ES3062285T3 - Histamine-dagk-producing bacterial strains and their use in colorectal cancer therapy - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Cepas bacterianas productoras de histamina y DagK y su uso en la terapia del cáncer colorrectal

[0003] Campo técnico de la invención

[0004] La presente invención generalmente se refiere a cepas bacterianas del ácido láctico y, en particular, a la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina y a su uso, por ejemplo, en el cáncer.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Se han recopilado pruebas anteriores que indican que la histamina puede modular la proliferación de diferentes células normales y malignas. Se han comunicado altos niveles de biosíntesis y contenido de histamina, junto con receptores de histamina, en diferentes cánceres humanos, incluidos el melanoma, el cáncer de colon y de mama.

[0007] El cáncer colorrectal (CCR), también conocido como cáncer de colon, cáncer de recto o cáncer de intestino grueso, es el tercer cáncer más común y la tercera causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer. La carcinogénesis colorrectal se ha asociado con factores genéticos y ambientales. El cáncer colorrectal es un cáncer en el colon y/o el recto.

[0008] ElLactobacillus reuteries un probiótico y firmicute intestinal comensal que predomina ampliamente en el tubo digestivo de diversas especies de aves y mamíferos. Este organismo es un microbio generalmente considerado seguro (GRAS) y beneficioso, y se ha utilizado en todo el mundo como probiótico durante aproximadamente dos décadas. Se ha comunicado queL. reuterisuprime las citocinas proinflamatorias en las células epiteliales intestinales, los monocitos y la inflamación intestinal en diferentes modelos de roedores.

[0009] La patente WO 2013/011137 describe la selección de cepas bacterianas del ácido láctico probióticas específicas que producen histamina y el uso de tales cepas para obtener efectos beneficiosos para los mamíferos. Las cepas bacterianas seleccionadas se pueden utilizar en la producción local de histamina en mamíferos, en particular para su uso en el tratamiento o la profilaxis de afecciones inflamatorias.

[0010] En Iyer y col., Probiotic Lactobacillus reuteri promotes TNF-induced apoptosis in human myeloid leukemia-derived cells by modulation of NF-kappaB and MAPK signalling, Cellular Microbiology 10(7): 1442-1452 (2008) se describe queL. reuteriATCC PTA 6475 secreta factores que potencian la apoptosis en células derivadas de leucemia mieloide inducidas por el factor de necrosis tumoral (TNF). La mejor comprensión de los efectos mediados porL. reuterien las vías de señalización apoptótica puede facilitar el desarrollo de futuras pautas posológicas basadas en probióticos para la prevención del cáncer colorrectal y la enfermedad inflamatoria intestinal.

[0011] En Liu y col., Lactobacillus reuteri strains reduce incidence and severity of experimental necrotizing enterocolitis via modulation of TLR4 and NF-κB signaling in the intestine, American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology 302(6): G608-G617 (2011) se demuestra que las cepas DSM 17938 y ATCC PTA 4659 deL. reuteritienen un potencial valor terapéutico en un modelo de enterocolitis necrosante (ECN) y en la enteritis asociada a la alimentación con leche de vaca, de este modo se podrían utilizar en el tratamiento de la ECN.

[0012] La patente WO 2011/095526 describe un método para mejorar las propiedades inmunomoduladoras de las cepas de Lactobacillus utilizando medios de cultivo con una fuente de carbono primaria específica, que incluye un método para incrementar el efecto antiinflamatorio de las cepas bacterianas antiinflamatorias no patógenas, mediante el uso de condiciones de crecimiento específicas.

[0013] La patente US-2013/0022586 describe un método para seleccionar bacterias del ácido láctico probióticas específicas que producen histamina y el uso de tales cepas para obtener efectos beneficiosos para los mamíferos. El método incluye seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la producción local de histamina en un mamífero, y comprende además el cribado de bacterias para revelar la presencia de un operón de histidina activo y seleccionar una cepa que tenga un operón de histidina activo y sea capaz de producir histamina. También se describen productos que comprenden las cepas obtenibles mediante los métodos de selección de la invención para su uso en la producción local de histamina en un mamífero, en particular para su uso en el tratamiento o la profilaxis de afecciones inflamatorias.

[0014] La patente WO 2006/110088 describe cepas de bacterias del ácido láctico seleccionadas por su capacidad para reducir la inflamación, tal como la enfermedad del intestino grueso, un método para seleccionar tales cepas y productos que contienen tales cepas.

[0015] En Dong Yang y col., Histamine deficiency promotes inflammation-associated carcinogenesis through reduced myeloid maturation and accumulation of CD11b+Ly6G+ immature myeloid cells, Nature Medicine 17(1): 87-95 (2011) se describe que los ratones con desactivación de Hdc muestran una alta tasa de carcinogénesis de colon y piel. La histamina exógena indujo la diferenciación de las células mieloides inmaduras (CMI) y suprimió su capacidad para favorecer el crecimiento de los aloinjertos tumorales. Los datos indicaron las funciones clave deHdcy la histamina en la diferenciación de las células mieloides y de CMI CD11b<+>Ly6G<+>en el desarrollo precoz del cáncer.

[0016] Resumen de la invención

[0017] La invención de la presente memoria describe cepas bacterianas productoras de histamina para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal.

[0018] Los inventores han descubierto que las bacterias probióticas productoras de histamina son capaces de reducir la frecuencia y la gravedad del CCR asociado a la inflamación enHdc-/-

del cáncer colorrectal.L. reuteriATCC PTA-6475 disminuyó significativamente el número y el tamaño de los tumores colorrectales o de colon. Mientras tanto, unhdcAmutante isogénico deL. reuteriATCC PTA-6475, que carece de actividad productora de histamina, no mostró tales efectos, lo que indica un papel significativo del genhdcAbacteriano en el microbioma gastrointestinal y la producción de histamina para la supresión de la oncogénesis colorrectal.

[0019] En consecuencia, un aspecto de las realizaciones se refiere a una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo y la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina expresa un gen que codifica una diacilglicerol cinasa (DagK) y produce histamina y produce DagK.

[0020] Otro aspecto de las realizaciones se refiere a una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso como adyuvante en el tratamiento del cáncer colorrectal. El tratamiento del cáncer se selecciona de entre un grupo que consiste en radioterapia y quimioterapia. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo y la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina expresa un gen que codifica una DagK y produce histamina y produce DagK.

[0021] Otro aspecto de las realizaciones se refiere a un método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal. El método comprende el cribado de bacterias del ácido láctico para revelar la presencia de un operón de histidina activo y la presencia de la expresión de un gen que codifica una DagK. El método también comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que produce histamina y produce DagK.

[0022] Otros aspectos adicionales de las realizaciones se refieren a una nueva cepa deL. reuteri, Lactobacillus reuteriDSM 32273, tal como una cepaL. reuteriDSM 32273, para su uso como medicamento y, en particular, para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal.

[0023] Descripción de los dibujos

[0024] Figura 1. L. reuteri ATCC PTA-6475 natural, pero no su hdcA mutante, atenúa el cáncer de colon inducido por AOM/DSS in vivo.(A) Cronología de los experimentos con ratones. Se dividió al azar a ratonesHdc-/-

BALB/c de once semanas de edad en cuatro grupos, incluido un grupo de control negativo, un grupo de control positivo, un grupo tratado conL. reuteriATCC PTA-6475 y un grupo tratado conL. reuteri hdcAmutante. Los ratones del grupo tratado conL. reuteriATCC PTA-6475 o del grupo tratado conhdcAmutante recibieron 5×10<9>UFC deL. reuteriATCC PTA-6475 natural o la cepaL. reuteri hdcAmutante isogénica, respectivamente, en 0,2 ml de MRS mediante alimentación por sonda orogástrica una vez al día durante siete días y una vez cada tres días después. Los ratones de los grupos de control negativo y positivo recibieron únicamente medios microbiológicos enriquecidos (MRS). A las doce semanas de edad, se expuso a estos ratones a una dosis de AOM (12,5 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal seguida de dos ciclos de tratamiento con DSS al 2 % en agua potable durante 6 días, con períodos de recuperación de dos semanas con agua potable solo entre las fechas de administración del DSS. Los ratones del grupo de control negativo recibieron solo una dosis de PBS y agua potable, en lugar de AOM y DSS. Los ratones se sacrificaron a las 27 semanas de edad y se evaluó la carcinogénesis colónica en cada grupo. (B) Imágenes de colon representativas de ratones del grupo de control negativo (MRS/PBS-H2O), el grupo de control positivo (MRS/AOM-DSS), el grupo tratado conL. reuteriATCC PTA-6475(L. reuteri6475/AOM-DSS) y el grupo tratado conL. reuteri hdcAmutante isogénica (hdcAmutante/AOM-DSS). (C) Números de tumores colónicos grandes (>3 mm) y pequeños (<3 mm) de ratones en cada grupo mencionado anteriormente. Los datos se presentan como gráficos de cajas y bigotes que muestran la mediana y los percentiles 10 y 90 (**P < 0,01,***p < 0,001,n = 8~10 para cada grupo). (D) Imágenes de colon microscópicas representativas (teñidas con H&E) de ratones del grupo de control negativo (MRS/PBS-H<2>O), el grupo de control positivo (MRS/AOM-DSS), el grupo tratado conL. reuteriATCC PTA-6475 natural (L. reuteri6475/AOM-DSS) y el grupo tratado conL. reuteri hdcAmutante isogénica ((hdcAmutante/AOM-DSS).

[0025] Figura 2. Detección de la atenuación de la oncogénesis del colon mediante imágenes de TEP.(A) Procedimientos de obtención de imágenes por PET. (B) Imágenes representativas de ratones capturadas mediante exploración PET/TC en cada grupo. La barra de código representa la intensidad de la señal de FDG. (C) La cuantificación de las señales de FDG en todo el colon de los ratones utilizando SUV en cada grupo mostró que la administración deL. reuteriATCC PTA-6475 redujo significativamente la intensidad de la FDG en el colon de ratón, en comparación con el control del medio MRS, peroL. reuteri hdcAmutante isogénica carecía de tales efectos (analizados con enmascaramiento). Los datos se presentan como gráficos de dispersión (*P<0,05,n = 6 para cada grupo).

