad y/o infección para identificar al mamífero como probable respondedor de bien a terapias basadas en TRAIL short. En algunos casos, un mamífero que padece una enfermedad y/o una infección o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad y/o una infección puede evaluarse para determinar la presencia o ausencia de TRAILshort y/o TRAIL. Por ejemplo, la presencia, ausencia o nivel de TRAILshort y/o TRAIL en una muestra obtenida de un ser humano que padece una enfermedad y/o infección se puede utilizar para determinar si es probable o no que el ser humano responda a terapias basadas en TRAIL. Se puede evaluar cualquier muestra apropiada para determinar la presencia de TRAILshort y/o TRAIL. Por ejemplo, se pueden obtener muestras biológicas tales como muestras de tejido y muestras de fluidos (por ejemplo, sangre, suero, plasma u orina) de un mamífero y evaluar la presencia, ausencia o nivel de TRAILshort y/o TRAIL. Se puede utilizar cualquier método apropiado para detectar la presencia, ausencia o nivel de TRAILshort y/o TRAIL. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de anticuerpos, pruebas de detección de antígenos virales, técnicas de cultivo, técnicas ELISA, técnicas basadas en PCR (por ejemplo, prueba de carga viral), técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western), técnicas de hibridación (por ejemplo, ISH) y técnicas histológicas (por ejemplo, IHC) para determinar la presencia, ausencia o nivel de TRAILshort y/o TRAIL en una muestra obtenida de un mamífero. En algunos casos, el anticuerpo anti-TRAILshort descrito en este documento (por ejemplo, incluido un dominio VH que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio VL que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y SEQ ID NO: 16) se pueden marcar (por ejemplo, con radionúclidos para permitir la obtención de imágenes PET o SPECT) y utilizar para determinar la presencia, ausencia o nivel de TRAILshort y/o TRAIL en una muestra obtenida de un mamífero. Se puede identificar que un mamífero tiene probabilidades de responder a terapias basadas en TRAIL cuando una muestra obtenida del mamífero tiene niveles detectables de TRAILshort y/o TRAIL. En algunos casos, los mamíferos identificados como propensos a responder a terapias basadas en TRAIL pueden ser tratados como se describe aquí. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más agentes anticancerígenos que inhiben IL-6, IL-8 y EGF a un ser humano identificado con un cáncer de mama triple negativo (por ejemplo, un TNBC) para tratarlo.
[0081] Una vez identificado que padece una enfermedad y/o una infección, que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad y/o una infección, o que es probable que responda bien a las terapias basadas en TRAIL, se le puede administrar o instruir para que se autoadministre uno o más anticuerpos anti-TRAILshort (por ejemplo, una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort que neutralizan TRAILshort). En algunos casos, se puede identificar a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) como portador de TRAILshort. Por ejemplo, se puede evaluar la presencia o ausencia de TRAILshort en un mamífero utilizando cualquier método apropiado. Por ejemplo, las técnicas para detectar niveles de TRAILshort incluyen técnicas ELISA, técnicas basadas en PCR, técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western), técnicas de hibridación (por ejemplo, ISH) y/o técnicas histológicas (por ejemplo, IHC). La presencia o ausencia de TRAILshort se puede utilizar, por ejemplo, para determinar si es probable que un mamífero responda a la terapia con anticuerpos anti-TRAILshort.
[0083] Se puede utilizar cualquier método apropiado para administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero, y/o se pueden administrar ácidos nucleicos que codifican uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero. En los casos en que se administran ácidos nucleicos que codifican uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero, los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en un vector (por ejemplo, para la transferencia de genes de anticuerpos mediada por vectores).
[0085] Los anticuerpos anti-TRAILshort proporcionados en este documento se unen específicamente a un epítopo en TRAILshort. El término "anticuerpo" tal como se utiliza en este documento se refiere a anticuerpos intactos, así como a fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno) que conservan cierta capacidad de unirse a TRAILshort. En algunos casos, los anticuerpos anti-TRAILshort proporcionados en este documento no se unen a TRAIL de longitud completa. Un anticuerpo anti-TRAILshort puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Un anticuerpo anti-TRAILshort puede ser un anticuerpo quimérico (por ejemplo, parcialmente humanizado o totalmente humanizado). Un anticuerpo anti-TRAILshort puede ser un anticuerpo no inmunogénico. En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort puede ser un anticuerpo neutralizante. Tal como se utiliza en este documento, un anticuerpo "neutralizante" anti-TRAILshort es un anticuerpo que se une a TRAILshort para neutralizar los efectos biológicos de TRAILshort. En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort puede inducir (por ejemplo, aumentar) la apoptosis. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante anti-TRAILshort se une a TRAILshort, impidiendo que TRAILshort se una a R1 y/o R2, y dejando así R1 y R2 disponibles para la unión de TRAIL y la inducción de la apoptosis. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante anti-TRAILshort se une a TRAILshort, eliminando TRAILshort unido de R1 y/o R2, y dejando así R1 y R2 disponibles para la unión de TRAIL y la inducción de la apoptosis. En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort puede recapitular la función de TRAILshort. Tal como se utiliza en este documento, "función de TRAIL short" incluye la capacidad de reducir y/o eliminar la muerte celular mediada por TRAIL. En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort puede inhibir (por ejemplo, disminuir) la apoptosis. Por ejemplo, los anticuerpos anti-TRAILshort proporcionados en este documento pueden incluir un dominio extracelular de TRAILshort fusionado a un dominio Fc (por ejemplo, un dominio Fc de IgG). Por ejemplo, un dominio extracelular de TRAILshort fusionado a un dominio Fc de IgG se puede utilizar para reducir y/o eliminar la apoptosis (por ejemplo, apoptosis no deseada).
[0087] Los anticuerpos anti-TRAILshort proporcionados en este documento se pueden preparar utilizando cualquier método adecuado (véase, p. ej., Green et al., Production of Polyclonal Antisera, en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992); Coligan et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, en Current Protocols In Immunology, sección 2.4.1 (1992); Coligan et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994; Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975); Coligan et al., secciones 2.5.1 2.6.7; y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub.
[0088] 1988)). Por ejemplo, una muestra que contiene un TRAILshort se puede utilizar como inmunógeno para provocar una respuesta inmune en un animal de modo que se produzcan anticuerpos específicos.
[0089] Los anticuerpos anti-TRAILshort proporcionados en este documento pueden humanizarse y/o desinmunizarse (por ejemplo, hacerse no inmunogénicos) utilizando cualquier método apropiado. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales humanizados transfiriendo las CDR de ratón de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano y sustituyendo después restos humanos en las regiones marco de las contrapartes murinas. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados puede obviar posibles problemas asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas cuando se tratan seres humanos. Las técnicas generales para la clonación de dominios variables de inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, por Orlandi et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, por Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988); Carter et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); y Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12:437 (1992); Singer et al., J. Immunol.150:2844 (1993). En algunos casos, se puede utilizar la humanización, tal como la superhumanización, como se describe en otro lugar (Hwang et al., Methods, 36:35-42 (2005)). En algunos casos, el injerto de SDR (Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005)), la optimización del contenido de cadenas humanas (Lazar et al., Mol. Immunol., 44:1986-1998 (2007)), el barajado del marco (Dall' Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005); y Damschroder et al., Mol. Immunol., 44:3049-3060 (2007)), y los enfoques de presentación en fagos (Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611-22618 (1996); Radar et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998); y Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)) se pueden utilizar para obtener preparaciones de anticuerpos anti-TRAILshort. En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort puede humanizarse como se describe en los Ejemplos 3 y 4. Un anticuerpo anti-TRAILshort puede ser el anticuerpo Ab866.
[0090] Una cadena pesada de anticuerpo anti-TRAILshort puede incluir un dominio Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina humanizado). El dominio Fc puede ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgA, IgD, IgE o IgM). El dominio Fc puede ser de cualquier subclase de isotipo. Por ejemplo, cuando un dominio Fc es un isotipo IgG, el dominio Fc puede ser un dominio Fc IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
[0091] Un dominio VH de un anticuerpo anti-TRAILshort (por ejemplo, el anticuerpo Ab866) puede incluir las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que se detallan a continuación:
[0092] VH CDR1: GYIFTNNDMN (SEQ ID NO:1);
[0093] VH CDR2: GIDPGDGRTKYNEKFKG (SEQ ID NO:2); y
[0094] VH CDR3: GRGGYEFGIDY (SEQ ID NO:3).
[0095] Los ejemplos de dominios VH de anticuerpos anti-TRAILshort, incluidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3, incluyen, sin limitación, los dominios VH que se detallan a continuación:
[0096] VH0:
[0098]
[0100] VH3:
[0101]
[0104] En algunos casos, un dominio VH de anticuerpo anti-TRAILshort puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 por ciento (por ejemplo, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a la secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 8. Por ejemplo, un dominio VH de cadena pesada de anticuerpo anti-TRAILshort puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO:4. Por ejemplo, un dominio VH de cadena pesada de anticuerpo anti-TRAILshort puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO:6.
[0106] A continuación se presentan ejemplos de cadenas pesadas de anticuerpos anti-TRAILshort:
[0108] HC0:
[0110]
[0113] HC2:
[0114]
[0116] Un dominio VL de un anticuerpo anti-TRAILshort (por ejemplo, el anticuerpo Ab866) puede incluir las CDR que se detallan a continuación:
[0117] VL CDR1: KSSQSLLNSGNQKNSLA (SEQ ID NO:14);
[0118] VL CDR2: GASTRES (SEQ ID NO:15); y
[0119] VL CDR3: QNDHSFPLT (SEQ ID NO: 16).