[0026] Figura 3. La administración de L. reuteri ATCC PTA-6475 afecta a la producción de citocinas en el plasma murino.La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 disminuyó significativamente la producción de citocinas proinflamatorias KC (A), IL-22 (B) e IL-6 (C) en el plasma de ratonesHdc-/-

macho en el nivel de proteínas determinado mediante el ensayo Luminex, mientras queL. reuteri hdcAmutante isogénica, que carece de la capacidad de producir histamina, no mostró tales efectos. Los datos se presentan como gráficos de dispersión (*P <0,05, **P < 0,01, ***p < 0,001,n = 8~10 para cada grupo).

[0027] Figura 4. La administración de L. reuteri ATCC PTA-6475 afecta a la expresión génica de las citocinas en el colon.La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 disminuyó significativamente la expresión génica de las citocinas proinflamatorias KC (A), IL-22 (B), IL-6 (C), TNF (D) e IL-1α (E) en la mucosa colónica de ratonesHdc-/-macho en el nivel de ARNm determinado mediante RT-qPCR, mientras queL. reuteri hdcAmutante isogénica, que carece de la capacidad de producir histamina, no mostró tales efectos. Los datos se presentan como gráficos de dispersión (*P<0,05, **P < 0,01, ***p < 0,001,n = 5~6 para cada grupo).

[0028] Figura 5. La expresión de H2R se redujo mediante la exposición a AOM/DSS y se indujo mediante L. reuteri.(A) Los estudios de inmunohistoquímica en los que se utilizaron anticuerpos específicos contra H2R mostraron que H2R se expresaba en el colon de ratonesHdc-/-

. El tratamiento con AOM y DSS redujo la intensidad de H2R en comparación con los controles sanos y la administración deL. reuteriindujo la expresión de H2R. (B) La expresión génica de H2R en la mucosa colónica no cambió significativamente por la exposición a AOM/DSS o la administración deL. reuterien ratonesHdc-/-

macho (n = 5~6 para cada grupo).

[0029] Figura 6. Las CMI CD11b+Gr-1+ del bazo se redujeron con la administración de L. reuteri ATCC PTA-6475.El análisis por citometría de flujo obtenido de muestras de médula ósea (A) y bazo (B) de ratonesHdc-/-

macho mostró que el tratamiento con AOM/DSS incrementó significativamente el porcentaje de CMI CD11b<+>Gr-1<+>en comparación con los controles sanos del bazo. La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 en ratones expuestos a AOM/DSS disminuyó significativamente el porcentaje de CMI CD11b<+>Gr-1<+>en el bazo, en comparación con los ratones que no recibieron bacterias(***p < 0,001,medias ± d.e.; n = 3~4 para cada grupo).

[0030] Figura 7. L. reuteri ATCC PTA-6475 redujo los tumores colónicos grandes en ratones Hdc-/- hembra.(A) Imágenes de colon representativas de ratones del grupo de control negativo (MRS/PBS-H2O), el grupo de control positivo (MRS/AOM-DSS), el grupo tratado conL. reuteriATCC PTA-6475(L. reuteri6475/AOM-DSS) y el grupo tratado conL. reuteri hdcAmutante (hdcAmutante/AOM-DSS). (B) El número de tumores de colon grandes (>3 mm) de ratonesHdc-/-

hembra disminuyó significativamente con la administración deL. reuteriATCC PTA-6475, pero el número de tumores de colon pequeños (<3 mm) de ratonesHdc-/-

hembra no cambió significativamente. Los datos se presentan como gráficos de cajas y bigotes que muestran la mediana y los percentiles 10 y 90(*P < 0,05, ***p < 0,001,n = 8~10 para cada grupo).

[0031] Figura 8. Mecanismo de L. reuteri en un modelo de carcinogénesis asociada a la inflamación.La figura ilustra esquemáticamente un mecanismo potencial de la probiosis deL. reuteriATCC PTA-6475 en el modelo murino de carcinogénesis asociada a la inflamación.

[0032] Figura 9. L. reuteri WT y hdcA mutante ATCC PTA-6475 y ATCC PTA-4659 producen diacilglicerol cinasa (DagK).Los niveles relativos de expresión génica diana de ARNm normalizados con respecto al gen constitutivorpoBse presentan a partir de cultivos de 3, 6, 24 y 48 horas de cada bacteria. El ARNm obtenido a partir de cultivos de 3 horas de cada bacteria se estableció en 1,0 y se usó como calibrador para identificar la diferencia relativa de modificaciones del ARNm.

[0033] Figura 10. Secuencia de aminoácidos de DagK en L. reuteri.La secuencia de aminoácidos de DagK enL. reuteri(Id. de sec. n.°: 25) se muestra junto con los sitios de escisión de la tripsina (líneas verticales). Los aminoácidos en negrita indican las secuencias de péptidos obtenidas después de tal tratamiento con tripsina. Las barras negras indican las secuencias de péptidos descubiertas en los experimentos de LC-MS/MS.

[0034] Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas de la misma

[0035] La presente invención describe cepas bacterianas probióticas productoras de histamina para su uso en el cáncer colorrectal. La presente invención describe una selección de cepas bacterianas probióticas productoras de histamina para su uso en el cáncer colorrectal. Las cepas bacterianas productoras de histamina seleccionadas se pueden utilizar para el suministro local de histamina, como agonistas del receptor de histamina.

[0036] Un ejemplo de la descripción es seleccionar ciertas bacterias probióticas capaces de producir histamina. Estas bacterias seleccionadas se pueden utilizar en el tratamiento del cáncer, especialmente del cáncer dependiente de la histamina, tal como, por ejemplo, el cáncer colorrectal.

[0037] Una realización de la presente invención consiste en seleccionar ciertas bacterias probióticas capaces de producir histamina y también capaces de producir diacilgliceril cinasa (DagK), tales como producir y secretar DagK, o al menos liberar DagK para que tengan un efecto extracelular. Estas bacterias seleccionadas se pueden utilizar en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal.

[0038] Otro ejemplo de la descripción es seleccionar ciertas bacterias probióticas capaces de producir histamina y capaces de producir DagK. Estas bacterias seleccionadas se pueden utilizar en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de una afección inflamatoria, tal como, por ejemplo, colitis, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), diverticulosis, gingivitis, mastitis o vaginitis.

[0039] En otra realización de la invención, las cepas bacterianas seleccionadas se utilizan preferiblemente para pacientes hombres con cáncer y, en otra realización más de la invención, las cepas bacterianas se utilizan para pacientes hombres con tumores de colon o recto grandes.

[0040] Las cepas bacterianas seleccionadas se pueden utilizar como adyuvantes para la radioterapia o la quimioterapia clásicas.

[0041] Las cepas bacterianas seleccionadas también se pueden utilizar como un producto para minimizar la diarrea y otros trastornos gastrointestinales asociados con la radioterapia o la quimioterapia del cáncer y, al mismo tiempo, funcionar como un adyuvante para mejorar tal tratamiento para reducir el cáncer.

[0042] La histamina derivada de microbios puede producir diferentes efectos en el anfitrión, dependiendo de la activación de receptores de histamina específicos que difieren en sus patrones de expresión tisular. Particularmente, con respecto al CCR, se descubrió un incremento significativo de la actividad de la histidina descarboxilasa (HDC) en especímenes de tumores humanos extirpados en una serie de diez pacientes quirúrgicos con carcinoma colorrectal, lo que indica un papel significativo de la actividad enzimática de la HDC en el desarrollo de las células tumorales colorrectales (Garcia-Caballero y col., 1988). Por otro lado, se demostró que la deficiencia de HDC promueve el CCR asociado a la inflamación mediante acumulación de CMI CD11b<+>Gr-1<+>(Yang y col., 2011). En cuanto al H2R, la inhibición del H2R a través de su antagonista incrementó la supervivencia de los pacientes con CCR (Adams y Morris, 1994; Kelly y col., 1999).

[0043] Los inventores han descubierto que las bacterias productoras de histamina, tales comoL. reuteriATCC PTA-6475, protegían a ratonesHdc-/-

macho en un modelo de cáncer colorrectal asociado a la inflamación inducida por azoximetano/sulfato de dextrano sódico (AOM/DSS), como lo indica la disminución del número y tamaño de los tumores de colon valorados mediante la evaluación macroscópica y microscópica del colon, así como la obtención de imágenes por PET de animales vivos con<18>F-FDG. Mientras tanto, descubrimos que la maquinaria enzimática, la histidina descarboxilasa, debe estar presente en el microbioma intestinal para generar histamina como compuesto bioactivo, como lo indica la pérdida de efectos antioncógenos dehdcAmutante. Los estudios de citocinas (cantidades de proteínas en plasma y cantidades de ARNm en la mucosa colónica) mostraron una reducción de las citocinas asociadas a la inflamación/tumor mediante la administración de la cepa productora de histamina, pero no de la cepa no productora de histamina, coherentes con las observaciones fenotípicas.

[0044] También observamos un cambio potencial en la expresión de H2R en el colon de ratonesHdc-/-

. El tratamiento con AOM y DSS redujo la intensidad de H2R en comparación con los controles sanos y la administración deL. reuteriindujo la expresión de H2R. Esta observación sugirió una asociación entre la expresión de H2R y la inflamación o CCR. Cuando se trató a los ratones con AOM/DSS para la inducción del cáncer de colon, la expresión de H2R se redujo. Cuando se administraL. reuteri, se induce la expresión de H2R. Teniendo en cuenta que la administración dehdcAmutante también mostró un incremento de la expresión de H2R (no tan alto como el grupo deL. reuteriATCC PTA-6475) en comparación con los ratones de control positivo que recibieron AOM/DSS pero no bacterias,L. reuteripodría producir algunas sustancias además de la histamina que podrían inducir H2R.

[0045] Un objeto de la presente invención son las bacterias productoras de histamina y DagK para tratar y prevenir el cáncer colorrectal (de colon).

[0046] Otro objeto es utilizar ciertas bacterias para el suministro local de histamina como agonistas del receptor de histamina, posiblemente suministradas junto con una fuente específica de histidina.

[0047] En otra realización preferida, las cepas bacterianas seleccionadas se utilizan especialmente para pacientes hombres que padecen cáncer colorrectal.

[0048] En otra realización más, las cepas bacterianas seleccionadas se utilizan especialmente para pacientes hombres con tumores de colon o recto más grandes.

[0049] En otra realización, las cepas productoras de histamina se utilizan como adyuvantes para la radioterapia o la quimioterapia clásicas.

[0050] En la presente memoria se describe un producto que comprende las cepas productoras de histamina para minimizar la diarrea y otros trastornos gastrointestinales asociados con la radioterapia o la quimioterapia del cáncer y, al mismo tiempo, actuar como un adyuvante para mejorar tal tratamiento y reducir el cáncer dependiente de la histamina. Otra característica del cáncer colorrectal inducido por la AOM/DSS en ratonesHdc-/-

es la acumulación de CMI CD11b<+>Gr-1<+>en el bazo. Se ha observado que las CMI CD11b<+>Gr-1<+>se acumulan en gran medida en el bazo de ratones portadores de cáncer (Watanabe y col., 2008) con una expresión génica deficiente deHdc(Yang y col., 2011). Los inventores han descubierto que la administración de bacterias productoras de histamina reduce las CMI CD11b<+>Gr-1<+>, lo que confirma que la histamina exógena regula la diferenciación de las CMI CD11b<+>Gr-1<+>.

[0051] Basándonos en estas investigaciones, resumimos el mecanismo potencial de la probiosis deL. reuteriATCC PTA-6475 en el modelo murino de carcinogénesis asociada a la inflamación (Figura 8). La inyección intraperitoneal de AOM seguida del tratamiento con DSS en el agua potable indujo un cáncer de colon asociado a la inflamación, como lo indican los tumores colónicos visibles macroscópicamente, el incremento de las cantidades colónicas de KC, IL-22, IL-6, TNF e IL-1α según los datos de expresión génica, y el incremento de las cantidades de IL-6, IL-22 y KC en plasma. Cuando se alimentó a los ratones con una dieta que contenía histidina, laL. reuteri hdc+administrada a ratones por sonda orogástrica convirtió la L-histidina en histamina mediante la histidina descarboxilasa (HdcA) y exportó histamina a la luz mediante el antiportador de histidina/histamina (HdcP) (Thomas y col., 2012). La histamina derivada deL. reuteriactivó el receptor H2 de la histamina (H2R) en las células epiteliales y desencadenó las vías antioncógenas, como lo indica la supresión de la expresión génica de KC, IL-22, IL-6, TNF y IL-1α en el colon y la producción de IL-6, IL-22 y KC en el plasma. Por otro lado, la administraciónL. reuteriATCC PTA-6475 redujo la abundancia relativa de las CMI CD11b<+>Gr-1<+>en el bazo, y la reducción de las CMI CD11b<+>Gr-1<+>también contribuyó a un posible efecto antioncógeno.

[0052] L. reuteriATCC PTA-6475 pero nohdcAmutante atenúa la carcinogénesis del colonin vivo

[0053] Para examinar si la colonización deL. reuteriATCC PTA-6475 tiene una función antioncógena, utilizamos el tratamiento con OMA más DSS para inducir el cáncer de colon asociado a colitis en ratonesHdc-/-

BALB/c de doce semanas (Figura 1A). La gravedad de la oncogénesis colónica se evaluó 15 semanas después de la inyección de AOM según el número y el tamaño de los tumores colónicos. En el caso de los machos, los ratones de control negativo que recibieron solución salina tamponada (PBS) y agua potable, en lugar de AOM y DSS al 2 %, no desarrollaron tumores. Los ratones de control positivo que fueron expuestos a AOM/DSS y alimentados por sonda con medio MRS, pero que no recibieron bacterias exógenas, desarrollaron tumores colónicos. La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 en su fase exponencial redujo significativamente el número y el tamaño de los tumores colónicos, en comparación con el grupo de control positivo. Sin embargo, la administración dehdcAmutante no mostró tales efectos (Figura 1B~1C). Para las hembras, se observó un patrón similar. Los ratones de control negativo no produjeron tumores colónicos, y los ratones de control positivo desarrollaron tumores colónicos. La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 redujo significativamente el número de tumores colónicos grandes (>3 mm) en comparación con el grupo de control positivo, pero el número de tumores pequeños (<3 mm) no se redujo. La administración de una cepaL. reuteri hdcAmutante no redujo las cantidades de tumores colorrectales grandes ni pequeños (Figura 7).

[0054] El análisis histológico del colon en machos mediante tinción con H&E confirmó el efecto antioncógeno deL. reuteriATCC PTA-6475 natural que genera histamina. Los ratones de control negativo mostraron la histología colónica esperada, mientras que los ratones de control positivo mostraron evidencia de tumores de colon extensos. Los ratones tratados conL. reuteriATCC PTA-6475 presentaron una reducción en el tamaño y el número de tumores colónicos, en comparación con el grupo de control positivo, y la cepaL. reuteri hdcAmutante isogénica no presentó efectos similares (Figura 1D).

[0055] Las imágenes de PET respaldaron los efectos antioncógenos deL. reuteriATCC PTA-6475

[0056] Para analizar adicionalmente los posibles efectos antioncógenos deL. reuterien el modelo murino de cáncer de colon inducido por AOM/DSS, se utilizaron imágenes PET, una de las herramientas diagnósticas no invasivas más potentes, para hacer un seguimiento del funcionamiento de los órganos, antes de sacrificarlos (Figura 2A). Se usó [<18>F]FDG como trazador y su concentración dentro del cuerpo refleja la distribución de la captación y fosforilación de la glucosa (Brewer y col., 2008). Durante la oncogénesis colónica, la captación de FDG por parte de los linfocitos activados en el colon se puede detectar mediante la alta intensidad de la señal del trazador. En los ratones de control negativo, la señal de FDG se detectó mayoritariamente en la vejiga y la parte superior del tórax del ratón, áreas que se propusieron como sitios corporales “normales” donde se produce una captación y un metabolismo elevados de la glucosa (Galitovskiy y col., 2013). Se observaron trazas de señal de FDG en la región del colon, lo que indica una baja captación de glucosa en el colon en ratones sanos (Figura 2B~2C). En los ratones de control positivo, se observaron varios puntos calientes en el colon y la intensidad de la FDG en todo el colon del ratón se incrementó significativamente en comparación con el grupo de control negativo (Figura 2B~2C), lo que indica la detección de tumores colónicos y un incremento de la captación de glucosa en el colon de ratones que recibieron tratamiento con AOM más DSS y se sometieron a administración por sonda con medio MRS. Los ratones tratados conL.reuteriATCC PTA-6475 mostraron una reducción del número de puntos calientes en el colon e intensidades de FDG significativamente disminuidas en comparación con los controles positivos, lo que demuestra el efecto antioncógeno deL. reuteriATCC PTA-6475. Mientras tanto,L. reuteri hdcAmutante isogénica no presentó efectos similares y mostró un número incrementado de puntos calientes en el colon, además de un incremento significativo de la intensidad de la FDG, en comparación con los ratones tratados conL. reuteriATCC PTA-6475. Estos resultados indican que la ausencia de un gen de histidina descarboxilasa bacteriano intacto en el microbioma intestinal resulta en la pérdida de los efectos antioncógenos, coherente con los números y tamaños de colon observados.

[0058] Las concentraciones sistémicas de citocinas en el plasma murino se asociaron con los efectos antioncógenos deL. reuteri

[0060] Se ha comunicado que las citocinas proinflamatorias específicas contribuyen al desarrollo de la oncogénesis colónica al promover la formación de un microambiente que favorece el tumor (Landskron y col., 2014). Aprovechando un sistema Luminex (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), pudimos multiplexar (medir simultáneamente) analitos en una única microplaca utilizando pequeños volúmenes de muestra (25 µl). Los niveles de proteínas de dieciséis citocinas (Tabla 1) en el plasma se midieron utilizando cuatro kits de multiplexación de citocinas. Curiosamente, descubrimos que tres citocinas, incluidas KC, IL-22 e IL-6, mostraron un patrón similar (Figura 3): El tratamiento con AOM/DSS en ratonesHdc-/-

macho incrementó significativamente la producción de estas citocinas en el plasma en comparación con los ratones de control que recibieron PBS/H2O; La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 disminuyó significativamente la producción de estas citocinas, mientras queL. reuteri hdcAmutante isogénica, que carece de la capacidad de producir histamina, no disminuyó estas citocinas en ratones machoHdc-/-

tratados con AOM/DSS.

[0061] La KC comparte muchas propiedades funcionales con la IL-8 (Oquendo y col., 1989), de la que se ha comunicado que promueve el crecimiento, la progresión y la metástasis del cáncer de colon (Lee y col., 2012). También se demostró que la IL-22 promueve la invasión de células cancerosas gástricas (Fukui y col., 2014; Ji y col., 2014) y la pluripotencialidad del cáncer de colon (Kryczek y col., 2014). La IL-6 se ha considerado un regulador clave del desarrollo del cáncer colorrectal (Waldner y col., 2012) y los niveles altos de IL-6 en plasma se correlacionan con un mal pronóstico en una variedad de cánceres, incluido el cáncer de colon (Nagasaki y col., 2014). Basándose en estas evidencias comunicadas, los cambios de estas citocinas en el plasma de diferentes grupos de ratones en nuestro estudio están asociados y son coherentes con el fenotipo de la enfermedad: incremento de las citocinas asociadas a la inducción de CCR por la exposición a AOM/DSS en comparación con los controles sanos, disminución de las citocinas asociadas a la atenuación del CCR por la administración deL. reuteriATCC PTA-6475 productora de histamina, e incremento de las citocinas asociadas con la pérdida de los efectos antioncógenos porhdcAmutante no productor de histamina.