[0120] Los ejemplos de dominios VL de anticuerpos anti-TRAILshort, incluidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, incluyen, sin limitación, los dominios VL que se detallan a continuación:
[0121] VL0:
[0122]
[0125] En algunos casos, un dominio VL de anticuerpo anti-TRAILshort puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 por ciento (por ejemplo, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a la secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 17 a 21. Por ejemplo, un dominio VL de anticuerpo anti-TRAILshort puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 75 % idéntica a SEQ ID NO: 17. Por ejemplo, un dominio VL de anticuerpo anti-TRAILshort puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 75% idéntica a SEQ ID NO:20.
[0127] A continuación se presentan ejemplos de cadenas ligeras de anticuerpos anti-TRAILshort:
[0129] LC0:
[0131]
[0132] LC2:
[0134]
[0136] Un anticuerpo anti-TRAILshort descrito en este documento puede incluir cualquier combinación de una cadena pesada descrita en este documento y una cadena ligera descrita en este documento. En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort puede incluir HC2 y LC3.
[0137] En algunos casos, un anticuerpo anti-TRAILshort descrito en este documento puede incluir (por ejemplo, fusionarse o acoplarse a) una o más marcadores (por ejemplo, marcadores detectables). Un marcador puede ser, sin limitación, un marcador fluorescente (por ejemplo, un fluoróforo), un marcador radiactivo, o una enzima. Los ejemplos de un marcadores detectables incluyen, sin limitación, R-ficoeritrina (PE), CTO, GFP, proteína activadora de fluorógeno (FAP), luciferasa de Gaussia (GLuc), luciferasa de cipridina (Cluc), y radionúclidos, y biotina. En algunos casos, se pueden administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o más anticuerpos anti-TRAILshort) a un mamífero para tratar una enfermedad y/o una infección. Por ejemplo, se pueden administrar dos o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) para tratar una enfermedad y/o una infección.
[0138] En algunos casos, una composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede administrar como único ingrediente activo a un mamífero que tiene una enfermedad y/o una infección.
[0139] En algunos casos, una composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede administrar a un mamífero que tiene una enfermedad y/o una infección como una terapia combinada con uno o más agentes/terapias adicionales utilizados para tratar la enfermedad y/o la infección. Por ejemplo, una terapia combinada utilizada para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad y/o una infección puede incluir administrar al mamífero (por ejemplo, un ser humano) uno o más anticuerpos anti-TRAILshort en combinación con una o más terapias basadas en células y/o una o más terapias basadas en TRAIL. Las terapias basadas en TRAIL pueden incluir, por ejemplo, moduladores de TRAIL que incluyen, pero no se limitan a, TRAIL recombinante (p. ej., dulanermina), anticuerpos anti-TRAIL-R1 (p. ej., mapatumumab), anticuerpos anti-TRAIL-R2 (p. ej., conatumumab, lexatumumab, tigatuzumab, drozitumab, LBY-135), oligómeros de TRAIL (p. ej., ABBV-621) y/o fusiones de dominio extracelular de TRAILshort:Fc. En algunos casos, un modulador de TRAIL puede ser un agonista de TRAIL. En algunos casos, un modulador de TRAIL puede incluir (por ejemplo, fusionarse o acoplarse a) uno o más dominios adicionales (por ejemplo, dominios para mejorar la estabilidad y/o función como polihistidina, epítopos de FLAG, motivos de cremallera de isoleucina (LZ), la porción Fc de inmunoglobulinas humanas, albúmina, y/o nanopartículas). En los casos en que se administran dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) moduladores de TRAIL a un mamífero, los moduladores de TRAIL se pueden administrar individualmente o en cualquier combinación. Las terapias basadas en células pueden incluir, por ejemplo, terapias de transferencia celular adoptiva (p. ej., terapia de células T adoptivas) que incluyen, pero no se limitan a, transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), incluidos TIL autólogos, TIL modificados genéticamente con receptores de células T alfa-beta, TIL modificados genéticamente con receptores de antígenos quiméricos (terapia de células T CAR) y/o células NK o NK/T modificadas genéticamente.
[0141] Una terapia combinada utilizada para tratar a un mamífero que tiene cáncer puede incluir la administración al mamífero (p. ej., un ser humano) de una composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort y uno o más tratamientos contra el cáncer, tales como agentes de quimioterapia que incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes (p. ej., altretamina, busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, lomustina, melfalán, oxalaplatino, temozolomida y tiotepa), antimetabolitos (p. ej., 5-FU), 6-mercaptopurina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, y pemetrexed), antibióticos de antraciclina (p. ej., daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, e idarrubicina), antibióticos no antraciclínicos (p. ej., actinomicina-D, bleomicina, mitomicina-C, y mitoxantrona), inhibidores de la topoisomerasa I (p. ej., topotecán e irinotecán (p. ej., CPT-11)), inhibidores de la topoisomerasa II (p. ej., etopósido (p. ej., VP-16), tenipósido, y mitoxantrona), inhibidores mitóticos (p. ej., docetaxel, estramustina, ixabepilona, paclitaxel, vinblastina, vincristina, y vinorelbina), corticosteroides (p. ej., prednisona, etilprednisolona, y dexametasona), enzimas (p. ej., L-asparaginasa) y/o inhibidores del proteasoma (p. ej., bortezomib); agentes diferenciadores que incluyen, pero no se limitan a, retinoides, tretinoína, bexaroteno, y trióxido de arsénico; terapias de cóctel (por ejemplo, una combinación de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona (CHOP), o una combinación de rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona (R-CHOP)); anticuerpos monoclonales que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-HER2 (p. ej., trastuzumab y pertuzumab), anticuerpos anti-CTLA-4 (p. ej., ipilimumab), anticuerpos anti-GD2 (p. ej., dinutuximab), anticuerpos anti-IL-6 (p. ej., siltuximab), anticuerpos anti-EGFR (p. ej., cetuximab, panitumumab y necitumumab), anticuerpos anti-VEGF (p. ej., ramucirumab y bevacizumab), anticuerpos anti-PD-1 (p. ej., pembrolizumab y nivolumab), anticuerpos anti-PD-L1 (p. ej., atezolizumab), anticuerpos anti-PDGF (p. ej., olaratumab), anticuerpos anti-RANK (p. ej., denosumab), anticuerpos anti-CD3 (p. ej., blinatumomab), anticuerpos anti-CD19 (p. ej., blinatumomab), anticuerpos anti-CD20 (rituximab, ofatumumab y obinutuzumab), anticuerpos anti-CD38 (p. ej., daratumumab), anticuerpos anti-CD52 (p. ej., alemtuzumab) y anticuerpos anti-SLAMF7 (p. ej., elotuzumab); conjugados anticuerpo-fármaco que incluyen, pero no se limitan a, gemtuzumab ozogamicina, brentuximab vedotina, trastuzumab, y emtansina; moléculas pequeñas dirigidas, incluidos, pero no se limitan a, inhibidores de tirosina cinasa (p. ej., inhibidores de VEGF (tal como apatinib), inhibidores de c-Met (tal como cabozantinib), inhibidores de ALK (tales como alectinib y crizotinib), inhibidores de Brc-Abl (tal como dasatinib, imatinib y nilotinib), inhibidores de EGFR (tales como erlotinib y gefitinib), inhibidores de HER2 (tal como lapatinib), inhibidores de tirosina cinasa multidirigidos (tales como sorafenib y sunitinib), inhibidores de JAK1 (tal como tofacitinib), inhibidores de MEK (tales como cobimetinib y trametinib), inhibidores del proteasoma (tales como ixazomib, carfilzomib, bortezomib, disulfiram, y lactacistina), moduladores del receptor de estrógeno (tal como tamoxifeno), inhibidores de Bcl-2 (tales como obatoclax, navitoclax, y gossipol), inhibidores de PARP (tales como iniparib y olaparib), inhibidores de PI3K (tal como perifosina), inhibidores de BRAF (tales como dabrafenib y vemurafenib), inhibidores de MEK (tal como trametinib), inhibidores de CDK (tales como abemaciclib, palbociclib, ribociclib, y trilaciclib), degradadores selectivos del receptor de estrógeno (tal como fulvestrant), inhibidores de BET, inhibidores de serina/treonina cinasa (tales como temsirolimus, everolimus, vemurafenib, trametinib, y dabrafenib); conjugados de fármacos de moléculas pequeñas que incluyen, pero no se limitan a, vintafolida; radioterapia (p. ej., radioterapia externa, radioterapia de intensidad modulada, radioterapia guiada por imágenes, terapia con haz de protones); braquiterapia; y/o cirugía (p. ej., resección quirúrgica de un tumor, una porción de un tumor o una metástasis).
[0142] Una terapia combinada utilizada para tratar a un mamífero que tiene una afección hepática puede incluir administrar al mamífero (por ejemplo, un ser humano) una composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort y uno o más tratamientos para enfermedades hepáticas que incluyen, pero no se limitan a, pérdida de peso, vacunas contra enfermedades hepáticas (por ejemplo, hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C), vitamina E, y/o café.
[0144] Una terapia combinada utilizada para tratar a un mamífero que tiene una infección (p. ej., una infección viral) puede incluir administrar al mamífero (p. ej., un humano) una composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort y uno o más tratamientos para la infección, tales como terapias antirretrovirales que incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (p. ej., abacavir, didanosina, emtricitabina, entecavir, lamivudina, estavudina, fumarato de tenofovir disoproxil, zalcitabina y zidovudina); inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (p. ej., delavirdina, efavirenz, etravirina, nevirapina y rilpivirina); inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleótidos (p. ej., adefovir y tenofovir); inhibidores de la fusión (p. ej., enfuvirtida); inhibidores de la entrada (p. ej., maraviroc); inhibidores de la integrasa (p. ej., dolutegravir, elvitegravir (con o sin ritonovair y/o cobisistat) y raltegravir); inhibidores de la maduración (p. ej., bevirimat); inhibidores de la proteasa (p. ej., amprenavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir, atazanavir, darunavir, y tipranavir); inhibidores de la pérdida de recubrimiento (p. ej., TRIM5alfa); inhibidores de la transcripción (p. ej., antagonistas tat); y/o inhibidores de la traducción (p. ej., tricosantina); interferón alfa pegilado (PEG-IFN-a); daclatasvir; elbasvir; grazoprevir; glecaprevir; pibrentasvir; ledipasvir; sofosbuvir; ombitasvir; paritaprevir; ritonavir; dasabuvir; simeprevir; velpatasvir; y voxilaprevir.