[0063] La expresión génica de las citocinas en la mucosa colónica se reguló mediante la administración deL. reuteri

[0064] Para investigar adicionalmente las asociaciones entre las citocinas y la gravedad del CCR, analizamos la expresión génica de citocinas seleccionadas (Tabla 2) en muestras de mucosa colónica mediante RT-qPCR utilizando la GAPDH como patrón interno, además de medir las cantidades sistémicas de citocinas en el plasma. La exposición a AOM/DSS indujo significativamente la expresión génica de las citocinas proinflamatorias KC, IL-22, IL-6, TNF e IL-1α en comparación con ratonesHdc-/-

macho sanos (Figura 4). El tratamiento conL. reuteriATCC PTA-6475 de ratones expuestos a AOM/DSS redujo significativamente la expresión génica relativa de estas citocinas, mientras queL. reuteri hdcAmutante isogénica que carecía de producción de histamina produjo un incremento de la expresión génica relativa de estas citocinas proinflamatorias en comparación con los ratones alimentados por sonda con bacterias naturales. La detección de otros ARNm de citocinas mediante qPCR produjo resultados indetectables (IL-17) o no hubo diferencias significativas entre los grupos (IL-12, IL-23 e IFN-γ).

[0066] La expresión de H2R se indujo por la administración deL. reuteri

[0068] La administraciónL. reuteriATCC PTA-6475 productora de histamina atenuó el CCR inducido por AOM/DSS en ratonesHdc-/-

macho, mientras quehdcAmutante que no produce histamina perdió tales efectos, lo que indica el importante papel de la histamina luminal en la atenuación del CCR. Sin embargo, la vía de señalización por la que la histamina puede ejercer sus efectos antiinflamatorios y anticarcinógenos no está clara. La histamina es una amina biogénica que ejerce diversas funciones fisiopatológicas a través de cuatro receptores de histamina (H1R, H2R, H3R y H4R) (O'Mahony y col., 2011), y la activación del H2R se ha asociado a efectos antiinflamatorios (Frei y col., 2013; Jutel y col., 2001; O'Mahony y col., 2011). Es más, nuestros estudios anteriores mostraron queL. reuteriATCC PTA-6475 atenúa la colitis inducida por TNBS mediante la activación del H2R. Por eso, en nuestro estudio actual, investigamos la expresión relativa del H2R en diferentes grupos de ratonesHdc-/-

macho mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos contra H2R. La expresión de H2R se detectó en el colon de ratonesHdc-/-

macho sanos, con intensidades relativamente altas en las criptas (Figura 5A). Curiosamente, la exposición a AOM/DSS redujo las intensidades relativas del H2R en el colon, en comparación con los controles sanos. Cuando los ratones que fueron expuestos a AOM/DSS recibieronL. reuteriATCC PTA-6475 oL. reuteri hdcAmutante isogénica, se observó un incremento de la expresión de H2R en comparación con el grupo de control que no recibió ninguna bacteria. La administración deL.reuteriATCC PTA-6475 produjo la mayor intensidad de H2R, lo que sugiere que la activación del H2R se puede inducir mediante microbios intestinales específicos y que la histamina puede desempeñar un papel importante en la atenuación del CCR. La reducción de H2R se asocia con el desarrollo de CCR en ratones expuestos a AOM/DSS y la inducción de H2R por la administración deL. reuteriATCC PTA-6475 se asocia con un CCR atenuado. Dado que la administración dehdcAmutante también incrementó las intensidades del H2R (aunque no tan altas como las de la cepa natural), parece que la administración deL. reuteria ratones puede producir una señal, además de la histamina, que puede inducir la expresión del H2R en el colon de ratón.

[0069] Sin embargo, cuando se investigó la expresión de H2R en el nivel de ARNm mediante RT-qPCR en la mucosa colónica, no se observaron diferencias significativas entre los grupos (Figura 5B). Esta observación indica que las diferentes cantidades de H2R en la superficie celular se deben a diferencias postranscripcionales en la producción y localización de proteínas.

[0070] L. reuteriATCC PTA-6475 reguló a la baja las CMI CD11b<+>Gr-1<+>en el bazo

[0071] La ausencia de histamina endógena conduce a un incremento de las CMI CD11b<+>Gr-1<+>y esto se asocia con la progresión del cáncer en mamíferos (Yang y col., 2011). Para evaluar si la administración deL. reuteriATCC PTA-6475 productora de histamina afecta a la diferenciación de las CMI, se realizó un análisis por citometría de flujo en las células derivadas de muestras de especímenes de médula ósea y bazo recogidas inmediatamente después de que se sacrificase a los ratonesHdc-/-

macho. El porcentaje de CMI CD11b<+>Gr-1<+>en el bazo se incrementó significativamente en los ratones expuestos a AOM/DSS en comparación con los controles sanos (Figura 6). La administración deL. reuteriATCC PTA-6475 en ratones expuestos a AOM/DSS disminuyó significativamente el porcentaje de CMI CD11b<+>Gr-1<+>en comparación con los ratones de control que solo recibieron medio (MRS). Estas observaciones son coherentes con los resultados fenotípicos de queL. reuteriATCC PTA-6475 atenuó el CCR inducido por AOM/DSS. Se demuestra que la administración deL. reuteriATCC PTA-6475 productora de histamina afecta a la diferenciación de las CMI.

[0072] L. reuteriATCC PTA-6475, ATCC PTA-4659 y DSM 32273 expresan en gendagK

[0073] L. reuteriATCC PTA-6475 natural yhdcAmutante junto conL. reuteriDSM 32273 yL. reuteriATCC PTA-4659 fueron capaces de expresar el gendagK. El gendagKse expresó de forma muy elevada durante la fase de elongación de la bacteria. Otras cepas bacterianas, incluidas otras cepas deL. reuterique expresan el gendagK, se pueden detectar utilizando los métodos como se describe en la presente memoria. Este gendagKcarece de una cepa DSM 17938 deL. reuterique tampoco puede producir histamina.

[0074] Secreción/liberación de DagK por parte deL. reuteriATCC PTA-6475

[0075] La proteína DagK expresada por el gendagKenL. reuteriATCC PTA-6475 se descubrió en el sobrenadante del medio de cultivo tras la eliminación de las células bacterianas intactas. En consecuencia,L. reuteriATCC PTA-6475 es capaz de producir y secretar (o de otras formas liberar) DagK, para lograr de este modo un efecto extracelular de DagK. La DagK es una enzima que cataliza la conversión de diacilglicerol (DAG) en ácido fosfatídico (PA) utilizando trifosfato de adenosina (ATP) como fuente de fosfato. En las células no estimuladas, la actividad de DagK es baja, lo que permite que se utilice DAG para la biosíntesis de glicerofosfolípidos. Sin embargo, al activarse el receptor de la vía de los fosfoinosítidos, la actividad de la DagK se incrementa, lo que impulsa la conversión de DAG en PA. La conversión de DAG en PA agota el DAG, que de cualquier otro modo podría activar la proteína cinasa C (PKC).

[0076] La señalización secuencia abajo de H1R es interrumpida por la síntesis de DagK enL. reuterial inhibir el DAG lipídico implicado en la señalización. En consecuencia, las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina y DagK, según se describe en la presente memoria, suprimen los efectos proinflamatorios de la histamina. Esto, a su vez, solo permite la activación del H2R por la histamina producida por las cepas bacterianas. Tal activación de H2R promueve los síntomas antiinflamatorios.

[0077] Por lo tanto, una cepa bacteriana del ácido láctico capaz de producir tanto histamina como DagK provoca una supresión de la señalización secuencia abajo del H1R, pero induce la activación del H2R. Esto, a su vez, suprime los efectos proinflamatorios de la histamina y promueve los síntomas antiinflamatorios. Las cepas bacterianas con expresión génica activa dedagKpueden producir y opcionalmente secretar, o liberar de otras formas, DagK.

[0078] Un aspecto de las realizaciones se refiere a una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo y la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina expresa un gen que codifica una DagK y produce histamina y produce DagK. Las cepas bacterianas lácticas productoras de histamina de las realizaciones según se describe en la presente memoria tienen características beneficiosas que se pueden aprovechar en relación con pacientes con cáncer colorrectal o pacientes que tienen riesgo de desarrollar cáncer colorrectal. Esto significa que las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina de las realizaciones se pueden utilizar para tratar el cáncer colorrectal en un paciente.

[0079] El tratamiento con cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina se podría combinar con otros tratamientos del cáncer, incluidos, aunque no de forma limitativa, la radioterapia, la quimioterapia y la cirugía. En tal caso, las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina se pueden utilizar como adyuvantes en un tratamiento del cáncer. En consecuencia, otro aspecto de las realizaciones se refiere a una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso como adyuvante en el tratamiento del cáncer colorrectal. El tratamiento del cáncer se selecciona de entre un grupo que consiste en radioterapia y quimioterapia. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo y la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina expresa un gen que codifica una DagK y produce histamina y produce DagK.

[0080] Las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina de las presentes realizaciones también tienen, además de las propiedades de tratamiento del cáncer en sí,propiedades beneficiosas para los pacientes sometidos o que experimentan un tratamiento del cáncer, en particular pacientes sometidos a radioterapia y/o quimioterapia. En particular, las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina son útiles para combatir o tratar los trastornos gastrointestinales asociadas con, tales como las causadas por, el tratamiento del cáncer.

[0081] En un ejemplo de la descripción, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina se utiliza en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de la diarrea asociada con el tratamiento del cáncer. En una realización particular, el tratamiento del cáncer es un tratamiento del cáncer para tratar el cáncer colorrectal, es decir, el paciente sometido al tratamiento del cáncer es un paciente que padece cáncer colorrectal.

[0082] Sin embargo, la administración de las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina al paciente no tiene por qué provocar necesariamente un tratamiento del 100 % del cáncer colorrectal en el paciente, es decir, resultar en un paciente sin ningún tumor detectable. Por lo tanto, las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina se podrían utilizar para inhibir o reducir el cáncer colorrectal en el paciente. Por ejemplo, los datos experimentales que se presentan en la presente memoria indican que las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina son capaces de disminuir el número de tumores y disminuir los tamaños de los tumores. En consecuencia, la inhibición o reducción del cáncer colorrectal comprende, en realizaciones, disminuir el número de tumores en el paciente, disminuir el tamaño de los tumores en el paciente o disminuir el número y el tamaño de los tumores en el paciente. Por lo tanto, en una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina se utiliza para reducir el número y/o el tamaño de los tumores en un paciente que padece cáncer colorrectal.