[0145] En los casos en que uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se utilizan en combinación con uno o más agentes adicionales utilizados para tratar una enfermedad y/o una infección, los uno o más agentes adicionales pueden administrarse al mismo tiempo o de forma independiente. Por ejemplo, la composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede administrar primero, y uno o más agentes adicionales se pueden administrar en segundo lugar, o viceversa. En realizaciones en las que se utilizan uno o más anticuerpos anti-TRAILshort en combinación con una o más terapias adicionales utilizadas para tratar una enfermedad y/o una infección, las una o más terapias adicionales se pueden realizar al mismo tiempo o independientemente de la administración de uno o más anticuerpos anti-TRAILshort. Por ejemplo, la composición que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede administrar antes, durante o después de que se realicen una o más terapias adicionales.
[0146] En algunos casos, uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se pueden formular en una composición farmacéuticamente aceptable para su administración a un mamífero que padece una enfermedad y/o una infección. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TRAILshort se puede formular junto con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Una composición farmacéutica puede formularse para su administración en forma sólida o líquida, incluyendo, sin limitación, soluciones estériles, suspensiones, formulaciones de liberación sostenida, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, y gránulos. Los portadores, cargas y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en una composición farmacéutica descrita en este documento incluyen, sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de polietilenopolioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.
[0148] Una composición farmacéutica que contenga uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede diseñar para administración oral, parenteral (incluida subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratecal e intradérmica), o inhalada. Cuando se administra por vía oral, una composición farmacéutica que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort puede estar en forma de píldora, comprimido, o cápsula. Las composiciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones para inhalación se pueden administrar utilizando, por ejemplo, un inhalador, un nebulizador, y/o un inhalador de polvo seco. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en estado liofilizado, requiriendo únicamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas a partir de polvos, gránulos, y comprimidos estériles.
[0150] En algunos casos, una composición farmacéuticamente aceptable que incluye uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede administrar local o sistémicamente. Por ejemplo, una composición que contiene un anticuerpo anti-TRAILshort se puede administrar sistémicamente mediante administración oral o inhalación por un mamífero (por ejemplo, un ser humano).
[0152] Las dosis efectivas pueden variar dependiendo de la gravedad de la enfermedad y/o la infección, la vía de administración, la edad y el estado general de salud del sujeto, el uso de excipientes, la posibilidad de uso conjunto con otros tratamientos terapéuticos tal como el uso de otros agentes y el criterio del médico tratante.
[0154] En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort puede ser cualquier cantidad que reduzca la gravedad o la aparición de los síntomas de la enfermedad y/o la infección a tratar sin producir toxicidad significativa para el mamífero. En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort puede ser cualquier cantidad que reduzca la cantidad de células enfermas (por ejemplo, células cancerosas) y/o células infectadas sin producir toxicidad significativa para el mamífero. La cantidad efectiva puede permanecer constante o puede ajustarse como una escala móvil o dosis variable dependiendo de la respuesta del mamífero al tratamiento. Diversos factores pueden influir en la cantidad efectiva real utilizada para una aplicación particular. Por ejemplo, la frecuencia de administración, la duración del tratamiento, el uso de múltiples agentes de tratamiento, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad y/o la infección pueden requerir un aumento o una disminución de la cantidad efectiva real administrada.
[0156] En algunos casos, la frecuencia de administración puede ser cualquier frecuencia que reduzca la gravedad o la aparición de los síntomas de la enfermedad y/o la infección a tratar sin producir toxicidad significativa para el mamífero. En algunos casos, la frecuencia de administración puede ser cualquier frecuencia que reduzca el número de células enfermas (por ejemplo, células cancerosas) y/o células infectadas sin producir toxicidad significativa para el mamífero. Por ejemplo, la frecuencia de administración puede ser de alrededor de una vez al mes a una vez cada dos semanas, de alrededor de una vez a la semana a alrededor de tres veces al día, de alrededor de dos veces al mes a alrededor de seis veces al día, o de alrededor de dos veces a la semana a alrededor de una vez al día. En algunos casos, la frecuencia de administración puede ser semanal. En algunos casos, la frecuencia de administración puede ser cada dos semanas. La frecuencia de administración puede permanecer constante, o puede ser variable durante la duración del tratamiento. Un curso de tratamiento con una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort puede incluir períodos de descanso. Por ejemplo, una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort se puede administrar diariamente durante un período de dos semanas, seguido de un período de descanso de dos semanas, y dicho régimen se puede repetir varias veces. Al igual que con la cantidad efectiva, diversos factores pueden influir en la frecuencia real de administración utilizada para una aplicación particular. Por ejemplo, la cantidad efectiva, la duración del tratamiento, el uso de múltiples agentes de tratamiento, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad y/o la infección pueden requerir un aumento o una disminución en la frecuencia de administración.
[0157] En algunos casos, una duración efectiva para administrar una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort puede ser cualquier duración que reduzca la gravedad o la aparición de los síntomas de la enfermedad y/o la infección a tratar sin producir toxicidad significativa para el mamífero. En algunos casos, una duración efectiva para administrar una composición que contiene uno o más anticuerpos anti-TRAILshort puede ser cualquier duración que reduzca la cantidad de células enfermas (por ejemplo, células cancerosas) y/o células infectadas sin producir toxicidad significativa para el mamífero. Por ejemplo, la duración efectiva puede variar desde varios días hasta varias semanas, meses o años. En algunos casos, la duración efectiva del tratamiento de una enfermedad y/o infección puede variar de alrededor de un mes a alrededor de 10 años. Existen múltiples factores que pueden influir en la duración efectiva real utilizada para un tratamiento particular. Por ejemplo, una duración efectiva puede variar según la frecuencia de administración, la cantidad efectiva, el uso de múltiples agentes de tratamiento, la vía de administración, y la gravedad de la afección que se está tratando.
[0158] En ciertos casos, se puede monitorizar el curso del tratamiento y la gravedad de la enfermedad y/o la infección que se está tratando. Se puede utilizar cualquier método apropiado para determinar si se reduce o no la gravedad de una enfermedad y/o una infección. Por ejemplo, la gravedad de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) se puede evaluar utilizando técnicas de formación de imágenes (con o sin contraste), técnicas de biopsia, aspiración de médula ósea, colonoscopia, sigmoidoscopia, examen rectal digital, análisis de sangre, análisis de plaquetas, análisis de heces, análisis de orina, técnicas endoscópicas, técnicas de ELISA, técnicas basadas en PCR, técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western), citometría de flujo, análisis genético (por ejemplo, para reordenamientos genéticos), y/o técnicas histológicas en diferentes puntos temporales. Por ejemplo, la gravedad de una infección se puede evaluar utilizando técnicas de anticuerpos, pruebas de detección de antígenos virales, técnicas de cultivo, técnicas de ELISA, técnicas basadas en PCR (por ejemplo, prueba de carga viral), técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western), y/o técnicas histológicas en diferentes puntos temporales. Se puede utilizar cualquier método apropiado para monitorizar la respuesta a las terapias con anticuerpos anti-TRAILshort o terapias combinadas que incluyan anticuerpos anti-TRAILshort. Por ejemplo, técnicas para detectar niveles de TRAIL y/o TRAILshort incluyendo técnicas ELISA, técnicas basadas en PCR, técnicas de transferencia (por ejemplo, transferencia Western), técnicas de hibridación (por ejemplo, ISH) y/o técnicas histológicas (por ejemplo, IHC).
[0159] En algunos casos, la monitorización de la respuesta a las terapias con anticuerpos anti-TRAILshort o terapias combinadas que incluyen anticuerpos anti-TRAILshort puede incluir teranósticos. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más anticuerpos anti-TRAILshort a un mamífero que padece una enfermedad y/o infección, y la enfermedad y/o infección se pueden monitorizar simultáneamente. Por ejemplo, uno o más anticuerpos anti-TRAILshort descritos en este documento (por ejemplo, un anticuerpo que incluye un dominio VH que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio VL que incluye las CDR expuestas en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y SEQ ID NO: 16) se pueden marcar con radionucleidos para permitir la monitorización con imágenes PET o SPECT.
[0160] La invención se describirá más detalladamente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
[0161] EJEMPLOS
[0162] Ejemplo 1: La resistencia a TRAIL es conferida por TRAILshort asociado a microvesículas, y se revierte mediante neutralización de anticuerpos
[0163] Sumario
[0164] TRAIL se une a TRAIL-R1 o TRAIL-R2, y puede inducir la apoptosis en células tumorales y/o células infectadas por virus mientras que preserva las células normales. Lamentablemente, el éxito clínico de las terapias dirigidas contra el receptor de TRAIL ha sido limitado. Los siguientes datos indican que la señalización del interferón tipo I induce la expresión de TRAILshort, y que TRAILshort se libera en microvesículas en el microambiente celular en el que puede ser absorbido por células vecinas. TRAILshort se une a TRAIL-R1 y R2, pero no a los receptores señuelo de TRAIL R3 y R4, e impide que TRAIL de longitud completa induzca la muerte celular. La protección mediada por TRAILshort contra la muerte por TRAIL ocurre en trans, ya que las células que no producen TRAILshort están protegidas contra TRAIL después de unirse a TRAILshort. TRAILshort recombinante es suficiente para proteger las células contra la muerte inducida por TRAIL, mientras que la eliminación de TRAILshort con un anticuerpo específico restaura la sensibilidad de TRAIL. Estos resultados establecen un paradigma para comprender y superar la resistencia a TRAIL.
[0165] Resultados
[0166] TRAILshort es producido tanto por células no infectadas como por células infectadas por el VIH
[0167] La producción de TRAILshort en células infectadas por VIH frente a no infectadas se evaluó mediante análisis de ARNm de células individuales. En estos experimentos, las células T CD4 individuales de donantes infectados o no infectados con VIH se separaron mediante un circuito fluídico integrado, y se realizaron análisis de células individuales utilizando PCR para dianas específicas del VIH, TRAILshort y receptor/ligando de TRAIL, y marcadores de linaje celular y estado de activación (Fig.1A).
[0168] La especificidad del ensayo se confirmó al observar que los donantes no infectados con VIH no tenían células que contuvieran transcritos del VIH y que muy pocas de las células T CD4 de los donantes infectados con VIH contenían transcritos del VIH (Fig. 1B). También se observó la activación inmune inadecuada y excesiva observada en pacientes con infección por VIH, es decir, más células de donantes infectados con VIH expresaron el marcador de activación HLA-DR que las células de donantes no infectados con VIH (Fig. 1C). Tanto las células de donantes infectados con VIH como las no infectadas contenían transcritos para TRAILshort (Fig. 1D), y tanto las células infectadas por VIH (VIH ARNm+) como las no infectadas por VIH (VIH ARNm-) de donantes infectados con VIH expresaron TRAILshort (Fig. 1E), lo que indica que la infección por VIH no es necesaria para la producción de TRAILshort. La mayoría de las células individuales expresaron TRAIL<FL>y TRAILshort, o ni TRAIL<FL>ni TRAILshort, lo que concuerda con que TRAILshort es una variante de ayuste de TRAIL<FL>(Fig. 1F). Con el fin de comprender qué estímulos inducen la expresión de TRAILshort, se evaluó si dicha expresión estaba correlacionada con la activación celular, y se encontró que el mensaje de TRAILshort no estaba asociado con la activación inmune según lo determinado por la presencia de transcritos para CD25, CD38 o HLA-DR (Fig. 1G). Dentro de los subconjuntos de células T CD4 representados en este análisis, más células T CD4 de memoria central (T<CM>) contenían transcritos de TRAILshort que las células T emigrantes tímicas recientes (RTE), las células T CD4 de memoria efectora (T<EM>) o las células T CD4 de memoria transicional (T<TM>) (Fig. 1H). Por tanto, los datos indican que TRAILshort puede expresarse en células individuales que no están infectadas por el VIH.
[0169] Los interferones tipo I impulsan la producción de TRAILshort
[0170] Dado que las células no infectadas por el VIH son capaces de producir TRAILshort, resulta relevante comprender qué estímulos son responsables de impulsar la producción de TRAILshort; las proteínas del VIH, las citocinas inducidas por el VIH y/o el IFN podrían ser responsables de inducir la expresión de TRAILshort. La infección por VIH produce una serie de proteínas bioactivas codificadas por el VIH que tienen efectos pleotrópicos en las células huésped. La infección por VIH de células individuales puede ser reconocida por una variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), incluidos TLR y RIG, que culminan en la producción de IFN tipo I y la consiguiente inducción de genes estimulados por IFN (ISG) (Zitvogel et al., 2015 Nat Rev Immunol 15:405-414). Para determinar cuál de estos estímulos impulsa la producción de TRAILshort, se examinó un panel de citocinas, IFN y proteínas del VIH presentes en el plasma de pacientes infectados para evaluar cuál de estos estímulos, si alguno, puede inducir a una célula T CD4 en reposo (CD25, CD69, HLA-DR) a producir TRAILshort. IFNα14 y el IFNβ indujeron significativamente el mensaje de TRAILshort ~50 veces (Fig. 2A y E), mientras que un panel de citocinas, incluidas las citocinas inflamatorias, aumentaron de manera modesta pero no significativa la expresión del mensaje de TRAILshort sólo en varias veces (Fig. 2B). De manera similar, TNFα, LPS y gp120 afectaron mínimamente la expresión de TRAILshort (Fig.2C). Se encontraron efectos similares de los interferones tipo I en comparación con otros estímulos cuando se analizaron los niveles de proteína TRAILshort en muestras tratadas (Fig.2E). En las mismas muestras se midió el mensaje TRAIL<FL>, y se encontró una estrecha correlación lineal entre la expresión de TRAIL<FL>y la expresión de TRAILshort (Fig. 2D), consistente con la figura 1F. En conjunto, estos datos respaldan la conclusión de que TRAILshort es un gen estimulado por interferón de facto, que por lo tanto probablemente se expresa en diversas afecciones caracterizadas por la señalización de interferón tipo I.
[0171] El extremo carboxilo de TRAILshort se externaliza en la membrana plasmática e interactúa con los receptores de TRAIL R1 y R2, pero no con los receptores de TRAIL R3 y R4.
[0172] TRAIL<FL>se expresa como una proteína transmembrana tipo II de un solo paso con un dominio C-terminal extracelular. La región C-terminal de TRAIL<FL>que contiene los aminoácidos ~95-281 es responsable de la función proapoptótica y forma homotrímeros coordinados alrededor de un ion de zinc central (Cha et al., 1999 Immunity 11:253-261). TRAILshort se produce como consecuencia de un evento de ayuste en el que se eliminan los exones 3 y 4 y se introduce un cambio de marco en el exón 5, lo que da como resultado un codón de parada prematuro y un nuevo extremo C de 11 aminoácidos (Fig.3A).
[0173] Se evaluó si TRAILshort se transporta a la membrana plasmática y está presente en la superficie exterior de la célula. Para ello, se insertó una etiqueta myc dentro del nuevo extremo C de TRAILshort, y se analizó mediante citometría de flujo la accesibilidad del epítopo en células transfectadas permeabilizadas o no permeabilizadas. Mientras que las células transfectadas de control permeabilizadas contenían myc detectable (probablemente reflejando myc endógeno), las células transfectadas con TRAILshort-myc mostraron una tinción de myc adicional consistente con la expresión de la proteína transfectada (Fig. 3B, panel izquierdo). Las muestras no permeabilizadas de las mismas células no mostraron tinción de myc en la superficie de las células transfectadas de control, pero se pudo detectar una población distinta de células positivas para myc de superficie tras la expresión de TRAIL short-myc (Fig.3B, panel derecho), lo que respalda la interpretación de que el extremo carboxilo terminal de TRAILshort es accesible en el entorno extracelular.
[0175] TRAIL<FL>ejerce su efecto proapoptótico a través de la unión a miembros de la familia de receptores de TRAIL, de la cual hay cuatro proteínas miembro distintas. TRAIL-R1 y R2 contienen dominios de muerte que, tras la unión del ligando, reclutan la proteína asociada a Fas con dominio de muerte (FADD) y conducen a la activación de la caspasa-8. TRAIL-R3 y R4 no contienen dominios de muerte funcionales, no conducen a la activación de la caspasa-8, y a menudo se consideran receptores "señuelo". Los miembros de la familia del receptor de TRAIL también se distinguen entre sí por sus diferentes capacidades para unirse a TRAIL<FL>. Un estudio de calorimetría de titulación isotérmica mostró que la afinidad de unión de TRAIL<FL>a TRAIL-R2 era al menos 35 veces mayor que a TRAIL-R1 y 100 veces mayor que a TRAIL-R3 (no se evaluó TRAIL-R4) (Truneh et al., 2000, J Biol Chem 275:23319-23325), mientras que otro mostró TRAIL R4 > R2 > R3 > R1, con constantes de disociación que oscilaban de 0,869 a 4,08 nM (Lang et al., 2016, J Biol Chem 291:5022-5037). Estos estudios destacan a TRAIL-R2 como el receptor inductor de apoptosis con mayor afinidad por TRAIL<FL>.
[0177] Para determinar si TRAILshort también interactúa con otros miembros de la familia de receptores de TRAIL, se combinaron lisados celulares de células 293T que expresan TRAIL-R1, R2, R3 o R4 etiquetados con FLAG en el extremo C con lisados celulares de células que expresan TRAIL<FL>etiquetado con HA en el extremo N o TRAILshort etiquetado con HA en el extremo N. Las mezclas se inmunoprecipitaron con anti-HA, y se analizaron para detectar proteínas que contenían FLAG. Tanto FLAG-TRAIL-R1 como R2 se inmunoprecipitaron a través de HA-TRAIL<FL>(Fig. 3C). FLAG-TRAIL-R1 y R2 también co-inmunoprecipitaron HA-TRAILshort en un grado similar (Fig. 3C). Sin embargo, mientras que TRAIL<FL>se asoció con TRAIL-R3 y R4, TRAILshort notablemente no lo hizo (Fig.3D). Por lo tanto, TRAILshort se une preferentemente a los receptores inductores de muerte TRAIL-R1 y R2, mientras que preserva los receptores señuelo R3 y R4, lo que sugiere que la unión selectiva a los receptores puede ser central para los efectos biológicos de TRAILshort.
[0179] TRAILshort está contenido dentro de vesículas extracelulares
[0181] Aún se desconoce cómo se libera TRAILshort en ese compartimento. Para explorar este proceso, se analizaron mediante microscopía confocal células T Jurkat transfectadas con GFP o GFP-TRAILshort. Se observó que TRAILshort se localizaba en la membrana plasmática (Fig.4A), lo que se confirmó mediante inmunotransferencia de la fracción de membrana pesada de células infectadas por VIH o de control (Fig.4B); la pureza de las fracciones se confirmó mediante HSP70 específica del citosol. TRAILshort se encontró en la fracción sobrenadante de cultivos infectados. Además, el TRAILshort asociado al sobrenadante migró de manera similar al TRAILshort asociado a la célula, lo que sugiere que es poco probable que TRAILshort asociado al sobrenadante haya sido generado por un evento de escisión (Fig.4C).