[0083] Las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina de las realizaciones se podrían utilizar también, o alternativamente, en la profilaxis, es decir, para reducir el riesgo de que un paciente desarrolle cáncer colorrectal. El paciente podría ser, por ejemplo, un paciente que tiene una predisposición al cáncer colorrectal, tal como una predisposición genética o hereditaria al cáncer colorrectal. Las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina se podrían administrar entonces a tal paciente para prevenir o al menos reducir el riesgo de que el paciente padezca cáncer colorrectal.

[0084] Las cepas de bacterias del ácido láctico productoras de histamina de las realizaciones también tienen características beneficiosas para los pacientes que han padecido cáncer colorrectal y que han recibido tratamiento contra el cáncer colorrectal. De este modo, las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina se pueden utilizar para reducir el riesgo de recaída del cáncer colorrectal.

[0085] En una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina se utiliza en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída de un cáncer colorrectal asociado a la inflamación.

[0086] El paciente es preferiblemente un paciente mamífero y más preferiblemente un paciente humano. En una realización particular, el paciente es un paciente humano hombre. Por lo tanto, en esta realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina se utiliza en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal en un paciente hombre.

[0087] Según la invención, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo. En una realización particular, este operón de histidina comprende, tal como consiste en, un gen antiportador de histidina/histamina (hdcP), un gen de histidina descarboxilasa piruvilo de tipo A (hdcA) y un gen de histidina descarboxilasa piruvilo de tipo B (hdcB). Por lo tanto, en una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende el genhdcP, el genhdcAy el genhdcB.

[0088] Según la invención, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina es capaz de producir una diacilglicerol cinasa (DagK). Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria muestran que puede ser ventajoso utilizar una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina y productora de DagK en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento del cáncer colorrectal o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal.

[0089] La producción de DagK tiene efectos beneficiosos en términos de suprimir la señalización secuencia abajo del H1R y, de este modo, suprimir los efectos inflamatorios que, de cualquier otro modo, podría causar la histamina. En consecuencia, la producción tanto de histamina como de DagK redirige la acción de la activación de H1R a la de H2R, lo que a su vez promueve los efectos antiinflamatorios de la histamina.

[0091] En una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina es una cepa deLactobacillus reuteriproductora de histamina. En una realización particular, la cepa deL. reuteriproductora de histamina esL. reuteriATCC PTA-6475. En otra realización particular, la cepa deL. reuteriproductora de histamina esL. reuteriATCC PTA-4659. En una realización particular adicional, la cepa deL. reuteriproductora de histamina esL. reuteriDSM 32273. En otra realización más, la cepa deL. reuteriproductora de histamina es una mezcla de al menos dos cepas deL. reutericapaces de producir histamina y, opcionalmente y de forma adicional, capaces de producir DagK. Por ejemplo, se puede utilizar una mezcla deL. reuteriATCC PTA-6475 y ATCC PTA-4659, una mezcla deL. reuteriATCC PTA-6475 y DSM 32273, una mezcla deL. reuteriATCC PTA-4659 y DSM 32273 o una mezcla deL. reuteriATCC PTA-6475, ATCC PTA-4659 y DSM 32273.

[0093] En una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina es capaz de suprimir la producción de al menos una citocina asociada al cáncer seleccionada de entre un grupo que consiste en el ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL1), la interleucina 22 (IL-22) y la interleucina 6 (IL-6). El CXCL1 también se conoce como oncogén GRO1, GROα, KC, proteína 3 activadora de neutrófilos (NAP-3) y actividad estimulante del crecimiento del melanoma, alfa (MGSA-α) en la técnica. Se conoce que todas estas tres citocinas están implicadas en el cáncer colorrectal. En consecuencia, la supresión de la producción de estas citocinas tendrá efectos beneficiosos en términos de suprimir el crecimiento, la progresión y la metástasis del cáncer de colon (debido a la supresión de CXCL1), la supresión de la invasión de las células cancerosas gástricas y la pluripotencialidad del cáncer de colon (debido a la supresión de IL-22) y la mejora del pronóstico del cáncer de colon (debido a la supresión de IL-6). La supresión de la producción de estas quimiocinas se puede inducir de diversas maneras. Por ejemplo, la transcripción de los genes de las citocinas se puede suprimir o reducir mediante las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina. Alternativamente o de forma adicional, la traducción de las moléculas de ARNm de citocinas se puede suprimir o reducir mediante las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina. También, o de forma adicional, podrían estar implicados efectos postraduccionales para suprimir la producción de estas citocinas. Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria indican que las cepas bacterianas del ácido láctico productoras de histamina de las realizaciones reducen los niveles de proteínas de estas citocinas en el plasma y reducen las expresiones génicas relativas de estas citocinas.

[0095] En una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina es capaz de reducir la abundancia de células mieloides inmaduras (CMI) CD11b<+>Gr-1<+>en el bazo. Las CMI CD11b<+>Gr-1<+>se asocian con la progresión del cáncer en mamíferos. En consecuencia, reducir la abundancia de estas CMI CD11b<+>Gr-1<+>, como se muestra en los datos experimentales, tendrá efectos beneficiosos con respecto a la supresión de la progresión del cáncer.

[0097] Un aspecto adicional de las realizaciones se refiere a un método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal. El método comprende el cribado de bacterias del ácido láctico para revelar la presencia de un operón de histidina activo y la presencia de la expresión de un gen que codifica una DagK. El método también comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que produce histamina y produce DagK.

[0099] Por lo tanto, este aspecto de las realizaciones se refiere a un método que se puede utilizar para seleccionar e identificar cepas bacterianas del ácido láctico que son adecuadas para utilizar en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal. Se identifica que tales cepas bacterianas del ácido láctico seleccionadas tienen un operón de histidina activo y producen histamina y producen DagK como se describe en la presente memoria.

[0101] La presencia de un operón de histidina activo se puede decidir basándose en la detección de la presencia de un gen antiportador de histidina/histamina, un gen de histidina descarboxilasa piruvilo de tipo A y un gen de histidina descarboxilasa piruvilo de tipo B, tal como la presencia del genhdcP, el genhdcAy el genhdcB. Alternativamente, la presencia de un operón de histidina activo se puede decidir basándose en la detección de la producción o presencia de una proteína antiportadora de histidina/histamina, una proteína histidina descarboxilasa piruvilo de tipo A y una proteína histidina descarboxilasa piruvilo de tipo B, tal como la producción o presencia de las proteínas HdcP, HdcA y HdcB.

[0103] Según la invención, el cribado de las bacterias del ácido láctico comprende el cribado de las bacterias del ácido láctico para revelar la presencia del operón de histidina activo y una capacidad adicional de producir una diacilglicerol cinasa (DagK). En esta realización, seleccionar la cepa bacteriana del ácido láctico comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que produce histamina y produce DagK.

[0104] Por lo tanto, en una realización, la cepa bacteriana del ácido láctico no solo comprende el operón de histidina activo para producir histamina, sino que también tiene la capacidad de producir DagK. La capacidad de producir DagK se puede evaluar detectando la presencia de un gen que codifica una diacilglicerol cinasa, tal como el gendagK, en la cepa bacteriana del ácido láctico, en el genoma del mismo o en un casete de expresión, tal como en un plásmido. Alternativamente, la capacidad de producir DagK se podría determinar detectando la presencia de la proteína diacilglicerol cinasa, tal como en el citosol de la bacteria o, si de forma adicional la cepa bacteriana es capaz de secretar DagK, en el medio de cultivo en el que se cultiva la cepa bacteriana.

[0105] En un ejemplo de la descripción, el método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal comprende identificar y seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico distinta deL. reuteriATCC PTA-4659 y ATCC PTA-6475.

[0106] Un ejemplo de la descripción se refiere a un método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer. El método comprende el cribado de bacterias del ácido láctico para revelar la presencia de un operón de histidina activo y la capacidad de producir una diacilglicerol cinasa (DagK). El método también comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que es capaz de producir histamina y de producir DagK.

[0107] En este ejemplo de la descripción, la cepa bacteriana del ácido láctico seleccionada no tiene que utilizarse necesariamente para prevenir, inhibir, tratar o reducir el riesgo de recaída del cáncer colorrectal. En claro contraste, la capacidad de producir no solo histamina sino también una diacilglicerol cinasa también será beneficiosa en otros tipos de cáncer además del cáncer colorrectal, incluidos el melanoma, el cáncer de mama, el cáncer de páncreas y similares.

[0108] En un ejemplo de la descripción, seleccionar la cepa bacteriana del ácido láctico comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída de un cáncer asociado a la histamina seleccionado de entre un grupo que consiste en cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama y cáncer de páncreas, identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que es capaz de producir histamina y producir DagK.

[0109] En un ejemplo de la descripción, el método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer comprende identificar y seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico distinta deL. reuteriATCC PTA-4659 y ATCC PTA-6475.

[0110] Otro ejemplo más de la descripción se refiere a un método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de una afección inflamatoria. El método comprende el cribado de bacterias del ácido láctico para revelar la presencia de un operón de histidina activo y la capacidad de producir una diacilglicerol cinasa (DagK). El método también comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de una afección inflamatoria, identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que es capaz de producir histamina y producir DagK. Una cepa bacteriana del ácido láctico capaz de producir tanto histamina como diacilglicerol cinasa tendrá, cuando se administre a un paciente, efectos beneficiosos en términos de prevención, reducción o tratamiento de diversas afecciones inflamatorias. La DagK producida suprimirá las propiedades inflamatorias de la histamina al suprimir la vía o señalización secuencia abajo del H1R. En consecuencia, la histamina puede ejercer propiedades antiinflamatorias debido a la activación del H2R.