[0183] Para examinar si TRAILshort podría incorporarse a vesículas extracelulares, se recolectaron mediante ultracentrifugación vesículas extracelulares de células CD4+ estimuladas y no estimuladas con PHA, se fijaron, y se analizaron para determinar su tamaño mediante microscopía electrónica, revelando un intervalo de 50 nm a ~400 nm con un diámetro mediano de 136 nm (Fig.4D). Estos resultados sugieren la presencia de microvesículas (>100 nm) y exosomas (<100 nm). Se realizó un análisis de transferencia Western de las mismas vesículas extracelulares utilizando el anticuerpo anti-TRAILshort. Esto reveló una banda de ~15 kDa (Fig. 4E) consistente con las vesículas extracelulares que contienen TRAILshort. Los lisados de células completas y las preparaciones de vesículas extracelulares purificadas de células 293T transfectadas con HA-TRAIL<FL>y HA-TRAILshort produjeron un patrón similar mediante transferencia Western (Fig. 4F). La presencia de vesículas extracelulares asociadas con TRAILshort se verificó además transfectando células 293T con eGFP-TRAIL<FL>y/o Ruby-TRAILshort y analizando los sobrenadantes con citometría de flujo. Los sobrenadantes de células no transfectadas prácticamente no contenían señal de GFP o Ruby, mientras que las células transfectadas con eGFP-TRAIL<FL>o Ruby-TRAILshort solos mostraron una expresión detectable de cada proteína individualmente. Cuando las células se contransfectaron con eGFP-TRAIL<FL>y Ruby-TRAILshort, se pudieron detectar vesículas con eGFP-TRAIL<FL>solo, con Ruby-TRAILshort solo, y tanto eGFP-TRAIL<FL>como Ruby-TRAILshort. (Fig 4G).
[0185] Se ha demostrado que TRAIL<FL>localizado en microvesículas es bioactivo (Huber et al., 2005 Gastroenterology 128:1796-1804), y por tanto se examinó si TRAILshort en vesículas extracelulares también es bioactivo. Células 293T se transfectaron con HA-TRAIL<FL>solo, HA-TRAILshort solo, ambos en una relación 1:1, o ambos en una relación 1:2 HA-TRAIL<FL>:HA-TRAILshort, y se recolectaron sobrenadantes concentrados que contenían microvesículas de TRAILshort. Las células Jurkat se incubaron en medios recientes, medios acondicionados a partir de células 293T no transfectadas, o medios acondicionados a partir de una de las cuatro variedades de células 293T transfectadas, y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar caspasa-3 escindida como marcador de muerte celular por apoptosis. Las células Jurkat incubadas con medios recientes o medios de células 293T no transfectadas tuvieron niveles bajos de apoptosis basal (~5 %). Por el contrario, las células Jurkat incubadas con medios de células 293T transfectadas con TRAIL<FL>tuvieron >20 % de apoptosis, lo que es consistente con la actividad de TRAIL<FL>en fracciones de microvesículas. Significativamente, cuando las células 293T se contransfectaron con TRAIL<FL>y TRAILshort, el grado de muerte de células T Jurkat por las preparaciones de microvesículas se redujo, y fue más bajo cuando había mayores cantidades de TRAILshort (~3 %-13 %; Fig. 4H e I).
[0187] Se evaluó si TRAILshort está asociado de manera similar con microvesículas y no con exosomas, ya que TRAILshort es una proteína asociada a la membrana con un dominio transmembrana. Los sobrenadantes de cultivos primarios de células T CD4 infectadas por VIH se fraccionaron en microvesículas mediante ultracentrifugación, o en exosomas mediante extracción basada en resina como se describe en otro lugar (véase, p. ej., Taylor et al., 2011 Methods Mol Biol 728:235-246). Las preparaciones de microvesículas y exosomas se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando nuestro anticuerpo específico anti-TRAILshort, e identificó TRAILshort sólo en las preparaciones de microvesículas (Fig.4J).
[0189] La protección de TRAILshort contra TRAIL se puede transferir a las células vecinas
[0191] Para evaluar el impacto biológico de la expresión de TRAILshort, TRAIL<FL>, TRAILshort o ambos se expresaron en células 293T utilizadas como células efectoras. Las células T Jurkat diana, que expresan TRAIL-R2, se marcaron con Cell Tracker Orange (CTO), las células efectoras 293T se mezclaron con células Jurkat CTO+ diana, y el análisis se llevó a cabo mediante citometría de flujo en las poblaciones CTO positivas (Fig.5A). Las células Jurkat diana se correlacionaron positivamente con cantidades crecientes de plásmidos HA-TRAIL<FL>transfectados que oscilaron de 7,1 % a 32,8 % con una transfección de 1 µg a 20 µg de HA-TRAIL<FL>(Fig. 5B y C). Las células efectoras 293T se transfectaron con 10 µg de HA-TRAIL<FL>y cantidades crecientes de HA-TRAILshort, se cocultivaron con células T Jurkat marcadas con CTO, y se analizaron de manera similar. El aumento de la cantidad de plásmido TRAILshort provocó una mayor expresión de TRAILshort (Fig.5D). Esto a su vez dio como resultado cantidades reducidas de muerte de células diana Jurkat (Fig. 5E). Por lo tanto, la coexpresión de TRAILshort con TRAIL<FL>antagoniza la actividad inductora de apoptosis de TRAIL<FL>de una manera dependiente de la dosis.
[0192] Para examinar si la resistencia mediada por TRAILshort a la muerte por TRAIL es transferible desde células productoras de TRAILshort a células espectadoras presentes en el microambiente que no producen TRAILshort, se generaron constructos de expresión de TRAILshort etiquetado con ruby (ruby-TRAILshort) y TRAILshort etiquetado con ruby sin el dominio transmembrana (ruby-TRAILshortΔTM), y se verificó la expresión robusta de cada constructo (Fig. 5F). Las células 293T transfectadas con ruby-TRAILshort demostraron expresión perimembrana de ruby, mientras que las células que expresaban ruby-TRAILshortΔTM mostraron expresión citoplasmática difusa (Fig. 5G, panel superior). Los sobrenadantes de las células transfectadas se recolectaron y se utilizaron para tratar células HeLa. Las células HeLa tratadas mostraron captación de ruby-TRAILshort, pero no de ruby-TRAILshortΔTM (Fig. 5G, panel inferior), lo que es consistente con la comprensión de que el dominio transmembrana es necesario para la localización de TRAILshort en la membrana, y también indica que las microvesículas que contienen TRAILshort son captadas por células vecinas que no producen TRAILshort. Se evaluó si estas células HeLa tratadas con microvesículas adquirieron resistencia a la muerte mediada por TRAIL. Las células HeLa no tratadas murieron de manera dependiente del tiempo después del tratamiento con sk-TRAIL. La adición de sobrenadantes de células 293T transfectadas con ruby o transfectadas con ruby-TRAILshortΔTM no alteró apreciablemente la muerte por sk-TRAIL, mientras que la adición de sobrenadantes de células transfectadas con ruby-TRAILshort redujo la muerte inducida por sk-TRAIL en un ~20 % (Fig.5H). Por lo tanto, la expresión de TRAILshort por una célula puede conferir resistencia a TRAIL a otra célula mediada por la transferencia de microvesículas de TRAILshort.
[0194] TRAILshort contiene un dominio PEST, y es ubiquitinado y degradado por el proteasoma
[0196] Durante los estudios que examinaron la localización subcelular de TRAILshort (Fig.1A) se observó una vida media aparentemente corta para TRAILshort. Para examinar esta observación, se transfectaron células 293T con HA-TRAILshort, y se evaluó la vida media de la proteína en ausencia y presencia del inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (Fig. 6A). Se perdió ~50 % de la proteína en los primeros ~60 minutos, lo que indica un recambio rápido de la proteína. Se identificó un supuesto dominio PEST en TRAILshort entre los aminoácidos 59 y 81 (Fig. 6B). La sustitución de Prolina 76 por Alanina prolongó notablemente la vida media de TRAILshort (Fig. 6C), lo que confirma un dominio PEST funcional y sugiere una posterior ubiquitinación y degradación mediada por el proteasoma.
[0198] Para verificar que TRAILshort está ubiquitinado, TRAILshort etiquetado con HA se expresó en células 293T, y se realizaron extracciones anti-HA e inmunotransferencia para ubiquitina. Estos análisis revelaron una abundancia de proteínas ubiquitinadas que migran en tamaños correspondientes a HA-TRAILshort poliubiquitinado (Fig. 4D). La modificación de proteínas con ubiquitina en sus enlaces Lys48 puede impulsar la degradación del proteasoma, mientras que la ubiquitinación en los enlaces Lys63 da como resultado interacciones proteína:proteína modificadas y alteración de las rutas de transducción de señales (Deng et al., 2000 Cell 103:351-361). Para evaluar si TRAILshort ubiquitinado es la diana para la degradación a través de Lys48, se utilizaron enzimas desubiquitinantes específicas (DUB) que distinguen entre los enlaces de ubiquitina Lys48 y Lys63 (véase, p. ej., Komander et al., 2009 Nat Rev Mol Cell Biol 10:550-563). La ubiquitinación de HA-TRAILshort se revertió por el DUB USP2 específico de Lys48 (Fig. 6D), lo que indica que TRAILshort está ubiquitinado de una manera que es consistente con su direccionamiento al proteasoma para su degradación. Esto se confirmó midiendo los niveles de TRAILshort en células tratadas con o sin el inhibidor del proteasoma MG132, revelando que la inhibición del proteasoma aumenta en gran medida los niveles de expresión de TRAILshort (Fig. 6E). En consonancia con estas observaciones y con la hipótesis de que la ruta de ubiquitina-proteasoma regula los niveles de expresión de TRAILshort, la expresión del mutante de PEST P76A TRAILshort dio como resultado mayores niveles de TRAILshort en células individuales; el número total de células que contenían TRAILshort no aumentó de forma apreciable (Fig.6F).