[0111] Los pacientes que padecen cáncer colorrectal muestran ausencia de maduración de las CMI debido a la deficiencia de histamina. En consecuencia, puede ser beneficioso suplementar a estos pacientes con histamina a niveles biológicos. Sin embargo, estos pacientes también muestran una respuesta proinflamatoria incrementada y administrarles una molécula de histamina podría conducir a efectos adversos. Por lo tanto, el mejor planteamiento terapéutico podría ser proporcionar una cepa bacteriana beneficiosa que tenga la capacidad de suministrar histamina exógena y también suprimir las respuestas inflamatorias mediante la inhibición de la señalización proinflamatoria. Por lo tanto, una cepa bacteriana del ácido láctico capaz de producir tanto histamina como DagK es de gran interés para tratar los trastornos proinflamatorios con disfunción mieloide.

[0112] Enun ejemplo de la descripción, seleccionar la cepa bacteriana del ácido láctico comprende seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de una afección inflamatoria seleccionada de entre un grupo que consiste en colitis, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable, diverticulosis, gingivitis, mastitis y vaginitis, identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que es capaz de producir histamina y producir DagK.

[0113] Por lo tanto, las afecciones inflamatorias descritas anteriormente son ilustrativas, pero son ejemplos preferidos de afecciones inflamatorias que se pueden prevenir, inhibir o tratar mediante cepas bacterianas del ácido láctico identificadas y seleccionadas según se describe en la presente memoria.

[0114] En un ejemplo de la descripción, el método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de una afección inflamatoria comprende identificar y seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico distinta deL. reuteriATCC PTA-4659 y ATCC PTA-6475.

[0115] Otros aspectos adicionales de las realizaciones se refieren aLactobacillus reuteriDSM 32273, que es una cepa deL. reuteriproductora de histamina y DagK. La cepa DSM 32273 deLactobacillus reuterise depositó según el Tratado de Budapest ante la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstrasse 7B, D - 38124 Braunschweig) el 8 de marzo de 2016. Esta nuevaL. reuteriDSM 32273 se puede utilizar como medicamento. Por ejemplo,L. reuteriDSM 32273 se puede utilizar en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal. LaL. reuteriDSM 32273 también se puede utilizar en la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de una afección inflamatoria. En una realización particular, la afección inflamatoria se selecciona de entre un grupo que consiste en colitis, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable, diverticulosis, gingivitis, mastitis y vaginitis. Otros usos adicionales deL. reuteriDSM 32273 incluyen la mejoría de los cólicos del lactante, el alivio del eccema, la reducción de los episodios de enfermedades profesionales y la supresión de la infección por Heliobacter pylori.

[0116] Las realizaciones también incluyen el uso de una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para la fabricación de un medicamento para la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal, y el uso de una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para la fabricación de un adyuvante en un tratamiento del cáncer seleccionado de entre un grupo que consiste en radioterapia y quimioterapia. En estas realizaciones, la cepa bacteriana láctica productora de histamina también es capaz de producir y, opcionalmente, secretar una diacilglicerol cinasa.

[0117] La descripción proporciona un método para la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal en un sujeto. El método comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina. La descripción también proporciona un método para la profilaxis, la inhibición o el tratamiento de un trastorno gastrointestinal asociado a un tratamiento del cáncer seleccionado de entre un grupo que consiste en radioterapia y quimioterapia. Comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina a un paciente sometido o que se va a someter al tratamiento del cáncer. La cepa bacteriana láctica productora de histamina también es capaz de producir y, opcionalmente, secretar una diacilglicerol cinasa. El paciente es preferiblemente un paciente mamífero y más preferiblemente un paciente humano, tal como un paciente humano hombre.

[0118] Se elige un modo apropiado de administración y formulación de las cepas dependiendo del sitio en el que se desee la producción local de histamina y DagK. Se prefiere el modo de administración oral; sin embargo, para algunos tratamientos, también será apropiado la forma tópica u otra forma de administración local en la piel, recto, vagina o encías, o bien la inyección intravenosa o intramuscular será apropiada.

[0119] Se pueden utilizar mezclas dietarias que comprenden histidina para garantizar la presencia de histidina y, de este modo, incrementar la eficacia de las bacterias. La histidina se puede administrar por sí sola o junto con la bacteria. Una posibilidad para garantizar el suministro de histidina a las bacterias es comer alimentos ricos en histidina, que incluyen, aunque no de forma limitativa, proteína de soja, queso, huevos, pollo y cerdo.

[0120] Ejemplos

[0121] Ejemplo 1

[0122] Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

[0123] Para la colonización en los ratones, se utilizaronL. reuteriATCC PTA 6475 (depositada según el Tratado de Budapest en la ATCC-American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, EE. UU.) el 21 de diciembre de 2004) y suhdcAmutante como se describe anteriormente (Thomas y col., 2012). Ambas cepas se cultivaron a 37 °C en medios deMan, Rogosa, Sharpe (Difco, Franklin Lakes, NJ) en una estación de trabajo anaerobia (MACS MG-500, Microbiology International, Frederick, MD) provista de una mezcla de CO<2>al 10 %, H<2>al 10 % y N<2>al 80 %.

[0124] Animales

[0125] Los ratonesHdc-/-

BALB/c fueron proporcionados originalmente por Timothy C. Wang (Universidad de Columbia) y se rederivaron en el Baylor College of Medicine. Los ratonesHdc-/-

rederivados se mantuvieron en condiciones exentas de agentes patógenos específicos (SPF) en el Texas Children' Hospital. Los ratones se mantuvieron en jaulas con filtro superior (5 ratones por jaula) y tuvieron libre acceso a agua destilada y a la dieta PicoLab Rodent 50IF/6F. Todos los experimentos con ratones se realizaron en una instalación para animales SPF, según un protocolo para ratones aprobado por un Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine, Houston, TX.

[0126] Preparación de bacterias y administración a ratones

[0127] Las cepas y condiciones de cultivo deL. reuterise describieron anteriormente. Las bacterias se recolectaron en una fase exponencial (5,5 horas en un medio MRS con una OD<600 nm>inicial = 0,03), se centrifugaron a 2500 × g durante 4 minutos y el sedimento bacteriano se resuspendió en un medio MRS estéril para la alimentación de los animales. Todas las cepas deL. reuterise prepararon frescas antes de la administración a los ratones. Cada ratón recibió 5×10<9>UFC de bacterias en 0,2 ml de MRS o medio MRS solo como control mediante alimentación por sonda orogástrica. La frecuencia de administración de las bacterias fue una vez al día durante siete días antes de la inyección de AOM y una vez cada tres días después de eso durante 15 semanas, con una pausa cuando los ratones estuvieron expuestos a DSS.

[0128] Inducción del cáncer de colon en ratones BALB/c

[0129] A las 12 semanas de edad, los ratones del grupo de control positivo y los grupos tratados con bacterias recibieron una dosis única del carcinógeno colónico genotóxico AOM (12,5 mg por kg de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal. Se expuso a estos ratones a dos ciclos de DSS al 2 % (p/v) en agua potable durante 6 días, con un ciclo inmediatamente después de la inyección de AOM, seguido de un período de recuperación con agua potable durante dos semanas antes del segundo ciclo. Los ratones del grupo de control negativo recibieron una dosis de solución salina tamponada (PBS) en lugar de AOM y agua potable.

[0130] Valoración de tumores y preparaciones de tejidos

[0131] Quince semanas después de la inyección de AOM, los ratones se sacrificaron y los especímenes se recogieron de la siguiente manera. Se extrajo sangre de ratones sedados mediante punción cardíaca en tubos de recogida de muestras de sangre con EDTA K<2>(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ), y se centrifugó a 17000 × g durante 10 minutos a 4 °C para aislar el plasma. Se extirpó cuidadosamente el tubo digestivo y se recolectó el contenido de las luces del íleon, el ciego y el colon y se ultracongeló rápidamente en nitrógeno líquido. Se extirparon los cólones de los ratones y se abrieron longitudinalmente, y el número y el tamaño de los tumores se contaron y se midieron con enmascaramiento. La mucosa intestinal se raspó con la hoja de un bisturí y se almacenó en RNALater (Ambion, Austin, TX) para analizar los niveles de expresión del ARNm en el futuro. Todas las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se analizaron. Los intestinos de los ratones se fijaron en formol al 10 %, se incluyeron en parafina y se seccionaron con un micrótomo en secciones de 5 µm. Los tejidos seccionados se utilizaron para estudios histológicos e inmunohistoquímicos dirigidos a la expresión de H2R utilizando anticuerpos específicos (Alomone Labs, Jerusalem, Israel and Abcam plc, MA, EE. UU.). Las muestras de bazo de ratón se recogieron inmediatamente después de sacrificar los ratones. Estas muestras se utilizaron para estudios de citometría de flujo.

[0132] Análisis estadístico

[0133] El análisis bioestadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism (versión 5) (GraphPad Inc., La Jolla, CA). Para las variables numéricas que se ajustaban a la distribución normal (determinadas mediante el ensayo de Kolmogorov-Smirnov), los datos se presentaron como medias aritméticas con desviaciones estándar y los diferentes grupos se compararon con la prueba de la t (dos grupos) o ANOVA unidireccional (más de dos grupos). De cualquier otro modo, los datos se presentaron como gráficos de cajas y bigotes que muestran los valores de la mediana, los percentiles 10 y 90 o gráficos de dispersión que muestran los valores de la mediana. Los diferentes grupos se compararon mediante una prueba de la U de Mann-Whitney no paramétrica (dos grupos) o una prueba de Kruskal-Wallis. Las diferencias entre los grupos se consideraron significativas en*P<0,05, **P < 0,01, ***p < 0,001.

[0134] Ejemplo 2

[0135] Preparaciones como se describe en el Ejemplo 1.

[0136] Análisis por citometría de flujo

[0137] Las células derivadas de la médula ósea de los fémures y las tibias de los ratones de cada grupo se lavaron inmediatamente con DMEM helado (ATCC, cat.30-2002) que contiene FBS al 10 %. A este procedimiento le siguió la adición de un tampón de lisis de glóbulos rojos para agotar los glóbulos rojos (BD Biosciences). Se extirparon los bazos y se almacenaron en DMEM helado (ATCC, cat.30-2002) con FBS al 10 %. A esta etapa le siguió el aislamiento de las células del bazo utilizando portaobjetos de vidrio estériles y la adición de un tampón de lisis de RBC a las células aisladas. Las suspensiones de células sueltas se prepararon filtrando las células a través de tamices filtrantes de 40 µm. Para el análisis por citometría de flujo, las suspensiones de células sueltas se tiñeron con anticuerpos [1 µl de anticuerpos contra Gr-1 conjugados con APC-Cy7 (BD Pharmingen, cat. 557661) y 5 µl de anticuerpo contra CD11b conjugado con FITC (BD Pharmingen, cat.557396)] durante 30 minutos en hielo, en la oscuridad y evaluadas mediante citometría de flujo multicolor utilizando un analizador de células BD FACSCanto, y los datos se recopilaron con el software FACSdiva (BD Biosciences). Los datos acumulados se analizaron con el software FlowJo V10 (FlowJo, LLC). Ejemplo 3

[0138] Preparaciones como en el Ejemplo 1.

[0139] Medición de citocinas mediante inmunoensayo multiplex en plasma murino

[0140] Las concentraciones de IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A, KC, TNF, IL-21, IL-22 y IL-23 murinos en el plasma se midieron utilizando kits multiplex de citocinas (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), véase la Tabla 1. La cuantificación de las citocinas se realizó utilizando el sistema Luminex (Austin, TX, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se descongelaron por completo 25 µl de muestras de plasma recogidas anteriormente de cada ratón y se diluyeron con la misma cantidad de tampón de ensayo proporcionada en los kits. Los ensayos se realizaron por duplicado con enmascaramiento. Se revisaron los informes generados automáticamente por el software MILLIPLEX<®>Analyst 5.1 y solo se tuvieron en cuenta las citocinas que superaban valor del límite de detección y estaban por debajo del valor de saturación.

[0141] Tabla 1. Citocinas medidas en los cuatro kits multiplex para el ensayo Luminex.

[0144]

[0146] Ejemplo 4

[0147] Preparaciones como en el Ejemplo 1.

[0148] Niveles de ARNm de citocinas y receptores de histamina en la mucosa colónica

[0149] Para cuantificar los niveles relativos de expresión de ARNm del interferón (IFN)-y, el factor de necrosis tumoral (TNF), la interleucina (IL)-6, IL-12, IL-23, IL-17, IL-18, Il-22, IL-4, KC y el receptor de histamina H2 (H2R), se extrajo el ARN de las muestras de la mucosa colónica utilizando el minikit miRNeasy<®>(Qiagen, Hilden). Se sometió a transcripción inversa un µg de ARN a ADNc monocatenario utilizando el kit de síntesis de la primera cadena de ADNc RevertAid H Minus (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Se realizó PCR con retrotranscripción en tiempo real (RT) utilizando un sistema de PCR en tiempo real (Stratagene). La mezcla de reacción de RT-PCR (ajustada con H<2>O hasta un volumen total de 25 μl) contenía 1 μl de ADN molde, 12,5 μl de mezcla maestra de PCR Power SYBR Green (ABI, Life Tech) y 0,5 μl de los respectivos cebadores (10 μM cada uno). Los cebadores directos e inversos utilizados para la cuantificación de IFN-γ, IL-12, IL-17, TNF-α, IL-6, IL-23, IL-18 y IL-4 se describieron anteriormente (Ganesh y col., 2012) y los cebadores para otros genes se muestran en la Tabla 2. Se normalizaron los niveles relativos de expresión génica diana de ARNm (Relación = [(E<diana>)<dCPdiana (Control-Muestra)>] / [(E<ref.>)<dCPref. (Control-Muestra)>]) con respecto al gen constitutivo, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), y se utilizaron como referencia. Posteriormente, los valores de expresión génica de H2R y citocinas de la mucosa intestinal del grupo de control se establecieron en 1,0 y se utilizaron como calibrador para identificar la diferencia relativa de modificaciones del ARNm entre el grupo de control negativo (MRS/PBS-H2O), el grupo de control positivo (MRS/AOM-DSS), el grupo tratadoL. reuteriATCC PTA-6475(L. reuteri6475/AOM-DSS) y el grupo tratado conL. reuteri hdcAmutante isogénica(hdcAmutante/AOM-DSS). Tabla 2. Cebadores y sondas utilizados para los estudios de expresión génica.

[0152]

[0153] Ejemplo 5

[0154] Preparaciones como en el Ejemplo 1.

[0155] Imágenes de PET de ratones vivos

[0156] La exploración PET/TC se realizó 15 semanas después de la inyección de AOM, justo antes de sacrificar a los ratones como se describe (Brewer y col., 2008) con modificaciones minoritarias. En resumen, se anestesió a los ratones con isoflurano y recibieron 200 µCi de<18>F-FDG mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Una hora más tarde, estos ratones recibieron 200 µl de MD-Gastroview por vía rectal a través de un catéter de 3,5 F inmediatamente antes del inicio del escaneo. Se realizó una tomografía computarizada (TC) durante 10 minutos seguida de una PET durante 20 minutos utilizando el sistema multimodal PET/TC Inveon (Siemens, Alemania). Los ratones se mantuvieron sedados durante el proceso de escaneo mediante la inhalación constante de isoflurano. Las imágenes se registraron y los valores de captación estandarizados (SUV) de FDG se analizaron con enmascaramiento utilizando el software Inveon Research Workplace (Siemens, Alemania). Las imágenes 2D de ratones se generaron mediante el software OsiriX Imaging (Pixmeo, Suiza).

[0157] Ejemplo 6

[0158] Cuantificación de la expresión génica de ARNm dedagKmediante qRT-PCR

[0159] Se cultivaronLactobacillus reuteriATCC PTA-6475 natural,L. reuteri6475hdcAmutante,L. reuteriATCC PTA-4659 natural (depositadas según el Tratado de Budapest ante la ATCC-American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, EE. UU.) el 11 de septiembre de 2002) yL. reuteriDSM 17938 natural (depositada según el Tratado de Budapest ante la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroeder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) el 30 de enero de 2006) en medio MRS durante la noche a 37 °C y se cultivaron en condiciones estrictamente anóxicas con N<2>/ CO<2>(80/20; v/v) como fase gaseosa. Se incubaron 100 µl de cultivo recién preparado en 10 ml de medio definido para Lactobacillus 4 (LDM4). Los cultivos se mantuvieron en minibiorreactores a 37 °C en condiciones anóxicas estrictas. Se recogieron las muestras a las 3 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas. El sedimento bacteriano se obtuvo tratando el cultivo a 6000 × g durante 10 min a 4 °C. Se trató el sedimento con ARNasa. El ARNm de las células bacterianas se extrajo con el kit de separación Trizol. Se utilizaron 500 ng de ARNm de cada grupo para convertir el ARNm en ADNc. El ADNc tratado se diluyó 1:2 y se usó para realizar la qRT-PCR. Se utilizó qRT-PCR con Stratagene Mx3000p (Agilent Technologies GmbH, EE. UU.) para la recolección de datos de amplificación y fluorescencia. La mezcla maestra consistió en 12,5 µl de Power SYBR Green 2000 (ABI systems, EE. UU.), 0,5 µl de cada cebador (10 µM), 1 µl de muestra y se ajustó con agua hasta un volumen final de 25 µl por pocillo. Después de la amplificación por PCR, se comprobó la especificidad de los cebadores inspeccionando la curva de fusión y determinando el tamaño del amplicón mediante electroforesis en gel de agarosa (1 %). Se normalizaron los niveles relativos de expresión génica diana de ARNm (Relación = [(E<diana>)<dCPdiana(control-muestra)>] / [(E<ref.>)<dCPref. (control-muestra)>]) con respecto al gen constitutivorpoBy se utilizaron como referencia. Posteriormente, el ARNm obtenido a partir de cultivos de 3 horas de cada bacteria se estableció en 1,0 y se usó como calibrador para identificar la diferencia relativa de modificaciones del ARNm de la misma cepa bacteriana en diferentes puntos temporales como 6 h, 24 h y 48 h deL. reuteriATCC PTA-6475, ATCC PTA-4659 y DSM 17938.

[0160] La Figura 9 ilustra los resultados de los experimentos de expresión génica dedagK. La figura muestra un incremento de la expresión dedagKtanto porL. reuteriATCC PTA-6475 natural como conhdcAmutante junto conL.reuteriATCC PTA-4659. Sin embargo,L. reuteriDSM 17938, que no puede producir histamina, también carecía de expresión dedagK. Curiosamente, la expresión de ARNm dedagKse expresó de manera muy elevada durante la fase de elongación de la bacteria. A partir de los experimentos de repetición, se seleccionaron puntos temporales de incubación de 12 horas, ya que mostraron una expresión similar a la de 6 horas.

[0161] Ejemplo 7

[0162] LC-MS/MS para detectar la proteína DagK en los sobrenadantes de cultivos bacterianos

[0163] Según la bibliografía, se cree que DagK tiene isoformas solubles en bacterias grampositivas. Planteamos la hipótesis de que la DagK es liberada porL. reuteriATCC PTA-6475 e interactúa con la señalización lipídica del epitelio intestinal del anfitrión y promueve el comportamiento antiinflamatorio en circunstancias inflamatorias junto con la liberación de histamina. Cuando mutamos el gendagKenL. reuteriATCC PTA-6475 y se colonizó a nuestros ratones axénicos (GF) conL. reuteriATCC PTA-6475 con DAGK mutante, no observamos una supresión de IL-6 ni IL-1α como la que observamos en los ratones axénicos colonizados conL. reuteriATCC PTA-6475 natural. Los niveles basales de citocinas proinflamatorias se suprimieron significativamente. Esto nos llevó a la conclusión de queL. reuteriATCC PTA-6475 necesita histamina para la activación de H1R y H2R. Sin embargo, la señalización secuencia abajo del H1R es interrumpida por la síntesis de DagK enL. reuteri, al inhibir el DAG lipídico implicado en la señalización y, de este modo, suprimir el efecto proinflamatorio de la histamina. Esto solo permite la activación del H2R por la histamina derivada deL. reuteriy se conoce que la activación del H2R promueve los síntomas antiinflamatorios.