[0199] TRAILshort es suficiente y necesario para causar resistencia a TRAIL
[0200] Estos datos indican que TRAILshort afecta fundamentalmente la muerte/supervivencia celular, tanto de la célula que produce TRAILshort como de las células espectadoras que absorben TRAILshort mediante transferencia mediada por microvesículas. Para evaluar si TRAILshort por sí solo es responsable de estos efectos, se generó un constructo recombinante de TRAILshort clonando el dominio extracelular de TRAILshort fusionado al dominio Fc de la inmunoglobulina G. Después de la purificación, se añadió la fusión del dominio extracelular de TRAILshort recombinante:Fc (TRAILshortECD:Fc) a células T Jurkat solas o a células T Jurkat pretratadas con sk-TRAIL. Si bien TRAILshortECD:Fc no fue tóxico, sí previno la muerte de células T Jurkat mediada por sk-TRAIL de manera dependiente de la dosis (Fig.7A).
[0201] Se evaluó si el agotamiento de TRAILshort es suficiente para mitigar la resistencia a TRAIL. La generación de anticuerpos anti-TRAILshort que son específicos para los 11 aminoácidos C terminales exclusivos de TRAILshort se describe en otra parte (véase, p. ej., Schnepple et al., 2011 J Biol Chem 286:35742-35754). Las células T Jurkat que expresan constitutivamente TRAILshort se estimularon con IFNα14 para inducir la expresión máxima de TRAILshort, y después se indujeron a morir por sk-TRAIL. En consonancia con nuestras observaciones anteriores, el tratamiento con sk-TRAIL dio como resultado un exterminio robusto de las células T Jurkat (Fig. 7B). En congruencia con el hecho de que TRAILshort es un antagonista de TRAIL, el tratamiento con sk-TRAIL en presencia de dosis crecientes del anticuerpo anti-TRAILshort indujo un aumento dependiente de la dosis en la muerte de Jurkat, que en la dosis más alta de anticuerpo probada de 5 µg/ml, duplicó efectivamente el número de células muertas a pesar de que el anticuerpo anti-TRAILshort por sí solo no tenía citotoxicidad intrínseca. En conjunto, en este sistema modelo, la presencia de TRAILshort es necesaria y suficiente para la resistencia a TRAIL, y nuestros datos indican que los efectos anti-TRAIL de TRAILshort pueden inhibirse eficazmente mediante el anticuerpo específico anti-TRAILshort.
[0202] Ejemplo 2: TRAILshort reduce la capacidad citotóxica de las células NK
[0203] Las células NK desempeñan un papel clave en la respuesta antiviral a la infección por VIH. Si bien las células NK pueden producir TRAIL como molécula efectora para matar células tumorales, su papel en la defensa antiviral apenas está surgiendo. La proteína TRAILshort producida por las células infectadas por VIH puede ser un factor importante en la reducción de la capacidad de estas células para generar una respuesta inmune innata significativa al virus. Para determinar el efecto de TRAILshort sobre la función de NK, se evaluó el papel de TRAILshort en la reducción de la función citotóxica de las células NK durante la infección por VIH.
[0204] Métodos
[0205] Las células Jurkat se transfectaron con plásmidos de control o que expresaban TRAILshort, y se incubaron con células NK primarias de donantes no infectados (N = 10) a diversas relaciones efectoras: diana (1:1 a 20:1). Se utilizó un ensayo basado en citometría de flujo para determinar los efectos citotóxicos de las células NK en las células Jurkat diana. El efecto de la sobreexpresión de TRAILshort sobre la actividad y función de las células NK se determinó mediante tinción para CD69, perforina, CD16 y CD107a. Además, se midió el efecto de gp120, o del sobrenadante que contiene la cepa VIH-1 IIIB, sobre la expresión de NK de TRAIL y TRAILshort mediante tinción de superficie.
[0206] Resultados
[0207] La sobreexpresión de TRAILshort en las células diana redujo significativamente la función citotóxica de NK contra estas células en un intervalo de relaciones E:T en comparación con las células de control (Figura 8; p = 0,006 en una relación E:T de 20:1). Estos resultados demostraron que la expresión de TRAILshort reduce significativamente la citotoxicidad mediada por NK.
[0208] El pretratamiento de células NK con sobrenadante de cultivo que contenía el virus VIH IIIB provocó un gran aumento en la expresión de superficie de TRAILshort, pero no tuvo efecto en la expresión de TRAIL, mientras que gp120 solo no lo tuvo (Figura 9). Estos resultados demostraron que el sobrenadante que contiene VIH por sí solo aumenta la expresión superficial de TRAILshort en las células NK.
[0209] TRAILshort no alteró la expresión de CD69, CD16, perforina o CD107a en las células NK (Figura 10). Estos resultados demostraron que TRAILshort afecta la función de las células NK, y puede desempeñar un papel importante en la respuesta inmune innata a la infección por VIH.
[0210] Ejemplo 3: Humanización de anticuerpos anti-TRAILshort
[0211] El anticuerpo monoclonal murino TRAILs 2.2 se humanizó para crear el anticuerpo Ab866.
[0212] Cadena pesada
[0213] La secuencia del dominio VH de TRAILs 2.2 murino se expone a continuación, con las CDR indicadas en negrita:
[0215]
[0217] Las CDR del VH murino se injertaron en marcos aceptores humanos para crear variantes humanizadas VH1-VH4: VH1:
[0219]
[0221] En la Figura 12A se muestra una alineación de la secuencia murina de VH0 con las variantes humanizadas VH1-4. La homología de las variantes humanizadas VH1-4 con la secuencia murina de VH0 se muestra en la Tabla 1 a continuación.
[0222] Tabla 1. Homología de variantes humanizadas con VH murino.
[0225]
[0226] Cadena ligera
[0227] La secuencia del dominio VL de TRAILs 2.2 murino se expone a continuación, con las CDR indicadas en negrita:
[0229]
[0231] Las CDR del VL murino se injertaron en marcos aceptores humanos para crear variantes humanizadas VL1-VL4: VL1:
[0233]
[0235] En la Figura 12B se muestra una alineación de la secuencia murina de VL0 con las variantes humanizadas VL1-4. La homología de las variantes humanizadas VL1-4 con la secuencia murina de VL0 se muestra en la Tabla 2 a continuación.
[0236] Tabla 2. Homología de variantes humanizadas con VL murino.
[0239]
[0241] Todas las variantes humanizadas estaban de acuerdo con la definición de anticuerpos humanizados de la Organización Mundial de la Salud (OMS).
[0242] Ejemplo 4: Anticuerpos anti-TRAILshort
[0243] Cada uno de los dominios V<H>se sintetiza en marco con una secuencia de dominio constante del isotipo IgG1 humano. Es posible optimizar los codones de toda la secuencia de cadena pesada (DNA2.0, USA) y verificar la secuencia de ADN. La secuencia de aminoácidos del dominio constante de IgG1 (alotipo G1m17,1) es:
[0246] Cada uno de los dominios V<L>se sintetiza en marco con una secuencia de dominio constante del isotipo IgK humano. Es posible optimizar los codones de toda la secuencia de cadena ligera (DNA2.0, USA) y verificar la secuencia de ADN. La secuencia de aminoácidos del dominio constante de IgK (alotipo Km3) es:
[0248]
[0251] Cada una de las cadenas variantes se verifica mediante análisis de secuenciación de ADN. Los 16 anticuerpos humanizados pueden incluir cualquier combinación de dominios variables humanizados como se muestra en la Tabla 3.
[0253] Tabla 3. Combinaciones de dominios variables humanizados en anticuerpos anti-TRAILshort humanizados.
[0256]
[0259] La secuencia completa de aminoácidos de cada cadena pesada y ligera se muestra en la Figura 13.
[0261] Ejemplo 5: Anticuerpos anti-TRAILshort para el tratamiento del cáncer
[0263] Para examinar el efecto de los anticuerpos anti-TRAILshort in vivo, se inyectaron a ratones NSG células de leucemia de células T Jurkat que expresan constitutivamente luciferasa, y se determinó la expresión de luciferasa dos veces por semana. Para los experimentos que se muestran en las Figuras 14A-C, a los ratones se les inyectaron 10 mg/kg de anticuerpo IC o anticuerpo anti-TRAILshort clon 2.2 (por ejemplo, TRAILs 2.2 murino como se describe en el Ejemplo 4) el día 27. A los ratones se les inyectó 24 horas después (por ejemplo, el día 28) un anticuerpo anti-receptor 2 de TRAIL (anti-DR5) (10 mg/kg). La expresión representativa de luciferasa se redujo en ratones tratados con anticuerpo anti-TRAILshort con respecto a ratones tratados con el control de isotipo (Figura 14A y 14B). La expresión de luciferasa se redujo significativamente en ratones tratados con anticuerpo anti-TRAILshort y anti-DR5 (Figura 14C). Aunque los ratones tratados con el anticuerpo anti-TRAILshort y anti-DR5 sobrevivieron mientras que los ratones de control no, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 14D). Estos resultados muestran que la inhibición de TRAILshort en presencia de un agonista de TRAIL (anti-DR5) da como resultado un mejor control del tumor y una mejor supervivencia en comparación con el control de isotipo más anti-DR5. Para los experimentos que se muestran en las Figuras 14D-E, a los ratones se les inyectaron 10 mg/kg de anticuerpo IC o anticuerpo anti-TRAILshort clon 2.2 los días 20, 27 y 34. La expresión de luciferasa se redujo significativamente en ratones tratados con anticuerpo anti-TRAILshort (Figura 14E), y la supervivencia aumentó significativamente en ratones tratados con anticuerpo anti-TRAILshort (Figura 14F), en comparación con los ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo. Estos resultados demostraron que la administración in vivo del anticuerpo anti-TRAILshort, solo o en presencia de anti-DR5, puede reducir el número de células leucémicas en ratones y prolongar la supervivencia de los ratones.
[0265] Se examinó el efecto de los anticuerpos anti-TRAILshort sobre la citotoxicidad de sk-TRAIL en diferentes líneas de células cancerosas. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1X10<4>células por pocillo. Las células se preincubaron con el anticuerpo neutralizante anti-TRAIL short clon 2.2 o con el control IgG3 a concentraciones variables (1-20 µg/ml), como se indica, durante una hora a 37 °C. Posteriormente, se añadió sk-TRAIL a las células en una dosis de 1-10 ng/ml, como se indica. Para medir la muerte celular, se añadió a las células el reactivo de ensayo de apoptosis de Caspasa 3/7 a una dilución de 1: 1000. Para el análisis en tiempo real de la muerte celular, se utilizó el sistema IncuCyte<®>para capturar imágenes en tiempo real de las células cada 2 horas. Se examinaron células de leucemia linfomatosa (Figura 15A), células de cáncer de páncreas (Figura 15B), células de melanoma (Figura 15C), y células de cáncer de ovario (Figura 15D). Cada tratamiento se realizó por triplicado. Estos resultados demostraron que, en algunas líneas celulares, los anticuerpos anti-TRAILshort actúan en conjunto con TRAIL recombinante para inducir la apoptosis en las células cancerosas.
[0266] Tabla 4. El efecto del anticuerpo anti-TRAILshort en diferentes líneas de células de cáncer humano.
[0268]
[0270] Para examinar la expresión de TRAIL en las diferentes células cancerosas, se cuantificó el ARNm de TRAIL en diferentes células cancerosas mediante qRTPCR. El ARN se aisló utilizando el minikit RNeasy de Qiagen. Se transcribió de manera inversa 1 µg de ARN a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad. El ADNc se diluyó y, utilizando estándares para TRAILshort y TRAIL<FL>, se calculó el número de copias de cada gen en células de leucemia linfoma, células de cáncer de páncreas, células de melanoma, y células de cáncer de ovario (Figura 16).
[0271] Para examinar más a fondo la expresión de TRAIL en las diferentes células cancerosas, los tejidos de una micromatriz de tejidos se tiñeron mediante inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-TRAILshort 2.2 a una concentración de 1:400. Como se muestra en la Figura 17, ejemplos de tejidos normales y cancerosos correspondientes del páncreas, el estómago y la próstata se tiñeron de forma positiva para TRAILshort. Estos resultados demostraron que los tejidos cancerosos tienen una expresión significativamente elevada de TRAILshort en comparación con los tejidos no malignos.
[0272] Ejemplo 6: Anticuerpos anti-TRAILshort para el tratamiento del cáncer
[0273] Se observó la expresión de TRAILshort en una variedad de tipos de cáncer utilizando inmunohistoquímica de microamatrices de tejido. Las 8 microamatrices de tejido (TMA) obtenidas utilizando el anticuerpo anti-TRAIL-short 2.2 a una dilución de 1:400 se resumen en la Figura 18 y en la Tabla 5 a continuación.
[0274] Tabla 5. Expresión de TRAILshort observada en inmunohistoquímica de microamatrices de tejido.
[0276]
[0277]
[0278]
[0280] TRAILshort se encontró en muchos tumores humanos (Figura 19). Los niveles de TRAILshort se cuantificaron como lecturas por kilobase por millón (RPKM). Los datos se determinaron a partir del Cancer Genome Atlas (TCGA).
[0281] Los niveles crecientes de TRAILshort se asociaron con una peor supervivencia en algunos tumores humanos (Figura 20). La supervivencia se evaluó mediante el análisis de Kaplan Meyer para pacientes con linfoma difuso de células B grandes (Figura 20A), adenocarcinoma de colon y recto (Figura 20B), carcinoma de células renales cromófobo (Figura 20C), adenocarcinoma pancreático (Figura 20D), y timoma (Figura 20E), y se estratificó por el nivel de TRAILshort expresado como transcritos por kilobase por millón (TPM). Las curvas de supervivencia se determinaron a partir del Cancer Genome Atlas (TCGA).
[0282] El anticuerpo anti-TRAILshort interactuó con el antígeno TRAILshort. Las células HEK293T se transfectaron con plásmidos que codifican la proteína fluorescente verde (GFP), GFP-TRAILshort, o GFP-TRAIL<FL>, y se analizaron mediante microscopía confocal (Figura 21).
[0283] La optimización de codones produjo 16 variantes de anticuerpos anti-TRAILshort. Las variantes del anticuerpo anti-TRAILshort tuvieron un efecto variable sobre la citotoxicidad inducida por TRAIL contra células Jurkat en combinación con super killer (sk)-TRAIL, y una afinidad variable (Tabla 6). Se utilizó resonancia de plasmones de superficie para analizar la afinidad. El clon HC2LC3 mostró una afinidad de 3,8 pM, y un exterminio sinérgico significativo en presencia de sk-TRAIL (1 ng/ml; Figura 22).
[0284] Tabla 6. Efecto sobre la citotoxicidad inducida por TRAIL y la afinidad de los anticuerpos anti-TRAILshort optimizados por codones
[0286]
[0288] Algunas células derivadas de pacientes respondieron al anticuerpo anti-TRAILshort más sk-TRAIL, pero otras no. Las células de los bazos de pacientes sometidos a esplenectomía por sospecha de malignidad hematológica se aislaron recientemente y se trataron con nada (control), con superkiller TRAIL (sk-TRAIL, un agonista de TRAIL oligomerizado), con anticuerpo anti-TRAILshort humanizado (clon HC2LC3), o con anticuerpo de control de Isotipo (IgG4). La muerte celular a lo largo del tiempo se monitorizó utilizando la plataforma de formación de imágenes de células vivas Incucyte analizando la actividad de la caspasa 3/7 activa a lo largo del tiempo (Figura 23).
[0289] Se evaluó el efecto del anticuerpo anti-TRAILshort sobre la citotoxicidad de sk-TRAIL en diferentes líneas de células cancerosas derivadas de pacientes humanos. Las células de los bazos de los pacientes se recibieron recientes en RPMI y se analizaron para determinar su sensibilidad a la citotoxicidad en presencia de sk-TRAIL a una dosis de 1 ng/ml en presencia o ausencia de dosis crecientes de anti-TRAIL-short clon HC2LC3 (1,25, 2,5, o 5 µg). Los controles se trataron con IgG4 humana en las mismas dosis. Utilizando Incucyte, se monitorizó la muerte celular cada 2 horas según el número de células positivas para la caspasa 3/7 escindida durante 72 horas (Figura 24).
[0290] La capacidad de respuesta al tratamiento anti-TRAILshort más sk-TRAIL fue mayor que la de sk-TRAIL solo en varias líneas de células cancerosas derivadas de pacientes humanos. El número de células muertas a las 48 horas posteriores al tratamiento con sk-TRAIL en una dosis de 1 ng/ml solo o sk-TRAIL (misma dosis) más anti-TRAIL short clon HC2LC3 en una dosis de 5 µg/ml se muestra en la Figura 25. La capacidad de respuesta se definió como un aumento estadísticamente significativo en el número de células muertas después de la adición del anticuerpo anti-TRAIL short. Se muestran las estadísticas para la prueba de la t por pares.
[0291] La capacidad de respuesta de las líneas celulares derivadas de pacientes humanos a anti-TRAILshort tanto solo como en combinación con sk-TRAIL se muestra en la Figura 26 y en la Tabla 7. La capacidad de respuesta se definió como un aumento estadísticamente significativo en el número de células muertas durante el tratamiento con sk-TRAIL solo.
[0292] Tabla 7. Respuesta de líneas celulares humanas derivadas de pacientes a anti-TRAILshort.
[0294]
[0296] Se observó un aumento de la expresión de TRAILshort en líneas celulares respondedoras a anti-TRAILshort mediante la cuantificación del número de copias de ARNm de TRAILshort usando qPCR en tiempo real en varias líneas celulares respondedoras y no respondedoras (Figura 27A), y mediante el porcentaje de positividad de TRAILshort medido mediante tinción de 3 líneas celulares usando anti-TRAIL-short 2.2 conjugado con CF555 o isotipo por citometría de flujo (Figura 27B).
[0297] Se examinó la expresión de TRAILshort en células 293T y tejidos tumorales de pacientes. En la Figura 28 se muestran portaobjetos de inmunohistoquímica teñidos para TRAILshort utilizando el anticuerpo anti-TRAILshort a una dilución de 1:400.
[0298] Los ratones NSG a los que se les implantó células de linfoma de células T Jurkat humanas se trataron eficazmente con la combinación de anticuerpo anti-DR5 más anti-TRAILshort. A los ratones NSG se les implantaron células T Jurkat que expresaban luciferasa mediante inyección intravenosa. Se permitió que los tumores se establecieran y se trataron cada 2 semanas con 10 mg/kg cada 14 días de (i) control de isotipo para TRAILshort e isotipo para anticuerpos anti-DR5 (denominado Isotipo), (ii) anticuerpo anti-TRAILshort clon 2.2 más un control de Isotipo para anti-DR5 (denominado Anti-TRAILshort), (iii) un control de isotipo para anticuerpo anti-TRAILshort más anticuerpo anti-DR5 (denominado control de isotipo más Anti-DR5), o (iv) anti-TRAILshort (2.2) más anti-DR5, según se indique. A lo largo del tiempo, se analizó la expresión de luciferasa en ratones mediante imágenes de cuerpo entero (Figura 29A). Supervivencia evaluada mediante análisis de Kaplan Meyer (Figura 29B).