[0164] Para que la dagK muestre algún efecto positivo en la respuesta inmunitaria del anfitrión, se debe expresar el lípido DAG del anfitrión. Para que el DAG se active, la señalización H1R debe estar activada. Por eso, cuando mutamosdagKenL. reuteriy se colonizó a los ratones, no observamos una supresión de las citocinas proinflamatorias. Esto se confirmó de forma adicional con la activación de PKC y PKA. Además, no vimos ninguna diferencia en la expresión de H1R ni H2R en el tejido (f-IHC) entre los grupos colonizados con cepas deL. reuterinatural o conhdcAmutante o condagKmutante porque estos ratones axénicos también expresaban histamina endógena.

[0165] Cuando los ratones con desactivación de HDC recibieronL. reutericonhdcAmutante, no pudieron protegerse de la inflamación y del cáncer porque carecían de histamina tanto endógena como exógena. Sin embargo, en los ratones GF colonizados conL. reutericonhdcAmutante, la histamina endógena estaba presente, lo que activó el receptor. Sin embargo, la DagK producida porL. reutericonhdcAmutante ayudó a suprimir la expresión de la activación del H1R. Por eso observamos biomarcadores proinflamatorios suprimidos en grupos colonizados conhdcAmutante. Pero cuando se desactivadagKenL. reuteri (dagKmutante) había histamina endógena y exógena que activaba tanto H1R como H2R, pero no había DagK para suprimir H1R. En consecuencia, observamos un incremento de la señalización proinflamatoria similar al de los ratones GF sin ninguna bacteria. En los ratones GF, la histamina endógena activa tanto el H1R como el H2R.

[0166] De este modo, los datos experimentales mostraron que los niveles inmunitarios basales se redujeron después de colonizar los ratones conL. reuteriATCC PTA-6475 natural, que de este modo es un inmunosupresor completo y, en pacientes con una respuesta inmunitaria agresiva, esta cepa bacteriana puede ser una opción terapéutica excelente. Para demostrar además siL. reuterisecreta o no las isoformas de DagK, realizamos un experimento de cultivo de células bacterianas. Se añadieron 100 µl deL. reuteriATCC PTA-6475 cultivado en MRS durante la noche a 37 °C en condiciones anóxicas a 10 ml de medio LDM4 y se dejaron a 37 °C durante 12 horas en condiciones anóxicas. Las células bacterianas se retiraron por centrifugación a 6000 × g durante 10 min a 4 °C. Se añadió una relación 1:1 de proteinasa e inhibidor de proteína cinasa al sobrenadante. Los sobrenadantes se filtraron con un filtro de 0,22 µm para retirar las trazas de bacterias. Dado que DagK es una proteína de 10-13 kDa, es necesario reducir el fondo. Por lo tanto, el sobrenadante se procesó con un filtrado de 50 kDa. La circulación continua se añadió al filtrado de 3 kDa y se centrifugó a 5000 × g durante 30 min. El concentrado de la fase superior se utilizó para realizar la LC-MS/MS después de la digestión tripsínica. La Figura 10 ilustra la secuencia de aminoácidos de la forma de proteína DagK deL. reuteriATCC PTA-6475 junto con los sitios de digestión o escisión de la tripsina (Tryps).

[0167] Los resultados del experimento de LC-MS/MS se presentan en la Tabla 3 y la Figura 10. Las secuencias que coinciden con la proteína DagK deL. reuterise descubrieron en el sobrenadante. En consecuencia,L. reuteriATCC PTA-6475 es capaz de producir y secretar la proteína DagK.

[0168] Tabla 3. Resultados de LC-MS/MS del tratamiento con tripsina del sobrenadante deL. reuteriATCC PTA-6475

[0171]

[0173] Péptidos A-F de la Tabla 3:

[0174] A EERNMR Id. de sec. n.°: 15 B DVAAGGVLISA Id. de sec. n.°: 16 C DKHQTEK Id. de sec. n.°: 17 D NMRYHLLAACLAI Id. de sec. n.°: 18 E EERNMRY Id. de sec. n.°: 19 F KAKDVAAGGVLISAIFSVLVGLIIFIP Id. de sec. n.°: 20 Ejemplo 8

[0175] Identificación de cepas capaces de producir DagK

[0176] Se cultivan las bacterias en placas con MRS durante 16 h a 37 °C en atmósfera anaerobia. Las colonias bacterianas se recogen con un asa de plástico estéril y se suspenden en 100 µl de agua estéril (calidad para PCR). Alternativamente, el ADN se puede preparar a partir del cultivo bacteriano utilizando cualquier método adecuado, véase, por ejemplo, el Ejemplo 6.

[0177] La presencia del gendagKse examina mediante PCR, p. ej., utilizando perlas de PCR PuReTaq Ready To Go (GE Healthcare) y el par de cebadores dagK_LrF (TGGACTCACGCGATAAACATCA, Id. de sec. n.°: 21) and dagK_LrR (ACAATCAAATCTGTAACAGCTTCG, Id. de sec. n.°: 22), 0,4 mM de cada uno. Se añade una suspensión bacteriana o una preparación de ADN (0,5 µl) a la mezcla de PCR y se realiza la reacción de PCR ejecutando el programa a 95 °C, 5 min; 30× (95 °C, 30 s; 58 °C, 30 s; 72 °C, 30 s); 72°, 10 min. Los productos de la PCR se separan y visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa estándar, y la secuencia se determina mediante secuenciación de Sanger estándar utilizando el cebador directo (dagK _LrF) empleado para la PCR.

[0178] Ejemplo 9

[0179] Análisis deLactobacillus reuteriDSM 32273 capaz de producir histamina y DagK

[0180] Se cultivaron bacterias deLactobacillus reuteriDSM 32273 (depositadas según el Tratado de Budapest ante la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstrasse 7B, D - 38124 Braunschweig) el 8 de marzo de 2016) durante la noche en caldo MRS a 37 °C. Las suspensiones bacterianas se centrifugaron a 3500 rpm durante 5 minutos y se suspendió 1 µl del sedimento en 100 µl de PBS.

[0181] El análisis por PCR (histidina descarboxilasa (hdc)) se realizó con los siguientes cebadores: hdcA425fde (CGTCAYTATCCWGCTCCWGG, Id. de sec. n.°: 23) y hdcA867rde (TCCATRTCAGTATCWGGKGT, Id. de sec. n.°: 24). El producto resultante de la PCR tenía un tamaño de 442 pb. Los cebadores de PCR se diseñaron a partir de una alineación dehdcdeL. reuteri, L. hilgardii, L. buchneriyL. sakei.Se usó la mezcla maestra de PCR DreamTaq Green (2X Thermo Scientific, número de artículo K1081) para las reacciones de PCR. Reacciones de PCR según lo siguiente:

[0182] Mezcla maestra con cebadores Volumen por reacción

[0183] Agua (calidad para PCR) 10,0 µl

[0184] Cebador, directo (10 pmol/µl) 1,0 µl

[0185] Cebador, inverso (10 pmol/µl) 1,0 µl

[0186] DreamTaq 12,5 µl

[0187] Se mezclaron 24,5 µl de la mezcla maestra con 0,5 µl de suspensión bacteriana y se ejecutó el siguiente programa de PCR: 95 °C, 10 min; 30× (95 °C, 30 s; 48 °C, 30 s; 72 °C, 30 s); 72 °C, 5 min.

[0188] El análisis por PCR del gendagKenL. reuteriDSM 32273 se realizó como se describe en el Ejemplo 8.

[0189] Los resultados mostraron queL. reuteriDSM 32273 era positiva para el gen que codifica la histidina descarboxilasa y el gendagK, véase la Tabla 4. Las cepas bacterianasL. reuteriATCC PTA-6475 y DSM 17938 se incluyeron como controles.

[0190] Tabla 4. Resultados del análisis de PCR que muestran la especie, la cepa y el origen del anfitrión de las bacterias analizadas.

[0193]

[0195] Las realizaciones descritas anteriormente se deben entender como unos pocos ejemplos ilustrativos de la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones, combinaciones y cambios en las realizaciones sin abandonar el ámbito de la presente invención. En particular, se pueden combinar diferentes soluciones parciales en las diferentes realizaciones en otras configuraciones, cuando sea técnicamente posible. El alcance de la presente invención queda definido, sin embargo, por las reivindicaciones adjuntas.

[0196] Referencias

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer, comprendiendo dicho método:

el cribado de bacterias del ácido láctico para revelar la presencia de un operón de histidina activo y la presencia de la expresión de un gen que codifica una diacilglicerol cinasa (DagK); y

seleccionar una cepa bacteriana del ácido láctico para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal identificada como una cepa bacteriana del ácido láctico que tiene un operón de histidina activo y que produce histamina y produce DagK.

2. Una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal, en donde dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo y dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina expresa un gen que codifica una diacilglicerol cinasa (DagK) y produce histamina y produce DagK.

3. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso según la reivindicación 2, en donde dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina es para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída de un cáncer colorrectal asociado a la inflamación.

4. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso según las reivindicaciones 2 o 3, en donde dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina se utiliza para reducir el número y/o el tamaño de los tumores en un paciente que padece cáncer colorrectal.

5. Una cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso como adyuvante en un tratamiento de cáncer del cáncer colorrectal, en donde dicho tratamiento de cáncer se selecciona de entre un grupo que consiste en radioterapia y quimioterapia, en donde dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina comprende un operón de histidina activo y expresa un gen que codifica una diacilglicerol cinasa (DagK) y dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina produce histamina y produce DagK.

6. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde dicha cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina es una cepa deLactobacillus reuteriproductora de histamina.

7. La cepa bacteriana del ácido láctico productora de histamina para su uso según la reivindicación 6, en donde dicha cepa deLactobacillus reuteriproductora de histamina se selecciona del grupo que consiste enLactobacillus reuteriATCC PTA-6475,Lactobacillus reuteriATCC PTA-4659 yLactobacillus reuteriDSM 32273.

8. UnLactobacillus reuteriDSM 32273.

9. UnLactobacillus reuteriDSM 32273 para su uso como medicamento.

10. UnLactobacillus reuteriDSM 32273 para su uso en la profilaxis, la inhibición, el tratamiento o la reducción del riesgo de recaída del cáncer colorrectal.