[0299] El anticuerpo anti-TRAILshort más el control de isotipo o el anticuerpo anti-TRAILshort más el anticuerpo anti-DR5 dieron como resultado una supresión del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer humano (Figura 30). A los ratones NSG se les implantó por vía subcutánea la línea celular de linfoma de células B grandes difuso humano (HBL-1) y se midió diariamente el tamaño del tumor. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño mayor o igual a 100 mm cúbicos, los ratones recibieron los tratamientos indicados mediante inyecciones IP semanales con 10 mg/kg cada 14 días de (i) controles de isotipo para TRAILshort y para anticuerpos anti-DR5 (IC+IC), (ii) anticuerpo anti-TRAILshort clon 2.2 más un control de isotipo para anti-DR5 (2.2 IC), (iii) un control de isotipo para anticuerpo anti-TRAILshort más anticuerpo anti-DR5 (IC DR5), o (iv) anti-TRAILshort (2.2) más anticuerpo anti-DR5 según se indique (2.2 DR5). Con el tiempo, los ratones se analizaron para determinar el tamaño del tumor y las veces de cambio calculado a partir del valor inicial (Figura 30A). Supervivencia evaluada mediante análisis de Kaplan Meyer (Figura 30B).
[0301] Se examinó la toxicidad, y la reversibilidad de cualquier efecto tóxico, del anticuerpo anti-TRAILshort Clon 2.2. Se utilizaron diez ratones C57BL/6 (5 machos y 5 hembras). Los animales recibieron el anticuerpo anti-TRAILshort Clon 2.2 mediante bolo intravenoso el día 1 a una dosis de 10 mg/kg y un volumen de 5 ml/kg. Los parámetros evaluados durante el estudio incluyeron los cambios en la piel, pelaje, ojos y membranas mucosas, sistema respiratorio, sistema circulatorio, sistema nervioso central autónomo, actividad somatomotora, actividad locomotora y patrón de comportamiento, cambios en el peso corporal, y efectos sobre la mortalidad. Al final de la parte en vida, todos los animales se pesaron, se sacrificaron humanitariamente, se extrajo sangre para análisis de química clínica y hematología, y se realizó una necropsia macroscópica. No se observaron anormalías ni cambios en la condición física, actividad, o comportamiento de ningún animal. Se realizaron observaciones clínicas diariamente para todos los animales del estudio. Todos los animales del estudio se observaron dos veces al día durante 7 días. Todos los animales sobrevivieron durante la duración del estudio. Todos los animales perdieron peso corporal durante el estudio, sin embargo, los pesos corporales terminales se recolectaron antes del sacrificio, después del ayuno, por lo que se desconoce si la disminución de peso se debió a los procedimientos de ayuno, al anticuerpo anti-TRAILshort Clon 2.2, o a una combinación de ambos. Se realizaron investigaciones de patología clínica en hematología y química clínica en todos los animales resistentes supervivientes el día 8. Las muestras de sangre terminal se recogieron de la vena cava o de una punción cardíaca. No se observó ninguna toxicidad adversa en una cohorte de 10 ratones C57 BL/6 sanos durante un período de observación de siete días después de la inyección intravenosa de anticuerpo anti-TRAILshort el día 1 en animales machos o hembras.
[0303] TRAILshort se puede detectar en tejidos mediante hibridación in situ (ISH; Figura 31). Los tejidos de macaco infectados con VIS se tiñeron con sondas específicas de longitud completa de TRAIL o con sondas específicas de TRAILshort (con secuencia 383 pb 5'-tcgttaga aagactccaa gaatgaaaag gctctgggcc gca -3' 423 pb (SEQ ID NO:31)) de Advanced Cell Diagnostics, y se visualizaron con un aumento de 10×, 20× y 40× (Figura 31). Tejido del ganglio linfático axilar de macaco infectado con VIS teñido con la sonda específica de TRAIL y con la sonda específica de TRAILshort. De manera similar, el tejido del bazo de macaco infectado con VIS se tiñó con la sonda específica de TRAIL y con la sonda específica de TRAILshort.
[0305] OTRAS REALIZACIONES
[0307] Se debe entender que, si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones quedan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une al ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL) corto, en el que dicho anticuerpo comprende:
un dominio de región variable de cadena pesada (VH) que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3; y
un dominio de región variable de cadena ligera (VL) que comprende las CDR expuestas en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, y SEQ ID NO:16.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia de dominio VH expuesta en SEQ ID NO: 6.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena pesada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13.
4. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia de dominio VL expuesta en SEQ ID NO: 20.
5. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha cadena ligera comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, y SEQ ID NO:26.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, o en el que dicho anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, o en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, o en el que dicho anticuerpo neutraliza TRAILshort.
7. Una composición que comprende:
un anticuerpo que se une al ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL) corto, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio de región variable de cadena pesada (VH) que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio de región variable de cadena ligera (VL) que comprende las CDR expuestas en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16; para uso en un método de tratamiento de una infección, en el que dicha infección es una infección crónica,
en la que dicho anticuerpo aumenta la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK).
8. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicha infección se selecciona del grupo que consiste en infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, infección por el virus de la hepatitis B, e infección por el virus de la hepatitis C.
9. La composición para uso según la reivindicación 7, que comprende además la administración a dicho mamífero de una terapia antirretroviral, en la que opcionalmente dicha terapia antirretroviral se selecciona del grupo que consiste en abacavir, didanosina, emtricitabina, entecavir, lamivudina, estavudina, fumarato de tenofovir disoproxil, zalcitabina, zidovudina, delavirdina, efavirenz, etravirina, nevirapina, rilpivirina, adefovir, tenofovir, enfuvirtida, maraviroc, dolutegravir, elvitegravir, raltegravir, bevirimat, amprenavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir, atazanavir, darunavir, tipranavir, TRIM5alfa, antagonistas de tat, tricosantina, interferón alfa pegilado (PEG-IFN-a), daclatasvir, elbasvir, grazoprevir, glecaprevir, pibrentasvir, ledipasvir, sofosbuvir, ombitasvir, paritaprevir, ritonavir, dasabuvir, simeprevir, velpatasvir, y voxilaprevir.
10. Una composición que comprende:
un anticuerpo que se une al ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL) corto, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio de región variable de cadena pesada (VH) que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3; y un dominio de región variable de cadena ligera (VL) que comprende las CDR expuestas en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16; para uso en un método de tratamiento de un cáncer, en la que dicho anticuerpo induce apoptosis en una célula cancerosa de dicho cáncer, en la que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, tumor de células germinales, blastoma, y metástasis.
11. La composición para uso según la reivindicación 10, en la que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de ovario, melanoma, carcinoma pancreático, neoplasias malignas de células T, neoplasias
malignas de células B, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas escamosas, cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama con receptor hormonal positivo, cáncer de mama HER2 positivo, cáncer de mama triple negativo, cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de células papilares renales, cáncer de células claras de riñón, carcinoma de células transicionales renales, carcinoma de células renales cromófobo, carcinoma hepatocelular, mieloma, y cáncer de útero.
12. La composición para uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 10, en la que dicho mamífero es un ser humano, opcionalmente en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
13. La composición para uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 10, que comprende además administrar a dicho mamífero un agonista de TRAIL, opcionalmente en la que dicho agonista de TRAIL se selecciona del grupo que consiste en TRAIL recombinante, un anticuerpo anti-TRAIL-R1, un anticuerpo anti-TRAIL-R2, y un oligómero de TRAIL.
14. La composición para uso según la reivindicación 10, que comprende además administrar a dicho mamífero un tratamiento contra el cáncer.
15. La composición para uso según la reivindicación 14, en la que dicho tratamiento contra el cáncer es un agente de quimioterapia, opcionalmente en la que dicho agente de quimioterapia se selecciona del grupo que consiste en altretamina, busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, lomustina, melfalán, oxalaplatino, temozolomida, tiotepa, 5-fluorouracilo (5-FU), 6-mercaptopurina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, y pemetrexed, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, actinomicina-D, bleomicina, mitomicina-C, mitoxantrona, topotecán, irinotecán, etopósido, tenipósido, mitoxantrona, docetaxel, estramustina, ixabepilona, paclitaxel, vinblastina, vincristina, vinorelbina, prednisona, etilprednisolona, dexametasona, L-asparaginasa, bortezomib, retinoides, tretinoína, bexaroteno, trióxido de arsénico, CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona), R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona), trastuzumab, pertuzumab, ipilimumab, dinutuximab, siltuximab, cetuximab, panitumumab, necitumumab, ramucirumab, bevacizumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, olaratumab, denosumab, blinatumomab, rituximab, ofatumumab, obinutuzumab, daratumumab, alemtuzumab, elotuzumab, gemtuzumab ozogamicina, brentuximab vedotin, trastuzumab, emtansina, apatinib, cabozantinib, alectinib, crizotinib, dasatinib, imatinib, nilotinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, sorafenib, sunitinib, tofacitinib, cobimetinib, trametinib, bortezomib, disulfiram, lactacistina, tamoxifeno, obatoclax, navitoclax, gosipol, iniparib, olaparib, perifosina, dabrafenib, vemurafenib, trametinib, abemaciclib, palbociclib, ribociclib, trilaciclib, fulvestrant, temsirolimus, everolimus, vemurafenib, trametinib, dabrafenib, y vintafolida.
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